一种检测样品中靶分子的方法
阅读：433发布：2021-06-10
专利汇可以提供一种检测样品中靶分子的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供快速并灵敏地鉴定医学、工业、和环境样品中的细胞和病毒靶的有效方法。本发明标记靶分子，然后利用大面积成像检测它们。基于本发明的诊断试验可以是快速、超灵敏、定量、多路、且自动化的。该试验可使样品制备减到最少，而且无需核酸扩增或细胞培养。，下面是一种检测样品中靶分子的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测样品中靶分子的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.使所述靶分子与标记粒子接触，其中标记比小于100，和
b.同时检测检测区中的各个靶分子：标记粒子复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物以小于10个复合 物/mm2检测面积的密度随机分散在检测区中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶分子以小于1个复合物 /mm2检测面积的密度随机分散在检测区中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测无需放大超过5X。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测无需放大超过2X。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测无需放大超过1X。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述检测无需放大超过0.2X。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子是蛋白。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子是核酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子的分子量小于 100kD。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶分子的分子量小于 10kD。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶分子的分子量小于 1kD。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测并鉴定靶分 子的一个以上非重叠类目。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子上的所述类目特 异性结合位点是特异性结合天然或重组的抗体或适体的位点。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子上的所述类目特 异性结合位点是特异性结合DNA，RNA，或PNA探针的位点。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子上的所述类目 特异性结合位点是包括单核苷酸多态性的核酸多态性或与包括单核苷 酸多态性的核酸多态性紧邻。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品含有从多细胞生物 获得的液体或组织。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品含有动物的体液或 组织。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品来源于人类。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品来源于非人脊椎动 物。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品是下列的一员、或 来源于：呼吸道，泌尿生殖道，生殖道，中枢神经系统，尿液，血液， 皮肤，血浆，血清，唾液，创伤组织，创伤渗出物，活组织检查物， 粪便，和实体组织的样品。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品来源于植物。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是通过从环境空气 或水，或与环境接触的表面，物体，或生物采集样品而获得的。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品选自、来源于、或 从下列成分获得：在药物，化妆品，血液，或表面或内部用于人或动 物中的其它产品的制造过程中的原料，成品或半成品；食品或饮料制 造过程中的原料，成品或半成品；医疗或体外诊断装置制造过程中的 原料，半成品或成品；化学品；工业表面；仪器；和机械。
25.根据权利要求1所述的方法，其中选择法用于将所述复合物沉 积在所述检测表面上，且其中所述选择法是磁性选择，离心，沉降， 和过滤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法包括使样品接触与 类目结合分子偶联的磁性粒子。
27.根据权利要求25所述的方法，其中利用所述选择法中的一种而 不使用选择部分，使靶分子沉积在所述检测区中。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述靶分子与靶分子特异性 选择部分在液体中接触，该靶分子特异性选择部分的平均密度大于所 述液体的平均密度，且随后利用重力，离心力，或向心力在所述检测 表面上沉积。
29.根据权利要求1所述的方法，其中处理所述样品使其液化和/或 均化。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触发生在液相中。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触发生在液相和固相 之间的界面上。
32.根据权利要求1所述的方法，其中处理所述样品，从而将所述 靶分子之外的物质或物体除去。
33.根据权利要求1所述的方法，其中在所述接触之前，将所述靶 分子固定在所述检测表面上。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子通过与检测区的 基质或底物结合的类目结合分子而特异性结合在检测区中。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子通过与检测区的 基质或底物形成化学键而特异性结合在检测区中。
36.根据权利要求1所述的方法，其中利用选自风干、热固定、和 化学固定法的方法将所述靶固定在所述检测区中。
37.根据权利要求1所述的方法，其中处理所述样品，从而使所述 靶分子上的类目特异性结合位点更容易与所述类目结合分子接触。
38.根据权利要求1所述的方法，其中在所述检测之前，除去所述 复合物中的未结合标记粒子。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子具有光子信号 传递特征，且其中可加入胶态或可溶性物质来吸收由不在所述检测区 中的标记粒子发射的信号。
40.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品细分成用于平行 则试靶的不同非重叠类目的存在的各个等分试样。
41.根据权利要求40所述的方法，其中使每份等分试样与标记粒子 群接触，而所述标记粒子群与类目结合分子的不同非重叠家族偶联。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述样品与特异性结合靶实 体的非重叠类目的类目结合分子不同家族连续接触。
43.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测区选自固体玻璃， 固体塑料，微量滴定平板孔的表面，吸水薄膜，塑料带，毛细管的表 面，微流室的表面和微流通道的表面。
44.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括侧流色谱法。
45.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法自动在一系列样品 上重复。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述样品可自动加样到包括 所述检测工具的仪器上。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述样品可自动沉积在一系 列检测区中，其中所述一系列检测区在物理上关联，并可自动连续加 样到包括所述检测工具的仪器上。
48.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述复合物产生可检测 信号。
49.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法检测由于所述复合 物的照射而发射，散射，反射，或吸收的光。
50.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测荧光。
51.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测化学发光。
52.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述复合物的工具包括 一束或多束激光。
53.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述复合物的工具包括 一个或多个发光二极管。
54.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述复合物的工具包括 白光源。
55.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述复合物的工具包括 一个或多个滤光器，该滤光器适合用波长适于检测所述复合物的光照 射所述样品。
56.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述复合物的工具包括 一个或多个滤光器，该滤光器适合用波长适于检测所述标记粒子的光 照射所述样品。
57.根据权利要求1所述的方法，其中用于检测所述发射、散射、 透射、或吸收光的工具包括滤光器，该滤光器适于检测源于所述标记 粒子的照射的信号。
58.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测不使用照射。
59.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测热辐射。
60.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测吸光度。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述吸光度是指红外区中 的。
62.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测荧光偏振。
63.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测光反射。
64.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测光散射。
65.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测拉曼散射。
66.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子小于20微米。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述标记粒子小于10微米。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述标记粒子小于5微米。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述标记粒子小于1微米。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述标记粒子小于100nm。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述标记粒子小于10nm。
72.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子是胶乳粒子， 二氧化硅粒子，量子点，共振光散射粒子，向上转换型磷光体，或由 金或银组成的粒子。
73.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子由酶促信号传 递部分涂覆。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述标记粒子包括平均密度 为每立方微米粒子体积大于或等于2个酶促信号传递部分的酶促信号 传递部分。
75.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括信号传递 部分，所述信号传递部分是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
76.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子与以前接触 过样品的类目结合分子结合。
77.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括信号传递 部分，所述信号传递部分选自有机荧光团，上调型磷光体，镧系元素， 量子点，以及从非荧光底物产生荧光产物的酶。
78.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括信号传 递部分，所述信号传递部分是用具有荧光信号特征并且选自下组的信 号传递部分染色或偶联的粒子：有机荧光团，上调型磷光体，镧系元 素，量子点，以及从非荧光底物产生荧光产物的酶。
79.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括具有荧光 信号传递特征的信号传递部分。
80.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括具有化学 发光信号传递特征的信号传递部分。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述分子是吖啶_酯。
82.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括具有产色 信号传递特征的信号传递部分。
83.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括具有光散 射信号传递特征的信号传递部分。
84.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号传递部分具有光散 射信号传递特征。
85.根据权利要求1所述的方法，其中使所述样品在类目结合分子 和靶分子上的类目特异性结合位点之间能够形成复合物的条件下与包 括类目结合分子的标记粒子接触。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述类目结合分子包括抗 体。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述类目结合分子包括适 体。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述类目结合分子包括核酸 或肽核酸。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述类目结合分子包括配 体。
90.根据权利要求85所述的方法，其中所述类目结合分子包括分子 量小于100kD的分子。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述类目结合分子包括分子 量小于10kD的分子。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述类目结合分子包括分子 量小于1kD的分子。
93.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子包括不同的群 体，其中每个群体与类目结合分子的不同非重叠家族偶联。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述每个家族特异性结合 靶分子的类目，该靶分子的类目特异性结合类目结合分子的家族，而 该类目结合分子的家族与检测区的一部分稳定结合，其中与检测区结 合的所述每个家族结合不同的位点，其中所述位点可通过所述检测区 别。
95.根据权利要求94所述的方法，其中每个所述标记粒子的群体具 有相同的信号传递种类和信号传递标志。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述每个群体具有不同的信 号传递标志或信号传递种类。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述方法包括适于区别所述 标记粒子的群体的信号标志的滤光器。
98.根据权利要求93所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度大于1。
99.根据权利要求93所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度≥5。
100.根据权利要求93所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度≥10。
101.根据权利要求93所述的方法，其中所述类目结合分子家族 的家族复杂度≥20。
102.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测发生在容器中， 该容器是条形码或用于自动追踪样品的等同标记。
103.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测发生在具有登记标 记的表面上，便于多个像在同一表面上排列。
104.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法可检测检测区的指 定区域中的对照标记或对照细胞。
105.根据权利要求1所述的方法，其中用于检测所述发射，散射， 透射，或吸收光的工具包括滤光器，该滤光器适于检测源于所述复合 物的照射的信号。
106.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电检测器的 使用。
107.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电阵列检测 器的使用。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述光电检测器包括CCD 或CMOS检测器。
109.根据权利要求1所述的方法，其中所述用于检测发射，散射， 或吸收光的工具不包括像增强器。
110.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电倍增管检 则器的使用。
111.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电二极管检 刻器的使用。
112.根据权利要求1所述的方法，其中检测和鉴定所述靶分子的工 具包括光敏胶片。
113.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括直接目测。
114.根据权利要求1所述的方法，其中靶分子的数目是通过分析由 所述检测获得的像而从所述检测推断的。
115.根据权利要求1所述的方法，其中靶分子的类目是使用像分析 软件根据所述检测推断的。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述像分析软件还包括用 于分辨由所述复合物产生的信号与其它信号的功能。
技术领域
本发明涉及医学、工业、或环境样品中显微和亚显微靶的鉴定。
背景技术
检测、计算、和鉴定低水平的分子靶是常规医学、工业、和环境 诊断的基础。例如，对样品进行分析从而检测来自感染剂，癌细胞， 激素、工业沾染物和污染物的分子。
尽管低水平分子的许多不同和有效的方法已经进行了商业化，在 检测中仍然存在缺陷。在2001年的生物恐怖袭击之后，一些缺陷变 得更明显。例如，存在着对在暴露点同时筛选多种类型试剂的快速、 超灵敏、经济和方便用户的试验的需要。由于缺乏可以由非医务工作 者现场进行的快速、灵敏和便于使用的诊断试验，健康护理和工业都 受到了阻碍。
下面的讨论集中在常规的医学诊断上；类似的方法可用于工业和 环境应用。
免疫学方法
免疫学试验，或免疫测定法，在医学诊断中是普遍存在的。基于 抗体与相应靶(称为抗原)之间的相互作用，免疫测定法可检测从小 (如滥用的药物)至大(如HIV蛋白)的许多分子。血清学试验属于 免疫测定法，它不是直接测试抗原，而是测试宿主对先前与抗原接触 的免疫应答一例如，它们可测试宿主对特定细胞和病毒的抗体的存 在。有很多免疫测定系统都可使用，例如从大型自动化中心实验室系 统，到可直接进行的合法妊娠试验。该试验包括多种形式，如凝集测 定法，沉淀素测定法，酶联免疫测定法，直接发荧光测定法，免疫- 组织学试验，补体结合测定法，血清学试验，免疫-电泳测定法，和 快速“带状”试验(例如，侧流和流通试验)。免疫学试验可以非常 简单而且快速。因此，绝大多数理想试验，例如可在医生办公室或由 患者在家进行的那些，是免疫学试验。商业化的快速免疫试验的一个 缺陷是它们不灵敏。
对商业化灵敏免疫测定的需要将逐渐增加。人类基因组和蛋白组 计划的一个主要回报将是诊断疾病状态，如癌症、心血管疾病和神经 疾病的许多新的标记。这些标记可以在临床样品，如血液、尿和实体 组织中以痕量存在。适用于高丰度蛋白标记(如PSA，肌红蛋白和抗 体)的商业化的快速免疫测定试验对于检测绝大部分以低浓度存在的 蛋白可能是不够的。
基因方法
基因方法是用于检测并鉴定细胞和病毒中核酸分子的普通且有效 的工具。近来已经发展了以核酸扩增为基础、超灵敏检测并区别细胞 和病毒的核酸含量的革命性新方法。例如，商业试验可检测少数亚显 微HIV病毒颗粒的核酸(例如，50个粒子/ml)。扩增技术包括聚合酶 链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)， 转录介导的扩增(TMA)，和滚环扩增(RCA)。
基于核酸扩增的试验具有一些缺陷，阻碍了它们在常规临床和商 业诊断中的利用。这些试验一般比微生物培养试验更昂贵；需要更高 的使用者专业技术；涉及费力的样品制备程序；一般需要耗时的施用 步骤；容易受到污染和产生假阳性结果；具有对许多临床样品中存在 的抑制剂敏感的酶促步骤并导致假阴性；并且通常在多路应用中具有 重复性的问题。此外，与微生物培养方法相似，这些方法不太适用于 检测重要类型的非核酸靶(例如毒素、激素、滥用的药物和蛋白)。
生物化学、化学、及物理方法
灵敏检测微生物和亚微生物靶的其它技术包括流式细胞术，质谱， 生物传感器，吸光光谱，荧光偏振，荧光波动光谱，电泳，色谱等。 由于昂贵和需要专业技术，这些方法中的大多数只用于实验室中。
证明可以用于临床诊断实验室的一种方法是流式细胞术。流式细 胞术方法根据它们的物理性质以及它们结合标记探针(例如，染料， 抗体，或核酸)的能力，可用于定量检测特定的细胞类型。单一细胞 或粒子被强迫流过狭窄的通道，每次流过一个，通过激光束。荧光发 射和大小/形状的信息是通过分析光谱和由生物体/粒子引起的光散射 而搜集的。每分钟可分析上千单一的细胞或粒子。例如，流式细胞术 可用于量化AIDS患者中淋巴细胞类的群体大小。可检测并鉴定非-细 胞分子，如蛋白或核酸的多路流式细胞术方法已经由Luminex商业化 (美国专利号第5,981,180)。流式细胞术的缺陷包括昂贵、需要操作 者的技术、不能分析大的样品体积(限制了灵敏度)。
生物传感器技术有希望用于灵敏的分子检测。生物传感器使用物 理方法将生物事件，例如，抗体与抗原的结合，转换成可检测的信号。 其中一种用于分子检测的普及生物传感器使用表面等离子共振 (Mullett，W.M.等，(2000)Methods 22：77-91)。热BioStar’s光学 免疫测定法(Schultze，D.等(2001)Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20：280-3)利用光干涉原理检测抗原与抗体的结合。BARC生物传 感器技术是磁阻检测(硬盘存储)单一磁性微粒标记的分析物 (Edelstein，R.L.等，Biosens Bioelectron 14：805-13，2000)。 关注点(point-of-care)和现场(on-site)方法
关注点试验使得从业者和消费者能够在专门的中心实验室外进行 诊断试验。关注点诊断是体外诊断中增长最迅速的部分之一。典型的 关注点试验位点包括医院中的患者床旁；物理学实验室；护理室；公 共和私人健康诊所；大学健康中心；相关设施；急救车；工作地点和 家里。近年来已经引入了许多关注点试验，其中一些已经取得了显著 成功。商业化的关注点试验分为几类，分别检测：(1)代谢物(如葡 萄糖和尿素)、无机分子、药物和血气；(2)大分子和激素；以及(3) 致病剂(如细菌、病毒、寄生虫)。
尽管对浓度相对高的分析物(如血糖)已经非常成功，开发中的 关注点试验对低丰度靶分子还有一些问题。该困难很大程度取决于两 种相互对立的产品要求的结合：(1)需要精密的技术以满足费力的试 验规格，包括超灵敏度，和(2)需要没有技术的操作者能够操作的 低成本、方便用户和便携的试验。
一些商业化或正在开发的超灵敏关注点试验是用于较不灵敏的商 业化试验的形式改进。例如Response Biomedical公司具有商业化的 10分钟条带试验(或侧流)，该试验基于其RAMP平台，使用荧光染色 的微珠标记(Brooks，D.E.，et al.(1999).Clin Chem 45：1676- 1678.)。相似地，Biosite′s快速条带试验检测滥用的药物、心脏标 记和感染剂(Landry，M.L.，et al.(2001).JClin Microbiol 39： 1855-8.)。
很难开发基于核酸扩增的关注点试验，这是由于其复杂性和昂贵。 一种系统是Cepheid′s Smart Cycler系统。Mayo Clinic和Roche合 作开发了用于炭疽芽孢杆菌的另一种核酸扩增试验(Light Cycler； Makino，S.I.，et al.(2001)Lett Appl Microbiol 33：237-40.)。 这些系统携带了PCR固有的优点和缺点。扩增方法可以带来极大的分 析灵敏度并且可以适当快速进行，例如，Smart Cycler可以在1小时 得到结果(Belanger，S.D.，et al.(2002).Journal of Clinical Microbiology 40：1436-40)。分析物限于含有核酸的那些(例如排 除蛋白毒素和小分子试验)；样品抑制可以导致假阴性；高度多路试 验导致问题；试验需要经过训练的人，并且试验是昂贵的。
基于生物传感器的技术也是有希望的，因为它们可以结合优越的 技术规格以及低成本和方便用户。例如，可以检侧流感病毒等病原体 的Thermo Biostar′s OIA技术依赖于生物传感器，该传感器具有光 活化表面，该表面在结合病毒时由于光干涉的改变而改变颜色 (Rodriguez，W.J.，et al.(2002).Pediatr Infect Dis J 21： 193-6.)。
一些正在出现的技术致力于改进的多路技术。例如Biosite正在 开发一种高度平行的毛细管微流免疫测定系统。Somalogic的技术使 用适体阵列分析成百甚至上千个分析物(Brody，E.N.，et al.(1999). Mol Diagn 4：381-8)。Nanogen′s NanoChip(Ewalt，K.L.，et aL (2001).Anal Biochem 289：162-72.)电子阵列也用于检测生物恐 怖行动的试剂。尽管筛选成百分析物的试验对药物发现具有明确的价 值，还不明确该水平的多路技术是否对关注点试验重要。
用于改进关注点试验的灵敏度的各种新的标记/检测策略也定位于 生物战试剂的试验。Orasure的新的定量滥用的药物试验使用UPT(向 上转换型磷光技术)粒子(Niedbala，R.S.，et al.(2001).Anal Biochem 293：22-30.)。海军的BARC技术使用磁例子和检测器敏感 性分析样品中的特定分析物(Edelstein，R.L.，et al.(2000). Biosens Bioelectron 14：805-13.)。其它新的标记方法包括量子 点纳米晶体(Quantum Dot；Wang，C.，et al.(2001).Science 291： 2390-2.)和共振光散射粒子(Genicon；Yguerabide，J.，et al.(2001). J Cell Biochem Suppl Suppl：71-81.)，它们也可以潜在改进关注 点试验的灵敏度。
分子诊断的未满足的需要
对通过第一反应者在暴露点和通过空气和水供应的常规自动化扫 描进行的有效生物战试剂检测还具有关键的未满足的需要。类似地， 由于缺乏敏感的现场试验，不能在现场检验临床患者的性传播疾病病 原体，并且不能快速和灵敏地筛选手术后患者的血液感染。对解决该 缺陷的新技术可能变得更急迫，因为疾病(包括癌症、感染性疾病和 心血管疾病)的新的诊断标记从基因组和蛋白组计划不可避免地出 现。
尽管低水平分子的许多不同和有效的方法已经进行了商业化，在 检测中仍然存在缺陷。在2001年的生物恐怖袭击之后，一些缺陷变 得更明显。例如，存在着对在暴露点同时筛选多种类型试剂的快速、 超灵敏、经济和方便用户的试验的需要。由于缺乏可以由非医务工作 者现场进行的快速、灵敏和便于使用的诊断试验，健康护理和工业都 受到了阻碍。
下面的讨论集中在常规的医学诊断上；类似的方法可用于工业和 环境应用。
免疫学方法
免疫学试验，或免疫测定法，在医学诊断中是普遍存在的。基于 抗体与相应靶(称为抗原)之间的相互作用，免疫测定法可检测从小 (如滥用的药物)至大(如HIV蛋白)的许多分子。血清学试验属于 免疫测定法，它不是直接测试抗原，而是测试宿主对先前与抗原接触 的免疫应答一例如，它们可测试宿主对特定细胞和病毒的抗体的存 在。有很多免疫测定系统都可使用，例如从大型自动化中心实验室系 统，到可直接进行的合法妊娠试验。该试验包括多种形式，如凝集测 定法，沉淀素测定法，酶联免疫测定法，直接发荧光测定法，免疫- 组织学试验，补体结合测定法，血清学试验，免疫-电泳测定法，和 快速“带状”试验(例如，侧流和流通试验)。免疫学试验可以非常 简单而且快速。因此，绝大多数理想试验，例如可在医生办公室或由 患者在家进行的那些，是免疫学试验。商业化的快速免疫试验的一个 缺陷是它们不灵敏。
对商业化灵敏免疫测定的需要将逐渐增加。人类基因组和蛋白组 计划的一个主要回报将是诊断疾病状态，如癌症、心血管疾病和神经 疾病的许多新的标记。这些标记可以在临床样品，如血液、尿和实体 组织中以痕量存在。适用于高丰度蛋白标记(如PSA，肌红蛋白和抗 体)的商业化的快速免疫测定试验对于检测绝大部分以低浓度存在的 蛋白可能是不够的。
基因方法
基因方法是用于检测并鉴定细胞和病毒中核酸分子的普通且有效 的工具。近来已经发展了以核酸扩增为基础、超灵敏检测并区别细胞 和病毒的核酸含量的革命性新方法。例如，商业试验可检测少数亚显 微HIV病毒颗粒的核酸(例如，50个粒子/ml)。扩增技术包括聚合酶 链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)， 转录介导的扩增(TMA)，和滚环扩增(RCA)。
基于核酸扩增的试验具有一些缺陷，阻碍了它们在常规临床和商 业诊断中的利用。这些试验一般比微生物培养试验更昂贵；需要更高 的使用者专业技术；涉及费力的样品制备程序；一般需要耗时的施用 步骤；容易受到污染和产生假阳性结果；具有对许多临床样品中存在 的抑制剂敏感的酶促步骤并导致假阴性；并且通常在多路应用中具有 重复性的问题。此外，与微生物培养方法相似，这些方法不太适用于 检测重要类型的非核酸靶(例如毒素、激素、滥用的药物和蛋白)。
生物化学、化学、及物理方法
灵敏检测微生物和亚微生物靶的其它技术包括流式细胞术，质谱， 生物传感器，吸光光谱，荧光偏振，荧光波动光谱，电泳，色谱等。 由于昂贵和需要专业技术，这些方法中的大多数只用于实验室中。
证明可以用于临床诊断实验室的一种方法是流式细胞术。流式细 胞术方法根据它们的物理性质以及它们结合标记探针(例如，染料， 抗体，或核酸)的能力，可用于定量检测特定的细胞类型。单一细胞 或粒子被强迫流过狭窄的通道，每次流过一个，通过激光束。荧光发 射和大小/形状的信息是通过分析光谱和由生物体/粒子引起的光散射 而搜集的。每分钟可分析上千单一的细胞或粒子。例如，流式细胞术 可用于量化AIDS患者中淋巴细胞类的群体大小。可检测并鉴定非-细 胞分子，如蛋白或核酸的多路流式细胞术方法已经由Luminex商业化 (美国专利号第5,981,180)。流式细胞术的缺陷包括昂贵、需要操作 者的技术、不能分析大的样品体积(限制了灵敏度)。
生物传感器技术有希望用于灵敏的分子检测。生物传感器使用物 理方法将生物事件，例如，抗体与抗原的结合，转换成可检测的信号。 其中一种用于分子检测的普及生物传感器使用表面等离子共振 (Mullett，W.M.等，(2000)Methods 22：77-91)。热BioStar’s光学 免疫测定法(Schultze，D.等(2001)Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20：280-3)利用光干涉原理检测抗原与抗体的结合。BARC生物传 感器技术是磁阻检测(硬盘存储)单一磁性微粒标记的分析物 (Edelstein，R.L.等，Biosens Bioelectron 14：805-13，2000)。 关注点(point-of-care)和现场(on-site)方法
关注点试验使得从业者和消费者能够在专门的中心实验室外进行 诊断试验。关注点诊断是体外诊断中增长最迅速的部分之一。典型的 关注点试验位点包括医院中的患者床旁；物理学实验室；护理室；公 共和私人健康诊所；大学健康中心；相关设施；急救车；工作地点和 家里。近年来已经引入了许多关注点试验，其中一些已经取得了显著 成功。商业化的关注点试验分为几类，分别检测：(1)代谢物(如葡 萄糖和尿素)、无机分子、药物和血气；(2)大分子和激素；以及(3) 致病剂(如细菌、病毒、寄生虫)。
