人白介素-12(IL-12)是具有独特结构和多向作用(Kobayashi，等人 (1989)J Exp Med 170:827-845；Seder，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sd. 90:10188-10192，Ling，等人(1995)J Exp Med 154:116-127；Podlaski， 等人(1992)Arch.Biochem.Biophys.294:230-237)。IL-12在与涉及免 疫和炎性反应的几种疾病有关的病理学中起作用。有关IL-12、其生 物活性和其在疾病中的作用的综述可参见Trinchieri，G.(2003)Nat.Rev. Immun.3:133-146。在结构上，IL-12是异二聚体蛋白(称为“p70” 蛋白)，其包括35kDa亚单位(p35)和40kDa亚单位(p40)，这两个亚 单位是通过二硫桥连接在一起的。异二聚体蛋白主要是通过抗原呈递 细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树状细胞产生的。相对于p70亚单位， 这些类型细胞还分泌过量p40亚单位。p40和p35亚单位在基因上是 无关的，并且没有报道具有生物活性，虽然p40同二聚体可以起IL-12 拮抗剂的作用。
在功能上，IL-12在调控抗原特异性T辅助细胞1型(Th1)与2型 (Th2)淋巴细胞之间的平衡中起关键作用。Th1和Th2细胞控制自身免 疫性病症的开始和发展，并且IL-12在Th1-淋巴细胞分化和成熟的调 控中起关键作用。通过Th1细胞释放的细胞因子是炎性的，并且包括 γ干扰素(IFN-γ)、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL- 6、IL-10和IL-13以帮助体液免疫、变态反应和免疫抑制。与自身免 疫性疾病中Th1反应占优势以及IFN-γ的促炎活性相一致的是，IL-12 可以在与很多自身免疫性疾病和炎性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、 多发性硬化(MS)、牛皮癣(PS)和局限性回肠炎(CD)有关的病理学中起 主要作用。
已经证实患有MS的人类患者具有IL-12表达提高，这是通过在 急性MS斑中的p40mRNA水平证实的(Windhagen等人，(1995)J Exp. Med.182:1985-1996)。此外，与对照T细胞相比，具有得自MS患 者的CD40L表达T细胞的抗原呈递细胞的外体内刺激导致IL-12生成 增加，这与CD40/CD40L相互作用是IL-12的有效诱导剂的观测相一 致。已经观测到，与健康对照相比，在RA患者的滑液中具有增高水 平的IL-12 p70(Morita等人(1998)Arth.and Rheumat.41:306-314)。RA 滑液中的细胞因子信使核糖核酸(mRNA)表达状况主要鉴定出了Th1 细胞因子(Bucht等人(1996)Clin.Exp.Immunol.103:347-367)。IL-12 似乎还在与局限性回肠炎有关的病理学中起关键作用。已经在患有该 疾病的患者的肠粘膜中观测到EMF-γ和IL-12表达的增加(Fais等人 (1994)J Interferon Res.14:235-238；Parronchi等人(1997)Am.J.Path. 150:823-832；Monteleone等人(1997)Gastroent.112:1169-1178，and Berrebi等人(1998)Am.J Path 152:667-672)。来自CD患者的固有层 的T细胞的细胞因子分泌的特征在于主要是Th1反应，板块大大增加 大IFN-γ水平(Fuss，等人(1996)J Immunol.157:1261-1270)。此外， 得自CD患者的结肠组织切片表明富含表达IL-12的巨嗜细胞和表达 IFN-γ的T细胞(Parronchi等人，(1997)Am.J.Path.150:823-832)。
IL-23也是异二聚细胞因子，并且属于由5个这样的异二聚细胞 因子组成的家族，5个这样的异二聚细胞因子包括IL-12和IL-27 (Trinchieri等人，(2003)Immunity 19:641-644)。IL-23与IL-12具有 相同的p40亚单位，但是与p19亚单位经由二硫键结合。p19亚单位 在结构上与IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及IL-12的p35亚单 位有关，IL-23是通过与JLL-12类似大细胞类型产生的，并且其受体 是在T细胞、NK细胞以及吞噬和树状造血细胞上表达的。IL-23通过 与由BL-23R和IL-12β1组成的异二聚受体结合而介导信号传递。IL-12 受体也具有EL-12β1亚单位，IL-12受体是由IL-12β1和IL-12β2组成 的。DL-23与IL-12有重叠功能(通过诱导IFN-γ生成、Th1细胞分化 以及激活树状细胞的抗原呈递功能)，然而，其选择性地诱导记忆T 细胞的增殖(Oppmann等人(2000)Immunity 13:715-725，Parham，等 人(2002)J.Immunol.168:5699-5708)。
IL-23在自身免疫炎症中的作用已经通过用p19剔除的小鼠进行 的试验而得到了部分探明(Murphy等人J Exp Med 198:1951-1957；Cua 等人(2003)Nature 421:744-748)。研究已经证明IL-23调节对于感染 的免疫反应(参见例如Pirhonen，等人(2002)J.Immunol.169:5673- 5678；Broberg，等人(2002)J.Interferon Cytokine Res.22:641-651； Elkins，等人(2002)Infection Immunity 70:1936-1948；Cooper，等人(2002) J.Immunol.168:1322-1327)。据信IL-23在免疫介导的炎性疾病中起 作用(Langrish等人，(2004)Immunological Reviews202:96-105)。
由于人IL-12在多种人类病症中的作用，已经设计了治疗策略来 抑制或抵抗IL-12活性。特别是，已经寻找了与IL-12结合并中和IL- 12的抗体来作为抑制IL-12活性的手段。某些较早发现的抗体是鼠单 克隆抗体(mAb)，由用IL-12免疫接种的小鼠淋巴细胞制得的杂交瘤 分泌的(参见例如Strober等人，PCT公开WO 97/15327；Gately等人， WO9937682 A2；Neurath等人，J Exp.Med 182:1281-1290(1995)； Duchmarm等人，J Immunol.26:934-938(1996))。这些鼠IL-12抗体 在体内应用方面是有限的，因为把小鼠抗体施用给人类会带来一些问 题，例如短的血清半存留期，不能够引发一些人类效应子功能，以及 在人类中引起抗小鼠抗体的不希望的免疫反应(“人抗小鼠抗体” (HAMA)反应)。
克服在人类中使用全鼠抗体带来的问题的一种方法是产生全人抗 体，例如Salfeld等人，PCT公开WO 00/56772 A1中描述的方法。克 服在人类中使用全鼠抗体带来的问题的其他方法已经涉及对抗体进行 基因工程处理，使得其更“类似人”。例如，已经制备了嵌合型抗体， 其中抗体链的可变区是源自鼠，并且抗体链的恒定区是源自人 (Junghans，等人(1990)Cancer Res.50:1495-1502；Brown等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.88:2663-2667；Kettleborough等人(1991)Prot. Engineer.4:773-783)。这样的抗IL-12的嵌合型抗体还公开在Peritt 等人PCT公开WO2002097048A2中。然而，由于这些嵌合型抗体仍 然保留着鼠可变链序列，当长时间施用时，他们仍然有可能引起不希 望的免疫反应，尤其是人抗嵌合抗体(HACA)反应。
本领域需要能够结合IL-12的p40亚单位(IL-12p40)的改进的抗 体。这样的抗体优选结合IL-12和/或IL-23。这样的抗体优选能够结 合IL-12和/或IL-23。本发明提供了一个新家族的结合蛋白、CDR接 枝抗体、人源化抗体及其片段，其能够结合IL-12p40，以高亲合力结 合，以及结合并中和IL-12和/或IL-23。
发明概述
本发明涉及IL-12p40结合蛋白，特别是能够结合人IL-12的p40 亚单位和人IL-23的p40亚单位的抗体。此外，本发明提供了制备和 使用IL-12p40结合蛋白的方法。
本发明的一个方面涉及包括能够结合IL-12的p40亚单位的抗原 结合结构域的结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合结构域包括至 少一个包含选自下列的氨基酸序列的CDR:
CDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:55)，其中
          X1是D、K、T或S；
          X2是Y、S或T；
          X3是Y、V、G、W、S或F；
          X4是I或M；
          X5是H、G、E或V；
          X6是V，或者不存在；且
          X7是S，或者不存在；
CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-
          X18-X19-X20(SEQ ID NO:56)，其中
          X1是H、D、G、W、S、Y或R；
          X2是I或F；
          X3是Y、W、L、S、N、D或G；
          X4是W、P、H、T或S；
          X5是D、G、E、A或I；
          X6是D、G、S、T或N；
          X7是D、G、S或P；
          X8是K、N、S、E、T或H；
          X9是Y、T、P、I或N；
          X10是Y、N、T、H、K、S或G；
          X11是N或Y；
          X12是P、N、A、D或S；
          X13是S、E、D或P；
          X14是L、K、D、T或Y；
          X15是K、F、V、M、R或A；
          X16是S、K、Q、P，或者不存在；
          X17是D、G、R，或者不存在；
          X18是F，或者不存在；
          X19是Q，或者不存在；且
          X20是D，或者不存在；
CDR-H3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID NO:
          57)，其中
           X1是R、N或W；
           X2是G、T、R、P或H；
           X3是I、R、F、Y或Q；
           X4是R、V、Y、F或A；
           X5是S、N、G、A或R；
           X6是A、Y、L、F或M；
           X7是M、A、D、L或F；
           X8是D、M、Y或W；
           X9是Y、D或N；
           X10是Y、A，或者不存在；
           X11是M，或者不存在；
           X12是D，或者不存在；且
           X13是Y，或者不存在；
CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID
          NO:58)，其中
           X1是K或R；
           X2是A；
           X3是S；
           X4是Q或E；
           X5是S或N；
           X6是V或I；
           X7是S、G或D；
           X8是N、T或K；
           X9是D、N或Y；
           X10是V、G或L；
           X11是A、I或H；
           X12是S，或者不存在；
           X13是F，或者不存在；
           X14是M，或者不存在；且
           X15是N，或者不存在；
CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:59)，其中
           X1是Y或S；
           X2是A或T；
           X3是S或A；
           X4是N、H、S或Q；
           X5是R、N或S；
           X6是Y、Q或I；
           X7是T、S或G；且
           X8是S，或者不存在；
和
CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:60)，其中
           X1是Q；
       X2是Q；
       X3是D、Y或S；
       X4是Y、N、K或I；
       X5是N、T、S或E；
       X6是S、Y、V或W；
       X7是P；
       X8是W、F、Y、L或P；且
       X9是T或S。
优选地，抗原结合结构域包括至少一个包含选自下列的氨基酸序 列的CDR:SEQ ID NO.:35的残基31-37；SEQ ID NO.:35的残基 52-67；SEQ ID NO.:35的残基100-108；SEQ ID NO.:36的残基24- 34；SEQ ID NO.:36的残基50-56；SEQ ID NO.:36的残基89-97； SEQ ID NO.:37的残基31-37；SEQ ID NO.:37的残基52-67；SEQ ID NO.:37的残基100-109；SEQ ID NO.:38的残基24-34；SEQ ID NO.: 38的残基50-56；SEQ ID NO.:38的残基89-97；SEQ ID NO.:39的 残基31-35；SEQ ID NO.:39的残基50-66；SEQ ID NO.:39的残基 99-106；SEQ ID NO.:40的残基24-34；SEQ ID NO.:40的残基50-56； SEQ ID NO.:40的残基89-97；SEQ ID NO.:41的残基31-35；SEQ ID NO.:41的残基50-66；SEQ ID NO.:41的残基99-106；SEQ ID NO.: 42的残基24-34；SEQ ID NO.:42的残基50-56；SEQ ID NO.:42的 残基89-97；SEQ ID JNU.:43的残基31-35；SEQ ID NO.:43的残基 50-66；SEQ ID NO.:43的残基99-106；SEQ ID NO.:44的残基24-34； SEQ ID NO.:44的残基50-56；SEQ ID NO.:44的残基89-97；SEQ ID NO.:45的残基31-35；SEQ ID NO.:45的残基50-66；SEQ ID NO.: 45的残基99-101；SEQ ID NO.:46的残基24-34；SEQ ID NO.:46 的残基50-56；SEQ ID NO.:46的残基89-97；SEQ ID NO.:47的残 基31-35；SEQ ID NO.:47的残基50-66；SEQ ID NO.:47的残基99-106； SEQ ID NO.:48的残基24-34；SEQ ID NO.:48的残基50-56；SEQ ID NO.:48的残基89-97；SEQ ID NO.:49的残基31-35；SEQ ID NO.: 49的残基50-66；SEQ ID NO.:49的残基99-111；SEQ ID NO.:50 的残基24-38；SEQ ID NO.:50的残基53-60；SEQ ID NO.:50的残 基93-101；SEQ ID NO.:51的残基31-37；SEQ ID NO.:51的残基52-67； SEQ ID NO.:51的残基100-109；SEQ ID NO.:52的残基24-34；SEQ ID NO.:52的残基50-56；SEQ ID NO.:52的残基89-97；SEQ ID NO.: 53的残基31-35；SEQ ID NO.:53的残基47-66；SEQ ID NO.:53的 残基99-107；SEQ ID NO.:54的残基24-34；SEQ ID NO.:54的残 基50-56；和SEQ ID NO.:54的残基89-97。在优选的实施方案中， 结合蛋白包括至少3个选自上述序列的CDR。更优选地，所选择的3 个CDR来自选自下列的可变区CDR组:
  VH 1D4 CDR组    VH 1D4 CDR-H1 SEQ ID NO.:35的残基31-37    VH 1D4 CDR-H2 SEQ ID NO.:35的残基52-67    VH 1D4 CDR-H3 SEQ ID NO.:35的残基100-108 VL 1D4 CDR组    VL 1D4 CDR-L1 SEQ ID NO.:36的残基24-34    VL 1D4 CDR-L2 SEQ ID NO.:36的残基50-56    VL 1D4 CDR-L3 SEQ ID NO.:36的残基89-97 VH 1A6 CDR组    VH 1A6 CDR-H1 SEQ ID NO.:37的残基31-37    VH 1A6 CDR-H2 SEQ ID NO.:37的残基52-67    VH 1A6 CDR-H3 SEQ ID NO.:37的残基100-109 VL 1A6 CDR组    VL 1A6 CDR-L1 SEQ ID NO.:38的残基24-34    VL 1A6 CDR-L2 SEQ ID NO.:38的残基50-56    VL 1A6 CDR-L3 SEQ ID NO.:38的残基89-97 VH 1D8 CDR组    VH 1D8 CDR-H1 SEQ ID NO.:39的残基31-35    VH 1D8 CDR-H2 SEQ ID NO.:39的残基50-66    VH 1D8 CDR-H3 SEQ ID NO.:39的残基99-106 VL 1D8 CDR组    VL 1D8 CDR-L1 SEQ ID NO.:40的残基24-34    VL 1D8 CDR-L2 SEQ ID NO.:40的残基50-56
     VL 1D8 CDR-L3 SEQ ID NO.:40的残基89-97 VH 3G7 CDR组    VH 3G7 CDR-H1 SEQ ID NO.:41的残基31-35    VH 3G7 CDR-H2 SEQ ID NO.:41的残基50-66    VH 3G7 CDR-H3 SEQ ID NO.:41的残基99-106 VL 3G7 CDR组    VL 3G7 CDR-L1 SEQ ID NO.:42的残基24-34    VL 3G7 CDR-L2 SEQ ID NO.:42的残基50-56    VL 3G7 CDR-L3 SEQ ID NO.:42的残基89-97 VH 5E8 CDR组    VH 5E8 CDR-H1 SEQ ID NO.:43的残基31-35    VH 5E8 CDR-H2 SEQ ID NO.:43的残基50-66    VH 5E8 CDR-H3 SEQ ID NO.:43的残基99-106 VL 5E8 CDR组    VL 5E8 CDR-L1 SEQ ID NO.:44的残基24-34    VL 5E8 CDR-L2 SEQ ID NO.:44的残基50-56    VL 5E8 CDR-L3 SEQ ID NO.:44的残基89-97 VH 8E1 CDR组    VH 8E1 CDR-H1 SEQ ID NO.:45的残基31-35    VH 8E1 CDR-H2 SEQ ID NO.:45的残基50-66    VH 8E1 CDR-H3 SEQ ID NO.:45的残基99-101 VL 8E1 CDR组    VL 8E1 CDR-L1 SEQ ID NO.:46的残基24-34    VL 8E1 CDR-L2 SEQ ID NO.:46的残基50-56    VL 8E1 CDR-L3 SEQ ID NO.:46的残基89-97 VH 1H6 CDR组    VH 1H6 CDR-H1 SEQ ID NO.:47的残基31-35    VH 1H6 CDR-H2 SEQ ID NO.:47的残基50-66    VH 1H6 CDR-H3 SEQ ID NO.:47的残基99-106 VL 1H6 CDR组    VL 1H6 CDR-L1 SEQ ID NO.:48的残基24-34
     VL 1H6 CDR-L2 SEQ ID NO.:48的残基50-56    VL 1H6 CDR-L3 SEQ ID NO.:48的残基89-97 VH 3A11 CDR组    VH 3A11 CDR-H1 SEQ ID NO.:49的残基31-35    VH 3A11 CDR-H2 SEQ ID NO.:49的残基50-66    VH 3A11 CDR-H3 SEQ ID NO.:49的残基99-111 VL 3A11 CDR组    VL 3A11 CDR-L1 SEQ ID NO.:50的残基24-38    VL 3A11 CDR-L2 SEQ ID NO.:50的残基53-60    VL 3A11 CDR-L3 SEQ ID NO.:50的残基93-101 VH 4B4 CDR组    VH 4B4 CDR-H1 SEQ ID NO.:51的残基31-37    VH 4B4 CDR-H2 SEQ ID NO.:51的残基52-67    VH 4B4 CDR-H3 SEQ ID NO.:51的残基100-109 VL 4B4 CDR组    VL 4B4 CDR-L1 SEQ ID NO.:52的残基24-34    VL 4B4 CDR-L2 SEQ ID NO.:52的残基50-56    VL 4B4 CDR-L3 SEQ ID NO.:52的残基89-97 VH 7G3 CDR组    VH 7G3 CDR-H1 SEQ ID NO.:53的残基31-35    VH 7G3 CDR-H2 SEQ ID NO.:53的残基47-66    VH 7G3 CDR-H3 SEQ ID NO.:53的残基99-107 和 VL 7G3 CDR组    VL 7G3 CDR-L1 SEQ ID NO.:54的残基24-34    VL 7G3 CDR-L2 SEQ ID NO.:54的残基50-56    VL 7G3 CDR-L3 SEQ ID NO.:54的残基89-97
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白包含至少两个可变区CDR 组。更优选地，所述两个可变区CDR组选自:VH 1D4 CDR组& VL 1D4 CDR组；VH 1A6 CDR组& VL 1A6 CDR组；VH 1D8 CDR组& VL 1D8 CDR组；VH 3G7 CDR组& VL3 G7 CDR组；VH5 E8 CDR组& VL 5E8 CDR组；VH 8E1 CDR组& VL 8E1 CDR组；VH 1H6 CDR组& VL 1H6 CDR组；VH 3A11 CDR组& VL 3A11 CDR组；VH 4B4 CDR组& VL 4B4 CDR组；和VH 7G3 CDR组& VL 7G3 CDR组。
在另一个实施方案中，上面公开的结合蛋白还包括人接受者框 架。人接受者框架优选包含选自下列的氨基酸序列:SEQ ID NO.:6； SEQ ID NO.:7；SEQ ID NO.:8；SEQ ID NO.:9；SEQ ID NO.:10； SEQ ID NO.:11；SEQ ID NO.:12；SEQ ID NO.:13；SEQ ID NO.: 14；SEQ ID NO.:15；SEQ ID NO.:16；SEQ ID NO.:17；SEQ ID NO.: 18；SEQ ID NO.:19；SEQ ID NO.:20；SEQ ID NO.:21；SEQ ID NO.: 22；SEQ ID NO.:23；SEQ ID NO.:24；SEQ ID NO.:25；SEQ ID NO.: 26；SEQ ID NO.:27；SEQ ID NO.:28；SEQ ID NO.:29；SEQ ID NO.: 30；SEQ ID NO.:31；SEQ ID NO.:32；SEQ ID NO.:33；SEQ ID NO.: 34，SEQ ID NO.:92，SEQ ID NO.:93，SEQ ID NO.:94，SEQ ID NO.: 95，SEQ ID NO.:96，AND SEQ ID NO.:97。
在优选的实施方案中，结合蛋白是能够结合IL-12或IL-23的p40 亚单位的CDR接枝的抗体或其抗原结合部分。所述CDR接枝的抗体 或其抗原结合部分优选包含一个或多个上面公开的CDR。所述CDR 接枝的抗体或其抗原结合部分更优选包含至少一个具有选自下列的氨 基酸序列的可变区:SEQ ID NO.:61；SEQ ID NO.:62；SEQ ID NO.: 63；SEQ ID NO.:64；SEQ ID NO.:65；SEQ ID NO.:66；SEQ ID NO.: 67；SEQ ID NO.:68；SEQ ID NO.:69；SEQ ID NO.:70；SEQ ID NO.: 71；SEQ ID NO.:72；SEQ ID NO.:73；SEQ ID NO.:74；SEQ ID NO.: 75；SEQ ID NO.:76；SEQ ID NO.:77；和SEQ TD NO.:78。所述 CDR接枝的抗体或其抗原结合部分最优选包含两个选自上面公开的序 列的可变区。所述CDR接枝的抗体或其抗原结合部分优选包含人接 受者框架。所述人接受者框架更优选是任一个上面公开的人接受者框 架。
在优选的实施方案中，结合蛋白是能够结合IL-12或IL-23的p40 亚单位的人源化抗体或其抗原结合部分。所述人源化抗体或其抗原结 合部分优选包含掺入到人接受者框架的人抗体可变区内的一个或多个 上面公开的CDR。人抗体可变区优选是共有人可变区。人接受者框架 更优选包含至少一个在关键残基上的框架区氨基酸取代，其中所述关 键残基选自:与CDR相邻的残基；糖基化位点残基；稀有残基(rare residue)；能够与人IL-12的p40亚单位相互作用的残基；能够与CDR 相互作用的残基；正规残基(canonical residue)；重链可变区与轻链 可变区之间的接触残基；Vernier区内的残基；以及在Chothia-定义的 可变重链CDR1与Kabat-定义的第一重链框架之间重叠的区域内的残 基。优选地，所述关键残基选自3H、5H、10H、11H、12H、13H、15H、 16H、18H、19H、23H、24H、25H、30H、41H、44H、46H、49H、66H、 68H、71H、73H、74H、75H、76H、77H、78H、79H、81H、82H、82AH、 82BH、82CH、83H、84H、85H、86H、87H、89H、93H、98H、108H、 109H、1L、2L、3L、7L、8L、9L、10L、11L、12L、13L、15L、17L、 19L、20L、21L、22L、36L、41L、42L、43L、45L、46L、58L、60L、 62L、63L、67L、70L、73L、74L、77L、78L、79L、80L、83L、85L、 87L、104L和106L。优选地，人接受者框架包含至少一个框架区氨基 酸取代，其中该框架的氨基酸序列与所述人接受者框架的序列是至少 65％相同，并且包含至少70个与所述人接受者框架相同的氨基酸残 基。
在优选的实施方案中，结合蛋白是能够结合IL-12或IL-23的p40 亚单位的人源化抗体或其抗原结合部分。所述人源化抗体或抗原结合 部分优选包含一个或多个上面公开的CDR。所述人源化抗体或其抗原 结合部分更优选包含3个或更多个上面公开的CDR。所述人源化抗体 或其抗原结合部分最优选包含6个上面公开的CDR。
在本发明的另一个实施方案中，所述人源化抗体或抗原结合部分 包含至少一个具有选自下列的氨基酸序列的可变区:SEQ ID NO.:79、 SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQ ID NO.: 83、SEQ ID NO.:84、SEQ ID NO.:85、SEQ ID NO.:86、SEQ ID NO.: 87、SEQ ID NO.:88、SEQ ID NO.:89、SEQ ID NO.:90、SEQ ID NO.: 91、SEQ ID NO.:98、SEQ ID NO.:99、SEQ ID NO.:100、SEQ ID NO.: 101、SEQ ID NO.:102、SEQ ID NO.:103、SEQ ID NO.:104、SEQ ID NO.:105、SEQ ID NO.:106、SEQ ID NO.:107、SEQ ID NO.:108 和SEQ ID NO.:109。更优选地，所述人源化抗体或其抗原结合部分 包含两个选自上面公开的序列的可变区。最优选地，所述人源化抗体 或其抗原结合部分包含两个可变区，其中所述两个可变区具有选自下 列的氨基酸序列:SEQ ID NO.:67 & SEQ ID NO.:79、SEQ ID NO.: 80 & SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82 & SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84 & SEQ ID NO.:85、SEQ ID NO.:86 & SEQ ID NO.:87、SEQ ID NO.:88 & SEQ ID NO.:89、SEQ ID NO.:90 & SEQ ID NO.:91、 SEQ ID NO.:98 & SEQ ID NO.:99、SEQ ID NO.:100 & SEQ ID NO.: 101、SEQ ID NO.:102 & SEQ ID NO.:103、SEQ ID NO.:104 & SEQ ID NO.:105、SEQ ID NO.:106 & SEQ ID NO.:107和SEQ ID NO.: 108 & SEQ ID NO.:109。
在优选的实施方案中，上面公开的结合蛋白包含选自下列的重链 免疫球蛋白恒定区:人IgM恒定区、人IgG1恒定区、人IgG2恒定区、 人IgG3恒定区、人IgG4恒定区、人IgE恒定区和人IgA恒定区。更 优选地，结合蛋白包含SEQ ID NO.:2；SEQ DD NO.:3；SEQ ID NO.: 4；和SEQ ID NO.:5。
本发明的结合蛋白能够结合选自IL-12和IL-23的靶。本发明结 合蛋白优选能够调节选自IL-12和IL-23的靶的生物功能。本发明结 合蛋白更优选能够中和选自IL-12和IL-23的靶。
在一个实施方案中，本发明结合蛋白对于IL-12或IL-23的结合 速率常数(Kon)为至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1 ；至少约105M-1s-1；或至少约106M-1s-1，这是通过表面等离子共振 测定的。优选地，本发明结合蛋白对于IL-12或IL-23的结合速率常 数(Kon)为102M-1s-1-103M-1s-1；103M-1s-1-104M-1s-1；104M-1s-1-105 M-1s-1；或105M-1s-1-106M-1s-1，这是通过表面等离子共振测定的。
在另一个实施方案中，本发明结合蛋白对于IL-12或IL-23的解 离速率常数(Koff)为至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；或 至多约10-6s-1，这是通过表面等离子共振测定的。优选地，本发明结 合蛋白对于IL-12或IL-23的解离速率常数(Koff)为10-3s-1-10-4s-1； 或10-4s-1-10-5s-1；或10-5s-1-10-6s-1，这是通过表面等离子共振测定 的。
在另一个实施方案中，本发明结合蛋白对于IL-12或IL-23的离 解常数(KD)为至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约 10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；或至多约10-13M。优选地， 本发明结合蛋白对于IL-12或IL-23的离解常数(KD)为10-7M-10-8 M；10-8M-10-9M；10-9M-10-10M；10-10M-10-11M；10-11M-10-12M； 或10-12M-10-13M。本发明的一个实施方案提供了抗体构建物，其包 含任一种上面公开的结合蛋白和接头多肽或免疫球蛋白。在优选的实 施方案中，抗体构建物选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合型抗 体、CDR-接枝抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键 连接的Fv、scFv、单结构域抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体和 双特异性抗体。在优选的实施方案中，抗体构建物包含选自下列的重 链免疫球蛋白恒定区:人IgM恒定区、人IgG1恒定区、人IgG2恒定 区、人IgG3恒定区、人IgG4恒定区、人IgE恒定区和人IgA恒定区。 更优选地，抗体构建物包含SEQ ID NO.:2；SEQ ID NO.:3；SEQ ID NO.:4；和SEQ ID NO.:5。在另一个实施方案中，本发明提供了抗 体缀合物，其包含上面公开的抗体构建物和选自下列的物质:免疫粘 着分子、造影剂、治疗剂和细胞毒性剂。在优选的实施方案中，造影 剂选自:放射性标记物、酶、荧光标记物、发光标记物、生物发光标 记物、磁性标记物和生物素。更优选地，造影剂是选自下列的放射性 标记物:3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。 在优选的实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂选自:抗-代谢物；烷化剂； 抗生素；生长因子；细胞因子；抗-血管生成剂；抗-有丝分裂剂；蒽 环霉素；毒素；和编程性细胞死亡剂。
在另一个实施方案中，抗体构建物是糖基化的。糖基化优选是人 糖基化模式。
在另一个实施方案中，上面公开的结合蛋白、抗体构建物或抗体 缀合物作为晶体存在。优选地，所述晶体是没有载体的药学控制释放 晶体。在一个优选的实施方案中，晶体形式的结合蛋白、晶体形式的 抗体构建物或晶体形式的抗体缀合物具有比其可溶性相应物更大的体 内半存留期。在另一个实施方案中，晶体形式的结合蛋白、晶体形式 的抗体构建物或晶体形式的抗体缀合物在结晶之后保留其生物活性。
本发明的一个方面涉及编码任一种上面公开的结合蛋白、抗体构 建物或抗体缀合物的分离的核酸。另一个实施方案提供了包含上面公 开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher 等人，Nucleic Acids Research 2002，VoI 30，No.2)；pTT3(具有另外 的多克隆位点的pTT)；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990) Nucleic acids Research VoI 18，No.17)；pBV；pJV；和pBJ。
在另一个方面，用上面公开的载体转化宿主细胞。优选地，宿主 细胞是原核细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌。在相关实施方案 中，宿主细胞是真核细胞。优选地，所述真核细胞选自原生生物细胞、 动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细 胞，包括但不限于CHO和COS；或者真菌细胞，例如啤酒糖酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；或昆虫细胞，例如Sf9。
本发明的另一方面提供结合IL-12的p40亚单位的结合蛋白的制 备方法，所述方法包括在足以产生结合IL-12的p40亚单位的结合蛋 白的条件下在培养基中培养上面公开的宿主细胞中的任何一种。另一 个实施方案提供根据上面公开的方法制备的结合蛋白。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合 物包括制剂，所述制剂包含上面公开的晶体形式的结合蛋白、晶体形 式的抗体构建物或晶体形式的抗体缀合物和组分，和至少一种聚合载 体。优选地，所述聚合载体是选自一种或多种下列聚合物的聚合物: 聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩肽)、聚 (酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)或PLGA、聚(β-羟基丁酸)、聚 (己内酯)、聚(二氧杂环己酮)；聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)、 聚[(有机)磷嗪]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸 酐-烷基乙烯基醚共聚物、多聚醇(pluronic polyols)、白蛋白、藻酸 盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、低 聚糖、糖氨基聚糖(glycaminoglycan)、硫酸多糖、他们的混合物和共 聚物。优选地，所述组分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、 羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供 了治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的上面 公开的组合物。
