光电子探测系统
阅读：74发布：2021-05-31
专利汇可以提供光电子探测系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及探测一或多种靶颗粒的光 电子 系统。该系统包括一个反应室，一个样品收集器，一个光学探测器，和一个含有细胞的容器，每个所述细胞都具有受体，所述受体存在于每个细胞的表面上并且对待测靶颗粒具有特异性，其中所述靶颗粒与所述受体的结合将直接或间接地激活一个报告分子，由此产生一个可测量的光学 信号 。，下面是光电子探测系统专利的具体信息内容。
1、一种探测靶颗粒的光电子系统，该系统包括
一个第一反应室；
一个样品收集器，用于收集存在于一种介质中的待测颗粒，该收 集器被设计成能将待测颗粒沉积到第一反应室中；
一个第一容器，它含有第一发光细胞，每个第一发光细胞都具有 第一受体，所述受体表达在每个第一发光细胞的表面上并对一种待测 的第一靶颗粒具有特异性，其中每个第一发光细胞还含有一种第一发 光分子，该第一发光分子在应答所述第一靶颗粒与第一受体的结合时 将发出一个第一光子，其中所述第一容器被设计成能将至少一部分的 所述第一发光细胞沉积到所述第一反应室中；以及
一个光学探测器，它被设定得能接收所述细胞所发出的光子，
其中所述第一反应室、样品收集器和第一容器被设置为可使得根 据待测颗粒的尺寸而将所述待测颗粒或者至少一部分的所述第一发 光细胞沉积到所述第一反应室中。
2、权利要求1的系统，其进一步包括一个能连接于所述第一 反应室并且在旋转时向第一反应室施加一个向心力的转子，所述向心 力的大小足以将大部分的待测颗粒或大部分的第一发光细胞收集到 第一反应室的一部分中。
3、权利要求1的系统，其中所述第一反应室被安装在一个可 动台上，其中在一个第一位置处该可动台将所述第一反应室置于一个 第一构型，该第一构型使收集器能将待测颗粒沉积到所述第一反应室 中，并且其中在一个第二位置处该可动台将所述第一反应室置于一个 第二构型，该第二构型使所述第一容器能将至少一部分的第一发光细 胞沉积到所述第一反应室中。
4、权利要求1的系统，其中所述光学探测器包括电荷耦合器 件、雪崩光二极管、CMOS图像探测器、光电倍增管、或光电倍增阵 列管。
5、权利要求1的系统，其中所述介质是一种气体。
6、权利要求1的系统，其中所述介质是一种液体。
7、权利要求1的系统，其中所述发光细胞是B细胞。
8、权利要求7的系统，其中所述B细胞含有编码所述第一受 体的人工表达质粒。
9、权利要求8的系统，其中所述第一受体是单链抗体。
10、权利要求1的系统，其中第一靶颗粒是病毒、细菌、蛋白、 核酸、真菌、原生动物、多细胞寄生虫、或朊病毒、以及由这些颗粒 产生或诱导的产物。
11、权利要求1的系统，其还包括一个控制机械装置，所述机 械装置能按顺序沉积所述待测颗粒和至少一部分的所述第一发光细 胞。
12、权利要求11的系统，其中所述的顺序是首先沉积至少一部 分的所述第一发光细胞，其后沉积所述待测颗粒。
13、权利要求11的系统，其中所述的顺序是首先沉积所述待测 颗粒，其后沉积至少一部分的所述第一发光细胞。
14、权利要求1的系统，其中所述第一容器进一步含有第二发 光细胞，每个所述第二发光细胞都有第二受体，所述受体表达在所述 第二发光细胞表面上并对待测的第二靶颗粒具有特异性，每个第二发 光细胞进一步含有一种第二发光分子，该第二发光分子在应答所述第 二靶颗粒与第二受体的结合时发出一个第二光子，其中所述第一容器 被设计成能将至少一部分的所述第二发光细胞沉积到所述第一反应 室中，并且其中所述第二光子的波长不同于所述第一光子的波长。
15、权利要求1的系统，其进一步包括一个空气采样装置。
16、权利要求1的系统，其中同时对多个样品进行多种靶颗粒 的分析。
17、权利要求1的系统，其中所述第一受体包括抗体。
18、一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方法包括：
a.将液体样品沉积到一个第一反应室中；
b.将发光细胞自一个第一容器加入到一个第二反应室中，所述 发光细胞包含一或多种适合于与一种靶颗粒相互作用的受体以及发 光分子，所述发光分子在应答一或多种受体与所述靶颗粒的相互作用 时发出光子，所述第二反应室由一个可控膜与所述第一反应室隔离；
c.将所述靶颗粒定位化在所述第一反应室内；
d.使膜溶解；
e.使所述发光细胞定位化在所述第一反应室内；和
f.测量所述混合物中的发光细胞的光子发射。
19、一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方法包括：
a.将发光细胞加入到一个室中，所述发光细胞包含一或多种适 合于与一种靶颗粒相互作用的受体以及发光分子，所述发光分子在应 答一或多种受体与所述靶颗粒的相互作用时发出光子；
b.用沉降法使所述细胞在该室内定位化；
c.加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d.使所述靶颗粒定位化；
e.通过对所述颗粒施加驱动力或去除定位化力将浓缩的颗粒带 到与细胞相同的区域；
f.测量所述混合物中的细胞的光子发射。
20、一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方法包括：
a.将发光细胞加入到一个室中，所述发光细胞包含一或多种适 合于与一种靶颗粒相互作用的受体以及发光分子，所述发光分子在应 答一或多种受体与所述靶颗粒的相互作用时发出光子；
b.用沉降法或流动法使细胞在该室内定位化到一个屏障、可透 性膜、或过滤器上；
c.加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d.使所述样品从有细胞一侧流过该屏障、可透性膜、或过滤器 以使得颗粒与所述细胞接触；
e.测量所述混合物中的细胞的光子发射。
21、一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方法包括：
a.将发光细胞加入到一个第一室中，所述发光细胞包含一或多 种适合于与一种靶颗粒相互作用的受体以及发光分子，所述发光分子 在应答一或多种受体与所述靶颗粒的相互作用时发出光子；
b.通过沉降法或流动法使所述细胞在所述第一室内定位化到一 个屏障上；
c.将液体样品中的靶颗粒加入到一个第二室中，该第二室在所 述屏障的相对于有发光细胞一侧的另一侧与所述第一室相连接；
d.在重力或离心力作用下使样品流经屏障以使得颗粒与所述细 胞接触；
e.测量所述混合物中的细胞的光子发射。
22、权利要求18-21中任一项的方法，其中采用离心力进行定 位化的的步骤，且定位化和测量光子发射的步骤是在单个设备中使用 在单个样品容器中的所述样品混合物进行的。
23、一种探测空气样品中的靶颗粒的方法，该方法包括：
a.通过样品收集器收集空气样品中的靶颗粒；
b.将空气样品自样品收集器沉积到一个第一反应室中；
c.使空气样品中的靶颗粒定位化到一个表面上或第一反应 室的内表面上；
d.将发光细胞自第一容器加入到第一反应室中以形成一种 混合物，所述发光细胞包含一或多种适合于与靶颗粒相互作用的受体 以及发光分子，所述发光分子在应答一或多种受体与所述靶颗粒的相 互作用时发出光子；
e.用液体去除法定位化所述混合物中的所述发光细胞；和
f.测量所述混合物中的发光细胞的光子发射。
24、权利要求18-21或23中任一项的方法，其中所述发光细胞 是B细胞。
25、权利要求18-21或23中任一项方法，其中同时对多个样品 进行多种靶颗粒的分析。
发明背景
由于“穷人的核武器”即生物化学武器的激增，加强了对能够长 期监视环境的小型、快速、灵敏的生物制剂探测器的需求。在战场环 境中，当一个有效的探测器探测到了特定的生物或化学制剂时，将能 快速地向士兵发出告警，使之能快速地采取应对措施。
这种探测器同样可以有非军事的应用。在患者体内快速地探测到 能抵抗抗生素的细菌将有助于医生选择更为有效的治疗方案。对城市 饮用水供应系统的持续监测将可给出存在潜在病原体的早期警告，使 公共建设管理人员有更多的时间来控制可能出现的危及公众健康的 情况。此外，把这种探测器应用于肉和禽类的检测将是对目前“探嗅” 式检测的一个重大改良。总的来说，在医学(如兽医学)、农业、环 境保护(如诊断病态建筑物综合征(sick building syndrome))和食品 处理或标准制订等领域均急需应用这种探测器以进行分析和诊断。
所有脊椎动物都可对外来物质(抗原)产生特异性免疫反应，其 部分原因在于脊椎动物产生的抗体分子具有巨大的多样性 (diversity)。抗体分子能够以高度的特异性与抗原相结合，例如，它 们能区别两类密切相关的细菌、病毒、蛋白质、核酸、真菌、原生动 物、多细胞寄生物或原生物以及由其产生或诱导的产物，并与之结合。
抗体是由B细胞所产生的，B细胞是免疫系统中的一个关键成 分。抗原可通过结合B细胞表面上的抗体而激活B细胞，从而导致 一系列细胞内的生化反应，这些反应使钙离子流入(influx)B细胞 的细胞质。
有关抗体的结构、功能和B细胞激活的综述，请参见Paul编著 的“Fundamental Immunology(免疫学基础)”，第三版，Raven Press， New York(1993)。
发明内容
在美国专利No.6 087 114和申请日为1998年10月9日的未决 申请USSN 09/169 196中，已描述了一些利用抗体多样性来探测种类 多样而又含量稀少的(multiple and rare)靶颗粒(target particle)或 抗原的装置。
这些装置一般包括：一种用于容纳传感细胞(如B细胞或成纤 维细胞)的液体介质，一个光学探测器，以及一种用来接收待探测靶 颗粒的液体介质。每个细胞均有受体(如嵌合抗体(chimeric antibody) 或单链抗体)，它们表达于细胞表面，并对被测抗原有特异性。抗原 与受体的结合将产生一个涉及化学变化或生化变化(如钙浓度的增 大)的信号途径。这些细胞还在其细胞质中含有发光分子(如水母发 光蛋白质(aequorin)或indo-1)，这些发光分子能针对上述信号途径 (如细胞质中的钙浓度增大)产生反应而发射光子。探测器可以用一 个可透过光子的覆盖物(如玻璃)与所述含细胞的介质分开。这一覆 盖物可以用来支撑介质、保护探测器易碎表面、或起透镜的作用。光 学探测器，例如电荷耦合器件(CCD)，能够探测到细胞作为对受体 介导的信号途径的应答而发射的光子，并向用户指明已出现了待探测 的抗原。可以使用的其他光学探测器还有光电倍增管、光二极管、互 补金属氧化物半导体(CMOS)图像探测器(例如参见 http://kodak.com/US/en/corp/researchDevelopment/technologyFeatures/c mos.shtml)、雪崩光二极管、和像增强电荷耦合器件(ICCD)(例如 见那些可从英国photek Ltd.，East Sussex购得的器件)。在一些实施方 案中，光学探测器能够区分各个单个细胞。
本发明部分地基于下述发现：随着待探测靶颗粒大小的不同，待 测的待测颗粒应该在发光细胞于反应室(如离心管)中被沉积之前或 之后与该发光细胞相混合。已发现沉积顺序对探测效率的高低有极大 的影响。当靶颗粒是细菌从而远小于B细胞时，在离心管内沉积和 浓缩B细胞之前首先在离心管内沉积浓缩待测颗粒可以大为提高探 测效率。这一事实的部分原因是，不同大小的颗粒(如细胞和细菌) 有不同的颗粒沉降速率(sedimentation rate)。如果把细胞和细菌混合 在一起同时进行离心，则细胞将快速地凝聚成团而大部分的细菌却至 少在一段时间内将停留在细胞团上方的液体中。反之，如果在把较大 的发光细胞以低速驱入待测颗粒内之前，预选以高速旋转使待测颗粒 浓缩集中，则可以增加而不是减小细胞与颗粒的接触。如果靶颗粒(如 原生动物)大于B细胞，则顺序可以反转过来或简化为B细胞和待 测颗粒的单次离心。由于这里所描述的探测系统依赖于发光细胞与靶 颗粒的接触，所以重要的是应该尽快和尽量高效地达到接触。因此， 反应室内的定位化(localization)顺序对于改善探测是重要的。
此外，分开地把发光细胞和待测颗粒放入一个或几个反应室可为 系统提供灵活性并允许探测多个样品中的多种靶颗粒。例如，可以使 多种分别对不同的靶具有特异性的发光细胞与单独一种颗粒样品相 接触。或者可以使同一种发光细胞与不同的颗粒样品相接触。是否将 分别对不同抗原或靶颗粒具有特异性的不同发光细胞放置到空间上 分开的不同反应室内，取决于不同发光细胞的光子波长是不同的还是 相同的。如果波长相同，则反应可以是，但不需要一定是分开进行的。 有关多重探测需要考虑的问题请参见美国专利No.6,087,114和 USSN 09/169,196。
本发明的一个方面是一种用于探测靶颗粒的光电子系统，该系统 包括：
一个第一反应室；
一个样品收集器，用于收集存在于介质中的待测颗粒，该收集器 被设计成能在第一反应室中沉积待测颗粒；
一个含有第一发光细胞的第一容器，每个第一发光细胞都含有第 一受体(如抗体)，所述受体表达于每个第一细胞表面上并对待探测 的第一靶颗粒具有特异性，其中每个第一发光细胞还含有一个第一发 光分子，所述分子能在应答于所述第一靶颗粒与所述第一受体的结合 时发射第一光子，其中所述第一容器被设计成能将至少一部分的所述 第一细胞沉积在所述第一反应室内；以及
一个准备接收所述细胞所发射的光子的光学探测器。
该系统还可以包括一个转子，该转子适合于与所述第一反应室相 连接，并且，当其旋转时将向所述第一反应室施加一个向心力或离心 力，这个力足以把大部分的所述待测颗粒或第一发光细胞收集到第一 反应室的某一部分内。
本发明的另外方面是任何具有以下性质的上述系统：其中第一反 应室被安装在一个可动台上，其中在一个第一站处该可动台使第一反 应室置于一个第一构形(configuration)，以使得收集器将待测颗粒沉 积在第一反应室内，并且其中在一个第二站处该可动台使第一反应定 处于一个第二构形，以使得第一容器将至少一部分的第一发光细胞沉 积在第一反应定内；其中光学探测器包括电荷耦合器件，雪崩光二极 管、CMOS图像探测器，光电倍增管或其他光探测器或此类探测器的 阵列；其中介质是一种气体；其中介质是一种液体；其中发光细胞是 B细胞；其中B细胞含有编码第一受体的人工表达质粒；其中第一受 体是单链抗体；其中第一靶颗粒是病毒、细菌、蛋白质、核酸、真菌、 原生动物、多细胞寄生物或朊病毒(prion)，以及由这些颗粒产生或 诱导的产物；其中所述第一靶颗粒选自如下一组：口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、土拉热弗朗西 丝氏菌(Francisella tularensis)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio Cholera)、正痘病毒(orthopoxvirus)(含天花病毒(Smallpox))；其 中第一反应室的一部分包被有载体蛋白层；其中载体蛋白层是牛血清 白蛋白；其中第一反应室的一部分包被有聚L赖氨酸；还包括一个能 按先后顺序沉积待测颗粒和至少一部分第一细胞的控制机械装置；其 中的先后顺序是首先沉积至少一部分第一细胞然后沉积待测颗粒；其 中的先后顺序是首先沉积待测颗粒然后沉积至少一部分第一细胞。
本发明的其他方面是在此所述的系统：还包括一个连接于控制机 械装置的颗粒尺寸探测器，该颗粒尺寸探测器被设计成能探测进入或 存在于收集器内的待测颗粒的尺寸，其中(1)如果颗粒尺寸探测器 探测到待测颗粒的尺寸大于某一参考尺寸，则控制机械装置将设定成 首先沉积至少一部分的第一细胞然后再沉积待测颗粒，以及(2)如 果颗粒尺寸探测器探测到待测颗粒的尺寸小于某一参考尺寸，则控制 机械装置将设定成首先沉积待测颗粒然后再沉积至少一部分第一细 胞；其中控制机械装置包括一个其上安装了第一反应室的可动台，其 中在可动台的第一站处使第一反应室置于一个第一构形状态，以使得 收集器沉积第一反应室中的待测颗粒，并且其中在第二站处使第一反 应室置于一个第二构形状态，以使得第一容器沉积第一反应室中至少 一部分的第二细胞；其中第一反应室包括一个粘性表面，并且收集器 对着粘性表面引导气流；其中第一反应室包括一个过滤器，并且收集 器迫使介质流经过滤器；其中第一容器还包括第二细胞，每个第二细 胞都具有第二受体(如抗体)，所述受体表达于每个第二细胞表面上 并对第二待探测靶颗粒具有特异性，其中每个第二细胞还含有一种第 二发光分子，该第二发光分了在应答于所述第二靶颗粒与第二受体的 结合时将发射第二光子，其中第一容器被设计成能将至少一部分的第 二细胞沉积到第一反应室中，并且其中第二光子的波长与第一光子的 波长不同。
本发明系统还包括在此所述的系统：还包括一个含有第二细胞的 第二容器，每个第二细胞都有第二受体(如抗体)，所述受体表达于 第二细胞表面上并对第二待探测靶颗粒具有特异性，其中每个第二细 胞还含有一种第二发光分子，该发光分子在应答于第二靶颗粒与第二 受体的结合时能发射第二光子，其中第一容器被设计成能将至少一部 分的所述第二细胞沉积到第一反应室中，并且其中第二光子的波长不 同于第一光子的波长；还包括一个第二反应室和一个含有第二细胞的 第二容器，每个第二细胞都含有第二受体(如抗体)，所述受体表达 于第二细胞表面上并且对第二待探测靶颗粒具有有特异性，其中每个 第二细胞还含有一种第二发光分子，该发光分子在应答于第二靶颗粒 与第二受体的结合时能发射第二光子，其中第二容器被设计成能将至 少一部分的第二细胞沉积到第二反应室中，并且其中待测颗粒也在第 二反应室内沉积；还包括一个空气采样装置；还包括一个生物学气溶 胶告警传感器；以及，其中空气采样装置是一个空气撞击器(impactor) 的系统。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、把液体样品加入到一个室中；
b、把发光细胞加入到该室中以形成一种混合物，其中的发光细 胞包括一或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和能 在应答于一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光 或荧光)的发光分子；
c、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液本样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、把液体样品加入一个室中；
b、使靶颗粒在室内定位化(例如利用离心、过滤、电泳、双 向电泳(dielectrophoresis)、磁力(使用亲和力捕获磁珠)、声波或超 声波或其他方法)；
c、加入发光细胞以形成一种混合物，其中的发光细胞包括一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和能在应答于 一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光) 的发光分子；
d、使发光细胞在室内定位化(例如利用离心、双向电泳、重 力沉降、或其他方法在颗粒所在的同一区域产生高浓度的细胞)；
e、测量混合物中细胞的光子发射(如发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、在一个室中加入发光细胞，其中发光细胞含有一或多种适 合于与靶颗粒相互作用的受体(如抗体)和能在应答于一或几种受体 与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光)的发光分子；
b、在室内使细胞定位化(例如通过使它们沉降到一个它们将 会粘着的适当表面上)；
c、加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d、使靶颗粒定位化(例如通过重力沉降、电泳、或其他方法 在细胞所在的同一区域产生高浓度的颗粒)；
e、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、在一个室中加入一些发光细胞，该发光细胞含有一或多种 适合于与靶颗粒互相作用的受体(如抗体)和能在应答于一或多种受 体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如发光或荧光的)的发光分子；
b、使细胞在室内定位化(例如使它们沉降到一个它们将会沾 着的适当表面上)；
c、加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d、使靶颗粒在室内定位化(例如利用磁珠捕获，过滤(带有 或不带有亲和力磁珠捕获)、电泳、双向电泳、声波或超声波、或其 他方法来将颗粒浓缩到靠近细胞的地点)；
e、通过对颗粒施加驱动力(例如电泳、磁驱动或其他手段) 或去除定位化力(例如允许由重力沉降)使得浓缩的颗粒进入细胞所 处的同一区域；
f、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、把一些发光细胞加入到一个室中，其中的发光细胞含有一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和一些能在应 答于一或多种受体与颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧 光)的发光分子。
b、通过沉降或流动使室内的细胞定位化到一个屏障、可透性 膜或过滤器上；
