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制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法

阅读:203发布:2020-12-15

专利汇可以提供制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 是对已公开发明 专利 ( 申请 号201110103966.4)“制备和构建抗各种 呼吸道 病毒感染 的重大创新性Ab2β 抗体 库的方法”,更具创造性的全方位补充。本发明 说明书 对外表明,作为世界首创项目具有完全的可行性和重大用途,否定本发明即否定现代免疫学和相应大自然规律。而且通过 权利要求 书囊括任何衍生途径的发明专利。本发明五个主要目标:1.实验方案开始,半年内就会有本发明关键产品,立即向全世界各大国申请发明专利,保护主要技术控制世界市场。2.同时伴随试验附加产品:筛选特异性抗人 肺 肿瘤 细胞的抗体。3.一年半时间内构建多个不同用途的Ab2β抗体库,用于筛选抗各种人类呼吸道病毒特异性中和抗体。4.为工程抗体(三种特异性免疫球蛋白)产业化之路打 基础 。5.其它重要用途。本发明罕见的将如此众多的知识点、难点、技术点、发现和创造点浑然成一体,需辩证全面透彻思维方可理解。,下面是制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法专利的具体信息内容。

1.一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案:包括第一阶段和第二阶段两个主要实验步骤。
第一阶段主要实验步骤:
(1).通过四种不同试验途径制备全方位抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab1抗体):
一方面①.应用不同来源保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞(包括相应永生化细胞),分别免疫大量不同品系(注:包括杂交和野生)的兔子和鼠,从中分别提取兔子和鼠的抗人血清和其纯化的总抗体。然后应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞分别与这些抗人血清和其纯化的总抗体相互作用,接着以人呼吸道上皮细胞吸附其中抗体,即抗人呼吸道上皮细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人呼吸道上皮细胞的抗体称Ab1抗体。②.制备大量不同品系(注:包括杂交和野生)未经免疫的兔子和鼠以及羊等动物血清和从这些动物血清中提取纯化的总抗体。然后应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞分别与这些未经免疫的兔子和鼠以及羊等动物血清和其纯化的总抗体相互作用,接着以人呼吸道上皮细胞吸附其中抗体,即抗人呼吸道上皮细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人呼吸道上皮细胞的抗体称Ab1抗体。③.应用常规免疫学试验技术,从不同品系和羊乳汁中提取纯化总抗体。然后应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞分别与这些从不同品系牛和羊乳汁中提取纯化的总抗体相互作用,接着以人呼吸道上皮细胞吸附其中抗体,即抗人呼吸道上皮细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人呼吸道上皮细胞的抗体称Ab1抗体。④由于这是一条十分特殊的试验途径因此单独阐述:即通过说明书2.1.2途径可得到万人体内全部不同克隆的抗体。首先应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与上述商品化的全部人免疫球蛋白相互作用,并通过常规免疫学实验技术,提取并纯化吸附在人呼吸道上皮细胞的低亲和性和多反应性的天然自身抗体(NAA),即少量的具有天然免疫耐受性质的Ab1抗体。同时全部回收(收集并保留)那些不与上皮细胞相结合的全部人免疫球蛋白。然后再用相应肿瘤细胞与那些不与上皮细胞结合的全部人免疫球蛋白相互作用,从中筛选特异性抗癌抗体。并在吸附特异性抗癌抗体后,最后千万注意再次全部回收和储存那些不与肿瘤细胞相结合的全部人免疫球蛋白以备制备本发明所需的Ab2β抗体。
本发明通过上述四种途径---制备全方位抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗体(本发明称原始Ab1抗体,借以区别第二阶段的人工“Ab1抗体库”)。。
另一方面上述试验衍生的附加产品-----特异性抗相应人肿瘤细胞Ab1抗癌抗体的获得。特别重点指出:本发明在该阶段试验中存在着毫不费的附加产品(抗癌领域方面)-----即应用不同来源保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞完全彻底吸附上述四种途径制备Ab1抗体的试验后,再应用相应人肺肿瘤细胞分别与全部回收(收集并保留)没有结合上皮细胞后所剩下的其它全部抗体相互作用。,接着以相应人肺肿瘤细胞吸附其中抗体,即抗人肺肿瘤细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人肺肿瘤细胞抗体,称特异性Ab1抗癌抗体。有充分理论依据说明:本发明已经是尽可能最大限度集中人和动物众群体免疫系统的综合力量,并以求获得最大程度免疫识别广度和深度的优势效应,即众多不同的“自我”与“非我”免疫识别体系,以此克服个体免疫识别盲区(如有充分理论依据说明鼠源单克隆抗体免疫识别能力十分有限,而且由于遗传因素影响每一个体淋巴细胞库的库容量都是既有限度又有差异,另外个体免疫系统胚胎发育期因先天免疫耐受造成T细胞库和B细胞库漏洞……等众多原因),用以识别人呼吸道上皮细胞与相应肿瘤细胞之间的微细差异(注:这本身就是辩证思维相对论指导下事物两面性和整体与局部相互作用的大局观念)。因此通过本阶段该方法获得的抗癌抗体比之目前任何方法获得的抗癌抗体在精准性识别肿瘤细胞方面都会更加可靠和更具有可行性。(注:一般规律是应用同一个体具有共同起源的人呼吸道上皮细胞和相应人肿瘤细胞从事上述试验的,这种试验准确度高。如同一个体肺癌手术切除术后,分离被切除肿瘤组织中的新鲜正常细胞和新鲜肿瘤细胞)
(2).全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab2β抗体)的制备:
一方面①.首先通过以下三种不同途径,分别获得大量不同来源的不同人群的不同个体和不同种系的不同动物(注:包括杂交和野生)以及其它不同来源的总抗体。第一途径:
应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人血清和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物血清中的总抗体。第二途径:应用常规免疫学实验技术,分别从牛和羊或人乳汁中提取纯化总抗体。第三途径:购买正规市场各种不同来源的商品化人体免疫球蛋白,即通过(1)……④……途径全部回收(收集并储存)那些不与人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞相结合的所有剩下的全部人免疫球蛋白,这才是本发明制备人源性Ab2β抗体所需总抗体的最佳途径。本发明通过上述三种途径可分别获得大量不同来源未经免疫的人和动物的总抗体(注:内含潜在的本发明所需的“Ab2β抗体”)。②专一筛选结合Ab1抗体抗原结合位点的Ab2β抗体:首先通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,分别巧妙处理第一阶段(2)……①……通过上述三种途径获得大量不同来源未经免疫的人和动物的总抗体(注:内含潜在的本发明所需的Ab2β抗体)与第一阶段(1)……制备的全方位抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗体,关键在于解决两者之间相互作用关系问题。即通过本发明独创性免疫试验技术,分别从第一阶段(2)……①……经三种途径获得的大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体中,完全彻底清除掉与全部Ab1抗体本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的抗体,辩证思维就是指完全彻底清除掉那些专与Ab1抗体(非抗原结合部位)本身其它表位相结合的抗体。经过本发明这种独创性特殊筛选技术和过程,唯一目的是全部回收(收集和储存)其它与本发明相关的抗体(注:
内含潜在的本发明所需的Ab2β抗体)。然后应用常规免疫学实验技术如免疫亲和纯化技术:第一步,将纯化的Ab1抗体与固相基质共价连接,制备Ab1抗体亲和层析柱。第二步,在(2)……①和②……试验过程,即已经完全彻底清除掉与Ab1抗体(非抗原结合部位)的本身其它表位相结合的无关抗体后,把全部回收(收集和储存)的其它与本发明相关的总抗体,分别与Ab1抗体亲和层析柱相互作用,唯一目标是特异性筛选结合到Ab1抗体本身的抗原结合部位的抗体,即本发明所需的Ab2β抗体。第三步,从层析柱上洗脱Ab2β抗体。如此经过免疫亲和纯化技术,分别提取纯化来自人源和动物源的不同的Ab2β抗体。
另一方面上述试验衍生的附加产品-------模拟人相应肺肿瘤细胞膜表面特有抗原表位抗体(Ab2β抗体)的获得,整个试验过程和应用技术完全同第一阶段(2).全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab2β抗体)的制备试验过程和应用技术,因此不再重复阐述。制备的模拟人相应肺肿瘤细胞膜表面特有抗原表位的Ab2β抗体,同样可通过下面第二阶段主要实验步骤的整个试验过程和应用技术,获得“Ab1抗癌抗体”产生细胞。并可通过转基因动物或通过细胞工程抗体技术和基因工程抗体技术制备工程抗癌抗体,最终走向工程抗癌抗体产业化之路。由于本发明目标和实验方案时间有限,故对抗癌抗体的制备在此简单陈述,并在第二阶段主要实验步骤不再阐述这种附加产品。
(3)竞争抑制试验
应用各种常规免疫学实验技术:根据竞争抑制试验,观察Ab2β抗体竞争抑制人呼吸道上皮细胞与Ab1抗体结合的能力,特别是能否全方位阻断人呼吸道上皮细胞与Ab1抗体的结合能力(同时设置人呼吸道上皮细胞与Ab1抗体结合的对照组),以此判断本发明全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab2β抗体是否还存在“克隆漏洞”,本发明可完全通过简单的特异性试验弥补这种“克隆漏洞”。
(4).检测Ab2β抗体与引起普通感冒的各种病毒和流感疫苗相互作用
经过(2).全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab2β抗体)的制备:过程,获得的全部Ab2β抗体,其实质就是一个简单的、不同的、初级的Ab2β抗体库。可以肯定此阶段尽管抗体库中每一单个克隆的抗体数量不会很多,但足以应对试验所需。
本发明从安全度出发,通过常规免疫学实验技术,检测Ab2β抗体与引起普通感冒的各种病毒和流感减毒活疫苗以及灭活疫苗相互作用。即通过不同技术手段检测Ab2β抗体与病毒和疫苗特异性结合的功能和效果。确证试验成功的最重要标志是:“Ab2β抗体库”与各种引发普通感冒的病毒和各种流感特定疫苗特异性结合的范围越广说明成功率越高(设置巧妙的试验对照组),同时说明本发明“Ab2β抗体库”构建越完善。如果与上述病毒和疫苗特异性结合的成功率达到百分之百,则意味着本发明“Ab2β抗体库”与未知和变异的致命性呼吸道病毒特异性结合的成功率也会极高。当然本发明“Ab2β抗体库”会进.一步完善。
(5).Ab2β抗体与引起普通感冒的特定病毒中和试验
如果针对某一特定病毒的特异性Ab2β抗体数量足够多的话,或者通过“追踪溯源”再次提取纯化该抗体,以便进行相应病毒中和试验。
(6).确证试验证实本发明筛选到特异性抗病毒抗体,表明第一阶段(时间3-6个月)试验成功结束。
(7)预期产品:
①制备具有不同功能和用途的全部原始Ab1抗体和相对应的全部原始Ab2β抗体。
②本实验方案可毫不费力的极可能同时获得抗相应人肺肿瘤细胞的特异性抗癌抗体。
(8).立即向世界各大国申请发明专利,在全世界控制实验方法和主要技术及场......第二阶段主要实验步骤:
(1).制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”:
①.专一筛选能够结合Ab2β抗体本身抗原结合位点的B细胞:
第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物的B细胞-------主要是未经过免疫的B细胞和第一阶段经过多次免疫后纯化并储存的兔子及鼠的B细胞,其中包括不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。第二步试验:通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,分别巧妙处理上述第一步试验获得的兔子、鼠、羊等动物的B细胞和第一阶段获得的全部Ab2β抗体,关键在于解决B细胞和Ab2β抗体两者之间相互作用关系问题。即通过本发明独创性免疫试验技术,从这些B细胞中完全彻底清除掉与全部Ab2β抗体本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的B细胞,辩证思维就是指完全彻底清除掉那些专门与Ab2β抗体(非抗原结合部位)本身其它表位相结合的B细胞。经过本发明这种独创性特殊筛选技术和过程,唯一目的是全部回收(收集和保留)所有剩下的其它与本发明相关的B细胞(注:内含潜在的本发明所需的Ab1抗体产生细胞)。第三步试验:即将第二步试验……全部回收(收集和保留)所有剩下的其它与本发明相关的B细胞并和全部Ab2β抗体分别分类进行相互作用,再通过流式细胞术(FCM)或结合免疫磁性微珠技术,可更多更快的筛选出专一结合Ab2β抗体本身的抗原结合部位的特异性B细胞,即本发明所需的Ab1抗体产生细胞。
