冷冻干燥制剂
阅读：973发布：2020-05-12
专利汇可以提供冷冻干燥制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供含有 抗体 与溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分、具有能够在市场上流通的程度的 稳定性 的药物组合物。一种 冷冻干燥 制剂，含有抗体与溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分，并进一步含有中性盐、 二糖 类、非离子型 表面活性剂 和缓冲剂。作为该冷冻干燥制剂，可以列举例如含有抗转 铁 蛋白受体抗体与人 艾 杜糖 醛 酸-2- 硫酸 酯酶的融合蛋白作为有效成分、并进一步含有作为中性盐的 氯化钠 、作为二糖类的 蔗糖 、作为非离子型表面活性剂的泊洛沙姆和作为缓冲剂的 磷酸 缓冲剂的冷冻干燥制剂。，下面是冷冻干燥制剂专利的具体信息内容。
1.一种冷冻干燥制剂，其为含有抗体与溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分的冷冻干燥制剂，其中，进一步含有中性盐、二糖类、非离子型表面活性剂和缓冲剂。
2.如权利要求1所述的冷冻干燥制剂，其中，该中性盐为氯化钠。
3.如权利要求1或2所述的冷冻干燥制剂，其中，该二糖类选自由海藻糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖组成的组。
4.如权利要求1至3中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该非离子型表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
5.如权利要求1至3中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该非离子型表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇组成的组。
6.如权利要求1至5中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该缓冲剂为磷酸缓冲剂。
7.如权利要求1或2所述的冷冻干燥制剂，其中，该二糖类为蔗糖，该非离子型表面活性剂为聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，并且该缓冲剂为磷酸缓冲剂。
8.如权利要求1至7中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，相对于该融合蛋白的含量，该中性盐、该二糖类和该离子型表面活性剂的含量分别为0.015～2.5(w/w)、2.5～200(w/w)和0.005～6(w/w)。
9.如权利要求1至7中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，相对于该融合蛋白的含量，该中性盐、该二糖类和该离子型表面活性剂的含量分别为0.05～0.5(w/w)、5～50(w/w)和
0.02～0.2(w/w)。
10.如权利要求1至7中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，相对于该融合蛋白的含量，该中性盐、该二糖类和该离子型表面活性剂的含量分别为0.1～0.25(w/w)、10～25(w/w)和
0.04～0.1(w/w)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，用纯水溶解时的pH为5.5～
7.5。
12.如权利要求1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶通过肽键结合于该抗体的轻链或重链中的任一者的C末端侧或N末端侧中的任一末端侧而成的。
13.如权利要求1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶通过肽键结合于该抗体的重链的C末端侧而成的。
14.如权利要求1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶经由至少一个氨基酸所构成的接头结合于该抗体的轻链或重链中的任一者的C末端侧或N末端侧中的任一末端侧而成的。
15.如权利要求1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶经由至少一个氨基酸所构成的接头结合于该抗体的重链的C末端侧而成的。
16.如权利要求14或15所述的冷冻干燥制剂，其中，该接头具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列。
17.如权利要求1至16中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该溶酶体酶为人溶酶体酶。
18.如权利要求1至17中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该溶酶体酶选自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、透明质酸酶-1、CLN1和CLN2组成的组。
19.如权利要求17所述的冷冻干燥制剂，其中，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
20.如权利要求1至19中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人抗体或人源化抗体。
21.如权利要求1至20中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体将存在于血管内皮细胞的表面的分子作为抗原进行识别。
22.如权利要求21所述的冷冻干燥制剂，其中，该血管内皮细胞为人的血管内皮细胞。
23.如权利要求21或22所述的冷冻干燥制剂，其中，该血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。
24.如权利要求23所述的冷冻干燥制剂，其中，该存在于脑血管内皮细胞的表面的分子选自由转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F、有机阴离子转运蛋白、MCT-8和单羧酸转运蛋白组成的组。
25.如权利要求20所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人源化抗人转铁蛋白受体(hTfR)抗体。
26.如权利要求20所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗hTfR抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白选自由下述(a)～(c)组成的组：
(a)由具有序列号2所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
(b)由具有序列号4所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
(c)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号
10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
27.如权利要求20所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗hTfR抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白选自由下述(a)～(c)组成的组：
(a)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号2所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而由此形成了序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
(b)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号4所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而由此形成了序列号15所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
(c)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而由此形成了序列号17所表示的氨基酸序列的融合蛋白。
28.如权利要求1至27中任一项所述的冷冻干燥制剂，其被封入在由硼硅酸玻璃或疏水性树脂形成的容器中。
29.如权利要求28所述的冷冻干燥制剂，其中，该容器使用环烯烃共聚物、环烯烃类开环聚合物或环烯烃类开环聚合物的氢化物而形成。
冷冻干燥制剂
技术领域
背景技术
[0002] 作为使抗体与溶酶体酶结合而成的蛋白质，有制作抗胰岛素受体抗体与α-L-艾杜糖醛酸酶的融合蛋白(专利文献1)、抗胰岛素受体抗体与艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白(专利文献2)的报道。在这种人工构建的新蛋白质的制剂化中，何种形态适合作为它们的制剂配方是未知的。
[0003] 关于抗体的制剂化，有含有抗IL-13抗体作为有效性成分的冷冻干燥制剂(专利文献3)、含有精氨酸、组氨酸、赖氨酸等氨基酸或其盐的抗体的冷冻干燥制剂(专利文献4)、含有葡甲胺的抗体的冷冻干燥制剂(专利文献5)、含有乳糖酸的抗EGF受体抗体的冷冻干燥制剂(专利文献6)、含有柠檬酸、聚山梨醇酯80和蔗糖的抗人IL-23p19抗体的冷冻干燥制剂(专利文献7)等很多报道。即，实际情况是，即使仅对于抗体来说，在其制剂化时，也需要反复进行试验。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献1：日本特表2010-534723号公报
[0007] 专利文献2：日本特表2012-521194号公报
[0008] 专利文献3：日本特表2016-519124号公报
[0009] 专利文献4：WO2007/074880
[0010] 专利文献5：WO2006/132363
[0011] 专利文献6：日本特表2009-540015号公报
[0012] 专利文献7：日本特表2012-501332号公报
发明内容
[0013] 发明所要解决的问题
[0014] 本发明的目的在于提供含有蔗糖和非离子型表面活性剂作为稳定剂、具有能够在市场上流通的程度的稳定性、含有使抗体与溶酶体酶结合而成的蛋白质作为有效成分的冷冻干燥制剂。
[0015] 用于解决问题的方法
[0016] 在面向上述目的的研究中，本发明人发现，通过将使抗体与作为人溶酶体酶之一的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而成的蛋白质制成含有蔗糖和非离子型表面活性剂作为赋形剂的冷冻干燥制剂的形态，能够稳定地进行保存，从而完成了本发明。即，本发明包括下述发明。
[0017] 1.一种冷冻干燥制剂，其为含有抗体与溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分的冷冻干燥制剂，其中，进一步含有中性盐、二糖类、非离子型表面活性剂和缓冲剂。
[0018] 2.如上述1所述的冷冻干燥制剂，其中，该中性盐为氯化钠。
[0019] 3.如上述1或2所述的冷冻干燥制剂，其中，该二糖类选自由海藻糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖组成的组。
[0020] 4.如上述1至3中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该非离子型表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
[0022] 6.如上述1至5中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该缓冲剂为磷酸缓冲剂。
[0023] 7.如上述1或2所述的冷冻干燥制剂，其中，该二糖类为蔗糖，该非离子型表面活性剂为聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，并且该缓冲剂为磷酸缓冲剂。
[0024] 8.如上述1至7中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，相对于该融合蛋白的含量，该中性盐、该二糖类和该离子型表面活性剂的含量分别为0.015～2.5(w/ww/w)、2.5～200(w/ww/w)和0.005～6(w/ww/w)。
[0025] 9.如上述1至7中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，相对于该融合蛋白的含量，该中性盐、该二糖类和该离子型表面活性剂的含量分别为0.05～0.5(w/ww/w)、5～50(w/ww/w)和0.02～0.2(w/ww/w)。
[0026] 10.如上述1至7中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，相对于该融合蛋白的含量，该中性盐、该二糖类和该离子型表面活性剂的含量分别为0.1～0.25(w/ww/w)、10～25(w/ww/w)和0.04～0.1(w/ww/w)。
[0027] 11.如上述1至10中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，用纯水溶解时的pH为5.5～7.5。
[0028] 12.如上述1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶通过肽键结合于该抗体的轻链或重链中的任一者的C末端侧或N末端侧中的任一末端侧而成的。
[0029] 13.如上述1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶通过肽键结合于该抗体的重链的C末端侧而成的。
[0030] 14.如上述1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶经由至少一个氨基酸所构成的接头结合于该抗体的轻链或重链中的任一者的C末端侧或N末端侧中的任一末端侧而成的。
[0031] 15.如上述1至11中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该融合蛋白是该人溶酶体酶经由至少一个氨基酸所构成的接头结合于该抗体的重链的C末端侧而成的。
[0032] 16.如上述14或15所述的冷冻干燥制剂，其中，该接头具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列。