c、加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d、使样品从细胞一侧流经屏障、可透性膜或过滤器，让颗粒 与细胞相接触；
e、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方法包 括：
a、将发光细胞加入到一个第一室中，其中的发光细胞含有一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和一些能在应 答于一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧 光)的发光分子；
b、通过沉降或流动使第一室内的细胞定位化到一个屏障、可 透性膜或过滤器上；
c、将液体样品中的靶颗粒加入到一个第二室中，该第二室在 屏障、可透性膜或过滤器的发光细胞侧的另一侧处与第一室相连接；
d、在重力或离心力的作用下使样品流经屏障、可透性膜或过 滤器，让颗粒与细胞相接触；
e、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光的发 射)。
本发明的另一方向是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方 法包括：
a、将液体样品加入到一个第一室中；
b、将发光细胞加入到一个通过可控膜(例如可电控溶解的金 膜)而与第一室相隔离的第二室中，其中的发光细胞包括一或多种适 合于靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和一些能在应答于一个或 几受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光)的发光 分子；
c、使靶颗粒在第一室内定位化(例如通过离心或其他方法)；
d、使膜溶解；
e、使发光细胞在第一室内定位化(例如通过离心、重力沉降 或其他方法在颗粒所在的同一区域产生高浓度细胞)；
f、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光的发 射)。
本发明的另一个方面是一种探测空气样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、通过撞击、静电吸引或自静态空气落下使空气样品中的靶 颗粒定位化到一个表面或一个室的内表面上；
b、加入发光细胞以形成一种混合物，其中的发光细胞包括一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和能在应答于 一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光) 的发光分子；
c、(任选地)使混合物中的发光细胞定位化(例如通过用过 滤或“灯芯(wicking)效应”除去液体、离心、双向电泳、重力沉 降或其他方法在颗粒所在的同一区域产生高浓度的细胞)；
d、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
在其他方面，本发明方法可以是任何在此所述的方法：其中样品 是空气或液体；其中发光细胞是B细胞；其中发光细胞含有靶颗粒 的抗体；其中发光细胞包含编码抗体的表达质粒；其中发光细胞包含 编码发光蛋白质的核酸；其中发光细胞包含适合于诱导钙迁移的成纤 维细胞；其中测量包括利用一个光电倍增管、光电倍增阵列管或光电 倍增管阵列；其中测量包括利用一个电荷耦合器件、一个雪崩二极管 或雪崩二极管阵列、一个CMOS图像探测器、或一个像增强型电荷 耦合器件(ICCD)。
在其他方面，本发明方法可以是任何在此所述的方法：其中施加 离心力和测量光子发射是在单个设备中进行的，并且样品混合物位于 单个样品槽内；其中施加离心力和测量光子发射在30秒钟或更短时 间之内(如10秒钟或5秒钟之内)进行；其中整个方法在10分钟或 更短时间之内(如5分钟、2分钟或1分钟之内)进行；其中同时对 一个样品中的多种靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中的同一种 靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中的多种靶颗粒进行分析；其 中同时对1至20(例如1至10)个样品中的1至100种(例如1至 50，1至25种)靶颗粒进行分析；其中发光分子位在胞浆内；其中 在单个装置内同时对多个样品中的多种靶颗粒进行分析；其中在一个 含有1至10个通道的内同时对多个样品中的多种靶颗粒进行分析； 其中靶颗粒是口蹄疫病毒(RMDV)、委内瑞拉马脑髓炎(VEE)病 毒、鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、霍乱弧菌的01和 0139菌株和正痘病毒；以及使用本发明系统的情形。
本发明系统还包括在此所述的系统：还包括1至10个通道；其 中同时对一个样品中的多种靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中 的同一种靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中的多种靶颗粒进行 分析；系统尺寸为12英寸×12英寸×12英寸或更小(例如6英寸× 4英寸×1英寸或更小)。
本发明系统适用于医药(如兽医)、农业、环境保护(如诊断病 态建筑物综合征)和食品加工及标准制订等领域中的分析和诊断。
本发明的其他特点和优点将通过下面的详细说明和所附权利要 求书而变得明显。
附图说明
图1是光电子传感细胞概念的示意图；
图2是说明一个含有对可疑物质进行初步探测的采样器(触发 器)的光电子传感器的一般结构体系的示意图；
图3是说明建立用于光电子传感器的细胞系的示意图；
图4是一个生物学气溶胶告警传感器(BAWS)/光电子传感器集 成系统的示意图；
图5示出光电子传感器中B细胞对口蹄疫病毒的应答；
图6示出光电子传感器的干式撞击器模块；
图7是说明定位化和混合的效果的示意图；
图8示出利用土拉菌病细胞定位化的效果；
图9示出光电子传感器的一个自动细胞供应模块；
图10示出使用光电子传感器时一个兔热菌细胞样品的剂量应答 关系；
图11示出B细胞对化学和生物学污染的抵抗能力；
图12示出光电子传感器的一个自动离心模块；
图13是说明一个空气撞击器/光电子传感器的示意图
图14是说明一个光电子传感器的示意图；
图15示出光电子传感器的光学/光电倍增管(PMT)模块；
图16是说明一个空气撞击器/光电子传感器的示意图；
图17是说明光电子传感器中一个多通道离心机的示意图；
图18是说明光电子传感器中一种湿离心/撞击器概念的示意图；
图19是说明光电子传感器中一种湿离心/撞击器概念的示意图；
图20是光电子传感器的一个特制管(custom tube)的示意图；
图21示出一个集成的干式撞击器/光电子传感器。
图22说明细胞处理对特异于鼠疫杆菌的B细胞的应答的影响。
图23示出一个能收集气溶胶样品的撞击器。
详细说明
本发明涉及基于细胞的探测系统，所述的细胞在其表面上具有抗 体并且含有一种在抗原或靶颗粒的外部刺激下能发射光子的化合物。 适用于本发明的材料和处理步骤说明如下。
细胞
细胞可以是原核或真核生物细胞，其可以自然地或通过基因工程 或化学添加而含有适当的受体、信号途径和信号输出方法。只要含有 功能性受体、信号途径和信号输出方法，细胞甚至可以是人造的或者 是无生命的单元。当抗原与抗体结合时，细胞将使钙离子迁移到细胞 质中。一个可以用于本发明装置和方法的细胞的例子是B细胞(即 具有骨性颚(bony jaw)的冷血或热血脊椎动物的B细胞)，它可以 借助基因工程来表达一或多种表面结合型的单克隆抗体。所述单克隆 抗体例如可以这样产生：用待探测的抗原使一个动物免疫，再从免疫 后的动物采集B细胞。然后，将编码所述单克隆抗体的DNA(脱氧 核糖核酸)分离出来并转入一个不朽化的细胞系，然后筛选出具有对 待测抗原具有特异性的表面单克隆抗体的细胞系。B细胞对于定性分 析和定量分析都是有用的，这特别是由于B细胞的发射信号典型地 并不随着暴露于其的另外的靶标本而显著降低，并且还由于此发射信 号具线性性质。
或者，细胞也可以是成纤维细胞。不过，成纤维细胞不具有将信 号从表面抗体的胞浆部分转换成细胞中钙储备所必需的信号转导机 制。为了克服这一问题，可以在成纤维细胞中表达一个嵌合的表面抗 体。所述嵌合抗体含有一个衍生自一多肽(例如成纤维细胞生长因子 受体)的胞浆氨基酸序列，它能将来自成纤维细胞的细胞膜内表面的 信号转换成细胞内的钙储备。这样，当一个抗原结合到嵌合抗体的细 胞外部分从而引起表面上的抗体聚积时，便将诱导出钙迁移。对于B 细胞以外的其他类型细胞也可采用利用嵌合抗体的类似策略，使得这 些细胞也可适用于本发明的装置和方法。
适用于本发明装置和方法的细胞是那些被设计成能识别某种特 定物质的细胞，包括那些在表面上含有能够特异性结合所述物质的受 体的细胞。虽然优选的受体是抗体或单链抗体，但其他适当的受体也 是可能的，其中包括促分裂原受体(如LPS(lipopolysaccharide)受 体)、巨噬细胞清道夫受体、T细胞受体、细胞黏附分子、DNA结合 蛋白如部分的序列特异性限制酶或转录因子、单链RNA(核糖核酸) 或双链RNA结合蛋白、与待识别的DNA或RNA序列互补的寡核苷 酸、或者其他与待识别物质有结合特异性的配位结合受体(如Fas、 细胞因子、白细胞介素、或激素受体；神经递质受体；气味素(odorant) 受体；趋化因子受体等)，受体可以通过一个跨膜的区域、膜上的对 受体有结合特异性的分子(如结合抗体的Fc受体)、或对于膜上分子 的共价或非共价结合(如生物素—链霉抗生素蛋白、二硫键等)来结 合到细胞表面上。受体也可以是一个嵌合分子，例如，它可以有一个 胞外区(如抗体、单链抗体、植物凝血素或其他对待识别物质有结合 特异性的区域或肽)和一个胞内区(例如来自胰岛素受体、成纤维细 胞生长因了或其他能引发第二信使级联的蛋白)。受体除了直接结合 于待识别物质外，也可以是特异性地结合于另一个分子或对象，再由 后者特异性地结合于待识别物质，例如第二抗体、标记的珠、与抗原 缀合的寡核苷酸等。
或者，这些结合步骤中可以只需要有一个步骤有特异性。例如可 以用与一种抗原(或直接与一种珠或在一种基质上)相缀合的寡核苷 酸探针把含有特异性序列的DNA或RNA从溶液中提取出来，然后 可以用与靶DNA/RNA退火的第二组非特异性抗原缀合的寡核苷酸 探针来刺激对该第二抗原具有有特异性的细胞。此外，以嵌合形式表 达在细胞表面上的非特异性核酸结合蛋白(组蛋白、精蛋白、RNA 结合蛋白)或者这些蛋白的抗体也可以用来通过序列特异性选择步骤 来探测核酸的存在。
抗体
无论细胞来源于哪种类型，单克隆抗体的抗原结合可变区都可以 或者来自公开的DNA序列，或者由一个杂交瘤细胞系通过RT—PCR 克隆得到。RT—PCR是这样完成的，利用几组设计为在5’端与可变 区的引导区或框架区退火以及在3’端与恒定区退火的引物来完成。
然后抗体可变区被克隆成已经含有轻、重链恒定区的表达载体。 Bradbury著作中所述的轻链表达(Gene 187：9—18，1997)特别适 合于这一目的。Bradbury描述的VK表达含有EF—1x启动子，一个 引导序列，多个克隆位点，人类Ig kappa恒定区和聚腺苷酸信号。重 链表达载体是从Invitrogen的p Display得到的。这个载体含有一个 CMV启动子、一个引导序列、一个HA标记、多个克隆位点、myc 标记以及其后的PDGFR穿膜区和牛生长激素聚腺苷酸信号。
p Display可以用下述方法改良用于重链表达。用不含有分泌所需 的外显子的小鼠IgM恒定区替代p Display的PDGFR穿膜区。这可 保证蛋白将在膜上。新霉素抵抗基因可以由下述任一种抗生素抵抗基 因取代，它们包括，但不局限于，潮霉素、博来霉素、嘌呤霉素、卡 那霉素和灭菌素基因。重链(或轻链)可变区可以用一个双步骤方法 插入：利用重叠扩展PCR除去存在于p Display多克隆位点两侧的 HA和myc标记。也可以建立一个载体以插入含有融于约300个碱基 对的IgM恒定区的可变区的重叠扩展产物，从而可以用一个步骤完 成克隆。
下面的例子就是用上述抗体载体构建步骤来实现的。
能对待探测抗原有特异性结合的抗体是一个能结合于抗原或其 表位，但基本上不能结合于样品中其他抗原或表位的分子。这种抗体 可以是嵌合的(即含有非抗体氨基酸序列)或是单链的(即决定抗体 区的互补性由一个连续的多肽序列形成)。
或者，也可以用标准技术从动物获得产生表面抗体的细胞并来制 备产生表面抗体的单克隆细胞群体，该标准技术例如有Kohler等人 在<自然>杂志(256：495—497，1975)中；Kozbor等人在(4：72，1983)中；或者Cole等人在<单克隆抗体与肿瘤治 疗>(Alan R.Liss Inc.，pp 77—96，1985)中所描述的杂交技术。生产 表达单克隆抗体细胞的技术是众知的(例如见Coligan等人编著的 (John主& Sons，Inc.，New York， NY，1994))，只是需要作选择表面抗体而不是分泌抗体的修改。
许多用来融合淋巴和不朽细胞系的众知方案中的每一种都可应 用于生成产生表面单克隆抗体的细胞的目的(例如见上述的，Galfre等人在<自然>杂志266：55052，1977 的文章；Kenneth在<单克隆抗体>中的文章：生物分析中的新维数 (Dimension Plenum Publishing Gorp.，New York NY，1980)；以及 Lerner在耶鲁生物医学学报54：387—402，1981的文章。此外，普 通的技术工作者可以看到，这些方法的许多改良方法也可以使用。
表达抗体的多克隆细胞可以通过用待探测抗原使合适的动物免 疫来制备。产生针对抗原的抗体分子的细胞可以从动物身上(例如从 血液中)分离出来，并借助包被有抗原的培养皿进行淘选等已知技术 予以进一步纯化。作为制备单克隆细胞的一种替代，可以通过用抗原 筛选一个重组组合免疫球蛋白库(如抗体噬菌体显示)来识别和分离 出编码单克隆抗体的核酸，由此分离出免疫球蛋白库中那些能结合抗 原的成员。用于生成和筛选噬菌体显示库的试剂盒是可购得的(如药 物重组噬菌体抗体系统，目录号No.27-9400-01；以及Stratagene Surf ZAP phage Display Kit，目录号No.240612)。此外，例如可在下述 文献中找到特别适用于生成的筛选抗体显示库的方法和试剂的例子： 美国专利No.5，223,409；PCT公开文本No.WO 92/18619；PCT 公开文本No.WO 91/17271；PCT公开文本WO 92/20791；PCT公开 文本No.WO 92/15679；PCT公开文本WO 93/01288；PCT公开文本 No.WO 92/09690；PCT公开文本No.WO 90/02809；Fuchs等人在< 生物技术>9：1370—1372(1991)上的文章；Hay等人在<人类抗体 杂交(HumAntibod Hybridomas)>3：81—85(1992)上的文章；Huse 等人在<科学>246：1275—1281(1989)上的文章；和Griffiths等人 在EMBO学报12：725—724(1993)上的文章。
当识别出库中所希望的成员后，特定的序列可被克隆成任何合适 的核酸表达子并转染到如成纤细胞这样的细胞中，表达子也可以编码 可操纵连接于抗体序列的氨基酸序列，以适合于细胞表达抗体。如上 面所讨论的，成纤维细胞生长因子受体的胞浆穿膜序列能被连接到对 待探测抗原具有特异性的单链抗体上，使得当与抗原接触时细胞将停 止钙迁移。虽然在成纤维细胞中可以表达分开的重组重链和轻链以形 成嵌合抗体，但单链抗体也是适用的(例如见Bird等人在Trends Biotechnol 9：1332-137，1991中和Hust等人在Int Rev Immunal 10：195 —217，1993中的文章)。
光子发射分子
所需探测的物质与细胞表面受体的结合将在细胞内触发出一个 信号途径。一种优选的信号途径是在B细胞、T细胞、肥大细胞、巨 噬细胞和其他免疫细胞中发现的第二信使级联途径，其中各个细胞表 面受体的交联(crosslinking)将激活一种酪氨酸激酶，然后后者使磷 脂酶C磷酸化，磷脂酶C又把磷脂酰肌醇4，5—二磷酸酯(PIP2) 裂解成肌醇1，4，5—三磷酸酯(IP3)和甘油二酯(DAG)；然后IP3 打开钙通道，使例如细胞内质网存储的细胞内钙释放或者使细胞外的 钙进入细胞，由此提高细胞内的钙浓度。根据受体的类型、细胞的类 型和所需的信号转导方法，也可采用另外的第二信使级联，例如G 蛋白腺嘌呤环c-AMP蛋白激酶A级联。
需要提供一种方法来监测细胞在应答于待识别的物质时的内部 信号转导。如果信号转导涉及胞浆中钙的增加，则一个优选的探测方 法是钙敏感发光分子或荧光分子，例如多管水母、obelin、thalassicolin、 mitrocomin(halistaurin)、clytin(phialidin)、mnemopsin、berovin、 Indo-1、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、calcium green、BAPTA、 cameleons(见A.Miyawaki等人在Proc.Nate.Acad.Sci.96，2135—40， 1999上的文章)或类似分子。可以预料，利用钙敏感分子产生的相 对光强度和传感器细胞存储特性可能取决于特定的发光分子和激活 发光分子的半衰期——在某些情形下可具有显著的优势(例如改善的 灵敏度、定量或定性的探测)。利用光蛋白发光分子自然的辅助因子 的结构类似物，可能还会产生其他的性能增强。可以从一些途径购得 各种能被激活细胞接纳的钙敏感荧光染料，如Molecular Porbes，Inc.， Eugene，OR。例如水母，obelin、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、 clytin(phialidin)、mnemopsin、berovin或cameleons等蛋白可以用遗 传学方法加入、注入到细胞内，或者用来自HIV TAT(氨基酸约47 —57；见A.Ho等人在Cancer Research61，474—477，2001上的文 章)的蛋白摄取标记提供，或者用其他手段加入。如果需要，此类报 告分子可以包括一些目标信号，使这些分子导向到内质网或胞浆膜的 胞质面上、线粒体的内部或者那些局部钙浓度变化可能特别大的位置 处。也可以使用探测信号通路中其他位置的活性的光学方法，例如附 着在信号途径组分上的荧光基团的荧光共振能量转移(FRET)(见 S.R.Adams等人在<自然>349，694—697，1991上的文章)。对于内 部信号转导涉及增加活性氧分子(如超氧阴离子、羟自由基、辣根过 氧化物酶化合物I或II等)的情形，优选的探测方法是活性氧敏感性 发光或荧光分子，如光蛋白pholasin(一种来自生物发光软体动物 Pholas dactylus的34—k Da糖蛋白)或类似分子。或者，任何荧光 素酶的报告基因可以连接到被信号途径诱导出的启动子上。在T细胞 和肥大细胞等细胞中，信号途径将触发出含有例如粒酶(granzyme)、 类胰蛋白酶(tryptase)或chymases等蛋白酶的胞吐(exocytosis)颗 粒。这些蛋白酶的胞吐可以用色度或荧光度量方法探测(例如连接在 被蛋白酶裂解的肽链上的p-硝基苯胺(p-nitroaniline)或7-氨基-4-三 氟甲基香豆素(7-amino-4-trifluoromethyl coumarin，AFC)上，(见 以下文章：S.E.Lavens等人的<免疫学方法学板>166，93，1993； D.Masson等人的FEBS Letters 208，84，1986；R&D Systems)。还有， 用微电极或其他方法来探测与钙离子流或其他信号转导离子流相关 的电活动也适用于监测细胞中的信号转导应答。
合适的发光分子是任何能在应答于增加的细胞质钙浓度时发射 光子的分子，包括生物发光和荧光分子。在Buttou等人的14：663—671(1993)；Shimomura等人的14： 373—378(1993)和Shimomura的<自然>227：1356—1357(1970) 等文章中描述了一种发光分子：生物发光水母发光蛋白，水母发光蛋 白通过氧化一种小化学分子腔肠素(coelenterazine)来产生光子。腔 肠素通过细胞膜扩散，所以它或类似的分子可以加到细胞周围的介质 中。或者，编码能制造腔肠素的酶的基因可被导入细胞。在另一个实 施例中，可以使用生物发光绿荧光蛋白(GFP，见Chalfie，62：651—656，1995)或黄荧光蛋白(YFP)。在该实施例 中，细胞质中既含有GFP又含有水母发光蛋白。在应答于胞液中钙 的增大时，水母发光蛋白以非发现能量转移的方式向GFP提供能量。 然后GFP将发射光子。或者，发光分子也可以是被适合于诱导荧光 的波长的光照明下的钙敏感荧光分子(如indo—1)。
可以用本领域众知的方法把水母发光蛋白或任何其他发光分子 导入细胞。如果发光分子是一种蛋白(例如水母发光蛋白情形)，则 细胞可以含有一个编码该蛋白的表达载体(即，一种被导入细胞后将 产生发光分子的核酸或病毒)。表达载体可以存在于染色体外部，或 者被整合到细胞基因中。
反应室
