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用于快速PCR的装置和方法

阅读:686发布:2022-09-14

专利汇可以提供用于快速PCR的装置和方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且公开了用于进行快速热循环的仪器、方法和套件。,下面是用于快速PCR的装置和方法专利的具体信息内容。

1.一种热循环方法,包括:
(a)提供样品容器,该样品容器包括与第二阶段反应区流体连接的第一阶段室,所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应孔;
(b)将样品引入所述样品容器;
(c)将所述样品容器插入仪器中,所述仪器包括温度控制元件;
(d)将所述温度控制元件和所述第一阶段室对准,以实现所述样品在所述第一阶段室中的热循环;
(e)在所述第一阶段反应室中进行所述样品的热循环之后,将来自所述样品的至少一部分的产物从所述第一阶段室移动到所述第二阶段反应区中的多个第二阶段反应孔中;以及
(f)将所述温度控制元件和所述第二阶段反应区对准,以实现所述第二阶段反应区中所述样品的该部分的热循环。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述温度控制元件包括一个或多个加热器或冷却器装置,所述一个或多个加热器或冷却器装置选自由帕尔贴装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器以及它们的组合所组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述温度控制元件包括第一温度区和第二温度区,其中,所述第一温度区比所述第二温度区热。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,步骤(f)包括相对于所述第二阶段反应区重复地平移所述温度控制元件。
5.根据权利要求3所述的方法,其中,步骤(f)包括相对于所述温度控制元件重复地平移所述第二阶段反应区。
6.根据权利要求3所述的方法,其中,所述仪器还包括擦拭器元件,并且步骤(d)还包括:使所述擦拭器元件与所述温度控制元件和所述第一阶段室对准,使得所述擦拭器元件的旋转移动将所述样品的第一部分从所述第一温度区的热控制移动到所述第二温度区的热控制,同时将所述样品的第二部分从所述第二温度区的热控制移动到所述第一温度区的热控制。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述样品容器还包括样品制备区,所述样品制备区流体连接到所述第一阶段室,并且在步骤(d)之前,所述方法还包括:
将所述样品引入所述样品制备区;
使所述样品制备区与裂解装置接触以产生裂解物;
从所述裂解物中回收核酸;以及
将回收的核酸移动到所述第一阶段室中。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,从所述样品中回收核酸还包括:
使所述裂解物与多个磁珠接触;
展开磁体以将所述磁珠与所述裂解物分离;
洗涤所述磁珠;
用所述磁体重新捕获所述磁珠;
使所述磁珠与洗脱缓冲液接触以从所述磁珠中释放核酸;以及
用所述磁体重新捕获所述磁珠并将洗脱的核酸与所述磁珠分离。
9.根据权利要求7所述的方法,其中,所述样品制备区和所述第一阶段室是所述样品容器内的单独室。
10.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法的步骤(f)还包括:将所述第二核酸扩增区与所述温度控制元件的所述第一温度区、且随后与所述第二温度区对准,以使所述第二核酸扩增区中的所述样品热循环。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述方法的步骤在20分钟或更短、15分钟或更短、或优选地10分钟或更短的时间内完成。
12.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一核酸扩增区和所述第二核酸扩增区的每个热循环在8秒或更短、6秒或更短、或优选地4秒或更短的时间内完成。
13.根据权利要求1所述的方法,还包括:提供计算装置,所述计算装置被构造用于控制所述对准步骤并用于控制所述温度控制元件的温度。
14.一种用于热循环样品的仪器,所述样品被设置在柔性样品容器中,所述仪器包括:
第一加热器,邻近所述柔性样品容器的第一部分,用于将所述样品的第一部分调节至第一温度,
第二加热器,邻近所述柔性样品容器的第二部分,用于将所述样品的第二部分调节至第二温度,所述第二温度不同于所述第一温度,以及
擦拭器元件,其将所述样品的第一部分移动到所述柔性样品容器的第二部分,同时将所述样品的第二部分移动到所述柔性样品容器的第一部分,使得所述样品的多个部分同时地受到每个加热器的控制。
15.根据权利要求14所述的仪器,其中,所述擦拭器元件还包括叶片,所述叶片将所述样品分成至少两个不连续的区段,所述至少两个不连续的区段包括至少第一区段和第二区段,使得所述第一部分被包含在所述第一区段中且所述第二部分被包含在所述第二区段中。
16.根据权利要求14所述的仪器,其中,所述擦拭器元件在所述样品中产生涡流和漩涡,使得所述样品的第一部分处于所述第一加热器的控制下,所述样品的第二部分处于所述第二加热器的控制下,而所述样品的第三部分在第一加热器和所述第二加热器的控制之间转换。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的仪器,其中,所述擦拭器元件将所述样品的多个部分重复地移动到所述样品容器的相对部分以热循环所述样品。
18.根据权利要求14所述的仪器,其中,样品器皿包括用于PCR的组分和核酸。
19.根据权利要求14所述的仪器,其中,所述擦拭器元件能移动以压缩所述柔性样品容器以排出所述样品的一部分,并且所述擦拭器元件在排出所述样品的该部分之前具有第一速度,而在排出所述样品的一部分之后具有较快的第二速度。
20.根据权利要求14所述的仪器,还包括被设置在所述擦拭器元件与所述柔性样品容器之间的可压缩构件,其中,所述可压缩构件朝向所述样品容器被偏置。
21.根据权利要求14所述的仪器,还包括与所述样品容器流体连接的阵列,所述阵列被构造成接收所述样品的至少一部分,以及
所述仪器还包括多个加热器,所述多个加热器能移动以顺序地影响所述阵列中的所述样品的该部分的温度。
22.一种用于热循环样品的仪器,包括:
接受器,用于定位柔性样品容器,所述柔性样品容器在所述仪器中具有至少第一反应室;
加热器组件,包括第一加热元件和第二加热元件;以及
平移器,机械地联接到所述接受器、所述柔性样品容器或所述加热器组件中的至少一个,以使所述第一反应室相对于所述加热器组件的第一加热元件和第二加热元件横向对准,使得所述第一反应室处于所述第一加热元件或所述第二加热元件中的至少一个的温度控制下;以及
其中,所述仪器被构造成使所述第一反应室与所述第一加热元件、且随后与所述第二加热元件重复地对准,以在所述至少一个反应室中热循环流体样品。
23.根据权利要求22所述的仪器,其中,所述第一加热元件被设定到约90℃-110℃范围内的温度,所述第二加热元件被设定到约55℃至约65℃范围内的温度。
24.根据权利要求22所述的仪器,其中,所述加热器组件联接到所述平移器,并且所述平移器被构造成相对于所述第一反应室横向地平移所述加热器组件,使得所述第一加热元件和所述第二加热元件能够在第一个反应室处限定受控温度区。
25.根据权利要求22所述的仪器,其中,所述接受器联接到所述平移器,并且所述平移器被构造成使所述接受器和位于其中的所述柔性样品容器相对于所述加热器组件横向地平移,使得所述第一加热元件和所述第二加热元件能够在第一反应室处限定受控温度区。
26.根据权利要求22所述的仪器,其中,所述柔性样品容器联接到所述平移器,并且所述平移器被构造成相对于所述加热器组件平移所述柔性样品容器,使得所述第一反应室处于所述第一加热元件和所述第二加热元件的温度控制下。
27.根据权利要求22所述的仪器,所述柔性样品容器还包括处在所述第一反应室下游的第二反应室,并且其中,所述平移器被构造成相对于所述加热器组件的第一加热元件和第二加热元件横向地对准所述第二反应室,使得所述第二反应室处于所述第一加热元件和所述第二加热元件的温度控制之下。
28.根据权利要求27所述的仪器,其中,所述第二反应室包括与所述第一反应室流体连接的各个扩增孔的阵列,所述阵列被构造成从所述第一反应室接收至少一部分扩增产物。
29.根据权利要求22所述的仪器,其中,所述接受器包括基本上平坦的表面,所述基本上平坦的表面中定位有一个或多个开口,以便允许所述加热器组件的第一加热元件和第二加热元件在被定位于所述接受器中时接触所述柔性样品容器的一个或多个部分。
30.根据权利要求22所述的仪器,其中,所述加热器组件包括第一加热元件、第二加热元件和第三加热元件。
31.根据权利要求30所述的仪器,其中,所述第一加热元件、所述第二加热元件和所述第三加热元件被线性地设置。
32.根据权利要求31所述的仪器,其中,所述第一加热元件和所述第三加热元件的温度被设定在约90℃-110℃的范围内,所述第二加热元件的温度被设定到约55℃到约65℃的温度。
33.一种热循环系统,包括:
接受器,用于在其中接收柔性样品容器,所述柔性样品容器具有第一阶段室,所述第一阶段室包括待在其中热循环的样品;
加热元件,包括被定位于所述柔性样品容器的第一侧上的至少第一温度区和第二温度区;以及
擦拭器元件,被定位于所述样品容器的第二侧上,所述擦拭器元件构造成用于接触所述第一阶段室以将所述样品分成至少第一部分和第二部分;
其中,所述接受器、所述加热元件、所述擦拭器元件或所述柔性样品容器中的一个或多个能移动,以便将所述第一阶段室相对于所述擦拭器元件和所述加热元件的第一温度区和第二温度区对准;以及
其中,所述擦拭器元件被构造成邻近所述第一阶段室旋转,以将所述样品的第一部分移动到所述第二部分,同时将所述样品的第二部分移动到所述第一部分,使得所述第一部分和第二部分处于所述加热元件的第一温度区和第二温度区的温度控制下。
34.根据权利要求33所述的热循环系统,其中,所述柔性样品容器包括样品制备区,其中,所述样品制备区是所述第一阶段室的上游之一,或者所述样品制备区和所述第一阶段室包括单个区。
35.根据权利要求34所述的热循环系统,其中,所述擦拭器元件被构造用于接触所述样品容器以在所述样品制备区中混合所述样品。
36.根据权利要求35所述的热循环系统,其中,所述擦拭器元件和所述加热元件协同工作以实现样品制备,并且还协同工作以实现核酸扩增。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的热循环系统,其中,所述擦拭器元件在所述样品中产生涡流、漩涡和空化气泡中的一种或多种以裂解所述样品中的细胞。
38.根据权利要求33所述的热循环系统,其中,所述第一阶段室包括研磨元件以增强细胞裂解。
39.根据权利要求33所述的热循环系统,所述仪器还包括裂解部件,所述裂解部件被构造用于接触所述样品制备区,其中,所述裂解部件可选地是所述擦拭器元件的部件。
40.根据权利要求33所述的热循环系统,其中,所述擦拭器元件重复地将所述样品的第一部分移动到第二部分,同时移动所述样品的第二部分以热循环所述样品。
41.根据权利要求33所述的热循环系统,其中,所述柔性样品容器还包括位于所述第一阶段室下游的第二阶段室,并且其中,所述接受器、所述柔性样品容器、或所述加热元件中的一个或多个能移动,使得所述第二阶段室相对于所述加热元件对准,使得所述第二阶段室处于所述第一温度区和所述第二温度区的温度控制之下。
42.根据权利要求41所述的热循环系统,其中,所述第二阶段室包括流体连接到所述第一阶段室的各个扩增孔的阵列,所述阵列被构造成从所述第一阶段室接收至少一部分产物。
43.根据权利要求41所述的热循环系统,所述加热元件还包括至少第一温度区、第二温度区和第三温度区,其中,两个温度区对准以用于热循环所述第一阶段室,并且三个温度区一次一个地对准以用于热循环所述第二阶段室。
44.根据权利要求33-43中任一项所述的热循环系统,其中,所述接受器包括基本上平坦的表面,所述基本上平坦的表面中定位有一个或多个开口,以便允许所述加热元件接触所述柔性样品容器的一个或多个部分。
45.根据权利要求33-44中任一项所述的热循环系统,还包括光学阵列,所述光学阵列包括被构造用于从所述柔性样品容器的至少一部分收集光学数据的光源和相机元件。
46.根据权利要求33-45中任一项所述的热循环系统,其中,所述柔性样品容器包括含有核酸和用于核酸扩增的试剂的样品。
47.根据权利要求33-35中任一项所述的热循环系统,其中,所述擦拭器元件还包括一个或多个压构件,所述压力构件被构造成向所述柔性样品容器的所述样品制备区和/或第一阶段室施加压力。
48.根据权利要求47所述的热循环系统,其中,所述一个或多个压力构件还包括能在所述柔性样品容器附近展开的至少一个磁体。
49.根据权利要求33所述的热循环系统,其中,所述擦拭器元件还包括能在所述柔性样品容器附近展开的至少一个磁体。
50.一种用于热循环样品的仪器,包括:
接受器,用于在所述仪器中定位柔性样品容器,所述柔性样品容器包括:
第一阶段室和第二阶段反应室,所述第二阶段反应室具有第二阶段反应孔的阵列;
加热元件,包括第一温度区和第二温度区,
其中,所述接受器、所述样品容器或所述加热元件中的一个或多个能移动,以便将所述第一阶段室和所述第二阶段反应室相对于加热元件对准;以及
其中,所述接受器和所述加热元件被构造成允许所述加热元件首先加热第一阶段室,然后加热所述第二阶段反应室,以在所述第一阶段室中进行热循环和核酸扩增,然后在所述第二阶段室中进行热循环和核酸扩增。
51.根据权利要求50所述的仪器,还包括:
擦拭器元件,具有至少一个叶片,被构造成接触所述第一阶段室并将所述第一阶段室分成至少第一容积和第二容积,
其中,所述加热元件在所述第一阶段室下方被对准,使得所述第一容积位于所述第一温度区上方,所述第二容积位于所述第二温度区上方,并且
其中,所述擦拭器元件被构造成旋转以将所述第一容积移动到所述第二温度区,同时将所述第二容积移动到所述第一温度区,使得所述第一容积和所述第二容积在每个所述温度区的控制下。
52.根据权利要求51所述的仪器,其中,所述柔性样品容器包括样品制备区。
53.根据权利要求52所述的仪器,其中,所述样品制备区位于所述第一阶段室的上游。
54.根据权利要求52所述的仪器,其中,所述样品制备区和所述第一阶段室包括单个室。
55.根据权利要求52所述的仪器,其中,所述擦拭器元件被构造成接触所述样品制备区。
56.一种用于热循环样品的仪器,包括:
接受器,用于在所述仪器中定位柔性样品容器,所述柔性样品容器包括:
至少一个反应室;
加热器组件,包括第一加热元件、第二加热元件和第三加热元件,其中所述第一加热元件和所述第三加热元件保持在高于所述第二加热元件的温度,并且
其中,所述仪器被构造成使所述至少一个反应室与所述第一加热元件、所述第二加热元件和所述第三加热元件对准,用于在所述至少一个反应室中热循环流体样品。
57.根据权利要求56所述的仪器,其中,所述第一加热元件和所述第三加热元件的温度被设定在约90℃-110℃的范围内,所述第二加热元件的温度被设定到约55℃-65℃的温度。
58.根据权利要求56所述的仪器,其中,所述第一加热元件和所述第三加热元件包括电阻加热元件,并且所述第二加热元件包括珀帖装置。
59.根据权利要求58所述的仪器,其中,所述第一加热元件或所述第三加热元件中的一个包括被放置在珀耳帖装置上的电阻加热元件。
60.根据权利要求56所述的仪器,其中,所述加热器组件包括圆形安装座,所述圆形安装座被构造成邻近所述柔性样品容器旋转。
61.根据权利要求56所述的仪器,其中,所述加热器组件包括线性安装座,所述线性安装座被构造成邻近所述柔性样品容器平移。
62.一种使用权利要求56-61中任一项所述的仪器的聚合酶链式反应方法,所述方法包括:
(a)提供包括至少一个反应室的所述样品容器,
(b)将样品引入所述反应室,其中,所述样品包括靶核酸、用于扩增靶核酸的至少一种引物、和热稳定DNA聚合酶,
(c)将所述样品容器插入所述仪器,
(d)将所述第一加热元件与所述反应室对准,然后将所述第二加热元件与所述反应室对准,且随后将所述第三加热元件与所述反应室对准,
其中,所述第一加热元件和所述第三加热元件被设定在变性温度,所述第二加热元件被设定在退火温度,以及
其中,步骤(d)包括变性、退火和伸长/变性循环中的一个;以及
(f)重复步骤(d)。
63.一种用于扩增在样品容器中提供的核酸的仪器,其中,所述核酸被构造在阵列中,所述仪器包括:
开口,用于接收所述样品容器,
多个加热器,每个加热器被设置在不同的温度,以及
移动器,用于将所述加热器按顺序地移动到邻近所述开口的位置,使得仅处在所述位置的所述加热器控制所述样品容器中的所述核酸的温度。
64.根据权利要求63所述的仪器,其中,所述样品容器还包括用于扩增核酸的部件,以及
多个加热器至少包括处于退火温度的第一加热器和处于变性温度的第二加热器。
65.根据权利要求64所述的仪器,其中,所述多个加热器还包括处于伸长温度的第三加热器。
66.根据权利要求64所述的仪器,其中,所述样品还包括被构造用于检测已扩增核酸的荧光实体,并且所述仪器还包括光电检测器,所述光电检测器被定位成检测来自所述阵列的荧光。
67.一种用于进行PCR的方法,包括:
(a)在样品器皿中提供PCR混合物,所述PCR混合物具有体积,
(b)热循环第一循环次数,所述第一循环次数中的每一次具有第一循环时间,(c)将所述样品容器中的所述PCR混合物的体积减少至第二体积,所述第二体积小于所述第一体积,并且
(d)热循环第二循环次数,所述第二循环次数中的每一次具有第二循环时间,所述第二循环时间短于所述第一循环时间。
68.根据权利要求67所述的方法,还包括:
(e)将所述样品容器中的所述PCR混合物的体积减少至第三体积,所述第三体积小于所述第二体积,并且
(f)热循环第三循环次数,所述第二循环次数中的每一次具有第三循环时间,所述第三循环时间短于所述第二循环时间。
69.根据权利要求67所述的方法,其中,所述样品器皿能压缩,并且减少步骤通过从所述样品器皿中排出所述样品的一部分来进行。
70.根据权利要求67所述的方法,其中所述样品器皿与至少两个温度区接触,并且热循环步骤包括在所述温度区之间移动所述样品。
71.根据权利要求67所述的方法,其中,所述样品器皿由在几个温度之间进行热循环的加热器来加热。
72.一种扩增样品中的核酸的方法,包括:
将流体样品引入容器的样品隔室中,所述流体样品包括靶核酸和用于扩增靶核酸的试剂;
将所述容器引入加热设备中,所述加热设备包括第一加热器、第二加热器和用于在所述样品隔室内移动所述流体样品的移动器,所述第一加热器被设定到第一温度,所述第二加热器被设定到第二温度,所述第一温度大于所述第二温度,所述样品隔室的第一部分被设置成邻近所述第一加热器,使得所述第一加热器在所述样品隔室的第一部分上展示热控制,所述样品隔室的第二部分被设置成邻近所述第二加热器,使得所述第二加热器在所述样品隔室的第二部分上展示热控制;以及
选择性地在所述样品隔室的第一部分与所述样品隔室的第二部分之间移动所述流体样品的至少一部分,使得所述样品的多个部分同时受每个所述加热器的控制。
73.一种扩增样品中的核酸的方法,包括:
(a)将流体样品引入容器的第一隔室中,所述流体样品包括靶核酸和用于扩增所述靶核酸的试剂,其中,所述第一隔室处于第一加热器的控制下,所述第一加热器被设定在低于退火温度的温度(低退火温度),
(b)将所述第一加热器的温度升高至所述退火温度,
(c)将所述流体样品移动到容器的第二隔室中,其中,所述第二隔室在第二加热器的控制下,所述第二加热器被设定在高于伸长温度的温度(高伸长温度),并在将所述流体样品移动到所述第二隔室中之后,降低所述第一加热器的温度达到所述低退火温度,(d)将所述第二加热器的温度降低到所述伸长温度,
(e)将所述第二加热器的温度升高到至少变性温度,以及
(f)重复步骤(a)至步骤(e)。
74.根据权利要求73所述的方法,其中,当重复步骤(a)时,将所述第二加热器的温度移动到所述高伸长温度。
75.根据权利要求73所述的方法,其中,所述低退火温度比所述退火温度低2至20度。
76.根据权利要求73所述的方法,其中,所述高伸长温度比所述伸长温度高2至10度。
77.根据权利要求73所述的方法,其中,步骤(e)包括将所述第二加热器的温度升高到高于所述变性温度的温度,并且一旦所述流体样品达到变性温度就重复步骤(a)。
78.一种用于热循环样品的仪器,包括:
接受器,用于在所述仪器中定位柔性样品容器,所述柔性样品容器具有第一阶段室;
加热元件,包括至少第一温度区和第二温度区,
其中,所述接受器和所述加热元件中的一个或多个能移动,以便将所述第一阶段室相对于所述加热元件的第一温度区和第二温度区定位;以及
其中,所述接受器和所述加热元件被构造成允许所述第一温度区和所述第二温度区控制所述第一阶段室的温度以实现其中的热循环和核酸扩增。
79.根据权利要求78所述的仪器,其中,所述柔性样品容器包括样品制备区。
80.根据权利要求79所述的仪器,其中,所述样品制备区域位于所述第一阶段室的上游。