[0033] 17.如上述1至16中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该溶酶体酶为人溶酶体酶。
[0034] 18.如上述1至17中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该溶酶体酶选自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、透明质酸酶-1、CLN1和CLN2组成的组。
[0035] 19.如上述17所述的冷冻干燥制剂，其中，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
[0036] 20.如上述1至19中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人抗体或人源化抗体。
[0037] 21.如上述1至20中任一项所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体将存在于血管内皮细胞的表面的分子作为抗原进行识别。
[0038] 22.如上述21所述的冷冻干燥制剂，其中，该血管内皮细胞为人的血管内皮细胞。
[0039] 23.如上述21或22所述的冷冻干燥制剂，其中，该血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。
[0040] 24.如上述23所述的冷冻干燥制剂，其中，该存在于脑血管内皮细胞的表面的分子选自由转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F、有机阴离子转运蛋白、MCT-8和单羧酸转运蛋白组成的组。
[0041] 25.如上述20所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人源化抗人转铁蛋白受体(hTfR)抗体。
[0042] 26.如上述20所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗hTfR抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白选自由下述(a)～(c)组成的组：
[0043] (a)由具有序列号2所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
[0044] (b)由具有序列号4所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白；
[0045] (c)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
[0046] 27.如上述20所述的冷冻干燥制剂，其中，该抗体为人源化抗hTfR抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗hTfR抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白选自由下述(a)～(c)组成的组：
[0047] (a)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号2所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而由此形成了序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0048] (b)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号4所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而由此形成了序列号15所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0049] (c)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而由此形成了序列号17所表示的氨基酸序列的融合蛋白。
[0052] 发明效果
[0053] 根据本发明，能够使抗体与溶酶体酶结合而成的融合蛋白以冷冻干燥制剂的形式以能够在市场上流通的程度稳定化。
具体实施方式
[0054] 本发明涉及以使抗体与溶酶体酶结合而成的蛋白质作为有效成分的药物的、在冷冻干燥状态下稳定储存的药物组合物。在此，与溶酶体酶结合的抗体优选为人抗体或人源化抗体，但只要具有与抗原特异性结合的性质，对于抗体的动物种等没有特别限制。例如，抗体可以为人以外的哺乳动物的抗体，另外也可以为人抗体与人以外的其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。
[0055] 人抗体是指其整体由来源于人的基因编码的抗体。其中，出于提高基因的表达效率等目的对原来的人的基因施加突变而得到的基因所编码的抗体也是人抗体。另外，将编码人抗体的两种以上的基因组合、并将某一人抗体的一部分置换成其他人抗体的一部分而得到的抗体也是人抗体。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
[0056] 原则上，人抗体在免疫球蛋白轻链的可变区具有三处互补决定区(CDR)、在免疫球蛋白重链的可变区具有三处互补决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链的三处CDR按照从N末端侧起的顺序依次称为CDR1、CDR2和CDR3。免疫球蛋白重链的三处CDR按照从N末端侧起的顺序依次称为CDR1、CDR2和CDR3。通过将某一人抗体的CDR置换成其他人抗体的CDR而改变了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也是人抗体。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
[0057] 原则上，人抗体的重链和轻链的可变区均包含四个框架区1～4(FR1～4)。FR1为与CDR1在其N末端侧相邻的区域，由构成重链和轻链的各肽中的从其N末端至与CDR1的N末端相邻的氨基酸为止的氨基酸序列构成。FR2由构成重链和轻链的各肽中的CDR1与CDR2之间的氨基酸序列构成。FR3由构成重链和轻链的各肽中的CDR2与CDR3之间的氨基酸序列构成。FR4由与CDR3的C末端相邻的氨基酸至可变区的C末端为止的氨基酸序列构成。但是，不限于此，本发明中，也可以将上述各FR区域中除去其N末端侧的1～5个氨基酸和/或C末端侧的1～5个氨基酸后的区域作为框架区。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
[0058] 本发明中，通过改造原来的人抗体的基因而对原来的抗体的氨基酸序列施加了置换、缺失、添加等突变的抗体也称为人抗体。在将原来的抗体的氨基酸序列之中的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。在使原来的抗体的氨基酸序列之中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～20个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。另外，施加了将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变的抗体也是人抗体。在添加氨基酸的情况下，在原来的抗体的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～20个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个的氨基酸。施加了将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变的抗体也是人抗体。施加了突变的抗体的氨基酸序列与原来的抗体的氨基酸序列优选显示出80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性、更进一步优选显示出98％以上的同源性。即，本发明中提到“来源于人的基因”时，除了来源于人的原来的基因以外，也包含通过对来源于人的原来的基因施加改造而得到的基因。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
[0059] 例如，在对序列号2所表示的人源化抗hTfR抗体编号1的轻链、序列号4所表示的人源化抗hTfR抗体编号2的轻链和序列号6所表示的人源化抗hTfR抗体编号3的轻链施加突变的情况下，应用上述的规则。另外，在对序列号8所表示的人源化抗hTfR抗体编号1的重链、序列号9所表示的人源化抗hTfR抗体编号2的重链和序列号10所表示的人源化抗hTfR抗体编号3的重链施加突变的情况下，也应用上述的规则。
[0060] 在对编码原来的人抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因施加突变的情况下，施加突变后的基因与原来的基因优选具有80％以上的同源性、更优选具有90％以上的同源性，但只要突变导入后的抗体对抗原具有特异性的亲和性，对于同源性没有特别限制。在将轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为
1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在对轻链的可变区添加氨基酸的情况下，在轻链的可变区的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的轻链的可变区的氨基酸序列与原来的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。特别是在将CDR的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为
1～2个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在添加氨基酸的情况下，在该氨基酸序列中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的各CDR各自的氨基酸序列与原来的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在对轻链的可变区添加氨基酸的情况下，在轻链的可变区的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的轻链的可变区的氨基酸序列与原来的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。特别是在将CDR的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为
1～2个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在添加氨基酸的情况下，在该氨基酸序列中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的各CDR各自的氨基酸序列与原来的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
[0061] 例如，在对序列号23所表示的人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的可变区、序列号25所表示的人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的可变区和序列号27所表示的人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的可变区施加突变的情况下，应用上述的规则。
[0062] 序列号23所表示的轻链的可变区在CDR1中包含序列号29或30的氨基酸序列、在CDR2中包含序列号31或32的氨基酸序列、在CDR3中包含序列号33的氨基酸序列。序列号25所表示的轻链的可变区在CDR1中包含序列号40或41的氨基酸序列、在CDR2中包含序列号42或43的氨基酸序列、在CDR3中包含序列号44的氨基酸序列。序列号27所表示的轻链的可变区在CDR1中包含序列号51或52的氨基酸序列、在CDR2中包含序列号53或54的氨基酸序列、在CDR3中包含序列号55的氨基酸序列。在对这些CDR施加突变的情况下，应用上述的规则。
[0063] 在对编码原来的人抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因施加突变的情况下，施加突变后的基因与原来的基因优选具有80％以上的同源性、更优选具有90％以上的同源性，但只要突变导入后的抗体对抗原具有特异性的亲和性，对于同源性没有特别限制。在将重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。在使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为
1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在对重链的可变区添加氨基酸的情况下，在重链的可变区的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的重链的可变区的氨基酸序列与原来的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。特别是在将CDR的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为
1～2个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在添加氨基酸的情况下，在该氨基酸序列中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的各CDR各自的氨基酸序列与原来的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在对重链的可变区添加氨基酸的情况下，在重链的可变区的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的重链的可变区的氨基酸序列与原来的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。特别是在将CDR的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为