尽管对浓度相对高的分析物(如血糖)已经非常成功，开发中的 关注点试验对低丰度靶分子还有一些问题。该困难很大程度取决于两 种相互对立的产品要求的结合：(1)需要精密的技术以满足费力的试 验规格，包括超灵敏度，和(2)需要没有技术的操作者能够操作的 低成本、方便用户和便携的试验。
一些商业化或正在开发的超灵敏关注点试验是用于较不灵敏的商 业化试验的形式改进。例如Response Biomedical公司具有商业化的 10分钟条带试验(或侧流)，该试验基于其RAMP平台，使用荧光染色 的微珠标记(Brooks，D.E.，et al.(1999).Clin Chem 45：1676- 1678.)。相似地，Biosite′s快速条带试验检测滥用的药物、心脏标 记和感染剂(Landry，M.L.，et al.(2001).JClin Microbiol 39： 1855-8.)。
很难开发基于核酸扩增的关注点试验，这是由于其复杂性和昂贵。 一种系统是Cepheid′s Smart Cycler系统。Mayo Clinic和Roche合 作开发了用于炭疽芽孢杆菌的另一种核酸扩增试验(Light Cycler； Makino，S.I.，et al.(2001)Lett Appl Microbiol 33：237-40.)。 这些系统携带了PCR固有的优点和缺点。扩增方法可以带来极大的分 析灵敏度并且可以适当快速进行，例如，Smart Cycler可以在1小时 得到结果(Belanger，S.D.，et al.(2002).Journal of Clinical Microbiology 40：1436-40)。分析物限于含有核酸的那些(例如排 除蛋白毒素和小分子试验)；样品抑制可以导致假阴性；高度多路试 验导致问题；试验需要经过训练的人，并且试验是昂贵的。
基于生物传感器的技术也是有希望的，因为它们可以结合优越的 技术规格以及低成本和方便用户。例如，可以检侧流感病毒等病原体 的Thermo Biostar′s OIA技术依赖于生物传感器，该传感器具有光 活化表面，该表面在结合病毒时由于光干涉的改变而改变颜色 (Rodriguez，W.J.，et al.(2002).Pediatr Infect Dis J 21： 193-6.)。
一些正在出现的技术致力于改进的多路技术。例如Biosite正在 开发一种高度平行的毛细管微流免疫测定系统。Somalogic的技术使 用适体阵列分析成百甚至上千个分析物(Brody，E.N.，et al.(1999). Mol Diagn 4：381-8)。Nanogen′s NanoChip(Ewalt，K.L.，et aL (2001).Anal Biochem 289：162-72.)电子阵列也用于检测生物恐 怖行动的试剂。尽管筛选成百分析物的试验对药物发现具有明确的价 值，还不明确该水平的多路技术是否对关注点试验重要。
用于改进关注点试验的灵敏度的各种新的标记/检测策略也定位于 生物战试剂的试验。Orasure的新的定量滥用的药物试验使用UPT(向 上转换型磷光技术)粒子(Niedbala，R.S.，et al.(2001).Anal Biochem 293：22-30.)。海军的BARC技术使用磁例子和检测器敏感 性分析样品中的特定分析物(Edelstein，R.L.，et al.(2000). Biosens Bioelectron 14：805-13.)。其它新的标记方法包括量子 点纳米晶体(Quantum Dot；Wang，C.，et al.(2001).Science 291： 2390-2.)和共振光散射粒子(Genicon；Yguerabide，J.，et al.(2001). J Cell Biochem Suppl Suppl：71-81.)，它们也可以潜在改进关注 点试验的灵敏度。
分子诊断的未满足的需要
对通过第一反应者在暴露点和通过空气和水供应的常规自动化扫 描进行的有效生物战试剂检测还具有关键的未满足的需要。类似地， 由于缺乏敏感的现场试验，不能在现场检验临床患者的性传播疾病病 原体，并且不能快速和灵敏地筛选手术后患者的血液感染。对解决该 缺陷的新技术可能变得更急迫，因为疾病(包括癌症、感染性疾病和 心血管疾病)的新的诊断标记从基因组和蛋白组计划不可避免地出 现。
发明内容
本发明提供快速并灵敏地鉴定医学、工业、和环境样品中的细胞 和病毒靶的有效方法。本发明标记靶分子，然后利用大面积成像检测 它们。基于本发明的诊断试验可以是快速、超灵敏、定量、多路、且 自动化的。该试验可使样品制备减到最少，而且无需核酸扩增或细胞 培养。本试验可检测多种感染剂(如细菌、病毒、真菌和寄生虫)和 分子(如蛋白、DNA、RNA、激素和药物)。基于本发明的试验可提供 核酸扩增试验的高水平灵敏度，用户容易掌握使用，而且可提供免疫 测定法的速度，以及由微生物试验提供的低成本及量化。本发明通过 进行快速、超灵敏和便携的试验，解决了关注点和现场诊断中重要的 未满足的需要。本发明实现现有诊断技术的最佳特征，同时解决了诊 断系统中的缺陷。
本发明能够快速并低成本检测低水平靶分子的能力源于联合使用 高强度标记，促进快速反应动力学的形式，和大面积成像的优点，该 大面积成像使用由现有商业元件制造的仪器，或根本不用仪器。表1 列出本发明某些优点。
表1
本发明的选择的优点 ·快速出结果(＜15分钟) ·超灵敏 ·易于使用 ·节省成本 ·同时分析多个靶 ·扫描蛋白、核酸、病毒、细菌和寄生虫 ·分析大体积或小体积 ·自动定量分析 ·便携(一些实施方案) ·将样品制备减到最少
本发明通过标记低水平的靶分子，产生高强度信号而检测它们。 这些复合物具有两种功能，即对特异性靶的亲和性和信号产生。这些 功能是通过复合物上的两部分实现的：特异性结合靶分子的类目结合 分子和用于检测粒子的信号传递部分。产生具有特征性标志(如发射 光的特定波长)的高强度信号的标记使得能够快速和超灵敏检测并且 允许有效区分来自伪迹的真阳性(例如荧光灰尘粒子)。可使用各种 产生信号的复合物，包括荧光染色的，光-散射，量子点，磷光体， 和酶-涂覆的粒子。这些粒子可产生各类型的信号，包括荧光，化学 发光，和比色。同样，可使用各种分子获得产生信号的标记，包括抗 体，核酸，配体，和适体的特异性结合。
由于本发明检测分子，靶的范围是很宽的，包括可溶性分子和作 为更大靶，如病毒、细菌或动物或植物细胞的一部分的分子。通过使 用各种类型的靶特异性分子，包括抗体、核酸、适体和配体的能力， 本发明解决的诊断问题的范围得到了扩展。
当检测某些临床，环境，和制造样品时，需要检测较大体积中的少数靶和病 毒。本发明检测大量样品中低水平靶的能力部分取决于其在不放大的情况下，检 测单一细胞和病毒的能力。在一种实施方案中，所述检测无需放大超过5X。在 优选实施方案中，所述检测无需放大超过2X。在更优选的实施方案中，所述检 测无需放大超过1X。在进一步优选的实施方案中，所述检测无需放大超过0.2X。 不放大的检测可检测大面积中少数粒子的单一像。大面积成像对于本发明有效分 析较大样品体积的能力至关重要。使用高倍显微镜或微流检测较大体积中的 标记粒子时，需要浓缩步骤或对上千个像进行分析。使用微束扫描少 数粒子的方法非常浪费时间，且大面积使用时较为昂贵。
计算单一显微标记可增加基于本发明的试验结果的稳定性。与很 多用于分析细胞和病毒靶的大面积成像方法形成对照，本发明通常直 接将单一信号与较小的邻接区进行比较。与求大面积中总信号和背景 积分的方法相比，这种比较可提高含有少数标记靶的样品的信号背景 比。
检测单一细胞或病毒的其它优点是在不牺牲速度的前提下，通过 适当增加检测形式的大小来增加样品体积，从而增加试验的灵敏度(具 体解释见43页实施例8的结果部分)。
计算大面积像中的单一信号数还可减少产生假阳性结果的机会。 (假阳性结果是不存在实际靶时产生的阳性试验结果)。与检测单一 积分信号的方法，如测量样品中分子(例如，ATP，抗原，或核酸) 总量的方法相比，这种计数方法是有利的。当使用依赖于信号积分的 方法时，引起信号的任何人工制品都可产生假阳性结果。含有482个 正信号的样品，每个都可产生100个荧光单位。积分方法的结果是单 一的数字(48,200个荧光单位)。产生相似荧光单位数的人工制品， 例如，较大的荧光尘粒是不能区别的。相反，本发明可很容易地区分 单一较大的荧光尘粒和482个正信号。
使用本发明构造的试验可检测各种浓度，从非常低的水平到高水 平的靶和病毒。本发明的这种性质，其较大的动态范围，可让用户取 消样品的制备步骤(例如，多次稀释)，而这一步骤常常是具有较小 动态范围的技术所需的。
基于本发明的试验可利用各种有效的形式，包括简单、非-仪器、 且低成本的一次性带状试验，和精密的自动化台式系统，用于连续的 不衰减的环境监测。特别重要的是本发明与使得试验中的反应速度(如 靶分子与靶特异性标记的结合速度)最大化的形式的相容性。例如， 通过本发明的一些实施方案，结合反应在多孔膜中迅速发生。
本发明可使用的各种检测方法包括目测，基于胶片的检测，和电 子检测。检测方法的范围对于提出广泛的诊断问题和试验地点是有利 的。例如，对于便携式系统，使体积和重量最小是优点。本发明中减 少和去除仪器化的实施方案对于便携是特别有用的。
本发明的其它特征和优点可从下列说明书和权利要求书很明显地看出。
靶分子是指可能存在于样品中的细胞或病毒，它的存在是通过本发明 测试的。靶分子可以是不同的分子，或者它们可以与样品中的其它分子、 细胞或物质物理缔合。例如，用于检测真菌病原体白色念珠菌的试验可 以检测生物的基因组特有的三种不同DNA序列。尽管在真菌的基因组中 物理缔合，这三种序列被认为是不同的靶分子。在一种实施方案中，所 述靶分子的分子量小于100kD。在优选实施方案中，所述靶分子的分子 量小于10kD。在更优选的实施方案中，所述靶分子的分子量小于1kD。
靶的类目是指共有一个或多个特征，且为了使用本发明构造试验的 目的，被认为相同的多个靶。例如，对于被设计检测所有HIV病毒的试 验而言，类目只是HIV。这种试验可检测所有HIV病毒，而不区分HIV- 1和HIV-2变体。在这种情况下，靶的类目包括HIV-1和HIV-2。其它 试验的目的可能是区分HIV-1和HIV-2。在这种情况下，每种类型的HIV 被看作是不同的类目。或者，考虑上述靶分子定义中白色念珠菌的三种 DNA探针。如果试验的目的是检测白色念珠菌，对于试验的目的而言， 三种探针被认为是相同的，因为它们具有特异性结合白色念珠菌的共同 特征。因此，这三种靶分子将被认为处于相同的靶分子类目。
靶的非重叠类目是指其并集为空集的靶的类目。也就是说，任一 类目都没有哪个成员是其它任一组的成员。例如，IL-2、凝血酶、PSA 和肌红蛋白是非重叠类目。
检测并鉴定多个类目的试验通常(但并不总是)可检测靶分子的 多个非重叠类目。例如，设计试验来鉴定血液中的HIV，HCV，和HBV 病毒。这种试验可区分靶的三个非重叠类目，即三种类型的病毒的每 一种是一个类目。
试验的类目复杂度是指在试验中检测的靶分子的非重叠类目数。
类目特异性结合位点是指靶分子上的位点，它可在特异性结合条 件下特异性结合类目结合分子，而且可把在试验中鉴定的特定类目成 员与不是该类目成员，但可能也存在于试验样品中的靶区分开来。也 就是说，该位点通常存在于一个类目的所有成员上，而且通常不存在 于非重叠类目的任何成员上。类目特异性结合位点特异性结合类目特 异性结合分子。
例如，考虑HIV病毒被膜蛋白上特异性结合抗体类目结合分子的 表位(抗原位点)。靶分子是病毒被膜蛋白，类目特异性结合位点是 被膜蛋白的表位。
如果试验扫描含有构成分类群的靶类目样品，那么类目特异性结 合位点基本存在与该分类群的所有成员中，但基本不存在于试验样品 中其它分类群的所有成员中。其中一个例子是结合特定单克隆抗体的 HIV膜蛋白上的位点。
可选择性地，试验可扫描包括了由不同分类群成员共有的类目特 异性结合位点的样品。这种类型的类目特异性结合位点的例子包括各 种大分子(例如，DNA)和基因，mRNA，和蛋白，它们可产生抗生素 抗性，毒性，或显示活力。类目特异性结合位点常常是较大分子或复 合物的一部分。例如，在试验中，可将类目特异性基因组序列用作类 目特异性结合位点。这种类目特异性结合位点是更大基因组的一部 分，它可含有：(1)不是类目特异性的部分；(2)是类目特异性结合 位点，但试验不能扫描的部分；和(3)试验可扫描的、不同类目特 异性序列的其它部分。
类目特异性结合位点是指在属于类目成员的靶中以80％，90％，95 ％，或超过99％存在，但在属于相同种类所有其它类目成员的靶中， 以80％，90％，95％，或超过99％缺少的结合位点。值得注意的是， 属于类目成员的靶可能一般或异常缺少类目特异性结合位点。同样， 类目特异性结合位点可一般或异常存在于不属于类目成员的靶中。例 如，认为蛋白位点基本存在于所有大肠埃希氏菌中，而不存在于其它 细菌种类中。如果，在上百万个细菌中少于一个细胞，导致不产生蛋 白的突变，那么标记将不存在于大肠埃希氏菌中。然而，这种蛋白位 点仍然被认为是类目特异性结合位点。可选择性地，利用重组DNA技 术或自然方式(例如，利用病毒转导)可将相同蛋白的基因转移到不 同种类细菌的菌株中。在这种情况下，不属于大肠埃希氏菌类目成员 的细菌菌株将表达什么仍然被认为是大肠埃希氏菌-特异性结合位 点。
类目结合分子是指特异性结合类目特异性结合位点的分子或分子 复合物。类目结合分子的例子是与基因组DNA杂交的核酸探针；已经 被选择或“推断”体外特异性结合蛋白上位点的核酸适体；结合细胞 抗原或血清蛋白的抗体；以及特异性结合激素受体或结合分子，如抗 生物素蛋白的配体，如表皮生长因子或生物素。如果它们结合不同且非重叠的 类目特异性结合位点，那么这两个类目结合分子被认为是不同的。根据它们的 分子组成，类目结合分子可被称作，例如，类目结合寡核苷酸，探针，抗体， 配体等。在一种实施方案中，所述类目结合分子包括分子量小于100kD的 分子。在优选实施方案中，所述类目结合分子包括分子量小于10kD的分子。 在更优选的实施方案中，所述类目结合分子包括分子量小于1kD的分子。
捕获分子是指与表面，薄膜，或不是颗粒的其它基质稳定结合的类目结合分子。
特异性结合靶类目的类目结合分子是指在规定的结合条件下，基本结合可由试 验扫描的类目成员的所有靶，但基本不结合不属于该类目成员，但可能存在于样品 中的其它种类靶的类目结合分子。与不是通过这种类目中的靶结合的数目相比，通 过所扫描类目中的靶结合的类目结合分子数要高2倍，5倍，10倍，或50倍。
结合条件是指在试验中使用的、获得类目结合分子与类目特异性 结合位点的特异性结合的条件。例如，当类目结合分子是类目特异性 DNA探针时，特定试验的结合条件是严格的DNA杂交条件。适宜的严 格DNA杂交条件取决于探针的性质，这是本领域那些技术人员熟知的。 例如，对于长度大于500个碱基的典型DNA探针而言，适宜的结合条 件(在杂交中被称作“清洗条件”)是65℃，0.2X SSC。对于抗体与 抗原的结合而言，典型的结合条件是室温，PBS-TB。
类目结合分子的家族是指一组特异性结合靶特定类目的类目结合 分子。针对丙型肝炎病毒培养的多克隆抗体制品构成类目特异性分子 的家族，这是因为它含有特异性结合靶-HCV相同类目的多个不同抗 体。多克隆抗体通常构成类目结合分子的家族，这是因为它们通常包 括结合靶相同类目的多个不同类目结合分子。值得注意的是，除非使 用亲和纯化，多克隆抗体制品通常还含有不与靶的选定类目结合的抗 体，而且可含有结合其它类目的抗体，这是因为动物的抗体系统是通 过动物的感染史确定的。因此，优选利用亲和法纯化多克隆抗体。
家族中的类目结合分子可能与类目中的某些靶结合，但不与其它 靶结合。例如，HIV-1特异性抗体不与HIV-2交叉反应，HIV-2-特异 性抗体不与HIV-1交叉反应。在不区分HIV-1或HIV-2的条件下，如 果HIV作为试验中的类目被检测，那么可用具有相同信号标志的信号 传递部分标记两种类型抗体的混合物。当在试验中使用该家族的类目 结合分子，即两种抗体制品的混合物时，不论存在HIV-1还是HIV-2， 都可获得相同的信号。(值得注意的是，如果使用抗体捕获本实施例 中检测区位点的HIV靶，那么在该位点使用抗-HIV-1和抗-HIV-2捕 获抗体的混合物)。
类目结合分子家族的其它例子是一组80个类目特异性基因组DNA 序列，它们存在于所有大肠埃希氏菌O157:H7菌株中，但不存在于其 它种类细菌的成员中。该家族的类目结合分子可与适当制备的大肠埃 希氏菌O157:H7细胞杂交，但是不与细胞的其它类目杂交。
类目结合分子的非重叠家族是指这样的类目结合分子家族，其中 每个家族特异性结合一组非重叠类目中的一个，而且仅仅一个类目。 也就是说，一组类目结合分子的非重叠家族对应于一组非重叠类目。 例如，在扫描4 USP有害生物大肠埃希氏菌，沙门氏菌，假单胞菌， 和金黄色葡萄球菌的试验中，有4个非重叠类目。这种试验可掺入4 种不同的非-交叉反应多克隆抗体，每种抗体对其中一个试验类目特 异。因此，该试验包括类目结合分子的4个非重叠家族。试验中的类 目结合分子的非重叠家族被称作类目结合分子的整体(ensemb1e)(见 下面的定义)。
类目结合分子的整体是指类目结合分子的一个或多个非重叠家族 组，对于特定的试验而言，将它们在混合物中混合。扫描靶的多个非 重叠类目的试验包括每个类目的一个类目结合分子家族。包含这些家 族的类目结合分子的整个组被称作整体。例如，可使用5种病毒-特 异性单克隆抗体扫描5种类型上呼吸道病毒(RSV，甲型流感病毒， 乙型流感病毒，副流感和腺病毒)的存在。这5个单克隆抗体构成类 目结合分子的5个非重叠家族。抗体的联合组是类目结合分子的整体。
整体的类目结合分子复杂度是指一个整体中的不同类目结合分子 或部分的数目。例如，如果一个类目结合分子的整体包括234个寡核 苷酸探针，那么该整体的类目结合分子复杂度为234。
整体的家族复杂度是指一个整体中的类目结合分子的非重叠家族 数。家族复杂度与结合整体中每个家族的类目结合分子所需的最小靶 数相等。试验的家族复杂度与试验的分类学复杂度一即，所扫描样品 的不同类目数相对应。概言之，家族复杂度也与试验中使用的不同信 号标志的数目相对应。考虑设计用于检测四种人细胞因子蛋白的靶分 子特异性抗体的整体：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白介 素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。整体的家 族复杂度是4，因为没有小于4的靶分子亚组可以满足结合整体中的 每一抗体。作为另一个例子，考虑由3个探针家族组成的DNA探针整 体。其中一个家族由一组12个大肠埃希氏菌类目结合DNA序列组成， 另外一个家族由一组10个轮状病毒类目结合DNA序列组成，另外一 个家族由一组15个贾第虫类目结合DNA序列组成。该探针整体的家 族复杂度为3，这是因为结合整体中的所有探针时，需要不少于3种 类型靶的基因组(大肠埃希氏菌，轮状病毒，和贾第虫)。
信号元件是指直接产生可检测信号的分子或粒子。术语“直接产 生”是指信号元件是可检测信号的直接来源或决定性调节子。因此， 如果信号是由荧光团产生的光子，那么荧光团是光子的直接来源，并 因此是信号元件。如果信号是由RLS散射的光子，那么RLS粒子是信 号元件。可选择性地，如果信号是从辣根过氧化物酶的产色沉淀产物 发射或散射的光，那么产色产物是信号元件。
信号元件的特征在于这种元件不能被分成若干部分，以致每个部 分产生可与整体(特征，而不必是强度方面)比较的信号。因此，2nM 直径的量子点也是一种信号元件，随着分开，它可改变所得毫微晶体 的特征(发射谱)。用荧光染料，如荧光素浸渗的5μm粒子不是信号 元件，这是因为它可被分成若干部分，以致每个部分具有可与完整粒 子相比较的信号特征。相反，分子荧光素是信号元件。产生信号的酶 (例如，荧光素酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)的可检测产物也 被认为是信号元件。这种信号元件(或它们的前体，当存在前体向信 号元件化学转化时)可以是扩散性物质，不溶性产物，和/或不稳定 的中间体。例如，碱性磷酸酶可将化学发光底物CDP-Star(NEN；目 录号NEL-601)转化成活化产物，它是发射光子的信号元件。
信号传递部分是指含有或产生(在酶情况下)一种或多种信号元 件的分子，粒子，或物质，而且它与类目结合分子偶联。信号传递部 分可与类目结合分子共价或非-共价和直接或间接(例如，经由一个 或多个连接物或“化学键”或通过与同一粒子偶联的两个部分)偶联。 信号传递部分的例子包括羧化量子点；被修饰用于结合核酸探针或抗 体探针的荧光团如Texas Red；涂覆链霉抗生物素的荧光聚苯乙烯粒 子(其可与生物素化的类目特异性结合蛋白偶联)；含有重复核酸序 列的滚环复制产物，其中每个核酸序列都可与用荧光修饰的核苷酸追 踪的若干寡核苷酸杂交，并在5’末端含有类目特异性结合寡核苷酸。 信号传递部分可含有完全不同的元件。例如，在某些情况下，信号传 递部分是与类目结合分子(例如，抗体)偶联的酶(例如，碱性磷酸 酶)。当碱性磷酸酶的底物(例如，分别来源于NEN和Roche的CDP- Star，或BM紫)转化成信号元件产物(例如，发射光子的不稳定中 间体，或可沉淀的产色产物)时，产生信号。对于类目结合分子，酶 信号传递部分，和在不同反应时间所用的底物而言，它是不寻常的。
信号传递部分复合物是指含有一个以上信号传递部分和一个以上 类目结合分子的物质实体。信号传递部分与类目结合分子在信号传递 部分复合物中的缔合必须是稳定的(例如，信号传递部分和类目结合 分子的复合物应在4℃的PBS中具有至少1天的平均半衰期)。信号传 递部分复合物的其中一个例子是涂覆两种类型的上千个分子的聚苯乙 烯微粒：靶特异性抗体和碱性磷酸酶。这种信号传递部分复合物经由 偶联的抗体类目结合分子与靶结合。当与产色碱性磷酸酶底物(信号 元件；例如，BM紫，Roche)培养时，产生肉眼可检测的有色斑点。 可选择性地，相同的信号传递部分复合物，当与化学发光或荧光碱性 磷酸酶底物培养时，可产生化学发光或荧光信号。信号传递部分复合 物的其它例子包括：与荧光素标记抗体偶联的毫微金粒子，与寡核苷 酸类目结合分子及吖啶_(acridinium)酯偶联的胶乳粒子，它可在 加入过氧化氢后化学发光。
粒子是指小于50微米的物体或基质。一群或一批粒子的大小被定 义为粒子样品最长一对正交维数的平均测量值。正交维数最长那对是 指正交维数如下的这样一对粒子：其长度总和是粒子所有这种总和的 最大值。如果2个粒子的样品分别具有1微米×2微米和2微米×3 微米的最长一对正交维数，那么最长那对正交维数的平均测量值是2 微米[(1+2+2+3)/4＝2微米]。粒子样品最长那对正交维数的平均测 量值是，例如，小于50微米，小于20微米，或小于5微米。
很多粒子都具有某些固体的性质。然而，分子骨架或复合物，虽 然不是刚性的，但也可被定义为粒子。例如，dendrimer或其它支链 分子结构也被认为是粒子。同样，脂质体是另外一种类型的粒子。粒 子可用信号元件染色或与信号元件偶联。常常可用术语反映粒子的大 小或几何形状。例如，术语纳米球，纳米粒，或纳米珠用于指代沿着任何 规定轴测量时，小于1微米的粒子。同样，术语微球，微粒或微珠用于指 代沿着任何规定轴测量时，小于1毫米的粒子。粒子的例子包括胶乳粒， 聚丙烯酰胺粒，磁铁矿微粒，铁流(磁性纳米粒)，量子点等。
标记粒子是指可特异性结合靶分子并产生信号的粒子。标记粒子 与信号传递部分和类目结合分子偶联或稳定缔合。本发明中使用的标 记粒子可以是胶乳粒子，二氧化硅粒子，量子点，共振光散射粒子， 向上转换型磷光体，或主要由金或银组成的粒子。
靶分子：标记粒子复合物是指特异性结合一个或多个靶分子的标记粒子。
标记比是指在接触步骤过程中，靶分子与标记粒子的比例。例如， 如果1×107个标记粒子与含有1×106个靶分子的样品接触，那么标记 比为0.1。为了计算标记比，仅仅考虑特异性结合于标记粒子的靶分 子。例如，物理上不可接近(如掩蔽于细胞腔室内)的靶分子不包括 在计算内。
信号元件或信号传递部分的信号特征是指由信号元件信号传递部 分产生的信号情况，可用于区别它与其它信号元件或信号传递部分。 例如，用荧光素和若丹明标记的信号传递部分的信号特征是荧光。无 线电询答器的特征是无线电频率。光子信号传递特征的例子是荧光， 光散射，磷光，反射比，吸光度，化学发光，和生物发光。除后两者 外，所有光子信号传递的特征取决于外部照射(例如，白光源，激光 源，或日光)。相反，化学发光和生物发光是不依赖外部光源的信号 特征。
信号元件或信号传递部分的种类是指信号的不同性质，可用于区 别它与其它信号元件或信号传递部分。例如，用红色染料标记的脂质 体就可与带有不同颜色的脂质体区别开来。红色是它的种类。对于传 播特定无线电频率信号的微型发送器而言，将微型传送器与其它微型 传送器区别开来的无线电频率信号的性质构成信号元件的种类。
信号标志是指试验中，结合靶类目的信号传递部分组合的区别信 号性质。与4种类型抗体结合的靶，即其中一个与荧光素分子偶联， 另外3个与若丹明分子偶联，它们的信号标志由荧光素和若丹明的组 合加权的吸光度和发射谱描述。
试验或标记类目结合分子整体的信号复杂度是指可在试验中或通 过与整体结合而区别标记的靶类目数。可选择性地，如果靶的每个类 目成员都存在，信号复杂度被定义为预期出现的不同信号标志数。对 于某些试验而言，类目结合分子整体的信号复杂度与试验扫描的类目 数相等。扫描多种类目的其它试验所具有的信号复杂度只为1。
选择力是指用于捕获，分离，移动，或汇集靶的力。选择力的例 子包括重力，磁力，电力，离心力，向心力，浮力密度，和压力。通 过将选择力单独作用于靶上可使靶移动。可选择性地，选择力可特定 作用在与选择部分缔合的靶上(见下面的定义)。
应用选择力使靶移动的例子包括靶的离心；与磁性粒子结合的靶 的磁性选择；用金属粒子标记的靶的重力沉降；和利用真空过滤使靶 在多孔膜上沉积。选择力使用的其它例子包括在下面的实施例中。
选择部分是指可与类目结合分子偶联并赋予类目结合分子利用选 择力而被选择性捕获，分离，移动，或汇集能力的原子，分子，粒子， 或其它实体。当类目结合分子：选择性部分的复合物与靶特异性结合 时，通常可利用选择力选择性捕获，分离，移动，或汇集靶。这里所 用的选择性是指和与选择部分无关的实体相比，利用选择力优先赋予 选择部分和相关实体的移动灵敏度。
顺磁粒子和铁蛋白是选择部分的例子。在溶液中渗透的密集二氧 化硅粒子是另外一种类型的选择部分。这种粒子，当涂覆类目结合分 子或与靶结合时，可使靶在水溶液中渗透，从而将结合靶与其它样品 的未结合成分分离。
选择性特征是指用于捕获，选择或移动选择部分的选择部分的情 况。例如，顺磁粒子的选择特征是磁力。迅速渗透在水溶液中的二氧 化硅粒子的选择特征是聚集。
基本处于同一平面上的表面或底物是指可与虚平面平行排列的表 面，这样当测量从表面上任何一个1mm×1mm正方形中的点到虚平面 上最近点的距离时，平均距离的绝对值小于50微米。
检测表面是指靶在上面沉积的、大概处于同一平面上的底物表面。 在利用光子信号传递特征的实施方案中，如果检测表面是光学透明 的，那么检测可经由检测表面的任何一面进行。如果检测表面是不透 明的，那么检测可经由沉积了靶的检测表面进行。
检测面积是指由本发明同时分析的检测表面或检测区的面积。检 测面积的最长线性尺寸通常大于1mm，例如，大于5mm，大于10mm， 或大于15mm。例如，由光学装置同时成像的载玻片的一部分可测量 0.8cm×0.5cm，其中的光学装置包括一个聚光透镜和一个CCD芯片。 检测面积为0.4cm2。
检测区是指靶在其中检测的体积。检测区具有与检测面积相同的 尺寸，深度与信号传递部分在其中检测并鉴定的深度相应。因此，检 测区的深度取决于评价正信号的临界标准。当利用光学检测时，检测 区深度取决于视野的光学深度。
检测面积的最长尺寸是指检测面积周长上两个点之间的最大直线 长度。例如，如果检测面积是0.3cm×0.4cm的长方形，那么检测面 积的最长尺寸是0.5cm的对角线。如果检测面积是一个半-主轴长度 为7mm，半-副轴长度为2.5mm的椭圆形，那么检测面积的最长尺寸是 14mm。
大面积检测或大面积成像是指一种用于检测显微靶的方法，其中 检测面积(由检测装置同时分析的面积)大于靶。大面积检测的检测 面积具有至少1个≥1mm的线性尺寸。相反，显微靶基本较小，通常在 至少2个正交维数中具有小于50μm的测量值。大面积检测的例子包 括用CCD照相机使一个9mm直径的检测面积成像；通过用CCD线扫描 仪扫描而使一个2cm×1m的长方形成像，其中该扫描仪的长尺寸为 1cm；利用在照相胶片上直接曝光而使一个含有微生物靶的4cm×4cm 滤器成像；和在快速侧流带状试验中，目测与1cm×3cm试验区域上 的显微靶相对应的有色斑点。
很多技术都可扫描含有显微靶的样品，但不能利用大面积检测。 例子包括：流式细胞术；固相激光微束扫描细胞术；液相扫描(Tibbe 等，Nat Biotechnol 17：1210-3，1999)；以及利用高倍显微镜，使 载玻片上的多个视野成像并检测。
偶联或稳定缔合是指两个实体之间的缔合，其中在4℃的PBS中， 缔合的平均半衰期最少为1天。例如，被动蛋白吸附聚苯乙烯粒子。 有很多不同种类的吸附蛋白。某些蛋白与表面稳定缔合，具有几个月 的半衰期。其它蛋白，如松散结合在吸附蛋白外层上的那些，可能并 不与粒子稳定缔合，而且可在几小时内浸出。
像增强器或映像管是指放大光子信号传递的装置，见Inoué的专 业词典，Shinya等，Video microscopy：the fundamentals(Plenum Press，New York，1997；p.665)：“一种(通过纤维光学或透镜)与 摄像管连接从而增加灵敏度的装置”。增强器是一个在前端具有光电 阴极的真空管，它可根据聚焦在它上面的像发射电子，它还具有一个 将电子聚焦在后端磷光体上的电子透镜和/或微通道板，以及一个增 加电子能量的高压加速器。可以是单级或多级的。各种像增强器在同 一篇参考文献的第8章中详细描述。
对检测面积一部分中的靶同时检测是指一步检测来源于基本处于 同一平面的检测表面部分的信号。同时检测的例子是用CCD芯片、目 测、或基于光电二极管的信号积分来检测在检测面积中大面积成像的 靶。
静止期的靶是指不移动的靶。例如，固定于载玻片上的靶就处于 静止期。被微量滴定皿孔底上的固定位置中的类目结合分子捕获的靶 也处于静止期。甚至是没被固定在表面上，而且可通过流体动力或其 它力移动的靶也被认为处于静止期，在检测/成像过程中，以大于10 秒的间隔拍摄的连续像基本可检测基本处于同一相对位置的相同靶。 流式细胞术中的靶不处于静止期。然而，由与侧流试验的固相试验区 结合的抗体所捕获的靶处于静止期。
均相测定法或均相免疫测定法是指反应物没有从已完成测定法的 产物中完全除去的测定法或免疫测定法。
鉴定是指确定属于其中成员的靶的类目。例如，扫描靶多个类目 的侧流试验中，每个都可能存在于样品中。属于特定类目的靶在结合 了相应类目特异性抗体的薄膜区被捕获。已知薄膜区含有捕获抗体， 靶可由发生捕获的区鉴定。
样品是指可利用本发明扫描其中是否存在靶的物质。
连接依赖性多态性探针对表示一组寡核苷酸类目结合分子(其中 该组含一个以上寡核苷酸)，当与基因组杂交时，在多态性位点相邻。 探针对中的一个寡核苷酸包含与基因组多态性位点一侧的基因组序列 互补的序列，而另一核苷酸包含与多态性位点另一侧互补的序列。当 相邻地与基因组杂交时，仅仅当靶定的位点处的等位基因或基因型与 多态性探针的寡核苷酸的邻接序列匹配时，一组这样的寡核苷酸可以 彼此有效连接。连接依赖性多态性探针对的结构和用途示于图18和 19。一般地，合成一组相应于特定位点的每个等位基因的多态性探针。 多态性探针可以包括各种功能部分，包括，信号传递部分、选择部分、 化学间隔基或束缚物、标志、扩增位点和半抗原。对于SNP探针的使 用的例子，见实施例14和15。
延伸依赖性多态性探针表示设计用于与一种序列杂交的核酸类目 结合分子，以便探针的3’末端位于与有待通过试验检测的多态性位点 碱基配对的几个核苷酸内。延伸依赖性多态性探针的模板依赖性延伸 被用于差别标记依赖于多态性位点的等位基因的探针。例如，考虑设 计用于紧邻地杂交于在模板链上具有“A”或“C”的多态性位点的寡 核苷酸，以便寡核苷酸的3’末端紧邻多态性位点。在适当条件下，在 DNA聚合酶存在下，用标记了发射绿色的荧光团的TTP和标记了红色 荧光团的dGTP培养杂交体，可以导致依赖于模板链的等位基因的探 针的差别标记。
等位基因特异性杂交探针表示在规定的条件下与不同的核酸等位 基因差别杂交的寡核苷酸类目结合分子。例如，熟悉本领域的人可以 确定12个碱基的核苷酸可以与精确匹配的DNA片段有效杂交，但是 相同寡核苷酸不能与寡核苷酸中12个碱基中的11个匹配的DNA片段 有效杂交的条件。
接目测是指除了佩戴矫正透镜外，在不借助仪器的情况下目测。 例如，直接目测可用于检测某些快速侧流试验中，纳米金粒子的微红 反射信号。
光电检测器是指将光子信号传递转换成电信号的人造装置或仪 器。光电检测器的例子包括CCD检测器，光电倍增管检测器，和光电 二极管检测器，例如，雪崩光电二极管。
照射是指用电磁辐射照射。可使用各种波长的电磁辐射照射。它 包括，例如，用光谱的X-射线，UV，可见，或红外区照射，值得注意 的是，在可见范围中，照射不是必需的。
具有光子信号传递特征的信号元件或信号传递部分是指可通过光 子的发射，反射，散射，折射，吸收，捕获，或重定向，或光子行为 的任何其它调制或组合而检测的信号元件或信号传递部分。具有光子 信号传递特征的信号元件或信号传递部分的一些例子包括：荧光团 Texas Red(荧光信号特征)；CDP-Star(化学发光信号传递特征)； 荧光素酶(生物发光信号特征)；共振光散射粒子(光散射信号特征)； BM紫(光吸收或产色信号传递特征)；和正向-转换的磷光体(两个较 长波长光子的吸收和一个较短波长光子的发射)。
‘数目’ב溶液名称’是指这样一种水溶液，它的溶液浓度为 这个数目的倍数(水除外)。例如，10×EE含有10mM EDTA/100mM EPSS (EE，或1×EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE是1mM EDTA/10mM EPPS溶液。在将它们混合之前，用NaOH将 两个成分的共轭酸调节至pH8.0。
HYB是用于杂交的溶液，含有：1M NaCl，50mM EPSS pH 8.0，2％ 封闭试剂(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母 tRNA(Sigma)。
UBB(通用结合缓冲液)是用于结合各种类型类目结合分子(如抗 体及核酸)的混合物的溶液，含有：250mM NaCl，50mM EPPS pH 8.0， 2％封闭试剂(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml 酵母tNRA(Sigma)。
BB(封闭缓冲液)含有100mM EPPS pH 8.0/150mM NaCl/2％封闭试 剂(Boehringer Mannheim)。
PB是0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.4。
PBS是磷酸盐-缓冲生理盐水溶液，含有：120mM NaCl，2.7mM KCl 和10mM磷酸盐缓冲液(钠盐)pH 7.4。
PBS-B是BSA的0.1％PBS溶液(没有IgG；Sigma目录号A-7638)。
PBS-T是Triton X-100的0.05％PBS溶液(Sigma目录号X-100)
PBS-TB是PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100。
PBT是PBS/0.1％BSA(没有IgG；Sigma目录号A-7638)/0.05％ Tween-20(Sigma目录号X-100)