②.制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”的方法和技术:
首先将能够与Ab2β抗体本身的抗原结合部位特异性结合的B细胞,进行体外培养并在不同刺激条件下,在特定的不同时间内,通过两条途径:第一途径,将体外培养的B细胞(增值为目的),通过构建噬菌体抗体库技术的两种不同方式:其一为主要方式,即B细胞内PCR(In-CellPCR)装配技术--噬菌体抗体库技术,以保证抗体的轻重链配对为体内原始配对的前提下,制备噬菌体Ab1抗体(注:本发明不排除伴随细胞内PCR(In-CellPCR)技术--噬菌体抗体库技术的不断进步,解决经多次免疫产生的千差万别不同克隆的记忆性B细胞,最重要“通用引物”设计的困难问题,制备轻重链配对为体内原始配对的噬菌体Ab1抗体)。其二,即通常的构建噬菌体抗体库技术,,尽管这种方式获得的抗体基因是体外的随机组合。但由于抗体和抗原结合的特异性常主要由VH决定,所以本发明全部特异性B细胞(Ab1抗体产生细胞)可在不改变特异性的情况下,使其每一个特异性的VH与本发明特异性B细胞不同的VL进行组合(链替换),产生特异性相同而亲和力不同的Ab1抗体(注:不排除某些VH与VL因空间结构互补性差和稳定性差等原因导致配对失败)。因此本发明可在不改变每一个B细胞克隆特异性的情况下找到VH---VL最佳配对,反而更可能筛选到高亲和力的Ab1抗体。或许由于类似免疫抗体库的原因,但本发明比免疫抗体库更具优越性和保障性,即全部由特异性B细胞克隆组成,如果数量足够大而且VH---VL互补性强空间结构十分稳定,这会使原始抗体轻链和重链配对极易被恢复,反而不会导致高亲和力原始Ab1抗体丢失。本发明通过这两种不同方式(注:关注通用引物和简并引物使用的方法)制备噬菌体“Ab1抗体库”(注:需要和具体试验操作者协商,选择最适合本发明的方法和技术)。
第二途径根据用途不同:其一,将体外培养的B细胞(生产抗体为目的),通过转化为抗体分泌浆细胞,获得分泌性Ab1抗体(该途径虽获得的每一单个克隆抗体的数量较少,但足够试验所用),制备原始特异性“Ab1抗体库”。其二,将体外培养的B细胞(增值为目的),作为抗原储存(注:每个B细胞膜表面有1万-10万个BCR抗原分子,而且BCR排列方向一致都易接近,区别抗体作为免疫原)以备免疫不同品系兔子和鼠制备Ab2β抗体和获取Ab2β抗体产生细胞。
通过这两条途径尽可能获得抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的全部“Ab1抗体”,并以此制备和构建初级具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”:
(2).构建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”
①.专一筛选能够结合Ab1抗体抗原结合位点的B细胞:
第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子以及鼠的B细胞(包括未经过免疫和经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞)。其中含有第二阶段(1)……②……其二,将体外培养的B细胞(增值为目的),作为抗原(注:每个B细胞膜表面有1万-10万个BCR抗原分子,而且BCR排列方向一致都易接近,区别抗体作为免疫原)免疫不同品系兔子和鼠,并提取纯化经过免疫的B细胞(注:其免疫血清内含相应Ab2β抗体,可通过第一阶段制备的特异性Ab1抗体筛选出来,制备原始Ab2β抗体)。另外本试验重复指出:通过说明书2.1实验主要材料2.1.1途径……可获得内含专一针对和模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的特异性B细胞可达几十万至百万不同克隆,而且已注意到B细胞和抗原都会出现重复计算。其中必然会得到本发明所需的全部模拟各种已知和未知或变异的呼吸道上皮细胞表面病毒受体(如呼吸道以有包膜病毒为主,其受体表达十分丰富)的,具有较高亲和力的众多不同克隆的Ab2β抗体,这是本发明构建人源性“Ab2β抗体库”的最佳途径。第二步试验:
通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,分别巧妙处理第一步试验获得的人和兔子以及鼠的B细胞与第一阶段获得的全部Ab1抗体,关键在于解决B细胞与Ab1抗体两者之间相互作用关系问题。即通过本发明独创性免疫试验技术,从这些B细胞中完全彻底清除掉与Ab1抗体本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的B细胞,辩证思维就是指完全彻底清除掉那些专门与Ab1抗体(非抗原结合部位)本身其它表位相结合的B细胞。经过本发明这种独创性特殊筛选技术和过程,唯一目的是全部回收(收集和保留)所有剩余的其它与本发明相关的B细胞(注:内含潜在的本发明所需的Ab2β抗体产生细胞)。第三步试验:.即将第二步试验……全部回收(收集和储存)所有剩余的与本发明相关的B细胞并和全部Ab1抗体分别分类进行相互作用,再通过流式细胞术(FCM)或结合免疫磁性微珠技术,可更多更快的筛选出专一结合Ab1抗体本身的抗原结合部位的特异性B细胞,即本发明所需的Ab2β抗体产生细胞。
②制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”的方法和技术:
首先将能够与Ab1抗体本身的抗原结合部位特异性结合的B细胞,进行体外培养并在不同刺激条件下,在特定的不同时间内,通过两条途径:第一条途径,将体外培养的B细胞(增值为目的),通过构建噬菌体抗体库技术的两种不同方式:其一为主要方式,即通过B细胞内PCR(In-CellPCR)装配技术--噬菌体抗体库技术,以保证抗体的轻重链配对为体内原始配对的前提下,制备噬菌体“Ab2β抗体库”(注:本发明不排除伴随细胞内PCR(In-CellPCR)技术--噬菌体抗体库技术的不断进步,解决经多次免疫产生的千差万别不同克隆的记忆性B细胞,最重要“通用引物”设计的困难问题,制备轻重链配对为体内原始配对的噬菌体Ab2β抗体)。其二,即通常的构建噬菌体抗体库技术,,尽管这种方式获得的抗体基因是体外的随机组合。但由于抗体和抗原结合的特异性常主要由VH决定,所以本发明全部特异性B细胞(Ab2β抗体产生细胞),可在不改变特异性的情况下,使其每一个特异性的VH与本发明特异性B细胞不同的VL进行组合(链替换),产生特异性相同而亲和力不同的Ab2β抗体(注:不排除某些VH与VL因空间结构互补性差和稳定性差等原因导致配对失败)。因此本发明可在不改变每一个B细胞克隆特异性的情况下找到VH---VL最佳配对,反而更可能筛选到高亲和力的Ab2β抗体抗体。或许由于类似免疫抗体库的原因,但本发明比免疫抗体库更具优越性和保障性,即全部由特异性B细胞克隆组成,如果数量足够大而且VH---VL互补性强空间结构十分稳定,这会使原始抗体轻链和重链配对极易被恢复,反而不会导致高亲和力原始Ab2β抗体丢失。本发明通过这两种不同方式(注:关注通用引物和简并引物使用的方法)制备噬菌体“Ab2β抗体库”(注:需要和具体试验操作者协商,选择最适合本发明的方法和技术)。第二条途径,将体外培养的B细胞(生产抗体为目的),通过转化为抗体分泌浆细胞,获得分泌性Ab2β抗体(该途径虽获得的每一单个克隆抗体的数量较少,但足够试验所用),制备原始特异性“Ab2β抗体库”。
通过这两条途径尽可能获得模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的全“Ab2β抗体”,并以此制备和构建初级具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”。
(3)结合试验和竞争抑制试验
应用各种常规免疫学实验技术:(1)根据结合试验,观察来自第二阶段不同途径的噬菌体Ab2β抗体和分泌性Ab2β抗体与第一阶段获得的原始Ab1抗体特异性结合的效果。
(2)根据竞争抑制试验,观察来自第二阶段不同途径的噬菌体Ab2β抗体和分泌性Ab2β抗体竞争抑制人呼吸道上皮细胞与第一阶段获得的原始Ab1抗体结合的能力,特别是能否全方位阻断人呼吸道上皮细胞与原始Ab1抗体的结合能力(同时设置人呼吸道上皮细胞与原始Ab1抗体结合的对照组),以此判断本发明第二阶段获得的全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的“Ab2β抗体库”是否还存在“克隆漏洞”,本发明可通过特异性试验弥补这种“克隆漏洞”,从而完善“Ab2β抗体库”。
(4).验证初级“Ab2β抗体库”的功能和效果:
应用常规免疫学实验技术,利用引起普通感冒的各种病毒和不同流感减毒活疫苗及灭活疫苗等从初级“Ab2β抗体库”中筛选特异性抗体,并提取和纯化这种专一抗特定呼吸道病毒---靶细胞结合位点的抗体,即模拟人呼吸道上皮细胞膜表面“病毒受体”的Ab2β抗体,以此验证初级“Ab2β抗体库”的功能和效果。确证试验成功的最重要标志是:“Ab2β抗体库”与引起普通感冒的各种病毒和不同流感特定疫苗特异性结合的范围越广说明成功率越高(设置巧妙的试验对照组),同时说明本发明“Ab2β抗体库”构建越完善。如果与上述病毒和疫苗特异性结合的成功率达到百分之百,则意味着本发明“Ab2β抗体库”与未知和变异的致命性呼吸道病毒特异性结合的成功率也会极高。当然本发明“Ab2β抗体库”也会越来越完善。
(5).致命性呼吸道病毒中和试验:
应用常规免疫学实验技术,利用某些已知致命性呼吸道病毒或减毒活疫苗等,从初级“Ab2β抗体库”中筛选特异性抗体,并进行致命性病毒中和试验(委托试验),确证特异性Ab2β抗体的功能和效果,制备针对某些特定致命性呼吸道病毒的特异性中和抗体,为工程抗体产业化和商品化产品-----特异性免疫球蛋白打基础
(6).制备和构建多个具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”和“Ab2β”抗体库”根据人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原(如呼吸道以有包膜病毒为主,其受体表达十分丰富)的分布特点以及与Ab1抗体和Ab2β抗体相互作用的特点,通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,可随着第一阶段和第二阶段试验,构建多个具有不同功能和用途的“Ab1抗体库”和多个相对应的“Ab2β抗体库”,用于筛选特异性抗病毒抗体和进行相应
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病毒中和试验。这些抗体库其中抗体克隆库容量估计最大的为10--10。.对比一般抗体
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库10-10 以上库容量,两者在库容总抗体数量相等情况下,本发明抗体库每一个单克隆抗体的数量都在对方每一个单克隆抗体数量的千倍---百万倍以上,因此本发明“Ab2β”抗体库”与呼吸道病毒相互作用,根本就没有淘筛失败的可能性(注:抗体库库容量太大或每个特异性克隆数量太少都会影响筛选效果,因此要有度)。
另外仅从抗原的免疫原性讲,动物源基因工程抗体如ScFv小分子抗体(包括双链和三链ScFv抗体),其免疫原性与经过多次体细胞高频突变和具有种间独特型的人源抗体又有多大区别,本发明认为两者应用临床没有多大区别。
(7)第二阶段试验需要时间12个月-18个月
(8)第二阶段预期产品:制备和构建多个具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”和“Ab2β”抗体库”
(9)第二阶段试验结束后,立即向世界各大国申请发明专利,在全世界控制实验方法和主要技术及市场……
逆向工程设计的两种附加实验方案
事物的两面性理论---Ab1抗体和Ab2抗体分别属于事物的两个面,这一原理对本附加实验方案启迪:即人呼吸道上皮细胞和呼吸道病毒同样分别属于事物的两个面,因此可以通过逆向工程设计两者程序位置互换的实验方案。
(1)把本实验方案中的人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,通过相同的本实验方案全部试验过程,制备抗和模拟病毒配体结合位点的Ab1抗体和Ab2β抗体,如果模拟病毒配体的Ab2β抗体能够特异性结合人呼吸道上皮细胞,说明抗病毒配体结合位点的Ab1抗体,就是本发明所指专一阻断特定呼吸道病毒------人呼吸道上皮细胞结合部位的特异性中和抗体。
(2)把本实验方案中的人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,通过相同的本实验方案全部试验过程制备抗特定病毒Ab1抗体。同时制备抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗体。将两种不同来源的Ab1抗体固定一方,筛选另一方(如利用所谓抗原柱纯化抗体技术)。其中发生特异性结合的抗体分别为模拟病毒受体的抗体和模拟病毒配体的抗体,而模拟病毒受体的抗体就是本发明所指专一阻断特定呼吸道病毒------人呼吸道上皮细胞结合部位的特异性中和抗体。
(3)该逆向工程设计的附加实验方案,不在本次发明的试验范围之内。
最后本发明目标------.市场商品化产品,即走向工程抗体产业化道路(可根据长远和短期目标精心制定规划,选择最合适工艺,)。工程抗体主要包括细胞工程抗体和基因工程抗体。细胞工程抗体,指该技术是在细胞平上进行操作,如人B细胞的EBV转化及融合技术、杂交瘤细胞通过克隆化筛选产生单克隆抗体和转基因动物作为生物反应器通过乳汁获得特异性抗体等各种相关技术和方法。基因工程抗体则指在基因水平上进行操作,把特定编码抗体分子的目的基因,转移至大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达系统,生产目的抗体等各种相关技术和方法。制备三种市场商品化产品----(1)抗未知和变异的呼吸道病毒人体特异性免疫球蛋白或人源化特异性免疫球蛋白。(2)抗各种已知的呼吸道病毒人体特异性免疫球蛋白或人源化特异性免疫球蛋白.。(3)仅抗1--几个已知的特定致命性呼吸道病毒的人体特异性免疫球蛋白或人源化特异性免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第一阶段主要实验步骤:(1).……①.……分别免疫大量不同品系(注:包括杂交和野生)的兔子和鼠,用分别免疫大量其它不同种系的不同动物所代替。(1)……②…….制备大量不同品系(注:包括杂交和野生)未经免疫的兔子、鼠、羊等动物血清和其纯化的总抗体,用制备大量其他种系的未经免疫的不同动物(注:包括杂交和野生)和不同人的血清以及从这些动物和人血清中提取纯化的总抗体所代替。(1)……③……从不同品系牛和羊乳汁中提取纯化总抗体,用人和其他种系的不同动物(注:包括杂交和野生)乳汁中提取纯化的总抗体所代替。
