用于分析物定量的中子编码质量标签
阅读：375发布：2021-03-15
专利汇可以提供用于分析物定量的中子编码质量标签专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供质谱方法、组合物和系统，其使得能够实现用于达到了非常高度的多路复用和精确定量的分析物定量的独特平台，特别适合于用于 蛋白质 组学应用的一系列定量分析。本方法和系统的实施方案将特征为分子量差异非常小的同位素编码 试剂 与提供高 分辨率 的质谱法结合起来，以提供在大量样品中的相对或绝对分析物定量。，下面是用于分析物定量的中子编码质量标签专利的具体信息内容。
1.一种用于确定多个样品中分析物的丰度的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包括至少第一细胞培养物和第二细胞培养物的多个细胞培养物；
(b)向每种所述细胞培养物提供不同的同位素标记的氨基酸，其中各同位素标记的氨
基酸包含至少两个稳定的重同位素，其在正常氨基酸中被替换为轻同位素，并且其中所述两个重同位素中至少一个选自15N、18O和34S，其中每种所述细胞培养物的所述同位素标记的氨基酸是相同氨基酸的同位素体；
(c)培养每种所述细胞培养物的细胞，从而将不同的同位素标记物引入每种细胞培养
物产生的蛋白质中；
(d)生成每种所述细胞培养物的样品，其中每种样品的特征在于不同的同位素标记的
分析物，所述样品至少包括具有第一同位素标记的分析物的所述第一细胞培养物的第一样品和具有第二同位素标记的分析物的所述第二细胞培养物的第二样品，其中每种样品的所述同位素标记的分析物是同位素体；且其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量差异小于或等于300mDa；
(e)利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标
记的分析物，从而产生每种样品的所述同位素标记的分析物的独立且可区分的质谱信号；
以及
(f)比较每种样品的所述同位素标记的分析物的所述质谱信号，从而确定所述多个样
品中所述分析物的丰度。
2.一种用于确定多个样品中分析物的丰度的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供每种均含有所述分析物的所述多个样品，其至少包括第一样品和第二样品；
(b)向每种样品提供不同的同位素标记试剂，其中各同位素标记试剂包含至少两个稳
定的重同位素，其在对应的未标记试剂中被替换为轻同位素，并且其中所述两个重同位素中至少一个选自15N、18O和34S，其中每种所述样品的所述同位素标记试剂是同位素体，并且其中所述同位素标记试剂不是具有报告基团和质量平衡基团的等量异位标签；
(c)使所述分析物和每种样品的同位素标记试剂发生化学反应，从而生成每种样品的
不同的同位素标记的分析物，包括所述第一样品的第一同位素标记的分析物和所述第二样品的第二同位素标记的分析物；其中每种样品的所述同位素标记的分析物是同位素体；并且其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量差异小于或等于300mDa；
(d)利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标
记的分析物，从而产生每种样品的同位素标记的分析物的独立且可区分的质谱信号；以及(e)比较每种样品的同位素标记的分析物的所述质谱信号，从而确定所述多个样品中
所述分析物的丰度。
3.权利要求1或2的方法，其中所述样品的同位素标记的分析物不包括具有报告基团和
质量平衡基团的等量异位质量标签。
4.权利要求1或2的方法，其中使用单级质谱技术进行所述分析每种样品的所述同位素
标记的分析物的步骤。
5.权利要求1或2的方法，其中所述使用所述质谱分析技术分析每种样品的所述同位素
标记的分析物的步骤包括：
从每种样品的每种所述同位素标记的分析物生成离子；
将所述离子碎片化，以生成每种样品的具有不同同位素标记物的产物离子；以及
检测每种样品的所述产物离子。
6.权利要求5的方法，其中所述产物离子是具有所述同位素标记的肽碎片离子。
7.权利要求5的方法，其中检测所述产物离子而不进行对所述产物离子的进一步质量
选择或碎片化。
8.权利要求1或2的方法，其中所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤不
x
是使用MS多级质谱法进行的，其中x大于或等于2。
9.权利要求1或2的方法，其中所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤是
使用MSx多级质谱法进行的，其中x大于或等于2。
10.权利要求1的方法，其中所述向每种所述细胞培养物提供所述不同的同位素标记的
氨基酸的步骤包括向每种所述细胞培养物提供包含所述同位素标记的氨基酸的生长培养基。
11.权利要求1的方法，其中通过将所述同位素标记的氨基酸代谢掺入至所述细胞培养
物的细胞中，实现将不同的同位素标记引入至每种细胞培养物生成的蛋白质中。
12.权利要求1的方法，其中所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括裂解每种
所述细胞培养物的细胞。
13.权利要求1的方法，其中所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括提取每种
所述细胞培养物的蛋白质。
14.权利要求1的方法，其中所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括消化每种
所述细胞培养物的蛋白质。
15.权利要求14的方法，其中使用胰蛋白酶或Endo LysC消化所述样品。
16.权利要求1或2的方法，其中所述分析每种样品中所述同位素标记的分析物的步骤
包括分辨所述同位素标记的分析物的分子质量的差异。
17.权利要求1或2的方法，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记
的分析物的分子质量的差异小于或等于100mDa。
18.权利要求1或2的方法，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记
的分析物的分子质量的差异小于或等于50mDa。
19.权利要求1或2的方法，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记
的分析物的分子质量的差异大于或等于10mDa。
20.权利要求1或2的方法，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记
的分析物的分子质量的差异选自100mDa至1mDa的范围。
21.权利要求1或2的方法，其中每种所述同位素标记的分析物具有在另一所述同位素
标记的分析物的50mDa至1mDa内的分子质量。
22.权利要求1或2的方法，其中每种所述同位素标记的分析物的分子质量在10000mDa
至10mDa的范围内。
23.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的氨基酸或同位素标记试剂具有的稳
定重同位素的数目选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
24.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的氨基酸或同位素标记试剂具有的稳
定重同位素的数目等于或大于4。
25.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的氨基酸或同位素标记试剂选自：
具有至少一个15N同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个13C同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个18O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂；以及
具有至少一个2H同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
26.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的氨基酸或同位素标记试剂选自：
具有至少一个13C同位素和至少一个15N同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个13C同位素和至少一个18O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个13C同位素和一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
15
具有至少两个 N同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个15N同位素和至少一个2H同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个15N同位素和至少一个18O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
2 18
具有至少一个H同位素和至少一个 O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个2H同位素和至少一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少两个18O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个18O同位素和至少一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至少一个2H同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至少一个18O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂；以及
具有至少一个18O同位素、至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂。
27.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的氨基酸或同位素标记试剂选自：
具有1、2、3或4个15N同位素的氨基酸或同位素标记试剂；
具有1或2个18O同位素的氨基酸或同位素标记试剂；以及
具有1个34S同位素的氨基酸或同位素标记试剂。
28.权利要求1的方法，其中所述同位素标记的氨基酸是天然存在的氨基酸的同位素
体。
29.权利要求1的方法，其中所述同位素标记的氨基酸是丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸或精氨酸的同位素体。
30.权利要求29的方法，其中所述同位素体具有的稳定重同位素的数目选自2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
31.权利要求1的方法，其中每种样品的所述同位素标记的氨基酸的编码元素式的同位
素组成选自：
12C3-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤3，j≤4，n≤l，o≤l；
12C6-i13Ci1H7-j2Hj14N4-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤7，n≤4，o≤l；
12C4-i13Ci1H3-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤4，j≤3，n≤2，o≤2；
12C4-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤4，j≤3，n≤1，o≤2；
12C3-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤3，j≤3，n≤1，o≤l，p≤l；
12C5-i13Ci1H5-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤5，j≤5，n≤1，o≤2；
12C5-i13Ci1H5-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤5，j≤5，n≤2，o≤2；
12 13 1 2 14 15 16 18
C2-i CiH2-jHj N1-n Nn O1-o Oo,其中i≤2，j≤2，n≤l，o≤l；
12C6-i13Ci1H5-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤5，n≤3，o≤l；
12C6-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤10，n≤l，o≤l；
12C6-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤10，n≤l，o≤l；
12 13 1 2 14 15 16 18
C6-i CiH9-jHj N2-n Nn O1-o Oo,其中i≤6，j≤9，n≤2，o≤l；
12C5-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤5，j≤8，n≤1，o≤l，p≤l；
12C9-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤9，j≤8，n≤1，o≤1；
12C5-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤5，j≤7，n≤1，o≤1；
12 13 1 2 14 15 16 18
C3-i CiH3-jHj N1-n Nn O1-o Oo,其中i≤3，j≤3，n≤1，o≤1；
12C4-i13Ci1H5-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤4，j≤5，n≤1，o≤1；
12C11-i13Ci1H8-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤11，j≤8，n≤2，o≤1；
12C9-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤9，j≤7，n≤1，o≤1；以及
12C5-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤5，j≤8，n≤1，o≤1；
其中i、j、n、o和p中的每一个独立地为整数或0。
32.权利要求1的方法，其中所述同位素标记氨基酸具有下式：
其中gN和hN都是15N；或
gN和hN中的一个是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C；或
g h 15 j k l m n o p q r s t u v 2
N和N中的一个是 N，并且H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H和H中的一个是H；或
iO是18O。
33.权利要求1的方法，其中所述同位素标记的氨基酸具有下式：
其中gN和hN都是15N，并且iO是18O；或
g h 15 a b c d e f 13
N和N都是 N，并且C、C、C、C、C和C中的两个是 C；或
gN和hN都是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H；或
gN和hN中的一个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C，并且iO是18O；或
gN和hN都是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的两个是2H；或gN和hN中的一个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的三个是13C；或
gN和hN中的一个是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H，并且iO是18O；或
gN和hN中的一个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H；或
aC、bC、cC、dC、eC和fC中的两个是13C，并且iO是18O；或
gN和hN中的一个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的两个是2H；或
gN和hN中的一个是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的三个是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的两个是2H，并且iO是18O。