LB是用于生长细菌并按照先前所述(Ausubel 1987，supra)制备 的Luria肉汤。
SSC是用HCl调节至pH 7.0的150mM NaCl/15mM柠檬酸钠
MES是(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)
MESB是0.05M MES(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)，pH 6.1
EDAC是(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基))碳二亚胺
连接缓冲液是10mM MgCl2/50mM Tris-HCl/10mM二硫苏糖醇/1mM
ATP/25μg/μl牛血清白蛋白。
AP：碱性磷酸酶
BAL：支气管肺泡的灌洗
BSA：牛血清白蛋白
CCD：荷电耦联装置
CFTR：囊性纤维化跨膜电导调节器
cfu：集落形成单位(与活细菌细胞数对应的细菌浓度测量值)
CMV：巨细胞病毒
FITC：异硫氰酸荧光素
HBV：乙型肝炎病毒
HCV：丙型肝炎病毒
HIV：人免疫缺损病毒
pfu：噬斑形成单位(与感染病毒颗粒数对应的病毒浓度测量值)
PNA：肽核酸
RSV：呼吸道合胞病毒
TCID50：烧瓶50％感染的组织培养感染剂量
XhoL是具有序列：5′-GGGCCCCCCCTCGATC-3′的寡核苷酸引物。
XhoR是具有序列：5′-ATCGATACCGTCGACCTC-3′的寡核苷酸引物。
除非另有说明，寡核苷酸序列是按照5’-3’方向表示的。
除非另有说明，说明书中描述的微生物株是从美国典型培养物保 藏中心(ATCC)，Manassas，VA获得的。
附图说明
图1.用CCD阵列对产生信号的各个粒子进行不放大的大面积成像的原 理
采用本发明，用抗IL-2抗体(类目结合分子)涂覆的荧光标记 粒子与血液中的IL-2蛋白分子(靶分子)结合。得到的复合物与微 量滴定皿的孔底部的捕获抗体结合。去除未结合的标记粒子。照射时， 捕获的标记粒子发出荧光，发射撞击在CCD芯片像素上的光子。标记 粒子的数量和位置由自动像分析解释。该图通过不包括光学成分和其 它硬件进行简化。
图2.以微量滴定孔形式检验血样
该图表示如何使用对各个标记粒子的成像来检测靶分子，在此处 是蛋白。
图3.进行大面积成像的CCD成像装置
图中描述的CCD成像器用于收集在实施例中描述的大量数据(见 详述部分的步骤6)。激发光是通过将光从高强度白光源(1000瓦Xenon 弧光灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)引入到液体光导(芯直径5mm，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)中提供的。液 体光导可将光传送给激发滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics， Hawthorne，NY)并将滤过的光束(通常直径为9mm)对准含有标记靶 的检测表面。该仪器可检测各种检测表面(例如，多孔膜，显微镜载 玻片，微量滴定皿，盖玻片，和底部平坦，且光学透明的试管)上的 标记靶。入射光穿透检测表面，诱导信号传递部分中的荧光，该信号 传递部分经由类目结合分子与靶结合，并沉积在光学透明的表面上。 发射荧光的一部分是通过高-收集效率的透镜系统收集的，并通过发 射滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics)传输给CCD照相机(Orca ll，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
图4.进行不放大的大面积成像的CCD成像系统
该图表示具有角形照射结构的CCD成像器，其中光被传到收集透 镜侧面斜角处的检测表面(这里表示为微量滴定平板的孔底)上。选 择适当角度从而优化收集效率，并避免收集透镜对入射光束的阻碍。 这种结构的优点在于源于样品支持物底部表面的反射没有被收集透镜 收集，因此不会造成荧光背景干扰。
图5.使用电、瞬时胶片和无辅助的目测进行不放大的各个显微标记粒 子的检测(实施例1)
该图证明了本发明使用各种检测方法，在不放大的条件下检测大 的检测面积中各个显微标记粒子的能力。采用瞬时胶片、CDC照相机 和无辅助的目测检测碱性磷酸酶涂覆的各个标记粒子。通过肉眼可见 的相同颜色的点适于图像的中心图片，该图像是用数字照相机采集 的。
图6.用于采用不放大的大面积成像检测低数量细菌的超灵敏侧流试验 (实施例2)
该图表示采用不放大的大面积成像进行的超灵敏侧流试验的结 果。示出了来自多个测试条的捕获和对照线的像，测定中加入了不同 数量的大肠埃希氏菌。柱状图说明随着大肠埃希氏菌的数量增加，来 自捕获线的信号也增加。该图证明了检测样品中低数量细菌的能力。
图7.用于采用不放大的大面积成像检测低水平蛋白的超灵敏侧流试验 (实施例3)
该图示出了用于使用侧流形式和不放大的大面积成像的细胞因子 蛋白IL-2的超灵敏试验的结果。在该图中可见来自多个测试条的捕 获和对照线的像，测定中加入了不同浓度的IL-2。柱状图说明随着IL-2 的数量增加，来自捕获线的信号也增加。该图证明了检测样品中低水 平蛋白的能力。
图8.用于采用不放大的大面积成像检测血清中的低水平蛋白的超灵敏 侧流试验(实施例4)
该图表示用于血清中的IL-2的侧流试验的结果。在该图中可见来 自代表性测试条的捕获和对照线的像。最左侧的条表示阴性对照。当 阴性对照与中间(20pg/ml)和右侧(200pg/ml)的条进行比较时，很明 显随着IL-2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。底部的柱状图 表示与加入的IL-2量相关的5次重复试验的平均值的信号。标准误 柱表示重复信号之间的三个标准误。数据表示本发明可以检测浓度为 20pg/ml血清的IL-2，证明该测定检测甚至是复杂样品中极低水平的 靶蛋白。
图9.用于采用不放大的大面积成像多路检测蛋白和细菌的超灵敏侧流 试验(实施例5)
该图表示采用不放大的大面积成像进行的多路侧流试验的结果。该 图表示应用了含有(从左到右)大肠埃希氏菌和IL-2、单独的大肠埃 希氏菌、单独的IL-2、以及即不含IL-2也不含大肠埃希氏菌的样品 的测试条的捕获和对照线的像。该图证明了灵敏侧流试验可以检测同 一测定中的多个靶分子。
图10.利用瞬时胶片检测低水平蛋白的超灵敏化学发光侧流试验(实 施例7)
该图表示使用化学发光标记粒子和瞬时胶片检测的侧流试验的结 果。示出了代表性测试条的捕获和对照线。施用了含IL-2(从左到 右：0，20，200，and 2000pg/ml)的样品的测试条的比较表明随着IL- 2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。这些数据表明，本发明可 以使用瞬时胶片检测浓度低至20pg/ml的IL-2。因此，该试验是超灵 敏、迅速、容易进行并且非常昂贵。
图11.使用捕获线选择靶分子：标记粒子复合物的试验设备的概图(实 施例8)
该图表示用于该实施例中的设备的构建。将样品加载到样品区中， 在此它侧流进入偶联物垫。在装置远端的吸附垫牵拉样品，溶解和固 定检测珠，该样品流经测定线。
图12.使用捕获线形式的蛋白的超灵敏试验
该图表示捕获线试验的结果。该图表示来自施用了含IL-2(0、20 和200pg/ml)的样品的试验的捕获和对照线的像。结果表明该试验可 以检测浓度为20pg/ml的IL-2。此外，捕获线的浓度依赖性斑点状外 观表明，对各个标记粒子进行了成像。
图13.使用不放大的大面积成像和固相捕获免疫测定对蛋白分子进行 的灵敏检测(实施例9)
该图表示使用结合于固相以捕获蛋白的抗体扫描样品中的人蛋白 细胞因子IL-2的试验。用抗IL-2抗体涂覆微量滴定板的孔。向孔中 加入IL-2标准物的稀释液。培养1小时后，洗掉所有未结合的粒子， 向孔中加入抗IL-2涂覆的荧光粒子。洗涤后，在CCD成像仪中进行 不放大的显像。阴性对照(抗腺病毒颗粒组)表明在孔中保留了非常 少的粒子。在IL-2组中，可见随着IL-2标准物的增加，信号增加。 信号是由于抗IL-2涂覆的孔、IL-2和抗IL-2涂覆的颗粒之间的相互 作用。该图表明测定方法的灵敏度(定义为平均阴性对照之上和之下 两个标准差)，其中IL-2浓度与灵敏度相关。
图14.使用不放大的大面积成像和液相捕获对蛋白分子进行的灵敏检 测(实施例10)
该图表示用“双珠”液相夹心方法扫描样品中的人蛋白细胞因子 IL-2的试验的结果。将IL-2标准物的稀释液与抗IL-2涂覆的磁性和 荧光粒子混合。培养2小时后，将磁性粒子和任何结合的粒子与其它 物质分离，转移到微量滴定板，并且在在CCD成像仪中进行不放大的 显像。阴性对照(无IL-2粒子组)表明在孔中保留了非常少的粒子。 在IL-2组中，可见随着IL-2标准物的增加，信号增加。IL-2组表现 出由磁性粒子捕获的成千个抗IL-2涂覆的荧光粒子，这是由于它们 与IL-2的相互作用。该图表明测定方法的灵敏度(定义为平均阴性 对照之上和之下两个标准差)，其中IL-2浓度与灵敏度相关。
图15.使用不放大的大面积成像检测多种人细胞因子的免疫测定(实 施例11)
该图表示用于在微量滴定皿中超灵敏检测多种蛋白的免疫测定策 略。
图16.使用不放大的大面积成像检测总(结合的+游离的)细胞因子 IL-2的竞争性免疫测定(实施例12)
该图表示竞争性免疫测定的概要。用抗IL-2捕获抗体涂覆微量滴 定皿孔，该抗体结合暴露于细胞因子的游离和结合形式的表位。该样 品与IL-2：生物素偶联物混合，该偶联物与样品中的细胞因子竞争结 合捕获抗体。混合物中也包括结合于IL-2：生物素偶联物的链亲和素 涂覆的荧光粒子。荧光粒子结合于孔的程度达到了偶联物与样品中的 细胞因子竞争捕获抗体位点。这样，结合的荧光粒子数反应了样品中 的总细胞因子浓度。孔底部的不放大的大面积成像量化了荧光粒子结 合于捕获抗体的程度。
图17.使用量尺形式和不放大的大面积成像灵敏检测核酸分子(实施 例13)
该图表示使用量尺形式和不放大的大面积成像检测病毒DNA的测 定的结果。将生物素化的病毒DNA的稀释液点样到尼龙膜上。作为阴 性对照，也点样非生物素化的病毒DNA。封闭以阻止非特异性结合后， 将膜条带浸入含有亲和素涂覆的红色荧光珠的溶液。珠溶液通过毛细 作用向膜上迁移，并且在该过程中与滤膜结合的DNA接触。洗涤膜， 然后通过基于CCD的不放大的大面积成像进行分析。图中的像中的亮 点表示从单个膜条带上的多个DNA点获得的荧光信号。每个点中的DNA 的拷贝数表示在每个像的右侧。左边的图表示DNA点如何在量尺上定 位。
图18.使用侧流形式和不放大的大面积成像进行不放大的多路SNP分 析：寡核苷酸连接和加样
该图示出了实施例15中描述的试验的前几个步骤，试验的最后几 个步骤示于图19。成对的等位基因特异性寡核苷酸与基因组DNA杂交。 对中的一个成员是生物素化的(图中具有黄色三角的寡核苷酸)。对 中的另一个成员具有相应于单核苷酸多态性的末端核苷酸，并且具有 独特的多态性特异性寡核苷酸标记物(图中带有明确的碱基-A，T，G， 或C的寡核苷酸)。连接后，将寡核苷酸加样到侧流色谱条带。寡核 苷酸标记物序列杂交于排列在侧流膜上的条带中的标记物互补序列。 仅仅相应于基因组DNA中的多态性的标记物序列与生物素化的寡核苷 酸连接。因此，仅仅相应于基因组DNA样品中的多态性的标记物互补 序列的条带与生物素化的寡核苷酸杂交。
图19.使用侧流形式和不放大的大面积成像进行不放大的多路SNP分 析：检测
该图示出了实施例15中描述的试验的后几个步骤，试验的前几个 步骤示于图18。如图18所示，在侧流层析后，生物素分子将与含有 相应于基因组DNA样品的基因型的标记物的膜上的条带缔合。通过结 合于涂覆了链亲和素(结合于生物素部分)和碱性磷酸酶的粒子检测 该条带的图样。加入产生化学发光产物的碱性磷酸酶的底物后，用CCD 成像仪检测含有生物素化的寡核苷酸的条带。
本发明能够快速并低成本检测低水平靶分子的能力源于联合使用 高强度标记，促进快速反应动力学的形式，和大面积成像的优点，该 大面积成像使用由现有商业元件制造的仪器，或根本不用仪器。表1 列出本发明某些优点。
表1
本发明的选择的优点 ·快速出结果(＜15分钟) ·超灵敏 ·易于使用 ·节省成本 ·同时分析多个靶 ·扫描蛋白、核酸、病毒、细菌和寄生虫 ·分析大体积或小体积 ·自动定量分析 ·便携(一些实施方案) ·将样品制备减到最少
本发明通过标记低水平的靶分子，产生高强度信号而检测它们。 这些复合物具有两种功能，即对特异性靶的亲和性和信号产生。这些 功能是通过复合物上的两部分实现的：特异性结合靶分子的类目结合 分子和用于检测粒子的信号传递部分。产生具有特征性标志(如发射 光的特定波长)的高强度信号的标记使得能够快速和超灵敏检测并且 允许有效区分来自伪迹的真阳性(例如荧光灰尘粒子)。可使用各种 产生信号的复合物，包括荧光染色的，光-散射，量子点，磷光体， 和酶-涂覆的粒子。这些粒子可产生各类型的信号，包括荧光，化学 发光，和比色。同样，可使用各种分子获得产生信号的标记，包括抗 体，核酸，配体，和适体的特异性结合。
由于本发明检测分子，靶的范围是很宽的，包括可溶性分子和作 为更大靶，如病毒、细菌或动物或植物细胞的一部分的分子。通过使 用各种类型的靶特异性分子，包括抗体、核酸、适体和配体的能力， 本发明解决的诊断问题的范围得到了扩展。
当检测某些临床，环境，和制造样品时，需要检测较大体积中的少数靶和病 毒。本发明检测大量样品中低水平靶的能力部分取决于其在不放大的情况下，检 测单一细胞和病毒的能力。在一种实施方案中，所述检测无需放大超过5X。在 优选实施方案中，所述检测无需放大超过2X。在更优选的实施方案中，所述检 测无需放大超过1X。在进一步优选的实施方案中，所述检测无需放大超过0.2X。 不放大的检测可检测大面积中少数粒子的单一像。大面积成像对于本发明有效分 析较大样品体积的能力至关重要。使用高倍显微镜或微流检测较大体积中的 标记粒子时，需要浓缩步骤或对上千个像进行分析。使用微束扫描少 数粒子的方法非常浪费时间，且大面积使用时较为昂贵。
计算单一显微标记可增加基于本发明的试验结果的稳定性。与很 多用于分析细胞和病毒靶的大面积成像方法形成对照，本发明通常直 接将单一信号与较小的邻接区进行比较。与求大面积中总信号和背景 积分的方法相比，这种比较可提高含有少数标记靶的样品的信号背景 比。
检测单一细胞或病毒的其它优点是在不牺牲速度的前提下，通过 适当增加检测形式的大小来增加样品体积，从而增加试验的灵敏度(具 体解释见43页实施例8的结果部分)。
计算大面积像中的单一信号数还可减少产生假阳性结果的机会。 (假阳性结果是不存在实际靶时产生的阳性试验结果)。与检测单一 积分信号的方法，如测量样品中分子(例如，ATP，抗原，或核酸) 总量的方法相比，这种计数方法是有利的。当使用依赖于信号积分的 方法时，引起信号的任何人工制品都可产生假阳性结果。含有482个 正信号的样品，每个都可产生100个荧光单位。积分方法的结果是单 一的数字(48,200个荧光单位)。产生相似荧光单位数的人工制品， 例如，较大的荧光尘粒是不能区别的。相反，本发明可很容易地区分 单一较大的荧光尘粒和482个正信号。
使用本发明构造的试验可检测各种浓度，从非常低的水平到高水 平的靶和病毒。本发明的这种性质，其较大的动态范围，可让用户取 消样品的制备步骤(例如，多次稀释)，而这一步骤常常是具有较小 动态范围的技术所需的。
基于本发明的试验可利用各种有效的形式，包括简单、非-仪器、 且低成本的一次性带状试验，和精密的自动化台式系统，用于连续的 不衰减的环境监测。特别重要的是本发明与使得试验中的反应速度(如 靶分子与靶特异性标记的结合速度)最大化的形式的相容性。例如， 通过本发明的一些实施方案，结合反应在多孔膜中迅速发生。
本发明可使用的各种检测方法包括目测，基于胶片的检测，和电 子检测。检测方法的范围对于提出广泛的诊断问题和试验地点是有利 的。例如，对于便携式系统，使体积和重量最小是优点。本发明中减 少和去除仪器化的实施方案对于便携是特别有用的。
本发明的其它特征和优点可从下列说明书和权利要求书很明显地看出。
靶分子是指可能存在于样品中的细胞或病毒，它的存在是通过本发明 测试的。靶分子可以是不同的分子，或者它们可以与样品中的其它分子、 细胞或物质物理缔合。例如，用于检测真菌病原体白色念珠菌的试验可 以检测生物的基因组特有的三种不同DNA序列。尽管在真菌的基因组中 物理缔合，这三种序列被认为是不同的靶分子。在一种实施方案中，所 述靶分子的分子量小于100kD。在优选实施方案中，所述靶分子的分子 量小于10kD。在更优选的实施方案中，所述靶分子的分子量小于1kD。
靶的类目是指共有一个或多个特征，且为了使用本发明构造试验的 目的，被认为相同的多个靶。例如，对于被设计检测所有HIV病毒的试 验而言，类目只是HIV。这种试验可检测所有HIV病毒，而不区分HIV- 1和HIV-2变体。在这种情况下，靶的类目包括HIV-1和HIV-2。其它 试验的目的可能是区分HIV-1和HIV-2。在这种情况下，每种类型的HIV 被看作是不同的类目。或者，考虑上述靶分子定义中白色念珠菌的三种 DNA探针。如果试验的目的是检测白色念珠菌，对于试验的目的而言， 三种探针被认为是相同的，因为它们具有特异性结合白色念珠菌的共同 特征。因此，这三种靶分子将被认为处于相同的靶分子类目。
靶的非重叠类目是指其并集为空集的靶的类目。也就是说，任一 类目都没有哪个成员是其它任一组的成员。例如，IL-2、凝血酶、PSA 和肌红蛋白是非重叠类目。
检测并鉴定多个类目的试验通常(但并不总是)可检测靶分子的 多个非重叠类目。例如，设计试验来鉴定血液中的HIV，HCV，和HBV 病毒。这种试验可区分靶的三个非重叠类目，即三种类型的病毒的每 一种是一个类目。
试验的类目复杂度是指在试验中检测的靶分子的非重叠类目数。
类目特异性结合位点是指靶分子上的位点，它可在特异性结合条 件下特异性结合类目结合分子，而且可把在试验中鉴定的特定类目成 员与不是该类目成员，但可能也存在于试验样品中的靶区分开来。也 就是说，该位点通常存在于一个类目的所有成员上，而且通常不存在 于非重叠类目的任何成员上。类目特异性结合位点特异性结合类目特 异性结合分子。
例如，考虑HIV病毒被膜蛋白上特异性结合抗体类目结合分子的 表位(抗原位点)。靶分子是病毒被膜蛋白，类目特异性结合位点是 被膜蛋白的表位。
如果试验扫描含有构成分类群的靶类目样品，那么类目特异性结 合位点基本存在与该分类群的所有成员中，但基本不存在于试验样品 中其它分类群的所有成员中。其中一个例子是结合特定单克隆抗体的 HIV膜蛋白上的位点。
可选择性地，试验可扫描包括了由不同分类群成员共有的类目特 异性结合位点的样品。这种类型的类目特异性结合位点的例子包括各 种大分子(例如，DNA)和基因，mRNA，和蛋白，它们可产生抗生素 抗性，毒性，或显示活力。类目特异性结合位点常常是较大分子或复 合物的一部分。例如，在试验中，可将类目特异性基因组序列用作类 目特异性结合位点。这种类目特异性结合位点是更大基因组的一部 分，它可含有：(1)不是类目特异性的部分；(2)是类目特异性结合 位点，但试验不能扫描的部分；和(3)试验可扫描的、不同类目特 异性序列的其它部分。
类目特异性结合位点是指在属于类目成员的靶中以80％，90％，95 ％，或超过99％存在，但在属于相同种类所有其它类目成员的靶中， 以80％，90％，95％，或超过99％缺少的结合位点。值得注意的是， 属于类目成员的靶可能一般或异常缺少类目特异性结合位点。同样， 类目特异性结合位点可一般或异常存在于不属于类目成员的靶中。例 如，认为蛋白位点基本存在于所有大肠埃希氏菌中，而不存在于其它 细菌种类中。如果，在上百万个细菌中少于一个细胞，导致不产生蛋 白的突变，那么标记将不存在于大肠埃希氏菌中。然而，这种蛋白位 点仍然被认为是类目特异性结合位点。可选择性地，利用重组DNA技 术或自然方式(例如，利用病毒转导)可将相同蛋白的基因转移到不 同种类细菌的菌株中。在这种情况下，不属于大肠埃希氏菌类目成员 的细菌菌株将表达什么仍然被认为是大肠埃希氏菌-特异性结合位 点。
类目结合分子是指特异性结合类目特异性结合位点的分子或分子 复合物。类目结合分子的例子是与基因组DNA杂交的核酸探针；已经 被选择或“推断”体外特异性结合蛋白上位点的核酸适体；结合细胞 抗原或血清蛋白的抗体；以及特异性结合激素受体或结合分子，如抗 生物素蛋白的配体，如表皮生长因子或生物素。如果它们结合不同且非重叠的 类目特异性结合位点，那么这两个类目结合分子被认为是不同的。根据它们的 分子组成，类目结合分子可被称作，例如，类目结合寡核苷酸，探针，抗体， 配体等。在一种实施方案中，所述类目结合分子包括分子量小于100kD的 分子。在优选实施方案中，所述类目结合分子包括分子量小于10kD的分子。 在更优选的实施方案中，所述类目结合分子包括分子量小于1kD的分子。
捕获分子是指与表面，薄膜，或不是颗粒的其它基质稳定结合的类目结合分子。
特异性结合靶类目的类目结合分子是指在规定的结合条件下，基本结合可由试 验扫描的类目成员的所有靶，但基本不结合不属于该类目成员，但可能存在于样品 中的其它种类靶的类目结合分子。与不是通过这种类目中的靶结合的数目相比，通 过所扫描类目中的靶结合的类目结合分子数要高2倍，5倍，10倍，或50倍。
结合条件是指在试验中使用的、获得类目结合分子与类目特异性 结合位点的特异性结合的条件。例如，当类目结合分子是类目特异性 DNA探针时，特定试验的结合条件是严格的DNA杂交条件。适宜的严 格DNA杂交条件取决于探针的性质，这是本领域那些技术人员熟知的。 例如，对于长度大于500个碱基的典型DNA探针而言，适宜的结合条 件(在杂交中被称作“清洗条件”)是65℃，0.2X SSC。对于抗体与 抗原的结合而言，典型的结合条件是室温，PBS-TB。
类目结合分子的家族是指一组特异性结合靶特定类目的类目结合 分子。针对丙型肝炎病毒培养的多克隆抗体制品构成类目特异性分子 的家族，这是因为它含有特异性结合靶-HCV相同类目的多个不同抗 体。多克隆抗体通常构成类目结合分子的家族，这是因为它们通常包 括结合靶相同类目的多个不同类目结合分子。值得注意的是，除非使 用亲和纯化，多克隆抗体制品通常还含有不与靶的选定类目结合的抗 体，而且可含有结合其它类目的抗体，这是因为动物的抗体系统是通 过动物的感染史确定的。因此，优选利用亲和法纯化多克隆抗体。
家族中的类目结合分子可能与类目中的某些靶结合，但不与其它 靶结合。例如，HIV-1特异性抗体不与HIV-2交叉反应，HIV-2-特异 性抗体不与HIV-1交叉反应。在不区分HIV-1或HIV-2的条件下，如 果HIV作为试验中的类目被检测，那么可用具有相同信号标志的信号 传递部分标记两种类型抗体的混合物。当在试验中使用该家族的类目 结合分子，即两种抗体制品的混合物时，不论存在HIV-1还是HIV-2， 都可获得相同的信号。(值得注意的是，如果使用抗体捕获本实施例 中检测区位点的HIV靶，那么在该位点使用抗-HIV-1和抗-HIV-2捕 获抗体的混合物)。
类目结合分子家族的其它例子是一组80个类目特异性基因组DNA 序列，它们存在于所有大肠埃希氏菌O157:H7菌株中，但不存在于其 它种类细菌的成员中。该家族的类目结合分子可与适当制备的大肠埃 希氏菌O157:H7细胞杂交，但是不与细胞的其它类目杂交。
类目结合分子的非重叠家族是指这样的类目结合分子家族，其中 每个家族特异性结合一组非重叠类目中的一个，而且仅仅一个类目。 也就是说，一组类目结合分子的非重叠家族对应于一组非重叠类目。 例如，在扫描4 USP有害生物大肠埃希氏菌，沙门氏菌，假单胞菌， 和金黄色葡萄球菌的试验中，有4个非重叠类目。这种试验可掺入4 种不同的非-交叉反应多克隆抗体，每种抗体对其中一个试验类目特 异。因此，该试验包括类目结合分子的4个非重叠家族。试验中的类 目结合分子的非重叠家族被称作类目结合分子的整体(ensemb1e)(见 下面的定义)。
类目结合分子的整体是指类目结合分子的一个或多个非重叠家族 组，对于特定的试验而言，将它们在混合物中混合。扫描靶的多个非 重叠类目的试验包括每个类目的一个类目结合分子家族。包含这些家 族的类目结合分子的整个组被称作整体。例如，可使用5种病毒-特 异性单克隆抗体扫描5种类型上呼吸道病毒(RSV，甲型流感病毒， 乙型流感病毒，副流感和腺病毒)的存在。这5个单克隆抗体构成类 目结合分子的5个非重叠家族。抗体的联合组是类目结合分子的整体。
整体的类目结合分子复杂度是指一个整体中的不同类目结合分子 或部分的数目。例如，如果一个类目结合分子的整体包括234个寡核 苷酸探针，那么该整体的类目结合分子复杂度为234。
整体的家族复杂度是指一个整体中的类目结合分子的非重叠家族 数。家族复杂度与结合整体中每个家族的类目结合分子所需的最小靶 数相等。试验的家族复杂度与试验的分类学复杂度一即，所扫描样品 的不同类目数相对应。概言之，家族复杂度也与试验中使用的不同信 号标志的数目相对应。考虑设计用于检测四种人细胞因子蛋白的靶分 子特异性抗体的整体：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白介 素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。整体的家 族复杂度是4，因为没有小于4的靶分子亚组可以满足结合整体中的 每一抗体。作为另一个例子，考虑由3个探针家族组成的DNA探针整 体。其中一个家族由一组12个大肠埃希氏菌类目结合DNA序列组成， 另外一个家族由一组10个轮状病毒类目结合DNA序列组成，另外一 个家族由一组15个贾第虫类目结合DNA序列组成。该探针整体的家 族复杂度为3，这是因为结合整体中的所有探针时，需要不少于3种 类型靶的基因组(大肠埃希氏菌，轮状病毒，和贾第虫)。
信号元件是指直接产生可检测信号的分子或粒子。术语“直接产 生”是指信号元件是可检测信号的直接来源或决定性调节子。因此， 如果信号是由荧光团产生的光子，那么荧光团是光子的直接来源，并 因此是信号元件。如果信号是由RLS散射的光子，那么RLS粒子是信 号元件。可选择性地，如果信号是从辣根过氧化物酶的产色沉淀产物 发射或散射的光，那么产色产物是信号元件。
信号元件的特征在于这种元件不能被分成若干部分，以致每个部 分产生可与整体(特征，而不必是强度方面)比较的信号。因此，2nM 直径的量子点也是一种信号元件，随着分开，它可改变所得毫微晶体 的特征(发射谱)。用荧光染料，如荧光素浸渗的5μm粒子不是信号 元件，这是因为它可被分成若干部分，以致每个部分具有可与完整粒 子相比较的信号特征。相反，分子荧光素是信号元件。产生信号的酶 (例如，荧光素酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)的可检测产物也 被认为是信号元件。这种信号元件(或它们的前体，当存在前体向信 号元件化学转化时)可以是扩散性物质，不溶性产物，和/或不稳定 的中间体。例如，碱性磷酸酶可将化学发光底物CDP-Star(NEN；目 录号NEL-601)转化成活化产物，它是发射光子的信号元件。
信号传递部分是指含有或产生(在酶情况下)一种或多种信号元 件的分子，粒子，或物质，而且它与类目结合分子偶联。信号传递部 分可与类目结合分子共价或非-共价和直接或间接(例如，经由一个 或多个连接物或“化学键”或通过与同一粒子偶联的两个部分)偶联。 信号传递部分的例子包括羧化量子点；被修饰用于结合核酸探针或抗 体探针的荧光团如Texas Red；涂覆链霉抗生物素的荧光聚苯乙烯粒 子(其可与生物素化的类目特异性结合蛋白偶联)；含有重复核酸序 列的滚环复制产物，其中每个核酸序列都可与用荧光修饰的核苷酸追 踪的若干寡核苷酸杂交，并在5’末端含有类目特异性结合寡核苷酸。 信号传递部分可含有完全不同的元件。例如，在某些情况下，信号传 递部分是与类目结合分子(例如，抗体)偶联的酶(例如，碱性磷酸 酶)。当碱性磷酸酶的底物(例如，分别来源于NEN和Roche的CDP- Star，或BM紫)转化成信号元件产物(例如，发射光子的不稳定中 间体，或可沉淀的产色产物)时，产生信号。对于类目结合分子，酶 信号传递部分，和在不同反应时间所用的底物而言，它是不寻常的。
信号传递部分复合物是指含有一个以上信号传递部分和一个以上 类目结合分子的物质实体。信号传递部分与类目结合分子在信号传递 部分复合物中的缔合必须是稳定的(例如，信号传递部分和类目结合 分子的复合物应在4℃的PBS中具有至少1天的平均半衰期)。信号传 递部分复合物的其中一个例子是涂覆两种类型的上千个分子的聚苯乙 烯微粒：靶特异性抗体和碱性磷酸酶。这种信号传递部分复合物经由 偶联的抗体类目结合分子与靶结合。当与产色碱性磷酸酶底物(信号 元件；例如，BM紫，Roche)培养时，产生肉眼可检测的有色斑点。 可选择性地，相同的信号传递部分复合物，当与化学发光或荧光碱性 磷酸酶底物培养时，可产生化学发光或荧光信号。信号传递部分复合 物的其它例子包括：与荧光素标记抗体偶联的毫微金粒子，与寡核苷 酸类目结合分子及吖啶_(acridinium)酯偶联的胶乳粒子，它可在 加入过氧化氢后化学发光。
粒子是指小于50微米的物体或基质。一群或一批粒子的大小被定 义为粒子样品最长一对正交维数的平均测量值。正交维数最长那对是 指正交维数如下的这样一对粒子：其长度总和是粒子所有这种总和的 最大值。如果2个粒子的样品分别具有1微米×2微米和2微米×3 微米的最长一对正交维数，那么最长那对正交维数的平均测量值是2 微米[(1+2+2+3)/4＝2微米]。粒子样品最长那对正交维数的平均测 量值是，例如，小于50微米，小于20微米，或小于5微米。
很多粒子都具有某些固体的性质。然而，分子骨架或复合物，虽 然不是刚性的，但也可被定义为粒子。例如，dendrimer或其它支链 分子结构也被认为是粒子。同样，脂质体是另外一种类型的粒子。粒 子可用信号元件染色或与信号元件偶联。常常可用术语反映粒子的大 小或几何形状。例如，术语纳米球，纳米粒，或纳米珠用于指代沿着任何 规定轴测量时，小于1微米的粒子。同样，术语微球，微粒或微珠用于指 代沿着任何规定轴测量时，小于1毫米的粒子。粒子的例子包括胶乳粒， 聚丙烯酰胺粒，磁铁矿微粒，铁流(磁性纳米粒)，量子点等。
标记粒子是指可特异性结合靶分子并产生信号的粒子。标记粒子 与信号传递部分和类目结合分子偶联或稳定缔合。本发明中使用的标 记粒子可以是胶乳粒子，二氧化硅粒子，量子点，共振光散射粒子， 向上转换型磷光体，或主要由金或银组成的粒子。
靶分子：标记粒子复合物是指特异性结合一个或多个靶分子的标记粒子。
标记比是指在接触步骤过程中，靶分子与标记粒子的比例。例如， 如果1×107个标记粒子与含有1×106个靶分子的样品接触，那么标记 比为0.1。为了计算标记比，仅仅考虑特异性结合于标记粒子的靶分 子。例如，物理上不可接近(如掩蔽于细胞腔室内)的靶分子不包括 在计算内。
信号元件或信号传递部分的信号特征是指由信号元件信号传递部 分产生的信号情况，可用于区别它与其它信号元件或信号传递部分。 例如，用荧光素和若丹明标记的信号传递部分的信号特征是荧光。无 线电询答器的特征是无线电频率。光子信号传递特征的例子是荧光， 光散射，磷光，反射比，吸光度，化学发光，和生物发光。除后两者 外，所有光子信号传递的特征取决于外部照射(例如，白光源，激光 源，或日光)。相反，化学发光和生物发光是不依赖外部光源的信号 特征。
信号元件或信号传递部分的种类是指信号的不同性质，可用于区 别它与其它信号元件或信号传递部分。例如，用红色染料标记的脂质 体就可与带有不同颜色的脂质体区别开来。红色是它的种类。对于传 播特定无线电频率信号的微型发送器而言，将微型传送器与其它微型 传送器区别开来的无线电频率信号的性质构成信号元件的种类。
信号标志是指试验中，结合靶类目的信号传递部分组合的区别信 号性质。与4种类型抗体结合的靶，即其中一个与荧光素分子偶联， 另外3个与若丹明分子偶联，它们的信号标志由荧光素和若丹明的组 合加权的吸光度和发射谱描述。
试验或标记类目结合分子整体的信号复杂度是指可在试验中或通 过与整体结合而区别标记的靶类目数。可选择性地，如果靶的每个类 目成员都存在，信号复杂度被定义为预期出现的不同信号标志数。对 于某些试验而言，类目结合分子整体的信号复杂度与试验扫描的类目 数相等。扫描多种类目的其它试验所具有的信号复杂度只为1。
选择力是指用于捕获，分离，移动，或汇集靶的力。选择力的例 子包括重力，磁力，电力，离心力，向心力，浮力密度，和压力。通 过将选择力单独作用于靶上可使靶移动。可选择性地，选择力可特定 作用在与选择部分缔合的靶上(见下面的定义)。
应用选择力使靶移动的例子包括靶的离心；与磁性粒子结合的靶 的磁性选择；用金属粒子标记的靶的重力沉降；和利用真空过滤使靶 在多孔膜上沉积。选择力使用的其它例子包括在下面的实施例中。
选择部分是指可与类目结合分子偶联并赋予类目结合分子利用选 择力而被选择性捕获，分离，移动，或汇集能力的原子，分子，粒子， 或其它实体。当类目结合分子：选择性部分的复合物与靶特异性结合 时，通常可利用选择力选择性捕获，分离，移动，或汇集靶。这里所 用的选择性是指和与选择部分无关的实体相比，利用选择力优先赋予 选择部分和相关实体的移动灵敏度。
顺磁粒子和铁蛋白是选择部分的例子。在溶液中渗透的密集二氧 化硅粒子是另外一种类型的选择部分。这种粒子，当涂覆类目结合分 子或与靶结合时，可使靶在水溶液中渗透，从而将结合靶与其它样品 的未结合成分分离。
选择性特征是指用于捕获，选择或移动选择部分的选择部分的情 况。例如，顺磁粒子的选择特征是磁力。迅速渗透在水溶液中的二氧 化硅粒子的选择特征是聚集。
基本处于同一平面上的表面或底物是指可与虚平面平行排列的表 面，这样当测量从表面上任何一个1mm×1mm正方形中的点到虚平面 上最近点的距离时，平均距离的绝对值小于50微米。
检测表面是指靶在上面沉积的、大概处于同一平面上的底物表面。 在利用光子信号传递特征的实施方案中，如果检测表面是光学透明 的，那么检测可经由检测表面的任何一面进行。如果检测表面是不透 明的，那么检测可经由沉积了靶的检测表面进行。
检测面积是指由本发明同时分析的检测表面或检测区的面积。检 测面积的最长线性尺寸通常大于1mm，例如，大于5mm，大于10mm， 或大于15mm。例如，由光学装置同时成像的载玻片的一部分可测量 0.8cm×0.5cm，其中的光学装置包括一个聚光透镜和一个CCD芯片。 检测面积为0.4cm2。
检测区是指靶在其中检测的体积。检测区具有与检测面积相同的 尺寸，深度与信号传递部分在其中检测并鉴定的深度相应。因此，检 测区的深度取决于评价正信号的临界标准。当利用光学检测时，检测 区深度取决于视野的光学深度。
检测面积的最长尺寸是指检测面积周长上两个点之间的最大直线 长度。例如，如果检测面积是0.3cm×0.4cm的长方形，那么检测面 积的最长尺寸是0.5cm的对角线。如果检测面积是一个半-主轴长度 为7mm，半-副轴长度为2.5mm的椭圆形，那么检测面积的最长尺寸是 14mm。
大面积检测或大面积成像是指一种用于检测显微靶的方法，其中 检测面积(由检测装置同时分析的面积)大于靶。大面积检测的检测 面积具有至少1个≥1mm的线性尺寸。相反，显微靶基本较小，通常在 至少2个正交维数中具有小于50μm的测量值。大面积检测的例子包 括用CCD照相机使一个9mm直径的检测面积成像；通过用CCD线扫描 仪扫描而使一个2cm×1m的长方形成像，其中该扫描仪的长尺寸为 1cm；利用在照相胶片上直接曝光而使一个含有微生物靶的4cm×4cm 滤器成像；和在快速侧流带状试验中，目测与1cm×3cm试验区域上 的显微靶相对应的有色斑点。