适用于本发明的反应室可以是任何基质或容器，只要发光细胞和 待测粒子能在其中混合并互相接触。在一个实施例中，反应室是一个 离心管(例如微量离心管或Eppendorf管)。如前所述，为了使被测 颗粒或发光细胞之一管先聚积成团，然后再把另一个驱入这个团中， 离心是一个特别适用的手段。为了增加粒子和细胞的成团，管的侧壁 可包被非粘性载体蛋白(如牛血清白蛋白)以防止发光细胞粘到侧壁 上，并且可以在管底涂以聚L赖氨酸来协助保证靶颗粒被粘留在管 底。在细胞生物学领域中还已知其他能防止或者造成细胞粘着的蛋白 或分子，它们也都适用于本发明。
具有特制样品孔几何形状的离心管提供了又一个实施方式，它利 用离心来增加B细胞与不易沉降颗粒的相互作用和减少对特定旋转 顺序的要求。在该实施例中，含有被分析粒的样品被放置在一个样品 室最大宽度近似等于发光细胞直径的管子中。使浓缩的发光细胞悬浮 在样品的上层，然后用离心来驱使大量密集在一起的发光细胞穿过小 的颗粒，同时在几何形状的限制下增大了发光细胞抗体与颗粒的相互 作用。与细胞相关联的抗体同颗粒的结合将捕获不易沉降的颗粒并把 它和发光细胞一起快速地拉向管底，这时在管底发出的光可以用光电 倍增器件观察到。
在另一个实施方式中，例如(如附图所示，反应室是一些排成二 维阵列的孔，例如是一个微滴板、或是一些沿一个带条的点或孔。这 些设定使得可以对多个样本和/或多种靶颗粒进行多重探测。为了自 动地供给待测颗粒和/或发光细胞，反应室或者样品收集器和发光细 胞容器至少可在两个方向上接近。孔阵列也可以像前述对离心管那样 用粘性或非粘性涂层处理，使发光细胞与待测颗粒更易接触。
样品收集器
可以用不同的装置从例如空气中收集样品。一般，空气采样装置 有一个含有液体的收集室，空气或气体从中或从其边上流过；或者有 一个多孔过滤器，当空气或气体流经该过滤器时颗粒(例如靶颗粒) 即被截获。对于含液体的收集室，可以通过把收集的液体离心或作其 他处理来使颗粒从液体中分离出来。然后在一个反应室中使分离的颗 粒沉积。对于有过滤器(如硝化纤维素)的收集室，过滤器或其一部 分可以起着反应室的作用。或者，可以从过滤器中洗出颗粒，或者可 以使过滤器溶解或用其他方法从颗粒上除去。过滤器收集室也可以用 来从流经它的液体(如供水样品(water supply sample)或脑脊液) 收集颗粒。此外，如前所述，可对液体样品离心以除去液体中的任何 颗粒物质。可用于本发明的许多种采样品都是已知可购得的。见SKC， Inc(www.skc.com)，该公司出售SKC BioSampler和其他采样装置。
也可用其他空气采样器。例如Air—O—Cell采样盒(SKC公司)。 在该装置中，空气中的颗粒被加速并与一个粘性片相碰撞，后者可直 接用于各种着色处理和显微检查。
气浮颗粒可以在一种称作撞击器的装置中用惯性分离法收集。把 一个含有被收集颗粒的气流从感兴趣的环境中吸入到撞击器内，其中 该气流被导向一个撞击表面。当撞击器的几何参数和其内的流速适当 时，具有足够惯性的颗粒将不随气流流动而是撞击到一个表面上。由 于静电作用和/或范德瓦尔力作用，相当一部分撞击表面的颗粒将被 粘住，从而被收集和浓缩。这样，利用包括上述装置和方法在内的各 种可用的试验技术，含有蛋白(包括毒素)、病毒、细菌(植物型的 胞子型的)、寄生虫、花粉和其他可探测物质的气浮颗粒可被收集以 供探测。
使用空气撞击器为生物试验收集干样品较之传统的空气至液体 样品收集具有一些普通的优点，即可减少或免除消耗物和转换机构， 从而减少了试验成本和简化了自动化。本发明装置和方法的特点优点 是，利用干式撞击进行收集保证了，不论单个待分析颗粒的大小如何， 在添加本发明装置和方法的传感细胞之前所有收集到的样品全部定 位化于一表面上。这样，不论待分析颗粒在液体中沉降系数为多大， 它们全部实现了定位化，从而使上述装置和方法的灵敏度最大化并因 免除了耗时的步骤而加速了许多试验。
能保留撞击到其上的一定比例的颗粒并适用于后继试验的任何 表面都适合于用作收集表面。合适的材料包括生物兼容的金属、塑料、 玻璃、晶体、气溶胶、水溶胶、纸张等。这些材料的特别有用的形式 包括微量离心管、用于高通量筛选的多孔板、连续带条、过滤器、侧 向流动免疫试验(lateral flow immunoassay)的缀合释放垫等。通过 修改收集表面来增加收集效率的方法包括：添加能产生对生物颗粒粘 性的涂层(这些涂层在性质上可以是化学的或生化的，如聚赖氨酸)； 增加表面粗糙度来增大收集表面面积；特制表面几何形状来使颗粒沉 积在规定的表面区域中。还有，可以通过使静电荷附着到收集表面和 输入颗粒上从而产生附加的吸引力来进一步改善收集效率。
对式撞击收集器的进一步改进可以这样实现：在收集器上游使 用一个空气——空气浓缩器来增加撞击到收集表面上的每个单位空 气样品中的颗粒数。这可以大为减少为探测器能提供可靠结果所需的 足够数目的气浮颗粒的收集时间。
在关于这个收集概念的一个例子中，图23所示的撞击器被设计 成在一个可购得的塑料管底部收集气浮样品。一个喷嘴向下伸入管 中，其出口位于管子内表面的曲率半径处。这样的布置增大了颗粒撞 击到管子底部的可能性，在那里装置的传感细胞最可能与颗粒接触。 一旦完成了收集，一个含有装置传感细胞的液滴被直接加到含有被收 集的气浮颗粒的管中，旋转5秒钟来加速对管表面的细胞供应，并用 光子探测器(如PMT、CCD、光二极管等)测量发出的光。利用这 个设备，可以在不到一分钟的时间内从气浮颗粒中收集干细菌胞子并 直接用光电器件识别出来。这个方法可用于多个收集样品的管子和一 个能控制后续试验的自动系统来实现。一个系统如何能够控制至少 10个独立的试验的例子示于图4、6、9、12和15。通过实现一种能 在一个管子(复用的)内寻找多种待分析颗粒的方法，单个试验周期 内可探测的物质数目可以大于管子的数目。这种方法可以这样实现， 生成表达了多个对不同待分析物有亲和性的受体的各个光电子探测 装置细胞系，或者在单个管子内组合多个有不同的特异性的细胞系。
图4是一个生物气浮告警传感器(BAWS)/光电子传感器集成系 统的示意图。BAWS触发模块用来初步探测例如具有预定尺寸范围的 颗粒的出现。如果探测到了符合预定规范的颗粒，ABWS将触发一个 空气——空气浓缩器，后者使具有特定尺寸范围的颗粒通过一个干式 撞击器模块被收集和沉积到一个孔(如反应室或反应管)内。干式撞 击器模块进行干样品收集，并与一个用来向反应室(如反应管)供应 细胞(如发光细胞)的注射模块相沟通。一个传输模块用来把反应室 组件(含有一个或多个室或管)转移到一个离心模块，在那里进行颗 粒样品与细胞的沉积或混合。离心模块可以(但不必须)与一个用于 探测光子发射的光学/PMT模块相沟通。一个控制器模块用于控制系 统的操作。
图6示出干式撞击器模块概念的一个例子。该例子中示出了一个 单通道(如原型系统)和一个多通道装置，包括各个样品管(如PCR 管)和管座，它们与收集颗粒测试样品的空气——空气浓缩器相沟通。
图9示出一个可自动化的细胞供应的例子。利用一个注射器与注 射器泵组件(其中可包含一些滴管和供应装置)，把传感细胞(如发 光细胞)导入系统。这种类型的组件使得可以把多种传感细胞同时导 向颗粒样品(如反应室(如反应管)内的样品)。
图12示出一个用来旋转颗粒样品或细胞样品的离心模块概念的 例子。借助一个载机构把带有管子的管座导入一个能接纳管座的旋转 组件上。旋转组件使样品旋转。旋转组件与收集信号(如光子发射) 的光学模块相沟通，可以用一个编码马达使样品室对准于探测器(如 光学模块)。
图15示出一个光学模块的例子。由于精密的设计，该模块能进 行多个样品(如位于反应室、管内的样品)的同时测试。其中管座和 管子导入单元的方式使得它们能与必要时使用的透镜组件(如集成的 反射镜和透镜)相沟通，并且最终与一个光探测(如PMT)相沟通。 PMT将产生信号，该信号然后被传送给一个处理器进行处理和显示。
图21示出一个集成式的干式撞击器/光电子传感器。在该传感器， 上述各个模块被排成一列，其中有一个装有30个管座的盒子可放置 到一个带式驱动的管座传送模块上。传送模块把各个试验管按下顺序 移动：从收集器到细胞供应模块再到离模块。最后在完成了光子探测 后南移动一个确认样品存储模块。这个集成式传感器总尺寸约为54 英寸×33英寸高×22英寸深。
现实中的样品可能会含有这样一些物质，它们或者会阻止试验实 现(结果造成假阴性)，或者会在并无靶抗原的情况下引起反应(造 成假阳性)。在许多情况中，可以在试验之前对样品进行处理以除去 这类物质。例如，对于去垢剂或血清因子这类可溶性物质，可用一个 预离心步骤予以去除，其时试剂将集中在管底，于是可以用试验培养 液(Portal Shield样品)来置换管内的液体。对于不可溶解的大颗粒 物质，可以使用可购得的滤孔尺寸例如为3至5μm的过滤器把它们 从样品中波除，其中波孔尺寸的选择应能让试剂通过而挡住污染物质 (柴油或烟垢样品)。利用注入式过滤器可以快速地处理样品，仅使 总的试验时间增加几分钟。
样品定位化
作为样品收集器或反应室的一部分，可以采用除了离心以外的一 些不同方法来使发光细胞与待测颗粒更容易接触。例如，可以在本发 明系统中增加使用生物电子装置中的电泳、等电位聚焦、双向电泳、 磁标记颗粒等手段。例如见美国专利No.6,017,696、授予Nanogen， Inc.(www.nanogen.com)的其他专利、Goater等人的文章 (117：S 117—189，1998)、美国专利No.5,512,439 和No.4,910,148以及授予Dynnl AS的其他专利(www.dynal.no)。
把含有靶颗粒(可被发光细胞识别的任何颗粒：蛋白/毒素、病 毒、细菌、寄生虫、核酸等)的水母细胞与含有发光细胞的等份量的 培养液相混合可造成会导致光子发射率暂时增大的颗粒/细胞接触。 从混合开始到出现最大发光率之间的时间取决于特定细胞对刺激的 特征性应答时间、发生混合的时间长度(混合时间)、以及混合后颗 粒与细胞发生接触的典型时间(扩散时间)。
由于即使不存在靶颗粒时也会探测到背景光子率(例如背景细胞 发光和光子探测器及其电路的热噪声)，所以由单个靶-细胞作用所发 射的光子难以与背景区分。要得到一个有用的信号，必须大为增大相 对于背景的探测光子率。对于一个给定的样品，当混合时间和扩散时 间最小化时该探测光子率将最大化。样品中存在的靶向颗粒的其他可 能的信号有：增大一定时间内探测光子多于仅有背景时的总数，改变 探测光子的统计性质，或者改变探测光子的光谱质量。
扩散时间可以通过减小混合颗粒与细胞之间的平均距离来最小 化。这可以通过在较大的混合体积中使颗粒和/或细胞定位化到一个 小体积(通常是一个层)内来实现。然而，使颗粒和/或细胞定位化 所需的时间可能大于细胞的特征性应答时间。(颗粒和细胞在这个较 长的定位化时间内的混合可能会因增大了各次发光之间的平均时间 而造成较低的光子发射率从而较小的信号)。为了避免这一情况，颗 粒和细胞两者中的一个或者两个应该在保证它们之间的接触最小化 的前提下分开地定位化。这样的定位化也可以缩短混合时间。
一般地说，移动颗粒或细胞有以下这些方法：
●沉降(由重力或离心)
●液体流动(强迫的或对流的)
●电力(电泳和双向电泳)
●磁力(利用磁珠)
●声波/超声波(驻波或行波)
定位化要求一种移动颗粒和/或细胞的手段并结合以一个可以收 集颗粒和/或细胞的屏障，例如一个通道或容器的固体表面、一个过 滤器的表面、或者一个环绕着一个电场极小点的势能屏障。它们的例 子有：
●沉降(使细胞定位化于一个室的下表面处)
●空气撞击(撞击的颗粒粘附于或驻留于一个收集表面)
●过滤(颗粒或细胞被收集于过滤器表面或进入过滤器内部)
●亲和力捕获(通过特异性或非特异性的结合作用使颗粒或细 胞定位化)
●磁捕获(通过定位化磁力使磁珠停留在一个固体表面，过滤 器表面上或过滤器内部；磁珠可以具有也可以不具有可促使颗粒或细 胞粘附的表面化学活性)
●电泳(仅适用于带电颗粒，收集于电极表面)
●双向电泳(正：把颗粒或细胞收集于一个电极的表面；负： 收集到一个最小电场区域内)
颗粒和细胞的定位化和混合可以用上述各方法的结合与其他方 法的结合来实现。下列表格给出了各种定位化/探测器组合的一些例 子。其中某些代表性例子示出了二维的颗粒或细胞定位化方法，这使 得在使用一个光子探测器阵列(包括CCD)而不是单个光子探测器 (如一个PMT)时能够改善灵敏度或对不同颗粒的甄别能力。
例子 细胞定位化方 法 颗粒定位化方 法 混合方法颗粒或细胞 探测器 离心 离心(短时) 离心(长时) 细胞/沉降(离心) 单个 流动细胞 沉降并粘着表 面 细胞上方的浅 通道 颗粒/沉降(重力) 单个 流动细胞 (多细胞系) 沉降并粘着表 面 细胞上方的浅 通道 颗粒/沉降(重力) 成像 流动细胞 /磁珠 沉降并粘着表 面 定位化磁珠捕 获 颗粒(珠上)/沉降(重 力) 成像 流动细胞 /电场 沉降并粘着表 面 细胞上方的浅 通道 颗粒/电泳 单个 带条/吸除芯 流动(进入吸 除芯) 空气撞击(带 条) 细胞/沉降(重力) 单个 空气撞击 离心(短时) 空气撞击(带 条) 细胞/沉降(离心) 单个 Uniprep /磁珠 沉降于表面 过滤器表面上 的磁珠 颗粒(珠上)/沉降(重 力) 单个 流经细胞 过滤器表面上 的细胞 颗粒/流经细胞 单个 逆向流动 离心使细胞附 于滤波器表面 颗粒/逆着离心力流经 细胞 单个 离心管 过滤器 离心到过滤器 表面上 驻留于过滤器 表面 细胞/沉降(离心) 单个 双向电泳 捕获 沉降并附着表 面 由双向电泳力 驻留于流体 颗粒/沉降(重力) 单个 行波电介 电泳 行波双向电泳 行波双向电泳 细胞或颗粒/行波、双 向电泳 单个 可溶膜管 分开容室 离心(长时)到 可溶膜上 颗粒/可溶膜和沉降 (离心) 单个 声波/超声波
定位化实施例
在下述实施例中，除了另有说明外都作了如下假设：样品是兼容 于短期细胞寿命和功能的液态细胞溶液的一个等分部分，其中可能含 有靶颗粒(不过在下面的说明中假设存在这种颗粒)。液体样品可以 从环境、临床、从空气制备成的液体、洗涤的药签或其他样品中获得。 空气样品可以从被驱动的空气流(空气采样器或表面取样器)、静电 捕获、或制备的气浮颗粒等获得。细胞应理解为位于兼容于细胞寿命 和功能的培养液中的发光细胞。假定颗粒与细胞的接触将导致发射一 个或多个光子。样品与细胞在其中混合的室的外部有单个的或阵列的 光子探测器阵列，而且在室的外部或内部还可能有用于增强对发射光 子的捕获和探测的光学元件(如反射镜、透镜、光导管等)。混合室 假定是部分或整体地透明的，或者有其他机构可让发射的光子到达探 测器。
离心
样品可在一个室内被离心足够的时间以使颗粒沉降。细胞可在不 干扰颗粒的情况下被导入室内并被短时间离心使它们能沉降到颗粒 上。光子探测可在离心时、或者较典型地离心后进行。
亲和力捕获(表面捕获)
样品可被导入到微量离心管、多孔板、过滤器单元或其他适当的 装置内，这些装置的某些与样品接触的部分被处理成能借助特异性的 或非特性的结合作用来结合和留住可能存在的颗粒。非特异性结合可 通过静电/离子交换作用、疏水作用、亲水作用等实现。特异性结合 可通过使那些结合在基质上的成分停留在颗粒(如抗体、受体、糖蛋 白、肽链、碳氢化合物、寡核苷酸等)的表面上来实现，或者可通过 使被受体结合的那些成分停留在颗粒(如小分子、肽链、蛋白、碳氢 化合物等)的表面上。
亲和力捕获(捕获在移动基质上)
类似于捕获于表面的亲和力捕获，但颗粒是结合在可移动基质 (如聚合物珠、细胞、带电分子、磁珠、细菌等)上的，这种可移动 基质利用包括这里所说明的方法在内的各种方法提供了移动和/或局 域颗粒或细胞的额外手段。
流动细胞(flow cell)
发光细胞可被导入一个浅流动槽中并以使得附着于底部表面；再 次流动可除去非粘性细胞。样品的导入使许多细胞培养液移动，于是 颗粒可沉降到附着的细胞上。当颗粒与细胞接触时将发出光子。
流动细胞(多细胞系)
类似于上述流动细胞，但具有一些敏感于不同靶颗粒的不同的发 光细胞区域。图像探测器探测到的光子使得可判断哪些类细胞被激活 了，于是可判断样品中存在哪些种靶颗粒。
流动细胞(磁珠)
类似于上述的流动细胞。适当的磁珠与样品的混合使靶颗粒附着 在珠上。这种附着了颗粒的磁珠可被导入一个流动槽，其中的一个强 局部磁场(由永久磁铁或电磁铁产生)将把这些磁珠捕获在附着了细 胞的表面的上方。混合过程可以这样起动，或者撤除磁力使磁珠能沉 降到细胞上，或者移动磁力把磁铁吸引到细胞所附着的表面上。
流动细胞(电场)
类似于上述流动细胞，但其中含有一个细胞所附着的表面和一个 平行于该表面的用作为一些分离电极的表面(两表面中至少有一个是 透明的)。样品的导入移动了许多细胞培养液。在各电极之间施加适 当的直流电压使颗粒因电泳现象而移至附着的细胞处。
带条/吸附芯
使可能含有靶颗粒的空气样品撞击一个透明表面，该表面可以是 刚性的也可以是柔性的(如带条)是多孔的或非多孔的。在撞击区域 周围粘着一个吸收材料或吸附芯，或者于对多孔表面情况，在该表面 的另一侧粘着了吸收材料。可以把细胞置于撞击区域，由于吸附芯的 作用多余的培养液将被吸收，从而减小了含细胞培养体积和深度，使 细胞更靠近于颗粒。细胞将在撞击颗粒上沉降出来，或者，对于背面 含吸附材料的多孔表面情况，还可以利用流动使细胞被拉向颗粒。
空气撞击
使可能含有靶颗粒的空气样品被撞击进入一个适合于离心的室 (固定的，开始时是空的)内。细胞在不干扰颗粒的情形下被导入该 室并被短时间地离心使之沉降在颗粒上。光子探测可不加旋转地在旋 转中，或更典型地在旋转之后进行。
过滤装置/磁珠
把细胞置入一个含有一个室和一个带有适当过滤器的栓塞的改 进型无注射过滤装置( Mini-UniprepTM或类似产品)中， 其中细胞可附着在室的底表面上，不附着的细胞可被洗去。样品和具 有合适表面亲和力的磁珠一起被导入室内。在室内插入一个其内部含 有一个固定于过滤器背面附近的适当磁铁的改进型柱塞，直到室中的 空气通过过滤器被排除。把这个组件倒过来，在经过让磁珠沉降到过 滤器表面的一段时间后把室向下推到柱塞上。由于过滤、沉降和磁力 吸引，磁珠和颗粒可聚积在过滤器表面上。颗粒可被附着到磁珠上或 被捕获在磁珠之间。再次倒转该组件，颗粒将被磁珠带离细胞，而磁 珠则被柱塞内的磁铁吸住。除去磁铁将释放磁珠从而释放颗粒，后者 通过一段短距离后将沉降到细胞上。
流经细胞
可以让一层或几层细胞沉降到位于室底的一个适合的过滤器或 膜的表面上。把样品导入室内细胞的上方并施加压力(例如利用柱塞 或外部泵)。当样品流经互相紧密接触的细胞时，颗粒将被导入细胞 的密集范围内，发生接触。
逆向流动
可以让一个或几个细胞层沉降在位于一个“细胞”室底部的合适 过滤器或膜的表面上。样品可以放置在一个分开的“样品”室内，该 “样品”室通过某个流动通道连接于位地滤波器下方某点处的细胞 室。这两个室的相互设定关系使得在一个离心管中样品室更靠近于转 轴；样品室中液体的高度比细胞室中液体的高度更靠近于转轴。这样， 当离心管旋转时，液体将在各室间流动，试图离开旋转轴有一个共同 的距离。这将迫使一些样品向上穿过支持细胞的过滤器并经过被向外 的离心力保持着抵抗流动的细胞。当样品流经互相紧密接触的细胞时 颗粒将被导入细胞的密集范围内，发生接触。
离心管过滤器
把样品导入一个被切掉适当大小的一块的离心管过滤器的过滤 器“筐”内。在适当的离心条件下，样品将被迫穿过过滤器并让尺寸 大于过滤器切削尺寸的颗粒聚集在过滤器表面上。在过滤器筐内加入 细胞并对之短时间离心，把它们带到过滤器表面和颗粒上。
双向电泳捕获
类似于上述流动细胞，但在任一表面上带有一些合适的电极或者 带有伸入到流动细胞中的电极。使样品以连续流经电极的方式导入， 这些电极连接于外部电源并受其电驱动。当流率、频率、波形和振幅 有合适的组合时，由于负双向电泳颗粒可被导向细胞上方的一个最小 电场强度区域并在那里被捕获。停止流动并改变对电极的电驱动(可 能包括在一些电极间施加直流电压以产生电泳力)之后，颗粒将被沉 降或驱(由电泳或正双向电泳)到粘着的细胞上。
行波双向电泳
在一个浅柱状室中，在一个或两个平行面上制作一些适当的电极 (或许是透明的)，其中包括一个用于收集颗粒的中央平面电极、一 个位于周边的电极、以及一组螺旋状电极(可以与中央电极位于同一 表面也可以在其反面)。把样品导入室中，在中央电极与周边电极之 间施加一个直流电压，利用电泳把颗粒吸引到中央电极上。通过交换 液体把细胞导入室内。通过用适当的相移交流电压驱动螺旋电极可借 助行波双向电泳把细胞“扫”到中央，并在那里沉降到颗粒上。
可溶膜管
用可电激励溶解金膜在离心沉降颗粒使之定位化时隔离靶粒子 与发光细胞。可以使颗粒沉降在位于细胞上方的膜上(如图20所示)， 也可以用铺设在另一个室(或许是插入到室度的)的底部的膜使得细 胞离开原来室的底部。不论是哪种情况，当膜在电激励下被溶化后， 利用沉降法(可以是离心法)使颗粒与细胞混合。
声波/超声波
可以用声波或超声波信号使颗粒浓缩。颗粒可以聚集在一个驻波 的节点处，或者被一个行波移动。细胞也可以用这种方法移动，或者 用前述任何一种方法供应。
毒素探测
为了探测单价抗原，有必要利用两种通用方案中的一种来诱导各 表面抗体的交联。第一种方案是，在细胞表面上表达两个独立的结合 点，使得两个受体细胞可结合于一个配位体。第二种方案是，如果配 位体以多价的形式表达于细胞，则可在细胞表面上表达一个结合点。 下面是利用抗体/抗原识别模型的一些具体例子。