本发明还提供了药物组合物，所述组合物包含上面公开的结合蛋 白、抗体构建物或抗体缀合物与可药用载体。在另一个实施方案中， 所述药物组合物包含至少一种用于治疗其中IL-12和/或IL-23活性是 有害的病症的另外的治疗剂。优选地，另外的物质选自:治疗剂、造 影剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂(包括但不限于抗-VEGF抗体或 VEGF-诱捕剂)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)； 共同-刺激分子阻断剂(包括但不限于抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、 抗-CD20)；粘着分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-1Abs、抗-E/L选 择蛋白Abs、小分子抑制剂)；抗-细胞因子抗体或者其功能片段(包 括但不限于抗-IL-18、抗-TNF、抗-IL-6/细胞因子受体抗体)；甲氨 喋呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测的标记物或报道基因；TNF 拮抗剂；抗风湿药物；肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾类抗炎药物(NSAID)、 镇痛剂、麻醉药、镇静剂、局麻剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、 皮质类固醇药物、组成代谢甾类药物、红细胞生成素、致免疫剂、免 疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗 抑郁剂、抗精神病剂、兴奋剂、哮喘药物、β-激动剂、吸入的甾类药 物、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于抑制人IL-12和/或人IL-23活 性的方法，所述方法包括将人IL-12和/或人IL-23与上面公开的结合 蛋白接触，从而抑制人IL-12和/或人IL-23活性。在有关方面，本发 明提供了在人个体中抑制人IL-12和/或人IL-23活性的方法，所述人 个体患有其中IL-12和/或IL-23活性是有害的病症，所述方法包括给 人个体施用上面公开的结合蛋白，这样人个体中的人IL-12和/或人 IL-23活性被抑制，从而实现治疗。优选地，所述病症选自:关节炎、 骨关节炎、幼年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性 关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身红斑狼疮、局限性回肠炎、 溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、 变态反应疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排 异、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬 化、传播性血管内凝血、Kawasaki′s病、Grave′s病、肾病综合征、慢 性疲劳综合征、Wegener′s肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾微 小性血管炎、慢性活性肝炎、眼色素层炎、脓毒性休克、中毒休克综 合征、脓毒症综合征、恶病质、传染病、由寄生虫引起的疾病、获得 性免疫缺陷综合征、急性横向骨髓炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、早 老性痴呆、中风、原发胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力 衰竭、心肌梗塞、Addison′s病、散发性I型多腺缺乏和II型多腺缺乏、 Schmidt′s综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、血 清反应阴性关节病、关节病、Reiter′s病、牛皮癣性关节病、溃疡性结 肠关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、鼠疫和沙门氏菌相关关节病、脊 椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫大 疱病、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、类天疱疮、线性IgA病、自身 免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性性恶性贫血、 少年恶性贫血、肌痛性大脑炎/Royal Free病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、 巨细胞关节炎、原发性硬化性肝炎、起因不明自身免疫性肝炎、获得 性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关疾病、乙肝、丙肝、普通 各式各样的免疫缺陷(普通各式各样的血丙种球蛋白减少症)、膨胀心 肌病、女性不孕症、卵巢衰竭、早产卵巢衰竭、纤维变性肺病、起因 不明的纤维组织形成牙槽炎、炎后间质性肺病、间质性肺炎、与间质 性肺病相关的结缔组织疾病、与肺病相关的混合结缔组织疾病、与间 质性肺病相关的全身硬化、与间质性肺病相关的类风湿性关节炎、与 肺病相关的全身红斑狼疮、与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎、与肺病相 关的Sjogren′s病、与肺病相关的僵硬脊椎炎、结节性血管炎弥散肺病、 与肺病相关的含铁血黄素沉着病、药物引起的间质性肺病、纤维化、 辐射纤维化、闭塞性毛细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞浸润 性肺病、传染病后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1- 型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮样肝炎)、2-型自身免疫性 肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色棘皮症 的B型胰岛素抗性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫 疾病、与器官移植相关的慢性免疫疾病、骨关节炎、原发性硬化性胆 管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫中性 白细胞减少、肾病NOS、肾小球肾炎、肾微小性血管炎、莱姆病、盘 形红斑狼疮、特发性男性不孕症或NOS、精液自身免疫性、多发性硬 化(所有亚型)、交感神经眼炎、结缔组织疾病继发性高血压、 Goodpasture′s综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿性发烧、 类风湿性脊椎炎、Still′s病、全身硬化、Sjogren′s综合征、Takayasu′s 病/动脉炎、自身免疫性血小板减少、特发性血小板减少、自身免疫性 甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺机能减退 (Hashimoto′s病)、萎缩性自身免疫性甲状腺机能减退、原发性粘液水 肿、晶状体原性眼色素层炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢 性肝病、酒精性肝硬化、酒精引起的肝损伤、choleosatatis、特应性肝 病、药物引起的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B族 链球菌(GBS)感染、精神病(例如抑郁症和精神分裂症)、Th2型和Th1 型介导的疾病，急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)和癌症，例如肺癌、 乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠 癌，以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)，无β脂蛋白血症、手足发绀、 急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病 (ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺 炎、急性肾衰竭、腺癌、空异位搏动、AIDS痴呆综合征、酒精诱导 的肝炎、过敏性结膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、同种移植 物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、 前角质细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗-受体过敏反应、主 动脉和周围动脉瘤、主动脉切开、动脉高血压、动脉硬化、动静脉瘘、 共济失调、心房纤维性颤动(持续或阵发性的)、心房扑动、房室阻滞、 B细胞淋巴瘤、骨移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、 Burkitt′s淋巴瘤、烧伤、心脏心律不齐、心脏震颤综合征、心脏肿瘤、 心肌病、心肺旁路炎症反应、软骨移植排斥、脑皮层变性、混乱或多 灶性心房性心博过速、与化疗有关的病症、慢性髓细胞性白血病 (CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病变、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、 慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸中毒、结肠直肠癌、充血性心力 衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺原性心脏病、冠状动脉疾病、 Creutzfeldt-Jakob病、培养阴性脓毒症、囊性纤维化、与细胞因子治 疗有关的病症、拳击手痴呆、脱髓鞘性疾病、登革热、出血热、皮炎、 皮肤病症、糖尿病、糖尿病症、糖尿病性动脉粥样疾病、弥散性雷维 小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年Down′s综合 征、阻断CNS多巴胺的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、 脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、爱-巴病毒感染、红斑性肢 痛症、锥体束外和脑病症、家族性噬红细胞细胞淋巴组织细胞增多症、 胎儿胸腺移植排斥、Friedreich′s共济失调、功能性周围动脉病症、真 菌脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、肾小球性肾炎、任何器官或组织的移 植物排斥、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、由于细胞内生物 体导致的肉芽肿、毛细胞白血病、Hallerrorden-Spatz疾病、桥本氏甲 状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血尿 毒症综合征/溶血栓血小板生成紫癜、出血、肝炎(A)、希斯束心律失 常、EQV感染/HIV神经病、Hodgkin′s病、运动机能亢进病症、过敏 反应、过敏性肺炎、高血压、运动机能减退病症、海马-垂体-肾上腺 轴评估、特发性Addison′s病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒 性、衰弱、婴儿脊髓肌肉萎缩、主动脉炎症、流感、离子辐射暴露、 虹膜睫状体炎/眼色素层炎/视神经炎、缺血-再灌注损伤、缺血性中风、 幼年类风湿性关节炎、幼年脊髓肌肉萎缩、Kaposi′s肉瘤、肾移植排 斥、军团菌病、利什曼病、麻风病、皮质脊髓系统损伤、脂肪水肿、 肝脏移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、 恶性黑素瘤、软膜蛛网膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头 痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织疾病、单克隆γ-球蛋白病、 多骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和 Machado-Joseph)、重症肌无力、细胞内鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、 脊髓发育不良综合征、心急梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿 慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I型肌肉萎缩、 粒细胞缺乏性发热、非何杰氏淋巴瘤、腹部主动脉及其分枝闭塞、闭 塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除述逆 向操作、器官巨大症、骨质疏松、胰腺移植排斥、胰腺癌、肾瘤形成 综合征/恶性高钙血症、甲状旁腺移植排斥、骨盆炎症疾病、常年性鼻 炎、心包病、周围动脉粥样硬化疾病、周围血管病症、腹膜炎、恶性 贫血、卡氏肺囊虫肺炎、肺炎、POEMS综合征(多精神病、器官巨大 症、内分泌病、单克隆γ-球蛋白病和皮肤改变综合征)、灌注后综合征、 泵后综合征、MI心脏切开术后综合征、子痫前期、进行性核上性麻 痹、原发性肺动脉高血压、放疗、Raynaud′s现象和疾病、Raynoud′s 病、Refsum′s病、规律性窄QRS心搏过速、肾血管高血压、再灌注损 伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年舞蹈病、雷维小体型老年痴 呆、血清反应阴性关节病、休克、镰状细胞性贫血、皮肤同种移植物 排斥、皮肤改变综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特异性心律失常、 脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急 性硬化性全脑炎、昏厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身性 炎性反应综合征、全身性发作型幼年类风湿性关节炎、T-细胞或FAB ALL、毛细管扩张、闭塞性血栓血管炎、血小板减少症、中毒、移植、 创伤/出血、III型过敏反应、IV型过敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、 尿脓毒症、荨麻疹、瓣性心脏病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静 脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性 脑膜炎、与病毒有关的噬血细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、 Wilson′s病、任何器官或组织的异种移植排斥。
在另一个方面，本发明提供了治疗患者中其中人IL-12和/或人 IL-23是有害的病症的方法，所述方法包括在施用上述第二种治疗剂 之前、同时或之后施用上面公开的任一种结合蛋白的步骤。在优选的 实施方案中，所述第二种治疗剂选自布地奈德、表皮生长因子、皮质 甾类药物、环孢菌素、柳氮磺胺吡啶、氨基水杨酸盐、6-巯基嘌呤、 硫唑嘌呤、甲硝哒唑、脂氧合酶抑制剂、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、巴柳 氮、抗氧化剂、血栓烷抑制剂、IL-1受体拮抗剂、抗-IL-1β单克隆抗 体、抗-IL-6单克隆抗体、生长因子、弹性蛋白酶抑制剂、吡啶基-咪 唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、 IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、 CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或 其配体的抗体，甲氨喋呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、 来氟洛米、NSAID、布洛芬、皮质甾类药物、氢化泼尼松、磷酸二酯 酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓剂、补体抑制剂、肾上腺素能剂、IRAK、 NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制剂、IL-1β转化酶抑制剂、TNFα转 化酶抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺 吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张肽转化酶抑制剂、可溶性细 胞因子受体、可溶性p55 TNF受体、可溶性p75 TNF受体、sIL-1RI、 sIL-1RII、sIL-6R、抗炎细胞因子、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ。 在优选的实施方案中，上面公开的药物组合物是通过选自下列的途径 对个体给药:胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹 内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫 颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜 内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑液内、 胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、经阴道、经直肠、颊、舍下、鼻 内和经皮。
本发明的一个方面涉及至少一种IL-12抗-遗传型抗体，所述抗体 抗至少一种本发明的IL-12结合蛋白。所述抗-遗传型抗体包括含有分 子的任何蛋白或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例 如但不限于至少一个重链或轻链的互补性决定区(CDR)或其配体结合 部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架区；或可以引入 到本发明结合蛋白内的其任何部分。
发明详述
本发明涉及IL-12p40结合蛋白，特别是抗-IL-12p40抗体，或结 合IL-12p40的其抗原结合部分。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片 段，及其药物组合物，以及用于制备这样的抗体和片段的核酸、重组 表达载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明抗体来在体外和体内 检测人IL-12p40、人IL-12和人IL-23的方法；抑制人IL-12和/或人IL-23 活性的方法；以及调节基因表达的方法。
除非在这里另有定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语 应该具有本领域技术人员通常理解的定义。术语的含义和范围应当是 清楚的，然而，如果出现任何潜在的含糊之处，则本文提供的定义优 先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文必需说明，单数应该包 括复数，而复数应当包括单数。在本说明书中，除非另有说明，否则 “或”的意思是“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式，例如 第三人称的和过去式的“包括”的使用，是非限制性的。还有。除非 另有说明，否则术语，例如“元素”或“成分”包括包含一个成分的 元素和成分以及包括一个以上子单位的元素和成分。
一般情况下，与这里描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫 学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的术 语是本领域公知的和通常使用的。本发明的方法和技术一般根据本领 域公知的常规方法和本说明书引述的和讨论的各种概述性的和更专业 的参考文献来进行，除非另有说明。根据厂商说明书进行酶促反应和 纯化技术，如本领域常规实现的或者如这里描述的。与这里描述的实 验步骤、分析化学、合成有机化学和药物化学技术相关的术语是本领 域公知的和通常使用的。化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递 送和对患者的治疗是标准技术。
下面定义选择的术语，可以更容易理解本发明。
本文使用的术语“多肽”是指任何氨基酸的聚合链。术语“肽” 和“蛋白质”与术语多肽互换使用，也指氨基酸的聚合链。术语“多 肽”包括天然或人造蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。 多肽可以是单体的或聚合的。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其来源或产生来 源不与其天然态下伴随它的天然相关成分相关；基本上没有来自相同 物种的其他蛋白质；由不同物种的细胞表达；或者在自然中不存在的 蛋白质或多肽。因此，化学合成或在不同于其天然起源细胞的细胞系 中合成的多肽是与其天然相关成分“分离的”。利用本领域公知的蛋 白质纯化技术，通过分离，可以使得蛋白质基本上没有天然相关成分。
本文使用的术语“回收＂”是指，例如，利用本领域公知的蛋白质 纯化技术，通过分离，使得化学物质例如多肽基本上没有天然相关成 分的方法。
本文所用术语“人IL-12”(在本文中简称为hIL-12或IL-12)包括 主要由抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树状细胞分泌的人细 胞因子。该术语包括异二聚体蛋白，其包括35kDa亚单位(p35)和40kDa 亚单位(p40)，这两个亚单位是通过二硫桥连接在一起的。所述异二聚 体蛋白称为“p70蛋白”。人IL-12的结构进一步描述于例如Kobayashi， 等人(1989)J.Exp Med.170:827-845；Seder，等人(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.90:10188-10192；Ling，等人(1995)J.Exp Med.154:116-127； Podlaski，等人(1992)Arch.Biochem.Biophys.294:230-237中。术语 人IL-12包括重组人IL-12(rh IL-12)，其可通过标准重组表达方法制 得。
本文所用术语“人IL-23”(在本文中简称为hIL-23或IL-23)包括 属于由5个这样的异二聚细胞因子组成的异二聚人细胞因子家族，5 个这样的异二聚细胞因子包括IL-12和IL-27(Trinchieri等人，(2003) Immunity 19:641-644)。该术语包括异二聚体蛋白，该异二聚体蛋白 包含19kD亚单位(p19)和40kD亚单位(p40)，这两个亚单位是通过二 硫桥连接在一起的。术语人IL-23包括重组人IL-23(rh IL-23)，其可 通过标准重组表达方法制得。
本文所用术语“IL-12p40”与“IL-23p40”相同，并且也简称为 “p40”，包括人细胞因子IL-12(p40)的40kD亚单位和人细胞因子 IL-23的40kD亚单位。表1显示了本领域已知的IL-12p40的氨基酸 序列，SEQ ID No.1。
表1:IL-12和IL-23的p40亚单位的序列
  蛋白 序列标识 序列 12345678901234567890123456789012 IL-12和IL-23的p40                   亚单位                                                                                                                                          SEQ ID NO.:1                                                                                           MCHQQLVISWFSLVFLDLVAIWELKKDVYVVE LDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSS EVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLS HSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLR CEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGS SDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQ EDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEY PDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVF TDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEW ASVPCS                          
本文所用术语“生物活性”是指细胞因子的所有固有生物性质。 IL-12的生物性质包括但不限于结合IL-12受体；诱导干扰素-γ(IFN-γ) 分泌和调节抗原特异性T辅助细胞1型(Th1)与2型(Th2)淋巴细胞之 间的平衡。IL-23的生物性质包括但不限于结合IL-23受体；诱导IFN-γ 生成。Th1细胞分化和激活树状细胞的抗原呈递功能，以及选择性地 诱导记忆T细胞的增殖。
关于抗体、蛋白质或肽与第二化学物质相互作用的本文使用的术 语“特异性结合”或“特异地结合”，意思是相互作用取决于化学物 质上的特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别 和结合特定蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对于表位“A” 是特异性的，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或 者游离的没有标记的A)的分子的存在会减少与抗体结合的标记的A 的量。
本文使用的术语“抗体”在广义上指由四个多肽链构成的任何免 疫球蛋白(Ig)分子:两个重链(H)和两个轻链(L)，或者保留Ig分子的 基本表位结合特征的其任何功能片段、突变体、变体或衍生物。这样 的突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域公知的。下面讨论非限制 性实施方案。
在全长抗体中，每条重链由一个重链可变区(本文中缩写为HCVR 或VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2 和CH3构成。每条轻链由一个轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL) 和一条轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL 区能进一步分为高变区，称作互补性决定区(CDR)，期中散布着更保 守的称作框架区(FR)的区。每条VH和VL由三个CDR和四个FR构 成，从氨基末端至羧基末端以下面的顺序排列:FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、 IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1和IgA2)或亚类。
本文使用的术语，抗体的“抗原-结合部分”(或者简单地“抗体 部分”)是指保留特异性结合抗原(例如hIL-12)能力的抗体的一个或几 个片段。已经证明通过全长抗体的片段能完成抗体的抗原-结合功能。 这样的抗体实施方案还可以是双特异性的，双重特异性的或多特异性 的形式；特异性结合两个或多个不同的抗原。术语抗体的“抗原-结合 部分”所包括的结合片段的实例包括:(i)Fab片段。由VL、VH、CL 和CH1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区通过 二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构 成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546，Winter等人，PCT 公开WO 90/05144 A1，其引入本文以供参考)。其包括一个可变区； 和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域， VL和VH由不同的基因编码，但是利用重组方法，通过使他们制备 成其中VL和VH区对形成一价分子(已知是单链Fv(scFv)；参见例如 Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:5879-5883)的蛋白质单链的合成接头，能将他们连 接。这样的单链抗体也包括在术语抗体的“抗原-结合部分”中。也包 括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价双特异性抗体， 其中VH和VL结构域在单链多肽上表达，但是使用太短不能在相同 链上两个结构域之间配对的接头。从而使结构域与另一个链的互补结 构域配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.，等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994) Structure 2:1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域已知的 (Kontermann和Dubel eds.，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag. New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5)。
本文所用术语“抗体构建物”是指多肽，其包含与接头多肽或免 疫球蛋白恒定区连接的一个或多个本发明抗原结合部分。接头多肽包 含通过肽键连接的两个或多个氨基酸残基，并且用于连接一个或多个 抗原结合部分。这样的接头多肽是本领域众所周知的(参见例如 Holliger，P.，等人(1993)Proc.Natl.Acad.ScL USA 90:6444-6448； Poljak，RJ.，等人(1994)Structure 2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定区 是指重链或轻链恒定区。人IgG重链和轻链恒定区氨基酸序列是本领 域已知的，并且显示在表2中。
表2:人IgG重链恒定区和轻链恒定区的序列
  蛋白 序列标识 序列 12345678901234567890123456789012 Igγ-1恒定区                                                                                                                      SEQ ID NO.:2                                                                                           ASTKGPSVFFLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK                       Igγ-1恒定区突变体                                                                                                                                                                            SEQ ID NO.:3                                                                                           ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK                       Igκ恒定区                       SEQ ID NO.:4                     TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC                       Igλ恒定区                       SEQ ID NO.:5                     QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDF YPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNK YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE KTVAPTECS                       
此外，抗体或其抗原-结合部分可以是更大的免疫粘着分子的部 分，是通过抗体或抗体部分与一个或几个其他蛋白质或肽的共价或非 共价结合形成的。这样的免疫粘着分子的例子包括使用链霉抗生物素 蛋白核心区形成四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)和使用半胱氨酸残基，一种标记 肽和C-末端多组氨酸标签形成二价的和生物素化scFv分子 (Kipriyanov，S.M.，等人(1994)MoI.Immunol.31:1047-1058)。抗体 部分，例如Fab和F(ab′)2片段，能应用常规技术，例如分别对全抗体 进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而从全抗体制备。此外，应用这里描 述的标准重组DNAa技术能获得抗体、抗体部分和免疫粘着分子。
本文使用的术语“分离的抗体”意指基本上没有具有不同抗原特 异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合hIL-12的分离的抗体基本上 没有特异性结合hIL-12以外抗原的抗体)。然而，特异性结合hIL-12 的分离的抗体具有与其他抗原例如来自其他物种的IL-12分子的交叉 反应性。此外，分离的抗体基本上没有其他细胞材料和/或化学物质。
本文使用的术语“人抗体”意指包括具有来自人种系免疫球蛋白 序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系 免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或定点诱变或通过体 内体突变诱导的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而， 本文使用的术语“人抗体”不包括其中来自另一个哺乳动物种系例如 小鼠的种系的CDR序列接枝到人构架序列内的抗体。
本文使用的术语“重组人抗体”意在包括通过重组方法制备、表 达、产生或分离的所有的人抗体，例如利用转染到宿主细胞中的重组 表达载体表达的抗体(在下面II C章节进一步描述)，从重组组合人抗 体库分离的抗体(HoogenboomKR.，(1997)TIB Tech.15:62-70；Azzazy H.，和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo J.V.，and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145； HoogenboomH.，and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371- 378)，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参 见例如Taylor，L.D.，等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295； Kellermann S-A.，和Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597；Little M.等人(2000)Immunology Today 21:364-370)或 者通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他 方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来自人 种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是在一些实施方案中，对 这样的重组人抗体体外诱变(或者当体内体诱变使用人Ig序列的转基 因动物时)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来自体内人 抗体种系全部中天然并不存在的人种系VH和VL序列和与人种系VH 和VL序列相关的序列。
术语“嵌合抗体”是指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序 列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接 的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“CDR-接枝抗体”是指包括来自一个物种的重链和轻链可变 区，但是其中序列中VH和/或VL中一个或几个CDR区被另一个物 种的CDR序列置换，例如具有其中一个或几个鼠CDR(例如CDR3) 被人CDR序列置换的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如小鼠)但是其 中VH和/或VL序列中至少一部分被变为更“人-样”，即与人种系可变 序列更相似的重链和轻链可变区序列的抗体。人源化抗体的一种类型 是CDR-接枝抗体，其中人CDR序列导入非人VH和VL序列以置换 相应的非人CDR序列。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中是 交替使用。为本领域所知的这些术语是指氨基酸残基编号系统，这些 氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨 基酸残基是更可变(即高度可变)(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad，Sci. 190:382-391和Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开91-3242)。对于重链可变区，对于CDR1， 高度可变区域位于31-35位氨基酸，对于CDR2，位于50-65位氨 基酸，对于CDR3，位于95-102位氨基酸。对于轻链可变区，对于 CDR1，高度可变区域位于24-34位氨基酸，对于CDR2，位于50- 56位氨基酸，对于CDR3，位于89-97位氨基酸。
本文所用术语“接受者”和“接受者抗体”是指抗体或核酸序列， 其提供或编码一个或多个框架区的氨基酸序列的至少80％、至少85％、 至少90％、至少95％、至少98％或100％。在某些实施方案中，术语 “接受者”是指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另一 个实施方案中，术语“接受者”是指通过或编码一个或多个框架区和 恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一个具体实施方案中，术语“接 受者”是指人抗体氨基酸或核酸序列，其提供或编码一个或多个框架 区的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少 98％或100％。依据该实施方案，接受者可含有至少1个、至少2个、 至少3个、至少4个、至少5个或至少10个在人抗体的一个或多个 特点位置不存在的氨基酸残基。接受者框架区和/或接受者恒定区可以 例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领 域众所周知的抗体、开发中的抗体或可商购获得的抗体)。
本文所用术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补性决定区。在 重链和轻链的每个可变区中存在3个CDR，对于每个可变区，其称为 CDR1、CDR2和CDR3。本文所用术语“CDR组”是指在能够结合抗 原的一个可变区中存在的一组3个CDR。这些CDR的精确界限已经 根据不同系统进行了不同定义。Kabat描述的系统(Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何 可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义这三个CDR的精 确残基界限。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia &Lesk，J.MoI.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等人，Nature 342: 877-883(1989))发现，Kabat CDR内的一些亚部分几乎采取了相同的 肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大差异。这些亚部分指 定为L1、L2和L3，或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别是 指轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的界限。Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J MoI Biol 262(5):732-45(1996))中已经描述了定义与Kabat CDR重叠 的CDR的其他界限。其他CDR界限可能没有严格遵照一个上述系统， 但是仍然与Kabat CDR重叠，尽管根据以下预测或实验发现，他们可 以被缩短或延长，特定残基或残基组或甚至整个CDR没有显著影响 抗原结合。本文使用的方法可使用根据任一这些系统所定义的CDR， 不过优选的实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
本文所用术语“正规”残基是指CDR或框架中的残基，其限定 了正规CDR结构，如Chothia等人所定义(J.MoI.Biol.196:901-907 (1987)；Chothia等人，J.MoI.Biol.227:799(1992)，二者引入本文 以供参考)。根据Chothia等人，很多抗体的CDR的关键部分具有几 乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大差异。对于 形成环的氨基酸残基的相连片段来说，每个正规结构主要指定一组肽 骨架扭转角。
本文所用术语“供体”和“供体抗体”是指提供一个或多个CDR 的抗体。在优选的实施方案中，供体抗体是与由其获得或衍生出框架 区的抗体不同物种的抗体。在人源化抗体的上下文中，术语“供体抗 体”是指提供一个或多个CDR的非人类抗体。本文所用术语“框架” 或“框架序列”是指减去CDR之后的可变区的其余序列。由于CDR 序列的精确定义可以通过不同系统来确定，所以框架序列的含义相应 地具有不同解读。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3和重链的 CDR-H1、-H2和-H3)还把轻链和重链上的框架区在每个链上分为4个 亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2 位于FR2与FR3之间，并且CDR3位于FR3与FR4之间。如果没有 把特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，由其他来指定的框架代 表一个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR。本文所用 术语FR代表这四个亚区中的一个，FRs代表构成框架区的这四个亚 区中的两个或多个。