很多技术都可扫描含有显微靶的样品，但不能利用大面积检测。 例子包括：流式细胞术；固相激光微束扫描细胞术；液相扫描(Tibbe 等，Nat Biotechnol 17：1210-3，1999)；以及利用高倍显微镜，使 载玻片上的多个视野成像并检测。
偶联或稳定缔合是指两个实体之间的缔合，其中在4℃的PBS中， 缔合的平均半衰期最少为1天。例如，被动蛋白吸附聚苯乙烯粒子。 有很多不同种类的吸附蛋白。某些蛋白与表面稳定缔合，具有几个月 的半衰期。其它蛋白，如松散结合在吸附蛋白外层上的那些，可能并 不与粒子稳定缔合，而且可在几小时内浸出。
像增强器或映像管是指放大光子信号传递的装置，见Inoué的专 业词典，Shinya等，Video microscopy：the fundamentals(Plenum Press，New York，1997；p.665)：“一种(通过纤维光学或透镜)与 摄像管连接从而增加灵敏度的装置”。增强器是一个在前端具有光电 阴极的真空管，它可根据聚焦在它上面的像发射电子，它还具有一个 将电子聚焦在后端磷光体上的电子透镜和/或微通道板，以及一个增 加电子能量的高压加速器。可以是单级或多级的。各种像增强器在同 一篇参考文献的第8章中详细描述。
对检测面积一部分中的靶同时检测是指一步检测来源于基本处于 同一平面的检测表面部分的信号。同时检测的例子是用CCD芯片、目 测、或基于光电二极管的信号积分来检测在检测面积中大面积成像的 靶。
静止期的靶是指不移动的靶。例如，固定于载玻片上的靶就处于 静止期。被微量滴定皿孔底上的固定位置中的类目结合分子捕获的靶 也处于静止期。甚至是没被固定在表面上，而且可通过流体动力或其 它力移动的靶也被认为处于静止期，在检测/成像过程中，以大于10 秒的间隔拍摄的连续像基本可检测基本处于同一相对位置的相同靶。 流式细胞术中的靶不处于静止期。然而，由与侧流试验的固相试验区 结合的抗体所捕获的靶处于静止期。
均相测定法或均相免疫测定法是指反应物没有从已完成测定法的 产物中完全除去的测定法或免疫测定法。
鉴定是指确定属于其中成员的靶的类目。例如，扫描靶多个类目 的侧流试验中，每个都可能存在于样品中。属于特定类目的靶在结合 了相应类目特异性抗体的薄膜区被捕获。已知薄膜区含有捕获抗体， 靶可由发生捕获的区鉴定。
样品是指可利用本发明扫描其中是否存在靶的物质。
连接依赖性多态性探针对表示一组寡核苷酸类目结合分子(其中 该组含一个以上寡核苷酸)，当与基因组杂交时，在多态性位点相邻。 探针对中的一个寡核苷酸包含与基因组多态性位点一侧的基因组序列 互补的序列，而另一核苷酸包含与多态性位点另一侧互补的序列。当 相邻地与基因组杂交时，仅仅当靶定的位点处的等位基因或基因型与 多态性探针的寡核苷酸的邻接序列匹配时，一组这样的寡核苷酸可以 彼此有效连接。连接依赖性多态性探针对的结构和用途示于图18和 19。一般地，合成一组相应于特定位点的每个等位基因的多态性探针。 多态性探针可以包括各种功能部分，包括，信号传递部分、选择部分、 化学间隔基或束缚物、标志、扩增位点和半抗原。对于SNP探针的使 用的例子，见实施例14和15。
延伸依赖性多态性探针表示设计用于与一种序列杂交的核酸类目 结合分子，以便探针的3’末端位于与有待通过试验检测的多态性位点 碱基配对的几个核苷酸内。延伸依赖性多态性探针的模板依赖性延伸 被用于差别标记依赖于多态性位点的等位基因的探针。例如，考虑设 计用于紧邻地杂交于在模板链上具有“A”或“C”的多态性位点的寡 核苷酸，以便寡核苷酸的3’末端紧邻多态性位点。在适当条件下，在 DNA聚合酶存在下，用标记了发射绿色的荧光团的TTP和标记了红色 荧光团的dGTP培养杂交体，可以导致依赖于模板链的等位基因的探 针的差别标记。
等位基因特异性杂交探针表示在规定的条件下与不同的核酸等位 基因差别杂交的寡核苷酸类目结合分子。例如，熟悉本领域的人可以 确定12个碱基的核苷酸可以与精确匹配的DNA片段有效杂交，但是 相同寡核苷酸不能与寡核苷酸中12个碱基中的11个匹配的DNA片段 有效杂交的条件。
接目测是指除了佩戴矫正透镜外，在不借助仪器的情况下目测。 例如，直接目测可用于检测某些快速侧流试验中，纳米金粒子的微红 反射信号。
光电检测器是指将光子信号传递转换成电信号的人造装置或仪 器。光电检测器的例子包括CCD检测器，光电倍增管检测器，和光电 二极管检测器，例如，雪崩光电二极管。
照射是指用电磁辐射照射。可使用各种波长的电磁辐射照射。它 包括，例如，用光谱的X-射线，UV，可见，或红外区照射，值得注意 的是，在可见范围中，照射不是必需的。
具有光子信号传递特征的信号元件或信号传递部分是指可通过光 子的发射，反射，散射，折射，吸收，捕获，或重定向，或光子行为 的任何其它调制或组合而检测的信号元件或信号传递部分。具有光子 信号传递特征的信号元件或信号传递部分的一些例子包括：荧光团 Texas Red(荧光信号特征)；CDP-Star(化学发光信号传递特征)； 荧光素酶(生物发光信号特征)；共振光散射粒子(光散射信号特征)； BM紫(光吸收或产色信号传递特征)；和正向-转换的磷光体(两个较 长波长光子的吸收和一个较短波长光子的发射)。
‘数目’ב溶液名称’是指这样一种水溶液，它的溶液浓度为 这个数目的倍数(水除外)。例如，10×EE含有10mM EDTA/100mM EPSS (EE，或1×EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE是1mM EDTA/10mM EPPS溶液。在将它们混合之前，用NaOH将 两个成分的共轭酸调节至pH8.0。
HYB是用于杂交的溶液，含有：1M NaCl，50mM EPSS pH 8.0，2％ 封闭试剂(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母 tRNA(Sigma)。
UBB(通用结合缓冲液)是用于结合各种类型类目结合分子(如抗 体及核酸)的混合物的溶液，含有：250mM NaCl，50mM EPPS pH 8.0， 2％封闭试剂(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml 酵母tNRA(Sigma)。
BB(封闭缓冲液)含有100mM EPPS pH 8.0/150mM NaCl/2％封闭试 剂(Boehringer Mannheim)。
PB是0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.4。
PBS是磷酸盐-缓冲生理盐水溶液，含有：120mM NaCl，2.7mM KCl 和10mM磷酸盐缓冲液(钠盐)pH 7.4。
PBS-B是BSA的0.1％PBS溶液(没有IgG；Sigma目录号A-7638)。
PBS-T是Triton X-100的0.05％PBS溶液(Sigma目录号X-100)
PBS-TB是PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100。
PBT是PBS/0.1％BSA(没有IgG；Sigma目录号A-7638)/0.05％ Tween-20(Sigma目录号X-100)
LB是用于生长细菌并按照先前所述(Ausubel 1987，supra)制备 的Luria肉汤。
SSC是用HCl调节至pH 7.0的150mM NaCl/15mM柠檬酸钠
MES是(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)
MESB是0.05M MES(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)，pH 6.1
EDAC是(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基))碳二亚胺
连接缓冲液是10mM MgCl2/50mM Tris-HCl/10mM二硫苏糖醇/1mM
ATP/25μg/μl牛血清白蛋白。
AP：碱性磷酸酶
BAL：支气管肺泡的灌洗
BSA：牛血清白蛋白
CCD：荷电耦联装置
CFTR：囊性纤维化跨膜电导调节器
cfu：集落形成单位(与活细菌细胞数对应的细菌浓度测量值)
CMV：巨细胞病毒
FITC：异硫氰酸荧光素
HBV：乙型肝炎病毒
HCV：丙型肝炎病毒
HIV：人免疫缺损病毒
pfu：噬斑形成单位(与感染病毒颗粒数对应的病毒浓度测量值)
PNA：肽核酸
RSV：呼吸道合胞病毒
TCID50：烧瓶50％感染的组织培养感染剂量
XhoL是具有序列：5′-GGGCCCCCCCTCGATC-3′的寡核苷酸引物。
XhoR是具有序列：5′-ATCGATACCGTCGACCTC-3′的寡核苷酸引物。
除非另有说明，寡核苷酸序列是按照5’-3’方向表示的。
除非另有说明，说明书中描述的微生物株是从美国典型培养物保 藏中心(ATCC)，Manassas，VA获得的。
附图说明
图1.用CCD阵列对产生信号的各个粒子进行不放大的大面积成像的原 理
采用本发明，用抗IL-2抗体(类目结合分子)涂覆的荧光标记 粒子与血液中的IL-2蛋白分子(靶分子)结合。得到的复合物与微 量滴定皿的孔底部的捕获抗体结合。去除未结合的标记粒子。照射时， 捕获的标记粒子发出荧光，发射撞击在CCD芯片像素上的光子。标记 粒子的数量和位置由自动像分析解释。该图通过不包括光学成分和其 它硬件进行简化。
图2.以微量滴定孔形式检验血样
该图表示如何使用对各个标记粒子的成像来检测靶分子，在此处 是蛋白。
图3.进行大面积成像的CCD成像装置
图中描述的CCD成像器用于收集在实施例中描述的大量数据(见 详述部分的步骤6)。激发光是通过将光从高强度白光源(1000瓦Xenon 弧光灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)引入到液体光导(芯直径5mm，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)中提供的。液 体光导可将光传送给激发滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics， Hawthorne，NY)并将滤过的光束(通常直径为9mm)对准含有标记靶 的检测表面。该仪器可检测各种检测表面(例如，多孔膜，显微镜载 玻片，微量滴定皿，盖玻片，和底部平坦，且光学透明的试管)上的 标记靶。入射光穿透检测表面，诱导信号传递部分中的荧光，该信号 传递部分经由类目结合分子与靶结合，并沉积在光学透明的表面上。 发射荧光的一部分是通过高-收集效率的透镜系统收集的，并通过发 射滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics)传输给CCD照相机(Orca ll，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
图4.进行不放大的大面积成像的CCD成像系统
该图表示具有角形照射结构的CCD成像器，其中光被传到收集透 镜侧面斜角处的检测表面(这里表示为微量滴定平板的孔底)上。选 择适当角度从而优化收集效率，并避免收集透镜对入射光束的阻碍。 这种结构的优点在于源于样品支持物底部表面的反射没有被收集透镜 收集，因此不会造成荧光背景干扰。
图5.使用电、瞬时胶片和无辅助的目测进行不放大的各个显微标记粒 子的检测(实施例1)
该图证明了本发明使用各种检测方法，在不放大的条件下检测大 的检测面积中各个显微标记粒子的能力。采用瞬时胶片、CDC照相机 和无辅助的目测检测碱性磷酸酶涂覆的各个标记粒子。通过肉眼可见 的相同颜色的点适于图像的中心图片，该图像是用数字照相机采集 的。
图6.用于采用不放大的大面积成像检测低数量细菌的超灵敏侧流试验 (实施例2)
该图表示采用不放大的大面积成像进行的超灵敏侧流试验的结 果。示出了来自多个测试条的捕获和对照线的像，测定中加入了不同 数量的大肠埃希氏菌。柱状图说明随着大肠埃希氏菌的数量增加，来 自捕获线的信号也增加。该图证明了检测样品中低数量细菌的能力。
图7.用于采用不放大的大面积成像检测低水平蛋白的超灵敏侧流试验 (实施例3)
该图示出了用于使用侧流形式和不放大的大面积成像的细胞因子 蛋白IL-2的超灵敏试验的结果。在该图中可见来自多个测试条的捕 获和对照线的像，测定中加入了不同浓度的IL-2。柱状图说明随着IL-2 的数量增加，来自捕获线的信号也增加。该图证明了检测样品中低水 平蛋白的能力。
图8.用于采用不放大的大面积成像检测血清中的低水平蛋白的超灵敏 侧流试验(实施例4)
该图表示用于血清中的IL-2的侧流试验的结果。在该图中可见来 自代表性测试条的捕获和对照线的像。最左侧的条表示阴性对照。当 阴性对照与中间(20pg/ml)和右侧(200pg/ml)的条进行比较时，很明 显随着IL-2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。底部的柱状图 表示与加入的IL-2量相关的5次重复试验的平均值的信号。标准误 柱表示重复信号之间的三个标准误。数据表示本发明可以检测浓度为 20pg/ml血清的IL-2，证明该测定检测甚至是复杂样品中极低水平的 靶蛋白。
图9.用于采用不放大的大面积成像多路检测蛋白和细菌的超灵敏侧流 试验(实施例5)
该图表示采用不放大的大面积成像进行的多路侧流试验的结果。该 图表示应用了含有(从左到右)大肠埃希氏菌和IL-2、单独的大肠埃 希氏菌、单独的IL-2、以及即不含IL-2也不含大肠埃希氏菌的样品 的测试条的捕获和对照线的像。该图证明了灵敏侧流试验可以检测同 一测定中的多个靶分子。
图10.利用瞬时胶片检测低水平蛋白的超灵敏化学发光侧流试验(实 施例7)
该图表示使用化学发光标记粒子和瞬时胶片检测的侧流试验的结 果。示出了代表性测试条的捕获和对照线。施用了含IL-2(从左到 右：0，20，200，and 2000pg/ml)的样品的测试条的比较表明随着IL- 2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。这些数据表明，本发明可 以使用瞬时胶片检测浓度低至20pg/ml的IL-2。因此，该试验是超灵 敏、迅速、容易进行并且非常昂贵。
图11.使用捕获线选择靶分子：标记粒子复合物的试验设备的概图(实 施例8)
该图表示用于该实施例中的设备的构建。将样品加载到样品区中， 在此它侧流进入偶联物垫。在装置远端的吸附垫牵拉样品，溶解和固 定检测珠，该样品流经测定线。
图12.使用捕获线形式的蛋白的超灵敏试验
该图表示捕获线试验的结果。该图表示来自施用了含IL-2(0、20 和200pg/ml)的样品的试验的捕获和对照线的像。结果表明该试验可 以检测浓度为20pg/ml的IL-2。此外，捕获线的浓度依赖性斑点状外 观表明，对各个标记粒子进行了成像。
图13.使用不放大的大面积成像和固相捕获免疫测定对蛋白分子进行 的灵敏检测(实施例9)
该图表示使用结合于固相以捕获蛋白的抗体扫描样品中的人蛋白 细胞因子IL-2的试验。用抗IL-2抗体涂覆微量滴定板的孔。向孔中 加入IL-2标准物的稀释液。培养1小时后，洗掉所有未结合的粒子， 向孔中加入抗IL-2涂覆的荧光粒子。洗涤后，在CCD成像仪中进行 不放大的显像。阴性对照(抗腺病毒颗粒组)表明在孔中保留了非常 少的粒子。在IL-2组中，可见随着IL-2标准物的增加，信号增加。 信号是由于抗IL-2涂覆的孔、IL-2和抗IL-2涂覆的颗粒之间的相互 作用。该图表明测定方法的灵敏度(定义为平均阴性对照之上和之下 两个标准差)，其中IL-2浓度与灵敏度相关。
图14.使用不放大的大面积成像和液相捕获对蛋白分子进行的灵敏检 测(实施例10)
该图表示用“双珠”液相夹心方法扫描样品中的人蛋白细胞因子 IL-2的试验的结果。将IL-2标准物的稀释液与抗IL-2涂覆的磁性和 荧光粒子混合。培养2小时后，将磁性粒子和任何结合的粒子与其它 物质分离，转移到微量滴定板，并且在在CCD成像仪中进行不放大的 显像。阴性对照(无IL-2粒子组)表明在孔中保留了非常少的粒子。 在IL-2组中，可见随着IL-2标准物的增加，信号增加。IL-2组表现 出由磁性粒子捕获的成千个抗IL-2涂覆的荧光粒子，这是由于它们 与IL-2的相互作用。该图表明测定方法的灵敏度(定义为平均阴性 对照之上和之下两个标准差)，其中IL-2浓度与灵敏度相关。
图15.使用不放大的大面积成像检测多种人细胞因子的免疫测定(实 施例11)
该图表示用于在微量滴定皿中超灵敏检测多种蛋白的免疫测定策 略。
图16.使用不放大的大面积成像检测总(结合的+游离的)细胞因子 IL-2的竞争性免疫测定(实施例12)
该图表示竞争性免疫测定的概要。用抗IL-2捕获抗体涂覆微量滴 定皿孔，该抗体结合暴露于细胞因子的游离和结合形式的表位。该样 品与IL-2：生物素偶联物混合，该偶联物与样品中的细胞因子竞争结 合捕获抗体。混合物中也包括结合于IL-2：生物素偶联物的链亲和素 涂覆的荧光粒子。荧光粒子结合于孔的程度达到了偶联物与样品中的 细胞因子竞争捕获抗体位点。这样，结合的荧光粒子数反应了样品中 的总细胞因子浓度。孔底部的不放大的大面积成像量化了荧光粒子结 合于捕获抗体的程度。
图17.使用量尺形式和不放大的大面积成像灵敏检测核酸分子(实施 例13)
该图表示使用量尺形式和不放大的大面积成像检测病毒DNA的测 定的结果。将生物素化的病毒DNA的稀释液点样到尼龙膜上。作为阴 性对照，也点样非生物素化的病毒DNA。封闭以阻止非特异性结合后， 将膜条带浸入含有亲和素涂覆的红色荧光珠的溶液。珠溶液通过毛细 作用向膜上迁移，并且在该过程中与滤膜结合的DNA接触。洗涤膜， 然后通过基于CCD的不放大的大面积成像进行分析。图中的像中的亮 点表示从单个膜条带上的多个DNA点获得的荧光信号。每个点中的DNA 的拷贝数表示在每个像的右侧。左边的图表示DNA点如何在量尺上定 位。
图18.使用侧流形式和不放大的大面积成像进行不放大的多路SNP分 析：寡核苷酸连接和加样
该图示出了实施例15中描述的试验的前几个步骤，试验的最后几 个步骤示于图19。成对的等位基因特异性寡核苷酸与基因组DNA杂交。 对中的一个成员是生物素化的(图中具有黄色三角的寡核苷酸)。对 中的另一个成员具有相应于单核苷酸多态性的末端核苷酸，并且具有 独特的多态性特异性寡核苷酸标记物(图中带有明确的碱基-A，T，G， 或C的寡核苷酸)。连接后，将寡核苷酸加样到侧流色谱条带。寡核 苷酸标记物序列杂交于排列在侧流膜上的条带中的标记物互补序列。 仅仅相应于基因组DNA中的多态性的标记物序列与生物素化的寡核苷 酸连接。因此，仅仅相应于基因组DNA样品中的多态性的标记物互补 序列的条带与生物素化的寡核苷酸杂交。
图19.使用侧流形式和不放大的大面积成像进行不放大的多路SNP分 析：检测
该图示出了实施例15中描述的试验的后几个步骤，试验的前几个 步骤示于图18。如图18所示，在侧流层析后，生物素分子将与含有 相应于基因组DNA样品的基因型的标记物的膜上的条带缔合。通过结 合于涂覆了链亲和素(结合于生物素部分)和碱性磷酸酶的粒子检测 该条带的图样。加入产生化学发光产物的碱性磷酸酶的底物后，用CCD 成像仪检测含有生物素化的寡核苷酸的条带。
具体实施方式
发明概述.本发明可迅速并节省成本地扫描含有低水平靶分子的最少 加工样品。本发明提供的有效特征是由一种新的诊断方法提供的，它 结合了现代高强度标记，低成本成像技术，和不放大的大面积检测。
图1图示了用不放大的成像检测少量铺展在大面积上的显微标记 物。图1描述的实施方案使用数字相机(CCD芯片)捕获比各个标记 粒子大很多的面积的像。CCD芯片具有光敏像素元件的阵列。来源于 检测面积中一个位置上的“正在发光”粒子的光影响CCD芯片相应位 置的像素元件。终端用户从计算机接收有关样品中粒子数的信息，而 计算机可加工从CCD芯片获得的像数据(即，受照射的像素的数量和 强度)。
为了更好理解本发明使用的原理，考虑具体的实施方案是有帮助 的。图1示出了对血样中的人蛋白细胞因子IL-2进行定量的方法。 用结合于IL-2分子上的一个位点的抗体涂覆带有光学透明底的微量 滴定皿的孔。在孔中加入一滴含有IL-2分子的血液。也向孔中加入 荧光粒子(用分子荧光素染色)。也用特异性结合于IL-2的抗体涂 覆这些颗粒(尽管这些抗体结合于与捕获抗体结合的位点不同的位 点)。血液中的IL-2分子结合荧光珠和捕获抗体，在孔底部形成“夹 心”。夹心形成的结果是荧光珠锚定于孔的底部。当不存在IL-2时， 不形成夹心，并且没有荧光珠锚定于孔的底部。血液中的IL-2越多， 被IL-2涂覆的珠越多，锚定于孔底部的珠也越多。下一个步骤是对 这些珠进行成像和计数。
用荧光素激发范围内的光照射孔底部(检测面积)，可以引发锚定 于孔底部的荧光珠发射荧光。采集粒子的荧光像，不经过放大，将发 射的光聚焦在CCD芯片的表面上。每个粒子的荧光会撞击一个像素或 一小簇像素，引起局部电信号从CCD芯片向计算机传送，并以像文件 的形式存储在计算机中。像分析软件可通过计算响应粒子所发出光的 像素簇数而计算锚定于孔底部的珠数。
本发明利用多种类型的形式，包括标记方法，类目结合分子，和 检测方法构造试验。然而，该试验有若干共有的重要特征。下面将描 述本发明很多实施方案共有的步骤和过程。
本发明的一般方法包括下列步骤：
步骤1：设计试验问题，选择样品、试验形式和类目结合分子
步骤2：制备标记粒子
步骤3：使样品中的靶分子与标记粒子结合
步骤4：选择或捕获靶分子：标记粒子复合物
步骤5：通过检测选择或捕获的靶分子：标记粒子复合物而鉴定并量 化样品中存在的靶分子
步骤1：设计试验问题，选择样品、试验形式和类目结合分子 设计试验要解答的问题是建立基于本发明的新检测方法的第一步。 工业和临床微生物学家必须解决的重要问题的一些例子列于表2。明 确的试验问题一般确定必须检验的样品类型(如环境水、尿、或药物 成品)。样品类型和体积是选择试验形式的重要参数。
表2
基于本发明的试验所回答的问题的例子 环境样品是否含有6种特殊的生物战试剂中的任何一种？ 环境样品的总病毒含量是多少？ 该患者的血液中是否含有作为脓毒症的标记的4种指定蛋白水 平？ 该患者的唾液中是否含有12种指定的滥用的药物中的任何一 种？ 临床试验中的该患者的血液中药物X的水平是多少？ 该食品中是否存在4种指定的食物传播的病原体或2种毒素中 的任何一种？ 宫颈样品中是否含有5种指定的性传播疾病病原体中的任何一 种？ 患者血液中是否含有与心脏病相关的一组12种蛋白中的任何一 种？ 患者血液中是否含有与乳腺癌相关的一组12种蛋白中的任何一 种？ 患者的DNA中是否含有与心血管疾病相关的一组12种等位基因 中的任何一种？
试验形式的选择是基于一些因素，包括样品体积、样品内容(即 存在颗粒还是细胞)、靶的类目数、操作者的技术水平、价格限制。 例子包括熟悉的侧流和微量滴定皿形式，以及新的形式。下文的实施 例中描述了多种形式。
设计了试验问题后，靶分子的类目就明确了。这些是试验检测的 分子。对于研究样品中一组小分子(如滥用的药物)或心血管疾病的 蛋白标记的试验，靶分子分别简单地是滥用的药物或蛋白标记。对于 研究样品中更复杂靶如细菌病原体或含有与白血病相关的含蛋白的白 细胞)的研究(，靶分子是靶的特征性或特异性分子。
一旦明确了靶分子的类目，选择类目结合分子。类目结合分子与 靶分子特异性结合。本发明支持多种适于不同靶分子的类目结合分 子。例如，抗体可以用作多种靶分子(如激素、糖和蛋白)的类目结 合分子。对于确定个体的基因组成，例如，可以使用DNA寡核苷酸。
步骤2：制备标记粒子
在不进行光学放大或不使用昂贵器械的情况下，本发明检测各个显 微靶分子的能力取决于以高信号强度特异性标记靶分子。标记是经由 与类目结合分子缔合使标记粒子与靶分子特异性结合而获得的。标记 粒子具有两种功能：信号产生和特异性结合。各种粒子组合物、信号 产生部分和类目结合分子都可以用于制备具有这些功能的标记粒子。
为制备结合于步骤1选择的靶分子的标记粒子，使用多种本领域技 术人员公知的方法(见，例如，Hermanson，G.，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)和下文的具体实施例)将类目 结合分子偶联于粒子。有时使用相同的一组偶联技术将信号传递部分 偶联于粒子(例如，用于酶促信号传递部分)。
使用多种类型的信号传递部分使粒子发射用于给定试验的适当类型 的强信号。例如，可以用荧光染料对聚苯乙烯珠(如1微米直径)等 微粒染色，产生强荧光粒子。可以将荧光染色的聚苯乙烯微粒(如直 径1微米)掺入几百万个荧光团信号传递部分。或者，可以将粒子偶 联于酶促信号传递部分，如碱性磷酸酶，该部分可以催化荧光、化学 发光或可见颜色的产物形成。其它类型的标记粒子包括量子点和共振 光散射粒子。这些小粒子也可以与更大的粒子复合，以增加信号强度 和信号复杂度。
本发明同时扫描多种不同靶分子类目的能力来自区别来源于不同 靶分子类目的信号的能力。本发明以两种一般途径区别靶分子类目。 其中一种方法，也被称作信号区别，是用信号传递部分标记类目结合 分子的每个类目特异性家族，这样它就具有独特的信号标志。产生并 检测大量不同信号标志的能力(即，高信号复杂度)可构造扫描靶若 干类目的试验(即，高度多路的试验)。区别靶多个类目的其它方法， 即几何区别，依赖于在检测面积的不同区中沉积不同类目的靶。可不 依赖于信号传递部分的信号标志的几何区别例如用于多路侧流试验。 几何区别在下面步骤4讨论。
本发明可利用不同类型的信号特征，包括：荧光，散射光，光偏 振，无线电波，粒度，磁场，化学发光和放射性。信号传递部分的例 子和利用各种信号特征的检测方案在下面给出。在一个信号特征内可 有多个信号传递种类。例如，如果信号特征是荧光，各种特征发射光 谱包括信号传递种类(例如，红色荧光，绿色荧光，和蓝色荧光)。 可选择性地，作为另一个例子，认为红色荧光微粒是用不同浓度的相 同荧光团染色的。荧光也是信号特征，然而在这种情况下，不同强度 的粒子构成信号特征的种类，即，荧光强度是区分一组粒子与另一组 粒子的信号特征的性质。
获得高信号复杂度对于发展扫描若干类型靶分子的试验(即，具 有高度类目复杂度的试验)很有用。
获得高信号复杂度.混合物中可区别的标记(或信号传递部分)数被 称作信号复杂度。对于高度多路的试验而言，使用具有高信号复杂度 的信号传递部分有时是有利的。可与本发明联合使用产生高信号复杂 度的3种一般方法是：(1)区别标记.(2)组合标记.和(3)比例标 记。
1.对于区别标记而言，不同探针家族中的探针是用单一信号传递 部分标记的，其可在所有其它信号传递部分存在的实验中很容易地检 测。迄今为止，很难获得高信号复杂度的区别标记。这是因为绝大多 数标记方法使用光学信号(例如，产色，荧光，化学发光)或放射性 标记。由于光学信号的光谱带宽和现有仪器可检测信号的有限范围， 可使用光学信号分辨的信号复杂度较小。例如，由于光谱重叠，具有 不同发射光谱的很多荧光团的分辨目前是不可能的。可以用于进行区 别标记的一种方法是使用微型转发器(如美国专利第6,001,571)。 每个微型转发器发射不溶的无线电波标志。因此，用微型转发器和其 它正在开发的区别标记方法进行标记有可能与本发明结合使用。
2.本发明所用获得高信号复杂度的其它方法是应用组合标记方 法。组合标记是使用相对少数的不同信号传递部分获得高信号复杂度 的技术。使用这种方法，不同组合的信号传递部分与不同的靶结合。 目前，荧光团是分子诊断学的一类有益信号传递部分。然而，由于涉 及分析多个不同荧光团的复杂情况(出现激发和发射光谱的大部分重 叠)，目前在实践中只能掺入大约7种或更少的常规荧光团。然而， 组合使用时，7种荧光团可用于产生127种不同的信号(N个荧光团 产生2N-1种组合)。高信号复杂度还可利用其它类型的信号传递部分， 经由组合标记获得。例如，用不同染料浸渗的粒子，落在不同离散大 小种类中的粒子，或发射不同无线电信号的转发器都可用于该方法 中。使用荧光团的组合标记近来已经成功用于人类的染色质组型 (Speicher等，1996，supra；Schr_ck等，1996，supra)。用于分 析组合标记实验的仪器和软件可从市场上购买。
3.高信号复杂度还可使用比例标记方法获得(Fulton等，1997， supra)。在比例标记中，就像组合标记那样，很多不同类型的信号传 递部分可使用相对少数的不同信号元件产生。然而，与组合标记相反， 比例标记中的信号传递部分是通过信号传递元件的比例区别的。例 如，两个荧光团X和Y，具有不同的激发/发射特征，可用于将聚苯乙 烯粒子染色。将不同相对浓度的荧光团([X]，[Y])用于不同的粒子 组。例如，8种不同浓度的X和8种不同浓度的Y用于将粒子染色时， 所有组合方式(X1Y1，X1Y2，X8Y7，X8Y8)产生64类可区分的粒子。比 例标记可将简化仪器，只需使用少数信号类型。除了荧光团之外，还 可使用包括非-光学信号元件的信号元件，利用比例标记方法产生高 信号复杂度。
步骤3：使样品中的靶分子与标记粒子结合
用于使样品中的靶分子与标记粒子结合的方法和形式取决于样品 类型、靶分子的性质和选择的试验形式。
本发明的一个重要特性在于它与快速和简单的样品制备过程相 容。对于很多应用来说，实际上不需要样品制备。这代表了与其它灵 敏的诊断方法，如基于核酸扩增的技术相比的主要优越性，基于核酸 扩增的技术需要更费力的样品制备程序，用于去除酶抑制剂。例如， 研究样品中的可溶分子标记的试验通常在结合标记粒子之前不需要任 何样品制备。对于一些试验，其中靶分子是更大的复合物的一部分或 螯合于更大的复合物中，更大的复合物可以作为样品制备步骤的一部 分而解离。例如，对于研究病毒核心蛋白在HIV病毒内部的存在的试 验，可以使用洗涤剂使病毒颗粒解离。例如，对于遗传分析，含有核 酸靶分子的细胞通常被打开(例如通过各种化学或物理处理)并且双 链DNA经过变性以允许核酸杂交。
本发明使用的各种形式具有允许标记粒子与样品中的靶分子快速 结合的优点。例如，使大量标记粒子与液体样品中的靶分子结合使得 碰撞比在常规ELISA形式中发生得更快，常规ELISA中靶分子一般在 能够发生碰撞之前扩散到反应室的一端。快速结合动力学也是接触发 生在多孔膜内部的试验形式(如侧流试验)的一个特征。
步骤4：选择或捕获靶分子：标记粒子复合物
选择步骤具有一些重要的功能，包括从未结合的标记粒子分离靶 分子：标记粒子复合物，使靶分子：标记粒子复合物沉积在检测区(例 如，一些实施方案的光学系统的焦面中)中，从靶分子：标记粒子复 合物去除样品材料，并且(对于某些试验形式)将标记的靶分子的特 定类目局限于检测面积的不同区域。
对于在结合步骤之前，将样品固定在固体基质上的测定法而言， 未结合的类目结合分子和信号传递部分通常通过清洗除去。实例包括 使用原位杂交和免疫细胞化学方法的应用。
其它试验形式是在液相，例如，微量滴定孔中进行的。对于一些 试验，选择步骤是经靶分子：标记粒子复合物于微量滴定孔的检测表 面上的捕获分子相结合而发生的。在这些试验中，扩散是使捕获分子 接触的手段。对于其它应用，靶分子/类目结合分子/信号传递部分复 合物沉积在表面上。使靶复合物沉积在表面上的方法包括离心，过滤， 重力沉降，磁性选择，或与表面结合的类目结合分子，例如，捕获抗 体结合。在某些情况下(例如，磁性分离)，使用不同的部分，即选 择部分。涂覆了类目特异性抗体的磁性微粒是选择部分的例子。未结 合的类目结合分子和信号传递部分通常留存在液相中，而且可除去。 如果选择过程(例如，光学成像)可选择性分析具有狭窄视野深度的 固体表面，那么有时无需除去未结合的物质(位于焦面外部)
对于一些应用，选择程序的组合是有用的。例如，可在接触标记 粒子前将样品过滤通过具有确定孔径的膜。例如，可以使用仅仅允许 大小为约0.5-5微米的粒子通过的过滤系统检测未知细菌的存在。 该试验可以基于结合于包含酪氨酸的任何蛋白的标记粒子。选择其它 大小范围可以进行未知病毒、游离蛋白或真核细胞的试验。
在关注点试验中，侧流和流通形式是可论证的最成功的试验形式。 这些形式利用吸水薄膜中毛细流的优点。它们通常使用捕获分子(如 表面-结合的类目结合分子)选择靶分子：标记粒子复合物。未结合 的标记粒子通过毛细作用流到捕获区外面。基于膜的测定法的其它重 要优点是很容易利用几何区别而成为多路。
当扫描靶分子的多个类目时，几何区别是一个重要的方法(即， 在多路试验中)。与高信号复杂度的多路试验(见步骤2)相比，几何 区别具有下列优点，即对于多路试验而言，只需要单一的信号标志。 在使用几何区别的典型免疫测定法中，不同的类目特异性捕获抗体沉 积在检测区的不同范围中(例如，侧流试验中的不同带或流通试验或 基于微量滴定孔的试验中的不同斑点)。因此，靶分子的不同类目在 捕获区的不同预定范围被捕获。与捕获抗体类似的其它类型捕获部分 包括抗原，配体，及核酸。其它形式，包括使用微流通道和使用“捕 获线”(用捕获分子涂覆的材料的细条带)的那些也可以使用几何区 分。
步骤5：通过检测选择或捕获的靶分子：标记粒子复合物而鉴定并量 化样品中存在的靶分子
该步骤使用锚定于检测区中的的靶分子：标记粒子复合物的大面积 成像分析检测、鉴定并且量化样品中的靶分子。该步骤本身一般包括 成像、像分析和报道分子产生的步骤。
本发明可以在不放大的情况下检测显微标记粒子。该有效的特征受 到高强度标记方法和高效光学的支持，以指导微集落发出的光子进入 光检测器阵列的少数像素。低放大成像促进大面积的成像，由此促进 了扫描大样品。
使用的成像方法取决于步骤2中选择的信号产生的类型。例如， 成像过程根据用于产生信号的光学特性或信号传递特征而不同。对于 某些信号特征(例如，反射、荧光、光散射或吸收)而言，检测区中 的复合物必须接受光源的照射。对于其它(例如，化学发光或热辐射) 而言，无需照射。
检测各个标记粒子是天然定量的并且是超灵敏的。可以通过人工 计数照片或数字像中的各个标记粒子或通过使用数字化图像的自动图 像分析而完成量化。也可以使用集成样品的信号强度量化靶细胞。信 号集成对含有高浓度靶细胞的样品特别有用。在这些情况下，分辨一 致的信号并不总是可能的。
解码标记粒子的标志使得能够鉴定多种靶细胞类目。该步骤的重要 目的是通过确定靶分子：标记粒子复合物的标志而鉴定样品中靶细胞 的类目。
当使用荧光作为信号特征时，基于CCD照相机的成像器，如图1 所示，是一种用于大面积成像的有效装置。这种装置用于收集下面很 多实施例的数据。激发光是通过从高强度白光源(1000W Xenon弧光 灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)将光引入到液体光导中(5mm芯直径，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)而提供的。液 体光导可将光传送给激发滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics， Hawthorne，NY)，并将滤过的光束(直径9mm或以上)对准含有标记 粒子的检测表面。该装置可检测各种构造(例如，多孔膜，显微镜载 玻片，盖玻片，或平坦、光学透明底部的试管或孔)上的标记粒子。 入射光穿透检测表面，诱导靶细胞中的荧光。所发射荧光的一部分是 由高-收集效率的透镜系统收集的，并通过发射滤器盘(BioPoint FW， Ludl Electronics)传输给CCD照相机(Orca II，Hamamatsu， Bridgewater，NJ)。光学装置的设计和构造是与本领域技术人员已知 的原理和实践为基础的。
本发明也可以结合使用其它类型的光检测器和其它构造。成像系 统的灵敏度可通过选择更灵敏的照相机(例如，冷却至低温的照相机， 或使用后面较薄的芯片的照相机)来增加。可选择性地，检测灵敏度 和分辨率可通过使用线扫描系统(例如，BT Image Array；Hamamatsu) 增加。进行线扫描时，线性CCD或光电二极管阵列(例如，1×500或 1×1000个像素)用于捕获像。一维分辨率与阵列元件数相对应，而第 二维常常通过在线性阵列下垂直移动样品载玻片而捕获。因为元件较 少，相似灵敏度的线性阵列通常比区域形式的CCD照相机要便宜。