34.权利要求1的方法，其中所述同位素标记的氨基酸具有下式：
其中，
gN、hN、wN和xN中的两个是15N；或
gN、hN、wN和xN中的一个是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C；或
gN、hN、wN和xN中的一个是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是
2H；或
iO是18O。
35.权利要求1的方法，其中所述同位素标记的氨基酸具有下式：
其中，
gN、hN、wN和xN中的四个是15N；或
gN、hN、wN和xN中的三个是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C；或
gN、hN、wN和xN中的三个是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是
2H；或
gN、hN、wN和xN中的两个是15N，并且iO是18O；或
gN、hN、wN和xN中的两个是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC中的两个是13C；或
gN、hN、wN和xN中的两个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H；或
gN、hN、wN和xN中的一个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN中的两个是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的两个是2H；或gN、hN、wN和xN中的一个是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC中的三个是13C；或
gN、hN、wN和xN中的一个是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H，并i 18
且O是 O；或
gN、hN、wN和xN中的一个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC中的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H；或
aC、bC、cC、dC、eC和fC中的两个是13C，并且iO是18O；或
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N、N、N和N中的一个是 N，C、C、C、C、C和C中的一个是 C，并且H、H、H、H、H、H
、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的两个是2H；或
aC、bC、cC、dC、eC和fC中的一个是13C，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的一个是2H，并且iO是18O；或
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N、N、N和N中的一个是 N，并且 H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H和H中的三个是
2H；或
jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH中的两个是2H，并且iO是18O。
36.权利要求2的方法，其中所述同位素标记试剂包括胺反应基团或羧酸反应基团。
37.权利要求2的方法，其中所述同位素标记试剂是肽同位素标签或经修饰的肽同位素
标签的同位素体。
38.权利要求2的方法，其中所述同位素标记试剂是肽标记试剂的同位素体。
39.权利要求37的方法，其中所述每种样品的所述肽同位素标签或经修饰的肽同位素
标签的同位素体的编码元素式的同位素组成选自：
12C9-i13Ci1H7-j2Hj35Cl1-m37Clm14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤7，m≤l，n≤l，o≤l；
12C5-i13Ci1H1-j2Hj14N5-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤5，j≤1，n≤5，o≤1；
12C5-i13Ci1H6-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤5，j≤6，n≤2；
12 13 1 2 14 15
C3-i CiH2-jHj N5-n Nn，其中i≤3，j≤2，n≤5；
12C4-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn，其中i≤4，j≤7，n≤3；
12C4-i13Ci1H6-j2Hj14N4-n15Nn，其中i≤4，j≤6，n≤4；
12C9-i13Ci1H7-j2Hj79Br1-l81Cll14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤7，l≤l，n≤l，o≤l；
12 13 1 2 14 15 16 18
C4-i CiH2-jHj N3-n Nn O1-o Oo，其中i≤4，j≤2，n≤3，o≤1；
12C4-i13Ci1H2-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤4，j≤2，n≤2，o≤2；
12C5-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤5，j≤4，n≤2，o≤2；
12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤3，o≤4；
12 13 1 2 14 15 16 18
C9-i CiH11-jHj N1-n Nn O1-o Oo，其中i≤9，j≤11，n≤1，o≤1；
12C10-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤10，j≤10，n≤1，o≤2；
12C10-i13Ci1H9-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤10，j≤9，n≤3，o≤3；
12C7-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤7，j≤7，n≤1，o≤1；
12C11-i13Ci1H12-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤11，j≤12，n≤1，o≤l，p≤l；
12C12-i13Ci1H17-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤12，j≤17，n≤1，o≤1；
12C9-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤9，n≤2，o≤1；
12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤3，o≤4；
12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤3，o≤4；
12C12-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤12，j≤13，n≤2，o≤3；
12C16-i13Ci1H23-j2Hj14N2-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤16，j≤23，n≤2，o≤4；
12C12-i13Ci1H15-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤12，j≤15，n≤2，o≤3；
12C14-i13Ci1H19-j2Hj14N2-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤19，n≤2，o≤4；
12C11-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤11，j≤13，n≤2，o≤2；
12C8-i13Ci1H7-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤8，j≤7，n≤2，o≤2；
12C18-i13Ci1H21-j2Hj14N4-n15Nn16O5-o18Oo，其中i≤18，j≤21，n≤4，o≤5；
以及
12 13 1 2 14 15 16 18
C18-i CiH21-jHj N4-n Nn O5-o Oo，其中i≤18，j≤21，n≤4，o≤5；
其中i、j、l、m、n、o和p中的每一个独立地为整数或0。
40.权利要求2的方法，其中所述同位素标记的分析物独立地包括肽标记物。
41.权利要求40的方法，其中所述每种同位素标记的分析物的肽标记物的编码元素式
的同位素组成选自：
12C14-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤14，j≤12，n≤8，o≤1；
12C27-i13Ci1H27-j2Hj14N8-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤27，j≤27，n≤8，o≤4；
12C17-i13Ci1H10-j2Hj14N6-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤17，j≤10，n≤6，o≤1；
12C9-i13Ci1H10-j2Hj14N6-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤10，n≤6，o≤1；
12C30-i13Ci1H31-j2Hj14N12-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤30，j≤31，n≤12，o≤4；
12C31-i13Ci1H35-j2Hj14N8-n15Nn16O6-o18Oo，其中i≤31，j≤35，n≤8，o≤6；
12C15-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤15，j≤12，n≤8，o≤1；
12C12-i13Ci1H8-j2Hj14N9-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤12，j≤8，n≤9，o≤1；
12C11-i13Ci1H6-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤11，j≤6，n≤8，o≤1；
12 13 1 2 14 15 16 18
C31-i CiH35-jHj N8-n Nn O4-o Oo，其中i≤31，j≤35，n≤8，o≤4；
12C12-i13Ci1H20-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤12，j≤20，n≤2，o≤2；
12C7-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤7，j≤13，n≤2，o≤1；以及
12C18-i13Ci1H25-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤18，j≤25，n≤3，o≤3；
其中i、j、n和o中的每一个独立地为整数或0。
42.权利要求2的方法，其中所述同位素标记试剂是小分子同位素标签的同位素体。
43.权利要求42的方法，其中所述每种样品的所述小分子同位素标签的同位素体的编
码元素式的同位素组成选自：
12 13 1 2 14 15
C9-i CiH14-jHj N1-n Nn，其中i≤9，j≤14，n≤1；
12C11-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn32S1-p34Sp,其中i≤11，j≤7，n≤1，p≤l；
12C12-i13Ci1H16-j2Hj14N6-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤16，n≤6，o≤2，p≤l；
12C2-i13Ci1H3-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤2，j≤3，o≤2；
12C3-i13Ci16O1-o18Oo,其中i≤3，o≤1；
12C4-i13Ci1H5-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤4，j≤5，o≤2；
12C1-i13Ci1H2-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤1，j≤2，n≤2；
12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤2，o≤2；
12C2-i13Ci16O1-o18Oo,其中i≤2，o≤1；
12C7-i13Ci1H6-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤7，j≤6，n≤2，o≤3；
12C7-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤7，j≤7，n≤3，o≤1；
12C6-i13Ci1H3-j2Hj14N4-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤6，j≤3，n≤4，o≤4；
12C6-i13Ci1H1-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤6，j≤1，o≤2；
12C15-i13Ci1H11-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤15，j≤11，o≤2；
12C6-i13Ci1H8-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤6，j≤8，o≤2；
12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N3-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤12，n≤3，o≤2，p≤l；
12C18-i13Ci1H23-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤18，j≤23，n≤2，o≤1；
12 13 1 2 14 15
C5-i CiH4-jHj N3-n Nn，其中i≤5，j≤4，n≤3；
12C6-i13Ci1H8-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤6，j≤8，o≤2；
12C6-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn，其中i≤6，j≤7，n≤3；
12C6-i13Ci1H11-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤6，j≤11，n≤2，o≤1；
12 13 1 2 14 15 16 18
C11-i CiH11-jHj N3-n Nn O1-o Oo，其中i≤11，j≤11，n≤3，o≤1；
12C6-i13Ci1H2-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤6，j≤2，n≤3，o≤3；
12C9-i13Ci1H10-j2Hj14N2-n15Nn32S1-p34Sp,其中i≤9，j≤10，n≤2，p≤l；
12C11-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤11，j≤7，n≤1，o≤1；
12C4-i13Ci16O1-o18Oo,其中i≤4，o≤1；
12C7-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤7，j≤4，n≤2，o≤2，p≤l；
12C7-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤7，j≤4，n≤1，o≤4；
12C8-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤8，j≤14，n≤1，o≤3；
12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤1，o≤4；