首先，可以在单个细胞系的表面上表达两种抗体，每种特异于同 一分子的不同表位(表位1和2)。单个分子结合于两种抗体(分别 针对表位1和2)将造成交联和发光。较具体地说，单个B细胞系被 加工成表达两种独立的抗体，它们分别识别单个分子上的一个不同的 表位。现在单体(monomeric)抗原的出现将能使两个表面抗体交联， 造成细胞内Ca2+的增加和水母分子的发光。近来我们找到一种表达 了能同时抵抗鼠疫杆菌和土拉热弗朗西丝氏菌的功能性抗体(加上表 达于基因内的PC抗体)的细胞系。这个细胞系能独立地识别这两种 细菌的每一种，表明这两种抗体都是功能性的，证明浓度增大的胞浆 发光分子的细胞便能实现细胞传感器。
另一个潜在的问题是对于不能通过离心力被沉淀的抗原此光电 装置和方法的敏感性如何。鼠疫杆菌F1抗原作为低分子量聚合物存 在于溶液中，因此在我们的分析中是不能被沉降的。不过，表达抗 F1抗体的B细胞能够探测到5ng/ml的可溶性F1抗原。这与当前的 免疫分析方法相当，因此证明此光电装置对于可溶性制剂而言是相当 敏感的。使用缀合了卵清蛋白的磷酸胆碱(phosphorylcholine)抗原 进行了补充实验。这种小抗原能够刺激抗体在细胞表面交联的能力提 示这种含有多个拷贝的PC表位的小分子量抗原能够有效交联表面抗 体并引起钙内流及光子发射。
第二种策略借助于离心方式能够改善上述对单价抗原的探测范 围。在这种方法所使用的方案中，毒素抗体之一表达于“良性”细菌 的表面，而第二抗体表达于B细胞表面。在此可通过离心将毒素沉 降，然后加入表达第二抗体的B细胞。由于细菌表面固定了多个抗 原，因此对于B细胞来说毒素大体上表现为多价，因此将引发交联 事件和光子发射。更特别地，抗单体抗原(如毒素)的表位1的抗体 表达于细菌表面。可溶性毒素结合于这些抗体，将细菌以毒素抗原包 被。这些由毒素包被的细菌在加入表达抗表位2的抗体的B细胞之 前通过离心被沉降。B细胞抗体的交联导致水母发光蛋白的光子发 射。这一策略的实验结果证实了对细菌表面抗原进行探测的可行性， 并且在加入B细胞之前先将细菌沉降可以增加探测的敏感性。相似 的方法可用于任何难以沉降的制剂以提高其对于B细胞的呈递。
多重分析
下面将描述B细胞混合物是如何能够用于在不增加探测通道(管 等)的情况下而提高可探测到的抗原的数量。探测多重待测物的最简 单的方法是在每个探测通道使用单一的B细胞系并通过增加探测通 道的数量而增加细胞分析的数量。这对于小数量的分析是可以接受 的，不过，随着所加入的待测物数量的增加，方法会变得越来越复杂。 但是，如果将多个B细胞系混合在一起，则有可能仅仅在一个5通 道系统上使用同时的阴性对照来进行多达31种测定。
试举一例，如果仅有一个单一的通道，则最多能进行一种B细 胞的探测分析。然而，如果由两个通道，则可进行3种不同的探测分 析，其中每个通道含有一等量的3种不同的B细胞系中的2种：
如，有3种B细胞系：A、B、C
并将它们混合放入两个通道，由此
通道1：A、B 通道2：B、C
然后可能会有3种阳性读数：
通道1 通道2
是 否 提示仅存在A
否 是 提示仅存在C
是 否 提示仅存在B
(或者可能存在多于一种
的制剂，但我们在此认为
不太可能)
相似地，如果有3个通道，通过将4种细胞系混合在一起则可以 进行7种独立的探测分析(在此简单地表示为，针对各个制剂的细胞 系以字母A至相应于细胞系数量的字母代表，并记录通道数量以显 示哪些通道对于各个制剂发阳性探测是必需的，记录如下—123：F— 表示通道1、2和3必须均记录阳性才能鉴定制剂F)：
通道1 通道2 通道3
A、B、G、F B、C、E、F C、D、G、F
1：A 12：B 123：F
2：E 13：G
3：D 23：C
如果所有的分析均按相等的比例进行混合，则可通过给定的通道 数而得到独立分析数，简单描述此关系的公式为：
#细胞分析＝2n-1，其中n是通道数，而每个通道中需要混合的细 胞分析数是2(n-1)。因此，将16种不同的B细胞系混合在一起，需 要5个通道以进行31种变体的分析。一个10通道系统的设计实际上 能够用于通过使用同时的阴性对照(5-通道阳性鉴定，5-通道阴性对 照)而鉴定31种不同的制剂。
如下所示为一个4-通道系统(15种不同的分析)的相应的通道 混合物和阳性探测：
通道1 通道2 通道3 通道4
A、B、G、F B、C、H、I F、C、D、I D、E、G、H
I、K、L、M J、L、M、N J、K、M、O J、K、L、M
1：A 23：C 123：I 1234：M
2：N 24：H 234：J
3：O 34：D 134：K
4：E 12：B 124：L
13：F
14：G
可以认为，无需过多的努力，本领域人员可以根据以上的描述及 以下的实施例，将本发明应用至其最大的程度。下面的实施例应被视 为仅仅是举例说明本领域人员如何实施本发明，而无意对说明书的其 他内容进行任何的限制。所有引用的文件，无论是印刷的、电子的、 计算机可读形式的存储介质或其他形式，均以全文并入作为参考，包 括但不限于，摘要、文章、杂志、出版物、教科书、条约、互联网网 址、数据库、专利、以及专利申请。
实施例
图1的示意图示出本发明的通常的细胞成分。细胞(在此为B 细胞)含有一种发光分子(在此为水母发光蛋白)且在其表面具有抗 体。抗体特异于靶颗粒上的抗原，该颗粒例如为生物武器制剂。靶颗 粒与B细胞的抗体的结合导致两个或多个抗体在细胞表面聚集，引 发的信号转导级联导致钙自细胞内的储存处释放至细胞浆内。细胞浆 内钙浓度的升高导致水母发光蛋白释放光子。该光子随即被光电倍增 装置如CCD捕获并记录。因此，使用具有功能性表面抗体并含有可 应答于钙浓度升高的胞浆发光分子的细胞，可实现一种细胞生物探测 器。
这种基于细胞的探测系统提供了对任何靶颗粒上的任何抗原的 快速、灵敏、特异、精确和灵活的探测。在灵活性方面，该系统能被 改良成针对任何颗粒或颗粒群。在一个实施例中，单个发光细胞可包 含多种抗体类型，每个类型都特异于靶颗粒的一些非重叠群。于是该 单个发光细胞可用来同时识别同一类的不同靶颗粒品种。
在第二个例子，一个反应室内可含有两种类型的发光细胞。一类 发光细胞含有一些特异于一种类型的不同种靶颗粒(如细菌)的抗体 并能在应答于与该类中任一种颗粒相接触时发射一个具有第一波长 的光子。第二类发光细胞含有一些仅特异于该类中某特定种颗粒(如 鼠疫杆菌)的抗体，并能在应答于与该种颗粒的结合时发射一个具有 不同于第一波长的第二波长光子。这样的设计通过减小或排除虚假阳 性信号而提供了极高的准确性。仅当第一波长和第二波长的光子都被 探测到时才记录为一个阳性事件。为了进一步减小或排除虚假阳性信 号，必要时还可以把发光分子所具的特异性扩展到多于两种。
图2是本发明通用结构和使用环境的示意图。
图3是本发明一个实施例所采用的分子生物学的示意图。在该例 子中，一个表达了一种发光分子(如水母分子)但不表达抗体的通用 B细胞系被变成用来产生能表达任何特异于任何抗原的抗体的B细 胞的基础。一种抗体表达载体被导入一个选来用于表达该载体并扩展 用于本发明系统的一般B细胞中。用这个方法，结合以p Display和 VK表达(见前面“抗体”一节的说明)，以各种目标产生有目标特 异性的发光细胞。已经制作了特异于口蹄疫病毒(RMDV)、委内瑞 拉马脑髓炎(VEE)病毒、鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏 菌、霍乱弧菌的01和0139菌株和正痘病毒等的发光细胞。在USDA 得到了FMDV抗体可变区的cDNA和序列。NMRC的研究人员得到 了鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、霍乱弧菌01和0139 菌株的抗体可变区的cDNA和序列。分别在CDC和USAMRIID得到 了由杂交克隆产生的VEE和正痘病毒抗体的可变区。口蹄疫病毒 (FMDV)、鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、委内瑞拉马脑髓炎病 毒(VEEV)分别是口蹄疫、鼠疫、土拉热病、脑髓炎的起因。通过 联合使用在一些公开的论文中描述引物自杂交瘤进行克隆。特异于 Bacillus globigii的发光细胞正在制造，因为这种非病原性细菌被一些 军事人员用作生物武器物质探测系统现场测试中的测试生物。图5示 出一个说明当几个特异于FMDV的发光分子的克隆与活FMDV靶接 触时产生的光子发射应答的曲线图。在每种情形中，发光分子都在靶 与细胞发生接触后约20—30秒内发出光子。图中也示出了这样的数 据：它们表明，当一个不期望会与发光分子结合的变异FMDV(在病 毒衣壳蛋白中单个氨基酸的变异)与一个发光细胞克隆接触时不会发 光。该阴性对照支持了导入探测系统的高度的特异性。
各种构形的离心管与光电倍增管(PMT)的设定状况可用于本发 明系统。设定中包含一个能使一个摆动装置上的样品微量离心管旋转 的转子(马达)和一个位于固定位置的平衡管。PMT位于底部，在 静止时其向上对着样品管的底部一端。在典型的实验中，对于小于发 光细胞的靶颗粒，含有颗粒的液体样品被置于样品管中，并在足以将 大部分颗粒沉积于管底的条件下进行离心(例如对于土拉热弗朗西丝 氏菌为5600xg，60秒)。然后将发光细胞悬液置于管中的样品上(使 其不会搅动沉积的颗粒)，并短暂离心将细胞沉积以使其与靶颗粒接 触。如果靶颗粒存在于待测颗粒中，细胞将发射特定波长的光子，并 由PMT捕获并记录。
在特定的实施方式中，PMT可以是Research公司的SR400双通 道选通光子计数器系统相接口的Hamamatsu(公司)HC125—08光 电倍增量。离心机可以是一个带有一个摆动管构形的蓝宝石17转， 18.5AWG，5安培马达。
离心管(反应室)可按需要予以改造和升级，以帮助待测颗粒与 发光细胞的接触。在图20所示的一个实施例中，离心管包含一个位 于管底处的含有预先安装的发光细胞的封闭小室。这个小室由一个可 溶性金阳极膜与管子的其余部分隔离。操作时，含有待测颗粒的样品 被置入管内并借助旋转使待测颗粒浓缩于膜上。然后使膜溶化并短时 间旋转管子，使颗粒与发光细胞接触。这个可溶膜系统已由Langer 及其同事在Angewantde Chimie International Editon 39：2396—2407， 2000以及<自然>397：335—338，1999中描述。
离心处理中的一些步骤可以自动化，或者可设计成根本不需要操 作人停止离心。例如，通过适配于可从Beckman Instruments公司购 得的制备性离心机(如超速离心机)的机构特性，液体和样品的加入 和去除可以在不停止转子旋转的情况下完成。有可能会希望在仍然施 加着向心力的情况下来探测光子发射(例如对于若不作离心转动发光 细胞与靶颗粒的接触就不会稳定的情况)。为了探测从旋转着的样品 管发出的光子，PMT可以安排在相对于转轴的一个径向位置处。在 大多数情形中，这种设定下的PMT不需要随样品管一起旋转，而可 以是静止的并且只简单地记录样品管通过其前方时的光子发射。如果 发射的信号非常弱，则可以把探测器(如PMT或CCD芯片)连结在 转子上与样品管一起旋转。或者可以用设定在转子周围的多个PMT 来探测光子发射。
如果多个样品在同一个转子上转动，则必要时PMT的位置或信 号处理可以改变。在一个实施例中，转子上搭载了4个样品管，每个 样品管都含有发射同样波长光子的细胞。为了区分各个样品的发射， 可以用一个径向对准的PMT连续地探测光子发射。然后利用一个来 自转子的监视每个样品在各时刻的位置的时标曲线来分解连续的发 光数据，确定每个样品的发光情况。可以理解本发明还包括了一些其 他的变化。
例如，图17是转子上承载了2个反应管并且在管子下方有2个 对准着的PMT的示意图。利用转子位置编码器，在停顿位置处转子 使每个管子向下对准于相应的PMT。在另一个例子中，图17所示的 离心系统可与一个空气样品收集器集成在一起，构成图18所示的系 统。径向的气浮物撞击管可以是任何类型的颗粒监视器，如美国专利 No.5,932,795和其中引用的参考资料所描述的监视器。在又一个 实施例中，图18所示的系统可更改得变成只需要一个相对于转子轴 径向对准的PMT，如图19所示。如上所述，被PMT纪录的发射情 况可用轴位编码器分解成每个样品管的发射。
返回图17，其中液体成分包括，但不局限于被加工行能识别特 定生物物质的悬浮B细胞、缓冲溶液、防变质剂、细胞介质等，这 些成分可被放置在几个离心管的任何一个中，并混合以悬浮着在另一 个步骤中预先从气浮物样品中收集到的样品颗粒的液体(其中的颗粒 可以包括，但不局限于，蛋白、肽链、化学剂、病毒、植物型或孢子 型的细菌、真菌孢子、花粉粒子、原生动物、血液或组织细胞及它们 的碎片，这些颗粒可以是单独的，也可以是与例如灰尘等载体粒子相 结合的)。当马达开始旋转时，离心管便被甩出成径向位置，于是B 细胞和/或颗粒将按照颗粒的大小和密度以不同的速率被驱赶到离心 管的底部。细胞和含样品液体的加入和离心的准确顺序可根据它们的 相对沉降速度，以得到最大信号为目的来设计。一般，可以预期能够 通过选使这些样品旋转(预旋转)适当时间然后加入B细胞并使它 们一起旋转到互相接触，来使较B细胞沉降得慢的颗粒能诱导出最 大的光子输出。对于以相似于或快于B细胞的速度沉降的颗粒，对 样品与B细胞混合物的单次旋转将诱导出系统的最大光子输出。可 以利用结合于离心装置的上游主的颗粒尺寸分析器所给出的数据来 自动化确定最优的操作顺序和启动恰当的计算机控制自动样品处理。
当“旋转周期”结束并且在旋转马达和轴位编码器的控制之下转 子在一个预定位置上停下来时，摆臂将因重力作用而下垂，使离心管 的底部面对于光电信增管的光敏面，然后记录光信号。在该实施例的 一个修改型中，可以把单个光电倍增管放置在转子/反应管离心机的 最大半径处，以便在各个反应管相继经过光电倍增管的光敏面时收集 来自反应管的光子。可以根据轴位编码系统的监视来区分和叠加来自 每个反应管的光子输出。
返回图18，其中对气浮颗粒的收集处理和使气浮颗粒与B细胞 相接触的处理被集成在一起。离心管被安装在摆臂上，旋转时摆臂将 让离心管能盖住径向撞击管的端部，于是，由于作用在旋转着径向撞 击管内的空气上的离心力，气浮样品将被引导流进离心管的样品入口 (如有必要可辅之以另外的吹气单元)。高速的流动使气浮颗粒撞击 到离心管的内表面上或管内所含液体的表面上，分别造成颗粒被捕获 于管子表面或液体中。存在液体时，作用在液体的离心压力将能抵消 为让颗粒被捕获于液体所需的高速空气流所产生的力，并防止颗粒被 撞击空气吹出。在与管子表面或液体撞击后，气浮颗粒将被留住，对 于液体收集的情况，颗粒将被迫沿径向向外流动，结果在最大半径处 (离心管底部)产生增大的局部颗粒浓度。在收集步骤之后加入B 细胞将它们旋转到局部浓缩的颗粒所处的同一区域将造成光子输出。 或者，也可以是在收集步骤进行时已在液体中加入了B细胞，并且 单个光电信增管在旋转时实时监测输出(图19)。这一实施例的一种 修改是，在入口入加入液体组分(包括但不局限于通过其他手段如生 物气浮颗粒收集吕所收的颗粒样品和已加工B细胞的悬浮液)并且 离心力使它们分布到管中。
当“旋转周期”结束并且在旋转马达和轴位编码器的控制之下转 子在一个预定的位置上停下来时，摆臂将因重力作用而下垂，使离心 管的底部面对于光电倍增管的光敏面，然后记录光信号。在该实施例 的一个修改型中，可以把单个光电倍增管放置在转子/反应管离心机 的最大半径处以便在各个反应管相继经过光电倍增管的光敏面时收 集来自反应器的光子。可以根据轴位编码系统的监视来区分和叠加来 自每个反应管的光子输出。
图7是顺序离心结果的代表性示意图。对于小于发光细胞但具有 与发光细胞相同密度的靶颗粒，首先旋转待测颗粒(例如以高速)使 之成团的是有益的。然后加入发光细胞，再在能防止减小所需的细胞 应答特性的可能是较为温和的条件下进行旋转(图中最高一行的顺 序)。此外，这一离心顺序将迫使几乎所有的待测颗粒和发光细胞进 入离心管底部处的一个比较小的体积内。反之，如果先把待测颗粒与 发光细胞混合在一起然后一次性地使它们旋转将会导致颗粒与发光 细胞的分离而不是接触(图中的中间行)。当然，若根本不作旋转， 则将大为减小反应室中颗粒和发光细胞的有效浓度(图中最下一行)。
图8示出一个用实际实验证明图7的顺序结果的曲线图。在图7 所示的三种方法中，都使用了对土拉热弗朗西丝氏菌具有有特异性的 发光细胞与已死亡土拉热弗朗西丝氏菌的混合。在曲线图中可以看 出，顺序旋转方法造成接触之后的快速而高效的发光。反之，单次旋 转方法的发光曲线在时间上和幅度上都要差得多。无旋转方法则难得 产生几次发光反应。
在另一个实验中得到了类似的发光曲线，如图8所示。对这些发 光曲线的审视似乎表明，单次旋转方法中的目标特异性发光经两次旋 转方法的稍快一些。然而，已发现这一结果主要是因为两次放置方法 需要较长的旋转时间造成的，因此并不能反映B细胞的应答时间实 际上有所改善。事实上，两次旋转方法的初始斜率明显大于单次旋转 方法，说明两次旋转方法导致了健全的发光应答。
图8所示探测系统的灵敏度可以用滴定方法计数进入离心管的 兔热菌的数目来评估。图10的曲线图总结了评估结果。可以看出， 25000个发光细胞能在应答于约5300个土拉热病靶颗粒时发出超过 背景的可探测光子。可以期望，对的反应条件的进一步优化将提供灵 敏度。
在经过一次冷冻，解冻循环后细胞应答将可改善(见图22)。在 该实验中，对特异于鼠疫杆菌(YP)的细胞进行离心、再次悬浮于 冷冻剂(含有10％ DMSO的RPMI再加10％ FBS)、在—80℃下冷 冻，然后转移到液氮中。在37℃下解冻细胞，把1ml(2×166个)细 胞稀释在4ml的RPMI中，并在37℃下培育过夜。第二天对细胞加 载腔肠素等待2小时，然后洗入独立地CO2的介质(CO2—I)，恢复 24个小时。用5×105个YP(50ml深度的107/ml的YP)作用于10000 个细胞。未经处理的细胞表现为9500个光子每秒的应答，而经冷冻/ 解冻处理的细胞在应答于YP时发出的6倍的光子。仅使细胞暴露于 冷冻剂而不进行冻结也可发出5倍的光子，这一刺激作用可被大量复 制。发现冷冻剂中的刺激因子是DMSO。当细胞用2％的DMSO处 理时(指DMSO的最终浓度，即让1ml位于含10％DMSO的冷冻剂 的细胞稀释到4ml的普通冷冻剂中)，可以探测到类似的刺激水平。 DMSO的作用可能源自许多因素。已知DMSO可实现造血细胞分化， 可能通过这个途径刺激细胞。此外，冷冻在含甘油介质中的细胞也显 示出类似的刺激水平。于是看来该作用还部分地由于DMSO所诱导 的应激应答，有可能可以利用任何一些能刺激“热休克”应答的条件 来复制这一刺激。
细胞可以在充有腔肠素的冷冻状态下存储。细胞先加载以腔肠 素，恢复24小时，然后冷冻。解冻后用10ml的CO2—I介质洗涤， 使细胞以每毫升5×105个的浓度重新悬浮于CO2—I介质中。这些细 胞可探测YP(在解冻后约1小时，但较少的时间也是可能的)。如果 在室温(RT)下存储，这些细胞仍能探测YP。在加载腔肠素和冻冷 之前用DMSO对细胞进行预先处理，可以提高解冻后细胞对被测物 的灵敏度。
图22所示的是经过各种细胞处理后细胞对于稀释于CO2—I中的 50μl的浓度为10,000,000个YP每毫升的YP的应答情况。未经处理： 细胞在RPMI中培养，加载以腔肠素，洗涤，恢复24小时，然后加 入YP。冷冻/解冻：细胞在RPMI中培养，移至冷冻剂，然后冷冻。 解冻的细胞(1ml)置入4ml折RPMI，在37℃下培育24小时，加载腔 肠素，洗涤，恢复24小时，然后加入YP。2％DMSO：细胞在RPMI 中培养，移至含有2％DMSO的RPMI中，在37℃下培育24小时， 加载腔肠素，洗涤，恢复24小时，然后加入YP。
成功的生物武器探测系统应能抵抗战场上一般环境物质的污染。 为了评估发光细胞能否在环境不良或污染条件下工作，在使发光细胞 暴露于强柴油排气环境中1个小时或者发光细胞被107的大肠杆菌 (作为任何现场细菌的代表)，污染之后，再让发光细胞与靶颗粒混 合。其结果如图11中两条曲线所示，左侧曲线对应前一情况，右侧 曲线代表后一情况。如该图所示，上述特定的化学和生物污染测试并 不影响发光分子在应答于靶颗粒时的光子发射能力。
图13至14说明本发明的一个不同的实施例，其中不需要离心。 图13的原理图给出了该实施例的各个组合。生物气浮体告警传感器 (BAWS)探测例如具有预定尺寸范围的颗粒是否出现。Primmerman 在林肯实验室学报12：3—32，2000上的文章描述了BAWS的一个 例子。如果要探测某些符合一定规范的颗粒，BAWS将触发一个空气 一空气收集器(样品收集器，如美国专利N.5,932,795中所描述的)， 使得具有特定尺寸范围的颗粒在一个第一站处被收集并沉积在一个 孔(反应室)中，这个孔位于一个样品带条的某一部分上，对此图 14示出了不同方向的视图。当待测颗粒沉积到孔中之后，带条将前 进到一个位于发光细胞容器下方、PMT上方的第二站处。此时对靶 颗粒上的特定抗原具有有特异性的发光分子沉积在孔内，从孔中发出 的光子可被很好地监测。
在待测颗粒被BAWS探测的过程中，随着带条移经第一站，各 个待测颗粒可沉积在一些相继的孔中。在第二站处；多个分别含有不 同目标特异性发光分子的发光分子容器被安装在一个转盘上，该转盘 可使某个特定的容器旋转到指定位置上，以便让不同的发光细胞沉积 到孔中。这样便可以探测待测颗粒中的不同目标。如图14中关于孔 的顶视原理图所示。当然，如果不同的发光细胞能发射不同波长的光 子，则只要位于第二站下方的PMT能区分不同的波长，便有可能将 不同的发光细胞沉积到同一个含有待测颗粒的孔内。
图16示出本发明系统又一个实施例的示意图。在该实施例中， 在第一站处空气颗粒被沉积在一个二维孔阵列的一个含有6个孔的 行中的每个孔中(例如一个要上有6个列和几百个行)。这样，每当 孔阵列前进一行，使这个行位在第二站处，向该行内的每个孔沉积入 不同的发光细胞，便可由设置在第二站下方的一行PMT同时探测出 全部6个反应的光发射。为了帮助颗粒粘着在带条的孔中，可以在孔 中涂以粘胶或液体。