81.根据权利要求79所述的仪器,其中,所述仪器还包括位于所述样品容器的第一侧上的擦拭器元件,所述擦拭器元件被构造成用于接触所述样品容器以混合所述样品制备区中和所述第一阶段室中的样品;以及
其中,所述接受器、所述擦拭器元件或所述加热元件中的一个或多个能移动,以便将所述柔性样品容器相对于所述擦拭器元件和所述加热元件定位;以及
其中,所述擦拭器元件和所述加热元件协同工作以实现样品制备,并且还协同工作以实现核酸扩增。
82.根据权利要求81所述的仪器,其中,所述擦拭器元件能在所述样品制备区与所述第一阶段室之间移动,并且所述加热元件能移动以在所述样品制备区和所述第一阶段室处限定受控温度区。
83.根据权利要求81所述的仪器,其中,所述接受器能相对于所述擦拭器元件和所述加热器移动,以在所述样品制备区和所述第一阶段室处提供混合和受限的温度区。
84.根据权利要求81所述的仪器,其中,所述接受器、所述擦拭器元件或所述加热元件中的至少两个能移动,以在所述样品制备区和所述第一阶段室处提供混合和限定的温度区。
85.根据权利要求81所述的仪器,其中,所述加热元件能移动到所述样品制备区以加热其中存在的样品,并且所述擦拭器元件具有至少一个叶片,所述叶片被构造成接触所述样品制备区并将所述样品混合以裂解所述样品中的细胞。
86.根据权利要求85所述的仪器,其中,所述擦拭器元件在所述样品中产生涡流、漩涡和空化气泡中的一种或多种以裂解所述样品中的细胞。
87.根据权利要求86所述的仪器,其中,所述样品制备区包括研磨元件以增强细胞裂解。
88.根据权利要求81所述的仪器,其中,所述擦拭器元件包括裂解部件。
89.根据权利要求78所述的仪器,其中,所述加热元件能定位在所述第一阶段室附近,使得所述样品的第一部分位于所述第一温度区附近,而所述样品的第二部分位于所述第二温度区附近,并且其中,所述仪器还包括具有至少一个叶片的擦拭器元件,所述至少一个叶片被构造成将所述第一阶段室分成至少两个不连续的区段,所述至少两个不连续的区段包括至少第一部分和第二部分,并且所述至少一个叶片被构造成能旋转以将所述样品的第一部分移动到所述第二温度区,同时将所述样品的第二部分移动到所述第一温度区,使得所述样品的第一部分和第二部分受每个所述温度区的控制。
90.根据权利要求89所述的仪器,其中,所述叶片将所述样品分成至少两个不连续的区段,所述至少两个不连续的区段包括至少第一区段和第二区段,使得所述第一部分被包含在所述第一区段中且所述第二部分被包含在所述第二区段中。
91.根据权利要求89所述的仪器,其中,所述擦拭器元件移动所述样品,使得所述样品的第一部分处于所述第一温度区的控制下,所述样品的第二部分处于所述第二温度区的控制下,而所述样品的第三部分在第一温度区和所述第二温度区的控制之间转换。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的仪器,其中,所述擦拭器元件将所述样品的多个部分重复地移动到所述样品容器的相对部分以热循环所述样品。
93.根据权利要求78所述的仪器,所述容器还包括处在所述第一阶段室下游的第二核酸扩增区,并且其中,所述接受器和所述柔性样品容器或所述加热元件中的一个或多个能移动,以便将所述第二核酸扩增区相对于所述加热元件定位,以在所述第二核酸扩增区限定受控温度区。
94.根据权利要求93所述的仪器,其中,所述第二核酸扩增区包括与所述第一核酸扩增区流体连接的各个扩增孔的阵列,所述阵列被构造为接收所述样品的至少一部分。
95.根据权利要求94所述的仪器,所述容器包括位于所述第一阶段室与所述阵列之间的孔,其中,所述孔被构造成从所述第一阶段室接收已知体积的所述样品并将所述已知体积递送至所述阵列。
96.根据权利要求95所述的仪器,所述容器包括处在所述孔与所述阵列之间的稀释区,其中,所述稀释区被构造成从所述孔接收所述已知体积,用一定体积的流体稀释所述已知体积以产生稀释样品,并将稀释后的样品递送到所述阵列。
97.根据权利要求78所述的仪器,其中,所述接受器包括基本上平坦的表面,所述基本上平坦的表面中定位有一个或多个开口,以允许所述加热元件在插入所述接受器中时接触所述柔性样品容器的一个或多个部分。
98.根据权利要求78所述的仪器,还包括光学阵列,所述光学阵列包括被构造用于从所述容器的至少一部分收集光学数据的光源和相机元件。
99.根据权利要求78所述的仪器,其中,所述加热元件包括第一加热器部分、第二加热器部分和第三加热器部分。
100.根据权利要求99所述的仪器,其中,所述第一加热器部分是电阻加热器,所述第二加热器部分是珀耳帖装置,且所述第三加热器部分是电阻加热器。
101.根据权利要求100所述的仪器,其中,所述第三加热器部分包括处在珀耳帖装置上的电阻加热器,并且其中,所述电阻加热器用于加热所述第三加热器部分,且所述珀耳帖装置基本上同时用于冷却所述第三加热器部分。
102.根据权利要求101所述的仪器,其中,所述第一加热器部分、所述第二加热器部分和所述第三加热器部分被线性地设置。
103.根据权利要求78-102中任一项所述的仪器,还包括计算装置,所述计算装置被构造用于控制所述仪器的一个或多个组件和/或从所述仪器的一个或多个组件收集数据。
104.一种用于扩增样品中的核酸的仪器,所述仪器包括:
开口,用于接收柔性样品容器,所述柔性样品容器包括至少一个反应区,以及多个加热器,其中,每个所述加热器被构造成设定在不同的温度,并且其中,所述加热器被定位在基本上平面的安装座上,使得每个加热器能够与所述至少一个反应区按顺序地对准以加热或冷却其中的样品。
105.根据权利要求104所述的仪器,其中,所述基本上平面的安装座包括圆形安装座,所述圆形安装座被构造成邻近所述柔性样品容器旋转。
106.根据权利要求105所述的仪器,其中,所述圆形安装座被构造为沿顺时针和逆时针两个方向旋转。
107.一种柔性样品容器,包括:
反应室,具有多个反应孔的阵列,其中,所述阵列的每个孔流体连接到能选择性打开且能选择性密封的填充通道。
108.根据权利要求107所述的柔性样品容器,其中,所述柔性样品容器由第一膜层、至少部分地粘合到所述第一膜层的第二膜层、粘合到所述第二膜层和其中形成所述阵列的反应孔的卡层的一个表面的粘合剂层、粘合到第三外部膜层和所述卡层的相对表面的第二粘合剂层制成,
其中,所述填充通道是通过在所述第一膜层与所述第二膜层之间留下开放空间而形成的。
109.根据权利要求108所述的柔性样品容器,其中,所述填充通道由密封线限定,所述密封线将所述第一膜层和第二膜层围绕所述反应孔阵列密封在一起。
110.根据权利要求108所述的柔性样品容器,其中,所述填充通道通过由所述第二膜层和所述第一粘合剂层中的选择性切口形成的填充孔流体连接到所述阵列的每个孔。
111.根据权利要求110所述的柔性样品容器,其中,所述填充孔流体连接到孔填充通道,所述孔填充通道在所述阵列的孔附近和上方流动,其中,所述孔填充通道通过在邻近所述阵列的孔的所述卡层中形成切口以及在所述第二粘合剂层中形成另一切口来形成。
112.根据权利要求110所述的柔性样品容器,其中,所述填充孔流体连接到孔填充通道,所述孔填充通道流入所述阵列的孔中,其中,所述孔填充通道通过在所述第一粘合剂层中形成切口来形成,所述切口将所述填充孔流体连接到所述阵列的孔。
113.根据权利要求107所述的柔性样品容器,其中,所述填充通道能热密封。
114.根据权利要求113所述的柔性样品容器,其中,单个热密封件密封从一填充通道到多个填充通道的流动并将所述多个孔彼此密封。
115.根据权利要求107所述的柔性样品容器,其中,所述填充通道能通过在所述阵列上施加压力来密封。

说明书全文

用于快速PCR的装置和方法

[0001] 政府利益
[0002] 本发明是在美国国防部批准的W911QY-13-D-0080的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求享有2016年2月22日提交的美国临时申请序列号No.62/298,311、2016年5月2日提交的美国临时申请序列号No.62/330,701、以及2016年10月18日提交的美国临
时申请序列号No.60/409,829的权益和优先权,其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

[0005] 本公开的实施例一般涉及用于扩增核酸的方法和装置。

背景技术

[0006] 在美国、加拿大和西欧,传染病造成人类死亡率的约7%,而在发展中地区,传染病造成人类死亡率的40%以上。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现包括发烧、炎、
脑膜炎、腹泻和含血的腹泻。虽然物理表现提示一些病原体并且消除作为病原因子
(etiological agent)的其他病原体,但是仍然存在多种潜在的致病因子,并且明确的诊断
通常需要进行多种测定。用于诊断病原体的传统生物学技术可能需要数天或数周,通常
会延迟正确的治疗过程。
[0007] 近年来,聚合酶链式反应(PCR)已成为快速诊断传染因子的精选方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏和特定的工具。使用PCR作为主要诊断手段的挑战是可能的致病生
物或病毒的多样性以及一些病理标本中存在的低平的生物或病毒。运行大量的PCR测定
板通常是不切实际的,一个PCR测定板用于每种可能的致病生物或病毒,其中大多数PCR测
定板预计是阴性的。当病原体核酸浓度低并且需要大量样品来收集足够的反应模板时,问
题可能会恶化。在某些情况下,没有足够的样品来测定所有可能的病原因子。一种解决方案
是运行“多重PCR”,其中在单一反应中对多个靶同时测定样品。虽然已经证明多重PCR在一
些系统中是有价值的,但是存在关于高水平多重反应的稳健性和难以清楚分析多种产物的
缺点。为了解决这些问题,可以随后将测定分成多个次级PCR。在初级产物中嵌套次阶段反
应提高了稳健性。诸如 (BioFire Diagnostics,LLC,盐湖城,UT)的封闭式系
统减少了操作,从而降低了污染险。
[0008] PCR可以在概念上分为3个反应,每个反应通常假定在三个温度中的每一个温度下随时间发生。在每个循环3个时间段的3个温度下发生的三个反应(变性、退火和延伸)方面,
这种PCR的“均衡范式”易于理解。然而,这种均衡范式并不适合物理现实。不会发生瞬间温
度变化;改变样品温度需要时间。此外,各个反应速率随温度而变化,并且一旦发生引物退
火,紧接着是聚合酶延伸。更准确地,特别是对于快速PCR,是一种动学范式,其中反应速
率和温度总是在变化。只要产物变性并且引物退火,就不需要在PCR期间保持温度恒定。在
PCR的动力学范式下,产物变性,引物退火和聚合酶延伸可能在时间上重叠,并且它们的速
率随温度连续变化。在均衡范式下,循环由3个温度限定,每个温度保持一段时间,而动力学
范式需要转换速率和目标温度。用于平衡和动力学范式的说明性时间/温度曲线在图5a-图
5b中被示出。然而,应理解的是,这些温度曲线仅是说明性的,并且在PCR的一些实施方式
中,退火和延伸步骤被组合,由此仅需要2个温度。
[0009] 当PCR在1980年代后期首次普及时,该过程很慢。典型的方案是在94℃下变性1分钟,在55℃下退火2分钟,在72℃下延伸3分钟。当包括温度之间的转变时间时,典型的是8分
钟循环,这导致在4小时内完成30个循环。25%的循环时间花费在温度转换上。随着循环速
度的增加,在温度转换中花费的时间比例也增加,动力学范式变得越来越相关。在快速循环
PCR期间,温度通常会发生变化。对于短产物(<100bps)的快速循环PCR,100%的时间可能花
费在温度转换上,并且不需要保持时间。对于较长产物的快速循环PCR,可以包括在最佳延
伸温度下保持的温度。
[0010] 单独地,术语“快速PCR“是相对的和模糊的。与4小时相比,1小时PCR是快速的,但与15分钟相比是较慢的。此外,如果以较高的模板浓度开始或使用较少的循环,可以缩短
PCR方案。更具体的衡量标准是每个循环所需的时间。因此,“快速循环PCR”(或“快速循环”)
定义于1994年,在10-30分钟内完成30个循环,导致每个循环20-60秒。每个循环的实际时间
长于用于变性、退火和延伸通常程序化的时间的总和,因为需要时间来使这些阶段中的每
个阶段之间的温度升高。1990年代早期的初步工作确定了使用毛细管和热空气进行温度控
制的快速循环的可行性。多年来,系统变得更快,变性、退火和延伸的动力学要求变得更加
清晰。
[0011] 快速方案在变性和退火温度下使用瞬时或“0”秒保持。也就是说,温度-时间曲线示出变性和退火的温度峰值,而不保持顶部和底部温度。变性和退火可以非常快速地发生。
[0012] 该早期工作的结论是:1)PCR产物的变性非常快,不需要保持变性温度,2)引物的退火可以非常快速地发生,特别是具有较高的引物浓度,并且退火温度保持可不必要时,3)
所需的延长时间取决于PCR产物长度和聚合酶浓度。此外,快速循环PCR不仅更快,而且在特
异性和产量方面更好,只要精确控制温度即可。
[0013] 减少循环时间的一种方法是引入PCR方案的变化以减轻温度循环要求。具有更高Tm的更长引物允许更高的退火温度。通过限制产物长度及其Tm,可以将变性温度降低到恰
好高于产物Tm。结合而言,较高的退火温度和较低的变性温度会降低成功扩增所需的温度
范围。将3步循环(变性、退火和延伸)减少到2步(变性和组合的退火/延伸步骤)也简化了温
度循环要求。然而,如果组合的退火/延伸步骤在低于70℃至80℃的聚合酶最活跃的(特别
是具有快速升降温速率(ramp rate))温度最佳条件的温度下进行,那么两步循环可能损害
聚合酶延伸率。聚合酶延伸率与温度成对数线性,直至约70℃-80℃,且已报告的最大值为
60bp/s-120bp/s。
[0014] 即使具有方案变化,当与对照反应相比时,当循环时间<20秒时,扩增效率和产量通常较差。这些朝着加速PCR方向的努力似乎主要通过工程学进行,很少关注生物化学。随
着循环时间从20秒减少到2秒,PCR产量降低并最终消失,表明即使在高拷贝数(copy 
number)的简单靶下也缺乏稳健性。
[0015] 最近,已经报道了使用薄壁毛细管和水浴以每个循环小于10秒(在一些实施例中,每个循环少于一秒)的速度来热循环或使用感应加热的系统(US 2015/0118715;WO 2015/
069743,其通过引用整体并入本文)。对于这种“极端PCR”的化学方面的调节,其中聚合酶和
引物浓度增加,允许聚合酶链式反应以如此快的速率进行。
[0016] 在极端PCR的一个示例中,聚合酶以至少0.5μM的浓度被提供,并且引物各自以至少2μM的浓度被提供,并且在一些示例中,引物浓度为2.5μM或更多。作为非限制性示例,退
火时间可以通过退火时间=k1/[引物]来定义,其中k1是常数,[引物]是每种引物的浓度,
并且伸长温度下的时间可以通过伸长时间=k2(延伸长度)/([聚合酶]×[聚合酶速度])来
定义,其中k2是比例常数,[聚合酶]是聚合酶的浓度,聚合酶速度是聚合酶掺入核苷酸基底
的速率。在极端PCR的另一个示例中,聚合酶与引物的比例说明性地(约0.03至约0.4聚合
酶):(总引物浓度),并且聚合酶浓度为至少0.5μM。值得注意的是,聚合酶单位定义可能令
人困惑。对于天然Taq聚合酶,在典型的快速循环条件下,0.4U/10μl约为1.5nM。
[0017] 虽然在WO 2013/177429中报道了化学方面的改进,但该装置需要大量的水浴,并且理想地将其放置在防水柜内。在商业仪器中使用WO 2013/177429的化学方法需要具有10
秒或更短循环时间的快速温度循环。还希望在密闭容器中进行这种快速温度循环。
[0018] 本发明通过提供用于快速PCR的装置、套件(kits)和方法,说明性地在封闭容器中解决了与快速PCR有关的各种问题,包括污染风险。

发明内容

[0019] 本文描述了用于在柔性样品容器中快速扩增核酸的装置(仪器和系统)和方法。在说明性实施例中,柔性样品容器可包括流体连接至第二阶段反应区的第一阶段室,第二阶
段反应区包括多个第二阶段反应孔。常规地,用于核酸扩增的热循环装置包括加热器,其升
高和降低样品的温度以实现退火、伸长和变性的多个循环。相反,本文描述的装置可包括温
度控制元件,其包括第一温度区和第二温度区。在一个示例中,第一温度区和第二温度区的
温度可以保持恒定,其中,说明性地,一个区可以保持在伸长温度而另一个区可以保持在变
性温度。备选地,第一温度区和第二温度区可以在有限范围(例如,5℃-20℃范围)内进行热
循环。温度控制单元和柔性样品容器的各个部分可以被对准以实现用于核酸扩增的温度循
环。本文详细描述的装置的其他部件可以与温度控制单元协同工作以实现热循环。因为第
一温度区和第二温度区的温度保持恒定或在窄范围内循环,所以可以更快地完成用于核酸
扩增的温度变化。
[0020] 在一个实施例中,描述了一种热循环方法。该方法包括(a)提供样品容器,该样品容器包括与第二阶段反应区流体连接的第一阶段室,第二阶段反应区包括多个第二阶段反
应孔;(b)将样品引入样品容器;(c)将样品容器插入仪器中,仪器包括温度控制元件。该方
法还包括(d)将温度控制元件和第一阶段室对准以实现样品在第一阶段室中的热循环;(e)
在第一阶段反应室中进行样品的热循环之后,将来自样品的至少一部分的产物从第一阶段
室移动到第二阶段反应区中的多个第二阶段反应孔中;以及(f)将温度控制元件和第二阶
段反应区对准,以实现第二阶段反应区中部分样品的热循环。
[0021] 在一个方案中,温度控制元件可包括一个或多个加热器或冷却器装置,例如但不限于,帕尔贴装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正
温度系数加热器以及它们的组合。在一个方案中,温度控制元件包括第一温度区和第二温
度区,其中第一温度区比第二温度区更热。
[0022] 在一个方案中,在步骤(f)中对准温度控制元件和第二阶段反应区包括相对于第二阶段反应区重复地平移温度控制元件。在另一方案中,在步骤(f)中对准温度控制元件和
第二阶段反应区包括相对于温度控制元件重复地平移第二阶段反应区。
[0023] 在一个方案中,仪器还包括擦拭器元件,并且步骤(d)还包括使擦拭器元件与温度控制元件和第一阶段室对准,使得擦拭器元件的旋转移动将样品的第一部分从第一温度区
的热控制移动到第二温度区的热控制,同时将样品的第二部分从第二温度区的热控制移动
到第一温度区的热控制。
[0024] 在一个方案中,样品容器还包括样品制备区,样品制备区流体连接到第一阶段室,并且在步骤(d)之前,方法还包括:将样品引入样品制备区;使样品制备区与裂解装置接触
以产生裂解物;从裂解物中回收核酸;以及将回收的核酸移动到第一阶段室中。在另一方案
中,从样品中回收核酸还包括:使裂解物与多个磁珠接触;展开磁体以将磁珠与裂解物分
离;洗涤磁珠;用磁体重新捕获磁珠;使磁珠与洗脱缓冲液接触以从磁珠中释放核酸;以及
用磁体重新捕获磁珠并将洗脱的核酸与磁珠分离。
[0025] 在一个方案中,方法的步骤(f)还包括将第二核酸扩增区与温度控制元件的第一温度区、且随后与第二温度区对准,以使第二核酸扩增区中的样品热循环。
[0026] 在一个方案中,方法的步骤可在20分钟或更短、15分钟或更短、或优选地10分钟或更短的时间内完成。在另一方案中,第一核酸扩增区和第二核酸扩增区的每个热循环在8秒
或更短、6秒或更短、或优选地4秒或更短的时间内完成。
[0027] 在另一实施例中,描述了一种用于热循环样品的仪器,样品被设置在柔性样品容器中。该仪器包括:第一加热器,邻近柔性样品容器的第一部分,用于将样品的第一部分调
节至第一温度;第二加热器,邻近柔性样品容器的第二部分,用于将样品的第二部分调节至
第二温度,第二温度不同于第一温度;以及擦拭器元件,其将样品的第一部分移动到柔性样
品容器的第二部分,同时将样品的第二部分移动到柔性样品容器的第一部分,使得样品的
各部分同时地受到每个加热器的控制。在一个方案中,擦拭器元件包括叶片,叶片将样品分
成至少两个不连续的区段,至少两个不连续的区段包括至少第一区段和第二区段,使得第
一部分被包含在第一区段中而第二部分被包含在第二区段中。在一个方案中,擦拭器元件
将样品的部分重复地移动到样品容器的相对部分以热循环样品。
[0028] 在另一实施例中,描述了一种用于热循环样品的仪器。该仪器包括:接受器,用于定位柔性样品容器,柔性样品容器在仪器中具有至少第一反应室;加热器组件,包括第一加
热元件和第二加热元件;以及平移器,机械地联接到接受器中、柔性样品容器或加热器组件
中的至少一个,以使第一反应室相对于加热器组件的第一加热元件和第二加热元件横向对
准,使得第一反应室处于第一加热元件或第二加热元件中的至少一个的温度控制下。其中,
仪器被构造成使第一反应室与第一加热元件、且随后与第二加热元件重复地对准,以在至
少一个反应室中热循环流体样品。
[0029] 在又一实施例中,描述了一种热循环系统。该热循环系统包括:接受器,用于在其中接收柔性样品容器,柔性样品容器具有第一阶段室,第一阶段室包括待热循环的样品;加
热元件,包括被定位于柔性样品容器的第一侧上的至少第一温度区和第二温度区;以及擦
拭器元件,被定位于样品容器的第二侧上,擦拭器元件构造成用于接触第一阶段室以将样
品分成至少第一部分和第二部分。其中,接受器、加热元件、擦拭器元件或柔性样品容器中
的一个或多个能移动,使得移动将第一阶段室相对于擦拭器元件和加热元件的第一温度区
和第二温度区对准,并且其中,擦拭器元件被构造成邻近第一阶段室旋转,以将样品的第一