12C9-i13Ci1H12-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤9，j≤12，n≤2；
12 13 1 2 14 15 16 18 32 34
C12-i CiH12-jHj N3-n Nn O2-o Oo S1-p Sp,其中i≤12，j≤12，n≤3，o≤2，p≤l；
12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤12，n≤1，o≤2，p≤l；
12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤1，o≤2；
12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N4-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤4，o≤1；
12 13 1 2 14 15 16 18
C20-i CiH15-jHj N2-n Nn O1-o Oo，其中i≤20，j≤15，n≤2，o≤1；
12C6-i13Ci1H12-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤6，j≤12，n≤2；
12C5-i13Ci1H13-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤5，j≤13，n≤1，o≤1；
12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤1，o≤2；以及
12 13 1 2 14 15
C8-i CiH18-jHj N1-n Nn，其中i≤8，j≤18，n≤1；
其中i、j、n、o、p和q中的每一个独立地为整数或0。
44.权利要求36-43中任一项的方法，所述同位素体具有的稳定重同位素的数目选自2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
45.权利要求1或2的方法，其中至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个12C
同位素和至少一个15N同位素；并且至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个13C同位素和至少一个14N同位素。
46.权利要求1或2的方法，其中至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个12C
同位素和至少一个2H同位素；并且至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个13C同位素和至少一个1H同位素。
47.权利要求1或2的方法，其中至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个14N
同位素和至少一个2H同位素；并且至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个15N同位素和至少一个1H同位素。
48.权利要求1或2的方法，其中至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个16O
同位素；并且至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个18O同位素。
49.权利要求1或2的方法，其中至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少两个13C
、2H或15N同位素和至少一个16O同位素；并且至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少
18 12 1 14
一个 O同位素和至少两个 C、H或 N同位素。
50.权利要求1或2的方法，其中至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少两个13C
、2H或15N同位素；并且至少一部分所述同位素标记的分析物包含至少一个34S同位素和至少两个12C、1H或14N同位素。
51.权利要求1或2的方法，其中每种所述同位素标记的分析物独立地为具有不同同位
素标记物的蛋白质分析物或经修饰的蛋白质分析物。
52.权利要求1或2的方法，其中每种所述同位素标记的分析物独立地为具有不同同位
素标记物的肽分析物或经修饰的肽分析物。
53.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的分析物的分子质量选自50Da至
250kDa的范围。
54.权利要求1或2的方法，其中所述同位素标记的分析物具有的分子质量彼此间的差
异为1至300mDa。
55.权利要求1或2的方法，包括分析所述多个样品中所述分析物的相对或绝对丰度的
多路复用方法。
56.权利要求1或2的方法，其中所述方法是用于分析至少4个样品中分析物的相对或绝
对丰度。
57.权利要求1或2的方法，其中所述提供所述多个细胞培养物的步骤包括提供2至20个
细胞培养物；并且所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括制备2至20个样品。
58.权利要求1或2的方法，其中所述利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技
术分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤产生对应于所述同位素标记的分析物的2-20个独立且可区分的质谱信号。
59.权利要求1或2的方法，其中该方法还包括在所述利用提供分辨率等于或大于
100000的质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤之前，将所述样品合并的步骤，其中所述样品的特征在于不同的同位素标记的分析物。
60.权利要求1或2的方法，其中同时分析所述多个样品的不同的同位素标记的分析物。
61.权利要求1或2的方法，其中所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤
包括：
生成每种所述同位素标记的分析物的一种或多种产物离子，以及
利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术测量至少一部分所述产物离子的
质荷比。
62.权利要求1或2的方法，其中所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤
是使用四级杆离子阱、傅立叶变换离子回旋共振离子阱、线性四级杆离子阱、轨道阱离子阱、四级杆质量分析器或飞行时间质量分析器进行的。
63.权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括在所述分析每种样品的所述同位素标
记的蛋白质或肽分析物之前，纯化所述样品的蛋白质或肽。
64.权利要求63的方法，其中所述纯化所述样品的蛋白质或肽的步骤是通过液相色谱
法、气相色谱法或毛细管电泳进行的。
65.权利要求1的方法，其中所述分析物是蛋白质、肽、经修饰的蛋白质或经修饰的肽。
66.一种确定样品中分析物丰度的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供具有所述分析物的所述样品，其中所述分析物是肽或蛋白质；
(b)向所述样品提供同位素标记的标准物，其中所述同位素标记的标准物包含至少两
个稳定的重同位素，其在对应的未标记的标准物中被替换为轻同位素，并且其中所述两个重同位素中至少一个选自15N、18O和34S，其中所述分析物和所述同位素标记的标准物是同位素体；其中所述分析物和所述同位素标记的标准物的分子质量差异小于或等于300mDa；
(c)使用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术，分析所述样品中所述分析物
和所述同位素标记的标准物，从而生成对应所述样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的独立且可区分的质谱信号；以及
(e)比较所述样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的质谱信号，从而确定所
述样品中所述分析物的丰度。
67.权利要求66的方法，其中所述同位素标记的标准物是使用一种或多种同位素标记
的氨基酸合成。
68.权利要求66的方法，所述方法还包括以下步骤：
(a)提供多个样品，其中每种样品均具有所述分析物；
(b)向每种所述样品提供所述同位素标记的标准物；
(c)使用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术，分析每种所述样品中所述分
析物和所述同位素标记的标准物，从而生成对应每种样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的独立且可区分的质谱信号；以及
(e)比较每种样品中所述分析物和所述同位素标记标准物的所述质谱信号，从而确定
所述多个样品中所述分析物的丰度。
用于分析物定量的中子编码质量标签
[0001] 相关申请的交叉引用
[0004] 本发明是在由美国国立卫生研究院授予的GM080148政府资助下完成。美国政府对本发明拥有某些权利。
背景技术
[0005] 蛋白质组学定量已成为现代生物学和转化医学越来越基本的组成部分。靶向的或整体的稳定同位素掺入和质谱(MS)分析是用来测定蛋白质丰度的主要机制。有多种将稳定
同位素引入肽中的方法——SILAC、等量异位标记(TMT/iTRAQ)、iCAT等。但是，在大多数常
规方法中，这些方法掺入重同位素，使质量增大至少1Da。例如，SILAC，定量的金标准，为了
限制重肽和轻肽的同位素簇重叠，通常使用4Da间隔。该要求将SILAC的定量能力限制至3路
(triplex)。其原因有二：(1)氨基酸的质量只能被提高到约+12Da，(2)当引入多个同位素峰
簇时，质谱复杂性增加。
同位素引入肽中的方法——SILAC、等量异位标记(TMT/iTRAQ)、iCAT等。但是，在大多数常
规方法中，这些方法掺入重同位素，使质量增大至少1Da。例如，SILAC，定量的金标准，为了
限制重肽和轻肽的同位素簇重叠，通常使用4Da间隔。该要求将SILAC的定量能力限制至3路
(triplex)。其原因有二：(1)氨基酸的质量只能被提高到约+12Da，(2)当引入多个同位素峰
簇时，质谱复杂性增加。
[0006] 等量异位标记通过在MS1扫描中隐藏定量信息解决了质谱复杂性增加的问题，从而允许比常规SILAC方法得到的更高水平的多路复用。Mc Alister等最近报道了使用TMT等
量异位试剂将该方法的通量从6路增大到8路的方法，例如通过分辨相对小的同位素位移的
技术，所述同位素位移是由等量异位标记试剂中用15N替换13C而产生[参见Mc Alister et
al.，Analytical Chemistry，已接收的稿件，DOI:10.1021/ac301572t]。尽管使用等量异位
标记在实现多路复用程度方面取得了进展，但是已证明所述方法容易收到某些限制，所述
限制影响了它们在用于蛋白质组学的定量分析中的应用。第一，由于在MS/MS分离窗中的母
离子(precursor)干扰，等量异位方法苦于严重的动态范围压缩和定量准确度丧失。例如，
已经证明，等量异位方法中的母离子干扰显著降低该技术的定量准确度。第二，只能获得被
选择用于进行进一步MS2分析的肽的定量数据。因此，当需要进行重复分析时，这将成为严
重的问题，因为从一次运行到下一次运行被选择进行MS2的肽存在高度差异(约60％)。第
三，目前的等量异位标记方法仅与碰撞激活(collisional activation)解离兼容，从而限
制了这项技术总体的通用性。
量异位试剂将该方法的通量从6路增大到8路的方法，例如通过分辨相对小的同位素位移的
技术，所述同位素位移是由等量异位标记试剂中用15N替换13C而产生[参见Mc Alister et
al.，Analytical Chemistry，已接收的稿件，DOI:10.1021/ac301572t]。尽管使用等量异位
标记在实现多路复用程度方面取得了进展，但是已证明所述方法容易收到某些限制，所述
限制影响了它们在用于蛋白质组学的定量分析中的应用。第一，由于在MS/MS分离窗中的母
离子(precursor)干扰，等量异位方法苦于严重的动态范围压缩和定量准确度丧失。例如，
已经证明，等量异位方法中的母离子干扰显著降低该技术的定量准确度。第二，只能获得被
选择用于进行进一步MS2分析的肽的定量数据。因此，当需要进行重复分析时，这将成为严
重的问题，因为从一次运行到下一次运行被选择进行MS2的肽存在高度差异(约60％)。第
三，目前的等量异位标记方法仅与碰撞激活(collisional activation)解离兼容，从而限
制了这项技术总体的通用性。
[0007] 从前述可以明显看出，目前存在对用于蛋白组学分析的质谱技术的需求。例如，需要能够实现高度多路复用的先进的质谱技术，所述多路复用是对包含蛋白质的样品的高通
量分析所必需的。此外，需要不易受影响定量准确度的母离子干扰的难题影响并与包括电
子捕获法和电子转移解离法的一系列解离技术兼容的先进质谱技术。
量分析所必需的。此外，需要不易受影响定量准确度的母离子干扰的难题影响并与包括电
子捕获法和电子转移解离法的一系列解离技术兼容的先进质谱技术。
发明内容
[0008] 本发明提供质谱方法、组合物和系统，其使得用于分析物定量的独特平台成为可能，所述平台实现了非常高度的多路复用和精确定量，特别适用于蛋白质组学应用的一系
列定量分析。本发明的方法和系统的实施方案结合同位素编码试剂和提供高分辨率的质谱
方法，以提供大量样品中的相对或绝对分析物定量，所述同位素编码试剂的特征在于分子
量的极小差异。例如，在一些实施方案中，本发明的定量方法通过从大量(例如，2-10，在一
些实施方案中超过20种)同位素编码试剂引入同位素标记来实现高度多路复用，所述同位
素编码试剂是具有可以使用高分辨率色谱法来准确分辨的质量差异的同位素体(例如氨基
酸、标记试剂和/或合成蛋白和肽)。本文所述的方法、组合物和系统使得能够提高与达到高
通量水平所需的多路复用兼容的定量准确度。
列定量分析。本发明的方法和系统的实施方案结合同位素编码试剂和提供高分辨率的质谱
方法，以提供大量样品中的相对或绝对分析物定量，所述同位素编码试剂的特征在于分子
量的极小差异。例如，在一些实施方案中，本发明的定量方法通过从大量(例如，2-10，在一
些实施方案中超过20种)同位素编码试剂引入同位素标记来实现高度多路复用，所述同位
素编码试剂是具有可以使用高分辨率色谱法来准确分辨的质量差异的同位素体(例如氨基
酸、标记试剂和/或合成蛋白和肽)。本文所述的方法、组合物和系统使得能够提高与达到高
通量水平所需的多路复用兼容的定量准确度。
[0009] 在一方面，本发明提供了用于确定多个样品中分析物的丰度的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供至少包括第一细胞培养物和第二细胞培养物的多个细胞培养物；(b)向
每种所述细胞培养物提供不同的同位素标记的氨基酸，其中每种所述细胞培养物的所述同
位素标记的氨基酸是相同氨基酸的同位素体；(c)培养每种所述细胞培养物的细胞，从而将
不同的同位素标记物引入每种细胞培养物生成的蛋白质；(d)生成每种所述细胞培养物的
样品，其中每种样品的特征在于不同的同位素标记的分析物，所述样品至少包括具有第一
同位素标记的分析物的第一细胞培养物的第一样品和具有第二同位素标记的分析物的第
二细胞培养物的第二样品，其中每种样品的同位素标记的分析物是同位素体；且其中所述
第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子量差异小于或等于
300mDa；(e)利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的同位素标
记的分析物，从而生成每种样品的同位素标记的分析物的独立且可区分的质谱信号；以及
(f)比较每种样品的同位素标记的分析物的质谱信号，从而确定多个样品中该分析物的丰
度。
每种所述细胞培养物提供不同的同位素标记的氨基酸，其中每种所述细胞培养物的所述同
位素标记的氨基酸是相同氨基酸的同位素体；(c)培养每种所述细胞培养物的细胞，从而将
不同的同位素标记物引入每种细胞培养物生成的蛋白质；(d)生成每种所述细胞培养物的
样品，其中每种样品的特征在于不同的同位素标记的分析物，所述样品至少包括具有第一
同位素标记的分析物的第一细胞培养物的第一样品和具有第二同位素标记的分析物的第
二细胞培养物的第二样品，其中每种样品的同位素标记的分析物是同位素体；且其中所述
第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子量差异小于或等于
300mDa；(e)利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的同位素标