人类重链和轻链接受者序列是本领域已知的。在本发明的一个实 施方案中，人类重链和轻链接受者序列选自表3和表4中描述的序列。
表3:重链接受者序列
  SEQ ID  No. 蛋白区域          序列      12345678901234567890123456789012 6 VH2-70/JH6 FR1 EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS 7 VH2-70/JH6 FR2 WIRQPPGKALEWLA 8 VH2-70/JH6 FR3 RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR 9 VH2-70/JH6 FR4 WGQGTTVTVSS 10 VH2-26/JH6 FR1 EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS 7 VH2-26/JH6 FR2 WIRQPPGKALEWLA 11 VH2-26/JH6 FR3 RLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR 9 VH2-26/JH6 FR4 WGQGTTVTVSS 12 VH3-72/JH6 FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 13 VH3-72/JH6 FR2 WVRQAPGKGLEWVG 14 VH3-72/JH6 FR3 RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR 9 VH3-72/JH6 FR4 WGQGTTVTVSS 15 VH3-21/JH6 FR1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS 16 VH3-21/JH6 FR2 WVRQAPGKGLEWVS 17 VH3-21/JH6 FR3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 9 VH3-21/JH6 FR4 WGQGTTVTVSS 18 VH1-69/JH6 FR1 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS 19 VH1-69/JH6 FR2 WVRQAPGQGLEWMG 20 VH1-69/JH6 FR3 RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR. 9 VH1-69/JH6 FR4 WGQGTTVTVSS 21 VH1-18/JH6 FR1 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 19 VH1-18/JH6 FR2 WVRQAPGQGLEWMG 22 VH1-18/JH6 FR3 RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR 9 VH1-18/JH6 FR4 WGQGTTVTVSS
表4:轻链接受者序列
  SEQ ID  No. 蛋白区域          序列      12345678901234567890123456789012 23 B3/JK4  FR1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC 24 B3/JK4  FR2 WYQQKPGQPPKLLIY 25 B3/JK4  FR3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC 26 B3/JK4  FR4 FGGGTKVEIKR 27 L2/JK4  FR1 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC 28 L2/JK4  FR2 WYQQKPGQAPRLLIY 29 L2/JK4  FR3 GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 26 L2/JK4  FR4 FGGGTKVEIKR 30 L15/JK4 FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 31 L15/JK4 FR2 WYQQKPEKAPKSLIY 32 L15/JK4 FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 26 L15/JK4 FR4 FGGGTKVEIKR 33 L5/JK4  FR1 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC 34 L5/JK4  FR2 WYQQKPGKAPKLLIY 32 L5/JK4  FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 26 L5/JK4  FR4 FGGGTKVEIKR
本文所用术语“种系抗体基因”或“基因片段”是指免疫球蛋白 序列，其是由没有经过突变过程的非淋巴细胞编码的，对于特定免疫 球蛋白的表达，所述突变导致基因重排和突变(参见例如Shapiro等人， Crit.Rev.Immunol.22(3):183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484:13-30(2001))。由本发明的各个实施方案提供的一个 优点源于这样的认识，也就是说，种系抗体基因比成熟抗体基因更有 可能保存物种个体的必需氨基酸序列结构特征，因此当在物种中治疗 使用时被作为外来抗体识别的可能性更小。
本文所用术语“关键”残基是指对于抗体，特别是人源化抗体的 结合特异性和/或亲合力具有更大影响的可变区内的一些残基。关键残 基包括但不限于一个或多个下列残基:与CDR相邻的残基，现在的 糖基化位点(可以是N-或O-糖基化位点)，稀有残基，能够与抗原相互 作用的残基，能够与CDR相互作用的残基，正规残基，重链可变区 与轻链可变区之间的接触残基，Vernier区内的残基，以及在可变重链 CDR1的Chothia定义与第一重链框架的Kabat定义之间重叠的区域中 的残基。
本文所用术语“人源化抗体”是这样的抗体或其变体、衍生物、 类似物或片段，其免疫特异性地与所关注的抗原结合，并且包含基本 上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体抗体 的氨基酸序列的互补性决定区(CDR)。本文所用的，在CDR上下文中 的术语“基本上”是指，CDR所具有的氨基酸序列与非人抗体CDR 的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％， 至少98％或至少99％的同一性。人源化抗体包括基本上所有至少一个， 通常两个可变区(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上 所有CDR区与非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区相一致，并且 所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。优选地， 人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定区 的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及重链的 至少可变区。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4 区。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在某些实施 方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体实施方案中，人源化 抗体仅含有轻链的人源化可变区和/或人源化重链。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、 IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4。人源化抗体可以包含一个类别以上的序列或同种型，并且可 以选择特定的恒定区来使用本领域众所周知的技术优化所需的效应子 功能。
人源化抗体的框架和CDR区域不需要精确地与母序列相一致， 例如，供体抗体CDR或共有框架可以通过取代、插入和/或删去至少 一个氨基酸残基来进行诱变，这样在该位置的CDR或框架残基与供 体抗体或共有框架不一致。然而，在优选的实施方案中，这样的突变 将不是广泛的。通常，至少80％，优选至少85％，更优选至少90％， 最优选至少95％的人源化抗体残基将与母FR和CDR序列的残基相一 致。本文所用术语“共有框架”是指在共有免疫球蛋白序列中的框架 区。本文所用术语“共有免疫球蛋白序列”是指由一个家族的相关免 疫球蛋白序列中的最经常存在的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例 如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim， Germany 1987)。在一个家族的免疫球蛋白中，共有序列中的每个位置 在该家族的此位置上被最经常存在的氨基酸所占据。如果两个氨基酸 存在的频率相同，则他们都可以包括在共有序列中。本文所用术语 “Vernier”区域是指一个亚组的框架残基，其可以调节CDR结构， 并且微调与抗原的适合性，如Foote和Winter所描述的那样(1992，J. MoI.Biol.224:487-499，其引入本文以供参考)。Vernier区残基形成 在CDR下面的层，并且可以影响CDR的结构以及抗体的亲合力。
本文所用术语“中和”是指，当结合蛋白特异性地与细胞因子结 合时，中和细胞因子的生物活性。优选地，中和性结合蛋白是中和性 抗体，其与hIL-12和/或hIL-23结合导致hIL-12和/或hIL-23的生物 活性被抑制。优选地，中和性结合蛋白结合hIL-12和/或hIL-23并且 把IL-12和/或hIL-23的生物活性降低至少约20％，40％，60％，80％， 85％或更多。中和性结合蛋白对于hIL-12和/或hIL-23生物活性的抑 制可通过测定本领域众所周知的hIL-12和/或hIL-23生物活性的一个 或多个指标来评估。例如，在PHA胚细胞干扰素-γ诱导分析中的人植 物凝集素胚细胞增殖的抑制(参见实施例1.1.C)或在人IL-12受体结合 分析中的受体结合抑制(还参见Salfeld等人，PCT公开WO 00/56772 A1)。
术语“活性”包括活性，例如抗体例如与IL-12抗原结合的抗-hIL-12 抗体对于抗原的结合特异性/亲合力，和/或抗体例如抗-hIL-12抗体的 中和效力，所述抗体与hIL-12的结合抑制hIL-12的生物活性，例如PHA 胚细胞增殖的抑制或在人IL-12受体结合分析中受体结合的抑制，或 PHA胚细胞干扰素-γ诱导分析(参见实施例1.1.C)。
术语“表位”包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何 多肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括象氨基酸、糖侧链、 磷酰基或磺酰基这样的分子的化学活性表面基团，并且在一些实施方 案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗体 结合的抗原的区。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白和/或大分 子的复合混合物中其靶物抗原时，抗体特异性结合抗原。
如本文使用的术语“表面等离振子共振”是指一种光学现象，它 使得通过检测生物传感器基体中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特 异性相互作用，例如利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB， Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)。关于进一步描述，参见Jonsson， U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson，U.，et al(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson，B.，等人(1995)J.MoI Recognit. 8:125-131；和Johnnson，B.，等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如本文使用的术语“Kon”意指本领域公知的抗体与抗原缔合以生 成抗体/抗原复合体的生成速率常数。
如本文使用的术语“Koff”意指本领域公知的抗体从抗体/抗原复 合体离解的离解速率常数。
如本文使用的术语“Kd”意指本领域公知的特定抗体-抗原相互作 用的离解常数。
如本文使用的术语“标记的结合蛋白”是指带有引入的标记物提 供结合蛋白鉴定的蛋白。优选地，标记物是可检测标记物，例如引入 放射性标记的氨基酸或连接可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素 基部分(例如包含荧光标记物或者可通过光学或比色方法检测的酶活性 的链霉抗生物素蛋白)。多肽的标记物的例子包括但不限于下列:放射 性同位素或放射性核素(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、 177Lu、166Ho或153Sm)；荧光标记物(例如FITC、罗丹明、镧系磷光剂)， 酶学标记物(例如辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发 光标记物；生物素基团；预先确定的第二报告基团识别的多肽表位(例 如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位 标签)；和有吸引力的试剂例如钆螯合剂。
术语“抗体缀合物”是指与第二化学部分，例如治疗剂或细胞毒 性剂化学连接的抗体。术语“试剂”在这里用来指化合物，化合物的 混合物，生物大分子或者从生物材料制备的提取物。优选地，治疗剂 或细胞毒性剂包括但不限于百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短 杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长 春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二 酮、二羟蒽二酮、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、 普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，和他们的类似 物或同系物。
本文使用的术语“晶体”和“结晶”是指以晶体形式存在的抗体 或其抗原结合部分。晶体是一种固态形式，它与其他形式例如无定形 固态或液晶态截然不同。晶体由原子、离子、分子(例如蛋白如抗体) 或分子集合体(例如抗原/抗体复合体)有序的重复的三维排列组成。 这些三维排列根据本领域公知的特殊数学关系排列。晶体中重复的基 础单元或者构件称作不对称单元。证实给出确定的结晶学对称性的排 列中重复的不对称单元提供晶体的“晶胞”。所有三个方向规则转换 的晶胞的重复得到晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A.Barrett， Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，2nd ea.，pp.201-16，Oxford University Press，New York，New York，(1999)。
本文中称作“多核苷酸”的术语在这里指两个或多个核苷酸，核 糖核酸或脱氧核糖核酸或任何类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该 术语包括单链和双链形式的DNA，但是优选双链DNA。
本文使用的术语“分离的多核苷酸”意思是多核苷酸(例如基因组 的、cDNA或者合成来源，或者他们的某些组合)，其由于其来源，“分 离的多核苷酸”:与自然界发现的“分离的多核苷酸”的多核苷酸的 全部或部分不相缔合；与自然界不连接的多核苷酸可操纵地连接；或 者在自然界不作为更大序列的部分而存在。
本文使用的术语“载体”意指能将它所连接的另一个核酸转运的 核酸分子。载体的一种类型是“质粒”其是指其中可以连接另外的DNA 片段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外 的DNA片段可连接到病毒基因组中。一些载体能在导入他们的宿主 细胞中自主复制(例如有细菌复制起点的细菌载体和游离基因哺乳动物 载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时能 被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外， 一些载体能指导他们可操纵地连接的基因的表达。这样的载体在这里 称作“重组表达载体”(或者简单地“表达载体”)。一般情况下，重 组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒形式。本说明书中，“质粒” 和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而， 本发明意在包括这样的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如复制 缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，他们起着同等的功能。
术语“可操纵地连接”是指其中将描述的成分相关联使得他们以 期望的方式发挥功能的连接。与编码序列“可操纵地连接”的调控序 列以这样的方式连接使得在与调控序列相匹配的条件下实现编码序列 的表达。“可操纵地连接的”序列包括与感兴趣的基因邻接的表达调 控序列和以反式起作用或者与感兴趣的调控基因有距离的表达调控序 列。
本文使用的“表达调控序列”是指进行表达和加工他们连接的编 码序列所必需的多核苷酸序列。表达调控序列包括合适的转录起始序 列、中止序列、启动子和增强子序列；有效RNA加工信号，例如剪 接和多腺苷酸酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序 列(即Kozak共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；以及如果期望， 增强蛋白质分泌的序列。这样的调控序列的性质根据宿主生物而不 同；在原核生物中，这样的调控序列一般包括启动子、核糖体结合位 点和转录终止序列；在真核生物中，一般情况下，这样的调控序列包 括启动子和转录终止序列。术语“调控序列”意在包括其存在对于表 达和加工是必须的成分，并且还包括其存在是有利的附加成分，例如 前导序列和融合相应物序列。
这里定义的“转化”是指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。 利用本领域公知的各种各样的方法在天然或人为条件下可以发生转 化。转化可以依赖公知的方法将外来核酸序列插入原核或真核宿主细 胞内。根据转化的宿主细胞选择方法，并且包括但不限于病毒感染、 电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这样的“转化”细胞包括稳定转化的 细胞，其中插入的DNA能作为自身复制质粒或者作为宿主染色体的 部分复制。他们还可以包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间的 细胞。
本文使用的“重组宿主细胞”(或者简单地“宿主细胞”)意指其 中已经导入外源DNA的细胞。应该理解这样的术语意在不仅指特定 受体细胞，而且还有这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响， 在后代中可能发生一些改变，这样的后代事实上可能与母本细胞不 同，但是它仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。优选 地，宿主细胞包括选自生命界任何原核和真核细胞。优选的真核细胞 包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。最优选地，宿主细胞包括但 不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK293和COS； 昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞啤酒糖酵母。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例 如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据厂商说明书进行 或者以本领域常规做法或者根据本文的描述进行。上述技术和方法一 般根据本领域公知的常规方法和各种概述和更具体引用的参考文献的 描述进行，这些参考文献在本说明书中引述并讨论。参见，例如 Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，本 文为了任何的目的引作参考。
正如本领域公知的和本文使用的“转基因生物”是指有包含转基 因的细胞的生物，其中导入生物体中的转基因(生物体的祖先)表达在 生物体中天然并不表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，其稳定且 可操纵地整合到产生转基因生物体的细胞的基因组中，在转基因生物 的一种或几种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。
术语“调控”和“调节”互换使用，如本文使用的，是指感兴趣 的分子活性(例如hIL-12的生物活性)的变化或改变。调控可以是感兴 趣的分子的某些活性或功能大小的增加或减小。举例的分子的活性和 功能包括但不限于结合特征、酶活性、细胞受体激活和信号转导。
相应地，本文使用的术语“调节剂”是能改变或变化感兴趣的分 子的活性或功能(例如hIL-12的生物活性)的化合物。例如，调节剂可 以引起分子的某些活性或功能的大小与不存在调节剂所发现的活性或 功能的大小相比有所增大或降低。在一些实施方案中，调节剂是抑制 剂，其降低分子的至少一种活性或功能大小。举例的抑制剂包括但不 限于蛋白质、肽、抗体、peptibodies、碳水化合物或小有机分子。 Peptibodies描述在例如WO01/83525中。
本文使用的术语“激动剂”是指一种调节剂，其当与感兴趣的分 子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在激动剂所发现 的活性或功能的大小相比有所增大。特别感兴趣的激动剂包括但不限 于IL-12多肽、核酸、碳水化合物或结合hIL-12的任何其他分子。
本文使用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指一种调节剂，其当 与感兴趣的分子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在 拮抗剂所发现的活性或功能的大小相比有所降低。特别感兴趣的拮抗 剂包括阻断或调节hIL-12和/或hIL-23的生物学或免疫学活性的那些。 hIL-12和/或hIL-23的拮抗剂和抑制剂包括但不限于蛋白、核酸、碳 水化合物或结合hIL-12和/或hIL-23的任何其他分子。
本文所用术语“有效量”是指这样的治疗量，其足以减轻或改善 病症或其一种或多种症状的持续，预防病症的进展，引起病症恢复， 防止与病症有关的一种或多种症状的复发、发作或进展，检测病症或 者提高或改善另一种治疗(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果。
本文使用的术语“样品”以其广义使用。本文使用的“生物样品” 包括但不限于来自活体或活体前的任何量物质。这样的活体包括但不 限于人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。这样的物质包括但不 限于血液、血清、尿液、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和 脾。
I.结合人IL-12p40的人抗体
本发明的一个方面提供了以高亲合力、低解离速率和高中和能力 结合IL-12p40的分离的鼠单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，抗 体，或者其部分是分离的抗体。本发明的第二个方面提供了结合IL- 12p40的嵌合抗体。本发明的第三个方面提供了结合IL-12p40的CDR 接枝抗体或其抗原结合部分。本发明的第四个方面提供了结合IL-12p40 的人源化抗体或其抗原结合部分。优选地，所述抗体或其部分是分离 的抗体。优选地，本发明的抗体是中和性人抗-IL-12和/或人抗-IL-23 抗体。
A.制备抗IL-12p40抗体的方法
本发明的抗体可通过本领域已知的多种技术中的任何一种来制 备。
1.使用杂交瘤技术的抗-IL-12p40单克隆抗体
单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术制得，包括使用杂交 瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂 交瘤技术来制备，包括本领域已知的杂交瘤技术，以及例如在Harlow 等人，Antibodies:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，等人，in:单克隆抗体and T-CeIl Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述文献全文引入本文 以供参考)中教导的那些技术。本文所用术语“单克隆抗体”不限于通 过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指从一个克隆产生 的抗体，包括真核、原核或噬菌体克隆，不是产生他的方法。
使用杂交瘤技术来制备和筛选特定抗体的方法是本领域众所周知 的。在一个实施方案中，本发明提供了产生单克隆抗体的方法，以及 通过包括培养能分泌本发明抗体的杂交瘤细胞的方法所产生的抗体， 其中优选地，杂交瘤是这样产生的:将从用本发明抗原免疫的小鼠中 分离出来的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选融合所产生的杂交 瘤，以筛选出分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆(参见实施 例1.2)。简言之，可将小鼠用IL-12抗原免疫。在优选的实施方案中， 将IL-12抗原与助剂一起施用以刺激免疫反应。这样的助剂包括完全 或不完全福氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合体)。 这样的辅助剂通过局部沉积分离它而可以保护多肽不快速散播，或者 他们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他成分有趋化 性的物质。优选地，如果施用多肽，免疫程序包括施用两次或多次多 肽，延续几周。
用IL-12抗原免疫动物之后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体 的细胞。通过从动物取血或杀死动物而从动物获得含有抗-IL-12抗体 的血清。可以使用从动物获得的血清，从血清获得的免疫球蛋白级分， 或者从血清纯化的抗-IL-12抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋 白是多克隆的，因此带有一系列异源性质。
一旦检测到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到对于抗原IL-12 有特异性的抗体，即收获小鼠脾，并且分离出脾细胞。然后通过众所 周知的技术来将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞，例如从得自ATCC 的细胞系SP20获得的细胞融合。通过有限稀释来选择和克隆杂交瘤。 然后通过本领域已知的方法分析杂交瘤克隆，以获得分泌能够结合 IL-12的抗体的细胞。通常含有高水平抗体的腹水流体可通过用阳性 杂交瘤克隆免疫小鼠来产生。
在另一个实施方案中，产生抗体的无限增殖化杂交瘤可以由免疫 动物获得。免疫后，将动物杀死，把脾B细胞与无限增殖化骨髓瘤细 胞融合是本领域众所周知的。参见例如上文中的Harlow and Lane。在 优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞 系)。融合与抗生素选择之后，使用IL-12或其部分或表达IL-12的细 胞来筛选杂交瘤。在优选的实施方案中，利用酶联免疫分析(ELISA) 或者放射免疫分析(RIA)进行最初的筛选，优选ELISA。ELISA筛选 的实例记载于WO 00/37504中，其引入本文以供参考。
选择产生抗-IL-12p40抗体的杂交瘤，克隆，并且进一步筛选期望 的特征，包括强健杂交瘤生长、高抗体产生和期望的抗体特征，下面 进一步讨论。培养杂交瘤并且在同源动物体内，在没有免疫系统的动 物，例如裸鼠中展开，或者在培养基中体外培养。筛选、克隆和扩展 杂交瘤的方法是本领域技术人员公知的。
在优选的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上所述。在另一 个优选的实施方案中，杂交瘤是在非人、非小鼠物种中产生的，例如 大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在另一个实施方案中，杂交瘤是人 杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗-IL-2抗体的人细胞融合。
识别特异性表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，本发 明的Fab和F(ab′)2片段可以通过使用酶将免疫球蛋白分子分解来制 得，所述酶是例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段s)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2 片段)。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CHI区。
2.使用SLAM的抗-IL-12p40单克隆抗体
在本发明的另一个方面，利用本领域称作筛选淋巴细胞抗体方法 (SLAM)的方法从单一的分离的淋巴细胞制备重组抗体，如U.S.专利 5,627,052，PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人(1996)Proc.Natl. Acad.ScL USA 93:7843-7848中所述。在该方法中，应用抗原特异性 溶血血小板测试来筛选章节I中描述的从任何一种免疫动物得到的分 泌感兴趣的抗体的单一细胞，例如淋巴细胞，在抗原特异性溶血血小 板测试中，抗原IL-12，IL-12的亚单位，或者其片段，利用接头，例 如生物素，与绵羊红细胞偶联，并且用来鉴定分泌对IL-12有特异性 的抗体的单一细胞。鉴定感兴趣的分泌抗体的细胞之后，通过逆转录 酶-PCR从细胞获得重链和轻链可变区cDNA，然后在哺乳动物细胞例 如COS或CHO细胞中，在合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区) 的上下游表达这些可变区。用来自体内筛选的淋巴细胞的扩增的免疫 球蛋白序列转染宿主细胞，然后进一步分析并体外筛选，例如通过使 转染细胞分离表达抗IL-12的抗体的细胞。进一步体外操作扩增的免 疫球蛋白序列，例如通过体外亲合性成熟方法，例如在PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的方法。
3.使用转基因动物的抗-IL-12p40单克隆抗体
在本发明的一个实施方案中，通过用IL-12抗原免疫包括人免疫 球蛋白基因座全部或部分的非人动物来制备人抗体。在优选的实施方 案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包括人免疫球蛋白基 因座的大片段并且在小鼠抗体产生中缺乏的基因工程小鼠品系。参 见，例如Green等人Nature Genetics 7:13-21(1994)和美国专利 5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、 6,114,598和6,130,364。还参见WO 91/10741，1991年7月25日公开， WO 94/02602，1994年2月3日公开，WO 96/34096和WO 96/33735， 二者都是在1996年10月31日公开，WO 98/16654，1998年4月23 日公开，WO 98/24893，1998年6月11日公开，WO 98/50433，1998 年11月12日公开，WO 99/45031，1999年9月10日公开，WO 99/53049，1999年10月21日公开，WO 0009560，2000年2月24日 公开，和WO 00/037504，2000年6月29日公开。XENOMOUSE转 基因小鼠产生全人抗体的成人-样人抗体库，并且产生抗原-特异性人 Mab。XENOMOUSE转基因小鼠通过导入兆碱基大小的人重链基因座 和x轻链基因座的种系构型YAC片段而包含大约80％人抗体库。参 见Mendez等人，Nature Genetics 15:146-156(1997)，Green and Jakobovits J.Exp.Med.188:483-495(1998)，该文献公开内容引入本 文以供参考。
4.使用重组抗体库的抗-IL-12单克隆抗体
也可以利用体外方法来制备本发明的抗体，其中筛选抗体库来鉴 定具有期望的结合特异性的抗体。这样筛选重组抗体库的方法是本领 域公知的并且包括例如下面文献中描述的方法:Ladner等人U.S.专利 5,223,409；Kang等人PCT公开WO 92/18619；Dower等人PCT公开 WO 91/17271；Winter等人PCT公开WO 92/20791；Markland等人PCT 公开WO 92/15679；Breitling等人PCT公开WO 93/01288；McCafferty 等人PCT公开WO 92/01047；Garrard等人PCT公开WO 92/09690； Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hyhridomas 3:81-85；Huse等人(1989)Science 246:1275-1281； McCafferty等人，Nature(1990)348:552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J12:725-734；Hawkins等人(1992)JMoI Biol 226:889-896；Clackson 等人(1991)Nature 352:624-628；Gram等人(1992)PNAS 89:3576- 3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom 等人(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；和Barbas等人(1991)PNAS 88:7978-7982，US专利申请公开20030186374，和PCT公开WO 97/29131，每一这些文献的内容都引入本文以供参考。
重组抗体库可以来自用IL-12或IL-23或IL-12或IL-23的部分免 疫的个体。或者，重组抗体库可以来自裸个体，即没有用IL-12或IL- 23免疫的个体，例如从没有用人IL-12或IL-23免疫的人个体获得的 人抗体库。通过用包括人人IL-12p40的肽筛选重组抗体库来筛选本发 明的抗体，从而筛选识别人IL-12p40的那些抗体。实施这样的筛选和 选择的方法是本领域公知的，例如上一段中的参考文献中描述的。为 了筛选对hIL-12具有特定结合亲合性的本发明抗体，例如以特定解离 速率常数从人IL-12离解的那些，能利用本领域公知的表面等离振子 共振的方法来筛选具有期望的解离速率常数的抗体。为了筛选对hIL- 12具有特定中和活性的本发明抗体，例如具有特定IC50的那些，可以 利用本领域公知的评价hIL-12活性的抑制作用的本领域公知的标准方 法。
在一个方面，本发明提供了结合人IL-12和/或人IL-23的分离的 抗体或者其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。优选地，抗体 是人抗体。在很多实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，本发明的抗体还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方 法。在噬菌体展示方法中，在噬菌体颗粒表面上展示功能抗体结构域， 所述噬菌体颗粒携带编码他们的多核苷酸序列。特别是，这样的噬菌 体可用于展示由所有抗体或组合抗体库(例如人或鼠)表达的抗原结合 结构域。使用抗原，例如使用标记的抗原或者结合或捕获到固体表面 或珠子上的抗原来选择表达能结合感兴趣抗原的抗原结合结构域的噬 菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括fd和 M13结合结构域，这些结构域是由具有重组融合到噬菌体基因III或 基因VIII蛋白上的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv的噬菌体表达的。可 用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括在下列文献中公开 的方法:Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)；Ames 等人，J.Immunol.Methods 184:177-186(1995)；Kettleborough等人， Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persic等人，Gene187 9-18(1997)； Burton等人，Advances in Immunology 57:191-280(1994)；PCT申请 PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401； 和U.S.专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908； 5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225； 5,658,727；5,733,743和5,969,108；每一这些文献都全文引入本文以 供参考。
如上面的文献中所述，噬菌体选择之后，可从噬菌体中分离出抗 体编码区，并且用于产生包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段的 全部抗体，并且在任何所需宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、 昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下面信息描述。例如，还 可以采用用于重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，使用本领域 已知的方法，例如在下列文献中公开的方法:PCT公开WO 92/22324； Mullinax等人，BioTechniques 12(6):864-869(1992)；和Sawai等人， AJRI 34:26-34(1995)；以及Better等人，Science 240:1041-1043(1988) (所述文献全文引入本文以供参考)。可用于产生单链Fv和抗体的技术 的实例包括在下列文献中公开的方法:U.S.专利4,946,778和 5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203:46-88(1991)； Shu等人，PNAS 90:7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science 240: 1038-1040(1988)。