部分移动到第二部分,同时将样品的第二部分移动到第一部分,使得第一部分和第二部分
处于加热元件的第一温度区和第二温度区的温度控制下。
[0030] 在又一实施例中,描述了一种用于热循环样品的仪器。该仪器包括:接受器,用于定位柔性样品容器。在一个实施例中,柔性样品容器包括第一阶段室和第二阶段反应室,其
具有第二阶段反应孔的阵列。仪器还包括加热元件,加热元件包括至少第一温度区和第二
温度区,其中,接受器、样品容器或加热元件中的一个或多个能移动,使得移动将第一阶段
室和第二阶段反应室相对于加热元件对准;并且其中,接受器和加热元件被构造成允许加
热元件首先加热第一阶段室和然后加热第二阶段反应室,以在第一阶段室中进行热循环和
核酸扩增,然后在第二阶段室中进行热循环和核酸扩增。
[0031] 在一个方案中,仪器还包括擦拭器元件,擦拭器元件具有至少一个叶片,至少一个叶片被构造成接触第一阶段室并将第一阶段室分成至少第一容积和第二容积。其中,加热
元件在第一阶段室下方对准,使得第一容积位于第一温度区上方,第二容积位于第二温度
区上方,并且其中,擦拭器元件被构造成旋转以将第一容积移动到第二温度区,同时将第二
容积移动到第一温度区,使得第一容积和第二容积在每个温度区的控制下。
[0032] 在又一实施例中,描述了一种用于热循环样品的仪器。该仪器包括:接受器,用于在仪器中定位柔性样品容器。在一个方案中,柔性样品容器包括至少一个反应室。仪器还包
括加热器组件,加热器组件包括第一加热元件、第二加热元件和第三加热元件。其中,第一
加热元件和第三加热元件保持在高于第二加热元件的温度,并且其中,仪器被构造成使至
少一个反应室与第一加热元件、第二加热元件和第三加热元件对准,用于在至少一个反应
室中热循环流体样品。在一个方案中,第一加热元件和第三加热元件的温度被设定在约90
℃-110℃的范围内,第二加热元件的温度被设定到约55℃-65℃的温度。
[0033] 在又一实施例中,描述了一种前述段落中描述的仪器的聚合酶链式反应方法,该方法包括:(a)提供包括至少一个反应室的样品容器,(b)将样品引入反应室,其中,样品包
括靶核酸、用于扩增靶核酸的至少一种引物、和热稳定DNA聚合酶,(c)将样品容器插入仪
器,(d)将第一加热元件与反应室对准,然后将第二加热元件与反应室对准,然后将第三加
热元件与反应室对准,其中,第一加热元件和第三加热元件被设定在变性温度,第二加热元
件被设定在退火温度,并且其中,步骤(d)包括变性、退火和伸长/变性循环其中之一。该方
法还包括以选定的循环数(至少一次)重复步骤(d),以实现核酸扩增。
[0034] 在又一实施例中,描述了一种用于扩增核酸的仪器。核酸在样品容器中被提供,其中,核酸被构造在阵列中。该仪器包括:开口;用于接收样品容器;多个加热器,每个加热器
被设置在不同的温度下;以及移动器,用于将加热器按顺序地移动到邻近开口的位置,使得
仅处在该位置的加热器控制样品容器中的核酸的温度。在一个方案中,样品容器还包括用
于扩增核酸的组分,而且多个加热器至少包括处于退火温度的第一加热器和处于变性温度
的第二加热器。在另一方案中,多个加热器还包括处于伸长温度的第三加热器。
[0035] 在又一实施例中,描述了一种用于进行PCR的方法。该方法包括:(a)在样品器皿中提供PCR混合物,PCR混合物具有体积;(b)热循环第一循环次数,第一循环次数中的每一次
具有第一循环时间;(c)将样品容器中的PCR混合物的体积减少至第二体积,第二体积小于
第一体积;以及(d)热循环第二循环次数,第二循环次数中的每一次具有第二循环时间,第
二循环时间短于第一循环时间。在一个方案中,方法还包括:(e)将样品容器中的PCR混合物
的体积减少至第三体积,第三体积小于第二体积;以及(f)热循环第三循环次数,第二循环
次数中的每一次具有第三循环时间,第三循环时间短于第二循环时间。
[0036] 在又一实施例中,描述了一种扩增样品中核酸的方法。该方法包括:将流体样品引入容器的样品隔室中,流体样品包括靶核酸和用于扩增靶核酸的试剂;将容器引入加热设
备中,加热设备包括第一加热器、第二加热器和用于在样品隔室内移动流体样品的移动器
(例如,擦拭器或压扁器),第一加热器被设定到第一温度,第二加热器被设定到第二温度,
第一温度大于第二温度,样品隔室的第一部分被设置成邻近第一加热器,使得第一加热器
在样品隔室的第一部分上展示热控制,样品隔室的第二部分被设置成邻近第二加热器,使
得第二加热器在样品隔室的第二部分上展示热控制;以及选择性地在样品隔室的第一部分
与样品隔室的第二部分之间移动流体样品的至少一部分,使得样品的部分同时受每个加热
器的控制。
[0037] 在又一实施例中,描述了一种扩增样品中核酸的方法。该方法包括:(a)将流体样品引入容器的第一隔室中,流体样品包括靶核酸和用于扩增靶核酸的试剂,其中,第一隔室
处于第一加热器的控制下,第一加热器被设定在低于退火温度的温度(低退火温度);(b)将
第一加热器的温度升高至退火温度;(c)将流体样品移动到容器的第二隔室中,其中,第二
隔室在第二加热器的控制下,第二加热器被设定在高于伸长温度的温度(高伸长温度),并
在将流体样品移动到第二隔室中之后,降低第一加热器的温度达到低退火温度;(d)将第二
加热器的温度降低到伸长温度;(e)将第二加热器的温度升高到至少变性温度;以及(f)重
复步骤(a)至(e)。在一个方案中,当重复步骤(a)时,将第二加热器的温度移动到高伸长温
度。在一个方案中,步骤(e)包括将第二加热器的温度升高到高于变性温度的温度,并且一
旦流体样品达到变性温度就重复步骤(a)。
[0038] 在又一实施例中,提供了用于热循环样品的另一种仪器,该样品被设置在柔性样品容器中,该柔性样品容器具有至少一个第一阶段室。在一个实施例中,该仪器包括:接受
器,用于在仪器中定位柔性样品容器;加热元件,包括至少第一温度区和第二温度区。其中,
接受器和加热元件中的一个或多个能移动,使得移动将第一阶段室相对于加热元件的第一
温度区和第二温度区定位;并且其中,接受器和加热元件被构造成允许第一温度区和第二
温度区,以控制第一阶段室的温度以实现其中的热循环和核酸扩增。
[0039] 在一个方案中,加热元件可被定位在第一阶段室下方,使得样品的第一部分可以被定位在第一温度区上,并且样品的第二部分可以被定位在第二温度区上。该仪器还包括
具有擦拭器的混合部件,该擦拭器具有至少一个叶片,该叶片可被构造成接触第一阶段室
并旋转以将样品的第一部分移动到第二温度区,同时将样品的第二部分移动到第一温度
区,使得样品的第一部分和第二部分可以在每个温度区的控制下,以实现第一阶段室内容
物的热循环和核酸扩增。
[0040] 在另一个方案中,柔性样品容器可以包括样品制备区,其例如可以裂解样品中的细胞并且可以回收核酸用于在第一阶段室中扩增。在另一方案中,柔性样品容器可包括处
在第一阶段室下游的第二核酸扩增区。第二核酸扩增区可以被构造成从第一阶段室接收一
部分稀释的扩增产物,并进一步在孔的阵列中,以用于测定样品的内容物的特定的引物组
来扩增稀释的扩增产物。
[0041] 在又一实施例中,描述了用于扩增样品中核酸的另一种仪器。该仪器包括:开口,用于接收柔性样品容器,柔性样品容器包括至少一个反应区;以及多个加热器,其中,每个
加热器被构造成设定在不同的温度,并且其中,这些加热器被定位在基本上平面的安装座
上,使得每个加热器能够与至少一个反应区按顺序地对准以加热或冷却其中的样品。在一
个方案中,基本上平面的安装座包括圆形安装座,圆形安装座被构造成邻近柔性样品容器
旋转。
[0042] 本文所述的仪器和方法可包括或被构造成用于柔性样品容器中的第二阶段PCR产物的自动化样品制备、第一阶段PCR、第二阶段PCR和自动分析。例如,接受器、加热元件或混
合部件中的一个或多个可相对于柔性样品容器定位,用于加热和冷却的样品制备、第一阶
段PCR和第二阶段PCR。
[0043] 在又一实施例中,描述了一种柔性样品容器。该柔性样品容器包括:反应室,具有多个反应孔的阵列,其中,阵列的每个孔流体连接到能选择性打开且能选择性密封的填充
通道;以及填充孔。在一个方案中,填充孔流体连接到孔填充通道,孔填充通道在阵列的孔
附近和上方流动,其中,孔填充通道通过在邻近阵列的孔的层中形成切口以及在第二层中
形成另一切口来形成。在另一方案中,填充孔流体连接到孔填充通道,孔填充通道流入阵列
的孔中,其中,孔填充通道通过在第一层中形成切口来形成,切口将填充孔流体连接到阵列
的孔。
[0044] 本发明的附加特征和优点将在以下描述中提出或者可以从本发明的实施中了解。通过所附权利要求书中特别指出的工具和组合,可以实现并获得本发明这些实施例的特征
和优点。这些和其它特征将在下文说明书和所附权利要求的描述中变得更加显而易见,或
者可以通过实施下文提出的这些示例来了解。
附图说明
[0045] 为了描述获得本发明上述和其它优点和特征的方式,参考附图中所示的具体实施例对上述简要描述的内容进行更详细地描述。应当理解这些附图仅描绘了本发明的典型实
施例,所以不认为是对其范围的限制,通过附图的使用借助附加特征和细节对本发明进行
描述和解释,其中:
[0046] 图1示出了可用于独立式(self-contained)PCR的柔性袋。
[0047] 图2是根据本发明示例性实施例的与图1的袋一起使用的、包括图1的袋的仪器的立体分解图。
[0048] 图3示出了图2的仪器的局部剖视图,该仪器包括图2的囊袋(bladder)部件,且图1的袋以虚线示出。
[0049] 图4示出了在图2的仪器的一个说明性实施例中使用的电机
[0050] 图5A-图5B示出了PCR的均衡范式(图5a)和动力学范式(图5b)的说明性。实心黑色表示变性,条纹表示退火,而实心白色表示热循环期间核酸的延伸。
[0051] 图6是用于图2的仪器的第一阶段PCR的替代加热实施例的分解图。
[0052] 图7是图6的加热格式(format)的顶视图。
[0053] 图8A-图8D示出了根据本公开的一个实施例的图7的横截面视图,并且还示出了擦拭器(wiper)可如何接触流体填充的泡罩(blister)。
[0054] 图9A-图9C类似于图7,但示出了擦拭器的替代实施例。
[0055] 图10示出了可与图6-图9C中所示的热循环实施例一起使用的擦拭系统的实施例。
[0056] 图11A和图11B示出了根据本公开的一个实施例的擦拭器头。
[0057] 图12A和图12B示出了根据本公开的一个实施例的热循环仪器,其包括擦拭系统和包括至少两个温度区的加热器。
[0058] 图13A和图13B示出了根据本公开的一个实施例的另一种热循环仪器,其包括擦拭系统和包括至少两个温度区的加热器。
[0059] 图14A示出了可用于独立式PCR的柔性袋。
[0060] 图14B示出了图14A的袋沿着线B-B的局部剖视图。
[0061] 图15A是可被包括在图14A的袋中的第二阶段PCR阵列的示意图。
[0062] 图15B是沿着线B-B的图15A的阵列的剖视图,示出了阵列的一个孔(well,井)和用于填充该孔的一系列通道。
[0063] 图15C是图15A的阵列的剖视图,示出了阵列的一个孔和用于填充该孔的替代系统。
[0064] 图16A-图16F示出了可以由具有图14A的袋的图13A和图13B的仪器执行的用于制备和扩增核酸的一系列操作的示例。
[0065] 图17示意性地示出了可以包括在图12A和图12B以及图13A和图13B的热循环仪器中的加热器系统。
[0066] 图18是用于图2的仪器的第二阶段PCR的替代加热实施例的立体图。
[0067] 图19示出了与使用标准板基的热循环仪的扩增相比,使用图6-图8的仪器的原型(prototype)进行扩增的结果。
[0068] 图20示出了第二阶段PCR Cp的曲线图(graph),其由在热循环仪(圆形)和原型擦拭器叶片装置(正方形)中运行第一阶段PCR的不同循环数而产生。
[0069] 图21示出了使用两个加热器的三温度PCR方案的加热轮廓。延伸/变性加热器温度示出为实线,退火加热器温度示出为虚线,样品温度示出为点划线。
[0070] 图22示出了使用用于第一阶段扩增的类似于图6-图8或图12A-图13B的仪器的原型仪器进行多重扩增的DNA解链曲线(DNA melting curve)。在第一阶段扩增后,将扩增产
物稀释并扩增用于第二阶段PCR并在Roche LC480实时PCR仪器中解链。
[0071] 图23示出了用于第二阶段单重DNA扩增反应的实时DNA扩增数据。罗氏LC480实时PCR仪用于第一阶段PCR;来自第一阶段PCR的扩增产物被稀释、与第二阶段PCR预混合物
(master mix)混合、并被注入类似于图14A的阵列1430的阵列中,用于第二阶段扩增。使用
与参考图16E和图16F描述的第二阶段PCR程序类似的程序进行用于扩增的热循环。
[0072] 图24示出了图23的第二阶段扩增的DNA解链曲线。
[0073] 图25-图27描绘了使用类似于图13A和图13B中所示的仪器的仪器的第一阶段和第二阶段扩增的结果。图25描绘了第二阶段PCR阵列的孔中的荧光增加作为循环数的函数。图
26和图27描绘了解链实验的结果,以确保被扩增的产物是正确的产物。图26是原始解链曲
线,图27描绘了解链曲线的负一阶导数(dF/dt)。
[0074] 图28-图31示出了一系列实验的结果,这些实验被设计用于测试类似于阵列1430或阵列1500的阵列的一个或多个孔中的流体的温度响应,其中热循环程序类似于图16E和
图16F中所示的程序。图28示出了8秒循环时间(每个温度保持4秒)的温度响应,图29说明了
另一个8秒循环时间的温度响应实验,图30示出了4秒循环时间(每个温度下保持2秒)的温
度响应,图31示出了2秒循环时间(每个温度保持1秒)的温度响应。
[0075] 图32A-图32C示出了根据本公开的一个实施例的具有磁体系统的擦拭器头。
[0076] 图33示出了根据本公开的一个实施例的一对反应泡罩。
[0077] 图33A-图33C示出了与图32A-图32C的擦拭器头相互作用时的图33的反应泡罩。

具体实施方式

[0078] 以下参考附图描述示例性实施例。在不脱离本公开的精神和教导的情况下,许多不同的形式和实施例是可能的,因此本公开不应被解释为限于这里阐述的示例性实施例。
相反,提供这些示例性实施例是为了使本公开更加彻底和完整,并且将本公开的范围传达
给本领域技术人员。在附图中,为了清楚起见,可以夸大层和区域的尺寸和相对尺寸。在整
个说明书中,相同的附图标记表示相同的元件。
[0079] 除非另有限定,否则本文所使用的所有术语(包括技术和科学术语)都具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。将进一步理解的是,诸如在常用词典中限定的那些术语
应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义,并且除非在此
明确定义,否则不应以理想化或过于正式的意义解释。本文中对本发明的描述中使用的术
语仅用于描述特定实施例的目的,而并非意在限制本发明。虽然可以使用与本文所述相似
或等同的多种方法和材料实施本发明,但是本文仅描述了某些示例性的材料和方法。
[0080] 本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其他参考文献均以引用的方式整体并入。在用词冲突的情况下,以本说明书为准。
[0081] 参考一个或多个示例性实施方式对本发明的包括设备、系统、方法等各种技术方案进行描述。正如本文所述,术语“示例性”和“说明性”是指“用作示例、实例或描述”,并且不应被解释为比本发明所公开的其它实施例更优选或更有利。另外,对本发明的“实施方
式”或“实施例”的引用包括对一个或多个具体的实施例的引用,反之亦然,并且旨在不限制
本发明范围(由所附权利要求而非以下说明书的内容指示)的前提下提供示例性实施例。
[0082] 应当注意的是正如在本说明书和所附权利要求中所使用的,除非另有明确指示,否则单数形式“一个”和“该”包括复数指示物。因此,例如,提及“瓦片(tile)”包括一个、两个或更多瓦片。类似地,除非内容和/或上下文有明确指示,否则提及多个指示物应被解释
为包括单个指示物和/或多个指示物。因此,提及“多个瓦片”不一定需要多个这样的瓦片。
替代地,将理解的是此处应当独立于关联(conjugation)来考虑一个或多个瓦片。
[0083] 如在本申请全文所使用的,词语“能”和“可以”以允许的意思(即,意思是具有潜在的)而不是强制的意思(即,意思是必须)使用。此外,术语“包括”、“具有”、“涉及”、“包含”、“特征在于”等以及说明书包括权利要求书中所使用的类似术语应当是包容和/或开放的,
应当如词语“包括”及其变型一样具有相同的意思,而排除附加的、未引用的元件或方法步
骤。
[0084] 如本文所使用的,方向和/或任意术语,例如“顶”、“底”、“左”、“右”、“上”、“下”、“较高”、“较低”、“内”、“外”、“内部的”、“外部的”、“内部”、“外部”、“近端的”、“远端的”、“向前的”、“向后的”以及类似的表达可以单独用于指示相对方向和/或取向而不意欲限制本发明包括说明书、发明和/或权利要求的范围。
[0085] 应理解的是,当一个元件被称为“联接”、“连接”或“响应”于另一个元件或“在另一个元件上”时,它可以直接联接、连接或响应于另一个元件,备选地,也可以在其他元件或中间元件上。相反,当一个元件被称为“直接联接”、“直接连接”或“直接响应”于另一个元件或“直接在另一个元件上”时,则不存在中间元件。
[0086] 本文参考剖视图描绘了本发明构思的示例性实施例,这些剖视图是示例性实施例的理想化实施例(和中间结构)的示意图。因此,可以预期由于例如制造技术和/或公差导致
的图示形状的变化。因此,本发明构思的示例性实施例不应被解释为限于本文示出的区域
的特定形状,而是包括例如由制造导致的形状偏差。因此,附图中示出的区域本质上是示意
性的,并且它们的形状并非旨在示出装置的区域的实际形状,并且并非旨在限制示例性实
施例的范围。
[0087] 应理解的是,尽管本文可以使用术语“第一”、“第二”等来描述各种元件,但是这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件与另一个元件。因此,在不脱离
本实施例的教导的情况下,“第一”元件可以被称为“第二”元件。
[0088] 还应理解的是,还应当理解的是在不脱离本发明的范围的情况下,本文所描述的各种实施方式可以与所描述或公开的任何其他实施方式相结合使用。因此,根据本发明的
某些实施方式所述的产品、构件、元件、设备、装置、系统、方法、工艺、组合物和/或套件在不脱离本发明范围的情况下可包含、具有或包括在其它实施方式(包括系统、方法、装置和/或
类似物)中描述的特征、性质、组件、构件、元件、步骤和/或类似方式。因此,提及与一个实施
方式有关的具体特征不应被解释为仅在该实施例中限制本申请。
[0089] 本文使用的标题仅用于编排的目的,并不意味着用于限制说明书或权利要求书的范围。为了便于理解,如有可能,相同的附图标记用来指代附图中共用的相同元件。此外,如
有可能,相同的元件的附图标记已经在多个附图中使用。此外,特定元件的可替代构造每一
个可包括附加到元件附图标记的单独的文字。
[0090] 术语“约”在本文中用于表示近似于、在……的区域、大致、或大约。当术语“约”与数值范围结合使用时,它通过扩展上述数值的上下边界来修改该范围。通常,术语“约”在本
文中用于将数值修改为所述值之上和之下的5%的方差。当表达这样的范围时,另一个实施
例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地,当通过使用先行词“约”将值表示为近
似值时,应理解的是,该特定值形成另一个实施例。将进一步理解的是,每个范围的端点相
对于另一个端点都是重要的,并且独立于另一个端点。
[0091] 这里使用的词语“或”表示特定列表中的任何一个成员,并且还包括该列表的成员的任何组合。
[0092] “样品”指的是:动物;来自动物的组织或器官;细胞(在研究对象(subject)体内、直接取自研究对象、或保持在培养物中的细胞或来自培养出的细胞系);细胞裂解物(或裂
解物部分)或细胞提取物;含有一种或多种衍生自细胞、细胞材料或病毒材料(例如多肽或
核酸)的分子的溶液;或含有非天然存在的核酸的溶液,其如本文所述地被测定。样品也可
以是任何体液或排泄物(例如,但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁或脑脊髓液),其
可能含有或不含有宿主或病原体细胞、细胞组分或核酸。样品还可以包括环境样品,例如但
不限于土壤、水(淡水废水等)、空气监测系统样品(例如,在空气过滤介质中捕获的材料)、
表面拭子(swab)、和带菌者(例如,蚊子、蜱虫、跳蚤等)。
[0093] 本文使用的短语“核酸”是指:天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸,无论是DNA还是RNA或DNA-RNA杂合体,单链或双链,有义或反义,其能够通过Watson-Crick基配
对杂交成互补核酸。本发明的核酸还可包括核苷酸类似物(例如BrdU)和非磷酸二酯核苷间
键(例如肽核酸(PNA)或硫代二酯键)。特别地,核酸可包括但不限于DNA、RNA、mRNA、rRNA、
cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。