记的分析物，从而生成每种样品的同位素标记的分析物的独立且可区分的质谱信号；以及
(f)比较每种样品的同位素标记的分析物的质谱信号，从而确定多个样品中该分析物的丰
度。
[0010] 在一方面，本发明提供了用于确定多个样品中分析物的丰度的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供每个均具有至少包括第一样品和第二样品的分析物的多个样品；(b)向
每种样品提供不同的同位素标记试剂，其中每种所述样品的同位素标记试剂是同位素体，
且其中所述同位素标记试剂不是具有报告基团和质量平衡基团的等量异位标签；(c)使每
种样品的所述分析物和同位素标记试剂发生化学反应，从而生成每种样品的不同的同位素
标记的分析物，包括所述第一样品的第一同位素标记的分析物和所述第二样品的第二同位
素标记的分析物；其中每种样品的同位素标记的分析物是同位素体；且其中所述第一同位
素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子量的差异小于或等于300mDa；(d)
利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标记的分
析物，从而生成每种样品中同位素标记的分析物的独立且可区分的质谱信号；以及(e)比较
每种样品的同位素标记的分析物的所述质谱信号，从而确定所述多个样品中该分析物的丰
度。
每种样品提供不同的同位素标记试剂，其中每种所述样品的同位素标记试剂是同位素体，
且其中所述同位素标记试剂不是具有报告基团和质量平衡基团的等量异位标签；(c)使每
种样品的所述分析物和同位素标记试剂发生化学反应，从而生成每种样品的不同的同位素
标记的分析物，包括所述第一样品的第一同位素标记的分析物和所述第二样品的第二同位
素标记的分析物；其中每种样品的同位素标记的分析物是同位素体；且其中所述第一同位
素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子量的差异小于或等于300mDa；(d)
利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标记的分
析物，从而生成每种样品中同位素标记的分析物的独立且可区分的质谱信号；以及(e)比较
每种样品的同位素标记的分析物的所述质谱信号，从而确定所述多个样品中该分析物的丰
度。
[0011] 在一方面，本发明提供了用于确定多个样品中分析物的丰度的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供每个均具有包括至少第一样品和第二样品的分析物的多个样品；(b)向
每种样品提供不同的同位素标记的试剂，其中每种所述样品的同位素标记试剂是同位素
体；(c)使每种样品的所述分析物和同位素标记试剂发生化学反应，从而生成每种样品的不
同的同位素标记的分析物，包括所述第一样品的第一同位素标记的分析物和所述第二样品
的第二同位素标记的分析物；其中每种样品的所述同位素标记的分析物是同位素体；且其
中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子量的差异小于或
等于300mDa；(d)利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的所述
同位素标记的分析物，从而生成每种样品的所述同位素标记的分析物的独立且可区分的质
谱信号；以及(e)比较每种样品的所述同位素标记的分析物的所述质谱信号，从而确定所述
多个样品中所述分析物的丰度；其中所述使用质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标
记的分析物的步骤不使用等量异位标记法，例如，其中所述使用质谱分析技术分析每种样
品的所述同位素标记的分析物的步骤不生成报告离子或对应于报告离子的质谱数据。
每种样品提供不同的同位素标记的试剂，其中每种所述样品的同位素标记试剂是同位素
体；(c)使每种样品的所述分析物和同位素标记试剂发生化学反应，从而生成每种样品的不
同的同位素标记的分析物，包括所述第一样品的第一同位素标记的分析物和所述第二样品
的第二同位素标记的分析物；其中每种样品的所述同位素标记的分析物是同位素体；且其
中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子量的差异小于或
等于300mDa；(d)利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种样品的所述
同位素标记的分析物，从而生成每种样品的所述同位素标记的分析物的独立且可区分的质
谱信号；以及(e)比较每种样品的所述同位素标记的分析物的所述质谱信号，从而确定所述
多个样品中所述分析物的丰度；其中所述使用质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标
记的分析物的步骤不使用等量异位标记法，例如，其中所述使用质谱分析技术分析每种样
品的所述同位素标记的分析物的步骤不生成报告离子或对应于报告离子的质谱数据。
[0012] 在本发明的一些方法中，所述样品的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质不包括等量异位质量标签，例如TMT或
iTRAQ质量标签。例如，在一些实施方案中，所述样品的所述同位素标记的分析物、同位素标
记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质不具有常规等量异位质量标
签的官能团的至少一部分，例如不具有报告基团和/或不具有质量平衡基团。但是，值得注
意的是，本发明的同位素标记试剂通常包含反应基团(例如蛋白质或肽反应基团)，以通过
化学反应将同位素标记物掺入所述分析物。
iTRAQ质量标签。例如，在一些实施方案中，所述样品的所述同位素标记的分析物、同位素标
记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质不具有常规等量异位质量标
签的官能团的至少一部分，例如不具有报告基团和/或不具有质量平衡基团。但是，值得注
意的是，本发明的同位素标记试剂通常包含反应基团(例如蛋白质或肽反应基团)，以通过
化学反应将同位素标记物掺入所述分析物。
[0013] 在本发明的一些方法中，使用单级质谱技术进行所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤，例如包括对由所述分析物直接生成的产物离子的碎片化和检测的技
术，例如通过电喷雾电离和MALDI技术直接生成的离子。例如，在一些实施方案中，所述使用
质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤包括：(i)从每种样品的每
种所述同位素标记的分析物生成离子；(ii)使所述离子碎片化以生成每种样品的具有不同
同位素标记物的产物离子；以及(iii)检测每种样品的所述产物离子。例如，在一些实施方
案中，所述产物离子是具有所述同位素标记物的肽碎片离子，任选地其中检测所述产物离
子而不进行对所述产物离子的进一步质量选择或碎片化。在一个特定的实施方案中，所述
分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤不是使用MSX多级质谱法进行的，其中x大
于或等于2，例如，其中所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤不是使用串联
质谱法进行的。或者，本发明包括这样的方法，即其中所述分析每种样品的所述同位素标记
的分析物的步骤是使用MSX多级质谱法进行的，其中x大于或等于2，例如串联质谱技术。
术，例如通过电喷雾电离和MALDI技术直接生成的离子。例如，在一些实施方案中，所述使用
质谱分析技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤包括：(i)从每种样品的每
种所述同位素标记的分析物生成离子；(ii)使所述离子碎片化以生成每种样品的具有不同
同位素标记物的产物离子；以及(iii)检测每种样品的所述产物离子。例如，在一些实施方
案中，所述产物离子是具有所述同位素标记物的肽碎片离子，任选地其中检测所述产物离
子而不进行对所述产物离子的进一步质量选择或碎片化。在一个特定的实施方案中，所述
分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤不是使用MSX多级质谱法进行的，其中x大
于或等于2，例如，其中所述分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤不是使用串联
质谱法进行的。或者，本发明包括这样的方法，即其中所述分析每种样品的所述同位素标记
的分析物的步骤是使用MSX多级质谱法进行的，其中x大于或等于2，例如串联质谱技术。
[0014] 本发明的方法与多种用于将同位素标记物引入分析物以生成同位素标记的分析物的方法兼容，例如反应技术、合成技术和代谢技术。例如，在反应技术中，在一定条件下
(例如，标记试剂的浓度、温度、pH、离子强度、溶剂组成等)向样品提供一种或多种同位素标
记试剂，以使得至少一部分的所述同位素标记试剂与分析物反应生成同位素标记的分析
物。例如，在合成技术中，例如通过同位素编码的氨基酸的化学反应，合成一种或多种同位
素标记的标准物(例如同位素标记的肽标准物)，然后将其加入至待分析的样品。例如，在代
谢技术中，在一定条件下向细胞培养物提供同位素编码的化合物(例如同位素标记的氨基
酸或肽)，其中所述同位素标记的氨基酸或肽被掺入至由所述细胞生成的肽或修饰肽中。
(例如，标记试剂的浓度、温度、pH、离子强度、溶剂组成等)向样品提供一种或多种同位素标
记试剂，以使得至少一部分的所述同位素标记试剂与分析物反应生成同位素标记的分析
物。例如，在合成技术中，例如通过同位素编码的氨基酸的化学反应，合成一种或多种同位
素标记的标准物(例如同位素标记的肽标准物)，然后将其加入至待分析的样品。例如，在代
谢技术中，在一定条件下向细胞培养物提供同位素编码的化合物(例如同位素标记的氨基
酸或肽)，其中所述同位素标记的氨基酸或肽被掺入至由所述细胞生成的肽或修饰肽中。
[0015] 例如，在一个实施方案中，所述向每种所述细胞培养物提供所述不同的同位素标记的氨基酸的步骤包括，向每种所述细胞培养物提供包含所述同位素标记的氨基酸的生长
培养基。例如，在一个实施方案中，所述将不同的同位素标记物引入由每种细胞培养物生成
的蛋白质中是通过将所述同位素标记的氨基酸代谢掺入至所述细胞培养物的细胞中而实
现。例如，在一个实施方案中，所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括裂解每种所
述细胞培养物的细胞。例如，在一个实施方案中，所述生成每种所述细胞培养物的样品的步
骤包括提取每种所述细胞培养物的蛋白质。例如，在一个实施方案中，所述生成每种所述细
胞培养物的样品的步骤包括消化每种所述细胞培养物的蛋白质。例如，在一个实施方案中，
使用胰蛋白酶或Endo LysC消化所述样品。
培养基。例如，在一个实施方案中，所述将不同的同位素标记物引入由每种细胞培养物生成
的蛋白质中是通过将所述同位素标记的氨基酸代谢掺入至所述细胞培养物的细胞中而实
现。例如，在一个实施方案中，所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括裂解每种所
述细胞培养物的细胞。例如，在一个实施方案中，所述生成每种所述细胞培养物的样品的步
骤包括提取每种所述细胞培养物的蛋白质。例如，在一个实施方案中，所述生成每种所述细
胞培养物的样品的步骤包括消化每种所述细胞培养物的蛋白质。例如，在一个实施方案中，
使用胰蛋白酶或Endo LysC消化所述样品。
[0016] 本发明方法的一个重要方面是使用一系列具有质量差异的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质，所述质量差异能够
使用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分辨。在一些实施方案中，使用至少一
部分具有很小分子质量差异(例如，小于或等于300mDa)的同位素标记分析物、同位素标记
试剂、同位素标记氨基酸和/或同位素标记肽或蛋白质是有利于实现多路复用能力。例如，
在一些实施方案中，所述分析每种样品的同位素标记的分析物的步骤包括分辨所述同位素
标记的分析物的质荷比和/或分子质量的差异。例如，在一些实施方案中，所述第一同位素
标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量的差异小于或等于100mDa，并且
任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析
物的分子质量的差异小于或等于50mDa，并且任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素
标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量的差异大于或等于10mDa。例如，
在一些实施方案中，所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子
质量的差异选自100mDa至1mDa的范围，并且任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素
标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量的差异选自50mDa至1mDa的范
围，并且任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标
记的分析物的分子质量的差异选自10mDa至1mDa的范围。例如，在一些实施方案中，每种所
述同位素标记的分析物的分子质量在另一种所述同位素标记的分析物的分子质量相差
100mDa至1mDa，并且任选地对一些应用而言，每种所述同位素标记的分析物的分子质量与
另一种所述同位素标记的分析物的分子质量相差50mDa至1mDa，并且任选地对一些应用而
言，每种所述同位素标记的分析物的分子质量与另一种所述同位素标记的分析物的分子质
量相差10mDa至1mDa。例如，在一些实施方案中，每种所述同位素标记的分析物的分子质量
在10000mDa至10mDa的范围内，并且任选地对一些应用而言，每种所述同位素标记的分析物
的分子质量在1000mDa至10mDa的范围内，并且任选地对一些应用而言，每种所述同位素标
记的分析物的分子质量在100mDa至10mDa的范围内。
使用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分辨。在一些实施方案中，使用至少一
部分具有很小分子质量差异(例如，小于或等于300mDa)的同位素标记分析物、同位素标记
试剂、同位素标记氨基酸和/或同位素标记肽或蛋白质是有利于实现多路复用能力。例如，
在一些实施方案中，所述分析每种样品的同位素标记的分析物的步骤包括分辨所述同位素
标记的分析物的质荷比和/或分子质量的差异。例如，在一些实施方案中，所述第一同位素
标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量的差异小于或等于100mDa，并且
任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析
物的分子质量的差异小于或等于50mDa，并且任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素
标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量的差异大于或等于10mDa。例如，
在一些实施方案中，所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子
质量的差异选自100mDa至1mDa的范围，并且任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素
标记的分析物和所述第二同位素标记的分析物的分子质量的差异选自50mDa至1mDa的范
围，并且任选地对一些应用而言，其中所述第一同位素标记的分析物和所述第二同位素标
记的分析物的分子质量的差异选自10mDa至1mDa的范围。例如，在一些实施方案中，每种所
述同位素标记的分析物的分子质量在另一种所述同位素标记的分析物的分子质量相差
100mDa至1mDa，并且任选地对一些应用而言，每种所述同位素标记的分析物的分子质量与
另一种所述同位素标记的分析物的分子质量相差50mDa至1mDa，并且任选地对一些应用而
言，每种所述同位素标记的分析物的分子质量与另一种所述同位素标记的分析物的分子质
量相差10mDa至1mDa。例如，在一些实施方案中，每种所述同位素标记的分析物的分子质量
在10000mDa至10mDa的范围内，并且任选地对一些应用而言，每种所述同位素标记的分析物