作为通过噬菌体展示来筛选重组抗体库的替代方法，可以采用本 领域已知的用于筛选大组合库的其他方法来鉴定本发明的双特异性抗 体。一种类型的替代表达系统是这样的系统，其中重组抗体库是作为 RNA-蛋白融合体来表达，如Szostak和Roberts的PCT公开WO 98/31700，以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 94:12297-12302中所述。在该系统中，在mRNA与肽或蛋 白之间产生共价融合体，其通过在体外翻译合成mRNA而编码，所述 mRNA在3’末端携带嘌呤霉素，一种肽基接受者抗生素。因此，特异 性mRNA可从mRNA的复杂混合物(例如组合库)中富集，基于编码的 肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双特异性抗 原的结合。从筛选这样的库而回收的编码抗体或其部分的核酸序列可 以通过如上所述的重组工具来表达(例如在哺乳动物宿主细胞中表 达)，此外，可以通过另外轮次的mRNA-肽融合体筛选来进行进一步 的亲合性成熟，其中已经将突变引入到初始选择的序列内，或者通过 如上所述的用于重组抗体体外亲合性成熟的其他方法。
在另一个方法中，本发明抗体还可以使用本领域已知的酵母展示 方法来产生。在酵母展示方法中，使用基因方法来把抗体结构域结合 在酵母细胞壁上，并且在酵母表面上展示他们。特别是，这样的酵母 可用于展示从所有抗体或组合抗体库(例如人或鼠)表达的抗原结合结 构域。可用于制备本发明抗体的酵母展示方法的实例包括在Wittrup， 等人U.S.专利6,699,658中公开的方法，其引入本文以供参考。
B.产生重组IL-12p40抗体
通过本领域公知的各种技术可以制备本发明的抗体。例如，从宿 主细胞表达，其中编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染导 宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意在包括通常用于将外源DNA 导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、 DEAE-葡聚糖转染等。虽然有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发 明的抗体，但是在真核细胞中表达是优选的，最优选在哺乳动物宿主 细胞中表达抗体，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核 细胞更有可能装配和分泌适当地折叠并具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国 仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.ScL USA 77:4216-4220中，与DHFR 选择标记物一起使用，例如描述在RJ.Kaufman and P.A.Sharp(1982) MoI.Biol.159:601-621中)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细 胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时， 通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间来制备抗 体，或者，更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中。 利用标准蛋白纯化技术从培养基中回收抗体。
宿主细胞还可以用来制备功能抗体片段例如Fab片段或scFv分 子。理解上述方法中的变化在本发明的范围内。例如，可以预期用编 码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA来转染宿主细 胞。还可以利用重组DNA技术来去除对于与感兴趣的抗原结合不是 必需的编码轻链和重链之一或二者的DNA的一些或部分。由这样截 短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体内。另外，可以制 备双功能抗体，其中一个重链和一个轻链是本发明的抗体，而另一个 重链和轻链对于感兴趣的抗原之外的抗原是特异性的，通过标准化学 交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联。
在本发明抗体或其抗原-结合部分的重组表达的优选系统中，通过 磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入 dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自可操纵 地连接于CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，驱动高水平基因转 录。重组表达载体还带有DHFR基因，其用于使用甲氨喋呤筛选/扩 增用载体转染的CHO细胞的筛选。培养选择的转化子宿主细胞让它 表达抗体重链和轻链，并且从培养基回收完整抗体。利用标准分子生 物技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主 细胞，并且从培养基回收抗体。本发明还提供通过在合适的培养基中 培养本发明的宿主细胞直到合成本发明的重组抗体来合成本发明的重 组抗体的方法。该方法进一步包括从培养基分离重组抗体。
1.抗IL-12p40抗体
表5是本发明优选的抗-hIL-12p40抗体的氨基酸序列一览。
表5:VH和VL区的氨基酸序列一览






上面分离的抗-IL-12p40抗体CDR序列确立了根据本发明分离的 并且包含包括下面表6列出的CDR序列的多肽的IL-12p40结合蛋白 的新家族。为了制备和选择在hIL-12和/或hIL-23方面具有优选的IL- 12p40结合和/或中和活性的本发明的CDR，可以使用本领域公知的用 于产生结合蛋白的标准方法以及用于评估那些结合蛋白的IL-12和/或 IL-23结合和/或中和特征的标准方法，包括但不限于本文中具体描述 的方法。
表6:共有IL-12p40 CDR亲合性配体(下面列出每个氨基酸位置可供 选择的残基；-表示残基可以不存在)。
  CDR 区 序列标识 共有序列 CDR-H1 SEQ ID NO.:55 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 D  Y  Y  I  H  -  - K  S  V  M  G  V  S T  T  G     E S     W     V       S       F CDR-H2 SEQ ID NO.:56 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 H  I  Y  W  D  D  D  K  Y  Y   N   P   S   L   K   -   -   -   -   - D  F  W  P  G  G  G  N  T  N   Y   N   E   K   F   S   D   F   Q   D G     L  H  E  S  S  S  P  T       A   D   D   V   K   G W     S  T  A  T  P  E  I  H       D   P   T   M   Q   R S     N  S  I  N     T  N  K       S       Y   R   P Y     D              H     S                   A R     G                    G CDR-H3 SEQ ID NO.:57 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 R  G  I  R  S  A  M  D  Y  -   -   -   - N  T  R  V  N  Y  A  M  D  Y   M   D   Y W  R  F  Y  G  L  D  Y  N  A    P  Y  F  A  F  L  W    H  Q  A  R  M  F CDR-L1 SEQ ID NO.:58 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 K  A  S  Q  S  V  S  N  D  V   A   -   -   -   - R        E  N  I  G  T  N  G   I   S   F   M   N                   D  K  Y  L   H CDR-L2 SEQ ID NO.:59 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Y  A  S  N  R  Y  T  - S  T  A  H  N  Q  S  S          S  S  I  G          Q CDR-L3 SEQ ID NO.:60 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Q  Q  D  Y  N  S  P  W  T       Y  N  T  Y     F  S       S  K  S  V     Y          I  E  W     L                      P
2.抗IL-12p40嵌合型抗体
嵌合型抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分源自不同动物物 种，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗 体。用于制备嵌合型抗体的方法是本领域已知的，并且详细描述在实 施例2.1中。参见例如Morrison，Science 229:1202(1985)；Oi等人， BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202；U.S.专利5,807,715；4,816,567；和4,816,397，其全文 引入本文以供参考。此外，可以使用通过将得自具有适当抗原特异性 的小鼠抗体的基因与得自具有适当生物活性的人抗体的基因一起剪接 而开发出的制备“亲合性抗体”的技术(Morrison等人，1984，Proc.Natl. Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人，1984，Nature312:604-608； Takeda等人，1985，Nature 314:452-454，其全文引入本文以供参考)。
在一个实施方案中，本发明嵌合型抗体是这样制得的:用人IgG1 恒定区替代在章节1中描述的鼠单克隆抗人IL-12抗体的重链恒定区。 在一个具体实施方案中，本发明的嵌合型抗体包括重链可变区(VH)， 所述重链可变区包括以下氨基酸序列:SEQ ID NO:35；SEQ ID NO: 37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO: 45；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:51；或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包括以下氨 基酸序列:SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:48；SEQ BD NO:50；SEQ ID NO:52；或SEQ ID NO:54的序列。
3.抗IL-12p40 CDR接枝抗体
本发明的CDR-接枝抗体包含来自人抗体的重链和轻链可变区序 列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区被本发明鼠抗体的CDR 序列替代。得自人抗体的框架序列可以起CDR接枝的模板的作用。 然而，直链替代到这样的框架上经常导致对于抗原的结合亲合力的某 些损失。人抗体与初始鼠抗体的同源性越高，把鼠CDR与人框架组 合起来将在CDR中引入降低亲合力的畸变的可能性就越小。因此， 优选地，选择用来替代除了CDR之外的鼠可变框架的人可变框架与 鼠抗体可变区框架具有至少65％的序列同一性。更优选地，人可变区 与除了CDR之外的鼠可变区具有至少70％的序列同一性。甚至更优 选地，人可变区与除了CDR之外的鼠可变区具有至少75％的序列同 一性。最优选地，人可变区与除了CDR之外的鼠可变区具有至少80％ 的序列同一性。用于制备亲合性抗体的方法是本领域已知的，并且详 细描述在实施例2.2中(还参见EP 239,400；PCT公开WO 91/09967； U.S.专利5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，修饰或加工(EP 592,106； EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)； Studnicka等人，Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska等 人，PNAS 91:969-973(1994))和链穿梭(U.S.专利5,565,352)。
在具体的实施方案中，本发明提供了具有如表7中所述VH和/或 VL链的CDR接枝抗体。
表7:CDR接枝抗体
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 61  (6) (7) (8) (9) VH 1D4.1         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4)                                EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS                                 62   (23) (24) (25) (26) VL 1D4.1     (B3/JK4 FR1) (B3/JK4 FR2) (B3/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4)                                DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR             63        (10) (7)  (11) (9)  VH 1D4.2         (VH2-26/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-26/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4)                                EVTLXESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY YNRSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPV                                DTATYYCARRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS  64   (27) (28) (29) (26) VL 1D4.2     (L2/JX4 FR1) (L2/JK4 FR2) (L2/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS                                NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR             65  (6) (7) (8) (9) VH 1D4.3         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4) EVTLRESGPALVKPTOTLTLTCTESGFSLS  KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY YNFSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV                                DTATYYCARRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS  66   (27) (28) (29) (26) VL 1D4.3     (L2/JK4 FR1) (L2/JK4 FR2) (L2/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS                                NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR             67  (6) (7) (8) (9) VH 1A6.1         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4)                                EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS                                68   (23) (24) (25)      (26) VL 1A6.1     (B3/JK4 FR1) (B3/JK4 FR2) (B3/JK4 FR3)              (B3/JK4 FR4)                                DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR            
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 69   (10) (7)  (11) (9)  VH 1A6.2         (VH2-26/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-26/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4) EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS 70   (27) (28) (29) (26) VL 1A6.2     (L2/JK4 FR1) (L2/JK4 FR2) (L2/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4)                                EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR             71   (12) (13) (14) (9)  VH 8E1.1         (VH3-72/JH6 FR1) (VH3-72/JH6 FR2) (VH3-72/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMVWVRQAPGKGLEWVGSISSGSSNIYY ADTVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTED                                TAVYYCARNPYWGQGTTVTVSS         72   (30) (31) (32) (26) VL 8E1.1      (L15/JK4 FR1) (L15/JK4 FR2) (L15/JK4 FR3) (B3/JK4  FR4)                                 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TNVAWYQQKPEKAPKSLIYSASHRYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSYPLTFGGGTKVEIKR             73   (15) (16) (17) (9)  VH 8E1.2         (VH3-21/JH6 FR1) (VH3-21/JH6 FR2) (VH3-21/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMVWVRQAPGKGLEWVSSISSGSSNIYY ADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARNPYWGQGTTVTVSS         74   (33) (34) (32) (26) VL 8E1.2      (L15/JK4 FR1) (L15/JK4 FR2) (L15/JK4 FR3) (B3/JK4  FR4)  DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQNVG TNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASHRYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSYPLTFGGGTKVEIKR                  75   (18) (19) (20) (9)                   VH 3G7.1         (VH1-69/JH6 FR1) (VH1-69/JH6 FR2) (VH1-69/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4)                                EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS DYWIEWVROAPGOGLEWMGGFSHGSGSTNY   NEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARRRFRGMDYWGQGTTVTVSS    76   (23) (24) (25) (26) VL 3G7.1     (B3/JK4 FR1) (B3/JK4 FR2) (B3/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS                                NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYSSPWSFGGGTKVEIKR             77   (21) (19) (22) (9)  VH 3G7.2         (VH1-18/JH6 FR1) (VH1-69/JH6 FR2) (VH1-18/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4)                                EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYWIEWVRQAPGQGLEWMGGFSHGSGSTNY NEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDD TAVYYCARRRFRGMDYWGQGTTVTVSS    78   (27) (28) (29) (26) VL 3G7.2     (L2/JK4 FR1) (L2/JK4 FR2) (L2/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ DYSSPWSFGGGTKVEIKR             67  (6) (7) (8) (9) VH 1A6.5         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4) EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV                                DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS 70   (27) (28) (29) (26) VL 1A6.5     (L2/JK4 FR1) (L2/JK4 FR2) (L2/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ                                DYNSPWTFGGGTKVEIKR            
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 69   (10) (7)  (11) (9)  VH 1A6.6         (VH2-26/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-26/JH6 FR3) (VH2-70/JH6 FR4) EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS 68   (23) (24) (25)      (26) VL 1A6.6     (B3/JK4 FR1) (B3/JK4 FR2) (B3/JK4 FR3)              (B3/JK4 FR4) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR            
4.抗IL-12p40人源化抗体
人源化抗体是得自非人物种抗体的抗体分子，其结合所需抗原， 具有一个或多个来自非人物种的互补性决定区(CDR)和来自人免疫球 蛋白分子的框架区。已知的人Ig序列是公开的，例如
                                 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；
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人框架区中的框架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取 代，以改变，优选提高抗原结合力。这些框架取代是通过本领域众所 周知的方法鉴定的，例如，通过制作CDR与框架残基之间的相互作 用的模型以鉴定出对于抗原结合与序列比较很重要的框架残基，以确 定出在特定位置上的异常框架残基(参见例如Queen等人，U.S.专利 5,585,089；Riechmann等人，Nature 332:323(1988)，其全文引入本 文以供参考)。三维免疫球蛋白通常是可获得的，并且为本领域技术人 员所熟知。计算机程序是可获得的，其阐明和显示所选免疫球蛋白序 列的可能三维构象结构。检查这些显示使得能够分析残基在候选免疫 球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析能够影响候选免疫球蛋白结 合其抗原的能力。以这种方式，可以选择FR残基，并且从共有序列 和输出序列组合，以获得所需抗体特征例如对于靶抗原的亲合性增 加。通常情况下，CDR残基直接并且显著参与影响抗原结合。可以使 用本领域已知的技术将抗体人源化，例如在以下文献中描述的方法: Jones等人，Nature 321:522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239:1534 (1988))，Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia and Lesk， J.MoI.Biol.196:901(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993)，Padlan， Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering7(6):805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91:969-973 (1994)；PCT公开WO 91/09967，PCT/:US98/16280、US96/18978、 US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、 GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、 EP 592,106；EP 519,596、EP 239,400、U.S.Pat.Nos.5,565,332、 5,723,323、5,976,862、5,824,514，5,817,483、5814476、5763192、 5723323、5，766886、5,714,352，6,204,023、6,180,370、5,693,762、 5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567，每一文献都全文引入本 文，包括其中所引用的文献，以供参考。
C.生成抗体和抗体-生成性细胞系
优选地，本发明的抗-IL-12p40抗体表现出降低或中和IL-12活性 的高能力，例如通过本领域已知的几种体外和体内分析中的任一种来 评估(例如参见实施例1.1.C)。例如，这些抗体中和IL-12-诱导的PHA 胚细胞产生干扰素-γ，其中IC50值为至少约10-8M，约10-9M，或约10-10 M。优选地，本发明的抗-IL-12p40抗体还表现出降低或中和IL-23活 性的高能力。
在优选的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分结合人BL- 12p40，其中抗体或其抗原结合部分以约0.1s-1或更小的解离速率常数 (Koff)从人IL-12p40上解离，这是通过表面等离子共振测定的，或者以 约1×10-6M或更小的IC50抑制人IL-12和/或人IL-23活性。或者， 抗体或其抗原结合部分可以以约1×10-2s-1或更小的解离速率常数从 人IL-12p40上解离，这是通过表面等离子共振测定的，或者可以以约 1×10-7M或更小的IC50抑制人IL-12和/或人IL-23活性。或者，抗体 或其抗原结合部分可以以约1×10-3s-1或更小的解离速率常数从人IL- 12p40上解离，这是通过表面等离子共振测定的，或者可以以约1×10-8 M或更小的IC50抑制人IL-12和/或人IL-23。或者，抗体或其抗原结 合部分可以以约1×10-4s-1或更小的解离速率常数从人IL-12p40上解 离，这是通过表面等离子共振测定的，或者可以以约1×10-9M或更小 的IC50抑制人IL-12和/或人IL-23活性。或者，抗体或其抗原结合部 分可以以约1×10-5s-1或更小的解离速率常数从人IL-12p40上解离， 这是通过表面等离子共振测定的，或者可以以约1×10-10M或更小的 IC50抑制人IL-12和/或人IL-23活性。或者，抗体或其抗原结合部分 可以以约1×10-5s-1或更小的解离速率常数从人IL-12p40上解离，这 是通过表面等离子共振测定的，或者可以以约1×10-11M或更小的IC50 抑制人IL-12和/或人IL-23活性。
在一些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1 重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区，κ 轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包含κ轻链恒定区。或者， 抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。
替换Fc部分的氨基酸残基来改变抗体效应子功能是本领域已知 的(Winter，等人US PAT NOS 5,648,260；5624821)。抗体的Fc部分介 导几种重要的效应子功能，例如抗体和抗原-抗体复合物的细胞因子诱 导，ADCC，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性(CDC)和半存留期/清除 速率。在某些情况下，这些效应子功能对于治疗抗体是所希望的，而 在其他情况下，这些效应子功能可能是不需要的或者甚至是有害的。 一些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3分别通过与FcγR和补体CIq 结合来介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半 存留期的关键成分。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗 体的恒定区被替换，例如抗体的Fc区，这样抗体的效应子功能被改 变。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明抗体或抗体部 分衍生至或连接到另一个功能分子(例如另一种肽或蛋白)上。例如， 本发明的标记的结合蛋白可以通过把本发明抗体或抗体部分与一个或 多个其他分子实体连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其 他)来获得，所述其他分子实体是例如另一种抗体(例如双特异性抗体 或二抗体)、可检测到的试剂、细胞毒性剂、药剂和/或可以介导抗体 或抗体部分与另一个分子(例如链霉抗生物素蛋白或多组氨酸标记 物)的缔合的蛋白或肽。
本发明抗体或抗体部分可由其衍生出来的有用的可检测试剂包括 荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红 蛋白等。还可以用可检测酶将抗体衍生化，例如用碱性磷酸酶、辣根 过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等等能够。当用可检测酶将抗体衍生化时， 通过加入另外的试剂检测它，酶用来产生可检测反应产物。例如，当 存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产 生有色反应产物，其是可检测的。也可以用生物素将抗体衍生物化， 并且通过间接测定抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白结合来测定。
本发明的另一个实施方案提供了结晶结合蛋白。优选地，本发明 涉及本文公开的全抗-IL-12p40抗体及其片段的结晶，含有这样的结晶 的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋 白的可溶相应物更长的体内半存留期。在另一个实施方案中，结合蛋 白在结晶之后保留了生物活性。
根据本领域公知的方法和根据中公开的，可以制备本发明的结晶 结合蛋白，WO 02072636在此引作参考。
本发明的另一个实施方案提供了糖基化结合蛋白，其中抗体或其 抗原-结合部分包括一个或几个糖残基。最初的体内蛋白质的产生可以 进一步加工，这是翻译后修饰。特别地，糖(糖基)残基可以酶促加上， 这个过程是糖基化作用。得到的带有共价连接的寡糖侧链的蛋白质已 知是糖基化蛋白质或糖蛋白。抗体是糖蛋白，其在Fc结构域以及可 变区中具有一个或多个糖残基。Fc结构域中的糖残基对于Fc结构域 的效应子功能具有重要影响，对于抗体的抗原结合或半存留期有最小 影响(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.21(2005)，pp.11-16)。相反，可变 区的糖基化可对抗体的抗原结合活性具有影响。可变区中的糖基化可 对抗体结合亲合力具有负面影响，这可能是由于立体阻碍所致(Co， M.S.，等人，MoI.Immunol.(1993)30:1361-1367)，或者导致对于抗 原的亲合力增加(Wallick，S.C.，等人，Exp.Med.(1988)168:1099-1109； Wright，A.，等人，EMBO J.(1991)10:27172723)。
本发明的一个方面涉及产生糖基化位点突变体，其中结合蛋白的 O-或N-连接糖基化位点已经突变。本领域技术人员可使用标准众所周 知的技术来产生这样的突变体。保留生物活性，但是具有增加或降低 的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的，
在另一个实施方案中，本发明抗体或抗原结合部分的糖基化被修 饰。例如，可以制得无糖基化抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖 基化，以例如提高抗体对于抗原的亲合力。这样的糖修饰可以通过例 如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以产生 一个或多个氨基酸取代，导致一个或多个可变区糖基化位点被删除， 从而删除在该位点的糖基化位点。这样的非糖基化可提高抗体对于抗 原的亲合力。这样的方法进一步详细描述于PCT公开WO 2003016466A2以及U.S.专利5,714,350和6,350,861中，每一专利都 全文引入本文以供参考。
此外或者供选择地，可以制得本发明的修饰抗体，其具有改变的 糖基化类型，例如具有少量岩藻糖基残基的低岩藻糖化抗体，或具有 增加的等分GlcNAc结构。已经证实这样改变的糖基化模式能够提高 抗体的ADCC能力。这样的糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化 机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已 经在现有技术中描述过，并且可以用作宿主细胞，以表达本发明的重 组宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如Shields， R.L等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等人(1999)Nat Biotech.17:176-1，以及欧洲专利:EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/5434280，每一所述文献都全文引入本文以供参考。
蛋白质糖基化作用取决于感兴趣的蛋白质的氨基酸序列，以及其 中表达蛋白质的宿主细胞。不同的生物体可以产生不同的糖基化作用 酶(例如糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同的可利用底物(核苷酸糖 类)。由于这样的因素，蛋白糖基化模式和糖基残基的组成可以根据其 中表达特定蛋白质的宿主系统而不同。本发明中使用的糖基残基可以 包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰氨基葡萄糖 和唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白包括糖基化残基，使得糖基化模 式是人的。
本领域技术人员公知不同的蛋白糖基化作用可以产生不同的蛋白 质特征。例如，与哺乳动物例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相 比，微生物宿主例如使用酵母内源途径的酵母中产生的糖基化的治疗 性蛋白质的效力可能被减小。这样的糖蛋白在人体中也可以是免疫原 性的并且具有给药后减小的体内半存留期。人和其他动物中的特异受 体可以识别特异糖基残基并且促进蛋白质从血流中的快速清除。其他 副作用包括蛋白质折叠、可溶性、对蛋白酶的灵敏性、运输、转运、 区室化、分泌、被其他蛋白质或因子识别、抗原性或变应原性的改变。 因此，医师可能优选具有特定糖基化作用组成和模式的治疗性蛋白 质，例如与人细胞中或关注的个体动物的物种-特异性细胞中产生的相 同或至少相似的糖基化组成和模式。
通过基因修饰宿主细胞来表达异源糖基化酶，可以实现与宿主细 胞不同的糖基化蛋白的表达。应用本领域公知的技术，医师可以获得 表现出人蛋白糖基化作用的抗体或其抗原-结合部分。例如，对酵母菌 株进行基因修饰来表达非天然存在的糖基化酶，使得这些酵母菌株中 产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)具有与动物细胞，特别是人细胞产生的 相同的蛋白糖基化作用(U.S专利申请20040018590和20020137134以 及PCT公开WO2005100584A2)。
除了结合蛋白以外，本发明还涉及对于这样的本发明结合蛋白具 有特异性的抗独特型(抗-Id)抗体。抗-Id抗体是这样的抗体，其识别通 常与另一抗体的抗原结合区缔合的独特决定簇。抗-Id可以通过用结 合蛋白或含有CDR的其区域免疫来制得。免疫的动物将识别免疫化 抗体的独特型决定簇并且对其作出反应，产生抗-Id抗体。抗-Id抗体 还可以用作“免疫原”以在另一动物中诱导免疫反应，产生所谓的抗- 抗-Id抗体。
此外，本领域技术人员明白，使用经基因工程处理的表达各种糖 基化酶的宿主细胞库，可以表达感兴趣的蛋白质，使得库中成员宿主 细胞产生具有不同糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。医师可以选择 并分离具有特定新糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。优选地，具有 特定的选择的新的糖基化作用模式的蛋白具有改善的或改变的生物性 质。
D.抗-IL-12p40抗体的用途