[0094] “探针”、“引物”或“寡核苷酸”是指具有确定序列的单链核酸分子,其可以与含有互补序列的第二核酸分子(“靶”)碱基配对。所得杂交体的稳定性取决于长度、GC含量和所
发生的碱基配对的程度。碱基配对的程度受诸如探针与靶分子之间的互补程度以及杂交条
件的严格程度等参数的影响。杂交严格程度受诸如温度、盐浓度和有机分子(如甲酰胺)的
浓度等参数的影响,并且通过本领域技术人员已知的方法测定。探针、引物和寡核苷酸可通
过本领域技术人员熟知的方法被放射性地、荧光地或非放射性地可检测地标记。dsDNA结合
染料可用于检测dsDNA。应理解的是,“引物”特别被构造为通过聚合酶延伸,而“探针”或“寡核苷酸”可以被如此构造或不被如此构造。
[0095] “dsDNA结合染料”是指当与双链DNA结合时,相比于当与单链DNA结合或在溶液中游离时,通常通过更强烈地发荧光而差异地发荧光的染料。虽然参考了dsDNA结合染料,但
应理解的是,本文可使用任何合适的染料,其中一些非限制性说明性染料在美国专利第7,
387,887号中描述,其通过引用并入本文。其他产生信号的物质可用于检测核酸扩增和解
链,例如如本领域已知的,酶、抗体等。
[0096] “特异性杂交”是指探针、引物或寡核苷酸在高度严格条件下识别并与基本上互补的核酸(例如,样品核酸)物理相互作用(即,碱基配对),并且基本上不与其他核酸碱基配
对。
[0097] “高度严格条件”通常意指在约5℃的解链温度(Tm)下(即比探针的Tm低5°)发生。功能上,高度严格条件用于鉴定具有至少80%序列一致性的核酸序列
[0098] 尽管PCR是本文实施例中使用的扩增方法,但应理解的是,使用引物的任何扩增方法可能是合适的。这些合适的方法包括聚合酶链式反应(PCR);链替代扩增(SDA);基于核酸
序列的扩增(NASBA);级联滚环扩增(CRCA),环媒介导DNA恒温扩增(LAMP);等温和嵌合引物
启动的核酸扩增(ICAN);基于靶的解旋酶依赖性扩增(HDA);转录介导的扩增(TMA)等。因
此,当使用术语PCR时,应理解为包括其他替代的扩增方法。对于没有不连续的循环的扩增
方法,可以使用反应时间,其中以循环、倍增时间或交叉点(Cp)进行测量,并且可以添加额
外的反应时间,其中在本文描述的实施例中添加额外的PCR循环。应理解的是,可能需要相
应地调节方案。
[0099] 虽然本文的各种实施例涉及人类靶和人类病原体,但这些实施例仅是说明性的。本文描述的方法、套件和装置可用于检测和测序来自多种样品(包括人、兽医、工业和环境)
的多种核酸序列。
[0100] 本文公开的各种实施例使用独立式核酸分析袋来测定样品中各种生物物质的存在,说明性地为抗原和核酸序列,说明性地在单个封闭系统中。在美国专利第8,394,608号、
第8,895,295号、以及美国专利申请第2014-0283945号(在此引入作为参考)中更详细地公
开了这种系统,其包括袋和用于与袋一起使用的仪器。然而,应理解的是,这种袋仅是说明
性的,并且本文所讨论的核酸制备和扩增反应可以使用如本领域已知的各种核酸纯化和扩
增系统在本领域已知的各种开放或封闭系统样品器皿(包括96孔板、其他构造的板、阵列、
转盘等)中的任何一种中进行。虽然本文使用了术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”等,但这些术语指的是包围孔、管和各种其他反应容器,如在这些扩增系统中使用的那样。在一个
实施例中,袋用于测定多种病原体。袋可包括说明性地在封闭系统中用作样品孔的一个或
多个泡罩。说明性地,可以在任选的一次性袋中进行各种步骤,包括核酸制备、初级大体积
多重PCR、初级扩增产物的稀释和次级PCR,并通过可选的实时检测或扩增后分析(例如解链
曲线分析)告终。此外,应理解的是,虽然可以在本发明的袋中执行各种步骤,但是对于某些
用途可以省略一个或多个步骤,并且可以相应地改变袋构造。
[0101] 图1示出了可以在各种实施例中使用或者可以针对各种实施例重新构造的说明性的袋510。袋510类似于美国专利第8,895,295号的图15,其中相同的项目标记相同的附图标
记。配件(fitment)590设置有入口通道515a至515l,其也用作试剂储存器或废物储存器。说
明性地,试剂可以在配件590中冷冻干燥并在使用前再水合(rehydrated)。泡罩522、544、
546、548、564和566以及它们各自的通道514、538、543、552、553、562和565类似于美国专利
第8,895,295号的图15的相同附图标记的泡罩。图1的第二阶段反应区580类似于美国专利
申请第8,895,295号的第二阶段反应区,但是高密度阵列581的第二阶段孔582以稍微不同
的图案布置。图1的高密度阵列581的更圆形图案消除了拐处的孔并且可使第二阶段孔
582得到更均匀填充。如图所示,高密度阵列581设置有102个第二阶段孔582。袋510适用于
仪器(BioFire Diagnostics,LLC,盐湖城,UT)。然而,应理解的是,袋实施例
仅是说明性的。
[0102] 虽然可以使用其他容器,但是说明性地,袋510可以由两层柔性塑料膜或其他柔性材料(例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、混合
物、组合物、和可以通过本领域已知的任何方法(包括挤出、等离子体沉积和层压)制备的上
述材料的层)形成。例如,每层可以由单一类型或者层压在一起的多于一种类型的一层或多
层材料构成。也可以使用具有层压的金属箔或塑料。本领域已知的其他挡板材料可以密
封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料膜,则可以通过热密封件将这些层结合在一起。
说明性地,该材料具有低核酸结合能力。
[0103] 对于采用荧光监测的实施例,优选的是吸光度足够低且在工作波长下自发荧光的塑料膜。可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合比例以及不同厚度的膜来识别这
种材料。对于具有铝或其他箔层压的塑料,由荧光检测装置读取的袋的部分可以没有箔。例
如,如果在袋510的第二阶段反应区580的第二阶段孔582中监测荧光,那么将在孔582处留
下没有箔的一个或两个层。在PCR的示例中,由约0.0048英寸(0.1219mm)厚的聚酯(Mylar,
DuPont,WilmingtonDE)和0.001英寸-0.003英寸(0.025mm-0.076mm)厚的聚丙烯膜组成的
膜层压表现良好。说明性地,袋510可以由能够透射大约80%-90%的入射光的透明材料制
成。
[0104] 在说明性实施例中,通过在泡罩和通道上施加压力(说明性地,气压)使材料在泡罩之间移动。因此,在采用压力的实施例中,袋材料说明性地足够柔韧以允许压力具有期望
的效果。术语“柔性”在本文中用于描述袋的材料的物理特性。术语“柔性”在本文中被限定
为易于借助本文所用的压力水平变形而不会破裂、破坏、开裂等。例如,薄的塑料片(例如
SaranTM包装和 袋子)以及薄金属箔(例如铝箔),是柔性的。然而,即使在采用气压
的实施例中,仅泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外,只要泡罩和通道易于变形,泡
罩和通道的仅一侧就需要是柔性的。袋510的其他区域可以由刚性材料制成,或者可以用刚
性材料加固。因此,应理解的是,当使用术语“柔性袋”或“柔性样品容器”等时,仅袋或样品
容器的部分需要是柔性的。
[0105] 说明性地,塑料膜可以用于袋510。可以研磨或以其他方式切割金属片(示例性地为铝或其他合适的材料),以产生具有凸起表面图案的模具(die)。当适配到气动压力机(说
明性地为A-5302-PDS,简斯维尔工具公司,MiltonWI)时,说明性地在195℃的操作温度下调
节,气动压力机像印刷机一样工作,熔化塑料膜的密封表面,模具仅在此处接触膜。同样地,
可以使用激光切割焊接装置将用于袋510的一个或多个塑料膜切割并焊接在一起。随着
袋510的形成,诸如PCR引物(示例性地点在膜上并干燥)、抗原结合基质、磁珠和酸锆珠的
各种组分可以密封在各种泡罩内。用于样品处理的试剂可以在密封之前集中地或分开地点
在膜上。在一个实施例中,核苷酸三磷酸(NTP)与聚合酶和引物分开点在膜上,基本上消除
了聚合酶的活性,直到反应可以被含水样品水合。如果含水样品在水合之前已经加热,则这
为真正的热启动PCR创造了条件,并减少或消除了对昂贵的化学热启动组分的需求。在另一
个实施例中,组分可以以粉末或丸剂形式提供,并在最终密封之前被放入泡罩中。
[0106] 袋510可以以与美国专利第8,895,295号中描述的方式类似的方式使用。在一个说明性实施例中,可将包括待测试样品(100μl)和裂解缓冲液(200μl)的300μl混合物注入进
入通道515a附近的配件590中的注射端口(未示出),并且样品混合物可以被吸引到进入通
道515a。水也可以被注入到邻近入口通道515l的配件590的第二注射端口(未示出)中,并且
通过配件590中设置的通道(未示出)分配,从而水合多达十一种不同的试剂,每种试剂均在
进入通道515b至515l处以干燥形式先前提供。用于注射样品和水合流体(例如水或缓冲液)
的说明性方法和装置在美国专利申请第2014-0283945号中公开,其全部内容通过引用并入
本文,但应理解的是,这些方法和装置仅是说明性的,并且将样品和水合流体引入袋510的
其他方式也在本公开的范围内。这些试剂说明性地可包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试
剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其他化学个体。说明性地,试剂用于核酸提取、第一阶段多重
PCR、多重反应的稀释、第二阶段PCR试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施例中,所有
需要注入的是一个注射端口中的样品溶液和另一个注射端口中的水。注射后,可以密封两
个注射端口。有关袋510和配件590的各种构造的更多信息,请参见美国专利第8,895,295
号,其已通过引用并入本文。
[0107] 注射后,样品可以经由通道514从注射通道515a移动到裂解泡罩522。裂解泡罩522设置有珠或颗粒534(例如陶瓷珠或其他研磨元件),并且被构造用于使用 仪
器内提供的旋转叶片或拨片通过撞击进行涡旋。在诸如硅酸锆(ZS)珠534的裂解颗粒的存
在下,通过样品的摇动、涡旋、声处理和类似处理,珠磨是形成裂解物的有效方法。应理解的
是,如本文所使用的,诸如“裂解”、“进行裂解”和“裂解物”之类的术语不限于破裂细胞,这些术语还包括非细胞颗粒(例如病毒)的破坏。
[0108] 图4示出了珠打浆电机819,其包括叶片821,叶片821可被安装在图2中所示的仪器800的支撑构件802的第一侧811上。叶片可延伸穿过狭槽804以接触袋510。然而,应理解的
是,电机819可以安装在仪器800的其他结构上。在一个说明性实施例中,电机819是安装在
支撑构件802上的万宝至(Mabuchi)RC-280SA-2865DC电机(日本千叶)。在一个说明性实施
例中,电机以5,000rpm至25,000rpm转动,更具说明性地以10,000rpm至20,000rpm转动,并
且更具说明性地以约15,000rpm至18,000rpm转动。对于万宝至电机,已发现7.2V提供足够
的rpm用于裂解。然而,应理解的是,当叶片821撞击袋510时,实际速度可能稍微慢一些。根
据所使用的电机和桨叶,其他电压和速度可用于裂解。任选地,可以将受控的小体积空气提
供到邻近裂解泡罩522的囊袋822中。已经发现,在一些实施例中,用一个或多个小体积空气
部分填充相邻囊袋有助于在裂解过程中定位和支撑裂解泡罩。备选地,其他结构(说明性地
是裂解泡罩522周围的刚性或柔性垫圈或其他保持结构)可用于在裂解期间约束袋510。还
应理解的是,电机819仅是说明性的,并且其他装置可用于铣削、摇动或涡旋样品。在一些实
施例中,除了机械裂解之外或代替机械裂解,可以使用化学品或热量。
[0109] 一旦样品材料已经被充分裂解,样品就被移动到核酸提取区,说明性地通过通道538、泡罩544和通道543,到达泡罩546,其中样品与核酸结合物质(例如化硅涂覆的磁
珠533)混合。备选地,磁珠533可以再水合,说明性地使用从进入通道515c-515e中的一个所
提供的流体,然后通过通道543移动到泡罩544,然后通过通道538到达泡罩544。混合物允许
被培育适当的时间长度,例如约10秒至10分钟。位于仪器内邻近泡罩546的可伸缩磁体从溶
液中捕获磁珠533,形成抵靠泡罩546内表面的小球(pellet)。如果在泡罩522中进行培育,
则可能需要将溶液的多个部分移动到泡罩546用于捕获。然后将液体从泡罩546中移出并通
过泡罩544返回并进入泡罩522,该泡罩522现在用作废物接受器。来自一个或多个注射通道
515c至515e的一个或多个洗涤缓冲液经由泡罩544和通道543提供至泡罩546。可选地,通过
从泡罩544和546经由通道543来回移动珠来收缩磁体并清洗磁珠533。一旦磁珠533被清洗,
则通过激活磁体将磁珠533重新捕获在泡罩546中,然后将洗涤溶液移动到泡罩522。可以根
据需要重复该过程以洗涤裂解缓冲液和来自核酸结合磁珠533的样品碎片。
[0110] 洗涤后,将储存在注射通道515f中的洗脱缓冲液移动到泡罩548,并使磁体缩回。溶液经由通道552在泡罩546与548之间循环,破坏泡罩546中的磁珠533的小球,并使捕获的
核酸从珠上解离并进入溶液。再次激活磁体,捕获泡罩546中的磁珠533,并将洗脱的核酸溶
液移动到泡罩548中。
[0111] 将来自注射通道515g的第一阶段PCR预混合物与泡罩548中的核酸样品混合。任选地,通过经由通道553将混合物强制在泡罩548与564之间来混合混合物。经过几个循环的混
合后,溶液被包含在泡罩564中,其中设有第一阶段PCR引物的小球,用于每个靶的至少一组
引物,且进行第一阶段多重PCR。如果存在RNA靶,则可以在第一阶段多重PCR之前或同时进
行RT步骤。 仪器中的第一阶段多重PCR温度循环说明性地进行15-20个循环,
尽管根据具体应用的要求,可能需要其他水平的扩增。如本领域已知的,第一阶段PCR预混
合物可以是各种预混合物中的任何一种。在一个说明性示例中,第一阶段PCR预混合物可以
是US2015/0118715中公开的任何化学品,其通过引用并入本文,用于以每个循环花费20秒
或更少时间的PCR方案使用。
[0112] 在第一阶段PCR进行所需数量的循环后,样品可以被稀释,例如通过迫使大部分样品回到泡罩548中,仅在泡罩564中留下少量,并添加来自注射通道515i的第二阶段PCR预混
合物。备选地,可以将来自515i的稀释缓冲液移动到泡罩566,然后通过在泡罩564与566之
间来回移动流体而与泡罩564中的扩增样品混合。如果需要,可以使用来自注射通道515j和
515k的稀释缓冲液重复稀释数次,或注射通道515k可以被保留,说明性地,用于测序或用于
其他PCR后分析,然后将来自注射通道515h的第二阶段PCR预混合物添加到部分或全部稀释
的扩增样品中。应理解的是,可以通过改变稀释步骤的数量或通过改变在与稀释缓冲液或
包括用于扩增的组分的第二阶段PCR预混合物混合之前丢弃的样品的百分比来调节稀释水
平,说明性地为聚合酶、dNTP和适当的缓冲液,尽管其他组分可能是合适的,特别是用于非
PCR扩增方法。如果需要,样品和第二阶段PCR预混合物的这种混合物可以在移动到第二阶
段孔582之前在泡罩564中预热以进行第二阶段扩增。这种预热可以消除在第二阶段PCR混
合物中需要热启动组分(抗体、化学品或其他)。
[0113] 说明性的第二阶段PCR预混合物是不完整的,缺少引物对,并且102个第二阶段孔582中的每一个预装载有特异性PCR引物对。如果需要,第二阶段PCR预混合物可能缺少其他
反应组分,并且这些组分也可以预装载在第二阶段孔582中。每个引物对可以与第一阶段
PCR引物对相似或相同,或者可以嵌入第一阶段引物对中。样品从泡罩564移动到第二阶段
孔582完成PCR反应混合物。一旦填充了高密度阵列581,就可以通过本领域已知的任何数量
的手段将各个第二阶段反应密封在它们各自的第二阶段泡罩中。在美国专利第8,895,295
号中讨论了填充和密封高密度阵列581而没有交叉污染的说明性方法,该专利已经通过引
用并入本文。说明性地,高密度阵列581的孔582中的各种反应同时或单独地热循环,说明性
地借助一个或多个珀尔帖(Peltier)装置,尽管用于热循环的其他装置在本领域中是已知
的。
[0114] 在某些实施例中,第二阶段PCR预混合物含有dsDNA结合染料 Plus(BioFire Diagnostics,LLC)以产生指示扩增的信号。然而,应理解的是,该染料仅是说明
性的,并且可以使用其他信号,包括其他dsDNA结合染料以及荧光、放射性、化学发光、酶促
等(如本领域已知的)标记的探针。备选地,可以在没有信号的情况下提供阵列581的孔582,
通过后续处理报告结果。
[0115] 当使用气压来移动袋510内的材料时,在一个实施例中,可以采用“囊袋”。囊袋组件810,其一部分在图2-图3中示出,包括容纳多个可充气囊袋822、844、846、848、864和866
的囊袋板824,每个囊袋可以说明性地通过压缩气体源单独地充气。因为囊袋组件810可以
经受压缩气体并且多次使用,所以囊袋组件810可以由比袋更坚韧或更厚的材料制成。备选
地,囊袋822、844、846、848、864和866可以由一系列用垫圈、密封件、活塞紧固在一起的
板形成。其他布置也在本发明的范围内。备选地,阵列或机械致动器和密封件可用于密封通
道并引导流体在泡罩之间移动。可以适用于本文所述仪器的机械密封和致动器系统在美国
临时专利申请序列第62/368,095号中有详细描述,其全部内容通过引用并入本文。
[0116] 次级PCR反应的成功取决于多重第一阶段反应产生的模板。通常,使用高纯度的DNA进行PCR。诸如苯酚提取或商业DNA提取套件的方法提供高纯度的DNA。通过袋510处理的
样品可能需要调节以补偿较不纯的制剂。生物样品的组分可以抑制PCR,这是潜在的障碍。
说明性地,热启动PCR,更高浓度的Taq聚合酶,MgCl2浓度的调节,引物浓度的调节和佐剂
(例如DMSO、TMSO或甘油)的添加任选地可用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题可能更
多地是关于第一阶段扩增的问题,但应理解的是,也可以在第二阶段扩增中提供类似的调
节。
[0117] 当袋510被放置在仪器800内时,囊袋组件810被压靠在袋510的一个面上,使得如果特定的囊袋膨胀,压力就将迫使液体从袋510中的相应的泡罩中流出。除了对应于袋510
的许多泡罩的囊袋之外,囊袋组件810可具有另外的气动致动器,例如囊袋或气动驱动的活
塞,对应于袋510的各个通道。图2-图3示出了对应于袋510的通道538、543、553和565的说明
性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853和865,以及最小化回流到配件590中的密封件
871、872、873、874。当激活时,硬密封件838、843、852、853和865形成夹管阀(pinch valve)
以夹紧和关闭相应的通道。为了将液体限制在袋510的特定泡罩内,硬密封件在通向泡罩和
来自泡罩的通道上方被激活,使得致动器用作夹管阀以夹紧通道关闭。说明性地,为了在不
同的泡罩中混合两个体积的液体,密封连接通道的夹管阀致动器被激活,并且泡罩上方的
气动囊袋被交替加压,迫使液体来回通过连接泡罩的通道,以在其中混合液体。夹管阀致动
器可以具有各种形状和尺寸,并且可以被构造成一次夹紧多于一个通道。虽然本文讨论了
气动致动器,但应理解的是,可以设想向袋提供压力的其他方式,包括各种机电致动器,例
如线性步进电机,电动凸轮,由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶,辊,摇臂,在某些情况
下,翘起的弹簧。另外,除了施加垂直于通道轴线的压力之外,还有多种可逆或不可逆地关
闭通道的方法。这些包括将袋扭结穿过通道、热密封件、滚动致动器以及密封在通道中的各
种物理阀(例如蝶阀和球阀)。另外,小的珀尔帖装置或其他温度调节器可以被放置在通道
附近并且设定在足以冷冻流体的温度处,有效地形成密封。并且,虽然图1的设计适用于具
有位于每个泡罩和通道上方的致动器元件的自动化仪器,但是也可以预期致动器可以保持
静止,并且袋510可以转换成使得少数致动器可以用于若干处理站,包括样品破碎,核酸捕
获,第一和第二阶段PCR,以及用于袋510的其他应用的处理站,例如免疫测定和免疫PCR。作
用在通道和泡罩上的辊可以证明在袋510在站之间平移的构造中特别有用。因此,虽然在当
前公开的实施例中使用气动致动器,但是当在本文中使用术语“气动致动器”时,应理解的
是,可以根据袋和仪器的构造使用其他致动器和提供压力的其他方式。
[0118] 回到图2,每个气动致动器通过阀899连接到压缩空气源895。虽然图2中仅示出了若干软管878,但应理解的是,每个气动配件通过软管878连接到压缩气体源895。压缩气体
源895可以是压缩机,或,备选地,压缩气体源895可以是压缩气体气缸,例如二氧化碳气缸。