3.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第一阶段主要实验步骤:(1).……①.……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些抗人血清和其纯化的总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与工程抗体库如噬菌体抗体库和核糖体抗体库等各种抗体库相互作用所代替。(1)……②……应用保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞与这些未经免疫的兔子、鼠、羊等动物血清和其纯化的总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与工程抗体库如噬菌体抗体库和核糖体抗体库等各种抗体库相互作用所代替。(1)……③……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些从不同品系牛和羊乳汁中提取纯化总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与工程抗体库如噬菌体抗体库和核糖体抗体库等各种抗体库相互作用所代替。(备注:目前噬菌体抗体库技术和噬菌体随机肽库技术应用的主要障碍在于噬菌体与细胞的非特异性结合,噬菌体似乎与多种细胞有特别亲和力(特别是高亲和力),就会严重限制了应用细胞淘洗法筛选特异性噬菌体抗体和噬菌体多肽的技术。)
4.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第一阶段主要实验步骤:(1)……①.……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些抗人血清和其纯化的总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与各种合成肽库包括生物肽库(如噬菌体肽库)、化学合成肽库和天然肽库相互作用所代替。(1)……①.……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些抗人血清和其纯化的总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与各种化合物库相互作用所代替。(1)……②……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些未经免疫的兔子和鼠以及羊等动物血清和其纯化的总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与各种合成肽库包括生物肽库(如噬菌体肽库)、化学合成肽库和天然肽库相互作用所代替。(1)……②……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些未经免疫的兔子和鼠以及羊等动物血清和其纯化的总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与各种化合物库相互作用所代替。(1)……③……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些从不同品系牛和羊乳汁中提取纯化总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与各种合成肽库包括生物肽库(如噬菌体肽库)、化学合成肽库和天然肽库相互作用所代替。(1)……③……应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与这些从不同品系牛和羊乳汁中提取纯化总抗体相互作用,用应用保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞与各种化合物库相互作用所代替。
5.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第一阶段主要实验步骤:(2)……①……第一途径:应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人血清和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物血清中的总抗体,用分别提取纯化大量其它不同种系的不同动物血清中的总抗体所代替。(2)……①……第二途径:应用常规免疫学实验技术,分别从牛和羊或人乳汁中提取纯化的总抗体,用分别从大量其它不同种系的不同动物乳汁中提取纯化的总抗体所代替。
6.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第一阶段主要实验步骤:(2)……①.……本发明通过上述三种途径可获得大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体,用经过本发明制备的全方位抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的“Ab1抗体”作为抗体疫苗或制备成基因工程疫苗,有区别的分别免疫不同人群的不同个体和大量不同种系的不同动物所获得抗Ab1抗体(抗抗体)血清和其纯化的总抗Ab1抗体(抗抗体)所代替。
(2)…….①……本发明通过上述三种途径可获得大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体,用工程抗体库如噬菌体抗体库和核糖体抗体库等各种抗体库所代替。(2)……①……本发明通过上述三种途径可获得大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体,用各种合成肽库:生物肽库(如噬菌体肽库)、化学合成肽库和天然肽库所代替。(2)……①……本发明通过上述三种途径可获得大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体,用各种化合物库所代替。
7.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第二阶段主要实验步骤:(1).构建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物的B细胞------主要是未经过免疫的B细胞和第一阶段经过多次免疫后纯化并储存的兔子及鼠的B细胞,其中包括不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。用分别提取纯化大量其它不同种系的不同动物的B细胞,其中包括经过免疫和未经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞所代替。(1)……①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物的B细胞------主要是未经过免疫的B细胞和第一阶段经过多次免疫后纯化并储存的兔子及鼠的B细胞,其中包括不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。用工程抗体库如噬菌体抗体库和核糖体抗体库等各种抗体库所代替。(1)……①……第一步试验:第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物B细胞------主要是未经过免疫的B细胞和第一阶段经过多次免疫后纯化并储存的兔子和鼠的B细胞,其中包括不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。用各种合成肽库包括生物肽库(如噬菌体肽库)、化学合成肽库和天然肽库等所代替。(1)……①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠、羊等动物的B细胞,------主要是未经过免疫的B细胞和第一阶段经过多次免疫后纯化并储存的兔子和鼠的B细胞,其中包括不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。用各种化合物库所代替。
(2).构建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子以及鼠的B细胞(包括未经过免疫和经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞),用分别提取纯化大量其它不同种系的不同动物的B细胞(包括经过免疫和未经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞)所代替。(2)……①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子以及鼠的B细胞(包括未经过免疫和经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞),用工程抗体库如噬菌体抗体库和核糖体抗体库等各种抗体库所代替。(2)……①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子以及鼠的B细胞(包括未经过免疫和经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞),用各种合成肽库包括生物肽库(如噬菌体肽库)、化学合成肽库和天然肽库所代替。(2)……①……第一步试验:首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子以及鼠的B细胞(包括未经过免疫和经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞),用各种化合物库所代替。
8.根据权利要求1所诉的一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的第二阶段主要实验步骤:(1).构建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”①.……第三步试验.……再通过流式细胞术(FCM)或结合免疫磁性微珠技术,筛选出专一结合Ab2β抗体本身抗原结合部位的特异性B细胞。用具有类似功能的更先进仪器和技术的荧光激活细胞分类技术和磁性细胞分离术,抑或其它不同原理不同类型更先进的仪器所带来的更精准性细胞分选技术,筛选出专一结Ab2β抗体本身抗原结合部位的特异性B细胞所代替。(2).构建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”①……第三步试验----.再通过流式细胞术(FCM)或结合免疫磁性微珠技术,筛选出专一结合Ab1抗体本身抗原结合部位的特异性B细胞。用具有类似功能的更先进仪器和技术的荧光激活细胞分类技术和磁性细胞分离术,抑或其它不同原理不同类型更先进的仪器所带来的更精准性细胞分选技术,筛选出专一结合Ab1抗体本身抗原结合部位的特异性B细胞所代替。
9.根据权利要求1所诉的.一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的(1)第一阶段和第二阶段试验过程:
所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞,用人类任何器官组织保有天然正确空间结构的正常细胞和任何生物分子所代替。(2)第一阶段和第二阶段试验过程:所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞,用其它不同种系的不同动物的任何器官组织保有天然正确空间结构的正常细胞和任何生物分子所代替。(3).第一阶段和第二阶段试验过程:所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞,用任何保有天然正确空间结构的外源生物性物质(抗原)所代替。
10.根据权利要求1所诉的.一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的(1)第一阶段和第二阶段试验过程:
所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞和呼吸道病毒,用人类任何器官组织保有天然正确空间结构的正常细胞和相对应的病毒所代替。(2)第一阶段和第二阶段试验过程:所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞和呼吸道病毒,用人类任何器官组织保有天然正确空间结构的正常细胞和相对应的病原微生物所代替。(3)第一阶段和第二阶段试验过程:所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞和呼吸道病毒,用人类任何器官组织保有天然正确空间结构的正常细胞和相对应的病原微生物分泌的毒性物质所代替。(4)第一阶段和第二阶段试验过程:所应用的保有天然正确空间结构人呼吸道上皮细胞和呼吸道病毒,用人类任何器官组织保有天然正确空间结构的正常细胞和相对应的外源或内源生物性物质所代替。