由于他们与人IL-12p40结合的能力，本发明的抗-人IL-12p40抗 体或者其部分能用来检测IL-12和/或人IL-23(例如生物样品例如血清 或血浆中的)，利用常规的免疫分析，例如常用的酶联免疫吸着测定法 (ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学法。本发明提供 检测生物样品中IL-12和/或人IL-23的方法，包括使生物样品接触本 发明的抗体或抗体部分，并且检测与IL-12和/或人IL-23结合的抗体 (或抗体部分)或没有结合的抗体(或抗体部分)，从而检测生物样 品中的IL-12和/或人IL-23。用可检测物质直接或间接标记抗体有利 于结合或没有结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅 基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过 氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基 复合体的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物 素；合适的荧光材料的例子包括7-羟基香豆素、荧光素、荧光素异硫 氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光 材料的例子包括鲁米诺；合适的放射性材料的例子包括3H、14C、35S、 90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
供标记抗体可选择的，通过使用用可检测物质标记的人IL-12标 准物和没有标记的抗-人IL-12p40抗体的竞争免疫测定能测定生物液 体中的人IL-12。在该项分析中，生物样品，标记的rhIL-12标准物和 抗-人IL-12p40抗体合并，并且测定与没有标记的抗体结合的标记的 rhIL-12标准物的量。生物样品中，人IL-12的量与和抗-IL-12p40抗 体结合的标记的rhIL-12标准物的量成反比。类似地，在生物流体中 人IL-23也可以通过使用用可检测物质标记的rhIL-23标准物和没有标 记的抗-人IL-12p40抗体的竞争免疫分析来测定。
本发明的抗体和抗体部分能够在体外和体内中和人IL-12和/或人 IL-23活性。因此，例如，在含有hIL-12和/或hIL-23的细胞培养物中， 在IL-12和/或IL-23与本发明的抗体有交叉反应的人个体中或者其他 哺乳动物个体中，这样的本发明的抗体和抗体部分能用来抑制IL-12 和/或IL-23活性。在一个实施方案中，本发明提供了抑制hIL-12和/ 或hIL-23活性的方法，包括使hIL-12和/或hIL-23接触本发明的抗体 或抗体部分，使得hIL-12和/或hIL-23活性被抑制。例如，在含有或 怀疑含有hIL-12和/或hIL-23的细胞培养物中，向培养基加入本发明 的抗体或抗体部分，以抑制培养物中的hIL-12和/或hIL-23活性。
在另一个实施方案中，本发明提供减小个体中hIL-12和/或hIL-23 活性的方法，有利地在患有其中IL-12或IL-23活性是有害的疾病或 病症的患者中减小hIL-12和/或hIL-23活性。本发明提供在患有这样 的疾病或病症的个体中减小IL-12和/或IL-23活性的方法，该方法包 括对个体施用本发明的抗体或抗体部分，使得患者体内IL-12和/或 IL-23活性被减小。优选地，IL-12是人IL-12，IL-23是人IL-23，并 且个体是人个体。或者，可以是可以表达本发明抗体能够结合的IL-12 和/或IL-23的哺乳动物。还有，个体还可以是已经导入了IL-12和/或 IL-23的哺乳动物(例如通过施用IL-12和/或IL-23或者通过IL-12和/ 或IL-23转基因的表达)。为了治疗目的，可以对人个体施用本发明的 抗体。此外，为了兽医的目的或者作为人疾病的动物模型，可对表达 其中抗体能结合的IL-12和/或IL-23的非人哺乳动物施用本发明的抗 体。关于后一种情况，这样的动物模型对于评价本发明的抗体的治疗 效力是有用的(例如剂量试验和给药持续时间)。
如本文使用的术语“其中IL-12和/或IL-23活性是有害的病症” 意在包括其中已经确诊患有疾病的患者体内存在IL-12和/或IL-23是 或者怀疑是疾病病理原因或者使疾病恶化原因的因素的疾病或其他病 症。因此，其中IL-12和/或IL-23活性是有害的疾病是其中预期IL-12 和/或IL-23活性的减小能够减轻疾病的症状和/或进展的疾病。患有疾 病的个体的生物液体中IL-12和/或IL-23浓度的增加可以证实这种疾 病(例如个体的血清、血浆、滑液等中IL-18浓度的增加)，利用例如 上述抗-IL-12p40抗体能检测。能使用本发明抗体治疗的病症的非限制 性实例包括下面涉及本发明抗体的药物组合物的章节中讨论的那些病 症。
D.药物组合物
本发明还提供了含有本发明的抗体或其抗原-结合部分和可药用载 体的药物组合物。包含本发明抗体的药物组合物可用于但不限于预 防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状和/或研究。在具体的 实施方案中，组合物包含一种或多种本发明抗体，在另一个实施方案 中，药物组合物包含一种或多种本发明抗体与一种或多种用于治疗其 中IL-12和/或IL-23活性是有害的病症的除本发明抗体之外的预防剂 或治疗剂。优选已知用于或者已经用于或目前用于预防、治疗、控制 或改善病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂。根据这些实施方 案，组合物还可以包含载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的抗体和抗体部分能被掺入适合对个体给药的药物组合物 中。典型地，药物组合物含有本发明的抗体或抗体部分和可药用载体。 本文使用的“可药用载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介 质、抗细菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延迟剂等。可药用载体的实 例包括下面的一种或多种:水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘 油、乙醇等，以及他们的组合。很多情况下，组合物中优选含有等张 剂，例如糖，多元醇，例如甘露糖醇，山梨醇或氯化钠。可药用载体 还包括少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液，他们 提高抗体或抗体部分的贮存期或有效性。
各种递送系统是已知的，并且可用于施用一种或多种本发明抗体 或者一种或多种本发明抗体与用于预防、控制、治疗或改善病症或一 种或多种其症状的预防剂或治疗剂的组合，例如包封在脂质体、位颗 粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞中，受体介导的胞 吞作用(参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))， 构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的部分等。施用本发明预防剂或 治疗剂的方法包括但不限于胃肠外给药(例如皮内、肌内、腹膜内、静 脉内和皮下)，硬膜外给药，肿瘤内给药，和粘膜给药(例如鼻内和口 服途径)。此外，可以采用肺给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，和 使用气雾剂的制剂。参见例如U.S.专利6,019,968、5,985,320、 5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078； 和PCT公开WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346 和WO 99/66903，每一专利全文引入本文以供参考。在一个实施方案 中，本发明的抗体、组合治疗或本发明组合物使用Alkermes AIR(R) 经肺给药技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)来施用。在一个具 体实施方案中，本发明的预防剂或治疗剂是肌内给药、静脉内给药、 肿瘤内给药、口服给药、鼻内给药、经肺给药或皮下给药。预防剂或 治疗剂可以通过任何适宜的途径给药，例如通过输注或快速浓注，通 过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和场粘膜等)，并且 可以与其他生物活性剂一起给药。给药可以是全身或局部给药。
在一个具体实施方案中，可能希望把本发明的预防剂或治疗剂局 部施用到需要治疗的区域；这可通过例如但不限于局部输注、注射或 通过植入物来实现，所述植入物是多孔或非孔材料，包括膜和基质， 例如sialastic膜、聚合物、纤维基质(例如)，或胶原基质。在 一个实施方案中，把有效量的一种或多种本发明抗体拮抗剂局部施用 给个体以预防、治疗、控制和/或改善症状或其症状。在另一个实施方 案中，将有效量的一种或多种本发明抗体与除本发明抗体之外的一种 或多种治疗剂(例如一种或多种预防剂或治疗剂)联合局部施用到个体 的患病区域，以预防、治疗、控制和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中，可以将预防剂或治疗剂在控释或持续释放 系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵来递送控制或持续释放(参 见Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20； Buchwald等人，1980，Surgery 88:507；Saudek等人，1989，N.Engl. J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料来实现本 发明治疗剂的控制或持续释放(参见例如Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton， FIa.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61； 还参见Levy等人，1985，Science 228:190；During等人，1989，Ann. Neurol.25:351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71:105)；U.S. 专利5,679,377；U.S.专利5,916,597；U.S.专利5,912,015；U.S.专利 5,989,463；U.S.专利5,128,326；PCT公开WO 99/15154；和PCT公开 WO 99/20253。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(丙 烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共聚- 乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯 吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚 (丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在优选的实施方案中，在 持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的，不含渗漏的杂质，能够稳定 储存，无菌的，并且是生物可降解的。在另一个实施方案中，可以将 控制或持续释放系统置于预防剂或治疗剂邻近处，由此仅需要一部分 全身剂量(参见例如Goodson，Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。
控释系统由Langer做了综述性讨论(1990，Science 249:1527- 1533)。本领域技术人员已知的任何技术可用于制备包含一种或多种本 发明治疗剂的持续释放制剂。参见例如U.S.专利4,526,938，PCT公开 WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning等人，1996，“Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，”Radiotherapy & Oncology 39:179-189，Song 等人，1995，“Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397，Cleek等人，1997，“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application，”Pro.Intl.Symp.Control. ReI.Bioact.Mater.24:853-854，and Lam等人，1997， “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，”Proc.Int′l.Symp.Control ReI.Bioact.Mater.24: 759-760，每一文献全文引入本文以供参考。
在一个具体的实施方案中，其中本发明组合物是编码预防剂或治 疗剂的核酸，通过构建其作为合适的核酸表达载体的一部分，所述核 酸可以体内给药以促进其所编码的预防剂或治疗剂的表达，并且将其 给药，这样其变成细胞内，例如通过使用逆转录病毒载体(参见U.S.专 利4,980,286)，或者通过直接注射，或者通过使用微颗粒轰击(例如基 因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被， 或者通过将其与已知能进入细胞核的同种盒型肽连接来给药(参见例如 Joliot等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)。或者， 可以将核酸引入到细胞内，并且掺入宿主细胞DNA内以通过同种重 组来进行表达。
本发明的药物制剂可以配制成与预期的给药途径相容。给药途径 的实例包括但不限于胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服、鼻内(例 如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜和直肠给药。在具体实施方案中， 组合物是依据常规方法，作为适于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内 或局部给药的药物组合物对人给药。用于静脉内给药的组合物通常是 在无菌等渗水缓冲液中的溶液。当需要时，组合物还可以包含助溶剂 和局麻剂例如lignocamne来减轻注射位点的疼痛。
如果本发明组合物是局部给药，可以将组合物配制成膏剂、霜剂、 透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、香波、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂或本 领域技术人员众所周知的其他形式。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，19th ed.，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。对于非喷雾局 部剂型，通常采用包含一种或多种与局部应用相容并且其动力学粘度 优选大于水的赋形剂的粘稠至半固体或固体剂型。合适的制剂包括但 不限于溶液、悬浮液、乳剂、霜剂、膏剂、粉剂、搽剂、油膏剂等， 如果需要的话，将其灭菌或者与辅助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、 缓冲剂或盐)混合以影响各种性质例如渗透压。其他合适的局部剂型包 括可喷雾的气雾剂，其中优选与固体或液体惰性载体组合的活性组分 被包装在具有加压挥发性物质(例如气态推进剂如氟利昂)的混合物中 或挤瓶中。如果需要的话，润湿剂或湿润剂也可以加到药物组合物和 剂型中。这样的另外的组分的实例是本领域众所周知的。
如果本发明方法包括施用组合物，组合物可以配制成气雾剂、喷 雾剂、雾剂或滴剂形式。特别是，依据本发明使用的预防剂或治疗剂 可以以气雾剂形式从加压包装或喷雾器中递送，其中使用了合适的推 进剂(例如二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气 体)。对于加压气雾剂，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。 用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(由例如明胶组成)可以配制成含有 化合物与合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
如果本发明方法包括口服给药，组合物可以配制成用于口服给予 的片剂、胶囊、扁囊剂、凝胶盖剂、溶液剂、悬浮液等。片剂或胶囊 可以通过常规方法用下列物质制得:可药用赋形剂例如粘合剂(例如预 凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例 如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或 二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如 十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法包衣。用于口 服给药的液体制剂可以呈但不限于溶液、糖浆剂或悬浮剂的形式，或 者他们可以作为用于在使用之前用水或其他合适的赋形剂配制的无水 产品的形式。这样的液体制剂可以通过常规方法用以下物质制得:可 药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用 脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如杏仁油、油性 酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟 基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可以按照需要含有缓冲盐、矫味剂、 着色剂和甜味剂。用于口服给药的制剂可以适当地配制成用于缓慢释 放、控制释放或持续释放预防剂或治疗剂的形式。
本发明方法可包括经肺给药，例如使用吸入器或喷雾器，采用气 雾剂配制成的组合物。参见例如U.S.专利6,019,968、5,985,320、 5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078； 以及PCT公开WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346 和WO 99/66903，每一专利都全文引入本文以供参考。在具体的实施 方案中，本发明抗体、联合治疗和/或本发明组合物使用Alkermes AIR(R) 经肺给药技术(Alkermes，Inc.，Camb ridge，Mass.)来给药。
本发明方法可包括给予配制成用于通过注射(例如通过快速浓注 或连续输注)来胃肠外给药的组合物。注射用制剂可以在具有加入的 防腐剂的单位剂型中给药(例如在安瓿或多剂量容器)。组合物可以呈 在油性或水性载体内的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有辅 助剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性组分可以呈在使用 之前用合适的载体(例如无菌不含热原的水)配制的粉末形式。本发明 方法还可以包括给予配制成贮库制剂的组合物。这样的长效制剂可以 通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来给予。因此，例如，组 合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如在可接受油中的乳液)或离子 交换树脂配制，或者配制成难溶性衍生物(例如作为难溶性盐)。
本发明方法包括给予配制成中性或盐形式的组合物。可药用盐包 括用阴离子例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子 形成的盐，以及用阳离子例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异 丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成 的盐。
组合物的组分一般是单独提供或者在单位剂型中混合在一起，例 如作为干燥冻干粉或不含水的浓缩物而包装在指定活性剂量的密封容 器例如安瓿或药囊中。当给药方式是输注时，组合物可以用含有无菌 药用级水或盐水的输液瓶配送。当给药模式是通过注射来进行时，可 以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，这样可以在给药之前将组分混 合。
特别是，本发明还提供了，将一种或多种本发明预防剂或治疗剂 或药物组合物包装在指定活性剂量的密封容器例如安瓿或药囊中。在 一个实施方案中，一种或多种本发明预防剂或治疗剂或药物组合物是 作为干燥冻干粉或不含水的浓缩物在密封容器中提供，并且可以重新 配制成(例如用水或盐水)用于施用给个体的浓缩物。优选地，一种或 多种本发明预防剂或治疗剂或药物组合物是作为干燥无菌冻干粉在密 封容器中以下列单位剂量提供:至少5mg，更优选至少10mg，至少 15mg，至少25mg，至少35mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg 或至少100mg。冻干的本发明预防剂或治疗剂或药物组合物应当在 2℃-8℃贮存在其初始容器中，并且本发明预防剂或治疗剂或药物组 合物应当在配制后1周内，优选5天内，72小时内，48小时内，48 小时内，24小时内，12小时内，6小时内，5小时内，5小时内，3 小时内或1小时内施用。在另一个实施方案中，一种或多种本发明预 防剂或治疗剂或药物组合物以液体形式在指明活性剂浓度的密封容器 中提供。优选地，液体形式的组合物在密封容器中以下列浓度提供: 至少0.25mg/ml，更优选至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml， 至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/kg，至少25 mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml或至少100mg/ml。液体形式 应当在2℃-8℃贮存在其初始容器中。
本发明抗体和抗体部分可以掺入到适于胃肠外给药的药物组合物 中。优选地，把抗体或抗体部分制成含有0.1-250mg/ml抗体的注射 液。注射液可以由液体或冻干剂型在火石瓶或琥珀瓶、安瓿瓶或预填 充的注射器组成。缓冲剂可以是L-组氨酸(1-50mM)，任选5-10mM， pH 5.0-7.0(任选pH 6.0)。其他合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、 柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可以用氯化钠来改变0-300mM(对于液 体剂型最佳150mM)浓度的溶液的毒性。冻干剂型可以含有抗冻剂型， 主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的抗冻剂包括海藻糖和 乳糖。冻干剂型可以含有膨胀剂，主要是1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。 液体和冻干剂型可以含有稳定剂，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最佳 5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以含有0-0.05％ 吐温-80(最佳0.005-0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于吐温20 和BRIJ表面活性剂。制成胃肠外给药用注射液的包含本发明抗体和 抗体部分的药物组合物还可以包含佐剂，例如用于提高吸收的物质或 治疗蛋白(例如抗体)的分散剂。特别有用的佐剂是透明质酸酶例如 (重组人透明质酸酶)。在注射液中加入透明质酸酶改善了胃 肠外给药，特别是皮下给药之后人生物利用度。其还容许较大位点体 积(即大于1ml)，具有较小头疼和不适，以及注射位点反应的的最小 发生率(参见WO2004078140，US2006104968，其引入本文以供参考)。
本发明的组合物可以是各种各样的剂型。这些包括例如液体、半 固体和固体剂型，例如液体溶液(例如注射液和输注液)，分散剂或悬 浮剂，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选剂型取决于想要的给 药方式和治疗应用。典型优选组合物是注射液或灌注液，例如与用其 他抗体对人被动免疫使用的那些相似的组合物。优选的给药方式是胃 肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选的实施方案中，通 过静脉内输注或注射施用抗体。在另一个优选的实施方案中，通过肌 内或皮下注射施用抗体。
治疗性组合物一般必须是灭菌的并且在制备和贮存条件下是稳定 的。组合物可以配制成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或者适合高药 物浓度的其他有序结构。通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)与 上面例举的成分的一种或组合一起掺入需要量的合适的溶剂，如果需 要，接着无菌过滤，能制备灭菌注射液。一般情况下，通过将活性成 分掺入到含有基本分散基质和上面例举的那些的其他成分的无菌赋形 剂中来制备分散剂。在无菌情况下，无菌注射液制剂的冻干粉末剂， 制剂的优选方法是真空干燥和喷雾干燥，得到活性成分加预先灭菌过 滤的溶液的任何附加期望的成分的粉末剂。例如，通过使用包衣例如 卵磷脂，通过在分散剂情况下保持要求的粒度和通过使用表面活性 剂，能保持溶液的合适的流动性。通过组合物中含有延迟吸收的物质， 例如一硬脂酸盐和明胶，能使可注射组合物延续吸收。
通过本领域公知的各种方法能施用本发明的抗体和抗体-部分，但 是对于很多治疗性应用，优选的给药途径/方式是皮下注射，静脉内注 射或输液。如本领域技术人员明白的，给药途径/方式根据预期结果而 不同。在一些实施方案中，使用保护化合物抗快速释放的载体可以制 备活性化合物制剂，例如控制释放制剂，包括植入物，透皮贴，和微 胶囊送药系统。可以使用可生物降解生物匹配聚合物，例如乙烯醋酸 乙烯酯、聚酐类、聚乙二醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这样的制 剂的很多制备方法申请了专利或者一般为本领域技术人员公知的。参 见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson，编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如和惰性稀 释剂或可同化可食用载体一起口服给药。化合物(如果期望和其他成 分)还可以在硬或软外壳明胶胶囊中封闭，压制成片，或者直接掺到 个体的食物中。对于口服治疗给药，化合物可以与赋形剂混合并且以 摄食片剂，口腔片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮剂，糖浆，糯米纸囊 剂等剂型使用。对于通过肠胃外给药之外的本发明化合物的施用，必 需用防止它失活的材料将化合物包衣，或者与化合物共同给药。
还可以向组合物中掺入补充活性化合物。在一些实施方案中，本 发明的抗体或抗体部分与用于治疗其中IL-12活性是有害的疾病的一 种或几种另外的治疗药物共同配制和/或共同给药。例如，本发明的抗 -hIL-12抗体或抗体部分可以与结合其他靶物的一种或几种另外的抗体 (例如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/或共 同给药。此外，本发明的一种或几种抗体可以与上述治疗药物的一种 或几种联合使用。这样的联合治疗可以有利地使用较低剂量的施用的 治疗药物，从而避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。
在一些实施方案中，抗IL-12抗体或者其片段与本领域公知的半 存留期伸长赋形剂连接。这样的赋形剂包括但不限于Fc结构域、聚 乙二醇和葡聚糖。这样的赋形剂描述于，例如美国申请顺序号No. 09/428,082和公开的PCT申请No.WO 99/25044中，他们为了任何目 的在此引作参考。
在一个具体实施方案中，施用包含编码本发明抗体或另一种本发 明预防剂或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列来通过基因治疗以治疗、 预防、控制或改善病症或一种或多种其症状。基因治疗是指通过给予 个体表达或可表达的核酸来进行的治疗。在本发明的实施方案中，核 酸产生介导预防或治疗作用的其编码的本发明抗体或预防剂或治疗 剂。
根据本发明可以使用可在本领域中使用的任何基因治疗方法。关 于基因治疗方法的一般综述，请参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu，1991，Biotherapy 3:87-95； Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan， Science 260:926-932(1993)；和Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev. Biochem.62:191-217；May，1993，TIBTECH 11(5):155-215。可以 使用的本领域通常已知的重组DNA技术方法描述于Ausubel等人 (eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY (1993)；and Rriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。US20050042664 A1中公开了 各种基因治疗方法的详细描述，其引入本文以供参考。
白介素12在与涉及免疫与炎性成分的各种疾病的病理中起关键 作用。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年慢性 关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节 炎、脊椎关节病、全身红斑狼疮、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎 性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变态反应疾病、牛 皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排异、与器官移植相 关的急性或慢性免疫疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、传播性血管内 凝血、Kawasaki′s病、Grave′s病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、 Wegener′s肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾微小性血管炎、慢 性活性肝炎、眼色素层炎、脓毒性休克、中毒休克综合征、脓毒症综 合征、恶病质、传染病、由寄生虫引起的疾病、获得性免疫缺陷综合 征、急性横向骨髓炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、早老性痴呆、中风、 原发胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、 Addison′s病、散发性I型多腺缺乏和II型多腺缺乏、Schmidt′s综合 征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、血清反应阴性关 节病、关节病、Reiter′s病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠关节病、肠 病性滑膜炎、衣原体、鼠疫和沙门氏菌相关关节病、脊椎关节病、动 脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫大疱病、寻常性 天疱疮、落叶性天疱疮、类天疱疮、线性IgA病、自身免疫性溶血性 贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性性恶性贫血、少年恶性贫血、 肌痛性大脑炎/Royal Free病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞关节炎、 原发性硬化性肝炎、起因不明自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综 合征、获得性免疫缺陷相关疾病、乙肝、丙肝、普通各式各样的免疫 缺陷(普通各式各样的血丙种球蛋白减少症)、膨胀心肌病、女性不孕 症、卵巢衰竭、早产卵巢衰竭、纤维变性肺病、起因不明的纤维组织 形成牙槽炎、炎后间质性肺病、间质性肺炎、与间质性肺病相关的结 缔组织疾病、与肺病相关的混合结缔组织疾病、与间质性肺病相关的 全身硬化、与间质性肺病相关的类风湿性关节炎、与肺病相关的全身 红斑狼疮、与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎、与肺病相关的Sjogren′s 病、与肺病相关的僵硬脊椎炎、结节性血管炎弥散肺病、与肺病相关 的含铁血黄素沉着病、药物引起的间质性肺病、纤维化、辐射纤维化、 闭塞性毛细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞浸润性肺病、传染 病后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1-型自身免疫性 肝炎(典型自身免疫性或狼疮样肝炎)、2-型自身免疫性肝炎(抗-LKM 抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色棘皮症的B型胰岛素 抗性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官 移植相关的慢性免疫疾病、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、1型牛 皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫中性白细胞减少、 肾病NOS、肾小球肾炎、肾微小性血管炎、莱姆病、盘形红斑狼疮、 特发性男性不孕症或NOS、精液自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、 交感神经眼炎、结缔组织疾病继发性高血压、Goodpasture′s综合征、 结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿性发烧、类风湿性脊椎炎、Still′s 病、全身硬化、Sjogren′s综合征、Takayasu′s病/动脉炎、自身免疫性 血小板减少、特发性血小板减少、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能 亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺机能减退(Hashimoto′s病)、萎缩 性自身免疫性甲状腺机能减退、原发性粘液水肿、晶状体原性眼色素 层炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、 酒精引起的肝损伤、choleosatatis、特应性肝病、药物引起的肝炎、非 酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B族链球菌(GBS)感染、精神 病(例如抑郁症和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病，急性和 慢性疼痛(不同形式的疼痛)和癌症，例如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱 癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌，以及造血恶性肿 瘤(白血病和淋巴瘤)，无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或 感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓 性白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾衰竭、 腺癌、空异位搏动、AIDS痴呆综合征、酒精诱导的肝炎、过敏性结 膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、同种移植物排斥、α-1-抗胰 蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角质细胞变性、 抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗-受体过敏反应、主动脉和周围动脉瘤、 主动脉切开、动脉高血压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤 维性颤动(持续或阵发性的)、心房扑动、房室阻滞、B细胞淋巴瘤、 骨移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt′s淋巴瘤、 烧伤、心脏心律不齐、心脏震颤综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺旁 路炎症反应、软骨移植排斥、脑皮层变性、混乱或多灶性心房性心博 过速、与化疗有关的病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中 毒、慢性炎性病变、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病 (COPD)、慢性水杨酸中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、 接触性皮炎、肺原性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、 培养阴性脓毒症、囊性纤维化、与细胞因子治疗有关的病症、拳击手 痴呆、脱髓鞘性疾病、登革热、出血热、皮炎、皮肤病症、糖尿病、 糖尿病症、糖尿病性动脉粥样疾病、弥散性雷维小体病、扩张性充血 性心肌病、基底神经节病症、中年Down′s综合征、阻断CNS多巴胺 的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、 内分泌病、会厌炎、爱-巴病毒感染、红斑性肢痛症、锥体束外和脑病 症、家族性噬红细胞细胞淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、 Friedreich′s共济失调、功能性周围动脉病症、真菌脓毒症、气性坏疽、 胃溃疡、肾小球性肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性 脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、由于细胞内生物体导致的肉芽肿、毛细 胞白血病、Hallerrorden-Spatz疾病、桥本氏甲状腺炎、枯草热、心脏 移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血尿毒症综合征/溶血栓血小 板生成紫癜、出血、肝炎(A)、希斯束心律失常、EQV感染/HIV神经 病、Hodgkin′s病、运动机能亢进病症、过敏反应、过敏性肺炎、高血 压、运动机能减退病症、海马-垂体-肾上腺轴评估、特发性Addison′s 病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、衰弱、婴儿脊髓肌肉萎 缩、主动脉炎症、流感、离子辐射暴露、虹膜睫状体炎/眼色素层炎/ 视神经炎、缺血-再灌注损伤、缺血性中风、幼年类风湿性关节炎、幼 年脊髓肌肉萎缩、Kaposi′s肉瘤、肾移植排斥、军团菌病、利什曼病、 麻风病、皮质脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝脏移植排斥、淋巴水肿、 疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、软膜蛛网膜 炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、 混合型结缔组织疾病、单克隆γ-球蛋白病、多骨髓瘤、多系统变性 (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、 细胞内鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、脊髓发育不良综合征、心急梗塞、 心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变 性疾病、神经原性I型肌肉萎缩、粒细胞缺乏性发热、非何杰氏淋巴 瘤、腹部主动脉及其分枝闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/ 附睾炎、睾丸炎/输精管切除述逆向操作、器官巨大症、骨质疏松、胰 腺移植排斥、胰腺癌、肾瘤形成综合征/恶性高钙血症、甲状旁腺移植 排斥、骨盆炎症疾病、常年性鼻炎、心包病、周围动脉粥样硬化疾病、 周围血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫肺炎、肺炎、POEMS 综合征(多精神病、器官巨大症、内分泌病、单克隆γ-球蛋白病和皮肤 改变综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心脏切开术后综合征、 子痫前期、进行性核上性麻痹、原发性肺动脉高血压、放疗、Raynaud′s 现象和疾病、Raynoud′s病、Refsum′s病、规律性窄QRS心搏过速、 肾血管高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年舞 蹈病、雷维小体型老年痴呆、血清反应阴性关节病、休克、镰状细胞 性贫血、皮肤同种移植物排斥、皮肤改变综合征、小肠移植排斥、实 体瘤、特异性心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌 炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、昏厥、心血管系统梅毒、 全身性过敏反应、全身性炎性反应综合征、全身性发作型幼年类风湿 性关节炎、T-细胞或FAB ALL、毛细管扩张、闭塞性血栓血管炎、血 小板减少症、中毒、移植、创伤/出血、III型过敏反应、IV型过敏反 应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒症、荨麻疹、瓣性心脏病、静脉 曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和 真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、与病毒有关的噬血细胞综合征、 Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson′s病、任何器官或组织的异种移植 排斥(参见Peritt等人PCT公开WO2002097048A2，Leonard等人，PCT 公开WO9524918 A1和Salfeld等人，PCT公开WO00/56772A1)。