如果需要便携性,压缩气缸是特别有用。其他压缩气体源也在本发明的范围内。可以在图
12-图16的实施例中提供类似的气动控制,为了控制袋1400中的流体,可以提供其他致动
器、伺服器等。
[0119] 仪器810的若干其他部件也连接到压缩气体源895。被安装在支撑构件802的第二侧814上的磁体850说明性地使用经由软管878来自压缩气体源895的气体展开和缩回。尽管
移动磁体850的其他方法在本领域中是已知的。磁体850位于支撑构件802中的凹槽851中。
应理解的是,凹槽851可以是穿过支撑构件802的通路,使得磁体850可以接触袋510的泡罩
546。然而,根据支撑构件802的材料,应理解的是,只要当磁体850展开时,磁体850足够接近
以在泡罩546处提供足够的磁场,而当磁体850完全缩回时,磁体850不会显著影响泡罩546
中存在的任何磁珠533,凹槽851就不需要一直延伸穿过支撑构件802。尽管参考了回缩磁体
850,但应理解的是,可以使用电磁体,并且可以通过控制通过电磁体的电流来激活和停用
电磁体。因此,虽然本说明书讨论了抽出或缩回磁体,但应理解的是,上述条件宽泛至足以
与抽出磁场的其他方式结合。应理解的是,气动连接可以是气动软管或气动空气歧管,因此
减少了所需的软管或阀的数量。应理解的是,类似的磁体和用于激活磁体的方法可以用在
图12-图16的实施例中。
[0120] 气动活塞阵列869的各种气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。虽然仅示出了两个软管878将气动活塞868连接到压缩气体源895,但应理解的是,每个气动活塞
868连接到压缩气体源895。示出了十二个气动活塞868。
[0121] 一对温度控制元件被安装在支撑件802的第二侧814上。如本文所使用的,术语“温度控制元件”是指向样品添加热量或从样品移除热量的装置。温度控制元件的说明性示例
包括但不限于加热器、冷却器、珀帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加
热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器、以及它们的组合。温度控制元件可包括多个加
热器、冷却器、珀耳帖等。在一个方案中,给定的温度控制元件可包括一种以上类型的加热
器或冷却器。例如,温度控制元件的说明性示例可以包括珀耳帖装置,其具有应用于珀耳帖
的顶面和/或底面的单独的电阻加热器。虽然在整个说明书中使用术语“加热器”,但应理解
的是,可以使用其他温度控制元件来调节样品的温度。
[0122] 如上所述,第一阶段加热器886可被定位成加热和冷却泡罩564的内容物以进行第一阶段PCR。如图2所示,第二阶段加热器888可以被定位成加热和冷却袋510的阵列581的第
二阶段泡罩582的内容物,用于第二阶段PCR。然而,应理解的是,这些加热器也可以用于其
他加热目的,并且可以包括适合于特定应用的其他加热器。
[0123] 如上所述,虽然在两个或更多个温度之间热循环的珀耳帖装置对PCR有效,但在一些实施例中可能希望将加热器保持在恒定温度。说明性地,这可以用于通过消除转变加热
器温度所需的时间超过转变样品温度所需的时间来减少运行时间。而且,这种布置可以提
高系统的电效率,因为仅需要使较小的样品和样品器皿热循环,而不是更大(更多的热质
量)的珀耳帖装置。图18示出了第二阶段加热器888的替代实施例,其由加热器组件988代
替。说明性地,加热器组件988包括三个加热器930、931和932,这些加热器被设置在说明性
的圆形安装座934中,由电机933循环地驱动,由此当每个加热器顺序地移动到与阵列581相
邻的位置时,一次一个加热器接触阵列581。上面已经参考第一阶段PCR讨论了合适的加热
器的类型。说明性地,加热器930可以设定在退火温度,例如60℃,加热器931可以设定在伸
长温度,例如72℃,加热器932可以被设定在变性温度,例如94℃。然而,应理解的是,这些温
度仅是说明性的,并且可以使用其他温度和其他数量的加热器。两个加热器可能足以满足
很多个应用。在该实施例中,加热器930、931、932移动到接触阵列581。安装座934可以仅在
一个方向上移动,且每个加热器930、931、932依次接触阵列581,或者安装座可以在顺时针
和逆时针方向上移动,说明性地在每个PCR循环后改变方向。
[0124] 虽然加热器930、931、932被设置在安装座934中并且相对于阵列581移动,但应理解的是,这仅是说明性的,并且可以提供两个或更多个固定加热器,并且阵列581可以相对
于加热器旋转,如图6和图8中所示的实施例,用于第一阶段PCR。同样地,加热器可以如在例
如图12A-图13B和图17中所示的实施例中那样被线性地布置。在这样的示例中,热循环可以
通过相对于阵列平移加热器或通过相对于加热器平移阵列来完成。
[0125] 当需要荧光检测时,可以提供光学阵列890。如图2所示,光学阵列890包括光源898,说明性地为滤光的LED光源、滤光的白光或激光照射、以及相机896。相机896说明性地
具有多个光电检测器,每个光电检测器对应于袋510中的第二阶段孔582。备选地,相机896
可以拍摄包含所有第二阶段孔582的图像,并且图像可以被分成对应于每个第二阶段孔582
的单独的场。根据构造,光学阵列890可以是固定的,或者光学阵列890可以被放置在附接到
一个或多个电机的移动器上并且移动以从每个单独的第二阶段孔582获得信号。应理解的
是,其他布置也是可能的。图18中所示的第二阶段加热器的实施例在袋510与图2中所示的
加热器的相对侧上提供加热器。这种取向仅是说明性的,并且可以通过仪器内的空间约束
来确定。如果第二阶段反应区580以光学透明材料提供,则光电检测器和加热器可以在阵列
581的任一侧。
[0126] 如图所示,计算机894控制压缩空气源895的阀899,并因此控制仪器800的所有气动装置。此外,仪器中的许多气动系统在其他实施例中可以用机械致动器、压力施加装置等
代替。计算机894还控制加热器886和888,以及光学阵列890。这些组件中的每一个说明性地
通过电缆891电连接,尽管其他物理或无线连接也在本发明的范围内。应理解的是,计算机
894可以容纳在仪器800内或者可以在仪器800外部。此外,计算机894可以包括控制一些或
所有组件的内置电路板,并且还可以包括外部计算机(例如台式机或笔记本电脑),用于从
光学阵列接收和显示数据。可以提供界面,说明性地是键盘界面,其包括用于输入信息和诸
如温度、循环时间等变量的键。说明性地,还提供显示器892。例如,显示器892可以是LED、
LCD或其他这样的显示器。
[0127] 其他现有技术仪器教导处在密封的柔性容器内的PCR。参见,例如美国专利第6,645,758号和第6,780,617号,以及美国专利申请第2014/0038272号,其通过引用并入本文。
然而,包括密封的PCR器皿内的细胞裂解可以改善易用性和安全性,特别是如果待测样品可
能含有生物危害的情况下。在本文所示的实施例中,来自细胞裂解的废物以及来自所有其
他步骤的废物保留在密封的袋内。仍然,应理解的是,可以移除袋的内容物以进行进一步测
试。
[0128] 图2示出了可与袋510一起使用的说明性的仪器800。仪器800包括支撑构件802,其可形成壳体的壁或被安装在壳体内。仪器800还可包括第二支撑构件(未示出),其可选地相
对于支撑构件802移动,以允许袋510的插入和取出。说明性地,一旦袋510已插入到仪器800
中,盖子覆盖袋510。在另一个实施例中,两个支撑构件可以是固定的,且袋510通过其他
机械装置或通过气压固定到适当位置。
[0129] 在说明性示例中,加热器886和888被安装在支撑构件802上。然而,应理解的是,这种布置仅是说明性的,其他布置也是可能的。示例性加热器包括珀尔帖和其他块加热器、电
阻加热器、电磁加热器和薄膜加热器(如本领域中已知的),以热循环泡罩864和第二阶段反
应区580的内容物。具有囊袋822、844、846、848、864、866的囊板810,硬密封件838、843、852、
853和密封件871、872、873、874形成囊袋组件808,其可说明性地安装在可移动的支撑结构
上,该支撑结构可朝向袋510移动,使得气动致动器与袋510接触。当袋510插入仪器800中并
且可移动支撑构件朝向支撑构件802移动时,袋510的各种泡罩处于与囊袋组件810的各种
囊袋和组件808的各种密封件相邻的位置,使得气动致动器的激活可以推动来自袋510的一
个或多个泡罩的液体,或者可以形成具有袋510的一个或多个通道的夹管阀。在图3中更详
细地示出了袋510的泡罩和通道与组件808的囊袋和密封件之间的关系。
[0130] 通过热循环加热器886、888,PCR部分的运行时间必须至少与加热器在每次转变时达到合适温度的时间一样长。应理解的是,如果不需要改变加热器的温度,则可以减少运行
时间。图6-图8示出了第一阶段PCR扩增的另一个实施例。在该说明性实施例中,泡罩548和
564可以用单个泡罩549代替,并且说明性地仪器可以设置有包括加热器986和987的温度控
制元件。然而,应当理解的是,泡罩548或564中的一个可以使用较小的加热器986、987,或者
可以将泡罩549自身与可以包括或不包括用于细胞裂解和/或额外扩增的组分的其他实施
例组合使用。加热器986、987可以是珀尔帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄
膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器、本领域已知的其他加热器、或各加热器类
型的组合(例如,加热元件包括珀尔帖热电加热器/冷却器装置和电阻加热器)。然而,与在
退火和变性温度之间提供给热循环的加热器886不同,在一个示例中,加热器986可以在合
适的变性温度(例如94℃)下提供,并且加热器987可以在合适的退火温度(说明性地为60
℃)下提供,尽管可以使用本领域已知的其他说明性变性和退火温度。在一些实施例中,希
望将加热器986设定为高于94℃并且将加热器987设定为低于60℃的温度,因为当流体达到
温度时,流体可以通过控制这些加热器中的每一个而循环,从而提高升降温速率。这些实施
例可适用于增强的引物和聚合酶浓度。说明性地,可以在加热器986和加热器987之间提供
绝缘间隔物983。可以使用任何合适的绝缘材料,包括泡沫、塑料、橡胶、空气、真空、玻璃或
示例性地具有低导电率的任何其他合适的材料。在加热器986和987保持在大致恒定的温度
的实施例中,运行时间和能量使用可以显著减少。
[0131] 在说明性示例中,包括擦拭器989的擦拭器头910接合泡罩549的顶表面549b。当流体移动到泡罩549中时,擦拭器989移动,使得擦拭器989的本体913迫使泡罩549与加热器
986、987接触,使泡罩549的一部分与每个加热器接触,以允许从每个加热器到泡罩549的一
部分的热传递。然后可以使用一个或多个叶片949来使样品572从泡罩549的一个区域移动
到泡罩549的另一个区域。
[0132] 通常当流体进入隔室时,流体可保持在该隔室的入口附近,或隔室的内容物可能未被完全混合。这在图8A中示意性地示出,其中图示的泡罩549采用不规则形状并且可能不
与加热器986和987良好接触。根据泡罩549的体积、添加的样品572的体积、样品的内容物
等,流体572可以是不规则形状的,在将样品注入泡罩的位置附近收集大量流体。在隔室可
膨胀并且在添加流体之前部分或完全塌陷的情况下,或者在流体可能不足以完全填充隔室
的其他情况下,这可能尤其如此。可以想象一个实施例,其中样品572通过通道552a进入泡
罩549并保持在通道552a附近,使得叶片949的接合捕获区段549c中的样品572的大部分或
全部。因此,希望在叶片接合之前使流体散布在隔室上。因此,如图8B所示,擦拭器头910可
降低直至其接触泡罩549以将样品572散布在泡罩549上,以使得流体572均匀地分布在泡罩
549中,以使泡罩549采用规则形状,并且将泡罩549压成与加热器986和987良好、一致的接
触。
[0133] 在一个实施例中,擦拭器头910可设置有压力构件981,其将压力施加在泡罩549上并将样品572散布在泡罩549上。说明性地,使用构件981具有若干益处。一个是更多的样品
572可以以更薄的层在加热器986、987上散布,因此增加了表面积与体积比,这将改善进出
样品572的热传递。同样地,由于流体被快速热循环——即,样品572的液体被加热器986和
987快速升高和降低温度,将液体在泡罩549中散布成薄层可以减少任何给定温度下的保压
时间(dwell time),并允许更多样品更快地达到目标温度。而且,根据擦拭器989的形状,如
下所述,从构件981到泡罩549上的压力使样品572散布,使得擦拭器989的叶片949的接合将
泡罩549中的样品572分成相对均匀或成比例的体积。在叶片949接合之前来自构件981的压
力将迫使一些样品572进入泡罩549的每个区段中。
[0134] 在一个实施例中,构件981是可压缩的或半可压缩的(例如,由可压缩或半可压缩材料形成或包括可压缩或半可压缩材料)。这种材料包括可压缩或半可压缩的泡沫、塑料或
橡胶,或者可以是更坚固的材料,但在构件981和擦拭器本体913之间具有弹簧装载的、弹性
的或其他的偏置构件或力,使得当样品572被移动到泡罩549中时,样品572在泡罩549上散
布,但是构件981适当地压缩以允许样品572有足够的空间。可以使用本领域已知的其他可
压缩或半可压缩材料。备选地,构件981可以基本上是刚性的并且设置在一位置,使得在构
件981与加热器986、987之间仅提供足够的空间,以迫使样品572散布在泡罩549上。
[0135] 在说明性实施例中,擦拭器989具有x形叶片949,其延伸穿过构件981并将擦拭器989分成四个区段945、946、947、948,如图6所示。如图8C和图8D所示,擦拭器989和叶片949
可以以至少两种模式接触泡罩。如图8C所示,可以降低擦拭器989,直到构件981被部分地压
缩,并且叶片949部分地撞击在泡罩549上。如果擦拭器头910以图8C的模式旋转,则叶片949
的作用可用于提供搅拌动作以彻底混合泡罩549的内容物572。
[0136] 如果擦拭器头进一步下降,如图8D所示,使得构件981被进一步压缩并且叶片949完全撞击在泡罩549中,则叶片可将泡罩分成不连续的区段。例如,对于x形叶片949,如图7
所示,叶片949可以以足够的压力接触泡罩549,使得叶片949将泡罩549分成相应的四个区
段549a、549b、549c、549d。擦拭器989围绕轴993的旋转迫使泡罩549内的流体围绕泡罩549
进行圆周运动。在一个实施例中,叶片949允许部分流体被加热器986和987中的每一个同时
加热,并且从一个加热器的温度控制中移动部分流体,同时允许其他部分的流体受另一个
加热器的控制。构件981压缩泡罩549的内容物。因此,除了在泡罩549中散布流体572并改善
泡罩549与加热器986和987之间的接触之外,构件981还可以将泡罩549的内容物投入另一
个泡罩中。例如,在第一阶段热循环完成之后,可以打开出口通道,当构件981返回其原始形
状时,该出口通道打开流体流出泡罩的路径。在一个实施例中,流体可以仅流出与通道流体
连接的泡罩的象限(quadrant)。可以旋转擦拭器989,使得每个象限依次与出口通道连接。
[0137] 说明性地,叶片949可以是橡胶或弹性体材料,或者是诸如Teflon或Delrin的不粘材料,其具有足够的刚度以将泡罩549分成多个区段并且在泡罩549内移动流体,但不刺穿
或撕裂泡罩549,尽管应理解的是,这些材料仅是说明性的,并且可以使用其他材料,如本领
域中已知的。叶片949可替代地可以由辊或其他构造代替,以允许流体在泡罩549内移动。擦
拭器头910,包括擦拭器989和叶片949,可以通过任何电机、凸轮、曲柄齿轮机构、液压、气
动、或其他装置而被移动到位并旋转,如本领域中已知的。这种移动可以是连续的,或擦拭
器989和叶片949可以通过暂停逐步移动,例如0.1秒到一分钟或更长,从而在移动到其下一
个位置并在每个加热器986、987的控制下保持样品的不同部分之前保持样品的部分在每个
加热器986、987的控制下。擦拭器989的运动可以是圆形的,沿顺时针或逆时针运动,或者可
以反向,在顺时针和逆时针之间交替。应理解的是,擦拭器本体913和叶片949可以是单个固
定单元并且作为单个固定单元移动,或者本体913可以独立于叶片949的移动而移动到与泡
罩549接触或不接触。还应理解的是,泡罩549的圆形形状和旋转运动仅是说明性的,其他样
品器皿形状也是可能的,叶片或辊的非旋转运动(例如线性、曲线和半圆形运动)也是可能
的。参考图11A-图11B描述擦拭器的特定实施例的附加特征。
[0138] 如上所述,擦拭器989设置有x形叶片949,从而将擦拭器分成四个区段945、946、947、948,如图6中最佳所示,并且类似地将泡罩549分成四个区段549a,如图7中最佳所示。
然而,应理解的是,这仅是说明性的,并且可以使用任何形状的叶片949,包括单个线性叶
片,说明性地基本上对应于泡罩549的直径、包括S形叶片或螺旋叶片的单个或多个非线性
叶片、对应于泡罩549的半径的单个叶片(类似于钟针(clock hand)),以及将泡罩549分成
多个片段的多个叶片。应理解的是,将泡罩549分成多个相似区段的叶片可能在不同区段之
间提供更加可控的加热,其中整个区段将同时处于退火和变性温度,而S形、螺旋形和径向
叶片可产生多个涡流旋涡和不同的混合模式,以使样品移动到由加热器986、987产生的热
表面上。还应理解的是,较少的叶片材料允许更多的样品与加热器紧密接触,而更多的叶片
材料更好地控制流体运动。无论叶片图案如何,应理解的是,泡罩549中的部分流体将处于
退火温度,而其他部分将处于变性温度,并且还有其他部分可能处在上述温度之间的过渡
温度,所有这些都在单个样品容器内。叶片949的形状选择可取决于泡罩的尺寸和厚度以及
加热器的尺寸,以及一旦完成第一阶段热循环,使用擦拭器989从泡罩549排出材料的有利
条件。
[0139] 在说明性实施例中,加热器986、987提供平坦表面,泡罩549可以压靠在该平坦表面上。然而,应理解的是,这仅是说明性的,并且加热器986、987可提供纹理化表面从而有助
于混合样品的均匀性。
[0140] 在说明性实施例中,加热器986和987各自被设置在固定温度,例如分别被设置在94℃和60℃。然而,在一些实施例中,可能希望在使用期间调节加热器986和987的温度。例
如,当样品首次被引入泡罩549时,可能需要增加一个或两个加热器的温度,以在流体进入
泡罩549时补偿流体的较冷温度。在适用于以下讨论的另一个示例中,可能需要“过驱动”加
热器以使加热器能够更快地达到泡罩中的流体的目标温度。例如,如果热循环的目标温度
是94°和60°,则加热器可以设置为高于高温(例如,在95℃-110℃的范围内)并且低于低温
(例如,在59℃-50℃的范围内),以更快速地加热和冷却样品中的流体。另外,虽然示出了两
个加热器,但是可以使用任何数量的加热器。一个说明性示例使用三个加热器,一个设定在
变性温度,一个设定在退火温度,第三个设定在伸长温度。在另一个说明性示例中,第一加
热器可以大于第二加热器,使得样品在循环的较长部分中保持在第一温度。此外,应理解的
是,泡罩549及其内容物可保持静止,并且加热器986、987可横向旋转或平移。
[0141] 说明性地,流体可以从核酸提取区通过通道552a进入泡罩549,该泡罩说明性地类似于图1的袋的泡罩546,然后可以关闭通道552a。然后,构件981按压泡罩549,促进泡罩549
与加热器986和987的接触,然后叶片949朝向加热器986、987移动,并将泡罩549分成区段
549a、549b、549c和549d。当擦拭器989旋转时,四个区段549a、549b、549c和549d中的每一个
中的样品从与加热器986的接触移动到与加热器987接触,并再次返回。在每个区段中,加热
和冷却样品所需的时间量取决于许多因素,包括泡罩549上的膜的厚度,泡罩549内的流体
层的厚度,泡罩549内的样品的混合,以及与加热器的接触量。然而,应理解的是,擦拭器989
的一次完整旋转通常对应于该说明性实施例中的一个PCR循环。
[0142] 对于某些测定,靶核酸可以以非常少的量存在。因此,可能需要从泡罩549中的大量样品开始,以便具有足够的靶核酸副本。说明性地,泡罩549包含10μL至1mL的流体,说明
性地在25μL和200μL之间,但根据系统的构造,其他体积可能是合适的。任选地,在几个循环
之后,说明性地在2至10个循环之后,当靶核酸的量已经稍微扩增时,可以打开通道552a(或
另一个通道),并且可以将本体913移动为更靠近加热器986、987,以挤压泡罩549,从而从泡
罩549通过通道552a排出一部分流体。然后可以关闭通道552a。至少一部分样品也可以通过
叶片949的运动排出,特别是如果叶片949可以成形为迫使样品的至少一部分向外,例如用S
形叶片。说明性地,可以除去样品体积的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%或更多,或其间的任何量。如果使用可压缩或半可压缩构件981,则应理解的是,可能