细胞工程和试验方法实施例
A.细胞加工方法：
M12g3R细胞在37℃下保持在含有5％CO2的RPMI1640潮湿环 境中，RPMI中还添加了10％的胎牛血清、1mM的丙酮酸钠、2mM 的L—glutamine、100μM的非必需氨基酸、50μM的2—巯基乙醇、 每毫升50μg的链霉素、每毫升50U青霉素、和250ng/ml的两性霉 素B(Life Technologies公司)。细胞通过电穿孔(270V，950μF)被转染 以PCMV.AEQ.IRES.NEO并在1mg/ml的G418中选择2个星期。筛 选出能应答于抗—IgM的G418抵抗克隆。这些在交联于表面IgM时 能取得光子发射最大增强的克隆被用于后续的转染以产生特异性于 特定病菌的B细胞系。通过(借助于电穿孔)与轻、重链以及一种 对向嘌呤霉素传递抵抗性的基因编码的链的共同转染，具有加工霉素 传递抵抗性的基因编码的链的共同转染，具有加工获得特异性的抗体 的表面表达即可完成。嘌呤霉素抵抗物和克隆是根据它们对抗原的应 答来选择的。在人类延长因子1α(EF-1α)促催化剂的控制下，轻链 表达载体将在多个克隆点(MCS)的下游包含对于人类Kappa基因 的恒定区。重链载体是通过如下pDisplay(Invitrogen)来产生的：保留 巨细胞病毒(CMV)启动子和引导序列，但用小鼠IgM的结合于膜上 的恒定区的基因来取代从血小板衍生的生长因子(PDGF)受体穿膜 区，现时除去MCS两侧的标记。利用PCR向抗体的可变区加上一些 适当的限制点，并在克隆成表达构建体之前确认所有PCR产物的序 列。用来产生重组抗体的可变区是从以下两条途径克隆的：从cDNA 克隆或者由利用随机寡核苷酸引物和PCR的逆转录(RT)从杂交瘤 克隆。根据制造商的推荐，RNA可用Trizol试剂(Life Technologies 公司)提取，且第一链的合成使用逆转录试剂盒(Ambion)进行。 PCR用设计为与轻链或重链5’端的引导序列[S.T.Jones和 M.M.Bending，B.生物发光B细胞对FMDV的应答：
用于发光试验的以pCMV、AEQ、IRES、NEO菌液和能识别 FMDVA12菌株的重组抗体的表达载体稳定地转染的M12g3R B细胞 系用下述方法制备：第一天解冻细胞。解冻后经过24小时再制备细 胞对于获得最大活性和可靠性是至关重要的。冷冻/解冻步骤可使B 细胞的应答提高多达100倍。第二天，在覆盖以薄膜的情况下，在带 有50μM coelenterazion(Molecular Probes公司，Eugene OR)的试验介 质[无需CO2的介质，10％的FBS，50μg/ml的链霉素，50U/ml的 青霉素，250ng/ml的两性霉素B(life Technologies)]中以室温培育 106个细胞2小时，洗涤2次、最后以5×105个细胞每毫升的浓度重 新悬浮于试验介质中。在1.5ml的微量离心管内在室温下整夜旋转细 胞，待15—20小时后进行试验。试验时，用25μl的细胞与抗原(5 μl浓度为1.4×108pfu/ml的wt A12pRMC35系族，10μl浓度为7.5 ×107pfu/ml的A12变体B2PD.3)相混合，并用测光计(Lvemat LB9507，Perkin Elmer公司)测量应答。
C.细菌和大病毒的生物发光试验：
本传感装置和方法也可用于细菌和病毒的快速探测。细胞系被加 工成能应答于土拉热弗朗西丝氏菌——土拉热病的病源。然而，当采 用与FMD和VEE病毒相同的方法进行试验时，信号产生很慢且几乎 无法与背景分开，表明B细胞与抗原之间的相互作用率很低(O预旋 转/O旋转，即不离心)。过去用抗原珠刺激剂所做的实验已证明通过 浓缩抗原和B细胞可以提高灵敏度和速度(未给出数据)，于是重新 设计测光计使其在光电倍增管(PMT)上方设置一个离心机。当待测 物与细胞混合在一起后用离心机进行浓缩(O预旋转/5S旋转)，发现 信号改善且应答变快。当在加入细胞之前预先使较慢沉降的土拉热弗 朗西丝氏菌离心时(60秒预先旋转/5秒旋转)，可观察到最佳的结果。 这一方法保证了在短时间内有大量细胞与抗原发生物理接触，从而大 为改善了灵敏度和速度。在对试验方案进行了额外的优化之后，我们 能在不到三分钟内(其中还包括了预旋转的时间)探测到60cfu(克隆 形成单位)的土拉热弗朗西丝氏菌，但没有看到对非激活鼠疫杆菌(鼠 疫的致病细菌)的反应。这一探测极限已由另两个非激活土拉热弗朗 西丝氏菌来源和一个不同菌素(未给出数据)的肯定。此外，本传感 器装置还具有宽广的灵敏度范围，可探测的浓度范围达7个数量级。
B细胞用上述方法制备。50μl含有上述数量的鼠疫杆菌或土拉 热弗朗西丝氏菌的试验液以6500×g的力离心60秒，然后加入20μ 1的细胞并在离心我计中再旋转5秒。用Hamamatsu HC-125光电倍 增管探测光子，用Stanford Research Systems SR400选通光子计数器 监测信号。
其他实施方式
应该理解，虽然上面结合详细说明描述了本发明，但该发明只是 为了示例性说明本发明，而不是限制本发明的范畴，这个范畴应由所 附权利要求书定义。其他的方面优点和修改都在本发明范畴之内。
相关申请的互相参考
本申请要求美国专利申请流水号No.60/266 977的优先权，该申 请的标题为“光电子探测系统(Optoelectronic Detection System)”， 申请日为2001年2月7日，该申请的全部内容在此并入作为参考。
关于联邦资助研究的说明
本申请受到美国空军合同(合同号No.F19628-00-C-0002)政府 基金的资助，政府享有本发明的某些权益。
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这些装置一般包括：一种用于容纳传感细胞(如B细胞或成纤 维细胞)的液体介质，一个光学探测器，以及一种用来接收待探测靶 颗粒的液体介质。每个细胞均有受体(如嵌合抗体(chimeric antibody) 或单链抗体)，它们表达于细胞表面，并对被测抗原有特异性。抗原 与受体的结合将产生一个涉及化学变化或生化变化(如钙浓度的增 大)的信号途径。这些细胞还在其细胞质中含有发光分子(如水母发 光蛋白质(aequorin)或indo-1)，这些发光分子能针对上述信号途径 (如细胞质中的钙浓度增大)产生反应而发射光子。探测器可以用一 个可透过光子的覆盖物(如玻璃)与所述含细胞的介质分开。这一覆 盖物可以用来支撑介质、保护探测器易碎表面、或起透镜的作用。光 学探测器，例如电荷耦合器件(CCD)，能够探测到细胞作为对受体 介导的信号途径的应答而发射的光子，并向用户指明已出现了待探测 的抗原。可以使用的其他光学探测器还有光电倍增管、光二极管、互 补金属氧化物半导体(CMOS)图像探测器(例如参见 http://kodak.com/US/en/corp/researchDevelopment/technologyFeatures/c mos.shtml)、雪崩光二极管、和像增强电荷耦合器件(ICCD)(例如 见那些可从英国photek Ltd.，East Sussex购得的器件)。在一些实施方 案中，光学探测器能够区分各个单个细胞。
本发明部分地基于下述发现：随着待探测靶颗粒大小的不同，待 测的待测颗粒应该在发光细胞于反应室(如离心管)中被沉积之前或 之后与该发光细胞相混合。已发现沉积顺序对探测效率的高低有极大 的影响。当靶颗粒是细菌从而远小于B细胞时，在离心管内沉积和 浓缩B细胞之前首先在离心管内沉积浓缩待测颗粒可以大为提高探 测效率。这一事实的部分原因是，不同大小的颗粒(如细胞和细菌) 有不同的颗粒沉降速率(sedimentation rate)。如果把细胞和细菌混合 在一起同时进行离心，则细胞将快速地凝聚成团而大部分的细菌却至 少在一段时间内将停留在细胞团上方的液体中。反之，如果在把较大 的发光细胞以低速驱入待测颗粒内之前，预选以高速旋转使待测颗粒 浓缩集中，则可以增加而不是减小细胞与颗粒的接触。如果靶颗粒(如 原生动物)大于B细胞，则顺序可以反转过来或简化为B细胞和待 测颗粒的单次离心。由于这里所描述的探测系统依赖于发光细胞与靶 颗粒的接触，所以重要的是应该尽快和尽量高效地达到接触。因此， 反应室内的定位化(localization)顺序对于改善探测是重要的。
此外，分开地把发光细胞和待测颗粒放入一个或几个反应室可为 系统提供灵活性并允许探测多个样品中的多种靶颗粒。例如，可以使 多种分别对不同的靶具有特异性的发光细胞与单独一种颗粒样品相 接触。或者可以使同一种发光细胞与不同的颗粒样品相接触。是否将 分别对不同抗原或靶颗粒具有特异性的不同发光细胞放置到空间上 分开的不同反应室内，取决于不同发光细胞的光子波长是不同的还是 相同的。如果波长相同，则反应可以是，但不需要一定是分开进行的。 有关多重探测需要考虑的问题请参见美国专利No.6,087,114和 USSN 09/169,196。
本发明的一个方面是一种用于探测靶颗粒的光电子系统，该系统 包括：
一个第一反应室；
一个样品收集器，用于收集存在于介质中的待测颗粒，该收集器 被设计成能在第一反应室中沉积待测颗粒；
一个含有第一发光细胞的第一容器，每个第一发光细胞都含有第 一受体(如抗体)，所述受体表达于每个第一细胞表面上并对待探测 的第一靶颗粒具有特异性，其中每个第一发光细胞还含有一个第一发 光分子，所述分子能在应答于所述第一靶颗粒与所述第一受体的结合 时发射第一光子，其中所述第一容器被设计成能将至少一部分的所述 第一细胞沉积在所述第一反应室内；以及
一个准备接收所述细胞所发射的光子的光学探测器。
该系统还可以包括一个转子，该转子适合于与所述第一反应室相 连接，并且，当其旋转时将向所述第一反应室施加一个向心力或离心 力，这个力足以把大部分的所述待测颗粒或第一发光细胞收集到第一 反应室的某一部分内。
本发明的另外方面是任何具有以下性质的上述系统：其中第一反 应室被安装在一个可动台上，其中在一个第一站处该可动台使第一反 应室置于一个第一构形(configuration)，以使得收集器将待测颗粒沉 积在第一反应室内，并且其中在一个第二站处该可动台使第一反应定 处于一个第二构形，以使得第一容器将至少一部分的第一发光细胞沉 积在第一反应定内；其中光学探测器包括电荷耦合器件，雪崩光二极 管、CMOS图像探测器，光电倍增管或其他光探测器或此类探测器的 阵列；其中介质是一种气体；其中介质是一种液体；其中发光细胞是 B细胞；其中B细胞含有编码第一受体的人工表达质粒；其中第一受 体是单链抗体；其中第一靶颗粒是病毒、细菌、蛋白质、核酸、真菌、 原生动物、多细胞寄生物或朊病毒(prion)，以及由这些颗粒产生或 诱导的产物；其中所述第一靶颗粒选自如下一组：口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、土拉热弗朗西 丝氏菌(Francisella tularensis)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio Cholera)、正痘病毒(orthopoxvirus)(含天花病毒(Smallpox))；其 中第一反应室的一部分包被有载体蛋白层；其中载体蛋白层是牛血清 白蛋白；其中第一反应室的一部分包被有聚L赖氨酸；还包括一个能 按先后顺序沉积待测颗粒和至少一部分第一细胞的控制机械装置；其 中的先后顺序是首先沉积至少一部分第一细胞然后沉积待测颗粒；其 中的先后顺序是首先沉积待测颗粒然后沉积至少一部分第一细胞。
本发明的其他方面是在此所述的系统：还包括一个连接于控制机 械装置的颗粒尺寸探测器，该颗粒尺寸探测器被设计成能探测进入或 存在于收集器内的待测颗粒的尺寸，其中(1)如果颗粒尺寸探测器 探测到待测颗粒的尺寸大于某一参考尺寸，则控制机械装置将设定成 首先沉积至少一部分的第一细胞然后再沉积待测颗粒，以及(2)如 果颗粒尺寸探测器探测到待测颗粒的尺寸小于某一参考尺寸，则控制 机械装置将设定成首先沉积待测颗粒然后再沉积至少一部分第一细 胞；其中控制机械装置包括一个其上安装了第一反应室的可动台，其 中在可动台的第一站处使第一反应室置于一个第一构形状态，以使得 收集器沉积第一反应室中的待测颗粒，并且其中在第二站处使第一反 应室置于一个第二构形状态，以使得第一容器沉积第一反应室中至少 一部分的第二细胞；其中第一反应室包括一个粘性表面，并且收集器 对着粘性表面引导气流；其中第一反应室包括一个过滤器，并且收集 器迫使介质流经过滤器；其中第一容器还包括第二细胞，每个第二细 胞都具有第二受体(如抗体)，所述受体表达于每个第二细胞表面上 并对第二待探测靶颗粒具有特异性，其中每个第二细胞还含有一种第 二发光分子，该第二发光分了在应答于所述第二靶颗粒与第二受体的 结合时将发射第二光子，其中第一容器被设计成能将至少一部分的第 二细胞沉积到第一反应室中，并且其中第二光子的波长与第一光子的 波长不同。
本发明系统还包括在此所述的系统：还包括一个含有第二细胞的 第二容器，每个第二细胞都有第二受体(如抗体)，所述受体表达于 第二细胞表面上并对第二待探测靶颗粒具有特异性，其中每个第二细 胞还含有一种第二发光分子，该发光分子在应答于第二靶颗粒与第二 受体的结合时能发射第二光子，其中第一容器被设计成能将至少一部 分的所述第二细胞沉积到第一反应室中，并且其中第二光子的波长不 同于第一光子的波长；还包括一个第二反应室和一个含有第二细胞的 第二容器，每个第二细胞都含有第二受体(如抗体)，所述受体表达 于第二细胞表面上并且对第二待探测靶颗粒具有有特异性，其中每个 第二细胞还含有一种第二发光分子，该发光分子在应答于第二靶颗粒 与第二受体的结合时能发射第二光子，其中第二容器被设计成能将至 少一部分的第二细胞沉积到第二反应室中，并且其中待测颗粒也在第 二反应室内沉积；还包括一个空气采样装置；还包括一个生物学气溶 胶告警传感器；以及，其中空气采样装置是一个空气撞击器(impactor) 的系统。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、把液体样品加入到一个室中；
b、把发光细胞加入到该室中以形成一种混合物，其中的发光细 胞包括一或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和能 在应答于一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光 或荧光)的发光分子；
c、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液本样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、把液体样品加入一个室中；
b、使靶颗粒在室内定位化(例如利用离心、过滤、电泳、双 向电泳(dielectrophoresis)、磁力(使用亲和力捕获磁珠)、声波或超 声波或其他方法)；
c、加入发光细胞以形成一种混合物，其中的发光细胞包括一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和能在应答于 一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光) 的发光分子；
d、使发光细胞在室内定位化(例如利用离心、双向电泳、重 力沉降、或其他方法在颗粒所在的同一区域产生高浓度的细胞)；
e、测量混合物中细胞的光子发射(如发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、在一个室中加入发光细胞，其中发光细胞含有一或多种适 合于与靶颗粒相互作用的受体(如抗体)和能在应答于一或几种受体 与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光)的发光分子；
b、在室内使细胞定位化(例如通过使它们沉降到一个它们将 会粘着的适当表面上)；
c、加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d、使靶颗粒定位化(例如通过重力沉降、电泳、或其他方法 在细胞所在的同一区域产生高浓度的颗粒)；
e、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、在一个室中加入一些发光细胞，该发光细胞含有一或多种 适合于与靶颗粒互相作用的受体(如抗体)和能在应答于一或多种受 体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如发光或荧光的)的发光分子；
b、使细胞在室内定位化(例如使它们沉降到一个它们将会沾 着的适当表面上)；
c、加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d、使靶颗粒在室内定位化(例如利用磁珠捕获，过滤(带有 或不带有亲和力磁珠捕获)、电泳、双向电泳、声波或超声波、或其 他方法来将颗粒浓缩到靠近细胞的地点)；
e、通过对颗粒施加驱动力(例如电泳、磁驱动或其他手段) 或去除定位化力(例如允许由重力沉降)使得浓缩的颗粒进入细胞所 处的同一区域；
f、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
本发明的另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、把一些发光细胞加入到一个室中，其中的发光细胞含有一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和一些能在应 答于一或多种受体与颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧 光)的发光分子。
b、通过沉降或流动使室内的细胞定位化到一个屏障、可透性 膜或过滤器上；
c、加入液体样品中的靶颗粒以形成一种混合物；
d、使样品从细胞一侧流经屏障、可透性膜或过滤器，让颗粒 与细胞相接触；
e、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
另一个方面是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方法包 括：
a、将发光细胞加入到一个第一室中，其中的发光细胞含有一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和一些能在应 答于一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧 光)的发光分子；
b、通过沉降或流动使第一室内的细胞定位化到一个屏障、可 透性膜或过滤器上；
c、将液体样品中的靶颗粒加入到一个第二室中，该第二室在 屏障、可透性膜或过滤器的发光细胞侧的另一侧处与第一室相连接；
d、在重力或离心力的作用下使样品流经屏障、可透性膜或过 滤器，让颗粒与细胞相接触；
e、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光的发 射)。
本发明的另一方向是一种探测液体样品中的靶颗粒的方法，该方 法包括：
a、将液体样品加入到一个第一室中；
b、将发光细胞加入到一个通过可控膜(例如可电控溶解的金 膜)而与第一室相隔离的第二室中，其中的发光细胞包括一或多种适 合于靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和一些能在应答于一个或 几受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光)的发光 分子；
c、使靶颗粒在第一室内定位化(例如通过离心或其他方法)；
d、使膜溶解；
e、使发光细胞在第一室内定位化(例如通过离心、重力沉降 或其他方法在颗粒所在的同一区域产生高浓度细胞)；
f、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光的发 射)。
本发明的另一个方面是一种探测空气样品中的靶颗粒的方法，该 方法包括：
a、通过撞击、静电吸引或自静态空气落下使空气样品中的靶 颗粒定位化到一个表面或一个室的内表面上；
b、加入发光细胞以形成一种混合物，其中的发光细胞包括一 或多种适合于与靶颗粒发生相互作用的受体(如抗体)和能在应答于 一或多种受体与靶颗粒相互作用时发射光子(例如通过发光或荧光) 的发光分子；
c、(任选地)使混合物中的发光细胞定位化(例如通过用过 滤或“灯芯(wicking)效应”除去液体、离心、双向电泳、重力沉 降或其他方法在颗粒所在的同一区域产生高浓度的细胞)；
d、测量混合物中细胞的光子发射(例如通过发光或荧光)。
在其他方面，本发明方法可以是任何在此所述的方法：其中样品 是空气或液体；其中发光细胞是B细胞；其中发光细胞含有靶颗粒 的抗体；其中发光细胞包含编码抗体的表达质粒；其中发光细胞包含 编码发光蛋白质的核酸；其中发光细胞包含适合于诱导钙迁移的成纤 维细胞；其中测量包括利用一个光电倍增管、光电倍增阵列管或光电 倍增管阵列；其中测量包括利用一个电荷耦合器件、一个雪崩二极管 或雪崩二极管阵列、一个CMOS图像探测器、或一个像增强型电荷 耦合器件(ICCD)。
