技术领域：

本发明涉及一种打顶后无腋芽烟草的培育方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

烟草作为叶用作物，任其开花结实会消耗大量养分，降低烟叶产量和品质。在优质烤烟的种 植中，“打顶”是一项提高烟叶质量的重要措施，必须在适当时期摘去顶部的花蕾或花序，杜绝 烟株体内营养物质的无谓消耗，促使营养物质集中供应叶片生长，增大叶面积和单叶重量。

但是，打顶后，腋芽丛生，耗费养分，达不到提高烟叶质量的目的。实际生产中，通常采用 在“打顶”后人工抹芽或“打顶”后施以抑芽丹抑制腋芽生长的方法来对腋芽进行抑制。

然而，“打顶”后人工抹芽耗费劳力过大，提高了烟叶的生产成本。“打顶”后施以抑芽丹虽 然可以抑制腋芽生长，降低劳动强度，但是并不降低烟叶生产的成本，同时，抑芽丹作为农药， 无法避免对环境和烟叶产生污染。

高等植物含有许多过氧化物酶同工酶，不同的过氧化物酶基因表现出不同的表达模式。烟草 的过氧化物酶基因(tpoxN1)在伤诱导后20分钟后迅速表达，且能维持至少2周的时间，茉莉 酸和乙烯处理tpoxN1的表达并不加强，与其它过氧化物酶基因的表达表现出明显的不同。tpoxN1 启动子的克隆可以为进一步研究tpoxN1的表达调控打下基础。

启动子在植物的遗传转化中具有重要的作用，特别是在外源抗性基因的转化中尤为重要，如 使用组成型启动子，会是目的基因恒定而持续表达，过度消耗细胞内的物质和能量，造成植物体 内资源的浪费，影响正常的代谢，不利于产量和品质的提高。而使用诱导型启动子只有在接受诱 导信号后，目的基因才会表达，且胁迫解除后目的基因停止表达，这样不仅不会造成植物体内资 源的浪费，又可提高植物的抗性。诱导型启动子的研究和应用已成为植物基因工程的热点。烟草 tpoxN1基因启动子的克隆为下一步将它应用于转抗病虫基的研究提供一个有用的工具。

2000年Stafstrom，Joel等用差异显示技术在豌豆中获得了能抑制豌豆侧芽生长的基因DRM。 (Madoka Y，Mori H.Two novel transcripts expressed in pea dormant axillary buds.Plant Cell Physiol. 2000 Mar；41(3)：274-81)。

2001年TantikanjanaT等人发现缺失SPS基因的拟南芥植株会萌生大量侧芽，经实验确证该 基因SPS能压制侧芽的生长。(T，Yong JW，Letham DS，Griffith M，Hussain M，Liung K，Sandberg G， Sundaresan V.control of zxillary bud initiation and shoot architecture in arabidopsis through the supershoot gene.Tantikanjana.Genes Dev.2001 Jun 15；15(12)：1577-88)。

2002年，Madoka Y，MoriH等用反义RNA技术抑制PSA基因的表达，获得的植株比正常植株 侧芽数量明显增加，认为该基因有抑制侧芽生长的作用。(Bahrami AR，Bastow R，Rolfe S，Price C， Gray JE.A role for nuclear localised proteasomes in mediating auxin action.Plant J.2002 Jun；30(6)：691-8.)

目前广泛应用的标记基因为除草剂抗性基因和抗生素抗性基因。随着转基因植物的商品化种 植，人们担心转基因农作物中的除草剂抗性基因可能会经自然杂交传递至杂草，转基因食品中的 抗生素抗性基因可能通过转染肠道细菌从而造成人类对这些抗生素产生抗性，尽管尚无确凿可信 的科学证据，抗性标记基因(resistant marker gene)潜在的生态环境和食用安全性一直颇有争议，寻 找安全标记基因用于植物的遗传转化无疑是解决这一问题的最佳途径。而磷酸甘露糖异构酶基因 (pmi)作为标记基因可解决上述问题。来源于Ecoli的pmi作为标记基因已成功应用于甜菜、玉米 和水稻的遗传转化。

因此，培育一种在打顶后腋芽能够被有效抑制的烟草品种叶的产品质量和产量，同时避免造 成对环境和烟叶的污染，并且应用安全，能够降低生产成本和劳动力投入的方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种打顶后无腋芽烟草的培育方法。

本发明方法采用分子生物学技术鉴定“打顶”后促进腋芽萌发和生长的关键基因，然后用伤 诱导启动子驱动反义RNA在“打顶”后立即表达，从而抑制促进腋芽萌发和生长的关键基因的 表达，使腋芽不能萌发和生长。

本发明方法包括：抑制侧芽生长基因的克隆、伤诱导启动子POD的克隆和安全标记基因pmi 的克隆；将三者置于同一表达载体下，利用农杆菌介导法将该载体导入烟草，经过标记筛选、转 化，得到初筛烟草植株，再经分子检测、表形检测，得到转基因无腋芽烟草植株。

所述的抑制侧芽生长基因为：豌豆DRM基因、拟南芥SPS基因和烟草PSA基因。

豌豆DRM基因：2000年Stafstrom，Joel等用差异显示技术在豌豆中获得了能抑制豌豆侧芽 生长的基因DRM。(Madoka Y，Mori H.Two novel transcripts expressed in pea dormant axillary buds. Plant Cell Physiol.2000 Mar；41(3)：274-81)。

拟南芥SPS基因：2001年Tantikanjana T等人发现缺失SPS基因的拟南芥植株会萌生大量侧 芽，经实验确证该基因SPS能压制侧芽的生长。(T，Yong JW，Letham DS，Griffith M，Hussain M， Ljung K，Sandberg G，Sundaresan V.control of zxillary bud initiation and shoot architecture in arabidopsis through the supershoot gene.Tantikanjana.Genes Dev.2001 Jun 15；15(12)：1577-88)。

烟草PSA基因：2002年，Madoka Y，Mori H等用反义RNA技术抑制PSA基因的表达，获得 的植株比正常植株侧芽数量明显增加，认为该基因有抑制侧芽生长的作用。(Bahrami AR，Bastow R，Rolfe S，Price C，Gray JE.A role for nuclear localised proteasomes in mediating auxin action.Plant J. 2002 Jun；30(6)：691-8.)

2002年Sasaki K，Hiraga S等发现烟草过氧化物酶基因(tposN1)在伤诱导20min后迅速表达且 能维持至少2周的时间。(Sasaki K，Hiraga S，Ito H，Seo S，Matsui H，Ohashi Y.A wound-inducible tobacco peroxidase gene expresses preferentially in the vascular system.Plant Cell Physiol.2002 Jan；43(1)：108-17.)

上述伤诱导启动子POD根据tposN1序列，利用Genomerwalker技术克隆了该基因的启动子 序列。该伤诱导启动子可使目的基因在打顶伤害后诱导表达。

植物在受到伤害时通过激活体内的防卫系统产生的防卫反应来抵抗病原菌，包括活性氧的释 防、防卫基因的表达、过敏反应及系统获得性抗性。在许多植物中过氧化物酶(Peroxide，POX， EC 1.11.1.7)基因是一种伤诱导应答基因。外源茉莉酸、乙烯加强了伤诱导POX基因的表达，同 时也诱导伤应答基因PR的表达。因此，茉莉酸和乙烯被认为是伤诱导信号传导的中间体。烟草 的过氧化物酶基因(tpoxN1)在伤诱导后迅速表达且维持较长的时间，而茉莉酸和乙烯处理tpoxN1 的表达并不加强。

本发明方法中对烟草伤诱导型过氧化物酶基因(tpoxN1)启动子的克隆过程如下：

材料与方法部分：

植物材料：烟草(Nicotiana tabacum cv.K326)种子由中国热带农业科学院热带作物生物技 术国家重点实验室保存；幼叶采集后用于基因组DNA的提取；