需要调节本体913朝向加热器986、987的运动以补偿该压缩,以实现样品体积的适当减小。
由于泡罩549中的流体体积现在减小,因此可能需要更少的时间与每个加热器986、987接触
以使流体达到适当的温度并且可以增加擦拭器989旋转的速度,从而减少循环时间。说明性
地,当样品体积减少50%时,循环时间可减少25%至50%。在一个示例中,样品体积减少
50%并且循环时间减少约35%。在几个循环之后,可以进一步减少体积,并相应地减少循环
时间。可以进行多次减少,例如减少一到五次。应理解的是,有效反应在每个循环中基本上
使目标序列加倍。因此,在一些实施例中,在早期循环中丢失一些样品量以获得更快的运行
时间可能是一个很好的权衡。
[0143] 图9a-图9c示出了可以采用的另一个实施例(例如,用于减小样品572的体积或从泡罩549排出流体)。在该实施例中,擦拭器1089设置有叶片1049,该叶片1049具有两个臂
1049a和1049b。如图9a所示,两个臂1049a和1049b以线性布置来设置,从而将泡罩549分成
两个基本相等的半部。如箭头所示,叶片1049可以沿顺时针方向移动,但是,如上所述,其他
运动也是可能的。然而,在该实施例中,臂1049a和1049b可以独立地移动。为了减小体积,臂
1049b可以朝向臂1049a旋转以到达期望的位置。该移动可以在移动体913远离加热器986、
987的情况下或不在移动体913远离加热器986、987的情况下进行。如果擦拭器1089在该移
动期间从加热器986、987缩回,则在移动完成之后,本体913可以朝向加热器986、987移回。
一旦臂1049a和1049b处于期望位置,如图9b中最佳所示,则可以打开通道552a,并且叶片
1049a和1049b可以彼此移动分开,例如通过沿图9b中箭头所示的方向移动叶片1049b到达
图9c中的位置。虽然在图9c中示出了大约100度的旋转,但这仅是说明性的,并且可以调节
旋转量以实现适当的体积减小或泡罩的排空。应理解的是,臂1049a和1049b中的一个或两
个可以移动以实现体积的这种减小。然后可以密封通道552a,可以将臂1049a和1049b移回
其线性布置,并且可以继续热循环。
[0144] 应理解的是,体积的减少和循环时间的减少可以与本文公开的任何实施例一起使用,或与使用各种样品器皿和加热构造的其他实施例一起使用。还应理解的是,这种减少体
积和减少循环时间的方法可以与新鲜PCR组分的引入相结合。当需要组合的RT-PCR反应或
这种添加可包括用于嵌入式扩增的引物或用于通用引物时,这可能是有用的。
[0145] 一旦热循环完成,可以打开通道562a。说明性地,特别是当叶片949弯曲时,擦拭器989的方向可用于将流体从泡罩549送到通道562a中。备选地,泡罩549可以是用于热循环
样品的独立容器,使得泡罩549在接收PCR反应后被密封。泡罩549可用于需要热循环的各种
样品类型中的任何一种。
[0146] 图10示出了可与图6-图9C中所示的加热器装置一起使用的擦拭系统1000的实施例,该擦拭系统例如在两个加热区之间移动泡罩的内容物以进行热循环。擦拭系统1000包
括擦拭器头1010,该擦拭器头1010可以经由轴1070和连接器1060附接到旋转电机1030。旋
转电机1030可以联接到支撑件1040;电机1030和擦拭器头1010可以如箭头1020所示在例如
轨道1050上的支撑件1040上升高和降低。擦拭系统1000可以被安装在加热器986、987上方
(如图6-图7所示),具有用于将样品泡罩插入其间的空间。
[0147] 在一个实施例中,擦拭系统1000可以被安装在仪器中,使得样品器皿中的泡罩可以被放置在基部1080下方。在一个示例中,头部1010和电机1030组件可以被降低超过基部
1080,以接触流体填充的泡罩。可以旋转电机1030,使得擦拭器头1010可以移动流体填充的
泡罩的内容物。如果流体填充的泡罩与具有单独加热区(例如,94℃的区和60℃的单独区)
的加热器装置(例如,加热器986和987)接触,则电机1030和擦拭器头1010可以降低,使得擦
拭器头1010的一个或多个叶片将泡罩分成单独、不连续的体积,并用于移动流体填充的泡
罩的内容物,用于PCR的热循环,如上面参照图6-图9C所述。
[0148] 除了上述热循环装置之外,本文所述的加热器和混合器系统还可用于封闭袋中的自动化样品制备。例如,如下面将更详细描述的,用加热器986和987中的一个或两个加热如
泡罩549,同时将样品制备泡罩的内容物与混合器系统1000混合,可用于裂解细胞(例如,细
菌和哺乳动物细胞)并释放其中的核酸。备选地或另外地,泡罩可包括离液剂、去污剂和/或
裂解珠(参见例如图1的袋510的裂解泡罩522)。同样,用热电冷却装置(即珀尔帖装置)加热
和冷却以及混合可用于提高其他样品制备过程的效率。例如,核酸在较低温度(例如,~0-
10℃)下更有效地结合磁珠(例如,图1的磁珠533)并且在更高温度(例如,~60-90℃)下更
有效地从磁珠洗脱。因此,当泡罩549与加热器/冷却器986接触时,可以说明性地发生裂解,
而当泡罩549与加热器/冷却器987接触时,可以说明性地发生磁珠结合,并且这些加热器可
以横向移动,如下面关于图12-图13所讨论的。
[0149] 现在参照图11A和图11B,其示出了可包括在图10的擦拭系统上的擦拭器头1100的实施例。例如,擦拭器头1100可以经由位于擦拭器头的远端处的卡盘1170附接到图10的擦
拭系统1000的轴1070。擦拭器头1100的近端包括具有擦拭器叶片1149的擦拭器本体1110。
擦拭器头1100还可包括弹簧构件1140,以及将上本体1160的上部联接到擦拭器本体1110的
销、螺钉或类似物1150。在一个实施例中,擦拭器头可以被构造成使得弹簧构件1140可以调
节擦拭器头1110和擦拭器叶片1149所能够施加在流体填充的泡罩上的压力的量。
[0150] 所示的擦拭器本体1110还可以说明性地包括压力构件1181a-1181d,压力构件被设置在擦拭器叶片1149之间的象限中。在一个实施例中,压力构件1181a-1181d可以一起工
作,以起到类似于图8A-图8D中描述的压力构件981的作用。也就是说,压力构件1181a-
1181d可以相对于擦拭器叶片1149定位,使得当擦拭器叶片1149与流体填充的泡罩接触时,
压力构件1181a-1181d可以施加一致的、可预测的压力。然而,参考图11B,示出了另一实施
例,其中压力构件1181a-1181d可相对于擦拭器片1149展开、移动或降低,以向流体填充的
泡罩施加压力。在所示的示例中,压力构件1181a-1181d可以通过降低擦拭器头1100而展
开,直到叶片1149和压力构件1181a-1181d呈现基本上平坦的表面抵靠流体填充的泡罩。在
一个实施例中,压力构件1181a-1181d可以通过使擦拭器头1100降低超过擦拭器叶片1149
接触泡罩的点来展开;继续降低擦拭器头1100可以向上压缩擦拭器叶片1149和/或向下按
压压力构件1181a-1181d。弹簧构件1140可以构造成调节叶片1149上的压力量,并且需要柱
塞头1110来展开压力构件。将擦拭器头1100向下降低直到擦拭器叶片和压力构件形成基本
上平坦的表面可以例如用于将液体均匀地散布在泡罩内或者将液体从一个泡罩插入另一
个泡罩中。在另一个实施例(未示出)中,压力构件可以通过类似的机构展开到中间位置,以
例如在流体填充的泡罩上施加压力,以改善泡罩和下面的加热器之间的接触。在一个或多
个实施例中,擦拭器头1100可包括与一个或多个擦拭器叶片1149和/或压力构件1181a-
1181d相关联的多个弹簧构件类型,以调制或调节叶片1149和压力构件1181a-1181d可以应
用于流体填充的泡罩的压力量。
[0151] 现在参照图12A和图12B,其示出了仪器1200,该仪器包括参考图10讨论的擦拭系统1000、参考图11A和图11B讨论的擦拭器头1100的特征,以及图6的加热器986和987的许多
特征。在说明性示例中,仪器1200包括铰接盖1210和底盘盖1220。铰接盖1210可以打开,以
插入用于将独立式PCR的柔性袋插入铰接盖1210和底盘盖1220之间的仪器中。底盘盖1220
位于仪器1200的内部部件上方,并且可以限定用于定位柔性袋的接受器,例如仪器中的图
14A所示的柔性袋,其中接受器可以与袋的一部分共同延伸。如下面将更详细解释的,接受
器可以被构造成在仪器中接收柔性袋并对准柔性袋,使得仪器的各种部件可以与柔性袋相
互作用。同样,接受器可以包括开口等,使得仪器的内部部件可以接触柔性容器。同样地,铰
接盖1210可以包括开口等,使得仪器的外部部件可以与柔性容器相互作用。在盖1210和
1220上方,仪器1200包括擦拭系统1000,其包括先前描述的驱动电机1030和擦拭器头,以及
用于收集荧光数据的相机/荧光计1250和安装座1260。如在先前的示例中那样,擦拭系统可
以如箭头1020所示通过基部1080中的孔1240以及通过铰接盖1210中的一个或多个孔而上
下移动,以便接触袋。
[0152] 另外,在所示实施例中,擦拭系统例如可以在轨道1230上左右平移,以使得擦拭系统1000可以接触插入仪器1200中的袋的不同区域。在一个实施例中,擦拭系统1000可以被
平移,使得擦拭器1100可以与袋的不同部分相互作用。例如,如下面将更详细说明的,擦拭
系统1000可用于袋内样品制备和第一阶段PCR步骤。在替代实施例中,擦拭系统1000可以保
持静止,并且可以移动袋,使得擦拭器可以接触袋的不同部分。然而,应理解的是,这种布置
是说明性的,并且可以设想移动和对准擦拭器、加热器和样品容器的其他布置。应理解的
是,擦拭器、加热器和袋的任何组合可以放置在可移动元件上,并且当讨论擦拭器、加热器、
袋等的平移时,这种移动可以用在这种相反的平移与其他元件的布置一致的任何实施例中
与该元件协同工作擦拭器、加热器或袋的相反平移来代替。在一些实施例中,还可设想袋和
其他仪器元件的旋转运动。
[0153] 现在具体参考图12B,移除盖1210和1220,使得可以更清楚地看到仪器1200的内部。仪器1200的内部说明性地包括加热器组件1270,加热器组件1270可以例如在轨道1292
上通过平移器如箭头1294所示地来回平移。加热器组件1270包括第一加热元件1286和第二
加热元件1287。在所示的实施例中,加热器组件可以机械地联接到平移器,该平移器说明性
地包括驱动电机1296和驱动构件(例如,螺纹螺钉)1298。加热器组件1270可以例如在轨道
1286和1287上来回平移,使得加热器1286和1287可以与安装在仪器中的袋的不同区域相互
作用。然而,应理解的是,电机和轨道仅是说明性的,并且可以使用其他线性和非线性平移
器。如上面参考图6-图9C详细讨论的,加热器组件可以被定位成使得泡罩的部分(例如,第
一阶段PCR泡罩)可以同时受第一加热元件1286和第二加热元件1287的温度控制,类似于如
图6-图8所示。同样地,整个泡罩可以一次由一个加热器控制,并且泡罩(例如,第一阶段PCR
泡罩或第二阶段PCR泡罩)可以通过使用平移器来回移动加热器组件1270而被热循环,使得
所选择的泡罩反复地在第一加热器1286和以及随后第二加热器1287等的温度控制下。应理
解的是,虽然所示实施例包括可以移动的加热器,但是通过使袋相对于加热器平移而不是
移动加热器组件并且该运动可以沿着例如线性、轴线或旋转路径,可以实现一个或多个相
同的效果。
[0154] 加热器1286和1287可以是珀尔帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器、或本领域已知的其他加热器。应理解的是,
加热器类型也可以组合在单个单元中(例如,加热器单元可以包括珀尔帖装置,其在珀尔帖
的前部和/或后侧具有电阻加热器,以帮助维持固定的温度和/或提高加热和冷却的效率和
速度)。虽然术语“加热器”用于表示元件1286和1287,但应理解的是,可以使用其他温度控
制元件或元件组合来调节样品的温度。与在退火和变性温度之间提供给热循环的PCR装置
中通常包括的加热器不同,加热器1287和1286可以保持在固定温度下,或者可以在有限的
温度范围内(例如,在退火温度和伸长温度之间)进行热循环。例如,如上面参考图6-图9C详
细说明的,可以通过在两个静态温度区之间移动流体填充的泡罩的内容物来热循环样品。
在一个示例中,加热器1287可被设置在合适的变性温度(例如94℃),并且加热器1286可以
被设置在合适的退火温度(例如60℃),尽管可以使用如本领域已知的其他说明性的变性和
退火温度。而且,对于某些方案,可能需要三个或更多个加热器。
[0155] 在一个实施例中,加热器1286和1287中的一个或两个可包括珀耳帖元件。虽然加热器1286和1287可以不是热循环的,但是例如可能希望在加热器1286和1287中的一个或两
个中包括珀耳帖元件。与典型的电阻加热器不同,珀耳帖元件可以主动冷却以及加热样品。
例如,在将样品从变性温度(例如,94℃)移动到退火温度(例如,60℃)时,必须将样品冷却
至退火温度。这将通过辐射/传导发生,但这些过程相对较慢。对于快速热循环,例如,可能
优选地用珀尔帖装置主动冷却样品,其中珀尔帖的“冷”侧被设定为60℃,而“热”侧(此处可
以通过散热器说明性地泵送和处理多余的热量)可以被设定为较高的温度。
[0156] 仪器1200还包括计算机1299,其可被构造成控制擦拭器1100、加热器1286和1287、热循环参数(例如,擦拭器的移动、加热器的温度、擦拭器和具有样品容器的加热器的对准
等)、样品容器中的流体运动等中的一个或多个等。同样地,计算机1299可以被构造用于从
仪器1200(例如从光学系统1250)进行数据采集和分析。这些组件中的每一个都被电气地连
接,说明性地经由电缆1291,但是其他物理或无线连接也在本发明的范围内。应理解的是,
计算机1299可以容纳在仪器1200内或者可以在仪器1200外部。此外,计算机1299可以包括
控制一些或所有部件的内置电路板,并且还可以包括外部计算机,例如台式机或笔记本电
脑,用于接收和示出来自仪器1200的数据。可以提供界面,说明性地是键盘界面,包括用于
输入信息和诸如温度、循环时间等变量的键。说明性地,也可以提供显示器。例如,显示器可
以是LED、LCD或其他这样的显示器。
[0157] 现在参照图13A和13B,其示出了另一种仪器1300。仪器1300在许多方面类似于仪器1200,但仪器1300包括具有两个混合器/擦拭器的擦拭系统1305。因此,在一个实施例中,
可能不需要水平地平移擦拭器,使得擦拭器/混合器可以与安装在仪器1300中的袋的不同
部分相互作用。
[0158] 仪器1300包括擦拭系统1305,其包括第一擦拭器电机1310a和第二擦拭器电机1310b以及第一擦拭器头1100a和第二擦拭器头1100b。该仪器还包括第一盖和1315和第二
盖1320、相机1325和相机支撑件1330。现在参考图13B,仪器1300还包括加热器系统1335以
及第一加热元件1386和第二加热元件1387,该加热器系统可以在轨道1350上水平平移
1355。虽然术语“加热器”用于表示元件1386和1387,但应理解的是,可以使用其他温度控制
元件或元件组合来调节样品的温度。加热器系统1335机械地联接到用于平移加热器系统的
驱动电机1360和驱动构件1365。说明性地,加热器1386可以被设置在约90℃-95℃的温度,
加热器1387可以被设置在约55℃-65℃的温度,但是其他温度和布置也是可能的。
[0159] 仪器1300还包括计算机1399,其可被构造成控制擦拭器1100a和1100b、加热器1386和1387、热循环参数(例如,擦拭器的移动、加热器的温度、擦拭器和具有样品容器的加
热器的对准等)、样品容器中的流体运动等中的一个或多个等。同样地,计算机1399可以被
构造用于从仪器1300(例如从光学系统1325)进行数据采集和分析。这些组件中的每一个都
被电气地连接(说明性地经由电缆1399,但是其他物理或无线连接也在本发明的范围内)。
应理解的是,计算机1399可以容纳在仪器1300内或者可以在仪器1300外部。此外,计算机
1399可以包括控制一些或所有部件的内置电路板,并且还可以包括外部计算机,例如台式
机或笔记本电脑,用于接收和示出来自仪器1300的数据。可以提供界面,说明性地是键盘界
面,包括用于输入信息和诸如温度、循环时间等变量的键。说明性地,也可以提供显示器。例
如,显示器可以是LED、LCD或其他这样的显示器。
[0160] 现在参考图14A和图14B以及图15A-图15F,描述可以在仪器1200和1300中使用的柔性袋或化学卡的实施例(图14A),而可以由仪器1200和1300执行的用于样品制备、第一阶
段PCR和第二阶段PCR的一系列操作在图15A-图15F中描述。
[0161] 图14A的说明性柔性袋1400包括大体上平面区域1402,其包括多个区或泡罩,其中可以进行样品制备、核酸扩增和检测。在一个实施例中,袋1400可以由多个材料层(相同材
料的层或不同类型的材料的层)制成,这些材料被密封在一起以形成袋1400。在图14B中,剖
视图示出了沿着B-B线的层。说明性袋包括第一膜层1490、压敏粘合剂层1492、卡层1494、第
压敏粘合剂层1496和第二膜层1498。在一个说明性示例中,袋1400中的泡罩区域可以通
过在卡层1494中形成适当的切口来形成。备选地,袋的泡罩区域可以通过在有或没有卡层
的情况下将膜层(例如,膜层1490和1498)层压或焊接在一起而形成,在层之间留下开放空
间用作液体泡罩。应理解的是,其他构造也是可能的。应理解的是,虽然说明性的泡罩区域
是柔性的,但是卡层1494可选地可以是较不柔韧的并且可以是刚性的,并且仍然是柔性样
品容器的一部分。因此,应理解的是,“柔性袋”仅需要在某些区中是柔性的。填充通道1440-
1460和连接泡罩区域1465-1485的通道可以通过在第一压敏粘合剂层1492或第二压敏粘合
剂层1496中形成适当的切口,或者通过在卡层1494中提供通道来形成。可选地或另外地,通
过在膜层1490上方或膜层1498下方添加另一膜层并将这些层焊接在一起、在这些层之间留
下开放的泡罩区域和通道,可以形成泡罩区域之间的流动通道。
[0162] 虽然可以使用其他材料,但是说明性地,袋1400的膜层可以由柔性塑料膜或类似于图1中描述的袋510的其他柔性材料形成。例如,袋1400可以由例如但不限于聚酯、聚对苯
二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、混合物、组合物、和可以通过
本领域已知的任何方法(包括挤出、等离子体沉积和层压)制备的上述材料的层形成。类似
的材料(例如,聚碳酸酯)可以用于卡层1494。也可以使用其他材料,包括金属箔或具有铝层
压的塑料。本领域已知的其他挡板材料可以密封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料
膜,则可以通过热密封件将这些层结合在一起。说明性地,该材料具有低核酸结合能力。如
果使用荧光检测,则可以在袋的适当区域中(例如,在第二阶段阵列附近)使用光学透明材
料。
[0163] 回到图14A,说明性的袋1400包括样品制备泡罩1405,其中含有待扩增和分析的核酸的样品被引入袋1400。该袋还包括第一阶段PCR泡罩1410、用于在第二阶段PCR之前测量
来自第一阶段PCR的一部分产物的体积孔1415、以及用于第二阶段PCR的反应孔阵列1430。
体积孔1415还可以流体联接到试剂泡罩1425(其中引入用于第二阶段PCR的试剂)以及混合
泡罩1420。可以通过重复混合处在泡罩1420和1425之间的体积孔1415的内容物来制备用于
第二阶段PCR的样品。第二阶段阵列1430也可以流体连接到废物接受器1435。备选地,泡罩
1410可以用于样品制备和第一阶段PCR,并且泡罩1405可以用作废物接受器,例如用于一种
或多种样品制备废物。用于将样品和试剂引入袋1400中的装置未在图14A中示出,但是应理
解的是,可以将类似于图1的配件590的装置装配到袋1400中并用于将样品和试剂引入到袋
1400中。同样,可以提供可密封的端口(未示出)用于将样品引入袋1400中,并且可以提供一
个或多个可密封的端口用于引入液体试剂或水合缓冲液。另外,袋1400可包括配件或类似
结构中的脱水(例如,冷冻干燥)试剂,其可在使用袋之前用合适的水合缓冲液水合。
[0164] 现在参考图15A,其更详细地说明了可用于第二阶段PCR的孔的阵列1500。阵列1500可以是独立阵列,或者它可以作为更宽阵列的一部分(例如阵列1430的一部分)被包
括。阵列1500包括单独的孔1510a-1510e。孔1510a-1510e中的每个可用于第二阶段PCR反
应。在所示实施例中,孔1510a-1510e流体连接到填充通道1520;孔1530a-1530e形成在填充
通道中,用于填充每个孔。在一个实施例中,通过在“1565”所表示的区域中或围绕该区域施
加密封(例如,热密封)或压力,可以将孔1510a-1510e与填充通道1520密封并且彼此密封
(即,可以防止各孔之间的串扰)。因此,单个密封件1565将孔1510a-1510e与填充通道1520
封闭,并将各孔彼此封闭。阵列1500的横截面结构和用于填充孔的流动路径在下面的图15B
和图15B'中示出。虽然阵列1500被示出为具有与填充通道1520相关联的五个孔1510a-