1～2个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在添加氨基酸的情况下，在该氨基酸序列中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～5个、更优选为1～3个、进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加突变后的各CDR各自的氨基酸序列与原来的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性。对于后述的人源化抗体而言也是同样。
[0064] 例如，在对序列号24所表示的人源化抗hTfR抗体编号1的重链的可变区、序列号26所表示的人源化抗hTfR抗体编号2的重链的可变区和序列号28所表示的人源化抗hTfR抗体编号3的重链的可变区施加突变的情况下，应用上述的规则。
[0065] 序列号24所表示的重链的可变区在CDR1中包含序列号34或35的氨基酸序列、在CDR2中包含序列号36或37的氨基酸序列、在CDR3中包含序列号38或39的氨基酸序列。序列号26所表示的重链的可变区在CDR1中包含序列号45或46的氨基酸序列、在CDR2中包含序列号47或48的氨基酸序列、在CDR3中包含序列号49或50的氨基酸序列。序列号28所表示的重链的可变区在CDR1中包含序列号56或57的氨基酸序列、在CDR2中包含序列号58或59的氨基酸序列、在CDR3中包含序列号60或61的氨基酸序列。在对这些CDR施加突变的情况下，应用上述的规则。
[0066] 本发明中，“同源性”是指使用同源性计算算法对两个氨基酸序列进行比较的情况下，最佳比对中的相同的氨基酸残基相对于全部氨基酸残基的比例(％)。将两个氨基酸序列以该比例所示的同源性进行比较是本发明的技术领域中所公知的，对于本领域技术人员而言是容易理解的。
[0067] 需要说明的是，作为利用其他氨基酸对上述抗hTfR抗体的轻链和重链的氨基酸序列中的氨基酸进行的置换，可以列举例如芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等分类为同一组的氨基酸。可以预测这样的利用相似氨基酸的置换不会给蛋白质的表型带来变化(即，保守的氨基酸置换)。保守的氨基酸置换的具体例是该技术领域中公知的，记载于各种文献中(例如，参考Bowie等,Science,247:1306-1310(1990))。
[0068] 需要说明的是，本发明中，作为用于计算原来的蛋白质(包括抗体)的氨基酸序列与施加突变后的蛋白质的氨基酸序列的同源性的同源性计算算法，BLAST(Altschul SF.J Mol.Biol.215.403-10,(1990))、Pearson和Lipman的类似性检索法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85.2444(1988))、Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2.482-9(1981))等是公知的。另外，美国国立卫生研究院在互联网上提供的BLAST程序之一blastp作为用于计算两个氨基酸序列的同源性的手段是公知的。
[0069] 本发明中，“人源化抗体”的术语是指可变区的一部分(例如特别是CDR的全部或一部分)的氨基酸序列来源于人以外的哺乳动物、除此以外的区域来源于人的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的三处互补决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的三处互补决定区(CDR)用其他哺乳动物的CDR置换而制作的抗体。作为移植到人抗体的适当位置的CDR的来源的其他哺乳动物的生物种类只要是人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，例如为小鼠。
[0070] 本发明中，“嵌合抗体”的术语是指来源于两个以上的不同种的、两个以上的不同抗体的片段连接而成的抗体。
[0071] 人抗体与其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指人抗体的一部分被人以外的哺乳动物的抗体的一部分置换而得到的抗体。抗体由以下说明的Fc段、Fab段和铰链部构成。作为这样的嵌合抗体的具体例，可以列举Fc段来源于人抗体、而Fab段来源于其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰链部来源于人抗体或其他哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举Fc段来源于其他哺乳动物、而Fab段来源于人抗体的嵌合抗体。铰链部可以来源于人抗体或其他哺乳动物的抗体中的任意一者。
[0072] 另外，抗体也可以说由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例，还可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于人抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体；相反地重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于其他哺乳动物的嵌合抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于人抗体的嵌合抗体。在此，其他哺乳动物的生物种类只要是人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠。
[0073] 人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特别地称为“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体可以列举Fc段来源于人抗体、而Fab段来源于小鼠抗体的嵌合抗体；或者相反地Fc段来源于小鼠抗体、而Fab段来源于人抗体的嵌合抗体。铰链部来源于人抗体或小鼠抗体中的任意一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例，还可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于人抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于小鼠抗体的嵌合抗体；相反地重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)来源于小鼠抗体、而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)来源于人抗体的嵌合抗体。
[0074] 抗体原本具有由两条免疫球蛋白轻链和两条免疫球蛋白重链共计四条多肽链构成的基本结构。但是，本发明中，提到“抗体”时，除了具有该基本结构的抗体以外，还包含：
[0075] (1)由一条免疫球蛋白轻链和一条免疫球蛋白重链共计两条多肽链构成的抗体；或者如以下详述的那样，
[0076] (2)在免疫球蛋白轻链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白重链而成的单链抗体；以及
[0077] (3)在免疫球蛋白重链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体。
[0078] 另外，(4)由从原本的含义下的抗体的基本结构中缺失Fc段而得到的Fab段构成的片段、以及由Fab段和铰链部的全部或一部分构成的片段(包括Fab、F(ab’)和F(ab’)2)也包含在本发明中的“抗体”中。此外，经由接头序列使轻链的可变区与重链的可变区结合而形成单链抗体的scFv也包含在本发明中的抗体中。
[0079] 在此，Fab是指，包含可变区和CL区(轻链的恒定区)的一条轻链与包含可变区和CH1区(重链的恒定区的部分1)的一条重链在各自中存在的半胱氨酸残基之间通过二硫键结合而成的分子。Fab中，重链除了包含可变区和CH1区(重链的恒定区的部分1)以外，可以进一步包含铰链部的一部分，但这种情况下的铰链部缺失存在于铰链部中将抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基。Fab中，轻链与重链通过形成在轻链的恒定区(CL区)中存在的半胱氨酸残基与重链的恒定区(CH1区)或铰链部中存在的半胱氨酸残基之间的二硫键进行结合。将形成Fab的重链称为Fab重链。由于Fab缺失了存在铰链部中将抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基，因此由一条轻链和一条重链构成。构成Fab的轻链包含可变区和CL区。构成Fab的重链可以由可变区和CH1区构成，也可以除了可变区、CH1区以外还包含铰链部的一部分。但是，这种情况下，铰链部按照不包含使重链间结合的半胱氨酸残基的方式进行选择，以使在铰链部不会在两条重链之间形成二硫键。F(ab’)中，其重链除了包含可变区和CH1区以外，还包含含有将重链彼此结合的半胱氨酸残基的铰链部的全部或一部分。F(ab’)2是指两个F(ab’)在彼此的铰链部中存在的半胱氨酸残基之间通过二硫键结合而成的分子。将形成F(ab’)或F(ab’)2的重链称为Fab’重链。另外，多个抗体直接或经由接头结合而成的二聚体、三聚体等聚合物也是抗体。此外，不限于这些，包含免疫球蛋白分子的一部分、且具有与抗原特异性结合的性质的片段均包含在本发明中所述的“抗体”中。即，本发明中，在提到免疫球蛋白轻链时，包含来源于免疫球蛋白轻链、具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列的片段。另外，在提到免疫球蛋白重链时，包含来源于免疫球蛋白重链、具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列的片段。因此，只要具有可变区的全部或一部分氨基酸序列，例如缺失了Fc段的片段也是免疫球蛋白重链。
[0080] 另外，在此，Fc或Fc段是指包含抗体分子中的由CH2区(重链的恒定区的部分2)和CH3区(重链的恒定区的部分3)构成的片段的区域。
[0081] 此外，本发明中提到“抗体”时，还包含：
[0082] (5)使构成上述(4)所示的Fab、F(ab’)或F(ab’)2的轻链和重链经由接头序列进行结合、从而分别形成的单链抗体scFab、scF(ab’)和scF(ab’)2。在此，scFab、scF(ab’)和scF(ab’)2中，可以在轻链的C末端侧结合有接头序列、并且进一步在其C末端侧结合有重链，另外也可以在重链的C末端侧结合有接头序列、并且进一步在其C末端侧结合有轻链。此外，使轻链的可变区与重链的可变区经由接头序列结合而形成的单链抗体scFv也包含在本发明中的抗体中。scFv中，可以在轻链的可变区的C末端侧结合有接头序列、并且进一步在其C末端侧结合有重链的可变区，另外也可以在重链的可变区的C末端侧结合有接头序列、并且进一步在其C末端侧结合有轻链的可变区。
[0083] 本发明中，提到“单链抗体”时，是指在包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质。例如，上述(2)、(3)和(5)所示者包含在单链抗体中。另外，在包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质也是本发明中的“单链抗体”。在免疫球蛋白重链的C末端侧经由接头序列结合有免疫球蛋白轻链的单链抗体中，通常免疫球蛋白重链缺失了Fc段。免疫球蛋白轻链的可变区具有三个与抗体的抗原特异性相关的互补决定区(CDR)。同样地，免疫球蛋白重链的可变区也具有三个CDR。这些CDR是决定抗体的抗原特异性的主要区域。因此，单链抗体中优选包含免疫球蛋白重链的全部三个CDR和免疫球蛋白轻链的全部三个CDR。但是，只要可维持抗体的抗原特异性的亲和性，也可以为使CDR的一个或多个缺失的单链抗体。
[0084] 单链抗体中，配置在免疫球蛋白的轻链与重链之间的接头序列是由优选为2～50个、更优选为8～50个、进一步优选为10～30个、更进一步优选为12～18个或15～25个、例如为15个或25个的氨基酸残基构成的肽链。关于这样的接头序列，只要由其将两链连接而成的抗hTfR抗体保持对hTfR的亲和性，则对其氨基酸序列没有限定，但优选仅由甘氨酸或者由甘氨酸和丝氨酸构成，例如具有氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号19)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号20)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号21)、或者这些氨基酸序列重复2～10次或2～5次而成的序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的C末端侧经由接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区而形成ScFv的情况下，优选为由相当于3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号19)连续而成的序列的共计15个氨基酸构成的接头序列。
[0085] 本发明中，抗体特异性识别的抗原例如为存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)。作为该表面抗原，可以列举转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F等有机阴离子转运蛋白、MCT-8等单羧酸转运蛋白、Fc受体，但不限定于这些。抗原优选为存在于人血管内皮细胞的表面的这些分子(表面抗原)。
[0086] 上述表面抗原之中，转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、OATP-F等有机阴离子转运蛋白、MCT-8等单羧酸转运蛋白存在于形成血脑屏障(Blood Brain Barrier)的脑毛细血管内皮细胞的表面。能够识别这些抗原的抗体可经由抗原与脑毛细血管内皮细胞(脑血管内皮细胞)结合。并且，与脑毛细血管内皮细胞结合的抗体能够通过血脑屏障而到达中枢神经系统。因此，通过使目标蛋白质与这样的抗体结合，能够使其到达中枢神经系统。作为目标蛋白质，可以列举具有应在中枢神经系统中发挥药效的功能的蛋白质。可以列举例如在伴有中枢神经障碍的溶酶体病患者中缺失或功能缺陷的溶酶体酶作为目标蛋白质。该溶酶体酶无法直接到达中枢神经系统，无法对患者的中枢神经障碍显示出药效，但通过与这些抗体结合，变得能够通过血脑屏障，因此能够改善在溶酶体病患者中观察到的中枢神经障碍。
[0087] 本发明中，“人转铁蛋白受体”或“hTfR”的术语是指具有序列号22所表示的氨基酸序列的膜蛋白质。本发明的抗hTfR抗体在其一个实施方式中与序列号22所表示的氨基酸序列中从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基至C末端的苯丙氨酸为止的部分(hTfR的胞外区)特异性地结合，但并不限定于此。