试剂：Universal GenomewalkeTM Kit、Advantage Genomic Polymerase Mix购自CLONTECH 公司；IPTG、X-Gal、dNTPs、pGEM-T easy Vector购于Promega公司；其它生化试剂和常 规试剂均为超纯和分析纯；

方法部分：

烟草基因组DNA的提取：参照傅荣昭的方法(傅荣昭，孙勇如，贾士荣.植物遗传转化技术手 册.北京：中国科学技术出版社，1994，140-142)进行；

构建GenomeWalker文库及GenomeWalker DNA Walking：按Universal GenomewalkerTM Kit 使用说明书进行；

引物的设计：根据GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列设计引 物：

GSP 1：5′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′

GSP 2：5′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′

从GenomeWalker文库中进行PCR-based DNA Walking，按Universal GenomewalkerTM Kit 使用说明书进行；

第一轮PCR：在5个0.2ml离心管中分别加入5种DNA文库，然后依次加入以下成分：10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP1(10uM)、GSP1(10uM)、Advantage Genomic Polymerase Mix(50x)；反应总体积50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)进行 PCR反应，反应条件为：7个循环(94℃，2sec；70℃，3min)→32个循环(94℃，2sec；65℃，3min) →65℃，4min；

第二轮PCR：在5个0.2ml离心管中分别加入稀释的第一轮PCR产物，然后依次加入以下 成分：10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP2(10uM)、GSP2(10uM)、Advantage Genomic Polymerase Mix(50x)；反应总体积50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems) 进行PCR反应，反应条件为：7个循环(94℃，2sec；70℃，3min)→32个循环(94℃，2sec； 65℃，3min)→65℃，4min；

AP1、AP2由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTM Kit提供，序列为：

AP1：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

AP2：5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′。

PCR产物的回收、连接及重组质粒的鉴定按常规方法(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T. 分子克隆实验指南(第二版).金冬雁，等译.北京：科学出版社，1992，80-120)进行；

DNA的序列测定由上海生物工程公司测定；

结果与分析部分：

Genomewalker文库的构建与Genome Walker DNA Walking利用4种产生平末端的限制性 内切酶(DraI、EcoR V、PvuII、SspI)分别对烟草基因组DNA进行酶切，并对酶切后的DNA 进行纯化。然后把纯化的DNA与接头(由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTM Kit 提供)连接，构建成4种Genomewalker文库(DraI文库、EcoR V文库、PvuII文库、SspI 文库)；

根据GenBank(acession numberAB027753)的tpoxN1的mRNA序列设计了两个引物，利用 Genome Walker的方法，对烟草tpoxN1基因的5’调控区进行了克隆。通过第一轮PCR扩增后， 从4种Genomewalker文库中均能扩增出产物，但都呈弥散状，经过第二轮PCR扩增后，由DraI 文库、EcoR V文库、PvuII文库扩增出清晰的条带(结果未示)；对获得的最大的片段(DraI文库) 进行了克隆；PCR产物经琼脂糖电泳后回收，插入pGEM-T Easy载体，重组质粒经EcoRI酶切 获得约2000bp的片段，见图9；对重组质粒进行测序结果表明，该片段长为2070bp。

烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列分析用PCGENE对序列分析进行表明，tpoxN1基 因的转录起始位点(tspA)的保守序列5’YTCAATCA与其它植物基因非常一致([Joshi.CP.An inspection of the domain betwwen putative TATA box and translation start in 79 genes.Nucleic Acids Res，1987，15：6643-6653]；[Bucher P. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212：563-578])， 转录从tsp下游79bp处开始。在邻近5’区域，发现一些真核生物顺式调控元件。在-33bp处存在 TATAbox序列(TATAAATATGT)；在-71bp处具有TCCAAT序列，与多个高等真核生物的启动 子的‘CAAT’相似(Bucher P.Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212：563-578)；在 -840处存在GC-box；在-1005处存在CCAAT-box；在-214，-749处也可以发现TCA-like序列， TCA-like序列目前在30多种胁迫诱导基因的启动子中可以发现(Goldsbrough AP，Albrecht H， Stratford R.Salicylic acid-inducible binding of a tobacco nuclear protein to a 10-bp sequence which is highly conserved amongst stress-inducible genes.Plant J，1993，3；563-571)，，该序列在酵母的DDR2、 ubi4和CTT1等基因中与胁迫应答元件(stress-response element，STRE)有关(Schuller C，Brewster JL. Alexander MA，et al.The HOG pathway controls osmotic regulation of transcription via the stress reponse element(STRE)of the Saccharomyces cerevisiae CTT1 gene.EMBO J，1994，13：4382-4389)； 将烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列与一些伤诱导启动子比较，未找到相同的伤诱导相 关调控元件。本发明利用已克隆到的烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列与GUS构建了一 系列的融合基因，通过转基因的方法来研究其调控方式；烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控 序列见图10。

伤诱导启动子POD是在烟草里克隆到的诱导型启动子，使用组成型启动子，会使目的基因 恒定而持续表达，过度消耗细胞内的物质和能量，造成植物体内资源的浪费，影响正常的代谢， 不利于产量和品质的提高。例如，很多抑芽基因都与激素代谢水平有关，过早表达可能会影响烟草 的正常生理。而使用诱导型启动子只有在接受诱导信号后，目的基因才会表达，且胁迫解除后目 的基因停止表达，不会对植物的其他生理指标造成很大影响。为此本发明使用了伤诱导启动子 POD替换了pBI121载体上的CaMV35S启动子(将改造后的载体命名为pPOD)，使该基因得以在 打顶后(提供伤诱导)表达。

以下详细说明DRM基因的克隆、植物表达载体的构建及将载体转化烟草的研究。POD、SPS、 PSA三个片段的制备及载体的构建方法和DRM基因的完全相同。

所述的DRM基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草过程为：

材料与试剂部分：

植物材料：豌豆(Pisum sativum L.cv.Alaska)由中国热带农业科学院热带作物生物技术国 家重点实验室保存。

菌种及质粒：大肠杆菌E.coli DH5α、农杆菌EHA105菌株、辅助质粒pRK2013均由热带作 物生物技术国家重点实验室保存；限制性内切酶、pUCM18-T载体、T4DNA连接酶均是宝生物公 司产品，QIAquick Gel Extraction Kit为QiaGene公司产品L；IPTG、X-gal购自华美生物工程公 司，其它生化试剂分别购自曙光、华美、经科、Biolab等国内外公司。

方法与步骤部分：

DRM基因的克隆：

植物总DNA的提取参考傅荣昭的方法，具体如下：

(1)称取0.1g左右叶片，于研钵中在液氮下研至粉末。

(2)将粉末转移至一1.5ml离心管中，加入400μl DNA提取缓冲液。

(3)解冻后置于冰上，加入200μl冰预冷的20％PVP存贮液(于-20℃保存)。

(4)加入75μl 20％SDS溶液。

(5)轻轻颠倒数次，混匀后于65℃水浴保温15min，其间颠倒2～3次。

(6)冷却至室温，加入75μl 5mol/L KAc，混匀后，冰浴30min。

(7)4℃12,000r/min条件下离心10min。

(8)转移600μl上清至另一1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后，冰浴10min。

(9)4℃12,000r/min条件下离心15min。

(10)将上清液尽可能去除，沉淀溶于500μl TE(pH8.0)缓冲液中。

(11)加入1μl RNaseA(10mg/ml)，混匀后，室温放置10min。

(12)用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次。

(13)20℃12,000r/min离心5min，取上相400μl至另一1.5ml离心管中。

(14)加入20μl 3mol/LNaAc(pH5.2)、420μl异丙醇，混匀后，室温放置5min。

(15)4℃12,000r/min条件下离心5min，去上清液，沉淀用1ml 70％乙醇洗一遍，干燥后溶于 50μlTE(pH8.0)中，存于4℃。

(16)DNA紫外分析：取4μl DNA原液加入到400μl TE(pH8.0)缓冲液中，混匀后，用DU-70 紫外分光光度计测定260nm、280nm处吸收值，并计算DNA原液浓度。