1510e,但是应理解的是,更多或更少的反应孔可以与填充通道相关联,并且多个填充通道
可以流体连接到多组孔。可以组合使用多个阵列1500以产生更大的阵列。
[0165] 现在参考图15B和图15C,其沿图15A的B-B线示出了横剖视图。示出了孔填充系统的两个不同实施例的横截面视图。以图15B和图15C的横截面示出的阵列1500的一部分由类
似于图14B所示的层制成;应该注意的是,阵列1500可以作为图14A中所示的袋1400的一部
分包括在内。阵列1500由第一膜层1535、第二膜层1540、粘合剂层1545、其中可以形成阵列
的孔1510的卡层1550、第二粘合剂层1555和第三(外部)膜层1560制成。
[0166] 在图15B中,填充通道1520可以通过在第一膜层1535和第二膜层1540之间留下间隙来形成,其中液体可以流动。图15C示出了通过在第一膜层1535c和第二膜层1540c之间留
下间隙而形成的类似填充通道1520c。填充通道可以由焊接线1570或1570c限定,焊接线
1570或1570c将第一膜层和第二膜层密封在阵列周围。在图15A中示出了这些焊缝1570如何
应用的示例。在图15B中,填充孔1530可以通过在第二膜层1540和第一粘合剂层中形成选择
性切口来形成。在图15C中,可以通过在第二膜层1540c中形成选择性切口来形成填充孔
1530c。
[0167] 在图15B中,可以通过在卡层中形成切口1575和在粘合剂层1555中形成切口1580,来形成在孔1510周围和上方流动以用于填充孔1510的孔填充通道,尽管其他方式形成这些
通道也是可能的。例如,图15B的孔填充通道的设计可以例如帮助抑制孔之间的串扰,因为
流动路径是旋绕的。同样地,因为填充通道1520和填充孔1530形成在两个膜层1535和1540
之间,所以填充孔1530和阵列1500可以说明性地用热密封装置或通过压力说明性地通过膨
胀抵靠阵列1500的囊袋密封。在图15C中,孔填充通道直接流入孔1510c,并且可以通过在第
一粘合剂层1545c中形成切口1585c来形成,该切口1585c将填充孔1530c流体地连接到孔
1510c。预计图15C的填充设计通常也将抑制孔之间的串扰。然而,图15C的设计可以说明性
地用热密封装置密封,其可以提供比单独的压力更好的密封。在一个实施例中,第二阶段阵
列的孔(例如,孔1510)可以处于部分真空下以便于将流体从填充通道1520吸入孔1510中。
在另一个实施例中(未示出),第二阶段阵列的孔可以包括出口孔和下游废物接受器,以允
许空气和过量流体逸出,使得流体可以从填充通道1520流入并进入孔1510,而不必将袋和
阵列保持在真空下。
[0168] 现在参考图16A-图16F,其描述了可由仪器1300使用袋1400进行样品制备、第一阶段PCR和第二阶段PCR的示例性操作顺序。注意,为了清楚起见,图13A中所示的盖1315和
1320已被移除,但是它们通常在仪器工作时处在适当位置,并且袋1400将说明性地插入外
盖和内盖之间以相对于擦拭器、加热器等定位袋。在图16A中,将理解的是,样品已被添加到
袋1400中并且袋已经定位在仪器1300中。然而,在一些实施例中,仪器可被构造用于当袋在
仪器中时将样品注入袋中。如下面将更详细讨论的,如图14A所示,可以通过填充通道1440
将样品引入泡罩1405中。在第一步骤中,加热器组件1335可以被平移,使得加热元件与泡罩
1405接触,用于加热和冷却样品制剂。在该视图中,加热元件1386和1387是不可见的,但是,
例如,加热元件1386可以被定位成使得加热器组件1335沿着轨道1392平移,使得样品可以
被加热用于细胞裂解、通过加热器1387冷却(例如,至约5-10℃)用于以磁珠来回收核酸,通
过加热器1387冷却(例如,至约5-10℃)用于磁珠洗涤步骤,并通过加热元件1386加热(例
如,至约50-60℃)以从磁珠中洗脱。在图16B中,可以降低擦拭器头1100a直到擦拭器叶片
(未示出)接触泡罩1405。然后擦拭器头1100a可以随电机1310a旋转;加热和搅拌的组合可
足以有效地裂解大多数细胞和病毒类型。然而,虽然描绘了用于裂解的混合设备,但应理解
的是,混合设备可以用其他用于裂解的装置代替,例如但不限于超声装置、珠搅拌器电机、
冷冻/解冻机构、桨叶搅拌器、激光裂解、滑板锤击机构、锤钻搅拌器机构、均化器、它们的组
合、或本领域已知的其他细胞裂解装置。还应理解的是,可以省略样品制备或提前进行样品
制备,并且可以省略该步骤。
[0169] 现在参考图32A,其示出了可用于从裂解物中回收核酸的擦拭器头1800的实施例。擦拭器头1800类似于擦拭器头1100,但擦拭器头1800包括磁体系统,该磁体系统可用于选
择性地分离可在本文所述的一些实施例中用于从细胞裂解物中回收核酸的磁珠。擦拭器头
1800的近端包括具有擦拭器叶片1849的擦拭器本体1810。擦拭器头1800还包括外部弹簧构
件1850、上部本体1860和销1865a-1865d(销1865c未示出),上述销联接擦拭器头的上部到
下部。在一个实施例中,擦拭器头可以被构造成使得弹簧构件1850和销1865a-1865d可以调
节擦拭器头1810和擦拭器叶片1849可以施加在流体填充的泡罩上的压力。
[0170] 所示的擦拭器本体1810还包括被设置在擦拭器叶片1849之间的象限中的压力构件1881a-1881d(压力构件1881c未示出),其可在一个方案中向下展开以在流体填充的泡罩
上施加压力(参见例如图32B),并且可以在另一个方案中进一步向下展开,以将泡罩的流体
内容物挤压到另一个泡罩(参见例如图33C中的泡罩2020)。在所示的示例中,压力构件
1881a-1881d可以通过将擦拭器头1800降低超过擦拭器叶片1849接触泡罩的点来展开;继
续降低擦拭器头1800可以向上压缩擦拭器叶片1849和/或向下按压压力构件1881a-1881d,
直到磁体1882a-1882d可以收集磁珠或甚至进一步直到压力构件1881a-1881d被压平抵靠
泡罩以压出泡罩中的流体。
[0171] 进一步参考图32A并结合图32B-图32C和图33-图33C,其示出了擦拭器头1800、磁体1882a-1882d的磁体系统以及它们如何作用于流体填充的泡罩的一系列视图。图33示出
了具有互连流体通道2030的一对泡罩2010和2020,其可以被包括在类似于袋1400的样品卡
中。在一个实施例中,泡罩2010和2020可以类似于样品制备泡罩1405以及被包括在图14A的
袋1400中的第一阶段泡罩1410。在另一个实施例中,泡罩2010可以是样品制备泡罩,泡罩
2020可以是废物接受器,并且卡可以包括用于第一阶段PCR的另一个泡罩(未示出)。在图33
中,泡罩2010被示出以容纳用2015示意性表示的细胞裂解物和磁珠的浆液。磁珠可包含二
氧化硅涂覆的磁性材料等,其能够结合并分离来自细胞裂解液的核酸。本文其他地方(例
如,参考图1)详细讨论了用于从裂解物中磁珠回收核酸的示例性方法,并且这种方法可用
于本文的该实施方式和其他实施方式中。
[0172] 现在参考图32A和图33A,其示出了擦拭器头1800的第一状态以及擦拭器叶片1849如何与泡罩2010相互作用。在第一状态中,擦拭器叶片1849可以被压入泡罩2010中,使得擦
拭器头1800的旋转可以混合浆料2015,例如,用于将磁珠暴露于裂解物。图32B和图33B示出
了第二状态,其中头部1800例如已经进一步降低,使得压力构件1881a-1881d更靠近泡罩
2010,使得磁体1882a-1882d可以开始聚集磁珠。部分聚集的磁珠在“2016”处被示出,并且
部分清除的浆料在“2017”处被示意性地示出。随着压力构件和磁体移动靠近泡罩,磁珠可
以通过例如将擦拭器头前后旋转小弧度(例如,在约+/-5-20°的范围内)来固结。一旦磁珠
被磁体完全捕获并且完全固结,则擦拭器头1800可以完全降低,使得压力构件1881a-1881d
将泡罩2010压平,以将裂解物通过通道2030挤压到泡罩2020中。这在图32C和图33C中示出。
捕获的磁珠在“2018”处被示出,废弃裂解物在“2019”处被示出。可以重复图32A-图32C和图
33-图33C,用以洗涤珠2018并随后从其中洗脱捕获的核酸。
[0173] 如图16A-16F所示,在裂解和核酸回收后,可将回收的核酸移动到泡罩1410以进行第一阶段PCR。这在图16C中示出,其中擦拭器头1100a已经降低,使得擦拭器头的压力构件
可以抵靠泡罩变平(例如,如图11B所示),使得擦拭器头可以将泡罩1405的内容物的至少一
部分插入泡罩1410中。大约在同一时间(即,之前、同时或之后),加热器组件1335可以重新
定位,用于使得泡罩1410可以受到加热器1386和1387的温度控制,如关于图6所描述的那
样。这在图16D中示出。同样在图16D中,擦拭器头1100b下降直到擦拭器叶片(未示出)接触
泡罩1410。在具有一个混合器的替代实施例中,可以平移袋或者可以平移混合器以使混合
头1100可以接触袋的各种泡罩。在加热器1386和1387以及擦拭器头1100b在适当位置的情
况下,可以通过降低混合头1100使得擦拭器叶片将第一阶段PCR分成单独的和不连续的体
积并旋转擦拭器头以移动两个加热器1386和1387之间的泡罩1410的内容物来完成第一阶
段PCR,如前面参考图6-图9C所述。在一个替代实施例中,第一阶段PCR热循环可以通过沿着
轨道1392来回平移加热器组件1335或袋1400使得泡罩1410的内容物重复地在加热器1386
(例如,变性)、然后加热器1387(例如,退火)、然后加热器1386(例如,伸长和变性)等的温度
控制下来完成。
[0174] 在一个实施例中,通过加热器组件1335或袋1400的平移进行的热循环可以与例如图8C中所示的擦拭器头1100的混合动作相结合。例如,使用擦拭器头1100的混合可以通过
加热器组件1335的平移以混合泡罩1410的内容物以增加泡罩中的流体的温度均匀性而与
热循环结合。同样地,混合泡罩中的流体可以通过加热器组件1335的平移与热循环结合,以
增加有效扩散速率,从而改善PCR的化学性质。在一个方案中,擦拭器头可以以恒定速度旋
转,而例如加热器组件来回平移或者擦拭器头可以例如以对应于泡罩在加热器1387以及随
后在加热器1386的控制下的平移的时间间隔旋转。
[0175] 在泡罩1410中的第一阶段PCR之后,可以将一部分扩增的核酸移动至体积孔1415,并通过在泡罩1420和1425之间混合而与第二阶段PCR试剂(聚合酶、dNTP等)混合。混合可以
用类似于图2的囊袋系统808或另一个压力施加系统的囊袋系统完成。在一些实施例中,希
望借助热来制备用于第二阶段PCR的样品。这未在图16A-图16F中描绘,但是如果需要真正
的热启动,则可以通过使加热器1386移动到泡罩1415、1420和1425附近而将加热器组件
1335定位用于这样的步骤。还应理解的是,可在每个第二阶段孔中提供第二阶段PCR试剂。
[0176] 在泡罩1415、1420和1425中制备用于第二阶段PCR的样品之后,可以将样品移动到用于第二阶段PCR的阵列1430。如图16E和图16F所示,用于第二阶段PCR的热循环可以通过
相对于阵列1430平移加热器组件1335来完成,使得各个孔的阵列和内容物处于加热器1386
(例如,变性)、然后加热器1387(例如,退火)、然后加热器1386(例如,伸长和变性)等的温度
控制下。这些视图中未示出,但是压力施加装置(例如,可膨胀的囊袋,诸如被构造成施加压
力到泡罩而允许同时或基本上同时进行荧光测量的透明、柔性囊袋)可以被定位在阵列上
方,用以密封各个孔中的内容物并防止孔之间的串扰。同样,这种压力施加装置还可以改善
阵列与加热器之间的接触,从而提高传热效率。应理解的是,孔可以通过其他方式密封,例
如热密封件。在这些视图中没有描绘,但是阵列1430中的核酸扩增可以用如图13A和图13B
中所描绘的相机1325的光学阵列监测。
[0177] 图16A-图16F描绘了仪器1300,但是应理解的是,在这些视图中执行的操作也可以在仪器1200或类似仪器上执行。同样地,这些视图中描绘的操作是用袋1400执行的,但是这
仅仅是示例性的,因为这些视图中描绘的操作可以用其他袋类型和构造来执行。
[0178] 现在参考图17,其示出了加热器组件1700的替代实施例。而图12B和图13B的仪器1200和1300描绘了具有两个加热元件的加热器组件1270和1335,加热器组件1700包括容纳
外壳1735中的三个加热元件1710、1720和1730。在一个实施例中,加热器1710和1730被设
定到相同的温度(例如,变性温度处于约90℃-110℃的范围内),加热器1720可被设定到中
间温度(例如,约55℃至约65℃),以说明性地用于退火。在一个实施例中,泡罩的流体内容
物(例如,图14的泡罩1410或阵列1430)的热循环可以使用所有三个加热器。例如,待热循环
的泡罩可以在加热器1710处开始进行变性,然后加热器组件1700可以被平移,使得泡罩可
以在加热器1720的温度控制下进行退火,然后加热器组件1700可以被平移,使得泡罩可以
在加热器1730的温度控制下进行伸长/变性,然后可以在加热器组件平移相反方向的情况
下重复该过程。例如,具有三个加热器而不是两个加热器的热循环可以提供更大的温度均
匀性并减少前缘上的泡罩部分在给定温度花费较少的时间的所谓的“边缘效应”。因为加热
器组件1700在每个方向上允许从变性到退火再到变性的转变,所以认为泡罩的所有部分对
给定温度将接受较均衡的暴露。在另一个实施例中,三个加热器可以被设定在三个不同的
温度,说明性地被设定在退火温度、伸长温度和变性温度。
[0179] 加热器1710、1720和1730可以是珀尔帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器或本领域已知的其他加热器。在一个
实施例中,加热器1720可包括珀耳帖元件。如上面参考加热器1286和1287所讨论的,虽然加
热器1720可以不是热循环的,但是例如可能希望包括珀耳帖元件。与典型的电阻加热器不
同,珀尔帖元件可以主动冷却以及加热样品。在另一个实施例中,加热器1710或1730中的一
个或两个也可以包括珀耳帖元件。例如,加热器1710或1730中的一个或两个可被定位成参
与以下步骤,例如但不限于加热/冷却样品制备、热启动等,其可受益于通过珀尔帖元件提
供的精细温度控制和主动冷却。说明性地,绝缘间隔物1715和1725可以分别被设置在加热
器1710和1720与1720和1730之间。可以使用任何合适的绝缘材料,包括泡沫、塑料、橡胶、空
气、真空、玻璃或说明性地具有低导电性的任何其他合适的材料。在加热器1710、1720和
1730保持在大致恒定的温度的实施例中,运行时间和能量使用可以显著减少。
[0180] 再次参见图14A,其描述了用于填充袋、制备样品、进行第一阶段PCR和进行第二阶段PCR的两种备选顺序。在第一种方法中,样品制备和第一阶段PCR在单独的泡罩中进行。这
在本文中被称为“三区法”。在第一步中,经由填充通道1440将样品注入泡罩1405中。在一个
实施例中,使用在本文其他地方详细描述的擦拭系统在泡罩1405中裂解细胞、病毒等。备选
地,细胞裂解可以用例如但不限于超声装置或珠搅拌器或通过化学裂解的替代的裂解装置
完成。可以通过用本文其他地方详细描述的加热器组件的一个或多个加热元件加热样品
(例如,至约70-90℃)来辅助裂解。裂解后,可以用热电冷却器元件(即珀尔帖元件)将样品
冷却至约0℃至约20℃(例如,约10-15℃)的温度以帮助样品结合到磁珠。其他冷却器元件
包括但不限于流体或气体热交换元件、风扇冷却散热器热管、冷凝单元等。
[0181] 可以通过填充通道1440将磁珠注入泡罩1405中,以便从裂解物中回收核酸,这可以在裂解之前或之后。说明性地,磁珠和裂解物可以冷混合(例如,在约0-10℃的范围内,说
明性地通过调节其中一个加热器的温度)。一旦磁珠和裂解物已经充分混合足够的时间,磁
珠可以被收集在泡罩1405中,其中磁体示例性地被设置在仪器中,并且用过的裂解物可以
通过通道1445被送到液体废物。然后洗涤缓冲液可以通过填充通道1440注入。洗涤缓冲液
和磁珠可以冷混合(例如,在约0-10℃的范围内)。可以再次收集磁珠,并且可以通过通道
1445将用过的洗涤缓冲液冲洗到液体废物。洗涤循环可以重复至少一次。在洗涤之后,可以
通过填充通道1440将洗脱缓冲液(加上第一阶段PCR引物)注入到泡罩1405中。洗脱缓冲液
(加上第一阶段PCR引物)和磁珠可以说明性地在一个或多个加热器的控制下热混合(例如,
在约70℃-90℃)。
[0182] 对于第一阶段PCR,可以通过填充通道1450将PCR预混合物(例如,聚合酶、dNTP和本领域已知的其他扩增组分)注入泡罩1410中。可以在从磁珠引入洗脱液之前加热PCR预混
合物(例如,至约57℃)。在泡罩1405中,可以再次收集磁珠,并且洗脱液可以经由通道1465
被送到泡罩1410。
[0183] 第一阶段PCR可以在泡罩1410中,借助泡罩1410在两个加热器的温度控制下的旋转运动来进行,如本文其他地方详细描述的。备选地,可以通过平移加热器组件或袋1400来
执行第一阶段PCR热循环,使得泡罩1410可以在一个加热器的控制下然后在另一个加热器
的控制下。在第一阶段PCR期间,进入和离开泡罩1410的通道说明性地使用硬密封件关闭。
在一些实施例中,能够通过采用体积减少方案来加速袋中的第一阶段PCR。例如,体积减少
方案可以包括在泡罩1410中以初始体积(例如,~100μL)执行几个(例如,5-10个)PCR循环,
清除泡罩1410的大约一半体积,执行多个(例如,5-10个)PCR循环,并且再次清除大约一半
体积的泡罩1410。体积减少可以减少PCR反应的循环时间,因为较小体积的液体具有较小的
质量并且可以比较大体积更快地热循环。
[0184] 在足够数量的第一阶段PCR循环(例如,20-30个循环)之后,可以将小样品(例如,~1-5μL)的第一阶段PCR发送至稀释孔1415。通道1470可能会被打开;通道1475-1485已关
闭。用于第二阶段PCR的样品可以通过经由通道1460将第二阶段PCR预混合物注入泡罩1425
中来制备。密封件在通道1470和1485上封闭;密封件在通道1475和1480上打开。可以加热泡
罩1420和1425以及孔1415。通过在泡罩1425和1420与孔1415之间混合,可以将孔1415中的
样品与预混合物混合,以稀释用于第二阶段PCR的第一阶段PCR产物。然后打开通道1485,使
得第二阶段PCR混合物可以转移到第二阶段PCR阵列1430中。在另一个实施例中,袋1400可
以包括一个或多个额外的稀释孔和在孔1415和泡罩1425和1420下游以及在阵列1430上游
的混合泡罩组。例如,在具有浓缩的第一阶段PCR引物或具有高浓度产物的一些实施例中,
希望将第一阶段引物和产物稀释至用一个稀释孔可达到的程度。在注入第二阶段PCR阵列
1430之前,可以加热用于第二阶段PCR的混合物用于物理“热启动”。用于阵列1430中的第二
阶段PCR的热循环可以说明性地通过如前所述来回平移加热器组件而实现。
[0185] 在第二种方法中,样品制备和第一阶段PCR在相同的泡罩中进行。这在本文中称为“双区法”。在第一步中,可以通过填充通道1450将样品注入泡罩1410中。在一个实施例中,
使用在本文其他地方详细描述的擦拭系统在泡罩1410中裂解细胞、病毒等。备选地,细胞裂
解可以用例如但不限于超声装置或珠搅拌器或化学裂解的替代的裂解装置完成。可以通过
用本文其他地方详细描述的加热器组件的一个或多个加热元件加热样品到升高的温度(例
如,至约70-90℃)来辅助裂解。裂解后,可以可选地用热电冷却器元件(即珀尔帖元件)将样
品冷却至降低的温度(例如,低于环境温度的温度,例如但不限于~0-10℃)
[0186] 可以通过填充通道1450将磁珠注入泡罩1410中,以从裂解物中回收核酸。通过填充通道1450将磁珠注入泡罩1410。磁珠和裂解物可以冷混合(例如,在约0-10℃的温度范围
内)。一旦磁珠和裂解物已经充分混合足够的时间,磁珠就可以用磁体聚集在泡罩1410中,
并且用过的裂解物可以被送到泡罩1405(即,在该示例中为液体废物泡罩)经由通道1465到
液体废物中。然后可以通过填充通道1450将洗涤缓冲液注入泡罩1410。洗涤缓冲液和磁珠
可以冷混合(例如,在约0-10℃的温度范围内)。再次收集磁珠,并将用过的洗涤缓冲液冲洗
至泡罩1405。如果需要,洗涤循环可重复一次或多次。可将磁珠收集到泡罩1410的上游半部
中,并经由通道1465送至废物泡罩1405。
[0187] 对于第一阶段PCR,可以设置擦拭系统,并且可以将洗脱缓冲液(加引物)注入通道1450中并且可以保持在升高的温度(例如,约57℃)处。同时,如果需要真正的热启动,则可
将第一阶段PCR预混合物注入通道1455并任选地保持在升高的温度(例如,约57℃)处。可以
将第一阶段PCR预混合物与泡罩1410中的引物和模板混合,并且可以如上所述进行第一阶
段PCR。
[0188] 在第一阶段PCR之后,收集磁珠,并且在需要稀释的实施例中,可以将小样品(例如,~1-5μL)的第一阶段PCR产物转移至稀释孔1415。通道1470被打开;通道1475-1485已关
闭。用于第二阶段PCR的样品可以通过经由通道1460将第二阶段PCR预混合物注入泡罩1425
中来制备。密封件在通道1470和1485上封闭;密封件在通道1475和1480上打开。加热泡罩