11.根据权利要求1所诉的.一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于整个实验方案所诉的(1)第一阶段和第二阶段试验过程,所应用的保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞,用人类任何器官组织保有天然正确空间结构正常细胞和相应肿瘤细胞包括白血病细胞所代替。(2)第一阶段和第二阶段试验过程,所应用的保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞,用其它不同种系的不同动物的任何器官组织保有天然正确空间结构正常细胞和相应肿瘤细胞包括白血病细胞所代替。(3)第一阶段和第二阶段试验过程,所应用的保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞,用人类任何器官组织中任何保有天然正确空间结构的相似细胞(如利用保有天然正确空间结构的CD4+T细胞和CD8+T细胞之间的差异,制备专一抗HIV配体结合位点的Ab2β抗体)或相似分子所代替。(4)第一阶段和第二阶段试验过程,所应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞,用其它不同种系不同动物的任何器官组织中任何保有天然正确空间结构的相似细胞或相似分子所代替。(5)第一阶段和第二阶段试验过程,所应用的保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞,用任何保有天然正确空间结构的相似外源生物性物质(如用于微生物分型)所代替。
12.根据权利要求1所诉的.一种制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗体库的方法,其特征在于逆向工程设计的附加实验方案所诉的全部试验过程,(1)所应用人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,用相同方式把两种相对应的人和动物任何器官组织靶细胞置换成特定病毒或特定疾病减毒活疫苗及灭活疫苗等所代替。(2)所应用人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,用相同方式把两种相对应的人和动物任何器官组织靶细胞置换成特定病原微生物所代替。(3)所应用人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,用相同方式把两种相对应的人和动物任何器官组织靶细胞置换成特定病原微生物分泌的毒性物质所代替。(4)所应用人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,用相同方式以任何两种相对应的外源或内源生物性物质所代替。

说明书全文

制备和构建抗各种已知和未知呼吸道病毒感染的Ab2β抗

体库的方法

[0001] 本发明涉及防治人类呼吸系统任何急性病毒性传染病的特效“新式武器″,即全部由专一阻断病毒——呼吸道靶细胞结合位点的抗体组成的、具有特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”的制备和构建方法(特别涉及本发明独创性免疫学实验技术)。
[0002] 目前呼吸道致命性病毒,如“甲型H1N1流感、非典、禽流感”等病毒或其变异体引起的突发事件对世界各国人民造成了严重危害。其中世界著名“科学”杂志把攻克“病毒变异”做为生命科学领域首选世界难题。对此目前全世界抗病毒研究现状:①无任何特效的抗病毒药。②尚无任何有希望的抗病毒研究计划。
[0003] 在世界抗病毒领域与本发明相关的广谱抗病毒研究中,由美国国家卫生研究所(NIH)提供研究基金,发表在《美国国家科学院院刊》(PNAS)上一种太令人震惊的新技术能消灭所有包膜病毒包括滋病毒其原理:一种化合物(LJ001),能够同时与病毒和被入侵细胞的包膜上的脂质绑定,对两者造成损害的不同之处在于,较大的细胞(与病毒相比)有能修复各种各样定期发生的损害;而病毒则不能,原因在于病毒脂质被LJ001消耗殆尽导致病毒消亡。本发明认为该化合物(LJ001)存在的最大问题是应用到人体上,对免疫系7 8
统功能可能造成巨大危害。如正常人体每天都有10-10 的细胞突变其中的转化细胞,还有大量衰老细胞和正常细胞的凋亡以及细胞碎片等的清除,都与免疫系统(免疫自稳和免疫监视)识别和附着以及摄取......抗原呈递等活动有关,其作用机制就是通过特异性和非特异性胞吞作用,通过识别细胞膜表面改变性质的分子抗原,在内吞过程中卷入大量的质膜,即使对外源性或内源性非膜物质抗原摄取形成吞噬体,也要有免疫细胞自身膜融合而二者合并。如巨噬细胞每小时能内化25%膜性物质,树突状细胞在MHC1类分子呈递的细胞碎片大部分由膜相关材料组成。另外正常细胞分裂过程与上述机制的膜融合过程必有重叠之处,如果该化合物(LJ001)以相同机理对两者(融合和分裂)重叠之处包膜上的脂质绑定,对机体的危害就更大了,这还不算对正常细胞造成的损伤。因此本发明认为仅对正常人体而言,LJ001化合物对包膜病毒的作用在理论上同时阻断和干扰了整个人体的正常生理代谢活动,因此对人可能有剧毒。LJ001化合物或许有类似(敌我不分)抗癌化疗药的作用,但毒副作用恐怕更大。尽管质疑很多但很遗憾只有本发明能够在理论上提出问题所在,并以此提供能够确证LJ001化合物试验应该进行的研究方向。
[0004] 本发明认为LJ001化合物的发现违背了自然界演化规律。原因在于生物体在亿万年进化过程,始终遵循着大自然演化规律。特别是生物体内对“自我”与“非我”具有精准性识别功能(如识别仅一个基酸残基的差异)的双重免役识别体系(注:世界上没有任何物质或体系具有如此精准性识别功能),清除外源或内源异常生物性物质,就充分体现相对论指导下的事物两面性和整体与局部相互作用的自然规律。另外生物体在亿万年演化过程中渐进形成的固有免疫应答,如对病原微生物(尤其是原核生物)表面存在的许多恒定进化保守分子(人体没有)产生的天然免疫,就是进化和自然选择的结果。在如此漫长的生物体演化过程中,多少体内外生物性物质在相互作用,如果真的有很少损伤正常细胞如类似所谓LJ001化合物这种不分“敌我”作用机理的物质,或许早就进化出来了。
[0005] 所以本发明强调要在大自然规律指导下结合相关专业进行发现和创造,否则完全可能是花钱费力白忙活。
[0006] 1.本发明理论依据
[0007] 1.1本发明间接理论依据:
[0008] 1.1.1制备专一阻断病毒入侵靶细胞途径的“最好抗体“的理论依据[0009] 1.1.1.1抗体覆盖理论
[0010] 指抗体覆盖率与中和作用的相关性,如对狂犬病毒的中和,每个毒粒200个以上IgG分子,才能占据其表面结构(表位),使之不能与靶细胞受体相互作用。而对另一个狂犬病毒中和逃逸突变株分析发现,每个毒粒结合1000以上的IgG分子,但仍然不能被中和。
[0011] 1.1.1.2病毒“配体”与靶细胞“病毒受体”的相互作用理论
[0012] 病毒之所以能够吸附于细胞而开始感染,其主要的结构原因是病毒表面结构蛋白的特定
[0013] 位点,能够以特定的拓扑学性质与细胞表面某种受体发生相应结合,该结合使病毒有了借以进入细胞的桥梁。而在病毒感染中,机体产生的抗病毒特异性抗体之所以能够抑制病毒的再感染,一条主要原因就是有的抗体可以用特定的对应结构,与病毒表面与受体发生结合作用的位点结构产生特异结合,从而在拓扑学上阻断病毒与细胞受体的结合,因此终止了病毒对细胞的感染,这样一个自然的机理显然提供了寻找病毒感染治疗药物(注:包括化学药品)的理论基础
[0014] 1.1.1.3抗体与病毒的相互作用理论
[0015] HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一,其头部有5个抗原位点,分别称A、B、C、D和E位点,其中B位点为靶细胞受体结合位点。在研究病毒特别是HIV-细胞间相互作用中发现,除病毒包膜“配体”与靶细胞“病毒受体”间直接接触的氨基酸残基外,其他病毒部位诱生的抗体很难界定是中和性抗体还是非中和性抗体或增强性抗体,原因在于:①能被中和的病毒毒株可突变为对同一抗体具有抗性或被此抗体增强的毒株。②用某一毒株免疫个体产生的抗体可能对该毒株是中和抗体但对其他毒株是增强抗体。③明确只诱导中和抗体而不诱导增强抗体的病毒包膜区是很困难的。最终病毒与抗体相互作用的结果要取决于产生中和性抗体与增强性抗体之比,即两者对病毒总体作用的“净”效应。
[0016] 1.1.1.4结论:抗体中和病毒的关键,是需要找好中和病毒的位置(作用点),而最好的位置就是病毒——靶细胞的结合部位,即病毒“配体”的结合位点,而针对病毒“配体”结合位点的抗体就是最好的抗体。
[0017] 1.1.2制备和构建具有特殊功能和用途“抗体库”的理论依据:
[0018] 1.1.2、1病毒或其变异体入侵人体呼吸道细胞的全部途径
[0019] 任何已知或未知的病毒变异如流感病毒血凝素蛋白上一个氨基酸残基的变化,就可以使病毒与所结合的唾液酸受体类型发生变化。这种变化的实质就是增加入侵呼吸道细胞的新途径,特别指出这种新途径都必须是通过靶细胞表面相对应的“病毒受体”完成的,而“病毒受体”又是呼吸道靶细胞表面已知或未知的膜蛋白分子,(蛋白质组分)。正由于各种不同类型的“病毒受体”在呼吸道靶细胞表面的数量是有限的,所以病毒入侵呼吸道的途径也是有限的,因此可以说任何病毒通过变异产生的新途径都隐藏在这些“病毒受体”中。本项目预期产品——构建具有特殊功能和用途的’抗体库″,其抗体克隆数量包括对应病毒入侵靶细胞全部可能或潜在的入侵途径,这就是本发明项目的大框架
[0020] 1.1.2.2结论:构建阻断病毒入侵呼吸道全部途径的抗体库,可能提供了一种解决未知病毒或变异病毒世界难题的最好途径。
[0021] 1.2本发明的直接理论依据:
[0022] 1.2.1病毒配体——靶细胞“受体”相互作用理论
[0023] 实验证明,病毒感染细胞的前提是与细胞表面的受体相结合,这个结合在反映与结构蛋白的空间构象与受体空间构象之间的生物化学意义上的配构关系之外,在生物意义上则反映了病毒的组织和细胞特异嗜性的现象。如果病毒不能进入细胞,或被阻止于吸附细胞受体之前,则病毒对宿主细胞的影响是极小的,而对病毒——细胞受体的研究正好提供了这样一种可能。仅对本发明而言,正是这样的一种类似正常生理配体与受体结合的细胞生物效应导致病毒进入细胞。更多有关病毒配体——靶细胞“受体”相互作用理论与本发明实验方案之间的重要关系,见实验方案之后的6.本发明说明书和实验方案需要重点说明的几个问题:
[0024] 1.2.2抗体独特型与抗独特型抗体模拟抗原理论
[0025] 数字庞大的Id或AId抗体可以摸拟整个外来抗原世界,这是构建“Ab2β抗体库”的主要理论基础。利用这一理论,特别是通过创造性应用相关理论和免疫学实验技术,就可以制备模拟靶细胞膜表面全部分子的易接触的空间结构,其中包括模拟全部病毒受体的抗体。另外,不管病毒抗原如何千变万化,活的细胞表面病毒受体是不变的,因此本发明模拟靶细胞病毒受体的抗体,就能以“抗体的不变应对病毒抗原的万变”。而且本发明理论上推测,这种抗体本身还可能或多或少预留着可以结合病毒变异氨基酸残基所需的空间位置。而且由于先天免疫耐受的作用,体内高亲和力的自身反应性淋巴细胞被清除或因个体发生早期表现出的独特型缔合性影响,可能有助于其对应面---某些模拟自身的潜在B细胞克隆(包括本发明的某
[0026] 些Ab2β抗体产生细胞)成为优势克隆。本发明所述的Ab1抗体和Ab2抗体,实际上就是指事物的两个面,任何事物都具有互为对应相互作用的两个面,而且在不同生态环境下在动态(差异)的相互作用中保持平衡(度),生物体内不同分子生态环境下的Ab1抗体和Ab2抗体同样遵循该自然规律。
[0027] 1.2.3多态性MHC免疫识别理论
[0028] 多态性MHC的生物学功能和意义,决定了不同品系动物特别是某些品系动物具有更广和更深的免疫识别功能,应用多态性MHC免疫识别理论,同样是为最大限度增加对呼吸道上皮细胞膜表面全部分子易接触空间结构的免疫识别,并以此制备模拟靶细胞全部“潜在病毒受体”的抗体,构建Ab2β抗体库。多态性MHC免疫识别理论同样是构建“Ab2β抗体库”的重要理论基础。
[0029] 1.2.4遗传因素影响不同个体免疫系统形成的理论
[0030] 人体内T和B细胞克隆总数在1012以上,可以表达1012种独具识别特性的抗体分子和T细胞分子,其特点一个细胞(克隆),一种受体,这是免疫系统对抗原进行精准识别的基础。其机理在于每个B细胞所携带Ig基因V.(D).J片断的重排具有随机性和独立性,而每个胸腺细胞TCR基因重排同样是一个完全随机和独立的过程。因此每个BCR和TCR均具有独特的抗原特异性。
[0031] 例如:人免疫球蛋白VH区多样性机理,如包含120个不同的VH片断,根据序列一致性分为(VH1-VH7)共7个家族。每一家族80%以上同源性。VH基因片断组成和数目是高度变化的,人群中没有个体含有同样的VH基因片断,由此形成每个个体所谓的“抗体免疫指纹”。而TCR受遗传因素影响如MHC多态性影响,更是如此。
[0032] 另外,妊娠期间,母体IgG通过胎盘传递到胎儿,与胎儿自身IgM-V区相互识别,对于胎儿免疫系统的发育成熟如选择B细胞群具有重要作用。
[0033] 1.2.5生物体内对“自我”与“非我”具有精准性识别功能的双重免役识别体系的理论
[0034] 有关双重免役识别机制的理论,非常复杂。很遗憾许多文献都不清楚生物体内对“自我”与“非我”的识别是同时进行的,其中伴有“自我”与“非我”识别过程中的能量累积。简单说,就是识别“自我”加上识别“非我”所需的能量大于单纯识别“自我”所需的能量,即其中的能量差被识别,这如同正常体温者手摸发烧者可感知其发热的道理一样。通过对生物体内“自我”与“非我”之间差异的精准性识别(如识别仅一个氨基酸残基的差异)功能,清除外源或内源异常生物性物质。如个体每天对产生大量转化细胞的清除。但本发明指出不同个体的“自我”与“非我”双重免役识别体系的免疫识别功能是各不相同的,这正是本发明最重要的利用之处。
[0035] 1.2.6不同分子生态环境对同一个体或不同个体免疫系统的影响
[0036] 提出这个理论旨在说明仅与本发明相关的认识,即经过特定抗原免疫和未经过特定抗原免疫的同一个体或同一品系动物,除反应性和亲和力以及抗体效价区别之外,未必经过特定抗原免疫的抗血清就是所需抗特定抗原特定表位的抗体(如肿瘤细胞免疫),而且识别抗原表位有限,原因在于优势克隆的作用。那么未经过特定抗原免疫的同一个体或同一品系动物的血清抗体,则可能识别更多抗原表位这也是区别。那么不同分子生态环境针对不同个体免疫系统的影响则更大。其理论丰富而复杂,但其相互作用机制都遵循和符合我们肉眼所见到的大自然演化规律如各种物质(包括人)之间相互作用机制。这就是本发明即采用经过免疫的抗血清又采用未经过免疫的血清的原因。
[0037] 1.3有关本发明自命标题“Ab2β抗体库”的相关理论问题