DNA提取缓冲液：500mmol/LNaCl、50mmol/LTris·Cl(pH 8.0)、50mmol/L EDTA、1％(v/v) βMet

TE缓冲液：10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)

RNaseA：将RNaseA溶于10mmol/L Tris·Cl pH7.5，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的 浓度，沸水加热15min后，使其缓缓冷却至室温，分装成小份存于-20℃。

引物设计：根据DRM基因的mRNA序列设计，为构建载体的方便，设计了两个酶切位点： XbaI和BamHI。

    DRMP1：5`-ACT TCTAGAATGGGCCTCCTCGACCAGTT-3`

                 XbaI

    DRMP2：5`-ACT GGATCCTCACACATCGAAAGGAGAAG-3`

                 BamHI

    PCR扩增：在0.2ml的离心管中分别加入以下成分：

    ddH2O                            31.5μl

    10XPCR缓冲液                      5.0μl

    25mM dNTP                         5.0μl

    P1(10mM)                          1.0μl

    P2(10mM)                          1.0μl

    25mM MgCl2                       5.0μl

    DNA模板                           1.0μl

混匀后，在94℃预变性3min后，加入0.5μl Taq DNA聚合酶进行PCR反应。反应参数为94℃变 性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后在72℃继续延伸10min，4℃保存。

PCR产物的回收：PCR扩增产物的回收采用QIAquick Gel Extraction Kit，操作按说明书进行：

(1)10μl PCR扩增反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，2V/cm恒电压条件下电泳30min。紫外 灯下切下含目的片段的琼脂糖块，并转移至一1.5ml离心管中；

(2)加入3倍体积的QG缓冲液，50℃水浴保温10min将琼脂糖凝胶完全溶解；

(3)溶解液转移至QIAquick离心柱；

(4)2,000rpm/min，25℃离心1min；

(5)去除离心管中的液体，加入0.75ml PE缓冲液至QIAquick离心柱；

(6)12,000r/min，25℃离心1min；

(7)去除离心管中的液体，25℃12,000rpm/min条件下离心1min；

(8)加入30μl EB缓冲液至离心柱的膜上，将离心柱置于一个灭过菌的1.5ml离心管中，12,000 r/min，25℃离心1min；

(9)取1.0μl离心收集的回收液，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，估算目的DNA片段浓度。

目的片段的克隆：按宝生物公司提供的方法，将PCR扩增片段与pUC18-T Vertor连接，向 0.5ml的无菌离心管中加入：

    10×T4DNA连接酶Buffer     2.0μl

    pUC18-T Vector DNA        1.0μl

    PCR回收产物               4.0μl

    T4DNA连接酶(3U/ul)        1.0μl

    ddH2O                    12.0μl

总计20.0μl，充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。

E.coli DH5α感受态细胞的制备：

(1)从LB琼脂平板上挑取E.coli DH5α单菌落，接种到10ml不含抗生素的LB液体培养基中， 37℃，300rpm振荡培养过夜。次日按照1％(V/V)的量转入新鲜LB液体培养基中，37℃振荡 培养至OD600在0.3-0.4之间；

(2)将50-100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，于冰上放置30min；

(3)4℃、6000rpm离心3min，去上清液；

(4)向每个离心管中各加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬菌体，冰浴30min；

(5)4℃，6000rpm离心3min；去上清液，再将菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/LiCl溶液中，即为 感受态细胞。于4℃冰箱保存，一周内使用。

连接产物的转化：

(1)用无菌吸头取100μl感受态细胞置1.5ml预冷的无菌离心管中，加入5μl连接反应液，轻 轻混匀，立即置冰上30min；

(2)将管置42℃恒温水浴中热激90s；

(3)放回冰上3-5min；

(4)加入800μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养45-60min；

(5)制备LB附加100μg/ml氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的固体平板；

(6)取200μl菌液与4μl IPTG及16μl X-gal混匀；

(7)用无菌吸头蒋混合液移至LB平板上，再用无菌三角头玻棒蒋菌液均匀涂满整个平板表面；

(8)平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿，于37℃培养12-16h，LB培养基：

    酵母抽提物(Yeast Extract)(5g/L)

    蛋白胨(Tryptone)         (10g/L)

    NaCl                    (10g/L)

加900ml蒸馏水溶解，用NaOH调节pH值至7.0，再定容到1,000ml，分装后，121℃灭菌20min。

X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：用二甲基甲酰胺将X-Gal配制成50mg/ml的溶液， 黑纸包裹后，存于-20℃。

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)：用蒸馏水将IPTG配制成200mg/ml的溶液，通过0.22 μm的一次性滤器过滤除菌，分装后，贮存在-20℃备用。

质粒DNA的小量提取：

(1)用无菌牙签从LB平板上挑取白色单菌落并分别接种到盛有含Amp(100μg/ml)3ml LB培养 基(含Amp 100μg/ml)的试管中。

(2)37℃300r/min条件下连续振荡培养8～10h。

(3)分别转移1.4ml左右培养物至1.5ml离心管中。

(4)12,000r/min，4℃离心30s至60s。

(5)尽可能将上清倒尽，5,000r/min再离心数秒将残液收集到管底(沉淀物在转子中的位置应 与前一次离心时一致)，并用取液器将残液吸尽。

(6)加入200μl溶液I，振荡涡旋将细胞沉淀物彻底重悬。

(7)加入200μl溶液II，盖紧管盖并颠倒3～4次至溶液呈透明粘稠状。

(8)加入200μl溶液III，盖紧管盖，颠倒数次至白色絮状沉淀呈均匀分散状。

(9)12,000r/min，4℃离心5min。

(10)转移400μl上清液，并用1ml无水乙醇沉淀质粒DNA。

(11) 12,000r/min，4℃离心5min，去上清液，沉淀物用1ml 70％乙醇洗涤一遍，再稍离心， 将残液吸尽。

(12)干燥后，用50μl ddH2O将质粒溶解备用。

Solution I：50mmol/L Tris·HCl，pH7.510mmol/L EDTA，100μg/ml RNase A

Solution II：0.2mol/L NaOH，1％SDS

Solution III：1.32mol/L KAc，pH4.8

重组子的酶切鉴定：

(1)在一0.5ml离心管中，依次混入下列各组分：

    10×BufferM                    5.0μl

    质粒DNA                        5.0μl

    ddH2O                         38.0μl

    XbaI                           2.5μl

    BamHI                          2.5μl

    总计50.0μl。

(2)混匀后，稍离心，37℃温育30-60min。然后取5.0μl酶切反应液进行1.2％琼脂糖凝胶电泳， 并以PCR标准分子量做对照。5V/cm恒压条件下电泳30min后，于紫外灯下观察。

DNA序列测定与分析：挑取的阳性克隆进行DNA序列测定，测序由上海生物工程公司完成。

pPOD/DRM植物表达载体的构建：

目的片段的酶切及回收：用XbaI和BamHI双酶切将DRM从克隆载体上切下，插入到经同 样酶切的植物表达载体pPOD，构建带有DRM基因的植物表达载体pPOD/DRM。酶切反应体系 及步骤，酶切产物的回收步骤同上。

连接反应，连接用宝生物公司T4DNA连接酶，体系如下：

    DRM片段                        10μl

    Ppod片段                       5μl

    T4DNA连接酶                    1μl

    10×Buffer                     2.5μl

    ddH2O                         6.5μl

    总计25μl，充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。

pPOD/DRM植物表达载体的鉴定：

将上述连接产物转化大肠杆菌然后用PCR法筛选转化子，将此转化子再用XbaI和BamHI 双酶切进行酶切鉴定，如图12所示，所切下的片断与预期结果相符，说明构建正确。