的分子质量在1000mDa至10mDa的范围内，并且任选地对一些应用而言，每种所述同位素标
记的分析物的分子质量在100mDa至10mDa的范围内。
[0017] 对于不同应用，本发明不同的同位素编码的化合物可具有多个选自较大范围的稳定的重同位素。本文所使用的同位素编码的化合物是指具有一个或多个作为同位素标记物
发挥功能的稳定的重同位素。同位素编码的化合物包括一系列标记试剂、标准物和/或标记
的分析物，例如同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸、同位素标记
的标准物和/或同位素标记的肽或蛋白质。同位素编码的化合物包括作为同位素体的具有
一个或多个稳定的重同位素的化合物，例如，能够根据测定的质荷比使用质谱法准确区分
的同位素体。
发挥功能的稳定的重同位素。同位素编码的化合物包括一系列标记试剂、标准物和/或标记
的分析物，例如同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸、同位素标记
的标准物和/或同位素标记的肽或蛋白质。同位素编码的化合物包括作为同位素体的具有
一个或多个稳定的重同位素的化合物，例如，能够根据测定的质荷比使用质谱法准确区分
的同位素体。
[0018] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质具有的稳定的重同位素的数目选自2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质具有的稳
定的重同位素的数目等于或大于1，并且任选地对一些应用而言，稳定的重同位素的数目等
于或大于4，并且任选地对一些应用而言，稳定的重同位素的数目等于或大于10，并且任选
地对一些应用而言，稳定的重同位素的数目等于或大于15。
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质具有的稳
定的重同位素的数目等于或大于1，并且任选地对一些应用而言，稳定的重同位素的数目等
于或大于4，并且任选地对一些应用而言，稳定的重同位素的数目等于或大于10，并且任选
地对一些应用而言，稳定的重同位素的数目等于或大于15。
[0019] 例如，在一些实施方案中，所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质选自：具有至少一个15N同位素的同位素标记的
分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少
一个13C同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素
标记的肽或蛋白质；具有至少一个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位
34
素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个 S同位素的同位素标记的
分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少
一个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素
标记的肽或蛋白质。
分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少
一个13C同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素
标记的肽或蛋白质；具有至少一个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位
34
素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个 S同位素的同位素标记的
分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少
一个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素
标记的肽或蛋白质。
[0020] 例如，在一些实施方案中，所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质选自：具有至少两个13C同位素的同位素标记的
分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少
一个13C同位素和至少一个15N同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记
13 2
的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个 C同位素和至少一个 H同位素的
同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
质；具有至少一个13C同位素和至少一个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试
剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素和至少一
个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质；具有至少两个15N同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素
标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个15N同位素和至少一个2H同位
素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或
蛋白质；具有至少一个15N同位素和至少一个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记
试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个15N同位素和至少
一个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素
标记的肽或蛋白质；具有至少两个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位
素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个2H同位素和至少一个18O同
位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽
或蛋白质；具有至少一个2H同位素和至少一个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标
记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少两个18O同位素的同
位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
18 34
质；具有至少一个 O同位素和至少一个 S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试
剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素、至少一
个15N同位素和至少一个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的
氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至
18
少一个 O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位
素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的
同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
质；具有至少一个18O同位素、至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的同位素标记的分析
物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质。
分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少
一个13C同位素和至少一个15N同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记
13 2
的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个 C同位素和至少一个 H同位素的
同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
质；具有至少一个13C同位素和至少一个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试
剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素和至少一
个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质；具有至少两个15N同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素
标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个15N同位素和至少一个2H同位
素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或
蛋白质；具有至少一个15N同位素和至少一个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记
试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个15N同位素和至少
一个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素
标记的肽或蛋白质；具有至少两个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位
素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个2H同位素和至少一个18O同
位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽
或蛋白质；具有至少一个2H同位素和至少一个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标
记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少两个18O同位素的同
位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
18 34
质；具有至少一个 O同位素和至少一个 S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试
剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素、至少一
个15N同位素和至少一个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的
氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至
18
少一个 O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位
素标记的肽或蛋白质；具有至少一个13C同位素、至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的
同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
质；具有至少一个18O同位素、至少一个15N同位素和至少一个34S同位素的同位素标记的分析
物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质。
[0021] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质选自：一种同位素标记的分析物、同位素标记试
剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质、同位素标记的氨基酸，其选自：具
有1、2、3或4个15N同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/
或同位素标记的肽或蛋白质；具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个13C同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有1或2
个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质；具有1个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记
的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；以及具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
质。
剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质、同位素标记的氨基酸，其选自：具
有1、2、3或4个15N同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/
或同位素标记的肽或蛋白质；具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个13C同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；具有1或2
个18O同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质；具有1个34S同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记
的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质；以及具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个2H同位素的同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白
质。
[0022] 本发明的方法包括使用同位素编码氨基酸(例如同位素标记的氨基酸)的定量方法。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸是天然存在的氨基酸的同位素体。
例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸是丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甲
硫氨酸或精氨酸的同位素体。例如，在一个实施方案中，所述同位素体具有的稳定的重同位
素的数目选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。例如，在一个实施方案中，每种样品的同位素标记的氨基酸的编码元素式的同位素组成选自：
例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸是丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甲
硫氨酸或精氨酸的同位素体。例如，在一个实施方案中，所述同位素体具有的稳定的重同位
素的数目选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。例如，在一个实施方案中，每种样品的同位素标记的氨基酸的编码元素式的同位素组成选自：
[0023] 12C3-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤3，j≤4，n≤l，o≤l；
[0024] 12C6-i13Ci1H7-j2Hj14N4-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤7，n≤4，o≤l；