在其他方面，本发明方法可以是任何在此所述的方法：其中施加 离心力和测量光子发射是在单个设备中进行的，并且样品混合物位于 单个样品槽内；其中施加离心力和测量光子发射在30秒钟或更短时 间之内(如10秒钟或5秒钟之内)进行；其中整个方法在10分钟或 更短时间之内(如5分钟、2分钟或1分钟之内)进行；其中同时对 一个样品中的多种靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中的同一种 靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中的多种靶颗粒进行分析；其 中同时对1至20(例如1至10)个样品中的1至100种(例如1至 50，1至25种)靶颗粒进行分析；其中发光分子位在胞浆内；其中 在单个装置内同时对多个样品中的多种靶颗粒进行分析；其中在一个 含有1至10个通道的内同时对多个样品中的多种靶颗粒进行分析； 其中靶颗粒是口蹄疫病毒(RMDV)、委内瑞拉马脑髓炎(VEE)病 毒、鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、霍乱弧菌的01和 0139菌株和正痘病毒；以及使用本发明系统的情形。
本发明系统还包括在此所述的系统：还包括1至10个通道；其 中同时对一个样品中的多种靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中 的同一种靶颗粒进行分析；其中同时对多个样品中的多种靶颗粒进行 分析；系统尺寸为12英寸×12英寸×12英寸或更小(例如6英寸× 4英寸×1英寸或更小)。
本发明系统适用于医药(如兽医)、农业、环境保护(如诊断病 态建筑物综合征)和食品加工及标准制订等领域中的分析和诊断。
本发明的其他特点和优点将通过下面的详细说明和所附权利要 求书而变得明显。
附图说明
图1是光电子传感细胞概念的示意图；
图2是说明一个含有对可疑物质进行初步探测的采样器(触发 器)的光电子传感器的一般结构体系的示意图；
图3是说明建立用于光电子传感器的细胞系的示意图；
图4是一个生物学气溶胶告警传感器(BAWS)/光电子传感器集 成系统的示意图；
图5示出光电子传感器中B细胞对口蹄疫病毒的应答；
图6示出光电子传感器的干式撞击器模块；
图7是说明定位化和混合的效果的示意图；
图8示出利用土拉菌病细胞定位化的效果；
图9示出光电子传感器的一个自动细胞供应模块；
图10示出使用光电子传感器时一个兔热菌细胞样品的剂量应答 关系；
图11示出B细胞对化学和生物学污染的抵抗能力；
图12示出光电子传感器的一个自动离心模块；
图13是说明一个空气撞击器/光电子传感器的示意图
图14是说明一个光电子传感器的示意图；
图15示出光电子传感器的光学/光电倍增管(PMT)模块；
图16是说明一个空气撞击器/光电子传感器的示意图；
图17是说明光电子传感器中一个多通道离心机的示意图；
图18是说明光电子传感器中一种湿离心/撞击器概念的示意图；
图19是说明光电子传感器中一种湿离心/撞击器概念的示意图；
图20是光电子传感器的一个特制管(custom tube)的示意图；
图21示出一个集成的干式撞击器/光电子传感器。
图22说明细胞处理对特异于鼠疫杆菌的B细胞的应答的影响。
图23示出一个能收集气溶胶样品的撞击器。
详细说明
本发明涉及基于细胞的探测系统，所述的细胞在其表面上具有抗 体并且含有一种在抗原或靶颗粒的外部刺激下能发射光子的化合物。 适用于本发明的材料和处理步骤说明如下。
细胞
细胞可以是原核或真核生物细胞，其可以自然地或通过基因工程 或化学添加而含有适当的受体、信号途径和信号输出方法。只要含有 功能性受体、信号途径和信号输出方法，细胞甚至可以是人造的或者 是无生命的单元。当抗原与抗体结合时，细胞将使钙离子迁移到细胞 质中。一个可以用于本发明装置和方法的细胞的例子是B细胞(即 具有骨性颚(bony jaw)的冷血或热血脊椎动物的B细胞)，它可以 借助基因工程来表达一或多种表面结合型的单克隆抗体。所述单克隆 抗体例如可以这样产生：用待探测的抗原使一个动物免疫，再从免疫 后的动物采集B细胞。然后，将编码所述单克隆抗体的DNA(脱氧 核糖核酸)分离出来并转入一个不朽化的细胞系，然后筛选出具有对 待测抗原具有特异性的表面单克隆抗体的细胞系。B细胞对于定性分 析和定量分析都是有用的，这特别是由于B细胞的发射信号典型地 并不随着暴露于其的另外的靶标本而显著降低，并且还由于此发射信 号具线性性质。
或者，细胞也可以是成纤维细胞。不过，成纤维细胞不具有将信 号从表面抗体的胞浆部分转换成细胞中钙储备所必需的信号转导机 制。为了克服这一问题，可以在成纤维细胞中表达一个嵌合的表面抗 体。所述嵌合抗体含有一个衍生自一多肽(例如成纤维细胞生长因子 受体)的胞浆氨基酸序列，它能将来自成纤维细胞的细胞膜内表面的 信号转换成细胞内的钙储备。这样，当一个抗原结合到嵌合抗体的细 胞外部分从而引起表面上的抗体聚积时，便将诱导出钙迁移。对于B 细胞以外的其他类型细胞也可采用利用嵌合抗体的类似策略，使得这 些细胞也可适用于本发明的装置和方法。
适用于本发明装置和方法的细胞是那些被设计成能识别某种特 定物质的细胞，包括那些在表面上含有能够特异性结合所述物质的受 体的细胞。虽然优选的受体是抗体或单链抗体，但其他适当的受体也 是可能的，其中包括促分裂原受体(如LPS(lipopolysaccharide)受 体)、巨噬细胞清道夫受体、T细胞受体、细胞黏附分子、DNA结合 蛋白如部分的序列特异性限制酶或转录因子、单链RNA(核糖核酸) 或双链RNA结合蛋白、与待识别的DNA或RNA序列互补的寡核苷 酸、或者其他与待识别物质有结合特异性的配位结合受体(如Fas、 细胞因子、白细胞介素、或激素受体；神经递质受体；气味素(odorant) 受体；趋化因子受体等)，受体可以通过一个跨膜的区域、膜上的对 受体有结合特异性的分子(如结合抗体的Fc受体)、或对于膜上分子 的共价或非共价结合(如生物素—链霉抗生素蛋白、二硫键等)来结 合到细胞表面上。受体也可以是一个嵌合分子，例如，它可以有一个 胞外区(如抗体、单链抗体、植物凝血素或其他对待识别物质有结合 特异性的区域或肽)和一个胞内区(例如来自胰岛素受体、成纤维细 胞生长因了或其他能引发第二信使级联的蛋白)。受体除了直接结合 于待识别物质外，也可以是特异性地结合于另一个分子或对象，再由 后者特异性地结合于待识别物质，例如第二抗体、标记的珠、与抗原 缀合的寡核苷酸等。
或者，这些结合步骤中可以只需要有一个步骤有特异性。例如可 以用与一种抗原(或直接与一种珠或在一种基质上)相缀合的寡核苷 酸探针把含有特异性序列的DNA或RNA从溶液中提取出来，然后 可以用与靶DNA/RNA退火的第二组非特异性抗原缀合的寡核苷酸 探针来刺激对该第二抗原具有有特异性的细胞。此外，以嵌合形式表 达在细胞表面上的非特异性核酸结合蛋白(组蛋白、精蛋白、RNA 结合蛋白)或者这些蛋白的抗体也可以用来通过序列特异性选择步骤 来探测核酸的存在。
抗体
无论细胞来源于哪种类型，单克隆抗体的抗原结合可变区都可以 或者来自公开的DNA序列，或者由一个杂交瘤细胞系通过RT—PCR 克隆得到。RT—PCR是这样完成的，利用几组设计为在5’端与可变 区的引导区或框架区退火以及在3’端与恒定区退火的引物来完成。
然后抗体可变区被克隆成已经含有轻、重链恒定区的表达载体。 Bradbury著作中所述的轻链表达(Gene 187：9—18，1997)特别适 合于这一目的。Bradbury描述的VK表达含有EF—1x启动子，一个 引导序列，多个克隆位点，人类Ig kappa恒定区和聚腺苷酸信号。重 链表达载体是从Invitrogen的p Display得到的。这个载体含有一个 CMV启动子、一个引导序列、一个HA标记、多个克隆位点、myc 标记以及其后的PDGFR穿膜区和牛生长激素聚腺苷酸信号。
p Display可以用下述方法改良用于重链表达。用不含有分泌所需 的外显子的小鼠IgM恒定区替代p Display的PDGFR穿膜区。这可 保证蛋白将在膜上。新霉素抵抗基因可以由下述任一种抗生素抵抗基 因取代，它们包括，但不局限于，潮霉素、博来霉素、嘌呤霉素、卡 那霉素和灭菌素基因。重链(或轻链)可变区可以用一个双步骤方法 插入：利用重叠扩展PCR除去存在于p Display多克隆位点两侧的 HA和myc标记。也可以建立一个载体以插入含有融于约300个碱基 对的IgM恒定区的可变区的重叠扩展产物，从而可以用一个步骤完 成克隆。
下面的例子就是用上述抗体载体构建步骤来实现的。
能对待探测抗原有特异性结合的抗体是一个能结合于抗原或其 表位，但基本上不能结合于样品中其他抗原或表位的分子。这种抗体 可以是嵌合的(即含有非抗体氨基酸序列)或是单链的(即决定抗体 区的互补性由一个连续的多肽序列形成)。
或者，也可以用标准技术从动物获得产生表面抗体的细胞并来制 备产生表面抗体的单克隆细胞群体，该标准技术例如有Kohler等人 在<自然>杂志(256：495—497，1975)中；Kozbor等人在
许多用来融合淋巴和不朽细胞系的众知方案中的每一种都可应 用于生成产生表面单克隆抗体的细胞的目的(例如见上述的
表达抗体的多克隆细胞可以通过用待探测抗原使合适的动物免 疫来制备。产生针对抗原的抗体分子的细胞可以从动物身上(例如从 血液中)分离出来，并借助包被有抗原的培养皿进行淘选等已知技术 予以进一步纯化。作为制备单克隆细胞的一种替代，可以通过用抗原 筛选一个重组组合免疫球蛋白库(如抗体噬菌体显示)来识别和分离 出编码单克隆抗体的核酸，由此分离出免疫球蛋白库中那些能结合抗 原的成员。用于生成和筛选噬菌体显示库的试剂盒是可购得的(如药 物重组噬菌体抗体系统，目录号No.27-9400-01；以及Stratagene Surf ZAP phage Display Kit，目录号No.240612)。此外，例如可在下述 文献中找到特别适用于生成的筛选抗体显示库的方法和试剂的例子： 美国专利No.5，223,409；PCT公开文本No.WO 92/18619；PCT 公开文本No.WO 91/17271；PCT公开文本WO 92/20791；PCT公开 文本No.WO 92/15679；PCT公开文本WO 93/01288；PCT公开文本 No.WO 92/09690；PCT公开文本No.WO 90/02809；Fuchs等人在< 生物技术>9：1370—1372(1991)上的文章；Hay等人在<人类抗体 杂交(HumAntibod Hybridomas)>3：81—85(1992)上的文章；Huse 等人在<科学>246：1275—1281(1989)上的文章；和Griffiths等人 在EMBO学报12：725—724(1993)上的文章。
当识别出库中所希望的成员后，特定的序列可被克隆成任何合适 的核酸表达子并转染到如成纤细胞这样的细胞中，表达子也可以编码 可操纵连接于抗体序列的氨基酸序列，以适合于细胞表达抗体。如上 面所讨论的，成纤维细胞生长因子受体的胞浆穿膜序列能被连接到对 待探测抗原具有特异性的单链抗体上，使得当与抗原接触时细胞将停 止钙迁移。虽然在成纤维细胞中可以表达分开的重组重链和轻链以形 成嵌合抗体，但单链抗体也是适用的(例如见Bird等人在Trends Biotechnol 9：1332-137，1991中和Hust等人在Int Rev Immunal 10：195 —217，1993中的文章)。
光子发射分子
所需探测的物质与细胞表面受体的结合将在细胞内触发出一个 信号途径。一种优选的信号途径是在B细胞、T细胞、肥大细胞、巨 噬细胞和其他免疫细胞中发现的第二信使级联途径，其中各个细胞表 面受体的交联(crosslinking)将激活一种酪氨酸激酶，然后后者使磷 脂酶C磷酸化，磷脂酶C又把磷脂酰肌醇4，5—二磷酸酯(PIP2) 裂解成肌醇1，4，5—三磷酸酯(IP3)和甘油二酯(DAG)；然后IP3 打开钙通道，使例如细胞内质网存储的细胞内钙释放或者使细胞外的 钙进入细胞，由此提高细胞内的钙浓度。根据受体的类型、细胞的类 型和所需的信号转导方法，也可采用另外的第二信使级联，例如G 蛋白腺嘌呤环c-AMP蛋白激酶A级联。
需要提供一种方法来监测细胞在应答于待识别的物质时的内部 信号转导。如果信号转导涉及胞浆中钙的增加，则一个优选的探测方 法是钙敏感发光分子或荧光分子，例如多管水母、obelin、thalassicolin、 mitrocomin(halistaurin)、clytin(phialidin)、mnemopsin、berovin、 Indo-1、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、calcium green、BAPTA、 cameleons(见A.Miyawaki等人在Proc.Nate.Acad.Sci.96，2135—40， 1999上的文章)或类似分子。可以预料，利用钙敏感分子产生的相 对光强度和传感器细胞存储特性可能取决于特定的发光分子和激活 发光分子的半衰期——在某些情形下可具有显著的优势(例如改善的 灵敏度、定量或定性的探测)。利用光蛋白发光分子自然的辅助因子 的结构类似物，可能还会产生其他的性能增强。可以从一些途径购得 各种能被激活细胞接纳的钙敏感荧光染料，如Molecular Porbes，Inc.， Eugene，OR。例如水母，obelin、thalassicolin、mitrocomin(halistaurin)、 clytin(phialidin)、mnemopsin、berovin或cameleons等蛋白可以用遗 传学方法加入、注入到细胞内，或者用来自HIV TAT(氨基酸约47 —57；见A.Ho等人在Cancer Research61，474—477，2001上的文 章)的蛋白摄取标记提供，或者用其他手段加入。如果需要，此类报 告分子可以包括一些目标信号，使这些分子导向到内质网或胞浆膜的 胞质面上、线粒体的内部或者那些局部钙浓度变化可能特别大的位置 处。也可以使用探测信号通路中其他位置的活性的光学方法，例如附 着在信号途径组分上的荧光基团的荧光共振能量转移(FRET)(见 S.R.Adams等人在<自然>349，694—697，1991上的文章)。对于内 部信号转导涉及增加活性氧分子(如超氧阴离子、羟自由基、辣根过 氧化物酶化合物I或II等)的情形，优选的探测方法是活性氧敏感性 发光或荧光分子，如光蛋白pholasin(一种来自生物发光软体动物 Pholas dactylus的34—k Da糖蛋白)或类似分子。或者，任何荧光 素酶的报告基因可以连接到被信号途径诱导出的启动子上。在T细胞 和肥大细胞等细胞中，信号途径将触发出含有例如粒酶(granzyme)、 类胰蛋白酶(tryptase)或chymases等蛋白酶的胞吐(exocytosis)颗 粒。这些蛋白酶的胞吐可以用色度或荧光度量方法探测(例如连接在 被蛋白酶裂解的肽链上的p-硝基苯胺(p-nitroaniline)或7-氨基-4-三 氟甲基香豆素(7-amino-4-trifluoromethyl coumarin，AFC)上，(见 以下文章：S.E.Lavens等人的<免疫学方法学板>166，93，1993； D.Masson等人的FEBS Letters 208，84，1986；R&D Systems)。还有， 用微电极或其他方法来探测与钙离子流或其他信号转导离子流相关 的电活动也适用于监测细胞中的信号转导应答。
合适的发光分子是任何能在应答于增加的细胞质钙浓度时发射 光子的分子，包括生物发光和荧光分子。在Buttou等人的
可以用本领域众知的方法把水母发光蛋白或任何其他发光分子 导入细胞。如果发光分子是一种蛋白(例如水母发光蛋白情形)，则 细胞可以含有一个编码该蛋白的表达载体(即，一种被导入细胞后将 产生发光分子的核酸或病毒)。表达载体可以存在于染色体外部，或 者被整合到细胞基因中。
反应室
适用于本发明的反应室可以是任何基质或容器，只要发光细胞和 待测粒子能在其中混合并互相接触。在一个实施例中，反应室是一个 离心管(例如微量离心管或Eppendorf管)。如前所述，为了使被测 颗粒或发光细胞之一管先聚积成团，然后再把另一个驱入这个团中， 离心是一个特别适用的手段。为了增加粒子和细胞的成团，管的侧壁 可包被非粘性载体蛋白(如牛血清白蛋白)以防止发光细胞粘到侧壁 上，并且可以在管底涂以聚L赖氨酸来协助保证靶颗粒被粘留在管 底。在细胞生物学领域中还已知其他能防止或者造成细胞粘着的蛋白 或分子，它们也都适用于本发明。
具有特制样品孔几何形状的离心管提供了又一个实施方式，它利 用离心来增加B细胞与不易沉降颗粒的相互作用和减少对特定旋转 顺序的要求。在该实施例中，含有被分析粒的样品被放置在一个样品 室最大宽度近似等于发光细胞直径的管子中。使浓缩的发光细胞悬浮 在样品的上层，然后用离心来驱使大量密集在一起的发光细胞穿过小 的颗粒，同时在几何形状的限制下增大了发光细胞抗体与颗粒的相互 作用。与细胞相关联的抗体同颗粒的结合将捕获不易沉降的颗粒并把 它和发光细胞一起快速地拉向管底，这时在管底发出的光可以用光电 倍增器件观察到。
在另一个实施方式中，例如(如附图所示，反应室是一些排成二 维阵列的孔，例如是一个微滴板、或是一些沿一个带条的点或孔。这 些设定使得可以对多个样本和/或多种靶颗粒进行多重探测。为了自 动地供给待测颗粒和/或发光细胞，反应室或者样品收集器和发光细 胞容器至少可在两个方向上接近。孔阵列也可以像前述对离心管那样 用粘性或非粘性涂层处理，使发光细胞与待测颗粒更易接触。
样品收集器
可以用不同的装置从例如空气中收集样品。一般，空气采样装置 有一个含有液体的收集室，空气或气体从中或从其边上流过；或者有 一个多孔过滤器，当空气或气体流经该过滤器时颗粒(例如靶颗粒) 即被截获。对于含液体的收集室，可以通过把收集的液体离心或作其 他处理来使颗粒从液体中分离出来。然后在一个反应室中使分离的颗 粒沉积。对于有过滤器(如硝化纤维素)的收集室，过滤器或其一部 分可以起着反应室的作用。或者，可以从过滤器中洗出颗粒，或者可 以使过滤器溶解或用其他方法从颗粒上除去。过滤器收集室也可以用 来从流经它的液体(如供水样品(water supply sample)或脑脊液) 收集颗粒。此外，如前所述，可对液体样品离心以除去液体中的任何 颗粒物质。可用于本发明的许多种采样品都是已知可购得的。见SKC， Inc(www.skc.com)，该公司出售SKC BioSampler和其他采样装置。
也可用其他空气采样器。例如Air—O—Cell采样盒(SKC公司)。 在该装置中，空气中的颗粒被加速并与一个粘性片相碰撞，后者可直 接用于各种着色处理和显微检查。
气浮颗粒可以在一种称作撞击器的装置中用惯性分离法收集。把 一个含有被收集颗粒的气流从感兴趣的环境中吸入到撞击器内，其中 该气流被导向一个撞击表面。当撞击器的几何参数和其内的流速适当 时，具有足够惯性的颗粒将不随气流流动而是撞击到一个表面上。由 于静电作用和/或范德瓦尔力作用，相当一部分撞击表面的颗粒将被 粘住，从而被收集和浓缩。这样，利用包括上述装置和方法在内的各 种可用的试验技术，含有蛋白(包括毒素)、病毒、细菌(植物型的 胞子型的)、寄生虫、花粉和其他可探测物质的气浮颗粒可被收集以 供探测。
使用空气撞击器为生物试验收集干样品较之传统的空气至液体 样品收集具有一些普通的优点，即可减少或免除消耗物和转换机构， 从而减少了试验成本和简化了自动化。本发明装置和方法的特点优点 是，利用干式撞击进行收集保证了，不论单个待分析颗粒的大小如何， 在添加本发明装置和方法的传感细胞之前所有收集到的样品全部定 位化于一表面上。这样，不论待分析颗粒在液体中沉降系数为多大， 它们全部实现了定位化，从而使上述装置和方法的灵敏度最大化并因 免除了耗时的步骤而加速了许多试验。
能保留撞击到其上的一定比例的颗粒并适用于后继试验的任何 表面都适合于用作收集表面。合适的材料包括生物兼容的金属、塑料、 玻璃、晶体、气溶胶、水溶胶、纸张等。这些材料的特别有用的形式 包括微量离心管、用于高通量筛选的多孔板、连续带条、过滤器、侧 向流动免疫试验(lateral flow immunoassay)的缀合释放垫等。通过 修改收集表面来增加收集效率的方法包括：添加能产生对生物颗粒粘 性的涂层(这些涂层在性质上可以是化学的或生化的，如聚赖氨酸)； 增加表面粗糙度来增大收集表面面积；特制表面几何形状来使颗粒沉 积在规定的表面区域中。还有，可以通过使静电荷附着到收集表面和 输入颗粒上从而产生附加的吸引力来进一步改善收集效率。
对式撞击收集器的进一步改进可以这样实现：在收集器上游使 用一个空气——空气浓缩器来增加撞击到收集表面上的每个单位空 气样品中的颗粒数。这可以大为减少为探测器能提供可靠结果所需的 足够数目的气浮颗粒的收集时间。
在关于这个收集概念的一个例子中，图23所示的撞击器被设计 成在一个可购得的塑料管底部收集气浮样品。一个喷嘴向下伸入管 中，其出口位于管子内表面的曲率半径处。这样的布置增大了颗粒撞 击到管子底部的可能性，在那里装置的传感细胞最可能与颗粒接触。 一旦完成了收集，一个含有装置传感细胞的液滴被直接加到含有被收 集的气浮颗粒的管中，旋转5秒钟来加速对管表面的细胞供应，并用 光子探测器(如PMT、CCD、光二极管等)测量发出的光。利用这 个设备，可以在不到一分钟的时间内从气浮颗粒中收集干细菌胞子并 直接用光电器件识别出来。这个方法可用于多个收集样品的管子和一 个能控制后续试验的自动系统来实现。一个系统如何能够控制至少 10个独立的试验的例子示于图4、6、9、12和15。通过实现一种能 在一个管子(复用的)内寻找多种待分析颗粒的方法，单个试验周期 内可探测的物质数目可以大于管子的数目。这种方法可以这样实现， 生成表达了多个对不同待分析物有亲和性的受体的各个光电子探测 装置细胞系，或者在单个管子内组合多个有不同的特异性的细胞系。