图3所示的仪器可以经构造而使用X-Y定位平台(BioPoint XY， Ludl Electronics)在激发和收集的光学器件上移动试验样品而测量 多个样品。Image-Pro和Image-Pro附件可控制所有的仪器元件及像 的获得。滤器盘是用ScopePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)控制的，StagePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD) 操纵平台的定位，而照相机的控制是通过Hamamatsu Orca II驱动器 (Hamamatsu，Bridgewater，NJ)进行的。Image-Pro Plus也可用于 像-处理和下面所述的分析。
本发明使用白光照射的实施方案利用光谱滤器为每个荧光团提供 最佳激发峰。白光的光谱较大，可选择各种荧光团来消除发射光谱的 重叠。通常使用白光照明装置获得的斑点大小，例如，2mm-5mm，对 于大面积成像是适宜的。因为滤器更换相对简单，而且可以是自动化 的，因此白光系统非常适宜，可在使用不同荧光团组的试验中使用相 同的仪器。
图3所示系统的收集效率是通过插入由两个元件组成的、常规设 计的收集光学器件而最大化的，这两个元件是：收集物镜和聚焦元件。 收集物镜具有高收集效率(≥f#/1.2)，并输出相对准直的光束。聚焦 透镜可捕获从收集物镜输出的光，并将它聚焦在CCD的检测表面上。 光学器件被设计成两部分，从而使滤器盘插在收集透镜的路径中。对 于本发明的某些实施方案而言，例如，对于某些不需要更换滤器的实 施方案而言，它可包括一个用于获得高收集效率的锥形光纤束。光纤 束包括收集近样品光的纤维和光直接对准CCD芯片的通道。可选择性 地，本发明可利用直接近检测而非常灵敏地检测信号，其中样品直接 涂在CCD芯片上，或与CCD芯片紧密接近(对后面变薄的CCD芯片的 后面高度灵敏)。
除了白光、上述多-光谱系统之外，我们还可研制了一种更简单的 单色荧光成像系统，用于不放大的大面积成像。在图4所示的系统中， 激发光是由532nm的Frequency-Doubled Diode Laser(50mW， Model#BWT-50E，B&W Tek，Newark，DE)提供的。因为该检测是单色 的，因此无需滤器盘。单一的激发滤器可除去源于激光输出的谐波光 谱(Model HQ532/10x，色度Technology，Brattleboro，VT)，且 单一发射滤器(Model HQ620/60m，色度Technology，Brattleboro， VT)只能允许特异性荧光信号通过CCD照相机。这些系统还可使用较 之先前所述更便宜的CCD照相机(Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn， CA)来捕获像。通过插入多个激光和滤器装置，这些图中所示的仪器 很容易适合进行多色分析。
插入到本发明中的CCD照相机通常冷却至-5℃--50℃，对于具有 最小照相机干扰累积的10秒-约2分钟的积分时间(取决于照相机的 灵敏度)而言足够。通过长时间收集荧光团发射的光子，较长的积分 时间通常产生更高的灵敏度。较长的积分时间对于线扫描是不适宜 的；然而，存在着后面变薄的线性阵列，它具有非常高的量子效率， 可增加灵敏度。
本发明还可利用基于干涉仪的光谱成像检测和解译信号 (Schrock，E.，1997，supra)。使用这种技术，由信号传递部分发 射或散射的光分为两部分：通过棱镜(不同波长行进不同的距离)， 从而重组以创造干涉图样。干涉图样的Fourier分析可相对于像中的 每个点产生一个光谱。
对于包括需要便携式系统的应用的关注点应用，本发明可以经过构 造而使重量和大小达到最小。对于一些实施方案，可以完全去除仪器 (如当通过颜色检测显现标记粒子时)或很大程度简化(如，通过使 用瞬时胶片代替电子检测器)。如果需要，可以在用于数字储存和数 字像分析的商业化扫描仪中数字化收集在胶片上的像。或者，可以通 过使用近端成像在没有光学系统的条件下使用光检测器(光检测器基 本对着检测区放置)。为了最大的便携性，可以通过使用具有非照射 依赖性信号传递特征(如化学发光)的颗粒而去除光源。
对于本发明产生数字像的实施方案而言，计算机软件鉴定并且量 化靶标记粒子。对于其中使用不同类型的荧光信号传递部分的典型测 定而言，软件添加了适当的荧光团特异性像，通过确定每个靶标记粒 子发射哪一种信号标志或组合而鉴定靶细胞，并且计数样品中存在的 每个靶标记粒子类目。该软件也可以1)校正照射的不均匀性；(2) 校正通过去卷曲基质的荧光串音；(3)利用印在基质上的登记标记排 列像；(4)基于与查询表的比较，将ID码赋给样品中的每个成像标 记粒子；(5)记录用于样品鉴定的成像样品的条形码；和(6)将输 出的数据，像，和条形码自动保存在数据库中，通过网络浏览器界面 查询。市售的像分析软件包可用于提供这些功能。可使用多色像分析 软件包(例如，Image-Pro，Media Cybernetics；Metamorph，Universal Imaging，MatLab，The Mathworks)。
这里描述用于分析在下面很多实施例中收集的荧光数据的软件包 和方法。使检测表面成像，从而测定荧光物体数和/或总荧光信号。 荧光是通过CCD照相机从检测区域捕获的，并存储为TIFF(Tagged Image File Format)像文件，其中包括像素位置和强度的记录。3种 方法都可用于量化测定结果。成像检测区的总积分信号是通过计算所 有像素的荧光信号总和测定的。将样品的积分信号与阴性对照的进行 比较。测量总的积分信号对于含多个靶的样品特别有效。第2个方法 是计算检测区域中的物体数。第3个方法是将荧光物体内所含的全部 像素的强度积分(与计算像中所有像素强度的总和相反)。所有像分 析都是用Image-Prov 4.0(Media Cybernetics，Silver Springs， MD)进行的。
使用IPP Image-Pro宏语言，上述工具可同时自动批量处理若干 像。此外，还可使用其它用户自定义的IPP小型程序处理数据。例如， 可包括或排除低于或高于特定大小(面积)或强度的物体，它是用于 除尘的有效工具。其它确定物体定义(如接受和排斥标准)的用于像 分析的重要参数根据应用而不同并且应该进行相应的优化。
可以对本发明的多个方面进行自动化，包括连接上述步骤。考虑 用于分析液体样品，如用于注射的药水或临床尿样的应用。所述自动 化的系统可以自动收集样品，使它们与标记粒子接触，采用选择步骤， 获得像，分析像，并且报告结果。或者，本发明的各个功能可以自动 化。例如，用于将容器自动加样到成像仪器并且从其取出，以及用于 自动化聚焦的组件可以掺入系统。
实施例.下面的实施例为实行本发明的各种实施方案提供了技术细 节，它们可与各种应用联合使用，但不是对本发明的限制。
实施例1.使用电、瞬时胶片和无辅助的目测进行不放大的各个显微标 记粒子的检测
本发明量化低水平靶分子的能力部分在于其在不进行高度放大的 条件下检测并且计数大的检测面积中各个显微靶分子的能力。该实施 例的目的是证明本发明可以各种检测手段：CCD光检测器阵列、瞬时 胶片和简单的目测而完成。
用于这些实验的标记粒子是用抗体和碱性磷酸酶涂覆的乳胶粒 子。用分别产生化学发光或有色(紫色)产物的碱性磷酸酶的化学发 光或产色底物处理置于膜上的珠。对具有化学发光标记粒子的膜进行 电成像或用瞬时胶片成像，通过肉眼对具有产色标记粒子的膜进行成 像。
实验方法：通过向链亲和素涂覆的粒子(108个粒子；Bangs；0.95um， 非荧光；目录号CP01N)加入生物素化的碱性磷酸酶(5μl 2.9mg/ml 的原液，Pierce；目录号29339)和生物素化的山羊抗大肠埃希氏菌O157 抗体(5μl 1.0mg/ml的原液，Kirkeguard and Perry Laboratories； 目录号01-95-90)而制备涂覆了抗体和酶分子的粒子。用PBS使体 积成为100μl。培养30分钟后，洗涤粒子两次。一次洗涤包括在微 量离心机中以3000g旋转粒子5分钟，然后弃去上清液并且将粒子重 悬于PBS(100μl)中。制备双涂覆的粒子之后，将珠稀释至大约50 和500个珠。将每种稀释液和无珠对照的三份重复样品加入PBS(50 ml)，使用真空泵和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide， PF07114，Rev A 3/00)，通过0.2μm孔径的硝酸纤维素膜进行过滤。 向一组滤器中加入BM紫碱性磷酸酶底物(500μl；Roche；目录号 1442074)。将CDP-star(500μl；NEN；目录号NEL-601)加入另一组 滤器。培养1小时后，在水中洗涤BM紫膜以去除剩下的BM紫，让 膜风干。按照制造商的说明在SpotLight照相机(Boston Probes；目 录号DT10000)中封固CDP-star膜，并且曝光于ASA2000胶片(Boston Probes；目录号DT20000)两分钟。然后用不放大的大面积成像观察相 同的滤膜。用Image-Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics)从 CCD成像仪捕获像并且进行处理。
结果.图5表示可以用产色的或化学发光的信号元件检测偶联于 类目特异性结合分子和酶促信号传递部分的双功能粒子。甚至肉眼就 能够观察单个标记粒子的能力是由于每个标记粒子上的大量酶分子。 该实施例证明了本发明提供简单、便于用户、经济和不使用仪器的超 灵敏关注点试验的可能。
实施例2.用于采用不放大的大面积成像检测低数量细菌
背景和目的：该实施例证明了使用本发明，采用便于用户的侧流测定 形式和不放大的大面积成像快速检测低数量的细菌。侧流测定已经用 于诊断工业20年以上。该简单的测定依赖于抗原:抗体相互作用而 检测特定靶(或分析物)的存在。尽管简单，在大多数诊断领域，侧 流条带缺乏与ELISA免疫测定和核酸扩增方法竞争的灵敏度。
在该实施例中，将多种细菌裂解物(大肠埃希氏菌O157:H7)的 稀释液应用于包括含有标记粒子(涂覆了大肠埃希氏菌O157:H7特 异性抗体的荧光染色乳胶粒子)的偶联物垫、捕获抗体线和具有结合 于缺乏靶分子的标记粒子的捕获抗体的阳性对照线的多孔膜条带上。 进行试验后，用大面积的不放大成像对捕获和对照线进行成像。
实验方法：按照侧流试剂盒(Millipore；High Flow Mid Range Assembly Kit，目录号HFMIDAK015)上提供的说明组装侧流试验条 带。简言之，将芯、偶联物和样品垫置于侧流膜上，该膜连接于粘合 剂支持卡。通过在膜上(距离芯垫5-10mm)跨越膜条带施加两条捕 获抗体线而制备抗体线：一条是大肠埃希氏菌O157:H7(捕获线； 每8cm长的线含10μl 1mg/ml的溶液，BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目录号01-95-90)， 一条是阳性对照(对照线，每8cm长的线含10μl 1mg/ml的溶液， Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗山羊IgG，目 录号115-165-146)。在使用前使线干燥(至少15分钟)。通过混合 珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗体(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80 μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗大肠埃希氏菌O157:H7 抗体(BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories， 目录号01-95-90)标记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01 F-5121)。然后离心(5000g，10min) 珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗大肠埃希氏菌抗体涂覆的荧光 珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。用PBS系列稀释甲醛固定的大 肠埃希氏菌O157:H7细胞的原液(菌株DEC 3B，Dr.Tom Whittam， Pennsylvania State University，109细胞/ml)。然后将系列稀释液 (100μl)加入裂解液(100μl 200mM NaOH/1％SDS)并且静置3分 钟。加入PBS-B(800μl)中和裂解液。将试验样品(100μl裂解的大 肠埃希氏菌稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并且加入试验条带的样品 垫中。样品通过样品垫移动到偶联物垫，在此荧光珠整合到样品流中。 然后使样品进入试验膜，通过捕获和对照线，并且最终进入芯垫。进 行测定(约15分钟)。然后通过将条带置于基于CCD成像仪上(描述 于发明详述部分的第5步并且示于图3)而对膜进行成像，以便细菌 面对光源和CCD芯片。使用不放大的大面积成像对条带进行成像。用 Image-Pro软件分析像。
结果：图6表示用于检测细菌的侧流试验的结果。该图表示来自代表 性条带的捕获线和对照线的像。最左侧的条带表示分析不含细菌的阴 性对照样品时的结果。当阴性对照与分别含有1000和10,000个大肠 埃希氏菌的中间和右侧的条带进行比较时，很明显，随着细菌的数量 增加，来自捕获线的信号也增加。底部的柱状图表示与加入的大肠埃 希氏菌数量相关的五次重复试验的平均值的信号。标准误柱代表重复 样品信号之间的三个标准误。数据表示1000个细菌的检测限，这比 市场上出售的商业化试验灵敏10-100倍。
实施例3.用于采用不放大的大面积成像检测低水平蛋白的超灵敏侧 流试验
背景和目的：对于蛋白标记的更灵敏快速的试验仍然存在未满足的需 要。该实施例证明了使用本发明，采用便于用户的侧流测定形式、荧 光标记粒子和不放大的大面积成像快速检测低水平的蛋白(IL-2)。 由于发现了人类疾病(例如癌症和心血管疾病)的新标记，检测和量 化样品中的低水平靶分子变得更重要。
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将抗体施加于膜，制备IL-2特异性捕获线(Pharmingen，目录号 554424)和阴性对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.； 生物素抗小鼠IgG，目录号115-165-146)。在使用前使线干燥(至少 15分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗体(10μl 1.0μg/ml 原液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗IL-2 抗体(Pharmingen；目录号554426)标记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F-5121)。然后离心(5000g，10min) 珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗IL-2抗体涂覆的荧光珠(2μ l)加入每个条带的偶联物垫。用PBS系列稀释IL-2原液(Pharmingen； 重组小鼠IL-2，目录号550069)。将试验样品(100μl IL-2稀释 液)与PBS-TB(50μl)混合并且加入试验条带的样品垫中。进行测定 (约15分钟)后按实施例2的方法进行成像。用Image-Pro软件分 析像。
结果：图7表示用于检测I1-2的侧流试验的结果。该图中可见来自 代表性条带的捕获线和对照线的像。最左侧的条带表示阴性对照(无 IL-2)。当阴性对照与中间和右侧的条带，即分别含有2pg/ml和 20pg/ml IL-2的样品进行比较时，很明显，随着IL-2的量增加，来 自捕获线的信号也增加。底部的柱状图表示与加入的I1-2的量相关 的五次重复试验的平均值的信号。标准误柱代表重复样品信号之间的 三个标准误。数据表示该试验检测水平为2pg/ml的I1-2，这比市场 上出售的商业化试验灵敏10-100倍。
实施例4.用于采用不放大的大面积成像检测血清中的低水平蛋白的 超灵敏侧流试验
背景和目的：检测复杂样品中的靶分子对许多应用是重要的。该实施 例证明了使用本发明，采用便于用户的侧流测定形式和不放大的大面 积成像快速检测血清中的低水平的IL-2。在下面描述的实验中，用荧 光标记粒子检测血清中的IL-2。
实验方法：按照实施例3所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将抗体施加于膜，制备IL-2特异性捕获线(Pharmingen，单克隆抗 11-2，目录号554424)和对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目录号115-165-146)。在 使用前使线干燥(至少15分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml 原液)、抗体(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5 小时/室温)，用生物素抗IL-2抗体(Pharmingen；目录号554426)标 记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F- 5121)。然后离心(5000g，10min)珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。 将抗IL-2抗体涂覆的荧光珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。用 血清(Filzgerald Laboratories；正常山羊血清，目录号88-NG22) 系列稀释IL-2原液(Pharmingen；重组小鼠IL-2，目录号550069)。 将试验样品(100μl IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并且加 入试验条带的样品垫中。进行测定(约15分钟)后按实施例2的方 法进行成像。用Image-Pro软件分析像。
结果：该图表示用于血清中的IL-2的侧流试验的结果。在该图中可 见来自代表性测试条的捕获和对照线的像。最左侧的条表示阴性对 照。当阴性对照与中间(20pg/ml)和右侧(200pg/ml)的条进行比较时， 很明显随着IL-2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。底部的柱 状图表示与加入的IL-2量相关的5次重复试验的平均值的信号。标 准误柱表示重复信号之间的三个标准误。数据表示本发明可以检测浓 度为20pg/ml血清的IL-2，证明该测定检测甚至是复杂样品中极低水 平的靶蛋白。
实施例5.用于采用不放大的大面积成像多路检测蛋白和细菌的超灵 敏侧流试验
背景和目的：对检测一组靶分子的存在的试验的需要是常见的。其例 子是研究样品中导致性传播疾病的各种微生物、滥用的药物、各组生 物战试剂。该实施例证明了采用便于用户的侧流测定形式、荧光标记 粒子和不放大的大面积成像快速和同时检测低水平的大肠埃希氏菌和 IL-2。
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将抗体施加于膜，制备大肠埃希氏菌O157:H7(BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目录号01-95-90) 和IL-2(Pharmingen，目录号554424)捕获线和阴性对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目录号 115-165-146)。在使用前使线干燥(至少15分钟)。将IL-2(参照实 施例3制备IL-2珠)和大肠埃希氏菌(参照实施例2制备大肠埃希 氏菌珠)的荧光珠(各2μl)加入每个条带的偶联物垫。将试验样品 (100μl大肠埃希氏菌或IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并 且加入试验条带的样品垫中。进行测定(约15分钟)后按实施例2 的方法进行成像。用Image-Pro软件分析像。
结果：该图表示采用不放大的大面积成像进行的多路侧流试验的结 果。该图表示应用了含有(从左到右)大肠埃希氏菌和IL-2、单独的 大肠埃希氏菌、单独的IL-2、以及即不含IL-2也不含大肠埃希氏菌 的样品的测试条的捕获和对照线的像。该图证明了灵敏侧流试验可以 检测同一测定中的多个靶分子。
实施例6.利用瞬时胶片检测低水平蛋白的超灵敏化学发光侧流试验
目的：该实施例证明了如何使用本发明，采用便于用户的侧流测定形 式和不放大的大面积成像快速检测低数量的病毒颗粒。在下文描述的 实验中，采用荧光标记粒子和大面积成像检测含有裂解的流感病毒稀 释液的样品。(
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将甲型流感特异性捕获线(QED，目录号1302)和对照线Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目录号 115-165-146)施加于膜而制备抗体线。在使用前使线干燥(至少15 分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗体(10μl 1.0 μg/ml原液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗 甲型流感抗体(Virostat；目录号1307)标记链亲和素标记的荧光珠 (Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F-5121)。然后离心(5000g， 10min)珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗甲型流感抗体涂覆的 荧光珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。裂解纯化的甲型流感的原 液(Advanced Biotechnologies Inc：甲型流感/PR/8/34(H1N1)，目 录号10-210-000)(Aoyagi，K.，C.Ohue，et al.(1999).J Clin Microbiol 37(6)：1802-8)，然后用PBS系列稀释。将试验样品(100 μl IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并且加入试验条带的样品 垫中。进行测定(约15分钟)后按实施例2的方法进行成像。用 Image-Pro软件分析像。
实施例7.利用瞬时胶片检测低水平蛋白的超灵敏化学发光侧流试验
目的：对超灵敏的关注点试验仍然存在未满足的需要。理想地，这些 试验是便携的，并且不需要昂贵的仪器。该实施例证明了用经济的瞬 时胶片检测、高强度化学发光标记粒子和便于用户的侧流形式检测低 水平的细胞因子蛋白IL-2。
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在几片膜上(距离 芯垫5-10mm)施加IL-2特异性捕获线(Pharmingen；目录号554424) 和对照线Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗 小鼠IgG，目录号115-165-146)而制备抗体线。在使用前使线干燥(至 少15分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗体(10μl 1.0 μg/ml原液)、生物素标记的AP(10μl mg/ml原液)和PBS(70μl) 并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗IL-2抗体(Pharmingen；目 录号554426)和生物素碱性磷酸酶(Pieree；目录号29339)标记链 亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F- 5121)。然后离心(5000g，10min)珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。 将抗IL-2抗体涂覆的AP珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。用血 清PBS系列稀释IL-2原液(Pharmingen；重组小鼠IL-2，目录号 550069)。将试验样品(100μl IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl) 混合并且加入试验条带的样品垫中。进行测定(约15分钟)后，用 化学发光检测试剂(Pierce；Lumiphos，目录号34150)浸渍条带。 短时间培养后(约5分钟)，用瞬时胶片(VWR；Polaroid Polapan Type 667，目录号GRP0617538)对条带成像。然后扫描瞬时胶片(Hewlett Packard；HP scanjet 7400c，目录号C7713A)。
结果：图10表示使用化学发光标记粒子和瞬时胶片检测的侧流试验 的结果。示出了代表性测试条的捕获和对照线。施用了含IL-2(从 左到右：0，20，200，and 2000pg/ml)的样品的测试条的比较表明随 着IL-2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。这些数据表明，本 发明可以使用瞬时胶片检测浓度低至20pg/ml的IL-2。因此，该试验 是超灵敏、迅速、容易进行并且非常昂贵。
变化形式：可以使用其它胶片(包括正常照像胶片和X线胶片)。可 以使用便宜的市售扫描仪对曝光过的胶片进行数字化，产生可以用像 分析软件分析的像。可以使用碱性磷酸酶以外的其它化学发光试剂， 如辣根过氧化物酶。可以使用许多其它的化学发光底物，包括CDP-star (Applied Biosystems；目录号T2307)或SignalSignal West Pico (Pierce；目录号34080)。也可以使用BM紫(Roche；目录号1442074) 等产生底物对比色测定进行显影。
实施例8.用于使用不放大的大面积成像检测低水平蛋白的超灵敏、不 基于膜的侧流测定
该实施例描述用本发明的一个实施方案对蛋白进行快速和超灵敏的检 测，该实施方案使用多孔的“捕获线”，而不是传统的侧流条带。该 形式使膜的消耗最少，粒子必须通过该膜进入检测区。捕获线形式具 有两个主要的优点，两者均增加了试验的灵敏度：(1)有效处理了更 大的样品体积，和(2)可以使用更大的标记粒子，该粒子具有甚至 更强的信号。
图11表示用于该实施例中的装置的构建。将样品加载到样品区中， 在此它侧流进入偶联物垫。在装置远端的吸附垫牵拉样品，溶解和固 定检测珠，该样品流经测定线。在下文描述的实验中，将IL-2的稀 释液施加到载玻片上，该载玻片包括含有IL-2的特异性荧光标记粒 子的偶联物垫、结合IL-2的捕获线和阳性对照线。
实验方法：按下文在玻璃载玻片上组装试验(见图11)。将抗体条带 施加到两片(3mm×25mm)侧流膜上(Millipore；Hi-Flow Plus，目 录号HF13502)。捕获线条带含有捕获抗体(Pharmingen；单克隆抗- IL-2，目录号554424，每8cm长的线含10μl 1mg/ml的溶液)和对 照抗体((Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素 抗小鼠IgG，目录号115-165-146，每8cm长的线含10μl 1mg/ml 的溶液)。干燥(15min)后，将线置于距离载玻片(VWR；目录号48300- 025)末端10mm(对照线)和13mm(捕获线)处。切下一片(3mm×25 mm)玻璃纤维网(Millipore；玻璃纤维偶联物垫，目录号HFMIDAK015 的部分)，置于距离载玻片末端20mm处。将一片吸附纸(50mm×25mm) 置于载玻片末端。将第二个载玻片置于捕获线、玻璃纤维和吸附纸顶 端，这样载玻片的一端直接位于玻璃纤维片上，另一端重叠在吸附纸 上。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗体(10μl 1.0μg/ml原 液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗IL-2抗 体(Pharmingen；目录号554426)标记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F-5121)。然后离心(5000g，10min) 珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗IL-2抗体涂覆的荧光珠(2μ l)加入每个测定载玻片的偶联物垫。用PBS-B系列稀释IL-2原液 (Pharmingen；重组小鼠IL-2，目录号550069)(终浓度为0，20，200 pg/ml)。将试验样品(1ml 0，20和200pg/ml的稀释液)加入试验 载玻片的加样区。进行测定(约15分钟)后按实施例2的方法进行 成像。用Image-Pro软件分析像。
结果：图12表示捕获线试验的结果。该图表示来自施用了含IL-2(0、 20和200pg/ml)的样品的试验的捕获和对照线的像。结果表明该试验 可以检测浓度为20pg/ml的IL-2。此外，捕获线的浓度依赖性斑点状 外观表明，对各个标记粒子进行了成像。
该试验采用一般加样到常规侧流装置上的样品体积的5-10倍体 积，但是该测定与在前面的实施例中进行的常规“低体积”侧流试验 基本相同的时间内完成。通过增加捕获线的长度，甚至可以分析更大 的体积。通过延长捕获线增加灵敏度的能力是本发明检测各个标记粒 子的能力的副产品。当检测各个标记粒子时，增加捕获性的长度和增 加样品体积，产生了更多信号而不增加背景(回想可以在与含有阳性 信号的区域大小相似的区域中测量相关的背景强度)。现反，增加捕 获线的大小不改进测量积分信号强度的试验，因为背景的增加与信号 的增加成比例。
实施例9.使用不放大的大面积成像和固相捕获免疫测定对蛋白分子进 行的灵敏检测
概述：在该实施例中，用不放大的大面积成像检测IL-2蛋白靶实体。 用吸附到抗体涂覆的微量滴定皿孔的表面的抗体捕获IL-2分子。然 后将涂覆了不同抗IL-2抗体的荧光粒子结合于表面固定的IL-2分 子。用不放大的大面积成像检测各个粒子：IL-2复合物。
实验设计：用生物素化的BSA(Sigma；目录号A-8549；50μl溶于 2M碳酸氢钠的200μg/m生物素化的BSA，pH10)涂覆96孔板(光 学透明的塑料底；Greiner America，Inc；目录号55896)。将板室 温下培养过夜。第二天通过向每个孔加入PBS(200μl)然后吸出而 “洗涤”孔。然后进一步用链亲和素/PBS溶液(Jackson Labs；目录 号016-000-084；50μl 100μg/ml的溶液)涂覆生物素化的BSA涂 覆的孔，并且在室温下培养过夜。第二天，按上述方法洗涤孔。然后 用生物素化的大鼠抗小鼠IL-2抗体(50μl 0.5mg/ml的溶液； Pharmingen；目录号554426)涂覆生物素：链亲和素涂覆的孔。盖 上孔，在室温下振荡3.5小时。培养后，用PBS-B(Sigma；目录号 A-7638)/0.05％triton X 100(Sigma/X-100)洗涤孔三次。然后用Block Aid(150μl；Molecular Probes；目录号B-10710)封闭孔，随后在 室温下培养40分钟。倾去Block Aid，向每个孔中加入ELISA稀释液 (50μl；Pharmingen；目录号2728KD)。用标准稀释液(Pharmingen； 目录号2708KD)以10倍增加系列稀释IL-2标准物(150pg/ml； Pharmingen；目录号27316E)，向分开的孔中加入50μl每种稀释液。 将板在室温下培养2小时。培养后向每个孔中加入抗体涂覆的红色荧 光粒子(106；Molecular probes；1μm；硫酸酯；580/605nm；目录号 F-8851)，这些粒子通过被动吸附而涂覆了大鼠抗小鼠IL-2抗体 (Pharmingen；目录号18161 D)。为将抗体被动吸附至珠的表面硫酸 基团，通过离心(5min；10，200xg；Eppendorf Centrifuge Model 5417C，Eppendorf Swinging Bucket Rotor Model A-12-11)并且重 悬粒子沉淀(1ml PBS/.15M NaCl)而重复(重复3次)洗涤粒子(62.5 μl；2％固体；Molecular Probes目录号F8851，1μm，红色荧光 (580/605))。将粒子沉淀重悬于PBS(125μl；达到浓度为1％固体)， 然后在涡旋下逐滴加入纯化的抗体(1.25nmol，达到1nmol抗体/mg粒 子的比例)。25℃在旋转下培养悬浮液2小时，然后在4℃培养过夜。 洗涤粒子(按上述方法重复3次，但离心后重悬于PBS-TB)，重悬于 PBS-TB(200μl)，旋转下培养(30分钟，25℃)。按上述方法洗涤粒 子两次，并且重悬于PBS-TB(125μl，达到浓度为1％固体)。加入被 动涂覆的珠(107)后，让孔在室温下培养1小时。用1X ELISA洗涤 溶液(200μl；来自于20X原液的稀释；目录号2605KC)洗涤板6次， 然后用水洗涤1次。通过在GPS成像仪上用Texas Red滤光器装置(色 度激发560/55nm，发射645/75nm)对红色荧光粒子成像而检测荧光。 按实施例2所述用Image-Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics) 捕获和处理来自CCD成像仪的像。使用装有同样的滤光装置的Axioplan II荧光显微镜(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)证明成像仪上检测 的阳性信号是粒子。
结果：图13表示固相捕获测定中的Il-2检测。随着IL-2的浓度 减少，抗IL-2抗体涂覆的荧光粒子(白色点)的数量也减少。与没 有IL-2的阴性对照相比，该测定的灵敏度(定义为平均阴性对照之 上两个标准差)为大约1.5pg/ml。该结果与IL-2的ELISA试验相 似。
实施例10.使用不放大的大面积成像和液相捕获对蛋白分子进行的灵 敏检测
概述：在该实施例中，如同前一实施例，用不放大的大面积成像检测 IL-2蛋白靶实体。但是，此处将IL-2分子结合于液相中的抗体涂覆 的粒子对。如同前面的实施例，一个粒子是荧光的，另一个粒子是磁 性的。用磁力将粒子：分析物复合物沉积在平面检测区中。按照前面 的方法用不放大的大面积成像对这些复合物进行成像。