[0025] 12C4-i13Ci1H3-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤4，j≤3，n≤2，o≤2；
[0026] 12C4-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤4，j≤3，n≤1，o≤2；
[0027] 12C3-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤3，j≤3，n≤1，o≤l，p≤l；
[0028] 12C5-i13Ci1H5-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤5，j≤5，n≤1，o≤2；
[0029] 12C5-i13Ci1H5-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo,其中i≤5，j≤5，n≤2，o≤2；
[0030] 12C2-i13Ci1H2-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤2，j≤2，n≤l，o≤l；
[0031] 12C6-i13Ci1H5-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤5，n≤3，o≤l；
[0032] 12C6-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤10，n≤l，o≤l；
[0033] 12C6-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤10，n≤l，o≤l；
[0034] 12C6-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤6，j≤9，n≤2，o≤l；
[0035] 12C5-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤5，j≤8，n≤1，o≤l，p≤l；
[0036] 12C9-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤9，j≤8，n≤1，o≤1；
[0037] 12C5-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤5，j≤7，n≤1，o≤1；
[0038] 12C3-i13Ci1H3-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤3，j≤3，n≤1，o≤1；
[0039] 12C4-i13Ci1H5-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤4，j≤5，n≤1，o≤1；
[0040] 12C11-i13Ci1H8-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤11，j≤8，n≤2，o≤1；
[0041] 12C9-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤9，j≤7，n≤1，o≤1；以及
[0042] 12C5-i13Ci1H8-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo,其中i≤5，j≤8，n≤1，o≤1；
[0043] 其中i、j、n、o和p中的每一个均独立地为整数或0。
[0044] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸具有下式：
[0045]
[0046] 其中gN和hN都是15N；或gN和hN之一是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C；或gN和hN之一是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH是2H；或iO是18O；或aC、bC、cC、dC、eC和fC中的两个是13C；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H。
[0047] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸具有下式：
[0048]
[0049] 其中gN和hN都是15N，并且iO是18O；或gN和hN都是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C；或gN和hN都是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、t u v 2 g h 15 a b c d e f 13 i 18 g hH、H和H之一是H；或N和N之一是 N，C、C、C、C、C和C之一是 C，并且O是 O；或N和N
都是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或gN和hN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC的三个是13C；或gN和hN之一是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN和hN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nHo p q r s t u v 2 a b c d e f 13 i 18 g
、H、H、H、H、H、H、H和H之一是 H；或 C、C、C、C、C和C的两个是 C，并且 O是 O；或 N
和hN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的四个是13C；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN和hN之一是15N，并且jH、kH、lH、m n o p q r s t u v 2 a b c d e f 13 j k
H、H、H、H、H、H、H、H、H和H的三个是H；或 C、C、C、C、C和C的三个是 C，并且H、H、
lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H，并且iO是18O；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的三个是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的四个是2H。
都是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或gN和hN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC的三个是13C；或gN和hN之一是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN和hN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nHo p q r s t u v 2 a b c d e f 13 i 18 g
、H、H、H、H、H、H、H和H之一是 H；或 C、C、C、C、C和C的两个是 C，并且 O是 O；或 N
和hN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的四个是13C；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN和hN之一是15N，并且jH、kH、lH、m n o p q r s t u v 2 a b c d e f 13 j k
H、H、H、H、H、H、H、H、H和H的三个是H；或 C、C、C、C、C和C的三个是 C，并且H、H、
lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H，并且iO是18O；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的三个是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的四个是2H。
[0050] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸具有下式：
[0051]
[0052] 其中gN、hN、wN和xN的两个是15N；或gN、hN、wN和xN之一是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C；或gN、hN、wN和xN之一是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或iO是18O；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H。
[0053] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的氨基酸的式为：
[0054]
[0055] 其中gN、hN、wN和xN的四个是15N；或gN、hN、wN和xN的三个是15N，并且aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C；或gN、hN、wN和xN的三个是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之2 g h w x 15 i 18 g h w x 15 a b
一是H；或N、N、N和 N的两个是 N，并且O是 O；或N、N、N和 N的两个是 N，并且 C、C、
cC、dC、eC和fC的两个是13C；或gN、hN、wN和xN的两个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或gN、hN、wN和xN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN的两个是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、t u v 2 g h w x 15 a b c d e f 13 g
H、H和H的两个是H；或N、N、N和N之一是 N，并且 C、C、C、C、C和C的三个是 C；或 N、
hN、wN和xN之一是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN之一是
15 a b c d e f 13 j k l m n o p q r s t u v
N，C、C、C、C、C和C之一是 C，并且H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H和H的两个是
2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的四个是13C；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN之一是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的三个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的三个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H，并且iO是18O；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的三个是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之四是2H。
一是H；或N、N、N和 N的两个是 N，并且O是 O；或N、N、N和 N的两个是 N，并且 C、C、
cC、dC、eC和fC的两个是13C；或gN、hN、wN和xN的两个是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或gN、hN、wN和xN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN的两个是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、t u v 2 g h w x 15 a b c d e f 13 g
H、H和H的两个是H；或N、N、N和N之一是 N，并且 C、C、C、C、C和C的三个是 C；或 N、
hN、wN和xN之一是15N，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN之一是15N，aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN之一是
15 a b c d e f 13 j k l m n o p q r s t u v
N，C、C、C、C、C和C之一是 C，并且H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H、H和H的两个是
2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的四个是13C；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H，并且iO是18O；或gN、hN、wN和xN之一是15N，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的三个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的三个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之一是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H，并且iO是18O；或aC、bC、cC、dC、eC和fC的两个是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的两个是2H；或aC、bC、cC、dC、eC和fC之一是13C，并且jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH的三个是2H；或jH、kH、lH、mH、nH、oH、pH、qH、rH、sH、tH、uH和vH之四是2H。
[0056] 本发明的方法包括使用同位素编码的标记试剂(例如同位素标记的标记试剂)和同位素编码的标记物(例如同位素标记的分析物的官能团，包括同位素标记的肽基团)的定
量方法。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记试剂包含胺反应基团或羧酸反应基团，
例如一种或多种与蛋白质或肽的胺基团或羧酸基团反应的官能团。例如，在一个实施方案
中，所述同位素标记试剂是肽同位素标签或经修饰的肽同位素标签的同位素体。例如，在一
个实施方案中，所述同位素标记试剂是肽标记物试剂的同位素体。例如，在一个实施方案
中，每种样品的肽同位素标签或经修饰的肽同位素标签的同位素体的编码元素式的同位素
组成选自：
量方法。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记试剂包含胺反应基团或羧酸反应基团，
例如一种或多种与蛋白质或肽的胺基团或羧酸基团反应的官能团。例如，在一个实施方案
中，所述同位素标记试剂是肽同位素标签或经修饰的肽同位素标签的同位素体。例如，在一
个实施方案中，所述同位素标记试剂是肽标记物试剂的同位素体。例如，在一个实施方案
中，每种样品的肽同位素标签或经修饰的肽同位素标签的同位素体的编码元素式的同位素
组成选自：
[0057] 12C9-i13Ci1H7-j2Hj35Cl1-m37Clm 14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤7，m≤l，n≤l，o≤l；
[0058] 12C5-i13Ci1H1-j2Hj14N5-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤5，j≤1，n≤5，o≤1；
[0059] 12C5-i13Ci1H6-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤5，j≤6，n≤2；
[0060] 12C3-i13Ci1H2-j2Hj14N5-n15Nn，其中i≤3，j≤2，n≤5；
[0061] 12C4-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn，其中i≤4，j≤7，n≤3；
[0062] 12C4-i13Ci1H6-j2Hj14N4-n15Nn，其中i≤4，j≤6，n≤4；