[0038] 1.3.1本发明提出这个理论问题的目的在于,(1).有的教科书根据Id与抗Id的血清学反应和Ab2功能把Ab2分为α、β、γ和ε四种;也有的教科书直接把Ab2分为Ab2α和Ab2β两种。本发明采用后一种教科书Ab2分型模式,即抗Ab1V区抗原结合部位即互不决定区(CDR)的抗体统称Ab2β抗体,实际包括Ab2β抗体和Ab2γ抗体,原因在于这样可以使本发明说明书标题和内容简单化,易理解不易混淆而且更加说明问题。(2).抗Id抗体模拟抗原的模式包括:高变抗Id区与抗原间的同源性和基于拓扑相似性的模拟。而且结构上的模拟与功能模拟是一致的,如Ab1的相同表面可与两种无关的结构结合,另外模拟的程度也有完全性模拟和部分模拟之分别。(3).针对抗原结合部位的AId抗体称为Ab2γ型,其中有一类抗体能模拟外来抗原(内在影像)称为Ab2β型。(4).Ab2γ型和Ab2β型都能抑制抗原与抗原受体的结合。
[0039] 1.3.2本发明制备的Ab2β抗体模拟人类呼吸道上皮细胞膜表面“病毒受体”既包括结构上的模拟和功能模拟:也包括完全性模拟和部分模拟。总之针对抗原结合部位的AId抗体包括:Ab2γ型和Ab2β型。本发明需要的只是以各种不同结构、不同方式和不同程度模拟“病毒受体”的抗体,只要能够与各种人类呼吸道病毒特异性结合,并且专一阻断呼吸道病毒------靶细胞结合部位的抗体,本发明统称Ab2β抗体,即广义上的Ab2β抗体。对于作为抗原“内影像”(internal image)的功能并不需要,反而是有害的。
[0040] 1.4指导本发明实验方案设计的综合理论
[0041] 本发明涉及关键词:差异、两面性、双重免疫识别、整体和局部等在唯物辨证理论中的应用,唯一目的就是指导本发明在发现和创造中必须遵循大自然规律。首先指出不同人群不同个体和不同种系不同动物免疫系统之间的差异(如MHC多态性和随之带来的淋巴细胞库漏洞以及不同的个体因遗传表达不同的B细胞库和不同的T细胞库等),正是由于不同个体具有不同的免疫识别系统(注:特别强调单指差异不指共有或重叠),本发明则指不同个体的B细胞库和相应抗体库在识别各种各样抗原的克隆之间存在的差异,这导致免疫识别的方向也会出现差异。即不同个体具有不同的对“自我”与“非我”精准性识别功能的免役识别体系,在与体内外不同自然环境(包括分子生态环境)的相互作用中,如人类和动物与病原微生物及肿瘤细胞的相互作用中,决定了人类和动物的进化及生存的某种特定结果,理解差异其实就是理解演化的动力。其生物学功能和意义在于这种差异造就了遗传易感性各不相同的个体。正常情况下,个体死亡或显示较强的生命力并不重要,重要的是,环境改变或某些疾病流行时,总能有一部分个体因有较强的适应能力而生存下来,保证种群不致灭绝。此一时,某一部分个体生存力较强;彼一时,另一部分个体适应好,从而在群体平赋予物种极大的应变能力,以对付多变的环境条件,达到动态中的相对平衡状态,这就是进化和自然选择的结果。因此理解这种差异和其相应免疫应答格局的不同模式,就是理解现代免疫学的精髓和相应自然界生物的演化规律。如对抗疟疾的遗传因素的HLA---B53抗原,经差异性自然选择,使B53的频率由0上升到26.4%(冈比亚)和40%(尼日利亚)。本发明上述论述既是对差异作为动力阐述,同时也是对相对论指导下整体与局部相互作用的自然规律阐述,这种辩证思维在后面还要不断提及。具体到人体内T和B细胞克隆总数
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在10 以上,可以表达10 种独具识别特异性的抗体分子和T细胞分子,而每一个体都可能
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有10 以上表达不同抗原受体的B细胞和T细胞克隆,这就体现了整体与局部的相互作用关系。
[0042] 本发明与目前全世界抗病毒研究相比,在许多方面诸如事物整体观和认识论、多学科交叉指导理论、发明思维、研究方法、技术手段等都是截然相反的,这直接导致不同的发明原理。本发明通过实验方案尽可能最大限度集中人和动物众群体免疫系统的综合力量,即充分利用各不相同的对“自我”与“非我”具有精准性识别功能的免役识别体系,以求获得最大程度免疫识别广度和深度的优势效应,克服个体免疫识别盲区(如有充分理论依据说明小鼠源单克隆抗体免疫识别能力十分有限,而且由于遗传因素影响每一个体淋巴细胞库的库容量都是既有限度又有差异,另外个体免疫系统胚胎发育期因先天免疫耐受造成T细胞库和B细胞库漏洞……等众多原因),用以识别和模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原的不同表位(注:还包括本发明实验方案的附加产品,即识别人呼吸道上皮细胞与相应肿瘤细胞之间微细差异的特异性抗癌抗体)。这正是以唯物辩证法相对论指导下的事物两面性和整体与局部相互作用的思维方式,了解和掌控以及运用这种“差异”所带来的不同免疫反应格局,即尽可能最大限度发挥广义上的众群体免疫识别功能,来弥补个体免疫识别功能的不足,这种与众不同的创造模式奠定了本发明实验方案必然成功的基础。同时也在不客气的说明,如果连这些综合理论都不了解,也就是不了解现代免疫学原理和相应自然规律的关系,如果否定这些理论,也就是否定自然界的规律,。原因在于缺乏辩证思维(注:在免疫学理论和应用研究上把相关研究与相应大自然规律违背或分离的论点屡见不鲜)。这会导致难以应用辩证思维从事物两面性和整体与局部相互作用等自然规律度出发指导和从事免疫学研究,因此往往会得出片面结论。本发明完全遵循现代免疫学原理和自然规律从事相关研究,避免走错路。
[0043] 本发明综合上述理论指导实验方案设计,而且从病毒配体——靶细胞“受体”相互作用理论和抗体独特型与抗独特型抗体模拟抗原理论中导出如下重要结论:①抗靶细胞“病毒受体”的抗体,就是模拟病毒配体的抗体;抗病毒配体的抗体,就是模拟靶细胞“病毒受体”的抗体。②病毒组织嗜性,即组织特异性,决定了呼吸系统主要靶细胞——上皮细胞为本发明的研究对象。本发明采用独创性免疫试验技术,首先制备抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同蛋白分子不同抗原决定簇的抗体。然后再利用这些抗体,制备能够模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同蛋白分子不同表位(注:其中包含潜在病毒受体)的抗体,这就是能够专一阻断任何病毒——靶细胞全部结合位点的抗体。最后由所有这种抗体组成具有特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”。这样就可以随时从库中筛选针对任何引起呼吸系统急性传染病的病毒(包括未知病毒)或其变异体的特异性中和抗体了。
[0044] 2.实验方案
[0045] 本发明实验方案实施前重点说明和提示:(1)本实验方案属于生命科学领域的大工程,整个实验方案的设计和其中的每一步试验,都处在辩证唯物相对论指导下的事物两面性和整体与局部相互作用的大框架下,因此绝对遵循而且绝对符合现代免疫学原理和相7
应大自然规律。(2)一些研究认为构建天然抗体库,库容量10 可覆盖百分之99%自身抗
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原决定基,库容量超过10 可得到相对亲和力较高自身抗体,这种研究对本实验方案设计和试验过程有重要参考价值。(3)本实验方案不标技术路线图,因为会使专业人士的思维固定化和简单化。本实验方案需要全面、透彻、辩证的思维方可真正理解,特此提示。(4)另外有的内容文字重复,也只是为了复读加深记忆和方便理解,特此说明。
[0046] 2.1实验主要材料:
[0047] 如何最大限度的获取更多不同克隆的人B细胞和Ab2β抗体,是本发明构建人源性“Ab2β抗体库”的关键:由于人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位成千上万。而理论依据每1万至10万个B细胞中只有一个针对特定抗原表位的特异性B细胞,以此推算大约需10亿个B细胞,才能筛选出专一识别人呼吸道上皮细胞上万或更多不同表位的特异7 8
性B细胞。实际上每个人大约表达10---10 个不同的B细胞克隆(注:个体间都存在克隆差异),因此仅就个体而言B细胞库克隆数量有限。而人每250ml全血含有1千多万个B细胞。本发明重点关注呼吸道以有包膜病毒为主,其病毒受体在人呼吸道上皮细胞表达十分丰富,这很容易识别。而呼吸道腺病毒和鼻病毒无包膜,其受体或许表达并不十分丰富。但为识别人呼吸道上皮细胞膜表面上万或更多不同抗原表位,其中或许有的抗原浓度很低如每个细胞有1000个抗原分子,因此本实验方案需要大量不同的B细胞克隆,唯一目的就是为了不遗漏对任何呼吸道已知和未知或变异病毒的特异性识别,这本身就是一个最需要解决的重要问题。本发明者发现通过两条极特殊方式可省时省力获得数千人未经过免疫的B细胞克隆途径和上万人体内全部不同抗体克隆的途径。
[0048] 2.1.1据了解很多省市血站或血液中心,把血液通过各种分离机采集红细胞或其它血液成分过程,把其中的白细胞都丢弃了,因此对本发明而言太可惜了。如果通过协商购12
买数千人以上献血者的白细胞,从中提取纯化B细胞可以达到10 以上。天津市属人工操作论单位卖白细胞。如果仅针对人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位为目标,那么专一针对和模拟该目标的特异性B细胞就可达几十万至百万不同克隆(其中已注意到B细胞和抗原都会出现重复计算)。以此制备和构建全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的“Ab2β抗体库”,其中必然会得到本发明所需的全部模拟各种已知和未知或变异的呼吸道上皮细胞表面“病毒受体”的、具有较高亲和力的众多不同克隆的Ab2β抗体,这是本发明构建人源性“Ab2β抗体库”的最佳途径。
[0049] 2.1.2如某厂家商品人免疫球蛋白制法:取健康献血员的新鲜血浆或保存期不超过2年的冻血浆,可从每批最少应由1000名以上健康献血员的血浆混合,用低温乙醇蛋白分离法分段沉淀提取免疫球蛋白组分。本发明如果从不同厂家的不同生产工艺中获得不同的10个批次以上(每个批次购买一些)的人免疫球蛋白,就可得到万人以上体内全部不同克隆的各种类
[0050] 型抗体,而且肯定抗体的不同克隆数量更大于2.1.1……途径B细胞的不同克隆数量。据本发明者粗略推算,每毫升血液约含几亿个抗体分子。本途径可获得的抗体数量和不同克隆的数量如此众多,如果仅以针对人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位为目标,那么专一模拟该目标的特异性抗体可达百万以上不同克隆(其中已注意到抗体和抗原都会出现重复计算),而且每一单个克隆的抗体分子数量也不会少。其中必然会得到本发明所需的全部模拟各种已知和未知或变异的呼吸道上皮细胞表面“病毒受体”的、具有较高亲和力的众多不同克隆的Ab2β抗体,这是本发明制备人源性Ab2β抗体的最佳途径。
[0051] 2.2第一阶段主要实验步骤:
[0052] 2.2.1全方位抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab1抗体)的制备:
[0053] 2.2.1.1通过四种途径(1)应用不同来源保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞(包括相应永生化细胞),分别免疫大量不同品系(注:包括杂交和野生)的兔子和鼠,从中分别提取兔子和鼠的抗人血清和其纯化的总抗体。然后应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞分别与这些抗人血清和其纯化的总抗体相互作用,接着以人呼吸道上皮细胞吸附其中抗体,即抗人呼吸道上皮细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人呼吸道上皮细胞的抗体称Ab1抗体。(2)制备大量不同品系(注:包括杂交和野生)未经免疫的兔子和鼠以及羊等动物血清和从这些动物血清中提取纯化的总抗体。然后应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞分别与这些未经免疫的兔子和鼠以及羊等动物血清和其纯化的总抗体相互作用,接着以人呼吸道上皮细胞吸附其中抗体,即抗人呼吸道上皮细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人呼吸道上皮细胞的抗体称Ab1抗体。(3).应用常规免疫学试验技术,从不同品系和羊乳汁中提取纯化总抗体。然后应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞分别与这些从不同品系牛和羊乳汁中提取纯化的总抗体相互作用,接着以人呼吸道上皮细胞吸附其中抗体,即抗人呼吸道上皮细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人呼吸道上皮细胞的抗体称Ab1抗体。(4)由于这是特殊途径因此单独阐述:通过上述2.1.2途径可得到万人体内全部不同克隆的抗体。首先应用保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞与上述商品化的全部人免疫球蛋白相互作用,并通过常规免疫学实验技术,提取并纯化吸附在人呼吸道上皮细胞的低亲和性和多反应性的天然自身抗体(NAA),即少量的具有天然免疫耐受性质的Ab1抗体。同时全部回收(收集并保留)那些不与上皮细胞相结合的全部人免疫球蛋白。然后再用相应肿瘤细胞与那些不与上皮细胞结合的全部人免疫球蛋白相互作用,从中筛选特异性抗癌抗体。并在吸附特异性抗癌抗体后,最后千万注意再次全部回收和储存那些不与肿瘤细胞相结合的全部人免疫球蛋白以备制备本发明所需的Ab2β抗体。
[0054] 本发明通过上述四种途径------制备全方位抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗体(本发明称原始Ab1抗体,借以区别第二阶段的人工“Ab1抗体库”)。