本发明的抗体好抗体部分可用于治疗患有下列病症的人:自身免 疫性疾病，特别是与炎症有关的那些，包括类风湿性脊椎炎、变态反 应、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎。优选地，本发明的 抗体或其抗原-结合部分被用来治疗类风湿性关节炎、局限性回肠炎、 多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病和牛皮癣。
本发明的抗体或抗体部分还可以与用于治疗自身免疫性和炎症疾 病的一种或多种治疗剂一起给药。
本发明的抗体或者其抗原-结合部分可以单独使用或联合治疗这样 的疾病。应该明白本发明的抗体或者其抗原-结合部分可以单独使用或 与附加的药物例如治疗性药物联合，所述附加的药物由技术人员为了 想要的目的来选择。例如，附加的药物可以是本领域认为用于本发明 的抗体治疗的疾病或病症的治疗药物。附加药物也可以是对治疗组合 物有有益贡献的药物，例如影响组合物粘度的药物。
还应该明白本发明所包括的联合是用于他们想要的目的的那些组 合。下面列出的药物是为了详细说明的目的而不是为了限制。作为本 发明一部分的组合是本发明的抗体和至少一种选自下面列出的附加药 物。组合还可以包括一种以上的附加药物，例如两种或三种附加药物， 如果如此组合，则形成的组合物能实现它想要的功能。
本文描述的结合蛋白可以与另外的治疗剂例如疾病调节性抗风湿 药物(DMARD)或非甾类抗炎药物(NSAID)或甾类药物或其组合联合使 用。DMARD的优选实例是羟氯喹、来氟洛米、甲氨蝶呤、胃肠外用 金、口服金、柳氮磺胺吡啶。还称为NSAIDS的非甾类抗炎药物的优 选实例包括药物例如布洛芬。其他优选的组合是皮质类固醇，包括氢 化泼尼松；当与本发明的抗-IL-12抗体联合治疗患者时，通过减小甾 类剂量能减小甚至消除使用甾类的公知的副作用。本发明的抗体或抗 体部分可以与之联合使用的用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性 实例包括下列:细胞因子抑制抗炎药物(CSAID)；其他人细胞因子或 生长因子的抗体或拮抗剂，例如TNF、LT、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-I、IL-S、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干扰 素、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合 部分能与细胞表面分子的抗体联合使用，细胞表面分子是例如CD2、 CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80 (B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA或他们的配体，包括CD154(gp39 或CD40L)。
在自身免疫和接着的炎症级联中不同点，治疗剂优选的联合可能 干涉；优选的例子包括TNF拮抗剂，例如可溶性p55或p75 TNF受 体，其衍生物，(p75TNFRIgG(EnbrelTM)或p55TNFRIgG(Lenercept)， 嵌合、人源化或人TNF抗体或其片段，包括英夫单抗( Johnson and Johnson；描述于U.S.专利5,656,272，该专利引入本文以 供参考)，CDP571(一种人源化单克隆抗-TNF-α IgG4抗体)，CDP 870 (一种人源化单克隆抗-TNF-α抗体片段)，抗-TNF dAb(Peptech)，CNTO 148(golimumab；Medarex and Centocor，参见WO 02/12502)，好 adalimumab( Abbott Laboratories，一种人抗-TNF mAb，作为 D2E7描述在US 6,090,382中)。可用于本发明的TNF抗体描述在U.S. 专利6,593,458；6,498,237；6,451,983；和6,448,380中，其分别引入 本文以供参考。其他组合包括TNFα转化酶(TACE)抑制剂；出于相同 原因，IL-1抑制剂(白介素-1-转化酶抑制剂，1L-1RA等)可以是有效 的。其他优选组合包括白介素11。还有另一个优选组合是自身免疫应 答的其他关键起作用者，其作用平行于，依赖于或与IL-12功能一致； 特别优选的是IL-18拮抗剂包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体，或 IL-18结合蛋白。已经证明IL-12和IL-18重叠但是功能不同，两者的 拮抗剂的联合可能最有效。还有另一个优选的联合是非耗尽抗-CD4 抑制剂。还有其他优选的联合包括共同刺激途径CD80(B7.1)或CD86 (B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗剂配体。
本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下面的药物联合，例如 甲氨喋呤、6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉秦、 氯化喹啉/羟氯喹、pencillamine、金硫丁二钠(肌内和口服)、硫唑嘌呤、 cochicine、皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)、β-2腺受体激动剂(沙 丁胺醇、特布他林、沙美特洛)、黄嘌呤(茶叶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、 萘多罗米、酮替芬、阿托品和溴乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉 素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs、例如、布洛芬皮质类固醇，例 如、氢化泼尼松、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、 补体抑制剂，肾上腺素能剂、干扰通过促炎症细胞因子例如TNFα或 IL-1传导信号的药物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制 剂)、IL-1β转化酶抑制剂、TNFα转化酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号 传导抑制剂，例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、 硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张肽转化酶抑制剂、可溶性细胞因子 受体和其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物 p75TNFRIgG(EnbrelTM H p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL- 1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和 TGFβ)、塞来昔布、叶酸、羟氯喹硫酸盐、罗非克西、etanercept、英 夫单抗、萘普生、valdecoxib、柳氮磺胺吡啶、甲泼尼龙、美洛昔康、 甲泼尼龙乙酸盐、金硫丁二钠、阿司匹林、去炎松，待所利德、丙氧 芬，二硫硫胺/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、二氯酚酸钠、吡罗昔康、 依托度酸、双氯芬酸钠、噁丙嗪、氧可酮盐酸盐、氢可酮二酒石酸盐/ 扑热息痛、双氯芬酸钠/米索普特、芬太尼、anakinra、人重组体、曲 马朵盐酸盐、双水杨酯、舒林酸、维生素B12/脂肪酸/维生素B6、扑 热息痛、阿仑特罗钠、氢化泼尼松、硫酸吗啡、利多卡因盐酸盐、消 炎痛、硫酸葡萄糖胺/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸氧可酮 /扑热息痛、盐酸奥洛他定、米索普特、萘普生钠、奥美拉唑、环磷酰 胺、利妥希玛、IL-1TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗-IL-18、 抗-IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、 Roflumilast、IC-485、CDC-801和甲基氢化泼尼松。优选的联合包括 甲氨喋呤或来氟洛米，在中等或严重类风湿性关节炎情况下、环孢菌 素。
可以与IL-12或IL-23抗体或其抗原结合部分联合使用来治疗类 风湿性关节炎的非限制性另外的药物包括但不限于下列:非甾类抗炎 药物(NSAIDs)；细胞因子抑制性抗炎药物(CSADDs)；CDP-571/BAY- 10-3356(人源化抗-TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫单抗(嵌合 型抗-TNFα抗体；Centocor)；75 kdTNFR-IgG/etanercept(75kD TNF 受体-IgG融合蛋白；Immunex；参见例如Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37，S295；/.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)；55kdTNF-IgG(55 kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LαRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(非耗尽性灵长化抗-CD4抗体；IDEC/SmithKline；参见例如 Arthritis & Rheumatism(1995)Vol.38，S185)；DAB486-IL-2和/或DAB 389-1L-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如Arthritis & Rheumatism (1993)Vol.36，1223)；抗-Tac(人源化抗-IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；EL-4(抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；出租IL-10，抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；EL-IO 和/或IL-4激动剂(例如激动剂抗体)；IL-IRA(IL-I受体拮抗剂； Synergen/Amgen)；anakinra(/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性 TNF结合蛋白；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9 (增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995) Vol.268，pp.37-42)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如 Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S282)；MK-966 (COX-2 Inhibitor；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No. 9(增刊)，S81)；Iloprost(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol. 39，No.9(增刊)，S82)；甲胺蝶呤；沙利度胺(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S282)和沙利度胺相关药物(例 如Celgen)；lefiunomide(抗炎和细胞因子抑制剂；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S131；Inflammation Research (1996)Vol.45，pp.103-107)；氨甲环酸(纤溶酶原激活抑制剂；参见例 如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S284)；T-614(细 胞因子抑制剂；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9 (增刊)，S282)；前列腺素E1(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol. 39，No.9(增刊)，S282)；Tenidap(非甾类抗炎药物；参见例如Arthritis &Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S280)；萘普生(非甾类 抗炎药物；参见例如Neuro Report(1996)Vol.7，pp.1209-1213)；美 洛昔康(非甾类抗炎药物)；布洛芬(非甾类抗炎药物)；吡罗昔康(非甾 类抗炎药物)；双氯芬酸(非甾类抗炎药物)；消炎痛(非甾类抗炎药物)； 柳氮磺胺吡啶(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9 (增刊)，S281)；硫唑嘌呤(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol. 39，No.9(增刊)，S281)；ICE抑制剂(白介素-1β转化酶抑制剂)；zap- 70和/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或1ck的抑制剂)；VEGF抑制 剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长 因子受体的抑制剂；血管生成抑制剂)；皮质类固醇类抗炎药物(例如 SB203580)；TNF-转化酶抑制剂；抗-IL-12抗体；抗-IL-18抗体；白 介素-11(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增 刊)，S296)；白介素-13(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol. 39，No.9(增刊)，S308)；白介素-17抑制剂(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹； 苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋巴放射；抗-胸腺细 胞球蛋白；抗-CD4抗体；CD5-毒素；口服给药的肽和胶原；羟苯基 氯氨茴酸二钠；细胞因子调控剂(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-I反义硫代磷酸酯低聚-脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP1O；T Cell Sciences，Inc.)；强的松；奥古蛋白；多磷酸糖胺聚糖；米诺环素；抗 -IL2R抗体；海洋和植物脂质(鱼类和植物种子脂肪酸；参见例如DeLuca 等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21:759-777)；金诺芬；保泰 松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；zileuton；azaribine； 霉酚酸(RS-61443)；tacrolimus(FK-506)；sirolimus(雷帕霉素)； amiprilose(therafectin)；cladribine(2-氯脱氧腺苷)；甲氨蝶呤；抗病毒 剂；和免疫调节剂。
在一个实施方案中，将本发明的IL-12抗体或其抗原结合部分与 用于治疗类风湿性关节炎的一种或多种下列药物联合给药:KDR的小 分子抑制剂(ABT-123)，Tie-2的小分子抑制剂；甲氨喋呤；强的松； 塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；罗非克西；etanercept；英夫单抗；来 氟洛米；萘普生；valdecoxib；柳氮磺胺吡啶；甲基氢化泼尼松；布洛 芬；美洛昔康；醋酸甲基氢化泼尼松；金硫丁二钠；阿司匹林；硫唑 嘌呤；曲安奈德；萘磺酸丙氧芬/apap；叶酸盐；萘丁美酮；二氯酚酸 钠；吡咯昔康；乙哚酸；二氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可待酮；重 酒石酸二氢可待因酮/apap；二氯酚酸钠/米索普特；芬太尼；人重组 anakinra；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；维生素B12/fa/维生素B6； 对乙酰氨基酚；阿仑膦酸钠；泼尼松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因； 吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶； 盐酸羟可待酮对乙酰氨基酚；盐酸奥洛他定；米索普特；萘普生钠； 奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希玛；IL-I TRAP；MRA； CTLA4-IG；IL-18 BP；ABT-874；ABT-325(抗-IL18)；抗-IL 15； BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；Roflumilast； IC-485；CDC-801；和mesopram。在另一个实施方案中，将IL-12或 IL-23抗体或其抗原结合部分与用于治疗类风湿性关节炎的一种或多 种上述药物联合给药来治疗IL-12或IL-23相关病症。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合一起治疗炎性肠病的治疗药 物的非限制性例子包括下列:budenoside；表皮生长因子；皮质类固 醇药物；环孢菌素；柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫 唑嘌呤；甲硝哒唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮； 抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β单克隆抗体； 抗-IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶-咪唑化合 物；其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如TNF、LT、IL-1、 IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、 FGF和PDGF。本发明的抗体或者其抗原结合部分能与细胞表面分子 的抗体联合，例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、 CD40、CD45、CD69、CD90或者他们的配体。本发明的抗体或者其 抗原结合部分还可以与药物联合，例如与甲氨喋呤，环孢菌素，FK506， 雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAID例如布洛芬，皮质类固醇， 例如氢化泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体 抑制剂，肾上腺素能剂，干扰促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导 信号的药物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β 转化酶抑制剂，TNFα转化酶抑制剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如 激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基 嘌呤，血管紧张肽转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物(例 如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)，抗炎细 胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11，IL-13和TGFβ)。
本发明的抗体或抗原结合部分能与之联合一起治疗局限性回肠炎 的治疗药物的优选例子包括下面的:TNF拮抗剂例如抗-TNF抗体， D2E7(PCT公开WO97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFR IgG(ENBREL)和p55TNFRIgG (LENERCEPT))抑制剂和PDE4抑制剂。本发明的抗体，或其抗原结 合部分能与皮质类固醇联合，例如budenoside和地塞米松。本发明的 抗体，或其抗原结合部分还可以与药物例如柳氮磺胺吡啶，5-氨基水 杨酸和奥沙拉嗪，和干扰炎性细胞因子例如IL-1的合成或作用的药 物，例如IL-1β转化酶抑制剂和IL-1ra联合。本发明的抗体，或其抗 原结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂使用，例如，酪氨酸激酶 抑制剂6-巯基嘌呤。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与IL-11联 合。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与下面的药物联合:美沙拉 嗪，泼尼松，硫唑嘌呤，巯基嘌呤，英夫单抗，甲泼尼龙，琥珀酸钠， 地芬诺酯/硫酸阿托品，盐酸洛派丁胺，甲氨喋呤，奥美拉唑，叶酸盐， 环丙沙星/葡萄糖-水，重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛，盐酸四环素， 氟轻松醋酸酯，甲硝哒唑，硫贡撒/硼酸，消胆胺/蔗糖，盐酸环丙沙 星，硫酸天仙子胺，盐酸杜冷丁，盐酸咪达唑仑，盐酸氧可酮/扑热息 痛，盐酸异丙嗪，磷酸钠，新诺明/甲氧苄定，塞来昔布，聚丙烯酸树 脂，萘磺酸丙氧芬，氢化可的松，多种维他命，巴柳氮二钠，磷酸可 卡因/扑热息痛，colesevelam盐酸盐，维生素B12，叶酸，左氟沙星， 甲泼尼龙，natalizumab和干扰素-γ。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗多发性硬化的治疗药物 的非限制性例子包括下面的:皮质类固醇；氢化泼尼松；甲泼尼龙； 硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨喋呤；4-氨基吡啶；替扎尼定； 干扰素-β1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON； Chiron/Berlex)；干扰素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-α (Alfa Wassermann/J&J)，干扰素-β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)， Peginterferon α2b(Enzon/Schering-Plough)，共聚物1(Cop-1；格拉太咪 尔；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压纯氧；静脉内免疫球 蛋白；克拉利平；其他人细胞因子或生长因子和他们的受体的抗体或 拮抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-23，IL-15， IL-16，IL-18，EMAP-II，GM-CSF，FGF，和PDGF。本发明的抗体 或者其抗原结合部分能与细胞表面分子的抗体联合，例如CD2，CD3， CD4，CD8，CD19，CD20，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69， CD80，CD86，CD90或者他们的配体。本发明的抗体或者其抗原结合 部分还可以与药物联合，例如与甲氨喋呤，环孢菌素，FK506，雷帕 霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，例如，布洛芬，皮质类固醇， 例如氢化泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体 抑制剂，肾上腺素能剂，干扰促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导 信号的药物(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β 转化酶抑制剂，TACE抑制剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如激酶抑 制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤， 血管紧张肽转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物(例如可溶 性p55或p75TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)，抗炎细胞因子(例 如，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ)。
本发明的抗体或者其抗原结合部分能与之联合治疗多发性硬化的 治疗药物优选例子包括干扰素-β，例如，IFNβ1a和IFNβ1b；格拉太 咪尔，皮质类固醇，胱天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1的抑制剂， IL-1抑制剂，TNF抑制剂，和CD40配体和CD80的抗体。
本发明的抗体或者其抗原结合部分还可以与药物联合，例如 alemtuzumab，四氢大麻酚，Unimed，daclizumab，米托蒽醌，xaliproden hydrochloride，4-氨基吡啶，乙酸格拉太咪尔，natalizumab，sinnabidol， a-immunokine NNSO3，ABR-215062，AnergiX.MS，趋化因子受体拮 抗剂，BBR-2778，calagualine，CPI-1189，LEM(脂质体胶囊米托蒽 醌)，THC.CBD(类大麻素激动剂)MBP-8298，甲基氢化泼尼松(PDE4 抑制剂)，MNA-715，抗-IL-6受体抗体，neurovax，派非尼酮，allotrap 1258(RDP-1258)，sTNF-R1，talampanel，teriflunomide，TGF-β2， tiplimotide，VLA-4拮抗剂(例如，TR-14035，VLA4 Ultrahaler， Antegran-ELAN/Biogen)，γ干扰素拮抗剂，IL-4激动剂。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗心绞痛的治疗药物的非 限制性例子包括下面的:阿司匹林，硝酸甘油，单硝酸异山梨酯，琥 珀酸美托洛尔，阿替洛尔，酒石酸美托洛尔，阿罗地平磺酸盐，硫 氮鎓酮盐酸盐，硝酸异山梨酯，氯吡格雷硫酸氢盐，心痛定，阿托伐 他汀钙，氯化钾，呋塞米，辛伐他汀，盐酸维拉帕米，地高辛，盐 酸心得安，卡维地洛，萘诺普利，螺内酯，二氢氯噻，依那普利马 来酸盐，纳多洛尔，雷米普利，依诺肝素钠，肝素钠，缬沙坦，盐 酸甲磺胺心定，降脂异丙酯，ezetimibe，布美他尼，氯沙坦钾，萘诺 普利/二氢氯噻，非洛地平，卡托普利，比索洛尔富马酸盐。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗关节强硬脊椎炎的治疗 药物的非限制性例子包括下面的:布洛芬，二氯酚酸钠和米索普特， 萘普生，美洛昔康，消炎痛，二氯酚酸钠，塞来昔布，罗非克西，柳 氮磺胺吡啶，甲氨喋呤，硫唑嘌呤，米诺环素，泼尼松，etanercept， 英夫单抗。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗哮喘的治疗药物的非限 制性例子包括下面的:沙丁胺醇，沙美特罗/氟地松，孟鲁司特钠， 氟地松丙酸盐，步地奈德，泼尼松，沙美特罗xinafoate，levalbuterol 盐酸盐，硫酸沙丁胺醇/异丙托品，泼尼松龙磷酸钠，曲安柰德，倍氯 米松二丙酸盐，溴化异丙托品，阿奇霉素，乙酸吡布特罗，氢化泼尼 松，无水茶叶碱，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，克拉霉素，扎鲁司特，福莫 特罗富马酸盐，流感病毒疫苗，甲泼尼龙，阿莫西林三水合物，氟尼 缩松，变应性变态反应注射液，色氨酸钠，盐酸甲美芳铵，氟尼缩松/ 薄荷醇，阿莫西林/克拉维酸钾，左氟沙星，吸入器辅助装置，愈创甘 油醚，地塞米松钠磷酸盐，莫西沙星盐酸盐，盐酸多西环素，愈创甘 油醚/d-消旋啡烷，p-麻黄素/cod/扑尔敏，加替沙星，西替利嗪盐酸盐， 糠酸毛他松，沙美特罗xinafoate，退嗽，头孢氨苄，pe/氢可酮/扑尔 敏，西替利嗪盐酸盐/伪麻黄碱，苯福林/cod/异丙嗪，可卡因/异丙嗪， 头孢罗齐，地塞米松，愈创甘油醚/假麻黄碱，扑尔敏/氢可酮，奈多 罗米钠，硫酸特布他林，肾上腺素，甲泼尼龙，硫酸奥西那林。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗COPD的治疗药物的非 限制性例子包括下面的:硫酸沙丁胺醇/异丙托品，溴化异丙托品，沙 美特罗/氟地松，沙丁胺醇，沙美特罗xinafoate，倍氯米松二丙酸盐， 泼尼松，无水茶叶碱，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，孟鲁司特钠，布地奈 德，福莫特罗富马酸盐，曲安柰德，左氟沙星，愈创甘油醚，阿奇 霉素，倍氯美松二丙酸盐，levalbuterol盐酸盐，氟尼缩松，头孢曲 松钠，阿莫西林三水合物，加替沙星，扎鲁司特，阿莫西林/克拉维酸 钾，氟尼缩松/薄荷醇，扑尔敏/氢可酮，硫酸奥西那林，甲泼尼龙， 糠酸毛他松，对黄麻碱/cod/扑尔敏，乙酸吡布特罗，对黄麻碱/氯 雷他定，硫酸特布他林，tiotropium bromide，(R，R)-福莫特罗，TgAAT， Cilomilast，Roflumilast。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗HCV的治疗药物的非 限制性例子包括下面的:干扰素-α-2a，干扰素-α-2b，干扰素-α-con1， 干扰素-α-n1，PEG化干扰素-α-2a，PEG化干扰素-α-2b，利巴韦林，PEG 化干扰素-α-2b+利巴韦林，熊去氧胆酸，甘草酸，胸腺法新， Maxamine，VX-497和用下面的靶物干扰用来治疗HCV的任何化合 物:HCV聚合酶，HCV蛋白酶，HCV螺旋酶，HCV IRES(内部核糖 体进入位点)。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗特发性肺纤维化的治疗 药物的非限制性例子包括下面的:泼尼松，硫唑嘌呤，沙丁胺醇，秋 水仙碱，硫酸沙丁胺醇，地高辛，γ干扰素，甲泼尼龙钠琥珀酸盐， 劳拉西泮，呋塞米，赖诺普利，硝酸甘油，螺内酯，环磷酰胺，异丙 托品，放线菌素d，阿替普酶，丙酸氟地松，左氟沙星，硫酸奥西那 林，硫酸吗啡，盐酸羟可待酮，氯化钾，曲安奈德，无水他克莫司， 钙，干扰素-α，甲氨喋呤，霉酚酸酯，干扰素-γ-1β。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗心肌梗塞的治疗药物的 非限制性例子包括下面的:阿司匹林，硝酸甘油，酒石酸美托洛尔， 依诺肝素钠，肝素钠，氯吡格雷二硫酸盐，卡维地洛，阿替洛尔，硫 酸吗啡，琥珀酸美托洛尔，法华林钠，赖诺普利，单硝酸异山梨酯， 地高辛，呋塞米，辛伐他汀，雷米普利，替尼普酶，马来酸依那普利， torsemide，瑞替普酶，氯沙坦钾，盐酸喹那普利，碳酸镁，布美他尼， 阿替普酶，依那普利拉，胺碘酮盐酸盐，盐酸替罗非班一水合物，盐 酸地尔硫，卡托普利，依贝沙坦，缬沙坦，盐酸普萘洛尔，福辛普 利钠，盐酸利多卡因，表非替得，头孢唑啉钠，硫酸阿托品，亮氨酸， 螺内酯，干扰素，盐酸索他洛尔，氯化钾，琥珀辛酯钠，盐酸多巴酚 丁胺，阿普唑仑，普伐他汀钠，阿托伐他汀钙，盐酸咪达唑仑，盐 酸度冷丁，硝酸异山梨酯，肾上腺素，盐酸多巴胺，比伐卢定， rosuvastatin，ezetimibe/辛伐他汀，avasimibe，cariporide。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗牛皮癣的治疗药物的非 限制性例子包括下面的:KDR的小分子抑制剂(ABT-123)，Tie-2的小 分子抑制剂，钙泊三烯，丙酸氯倍他索，曲安奈德，halobetasol丙酸 盐，他佐罗汀，甲氨喋呤，氟轻松醋酸酯，增长的倍他米松，氟轻松， 阿维A，焦油香波，缬草酸倍他米松，糠酸毛他松，酮康唑，普拉莫 星/氟轻松，缬草酸氢化可的松，氟氢缩松，脲，倍他米松，丙酸氯倍 他索/伊莫，氟地松丙酸盐，阿奇霉素，氢化可的松，加湿配方，叶 酸，地奈德，pimecrolimus，煤焦油，二乙酸二氟拉松，etanercept folate， 乳酸，甲氧沙林，hc/bismuthsubgal/znox/resor，乙酸甲泼尼龙，强的 松，防晒剂，哈西奈德，水杨酸，蒽林，新戊酸氯可托龙，煤提取物， 煤焦油/水杨酸，煤焦油/水杨酸/硫，去羟米松，安定，润滑药，氟轻 松醋酸酯/润滑药，矿物油/蓖麻油/na lact，矿物油/花生油，石油/十四 酸异丙酯，补骨脂素，水杨酸，皂/三溴沙仑，硫贡撒/硼酸，塞来昔 布，英夫单抗，环孢菌素，alefacept，efalizumab，tacrolimus， pimecrolimus，PUVA，UVB，柳氮磺胺吡啶。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗牛皮癣关节炎的治疗药 物的非限制性例子包括下面的:甲氨喋呤，etanercept，罗非克西，塞 来昔布，叶酸，柳氮磺胺吡啶，萘普生，来氟洛米，乙酸甲泼尼龙， 消炎痛，硫酸羟氯喹，强的松，舒林酸，渐增的二丙酸倍他米松，英 夫单抗，甲氨喋呤，叶酸盐，曲安奈德，二氯酚酸钠，二甲基亚砜， 吡罗昔康，双氯芬酸钠，酮洛芬，美洛昔康，甲泼尼龙，萘普酮，托 美丁钠，钙泊三烯，环孢菌素，双氯芬酸钠/米索普特，氟轻松醋酸酯， 硫酸葡萄糖胺，硫羟苹果酸金钠，氢可酮酒石酸氢酯/扑热息痛，布洛 芬，利塞膦酸钠，磺胺嘧啶，硫鸟嘌呤，valdecoxib，alefacept， efalizumab。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗再狭窄的治疗药物的非 限制性例子包括下面的:西罗莫司，紫杉醇，everolimus，tacrolimus， ABT-578，扑热息痛。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗坐骨神经痛的治疗药物 的非限制性例子包括下面的:氢可酮酒石酸氢酯/扑热息痛，罗非克西， 盐酸环苯扎林，甲泼尼龙，萘普生，布洛芬，盐酸氧可酮/扑热息痛， 塞来昔布，valdecoxib，乙酸甲泼尼龙，强的松，磷酸可卡因/扑热息 痛，盐酸曲马朵/扑热息痛，美他沙酮，美洛昔康，美索巴莫，盐酸利 多卡因，双氯芬酸钠，加巴喷丁，地塞米松，卡立普多，酮洛酸，氨 丁三醇，消炎痛，扑热息痛，安定，萘普酮，盐酸氧可酮，替扎尼定 盐酸盐，双氯芬酸钠/米索普特，丙氧芬二硫硫胺/扑热息痛，阿司匹 林/oxycod/羟可待酮ter，布洛芬/少量氢可酮，盐酸曲马朵，乙哚乙酸， 盐酸丙氧芬，盐酸阿米替林，肌安宁/磷酸可卡因/阿司匹林，硫酸吗 啡，多种维他命，萘普生钠，邻甲苯海拉明柠檬酸盐，替马西泮。
本发明的抗体或抗原结合部分能与之联合治疗SLE(狼疮)的治疗 药物的优选例子包括下面的:NSAIDS，例如，双氯芬酸，萘普生， 布洛芬，吡罗昔康，消炎痛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布，罗非 克西，valdecoxib；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松， 氢化泼尼松，budenoside，地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤， 环磷酰胺，霉酚酸酯，甲氨喋呤；PDE4的抑制剂或嘌呤合成抑制剂， 例如麦考酚酸吗啉乙酯。本发明的抗体或抗原结合部分还可以与下 面的药物联合，例如柳氮磺胺吡啶，5-氨基水杨酸，奥沙拉嗪，硫唑 嘌呤，和干扰促炎性细胞因子例如IL-1的合成，制备或作用的药物， 例如胱天蛋白酶抑制剂，象IL-1β转化酶抑制剂和IL-1ra联合。本 发明的抗体，或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂使用， 例如，酪氨酸激酶抑制剂；或瞄向T细胞激活分子的分子，例如， CTLA-4-IgG或抗-B7家族抗体，抗-PD-1家族抗体。本发明的抗体或 抗原结合部分还可以与IL-11或抗-细胞因子抗体联合，例如， fonotolizumab(抗-IFNg抗体)，或抗-受体受体抗体，例如，抗-IL-6 受体抗体和抗B-细胞表面分子抗体。本发明的抗体或抗原结合部分还 可以与下面的药物联合使用:LJP 394(abetimus)，减少或灭活B-细胞 的药物，例如，利妥希玛(抗-CD20抗体)，lymphostat-B(抗-BlyS抗 体)，TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，D2E7(PCT公开WO 97/29131； HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体， (p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))。
本发明的药物组合物可以含有“治疗有效量”或“预防有效量” 本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量的”指实现期望的治疗结果 的必需的剂量和给药时间的有效量。本发明的抗体或抗体部分的治疗 有效量可以由本领域技术人员确定并且根据个体因素例如疾病状态， 年龄，性别和体重，以及抗体或抗体部分激发个体期望的响应的能力 而不同。治疗有效量也是其中治疗有益作用比抗体或抗体部分的毒性 或有害作用更重要的量。＂预防有效量＂指实现期望的预防结果的必需 的剂量和给药时间的有效量。典型地，在疾病之前或早期使用预防剂 量，预防有效量比治疗有效量小。