[0063] 12C9-i13Ci1H7-j2Hj79Br1-l81Cll 14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤7，l≤l，n≤l，o≤l；
[0064] 12C4-i13Ci1H2-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤4，j≤2，n≤3，o≤1；
[0065] 12C4-i13Ci1H2-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤4，j≤2，n≤2，o≤2；
[0066] 12C5-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤5，j≤4，n≤2，o≤2；
[0067] 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤3，o≤4；
[0068] 12C9-i13Ci1H11-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤11，n≤1，o≤1；
[0069] 12C10-i13Ci1H10-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤10，j≤10，n≤1，o≤2；
[0070] 12C10-i13Ci1H9-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤10，j≤9，n≤3，o≤3；
[0071] 12C7-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤7，j≤7，n≤1，o≤1；
[0072] 12C11-i13Ci1H12-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤11，j≤12，n≤1，o≤l，p≤l；
[0073] 12C12-i13Ci1H17-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤12，j≤17，n≤1，o≤1；
[0074] 12C9-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤9，n≤2，o≤1；
[0075] 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤3，o≤4；
[0076] 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N3-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤3，o≤4；
[0077] 12C12-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤12，j≤13，n≤2，o≤3；
[0078] 12C16-i13Ci1H23-j2Hj14N2-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤16，j≤23，n≤2，o≤4；
[0079] 12C12-i13Ci1H15-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤12，j≤15，n≤2，o≤3；
[0080] 12C14-i13Ci1H19-j2Hj14N2-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤19，n≤2，o≤4；
[0081] 12C11-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤11，j≤13，n≤2，o≤2；
[0082] 12C8-i13Ci1H7-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤8，j≤7，n≤2，o≤2；
[0083] 12C18-i13Ci1H21-j2Hj14N4-n15Nn16O5-o18Oo，其中i≤18，j≤21，n≤4，o≤5；以及
[0084] 12C18-i13Ci1H21-j2Hj14N4-n15Nn16O5-o18Oo，其中i≤18，j≤21，n≤4，o≤5；
[0085] 其中i、j、l、m、n、o和p中的每一个均独立地为整数或0。
[0086] 例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物独立地包含肽标记物。例如，在一个实施方案中，每种同位素标记的分析物的肽标记物的编码元素式的同位素组成选
自：
自：
[0087] 12C14-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤14，j≤12，n≤8，o≤1；
[0088] 12C27-i13Ci1H27-j2Hj14N8-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤27，j≤27，n≤8，o≤4；
[0089] 12C17-i13Ci1H10-j2Hj14N6-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤17，j≤10，n≤6，o≤1；
[0090] 12C9-i13Ci1H10-j2Hj14N6-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤9，j≤10，n≤6，o≤1；
[0091] 12C30-i13Ci1H31-j2Hj14N12-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤30，j≤31，n≤12，o≤4；
[0092] 12C31-i13Ci1H35-j2Hj14N8-n15Nn16O6-o18Oo，其中i≤31，j≤35，n≤8，o≤6；
[0093] 12C15-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤15，j≤12，n≤8，o≤1；
[0094] 12C12-i13Ci1H8-j2Hj14N9-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤12，j≤8，n≤9，o≤1；
[0095] 12C11-i13Ci1H6-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤11，j≤6，n≤8，o≤1；
[0096] 12C31-i13Ci1H35-j2Hj14N8-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤31，j≤35，n≤8，o≤4；
[0097] 12C12-i13Ci1H20-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤12，j≤20，n≤2，o≤2；
[0098] 12C7-i13Ci1H13-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤7，j≤13，n≤2，o≤1；以及
[0099] 12C18-i13Ci1H25-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤18，j≤25，n≤3，o≤3；
[0100] 其中i、j、n和o中的每一个独立地为整数或0。
[0101] 例如，在一个实施方案中，所述方法的同位素标记试剂是小分子同位素标签的同位素体。例如，在一个实施方案中，每种样品的小分子同位素标签的同位素体的编码元素式
的同位素组成选自：
的同位素组成选自：
[0102] 12C9-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn，其中i≤9，j≤14，n≤1；
[0103] 12C3-i13Ci1H9-j2Hj28Si1-q30Siq，其中i≤3，j≤9，q≤1；
[0104] 12C11-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn32S1-p34Sp,其中i≤11，j≤7，n≤1，p≤l；
[0105] 12C12-i13Ci1H16-j2Hj14N6-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤16，n≤6，o≤2，p≤l；
[0106] 12C6-i13Ci1H15-j2Hj28Si1-q30Siq，其中i≤6，j≤15，q≤1；
[0107] 12C2-i13Ci1H3-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤2，j≤3，o≤2；
[0108] 12C3-i13Ci16O1-o18Oo,其中i≤3，o≤1；
[0109] 12C4-i13Ci1H5-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤4，j≤5，o≤2；
[0110] 12C1-i13Ci1H2-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤1，j≤2，n≤2；
[0111] 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤2，o≤2；
[0112] 12C2-i13Ci16O1-o18Oo,其中i≤2，o≤1；
[0113] 12C7-i13Ci1H6-j2Hj14N2-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤7，j≤6，n≤2，o≤3；
[0114] 12C7-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤7，j≤7，n≤3，o≤1；
[0115] 12C6-i13Ci1H3-j2Hj14N4-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤6，j≤3，n≤4，o≤4；
[0116] 12C6-i13Ci1H1-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤6，j≤1，o≤2；
[0117] 12C15-i13Ci1H11-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤15，j≤11，o≤2；
[0118] 12C6-i13Ci1H8-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤6，j≤8，o≤2；
[0119] 12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N3-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤12，n≤3，o≤2，p≤l；
[0120] 12C18-i13Ci1H23-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤18，j≤23，n≤2，o≤1；
[0121] 12C5-i13Ci1H4-j2Hj14N3-n15Nn，其中i≤5，j≤4，n≤3；
[0122] 12C6-i13Ci1H8-j2Hj16O2-o18Oo,其中i≤6，j≤8，o≤2；
[0123] 12C6-i13Ci1H7-j2Hj14N3-n15Nn，其中i≤6，j≤7，n≤3；
[0124] 12C6-i13Ci1H11-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤6，j≤11，n≤2，o≤1；
[0125] 12C11-i13Ci1H11-j2Hj14N3-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤11，j≤11，n≤3，o≤1；
[0126] 12C6-i13Ci1H2-j2Hj14N3-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤6，j≤2，n≤3，o≤3；
[0127] 12C9-i13Ci1H10-j2Hj14N2-n15Nn32S1-p34Sp,其中i≤9，j≤10，n≤2，p≤l；
[0128] 12C11-i13Ci1H7-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤11，j≤7，n≤1，o≤1；
[0129] 12C4-i13Ci16O1-o18Oo,其中i≤4，o≤1；
[0130] 12C7-i13Ci1H4-j2Hj14N2-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤7，j≤4，n≤2，o≤2，p≤l；
[0131] 12C7-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤7，j≤4，n≤1，o≤4；
[0132] 12C8-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn16O3-o18Oo，其中i≤8，j≤14，n≤1，o≤3；
[0133] 12C14-i13Ci1H14-j2Hj14N1-n15Nn16O4-o18Oo，其中i≤14，j≤14，n≤1，o≤4；
[0134] 12C9-i13Ci1H12-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤9，j≤12，n≤2；
[0135] 12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N3-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤12，n≤3，o≤2，p≤l；
[0136] 12C12-i13Ci1H12-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo32S1-p34Sp,其中i≤12，j≤12，n≤1，o≤2，p≤l；
[0137] 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤1，o≤2；
[0138] 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N4-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤4，o≤1；
[0139] 12C20-i13Ci1H15-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤20，j≤15，n≤2，o≤1；
[0140] 12C6-i13Ci1H12-j2Hj14N2-n15Nn，其中i≤6，j≤12，n≤2；
[0141] 12C5-i13Ci1H13-j2Hj14N1-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤5，j≤13，n≤1，o≤1；
[0142] 12C6-i13Ci1H4-j2Hj14N1-n15Nn16O2-o18Oo，其中i≤6，j≤4，n≤1，o≤2；以及
[0143] 12C8-i13Ci1H18-j2Hj14N1-n15Nn，其中i≤8，j≤18，n≤1；
[0144] 其中i、j、n、o、p和q中的每一个独立地为整数或0。
[0145] 用于本方法的同位素编码的化合物(例如所述同位素标记分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质)可包含较大范围的稳定的同位素
组合。例如，在一个实施方案中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、
同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个12C同位素和至少一个
15N同位素；至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸
和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个13C同位素和至少一个14N同位素。例如，在一
个实施方案中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨
基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个12C同位素和至少一个2H同位素；至少一