[0055] 2.2.1.2附加产品-----特异性抗相应人肿瘤细胞Ab1抗癌抗体的获得。特别重点指出:本发明在该阶段试验中存在着毫不费力的附加产品(抗癌领域方面)-----即应用不同来源保有天然正确空间结构的人呼吸道上皮细胞完全彻底吸附上述四种途径制备的Ab1抗体的试验后,再应用相应人肺肿瘤细胞分别与全部回收(收集并保留)没有结合上皮细胞后所剩下的其它全部抗体相互作用。接着以相应人肺肿瘤细胞吸附其中抗体,即抗人肺肿瘤细胞抗体,并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体,本发明把这些专一抗人肺肿瘤细胞抗体,称特异性Ab1抗癌抗体。有充分理论依据说明------本发明已经尽可能最大限度集中人和动物众群体免疫系统的综合力量,以此获得最大程度免疫识别广度和深度的优势效应,即众多不同的“自我”与“非我”免疫识别体系,以此克服个体免疫识别盲区(如有充分理论依据说明鼠源单克隆抗体免疫识别能力十分有限,而且由于遗传因素影响每一个体淋巴细胞库的库容量都是既有限度又有差异,另外个体免疫系统胚胎发育期因先天免疫耐受造成T细胞库和B细胞库漏洞……等众多原因),用以识别人呼吸道上皮细胞与相应肿瘤细胞之间的微细差异(注:这本身就是辩证思维相对论指导下事物两面性和整体与局部相互作用的大局观念)。因此通过本阶段该方法获得的抗癌抗体比之目前任何方法获得的抗癌抗体在精准性识别肿瘤细胞方面都会更加可靠和更具有可行性(注:一般规律是应用同一个体具有共同起源的人呼吸道上皮细胞和相应人肿瘤细胞从事上述试验的,这种试验准确度高。如同一个体肺癌手术切除术后,分离被切除肿瘤组织中的新鲜正常细胞和新鲜肿瘤细胞)。
[0056] 2.2.2全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab2β抗体)的制备:
[0057] 2.2.2.1.(1)首先通过以下三种途径获得大量不同人群的不同个体和不同种系的不同动物(注:包括杂交和野生)以及其它不同来源的总抗体。第一途径:应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人血清和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子、鼠和羊等动物血清中的总抗体(注:未经过免疫)。第二途径:应用常规免疫学实验技术,分别从牛和羊或人乳汁中提取纯化总抗体。第三途径:购买正规市场各种不同来源的商品化人体免疫球蛋白,即通过2.2.1.1……(4)途径……最后千万注意全部回收(收集并储存)那些不与人呼吸道上皮细胞和相应肿瘤细胞相结合的所有剩余的全部人免疫球蛋白,这才是本发明制备人源性Ab2β抗体所需的总抗体的最佳途径。本发明通过上述三种途径可获得大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体(注:内含潜在的本发明所需的Ab2β抗体。(2).专一筛选结合Ab1抗体抗原结合位点的Ab2β抗体:应用本发明十分简单的独创性免疫试验技术,分别巧妙处理2.2.2.1.(1)三种途径获得的大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体与2.2.1试验制备的总Ab1抗体,关键在于解决两者之间相互作用关系问题。即通过本发明独创性免疫试验技术,分别从上述三种途径获得的大量不同来源未经免疫的人和动物总抗体中,完全彻底清除掉与全部Ab1抗体本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的抗体,辩证思维就是指完全彻底清除掉那些专与Ab1抗体(非抗原结合部位)本身其它表位相结合的抗体。经过本发明这种独创性特殊筛选技术和过程,唯一目的是全部回收(收集和储存)其它与本发明相关的抗体(注:内含潜在的本发明所需的Ab2β抗体)。然后应用常规免疫学实验技术如免疫亲和纯化技术:第一步,将纯化的Ab1抗体与固相基质共价连接,制备Ab1抗体亲和层析柱。第二步,在2.2.2.1---(1)和(2)……试验过程,即已经完全彻底清除掉与Ab1抗体(非抗原结合部位)的本身其它表位相结合的无关抗体后,把全部回收(收集和储存)的其它与本发明相关的总抗体,再分别与Ab1抗体亲和层析柱相互作用,唯一目标是特异性筛选结合到Ab1抗体本身的抗原结合部位的抗体,即本发明所需的Ab2β抗体。第三步,从层析柱上洗脱Ab2β抗体。如此经过免疫亲和纯化技术,分别提取纯化来自人源和动物源的不同的Ab2β抗体。
[0058] 2.2.2.2附加产品----模拟人相应肺肿瘤细胞膜表面特有抗原表位抗体(Ab2β抗体)的获得:整个试验过程和应用技术完全同2.2.2全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab2β抗体)的制备试验过程和应用技术,因此不再重复阐述。制备的模拟人相应肺肿瘤细胞膜表面特有抗原表位的Ab2β抗体,同样可通过下面第二阶段主要实验步骤的整个试验过程和应用技术,获得Ab1抗癌抗体产生细胞或模拟相应癌抗原的Ab2β抗体产生细胞。并可通过转基因动物或细胞工程抗体技术和基因工程抗体技术制备工程抗癌抗体,最终走向工程抗癌抗体产业化之路。由于本发明目标和实验方案时间所限,故对抗癌抗体的制备在此简单陈述,并在第二阶段主要实验步骤不再阐述这种附加产品。
[0059] 2.2.3竞争抑制试验
[0060] 应用各种常规免疫学实验技术:根据竞争抑制试验,观察Ab2β抗体竞争抑制人呼吸道上皮细胞与Ab1抗体结合的能力,特别是能否全方位阻断人呼吸道上皮细胞与Ab1抗体的结合能力(同时设置人呼吸道上皮细胞与Ab1抗体结合的对照组),以此判断本发明全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab2β抗体是否还存在“克隆漏洞”,本发明完全可以通过简单的特异性试验弥补这种“克隆漏洞”。
[0061] 2.2.4筛选和检测引起普通感冒的各种病毒和流感疫苗相互作用的Ab2β抗体[0062] 经过2.2.2全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位抗体(Ab2β抗体)的制备过程,获得的全部Ab2β抗体,其实质就是一个简单的初级“Ab2β抗体库”。可以肯定此阶段尽管抗体库中每一个克隆的抗体分子数量不会很多,但足以应对试验所需。本发明从安全角度出发,通过常规免疫学实验技术,筛选和检测Ab2β抗体与引起普通感冒的各种病毒和流感减毒活疫苗以及灭活疫苗相互作用(设置有创意的对照组)。即通过不同技术手段检测Ab2β抗体与病毒和疫苗特异性结合的功能和效果。确证试验成功的最重要标志是:“Ab2β抗体库”与引起普通感冒的各种病毒和各种流感特定疫苗特异性结合的范围越广说明成功率越高,同时说明本发明“Ab2β抗体库”构建越完善。如果与上述病毒和疫苗特异性结合的成功率达到百分之百,则意味着本发明“Ab2β抗体库”与未知和变异的致命性呼吸道病毒特异性结合的成功率也会极高。当然本发明“Ab2β抗体库”也会越来越完善。
[0063] 2.2.5特异性Ab2β抗体与引起普通感冒特定病毒的创意性免疫荧光试验[0064] 无疑,病毒中和试验是鉴定病毒最可靠的方法,重要的是可检测特异性抗体阻断病毒吸附、穿入和脱壳,使其失去感染靶细胞的能力,从而阻止病毒的增殖(复制),而且这在一定程度上也同时反应了机体抗病毒感染的能力。但需要细胞培养,需要观察细胞病变作用(CPE),方法较为繁琐,费时也费钱。
[0065] 本发明如果针对某一特定病毒的特异性Ab2β抗体数量足够多的话,或者通过“追踪溯源”再次提取纯化该抗体。通过创意性免疫荧光试验同样可以达到病毒中和试验的上述目的。采集本实验方案实施过程中储存或提前备好的特定病毒悬液和培养的人呼吸道上皮细胞后,与本发明特异Ab2β抗体三者进行相互作用,同时设置病毒与培养的人呼吸道上皮细胞两者相互作用对照组,并用抗细胞内特定病毒抗原抗体的免疫荧光间接试验法,以此观察有或无细胞内荧光颗粒,这会在较短的时间得出结果,理论上达75%-95%的阳性准确率,以此加快试验进度。当然也可采用病毒中和试验,以确保试验精确度。
[0066] 2.2.6确证试验证实本发明筛选到特异性抗病毒抗体,表明第一阶段(时间3-6个月)试验成功结束。
[0067] 2.2.7预期产品:
[0068] ①制备具有不同功能和用途的全部原始Ab1抗体和相对应的全部原始Ab2β抗体。
[0069] ②本实验方案可毫不费力的极可能同时获得抗相应人肺肿瘤细胞的特异性抗癌抗体。
[0070] 2.2.8第一阶段试验(时间3-6个月)结束后,所需经费70--90万人民币,立即向世界各大国申请关键性发明专利,在全世界控制实验方法和主要技术及市场……[0071] 2.3第二阶段主要实验步骤:
[0072] 2.3.1制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”:
[0073] 2.3.1.1专一筛选能够结合Ab2β抗体本身的抗原结合位点的特异性B细胞[0074] (1).首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同品系(注:包括杂交和野生)兔子和鼠以及羊等动物的B细胞------主要是未经过免疫的B细胞和第一阶段经过多次免疫后纯化并储存的兔子和鼠的B细胞,其中包括不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。(2).通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,分别巧妙处理2.3.1.1……(1)……获得的兔子和鼠以及羊等动物的B细胞与第一阶段获得的全部Ab2β抗体,关键在于解决B细胞和Ab2β抗体两者之间相互作用关系问题。即通过本发明独创性免疫试验技术,从这些B细胞中完全彻底清除掉与Ab2β抗体本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的B细胞,辩证思维就是指完全彻底清除掉那些专门与Ab2β抗体(非抗原结合部位)本身其它表位相结合的B细胞。经过本发明这种独创性特殊筛选技术和过程,唯一目的是全部回收(收集并保留)所有剩余的其它与本发明相关的B细胞(注:内含潜在的本发明所需的Ab1抗体产生细胞)。(3).即将2.3.1.1……(2)……唯一目的是全部回收(收集并保留)所有剩余的其它与本发明相关的B细胞并和全部Ab2β抗体分别分类进行相互作用,再通过流式细胞术(FCM)或结合免疫磁性微珠技术,可更多更快的筛选出专一结合Ab2β抗体本身的抗原结合部位的特异性B细胞,即本发明所需的Ab1抗体产生细胞。
[0075] 特别需要指出的是:通过流式细胞术(FCM),每个Ab1抗体产生细胞(特异性B细胞),只要有100个荧光分子就可以检测出来。而一个二抗(IgG分子)可标记几个-十几个荧光素分子,所以只需要20-50个一抗,就可以把一个特异性B细胞(每个B细胞表面的BCR有1万--10万个),即本发明所需的Ab1抗体产生细胞专一筛选出来(据本发明者粗略推算,每毫升血液约含几亿个抗体分子)。因此本发明任何一种途径(包括从纯化的未经免疫的血清总抗体和乳汁总抗体)获得的纯化Ab2β抗体中,每一个克隆本身的抗体数量都是足够流式细胞术或结合免疫磁性微珠技术,筛选专一结合相对应的特异性B细胞试验所用的。否则人体也不可能对第一次遭遇到的抗原,发生初始的是由始动者DC(而非B细胞)启动的特异性体液免疫应答,这也表明体液特异性抗体数量足够结合初始抗原的(注:DC通过受体摄取抗原抗体复合物介导的内化,属于各种生物大分子内化的基本方式)。
[0076] 2.3.1.2制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”的方法和技术:
[0077] 首先将能够与Ab2β抗体本身的抗原结合部位特异性结合的B细胞,进行体外培养并在不同刺激条件下,在特定的不同时间内,通过两条途径:(1)将体外培养的B细胞(增值为目的),通过构建噬菌体抗体库技术的两种不同方式:其一为主要方式,即B细胞内PCR(In-CellPCR)装配技术--噬菌体抗体库技术,以保证抗体的轻重链配对为体内原始配对的前提下,制备噬菌体Ab1抗体(注:本发明不排除伴随细胞内PCR(In-CellPCR)技术--噬菌体抗体库技术的不断进步,解决经多次免疫产生的千差万别不同克隆的记忆性B细胞,最重要“通用引物”设计的困难问题,制备轻重链配对为体内原始配对的噬菌体Ab1抗体)。其二,即通常的构建噬菌体抗体库技术,尽管这种方式获得的抗体基因是体外的随机组合。但由于抗体和抗原结合的特异性常主要由VH决定,所以本发明全部特异性B细胞(Ab1抗体产生细胞),可在不改变特异性的情况下,使其每一个特异性的VH与本发明特异性B细胞不同的VL进行组合(链替换),产生特异性相同而亲和力不同的Ab1抗体(注:不排除某些VH与VL因空间结构互补性差和稳定性差等原因导致配对失败)。因此本发明可在不改变每一个B细胞克隆特异性的情况下找到VH---VL最佳配对,反而更可能筛选到高亲和力的Ab1抗体。或许由于类似免疫抗体库的原因,但本发明比免疫抗体库更具优越性和保障性,即全部由特异性B细胞克隆组成,如果数量足够大而且VH---VL互补性强空间结构十分稳定,这会使原始抗体轻链和重链配对极易被恢复,反而不会导致高亲和力原始Ab1抗体丢失。本发明通过这两种不同方式(注:关注通用引物和简并引物使用的方法)制备噬菌体“Ab1抗体库”(注:需要和具体试验操作者协商,选择最适合本发明的方法和技术)。(2)将体外培养的B细胞根据两种不同用途:其一,将体外培养的B细胞(生产抗体为目的),通过转化为抗体分泌浆细胞,获得分泌性Ab1抗体(该途径虽获得的每一单个克隆抗体的数量较少,但足够试验所用),制备原始特异性“Ab1抗体库”。其二,将体外培养的B细胞(增值为目的),作为抗原储存(注:每个B细胞膜表面有1万-10万个BCR抗原分子,而且BCR排列方向一致都易接近,区别抗体作为免疫原)以备免疫不同品系兔子和鼠制备Ab2β抗体和获取Ab2β抗体产生细胞。
[0078] 通过这两条途径尽可能获得抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的全部Ab1抗体并以此制备和构建初级具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”:
[0079] 2.3.1.3在本试验阶段存在一个容易混淆的问题-----即本发明根本就不存在“Ab3抗体库”的问题,原因在于本发明“Ab1抗体库”的构建,并非由Ab2β抗体作为抗原免疫人和动物所获得Ab3抗体所构建。因此本发明实验方案既不产生也不存在Ab3抗体,故阅读本说明书不要把该问题弄混淆。
[0080] 2.3.2制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”
[0081] 2.3.2.1专一筛选能够结合Ab1抗体本身的抗原结合位点的特异性B细胞[0082] (1).首先应用常规免疫学实验技术,分别提取纯化大量不同人和不同品系(注:包括杂交和野生)兔子以及鼠的的B细胞------即全部未经过免疫和经过免疫的不同器官组织来源及不同途径来源的B细胞。其中包括2.3.1.2……(2)……其二,将体外培养的B细胞(增值为目的),作为抗原(注:每个B细胞膜表面有1万-10万个BCR抗原分子,而且BCR排列方向一致都易接近,区别抗体作为免疫原)免疫不同品系兔子和鼠,并提取纯化这些经过免疫的B细胞(注:其免疫血清内含相应Ab2β抗体,可通过第一阶段制备的特异性Ab1抗体筛选出来,制备原始Ab2β抗体)。另外本试验重复指出:经过2.1实验主要材料2.1.1途径……内含专一针对和模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的特异性B细胞可达几十万至百万不同克隆,而且已注意到B细胞和抗原都会出现重复计算。其中必然会得到本发明所需的全部模拟各种已知和未知或变异的人呼吸道上皮细胞表面“病毒受体”的、具有较高亲和力的众多不同克隆的Ab2β抗体,这是本发明构建人源性“Ab2β抗体库”的最佳途径。(2).通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,分别巧妙处理2.3.2.1……(1)试验获得的人和兔子以及鼠的B细胞与第一阶段获得的全部Ab1抗体,关键在于解决B细胞和Ab1抗体两者之间相互作用关系问题。即通过本发明独创性免疫试验技术,从这些B细胞中完全彻底清除掉与Ab1抗体本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的B细胞,辩证思维就是指完全彻底清除掉那些专门与Ab1抗体(非抗原结合部位)本身其它表位相结合的B细胞。经过本发明这种独创性特殊筛选技术和过程,唯一目的是全部回收(收集并保留)所有剩余的其它与本发明相关的B细胞(注:内含潜在的本发明所需的Ab2β抗体产生细胞)。(3).即将2.3.2.1……(1)和(2)……唯一目的是全部回收(收集并保留)所有剩余的其它与本发明相关的B细胞并和全部Ab1抗体分别分类进行相互作用,再通过流式细胞术(FCM)或结合免疫磁性微珠技术,可更多更快的筛选出专一结合Ab1抗体本身抗原结合部位的特异性B细胞,即本发明所需的Ab2β抗体产生细胞。
[0083] 特别需要指出的是:通过流式细胞术(FCM),每个Ab2β抗体产生细胞(特异性B细胞),只要有100个荧光分子就可以检测出来。而一个二抗(IgG分子)可标记几个-十几个荧光素分子,所以只需要20-50个一抗,就可以把一个特异性B细胞(每个B细胞表面的BCR有1万--10万个),即本发明所需的Ab2β抗体产生细胞专一筛选出来(据本发明者粗略推算,每毫升血液约含几亿个抗体分子)。因此本发明任何一种途径(包括从纯化的未经免疫的血清总抗体和乳汁总抗体)获得的纯化Ab1抗体中,每一个克隆本身的抗体数量都是足够流式细胞术或结合免疫磁性微珠技术,筛选专一结合相对应的特异性B细胞试验所用的。同理否则人体内也不可能对第一次遭遇到的抗原,发生初始的是由始动者DC(而非B细胞)启动的特异性体液免疫应答,这也表明体液特异性抗体数量足够结合初始抗原的(注:DC通过受体摄取抗原抗体复合物介导的内化,属于各种生物大分子内化的基本方式)。
[0084] 2.3.2.2制备和构建具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”的方法和技术:
[0085] 首先将能够与Ab1抗体本身的抗原结合部位特异性结合的B细胞,进行体外培养并在不同刺激条件下,在特定的不同时间内,通过两条途径:(1)将体外培养的B细胞(增值为目的),通过构建噬菌体抗体库技术的两种不同方式:其一为主要方式,即通过B细胞PCR(In-CellPCR)装配技术--噬菌体抗体库技术,以保证抗体的轻重链配对为体内原始配对的前提下,制备噬菌体“Ab2β抗体库”(注:本发明不排除伴随细胞内PCR(In-CellPCR)技术--噬菌体抗体库技术的不断进步,解决经多次免疫产生的千差万别不同克隆的记忆性B细胞,最重要“通用引物”设计的困难问题,制备轻重链配对为体内原始配对的噬菌体Ab2β抗体)。其二,即通常的构建噬菌体抗体库技术,,尽管这种方式获得的抗体基因是体外的随机组合。但由于抗体和抗原结合的特异性常主要由VH决定,所以本发明全部特异性B细胞(Ab2β抗体产生细胞),可在不改变特异性的情况下,使其每一个特异性的VH与本发明特异性B细胞不同的VL进行组合(链替换),产生特异性相同而亲和力不同的Ab2β抗体(注:不排除某些VH与VL因空间结构互补性差和稳定性差等原因导致配对失败)。因此本发明可在不改变每一个B细胞克隆特异性的情况下找到VH---VL最佳配对,反而更可能筛选到高亲和力的Ab2β抗体抗体。或许由于类似免疫抗体库的原因,但本发明比免疫抗体库更具优越性和保障性,即全部由特异性B细胞克隆组成,如果数量足够大而且VH---VL互补性强空间结构十分稳定,这会使原始抗体轻链和重链配对极易被恢复,反而不会导致高亲和力原始Ab2β抗体丢失。,通过这两种不同方式(注:关注通用引物和简并引物使用的方法)制备和构建噬菌体“Ab2β抗体库”(注:需要和具体试验操作者协商,选择最适合本发明的方法和技术)。(2)将体外培养的B细胞(生产抗体为目的),通过转化为抗体分泌浆细胞,获得分泌性Ab2β抗体(该途径虽获得的每一单个克隆抗体的数量较少,但足够试验所用),制备和构建原始特异性“Ab2β抗体库”。
[0086] 通过这两条途径尽可能获得模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的全部Ab2β抗体,并以此制备和构建初级具有不同特殊功能和用途的“Ab2β抗体库”。
[0087] 2.3.2.3结合试验和竞争抑制试验
[0088] 应用各种常规免疫学实验技术:(1)根据结合试验,观察来自第二阶段不同途径的噬菌体Ab2β抗体和分泌性Ab2β抗体与第一阶段获得的原始Ab1抗体特异性结合的效果。(2)根据竞争抑制试验,观察来自第二阶段不同途径的噬菌体Ab2β抗体和分泌性Ab2β抗体竞争抑制人呼吸道上皮细胞与第一阶段获得的原始Ab1抗体结合的能力,特别是能否全方位阻断人呼吸道上皮细胞与原始Ab1抗体的结合能力(同时设置人呼吸道上皮细胞与原始Ab1抗体结合的对照组),以此判断本发明第二阶段获得的全方位模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的“Ab2β抗体库”是否还存在“克隆漏洞”,本发明完全可以通过特异性试验弥补这种“克隆漏洞”,从而完善“Ab2β抗体库”。
[0089] 2.3.2.4验证初级“Ab2β抗体库”的功能和效果:
[0090] 应用常规免疫学实验技术,利用引起普通感冒的各种病毒和流感减毒活疫苗及灭活疫苗等从初级“Ab2β抗体库”中筛选特异性抗体,并提取和纯化专一抗特定呼吸道病毒---靶细胞结合位点的抗体,即模拟人呼吸道上皮细胞膜表面“病毒受体”的Ab2β抗体,以此验证初级“Ab2β抗体库”的功能和效果。确证试验成功的最重要标志是:“Ab2β抗体库”与引起普通感冒的各种病毒和各种流感特定疫苗特异性结合的范围越广说明成功率越高,同时说明本发明“Ab2β抗体库”构建越完善。如果与上述病毒和疫苗特异性结合的成功率达到百分之百,则意味着本发明“Ab2β抗体库”与未知和变异的致命性呼吸道病毒特异性结合的成功率也会极高。当然本发明“Ab2β抗体库”也会越来越完善。
[0091] 2.3.2.5致命性病毒中和试验:
[0092] 应用常规免疫学实验技术,利用某些已知致命性呼吸道病毒或减毒活疫苗等,从初级“Ab2β抗体库”中筛选特异性抗体,并进行致命性病毒中和试验(委托试验),确证特异性Ab2β抗体的功能和效果,制备针对某些特定致命性呼吸道病毒的特异性中和抗体,为工程抗体产业化和商品化产品---特异性免疫球蛋白打基础。
[0093] 2.3.3制备和构建多个具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”和“Ab2β”抗体库”
[0094] 根据人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原(如呼吸道以有包膜病毒为主,其受体表达十分丰富)的分布特点以及与Ab1抗体和Ab2β抗体相互作用的特点,通过本发明十分简单的独创性免疫试验技术,可随着第一阶段和第二阶段试验,构建多个具有不同功能和用途的“Ab1抗体库”和多个相对应的“Ab2β抗体库”,用于筛选特异性抗病毒抗体和进行4 5
病毒中和试验。这些抗体库其中抗体克隆库容量估计最大的为10--10。.对比一般抗体
7 10
库10-10 以上库容量,两者在库容总抗体数量相等情况下,本发明抗体库每一个单克隆抗体的数量都在对方每一个单克隆抗体数量的千倍------百万倍以上,因此本发明抗体库与呼吸道病毒相互作用,根本就没有淘筛失败的可能性(注:抗体库库容量太大或每个特异性克隆数量太少都会影响筛选效果,因此要有度)。
[0095] 2.3.4本实验方案(保护本发明专利),在实际试验中会选择其中最合理化的方法和技术,以求在最短时间内完成本发明。第二阶段试验需要时间12个月-18个月,所需经费160-180万人民币,同时立即向世界各大国申请重要发明专利,在全世界控制实验方法和主要技术及市场……
[0096] 2.3.5全部回收不参于上述任何结合试验过程中的所有抗体和B细胞与其重要用途
[0097] 所指本实验方案任何试验过程中,(1).全部回收第一阶段不与人呼吸道上皮细胞和Ab1抗体以及Ab2β抗体发生结合的所有剩余的非特异性抗体。(2)全部回收第二阶段不与第一阶段Ab1抗体和Ab2β抗体发生结合的所有剩余的非特异性B细胞。(3)所有剩余的全部回收的非特异性抗体和非特异性B细胞,分别分批分类长期冻存。重要目的是重复本实验方案用于任何外源或内源生物性物质(如细胞或分子抗原)试验,制备特异性Ab1抗体和Ab2β抗体以及两者各自相对应特异性B细胞。(4)该种用于不同用途针对不同生物性物质试验(见权利要求书),预示可产生难以计数的发明专利。(5)实现上述目标的原因在于本实验方案主要试验材料,即本实验方案实施后,全部回收的非特异性抗体和非特异性B细胞,因其来源于成千上万人和大量不同种系不同动物,而且都是纯化的,因此这是一笔非常省时省力省钱的财富。
[0098] 3.实验时间和预期产品以及预算经费
[0099] 3.1第一阶段全部试验需要时间3-6个月,所需经费70--90万人民币。
[0100] 3.1.1第一阶段预期产品:(1).制备具有不同功能和用途的全部原始Ab1抗体和相对应的全部原始Ab2β抗体。(2).本实验方案可毫不费力的极可能同时获得抗相应人肺肿瘤细胞的特异性抗癌抗体。
[0101] 3.1.2第一阶段试验结束后,立即向世界各大国申请关键性发明专利,在全世界控制实验方法和主要技术及市场……
[0102] 3.2第二阶段全部试验需要时间12个月-18个月,所需经费160-180万人民币。
[0103] 3.2.1第二阶段预期产品:制备和构建多个具有不同特殊功能和用途的“Ab1抗体库”和“Ab2β”抗体库”
[0104] 3.2.2第二阶段试验结束后,立即向世界各大国申请重要发明专利,在全世界控制实验方法和主要技术及市场……
[0105] 3.3.第一阶段和第二阶段全部实验时间两年,预算经费约250万元,预期向世界各大国申请多个重要发明专利……
[0106] 3.4.特别说明:在本实验方案之外伴随试验过程还可以产生另外一个附加产品,即如果利用人CD4+T细胞和CD8+T细胞之间的差异,通过本发明实验方案相同的独创性试验技术,制备抗CD4+T细胞膜表面CD4分子不同表位(内含HIV-艾滋病病毒受体)的Ab1抗体和相对应的Ab2β抗体,然后应用Ab2β抗体与含有HIV----gp160和gp120的试剂盒相互作用,并提取和纯化特异性结合的Ab2β抗体,同时进行进一步确证和HIV中和试验,以此制备重要的专一阻断HIV---CD4+细胞结合部位的特异性中和抗体。
[0107] 4.市场商品化产品---即走向工程抗体产业化道路(可根据长远和短期目标精心制定规划,选择最合适工艺,)。
[0108] 工程抗体主要包括细胞工程抗体和基因工程抗体。细胞工程抗体,指该技术是在细胞水平上进行操作,如人B细胞的EBV转化及融合技术、杂交瘤细胞通过克隆化筛选产生单克隆抗体和转基因动物作为生物反应器通过乳汁获得特异性抗体等各种相关技术和方法。基因工程抗体则指在基因水平上进行操作,把特定编码抗体分子的目的基因,转移至大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达系统,生产目的抗体等各种相关技术和方法。工程抗体产业化就是利用细胞工程、基因工程、蛋白质工程、发酵工程等现代生物工程技术,对工程抗体有目的、有计划地通过小试、中试、生产逐级放大过程,实现目标产品(抗体)生产的规范化、产业化,以满市场需求。
[0109] 本发明根据“Ab2β”抗体库”功能和用途的不同,应精心选择最适合本发明的工程抗体产业化之路,制备三种市场商品化产品:(1)抗未知和变异的呼吸道病毒人体特异性免疫球蛋白或人源化特异性免疫球蛋白。(2)抗各种已知的呼吸道病毒人体特异性免疫球蛋白或人源化特异性免疫球蛋白.。(3)仅抗1--几个已知的特定致命性呼吸道病毒的人体特异性免疫球蛋白或人源化特异性免疫球蛋白。
[0110] 本发明预期商品化免疫球蛋白与目前市场商品化免疫球蛋白相比主要有5个重要区别:其一,本发明免疫球蛋白抗体克隆数量最多104.而目前市场商品化免疫球蛋白抗7 8
体克隆数量至少10---10 以上.两者相差数千-数万倍.这意味着如果是规格和重量相同的免疫球蛋白,本发明每一单克隆抗体数量是目前市场商品化免疫球蛋白每一单克隆抗体数量的数千或数万倍以上。这样的对比结果,对防治呼吸道病毒感染,本发明免疫球蛋白的用量要相对少得多,效果却要好得多。其二,本发明最终走向商品化的3种免疫球蛋白都是针对各种呼吸道病毒的;而目前市场商品化免疫球蛋白却是针对各种各样抗原的,其中抗呼吸道病毒抗体含量太少.而众所周知市场主要需求防治呼吸道病毒感染的免疫球蛋白。