[0088] 以下以抗hTfR的抗体为例对抗体的制作方法进行说明。作为抗hTfR的抗体的制作方法，一般的方法是使用导入了整合有hTfR基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhTfR)，使用该rhTfR利用小鼠等动物进行免疫而得到的方法。从免疫后的动物取出抗hTfR的抗体产生细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，由此能够制作具有抗hTfR的抗体产生能力的杂交瘤细胞。
[0089] 另外，通过利用体外免疫法用rhTfR对由小鼠等动物得到的免疫系统细胞进行免疫，也能够取得产生抗hTfR的抗体的细胞。在利用体外免疫法进行免疫的情况下，对该免疫系统细胞所来源的动物种类没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，可以使用例如由小鼠的脾脏制备的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可以使用由人的外周血、骨髄、脾脏等制备的细胞。在利用体外免疫法对人的免疫系统细胞进行免疫的情况下，能够得到抗hTfR的人抗体。
[0090] 本发明中，对于应当与抗体结合的人溶酶体酶没有特别限定，可以列举α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS或I2S)、葡糖脑苷脂酶(GBA)、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白质、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶(LAMAN)、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、α-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶(ASM)、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)、乙酰肝素N-硫酸酯酶(SGSH)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶(AC)、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1(PPT-1)、三肽基肽酶-1(TPP-1)、透明质酸酶-1、酸性α-葡糖苷酶(GAA)、CLN1和CLN2等溶酶体酶。
[0091] 在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)的情况下，关于与抗体结合的人溶酶体酶，α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)能够用作赫勒氏综合征或赫勒-施艾氏(Hurler-Scheie)综合征中的中枢神经障碍治疗剂，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)能够用作亨特综合征中的中枢神经障碍治疗剂，葡糖脑苷脂酶(GBA)能够用作戈谢病中的中枢神经障碍治疗剂，β半乳糖苷酶能够用作GM1-神经节苷脂贮积症1～3型中的中枢神经障碍治疗剂，GM2活化蛋白质能够用作GM2-神经节苷脂贮积症AB变异型中的中枢神经障碍治疗剂，β-氨基己糖苷酶A能够用作山德霍夫氏病和泰-萨克斯病中的中枢神经障碍治疗剂，β-氨基己糖苷酶B能够用作山德霍夫氏病中的中枢神经障碍治疗剂，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶能够用作I-细胞病中的中枢神经障碍治疗剂，α-甘露糖苷酶(LAMAN)能够用作α-甘露糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，β-甘露糖苷酶能够用作β-甘露糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，半乳糖神经酰胺酶(GALC)能够用作克拉伯病中的中枢神经障碍治疗剂，鞘脂激活蛋白C能够用作戈谢病样贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，芳基硫酸酯酶A(ARSA)能够用作异染性脑白质退化症(异染性脑白质营养不良)中的中枢神经障碍治疗剂，α-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)能够用作岩藻糖苷贮积症中的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶能够用作天冬氨酰葡糖胺尿症中的中枢神经障碍治疗剂，α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶能够用作辛德勒病和川崎病中的中枢神经障碍治疗剂，酸性鞘磷脂酶(ASM)能够用作尼曼匹克病中的中枢神经障碍治疗剂，α-半乳糖苷酶能够用作法布里病中的中枢神经障碍治疗剂，β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)能够用作斯赖综合征中的中枢神经障碍治疗剂，乙酰肝素N-硫酸酯酶(SGSH)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶和N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶能够用作沙费利波综合征中的中枢神经障碍治疗剂，酸性神经酰胺酶(AC)能够用作法伯病中的中枢神经障碍治疗剂，淀粉-1,6-葡萄糖苷酶能够用作柯里氏病(福布斯-柯里氏病)中的中枢神经障碍治疗剂，唾液酸酶能够用作唾液酸酶缺乏症中的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶能够用作天冬氨酰葡糖胺尿症中的中枢神经障碍治疗剂，棕榈酰蛋白硫酯酶-1(PPT-1)能够用作神经元蜡样质脂褐质沉积症或桑-哈二氏(Santavuori-Haltia)病中的中枢神经障碍治疗剂，三肽基肽酶-1(TPP-1)能够用作神经元蜡样质脂褐质沉积症或詹-比二氏(Jansky-Bielschowsky)病中的中枢神经障碍治疗剂，透明质酸酶-1能够用作透明质酸酶缺乏症中的中枢神经障碍治疗剂，酸性α-葡糖苷酶(GAA)能够用作庞贝氏症中的中枢神经障碍治疗剂，CLN1和CLN2能够用作巴藤病中的中枢神经障碍治疗剂。
[0092] 在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞的表面的分子(表面抗原)的情况下，作为应当与抗体结合的溶酶体酶的优选例，可以列举人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)。I2S是具有将存在于硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素等糖胺聚糖(GAG)分子内的硫酸酯键水解的活性的溶酶体酶之一。亨特综合征是先天性缺乏该酶的基因疾病。亨特综合征的患者在组织内蓄积硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素，结果表现出角膜混浊、精神发育迟缓等各种症状。但是，在轻症的情况下，也有时观察不到精神发育迟缓。因此，该抗体与hI2S的融合蛋白能够通过透过BBB而将蓄积在脑组织内的GAG分解，因此，通过给药于表现出精神发育迟缓的亨特综合征的患者，能够作为中枢神经障碍治疗剂使用。此外，也可以预防性地给药于未表现出精神发育迟缓的亨特综合征的患者。
[0093] 本发明中，“人I2S”或“hI2S”的术语特别是指具有与野生型的hI2S相同的氨基酸序列的hI2S。野生型的hI2S具有序列号1所表示的由525个氨基酸构成的氨基酸序列。但是，不限于此，只要具有I2S活性，对野生型的hI2S的氨基酸序列施加置换、缺失、添加等突变而得到的氨基酸序列也包含在hI2S中。在将hI2S的氨基酸序列的氨基酸置换为其他氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。在使hI2S的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，所缺失的氨基酸的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个。另外，也可以施加将这些氨基酸的置换和缺失进行组合的突变。在对hI2S添加氨基酸的情况下，在hI2S的氨基酸序列之中或者在N末端侧或C末端侧添加优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个的氨基酸。也可以施加将这些氨基酸的添加、置换和缺失进行组合的突变。施加了突变的hI2S的氨基酸序列与原来的hI2S的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性、更优选显示出90％以上的同源性、进一步优选显示出95％以上的同源性、更进一步优选显示出98％以上的同源性。
[0094] 需要说明的是，本发明中，提到hI2S具有I2S活性时是指，在使hI2S与抗体融合而形成融合蛋白时，相对于天然型的hI2S本来具有的活性，具有3％以上的活性。其中，相对于天然型的hI2S本来具有的活性，该活性优选为10％以上、更优选为20％以上、进一步优选为50％以上、更进一步优选为80％以上。在与抗体融合的hI2S施加了突变的情况下也同样。抗体例如为抗hTfR抗体。
[0095] 本发明中提到“融合蛋白”时是指，使抗体与人溶酶体酶经由非肽接头或肽接头结合、或者直接结合而得到的物质。以下对使抗体与人溶酶体酶结合的方法进行详述。
[0096] 作为使抗体与人溶酶体酶结合的方法，有经由非肽接头或肽接头使其结合的方法。作为非肽接头，可以使用生物素-链霉抗生物素蛋白、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类和透明质酸、或它们的衍生物、或者它们的组合。肽接头是由以肽键结合的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端分别与抗体或人溶酶体酶中的任意一者形成共价键，由此使抗体与人溶酶体酶结合。
[0097] 在使用生物素-链霉抗生物素蛋白作为非肽接头的情况下，可以使抗体结合生物素，使人溶酶体酶结合链霉抗生物素蛋白，经由该生物素与链霉抗生物素蛋白的结合使抗体与人溶酶体酶结合；相反地，也可以使抗体结合链霉抗生物素蛋白，使人溶酶体酶结合生物素，经由该生物素与链霉抗生物素蛋白的结合使抗体与人溶酶体酶结合。生物素和链霉抗生物素蛋白可以利用公知的方法与蛋白质结合。
[0098] 使用PEG作为非肽接头使本发明的抗体与人溶酶体酶结合而得到的融合蛋白特别地称为抗体-PEG-人溶酶体酶。抗体-PEG-人溶酶体酶可以通过使抗体与PEG结合而制作抗体-PEG、接着使抗体-PEG与人溶酶体酶结合来制造。或者，抗体-PEG-人溶酶体酶也可以通过使人溶酶体酶与PEG结合而制作人溶酶体酶-PEG、接着使人溶酶体酶-PEG与抗体结合来制造。使PEG与抗体和人溶酶体酶结合时，使用经碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状酰亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团修饰的PEG。这些导入至PEG中的官能团主要通过与抗体和人溶酶体酶分子内的氨基反应而将PEG与抗体和人溶酶体酶共价键合。对此时使用的PEG的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝300～60000、更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可以优选作为非肽接头使用。
[0099] 例如，抗体-PEG通过将抗体和具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)按照ALD-PEG-ALD相对于该抗体的摩尔比为11、12.5、15、110、120等的方式进行混合，向其中添加NaCNBH3等还原剂使其反应而得到。接着，在NaCNBH3等还原剂的存在下使抗体-PEG与人溶酶体酶反应，由此得到抗体-PEG-人溶酶体酶。相反地，也可以通过先使人溶酶体酶与ALD-PEG-ALD结合而制作人溶酶体酶-PEG，接着使抗体与人溶酶体酶-PEG结合而得到抗体-PEG-人溶酶体酶。
[0100] 关于抗体和人溶酶体酶，也可以在抗体的重链或轻链的C末端侧或N末端侧经由接头序列或者直接通过肽键分别结合人溶酶体酶的N末端或C末端。这样使抗体与人溶酶体酶结合而成的融合蛋白可以通过将在编码抗体的重链或轻链的cDNA的3’末端侧或5’末端侧直接或者夹着编码接头序列的DNA片段以框内方式配置有编码人溶酶体酶的cDNA的DNA片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，并对导入有该表达载体的哺乳动物细胞进行培养而得到。在该哺乳动物细胞中，在使编码人溶酶体酶的DNA片段与重链结合的情况下，将整合有编码抗体的轻链的cDNA片段的哺乳动物细胞用的表达载体也导入至相同的宿主细胞中，另外，在使编码人溶酶体酶的DNA片段与轻链结合的情况下，将整合有编码抗体的重链的cDNA片段的哺乳动物细胞用的表达载体也导入至相同的宿主细胞中。在抗体为单链抗体的情况下，使抗体与人溶酶体酶结合而成的融合蛋白可以通过将在编码人溶酶体酶的cDNA的5’末端侧或3’末端侧直接或者夹着编码接头序列的DNA片段连接有编码单链抗体的cDNA的DNA片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，并在导入有该表达载体的这些细胞中进行表达而得到。
[0101] 在抗体的轻链的C末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的C末端侧。在此，抗体的轻链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
[0102] 在抗体的重链的C末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的重链的C末端侧。在此，抗体的重链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
[0103] 在抗体的轻链的N末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的N末端侧。在此，抗体的轻链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