图4是一个生物气浮告警传感器(BAWS)/光电子传感器集成系 统的示意图。BAWS触发模块用来初步探测例如具有预定尺寸范围的 颗粒的出现。如果探测到了符合预定规范的颗粒，ABWS将触发一个 空气——空气浓缩器，后者使具有特定尺寸范围的颗粒通过一个干式 撞击器模块被收集和沉积到一个孔(如反应室或反应管)内。干式撞 击器模块进行干样品收集，并与一个用来向反应室(如反应管)供应 细胞(如发光细胞)的注射模块相沟通。一个传输模块用来把反应室 组件(含有一个或多个室或管)转移到一个离心模块，在那里进行颗 粒样品与细胞的沉积或混合。离心模块可以(但不必须)与一个用于 探测光子发射的光学/PMT模块相沟通。一个控制器模块用于控制系 统的操作。
图6示出干式撞击器模块概念的一个例子。该例子中示出了一个 单通道(如原型系统)和一个多通道装置，包括各个样品管(如PCR 管)和管座，它们与收集颗粒测试样品的空气——空气浓缩器相沟通。
图9示出一个可自动化的细胞供应的例子。利用一个注射器与注 射器泵组件(其中可包含一些滴管和供应装置)，把传感细胞(如发 光细胞)导入系统。这种类型的组件使得可以把多种传感细胞同时导 向颗粒样品(如反应室(如反应管)内的样品)。
图12示出一个用来旋转颗粒样品或细胞样品的离心模块概念的 例子。借助一个载机构把带有管子的管座导入一个能接纳管座的旋转 组件上。旋转组件使样品旋转。旋转组件与收集信号(如光子发射) 的光学模块相沟通，可以用一个编码马达使样品室对准于探测器(如 光学模块)。
图15示出一个光学模块的例子。由于精密的设计，该模块能进 行多个样品(如位于反应室、管内的样品)的同时测试。其中管座和 管子导入单元的方式使得它们能与必要时使用的透镜组件(如集成的 反射镜和透镜)相沟通，并且最终与一个光探测(如PMT)相沟通。 PMT将产生信号，该信号然后被传送给一个处理器进行处理和显示。
图21示出一个集成式的干式撞击器/光电子传感器。在该传感器， 上述各个模块被排成一列，其中有一个装有30个管座的盒子可放置 到一个带式驱动的管座传送模块上。传送模块把各个试验管按下顺序 移动：从收集器到细胞供应模块再到离模块。最后在完成了光子探测 后南移动一个确认样品存储模块。这个集成式传感器总尺寸约为54 英寸×33英寸高×22英寸深。
现实中的样品可能会含有这样一些物质，它们或者会阻止试验实 现(结果造成假阴性)，或者会在并无靶抗原的情况下引起反应(造 成假阳性)。在许多情况中，可以在试验之前对样品进行处理以除去 这类物质。例如，对于去垢剂或血清因子这类可溶性物质，可用一个 预离心步骤予以去除，其时试剂将集中在管底，于是可以用试验培养 液(Portal Shield样品)来置换管内的液体。对于不可溶解的大颗粒 物质，可以使用可购得的滤孔尺寸例如为3至5μm的过滤器把它们 从样品中波除，其中波孔尺寸的选择应能让试剂通过而挡住污染物质 (柴油或烟垢样品)。利用注入式过滤器可以快速地处理样品，仅使 总的试验时间增加几分钟。
样品定位化
作为样品收集器或反应室的一部分，可以采用除了离心以外的一 些不同方法来使发光细胞与待测颗粒更容易接触。例如，可以在本发 明系统中增加使用生物电子装置中的电泳、等电位聚焦、双向电泳、 磁标记颗粒等手段。例如见美国专利No.6,017,696、授予Nanogen， Inc.(www.nanogen.com)的其他专利、Goater等人的文章 (
把含有靶颗粒(可被发光细胞识别的任何颗粒：蛋白/毒素、病 毒、细菌、寄生虫、核酸等)的水母细胞与含有发光细胞的等份量的 培养液相混合可造成会导致光子发射率暂时增大的颗粒/细胞接触。 从混合开始到出现最大发光率之间的时间取决于特定细胞对刺激的 特征性应答时间、发生混合的时间长度(混合时间)、以及混合后颗 粒与细胞发生接触的典型时间(扩散时间)。
由于即使不存在靶颗粒时也会探测到背景光子率(例如背景细胞 发光和光子探测器及其电路的热噪声)，所以由单个靶-细胞作用所发 射的光子难以与背景区分。要得到一个有用的信号，必须大为增大相 对于背景的探测光子率。对于一个给定的样品，当混合时间和扩散时 间最小化时该探测光子率将最大化。样品中存在的靶向颗粒的其他可 能的信号有：增大一定时间内探测光子多于仅有背景时的总数，改变 探测光子的统计性质，或者改变探测光子的光谱质量。
扩散时间可以通过减小混合颗粒与细胞之间的平均距离来最小 化。这可以通过在较大的混合体积中使颗粒和/或细胞定位化到一个 小体积(通常是一个层)内来实现。然而，使颗粒和/或细胞定位化 所需的时间可能大于细胞的特征性应答时间。(颗粒和细胞在这个较 长的定位化时间内的混合可能会因增大了各次发光之间的平均时间 而造成较低的光子发射率从而较小的信号)。为了避免这一情况，颗 粒和细胞两者中的一个或者两个应该在保证它们之间的接触最小化 的前提下分开地定位化。这样的定位化也可以缩短混合时间。
一般地说，移动颗粒或细胞有以下这些方法：
●沉降(由重力或离心)
●液体流动(强迫的或对流的)
●电力(电泳和双向电泳)
●磁力(利用磁珠)
●声波/超声波(驻波或行波)
定位化要求一种移动颗粒和/或细胞的手段并结合以一个可以收 集颗粒和/或细胞的屏障，例如一个通道或容器的固体表面、一个过 滤器的表面、或者一个环绕着一个电场极小点的势能屏障。它们的例 子有：
●沉降(使细胞定位化于一个室的下表面处)
●空气撞击(撞击的颗粒粘附于或驻留于一个收集表面)
●过滤(颗粒或细胞被收集于过滤器表面或进入过滤器内部)
●亲和力捕获(通过特异性或非特异性的结合作用使颗粒或细 胞定位化)
●磁捕获(通过定位化磁力使磁珠停留在一个固体表面，过滤 器表面上或过滤器内部；磁珠可以具有也可以不具有可促使颗粒或细 胞粘附的表面化学活性)
●电泳(仅适用于带电颗粒，收集于电极表面)
●双向电泳(正：把颗粒或细胞收集于一个电极的表面；负： 收集到一个最小电场区域内)
颗粒和细胞的定位化和混合可以用上述各方法的结合与其他方 法的结合来实现。下列表格给出了各种定位化/探测器组合的一些例 子。其中某些代表性例子示出了二维的颗粒或细胞定位化方法，这使 得在使用一个光子探测器阵列(包括CCD)而不是单个光子探测器 (如一个PMT)时能够改善灵敏度或对不同颗粒的甄别能力。
例子 细胞定位化方 法 颗粒定位化方 法 混合方法颗粒或细胞 探测器 离心 离心(短时) 离心(长时) 细胞/沉降(离心) 单个 流动细胞 沉降并粘着表 面 细胞上方的浅 通道 颗粒/沉降(重力) 单个 流动细胞 (多细胞系) 沉降并粘着表 面 细胞上方的浅 通道 颗粒/沉降(重力) 成像 流动细胞 /磁珠 沉降并粘着表 面 定位化磁珠捕 获 颗粒(珠上)/沉降(重 力) 成像 流动细胞 /电场 沉降并粘着表 面 细胞上方的浅 通道 颗粒/电泳 单个 带条/吸除芯 流动(进入吸 除芯) 空气撞击(带 条) 细胞/沉降(重力) 单个 空气撞击 离心(短时) 空气撞击(带 条) 细胞/沉降(离心) 单个 Uniprep /磁珠 沉降于表面 过滤器表面上 的磁珠 颗粒(珠上)/沉降(重 力) 单个 流经细胞 过滤器表面上 的细胞 颗粒/流经细胞 单个 逆向流动 离心使细胞附 于滤波器表面 颗粒/逆着离心力流经 细胞 单个 离心管 过滤器 离心到过滤器 表面上 驻留于过滤器 表面 细胞/沉降(离心) 单个 双向电泳 捕获 沉降并附着表 面 由双向电泳力 驻留于流体 颗粒/沉降(重力) 单个 行波电介 电泳 行波双向电泳 行波双向电泳 细胞或颗粒/行波、双 向电泳 单个 可溶膜管 分开容室 离心(长时)到 可溶膜上 颗粒/可溶膜和沉降 (离心) 单个 声波/超声波
定位化实施例
在下述实施例中，除了另有说明外都作了如下假设：样品是兼容 于短期细胞寿命和功能的液态细胞溶液的一个等分部分，其中可能含 有靶颗粒(不过在下面的说明中假设存在这种颗粒)。液体样品可以 从环境、临床、从空气制备成的液体、洗涤的药签或其他样品中获得。 空气样品可以从被驱动的空气流(空气采样器或表面取样器)、静电 捕获、或制备的气浮颗粒等获得。细胞应理解为位于兼容于细胞寿命 和功能的培养液中的发光细胞。假定颗粒与细胞的接触将导致发射一 个或多个光子。样品与细胞在其中混合的室的外部有单个的或阵列的 光子探测器阵列，而且在室的外部或内部还可能有用于增强对发射光 子的捕获和探测的光学元件(如反射镜、透镜、光导管等)。混合室 假定是部分或整体地透明的，或者有其他机构可让发射的光子到达探 测器。
离心
样品可在一个室内被离心足够的时间以使颗粒沉降。细胞可在不 干扰颗粒的情况下被导入室内并被短时间离心使它们能沉降到颗粒 上。光子探测可在离心时、或者较典型地离心后进行。
亲和力捕获(表面捕获)
样品可被导入到微量离心管、多孔板、过滤器单元或其他适当的 装置内，这些装置的某些与样品接触的部分被处理成能借助特异性的 或非特性的结合作用来结合和留住可能存在的颗粒。非特异性结合可 通过静电/离子交换作用、疏水作用、亲水作用等实现。特异性结合 可通过使那些结合在基质上的成分停留在颗粒(如抗体、受体、糖蛋 白、肽链、碳氢化合物、寡核苷酸等)的表面上来实现，或者可通过 使被受体结合的那些成分停留在颗粒(如小分子、肽链、蛋白、碳氢 化合物等)的表面上。
亲和力捕获(捕获在移动基质上)
类似于捕获于表面的亲和力捕获，但颗粒是结合在可移动基质 (如聚合物珠、细胞、带电分子、磁珠、细菌等)上的，这种可移动 基质利用包括这里所说明的方法在内的各种方法提供了移动和/或局 域颗粒或细胞的额外手段。
流动细胞(flow cell)
发光细胞可被导入一个浅流动槽中并以使得附着于底部表面；再 次流动可除去非粘性细胞。样品的导入使许多细胞培养液移动，于是 颗粒可沉降到附着的细胞上。当颗粒与细胞接触时将发出光子。
流动细胞(多细胞系)
类似于上述流动细胞，但具有一些敏感于不同靶颗粒的不同的发 光细胞区域。图像探测器探测到的光子使得可判断哪些类细胞被激活 了，于是可判断样品中存在哪些种靶颗粒。
流动细胞(磁珠)
类似于上述的流动细胞。适当的磁珠与样品的混合使靶颗粒附着 在珠上。这种附着了颗粒的磁珠可被导入一个流动槽，其中的一个强 局部磁场(由永久磁铁或电磁铁产生)将把这些磁珠捕获在附着了细 胞的表面的上方。混合过程可以这样起动，或者撤除磁力使磁珠能沉 降到细胞上，或者移动磁力把磁铁吸引到细胞所附着的表面上。
流动细胞(电场)
类似于上述流动细胞，但其中含有一个细胞所附着的表面和一个 平行于该表面的用作为一些分离电极的表面(两表面中至少有一个是 透明的)。样品的导入移动了许多细胞培养液。在各电极之间施加适 当的直流电压使颗粒因电泳现象而移至附着的细胞处。
带条/吸附芯
使可能含有靶颗粒的空气样品撞击一个透明表面，该表面可以是 刚性的也可以是柔性的(如带条)是多孔的或非多孔的。在撞击区域 周围粘着一个吸收材料或吸附芯，或者于对多孔表面情况，在该表面 的另一侧粘着了吸收材料。可以把细胞置于撞击区域，由于吸附芯的 作用多余的培养液将被吸收，从而减小了含细胞培养体积和深度，使 细胞更靠近于颗粒。细胞将在撞击颗粒上沉降出来，或者，对于背面 含吸附材料的多孔表面情况，还可以利用流动使细胞被拉向颗粒。
空气撞击
使可能含有靶颗粒的空气样品被撞击进入一个适合于离心的室 (固定的，开始时是空的)内。细胞在不干扰颗粒的情形下被导入该 室并被短时间地离心使之沉降在颗粒上。光子探测可不加旋转地在旋 转中，或更典型地在旋转之后进行。
过滤装置/磁珠
把细胞置入一个含有一个室和一个带有适当过滤器的栓塞的改 进型无注射过滤装置( Mini-UniprepTM或类似产品)中， 其中细胞可附着在室的底表面上，不附着的细胞可被洗去。样品和具 有合适表面亲和力的磁珠一起被导入室内。在室内插入一个其内部含 有一个固定于过滤器背面附近的适当磁铁的改进型柱塞，直到室中的 空气通过过滤器被排除。把这个组件倒过来，在经过让磁珠沉降到过 滤器表面的一段时间后把室向下推到柱塞上。由于过滤、沉降和磁力 吸引，磁珠和颗粒可聚积在过滤器表面上。颗粒可被附着到磁珠上或 被捕获在磁珠之间。再次倒转该组件，颗粒将被磁珠带离细胞，而磁 珠则被柱塞内的磁铁吸住。除去磁铁将释放磁珠从而释放颗粒，后者 通过一段短距离后将沉降到细胞上。
流经细胞
可以让一层或几层细胞沉降到位于室底的一个适合的过滤器或 膜的表面上。把样品导入室内细胞的上方并施加压力(例如利用柱塞 或外部泵)。当样品流经互相紧密接触的细胞时，颗粒将被导入细胞 的密集范围内，发生接触。
逆向流动
可以让一个或几个细胞层沉降在位于一个“细胞”室底部的合适 过滤器或膜的表面上。样品可以放置在一个分开的“样品”室内，该 “样品”室通过某个流动通道连接于位地滤波器下方某点处的细胞 室。这两个室的相互设定关系使得在一个离心管中样品室更靠近于转 轴；样品室中液体的高度比细胞室中液体的高度更靠近于转轴。这样， 当离心管旋转时，液体将在各室间流动，试图离开旋转轴有一个共同 的距离。这将迫使一些样品向上穿过支持细胞的过滤器并经过被向外 的离心力保持着抵抗流动的细胞。当样品流经互相紧密接触的细胞时 颗粒将被导入细胞的密集范围内，发生接触。
离心管过滤器
把样品导入一个被切掉适当大小的一块的离心管过滤器的过滤 器“筐”内。在适当的离心条件下，样品将被迫穿过过滤器并让尺寸 大于过滤器切削尺寸的颗粒聚集在过滤器表面上。在过滤器筐内加入 细胞并对之短时间离心，把它们带到过滤器表面和颗粒上。
双向电泳捕获
类似于上述流动细胞，但在任一表面上带有一些合适的电极或者 带有伸入到流动细胞中的电极。使样品以连续流经电极的方式导入， 这些电极连接于外部电源并受其电驱动。当流率、频率、波形和振幅 有合适的组合时，由于负双向电泳颗粒可被导向细胞上方的一个最小 电场强度区域并在那里被捕获。停止流动并改变对电极的电驱动(可 能包括在一些电极间施加直流电压以产生电泳力)之后，颗粒将被沉 降或驱(由电泳或正双向电泳)到粘着的细胞上。
行波双向电泳
在一个浅柱状室中，在一个或两个平行面上制作一些适当的电极 (或许是透明的)，其中包括一个用于收集颗粒的中央平面电极、一 个位于周边的电极、以及一组螺旋状电极(可以与中央电极位于同一 表面也可以在其反面)。把样品导入室中，在中央电极与周边电极之 间施加一个直流电压，利用电泳把颗粒吸引到中央电极上。通过交换 液体把细胞导入室内。通过用适当的相移交流电压驱动螺旋电极可借 助行波双向电泳把细胞“扫”到中央，并在那里沉降到颗粒上。
可溶膜管
用可电激励溶解金膜在离心沉降颗粒使之定位化时隔离靶粒子 与发光细胞。可以使颗粒沉降在位于细胞上方的膜上(如图20所示)， 也可以用铺设在另一个室(或许是插入到室度的)的底部的膜使得细 胞离开原来室的底部。不论是哪种情况，当膜在电激励下被溶化后， 利用沉降法(可以是离心法)使颗粒与细胞混合。
声波/超声波
可以用声波或超声波信号使颗粒浓缩。颗粒可以聚集在一个驻波 的节点处，或者被一个行波移动。细胞也可以用这种方法移动，或者 用前述任何一种方法供应。
毒素探测
为了探测单价抗原，有必要利用两种通用方案中的一种来诱导各 表面抗体的交联。第一种方案是，在细胞表面上表达两个独立的结合 点，使得两个受体细胞可结合于一个配位体。第二种方案是，如果配 位体以多价的形式表达于细胞，则可在细胞表面上表达一个结合点。 下面是利用抗体/抗原识别模型的一些具体例子。
首先，可以在单个细胞系的表面上表达两种抗体，每种特异于同 一分子的不同表位(表位1和2)。单个分子结合于两种抗体(分别 针对表位1和2)将造成交联和发光。较具体地说，单个B细胞系被 加工成表达两种独立的抗体，它们分别识别单个分子上的一个不同的 表位。现在单体(monomeric)抗原的出现将能使两个表面抗体交联， 造成细胞内Ca2+的增加和水母分子的发光。近来我们找到一种表达 了能同时抵抗鼠疫杆菌和土拉热弗朗西丝氏菌的功能性抗体(加上表 达于基因内的PC抗体)的细胞系。这个细胞系能独立地识别这两种 细菌的每一种，表明这两种抗体都是功能性的，证明浓度增大的胞浆 发光分子的细胞便能实现细胞传感器。
另一个潜在的问题是对于不能通过离心力被沉淀的抗原此光电 装置和方法的敏感性如何。鼠疫杆菌F1抗原作为低分子量聚合物存 在于溶液中，因此在我们的分析中是不能被沉降的。不过，表达抗 F1抗体的B细胞能够探测到5ng/ml的可溶性F1抗原。这与当前的 免疫分析方法相当，因此证明此光电装置对于可溶性制剂而言是相当 敏感的。使用缀合了卵清蛋白的磷酸胆碱(phosphorylcholine)抗原 进行了补充实验。这种小抗原能够刺激抗体在细胞表面交联的能力提 示这种含有多个拷贝的PC表位的小分子量抗原能够有效交联表面抗 体并引起钙内流及光子发射。
第二种策略借助于离心方式能够改善上述对单价抗原的探测范 围。在这种方法所使用的方案中，毒素抗体之一表达于“良性”细菌 的表面，而第二抗体表达于B细胞表面。在此可通过离心将毒素沉 降，然后加入表达第二抗体的B细胞。由于细菌表面固定了多个抗 原，因此对于B细胞来说毒素大体上表现为多价，因此将引发交联 事件和光子发射。更特别地，抗单体抗原(如毒素)的表位1的抗体 表达于细菌表面。可溶性毒素结合于这些抗体，将细菌以毒素抗原包 被。这些由毒素包被的细菌在加入表达抗表位2的抗体的B细胞之 前通过离心被沉降。B细胞抗体的交联导致水母发光蛋白的光子发 射。这一策略的实验结果证实了对细菌表面抗原进行探测的可行性， 并且在加入B细胞之前先将细菌沉降可以增加探测的敏感性。相似 的方法可用于任何难以沉降的制剂以提高其对于B细胞的呈递。
多重分析
下面将描述B细胞混合物是如何能够用于在不增加探测通道(管 等)的情况下而提高可探测到的抗原的数量。探测多重待测物的最简 单的方法是在每个探测通道使用单一的B细胞系并通过增加探测通 道的数量而增加细胞分析的数量。这对于小数量的分析是可以接受 的，不过，随着所加入的待测物数量的增加，方法会变得越来越复杂。 但是，如果将多个B细胞系混合在一起，则有可能仅仅在一个5通 道系统上使用同时的阴性对照来进行多达31种测定。
试举一例，如果仅有一个单一的通道，则最多能进行一种B细 胞的探测分析。然而，如果由两个通道，则可进行3种不同的探测分 析，其中每个通道含有一等量的3种不同的B细胞系中的2种：
如，有3种B细胞系：A、B、C
并将它们混合放入两个通道，由此
通道1：A、B 通道2：B、C
然后可能会有3种阳性读数：
通道1 通道2
是 否 提示仅存在A
否 是 提示仅存在C
是 否 提示仅存在B
(或者可能存在多于一种
的制剂，但我们在此认为
不太可能)
相似地，如果有3个通道，通过将4种细胞系混合在一起则可以 进行7种独立的探测分析(在此简单地表示为，针对各个制剂的细胞 系以字母A至相应于细胞系数量的字母代表，并记录通道数量以显 示哪些通道对于各个制剂发阳性探测是必需的，记录如下—123：F— 表示通道1、2和3必须均记录阳性才能鉴定制剂F)：
通道1 通道2 通道3
A、B、G、F B、C、E、F C、D、G、F
1：A 12：B 123：F
2：E 13：G
3：D 23：C
如果所有的分析均按相等的比例进行混合，则可通过给定的通道 数而得到独立分析数，简单描述此关系的公式为：
#细胞分析＝2n-1，其中n是通道数，而每个通道中需要混合的细 胞分析数是2(n-1)。因此，将16种不同的B细胞系混合在一起，需 要5个通道以进行31种变体的分析。一个10通道系统的设计实际上 能够用于通过使用同时的阴性对照(5-通道阳性鉴定，5-通道阴性对 照)而鉴定31种不同的制剂。
如下所示为一个4-通道系统(15种不同的分析)的相应的通道 混合物和阳性探测：
通道1 通道2 通道3 通道4
A、B、G、F B、C、H、I F、C、D、I D、E、G、H
I、K、L、M J、L、M、N J、K、M、O J、K、L、M
1：A 23：C 123：I 1234：M
2：N 24：H 234：J
3：O 34：D 134：K
4：E 12：B 124：L
13：F
14：G
可以认为，无需过多的努力，本领域人员可以根据以上的描述及 以下的实施例，将本发明应用至其最大的程度。下面的实施例应被视 为仅仅是举例说明本领域人员如何实施本发明，而无意对说明书的其 他内容进行任何的限制。所有引用的文件，无论是印刷的、电子的、 计算机可读形式的存储介质或其他形式，均以全文并入作为参考，包 括但不限于，摘要、文章、杂志、出版物、教科书、条约、互联网网 址、数据库、专利、以及专利申请。
实施例
图1的示意图示出本发明的通常的细胞成分。细胞(在此为B 细胞)含有一种发光分子(在此为水母发光蛋白)且在其表面具有抗 体。抗体特异于靶颗粒上的抗原，该颗粒例如为生物武器制剂。靶颗 粒与B细胞的抗体的结合导致两个或多个抗体在细胞表面聚集，引 发的信号转导级联导致钙自细胞内的储存处释放至细胞浆内。细胞浆 内钙浓度的升高导致水母发光蛋白释放光子。该光子随即被光电倍增 装置如CCD捕获并记录。因此，使用具有功能性表面抗体并含有可 应答于钙浓度升高的胞浆发光分子的细胞，可实现一种细胞生物探测 器。
这种基于细胞的探测系统提供了对任何靶颗粒上的任何抗原的 快速、灵敏、特异、精确和灵活的探测。在灵活性方面，该系统能被 改良成针对任何颗粒或颗粒群。在一个实施例中，单个发光细胞可包 含多种抗体类型，每个类型都特异于靶颗粒的一些非重叠群。于是该 单个发光细胞可用来同时识别同一类的不同靶颗粒品种。