实验程序：通过将带有活性甲苯磺酰基的磁性粒子偶联于抗IL-2的 单克隆抗体(大鼠抗-IL-2，Pharmingen；目录号18161 D)而制备抗IL -2磁性颗粒。在微量离心管(1.5ml)中用PB(重复3次洗涤，每次 1ml)洗涤磁性粒子(30mg/ml；100μl；Dynal，Oslo，Norway， Dynaparticles M-280 Tosylactivated目录号140.03)，采用粒子 的磁性分离，然后去除上清液(除特别指出，此实施例中的所有磁性 分离是采用Polysciences Inc.；目录号8MB4111 S的装置进行的)。 将粒子重悬于PB(70μl)。在微量离心管(1.5ml)中混合抗IL-2的 单克隆抗体(60μg；Pharmingen；目录号18161D)，短暂涡旋。旋 转下(除非特别指出，约30rpm)将反应在37℃培养20分钟。20分 钟后加入BSA(无IgG)至0.1％的终浓度，旋转下在37℃培养过夜。用 PBS-B洗涤磁性粒子2次(每次1ml，采用磁性分离)。将磁性粒子重 悬于缓冲液(补加了0.1％(w/v)BSA(无IgG)的0.2M Tris pH 8.5)， 并且旋转下在37℃培养4小时。最后，将磁性颗粒洗涤两次(在PBS-B 中，采用磁性分离)并且重悬(终浓度为PBS-B中含1％固体)。制备 磁珠后，以10倍增加系列稀释IL-2标准物(150pg/ml；Pharmingen； 目录号27316E)。向分开的1.5ml试管中将20μl每种稀释液与涂覆 了大鼠抗IL-2抗体的磁性粒子和涂覆了(见实施例9的被动吸附涂 覆)生物素标记的大鼠抗小鼠IL-2(Pharmingen；目录号554426)的 红色荧光粒子(108个粒子；Molecular Probes；1μl；硫酸酯；580/605 nm；目录号F-8851)混合。将粒子：I1-2悬浮液(120μl)与Block Aid(60μl；Molecular Probes；目录号B-10710)混合，并且超声 处理30秒(设置8,550 Sonic Dismembrator；Misonix)。超声处理 后，加入额外的Block Aid(60μl)，然后混合试管。然后在搅拌下 室温培养试管1小时。培养后，在PBS-TB中洗涤试管3次。一次洗 涤包括磁性分离将磁性粒子：IL-2荧光粒子夹心牵拉至试管的一侧， 然后吸出上清液。每次洗涤后，加入PBS-TB(50μl)。将等分物加入 光学透明的塑料底平板(Greiner America，Inc.；目录号655896)。 通过在GPS成像仪上用Texas Red滤光器装置(色度激发560/55nm， 发射645/75nm)对红色荧光粒子成像而检测荧光。按实施例2所述用 Image-Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics)捕获和处理来自CCD 成像仪的像。使用装有同样的滤光装置的Axioplan II荧光显微镜 (Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)证明成像仪上检测的阳性信号是 粒子。
结果：图14表示固相测定中的I1-2检测。随着IL-2的浓度减少， 抗IL-2抗体涂覆的荧光粒子(白色点)的数量也减少。与没有IL- 2的阴性对照相比，该测定的灵敏度(定义为平均阴性对照之上两个 标准差)为大约1.5pg/ml。
实施例11.使用不放大的大面积成像检测多种人细胞因子的免疫测定 细胞因子是细胞-细胞联系的关键介导物，并且在作为免疫应答 的基础的细胞动力学的协调中是关键的。这些蛋白的复杂组合和低浓 度是致病微环境的特征。因此，研究和临床分析中需要细胞因子的灵 敏多路检测方法。在该实施例中，用本发明构造这样的试验。在实施 例中，在不放大的条件下检测各个蛋白分子。用连接于微量滴定板孔 的抗体捕获蛋白分子，然后如实施例9所述通过结合于高强度荧光粒 子而对其进行标记。
图15描述了检验四种细胞因子的测定的示意图：粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)和肿瘤 坏死因子(TNF-α)。该实施例中开发的试验在形式上类似于前面的试 验(多路病毒检测)，只是有以下显著区别。由于蛋白分子(与病毒 不同)是该测定的靶，捕获抗体(连接于孔表面)和检测抗体(连接 于荧光粒子)必须识别靶上的不重叠表位。
涂覆荧光粒子和具有抗细胞因子的孔：按照以前的描述(Carson，R.T.， et al.，J Immunol Methods 227：41-52，1999)从商业来源获得标准 抗细胞因子抗体对(具有不重叠的表位)。
通过被动吸附使抗体在每孔的4个相邻的补体点结合于微量滴定皿 孔(每抗体1个点)。将每个抗病毒抗体点样(1μl；1μg/μl)至96 孔微量滴定板(Greiner America；目录号55896)的一个孔，并且在 湿化培养室(Boekel Slide Moat；model 240000)中室温下培养2小 时。然后洗涤孔并且按实施例9所述封闭(注意在此实施例中，还可 以将抗体的等摩尔混合物作为均相混合物结合于孔)。
按照前面实施例的描述，通过用抗细胞因子检测抗体涂覆具有不同 发射光谱的荧光染色的聚苯乙烯粒子而制备颜色编码的细胞因子特异 性荧光粒子(详述见Carson et al，1999，supra)。荧光粒子编码如 下：GM-CSF特异性粒子：黄色-绿色；IL-2特异性粒子：橙色；IL -4特异性粒子：深红色；TNF-α粒子：红外的。按照前面实施例所 述混合并且制备4中类型的抗体涂覆的粒子。如前面实施例所述，也 可以使用每种病毒的相同类型的荧光粒子。
标准曲线：建立将细胞因子的浓度与积分测定信号相关联的标准曲 线。将含有浓度为10pg/ml-10μg/ml的各个细胞因子的10倍稀释 液的样品(200μl，溶于PBS-TB；重复三份)加入含有点样的捕获抗 体的各个微量滴定皿孔。30分钟后，用PBS-TB(200μl，4X)洗涤孔。 将混合的细胞因子特异性粒子(200μl)加入孔中，并且在离心机 (Beckman Allegra 6；GH-3.8转子；1200g)短暂旋转，以便用粒子 涂覆孔的底面。在室温下温育粒子10分钟后，通过洗涤(用200μl PBS-TB洗涤3次，通过反复吸取5次而搅动每份洗涤溶液)除去未结 合的粒子。然后，确定结合于每个点的粒子的数目、颜色和累积强度。 然后按实施例2所述用CCD成像仪对孔进行成像和分析，但是用适当 的滤过装置获得多个像(黄绿色：激发色度HQ480/40x和发射色度 HQ535/50m；橙色：激发色度HQ535/50X和发射色度HG610/75m；深红 色：激发色度HQ560/55x和发射色度HQ645/75m；红外：激发色度 HQ710/75x和发射色度HQ810/90m)。通过结合的粒子所粘附的点鉴定 病毒。通过以下事实提供额外的诊断依据：如果测定成功，仅有预计 颜色的粒子粘附于特定的点。
检测未鉴定样品中的细胞因子：将含有，或可能含有细胞因子GM- CSF，IL-2，IL-4，和/或TNF-α的样品(200μl)加入含有点样的捕获 抗体的微量滴定皿孔。按上文所述处理并分析样品。通过内插比较相 应于4种细胞因子特异性捕获抗体点的定量信号建立标准曲线而估计 细胞因子的浓度。
实施例12.使用不放大的大面积成像检测总(结合的+游离的)细胞 因子IL-2的竞争性免疫测定
当靶实体不含有非重叠类目特异性结合位点(如表位)时，使用竞 争性免疫测定。对于小分子分析物如滥用的药物(如可卡因)、化学 污染物(如PCBs)、或激素(如三碘甲腺氨酸)通常如此。当靶分子 上仅有一个表位可接近抗体时，例如，当小分子蛋白激素或细胞因子 结合于并且很大程度被较大的结合蛋白或受体吞入时，竞争性免疫测 定也是有用的。
竞争性免疫测定测量靶实体的类似物的捕获，所述类似物与靶实体 不同，它具有两个不同的结合位点并且因此可以使用基本的免疫测定 程序进行测量。样品中的靶实体可以与类似物竞争捕获位点。因此， 类似物的捕获程度是样品中靶实体的浓度的函数。
该实施例描述了用本发明构造的测定，它使用竞争性免疫测定形式 检测总细胞因子IL-2(即结合的IL-2+游离的IL-2)。图16展示了 竞争性免疫测定的示意图。
IL-2的竞争性免疫测定：采用市售试剂盒(Chemicon；目录号CYT111)， 并且按照制造商推荐的方案进行IL-2的竞争性免疫测定，进行了以 下改变。试剂盒是多种导致微量滴定皿中的溶液有色的免疫测定的代 表。颜色强度表示样品中分析物的量，并且是结合的酶：抗体偶联物 的累积作用的结果。用本发明构造的试验与经典的竞争性免疫测定不 同。首先，通过与荧光链亲和素涂覆的粒子结合而对各个靶(在此情 况下是IL-2：生物素偶联物)成像。其次，通过光学透明的孔底部 对结合的荧光粒子成像，而不是从孔上对颜色改变进行分光光度测 定。尽管荧光粒子是显微水平的(约1μm)，是在不放大的条件下进 行成像的。
由于平坦的、光学透明的孔底部是各个成像结合事件需要的，因此 用适当的微量滴定板替代市售试剂盒中提供的第二抗体涂覆的板。按 照以前的描述(Coliganet al.，1994，section 6.22.1，supra)用 小鼠抗白介素-2抗体(Chemicon；#MAB1018)涂覆具有光学透明的底部 的96孔微量滴定板。
在市售试剂盒中，用链亲和素：碱性磷酸酶偶联物通过产色的碱性 磷酸酶底物的反应检测结合的IL-2：生物素偶联物。在此实施例中， 用链亲和素涂覆的荧光粒子(Molecular Probes；目录号8775；1μ m直径；荧光红色)替代链亲和素：碱性磷酸酶偶联物。
按照市售试剂盒制造商的推荐处理标准物(包含在市售试剂盒中) 和未知成分的竞争性免疫测定，具有以下例外。在具有光学透明的孔 底部的板中处理样品(见上文)。当按照制造商的方案应当加入链亲 和素：碱性磷酸酶偶联物时，加入链亲和素涂覆的荧光粒子(100μ l；PBS-T中的107粒子/ml)。然后按照实施例11所述进行测定和成 像。按照荧光粒子的光学特性(激发/发射580/605)选择用于使孔成 像的激发(色度HQ560/55x)和发射(色度HQ645/75m)滤光器。
实施例13.使用量尺形式和不放大的大面积成像灵敏检测核酸分子 概述：在此实施例中，用不放大的大面积成像检测特异性结合于亲和 素标记的荧光珠的生物素化的DNA。用简单但灵敏的量尺测定获得荧 光珠与结合于尼龙膜的生物素化λDNA的快速结合。该测定形式具有 用于关注点遗传试验的可能。
实验设计：将生物素化λDNA以10倍稀释液(1g-10pg)点样在尼 龙膜(0.2Am孔；Pall Biodyne A；目录号28152-409)上。将阴性对 照样品(1μg非生物素化λDNA)沉积在相同的滤膜上。采用紫外线 交联剂(Stratagene)将DNA交联于膜。通过用BB缓冲液(50μl)室 温下饱和膜30分钟而封闭膜。然后使膜干燥。封闭后，将膜的一端 浸入1.5ml试管中含1012亲和素涂覆的Texas red荧光珠(0.45μm； Spherotech；目录号VFP-0562-5)的溶液。通过毛细作用使溶液向膜 上移动，直到它到达峰高度，即条带长度的约3/4。将DNA点置于条 带上，以便它们在溶液的峰高度以下的适当位置。然后室温下在PBS- TB(35ml)中洗涤膜。通过联合使用CCD成像仪和适于检测红色荧光 珠的Texas Red滤光器装置(色度；激发560/55nm，发射645/75nm) 而检测荧光。用Image Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics) 捕获和处理CCD成像仪的像。通过使用装备了同样的滤光器装置的 AxioplanII荧光显微镜(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)证明成像 仪上检测的阳性信号是珠子。
结果：图17表示用不放大的大面积成像检测点中的低至约106个分子 的水平的DNA分子。含有100pg生物素化λDNA的点比含有1μg非 生物素化λDNA的阴性对照具有明显更强的信号。在图中可见预期的 剂量反应。随着点中的DNA增加，荧光珠的数量也增加(图中的白色 点)。
变化形式：该试验的一个重要的变化形式是使用特异性杂交探针作为 类目结合分子。可以按照其它实施例的描述直接或间接标记所述探 针。类似地，以此测定形式，可以开发用于测量RNA分子的特定类目 的表达的试验。
实施例14.用于对单核苷酸多态性进行基因型分析的试验
在应用(如医学和农业)和基础生物学领域，检测单核苷酸多态 性(SNPs)是一种重要的现代遗传学应用。该实施例描述了将本发明用 于建立使用均相的，不放大的形式，在导致镰状细胞贫血的常见突变 的位点测定患者的基因型的新试验。该试验使用寡核苷酸连接测定， 其中用磁性粒子标记探针之一，用荧光粒子标记另一探针。
用于寡核苷酸连接测定的标记探针：在该测定中使用寡核苷酸连接测 定，该寡核苷酸连接测定使用两个寡核苷酸部分：“恒定”寡核苷酸 和“等位基因特异性”寡核苷酸，用于对SNPs进行基因型分析。用 磁性粒子在3’末端对恒定的靶核苷酸进行标记。用荧光粒子在5’端对 等位基因特异性寡核苷酸进行标记(不同的等位基因使用不同颜色的 粒子)。将恒定寡核苷酸设计为与基因座的一条链杂交，这样寡核苷 酸的5’末端与多态性核苷酸邻近。“等位基因特异性”寡核苷酸与基 因座杂交，这样它的3’末端的核苷酸(相应于单核苷酸多态性)邻接 于恒定核苷酸的5’末端的核苷酸，前提是两者都与互补核酸链杂交。 恒定寡核苷酸
按照制造商的说明，用3’氨基修饰(Midland Certified Scientific Reagent Co.)合成恒定寡核苷酸 (p GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCGCTCTAGAACTAGTGGATC(T)50-NH2)，并且使 用多核苷酸激酶(New England Biolabs)在5’末端进行酶促磷酸化。 用5’氨基修合成镰状细胞和野生型等位基因特异性寡核苷酸NH2- (T)50CGCTCTAGAACTAGTGGATC ATGGTGCACCTGACTCCTGT和NH2- (T)50CGCTCTAGMCTAGTGGATC ATGGTGCACCTGACTCCTGA。注意寡核苷酸分 为两部分：一部分(在氨基酸修饰远端，加下划线)杂交于球蛋白基 于，另一部分(氨基修饰近端)作为间隔基或束缚物。将间隔基插入 结合于粒子(通过氨基)的寡核苷酸末端和与基因组DNA杂交的寡核 苷酸部分之间将改进杂交效率。
使寡核苷酸与粒子结合：按照前面的描述(实施例10)，使用甲苯磺 酰基将经末端氨基修饰的寡核苷酸与粒子共价连接。通过3’氨基将恒 定寡核苷酸与甲苯磺酰基活化的磁性粒子(2.8μm；Dynal；目录号 140.03)连接。通过5’氨基，将镰状细胞等位基因特异性寡核苷酸与 红色荧光粒子(200nm；Molecular Probes；目录号F-8811)连接，将 野生型等位基因特异性寡核苷酸与绿色荧光粒子(200nm；Molecular Probes；目录号F-8810)连接。连接后，洗涤并且封闭，以终浓度2％ 混合寡核苷酸涂覆的粒子。
均相寡核苷酸连接测定：从血块黄层部分纯化人DNA(Sambrook，J，et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，2001))。通过在100℃加热3分 钟而变性纯化的人基因组DNA(12μl EE中的1μg)，在冰浴上快速 冷却，然后与5μl寡核苷酸涂覆的粒子混合物和2μl 10×连接缓冲 液(New England Biolabs)混合，并且在50℃退火1小时。加入T4 DNA 连接酶(1μl 400μ/μl；New England Biolabs)，并且让连接反应 在37℃进行1小时。将阴性对照样品置于皿的另一个孔中。阴性对照 的组成与实验样品一样，只是用EE替代了人DNA。按照与实验样品相 同的方法处理阴性对照。通过加入EE(120μl)将样品稀释到200μl。 将黑色墨水(50μl；Black No.17，Pelikan，Hanover，Germany)加 入具有光学透明底部的96孔微量滴定皿(Greiner Labs；目录号665097) 的孔中。将微量滴定皿置于平坦的磁铁(Dexter Magnetics，LifeSep， 96F)上15分钟。然后轻轻将皿移至CCD成像仪上的一个位置(图3)， 成功对含有测定样品和对照的孔底部进行成像。然后按照实施例2， 用像分析软件包(image-Pro Plus software，4.1版；Media Cybernetics)分析像。阴性对照样品底部成像的绿色和红色粒子数代 表背景粒子计数。用在实验样品底部上成像的相似颜色的粒子数减去 这些数。红色粒子与绿色粒子的比值确定了镰状细胞基因座上的基因 型。如果绿色粒子(野生型等位基因)与红色粒子(突变型等位基因) 的比值大(＜90％)，该基因型是纯合的野生型。如果该比值小(＜10％)， 该基因型是纯合的镰状细胞等位基因。最后，如果该比值是大约1∶1， 该基因型是杂合的镰状细胞等位基因。
变化形式：可以引入该方案的多种变化形式。基因组DNA或细胞RNA 的扩增也可以用作模板，寡核苷酸探针在连接前与其退火。也可以使 用其它标记策略。例如，可以用半抗原(如生物素或洋地黄毒苷)替 代选择部分(实施例中的磁性粒子)，通过使用链亲和素或抗洋地黄 毒苷抗体作为捕获试剂，所述半抗原可以作为选择部分起作用(例如， 固定在表面或磁性粒子上)。类似地，信号部分可以具有一个或多个 信号传递特征(如荧光、化学发光、生物发光、无线电频率、大小等)。 如同选择部分，信号传递部分可以直接(如共价)或间接连接于等位 基因特异性寡核苷酸。例如，可以用生物素和荧光标记的链亲和素修 饰等位基因特异性寡核苷酸，生物素和荧光标记的链亲和素可以间接 结合，并且用作信号传递部分。或者，可以用标记序列涂覆信号传递 部分，如荧光粒子或选择部分，如磁性粒子，所述标记序列允许粒子 通过核酸杂交与杂交于基因组DNA的寡核苷酸上的标记互补体部分结 合。在此后一种情况下，标记是间接的，此时可以构建测定方法，其 中首先进行与基因组DNA的连接，然后将标记和/或信号传递部分与 寡核苷酸(连接的或未连接的)进行缔合。当使用可以空间或动力学 上降低连接反应效率的大的标记部分时，该方法可以是有利的。最后， 可以使用基因组或细胞RNA作为连接反应发生的模板。
实施例15.使用侧流形式和不放大的大面积成像进行不放大的多路SNP 分析
现代医学遗传学和药物基因组学的一个重要目标是迅速获得患者 的基因组图形。遗传标记可以是疾病(如乳腺癌或亨延顿氏病)的早 期预示或可以表示患者可能对哪些药物有良好的反应。单核苷酸多态 性(SNPs)是医学上重要的遗传学标记，因为它们在基因组中是充足 的，并且许多人类遗传疾病是由点突变导致的。
开发快速、高度多路和便宜的技术是应用医学遗传学的当前目标。 在该实施例中，用本发明建立具有这些属性的试验。该测定(不需要 DNA扩增)扫描人类DNA样品中3个不同基因(β球蛋白、α胰蛋白 酶和囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR))中的核苷酸多态性基因型。 技术概述.如同前面的实施例，该测定使用寡核苷酸连接测定检验SNP 等位基因。但是，在该实施例中，用侧流试验检测连接的产物。该形 式促进仅仅用单信号传递部分检测多种靶分子(在此处是SNPs)。以 此形式检测许多靶SNP等位基因的能力来自于通过它们与固定在膜上 的已知位点的不同捕获寡核苷酸的杂交而区分靶的可能。
该试验可以分成两个阶段，示于图18和图19。第一个阶段是寡核 苷酸连接测定(图18上部)。如前面的实施例，设计用于等位基因特 异性连接的寡核苷酸对与变性的基因组DNA杂交并且连接。在此测定 的第二阶段，将单链产物应用于侧流装置，其中它们遇到互补的捕获 寡核苷酸标记并且与其杂交(图18下部)。通过发射高强度化学发光 信号的结合的粒子使用CCD成像仪对各个捕获的寡核苷酸进行成像(图 19)。
寡核苷酸：在此实施例中，将核苷酸多态性的基因型分为3种基因： β球蛋白，α抗胰蛋白酶和CFTR。对每个基因座合成一组寡核苷酸， 以进行基因型分析。如前面的实施例，每组含有一个恒定寡核苷酸和 一个或多个等位基因特异性寡核苷酸。当与基因组DNA的相应链杂交 时，连接恒定寡核苷酸和与连接的核苷酸多态性互补的等位基因特异 性寡核苷酸。
按照前面实施例对寡核苷酸组进行类似的设计，但有以下不同。每 个等位基因特异性寡核苷酸分为两部分，一部分相应于基因组序列， 如前面所述。但是，在该实施例中，等位基因特异性寡核苷酸是用邻 近的独特标记序列合成的。
为促进单个反应中的多个探针的相同杂交，设计寡核苷酸使功能片 段的解链温度(Tm，见定义)与它们的互补序列基本相同。多个分成 两部分的寡核苷酸优选长度为约20个核苷酸，Tm等于60℃±2℃。 以前曾经描述过具有类似于表3中的寡核苷酸的靶突变和寡核苷酸连 接测定(Nickerson，D.A.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 87： 8923-7，1990)。
基因 靶 多态性a 等位基因特异性寡核苷酸b，c 恒定寡核苷酸b 捕获 寡核甘酸酸b，d β-球蛋白 βA CGCTCTAGAACTAGTGGATC TGGTGCACCTGACTCCTGA p GGAGAAGTCTGCCGTTACTG-b GATCCACTAGTTCTAGAGCG βB TCTCGAGGTCGACGGTATC TGGTGCACCTGACTCCTGT GATACCTTCGACCTCGAGA α1- 抗胰蛋白酶 M CATCQATACCGTCGACCTC GCTGTGCTGACCATCGACG p AGAAAGGGACTGAAGCTGCT-b GAGGTCGACGGTATCGATG Z GCAAGTTCAGCCTGGTTAAG GCTGTGCTGACCATCGACA CTTAACCAGGCTGAACTTGC CPTR non-F508 GCCTTTTGCTCACATGTTCTT CACCATTAAAGAAAATATCATCTT p TGGTGTTTCCTATGATGAATATA- b AAGAACATGTGAGCAAAAGGC F508 AAGGCGATTAAGTTGGGTAAC GGCACCATTAAAGAAAATATCAT GTTACCCAACTTAATCGCCTT
表3.用于实施例15中的核苷酸多态性基因型分析的寡核苷酸
a命名(Nickerson，et al.，1990supra)。
b以5’-3’方向写出的寡核苷酸序列；b＝生物素；p＝5’磷酸
c基因组序列加下划线；未加下划线的序列是标记序列。
d捕获寡核苷酸与等位基因特异性寡核苷酸中的标记序列部分(即等 位基因特异性寡核苷酸中未加下划线的片段)互补。
使捕获寡核苷酸与膜结合：按照以前的描述(Rule，G.S.，et al.， Clinical Chemistry 42：1206-9，1996)将捕获寡核苷酸(表3)应用 于塑料衬垫的硝酸纤维素滤膜(3μm孔径，Schleicher & Schuell) 并与其结合，但是在本实施例中，使用了多个捕获寡核苷酸。如Rule 等的描述，将第1条线应用于距离滤膜底缘1cm处。将后续的捕获寡 核苷酸线应用于3mm(离开滤膜的底缘和前面的线)间隔的平行线。 将滤膜切成0.5mm×8cm的条带(寡核苷酸线与长轴垂直)。 寡核苷酸连接测定：将寡核苷酸混合物(1nM，每种寡核苷酸)和人基 因组DNA(1μg)混合于14μl连接缓冲液(见定义)中。通过在热 循环仪(Perkin Elmer，GeneAmp PCR System 9700)中加热至95℃(3 分钟)使混合物变性，然后冷却(5％的最大下降速度)至37℃。向反 应中加入T4 DNA连接酶(1μl 400μ/μl酶；New England Biolabs； 酶浓度表示为粘附末端单位)，然后在37℃培养1小时。
终止反应，通过在热板上加热至100℃1分钟而使DNA变性。通过 浸入冰浴迅速使样品冷却至0℃，然后用HYB(见定义)稀释至150μ l。
使碱性磷酸酶与亲和素涂覆的粒子结合：用生物素化的碱性磷酸酶 (Pierce；#29339)涂覆链亲和素涂覆的粒子(0.95μm直径，Bangs Labs；#CP01 N)，使得只有最大数目约一半的碱性磷酸酶分子进行结 合。所述粒子保留了通过游离的链亲和素部分结合生物素化的靶分子 的能力。通过在每个粒子约1×104生物素化的碱性磷酸酶分子的比值 下培养链亲和素涂覆的粒子而完成部分涂覆。通过确定生物素化的碱 性磷酸酶与饱和粒子上的生物素化的碱性磷酸酶结合位点所需的粒子 的最小比值而经验确定每批粒子的比值。然后用该比值的一部分(如 1/2)涂覆粒子。生物素化的碱性磷酸酶与饱和粒子所需的粒子数是 通过用固定数目的粒子结合生物素化碱性磷酸酶的系列稀释液，通过 旋转过滤(spinX；Costar；#8161)除去游离的生物素化碱性磷酸酶， 回收粒子，并且用CDP-star(CDP-star；NEN)和X线膜发光绘图法测 量尼龙滤膜(GeneScreen；NEN)上的信号粒子的化学发光信号而确定 的。
采用前面所确定的生物素化碱性磷酸酶：粒子比(如104)，用生 物素化碱性磷酸酶部分涂覆链亲和素涂覆的粒子(2×109个粒子)。 涂覆反应(100μl)在EEN/0.1 BSA中室温下进行1小时。使用旋转 过滤(spinX；Costar；#8161)洗涤(3×500μl EEN)粒子并且收 集于EEN(200μl)中。
色谱和检测：根据Rule等的方法(1996，supra)在37℃进行色谱。 将寡核苷酸连接测定(150μl)置于10×75mm的聚苯乙烯试管中。 然后将硝酸纤维素条带置于试管中，以便条带的底部(第一个寡核苷 酸条带应用于底缘上方1cm)位于寡核苷酸连接测定溶液中。20分钟 后，从试管中取出条带，并且在HYB溶液(50℃)中洗涤3次(每次 5分钟)。用粒子(1ml EEN中的108个生物素化碱性磷酸酶涂覆的粒 子)覆盖滤膜，并且在室温下培养1小时。从滤膜上洗去游离粒子(剧 烈搅拌下用5×10ml EEN进行洗涤)。用CDP-Star(NEN)覆盖滤膜， 并且用X线胶片进行发光绘图。曝光前，用荧光带(GlogoswII Autorad Markers，Stratagene目录号420201)区别标记滤膜的角，以便曝光 的X线胶片用模板进行登记排列，该模板表示各种SNP线在滤膜上的 位置。粒子与单个捕获的SNP分子的结合所产生的化学发光信号表示 靶DNA中特定SNP基因型的存在。
其它实施方案：可以使用其它类型的标记，包括荧光和光散射标记。 类似地，可以使用多种仪器检测信号(如CCD照相机、产生检测、瞬 时胶片等)。也可以使用其它类型的基质，如不吸水的基质(如玻璃 载玻片)。也可以使用流通试验形式。该测定也可以使用微流形式(例 如使用Flow-Thru ChipTM system；Gene-logic)而不是使用侧流测 定中的吸水滤膜。在此情况下，将捕获探针固定在微型机械化的通道 壁上的可寻址的几何形状上(即已知顺序)，(连接和未连接的)寡核 苷酸探针经过该通道流通。
其它实施方案
本申请引用的所有专利，专利申请，和出版物都引入此处作为参 考。根据这里公开的本发明说明书和实施例，本发明的其它实施方案 对于本领域那些技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅仅用于举 例说明，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求来表示。适于这 里所述方法的其它实施方案的例子可在2002年9月6日提交的，名 称为“细胞和病毒的快速灵敏检测”的美国申请号10/237,010，和2002 年9月6日提交的，名称为“复制细胞的快速灵敏检测”的美国申请 号10/236,107中找到，这两篇文献也引入此处作为参考。
其它实施方案描述于权利要求书中。
图1图示了用不放大的成像检测少量铺展在大面积上的显微标记 物。图1描述的实施方案使用数字相机(CCD芯片)捕获比各个标记 粒子大很多的面积的像。CCD芯片具有光敏像素元件的阵列。来源于 检测面积中一个位置上的“正在发光”粒子的光影响CCD芯片相应位 置的像素元件。终端用户从计算机接收有关样品中粒子数的信息，而 计算机可加工从CCD芯片获得的像数据(即，受照射的像素的数量和 强度)。
为了更好理解本发明使用的原理，考虑具体的实施方案是有帮助 的。图1示出了对血样中的人蛋白细胞因子IL-2进行定量的方法。 用结合于IL-2分子上的一个位点的抗体涂覆带有光学透明底的微量 滴定皿的孔。在孔中加入一滴含有IL-2分子的血液。也向孔中加入 荧光粒子(用分子荧光素染色)。也用特异性结合于IL-2的抗体涂 覆这些颗粒(尽管这些抗体结合于与捕获抗体结合的位点不同的位 点)。血液中的IL-2分子结合荧光珠和捕获抗体，在孔底部形成“夹 心”。夹心形成的结果是荧光珠锚定于孔的底部。当不存在IL-2时， 不形成夹心，并且没有荧光珠锚定于孔的底部。血液中的IL-2越多， 被IL-2涂覆的珠越多，锚定于孔底部的珠也越多。下一个步骤是对 这些珠进行成像和计数。
用荧光素激发范围内的光照射孔底部(检测面积)，可以引发锚定 于孔底部的荧光珠发射荧光。采集粒子的荧光像，不经过放大，将发 射的光聚焦在CCD芯片的表面上。每个粒子的荧光会撞击一个像素或 一小簇像素，引起局部电信号从CCD芯片向计算机传送，并以像文件 的形式存储在计算机中。像分析软件可通过计算响应粒子所发出光的 像素簇数而计算锚定于孔底部的珠数。
本发明利用多种类型的形式，包括标记方法，类目结合分子，和 检测方法构造试验。然而，该试验有若干共有的重要特征。下面将描 述本发明很多实施方案共有的步骤和过程。
本发明的一般方法包括下列步骤：
步骤1：设计试验问题，选择样品、试验形式和类目结合分子
步骤2：制备标记粒子
步骤3：使样品中的靶分子与标记粒子结合
步骤4：选择或捕获靶分子：标记粒子复合物
步骤5：通过检测选择或捕获的靶分子：标记粒子复合物而鉴定并量 化样品中存在的靶分子
步骤1：设计试验问题，选择样品、试验形式和类目结合分子 设计试验要解答的问题是建立基于本发明的新检测方法的第一步。 工业和临床微生物学家必须解决的重要问题的一些例子列于表2。明 确的试验问题一般确定必须检验的样品类型(如环境水、尿、或药物 成品)。样品类型和体积是选择试验形式的重要参数。
表2
基于本发明的试验所回答的问题的例子 环境样品是否含有6种特殊的生物战试剂中的任何一种？ 环境样品的总病毒含量是多少？ 该患者的血液中是否含有作为脓毒症的标记的4种指定蛋白水 平？ 该患者的唾液中是否含有12种指定的滥用的药物中的任何一 种？ 临床试验中的该患者的血液中药物X的水平是多少？ 该食品中是否存在4种指定的食物传播的病原体或2种毒素中 的任何一种？ 宫颈样品中是否含有5种指定的性传播疾病病原体中的任何一 种？ 患者血液中是否含有与心脏病相关的一组12种蛋白中的任何一 种？ 患者血液中是否含有与乳腺癌相关的一组12种蛋白中的任何一 种？ 患者的DNA中是否含有与心血管疾病相关的一组12种等位基因 中的任何一种？
试验形式的选择是基于一些因素，包括样品体积、样品内容(即 存在颗粒还是细胞)、靶的类目数、操作者的技术水平、价格限制。 例子包括熟悉的侧流和微量滴定皿形式，以及新的形式。下文的实施 例中描述了多种形式。
设计了试验问题后，靶分子的类目就明确了。这些是试验检测的 分子。对于研究样品中一组小分子(如滥用的药物)或心血管疾病的 蛋白标记的试验，靶分子分别简单地是滥用的药物或蛋白标记。对于 研究样品中更复杂靶如细菌病原体或含有与白血病相关的含蛋白的白 细胞)的研究(，靶分子是靶的特征性或特异性分子。
一旦明确了靶分子的类目，选择类目结合分子。类目结合分子与 靶分子特异性结合。本发明支持多种适于不同靶分子的类目结合分 子。例如，抗体可以用作多种靶分子(如激素、糖和蛋白)的类目结 合分子。对于确定个体的基因组成，例如，可以使用DNA寡核苷酸。
步骤2：制备标记粒子
在不进行光学放大或不使用昂贵器械的情况下，本发明检测各个显 微靶分子的能力取决于以高信号强度特异性标记靶分子。标记是经由 与类目结合分子缔合使标记粒子与靶分子特异性结合而获得的。标记 粒子具有两种功能：信号产生和特异性结合。各种粒子组合物、信号 产生部分和类目结合分子都可以用于制备具有这些功能的标记粒子。
为制备结合于步骤1选择的靶分子的标记粒子，使用多种本领域技 术人员公知的方法(见，例如，Hermanson，G.，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)和下文的具体实施例)将类目 结合分子偶联于粒子。有时使用相同的一组偶联技术将信号传递部分 偶联于粒子(例如，用于酶促信号传递部分)。
使用多种类型的信号传递部分使粒子发射用于给定试验的适当类型 的强信号。例如，可以用荧光染料对聚苯乙烯珠(如1微米直径)等 微粒染色，产生强荧光粒子。可以将荧光染色的聚苯乙烯微粒(如直 径1微米)掺入几百万个荧光团信号传递部分。或者，可以将粒子偶 联于酶促信号传递部分，如碱性磷酸酶，该部分可以催化荧光、化学 发光或可见颜色的产物形成。其它类型的标记粒子包括量子点和共振 光散射粒子。这些小粒子也可以与更大的粒子复合，以增加信号强度 和信号复杂度。
本发明同时扫描多种不同靶分子类目的能力来自区别来源于不同 靶分子类目的信号的能力。本发明以两种一般途径区别靶分子类目。 其中一种方法，也被称作信号区别，是用信号传递部分标记类目结合 分子的每个类目特异性家族，这样它就具有独特的信号标志。产生并 检测大量不同信号标志的能力(即，高信号复杂度)可构造扫描靶若 干类目的试验(即，高度多路的试验)。区别靶多个类目的其它方法， 即几何区别，依赖于在检测面积的不同区中沉积不同类目的靶。可不 依赖于信号传递部分的信号标志的几何区别例如用于多路侧流试验。 几何区别在下面步骤4讨论。
本发明可利用不同类型的信号特征，包括：荧光，散射光，光偏 振，无线电波，粒度，磁场，化学发光和放射性。信号传递部分的例 子和利用各种信号特征的检测方案在下面给出。在一个信号特征内可 有多个信号传递种类。例如，如果信号特征是荧光，各种特征发射光 谱包括信号传递种类(例如，红色荧光，绿色荧光，和蓝色荧光)。 可选择性地，作为另一个例子，认为红色荧光微粒是用不同浓度的相 同荧光团染色的。荧光也是信号特征，然而在这种情况下，不同强度 的粒子构成信号特征的种类，即，荧光强度是区分一组粒子与另一组 粒子的信号特征的性质。
获得高信号复杂度对于发展扫描若干类型靶分子的试验(即，具 有高度类目复杂度的试验)很有用。
获得高信号复杂度.混合物中可区别的标记(或信号传递部分)数被 称作信号复杂度。对于高度多路的试验而言，使用具有高信号复杂度 的信号传递部分有时是有利的。可与本发明联合使用产生高信号复杂 度的3种一般方法是：(1)区别标记.(2)组合标记.和(3)比例标 记。
1.对于区别标记而言，不同探针家族中的探针是用单一信号传递 部分标记的，其可在所有其它信号传递部分存在的实验中很容易地检 测。迄今为止，很难获得高信号复杂度的区别标记。这是因为绝大多 数标记方法使用光学信号(例如，产色，荧光，化学发光)或放射性 标记。由于光学信号的光谱带宽和现有仪器可检测信号的有限范围， 可使用光学信号分辨的信号复杂度较小。例如，由于光谱重叠，具有 不同发射光谱的很多荧光团的分辨目前是不可能的。可以用于进行区 别标记的一种方法是使用微型转发器(如美国专利第6,001,571)。 每个微型转发器发射不溶的无线电波标志。因此，用微型转发器和其 它正在开发的区别标记方法进行标记有可能与本发明结合使用。