三亲交配法转化农杆菌：

三亲交配

(1)将保存的菌株接种在加有利福平(Rif)25μg/mL链霉素(str)25μg/mL的10ml的LB液体培养基中， 28℃，200rpm振荡培养24h；

(2)从保存的辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素LB液体培养基 中，37℃，250rpm振荡培养8h；

(3)从保存的中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素LB液体培养基中，37℃， 250rpm振荡培养8h.；

(4)分别取以上三种细菌培养物50μl于1.5离心管中混匀，取50μl涂布于不含抗生素的LB固体培养 基上，28℃，培养2-3天；

(5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kanμg/ml，Str25ug/ml和Rif25μg/ml的LB平板上，28℃ 培养过夜；同时各取1，2，3步骤中的菌液50μl分别涂布于含有三种抗生素的LB平板，作为对 照。

农杆菌质粒的提取：为了检测外源基因是否转移到农杆菌中，采用PCR检测。

(1)从含有植物表达载体的农杆菌三抗LB平板上挑取一个单菌落，接入含有Kan 50μg/ml，Str 25 μg/ml和Rif 25μg/ml的50ml LB液体培养基的100ml的三角瓶，28℃，200rpm振荡培养24h；

(2)取1.5ml菌液置2ml离心管中，4000rpm离心10min，重复3次收集菌液；

(3)用STE溶液洗涤菌体2次；

(4)加入0.4ml溶液I，涡混悬浮细菌，室温放置10min；

(5)加入0.8ml新配制的溶液II，颠倒离心管数次，室温放置10min；

(6)加入0.4ml溶液III，轻颠倒离心管数次，使酚和内容物混匀；

(7)加入0.2ml 3mol/L乙酸钠，轻颠倒离心管数次，冰浴中放置5min；

(8)1000rpm离心5min，将上清液转入一个新离心管中，加入2倍体积冰冷的95％乙醇，-20℃放置 1h；

(9)1000rpm离心5min，弃掉上清液；

(10)向沉淀中加入0.5ml 0.3mol/L醋酸钠溶解沉淀，加入1.0ml无水乙醇，颠倒离心管数次，-20℃ 放置1h；

(11)1000rpm离心5min，轻轻去掉上清液，离心管口向下，用无菌滤纸吸去管壁液滴；

(12)加入1ml70％乙醇漂洗沉淀，快速吹干；

(13)用无菌双蒸水溶解沉淀，加入2ulRNase，37℃放置7h。 重组子的PCR检测：

PCR反应体系：

    PCR Premix        10.0μl

    DNA质粒           1.0μl

    引物1             0.5μl

    引物2             0.5μl

    ddH2O            18.0μl

总计20.0μl，充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底。PCR反应参数为：94℃预变性5 min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃保温10min。取10μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，并以PCR标准分子量做对照。5V/cm恒压条件下电泳30min 后，于紫外灯下观察。

农杆菌介导烟草的遗传转化：

烟草无菌苗的培养：先用70％的乙醇浸泡K326烟草种子2min，再用15％的次氯酸钠浸泡 20min，期间要不断的搅动。用无菌水冲洗4-5遍播种于MS培养基上，28℃暗培养3-5待种子开 始萌发移至光照培养箱继续生长。一个月后取叶子为试验材料。

农杆菌侵染液的制备：从培养平板挑取EHA 105/pBI121/ADF4单菌落，接种到LB+50μg/ml Kan+25μg/ml Str+25μg/ml Rif的液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养至对数期(OD600 值约0.5)，3000rpm离心10min后，取沉淀用等体积的MS培养基悬浮。

叶盘转化法：

(1)将剪取0.5cm叶片浸入菌液5min后，用无菌滤纸吸干后转移到MS+2.0mg/L BA培养基上。

(2)侵染过的叶盘接种在分化培养基MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA，在28℃黑暗条件培养3d。

(3)经过共培养的叶盘转移到加有选择压培养基MS+0.05mg/L IAA+2.0mg/L BA+600mg/L Cef+100mg/LKan，大约15-20d继代一次，继代两次诱导出不定芽。

(4)待不定芽长到2-3cm长时，用解剖刀切下，转到伸长培养基上MS+0.5mg/L BA+600mg/Lcef +100mg/LKan，两周更换一次新鲜的伸长培养基，筛选培养2-3代，淘汰白化苗及畸形苗。

(5)选着形态正常、生长旺盛的抗性苗，转入生根培养基MS+0.2mg/L IAA+600mg/L Cef+ 100mg/L Kan上培养。

(6)待根系形成后取出小苗，在自来水洗净根上的琼脂，移入沙盆室温中培养。 MS培养基：

大量元素：KNO3 283mg/l，(NH4)NO3463mg/l，KH2PO4 400mg/l，MgSO4.7H2O 185mg/l，CaCl2H2O166mg/l

微量元素：MnSO4.H2O 76mg/l，H3BO4 300mg/l，ZnSO4.7H2O 200mg/l，NaMoO4.7H2O 2.5mg/l， CuSO4.5H2O 2.5mg/l，CoCl2.6H2O 2.5mg/l，KI 7.5mg/l

有机物：盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醛(B6)1mg/l，烟酸1mg/l，肌醇100mg/l

铁盐：FeSO4·7H2O 2.78mg/l，Na2-EDTA 37.25mg/l

琼脂粉：6.4g/L

蔗糖：30g/L

图2-图8是其他几个片段PCR扩增及构建过程的图片。

SPS基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草：

(植物材料：拟南芥)

(1)引物：SPS1：ACTTCTAGA GAAACGA GCACA CAACT CAC

         SPS2：ACTGGATCC CGTCGA AACAC ATCAC AGAG

(2)PCR反应体系及条件：在0.2mL离心管中分别加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板 DNA 1μL，P12μL，P22μL，反应总体积为50μL。反应条件为：5个循环(94℃，5min；94℃， 30sec；50℃，30sec；72℃，120sec)→30个循环(94℃，30sec；65℃，30min；72℃，120sec)→ 72℃，10min→4℃.

PSA基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草：

(植物材料：烟草)

(1)引物：PSA1：AGCAATCTAGAAAATGAGTAGAGGC

         PSA2：ATAGGATCCTGATAGCGAACATACATTTC

(2)模板：因为从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中检测到的PSA基因是其mRNA序列， 引物设计也是根据RNA序列设计的，但是该基因内部有一段很长的内含子序列，所以我们先提 取烟草的RNA，然后反转录得到其cDNA序列，用cDNA序列作为模板得到了PSA基因。以下 是对这个过程的详细说明：

PSA基因-cDNA：

转基因植株的RNA提取，采用异硫氰酸胍法：

(1)向50ml离心管中加入10ml异硫氰酸胍溶液，放置冰上于预冷；

(2)取1g新鲜幼嫩叶子放在研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末；

(3)将粉末全部转入冰上预冷的加入10ml异硫氰酸胍溶液离心管，振荡离心管混合均匀，将离心 管放置冰上；

(4)加入2mol/L NaAc 1ml、水饱和酚10ml和氯仿/异戊醇(24∶1)2ml，每加一种试剂，轻轻摇晃 离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，颠倒几次混合均匀，冰浴15min；

(5)4℃，12000rpm 30min，将上层液转移到一个干净的离心管中，用水饱和酚反复抽提三次； (6)将上层水相转移到一个干净的离心管中，向管中加入等体积的异丙醇，混匀，放置-20冰冻 1h；

(7)4℃，12000rpm 30min，小心去除上清液，沉淀溶于3M异硫氰酸胍溶液，在加入等体积的异丙 醇，混匀，放置-20冰冻1h；

(8)沉淀用70％乙醇洗涤一遍，在超净台吹干，溶于适量体积甲酰胺，-20℃低温保存；

(10)行含有甲醛变性电泳胶，检测RNA的完整性，调整转基因植株和对照的RNA浓度一致；

异硫氰酸胍溶液：4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸 钠，0.1mol/L巯基乙醇；2mol/LNaCl(pH4.0)，用经DEPC处理过的水配制，高压灭菌。水饱和 酚(pH3.5)