1420和1425以及孔1415。通过在泡罩1425和1420与孔1415之间混合,可以将孔1415中的样
品与预混合物混合,以稀释用于第二阶段PCR的第一阶段PCR产物。然后打开通道1485,使得
第二阶段PCR混合物可以转移到第二阶段PCR阵列1430中。阵列1430中的用于第二阶段PCR
的热循环可以通过使用珀尔帖平移加热器组件来完成,或者通过如前所述的其他方式。
[0189] 当需要荧光检测时,可以提供光学阵列(参见例如图12A和图13A的相机系统1250和1325)。光学阵列可以包括光源,光源示例性地是滤光的LED光源、滤光的白光或照明,以
及相机。相机示例性地具有多个光电检测器,每个光电检测器对应于袋1400的阵列1430中
的第二阶段孔。备选地,相机可以拍摄包含所有第二阶段孔的图像,并且图像可以被分成对
应于第二阶段孔中的每个的单独的场。根据构造,光学阵列可以是静止的,或者光学阵列可
以被放置在附接到一个或多个电机的移动器上并且移动以从每个单独的第二阶段孔获得
信号。应理解的是,其他布置也是可能的。
[0190] 示例1:高密度PCR
[0191] 在一个示例中,已知用于常见呼吸道病毒的标准商业免疫荧光测定可以检测七种病毒:腺病毒、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、甲型流感和乙型流感。更完整的板说明性地将包括对
于以下其他病毒的测定:冠状病毒、人偏肺病毒、鼻病毒和非HRV肠道病毒。对于诸如腺病毒
或HRV的高度可变的病毒,理想的是使用多个引物来确定病毒谱系的所有分支(说明性地分
别为4个外部因五组和4个内部引物组)的靶。对于如冠状病毒的其他病毒,有4种不同的谱
系(229E、NL63、OC43、HKU1),这些谱系在不同季节之间不同,但它们的分歧足够大,需要单
独的引物组。 呼吸面板(BioFire Diagnostics,LLC,盐湖城,UT)包括腺病毒、
冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、人类转移病毒、人类鼻病毒/
肠病毒、甲型流感、甲型流感/H1、甲型流感/H3、甲型流感/H1-2009、乙型流感、副流感病毒
1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4和呼吸道合胞病毒。除了这些病毒外,
呼吸面板还包括三种细菌:百日咳博德特氏菌、肺炎衣原体和肺炎支原体。高
密度阵列581能够将这样的面板容纳在单个袋510中。其他面板可用于 每个面
板测定至少20种病原体。
[0192] 示例2:快速PCR
[0193] 使用图6-图8的袋和加热器构造的原型仪器用来扩增DNA。75μl样品包含10,000份的110bp合成DNA分子和10x的较高引物(每种引物5μM)和DNA聚合酶(2U/μL)浓度(与标准
PCR浓度相比,如US205-0118715中教导的,该公开已经通过引用并入本文),且dNTP为
0.45mM和5mMMg++。1X LCGreen用于检测。应理解的是,反应混合物仅是说明性的。根据循环
时间,增强的引物和聚合酶浓度可能是有益的。参见美国专利申请第2015-0118715号(其已
通过引用并入本文),来获得增强的引物和聚合酶浓度的更多信息。例如,对于小于20秒的
循环时间,期望在多重反应中具有至少0.5μM的聚合酶和至少1μM的每种引物或在单重反应
中具有2μM的每种引物。加热器986设定为90℃,加热器987设定为57℃。将该混合物密封在
泡罩549中并用擦拭器989运行,擦拭器989以每10秒一个完整旋转的速度旋转。应理解的
是,旋转速度对应于循环时间。
[0194] 作为对照,PCR化学反应(具有增强的引物和聚合酶浓度)在标准块热循环仪中在96℃和60℃之间循环,与硬件允许的速度一样快(1秒保持,每个循环48秒)。为了比较两个
系统的扩增效率,在5、10、15和20个循环的“循环过程”中在每个仪器中扩增相同的PCR反
应。在第一阶段PCR后,将这些反应稀释100倍进入嵌入式第二阶段PCR反应,并在Roche 
LC480实时PCR仪器中扩增。
[0195] 图19-图20示出了图6-图8的原型仪器中的PCR结果。在图19中,将不同速度下擦拭系统中用于第一阶段反应的解链曲线与LC480中用于扩增的解链曲线进行比较。图20示出
了循环过程的结果。在图6-图8的原型中扩增以及在LC480块热循环仪中扩增重叠并且通过
R2值>0.99的线拟合。在
[0196] 图20中,这些线的斜率表示LC480中的一个循环与原型中的一个循环相比的相对效率。块循环器的效率(斜率为1.08)略大于擦拭器叶片系统(0.93)的效率,表明比块热循
环仪的全效率略低,约为3分20秒。
[0197] 示例3:使用两个温度区的三温度PCR
[0198] 如上所述,一些PCR方案使用三个温度,用于退火的第一温度、稍高的延伸温度(其基于酶活性来说明性地选择)、和用于变性的第三最高温度。虽然图18示出了使用三个加热
器930、931、932的实施例,但是在一些实施例中,可能希望快速地热循环更大的体积。说明
性地,希望通过三个温度热循环第一阶段PCR,其中诸如加热器组件988的加热器可能不能
按照期望快速加热和冷却泡罩564的内容物。
[0199] 在一个这样的实施例中,可能需要在图1的袋510中的第一阶段PCR中使用三步PCR方案。如上所述,图2的第一阶段加热器886定位于加热并冷却用于第一阶段PCR的泡罩564
的内容物。在一个实施例中,可以提供加热器887以控制泡罩548的内容物的温度,其中加热
器886和887被一起控制并一起循环。在另一个实施例中,加热器886和887可以处于单独的
控制下,说明性地,加热器887可以被设置成保持合适的退火温度,而泡罩886可以被设置成
保持合适的变性温度,尽管应该理解这仅是说明性的,且加热器可以颠倒。其他构造也是可
能的。在美国专利申请第2014-0038272号中更全面地讨论了使用两个加热区的两次温度
PCR,该专利申请通过引用整体并入本文。
[0200] 在一个实施例中,珀耳帖加热器或诸如美国专利申请第15/099,721号(通过引用并入本文)中公开的那些加热器,可以用于加热器887、888和本文讨论的其他加热器,尽管
其他加热器或加热器组件如本领域已知的那样,可以用于在两个温度区中获得三温度循
环,条件是这些加热器的温度是可调节的。在一个实施例中,期望对这些加热器进行主动控
制。
[0201] 图21中示出了一个示例,其中虚线示出了样品的温度。在该示例中,其中加热器887可以用于退火温度,加热器887的温度可以被设定在期望的退火温度,说明性地60℃,但
是应该理解该温度仅是说明性的并且其他退火温度可以根据引物的长度和GC含量使用。当
样品移动到泡罩548中时,样品可以保持在泡罩548中,直到整个样品达到退火温度。在一些
说明性方案中,可能需要在样品达到退火温度后将样品保持在泡罩548中一段时间。在另一
个说明性实施例中,如图21中的虚线所示,加热器887可以保持在低于退火温度几度的温
度,说明性地低于退火温度2至20度(“低退火温度”),说明性地为55℃,但其他温度也可能
是合适的。当样品从泡罩564移动时,该泡罩564处于加热器886的控制下并且基本上比退火
温度更热,样品可以更快地冷却到退火温度,因为加热器887低于退火温度。可选地,囊袋
848的移动可以混合泡罩548中的流体样品以在泡罩548内获得更均匀的温度。一旦样品流
体已经在泡罩548中一段时间,基本上所有流体都处于退火温度处或退火温度附近,那么加
热器887可以被调节到退火温度,如图21中的虚线“---”所示。保温说明性地2秒至5秒可以
允许适当的退火,尽管根据所使用的化学组分保温可能没有必要。然后可以将样品移动到
泡罩564。一旦样品已经离开泡罩548,如图21所示,然后可以将加热器887的温度调节回到
低退火温度以准备好进行下一循环。应理解的是,许多加热器需要更多时间来冷却而不是
加热,并且当泡罩546是空的并且加热器887上的热负荷最小时,可更快地冷却加热器887。
[0202] 在一个示例中,根据扩增长度、GC含量和聚合酶的选择来选择合适的延伸温度,说明性地为72℃,但是其他延伸温度也可能是合适的。如图21中的实线(——)所示,当样品仍
然在泡罩548中时,加热器886可以调节到比延伸温度高几度的温度,说明性地比延伸温度
高2到10度(“高延伸温度”)。一旦样品流体已经在泡罩564中一段时间使得基本上所有流体
处于或接近延伸温度,那么加热器887可以从高延伸温度调节到延伸温度,如图21的实线所
示。如上面关于泡罩548所讨论的,囊袋864的可选移动可以将泡罩564中的流体样品混合以
在泡罩564内获得更均匀的温度。根据方案保温说明性地0秒至5秒可以允许适当的延伸。在
此保温之后,然后可将加热器886调节至变性温度或变性温度以上几度,以使核酸变性。应
理解的是,如果将加热器886调节到高于变性温度的温度,则流体样品可以更快地达到变
性。同样,囊袋864的可选移动可以将泡罩564中的流体样品混合以在泡罩564内获得更均匀
的温度。一旦样品已经变性,可选地在变性温度下保持或不保持,样品可以移回到泡罩564
中,加热器886的温度可以调节到高延伸温度,这可以在没有泡罩564中的样品的情况下更
有效地获得,并且该循环重复足够次数以进行扩增。如果这是第一阶段PCR,则应理解可能
需要减少循环次数,循环次数足以富集靶,而如果这是第二阶段或单个阶段,则可能需要热
循环至平台阶段或超过平台阶段。
[0203] 可以使用标准PCR化学品在标准PCR循环方案中进行三次温度循环,说明性地每个循环20秒或更长。如果需要,可以添加使用增强浓度的聚合酶或引物的极端PCR化学品,并
且可以使用更快的热循环方案,如美国专利公开第2015-0118715号中所公开的,其通过引
用并入本文。应理解的是,增加浓度的聚合酶或引物可能导致形成增加的引物二聚体和其
他非特异性扩增产物,除非循环时间减少,并且使用的聚合酶或引物浓度越大,循环时间越
快,其中聚合酶和引物可以增加且循环时间大致成比例减少。应该能够使用10秒或更短的
循环时间。
[0204] 示例4:快速多重PCR
[0205] 使用类似于图6-图8的袋和加热器构造的原型仪器用于样品中DNA的多重扩增。模板是天然和合成模板的混合物——模板是一个长度为105bp的合成扩增子(内部称为
“mephisto”)、一种长度为164bp的合成扩增子(内部称为“Baal3”)、酿酒酵母序列(天然扩
增子长度364bp,内部称为“啤酒(beer)”)、M13(天然扩增子长度264bp)和MS2(天然扩增子
长度309bp)。制备150μl和75μl样品,其包含1000份的每个模板,对每个模板都独特的正向
和反向引物(每种引物5μM)、DNA聚合酶(2U/μL)、0.45mM的dNTP和5mMMg++。1XLCGreen用于
检测。应理解的是,反应混合物仅是说明性的,可以使用其他混合物。将这些混合物密封在
150μl和75μl等分部分的泡罩(例如,泡罩549)中。对于150μl反应,第一加热器(例如,加热
器986)被设定到103℃,第二加热器(例如加热器987)被设定到55℃。对于75μl反应,第一加
热器(例如,加热器986)被设定到102℃,第二加热器(例如,加热器987)被设定到55℃。根据
例如图6-图8中所述的方法对这些反应进行热循环,一个或多个擦拭器叶片949与泡罩接触
并且擦拭器头989以每8秒一个完整旋转的速度旋转(例如,旋转180°的循环,保持4秒,旋转
180°,保持4秒等;或旋转90°,保持2秒,旋转90°,保持2秒等,其中旋转时间可忽略不计)。应
理解的是,旋转速度对应于循环时间,每个完整旋转代表一个循环。而且,在该示例中使用
在每个四分之一圈之后保持,但这仅是说明性的并且可以设想连续旋转。在第一阶段PCR
后,将这些反应稀释100倍进入嵌入式第二阶段PCR反应,并在Roche LC480实时PCR仪器中
扩增。
[0206] 图22示出第二阶段PCR中的解链实验的结果,该结果显示所有第一阶段PCR反应均成功。在第一阶段PCR和第二阶段PCR中扩增所有模板,并且所有产物在其预期温度下解链。
这表明原型系统可用于多重第一阶段PCR。
[0207] 示例5:快速PCR
[0208] 在该实施例中,根据标准PCR方案,合成DNA模板(mephisto)在LC480仪器中扩增用于第一阶段PCR。来自第一阶段反应的扩增产物用第二阶段扩增混合物(例如,独特的正向
和反向引物(每种引物5μM)、DNA聚合酶(2U/μL)、0.45mM的dNTP、5mMMg++以及用于检测的
1XLCGreen染料)以1:100稀释,并注入类似于图14A的阵列1430或图15A的阵列1500的5孔阵
列中。阵列的每个孔的体积约为0.5μL。将样品热循环用于原型仪器中的第二阶段PCR,所述
原型仪器类似于图12A-图13B中所示的仪器。该阵列用类似于加热器组件1270和1335的双
元件加热器进行热循环,其中第一加热器被设定在96℃,第二加热器被设定在60℃。根据参
考图16A-图16F讨论的过程对阵列进行第二阶段PCR,并且具体参考图16E和图16F。将具有
第二阶段PCR样品的阵列在8秒/循环(在96℃下4秒,在60℃下4秒等)下热循环40个循环。
[0209] 图23和图24示出了第二阶段PCR反应的结果。图23示出了阵列的每个孔中荧光的变化作为循环数的函数,图24示出了阵列的每个孔中DNA产物(如果存在)的解链曲线。图23
和图24示出反应对于阵列的孔1是最成功的(图23),并且产物在mephisto产物的预期温度
下具有解链转变(图24)。该示例说明第二阶段PCR可以通过双温度加热器单元成功地进行,
其中加热器通过相对于阵列移动加热器组件而将阵列从一个温度转变为另一温度。应理解
的是,也可以通过相对于加热元件移动阵列(例如,通过横向平移样品容器或将样品容器定
位在仪器中的接收器)来实现热循环。
[0210] 示例6:快速第一阶段和第二阶段PCR
[0211] 在该示例中,合成DNA模板(mephisto)在类似于图14A中所示的袋1400的反应容器中扩增用于第一阶段PCR和第二阶段PCR。对于第一阶段PCR,模板DNA的约75,000份、对模板
独特的正向和反向引物(每个引物5μM)、DNA聚合酶(2U/μL)和0.45mM的dNTP以及5mMMg++组
合,75μL被注入并密封在泡罩(例如,泡罩1410)中用于第一阶段PCR反应。将反应容器放置
于类似于用于PCR扩增的仪器1300的仪器中。
[0212] 对于第一阶段PCR,第一加热器(例如加热器1387)被设定到58℃,第二加热器(例如加热器1386)被设定到106℃。加热器组件(例如,加热器组件1335)被定位成使得反应泡
罩的大约一半的温度可以由第一加热器控制,并且剩余部分的温度可以由第二加热器控
制。根据例如图6-图8中所述的过程,将反应泡罩的内容物在仪器中热循环,且一个或多个
擦拭器叶片(例如,擦拭器叶片1149)与泡罩接触并且擦拭器头(例如,擦拭器头1100)以8秒
的循环时间旋转(例如,旋转90°的循环,保持2秒,旋转90°,保持2秒等)。应理解的是,旋转
速度对应于循环时间,其中一个完整旋转等于一个循环。
[0213] 在第一阶段PCR反应泡罩(例如,泡罩1410)中进行20个循环的第一阶段PCR之后,通过在袋的两个较大体积的泡罩(例如,泡罩1420和1425)之间混合,将第一阶段PCR反应的
一部分(例如,~1μL)移动到体积测量孔(例如,体积孔1415)并与第二阶段PCR试剂(DNA聚
合酶(2U/μL)、0.45mM的dNTPs、2mMMg++和用于检测的1XLCGreen)混合。应理解的是,可通过
改变体积测量孔的体积或通过改变稀释剂的体积来调节稀释水平(说明性地为聚合酶、
dNTP和合适的缓冲液;尽管其他组分也可能是合适的,特别是对于非PCR扩增方法)从第一
阶段PCR加入到样品中。如果需要,样品和第二阶段PCR预混合物的这种混合物可以在移动
到第二阶段阵列以进行第二级扩增之前在体积孔1415和泡罩1420和1425中预热。这种引物
与预混合物的预热和分离可以避免在第二阶段PCR混合物中需要热启动组分(抗体、化学品
或其他)。
[0214] 在例如体积孔1415和泡罩1420和1425中制备用于第二阶段PCR的样品之后,可以将样品移动到类似于用于第二阶段PCR的阵列1430的阵列。阵列的每个孔预装载有特异性
正向和反向PCR引物。将引物以2.5μM或5μM点在阵列的孔中。通过用第二阶段PCR预混合物
淹没阵列来填充阵列的孔。阵列的孔可以通过在阵列上方膨胀透明的柔性囊袋来热密封
和/或密封,以密封进入填充通道的通路。也可以通过在阵列上方使透明的柔性囊袋膨胀来
从阵列中清除过量的第二阶段PCR预混合物。在这种情况下,透明的柔性囊袋膨胀至约
20psi的压力。如图16E和图16F所示,用于第二阶段PCR的热循环可以通过在阵列下来回平
移加热器组件1335来完成,使得各个孔的阵列和内容物处于第二加热器的温度控制下(例
如,用于变性的加热器1386),然后是第一加热器(例如,用于退火和伸长的加热器1387),然
后是第二加热器(用于再次变性)等。在该示例中,第二加热器被设定到102℃,并保持在第
二加热器处2秒,第一个加热器被设定在65℃,保持6秒。第二阶段反应被热循环共30个循
环。用与图13A和图13B中所示的相机1325类似的相机监测阵列中的核酸扩增和DNA解链。
[0215] 图25-图27描绘了第二阶段PCR反应的结果。图25描绘了阵列孔中荧光的增加作为循环数的函数。可以看出,DNA扩增发生在阵列的所有孔中。同样地,在每个孔中观察到用于
扩增的类似时间过程(例如,交叉点)。图26和图27描绘了解链实验的结果,以确保被扩增的
产物是正确的产物。图26是原始解链曲线,图27是解链曲线的负一阶导数(dF/dt)。如图26
和图27所示,所有孔中的产物在基本相同的温度下具有解链转变。所有孔的解链转变发生
在约84℃,这是该特定合成扩增子的预期解链温度。
[0216] 实施例7:第二阶段PCR阵列中的温度校准和热循环速度
[0217] 现在参考图28-图31,示出了被设计用于测试类似于阵列1430或阵列1500的阵列的一个或多个孔中的流体的温度响应的一系列实验的结果。在实验中,将小的热电偶插入
阵列的一个或多个孔中并密封在膜层之间。对于热循环,将阵列用PCR水性缓冲液填充,被
插入类似于仪器1200或1300的仪器中,并根据参照图16E和图16F描述的方案进行热循环。
对于这些实验,仪器中的透明柔性的囊袋在阵列上方膨胀至约20PSI。这些实验表明,在高
温和低温加热器中,阵列中的流体的温度响应具有不同的保压时间;不管所示示例中的保
压时间如何,加热器的转变时间(例如,高温到低温或低温到高温)相对于保压时间是快速
的。这些数据和未示出的其他数据被用于开发温度模型,该温度模型包括加热器的设定点,
每个温度下的保压时间,以及阵列和其中的流体的热响应,以便用户可以可靠地设置用于
热循环的阵列中的流体和具有各种引物组的各种模板的扩增的高和低的目标温度。
[0218] 在图28所示的实验中,目标终点温度为95℃和62℃。加热器被设定在98℃和62℃,在每个温度区有4秒的保持时间(即保压时间)。目标终点温度为95℃和62℃。因为该实验包
括相对长的保持时间,所以加热器的设定点和目标温度相对较近。从图28中可以看出,一个
或多个孔中的流体(~0.5μL)可以利用这些加热器设定点、保持时间和本文其他地方所描
述的平移加热器方案在~95℃和~62℃之间进行热循环。
[0219] 在图29所示的实验中,加热器被设定在97℃和62℃,在每个温度区保持4秒。在该实验中目标终点温度为94℃和62℃。从图29中可以看出,一个或多个孔中的流体(~0.5μL)
可以利用这些加热器设定点、保持时间和平移加热器方案而在~94℃和~63℃之间进行热
循环。
[0220] 在图30所示的实验中,加热器被设定在99℃和56℃,在每个温度区具有2秒的保持时间。目标终点温度为96℃和61℃。从图30中可以看出,一个或多个孔中的流体(~0.5μL)
可以利用这些加热器设定点、保持时间和平移加热器方案而在~96℃和~61℃之间进行热
循环。
[0221] 在图31所示的实验中,加热器被设定在108℃和52℃,在每个温度区保持1秒钟。目标终点温度为95℃和63℃。从图31中可以看出,一个或多个孔中的流体(~0.5μL)可以利用
这些加热器设定点和平移加热器方案(即使保持时间为低至1秒)在~95℃和~63℃之间进
行热循环。如在例如美国专利公开第2015/0118715号以及美国专利公开第2016/0289736号
(两者通过引用整体并入本文)中所描述的,化学调节(其中聚合酶和引物浓度增加)可以允
许聚合酶链式反应以与8秒、4秒、2秒或更短的循环时间相容的速率进行。
[0222] 在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下,本发明可以以其它具体形式实施。所描述的实施例在所有方面仅被认为是示例性的而非限制性的。因此,本发明的范围由所
附权利要求而非前述说明来表示。虽然为了描述本发明的实施例的目的而将在发明和所附
公开的内容中包括了某些实施例和细节,但是对于本领域技术人员来说,在不脱离由所附
权利要求限定的本发明的范围的前提下,可以允许对此处公开的方法和装置进行各种变
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