调节给药方案提供最佳期望响应(例如治疗或预防响应)。例如， 可以施用一次快速浓注，也可以在一定时间施用几次分开的剂量，或 者根据治疗状况紧急情形显示的，可以相应减小或增加剂量。以易于 给药和剂量均匀性的单位剂型配制肠胃外用组合物是特别有利的。本 文使用的单位剂型指适合作为要治疗的哺乳动物个体的单一剂量的物 理分散的单位；各个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的 活性化合物和必需的药物载体。根据(a)活性化合物的独特特征和要实 现的特定的治疗或预防效果，和(b)化合物领域固有的限制如活性化合 物对于个体治疗灵敏性，指示本发明的单位剂型的说明，并且该说明 直接根据(a)和(b)。
作为例子，本发明的抗体或抗体部分治疗或预防有效量的非限制 范围是0.1-20毫克/千克，更优选1-10毫克/千克。注意，剂量值 可以随着要减轻的症状的类型和严重程度而变化。要进一步明白，对 于任何特定个体，应该根据个体需要和实施或监督组合物的给与的人 的专业判断，随时间调节具体给药方案，这里给出的剂量范围只是例 举而不是为了限制要求的组合物的范围或实施。
对于本领域技术人员显而易见的是这里描述的本发明的其他合适 的修饰和改变是显而易见的，并且不脱离本发明的范围或这里公开的 实施方案使用合适的等同物可以进行。在详细描述本发明的基础上， 参照下面的实施例，更清楚地理解，实施例只是为了详细说明的目的 而不是要限制本发明的范围。
实施例
实施例1:产生和分离抗人IL-12单克隆抗体
实施例1.1:鉴定抗人IL-12抗体的测定
在实施例1中，除非另有说明，利用下面的试验鉴定和表征抗人 IL-12抗体。
实施例1.1.A:ELISA
如下所述进行用于筛选结合人IL-12抗体的酶联免疫吸附测定。
实施例1.1.A.1:检测抗人IL-12抗体与IL-12p70结合的ELISA
将ELISA平板(Corning Costar，Acton，MA)用50μL/孔的5μg/ml 特异性山羊抗-小鼠IgG Fc(Pierce#31170，Rockford，IL.)在磷酸盐缓 冲盐水(PBS)中的混合物于4℃包被过夜。把平板用含有0.05％ Tween- 20的PBS洗涤一次。通过加入在PBS中稀释至2％的200μL/孔阻断 溶液(BioRad#170-6404，Hercules，CA.)来阻断平板，在室温阻断1 小时。阻断之后，把平板用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤一次。
将50微升/孔的在含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St. Louis，MO.)的PBS中稀释的小鼠血清或杂交瘤上清液加到如上所述 准备的ELISA平板中，并且在室温培养1小时。把孔用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤3次。将50微升在含有0.1％ BSA的PBS中稀 释的生物素化的重组纯化的人IL-12 p70加到每个孔中，并且在室温 培养1小时。将平板用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤3次。将链 霉抗生物素蛋白HRP(Pierce#21126，Rockland，IL.)在含有0.1％BSA 的PBS中稀释稀释1:20000倍；加入50μL/孔，将平板在室温培养 1小时。将平板用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤3次。向每个孔中 加入50微升TMB溶液(Sigma#T0440，St.Louis，MO.)，并且在室 温培养10分钟。通过加入1N硫酸来停止反应。把平板在450nm波 长进行分光光度计读数。
实施例1.1.A.2:评估IL-12p70或IL-12p40竞争抗人IL-12抗体与IL-12 p70结合的能力的ELISA
将ELISA平板(Corning Costar，Acton，MA)用50μL/孔的5μg/ml 特异性山羊抗-小鼠IgG Fc(Pierce#31170，Rockford，IL)在磷酸盐缓 冲盐水(PBS)中的混合物于4℃包被过夜。把平板用含有0.05％Tween- 20的PBS洗涤一次。通过加入PBS+10％乳粉来阻断平板，在室温 阻断1小时。阻断之后，把平板用PBS+0.05％Tween-20洗涤3次。
实施例1.1.A2(a):IL-12p70竞争ELISA方案
根据预期的抗体滴度，将小鼠血清或杂交瘤上清液在含有0.1％ BSA(Sigma，St.Louis，MO.)的PBS中稀释。在含有0.1％BSA的PBS 中，把生物素化的重组纯化的人IL-12 p70制成三倍浓缩(3×)的 0.1μg/ml贮备液。在含有0.1％BSA的PBS中，把重组纯化的人IL-12 p70制成具有0.1-10μg/ml的不同浓度。将等体积的(75μL)每一下列 溶液混合:稀释的小鼠血清或杂交瘤上清液、生物素化的重组纯化的 人IL-12 p70和重组纯化的人IL-12 p70。将50微升该混合物加到如上 所述包被的ELISA平板中，并且在室温培养1小时。将孔用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤3次。将链霉抗生物素蛋白HRP(Pierce#21126， Rockland，IL.)在含有0.1％BSA的PBS中进行1:20000稀释；加入 50μL/孔，并且将平板在室温培养1小时。将平板用含有0.05％Tween-20 的PBS洗涤3次。向每个孔中加入50微升TMB溶液(Sigma#T0440， St.Louis，MO.)，并且在室温培养10分钟。通过加入1N硫酸来停止 反应。把平板在450nm波长进行分光光度计读数。
实施例1.1.A2(b):IL-12p40竞争ELISA方案
根据预期的抗体滴度，将小鼠血清或杂交瘤上清液在含有0.1％ BSA(Sigma，St.Louis，MO.)的PBS中稀释。在含有0.1％BSA的PBS 中，把生物素化的重组纯化的人IL-12 p70制成三倍浓缩(3×)的 0.1μg/ml贮备液。在含有0.1％BSA的PBS中，把重组纯化的人IL-12 p40制成具有0.1-10μg/ml的不同浓度。将等体积的(75μL)每一下列 溶液混合:稀释的小鼠血清或杂交瘤上清液、生物素化的重组纯化的 人IL-12 p70和重组纯化的人IL-12 p40。将50微升该混合物加到如上 所述包被的ELISA平板中，并且在室温培养1小时。将孔用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤3次。将链霉抗生物素蛋白HRP(Pierce#21126， Rockland，IL.)在含有0.1％ BSA的PBS中进行1:20000稀释；加入 50μL/孔，并且将平板在室温培养1小时。将平板用含有0.05％Tween-20 的PBS洗涤3次。向每个孔中加入50微升TMB溶液(Sigma#T0440， St.Louis，MO.)，并且在室温培养10分钟。通过加入1N硫酸来停止 反应。把平板在450nm波长进行分光光度计读数。
实施例1.1.B:使用BIACORE技术测定亲合力
BIACORE分析(Biacore，Inc，Piscataway，NJ)测定抗体亲合力， 结合速率、解离速率常数的动力学常数。在25℃，使用 3000 装置( AB，Uppsala，Sweden)，通过基于表面等离子共振的 测量方法测定抗体与重组纯化的人IL-12 p70或重组纯化的人IL-12 p40的结合，使用HBS-EP(10mM HEPES[pH7.4]，150mM NaCl，3mM EDTA，和0.005％表面活性剂P20)。所有化学试剂从 AB (Uppsala，Sweden)或者从本文所述其他不同来源获得。所有标准胺偶 联试剂盒，根据生产商的说明和操作指示，将在10mM乙酸钠(pH4.5) 中稀释的大约5000 RU山羊抗-小鼠IgG，(Fcγ)，对多克隆抗体有特异 性的片段(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)以25μg/ml直接固 定在CM5研究级生物传感器芯片上。将生物传感器表面上未反应的 部分用乙醇胺阻断。使用在流动池2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖作 为反应表面。流动池1和3中不具有山羊抗-小鼠IgG的未修饰的羧甲 基葡聚糖用作参照表面。对于动力学分析，使用Biaevaluation 4.0.1软 件将得自1:1 Langmuir结合模型的速率等式同时拟合到所有8次注 射的结合与解离相上(使用球形拟合分析)。将纯化的抗体在HEPES-缓 冲盐水中稀释以捕获山羊抗-小鼠IgG特异性反应表面。将欲作为配体 被捕获的(25μg/ml)小鼠抗体以5μl/分钟的流速注射到反应基质上。 在25μl/分钟的连续流速下测定结合与解离速率常数，Kon(单位M-1s-1) 和Koff(单位s-1)。通过在10-200nM的10个不同抗原浓度做动力学结 合测定来得到速率常数。通过以下公式由动力学速率常数计算出小鼠 抗体与重组纯化的人IL-12 p70或重组纯化的人IL-12 p40之间的反应 的平衡离解常数(单位M):KD＝Koff/Kon。记录结合与时间之间的关系， 并且计算动力学速率常数。在该测定中，可以测定快达106M-1s-1的结 合速率(on-rate)和慢达10-6s-1的解离速率(off-rate)。
实施例1.1.C:抗人IL-12抗体的功能活性
为了测定本发明抗-人IL-12抗体的功能活性，在测定抗体抑制 IL-12活性的能力的下列测定中使用抗体。
实施例1.1.C1:制备人PHA-激活的成淋巴细胞
按照Current Protocols in Immunology，Unit 7.1中描述的方法，通 过在1500rpm进行Ficoll-Hypaque梯度离心45分钟来从leukopac分 离出人周围血液单核细胞(PBMC)，所述leukopac是从健康供体采集 的。收集在血液水溶液界面以及淋巴细胞分离培养基中的PBMC，并 且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过以1500rpm离心15分钟来洗涤3次以 除去Ficoll-Paque颗粒。
然后按照Current Protocols in Immunology，Unit 6.16中描述的方 法将PBMC活化以形成成淋巴细胞。将洗涤的PBMC以0.5-1×106个 细胞/mL重悬在补充有0.01mg/mL PHA-P(Sigma#L8754，St.Louis， MO)的RPMI完全培养基(RPMI 1640培养基，10％胎牛血清(FBS)，100 U/ml青霉素，100tg/ml链霉素)中，并且在5％CO2气氛下于37℃培 养4天。4天后，把向细胞培养基中再加入1×106个细胞/mL，所述 细胞在含有0.01mg/mL PHA-P和50U/mL重组人IL-2(R&D Systems #202-EL，Minneapolis，MN.)的培养基中。把细胞在37℃培养24小 时，用RPMI完全培养基洗涤，然后在95％ FBS，5％ DMSO中以1 ×107个细胞/mL冷冻。
实施例1.1.C2:PHA成淋巴细胞IFN-γ诱导测定:抑制人IL-12活性
如下所述分析抗-人IL-12抗体抑制人IL-12诱导的PHA成淋巴细 胞产生IFN-γ的能力。在微量滴定板(U-底，96-孔，Costar)中，将不同 浓度的免疫的小鼠血清、鼠杂交瘤上清液或纯化的抗-人IL-12抗体与 400pg/ml重组纯化的人IL-12 p70在100μL RPMI完全培养基中于37 ℃预培养1小时。将如上所述分离的PHA成淋巴细胞洗涤一次，并 且重悬在RPMI完全培养基中至细胞密度为1×107个细胞/ml。将PHA 成淋巴细胞(100μL1×106个细胞/ml)加到抗体与重组纯化的人IL-12 p70混合物(最终的IL-12p70浓度为200pg/ml)中，并且在37℃培养18 小时。培养之后，从各个孔中取出150μL不含细胞的上清液，并且 使用人IFN-γELISA(R&D Systems Cat#DIF50)测定产生的IFN-γ的水 平。
实施例1.1.C3:PHA成淋巴细胞IFN-Y诱导测定:抑制猕猴(cyno)IL-12 活性
如下所述分析抗-人IL-12抗体抑制猕猴IL-12诱导的PHA成淋巴 细胞产生IFN-γ的能力。在微量滴定板(U-底，96-孔，Costar)中，将不 同浓度的免疫的小鼠血清、鼠杂交瘤上清液或纯化的抗-人IL-12抗体 与150pg/ml重组纯化的猕猴IL-12 p70在100μL RPMI完全培养基中 于37℃预培养1小时。将如上所述分离的PHA成淋巴细胞洗涤一次， 并且重悬在RPMI完全培养基中至细胞密度为1×107个细胞/ml。将 PHA成淋巴细胞(100μL 1×106个细胞/ml)加到抗体与重组纯化的猕猴 IL-12 p70混合物(最终的猕猴IL-12 p70浓度为75pg/ml)中，并且在37 ℃培养18小时。培养之后，从各个孔中取出150μL不含细胞的上清 液，并且使用人IFN-γELISA(R&D Systems Cat#DIF50)测定产生的 IFN-γ的水平。
实施例1.2:产生抗人IL-12单克隆抗体
如下所述获得抗人IL-12小鼠单克隆抗体:
实施例1.2A:用人IL-12抗原免疫小鼠
在第1天，将与完全Freund′s佐剂(Rockland Immunochemicals， Gilbertsville，PA)混合的20微克重组纯化的人IL-12 p70皮下注射到5 只6-8周大小的Balb/C和5只AJ小鼠中。在第24、38和49天， 将与Immunoeasy佐剂(Qiagen，Valencia，CA)混合的28微克重组纯 化的人IL-12 p70皮下注射到相同的5只Balb/C和5只AJ小鼠中。 在第84天或第112天或第114天，给小鼠皮下注射10ug重组纯化的 人IL-12 p70或2ug重组纯化的人IL-12 p40(R & D Systems， Minneapolis，MN)。
实施例1.2.B:产生杂交瘤
根据Kohler，G.和Milstein 1975，Nature，256:495中描述的方 法，将得自实施例1.2.A中描述的免疫小鼠的脾细胞与SP2/O-Ag-14 细胞以5:1的比例融合以产生杂交瘤。在96-孔平板中，将融合蛋白 以2.5×106个脾细胞/孔的密度铺在含有氮丝氨酸和次黄嘌呤的选择培 养基中。融合之后7-10天，观测到肉眼可见的杂交瘤集落。通过ELISA 测定每个孔中含有杂交瘤集落的上清液以确定IL-12 p70的抗体的存 在(如实施例1.1.A.1中所述)。然后，通过IL-12 p70或IL-12 p40竞争 ELISA(如实施例1.1.A.2中所述)测试对于与IL-12 p70的结合呈测试 阳性的上清液，以确定他们是否是p40-特异性的。然后在IFN-γ的PHA 成淋巴细胞(如实施例1.1.C中所述)测定表现出IL-12 p40-特异活性的 上清液中和IL-12的能力。
表8:用人IL-12免疫小鼠之后的融合与筛选数据

实施例1.2.C:鉴定和表征抗人IL-12p40单克隆抗体
将根据实施例1.2.B和1.2.C产生的，生成结合IL-12，并且能够 特异性地结合IL-12 p40，以及在PHA成淋巴细胞测定中具有12nM 或小于12nM的IC50值的抗体的杂交瘤扩增，并且通过有限稀释来克 隆。
将杂交瘤细胞接种到含有10％低IgG胎牛血清(Hyclone #SH30151，Logan，UT.)的培养基中。平均收获250mL每一杂交瘤上 清液(得自克隆群体)，浓缩，并且按照Harlow，E.和Lane，D.1988 “Antibodies:A Laboratory Manual”中描述的方法，通过蛋白A亲合色 谱进行纯化。使用实施例1.1.C2和1.1.C3中描述的PHA成淋巴细胞 分析来测定纯化的mAb抑制IL-12活性的能力。表9表明了对于10 种单克隆抗体，得自PHA成淋巴细胞分析的IC50值。
表9:抗IL-12p40鼠单克隆抗体对IL-12的中和
  鼠单克隆 抗体     平均IC50(nM) 人IL-12      平均IC50(nM) 猕猴IL-12    1D4 0.031 0.078 1A6 0.052 0.044 1D8 0.31 1.4 3G7 0.15 0.35 5E8 12 N/D 8E1 0.19 0.18 1H6 0.69 1.6 3A11 3.4 N/D 4B4 0.039 0.028 7G3 0.047 >20
使用实施例1.1.B中描述的表面等离子共振测定单克隆 抗体与重组纯化的人IL-12 p70的结合亲合力。表10表明了上面描述 的10种单克隆抗体对于人IL-12 p70的亲合力。
表10:抗IL-12p40鼠单克隆抗体对于IL-12 p70的亲合力
  名称 kon(1/M·s) koff(1/s) KD(nM) 1D4 2.5 x 105 2.9 x 10-5 0.12 1A6 1.5 x 105 3.5 x 10-5 0.23 1D8 5.1 x 105 2.3 x 10-5 0.044 3G7 8.2 x 105 3.8 x 10-5 0.047 5E8 5.7 x 105 2.3 x 10-3 4 8E1 6.9 x 105 5.1 x 10-5 0.074 1H6 4.3 x 105 9.9 x 10-5 0.25 3A11 1.5 x 105 1.9 x 10-4 1.2 4B4 1.3 x 105 1.4 x 10-5 0.1 7G3 1.1 x 106 2.8 x 10-4 0.27
实施例1.2.C.1:鼠单克隆抗-人IL-12p40抗体的物种特异性
为了确定上面描述的10种单克隆抗体是否识别IL-12，设定两组 ELISA。首先，通过用5ug/ml重组纯化的小鼠IL-12(Peprotech)直接 包被ELISA平板来设定直接的ELISA。在含有0.1％BSA(Sigma， StLouis，MO)的PBS中制备介于3-200ng/ml的不同浓度的鼠-抗-人 IL-12 p40mAb。将50μl每一抗体稀释液加到包被的ELISA平板中， 并且在室温培养1小时。将孔用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤3 次。将抗-小鼠IgG-HRP抗体(R&D#HAF007，Minneapolis，MN)在含 有0.1％ BSA的PBS中进行1:2000稀释；加入50μL/孔，并且将平 板在室温培养1小时。向每个孔中加入50微升TMB溶液(Sigma# T0440，St.Louis，MO.)，并且在室温培养10分钟。通过加入2N硫 酸来停止反应。把平板在450nm波长进行分光光度计读数。
然后，通过用5ug/ml山羊抗-小鼠IgG，Fc片段特异性抗体(Pierce #31170，Rockland，IL)包被ELISA平板来设定间接的ELISA。在含 有0.1％ BSA的PBS中制备介于0.1-100ng/ml的不同浓度的鼠-抗- 人IL-12 p40mAb；将50μl每一抗体稀释液加到包被的ELISA平板 中，并且在室温培养1小时。将孔用含有0.05％ Tween-20的PBS洗 涤3次。把重组纯化的小鼠IL-12(Preprotech)在含有0.1％BSA的PBS 中以0.2ug/ml稀释；加入50ul/孔，并且将平板在室温培养1小时。 将孔用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤3次。将生物素化的抗-小鼠 IL-12抗体(R&D#BAF419)在含有0.1％BSA的PBS中以0.2ug/ml稀 释；加入50ul/孔，并且将平板在室温培养1小时。将孔用含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤3次。把链霉抗生物素蛋白HRP(Pierce#21126， Rockland，IL.)在含有0.1％BSA的PBS中进行1:20000稀释；加入 50μL/孔，并且将平板在室温培养1小时。将孔用含有0.05％ Tween-20 的PBS洗涤3次。向每个孔中加入50微升TMB溶液，并且在室温培 养10分钟。通过加入2N硫酸来停止反应。把平板在450nm波长进 行分光光度计读数。Results from the direct and indirect得自用这10种 单克隆抗体进行的直接和间接ELISA的结果如表11所示。
表11:抗IL-12鼠单克隆抗体与小鼠IL-12p40的结合
  名称 直接ELISA          mAb与mu IL-12的结合 间接ELISA          mAb与mu IL-12的结合 1D4 否 N/D 1A6 否 N/D 1D8 否 否 3G7 否 否 5E8 否 否 8E1 否 否 1H6 否 否 2A11 否 否 4B4 否 N/D 7G3 否 N/D
实施例1.2.D:测定每一鼠抗-人IL-12 p40mAb的可变区的氨基酸序 列
对于每一氨基酸序列测定，通过离心分离出大约10×106个杂交 瘤细胞，并且使用Trizol(Gibco BRL/Invitrogen，Carlsbad，CA.)按照 生产商的说明进行加工以分离出全部RNA。使用Superscript First- Strand Synthesis System(hivitrogen，Carlsbad，CA)按照生产商的说明 将全部RNA进行第一链DNA合成。使用Oligo(dT)来引导第一链合 成以选择poly(A)+RNA。然后使用设计用来扩增鼠免疫球蛋白可变区 的引物(Ig-Primer Sets，Novagen，Madison，WI)通过PCR来扩增第一 链cDNA产物。将PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，切割，纯化，然 后用TOPO Cloning试剂盒亚克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen， Carlsbad，CA)，并且转染到TOP10化学活性的大肠杆菌(Invitrogen， Carlsbad，CA)内。在转化体上进行集落PCR以鉴定含有插入片段的 克隆。使用QIAprep Miniprep kit(Qiagen，Valencia，CA)从含有插入 片段的克隆中分离出质粒DNA。使用M13正向和M13反向引物 (Fermentas Life Sciences，Hanover MD)测定质粒中插入片段的两条链 的序列，以确定可变重链或可变轻链DNA序列。实施例1.2.C中描述 的10种单克隆抗体的可变重链或可变轻链序列描述在表1中。
实施例2:重组抗人IL-12p40抗体
实施例2.1:构建和表达重组嵌合型抗人IL-12p40抗体
通过在细胞中同源重组，将编码鼠抗-人IL-12p40单克隆抗体 3G7、8E1、1A6和1D4的重链恒定区的DNA用编码人IgG1恒定区 的含有2个铰链区氨基酸突变的cDNA片段替换。这些突变是在234 位(EU编号)上的亮氨酸变为丙氨酸和在235位上的上的亮氨酸变为丙 氨酸(Lund等人，1991，J.Immunol.，147:2657)。将每一这些抗体的 轻链恒定区用染κ恒定区替换。将全长嵌合型抗体在COS细胞中瞬时 表达，这是通过将嵌合重链和轻链cDNA连接到pBOS表达质粒 (Mizushima and Nagata，Nucleic Acids Research 1990，VoI 18，pg 5322) 内来实现的，所述质粒包含重链信号序列MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO.110)和轻链信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC ((SEQ ID NO.111)。
通过Protein A Sepharose色谱纯化含有重组嵌合型抗体的上清 液，并且通过加入酸缓冲液来洗脱结合的抗体。将抗体中和并且透析 到PBS内。
将编码嵌合3G7的重链cDNA(如上所述)与1D4嵌合轻链cDNA (都连接到pBOS载体内)共转染到COS细胞内。通过Protein A Sepharose 色谱纯化含有重组嵌合型抗体的上清液，并且通过加入酸缓冲液来洗 脱结合的抗体。将抗体中和并且透析到PBS内。
如实施例1.1.C2和1.1.C3所述，通过PHA成淋巴细胞分析来测 定纯化的嵌合型抗-人IL-12单克隆抗体抑制IL-12诱导的IFN-γ生成 的能力。表12显示了5种嵌合型抗体在PHA成淋巴细胞测定中的IC50 值。
表12:抗IL-12嵌合型抗体中和IL-12
  嵌合型抗体名称 平均IC50(nM) 人IL-12      平均IC50(nM) 猕猴IL-12    1D4-Chim 0.021 0.07 1A6-Chim 0.021 0.02 3G7-Chim 0.12 0.32 8E1-Chim 0.17 0.15 3G7/1D4-Chim 0.11 0.29
实施例2.2:构建和表达CDR接枝的抗人IL-12p40抗体
如下所述产生CDR-接枝的抗-人IL-12抗体。
实施例2.2.1:选择人抗体框架
将鼠可变重链和可变轻链基因序列(如表3中所述)单独地对着44 人免疫球蛋白种系可变重链或46种系可变轻链序列(得自NCBI Ig Blast网址，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.)使 用Vector NTI软件进行比对。对于每一重链和轻链序列，选择与初始 鼠序列具有最高总同源性的人可变区序列(以及在已知对于抗原结合很 重要的位置上具有最高同源性)(Welschof，M.和Krauss，J.Methods In Molecular Biology，VoI 207)来提供框架(FW)1、2和3序列以用于CDR- 接枝。鉴定合适的人可变重链和轻链FW4区(还称为“连接”区)是通 过单独将每一鼠重链和轻链FW4区域与NCBI数据库中的6人免疫球 蛋白种系连接重链和5种系连接轻链序列进行比对来完成的。完全CDR 接枝抗体的In silico构建是通过将人可变区CDR序列(来自NCBI网 址)用鼠CDR序列(来自杂交瘤)置换，并且向每一个3’端加上FW4区 (还称为“连接”区)来完成的。
实施例2.2.2:构建CDR-接枝抗体
使用寡核苷酸重新构建所述In silico构建的CDR接枝抗体。对于 每一可变区cDNA，分别涉及6个长度为60-80个核苷酸的寡核苷酸 来在每一寡核苷酸的5′和/或3′末端彼此重叠20个核苷酸。在退火反 应中，将所有6个寡核苷酸合并，煮沸，并且在dNTPs存在下退火。 然后加入DNA聚合酶I，大(Klenow)片段(New England Biolabs #M0210，Beverley，MA.)以填补在重叠寡核苷酸之间大约40bp的缺 口。在改性的pBOS载体(Mizushima，S.and Nagata，S.，(1990)Nucleic acids Research VoI 18，No.17))中使用含有与多克隆位点互补的突出端 序列的两个最外面引物来进行PCR以扩增整个可变区基因。
将得自每个cDNA装配体的PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，并 且切下与所预测的可变区cDNA尺寸一致的条带，纯化。通过在细菌 中同源重组，把该可变区插入到cDNA片段上的框架内，所述cDNA 片段表达人IgG1恒定区，并且含有2个铰链区氨基酸突变(SEQ ID NO.3)。这些突变是在234位(EU编号)上的亮氨酸变为丙氨酸以及235 位上的亮氨酸变为丙氨酸(Lund等人，1991，J.Immunol.，147:2657)。 通过同源重组将该可变轻链区插入到具有人κ恒定区的框架(SEQ ID NO.4)内。分离出细菌集落，并且提取质粒DNA；测定cDNA插入片 段的整个序列。将与每一抗体相对应的正确的CDR-接枝的重链和轻 链共转染到COS细胞内以瞬时生成全长CDR-接枝的抗-人IL-12抗 体。对于1A6，将含有1A6重链接枝的cDNA和1D4轻链接枝的cDNA 的pBOS载体从转染到COS细胞内(当接枝时，1A6轻链序列与1D4 轻链序列相同)。通过Protein A Sepharose色谱纯化含有重组嵌合型抗 体的上清液，并且通过加入酸缓冲液来洗脱结合的抗体。将抗体中和 并且透析到PBS内。表5中描述了9种CDR接枝抗体。
如实施例1.1.C2和1.1.C3所述，通过PHA成淋巴细胞分析来测 定纯化的CDR接枝抗体抑制IL-12活性的能力。使用实施例1.1.B中 描述的表面等离子共振测定纯化的CDR接枝抗体与重组纯 化的人IL-12 p70的结合亲合力。表13显示了表7中描述的9种CDR 接枝抗体在PHA成淋巴细胞测定中的IC50值，以及这9种CDR接枝 抗体对于人IL-12 p70和猕猴人IL-12 p70的亲合力。
表13:抗IL-12p40C DR接枝抗体中和IL-12以及抗IL-12p40 CDR接 枝抗体对于人好猕猴IL-12p70的亲合力
  抗IL-12p40 CDR接枝    抗体             1D4.1       1D4.2       1D4.3       1A6.1       1A6.2 结合速率 (1/M·s) 2.6 x 105 1.6 x 105 2.1 x 105 1.1 x 105 1 x 105 解离速率 (1/s)    2.9 x 10-5 2.610-4 5.3 x 10-5 2.9 x 10-5 5.4 x 10-5 KD(nM) 0.12 1.7 0.25 0.27 0.54 Av.IC50(nM) HuIL-12     0.47 3 0.83 0.48 1.1 Av.IC50(nM) Cyno IL-12   1.5 3 1.6 0.57 0.84
  抗IL-12p40 CDR接枝    抗体             8E1.1       8E1.2       3G7.1       3G7.2       1A6.5       1A6.6 结合速率 (1/M·s) 5.2 x 105 0 4.2 x 105 6.1 x 105 1.3 x 105 1.3 x 105 解离速率 (1/s)    8.7 x 10-4 0 9.1 x 10-5 1.4 x 10-4 5.6 x 10-5 1.0 x 10-4        KD(nM) 1.7 0 0.22 0.23      0.43       0.078 Av.IC50(nM) HuIL-12     2.8 0 0.56 0.24 1.9 0.59 Av.IC50(nM) Cyno IL-12   4.6 0 1.2 0.7 1.1 0.14
实施例2.3:人源化抗人IL-12抗体的构建
如下所述进行抗人IL-12抗体的人源化。
实施例2.3.1:用CDR-接枝抗体进行同源性模型化
使用同源性模型化来鉴定鼠抗体独特的残基，预测这些残基对于 抗体合并位点(CDR)的结构来说是至关重要的。
同源性模型化是计算方法，其中产生蛋白的近似三维坐标。初始 坐标的来源以及对于其进一步精化的指导是第二种蛋白，参照蛋白， 参照蛋白的三维坐标是已知的，并且其序列与第一种蛋白有关。使用 这两种蛋白序列之间的关系来产生参照蛋白与希望获得其坐标的蛋 白，即靶蛋白之间的相应性。将参照蛋白与靶蛋白的一级序列与直接 从参照蛋白移动到靶蛋白中的这两种蛋白的相同部分的坐标进行比 对。将这两种蛋白的错配部分的坐标，例如由于残基突变、插入或删 除而导致的错配部分的坐标从基因结构模板构建，并且进行能量精化 以保证与已经移动的模型坐标相一致。这种计算的蛋白结构可以进一 步精化或者直接用于模型研究。从该描述中应该清楚的是，模型结构 的质量是由参照蛋白与靶蛋白相关的精度以及构建序列比对的精确度 决定的。
对于鼠序列1A6、8E1和1D4，使用BLAST检索与目视检查的组 合来鉴定合适的参照结构。所选择的关于1A6和1D4的参照结构是 PDB登陆1JRH。对于8E1，重链参照结构是PDB登陆1FL3.轻链参 照结构是1MEX。参照氨基酸序列与靶氨基酸序列之间的25％序列同 一性被认为是尝试同源性模型化操作的最低要求。手动构建序列比 对，并且用程序Jackal产生模型坐标(参见Petrey，D.，Xiang，Z.，Tang， C.L.，Xie，L.，Gimpelev，M.，Mitros，T.，Soto，C.S.，Goldsmith-Fischman， S.，Kernytsky，A.，Schlessinger，A.，等人2003.Using multiple structure alignments，fast model building，and energetic analysis in fold recognition and homology modeling.Proteins 53(Suppl.6):430-435)。
所选抗体的鼠和人框架区的一级序列具有显著同一性。不同的残 基位置是鼠残基包括在人源化序列中的候选者，以保留所观测到的鼠 抗体的结合能力。手动构建人与鼠序列之间不同的一览框架序列。
给定框架残基将影响抗体结合性质的可能性取决于其与CDR残 基的近似性。因此，使用模型结构，根据其与CDR中任何原子的距 离，将鼠与人序列之间不同的残基排列。在任何CDR原子的4.5埃内 的残基鉴定为是最重要的，并且推荐作为在人源化抗体中保留鼠残基 的候选者(即回复突变)。
计算机模型测定表明，在抗体1A6.1中，轻链(1D4.1 VKB3)的残 基L1、L2、L36和L67与CDR显著接触，因此这意味着，鼠残基应 当保留在这些位置上。对于1D4.1，重链(1D4.1 VH2-70)的残基H1和 H98以及轻链(1D4.1 VKB3)的L2和L67是作为回复突变位置被鉴定 的。
实施例2.3.2:产生混合抗体
为了确定什么CDR-接枝的链(VH、VL或)可受益于框架回复突 变，通过让CDR-接枝的H或L链与合适的嵌合型鼠H或L链成对， 然后共转染到COS细胞内来构建“混合”抗体。表14表明了混合抗 体1A6.3、1A6.4、1A6.7、1A6.8、1D4.4和1D4.5的VH好VL氨基 酸序列。
表14:混合抗体的氨基酸序列
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 69   (10) (7)  (11)      (9)  VH 1A6.3         (VH2-26/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-26/JH6 FR3)                  (VH2-70/JH6 FR4) EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS       38                      VL 1A6.3          SVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVS NDVAWFQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQ DYNSPWTFGGGTKLEIKR                   37                      VH 1A6.4          QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLS TSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLRIATVDTA DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTSVTVSS 70   (27) (28) (29)      (26) VL 1A6.4     (L2/JK4 FR1) (L2/JK4 FR2) (L2/JK4 FR3)              (B3/JK4 FR4) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPA                                RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                   37                      VH 1A6.7          QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLS TSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLRIATVDTA DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTSVTVSS 68   (23) (24) (25) (26) VL 1A6.7     (B3/JK4 FR1) (B3/JK4 FR2) (B3/JK4 FR3) (B3/JK4 FR4) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR             67  (6) (7) (8)     (9) VH 1A6.8         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3)                  (VH2-70/JH6 FR4) EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS       38                   VL 1A6.8 SVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVS NDVAWFQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPD RFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQ DYNSPWTFGGGTKLEIKR             65  (6) (7) (8)     (9) VH 1D4.4         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3)                  (VH2-70/JH6 FR4) EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS     36                VL 1D4.4                   SVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVS                                NDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPD RFTGSGYGTDFTFIISTVRAEDLAVYFCQQ DYNSPWTFGGGTKLEIKR                   35                      VH 1D4.5          QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLR KSVMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKY                                YNPSLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTA DAATYYCTRRGIRSAMDYWGQGTSVTVSS  62   (23) (24) (25)      (26) VL 1D4.5     (B3/JK4 FR1) (B3/JK4 FR2) (B3/JK4 FR3)              (B3/JK4 FR4) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS                                NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR            
按照纯化的CDR接枝抗体抑制IL-12活性的能力。纯化的CDR 接枝抗体与重组纯化的人IL-12 p70的结合亲合力。表13显示了表7 中描述的9种CDR接枝抗体在PHA成淋巴细胞测定中的IC50值，以 及这9种CDR接枝抗体对于人IL-12 p70和猕猴人IL-12 p70的亲合 力。
通过蛋白A亲合力色谱(实施例12.C)纯化混合抗体，并且如如实 施例1.1.C2和1.1.C3所述，通过PHA成淋巴细胞分析来测定效力。 使用实施例1.1.B中描述的测定动力学。表15表明了混合抗 体的KD和IC50值。将用混合mAb获得的效力和亲合力数据与用合适 的CDR-接枝的mAb(实施例2.3.1)获得的数据进行比较，以确定由于 VH或VL链导致的效力和亲合力改变。使用实施例2.3.1中描述的方 法评估人源化VH或VL链是否是最佳链。在某些情况下，没有在任 何CDR原子的4.5埃内的残基是回复突变的另外的靶目标。
表15:抗-IL-12p40混合抗体的IL-12中和以及抗-IL-12p40混合抗体 的亲合力
  抗体 1D4.4 1D4.5 1A6.3 1A6.4 1A6.7 1A6.8 结合速率 (1/M·s) 2.8 x 105 3 x 105 1.9 x 105 1.1 x 105 ND ND 解离速率          (1/s)    2.1 x 10-5          3.1 x 10-6        2.6 x 10-5          1.1 x 10-4           ND    ND KD(nM) 0.074 0.11 0.14 1.0 ND ND Av.IC50(nM) huIL-12     0.64 0.053 0.068 2.1 0.29 0.08 Av.IC50(nM) cyno IL-12   1.1 0.11 0.049 1.2 0.35 0.06
实施例2.3.3:CDR-接枝抗体中框架回复突变的构建