2.本发明所用获得高信号复杂度的其它方法是应用组合标记方 法。组合标记是使用相对少数的不同信号传递部分获得高信号复杂度 的技术。使用这种方法，不同组合的信号传递部分与不同的靶结合。 目前，荧光团是分子诊断学的一类有益信号传递部分。然而，由于涉 及分析多个不同荧光团的复杂情况(出现激发和发射光谱的大部分重 叠)，目前在实践中只能掺入大约7种或更少的常规荧光团。然而， 组合使用时，7种荧光团可用于产生127种不同的信号(N个荧光团 产生2N-1种组合)。高信号复杂度还可利用其它类型的信号传递部分， 经由组合标记获得。例如，用不同染料浸渗的粒子，落在不同离散大 小种类中的粒子，或发射不同无线电信号的转发器都可用于该方法 中。使用荧光团的组合标记近来已经成功用于人类的染色质组型 (Speicher等，1996，supra；Schr_ck等，1996，supra)。用于分 析组合标记实验的仪器和软件可从市场上购买。
3.高信号复杂度还可使用比例标记方法获得(Fulton等，1997， supra)。在比例标记中，就像组合标记那样，很多不同类型的信号传 递部分可使用相对少数的不同信号元件产生。然而，与组合标记相反， 比例标记中的信号传递部分是通过信号传递元件的比例区别的。例 如，两个荧光团X和Y，具有不同的激发/发射特征，可用于将聚苯乙 烯粒子染色。将不同相对浓度的荧光团([X]，[Y])用于不同的粒子 组。例如，8种不同浓度的X和8种不同浓度的Y用于将粒子染色时， 所有组合方式(X1Y1，X1Y2，X8Y7，X8Y8)产生64类可区分的粒子。比 例标记可将简化仪器，只需使用少数信号类型。除了荧光团之外，还 可使用包括非-光学信号元件的信号元件，利用比例标记方法产生高 信号复杂度。
步骤3：使样品中的靶分子与标记粒子结合
用于使样品中的靶分子与标记粒子结合的方法和形式取决于样品 类型、靶分子的性质和选择的试验形式。
本发明的一个重要特性在于它与快速和简单的样品制备过程相 容。对于很多应用来说，实际上不需要样品制备。这代表了与其它灵 敏的诊断方法，如基于核酸扩增的技术相比的主要优越性，基于核酸 扩增的技术需要更费力的样品制备程序，用于去除酶抑制剂。例如， 研究样品中的可溶分子标记的试验通常在结合标记粒子之前不需要任 何样品制备。对于一些试验，其中靶分子是更大的复合物的一部分或 螯合于更大的复合物中，更大的复合物可以作为样品制备步骤的一部 分而解离。例如，对于研究病毒核心蛋白在HIV病毒内部的存在的试 验，可以使用洗涤剂使病毒颗粒解离。例如，对于遗传分析，含有核 酸靶分子的细胞通常被打开(例如通过各种化学或物理处理)并且双 链DNA经过变性以允许核酸杂交。
本发明使用的各种形式具有允许标记粒子与样品中的靶分子快速 结合的优点。例如，使大量标记粒子与液体样品中的靶分子结合使得 碰撞比在常规ELISA形式中发生得更快，常规ELISA中靶分子一般在 能够发生碰撞之前扩散到反应室的一端。快速结合动力学也是接触发 生在多孔膜内部的试验形式(如侧流试验)的一个特征。
步骤4：选择或捕获靶分子：标记粒子复合物
选择步骤具有一些重要的功能，包括从未结合的标记粒子分离靶 分子：标记粒子复合物，使靶分子：标记粒子复合物沉积在检测区(例 如，一些实施方案的光学系统的焦面中)中，从靶分子：标记粒子复 合物去除样品材料，并且(对于某些试验形式)将标记的靶分子的特 定类目局限于检测面积的不同区域。
对于在结合步骤之前，将样品固定在固体基质上的测定法而言， 未结合的类目结合分子和信号传递部分通常通过清洗除去。实例包括 使用原位杂交和免疫细胞化学方法的应用。
其它试验形式是在液相，例如，微量滴定孔中进行的。对于一些 试验，选择步骤是经靶分子：标记粒子复合物于微量滴定孔的检测表 面上的捕获分子相结合而发生的。在这些试验中，扩散是使捕获分子 接触的手段。对于其它应用，靶分子/类目结合分子/信号传递部分复 合物沉积在表面上。使靶复合物沉积在表面上的方法包括离心，过滤， 重力沉降，磁性选择，或与表面结合的类目结合分子，例如，捕获抗 体结合。在某些情况下(例如，磁性分离)，使用不同的部分，即选 择部分。涂覆了类目特异性抗体的磁性微粒是选择部分的例子。未结 合的类目结合分子和信号传递部分通常留存在液相中，而且可除去。 如果选择过程(例如，光学成像)可选择性分析具有狭窄视野深度的 固体表面，那么有时无需除去未结合的物质(位于焦面外部)
对于一些应用，选择程序的组合是有用的。例如，可在接触标记 粒子前将样品过滤通过具有确定孔径的膜。例如，可以使用仅仅允许 大小为约0.5-5微米的粒子通过的过滤系统检测未知细菌的存在。 该试验可以基于结合于包含酪氨酸的任何蛋白的标记粒子。选择其它 大小范围可以进行未知病毒、游离蛋白或真核细胞的试验。
在关注点试验中，侧流和流通形式是可论证的最成功的试验形式。 这些形式利用吸水薄膜中毛细流的优点。它们通常使用捕获分子(如 表面-结合的类目结合分子)选择靶分子：标记粒子复合物。未结合 的标记粒子通过毛细作用流到捕获区外面。基于膜的测定法的其它重 要优点是很容易利用几何区别而成为多路。
当扫描靶分子的多个类目时，几何区别是一个重要的方法(即， 在多路试验中)。与高信号复杂度的多路试验(见步骤2)相比，几何 区别具有下列优点，即对于多路试验而言，只需要单一的信号标志。 在使用几何区别的典型免疫测定法中，不同的类目特异性捕获抗体沉 积在检测区的不同范围中(例如，侧流试验中的不同带或流通试验或 基于微量滴定孔的试验中的不同斑点)。因此，靶分子的不同类目在 捕获区的不同预定范围被捕获。与捕获抗体类似的其它类型捕获部分 包括抗原，配体，及核酸。其它形式，包括使用微流通道和使用“捕 获线”(用捕获分子涂覆的材料的细条带)的那些也可以使用几何区 分。
步骤5：通过检测选择或捕获的靶分子：标记粒子复合物而鉴定并量 化样品中存在的靶分子
该步骤使用锚定于检测区中的的靶分子：标记粒子复合物的大面积 成像分析检测、鉴定并且量化样品中的靶分子。该步骤本身一般包括 成像、像分析和报道分子产生的步骤。
本发明可以在不放大的情况下检测显微标记粒子。该有效的特征受 到高强度标记方法和高效光学的支持，以指导微集落发出的光子进入 光检测器阵列的少数像素。低放大成像促进大面积的成像，由此促进 了扫描大样品。
使用的成像方法取决于步骤2中选择的信号产生的类型。例如， 成像过程根据用于产生信号的光学特性或信号传递特征而不同。对于 某些信号特征(例如，反射、荧光、光散射或吸收)而言，检测区中 的复合物必须接受光源的照射。对于其它(例如，化学发光或热辐射) 而言，无需照射。
检测各个标记粒子是天然定量的并且是超灵敏的。可以通过人工 计数照片或数字像中的各个标记粒子或通过使用数字化图像的自动图 像分析而完成量化。也可以使用集成样品的信号强度量化靶细胞。信 号集成对含有高浓度靶细胞的样品特别有用。在这些情况下，分辨一 致的信号并不总是可能的。
解码标记粒子的标志使得能够鉴定多种靶细胞类目。该步骤的重要 目的是通过确定靶分子：标记粒子复合物的标志而鉴定样品中靶细胞 的类目。
当使用荧光作为信号特征时，基于CCD照相机的成像器，如图1 所示，是一种用于大面积成像的有效装置。这种装置用于收集下面很 多实施例的数据。激发光是通过从高强度白光源(1000W Xenon弧光 灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)将光引入到液体光导中(5mm芯直径，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)而提供的。液 体光导可将光传送给激发滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics， Hawthorne，NY)，并将滤过的光束(直径9mm或以上)对准含有标记 粒子的检测表面。该装置可检测各种构造(例如，多孔膜，显微镜载 玻片，盖玻片，或平坦、光学透明底部的试管或孔)上的标记粒子。 入射光穿透检测表面，诱导靶细胞中的荧光。所发射荧光的一部分是 由高-收集效率的透镜系统收集的，并通过发射滤器盘(BioPoint FW， Ludl Electronics)传输给CCD照相机(Orca II，Hamamatsu， Bridgewater，NJ)。光学装置的设计和构造是与本领域技术人员已知 的原理和实践为基础的。
本发明也可以结合使用其它类型的光检测器和其它构造。成像系 统的灵敏度可通过选择更灵敏的照相机(例如，冷却至低温的照相机， 或使用后面较薄的芯片的照相机)来增加。可选择性地，检测灵敏度 和分辨率可通过使用线扫描系统(例如，BT Image Array；Hamamatsu) 增加。进行线扫描时，线性CCD或光电二极管阵列(例如，1×500或 1×1000个像素)用于捕获像。一维分辨率与阵列元件数相对应，而第 二维常常通过在线性阵列下垂直移动样品载玻片而捕获。因为元件较 少，相似灵敏度的线性阵列通常比区域形式的CCD照相机要便宜。
图3所示的仪器可以经构造而使用X-Y定位平台(BioPoint XY， Ludl Electronics)在激发和收集的光学器件上移动试验样品而测量 多个样品。Image-Pro和Image-Pro附件可控制所有的仪器元件及像 的获得。滤器盘是用ScopePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)控制的，StagePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD) 操纵平台的定位，而照相机的控制是通过Hamamatsu Orca II驱动器 (Hamamatsu，Bridgewater，NJ)进行的。Image-Pro Plus也可用于 像-处理和下面所述的分析。
本发明使用白光照射的实施方案利用光谱滤器为每个荧光团提供 最佳激发峰。白光的光谱较大，可选择各种荧光团来消除发射光谱的 重叠。通常使用白光照明装置获得的斑点大小，例如，2mm-5mm，对 于大面积成像是适宜的。因为滤器更换相对简单，而且可以是自动化 的，因此白光系统非常适宜，可在使用不同荧光团组的试验中使用相 同的仪器。
图3所示系统的收集效率是通过插入由两个元件组成的、常规设 计的收集光学器件而最大化的，这两个元件是：收集物镜和聚焦元件。 收集物镜具有高收集效率(≥f#/1.2)，并输出相对准直的光束。聚焦 透镜可捕获从收集物镜输出的光，并将它聚焦在CCD的检测表面上。 光学器件被设计成两部分，从而使滤器盘插在收集透镜的路径中。对 于本发明的某些实施方案而言，例如，对于某些不需要更换滤器的实 施方案而言，它可包括一个用于获得高收集效率的锥形光纤束。光纤 束包括收集近样品光的纤维和光直接对准CCD芯片的通道。可选择性 地，本发明可利用直接近检测而非常灵敏地检测信号，其中样品直接 涂在CCD芯片上，或与CCD芯片紧密接近(对后面变薄的CCD芯片的 后面高度灵敏)。
除了白光、上述多-光谱系统之外，我们还可研制了一种更简单的 单色荧光成像系统，用于不放大的大面积成像。在图4所示的系统中， 激发光是由532nm的Frequency-Doubled Diode Laser(50mW， Model#BWT-50E，B&W Tek，Newark，DE)提供的。因为该检测是单色 的，因此无需滤器盘。单一的激发滤器可除去源于激光输出的谐波光 谱(Model HQ532/10x，色度Technology，Brattleboro，VT)，且 单一发射滤器(Model HQ620/60m，色度Technology，Brattleboro， VT)只能允许特异性荧光信号通过CCD照相机。这些系统还可使用较 之先前所述更便宜的CCD照相机(Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn， CA)来捕获像。通过插入多个激光和滤器装置，这些图中所示的仪器 很容易适合进行多色分析。
插入到本发明中的CCD照相机通常冷却至-5℃--50℃，对于具有 最小照相机干扰累积的10秒-约2分钟的积分时间(取决于照相机的 灵敏度)而言足够。通过长时间收集荧光团发射的光子，较长的积分 时间通常产生更高的灵敏度。较长的积分时间对于线扫描是不适宜 的；然而，存在着后面变薄的线性阵列，它具有非常高的量子效率， 可增加灵敏度。
本发明还可利用基于干涉仪的光谱成像检测和解译信号 (Schrock，E.，1997，supra)。使用这种技术，由信号传递部分发 射或散射的光分为两部分：通过棱镜(不同波长行进不同的距离)， 从而重组以创造干涉图样。干涉图样的Fourier分析可相对于像中的 每个点产生一个光谱。
对于包括需要便携式系统的应用的关注点应用，本发明可以经过构 造而使重量和大小达到最小。对于一些实施方案，可以完全去除仪器 (如当通过颜色检测显现标记粒子时)或很大程度简化(如，通过使 用瞬时胶片代替电子检测器)。如果需要，可以在用于数字储存和数 字像分析的商业化扫描仪中数字化收集在胶片上的像。或者，可以通 过使用近端成像在没有光学系统的条件下使用光检测器(光检测器基 本对着检测区放置)。为了最大的便携性，可以通过使用具有非照射 依赖性信号传递特征(如化学发光)的颗粒而去除光源。
对于本发明产生数字像的实施方案而言，计算机软件鉴定并且量 化靶标记粒子。对于其中使用不同类型的荧光信号传递部分的典型测 定而言，软件添加了适当的荧光团特异性像，通过确定每个靶标记粒 子发射哪一种信号标志或组合而鉴定靶细胞，并且计数样品中存在的 每个靶标记粒子类目。该软件也可以1)校正照射的不均匀性；(2) 校正通过去卷曲基质的荧光串音；(3)利用印在基质上的登记标记排 列像；(4)基于与查询表的比较，将ID码赋给样品中的每个成像标 记粒子；(5)记录用于样品鉴定的成像样品的条形码；和(6)将输 出的数据，像，和条形码自动保存在数据库中，通过网络浏览器界面 查询。市售的像分析软件包可用于提供这些功能。可使用多色像分析 软件包(例如，Image-Pro，Media Cybernetics；Metamorph，Universal Imaging，MatLab，The Mathworks)。
这里描述用于分析在下面很多实施例中收集的荧光数据的软件包 和方法。使检测表面成像，从而测定荧光物体数和/或总荧光信号。 荧光是通过CCD照相机从检测区域捕获的，并存储为TIFF(Tagged Image File Format)像文件，其中包括像素位置和强度的记录。3种 方法都可用于量化测定结果。成像检测区的总积分信号是通过计算所 有像素的荧光信号总和测定的。将样品的积分信号与阴性对照的进行 比较。测量总的积分信号对于含多个靶的样品特别有效。第2个方法 是计算检测区域中的物体数。第3个方法是将荧光物体内所含的全部 像素的强度积分(与计算像中所有像素强度的总和相反)。所有像分 析都是用Image-Prov 4.0(Media Cybernetics，Silver Springs， MD)进行的。
使用IPP Image-Pro宏语言，上述工具可同时自动批量处理若干 像。此外，还可使用其它用户自定义的IPP小型程序处理数据。例如， 可包括或排除低于或高于特定大小(面积)或强度的物体，它是用于 除尘的有效工具。其它确定物体定义(如接受和排斥标准)的用于像 分析的重要参数根据应用而不同并且应该进行相应的优化。
可以对本发明的多个方面进行自动化，包括连接上述步骤。考虑 用于分析液体样品，如用于注射的药水或临床尿样的应用。所述自动 化的系统可以自动收集样品，使它们与标记粒子接触，采用选择步骤， 获得像，分析像，并且报告结果。或者，本发明的各个功能可以自动 化。例如，用于将容器自动加样到成像仪器并且从其取出，以及用于 自动化聚焦的组件可以掺入系统。
实施例.下面的实施例为实行本发明的各种实施方案提供了技术细 节，它们可与各种应用联合使用，但不是对本发明的限制。
实施例1.使用电、瞬时胶片和无辅助的目测进行不放大的各个显微标 记粒子的检测
本发明量化低水平靶分子的能力部分在于其在不进行高度放大的 条件下检测并且计数大的检测面积中各个显微靶分子的能力。该实施 例的目的是证明本发明可以各种检测手段：CCD光检测器阵列、瞬时 胶片和简单的目测而完成。
用于这些实验的标记粒子是用抗体和碱性磷酸酶涂覆的乳胶粒 子。用分别产生化学发光或有色(紫色)产物的碱性磷酸酶的化学发 光或产色底物处理置于膜上的珠。对具有化学发光标记粒子的膜进行 电成像或用瞬时胶片成像，通过肉眼对具有产色标记粒子的膜进行成 像。
实验方法：通过向链亲和素涂覆的粒子(108个粒子；Bangs；0.95um， 非荧光；目录号CP01N)加入生物素化的碱性磷酸酶(5μl 2.9mg/ml 的原液，Pierce；目录号29339)和生物素化的山羊抗大肠埃希氏菌O157 抗体(5μl 1.0mg/ml的原液，Kirkeguard and Perry Laboratories； 目录号01-95-90)而制备涂覆了抗体和酶分子的粒子。用PBS使体 积成为100μl。培养30分钟后，洗涤粒子两次。一次洗涤包括在微 量离心机中以3000g旋转粒子5分钟，然后弃去上清液并且将粒子重 悬于PBS(100μl)中。制备双涂覆的粒子之后，将珠稀释至大约50 和500个珠。将每种稀释液和无珠对照的三份重复样品加入PBS(50 ml)，使用真空泵和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide， PF07114，Rev A 3/00)，通过0.2μm孔径的硝酸纤维素膜进行过滤。 向一组滤器中加入BM紫碱性磷酸酶底物(500μl；Roche；目录号 1442074)。将CDP-star(500μl；NEN；目录号NEL-601)加入另一组 滤器。培养1小时后，在水中洗涤BM紫膜以去除剩下的BM紫，让 膜风干。按照制造商的说明在SpotLight照相机(Boston Probes；目 录号DT10000)中封固CDP-star膜，并且曝光于ASA2000胶片(Boston Probes；目录号DT20000)两分钟。然后用不放大的大面积成像观察相 同的滤膜。用Image-Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics)从 CCD成像仪捕获像并且进行处理。
结果.图5表示可以用产色的或化学发光的信号元件检测偶联于 类目特异性结合分子和酶促信号传递部分的双功能粒子。甚至肉眼就 能够观察单个标记粒子的能力是由于每个标记粒子上的大量酶分子。 该实施例证明了本发明提供简单、便于用户、经济和不使用仪器的超 灵敏关注点试验的可能。
实施例2.用于采用不放大的大面积成像检测低数量细菌
背景和目的：该实施例证明了使用本发明，采用便于用户的侧流测定 形式和不放大的大面积成像快速检测低数量的细菌。侧流测定已经用 于诊断工业20年以上。该简单的测定依赖于抗原:抗体相互作用而 检测特定靶(或分析物)的存在。尽管简单，在大多数诊断领域，侧 流条带缺乏与ELISA免疫测定和核酸扩增方法竞争的灵敏度。
在该实施例中，将多种细菌裂解物(大肠埃希氏菌O157:H7)的 稀释液应用于包括含有标记粒子(涂覆了大肠埃希氏菌O157:H7特 异性抗体的荧光染色乳胶粒子)的偶联物垫、捕获抗体线和具有结合 于缺乏靶分子的标记粒子的捕获抗体的阳性对照线的多孔膜条带上。 进行试验后，用大面积的不放大成像对捕获和对照线进行成像。
实验方法：按照侧流试剂盒(Millipore；High Flow Mid Range Assembly Kit，目录号HFMIDAK015)上提供的说明组装侧流试验条 带。简言之，将芯、偶联物和样品垫置于侧流膜上，该膜连接于粘合 剂支持卡。通过在膜上(距离芯垫5-10mm)跨越膜条带施加两条捕 获抗体线而制备抗体线：一条是大肠埃希氏菌O157:H7(捕获线； 每8cm长的线含10μl 1mg/ml的溶液，BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目录号01-95-90)， 一条是阳性对照(对照线，每8cm长的线含10μl 1mg/ml的溶液， Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗山羊IgG，目 录号115-165-146)。在使用前使线干燥(至少15分钟)。通过混合 珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗体(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80 μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗大肠埃希氏菌O157:H7 抗体(BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories， 目录号01-95-90)标记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01 F-5121)。然后离心(5000g，10min) 珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗大肠埃希氏菌抗体涂覆的荧光 珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。用PBS系列稀释甲醛固定的大 肠埃希氏菌O157:H7细胞的原液(菌株DEC 3B，Dr.Tom Whittam， Pennsylvania State University，109细胞/ml)。然后将系列稀释液 (100μl)加入裂解液(100μl 200mM NaOH/1％SDS)并且静置3分 钟。加入PBS-B(800μl)中和裂解液。将试验样品(100μl裂解的大 肠埃希氏菌稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并且加入试验条带的样品 垫中。样品通过样品垫移动到偶联物垫，在此荧光珠整合到样品流中。 然后使样品进入试验膜，通过捕获和对照线，并且最终进入芯垫。进 行测定(约15分钟)。然后通过将条带置于基于CCD成像仪上(描述 于发明详述部分的第5步并且示于图3)而对膜进行成像，以便细菌 面对光源和CCD芯片。使用不放大的大面积成像对条带进行成像。用 Image-Pro软件分析像。
结果：图6表示用于检测细菌的侧流试验的结果。该图表示来自代表 性条带的捕获线和对照线的像。最左侧的条带表示分析不含细菌的阴 性对照样品时的结果。当阴性对照与分别含有1000和10,000个大肠 埃希氏菌的中间和右侧的条带进行比较时，很明显，随着细菌的数量 增加，来自捕获线的信号也增加。底部的柱状图表示与加入的大肠埃 希氏菌数量相关的五次重复试验的平均值的信号。标准误柱代表重复 样品信号之间的三个标准误。数据表示1000个细菌的检测限，这比 市场上出售的商业化试验灵敏10-100倍。
实施例3.用于采用不放大的大面积成像检测低水平蛋白的超灵敏侧 流试验
背景和目的：对于蛋白标记的更灵敏快速的试验仍然存在未满足的需 要。该实施例证明了使用本发明，采用便于用户的侧流测定形式、荧 光标记粒子和不放大的大面积成像快速检测低水平的蛋白(IL-2)。 由于发现了人类疾病(例如癌症和心血管疾病)的新标记，检测和量 化样品中的低水平靶分子变得更重要。
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将抗体施加于膜，制备IL-2特异性捕获线(Pharmingen，目录号 554424)和阴性对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.； 生物素抗小鼠IgG，目录号115-165-146)。在使用前使线干燥(至少 15分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗体(10μl 1.0μg/ml 原液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗IL-2 抗体(Pharmingen；目录号554426)标记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F-5121)。然后离心(5000g，10min) 珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗IL-2抗体涂覆的荧光珠(2μ l)加入每个条带的偶联物垫。用PBS系列稀释IL-2原液(Pharmingen； 重组小鼠IL-2，目录号550069)。将试验样品(100μl IL-2稀释 液)与PBS-TB(50μl)混合并且加入试验条带的样品垫中。进行测定 (约15分钟)后按实施例2的方法进行成像。用Image-Pro软件分 析像。
结果：图7表示用于检测I1-2的侧流试验的结果。该图中可见来自 代表性条带的捕获线和对照线的像。最左侧的条带表示阴性对照(无 IL-2)。当阴性对照与中间和右侧的条带，即分别含有2pg/ml和 20pg/ml IL-2的样品进行比较时，很明显，随着IL-2的量增加，来 自捕获线的信号也增加。底部的柱状图表示与加入的I1-2的量相关 的五次重复试验的平均值的信号。标准误柱代表重复样品信号之间的 三个标准误。数据表示该试验检测水平为2pg/ml的I1-2，这比市场 上出售的商业化试验灵敏10-100倍。
实施例4.用于采用不放大的大面积成像检测血清中的低水平蛋白的 超灵敏侧流试验
背景和目的：检测复杂样品中的靶分子对许多应用是重要的。该实施 例证明了使用本发明，采用便于用户的侧流测定形式和不放大的大面 积成像快速检测血清中的低水平的IL-2。在下面描述的实验中，用荧 光标记粒子检测血清中的IL-2。
实验方法：按照实施例3所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将抗体施加于膜，制备IL-2特异性捕获线(Pharmingen，单克隆抗 11-2，目录号554424)和对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目录号115-165-146)。在 使用前使线干燥(至少15分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml 原液)、抗体(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5 小时/室温)，用生物素抗IL-2抗体(Pharmingen；目录号554426)标 记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F- 5121)。然后离心(5000g，10min)珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。 将抗IL-2抗体涂覆的荧光珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。用 血清(Filzgerald Laboratories；正常山羊血清，目录号88-NG22) 系列稀释IL-2原液(Pharmingen；重组小鼠IL-2，目录号550069)。 将试验样品(100μl IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并且加 入试验条带的样品垫中。进行测定(约15分钟)后按实施例2的方 法进行成像。用Image-Pro软件分析像。
结果：该图表示用于血清中的IL-2的侧流试验的结果。在该图中可 见来自代表性测试条的捕获和对照线的像。最左侧的条表示阴性对 照。当阴性对照与中间(20pg/ml)和右侧(200pg/ml)的条进行比较时， 很明显随着IL-2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。底部的柱 状图表示与加入的IL-2量相关的5次重复试验的平均值的信号。标 准误柱表示重复信号之间的三个标准误。数据表示本发明可以检测浓 度为20pg/ml血清的IL-2，证明该测定检测甚至是复杂样品中极低水 平的靶蛋白。
实施例5.用于采用不放大的大面积成像多路检测蛋白和细菌的超灵 敏侧流试验
背景和目的：对检测一组靶分子的存在的试验的需要是常见的。其例 子是研究样品中导致性传播疾病的各种微生物、滥用的药物、各组生 物战试剂。该实施例证明了采用便于用户的侧流测定形式、荧光标记 粒子和不放大的大面积成像快速和同时检测低水平的大肠埃希氏菌和 IL-2。
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将抗体施加于膜，制备大肠埃希氏菌O157:H7(BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目录号01-95-90) 和IL-2(Pharmingen，目录号554424)捕获线和阴性对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目录号 115-165-146)。在使用前使线干燥(至少15分钟)。将IL-2(参照实 施例3制备IL-2珠)和大肠埃希氏菌(参照实施例2制备大肠埃希 氏菌珠)的荧光珠(各2μl)加入每个条带的偶联物垫。将试验样品 (100μl大肠埃希氏菌或IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并 且加入试验条带的样品垫中。进行测定(约15分钟)后按实施例2 的方法进行成像。用Image-Pro软件分析像。
结果：该图表示采用不放大的大面积成像进行的多路侧流试验的结 果。该图表示应用了含有(从左到右)大肠埃希氏菌和IL-2、单独的 大肠埃希氏菌、单独的IL-2、以及即不含IL-2也不含大肠埃希氏菌 的样品的测试条的捕获和对照线的像。该图证明了灵敏侧流试验可以 检测同一测定中的多个靶分子。
实施例6.利用瞬时胶片检测低水平蛋白的超灵敏化学发光侧流试验
目的：该实施例证明了如何使用本发明，采用便于用户的侧流测定形 式和不放大的大面积成像快速检测低数量的病毒颗粒。在下文描述的 实验中，采用荧光标记粒子和大面积成像检测含有裂解的流感病毒稀 释液的样品。(
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在距离芯垫5-10mm 处将甲型流感特异性捕获线(QED，目录号1302)和对照线Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目录号 115-165-146)施加于膜而制备抗体线。在使用前使线干燥(至少15 分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗体(10μl 1.0 μg/ml原液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗 甲型流感抗体(Virostat；目录号1307)标记链亲和素标记的荧光珠 (Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F-5121)。然后离心(5000g， 10min)珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗甲型流感抗体涂覆的 荧光珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。裂解纯化的甲型流感的原 液(Advanced Biotechnologies Inc：甲型流感/PR/8/34(H1N1)，目 录号10-210-000)(Aoyagi，K.，C.Ohue，et al.(1999).J Clin Microbiol 37(6)：1802-8)，然后用PBS系列稀释。将试验样品(100 μl IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl)混合并且加入试验条带的样品 垫中。进行测定(约15分钟)后按实施例2的方法进行成像。用 Image-Pro软件分析像。
实施例7.利用瞬时胶片检测低水平蛋白的超灵敏化学发光侧流试验
目的：对超灵敏的关注点试验仍然存在未满足的需要。理想地，这些 试验是便携的，并且不需要昂贵的仪器。该实施例证明了用经济的瞬 时胶片检测、高强度化学发光标记粒子和便于用户的侧流形式检测低 水平的细胞因子蛋白IL-2。
实验方法：按照实施例2所述组装侧流试验条带。在几片膜上(距离 芯垫5-10mm)施加IL-2特异性捕获线(Pharmingen；目录号554424) 和对照线Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗 小鼠IgG，目录号115-165-146)而制备抗体线。在使用前使线干燥(至 少15分钟)。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗体(10μl 1.0 μg/ml原液)、生物素标记的AP(10μl mg/ml原液)和PBS(70μl) 并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗IL-2抗体(Pharmingen；目 录号554426)和生物素碱性磷酸酶(Pieree；目录号29339)标记链 亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F- 5121)。然后离心(5000g，10min)珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。 将抗IL-2抗体涂覆的AP珠(2μl)加入每个条带的偶联物垫。用血 清PBS系列稀释IL-2原液(Pharmingen；重组小鼠IL-2，目录号 550069)。将试验样品(100μl IL-2稀释液)与PBS-TB(50μl) 混合并且加入试验条带的样品垫中。进行测定(约15分钟)后，用 化学发光检测试剂(Pierce；Lumiphos，目录号34150)浸渍条带。 短时间培养后(约5分钟)，用瞬时胶片(VWR；Polaroid Polapan Type 667，目录号GRP0617538)对条带成像。然后扫描瞬时胶片(Hewlett Packard；HP scanjet 7400c，目录号C7713A)。
结果：图10表示使用化学发光标记粒子和瞬时胶片检测的侧流试验 的结果。示出了代表性测试条的捕获和对照线。施用了含IL-2(从 左到右：0，20，200，and 2000pg/ml)的样品的测试条的比较表明随 着IL-2的数量增加，来自捕获线的信号也增加。这些数据表明，本 发明可以使用瞬时胶片检测浓度低至20pg/ml的IL-2。因此，该试验 是超灵敏、迅速、容易进行并且非常昂贵。
变化形式：可以使用其它胶片(包括正常照像胶片和X线胶片)。可 以使用便宜的市售扫描仪对曝光过的胶片进行数字化，产生可以用像 分析软件分析的像。可以使用碱性磷酸酶以外的其它化学发光试剂， 如辣根过氧化物酶。可以使用许多其它的化学发光底物，包括CDP-star (Applied Biosystems；目录号T2307)或SignalSignal West Pico (Pierce；目录号34080)。也可以使用BM紫(Roche；目录号1442074) 等产生底物对比色测定进行显影。
实施例8.用于使用不放大的大面积成像检测低水平蛋白的超灵敏、不 基于膜的侧流测定
该实施例描述用本发明的一个实施方案对蛋白进行快速和超灵敏的检 测，该实施方案使用多孔的“捕获线”，而不是传统的侧流条带。该 形式使膜的消耗最少，粒子必须通过该膜进入检测区。捕获线形式具 有两个主要的优点，两者均增加了试验的灵敏度：(1)有效处理了更 大的样品体积，和(2)可以使用更大的标记粒子，该粒子具有甚至 更强的信号。
图11表示用于该实施例中的装置的构建。将样品加载到样品区中， 在此它侧流进入偶联物垫。在装置远端的吸附垫牵拉样品，溶解和固 定检测珠，该样品流经测定线。在下文描述的实验中，将IL-2的稀 释液施加到载玻片上，该载玻片包括含有IL-2的特异性荧光标记粒 子的偶联物垫、结合IL-2的捕获线和阳性对照线。