[0104] 在抗体的重链的N末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白中，抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的重链的N末端侧。在此，抗体的重链与人溶酶体酶可以直接结合，也可以经由接头结合。
[0105] 此时，在抗体与人溶酶体酶之间配置接头序列的情况下，该序列由优选为1～50个、更优选为1～17个、进一步优选为1～10个、更进一步优选为1～5个的氨基酸构成，构成接头序列的氨基酸的个数可以根据应当与抗体结合的人溶酶体酶而适当调节为1个、2个、3个、1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个等。关于这样的接头序列，只要由其连接的抗体保持对hTfR的亲和性，并且由该接头序列连接的人溶酶体酶在生理条件下能够发挥该蛋白质的生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如具有由甘氨酸或丝氨酸中的任意一个氨基酸构成的氨基酸序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号19)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号20)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号21)、或者1～10个、或者2～5个这些氨基酸序列连续而成的、由1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用具有氨基酸序列Gly-Ser的序列作为接头序列。抗体为单链抗体时也同样。
[0106] 需要说明的是，本发明中，在一个肽链包含两个以上的接头序列的情况下，为方便起见，将各接头序列从N末端侧起依次命名为第一接头序列、第二接头序列。
[0107] 在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，作为抗体的优选方式，可以列举以下的(x)～(z)。即为下述中的任意一者：
[0108] (x)轻链具有序列号2所表示的氨基酸序列、重链具有序列号8所表示的氨基酸序列的抗体；
[0109] (y)轻链具有序列号4所表示的氨基酸序列、重链具有序列号9所表示的氨基酸序列的抗体；
[0110] (z)轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、重链具有序列号10所表示的氨基酸序列的抗体。
[0111] 需要说明的是，在此，(x)、(y)和(z)分别相当于实施例中所示的人源化抗hTfR抗体编号1、人源化抗hTfR抗体编号2和人源化抗hTfR抗体编号3。
[0112] 但是，在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，抗体的优选方式并不限于上述的(x)～(z)。例如，只要对hTfR具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有80％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有80％以上的同源性的抗体也可以在本发明中使用。另外，只要对hTfR具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有90％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有90％以上的同源性的抗体也可以在本发明中使用。另外，只要对hTfR具有亲和性，抗体的轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列具有95％以上的同源性、该抗体的重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列具有95％以上的同源性的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。
[0113] 另外，只要对hTfR具有亲和性，轻链的氨基酸序列为在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、和/或重链的氨基酸序列为在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。另外，只要对hTfR具有亲和性，轻链的氨基酸序列为在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列、和/或重链的氨基酸序列为在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～5个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。此外，只要对hTfR具有亲和性，轻链的氨基酸序列为在构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列、和/或重链的氨基酸序列为在构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1～3个氨基酸而得到的氨基酸序列的抗体也可以作为本发明中的抗体使用。
[0114] 在上述抗体的优选方式(x)中，在序列号2所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号23所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号8所表示的重链的氨基酸序列中，序列号24所表示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式(y)中，在序列号4所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号25所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号9所表示的重链的氨基酸序列中，序列号26所表示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式(z)中，在序列号6所表示的轻链的氨基酸序列中，序列号27所表示的氨基酸序列为可变区，在序列号10所表示的重链的氨基酸序列中，序列号28所表示的氨基酸序列为可变区。在这些抗体的优选方式(x)～(z)中，特别是在这些可变区中导入对构成重链或/和轻链的氨基酸序列的氨基酸序列的置换、缺失或添加。
[0115] 作为本发明中的抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的优选的一个方式，可以列举人源化抗人转铁蛋白受体抗体(人源化抗hTfR抗体)与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)的融合蛋白。在该融合蛋白中，只要对人转铁蛋白受体的亲和性和人溶酶体酶的酶活性均得以保持，可以使hI2S与构成人源化抗hTfR抗体的重链和轻链中的任意一者融合。另外，在使hI2S与重链结合的情况下，可以使hI2S融合在重链的N末端侧和C末端侧中的任意一个末端侧，在使hI2S与轻链结合的情况下，可以使hI2S融合在轻链的N末端侧和C末端侧中的任意一个末端侧。
[0116] 作为该人源化抗hTfR抗体与hI2S的融合蛋白的优选的一个方式，可以列举在人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧结合人源化抗hTfR抗体而成的融合蛋白。作为该融合蛋白的优选例，可以例示下述(1)～(3)所示的融合蛋白：
[0117] (1)由具有序列号2所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
[0118] (2)由具有序列号4所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
[0119] (3)由具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链和在具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧经由接头序列结合人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而成的蛋白质构成的融合蛋白。
[0120] 这些(1)～(3)的融合蛋白中，人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶优选具有序列号1所表示的氨基酸，接头序列优选具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列。另外，这些融合蛋白通常由两条轻链和两条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合了的重链构成。
[0121] 另外，作为该人源化抗hTfR抗体与hI2S的融合蛋白的优选的一个方式，可以列举：
[0122] (1)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号2所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0123] (2)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号4所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号15所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0124] (3)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且作为整体具有序列号17所表示的氨基酸序列的融合蛋白。
[0125] 这些融合蛋白通常由两条轻链和两条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合了的重链构成。
[0126] 本发明中的冷冻干燥制剂含有抗体与人溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分，并进一步含有中性盐、二糖类、非离子型表面活性剂和缓冲剂。
[0127] 冷冻干燥制剂中含有的中性盐只要是药剂学上可接受的中性盐，则没有特别限定，作为该中性盐，优选为氯化钠、氯化镁，特别优选为氯化钠。
[0128] 冷冻干燥制剂中的中性盐的含量相对于融合蛋白的含量优选为0.015～2.5(w/ww/w)、更优选为0.05～0.5(w/ww/w)、进一步优选为0.1～0.25(w/ww/w)、例如为0.16(w/ww/w)。
[0129] 冷冻干燥制剂中含有的二糖类只要是药剂学上可接受的二糖类，则没有特别限定，作为该二糖类，优选海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或它们的组合，特别优选为蔗糖。
[0130] 冷冻干燥制剂中的二糖类的含量相对于融合蛋白的含量优选为2.5～200(w/ww/w)、更优选为5～50(w/ww/w)、进一步优选为10～25(w/ww/w)、例如为15(w/ww/w)。
[0131] 冷冻干燥制剂中含有的非离子型表面活性剂只要是药剂学上可接受的非离子型表面活性剂，则没有特别限定，作为该非离子型表面活性剂，优选为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。例如，作为非离子型表面活性剂，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇是优选的。特别是优选为聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇。聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇与泊洛沙姆188含义相同。
[0132] 冷冻干燥制剂中的非离子型表面活性剂的含量相对于融合蛋白的含量优选为0.005～6(w/ww/w)、更优选为0.02～0.2(w/ww/w)、进一步优选为0.04～0.1(w/ww/w)、例如为0.065(w/ww/w)。
[0133] 冷冻干燥制剂中含有的缓冲剂只要能够作为药品的赋形剂使用，则没有特别限定，优选为磷酸缓冲剂。磷酸缓冲剂按照在用纯水溶解冷冻干燥制剂时优选pH达到5.5～7.5的方式、更优选pH达到6.0～7.0的方式、例如pH达到6.5的方式添加到冷冻干燥制剂中。
[0134] 作为本发明的冷冻干燥制剂的优选的组成例，可以列举下述组成：
[0135] (A)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为0.5～20mg，中性盐、二糖类和离子型表面活性剂的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.015～2.5(w/ww/w)、2.5～200(w/ww/w)和0.005～6(w/ww/w)；
[0136] (B)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为0.5～20mg，中性盐、二糖类和离子型表面活性剂的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.05～0.5(w/w)、5～50(w/w)和0.02～0.2(w/w)；
[0137] (C)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为0.5～20mg，中性盐、二糖类和离子型表面活性剂的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.1～0.25(w/w)、10～25(w/w)和0.04～0.1(w/w)。
[0138] 上述(A)～(C)中，磷酸缓冲剂按照在用纯水溶解冷冻干燥制剂时pH达到5.5～7.5或6.0～7.0的方式、例如pH达到6.5的方式添加到冷冻干燥制剂中。
[0139] 作为本发明的冷冻干燥制剂的更优选的组成例，可以列举下述组成：
[0140] (D)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为0.5～20mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.015～2.5(w/w)、2.5～200(w/w)和0.005～6(w/w)；
[0141] (E)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为0.5～20mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.05～0.5(w/w)、5～50(w/w)和0.02～0.2(w/w)；