为了产生人源化抗体，使用诱变引物和QuikChange Multi Site- Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene#200513，La Jolla，CA)按照生 产商的说明将框架回复突变引入到CDR-接枝抗体内。对于每一个 CDR-接枝，构建回复突变的不同组合，以鉴定每一残基的相对重要性。 1A6.1轻链VKB3变体1(L1-D→S，L2-I→V，L36-Y→F，L67-S→Y)， 1D4.1 VKB3变体2(L1-D→S，L36-Y→F，L67-S→Y)，1D4.1 VKB3 变体3(L1-D→S，L67-S→Y)，1D4.1 VKB3变体4(L2-I→V，L67-S→Y) 和1D4.1 VKB3变体5(L67-S→Y)。1D4.1重链VH2-70变体1(H1- E→Q，H93-A→T)和1D4.1VH2-70变体2(H93-A→T)。然后将突变 的单链DNA转化成XLlO-Gold超活性细胞。在转化体上进行集落测 序以鉴定携带所需突变的克隆。使用Qiagen Maxiprep试剂盒(Qiagen， Valencia，CA)从阳性克隆中分离出质粒DNA，并且测定可变区和恒 定区的全长序列。
如上所述，对于CDR接枝抗体构建几种另外的回复突变组合。 按照实施例2.3.4中描述的方法进行如上所述所产生的人源化抗体的 表征。
实施例2.3.4:人源化抗体的表达和表征
将携带含有框架回复突变的重链和轻链的PBOS表达载体(参见实 施例2.1和2.2.2)共转染到COS细胞内以瞬时产生全长人源化抗体。 表16中显示了该人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列。
表16:人源化抗体的序列
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 67  (6) (7) (8)     (9) VH 1A6.9         (VH2-70/JH6 FR1) (VH2-70/JH6 FR2) (VH2-70/JH6 FR3)                  (VH2-70/JH6 FR4) EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTTVTVSS       79                      VL 1A6.9          SVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWFQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                   80                      VH 1D4.6          EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCTRRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS        81                      VL 1D4.6          DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                   82                      VH 1D4.7          EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLR KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCTRRGIRSANDYWGQGTTVTVSS        83                      VL 1D4.7          DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                   84                      VH 1D4.8          EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLR KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCTRRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS        85                      VL 1D4.8          DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR            
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890       86                      VH 1D4.9          EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLR KSVMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKY                                YNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCTRRGIRSAMDYWGQGTTVTVSS        87                      VL 1D4.9          DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVS NDVAWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                   88                      VH 8E1.3          EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMVWVRQAPGKGLEWVASISSGSSNIYY                                ADTVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED TAVYYCARNPYWGQGTTVTVSS               89                      VL 8E1.3          DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TNVAWYQQKPEKAPKSLIYSASHRYSGVPS                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSYPLTFGGGTKVEIKR                   90                      VH 3G7.3          EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKATGYTFN DYWIEWVRQAPGQGLEWMGGFSHGSGSTNY                                NEKFKGRVTMTADSSTNTAYMELRSLRSDD TAVYYCARRRFRGMDYWGQGTTVTVSS          91                      VL 3G7.3          EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVS NDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQ DYSSPWSFGGGTKVEIKR            
CDR-接枝抗体的VH和VL中回复突变的氨基酸位置列在表17 中。
表17:人源化抗体中存在的回复突变的氨基酸
  抗体名称 VH中的突变 VK中的突变 1A6.9             无       L1  D->S L2  I->V L36 Y->F L67 S->Y 1D4.6 H93 A->T L2  I->V L67 S->Y 1D4.7 H30 S->R H93 A->T L2  I->V L67 S->Y 1D4.8 H30 S->R H93 A->T None 1D4.9 H30 S->R H93 A->T L67 S->Y 8E1.3       H3  Q->K  H49 G->A H77 S->T L3  Q->V          3G7.3                   H25 S->T H30 T->N H71 T->A H73 T->S H76 S->N L58 I->V L60 A->D                  
按照实施例1.2.C中描述的方法纯化含有人源化抗体的细胞上清 液。使用实施例1.1.C2和1.1.C3中描述的PHA成淋巴细胞分析来测 定纯化的人源化抗体中和IL-12的能力。使用实施例1.1.B中描述的 BIAcore测定重组纯化的人IL-12 p70的纯化抗体的结合亲合力。表18 显示了PHA成淋巴细胞测定的IC50值，以及得自BIAcore的KD。
表18:抗-IL-12p40人源化抗体的IL-12中和以及抗-IL-12p40人源化 抗体的亲合力
  抗体 1D4.6 1D4.7 1D4.8 1D4.9 1A6.9 8E1.3 3G7.3 结合速率 (1/M·s) 4.8 x 105 >1 x 105 1.2 x 105 5.3 x 105 3.5 x 105 1.3 x 106 7.8 x 105 解离速率 (1/s)    <1 x 10-5 <1 x 10-5 <1 x 10-5 1 x 10-6 <1 x 10-5 1.0 x 10-3 1.5 x 10-4 KD(nM) <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.76 0.2 Av.IC50(nM) huIL-12     0.15 0.014 0.095 0.035 0.15 10 0.42 Av.IC50(nM) cyno IL-12   ND 0.031 ND ND ND ND ND
实施例2.4:产生另外的人源化抗人IL-12抗体
基本上按照Queen，C，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 10029-10033(1989)中描述的方法进行鼠单克隆抗体8E1和1A6的可 变区的人源化。首先鉴定与鼠单克隆抗体VH或VL氨基酸序列具有 高度同源性的人V片段。然后，将互补决定区(CDR)序列与对于保持 CDR结构很重要的框架氨基酸一起接枝到选择的人框架序列内。此 外，将发现在相应的V区稀有的人框架氨基酸用共有氨基酸取代以以 减小可能的免疫原性。如上所述，将所得人源化单克隆抗体在细胞中 表达、纯化和表征。
如下所述产生单克隆抗体8E1.4、8E1.5、8E1.6、1A6.10、1A6.11 和1A6.12。
实施例2.4.1:产生人源化单克隆抗体8E1.4、8E1.5、8E1.6
对于8E1可变区的人源化，基于序列同源性选择用作8E1的CDR 的接受者的人V区框架。首先，借助于计算机程序ABMOD和ENCAD (Levitt，M.，J.MoI.Biol.168:595-620(1983))构建8E1可变区的分 子模型。然后，基于针对人V和J片段序列的同源性检索，选择VH 片段HA3D1(Olee，T.，等人，J.Exp.Med.175:831-842(1992))和J 片段JH4(Ravetch，J.V.，等人，Cell 27:583-591(1981))来提供8E1.4、 8E1.5和8E1.6重链可变区的框架。对于8E1.4、8E1.5和8E1.6轻链可 变区，使用VL片段HK137(Bentley，D.L.，and Rabbitts，T.H.，Cell 32: 181-189(1983))和J片段JK2(Hieter，P.A.，等人，J.Biol.Chem.257: 1516-1522(1982))。8E1 VH与接受者人HA3D1和JH4片段之间的框 架氨基酸的同一性是84％，而8E1 VL与接受者人HK137和JK4片段 之间的同一性是67％。用于产生另外的人源化抗-人IL-12抗体的人抗 体重链和轻链接受者序列列在表19和表20中。
表19:用于另外的人源化抗体的重链接受者序列
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 92 M60/JH4   FR1 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTLYGFSLS 7 M60/JH4   FR2 WIRQPPGKALEWLA   8             M60/JH4   FR3 RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYC                                AR                             93 M60/JH4   FR4 WGQGTLVTVSS 94 HA3D1/JH4 FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 16 HA3D1/JH4 FR2 WVRQAPGKGLEWVS    17               HA3D1/JH4 FR3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC                                AR                             95 HA3D1/JH4 FR4 WGQGTLVTVSS
表20:用于另外的人源化抗体的轻链接受者序列
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890 30 III-3R/JK4 FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 34 III-3R/JK4 FR2 WYQQKPGKAPKLLIY    96                III-3R/JK4 FR3 GVPSRISGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATY                                YC                             26 III-3R/JK4 FR4 FGGGTKVEIKR 30 HK137/JK4  FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 97 HK137/JK4  FR2 WFQQKPGKAPKSLIY    32               HK137/JK4  FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY                                YC                             26 HK137/JK4  FR4 FGGGTKVEIKR
实施例2.4.2:构建8E1.4、8E1.5和8E1.6抗体
按照出版的方法(Rouillard，J.-M.，等人，Nucleic Acids Res.32: W176-W180(2004))使用大约30个长度为约20-40个碱基的重叠合成 寡核苷酸来构建重链和轻链可变区基因。将所述寡核苷酸退火，并且 使用Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis，IN)装配，产生全长产物。使用Expand High Fidelity PCR System通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所得产物。将PCR扩增片段进 行凝胶纯化，用MIuI和Xbal消化，进行凝胶纯化，并且分别亚克隆 到改性形式的pVg1.D.Tt(Cole，M.S.，等人，J.Immunol.159:3613- 3621(1997)；以及参见下文)和pVk(Co，M.S.，等人，J.Immunol.148: 1149-1154(1992))中。
在其中计算机模型表明与CDR显著接触的框架位置，用小鼠V 区的氨基酸替代初始人框架氨基酸。对于8E1.4和8E1.5重链，这是 在残基49上进行的，对于8E1.6重链，这是在残基74上发生的。对 于8E1.5和8E1.6的轻链，替代是在残基46上发生的，对于8E1.5， 还发生在残基60上的替代。将仅在相应的人V区亚组中的他们各自 位置稀有存在的框架残基用这些位置上的人共有氨基酸替代。对于 8E1.5和8E1.6重链，这是在残基78上发生的，对于8E1.5和8E1.6 轻链，这是在残基36上发生的。
使用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene， La Jolla，CA)，按照生产商的说明进行合成V-基因的位置定向诱变。 使用寡核苷酸和本领域众所周知的PCR方法产生8E1.6VH基因的特 异性突变。该PCR步骤是用PfuUltra HF DNA聚合酶(Stratagene)，按 照生产商的说明进行，通过以下流程进行的:在95℃培养30秒，然 后是18个循环的95℃30秒，55℃1分钟以及68℃1分钟，之后在 68℃培养7分钟。用DpnI消化之后，将大肠杆菌株TOP10 Chemically Competent Cells(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)用小部分PCR 产物转化。将序列得以证实的miniprep DNA用MIuI和XbaI消化， 将含有突变的8E1.6 VH基因的所得限制片段亚克隆到下述改性的 pVgl.D.Tt表达载体中。
类似地，使用寡核苷酸和本领域众所周知的PCR方法产生8E1.5 VL基因的特异性突变。如上所述进行PCR步骤，并且随后用MIuI 和XbaI进行消化，将所得限制片段亚克隆到pVk表达载体内。通过 核苷酸测序来证实突变。
设计作为最小外显子的编码人源化VH或VL的基因，包括信号 肽、剪接供体信号和合适的限制酶位点，以用于随后克隆到哺乳动物 表达载体内。VH和VL最小外显子中的剪接供体信号分别来自相应 的人种系JH和JK序列。人源化VH最小外显子中的信号肽序列是 MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO.110)，在人源化VL最小外 显子中是MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO.111)。通过重 叠合成寡核苷酸的装配和本领域众所周知的PCR方法来构建8E1.4、 8E1.5和8E1.6VH和VL基因。
实施例2.4.3:产生人源化单克隆抗体1A6.10、1A6.11和1A6.12
对于1A6.10、1A6.11和1A6.12可变区的人源化，采用本发明中 提供的一般方法。首先，借助于计算机程序ABMOD和ENCAD (Levitt，M.，J.MoI.Biol.168:595-620(1983))构建1A6可变区的分 子模型。然后，基于针对人V和J片段序列的同源性检索，选择VH 片段M60(Schroeder，Jr.，H.W.and Wang，J.Y.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:6146-6150(1990))和J片段JH4(Ravetch，J.V.，等人，Cell 27: 583-591(1981))来提供1A6.10和1A6.12重链可变区的框架。对于 1A6.10、1A6.11和1A6.12轻链可变区，使用VL片段III-3R (Manheimer-Lory，A.，等人，J.Exp.Med.174:1639-1652(1991))和J 片段JK4(Hieter，P.A.，等人，J.Biol.Chem.257:1516-1522(1982))。 1A6VH与接受者人M60和JH4片段之间的框架氨基酸的同一性是 74％，而1A6 VL与接受者人III-3R和JK4片段之间的同一性是71％。 用于产生另外的人源化抗-人IL-12抗体的人抗体重链和轻链接受者序 列列在表19和表20中。所产生的抗体序列描述在实施例2.3.3中。
在其中计算机模型表明与CDR显著接触的框架位置，用小鼠V 区的氨基酸替代初始人框架氨基酸。1A6.10、1A6.11和1A6.12重链， 这是在残基68上发生的。对于轻链，对于1A6.11和1A6.12，替代是 在残基36和67上发生的，对于1A6.12，还发生在残基60上的替代。 将仅在相应的人V区亚组中的他们各自位置稀有存在的框架残基用这 些位置上的人共有氨基酸替代。对于重链，这是在残基10、46、83、 84、86和87上发生的，对于1A6.10、1A6.11和1A6.12的轻链，这 是在残基62上发生的。如上所述使用寡核苷酸和本领域众所周知的 PCR方法进行位置定向诱变。
表21中列出了所产生的另外的人源化抗-IL-12抗体的VH和VL 区的氨基酸序列。
表21:另外的人源化抗体的序列
  SEQ ID  No.          蛋白区域      序列 123456789012345678901234567890    98              VH 1A6.10           EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIWWDGDNY YNPSLKSQLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTLVTVSS       99                        VL 1A6.10           DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVS NDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                     100                         VH 1A6.11           EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSQLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPV DTATYYCARRTRVNYAMDYWGQGTLVTVSS         101                         VL 1A6.11           DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVS NDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPS                                RFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                     102                         VH 1A6.12           EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLS TSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIWWDGDNY                                YNPSLKSQLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPV DTATYYCARRTRVNYANDYWGQGTLVTVSS         103                         VL 1A6.12           DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVS NDVAWFQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPD                                RFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ DYNSPWTFGGGTKVEIKR                     104                       VH 8E1.4          EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMVWVRQAPGKGLEWVASISSGSSNIYY                                ADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARNPYWGQGTLVTVSS                 105                       VL 8E1.4          DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TNVAWYQQKPGKAPKGLIYSASHRYSGVPS                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSYPLTFGGGTKVEIKR                     106                       VH 8E1.5          EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMVWVRQAPGKGLEWVASISSGSSNIYY                                ADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARNPYWGQGTLVTVSS                 107                       VL 8E1.5          DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TNVAWYQQKPGKAPKGLIYSASHRYSGVPD                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSYPLTFGGGTKVEIKR                     108                       VH 8E1.6          EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYGMVWVRQAPGKGLEWVASISSGSSNIYY                                ADTVKGRFTISRDDAKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARNPYWGQGTLVTVSS                 109                       VL 8E1.6          DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVG TNVAWYQQKPGKAPKGLIYSASHRYSGVPS                                RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YNSYPLTFGGGTKVEIKR            
框架中突变的氨基酸位置列在表22中。
表22:人源化抗体中框架突变的位置
  抗体名称 VH中的突变 VK中的突变 1A6.10 H10 A->G H46 A->G H68 R->Q H83 T->K H84 M->L H86 N->S H87M->V L62 I->F L67 S->Y 1A6.11 H10 A->G H46 A->G H68 R->Q H83 T ->K H84 M->L H86 N->S H87 M->V L36 Y->F L62 I->F L67 S->Y 1A6.12 H10 A->G H46 A->G H68 R->Q H83 T->K H84 M->L H86 N->S H87 M->V L36 Y->F L60 S->D L62 I->F L67 S->Y 8E1.4 H49 S->A H78 S->T L36 F->Y L46 S->G 8E1.5 H49 S->A H78 S->T L36 F->Y L46 S->G L60 S->D 8E1.6 H49 S->A H74 N->D H78 S->T L36 F->Y L46 S->G
实施例2.4.4:表达另外的人源化抗体
将表达质粒pVg1.D.Tt中的The allotype of the human gamma人γ-1 恒定区基因的异型从GIm(z，a)修饰为z，non-a异型。使用诱变引物， 通过重叠延伸PCR方法(Higuchi，R.，“PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification”，Stockton Press，New York(1989)， pp.61-70)来产生氨基酸取代D356E和L358M(根据EU index of Kabat 编号，E.A.，等人，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”， 5th ed.，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。PCR步 骤是如上所述用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)进行的。PCR产物用SfiI和EagI消化后，将所得限制片 段亚克隆到改性形式的pVg1.D.Tt表达载体中，所述载体在位于铰链 与CH2外显子之间的内含子中包含NheI限制位点。
通过位置定向诱变还产生γ-1恒定区基因的较低铰链区的突变。 使用诱变寡核苷酸特异性地产生氨基酸取代L234A and L235A(根据 EU index of Kabat编号，E.A.，等人)。PCR步骤是如上所述用 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)进行的。PCR 产物用NheI和EagI消化后，将所得限制片段亚克隆到上述改性形式 的pVg1.D.Tt表达载体中，所述载体含有D356E和L358M突变，以 及在位于铰链与CH2外显子之间的内含子中包含NheI位点。通过核 苷酸测序证实突变。
人源化VH和VL最小外显子的氨基酸序列列在表21中。将所得 V基因片段分别克隆到改性形式的pVg1.D.Tt和pVk中。
于37℃在7.5％CO2培养箱中，将人肾细胞系293T/17(American Type Culture Collection，Manassus，VA)保持在DMEM(BioWhittaker， Walkersville，MD)中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS)(HyClone， Logan，UT)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Invitrogen Corporation)和2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen Corporation)，其在下文中称为293培养基。 为了表达和纯化单克隆抗体，在瞬时转染后，把293T/17细胞在DMEM 中培养，所述DMEM含有10％低-IgG FBS(HyClone)、0.1mM MEM 非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺，其在下文中称为低-IgG 293培养 基。
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corporation)按照生产商的说 明进行293T/17细胞的瞬时转染。将大约2×107个细胞/转染铺在T-175 烧瓶内的50ml 293培养基中，并且生长过夜至铺满。在第二天，将35 μg轻链质粒和35μg重链质粒与3.75ml Hybridoma-SFM(HSFM)(Life Technologies，Rockville，MD)合并。在单独的管中，将175μl Lipofectamine 2000试剂与3.75ml HSFM合并，并且在室温培养5分 钟。将3.75ml Lipofectamine 2000-HSFM混合物与3.75ml DNA-HSFM 混合物轻微混合，并且在室温培养20分钟。抽吸出覆盖293T/17细胞 的培养基，并且用低-IgG 293培养基替换，然后向细胞中滴加 Lipofectamine-DNA复合物，通过涡旋而轻微混合，并且把细胞于37℃ 在7.5％CO2培养箱中培养7天，然后收获上清液。如上所述获得产生 8E1.4、8E1.5和8E1.6的瞬时转染体。
通过混合ELISA测定人源化8E1.4、8E1.5和8E1.6抗体表达。在 4℃将MaxiSorp ELISA平板(Nunc Nalge International，Rochester，NY) 用100μl/孔1:1000稀释的AffiniPure山羊抗-人IgG Fcγ-链特异性多 克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA) 在0.2M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH9.4中的混合物包被过夜，用洗 涤缓冲液(含有0.1％ Tween 20的PBS)洗涤，在室温用300μl/孔 SuperBlock Blocking Buffer在TBS(Pierce Chemical Company， Rockford，IL)中的混合物阻断1小时。用洗涤缓冲液洗涤之后，将含 有8E1.4、8E1.5或8E1.6的样本在ELISA缓冲液(含有1％BSA和0.1％ Tween 20的PBS)中适当地稀释，将100μl/孔施加到ELISA平板上。 使用人源化IgG1/κ抗体daclizumab(PDL BioPharma，Inc.)作为标准。 将平板在室温培养1小时后，并且用洗涤缓冲液洗涤，使用100μl/孔 1:1000稀释的HRP-缀合的山羊抗-人κ链特异性多克隆抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)检测结合的抗体。 在室温培养1小时，并且用洗涤缓冲液洗涤之后，通过加入100μl/孔 ABTS Peroxidase Substrate/Peroxidase Solution B(KPL，Inc.， Gaithersburg，MD)来显色。在室温培养7分钟之后，通过加入50μl/ 孔2％草酸来停止显色。使用VersaMax微量滴定板读书器(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)读取在415nm的吸收度。通过 ELISA分析得自瞬时转染的293T/17细胞的培养物上清液中8E1.4、 8E1.5和8E1.6的生成。观测到大约30-50μg/ml的表达水平。如上所 述对阳性样本进行纯化。
实施例2.4.5:纯化另外的人源化抗体
如下所述，使用Protein A Sepharose柱从耗尽的培养物上清液中 纯化8E1.4、8E1.5和8E1.6 IgG1/κ单克隆抗体。通过离心从瞬时转染 物收获培养物上清液，并且无菌过滤。通过加入1/50体积的1M柠檬 酸钠，pH7.0来调节过滤的上清液的pH。将上清液过1ml HiTrap Protein A HP柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation，Piscataway，NJ)， 所述柱预先用20mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH7.0平衡。将柱用 相同缓冲液洗涤，用20mM柠檬酸钠，pH3.5洗脱结合的抗体。通过 加入1/50体积的1.5M柠檬酸钠，pH6.5来中和，使用15ml Amicon Ultra-15离心滤器装置(30,000 dalton MWCO)(Millipore Corporation， Bedford，MA)把合并的抗体级份浓缩至约0.5-1.0mg/ml。然后使用具 有HT Tuffryn膜的0.2μm Acrodisc注射滤器(Pall Corporation，East Hills，NY)把样本无菌过滤。通过UV光谱法经由测定在280nm的吸 收度来确定纯化抗体的浓度(1mg/ml＝1.4A280)。
在非还原条件下进行的SDS-PAGE分析表明抗体的分子量为约 150-160kD。在还原条件下进行的分析表明，抗体由重链和轻链组成， 重链的分子量为约50kD，轻链的分子量为约25kD。抗体的纯度超 过95％。
实施例2.4.6:使用竞争ELISA表征另外的人源化抗体
在4℃，将MaxiSorp ELISA平板(Nalge Nunc International)用100 μl/孔1.0μg/ml人IL-12在0.2M碳酸钠-碳酸氢钠，pH9.4中的混合 物包被过夜，用洗涤缓冲液(含有0.1％ Tween 20的PBS)洗涤，在室 温用300μl/孔SuperBlock Blocking Buffer在TBS(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)中的混合物阻断1小时。用洗涤缓冲液洗涤 后，以一式两份加入生物素化8E1(0.8μg/ml终浓度)和竞争抗体(8E1 或8E1.4或8E11.5或8E1.6)，从100μg/ml终浓度开始并且进行3倍 系列稀释)在100μl/孔ELISA缓冲液中的混合物。作为同种型对照， 使用100μl/孔100μg/ml小鼠IgG1/κ(MuFd79)或人源化IgG1/κ (HuFd79)单克隆抗体在ELISA缓冲液中的混合物。作为非竞争对照， 使用100μl/孔ELISA缓冲液。将平板在室温培养1小时并且用洗涤 缓冲液洗涤之后，使用100μl/孔1μg/ml HRP-缀合的链霉抗生物素蛋 白(Pierce Chemical Company)在ELISA缓冲液中的混合物检测结合的 抗体。在室温培养1小时，并且用洗涤缓冲液洗涤之后，通过加入100 μl/孔ABTS Peroxidase Substrate/Peroxidase Solution B(KPL，Inc.)来显 色。在室温培养5分钟之后，通过加入50μl/孔2％草酸来停止显色。 读取在415nm的吸收度。
如上所述，通过竞争ELISA分析8E1.4、8E1.5和8E1.6对人IL- 12的亲合力。8E1和三种人源化变型都以剂量依赖方式与生物素化的 8E1竞争。表23表明了使用计算机软件GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)获得的8E1、8E1.4、8E1.5和8E1.6的 EC50值。
表23:8E1.4、8E1.5和8E1.6抗体的结合性质
  抗体 Expt.1 Expt.2 Expt.3 平均 S.D. 8E1 2.63 2.78 2.28 2.56 0.26 8E1.4 N.D. N.D. 8.33 N/A N/A 8E1.5 N.D. N.D. 13.4 N/A N/A 8E1.6 2.25 2.43 1.61 2.10 0.43
值代表竞争0.8(μg/ml)生物素化的8E1抗体所需的IC50(μg/ml)
还使用实施例2.3中描述的方法来产生抗体1A6.10、1A6.11、 1A6.12、8E1.4和8E1.5。在COS细胞中表达抗体。并且分别通过实 施例2.2.2和1.2.C中描述的方法，通过Protein A亲合力色谱法纯化。 根据实施例1.1.B和1.1.C2表征这些纯化的mAb的IC50和KD。表24 表明了1A6.10、1A6.11、1A6.12、8E1.4和8E1.5的结合特征。
表24:另外的人源化抗体的动力学和效力参数
  抗体 1A6.10 1A6.11 1A6.12 8E1.4 8E1.5 8E1.6 结合速率 (1/M·s) 3.2 x 105 ND 7.4 x 105 8 x 105 1.6 x 106 1.7 x 106 解离速率 (1/s)    7.6 x 10-6 ND 3 x 10-4 1 x 10-3 1.24 x 10-3 8 x 10-5 KD(nM) 0.024 ND 0.4 1.3 0.75 0.046 Av.IC50(nM) huIL-12     0.15 ND 0.088 12 8 ND Av.IC50(nM) cyno IL-12   ND ND ND ND ND ND
本发明参考了分子生物学领域公知的全部技术。这些技术包括但 不限于下面出版物中描述的技术:
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虽然上面描述了很多实施方案和特征，本领域技术人员明白可以 对所描述的实施方案和特征进行修饰和改变而不脱离本发明公开内容 后面权利要求书定义的本发明。这里提到的各个公开物在此引作参 考。
相关申请的交叉参考
本申请要求于2005年6月30日提交的第60/695,679号美国临时 申请的优先权。
本申请涉及于2000年3月24日提交的题为“结合人IL-12的人 抗体及其制备方法”的U.S.专利申请09/534717(作为U.S.专利 6,914,128公布)。该专利申请及其公布专利的全部内容引入本文以供 参考。
联合研究协议
本申请的内容是在联合研究协议下进行的，该联合研究协议是由 Protein Design Labs，Inc.与Abbott Laboratories参加并且在2005年12 月14日签订的，并且涉及重组工程抗体。