反转录反应按大连宝生物工程有限公司反转录试剂盒说明书进行。

(1)在一0.5ml离心管加入1μg的RNA(溶于11μl的DEPC处理的水中)，再加入1μl的oligdT15；

(2)70℃加热10min后，冰上冷却1min以上；

(3)在离心管中依此加入以下成分：

    10×PCR缓冲液                2μl

    25mM MgCl2                  2μl

    0.1MDTT                      2μl

    10mM dNTP                    1μl

(4)42℃加热5min后，加入1μl AMV反转录酶，42℃反应50min；

(5)70℃加热15min，冰上冷却；

(6)反应混合物于-20℃保存；

反应结束后得到的cDNA可用于后面的PCR扩增。

(3)PCR反应体系及条件在0.2mL离心管中分别加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板CDNA 1μL，P1 2μL，P2 2μL，反应总体积为50μL。反应条件为：5个循环(94℃，5min；94℃，30sec； 50℃，30sec；72℃，60sec)→30个循环(94℃，30sec；60℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min →4℃。

POD基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草

(植物材料：烟草)

(1)引物：POD1：5′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC  3′

         POD2：5′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC  3′

(2)PCR反应体系及条件在0.2mL离心管中分别加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA 1μL，P1 2μL，P2 2μL，反应总体积为50μL。反应条件为：5个循环(94℃，5min；94℃，30 sec；50℃，30sec；72℃，2min)→30个循环(94℃，30sec；68℃，30min；72℃，2min)→72℃，10min →4℃。

本发明所述的方法，可以同样的应用在棉花的培育上，所得棉花在质量和产量上均有显著提 高。

对应用本发明方法所得到的烟草进行PCR、Southern、Northern杂交结果显示，外源基因已 经整合到烟草基因组并且得到了表达，并获得了外形上打顶后不生侧芽的植株，且后代性状稳定 遗传，因而不需人工抹芽或施用抑芽剂抑芽，避免了对环境和烟叶的农药污染；应用本发明所得 到的烟草在打顶后没有腋芽产生，避免了烟株体内营养物质的无谓消耗，促使营养物质集中供应 叶片生长，叶片宽大，叶厚增加，叶片中干物质积累量加大，烟叶的可用性提高，叶面积和单叶 重量平均增加10％以上，产量和质量显著提高。

烟草转化采用的是农杆菌介导法。本发明利用农杆菌介导已经成功的将抑芽基因转入烟草， 对转化植株进行PCR、Southern、Northern杂交结果显示外源基因已经整合到烟草基因组并且得 到了表达，同时也获得了外形上打顶后不生侧芽的植株，并且后代性状稳定遗传。

附图说明：

图1为本发明所使用的农杆菌介导法示意图。

图2为SPS-PCR

1：标准分子量(2000)

2：SPS的PCR产物

图3为T-SPS

1：标准分子量(2000)

2：质粒T-SPS(对照)

3：质粒T-SPS XbaI和BamHI双酶切

图4为POD-SPS

1：标准分子量(15000)

2：pPOD/SPS质粒(对照)

3：pPOD/DRM双酶切

4：SPS的PCR产物

图5为T-PSA

1：标准分子量(2000)

2：PSA的PCR产物

3：质粒T-PSA(对照)

4：质粒T-PSA XbaI和BamHI双酶切

图6为POD-PSA

1：标准分子量(15000)

2：pPOD/PSA质粒(对照)

3：pPOD/PSA双酶切

4：PSA的PCR产物

图7为T-POD

1：标准分子量(2000)

2、3：POD的PCR产物

4：pPOD/POD质粒(对照)

5：质粒T-POD XbaI和BamHI双酶切

图8为121-POD

1：标准分子量(15000)

2：pPOD/PSA双酶切

3：pPOD/POD质粒(对照)

4：POD的PCR产物

图9为烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列的克隆

1：.Marker

2：PCR产物

3：重组质粒/EcoRI

4：重组质粒

图10为烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列

图11为T-DRM的双酶切鉴定

1：标准分子量(2000)

2：DRM的PCR产物

3：质粒T-DRM(对照)

4：质粒T-DRM XbaI和BamHI双酶切

图12为pPOD/DRM双酶切鉴定

1：标准分子量(2000)

2：DRM的PCR产物

3：pPOD/DRM双酶切

4：pPOD/DRM质粒(对照)

具体实施方式：

本发明方法中对烟草伤诱导型过氧化物酶基因(tpoxN1)启动子的克隆过程如下：

1.材料与方法

1.1植物材料：烟草(Nicotiana tabacum cv.K326)种子由中国热带农业科学院热带作物生物技 术国家重点实验室保存；幼叶采集后用于基因组DNA的提取；

1.2试剂：Universal GenomewalkerTM Kit、Advantage Genomic Polymerase Mix购自CLONTECH 公司；IPTG、X-Gal、dNTPs、pGEM-T easy Vector购于Promega公司；其它生化试剂和常 规试剂均为超纯和分析纯；

1.3方法

1.3.1烟草基因组DNA的提取：参照傅荣昭的方法(傅荣昭，孙勇如，贾士荣.植物遗传转化技 术手册.北京：中国科学技术出版社，1994，140-142)进行；

1.3.2构建GenomeWalker文库及GenomeWalker DNA Walking：按Universal GenomewalkerTM Kit使用说明书进行；

1.3.2.1引物的设计：根据GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列设 计引物：

GSP1：5′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC 3′

GSP2：5′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC 3′

1.3.2.2从GenomeWalker文库中进行PCR-based DNA Walking，按Universal GenomewalkerTM Kit使用说明书进行；

第一轮PCR：在5个0.2ml离心管中分别加入5种DNA文库，然后依次加入以下成分：10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP1(10uM)、GSP1(10uM)、Advantage Genomic Polymerase Mix(50x)；反应总体积50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems)进行 PCR反应，反应条件为：7个循环(94℃，2sec；70℃，3min)→32个循环(94℃，2sec；65℃，3min) →65℃，4min；

第二轮PCR：在5个0.2ml离心管中分别加入稀释的第一轮PCR产物，然后依次加入以下 成分：10X PCR Buffer、dNTP(10mM)、Mg(OAc)2(25mM)、AP2(10uM)、GSP2(10uM)、Advantage Genomic Polymerase Mix(50x)；反应总体积50.0μl；在DNA Thermal Cycler2400(PE Biosystems) 进行PCR反应，反应条件为：7个循环(94℃，2sec；70℃，3min)→32个循环(94℃，2sec； 65℃，3min)→65℃，4min；

AP1、AP2由CLONTECH公司的Universal GenomewalkerTM Kit提供，序列为：

AP1：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

AP2：5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′。

1.3.3 PCR产物的回收、连接及重组质粒的鉴定按常规方法(Sambrook J，FritschEF， Maniatis T.分子克隆实验指南(第二版).金冬雁，等译.北京：科学出版社，1992，80-120)进行；

1.3.4 DNA的序列测定由上海生物工程公司测定；

2.结果与分析

2.1 Genomewalker文库的构建与Genome Walker DNA Walking

利用4种产生平末端的限制性内切酶(DraI、EcoRV、PvuII、SspI)分别对烟草基因组 DNA进行酶切，并对酶切后的DNA进行纯化。然后把纯化的DNA与接头(由CLONTECH 公司的Universal GenomewalkerTM Kit提供)连接，构建成4种Genomewalker文库(DraI文 库、EcoR V文库、PvuII文库、SspI文库)；