[0142] (F)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为0.5～20mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.1～0.25(w/w)、10～25(w/w)和0.04～0.1(w/w)。
[0143] 上述(D)～(F)中，磷酸缓冲剂按照在用纯水溶解冷冻干燥制剂时pH达到5.5～7.5或6.0～7.0的方式、特别是pH达到6.5的方式添加。
[0144] 作为本发明的冷冻干燥制剂的更具体的组成例，可以列举下述组成：
[0145] (G)抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的含量为10mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.16(w/w)、15(w/w)和0.65(w/w)，按照在用纯水溶解时pH达到6.0～7.0的方式添加有磷酸缓冲剂。
[0146] 上述(A)～(G)所示的冷冻干燥制剂中，抗体与人溶酶体酶的融合蛋白例如为人源化抗hTfR抗体与hI2S的融合蛋白。作为该人源化抗hTfR抗体与hI2S的融合蛋白的优选方式，可以列举：
[0147] (1)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号2所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链具有序列号8所表示的氨基酸序列且在重链的C末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白；
[0148] (2)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号4所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链具有序列号9所表示的氨基酸序列且在重链的C末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白；
[0149] (3)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链具有序列号10所表示的氨基酸序列且在重链的C末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白。
[0150] 上述(1)～(3)的融合蛋白中，人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶优选具有序列号1所表示的氨基酸，接头序列优选具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列。另外，这些融合蛋白通常由两条轻链和两条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合了的重链构成。
[0151] 上述(A)～(G)所示的冷冻干燥制剂中，作为人源化抗hTfR抗体与hI2S的融合蛋白的进一步优选的方式，可以列举：
[0152] (4)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号2所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而形成了序列号13所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0153] (5)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号4所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而形成了序列号15所表示的氨基酸序列的融合蛋白；
[0154] (6)该人源化抗hTfR抗体的轻链具有序列号6所表示的氨基酸序列、该人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧经由具有(Gly-Ser)所表示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而形成了序列号17所表示的氨基酸序列的融合蛋白。
[0155] 上述(A)或(F)所示的冷冻干燥制剂中，在抗体与人溶酶体酶的融合蛋白为上述(1)～(6)所示的融合蛋白的情况下，该融合蛋白的含量优选为0.5～20mg、例如为2.0～10mg、2.0～6.0mg等，可适当调节为2.5mg、5.0mg等。作为该融合蛋白的优选的冷冻干燥制剂的组成例，可以列举下述组成：
[0156] (H)该融合蛋白的含量为0.5～20mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.015～2.5(w/w)、2.5～200(w/w)和0.005～6(w/w)；
[0157] (I)该融合蛋白的含量为0.5～20mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.05～0.5(w/w)、5～50(w/w)和0.02～0.2(w/w)；
[0158] (J)该融合蛋白的含量为0.5～20mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.1～0.25(w/w)、10～25(w/w)和0.04～0.1(w/w)。
[0159] 更具体而言，有下述冷冻干燥制剂：
[0160] (K)该融合蛋白的含量为10mg，氯化钠、蔗糖和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的含量相对于融合蛋白的含量分别为0.16(w/w)、15(w/w)和0.65(w/w)，按照用纯水溶解时pH达到6.0～7.0的方式添加有磷酸缓冲剂。
[0161] 以抗体与人溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分的本发明的冷冻干燥制剂例如可以通过封入、填充至双腔型的注射器或小瓶等容器中等方式供给。另外，本发明的冷冻干燥制剂也可以与用于将其溶解的专用溶液一起以试剂盒的形式供给。冷冻干燥制剂例如在使用前用专用的溶液、纯净水、林格氏液等溶解后，用生理盐水稀释而制成输注液，将该输注液进行静脉滴注。此外，冷冻干燥制剂也可以给药于患者的肌肉内、腹腔内或皮下等。对用于将冷冻干燥制剂封入、填充等的注射器和小瓶等容器的材质没有特别限定，优选为硼硅酸玻璃制，此外也优选由作为环状烯烃与烯烃的共聚物的环烯烃共聚物、环烯烃类开环聚合物或环烯烃类开环聚合物的氢化物等疏水性树脂制成。
[0162] 实施例
[0163] 以下，参考实施例进一步详细地对本发明进行说明，但并没有将本发明限定于实施例的意图。
[0164] [实施例1]hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白表达用载体的构建
[0165] 使用编码由具有序列号2所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号8所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗hTfR抗体编号1、由具有序列号4所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号9所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗hTfR抗体编号2、由具有序列号6所表示的氨基酸序列的轻链和具有序列号10所表示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗hTfR抗体编号3这三种人源化抗hTfR抗体(编号1～3)的基因，构建hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白表达用载体。
[0166] 用KpnI和NcoI消化pEF/myc/nuc载体(Invitrogen公司)，将包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域切出，利用T4DNA聚合酶对其进行平滑末端化处理。用BglII和EcoRI消化pCI-neo载体(Invitrogen公司)，切除包含CMV的增强子/启动子和内含子的区域后，用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理。在其中插入上述包含EF-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pE-neo载体。用SfiI和BstXI消化pE-neo载体，切除包含新霉素抗性基因的约1kbp的区域。以pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen公司)作为模板，使用引物Hyg-Sfi5’(序列号11)和引物Hyg-BstX3’(序列号12)，通过PCR反应对潮霉素基因进行扩增。用SfiI和BstXI消化扩增出的潮霉素基因，插入到上述切除了新霉素抗性基因的pE-neo载体中，构建pE-hygr载体。
[0167] 合成包含编码具有序列号2所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号1的轻链全长的基因的DNA片段(序列号3)。在该DNA片段的5’侧导入MluI序列，在3’侧导入NotI序列。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI-NotI间。将所得到的载体作为人源化抗hTfR抗体编号1的轻链表达用载体pE-hygr(LC1)。
[0168] 合成包含编码具有序列号4所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号2的轻链全长的基因的DNA片段(序列号5)。在该DNA片段的5’侧导入MluI序列，在3’侧导入NotI序列。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI-NotI间。将所得到的载体作为人源化抗hTfR抗体编号2的轻链表达用载体pE-hygr(LC2)。
[0169] 合成包含编码具有序列号6所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号3的轻链全长的基因的DNA片段(序列号7)。在该DNA片段的5’侧导入MluI序列，在3’侧导入NotI序列。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI-NotI间。将所得到的载体作为人源化抗hTfR抗体编号3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)。
[0170] 人工合成具有序列号14所表示的碱基序列的DNA片段，该DNA片段包含编码在具有序列号8所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号1的重链的C末端侧经由具有(Gly-Ser)的氨基酸序列的接头结合具有序列号1所表示的氨基酸序列的hI2S而得到的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号13所表示的氨基酸序列的、使人源化抗hTfR抗体编号1的重链与hI2S结合而得到的蛋白质。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI与NotI之间，构建pE-neo(HC-I2S-1)。
[0171] 人工合成具有序列号16所表示的碱基序列的DNA片段，该DNA片段包含编码在具有序列号9所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号2的重链的C末端侧经由具有(Gly-Ser)的氨基酸序列的接头结合具有序列号1所表示的氨基酸序列的hI2S而得到的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号15所表示的氨基酸序列的、使人源化抗hTfR抗体编号2的重链与hI2S结合而得到的蛋白质。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI与NotI之间，构建pE-neo(HC-I2S-2)。
[0172] 人工合成具有序列号18所表示的碱基序列的DNA片段，该DNA片段包含编码在具有序列号10所表示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体编号3的重链的C末端侧经由具有(Gly-Ser)的氨基酸序列的接头结合具有序列号1所表示的氨基酸序列的hI2S而得到的蛋白质的基因。该DNA片段编码具有序列号17所表示的氨基酸序列的、使人源化抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S结合而得到的蛋白质。用MluI和NotI消化该DNA片段，整合到pE-neo载体的MluI与NotI之间，构建pE-neo(HC-I2S-3)。
[0173] [实施例2]hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株的制作
[0174] 使用GenePulser(Bio-Rad公司)，利用实施例1中构建的pE-hygr(LC1)与pE-neo(HC-I2S-1)的组合、实施例1中构建的pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-2)的组合、以及实施例1中构建的pE-hygr(LC3)与pE-neo(HC-I2S-3)的组合，通过下述方法分别对CHO细胞(CHO-K1，由美国典型培养物保藏中心获得)进行转化。细胞的转化大致利用下述方法进行。
[0175] 将5×105个CHO-K1细胞接种到添加有CD OptiCHOTM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)的3.5cm培养皿中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。培养后，以达到5×106个细胞/mL的密度的方式将细胞悬浮在Opti-MEMTMI培养基(Thermo Fisher Scientific公司)中。采集100μL的细胞悬浮液，在其中添加用CD OptiCHOTM培养基稀释至100μg/mL的pE-hygr(LC1)和pE-neo(HC-I2S-1)质粒DNA溶液各5μL。使用GenePulser(Bio-Rad公司)实施电穿孔，在细胞中导入质粒。在37℃、5％CO2的条件下培养过夜后，将细胞在含有0.5mg/mL的潮霉素和0.8mg/mL的G418的CD OptiCHOTM培养基中进行选择培养。对于pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-2)的组合、以及pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-3)的组合，也利用同样的方法转化细胞。