实验方法：按下文在玻璃载玻片上组装试验(见图11)。将抗体条带 施加到两片(3mm×25mm)侧流膜上(Millipore；Hi-Flow Plus，目 录号HF13502)。捕获线条带含有捕获抗体(Pharmingen；单克隆抗- IL-2，目录号554424，每8cm长的线含10μl 1mg/ml的溶液)和对 照抗体((Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素 抗小鼠IgG，目录号115-165-146，每8cm长的线含10μl 1mg/ml 的溶液)。干燥(15min)后，将线置于距离载玻片(VWR；目录号48300- 025)末端10mm(对照线)和13mm(捕获线)处。切下一片(3mm×25 mm)玻璃纤维网(Millipore；玻璃纤维偶联物垫，目录号HFMIDAK015 的部分)，置于距离载玻片末端20mm处。将一片吸附纸(50mm×25mm) 置于载玻片末端。将第二个载玻片置于捕获线、玻璃纤维和吸附纸顶 端，这样载玻片的一端直接位于玻璃纤维片上，另一端重叠在吸附纸 上。通过混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗体(10μl 1.0μg/ml原 液)和PBS(80μl)并且搅拌(1.5小时/室温)，用生物素抗IL-2抗 体(Pharmingen；目录号554426)标记链亲和素标记的荧光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目录号CP01F-5121)。然后离心(5000g，10min) 珠，并且重悬于PBS-B(100μl)。将抗IL-2抗体涂覆的荧光珠(2μ l)加入每个测定载玻片的偶联物垫。用PBS-B系列稀释IL-2原液 (Pharmingen；重组小鼠IL-2，目录号550069)(终浓度为0，20，200 pg/ml)。将试验样品(1ml 0，20和200pg/ml的稀释液)加入试验 载玻片的加样区。进行测定(约15分钟)后按实施例2的方法进行 成像。用Image-Pro软件分析像。
结果：图12表示捕获线试验的结果。该图表示来自施用了含IL-2(0、 20和200pg/ml)的样品的试验的捕获和对照线的像。结果表明该试验 可以检测浓度为20pg/ml的IL-2。此外，捕获线的浓度依赖性斑点状 外观表明，对各个标记粒子进行了成像。
该试验采用一般加样到常规侧流装置上的样品体积的5-10倍体 积，但是该测定与在前面的实施例中进行的常规“低体积”侧流试验 基本相同的时间内完成。通过增加捕获线的长度，甚至可以分析更大 的体积。通过延长捕获线增加灵敏度的能力是本发明检测各个标记粒 子的能力的副产品。当检测各个标记粒子时，增加捕获性的长度和增 加样品体积，产生了更多信号而不增加背景(回想可以在与含有阳性 信号的区域大小相似的区域中测量相关的背景强度)。现反，增加捕 获线的大小不改进测量积分信号强度的试验，因为背景的增加与信号 的增加成比例。
实施例9.使用不放大的大面积成像和固相捕获免疫测定对蛋白分子进 行的灵敏检测
概述：在该实施例中，用不放大的大面积成像检测IL-2蛋白靶实体。 用吸附到抗体涂覆的微量滴定皿孔的表面的抗体捕获IL-2分子。然 后将涂覆了不同抗IL-2抗体的荧光粒子结合于表面固定的IL-2分 子。用不放大的大面积成像检测各个粒子：IL-2复合物。
实验设计：用生物素化的BSA(Sigma；目录号A-8549；50μl溶于 2M碳酸氢钠的200μg/m生物素化的BSA，pH10)涂覆96孔板(光 学透明的塑料底；Greiner America，Inc；目录号55896)。将板室 温下培养过夜。第二天通过向每个孔加入PBS(200μl)然后吸出而 “洗涤”孔。然后进一步用链亲和素/PBS溶液(Jackson Labs；目录 号016-000-084；50μl 100μg/ml的溶液)涂覆生物素化的BSA涂 覆的孔，并且在室温下培养过夜。第二天，按上述方法洗涤孔。然后 用生物素化的大鼠抗小鼠IL-2抗体(50μl 0.5mg/ml的溶液； Pharmingen；目录号554426)涂覆生物素：链亲和素涂覆的孔。盖 上孔，在室温下振荡3.5小时。培养后，用PBS-B(Sigma；目录号 A-7638)/0.05％triton X 100(Sigma/X-100)洗涤孔三次。然后用Block Aid(150μl；Molecular Probes；目录号B-10710)封闭孔，随后在 室温下培养40分钟。倾去Block Aid，向每个孔中加入ELISA稀释液 (50μl；Pharmingen；目录号2728KD)。用标准稀释液(Pharmingen； 目录号2708KD)以10倍增加系列稀释IL-2标准物(150pg/ml； Pharmingen；目录号27316E)，向分开的孔中加入50μl每种稀释液。 将板在室温下培养2小时。培养后向每个孔中加入抗体涂覆的红色荧 光粒子(106；Molecular probes；1μm；硫酸酯；580/605nm；目录号 F-8851)，这些粒子通过被动吸附而涂覆了大鼠抗小鼠IL-2抗体 (Pharmingen；目录号18161 D)。为将抗体被动吸附至珠的表面硫酸 基团，通过离心(5min；10，200xg；Eppendorf Centrifuge Model 5417C，Eppendorf Swinging Bucket Rotor Model A-12-11)并且重 悬粒子沉淀(1ml PBS/.15M NaCl)而重复(重复3次)洗涤粒子(62.5 μl；2％固体；Molecular Probes目录号F8851，1μm，红色荧光 (580/605))。将粒子沉淀重悬于PBS(125μl；达到浓度为1％固体)， 然后在涡旋下逐滴加入纯化的抗体(1.25nmol，达到1nmol抗体/mg粒 子的比例)。25℃在旋转下培养悬浮液2小时，然后在4℃培养过夜。 洗涤粒子(按上述方法重复3次，但离心后重悬于PBS-TB)，重悬于 PBS-TB(200μl)，旋转下培养(30分钟，25℃)。按上述方法洗涤粒 子两次，并且重悬于PBS-TB(125μl，达到浓度为1％固体)。加入被 动涂覆的珠(107)后，让孔在室温下培养1小时。用1X ELISA洗涤 溶液(200μl；来自于20X原液的稀释；目录号2605KC)洗涤板6次， 然后用水洗涤1次。通过在GPS成像仪上用Texas Red滤光器装置(色 度激发560/55nm，发射645/75nm)对红色荧光粒子成像而检测荧光。 按实施例2所述用Image-Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics) 捕获和处理来自CCD成像仪的像。使用装有同样的滤光装置的Axioplan II荧光显微镜(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)证明成像仪上检测 的阳性信号是粒子。
结果：图13表示固相捕获测定中的Il-2检测。随着IL-2的浓度 减少，抗IL-2抗体涂覆的荧光粒子(白色点)的数量也减少。与没 有IL-2的阴性对照相比，该测定的灵敏度(定义为平均阴性对照之 上两个标准差)为大约1.5pg/ml。该结果与IL-2的ELISA试验相 似。
实施例10.使用不放大的大面积成像和液相捕获对蛋白分子进行的灵 敏检测
概述：在该实施例中，如同前一实施例，用不放大的大面积成像检测 IL-2蛋白靶实体。但是，此处将IL-2分子结合于液相中的抗体涂覆 的粒子对。如同前面的实施例，一个粒子是荧光的，另一个粒子是磁 性的。用磁力将粒子：分析物复合物沉积在平面检测区中。按照前面 的方法用不放大的大面积成像对这些复合物进行成像。
实验程序：通过将带有活性甲苯磺酰基的磁性粒子偶联于抗IL-2的 单克隆抗体(大鼠抗-IL-2，Pharmingen；目录号18161 D)而制备抗IL -2磁性颗粒。在微量离心管(1.5ml)中用PB(重复3次洗涤，每次 1ml)洗涤磁性粒子(30mg/ml；100μl；Dynal，Oslo，Norway， Dynaparticles M-280 Tosylactivated目录号140.03)，采用粒子 的磁性分离，然后去除上清液(除特别指出，此实施例中的所有磁性 分离是采用Polysciences Inc.；目录号8MB4111 S的装置进行的)。 将粒子重悬于PB(70μl)。在微量离心管(1.5ml)中混合抗IL-2的 单克隆抗体(60μg；Pharmingen；目录号18161D)，短暂涡旋。旋 转下(除非特别指出，约30rpm)将反应在37℃培养20分钟。20分 钟后加入BSA(无IgG)至0.1％的终浓度，旋转下在37℃培养过夜。用 PBS-B洗涤磁性粒子2次(每次1ml，采用磁性分离)。将磁性粒子重 悬于缓冲液(补加了0.1％(w/v)BSA(无IgG)的0.2M Tris pH 8.5)， 并且旋转下在37℃培养4小时。最后，将磁性颗粒洗涤两次(在PBS-B 中，采用磁性分离)并且重悬(终浓度为PBS-B中含1％固体)。制备 磁珠后，以10倍增加系列稀释IL-2标准物(150pg/ml；Pharmingen； 目录号27316E)。向分开的1.5ml试管中将20μl每种稀释液与涂覆 了大鼠抗IL-2抗体的磁性粒子和涂覆了(见实施例9的被动吸附涂 覆)生物素标记的大鼠抗小鼠IL-2(Pharmingen；目录号554426)的 红色荧光粒子(108个粒子；Molecular Probes；1μl；硫酸酯；580/605 nm；目录号F-8851)混合。将粒子：I1-2悬浮液(120μl)与Block Aid(60μl；Molecular Probes；目录号B-10710)混合，并且超声 处理30秒(设置8,550 Sonic Dismembrator；Misonix)。超声处理 后，加入额外的Block Aid(60μl)，然后混合试管。然后在搅拌下 室温培养试管1小时。培养后，在PBS-TB中洗涤试管3次。一次洗 涤包括磁性分离将磁性粒子：IL-2荧光粒子夹心牵拉至试管的一侧， 然后吸出上清液。每次洗涤后，加入PBS-TB(50μl)。将等分物加入 光学透明的塑料底平板(Greiner America，Inc.；目录号655896)。 通过在GPS成像仪上用Texas Red滤光器装置(色度激发560/55nm， 发射645/75nm)对红色荧光粒子成像而检测荧光。按实施例2所述用 Image-Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics)捕获和处理来自CCD 成像仪的像。使用装有同样的滤光装置的Axioplan II荧光显微镜 (Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)证明成像仪上检测的阳性信号是 粒子。
结果：图14表示固相测定中的I1-2检测。随着IL-2的浓度减少， 抗IL-2抗体涂覆的荧光粒子(白色点)的数量也减少。与没有IL- 2的阴性对照相比，该测定的灵敏度(定义为平均阴性对照之上两个 标准差)为大约1.5pg/ml。
实施例11.使用不放大的大面积成像检测多种人细胞因子的免疫测定 细胞因子是细胞-细胞联系的关键介导物，并且在作为免疫应答 的基础的细胞动力学的协调中是关键的。这些蛋白的复杂组合和低浓 度是致病微环境的特征。因此，研究和临床分析中需要细胞因子的灵 敏多路检测方法。在该实施例中，用本发明构造这样的试验。在实施 例中，在不放大的条件下检测各个蛋白分子。用连接于微量滴定板孔 的抗体捕获蛋白分子，然后如实施例9所述通过结合于高强度荧光粒 子而对其进行标记。
图15描述了检验四种细胞因子的测定的示意图：粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)和肿瘤 坏死因子(TNF-α)。该实施例中开发的试验在形式上类似于前面的试 验(多路病毒检测)，只是有以下显著区别。由于蛋白分子(与病毒 不同)是该测定的靶，捕获抗体(连接于孔表面)和检测抗体(连接 于荧光粒子)必须识别靶上的不重叠表位。
涂覆荧光粒子和具有抗细胞因子的孔：按照以前的描述(Carson，R.T.， et al.，J Immunol Methods 227：41-52，1999)从商业来源获得标准 抗细胞因子抗体对(具有不重叠的表位)。
通过被动吸附使抗体在每孔的4个相邻的补体点结合于微量滴定皿 孔(每抗体1个点)。将每个抗病毒抗体点样(1μl；1μg/μl)至96 孔微量滴定板(Greiner America；目录号55896)的一个孔，并且在 湿化培养室(Boekel Slide Moat；model 240000)中室温下培养2小 时。然后洗涤孔并且按实施例9所述封闭(注意在此实施例中，还可 以将抗体的等摩尔混合物作为均相混合物结合于孔)。
按照前面实施例的描述，通过用抗细胞因子检测抗体涂覆具有不同 发射光谱的荧光染色的聚苯乙烯粒子而制备颜色编码的细胞因子特异 性荧光粒子(详述见Carson et al，1999，supra)。荧光粒子编码如 下：GM-CSF特异性粒子：黄色-绿色；IL-2特异性粒子：橙色；IL -4特异性粒子：深红色；TNF-α粒子：红外的。按照前面实施例所 述混合并且制备4中类型的抗体涂覆的粒子。如前面实施例所述，也 可以使用每种病毒的相同类型的荧光粒子。
标准曲线：建立将细胞因子的浓度与积分测定信号相关联的标准曲 线。将含有浓度为10pg/ml-10μg/ml的各个细胞因子的10倍稀释 液的样品(200μl，溶于PBS-TB；重复三份)加入含有点样的捕获抗 体的各个微量滴定皿孔。30分钟后，用PBS-TB(200μl，4X)洗涤孔。 将混合的细胞因子特异性粒子(200μl)加入孔中，并且在离心机 (Beckman Allegra 6；GH-3.8转子；1200g)短暂旋转，以便用粒子 涂覆孔的底面。在室温下温育粒子10分钟后，通过洗涤(用200μl PBS-TB洗涤3次，通过反复吸取5次而搅动每份洗涤溶液)除去未结 合的粒子。然后，确定结合于每个点的粒子的数目、颜色和累积强度。 然后按实施例2所述用CCD成像仪对孔进行成像和分析，但是用适当 的滤过装置获得多个像(黄绿色：激发色度HQ480/40x和发射色度 HQ535/50m；橙色：激发色度HQ535/50X和发射色度HG610/75m；深红 色：激发色度HQ560/55x和发射色度HQ645/75m；红外：激发色度 HQ710/75x和发射色度HQ810/90m)。通过结合的粒子所粘附的点鉴定 病毒。通过以下事实提供额外的诊断依据：如果测定成功，仅有预计 颜色的粒子粘附于特定的点。
检测未鉴定样品中的细胞因子：将含有，或可能含有细胞因子GM- CSF，IL-2，IL-4，和/或TNF-α的样品(200μl)加入含有点样的捕获 抗体的微量滴定皿孔。按上文所述处理并分析样品。通过内插比较相 应于4种细胞因子特异性捕获抗体点的定量信号建立标准曲线而估计 细胞因子的浓度。
实施例12.使用不放大的大面积成像检测总(结合的+游离的)细胞 因子IL-2的竞争性免疫测定
当靶实体不含有非重叠类目特异性结合位点(如表位)时，使用竞 争性免疫测定。对于小分子分析物如滥用的药物(如可卡因)、化学 污染物(如PCBs)、或激素(如三碘甲腺氨酸)通常如此。当靶分子 上仅有一个表位可接近抗体时，例如，当小分子蛋白激素或细胞因子 结合于并且很大程度被较大的结合蛋白或受体吞入时，竞争性免疫测 定也是有用的。
竞争性免疫测定测量靶实体的类似物的捕获，所述类似物与靶实体 不同，它具有两个不同的结合位点并且因此可以使用基本的免疫测定 程序进行测量。样品中的靶实体可以与类似物竞争捕获位点。因此， 类似物的捕获程度是样品中靶实体的浓度的函数。
该实施例描述了用本发明构造的测定，它使用竞争性免疫测定形式 检测总细胞因子IL-2(即结合的IL-2+游离的IL-2)。图16展示了 竞争性免疫测定的示意图。
IL-2的竞争性免疫测定：采用市售试剂盒(Chemicon；目录号CYT111)， 并且按照制造商推荐的方案进行IL-2的竞争性免疫测定，进行了以 下改变。试剂盒是多种导致微量滴定皿中的溶液有色的免疫测定的代 表。颜色强度表示样品中分析物的量，并且是结合的酶：抗体偶联物 的累积作用的结果。用本发明构造的试验与经典的竞争性免疫测定不 同。首先，通过与荧光链亲和素涂覆的粒子结合而对各个靶(在此情 况下是IL-2：生物素偶联物)成像。其次，通过光学透明的孔底部 对结合的荧光粒子成像，而不是从孔上对颜色改变进行分光光度测 定。尽管荧光粒子是显微水平的(约1μm)，是在不放大的条件下进 行成像的。
由于平坦的、光学透明的孔底部是各个成像结合事件需要的，因此 用适当的微量滴定板替代市售试剂盒中提供的第二抗体涂覆的板。按 照以前的描述(Coliganet al.，1994，section 6.22.1，supra)用 小鼠抗白介素-2抗体(Chemicon；#MAB1018)涂覆具有光学透明的底部 的96孔微量滴定板。
在市售试剂盒中，用链亲和素：碱性磷酸酶偶联物通过产色的碱性 磷酸酶底物的反应检测结合的IL-2：生物素偶联物。在此实施例中， 用链亲和素涂覆的荧光粒子(Molecular Probes；目录号8775；1μ m直径；荧光红色)替代链亲和素：碱性磷酸酶偶联物。
按照市售试剂盒制造商的推荐处理标准物(包含在市售试剂盒中) 和未知成分的竞争性免疫测定，具有以下例外。在具有光学透明的孔 底部的板中处理样品(见上文)。当按照制造商的方案应当加入链亲 和素：碱性磷酸酶偶联物时，加入链亲和素涂覆的荧光粒子(100μ l；PBS-T中的107粒子/ml)。然后按照实施例11所述进行测定和成 像。按照荧光粒子的光学特性(激发/发射580/605)选择用于使孔成 像的激发(色度HQ560/55x)和发射(色度HQ645/75m)滤光器。
实施例13.使用量尺形式和不放大的大面积成像灵敏检测核酸分子 概述：在此实施例中，用不放大的大面积成像检测特异性结合于亲和 素标记的荧光珠的生物素化的DNA。用简单但灵敏的量尺测定获得荧 光珠与结合于尼龙膜的生物素化λDNA的快速结合。该测定形式具有 用于关注点遗传试验的可能。
实验设计：将生物素化λDNA以10倍稀释液(1g-10pg)点样在尼 龙膜(0.2Am孔；Pall Biodyne A；目录号28152-409)上。将阴性对 照样品(1μg非生物素化λDNA)沉积在相同的滤膜上。采用紫外线 交联剂(Stratagene)将DNA交联于膜。通过用BB缓冲液(50μl)室 温下饱和膜30分钟而封闭膜。然后使膜干燥。封闭后，将膜的一端 浸入1.5ml试管中含1012亲和素涂覆的Texas red荧光珠(0.45μm； Spherotech；目录号VFP-0562-5)的溶液。通过毛细作用使溶液向膜 上移动，直到它到达峰高度，即条带长度的约3/4。将DNA点置于条 带上，以便它们在溶液的峰高度以下的适当位置。然后室温下在PBS- TB(35ml)中洗涤膜。通过联合使用CCD成像仪和适于检测红色荧光 珠的Texas Red滤光器装置(色度；激发560/55nm，发射645/75nm) 而检测荧光。用Image Pro Plus软件，4.1版(Media cybernetics) 捕获和处理CCD成像仪的像。通过使用装备了同样的滤光器装置的 AxioplanII荧光显微镜(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)证明成像 仪上检测的阳性信号是珠子。
结果：图17表示用不放大的大面积成像检测点中的低至约106个分子 的水平的DNA分子。含有100pg生物素化λDNA的点比含有1μg非 生物素化λDNA的阴性对照具有明显更强的信号。在图中可见预期的 剂量反应。随着点中的DNA增加，荧光珠的数量也增加(图中的白色 点)。
变化形式：该试验的一个重要的变化形式是使用特异性杂交探针作为 类目结合分子。可以按照其它实施例的描述直接或间接标记所述探 针。类似地，以此测定形式，可以开发用于测量RNA分子的特定类目 的表达的试验。
实施例14.用于对单核苷酸多态性进行基因型分析的试验
在应用(如医学和农业)和基础生物学领域，检测单核苷酸多态 性(SNPs)是一种重要的现代遗传学应用。该实施例描述了将本发明用 于建立使用均相的，不放大的形式，在导致镰状细胞贫血的常见突变 的位点测定患者的基因型的新试验。该试验使用寡核苷酸连接测定， 其中用磁性粒子标记探针之一，用荧光粒子标记另一探针。
用于寡核苷酸连接测定的标记探针：在该测定中使用寡核苷酸连接测 定，该寡核苷酸连接测定使用两个寡核苷酸部分：“恒定”寡核苷酸 和“等位基因特异性”寡核苷酸，用于对SNPs进行基因型分析。用 磁性粒子在3’末端对恒定的靶核苷酸进行标记。用荧光粒子在5’端对 等位基因特异性寡核苷酸进行标记(不同的等位基因使用不同颜色的 粒子)。将恒定寡核苷酸设计为与基因座的一条链杂交，这样寡核苷 酸的5’末端与多态性核苷酸邻近。“等位基因特异性”寡核苷酸与基 因座杂交，这样它的3’末端的核苷酸(相应于单核苷酸多态性)邻接 于恒定核苷酸的5’末端的核苷酸，前提是两者都与互补核酸链杂交。 恒定寡核苷酸
按照制造商的说明，用3’氨基修饰(Midland Certified Scientific Reagent Co.)合成恒定寡核苷酸 (p GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCGCTCTAGAACTAGTGGATC(T)50-NH2)，并且使 用多核苷酸激酶(New England Biolabs)在5’末端进行酶促磷酸化。 用5’氨基修合成镰状细胞和野生型等位基因特异性寡核苷酸NH2- (T)50CGCTCTAGAACTAGTGGATC ATGGTGCACCTGACTCCTGT和NH2- (T)50CGCTCTAGMCTAGTGGATC ATGGTGCACCTGACTCCTGA。注意寡核苷酸分 为两部分：一部分(在氨基酸修饰远端，加下划线)杂交于球蛋白基 于，另一部分(氨基修饰近端)作为间隔基或束缚物。将间隔基插入 结合于粒子(通过氨基)的寡核苷酸末端和与基因组DNA杂交的寡核 苷酸部分之间将改进杂交效率。
使寡核苷酸与粒子结合：按照前面的描述(实施例10)，使用甲苯磺 酰基将经末端氨基修饰的寡核苷酸与粒子共价连接。通过3’氨基将恒 定寡核苷酸与甲苯磺酰基活化的磁性粒子(2.8μm；Dynal；目录号 140.03)连接。通过5’氨基，将镰状细胞等位基因特异性寡核苷酸与 红色荧光粒子(200nm；Molecular Probes；目录号F-8811)连接，将 野生型等位基因特异性寡核苷酸与绿色荧光粒子(200nm；Molecular Probes；目录号F-8810)连接。连接后，洗涤并且封闭，以终浓度2％ 混合寡核苷酸涂覆的粒子。
均相寡核苷酸连接测定：从血块黄层部分纯化人DNA(Sambrook，J，et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，2001))。通过在100℃加热3分 钟而变性纯化的人基因组DNA(12μl EE中的1μg)，在冰浴上快速 冷却，然后与5μl寡核苷酸涂覆的粒子混合物和2μl 10×连接缓冲 液(New England Biolabs)混合，并且在50℃退火1小时。加入T4 DNA 连接酶(1μl 400μ/μl；New England Biolabs)，并且让连接反应 在37℃进行1小时。将阴性对照样品置于皿的另一个孔中。阴性对照 的组成与实验样品一样，只是用EE替代了人DNA。按照与实验样品相 同的方法处理阴性对照。通过加入EE(120μl)将样品稀释到200μl。 将黑色墨水(50μl；Black No.17，Pelikan，Hanover，Germany)加 入具有光学透明底部的96孔微量滴定皿(Greiner Labs；目录号665097) 的孔中。将微量滴定皿置于平坦的磁铁(Dexter Magnetics，LifeSep， 96F)上15分钟。然后轻轻将皿移至CCD成像仪上的一个位置(图3)， 成功对含有测定样品和对照的孔底部进行成像。然后按照实施例2， 用像分析软件包(image-Pro Plus software，4.1版；Media Cybernetics)分析像。阴性对照样品底部成像的绿色和红色粒子数代 表背景粒子计数。用在实验样品底部上成像的相似颜色的粒子数减去 这些数。红色粒子与绿色粒子的比值确定了镰状细胞基因座上的基因 型。如果绿色粒子(野生型等位基因)与红色粒子(突变型等位基因) 的比值大(＜90％)，该基因型是纯合的野生型。如果该比值小(＜10％)， 该基因型是纯合的镰状细胞等位基因。最后，如果该比值是大约1∶1， 该基因型是杂合的镰状细胞等位基因。
变化形式：可以引入该方案的多种变化形式。基因组DNA或细胞RNA 的扩增也可以用作模板，寡核苷酸探针在连接前与其退火。也可以使 用其它标记策略。例如，可以用半抗原(如生物素或洋地黄毒苷)替 代选择部分(实施例中的磁性粒子)，通过使用链亲和素或抗洋地黄 毒苷抗体作为捕获试剂，所述半抗原可以作为选择部分起作用(例如， 固定在表面或磁性粒子上)。类似地，信号部分可以具有一个或多个 信号传递特征(如荧光、化学发光、生物发光、无线电频率、大小等)。 如同选择部分，信号传递部分可以直接(如共价)或间接连接于等位 基因特异性寡核苷酸。例如，可以用生物素和荧光标记的链亲和素修 饰等位基因特异性寡核苷酸，生物素和荧光标记的链亲和素可以间接 结合，并且用作信号传递部分。或者，可以用标记序列涂覆信号传递 部分，如荧光粒子或选择部分，如磁性粒子，所述标记序列允许粒子 通过核酸杂交与杂交于基因组DNA的寡核苷酸上的标记互补体部分结 合。在此后一种情况下，标记是间接的，此时可以构建测定方法，其 中首先进行与基因组DNA的连接，然后将标记和/或信号传递部分与 寡核苷酸(连接的或未连接的)进行缔合。当使用可以空间或动力学 上降低连接反应效率的大的标记部分时，该方法可以是有利的。最后， 可以使用基因组或细胞RNA作为连接反应发生的模板。
实施例15.使用侧流形式和不放大的大面积成像进行不放大的多路SNP 分析
现代医学遗传学和药物基因组学的一个重要目标是迅速获得患者 的基因组图形。遗传标记可以是疾病(如乳腺癌或亨延顿氏病)的早 期预示或可以表示患者可能对哪些药物有良好的反应。单核苷酸多态 性(SNPs)是医学上重要的遗传学标记，因为它们在基因组中是充足 的，并且许多人类遗传疾病是由点突变导致的。
开发快速、高度多路和便宜的技术是应用医学遗传学的当前目标。 在该实施例中，用本发明建立具有这些属性的试验。该测定(不需要 DNA扩增)扫描人类DNA样品中3个不同基因(β球蛋白、α胰蛋白 酶和囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR))中的核苷酸多态性基因型。 技术概述.如同前面的实施例，该测定使用寡核苷酸连接测定检验SNP 等位基因。但是，在该实施例中，用侧流试验检测连接的产物。该形 式促进仅仅用单信号传递部分检测多种靶分子(在此处是SNPs)。以 此形式检测许多靶SNP等位基因的能力来自于通过它们与固定在膜上 的已知位点的不同捕获寡核苷酸的杂交而区分靶的可能。
该试验可以分成两个阶段，示于图18和图19。第一个阶段是寡核 苷酸连接测定(图18上部)。如前面的实施例，设计用于等位基因特 异性连接的寡核苷酸对与变性的基因组DNA杂交并且连接。在此测定 的第二阶段，将单链产物应用于侧流装置，其中它们遇到互补的捕获 寡核苷酸标记并且与其杂交(图18下部)。通过发射高强度化学发光 信号的结合的粒子使用CCD成像仪对各个捕获的寡核苷酸进行成像(图 19)。
寡核苷酸：在此实施例中，将核苷酸多态性的基因型分为3种基因： β球蛋白，α抗胰蛋白酶和CFTR。对每个基因座合成一组寡核苷酸， 以进行基因型分析。如前面的实施例，每组含有一个恒定寡核苷酸和 一个或多个等位基因特异性寡核苷酸。当与基因组DNA的相应链杂交 时，连接恒定寡核苷酸和与连接的核苷酸多态性互补的等位基因特异 性寡核苷酸。
按照前面实施例对寡核苷酸组进行类似的设计，但有以下不同。每 个等位基因特异性寡核苷酸分为两部分，一部分相应于基因组序列， 如前面所述。但是，在该实施例中，等位基因特异性寡核苷酸是用邻 近的独特标记序列合成的。
为促进单个反应中的多个探针的相同杂交，设计寡核苷酸使功能片 段的解链温度(Tm，见定义)与它们的互补序列基本相同。多个分成 两部分的寡核苷酸优选长度为约20个核苷酸，Tm等于60℃±2℃。 以前曾经描述过具有类似于表3中的寡核苷酸的靶突变和寡核苷酸连 接测定(Nickerson，D.A.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 87： 8923-7，1990)。
基因 靶 多态性a 等位基因特异性寡核苷酸b，c 恒定寡核苷酸b 捕获 寡核甘酸酸b，d β-球蛋白 βA CGCTCTAGAACTAGTGGATC TGGTGCACCTGACTCCTGA p GGAGAAGTCTGCCGTTACTG-b GATCCACTAGTTCTAGAGCG βB TCTCGAGGTCGACGGTATC TGGTGCACCTGACTCCTGT GATACCTTCGACCTCGAGA α1- 抗胰蛋白酶 M CATCQATACCGTCGACCTC GCTGTGCTGACCATCGACG p AGAAAGGGACTGAAGCTGCT-b GAGGTCGACGGTATCGATG Z GCAAGTTCAGCCTGGTTAAG GCTGTGCTGACCATCGACA CTTAACCAGGCTGAACTTGC CPTR non-F508 GCCTTTTGCTCACATGTTCTT CACCATTAAAGAAAATATCATCTT p TGGTGTTTCCTATGATGAATATA- b AAGAACATGTGAGCAAAAGGC F508 AAGGCGATTAAGTTGGGTAAC GGCACCATTAAAGAAAATATCAT GTTACCCAACTTAATCGCCTT
表3.用于实施例15中的核苷酸多态性基因型分析的寡核苷酸
a命名(Nickerson，et al.，1990supra)。
b以5’-3’方向写出的寡核苷酸序列；b＝生物素；p＝5’磷酸
c基因组序列加下划线；未加下划线的序列是标记序列。
d捕获寡核苷酸与等位基因特异性寡核苷酸中的标记序列部分(即等 位基因特异性寡核苷酸中未加下划线的片段)互补。
使捕获寡核苷酸与膜结合：按照以前的描述(Rule，G.S.，et al.， Clinical Chemistry 42：1206-9，1996)将捕获寡核苷酸(表3)应用 于塑料衬垫的硝酸纤维素滤膜(3μm孔径，Schleicher & Schuell) 并与其结合，但是在本实施例中，使用了多个捕获寡核苷酸。如Rule 等的描述，将第1条线应用于距离滤膜底缘1cm处。将后续的捕获寡 核苷酸线应用于3mm(离开滤膜的底缘和前面的线)间隔的平行线。 将滤膜切成0.5mm×8cm的条带(寡核苷酸线与长轴垂直)。 寡核苷酸连接测定：将寡核苷酸混合物(1nM，每种寡核苷酸)和人基 因组DNA(1μg)混合于14μl连接缓冲液(见定义)中。通过在热 循环仪(Perkin Elmer，GeneAmp PCR System 9700)中加热至95℃(3 分钟)使混合物变性，然后冷却(5％的最大下降速度)至37℃。向反 应中加入T4 DNA连接酶(1μl 400μ/μl酶；New England Biolabs； 酶浓度表示为粘附末端单位)，然后在37℃培养1小时。
终止反应，通过在热板上加热至100℃1分钟而使DNA变性。通过 浸入冰浴迅速使样品冷却至0℃，然后用HYB(见定义)稀释至150μ l。
使碱性磷酸酶与亲和素涂覆的粒子结合：用生物素化的碱性磷酸酶 (Pierce；#29339)涂覆链亲和素涂覆的粒子(0.95μm直径，Bangs Labs；#CP01 N)，使得只有最大数目约一半的碱性磷酸酶分子进行结 合。所述粒子保留了通过游离的链亲和素部分结合生物素化的靶分子 的能力。通过在每个粒子约1×104生物素化的碱性磷酸酶分子的比值 下培养链亲和素涂覆的粒子而完成部分涂覆。通过确定生物素化的碱 性磷酸酶与饱和粒子上的生物素化的碱性磷酸酶结合位点所需的粒子 的最小比值而经验确定每批粒子的比值。然后用该比值的一部分(如 1/2)涂覆粒子。生物素化的碱性磷酸酶与饱和粒子所需的粒子数是 通过用固定数目的粒子结合生物素化碱性磷酸酶的系列稀释液，通过 旋转过滤(spinX；Costar；#8161)除去游离的生物素化碱性磷酸酶， 回收粒子，并且用CDP-star(CDP-star；NEN)和X线膜发光绘图法测 量尼龙滤膜(GeneScreen；NEN)上的信号粒子的化学发光信号而确定 的。
采用前面所确定的生物素化碱性磷酸酶：粒子比(如104)，用生 物素化碱性磷酸酶部分涂覆链亲和素涂覆的粒子(2×109个粒子)。 涂覆反应(100μl)在EEN/0.1 BSA中室温下进行1小时。使用旋转 过滤(spinX；Costar；#8161)洗涤(3×500μl EEN)粒子并且收 集于EEN(200μl)中。
色谱和检测：根据Rule等的方法(1996，supra)在37℃进行色谱。 将寡核苷酸连接测定(150μl)置于10×75mm的聚苯乙烯试管中。 然后将硝酸纤维素条带置于试管中，以便条带的底部(第一个寡核苷 酸条带应用于底缘上方1cm)位于寡核苷酸连接测定溶液中。20分钟 后，从试管中取出条带，并且在HYB溶液(50℃)中洗涤3次(每次 5分钟)。用粒子(1ml EEN中的108个生物素化碱性磷酸酶涂覆的粒 子)覆盖滤膜，并且在室温下培养1小时。从滤膜上洗去游离粒子(剧 烈搅拌下用5×10ml EEN进行洗涤)。用CDP-Star(NEN)覆盖滤膜， 并且用X线胶片进行发光绘图。曝光前，用荧光带(GlogoswII Autorad Markers，Stratagene目录号420201)区别标记滤膜的角，以便曝光 的X线胶片用模板进行登记排列，该模板表示各种SNP线在滤膜上的 位置。粒子与单个捕获的SNP分子的结合所产生的化学发光信号表示 靶DNA中特定SNP基因型的存在。
其它实施方案：可以使用其它类型的标记，包括荧光和光散射标记。 类似地，可以使用多种仪器检测信号(如CCD照相机、产生检测、瞬 时胶片等)。也可以使用其它类型的基质，如不吸水的基质(如玻璃 载玻片)。也可以使用流通试验形式。该测定也可以使用微流形式(例 如使用Flow-Thru ChipTM system；Gene-logic)而不是使用侧流测 定中的吸水滤膜。在此情况下，将捕获探针固定在微型机械化的通道 壁上的可寻址的几何形状上(即已知顺序)，(连接和未连接的)寡核 苷酸探针经过该通道流通。
其它实施方案
本申请引用的所有专利，专利申请，和出版物都引入此处作为参 考。根据这里公开的本发明说明书和实施例，本发明的其它实施方案 对于本领域那些技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅仅用于举 例说明，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求来表示。适于这 里所述方法的其它实施方案的例子可在2002年9月6日提交的，名 称为“细胞和病毒的快速灵敏检测”的美国申请号10/237,010，和2002 年9月6日提交的，名称为“复制细胞的快速灵敏检测”的美国申请 号10/236,107中找到，这两篇文献也引入此处作为参考。
其它实施方案描述于权利要求书中。
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