根据GenBank(acession number AB027753)的tpoxN1的mRNA序列设计了两个引物，利 用GenomeWalker的方法，对烟草tpoxN1基因的5’调控区进行了克隆。通过第一轮PCR扩增 后，从4种Genomewalker文库中均能扩增出产物，但都呈弥散状，经过第二轮PCR扩增后， 由DraI文库、EcoR V文库、PvuII文库扩增出清晰的条带(结果未示)；对获得的最大的片段(DraI 文库)进行了克隆；PCR产物经琼脂糖电泳后回收，插入pGEM-T Easy载体，重组质粒经EcoR I酶切获得约2000bp的片段，见图9；对重组质粒进行测序结果表明，该片段长为2070bp。

2.2烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列分析

用PCGENE对序列分析进行表明，tpoxN1基因的转录起始位点(tspA)的保守序列5’ YTCAATCA与其它植物基因非常一致([Joshi.CP.An inspection of the domain betwwen putative TATA box and translation start in 79 genes.Nucleic Acids Res，1987，15：6643-6653]；[Bucher P.Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212：563-578])，转录从tsp下游79bp处开始。在邻 近5’区域，发现一些真核生物顺式调控元件。在-33bp处存在TATA box序列(TATAAATATGT)； 在-71bp处具有TCCAAT序列，与多个高等真核生物的启动子的‘CAAT’相似(Bucher P. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences.J.Mol.Biol，1990，212：563-578)；在-840处存在GC-box；在-1005处 存在CCAAT-box；在-214，-749处也可以发现TCA-like序列，TCA-like序列目前在30多种胁迫 诱导基因的启动子中可以发现(Goldsbrough A P，Albrecht H，Stratford R.Salicylic acid-inducible binding of a tobacco nuclear protein to a 10-bp sequence which is highly conserved amongst stress-inducible genes.Plant J，1993，3；563-571)，，该序列在酵母的DDR2、ubi4和CTT1等基因中 与胁迫应答元件(stress-response element，STRE)有关(Schuller C，Brewster JL.Alexander MA，et al.The HOG pathway controls osmotic regulation of transcription via the stress reponse element(STRE) of the Saccharomyces cerevisiae CTT1 gene.EMBO J，1994，13：4382-4389)；将烟草伤诱导过氧化 物酶基因的5’调控序列与一些伤诱导启动子比较，未找到相同的伤诱导相关调控元件。本发明 利用已克隆到的烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列与GUS构建了一系列的融合基因，通 过转基因的方法来研究其调控方式；烟草伤诱导过氧化物酶基因的5’调控序列见图10。

伤诱导启动子POD是在烟草里克隆到的诱导型启动子，使用组成型启动子，会使目的基因 恒定而持续表达，过度消耗细胞内的物质和能量，造成植物体内资源的浪费，影响正常的代谢， 不利于产量和品质的提高。例如，很多抑芽基因都与激素代谢水平有关，过早表达可能会影响烟草 的正常生理。而使用诱导型启动子只有在接受诱导信号后，目的基因才会表达，且胁迫解除后目 的基因停止表达，不会对植物的其他生理指标造成很大影响。为此本发明使用了伤诱导启动子 POD替换了pBI121载体上的CaMV35S启动子(将改造后的载体命名为pPOD)，使该基因得以在 打顶后(提供伤诱导)表达。

以下详细说明DRM基因的克隆、植物表达载体的构建及将载体转化烟草的研究。POD、SPS、 PSA三个片段的制备及载体的构建方法和DRM基因的完全相同。

所述的DRM基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草过程为：

1.1材料与试剂

1.1.1植物材料：豌豆(Pisum sativum L.cv.Alaska)由中国热带农业科学院热带作物生物技术国 家重点实验室保存。

1.1.2菌种及质粒：大肠杆菌E.coli DH5α、农杆菌EHA105菌株、辅助质粒pRK2013均由热带 作物生物技术国家重点实验室保存；限制性内切酶、pUCM18-T载体、T4DNA连接酶均是宝生物 公司产品，QIAquick Gel Extraction Kit为QiaGene公司产品L；IPTG、X-gal购自华美生物工程 公司，其它生化试剂分别购自曙光、华美、经科、Biolab等国内外公司。

1.2方法与步骤

1.2.1DRM基因的克隆

1.2.1.1植物总DNA的提取：参考傅荣昭的方法。

(1)称取0.1g左右叶片，于研钵中在液氮下研至粉末。

(2)将粉末转移至一1.5ml离心管中，加入400μl DNA提取缓冲液。

(3)解冻后置于冰上，加入200μl冰预冷的20％PVP存贮液(于-20℃保存)。

(4)加入75μl 20％SDS溶液。

(5)轻轻颠倒数次，混匀后于65℃水浴保温15min，其间颠倒2～3次。

(6)冷却至室温，加入75μl 5mol/L KAc，混匀后，冰浴30min。

(7)4℃ 12,000r/min条件下离心10min。

(8)转移600μl上清至另一1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后，冰浴10min。

(9)4℃ 12,000r/min条件下离心15min。

(10)将上清液尽可能去除，沉淀溶于500μl TE(pH8.0)缓冲液中。

(11)加入1μl RNase A(10mg/ml)，混匀后，室温放置10min。

(12)用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次。

(13)20℃ 12,000r/min离心5min，取上相400μl至另一1.5ml离心管中。

(14)加入20μl 3mol/LNaAc(pH5.2)、420μl异丙醇，混匀后，室温放置5min。

(15)4℃12,000r/min条件下离心5min，去上清液，沉淀用1ml 70％乙醇洗一遍，干燥后溶于 50μlTE(pH8.0)中，存于4℃。

(16)DNA紫外分析：取4μl DNA原液加入到400μl TE(pH8.0)缓冲液中，混匀后，用DU-70 紫外分光光度计测定260nm、280nm处吸收值，并计算DNA原液浓度。

·DNA提取缓冲液

500mmol/L NaCl

50mmol/LTris·Cl(pH 8.0)

50mmol/L EDTA

1％(v/v)βMet

·TE缓冲液：10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)

·RNase A：将RNase A溶于10mmol/L Tris·Cl pH7.5，15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml

的浓度，沸水加热15min后，使其缓缓冷却至室温，分装成小份存于-20℃。

1.2.1.2 引物设计：根据DRM基因的mRNA序列设计，为构建载体的方便，设计了两个酶切位 点：XbaI和BamHI。

DRMP1：5`-ACT TCTAGAATGGGCCTCCTCGACCAGTT-3`

               XbaI

DRMP2：5`-ACT GGATCCTCACACATCGAAAGGAGAAG-3`

               BamHI

1.2.1.3 PCR扩增：在0.2ml的离心管中分别加入以下成分：

        ddH2O                              31.5μl

        10X PCR缓冲液                       5.0μl

        25mM dNTP                           5.0μl

        P1(10mM)                            1.0μl

        P2(10mM)                            1.0μl

        25mM MgCl2                         5.0μl

        DNA模板                             1.0μl

混匀后，在94℃预变性3min后，加入0.5μl Taq DNA聚合酶进行PCR反应。反应参数为94℃变 性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后在72℃继续延伸10min，4℃保存。

1.2.1.4PCR产物的回收：PCR扩增产物的回收采用QIAquick Gel Extraction Kit，操作按说明书 进行；

(1)10μl PCR扩增反应液进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，2V/cm恒电压条件下电泳30min。紫外 灯下切下含目的片段的琼脂糖块，并转移至一1.5ml离心管中；

(2)加入3倍体积的QG缓冲液，50℃水浴保温10min将琼脂糖凝胶完全溶解；

(3)溶解液转移至QIAquick离心柱；

(4)2,000rpm/min，25℃离心1min；

(5)去除离心管中的液体，加入0.75ml PE缓冲液至QIAquick离心柱；

(6)12,000r/min，25℃离心1min；

(7)去除离心管中的液体，25℃12,000rpm/min条件下离心1min；

(8)加入30μl EB缓冲液至离心柱的膜上，将离心柱置于一个灭过菌的1.5ml离心管中，12,000 r/min，25℃离心1min；

(9)取1.0μl离心收集的回收液，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，估算目的DNA片段浓度。