[0176] 接着，利用有限稀释法，按照每一孔接种一个以下的细胞的方式将通过选择培养选择出的细胞接种到96孔板上，培养约10天，以使各细胞形成单克隆菌落。采集形成有单克隆菌落的孔的培养上清，利用ELISA法考察人源化抗体含量，选择出hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株。
[0177] 此时的ELISA法大致利用下述方法实施。在96孔微量滴定板(Nunc公司)的各孔中各添加100μL用0.05M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将山羊抗人IgG多克隆抗体溶液稀释至4μg/mL而得到的溶液，在室温下静置至少1小时，使抗体吸附到板上。接着，用在磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中添加有0.05％Tween20的溶液(PBS-T)将各孔清洗3次后，在各孔中各添加200μL Starting Block(PBS)封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)，将板在室温下静置30分钟。接着，将各孔用PBS-T清洗3次后，在各孔中各添加100μL用在磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中添加有0.5％BSA和0.05％Tween20的溶液(PBS-BT)稀释至适当浓度的培养上清或人IgG标准品，将板在室温下静置至少1小时。接着，将板用PBS-T清洗3次后，在各孔中各添加100μL用PBS-BT稀释的HRP标记抗人IgG多克隆抗体溶液，将板在室温下静置至少1小时。用PBS-T将各孔清洗3次后，在各孔中各添加100μL含有0.4mg/mL邻苯二胺的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)，在室温下静置8～20分钟。接着，在各孔中各添加100μL的1mol/L硫酸，使反应停止，使用96孔板酶标仪，对各孔测定490nm下的吸光度。选择出显示高测定值的孔所对应的细胞作为hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株。
[0178] 将利用pE-hygr(LC1)与pE-neo(HC-I2S-1)的组合进行转化而得到的hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hI2S-抗hTfR抗体表达株1。将该细胞株表达的hI2S与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为I2S-抗hTfR抗体1。
[0179] 将利用pE-hygr(LC2)与pE-neo(HC-I2S-2)的组合进行转化而得到的hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hI2S-抗hTfR抗体表达株2。将该细胞株表达的hI2S与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为I2S-抗hTfR抗体2。
[0180] 将利用pE-hygr(LC3)与pE-neo(HC-I2S-3)的组合进行转化而得到的hI2S-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的高表达细胞株作为hI2S-抗hTfR抗体表达株3。将该细胞株表达的hI2S与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白作为I2S-抗hTfR抗体3。
[0181] 将I2S-抗hTfR抗体1、I2S-抗hTfR抗体2和I2S-抗hTfR抗体3中包含的人源化抗体的轻链和重链的氨基酸序列、这些轻链和重链中包含的可变区的氨基酸序列、以及这些可变区中包含的CDR1～3的氨基酸序列的序列号汇总示于表1。
[0182] [表1]
[0183] 表1融合蛋白中包含的轻链和重链的氨基酸序列的序列号
[0184]
[0185] [实施例3]hI2S-抗hTfR抗体表达株的培养
[0186] 利用下述方法制造I2S-抗hTfR抗体。将实施例2中得到的hI2S-抗hTfR抗体表达株3按照细胞密度为约2×105个/mL的方式悬浮在含有4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、100μmol/L次黄嘌呤和16μmol/L胸苷的约200L无血清培养基(EX-CELL高级CHO流加培养基(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium)、Sigma Aldrich公司)中。将140L该细胞悬浮液移至培养槽中。利用叶轮以89rpm的速度对培养基进行搅拌，将培养基的溶解氧浓度保持于约
40％，在34～37℃的温度范围内将细胞培养约11天。培养期间中，对细胞数、细胞的存活率、培养基的葡萄糖浓度和乳酸浓度进行监测。在培养基的葡萄糖浓度小于15mmol/L的情况下，立即向培养基中添加葡萄糖溶液，以使葡萄糖浓度为37.89mmol/L。培养结束后回收培养基。利用Millistak+HC Pod过滤器D0HC级(Merck公司)对回收的培养基进行过滤，进一步利用Millistak+HC X0HC级(Merck公司)进行过滤，得到含有I2S-抗hTfR抗体3的培养上清。
使用PelliconTM 3Cassette w/Ultracel PLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：1.14m2、Merck公司)对该培养上清进行超滤，浓缩至液量为约十七分之一为止。接着，使用Opticap XL600(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。将所得到的液体作为浓缩培养上清。
40％，在34～37℃的温度范围内将细胞培养约11天。培养期间中，对细胞数、细胞的存活率、培养基的葡萄糖浓度和乳酸浓度进行监测。在培养基的葡萄糖浓度小于15mmol/L的情况下，立即向培养基中添加葡萄糖溶液，以使葡萄糖浓度为37.89mmol/L。培养结束后回收培养基。利用Millistak+HC Pod过滤器D0HC级(Merck公司)对回收的培养基进行过滤，进一步利用Millistak+HC X0HC级(Merck公司)进行过滤，得到含有I2S-抗hTfR抗体3的培养上清。
使用PelliconTM 3Cassette w/Ultracel PLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：1.14m2、Merck公司)对该培养上清进行超滤，浓缩至液量为约十七分之一为止。接着，使用Opticap XL600(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。将所得到的液体作为浓缩培养上清。
[0187] [实施例4]病毒的失活
[0188] 在实施例3中得到的浓缩培养上清中添加磷酸三正丁基酯(TNBP)和聚山梨醇酯80，使终浓度分别为0.3％(v/v)和1％(w/v)，在室温下轻柔地搅拌4小时。该操作用于使混入到培养上清中的病毒失活。但是，只要使用不含有生物来源成分的无血清培养基来培养细胞，即使没有病毒的失活步骤也几乎没有在培养上清中混入对人体有害的病毒的可能性。
[0189] [实施例5]hI2S-抗hTfR抗体的纯化
[0190] 对于将病毒失活后的浓缩培养上清，添加0.5倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)后，利用Millipak-200过滤单元(孔径：0.22μm、Merck公司)进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/小时的恒定流速上样到用柱体积的4倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)平衡了的、作为蛋白A亲和柱的MabSelect SuRe LX柱(柱体积：约3.2L、柱床高：约20cm、GE Healthcare公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到蛋白A上。
[0191] 接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的含有500mM NaCl和450mM精氨酸的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，对柱进行清洗。接着，以相同流速供给柱体积的2.5倍体积的含有140mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，进一步对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有140mM NaCl的100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)使吸附在蛋白A上的I2S-抗hTfR抗体
3洗脱。洗脱液接收到预先装有1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)的容器中，立即进行中和。
3洗脱。洗脱液接收到预先装有1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)的容器中，立即进行中和。
[0192] 在来自上述蛋白A亲和柱的洗脱液中依次添加200mM磷酸缓冲液(pH7.0)、含有4M NaCl和2mM磷酸缓冲液的10mM MES缓冲液(pH7.3)、以及1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，将洗脱液中含有的磷酸钠和NaCl的浓度分别调节至2mM和215mM，并且将洗脱液的pH调节至7.3。接着，利用Opticap XL600(孔径：0.22μm、Merck公司)对该洗脱液进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/小时的恒定流速上样到用柱体积的4倍体积的含有215mM NaCl和2mM磷酸钠的10mM MES缓冲液(pH7.3)平衡了的、作为羟基磷灰石柱的CHT II型40μm柱(柱体积：约
3.2L、柱床高：约20cm、Bio-Rad公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到羟基磷灰石上。
3.2L、柱床高：约20cm、Bio-Rad公司)上，使I2S-抗hTfR抗体3吸附到羟基磷灰石上。
[0193] 接着，以相同流速供给柱体积的5倍体积的该缓冲液，对柱进行清洗。接着，用柱体积的5倍体积的含有215mM NaCl的35mM磷酸缓冲液(pH7.3)使吸附在羟基磷灰石上的I2S-抗hTfR抗体3洗脱。需要说明的是，利用羟基磷灰石柱进行的纯化每次使用来自蛋白A亲和柱的洗脱液的一半，分两次实施。
[0194] 在上述来自羟基磷灰石柱的洗脱液中添加稀盐酸，将pH调节至6.5。接着，使用TM 2Pellicon 3Cassette w/Ultracel PLCTK膜(孔径：30kDa、膜面积：1.14m 、Merck公司)进行超滤，浓缩至溶液中的I2S-抗hTfR抗体3的浓度为约2mg/mL为止。接着，使用Opticap XL600(0.22μm、Merck公司)对该浓缩液进行过滤。
[0195] 将上述浓缩液以19cm/小时的恒定流速上样到用柱体积的5倍体积的含有0.8mg/mL NaCl和75mg/mL蔗糖的20mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡了的、作为尺寸排阻柱的Superdex 200柱(柱体积：约12.6L、柱床高：40cm、GE Healthcare公司)上，进一步以相同的流速供给该缓冲液。此时，在来自尺寸排阻柱的洗脱液的流道中配置用于连续测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm下显示出吸收峰的级分作为包含I2S-抗hTfR抗体3的级分，将其作为I2S-抗hTfR抗体纯化品。需要说明的是，利用尺寸排阻柱进行的纯化每次使用来自羟基磷灰石柱的洗脱液的一半，分两次实施。
[0196] [实施例6]含有I2S-抗hTfR抗体的冷冻干燥品的制造
[0197] 使用实施例5中得到的I2S-抗hTfR抗体纯化品，制备表2所示组成的水溶液。使用真空过滤器/储存瓶系统、0.22μm(Corning公司)对该水溶液进行除菌过滤。将过滤后的溶液作为试验药。根据需要添加氢氧化钠溶液或稀盐酸，使试验药的pH达到约6.5。
[0198] [表2]
[0199] 表2试验药的组成
[0200]成分 浓度(mg/mL)
I2S-抗hTfR抗体 5
NaCl 0.8
NaH2PO4-2H2O 2.136
Na2HPO4·12H2O 2.256
蔗糖 75
泊洛沙姆188 0.325
I2S-抗hTfR抗体 5
NaCl 0.8
NaH2PO4-2H2O 2.136
Na2HPO4·12H2O 2.256
蔗糖 75
泊洛沙姆188 0.325
[0201] 将试验药各2.5mL填充到硼硅酸玻璃制小瓶中，使橡胶塞(氯化丁基橡胶制)半压塞并冷冻干燥。在冷冻干燥工序中，将小瓶内的气相置换为氮气后使橡胶塞全压塞，将小瓶密封。所得到的冷冻干燥品在小瓶中形成白色的块。
[0202] [实施例7]含有I2S-抗hTfR抗体的冷冻干燥制剂的稳定性的研究
[0203] 将实施例6中制造的冷冻干燥品在暗处、5℃或25℃的环境下静置6个月。在静置开始时、1个月后、3个月后和6个月后，用2.5mL的纯水溶解小瓶中的冷冻干燥品，将其作为样品溶液。测定各样品溶液的pH，并且在白色光源下以2000～3750lx的亮度通过目视检查有无异物。另外，利用实施例8所示的方法测定各样品溶液中含有的粒径为1～100μm的微粒数。另外，利用实施例9所示的方法测定各样品溶液中的I2S-抗hTfR抗体的聚合物的比率。此外，利用实施例10所示的方法测定各样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体与人TfR的亲和性。此外，利用实施例11所示的方法测定各样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体的酶活性。