在第二个例子，一个反应室内可含有两种类型的发光细胞。一类 发光细胞含有一些特异于一种类型的不同种靶颗粒(如细菌)的抗体 并能在应答于与该类中任一种颗粒相接触时发射一个具有第一波长 的光子。第二类发光细胞含有一些仅特异于该类中某特定种颗粒(如 鼠疫杆菌)的抗体，并能在应答于与该种颗粒的结合时发射一个具有 不同于第一波长的第二波长光子。这样的设计通过减小或排除虚假阳 性信号而提供了极高的准确性。仅当第一波长和第二波长的光子都被 探测到时才记录为一个阳性事件。为了进一步减小或排除虚假阳性信 号，必要时还可以把发光分子所具的特异性扩展到多于两种。
图2是本发明通用结构和使用环境的示意图。
图3是本发明一个实施例所采用的分子生物学的示意图。在该例 子中，一个表达了一种发光分子(如水母分子)但不表达抗体的通用 B细胞系被变成用来产生能表达任何特异于任何抗原的抗体的B细 胞的基础。一种抗体表达载体被导入一个选来用于表达该载体并扩展 用于本发明系统的一般B细胞中。用这个方法，结合以p Display和 VK表达(见前面“抗体”一节的说明)，以各种目标产生有目标特 异性的发光细胞。已经制作了特异于口蹄疫病毒(RMDV)、委内瑞 拉马脑髓炎(VEE)病毒、鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏 菌、霍乱弧菌的01和0139菌株和正痘病毒等的发光细胞。在USDA 得到了FMDV抗体可变区的cDNA和序列。NMRC的研究人员得到 了鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、霍乱弧菌01和0139 菌株的抗体可变区的cDNA和序列。分别在CDC和USAMRIID得到 了由杂交克隆产生的VEE和正痘病毒抗体的可变区。口蹄疫病毒 (FMDV)、鼠疫杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、委内瑞拉马脑髓炎病 毒(VEEV)分别是口蹄疫、鼠疫、土拉热病、脑髓炎的起因。通过 联合使用在一些公开的论文中描述引物自杂交瘤进行克隆。特异于 Bacillus globigii的发光细胞正在制造，因为这种非病原性细菌被一些 军事人员用作生物武器物质探测系统现场测试中的测试生物。图5示 出一个说明当几个特异于FMDV的发光分子的克隆与活FMDV靶接 触时产生的光子发射应答的曲线图。在每种情形中，发光分子都在靶 与细胞发生接触后约20—30秒内发出光子。图中也示出了这样的数 据：它们表明，当一个不期望会与发光分子结合的变异FMDV(在病 毒衣壳蛋白中单个氨基酸的变异)与一个发光细胞克隆接触时不会发 光。该阴性对照支持了导入探测系统的高度的特异性。
各种构形的离心管与光电倍增管(PMT)的设定状况可用于本发 明系统。设定中包含一个能使一个摆动装置上的样品微量离心管旋转 的转子(马达)和一个位于固定位置的平衡管。PMT位于底部，在 静止时其向上对着样品管的底部一端。在典型的实验中，对于小于发 光细胞的靶颗粒，含有颗粒的液体样品被置于样品管中，并在足以将 大部分颗粒沉积于管底的条件下进行离心(例如对于土拉热弗朗西丝 氏菌为5600xg，60秒)。然后将发光细胞悬液置于管中的样品上(使 其不会搅动沉积的颗粒)，并短暂离心将细胞沉积以使其与靶颗粒接 触。如果靶颗粒存在于待测颗粒中，细胞将发射特定波长的光子，并 由PMT捕获并记录。
在特定的实施方式中，PMT可以是Research公司的SR400双通 道选通光子计数器系统相接口的Hamamatsu(公司)HC125—08光 电倍增量。离心机可以是一个带有一个摆动管构形的蓝宝石17转， 18.5AWG，5安培马达。
离心管(反应室)可按需要予以改造和升级，以帮助待测颗粒与 发光细胞的接触。在图20所示的一个实施例中，离心管包含一个位 于管底处的含有预先安装的发光细胞的封闭小室。这个小室由一个可 溶性金阳极膜与管子的其余部分隔离。操作时，含有待测颗粒的样品 被置入管内并借助旋转使待测颗粒浓缩于膜上。然后使膜溶化并短时 间旋转管子，使颗粒与发光细胞接触。这个可溶膜系统已由Langer 及其同事在Angewantde Chimie International Editon 39：2396—2407， 2000以及<自然>397：335—338，1999中描述。
离心处理中的一些步骤可以自动化，或者可设计成根本不需要操 作人停止离心。例如，通过适配于可从Beckman Instruments公司购 得的制备性离心机(如超速离心机)的机构特性，液体和样品的加入 和去除可以在不停止转子旋转的情况下完成。有可能会希望在仍然施 加着向心力的情况下来探测光子发射(例如对于若不作离心转动发光 细胞与靶颗粒的接触就不会稳定的情况)。为了探测从旋转着的样品 管发出的光子，PMT可以安排在相对于转轴的一个径向位置处。在 大多数情形中，这种设定下的PMT不需要随样品管一起旋转，而可 以是静止的并且只简单地记录样品管通过其前方时的光子发射。如果 发射的信号非常弱，则可以把探测器(如PMT或CCD芯片)连结在 转子上与样品管一起旋转。或者可以用设定在转子周围的多个PMT 来探测光子发射。
如果多个样品在同一个转子上转动，则必要时PMT的位置或信 号处理可以改变。在一个实施例中，转子上搭载了4个样品管，每个 样品管都含有发射同样波长光子的细胞。为了区分各个样品的发射， 可以用一个径向对准的PMT连续地探测光子发射。然后利用一个来 自转子的监视每个样品在各时刻的位置的时标曲线来分解连续的发 光数据，确定每个样品的发光情况。可以理解本发明还包括了一些其 他的变化。
例如，图17是转子上承载了2个反应管并且在管子下方有2个 对准着的PMT的示意图。利用转子位置编码器，在停顿位置处转子 使每个管子向下对准于相应的PMT。在另一个例子中，图17所示的 离心系统可与一个空气样品收集器集成在一起，构成图18所示的系 统。径向的气浮物撞击管可以是任何类型的颗粒监视器，如美国专利 No.5,932,795和其中引用的参考资料所描述的监视器。在又一个 实施例中，图18所示的系统可更改得变成只需要一个相对于转子轴 径向对准的PMT，如图19所示。如上所述，被PMT纪录的发射情 况可用轴位编码器分解成每个样品管的发射。
返回图17，其中液体成分包括，但不局限于被加工行能识别特 定生物物质的悬浮B细胞、缓冲溶液、防变质剂、细胞介质等，这 些成分可被放置在几个离心管的任何一个中，并混合以悬浮着在另一 个步骤中预先从气浮物样品中收集到的样品颗粒的液体(其中的颗粒 可以包括，但不局限于，蛋白、肽链、化学剂、病毒、植物型或孢子 型的细菌、真菌孢子、花粉粒子、原生动物、血液或组织细胞及它们 的碎片，这些颗粒可以是单独的，也可以是与例如灰尘等载体粒子相 结合的)。当马达开始旋转时，离心管便被甩出成径向位置，于是B 细胞和/或颗粒将按照颗粒的大小和密度以不同的速率被驱赶到离心 管的底部。细胞和含样品液体的加入和离心的准确顺序可根据它们的 相对沉降速度，以得到最大信号为目的来设计。一般，可以预期能够 通过选使这些样品旋转(预旋转)适当时间然后加入B细胞并使它 们一起旋转到互相接触，来使较B细胞沉降得慢的颗粒能诱导出最 大的光子输出。对于以相似于或快于B细胞的速度沉降的颗粒，对 样品与B细胞混合物的单次旋转将诱导出系统的最大光子输出。可 以利用结合于离心装置的上游主的颗粒尺寸分析器所给出的数据来 自动化确定最优的操作顺序和启动恰当的计算机控制自动样品处理。
当“旋转周期”结束并且在旋转马达和轴位编码器的控制之下转 子在一个预定位置上停下来时，摆臂将因重力作用而下垂，使离心管 的底部面对于光电信增管的光敏面，然后记录光信号。在该实施例的 一个修改型中，可以把单个光电倍增管放置在转子/反应管离心机的 最大半径处，以便在各个反应管相继经过光电倍增管的光敏面时收集 来自反应管的光子。可以根据轴位编码系统的监视来区分和叠加来自 每个反应管的光子输出。
返回图18，其中对气浮颗粒的收集处理和使气浮颗粒与B细胞 相接触的处理被集成在一起。离心管被安装在摆臂上，旋转时摆臂将 让离心管能盖住径向撞击管的端部，于是，由于作用在旋转着径向撞 击管内的空气上的离心力，气浮样品将被引导流进离心管的样品入口 (如有必要可辅之以另外的吹气单元)。高速的流动使气浮颗粒撞击 到离心管的内表面上或管内所含液体的表面上，分别造成颗粒被捕获 于管子表面或液体中。存在液体时，作用在液体的离心压力将能抵消 为让颗粒被捕获于液体所需的高速空气流所产生的力，并防止颗粒被 撞击空气吹出。在与管子表面或液体撞击后，气浮颗粒将被留住，对 于液体收集的情况，颗粒将被迫沿径向向外流动，结果在最大半径处 (离心管底部)产生增大的局部颗粒浓度。在收集步骤之后加入B 细胞将它们旋转到局部浓缩的颗粒所处的同一区域将造成光子输出。 或者，也可以是在收集步骤进行时已在液体中加入了B细胞，并且 单个光电信增管在旋转时实时监测输出(图19)。这一实施例的一种 修改是，在入口入加入液体组分(包括但不局限于通过其他手段如生 物气浮颗粒收集吕所收的颗粒样品和已加工B细胞的悬浮液)并且 离心力使它们分布到管中。
当“旋转周期”结束并且在旋转马达和轴位编码器的控制之下转 子在一个预定的位置上停下来时，摆臂将因重力作用而下垂，使离心 管的底部面对于光电倍增管的光敏面，然后记录光信号。在该实施例 的一个修改型中，可以把单个光电倍增管放置在转子/反应管离心机 的最大半径处以便在各个反应管相继经过光电倍增管的光敏面时收 集来自反应器的光子。可以根据轴位编码系统的监视来区分和叠加来 自每个反应管的光子输出。
图7是顺序离心结果的代表性示意图。对于小于发光细胞但具有 与发光细胞相同密度的靶颗粒，首先旋转待测颗粒(例如以高速)使 之成团的是有益的。然后加入发光细胞，再在能防止减小所需的细胞 应答特性的可能是较为温和的条件下进行旋转(图中最高一行的顺 序)。此外，这一离心顺序将迫使几乎所有的待测颗粒和发光细胞进 入离心管底部处的一个比较小的体积内。反之，如果先把待测颗粒与 发光细胞混合在一起然后一次性地使它们旋转将会导致颗粒与发光 细胞的分离而不是接触(图中的中间行)。当然，若根本不作旋转， 则将大为减小反应室中颗粒和发光细胞的有效浓度(图中最下一行)。
图8示出一个用实际实验证明图7的顺序结果的曲线图。在图7 所示的三种方法中，都使用了对土拉热弗朗西丝氏菌具有有特异性的 发光细胞与已死亡土拉热弗朗西丝氏菌的混合。在曲线图中可以看 出，顺序旋转方法造成接触之后的快速而高效的发光。反之，单次旋 转方法的发光曲线在时间上和幅度上都要差得多。无旋转方法则难得 产生几次发光反应。
在另一个实验中得到了类似的发光曲线，如图8所示。对这些发 光曲线的审视似乎表明，单次旋转方法中的目标特异性发光经两次旋 转方法的稍快一些。然而，已发现这一结果主要是因为两次放置方法 需要较长的旋转时间造成的，因此并不能反映B细胞的应答时间实 际上有所改善。事实上，两次旋转方法的初始斜率明显大于单次旋转 方法，说明两次旋转方法导致了健全的发光应答。
图8所示探测系统的灵敏度可以用滴定方法计数进入离心管的 兔热菌的数目来评估。图10的曲线图总结了评估结果。可以看出， 25000个发光细胞能在应答于约5300个土拉热病靶颗粒时发出超过 背景的可探测光子。可以期望，对的反应条件的进一步优化将提供灵 敏度。
在经过一次冷冻，解冻循环后细胞应答将可改善(见图22)。在 该实验中，对特异于鼠疫杆菌(YP)的细胞进行离心、再次悬浮于 冷冻剂(含有10％ DMSO的RPMI再加10％ FBS)、在—80℃下冷 冻，然后转移到液氮中。在37℃下解冻细胞，把1ml(2×166个)细 胞稀释在4ml的RPMI中，并在37℃下培育过夜。第二天对细胞加 载腔肠素等待2小时，然后洗入独立地CO2的介质(CO2—I)，恢复 24个小时。用5×105个YP(50ml深度的107/ml的YP)作用于10000 个细胞。未经处理的细胞表现为9500个光子每秒的应答，而经冷冻/ 解冻处理的细胞在应答于YP时发出的6倍的光子。仅使细胞暴露于 冷冻剂而不进行冻结也可发出5倍的光子，这一刺激作用可被大量复 制。发现冷冻剂中的刺激因子是DMSO。当细胞用2％的DMSO处 理时(指DMSO的最终浓度，即让1ml位于含10％DMSO的冷冻剂 的细胞稀释到4ml的普通冷冻剂中)，可以探测到类似的刺激水平。 DMSO的作用可能源自许多因素。已知DMSO可实现造血细胞分化， 可能通过这个途径刺激细胞。此外，冷冻在含甘油介质中的细胞也显 示出类似的刺激水平。于是看来该作用还部分地由于DMSO所诱导 的应激应答，有可能可以利用任何一些能刺激“热休克”应答的条件 来复制这一刺激。
细胞可以在充有腔肠素的冷冻状态下存储。细胞先加载以腔肠 素，恢复24小时，然后冷冻。解冻后用10ml的CO2—I介质洗涤， 使细胞以每毫升5×105个的浓度重新悬浮于CO2—I介质中。这些细 胞可探测YP(在解冻后约1小时，但较少的时间也是可能的)。如果 在室温(RT)下存储，这些细胞仍能探测YP。在加载腔肠素和冻冷 之前用DMSO对细胞进行预先处理，可以提高解冻后细胞对被测物 的灵敏度。
图22所示的是经过各种细胞处理后细胞对于稀释于CO2—I中的 50μl的浓度为10,000,000个YP每毫升的YP的应答情况。未经处理： 细胞在RPMI中培养，加载以腔肠素，洗涤，恢复24小时，然后加 入YP。冷冻/解冻：细胞在RPMI中培养，移至冷冻剂，然后冷冻。 解冻的细胞(1ml)置入4ml折RPMI，在37℃下培育24小时，加载腔 肠素，洗涤，恢复24小时，然后加入YP。2％DMSO：细胞在RPMI 中培养，移至含有2％DMSO的RPMI中，在37℃下培育24小时， 加载腔肠素，洗涤，恢复24小时，然后加入YP。
成功的生物武器探测系统应能抵抗战场上一般环境物质的污染。 为了评估发光细胞能否在环境不良或污染条件下工作，在使发光细胞 暴露于强柴油排气环境中1个小时或者发光细胞被107的大肠杆菌 (作为任何现场细菌的代表)，污染之后，再让发光细胞与靶颗粒混 合。其结果如图11中两条曲线所示，左侧曲线对应前一情况，右侧 曲线代表后一情况。如该图所示，上述特定的化学和生物污染测试并 不影响发光分子在应答于靶颗粒时的光子发射能力。
图13至14说明本发明的一个不同的实施例，其中不需要离心。 图13的原理图给出了该实施例的各个组合。生物气浮体告警传感器 (BAWS)探测例如具有预定尺寸范围的颗粒是否出现。Primmerman 在林肯实验室学报12：3—32，2000上的文章描述了BAWS的一个 例子。如果要探测某些符合一定规范的颗粒，BAWS将触发一个空气 一空气收集器(样品收集器，如美国专利N.5,932,795中所描述的)， 使得具有特定尺寸范围的颗粒在一个第一站处被收集并沉积在一个 孔(反应室)中，这个孔位于一个样品带条的某一部分上，对此图 14示出了不同方向的视图。当待测颗粒沉积到孔中之后，带条将前 进到一个位于发光细胞容器下方、PMT上方的第二站处。此时对靶 颗粒上的特定抗原具有有特异性的发光分子沉积在孔内，从孔中发出 的光子可被很好地监测。
在待测颗粒被BAWS探测的过程中，随着带条移经第一站，各 个待测颗粒可沉积在一些相继的孔中。在第二站处；多个分别含有不 同目标特异性发光分子的发光分子容器被安装在一个转盘上，该转盘 可使某个特定的容器旋转到指定位置上，以便让不同的发光细胞沉积 到孔中。这样便可以探测待测颗粒中的不同目标。如图14中关于孔 的顶视原理图所示。当然，如果不同的发光细胞能发射不同波长的光 子，则只要位于第二站下方的PMT能区分不同的波长，便有可能将 不同的发光细胞沉积到同一个含有待测颗粒的孔内。
图16示出本发明系统又一个实施例的示意图。在该实施例中， 在第一站处空气颗粒被沉积在一个二维孔阵列的一个含有6个孔的 行中的每个孔中(例如一个要上有6个列和几百个行)。这样，每当 孔阵列前进一行，使这个行位在第二站处，向该行内的每个孔沉积入 不同的发光细胞，便可由设置在第二站下方的一行PMT同时探测出 全部6个反应的光发射。为了帮助颗粒粘着在带条的孔中，可以在孔 中涂以粘胶或液体。
细胞工程和试验方法实施例
A.细胞加工方法：
M12g3R细胞在37℃下保持在含有5％CO2的RPMI1640潮湿环 境中，RPMI中还添加了10％的胎牛血清、1mM的丙酮酸钠、2mM 的L—glutamine、100μM的非必需氨基酸、50μM的2—巯基乙醇、 每毫升50μg的链霉素、每毫升50U青霉素、和250ng/ml的两性霉 素B(Life Technologies公司)。细胞通过电穿孔(270V，950μF)被转染 以PCMV.AEQ.IRES.NEO并在1mg/ml的G418中选择2个星期。筛 选出能应答于抗—IgM的G418抵抗克隆。这些在交联于表面IgM时 能取得光子发射最大增强的克隆被用于后续的转染以产生特异性于 特定病菌的B细胞系。通过(借助于电穿孔)与轻、重链以及一种 对向嘌呤霉素传递抵抗性的基因编码的链的共同转染，具有加工霉素 传递抵抗性的基因编码的链的共同转染，具有加工获得特异性的抗体 的表面表达即可完成。嘌呤霉素抵抗物和克隆是根据它们对抗原的应 答来选择的。在人类延长因子1α(EF-1α)促催化剂的控制下，轻链 表达载体将在多个克隆点(MCS)的下游包含对于人类Kappa基因 的恒定区。重链载体是通过如下pDisplay(Invitrogen)来产生的：保留 巨细胞病毒(CMV)启动子和引导序列，但用小鼠IgM的结合于膜上 的恒定区的基因来取代从血小板衍生的生长因子(PDGF)受体穿膜 区，现时除去MCS两侧的标记。利用PCR向抗体的可变区加上一些 适当的限制点，并在克隆成表达构建体之前确认所有PCR产物的序 列。用来产生重组抗体的可变区是从以下两条途径克隆的：从cDNA 克隆或者由利用随机寡核苷酸引物和PCR的逆转录(RT)从杂交瘤 克隆。根据制造商的推荐，RNA可用Trizol试剂(Life Technologies 公司)提取，且第一链的合成使用逆转录试剂盒(Ambion)进行。 PCR用设计为与轻链或重链5’端的引导序列[S.T.Jones和 M.M.Bending，
用于发光试验的以pCMV、AEQ、IRES、NEO菌液和能识别 FMDVA12菌株的重组抗体的表达载体稳定地转染的M12g3R B细胞 系用下述方法制备：第一天解冻细胞。解冻后经过24小时再制备细 胞对于获得最大活性和可靠性是至关重要的。冷冻/解冻步骤可使B 细胞的应答提高多达100倍。第二天，在覆盖以薄膜的情况下，在带 有50μM coelenterazion(Molecular Probes公司，Eugene OR)的试验介 质[无需CO2的介质，10％的FBS，50μg/ml的链霉素，50U/ml的 青霉素，250ng/ml的两性霉素B(life Technologies)]中以室温培育 106个细胞2小时，洗涤2次、最后以5×105个细胞每毫升的浓度重 新悬浮于试验介质中。在1.5ml的微量离心管内在室温下整夜旋转细 胞，待15—20小时后进行试验。试验时，用25μl的细胞与抗原(5 μl浓度为1.4×108pfu/ml的wt A12pRMC35系族，10μl浓度为7.5 ×107pfu/ml的A12变体B2PD.3)相混合，并用测光计(Lvemat LB9507，Perkin Elmer公司)测量应答。
C.细菌和大病毒的生物发光试验：
本传感装置和方法也可用于细菌和病毒的快速探测。细胞系被加 工成能应答于土拉热弗朗西丝氏菌——土拉热病的病源。然而，当采 用与FMD和VEE病毒相同的方法进行试验时，信号产生很慢且几乎 无法与背景分开，表明B细胞与抗原之间的相互作用率很低(O预旋 转/O旋转，即不离心)。过去用抗原珠刺激剂所做的实验已证明通过 浓缩抗原和B细胞可以提高灵敏度和速度(未给出数据)，于是重新 设计测光计使其在光电倍增管(PMT)上方设置一个离心机。当待测 物与细胞混合在一起后用离心机进行浓缩(O预旋转/5S旋转)，发现 信号改善且应答变快。当在加入细胞之前预先使较慢沉降的土拉热弗 朗西丝氏菌离心时(60秒预先旋转/5秒旋转)，可观察到最佳的结果。 这一方法保证了在短时间内有大量细胞与抗原发生物理接触，从而大 为改善了灵敏度和速度。在对试验方案进行了额外的优化之后，我们 能在不到三分钟内(其中还包括了预旋转的时间)探测到60cfu(克隆 形成单位)的土拉热弗朗西丝氏菌，但没有看到对非激活鼠疫杆菌(鼠 疫的致病细菌)的反应。这一探测极限已由另两个非激活土拉热弗朗 西丝氏菌来源和一个不同菌素(未给出数据)的肯定。此外，本传感 器装置还具有宽广的灵敏度范围，可探测的浓度范围达7个数量级。
B细胞用上述方法制备。50μl含有上述数量的鼠疫杆菌或土拉 热弗朗西丝氏菌的试验液以6500×g的力离心60秒，然后加入20μ 1的细胞并在离心我计中再旋转5秒。用Hamamatsu HC-125光电倍 增管探测光子，用Stanford Research Systems SR400选通光子计数器 监测信号。
其他实施方式
应该理解，虽然上面结合详细说明描述了本发明，但该发明只是 为了示例性说明本发明，而不是限制本发明的范畴，这个范畴应由所 附权利要求书定义。其他的方面优点和修改都在本发明范畴之内。
相关申请的互相参考
本申请要求美国专利申请流水号No.60/266 977的优先权，该申 请的标题为“光电子探测系统(Optoelectronic Detection System)”， 申请日为2001年2月7日，该申请的全部内容在此并入作为参考。
关于联邦资助研究的说明
本申请受到美国空军合同(合同号No.F19628-00-C-0002)政府 基金的资助，政府享有本发明的某些权益。
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