1.2.1.5目的片段的克隆：按宝生物公司提供的方法，将PCR扩增片段与pUC18-T Vertor连接。 向0.5ml的无菌离心管中加入：

    10×T4DNA连接酶Buffer        2.0μl

    pUC18-T Vector DNA           1.0μl

    PCR回收产物                  4.0μl

    T4DNA连接酶(3U/ul)           1.0μl

    ddH2O                       12.0μl

    Total                        20.0μl

充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。

1.2.1.6E.coli DH5α感受态细胞的制备：

(1)从LB琼脂平板上挑取E.coli DH5α单菌落，接种到10ml不含抗生素的LB液体培养基中， 37℃，300rpm振荡培养过夜。次日按照1％(V/V)的量转入新鲜LB液体培养基中，37℃振荡 培养至OD600在0.3-0.4之间；

(2)将50-100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，于冰上放置30min；

(3)4℃、6000rpm离心3min，去上清液；

(4)向每个离心管中各加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬菌体，冰浴30min；

(5)4℃，6000rpm离心3min；去上清液，再将菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/LiCl溶液中，即为 感受态细胞。于4℃冰箱保存，一周内使用。

1.2.1.7连接产物的转化：

(1)用无菌吸头取100μl感受态细胞置1.5ml预冷的无菌离心管中，加入5μl连接反应液，轻 轻混匀，立即置冰上30min；

(2)将管置42℃恒温水浴中热激90s；

(3)放回冰上3-5min；

(4)加入800μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养45-60min；

(5)制备LB附加100μg/ml氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的固体平板；

(6)取200μl菌液与4μl IPTG及16μl X-gal混匀；

(7)用无菌吸头蒋混合液移至LB平板上，再用无菌三角头玻棒蒋菌液均匀涂满整个平板表面；

(8)平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿，于37℃培养12-16h，LB培养基：

            酵母抽提物(Yeast Extract) (5g/L)

            蛋白胨(Tryptone)          (10g/L)

            NaCl                     (10g/L)

加900ml蒸馏水溶解，用NaOH调节pH值至7.0，再定容到1,000ml，分装后，121℃灭菌20min。

·X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：用二甲基甲酰胺将X-Gal配制成50mg/ml的 溶液，黑纸包裹后，存于-20℃。

·IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)：用蒸馏水将IPTG配制成200mg/ml的溶液，通过 0.22μm的一次性滤器过滤除菌，分装后，贮存在-20℃备用。

1.2.1.8质粒DNA的小量提取：

(1)用无菌牙签从LB平板上挑取白色单菌落并分别接种到盛有含Amp(100μg/ml)3ml LB培养 基(含Amp 100μg/ml)的试管中。

(2)37℃300r/min条件下连续振荡培养8～10h。

(3)分别转移1.4ml左右培养物至1.5ml离心管中。

(4)12,000r/min，4℃离心30s至60s。

(5)尽可能将上清倒尽，5,000r/min再离心数秒将残液收集到管底(沉淀物在转子中的位置应 与前一次离心时一致)，并用取液器将残液吸尽。

(6)加入200μl溶液I，振荡涡旋将细胞沉淀物彻底重悬。

(7)加入200μl溶液II，盖紧管盖并颠倒3～4次至溶液呈透明粘稠状。

(8)加入200μl溶液III，盖紧管盖，颠倒数次至白色絮状沉淀呈均匀分散状。

(9)12,000r/min，4℃离心5min。

(10)转移400μl上清液，并用1ml无水乙醇沉淀质粒DNA。

(11)12,000r/min，4℃离心5min，去上清液，沉淀物用1ml 70％乙醇洗涤一遍，再稍离心， 将残液吸尽。

(12)干燥后，用50μl ddH2O将质粒溶解备用。

·Solution I：50mmol/L Tris·HCl，pH7.510mmol/L EDTA，100μg/ml RNase A

·Solution II：0.2mol/L NaOH，1％SDS

·Solution III：1.322mol/L KAc，pH4.8

1.2.1.9重组子的酶切鉴定

(1)在一0.5ml离心管中，依次混入下列各组分：

    10×BufferM                          5.0μl

    质粒DNA                              5.0μl

    ddH2O                               38.0μl

    XbaI                                 2.5μl

    BamHI                                2.5μl

    Total                                50.0μl

(2)混匀后，稍离心，37℃温育30-60min。然后取5.0μl酶切反应液进行1.2％琼脂糖凝胶电泳， 并以PCR标准分子量做对照。5V/cm恒压条件下电泳30min后，于紫外灯下观察。

1.2.1.10DNA序列测定与分析：挑取的阳性克隆进行DNA序列测定，测序由上海生物工程公司 完成。

1.2.2pPOD/DRM植物表达载体的构建：

1.2.2.1目的片段的酶切及回收：用XbaI和BamHI双酶切将DRM从克隆载体上切下，插入到经 同样酶切的植物表达载体pPOD，构建带有DRM基因的植物表达载体pPOD/DRM。酶切反 应体系及步骤，酶切产物的回收步骤同上。

1.2.2.2连接反应，连接用宝生物公司T4DNA连接酶，体系如下：

    DRM片段            10μl

    Ppod片段           5μl

    T4DNA连接酶        1μl

    10×Buffer         2.5μl

    ddH2O             6.5μl

    Total              25μl

充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃水浴16-18h。

1.2.2.3pPOD/DRM植物表达载体的鉴定：

将上述连接产物转化大肠杆菌然后用PCR法筛选转化子，将此转化子再用XbaI和BamHI 双酶切进行酶切鉴定，如图12所示，所切下的片断与预期结果相符，说明构建正确。

2.3三亲交配法转化农杆菌：

2.2.3.1三亲交配

(1)将保存的菌株接种在加有利福平(Rif)25μg/mL链霉素(str)25μg/mL的10ml的LB液体培养基中， 28℃，200rpm振荡培养24h；

(2)从保存的辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素LB液体培养基 中，37℃，250rpm振荡培养8h；

(3)从保存的中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素LB液体培养基中，37℃， 250rpm振荡培养8h.；

(4)分别取以上三种细菌培养物50μl于1.5离心管中混匀，取50μl涂布于不含抗生素的LB固体培养 基上，28℃，培养2-3天；

(5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kanμg/ml，Str25ug/ml和Rif25μg/ml的LB平板上，28℃ 培养过夜；同时各取1，2，3步骤中的菌液50μl分别涂布于含有三种抗生素的LB平板，作为对 照。

2.2.3.2农杆菌质粒的提取：为了检测外源基因是否转移到农杆菌中，采用PCR检测。

(1)从含有植物表达载体的农杆菌三抗LB平板上挑取一个单菌落，接入含有Kan 50μg/ml，Str 25 μg/ml和Rif 25μg/ml的50ml LB液体培养基的100ml的三角瓶，28℃，200rpm振荡培养24h；

(2)取1.5ml菌液置2ml离心管中，4000rpm离心10min，重复3次收集菌液；

(3)用STE溶液洗涤菌体2次；

(4)加入0.4ml溶液I，涡混悬浮细菌，室温放置10min；

(5)加入0.8ml新配制的溶液II，颠倒离心管数次，室温放置10min；

(6)加入0.4ml溶液III，轻颠倒离心管数次，使酚和内容物混匀；

(7)加入0.2ml 3mol/L乙酸钠，轻颠倒离心管数次，冰浴中放置5min；

(8)1000rpm离心5min，将上清液转入一个新离心管中，加入2倍体积冰冷的95％乙醇，-20℃放置 1h；

(9)1000rpm离心5min，弃掉上清液；

(10)向沉淀中加入0.5ml 0.3mol/L醋酸钠溶解沉淀，加入1.0ml无水乙醇，颠倒离心管数次，-20℃ 放置1h；

(11)1000rpm离心5min，轻轻去掉上清液，离心管口向下，用无菌滤纸吸去管壁液滴；

(12)加入1ml70％乙醇漂洗沉淀，快速吹干；

(13)用无菌双蒸水溶解沉淀，加入2ulRNase，37℃放置7h。

2.2.3.3重组子的PCR检测：

PCR反应体系：

    PCR Premix        10.0μl

    DNA质粒           1.0μl

    引物1             0.5μl

    引物2             0.5μl

    ddH2O            18.0μl

    Total             20.0μl

充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底。PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变 性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃保温10min。取10μl PCR产物进 行1.0％琼脂糖凝胶电泳，并以PCR标准分子量做对照。5V/cm恒压条件下电泳30min后，于紫 外灯下观察。