[0204] 将在暗处、5℃的环境下静置6个月时的含有I2S-抗hTfR抗体的冷冻干燥制剂的稳定性的测定结果示于表3。如表3所示，在将冷冻干燥品静置6个月的期间中，样品溶液的pH基本保持于pH 6.5。另外，该期间中的样品溶液中无通过目视可明显确认到的不溶性异物。另外，该期间中的样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体中聚合物所占的比率基本恒定。另外，样品溶液中含有的粒径为1～100μm的微粒的数量在该期间中也未显著增加。在静置后6个月的样品溶液中观察到微粒数的增加，但在将冷冻干燥制剂的保存期间设定为低温处2年时，处于可接受的范围内。另外，样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体的酶活性在该期间中基本保持恒定。另外，样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体对人TfR的亲和性在该期间中也未显著降低(数据未显示)。
[0205] [表3]
[0206] 表3在暗处、5℃下保存时的冷冻干燥制剂的稳定性的评价结果
[0207]
[0208] 将在暗处、25℃的环境下静置6个月时的含有I2S-抗hTfR抗体的冷冻干燥制剂的稳定性的测定结果示于表4。如表4所示，在将冷冻干燥品静置6个月的期间中，样品溶液的pH基本保持于pH 6.5。另外，在该期间中没有产生通过目视可明显确认到的不溶性异物。另外，该期间中的聚合物比率基本恒定。另外，样品溶液中含有的粒径为1～100μm的微粒的数量在该期间中也未显著增加。6个月后观察到微粒数的增加，但在将冷冻干燥制剂的保存期间设定为低温处2年时，处于可接受的范围内。另外，样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体的酶活性在该期间中基本保持恒定。另外，样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体对人TfR的亲和性在该期间中也未显著降低(数据未显示)。
[0209] [表4]
[0210] 表4在暗处、25℃下保存时的冷冻干燥制剂的稳定性的评价结果
[0211]
[0212] 以上的结果显示，在流通过程和仓库中，以药剂放置于低温处为前提，通过将含有I2S-抗hTfR抗体作为有效成分的药剂制成表2所示组成的冷冻干燥制剂，能够以药理学上稳定的状态提供给市场。
[0213] [实施例8]样品溶液中含有的粒子数(粒径：1～100μm)的测定
[0214] 样品溶液中含有的粒子数的测定使用流式颗粒成像分析装置FlowCAMTM(Fluid Imaging Technologies公司)进行。流式颗粒成像分析装置是利用注射泵将样品溶液吸入与光学系统正交的流体池中，实时地对通过流体池中的粒子进行拍摄，由此能够测定样品溶液中含有的粒子数的装置。测定通过将应检测的粒子尺寸设定为1～100μm来进行。
[0215] [实施例9]样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体的聚合物的含量的测定
[0216] 将尺寸排阻柱色谱柱TSKgel UltraSW Aggregate 3μm柱(7.8mm径×30cm长、TOSOH公司)设置于岛津HPLC系统LC-20A(岛津制作所)中。另外，在柱的下游设置吸光光度计，以能够连续地测定从柱中流出的液体的吸光度(测定波长215nm)。以0.5mL/分钟的流速流入0.2M磷酸钠缓冲水溶液使柱平衡化后，将含有3～20μg的I2S-抗hTfR抗体的样品溶液上样到柱上，进一步以相同流速流入0.2M磷酸钠缓冲水溶液。在此期间，测定从柱中流出的液体的吸光度(测定波长215nm)，由此得到洗脱曲线。由所得到的洗脱曲线求出I2S-抗hTfR抗体的单体的峰面积(单体峰面积)与先于该单体峰而出现的I2S-抗hTfR抗体的聚合物的峰面积(聚合物峰面积)。利用下式求出聚合物的含量(％)。
[0217] 聚合物的含量(％)＝{聚合物峰面积/(单体峰面积+聚合物峰面积)}×100[0218] [实施例10]样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体对人TfR的亲和性的测定
[0219] I2S-抗hTfR抗体对人TfR的亲和性的测定使用利用生物膜层干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)的生物分子相互作用分析系统OctetRED96(ForteBio公司、颇尔公司的一个分公司)来实施。对生物膜层干涉法的基本原理进行简单说明。对固定于传感芯片表面的生物分子的层(膜层)投射特定波长的光时，从生物分子的膜层和作为内部参考的膜层这两个表面反射出光，产生光的干涉波。测定试样中的分子与传感芯片表面的生物分子结合，由此使传感器前端的膜层的厚度增加，使干涉波产生波长偏移。通过测定该波长偏移的变化，能够实时地进行与固定于传感芯片表面的生物分子结合的分子数的定量和动力学分析。测定大致按照OctetRED96附带的操作手册来实施。作为人TfR，使用在N末端附加有组氨酸标签、具有序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基至C末端的苯丙氨酸为止的hTfR的胞外区的氨基酸序列的重组人TfR(r人TfR：Sino Biological公司)。
[0220] 将实施例6中制备的样品溶液分别用HBS-P+(含有150mM NaCl、50μM EDTA和0.05％表面活性剂P20的10mM HEPES)进行2倍系列稀释，制备0.78125～50nM(0.117～7.5μg/mL)的七级浓度的样品溶液稀释液。将r人TfR用HBS-P+稀释，制备25μg/mL的溶液，作为r人TfR-ECD(His标签)。
[0221] 将上述2倍系列稀释制备的样品溶液稀释液以各200μL/孔添加到黑色96孔板(greiner bio-one公司)中。另外，将上述制备的r人TfR-ECD(His标签)溶液以各200μL/孔分别添加到规定的孔中。在基线、解离用和清洗用的孔中添加各200μL/孔的HBS-P+。在再生用的孔中添加各200μL/孔的10mM甘氨酸-HCl(pH 1.7)。在活化用的孔中添加各200μL/孔的0.5mM NiCl2溶液。将该板和生物传感器(生物传感器/Ni-NTA：ForteBio公司、颇尔公司的一个分公司)设置于OctetRED96的规定位置。
[0222] 使OctetRED96在下述表5所示的条件下工作，取得数据后，使用OctetRED96附带的分析软件，将结合反应曲线与1:1结合模型或2:1结合模型进行拟合，测定抗hTfR抗体对r人TfR的结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)，算出解离常数(KD)。需要说明的是，测定在25～30℃的温度下实施。
[0223] [表5]
[0224]
[0225] [实施例11]样品溶液中含有的I2S-抗hTfR抗体的酶活性测定
[0226] 通过使用垂直聚醚砜膜(VIVASPIN2 5000MWCO PES、赛多利斯公司)作为超滤膜的膜过滤对样品溶液进行脱盐，接着，将脱盐后的试样用反应缓冲液(5mM乙酸钠、0.5mg/L BSA、0.1％Triton X-100、pH 4.45)稀释至约100ng/mL。在96孔微量滴定板的各孔(FluoroNunc板、Nunc公司)中添加各10μL稀释的样品溶液，在37℃下预温育15分钟。底物溶液通过使用底物缓冲液(含有0.5mg/mL BSA的5mM乙酸钠、pH4.45)将4-甲基伞形酮基硫酸酯(SIGMA公司)按照最终浓度成为1.5mg/mL的方式溶解来制备。在含有稀释的样品溶液的各孔中添加各100μL底物溶液，将板在暗处在37℃下静置1小时。温育后，在含有样品的各孔中添加各190μL终止缓冲液(0.33M甘氨酸、0.21M碳酸钠缓冲液、pH 10.7)。作为对照，在孔中添加150μL的0.4μmol/L 4-甲基伞形酮(4-MUF、Sigma公司)溶液和150μL的终止缓冲液。接着，在激发波长330nm、荧光检测波长440nm下对板进行测定。
[0227] 通过测定各种浓度的4-MUF溶液的荧光强度，制成标准曲线。以各试样的荧光强度对标准曲线进行外推。需要说明的是，关于结果，将等同于在37℃下每一分钟生成1微摩尔的4-MUF的活性作为一个单位(Unit)，计算以Unit/mg蛋白质量表示的活性。在实施该测定时参考已公开的美国专利申请(公开号2004-0229250)。
[0228] 产业上的可利用性
[0229] 根据本发明，能够在市场上以药理学上稳定的状态提供含有使抗体与溶酶体酶结合而成的蛋白质作为有效成分的冷冻干燥制剂。
[0231] 序列号2：人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的氨基酸序列
[0232] 序列号3：包含编码人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列
[0233] 序列号4：人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的氨基酸序列
[0234] 序列号5：包含编码人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列
[0235] 序列号6：人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的氨基酸序列
[0236] 序列号7：包含编码人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的碱基序列的碱基序列、合成序列
[0237] 序列号8：人源化抗hTfR抗体编号1的重链的氨基酸序列
[0238] 序列号9：人源化抗hTfR抗体编号2的重链的氨基酸序列
[0239] 序列号10：人源化抗hTfR抗体编号3的重链的氨基酸序列
[0240] 序列号11：引物Hyg-Sfi5’、合成序列
[0241] 序列号12：引物Hyg-BstX3’、合成序列
[0242] 序列号13：抗hTfR抗体编号1的重链与I2S的融合蛋白的氨基酸序列
[0243] 序列号14：编码抗hTfR抗体编号1的重链与I2S的融合蛋白的碱基序列、合成序列[0244] 序列号15：抗hTfR抗体编号2的重链与I2S的融合蛋白的氨基酸序列
[0245] 序列号16：编码抗hTfR抗体编号2的重链与I2S的融合蛋白的碱基序列、合成序列[0246] 序列号17：抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S的融合蛋白的氨基酸序列
[0247] 序列号18：编码抗hTfR抗体编号3的重链与hI2S的融合蛋白的碱基序列、合成序列[0248] 序列号19：接头的氨基酸序列的例1
[0249] 序列号20：接头的氨基酸序列的例2
[0250] 序列号21：接头的氨基酸序列的例3
[0251] 序列号23：人源化抗hTfR抗体编号1的轻链的可变区的氨基酸序列
[0252] 序列号24：人源化抗hTfR抗体编号1的重链的可变区的氨基酸序列
[0253] 序列号25：人源化抗hTfR抗体编号2的轻链的可变区的氨基酸序列
[0254] 序列号26：人源化抗hTfR抗体编号2的重链的可变区的氨基酸序列
[0255] 序列号27：人源化抗hTfR抗体编号3的轻链的可变区的氨基酸序列
[0256] 序列号28：人源化抗hTfR抗体编号3的重链的可变区的氨基酸序列
[0257] 序列号29：抗hTfR抗体编号1的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0258] 序列号30：抗hTfR抗体编号1的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0259] 序列号31：抗hTfR抗体编号1的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0260] 序列号32：抗hTfR抗体编号1的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0261] 序列号33：抗hTfR抗体编号1的轻链CDR3的氨基酸序列
[0262] 序列号34：抗hTfR抗体编号1的重链CDR1的氨基酸序列1
[0263] 序列号35：抗hTfR抗体编号1的重链CDR1的氨基酸序列2
[0264] 序列号36：抗hTfR抗体编号1的重链CDR2的氨基酸序列1
[0265] 序列号37：抗hTfR抗体编号1的重链CDR2的氨基酸序列2
[0266] 序列号38：抗hTfR抗体编号1的重链CDR3的氨基酸序列1
[0267] 序列号39：抗hTfR抗体编号1的重链CDR3的氨基酸序列2
[0268] 序列号40：抗hTfR抗体编号2的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0269] 序列号41：抗hTfR抗体编号2的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0270] 序列号42：抗hTfR抗体编号2的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0271] 序列号43：抗hTfR抗体编号2的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0272] 序列号44：抗hTfR抗体编号2的轻链CDR3的氨基酸序列
[0273] 序列号45：抗hTfR抗体编号2的重链CDR1的氨基酸序列1
[0274] 序列号46：抗hTfR抗体编号2的重链CDR1的氨基酸序列2
[0275] 序列号47：抗hTfR抗体编号2的重链CDR2的氨基酸序列1
[0276] 序列号48：抗hTfR抗体编号2的重链CDR2的氨基酸序列2
[0277] 序列号49：抗hTfR抗体编号2的重链CDR3的氨基酸序列1
[0278] 序列号50：抗hTfR抗体编号2的重链CDR3的氨基酸序列2
[0279] 序列号51：抗hTfR抗体编号3的轻链CDR1的氨基酸序列1
[0280] 序列号52：抗hTfR抗体编号3的轻链CDR1的氨基酸序列2
[0281] 序列号53：抗hTfR抗体编号3的轻链CDR2的氨基酸序列1
[0282] 序列号54：抗hTfR抗体编号3的轻链CDR2的氨基酸序列2
[0283] 序列号55：抗hTfR抗体编号3的轻链CDR3的氨基酸序列1
[0284] 序列号56：抗hTfR抗体编号3的重链CDR1的氨基酸序列1
[0285] 序列号57：抗hTfR抗体编号3的重链CDR1的氨基酸序列2
[0286] 序列号58：抗hTfR抗体编号3的重链CDR2的氨基酸序列1
[0287] 序列号59：抗hTfR抗体编号3的重链CDR2的氨基酸序列2
[0288] 序列号60：抗hTfR抗体编号3的重链CDR3的氨基酸序列1
[0289] 序列号61：抗hTfR抗体编号3的重链CDR3的氨基酸序列2
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