其三,本发明3种免疫球蛋白都是专一阻断病毒-靶细胞间结合部位的,因此是用量很少的最好抗体,.而目前市场商品化免疫球蛋白所含抗体,却是好抗体和无效抗体以及坏抗体的混合物,对个体而言其临床用量很大。其四,本发明特定的免疫球蛋白就像阻断病毒侵入人呼吸道上皮细胞途径一样,可以阻断细菌等病原体通过其表面的黏附素(adhesin)与宿主粘膜上皮细胞黏附和有毒的分泌物对上皮细胞造成的损伤。其五,特别是防治未知或变异的致命性呼吸道病毒如引起“非典”和各种流感的病毒感染以及病毒性生物武器攻击引发的突发事件。因此预期产品本发明免疫球蛋白与目前市场商品化免疫球蛋白相比,孰优孰略一比便知。企业平时向市场提供3种抗不同呼吸道病毒的特效免疫球蛋白就是本发明最重要目的之一。
[0111] 5.逆向工程设计的两种附加实验方案
[0112] 事物的两面性理论---Ab1抗体和Ab2抗体分别属于事物的两个面,这一原理对本附加实验方案启迪,即人呼吸道上皮细胞和呼吸道病毒同样分别属于事物的两个面,因此可以通过逆向工程设计两者程序位置互换的实验方案。
[0113] 5.1把本实验方案中的人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,通过相同的本发明实验方案全部试验过程,制备抗和模拟病毒配体结合位点的Ab1抗体和Ab2β抗体,如果模拟病毒配体的Ab2β抗体能够特异性结合人呼吸道上皮细胞,说明抗病毒配体结合位点的Ab1抗体,就是本发明所指专一阻断特定呼吸道病毒------人呼吸道上皮细胞结合部位的特异性中和抗体。
[0114] 5.2把本实验方案中的人呼吸道上皮细胞置换成特定呼吸道病毒或流感减毒活疫苗及灭活疫苗等,通过相同的本实验方案全部试验过程制备抗特定病毒Ab1抗体。同时制备抗人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的Ab1抗体。将两种不同来源的Ab1抗体固定一方,筛选另一方(如利用所谓抗原柱纯化抗体技术)。其中发生特异性结合的抗体分别为模拟病毒受体的抗体和模拟病毒配体的抗体,而模拟病毒受体的抗体就是本发明所指专一阻断特定呼吸道病毒------人呼吸道上皮细胞结合部位的特异性中和抗体。
[0115] 5.3该逆向工程设计的附加实验方案,不在本次发明的试验范围之内。
[0116] 6.发说明书和实验方案需要重点说明的几个问题:
[0117] 首先特别指出:由于本发明和实验方案属于生命科学领域中的大工程,其中所涉及的众多知识点和各种难题以及相应的技术点与发现和创造性解决方式,就如同相互连接的似乎有些复杂的“网状结构”,这导致如果不排除某种观念禁锢(屡见不鲜),不建立辩证唯物所带来的正反双向思维大框架,即使专业知识再厚重,也难以真正透彻理解和完全弄通本发明以及本发明实验方案,更别提交叉其中相互连接点上的每一步试验的目标和要求,包括肯定会遇到和需要解决的各种问题,特别是本发明需要与每一步试验具体操作者协商选择最适合本发明的试验方法和技术。更需要合理的衔接好所有试验的整个实验过程。因此尽管本发明专利向全世界公开,世界上也只有发明者本人充分了解整个实验过程每一步试验如何有目的进行有序衔接和更有意义完成本发明。
[0118] 6.1内源性配体和病毒与细胞表面同一受体相互作用的复杂关系
[0119] 6.1.1病毒受体一词指位于细胞表面参与病毒识别和结合等过程,并促进病毒感染的一组分子复合物。病毒受体可以是细胞的特定受体,亦可能是特殊受体之外的膜蛋白分子。而决定一个病毒能否进入细胞,病毒的特异性受体起到关键性作用。随着对细胞膜分子生物学的深入研究,作为各种配体的细胞受体蛋白,大多是一类细胞的信号受体,而其中许多均是同时作为病毒受体存在的。至少对有包膜的病毒而言,细胞膜表面的病毒受体的分布十丰富而且稳定表达,且有易接近性。否则不能解释这类病毒如流感病毒能够引起大范围的感染和相应疾病。因此这一类病毒受体有一定规律可循,这提示本发明模拟此类病毒受体的Ab2β抗体的获得相对更容易。
[0120] 6.1.2本发明研究的是病毒和体内特定正常生理配体与细胞同一受体蛋白之间相互作用的空间结构,即两者与细胞同一受体蛋白结合部位是完全重叠;还是部分重叠;抑或两者分别作用同一受体蛋白的不同表位。重点问题在于如果两者与细胞同一受体蛋白结合部位完全重叠,而病毒仍然侵入机体,只能说明体内常态下特定内源性生理配体(激动剂)太少或者相应闲置受体太多,导致竞争性抑制病毒结合细胞同一受体同一部位的效应失败,本发明甚至认为如果闲置受体太多,其结合相应病毒的过程都不会受到干扰和影响。如果两者与细胞受体蛋白结合部位是部分重叠,抑或两者分别作用同一受体蛋白的不同表位,则特定生理配体对病毒侵入细胞的影响则更小或者根本没有影响。另外还有其他机制保护人呼吸道上皮细胞免遭病毒入侵,如分泌型IgA(SIgA)呼吸道粘膜上皮抗感染作用包括所谓少量的天然自身抗体(NAA)以低亲和力同自身抗原结合,屏蔽抗原决定基的作用等,都不能阻挡特定病毒侵入人呼吸道粘膜上皮细胞,如“非典”和特定流感的大范围流行,这种现象只能说明缺乏(哪怕是少量的)特异性中和抗体的保护作用。有论据表明抗狂犬病毒突变株1000个以上的IgG分子仍然不能中和该病毒,进一步论证抗体覆盖的空间位置是十分重要的而不是仅取决于抗体数量,关键在于抗体与病毒的结合所形成的空间位阻和所带来的外力,对病毒与靶细胞特定结合位点的作用和影响。
[0121] 6.1.3本发明制备的专一阻断病毒-靶细胞结合位点Ab2β抗体,可以完全克服5.1.2所阐述的各种重点问题。甚至在整个实验过程中,通过Ab2β抗体的特定功能和作用,可能观察到各种呼吸道病毒与呼吸道上皮细胞表面病毒受体相互作用的某些特点。
[0122] 6.2如何最大限度提高Ab2β抗体免疫识别广度和深度以及亲和力的问题[0123] 人体内T和B细胞克隆总数在1012以上,可以表达1012种独具识别特性的抗体分子和T细胞分子,因此每个BCR和TCR均具有独特的抗原特异性。具体到每一个体都可能7
有10 以上表达不同抗原受体的B细胞和T细胞。一些研究认为构建天然抗体库,库容量
7 8
10 可覆盖百分之99%自身抗原决定基,库容量超过10 可得到相对亲和力较高自身抗体。:
为此本发明有三条途径即可提高Ab2β抗体免疫识别广度和深度又可提高其亲和力。
[0124] 6.2.1第一途径:本发明利用不同人群不同个体和不同种系不同动物免疫系统之间的差异,越多越好的大量提取纯化不同人群不同个体和不同种系不同动物的B细胞和血清抗体。其中如何最大限度的获取更多克隆的人源B细胞和更多克隆的人源抗体,是本发明制备和构建人源性“Ab2β抗体库”的关键。如通过实验方案的2.1实验主要材料2.1.1和2.1.2所发现的两条十分特殊的途径,即针对人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位为目标,那么仅仅专一针对和模拟该目标的特异性B细胞就可达几十万至百万不同克隆,而特异性抗体至少可达百万以上不同克隆(注:本发明已注意到B细胞和抗原都会出现重复计算)。其中必然会得到本发明所需的全部模拟各种已知和未知或变异的呼吸道上皮细胞表面病毒受体的,具有较高亲和力的众多不同克隆的Ab2β抗体,这是本发明制备和构建人源性“Ab2β抗体库”的最佳途径。另外本发明就是要尽最大可能最大限度集中人和动物众群体免疫系统的综合力量,以此获得最大程度免疫识别广度和深度的优势效应,同时以此制备具有较高亲和力的模拟包含全部“病毒受体”的人源和动物源Ab2β抗体。
[0125] 6.2.2第二条特殊途径:本发明构建的具有不同特殊功能和用途的噬菌体“Ab2β抗体库”,完全不同于按抗体基因分类的天然抗体库和免疫抗体库。本发明噬菌体抗体库重要特点:(1)全部是以专一模拟人呼吸道上皮细胞膜表面不同抗原不同表位的特异性B细胞构建的,根本不存在任何非特异性B细胞。(2)由于抗体和抗原结合的特异性常主要由VH所决定,所以本发明抗体库针对某一特定病毒配体结合位点的的每一个特异性原始(原本的轻重链搭配)克隆,在不改变特异性的情况下,使其特异性的VH可与多种特定的不同的VL进行组合(链替换),即在不改变其特异性的情况下找到VH---VL最佳配对,产生高亲和力的Ab2β抗体。(3)由于本发明噬菌体抗体库容量小,而每一个克隆数量大如果互补性和稳定性强,那么原始抗体轻链和重链配对极易被恢复,不会导致高亲和力原始Ab2β抗体丢失。(注:需要和具体试验操作者协商,选择最适合本发明的方法和技术)[0126] 6.2.3制备多价单特异性微型抗体:如本发明的特异性噬菌体Ab2β抗体,可借鉴把2个或2个以上的ScFv重组在一起的技术,以此提高亲和力。
[0127] 6.3.本发明Ab2β抗体会不会产生自身抗体的问题
[0128] 6.3.1这个问题不仅对本发明是个问题,对人体内特异性免疫应答也是同样问题。如病毒结构上与病毒受体的结合结构部位通常也是免疫学中的中和抗体所涉及的主要抗原表位(注:单指这种结合结构部位的中和性抗体,其本身就或多或少模拟了病毒受体),因而此类模拟了病毒受体的Ab1抗体作为免疫原产生的抗抗体(Ab2)的作用点就是自身成分。如流感病毒HA抗原,既是结合细胞受体的结构成分,亦是产生中和性抗体的结构,这导致病毒经常变异逃逸相应免疫压力。在特定流感大范围流行期结束后,临床上有多少人因此产生自身免疫性疾病而到医院就诊。实际上此类中和性Ab1抗体等同于本发明的Ab2β抗体,对比两者相差了一个免疫过程,因此本发明通过Ab2β抗体诱导产生的Ab3抗体精准性更差,所以产生特异性和高亲和力的自身抗体的可能性更小。
[0129] 6.3.2免疫系统和免疫网络调节与抑制高亲和力自身抗体产生的原因:(1)由于个体免疫系统在发育早期和胚胎期形成的天然免疫耐受,其机制如克隆排除、克隆流产、克隆无能、克隆禁忌和免疫抑制等,导致体内自身反应性淋巴细胞或被清除或被抑制,特别指出胚胎发育期,AId就能引起免疫耐受。另外妊娠期间,母体IgG通过胎盘传递到胎儿,对选择B细胞群具有重要作用,并发现经母乳喂养的婴儿,很少发生自身免疫性疾病。(2)生物体内有少量天然自身抗体(NAA)的存在(进化过程中为识别自身抗原而保留的),有其生物学意义。如抗跨膜蛋白MUC1天然自身抗体与非小细胞肺癌关系以及天然自身抗体(NAA)以低亲和力同自身抗原结合,屏蔽抗原决定基,抑制或阻止自身抗体同自身抗原的过度反应等。(3).体内“自我”与“非我”的免疫识别机制:不同个体具有不同的免疫识别体系,导致免疫识别的方向也各不相同(注:本发明单指差异识别不指重叠识别)。如正常人体每7 8
天都有一定数量(10--10)的细胞突变,而免疫监督系统随之将其中转化细胞歼灭。要知道转化细胞比癌细胞与正常细胞间的微细差异更小,可见人体在正常情况下这种“自我”与“非我”的免疫识别机制,在清除“非我”时,会避免损伤自身。(4).免疫调节:涉及整体如神经-内分泌免疫网络、各种免疫细胞和免疫分子、独特型/抗独特型网络以及基因等构成调解网络,调控全身与局部的免疫应答。(5).本发明包括人源性和动物源性噬菌体抗体,仅从动物源性噬菌体抗体的免疫原性讲,如ScFv小分子抗体(包括双链或三链ScFv抗体),其免疫原性与经过多次体细胞高频突变和具有种间独特型的人源抗体又有多大区别,本发明认为两者应用临床没有多大区别。而且个体胚胎期高亲和力的自身反应性淋巴细胞被清除或抑制(禁忌克隆)所形成的淋巴细胞库漏洞,其中包括针对自身同一抗原同一表位却具有不同结构(功能模拟)的高亲和力自身抗体也会同时被清除或被抑制,或因个体发生早期表现出的独特型缔合性影响,这可能有助于其对应面---某些模拟自身抗原的B细胞会成为潜在优势克隆,如果复杂一点阐述:不同个体可能会有不同的模拟不同自身抗原的B细胞会成为潜在优势克隆。
[0130] 6.3.3基于上述五种原因,正常情况下产生自身抗体的可能性很小。本发明Ab2β抗体的临床应用量肯定少,因此引起的免疫反应容量有限,而且免疫原性弱和暴露不充分,比之抗HA抗原抗体或其它外源性抗原内影像-Ab2β抗体,诱导产生高亲和力自身抗体如Ab3抗体的可能性更小。当然不排除长期反复大量应用,在某些情况下产生主要为抑制性Ab3抗体或者类似天然自身抗体(NAA)的低亲和力Ab3抗体的诸多可能性。而由于“禁忌克隆”复活诱导产生高亲和力Ab3自身抗体的可能性相对更小。
[0131] 7.预期成果——本发明项目的重要用途和意义
[0132] 众所周知“非典”时期,北京某著名军医利用广东感染SARS病毒痊愈患者的抗病毒血清自救获得新生的故事,本发明项目预期产品-特异性免疫球蛋白,比之上述抗病毒血清强得多。与人感染病毒或接种了疫苗后提取的抗病毒血清相比,克服了抗病毒血清存在的四大问题:①安全性问题,抗病毒血清中可能存在病毒,由此可能增加受者感染病毒的机会,并由于同种异体血清中存在众多物质也可能会给受者带来过敏反应。②有效性问题,抗病毒血清中的抗病毒抗体是不纯的,而且由于不同个体存在不同的免疫应答格局的原因,病毒或疫苗在宿主体内产生的抗体有“好”抗体和“坏”抗体之分,而真正抗病毒作用取决于“好”抗体与“坏”抗体两者作用的“净”效应。③抗原“原罪”问题,这一问题很重要,即感染某一特定病毒或接种了某一特定病毒的疫苗后,再次接触感染了该特定病毒的“变异体”(病毒变异了)后,很可能某些个体对变异病毒不产生免疫应答,如果出现这种免疫延迟现象真不如当初不接种疫苗,因此疫苗接种是有原则和条件的。④从具有特殊功能和用途的“抗体库”筛选和大量制备特异性抗病毒抗体,体现了多、快、好和省的原则,可以快捷有效特别是防治任何呼吸道病毒引起的突发事件,这是任何病毒疫苗和抗病毒血清无法做到的、也是任何抗病毒物质包括化学药品所不能做到的。
[0133] 7.1本发明项目预期产品-“Ab2β抗体库”可在最短时间提供大量最有效抗体,防治人类呼吸系统的任何急性病毒性传染病。特别是如H1N1流感、禽流感、SARS或生物武器等致命性疾病引起的突发事件。
[0134] 7.2应用从“Ab2β抗体库”中筛选的特异性抗病毒抗体,制备抗体芯片和病毒诊断试剂盒
[0135] 7.3本发明独创性免疫学试验技术还有两个重要用途:特别与制备双重阻断艾滋病毒感染的超级抗体有关,如制备模拟HIV主要靶分子——CD4和SIGN“病毒受体”的Ab2β抗体。甚至应用抗癌领域制备专一杀伤癌细胞的高精准性CTL抗癌细胞和高特异性抗癌抗
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