2.2.4农杆菌介导烟草的遗传转化：

2.2.4.1烟草无菌苗的培养：先用70％的乙醇浸泡K326烟草种子2min，再用15％的次氯酸钠浸泡 20min，期间要不断的搅动。用无菌水冲洗4-5遍播种于MS培养基上，28℃暗培养3-5 待种子开始萌发移至光照培养箱继续生长。一个月后取叶子为试验材料。

2.2.4.2农杆菌侵染液的制备：从培养平板挑取EHA105/pBI121/ADF4单菌落，接种到LB+50 μg/ml Kan+25μg/ml Str+25μg/ml Rif的液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养至对 数期(OD600值约0.5)，3000rpm离心10min后，取沉淀用等体积的MS培养基悬浮。

2.2.4.3叶盘转化法：

(1)将剪取0.5cm叶片浸入菌液5min后，用无菌滤纸吸干后转移到MS+2.0mg/L BA培养基上。

(2)侵染过的叶盘接种在分化培养基MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA，在28℃黑暗条件培养3d。

(3)经过共培养的叶盘转移到加有选择压培养基MS+0.05mg/L IAA+2.0mg/L BA+600mg/L Cef+100mg/LKan，大约15-20d继代一次，继代两次诱导出不定芽。

(4)待不定芽长到2-3cm长时，用解剖刀切下，转到伸长培养基上MS+0.5mg/L BA+600mg/Lcef +100mg/LKan，两周更换一次新鲜的伸长培养基，筛选培养2-3代，淘汰白化苗及畸形苗。

(5)选着形态正常、生长旺盛的抗性苗，转入生根培养基MS+0.2mg/L IAA+600mg/L Cef+ 100mg/L Kan上培养。

(6)待根系形成后取出小苗，在自来水洗净根上的琼脂，移入沙盆室温中培养。 MS培养基：

大量元素：KNO3 283mg/l，(NH4)NO3 463mg/l，KH2PO4 400mg/l，MgSO4.7H2O 185mg/l，CaCl2H2O166mg/l

微量元素：MnSO4.H2O 76mg/l，H3BO4 300mg/l，ZnSO4.7H2O 200mg/l，NaMoO4.7H2O 2.5mg/l， CuSO4.5H2O 2.5mg/l，CoCl2.6H2O 2.5mg/l，KI 7.5mg/l

有机物：盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醛(B6)1mg/l，烟酸1mg/l，肌醇100mg/l

铁盐：FeSO4·7H2O 2.78mg/l，Na2-EDTA 37.25mg/l

琼脂粉：6.4g/L

蔗糖：30g/L

图2-图8是其他几个片段PCR扩增及构建过程的图片。

SPS基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草：

(植物材料：拟南芥)

(1)引物：SPS1：ACTTCTAGA GAAACGAGCACACAACTCAC

         SPS2：ACTGGATCC CGTCGAAACACATCACAGAG

(2)PCR反应体系及条件：在0.2mL离心管中分别加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板 DNA 1μL，P1 2μL，P2 2μL，反应总体积为50μL。反应条件为：5个循环(94℃，5min；94℃， 30sec；50，30sec；72℃，120sec)→30个循环(94℃，30sec；65℃，30min；72℃，120sec)→ 72℃，10min→4℃.

PSA基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草：

(植物材料：烟草)

(1)引物：PSA1：AGCAATCTAGAAAATGAGTAGAGGC

         PSA2：ATAGGATCCTGATAGCGAACATACATTTC

(2)模板：因为从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中检测到的PSA基因是其mRNA序列， 引物设计也是根据RNA序列设计的，但是该基因内部有一段很长的内含子序列，所以我们先提 取烟草的RNA，然后反转录得到其cDNA序列，用cDNA序列作为模板得到了PSA基因。以下 是对这个过程的详细说明：

PSA基因-cDNA：

转基因植株的RNA提取，采用异硫氰酸胍法：

(1)向50ml离心管中加入10ml异硫氰酸胍溶液，放置冰上于预冷；

(2)取1g新鲜幼嫩叶子放在研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末；

(3)将粉末全部转入冰上预冷的加入10ml异硫氰酸胍溶液离心管，振荡离心管混合均匀，将离心 管放置冰上；

(4)加入2mol/LNaAc 1ml、水饱和酚10ml和氯仿/异戊醇(24∶1)2ml，每加一种试剂，轻轻摇晃 离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，颠倒几次混合均匀，冰浴15min；

(5)4℃，12000rpm 30min，将上层液转移到一个干净的离心管中，用水饱和酚反复抽提三次；

(6)将上层水相转移到一个干净的离心管中，向管中加入等体积的异丙醇，混匀，放置-20冰冻 1h；

(7)4℃，12000rpm 30min，小心去除上清液，沉淀溶于3M异硫氰酸胍溶液，在加入等体积的异丙 醇，混匀，放置-20冰冻1h；

(8)沉淀用70％乙醇洗涤一遍，在超净台吹干，溶于适量体积甲酰胺，-20℃低温保存；

(11)行含有甲醛变性电泳胶，检测RNA的完整性，调整转基因植株和对照的RNA浓度一致；

异硫氰酸胍溶液：4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸 钠，0.1mol/L巯基乙醇；2mol/LNaCl(pH4.0)，用经DEPC处理过的水配制，高压灭菌。水饱和 酚(pH3.5)

反转录反应按大连宝生物工程有限公司反转录试剂盒说明书进行。

(1)在-0.5ml离心管加入1μg的RNA(溶于11μl的DEPC处理的水中)，再加入1μl的oligdT15；

(2)70℃加热10min后，冰上冷却1min以上；

(3)在离心管中依此加入以下成分：

10×PCR缓冲液                2μl

25mM MgCl2                  2μl

0.1MDTT                      2μl

10mM dNTP                    1μl

(4)42℃加热5min后，加入1μlAMV反转录酶，42℃反应50min；

(5)70℃加热15min，冰上冷却；

(6)反应混合物于-20℃保存；

反应结束后得到的cDNA可用于后面的PCR扩增。

(3)PCR反应体系及条件在0.2mL离心管中分别加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板CDNA 1μL，P1 2μL，P2 2μL，反应总体积为50)μL。反应条件为：5个循环(94℃，5min；94℃，30sec； 50℃，30sec；72℃，60sec)→30个循环(94℃，30sec；60℃，30min；72℃，120sec)→72℃，10min →4℃。

POD基因的克隆、植物表达载体构建及转化烟草

(植物材料：烟草)

(1)引物：POD1：5′AACCATAGTCACATCTATGGCTAGCAC  3′

         POD2：5′ATGGCTAGCACTAGAATAACGATAAAC  3′

(2)PCR反应体系及条件在0.2mL离心管中分别加入ddH2O 20μL，PCR premix 25μL，模板DNA 1μL，P1 2μL，P2 2μL，反应总体积为50μL。反应条件为：5个循环(94℃，5min；94℃，30 sec；50℃，30sec；72℃，2min)→30个循环(94℃，30sec；68℃，30min；72℃，2min)→72℃，10min →4℃。