部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记
的肽或蛋白质包含至少一个13C同位素和至少一个1H同位素。例如，在一个实施方案中，至少
一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质包含至少一个14N同位素和至少一个2H同位素；至少一部分的所述同位素标
记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至
少一个15N同位素和至少一个1H同位素。例如，在一个实施方案中，至少一部分的所述同位素
标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含
至少一个16O同位素；至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记
的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个18O同位素。例如，在一个实施方案
中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或
同位素标记的肽或蛋白质包含至少两个13C、2H或15N同位素和至少一个16O同位素；至少一部
分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的
18 12 1 14
肽或蛋白质包含至少一个 O同位素和至少两个 C、H或 N同位素。例如，在一个实施方案
中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或
同位素标记的肽或蛋白质包含至少两个13C、2H或15N同位素；至少一部分的所述同位素标记
的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少
34 12 1 14
一个 S同位素和至少两个 C、H或 N同位素。
组合。例如，在一个实施方案中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、
同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个12C同位素和至少一个
15N同位素；至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸
和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个13C同位素和至少一个14N同位素。例如，在一
个实施方案中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨
基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个12C同位素和至少一个2H同位素；至少一
部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记
的肽或蛋白质包含至少一个13C同位素和至少一个1H同位素。例如，在一个实施方案中，至少
一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质包含至少一个14N同位素和至少一个2H同位素；至少一部分的所述同位素标
记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至
少一个15N同位素和至少一个1H同位素。例如，在一个实施方案中，至少一部分的所述同位素
标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含
至少一个16O同位素；至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记
的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少一个18O同位素。例如，在一个实施方案
中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或
同位素标记的肽或蛋白质包含至少两个13C、2H或15N同位素和至少一个16O同位素；至少一部
分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的
18 12 1 14
肽或蛋白质包含至少一个 O同位素和至少两个 C、H或 N同位素。例如，在一个实施方案
中，至少一部分的所述同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或
同位素标记的肽或蛋白质包含至少两个13C、2H或15N同位素；至少一部分的所述同位素标记
的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质包含至少
34 12 1 14
一个 S同位素和至少两个 C、H或 N同位素。
[0146] 例如，在一个实施方案中，每种所述同位素标记的分析物独立地为具有不同同位素标记物的蛋白质分析物或经修饰的蛋白质分析物。例如，在一个实施方案中，每种所述同
位素标记的分析物独立地为具有不同同位素标记物的肽分析物或经修饰的肽分析物。例
如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物的分子质量选自50Da至250kDa的范围，例
如对针对蛋白质或肽分析物的应用而言，任选地选自400Da至250kDa的范围。例如，在一个
实施方案中，所述同位素标记的分析物的分子质量彼此相差1至300mDa。
位素标记的分析物独立地为具有不同同位素标记物的肽分析物或经修饰的肽分析物。例
如，在一个实施方案中，所述同位素标记的分析物的分子质量选自50Da至250kDa的范围，例
如对针对蛋白质或肽分析物的应用而言，任选地选自400Da至250kDa的范围。例如，在一个
实施方案中，所述同位素标记的分析物的分子质量彼此相差1至300mDa。
[0147] 例如通过实现更高水平的多路复用，本发明的方法提供了对等量异位和SILAC型定量方法的改进。在一些实施方案中，增强的多路复用至少部分是由所述方法对非常多的
同位素编码的分析物、试剂、标记试剂、标记物、标准物、氨基酸等(其是利用质谱分析技术
根据质荷比可区分的同位素体)的兼容性导致的。在一个实施方案中，本发明提供了分析多
个样品中分析物的相对或绝对丰度的多路复用方法，例如对应于体内或体外条件的差异的
样品。例如，在一个实施方案中，所述方法用于分析至少2个样品中分析物的相对或绝对丰
度，对一些应用而言任选地至少4个样品，对一些应用而言任选地至少8个样品，对一些应用
而言任选地至少20个样品。例如，在一个实施方案中，所述提供多个细胞培养物的步骤包括
提供2-20个细胞培养物；并且其中所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括生成2-
100个样品。例如，在一个实施方案中，所述利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析
技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤产生对应于所述同位素标记的分析
物的2-150个独立且可区分的质谱信号。
同位素编码的分析物、试剂、标记试剂、标记物、标准物、氨基酸等(其是利用质谱分析技术
根据质荷比可区分的同位素体)的兼容性导致的。在一个实施方案中，本发明提供了分析多
个样品中分析物的相对或绝对丰度的多路复用方法，例如对应于体内或体外条件的差异的
样品。例如，在一个实施方案中，所述方法用于分析至少2个样品中分析物的相对或绝对丰
度，对一些应用而言任选地至少4个样品，对一些应用而言任选地至少8个样品，对一些应用
而言任选地至少20个样品。例如，在一个实施方案中，所述提供多个细胞培养物的步骤包括
提供2-20个细胞培养物；并且其中所述生成每种所述细胞培养物的样品的步骤包括生成2-
100个样品。例如，在一个实施方案中，所述利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析
技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物的步骤产生对应于所述同位素标记的分析
物的2-150个独立且可区分的质谱信号。
[0148] 本发明的方法与较大范围的提供有用分辨率的质谱技术兼容，所述质谱技术包括被设计用于检测多个样品(例如含蛋白质和肽的样品)中分析物的丰度的技术。例如，在一
个实施方案中，本发明的方法还包括在所述利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析
技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物或同位素标记的标准物的步骤之前，结合所
述样品——其特征在于不同的同位素标记的分析物——的步骤，从而保证每种样品均经历
相同的样品制备、纯化、电离、碎片化和/或检测条件。例如，在一个实施方案中，例如通过对
多个样品的组合的纯化步骤和质谱分析步骤，同时分析所述多个样品中不同的同位素标记
的分析物或同位素标记的标准物。例如，在一个实施方案中，所述分析每种样品中所述同位
素标记的分析物的步骤包括：生成每种所述同位素标记分析物的一个或多个产物离子，以
及利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术测定至少一部分所述产物离子的质
荷比。例如，在一个实施方案中，所述分析每种样品中所述同位素标记的分析物或同位素标
记的标准物的步骤是通过使用四级杆离子阱(quadrupole ion trap)、傅立叶变换离子回
旋共振离子阱(Fourier transform ion cyclotron resonance ion trap)、线性四级杆离
子阱(linear quadrupole ion trap)、轨道阱离子阱(orbitrap ion trap)、四极杆质量分
析器(quadrupole mass analyzer)或飞行时间质量分析器进行。
个实施方案中，本发明的方法还包括在所述利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析
技术分析每种样品的所述同位素标记的分析物或同位素标记的标准物的步骤之前，结合所
述样品——其特征在于不同的同位素标记的分析物——的步骤，从而保证每种样品均经历
相同的样品制备、纯化、电离、碎片化和/或检测条件。例如，在一个实施方案中，例如通过对
多个样品的组合的纯化步骤和质谱分析步骤，同时分析所述多个样品中不同的同位素标记
的分析物或同位素标记的标准物。例如，在一个实施方案中，所述分析每种样品中所述同位
素标记的分析物的步骤包括：生成每种所述同位素标记分析物的一个或多个产物离子，以
及利用提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术测定至少一部分所述产物离子的质
荷比。例如，在一个实施方案中，所述分析每种样品中所述同位素标记的分析物或同位素标
记的标准物的步骤是通过使用四级杆离子阱(quadrupole ion trap)、傅立叶变换离子回
旋共振离子阱(Fourier transform ion cyclotron resonance ion trap)、线性四级杆离
子阱(linear quadrupole ion trap)、轨道阱离子阱(orbitrap ion trap)、四极杆质量分
析器(quadrupole mass analyzer)或飞行时间质量分析器进行。
[0149] 例如，在一个实施方案中，所述分析所述同位素标记的分析物或同位素标记的标准物的步骤包括例如利用电喷雾电离和MALDI技术，从所述同位素标记的分析物或同位素
标记的标准物生成产物离子。例如，在一个实施方案中，所述分析所述同位素标记的分析物
或同位素标记的标准物的步骤包括使从所述同位素标记的分析物或同位素标记的标准物
生成的离子碎片化，例如使用选自碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离(SID)、激光诱导解离
(LID)、电子捕获解离(ECD)和电子转移解离(ETD)中的一种或多种技术。
标记的标准物生成产物离子。例如，在一个实施方案中，所述分析所述同位素标记的分析物
或同位素标记的标准物的步骤包括使从所述同位素标记的分析物或同位素标记的标准物
生成的离子碎片化，例如使用选自碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离(SID)、激光诱导解离
(LID)、电子捕获解离(ECD)和电子转移解离(ETD)中的一种或多种技术。
[0150] 例如，在一个实施方案中，本发明的方法还包括在所述分析每种样品中同位素标记的蛋白质或肽分析物的步骤之前，纯化所述样品的蛋白质或肽，例如通过液相色谱法(例
如，HPLC)、气相色谱法和/或毛细管电泳。例如，在一个实施方案中，本发明的方法还包括在
所述分析每种样品中同位素标记的蛋白质或肽分析物的步骤之前，将所述样品的蛋白质或
肽分级分离。
如，HPLC)、气相色谱法和/或毛细管电泳。例如，在一个实施方案中，本发明的方法还包括在
所述分析每种样品中同位素标记的蛋白质或肽分析物的步骤之前，将所述样品的蛋白质或
肽分级分离。
[0151] 本发明的方法可用于分析多种样品，包括生物材料和衍生自生物材料的样品，例如生物液体(biofluid)、细胞提取物、细胞裂解物、组织提取物等。本发明的方法可用于分
析衍生自体内生物材料的样品。本发明的方法可用于分析蛋白质组学分析中的样品(例如
微阵列样品)和衍生自体外分析中的样品。例如，在一个实施方案中，所述分析物是蛋白质、
肽、经修饰的蛋白质或经修饰的肽。本发明的方法可用于通过气相色谱-质谱法、液相色谱-
质谱法和电泳-质谱法来分析待分析样品。
析衍生自体内生物材料的样品。本发明的方法可用于分析蛋白质组学分析中的样品(例如
微阵列样品)和衍生自体外分析中的样品。例如，在一个实施方案中，所述分析物是蛋白质、
肽、经修饰的蛋白质或经修饰的肽。本发明的方法可用于通过气相色谱-质谱法、液相色谱-
质谱法和电泳-质谱法来分析待分析样品。
[0152] 另一方面，本发明提供了确定样品中分析物的丰度的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有所述分析物的样品，其中所述分析物是肽或蛋白质；(b)向所述样品提供同位
素标记的标准物，其中所述分析物和所述同位素标记的标准物是同位素体；且其中所述分
析物和所述同位素标记的标准物的分子质量之差小于或等于300mDa；(c)使用提供分辨率
等于或大于100000的质谱分析技术分析所述样品中的所述分析物和所述同位素标记的标
准物，从而生成所述样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的独立且可区分的质谱
信号；以及(e)比较所述样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的质谱信号，从而确
定所述样品中所述分析物的丰度。本文所使用的“同位素标记的标准物”是指提供给样品以
允许进行绝对或相对定量的同位素编码的化合物，例如以已知量(例如，具有已知浓度)被
提供给样品的同位素编码的肽或蛋白质。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的标准
物是使用一种或多种同位素标记的氨基酸(例如，本说明书通篇中提供的氨基酸)合成的同
位素编码的蛋白质或肽。在一个实施方案中，此方面的方法还包括：(a)提供多个样品，其中
每种样品均具有所述分析物；(b)为每种所述样品提供所述同位素标记的标准物；(c)使用
提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种所述样品中的所述分析物和所述
同位素标记的标准物，从而生成每种样品的所述分析物和所述同位素标记的标准物的独立
且可区分的质谱信号；以及(e)比较每种样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的
质谱信号，从而确定所述多个样品中所述分析物的丰度。
素标记的标准物，其中所述分析物和所述同位素标记的标准物是同位素体；且其中所述分
析物和所述同位素标记的标准物的分子质量之差小于或等于300mDa；(c)使用提供分辨率
等于或大于100000的质谱分析技术分析所述样品中的所述分析物和所述同位素标记的标
准物，从而生成所述样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的独立且可区分的质谱
信号；以及(e)比较所述样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的质谱信号，从而确
定所述样品中所述分析物的丰度。本文所使用的“同位素标记的标准物”是指提供给样品以
允许进行绝对或相对定量的同位素编码的化合物，例如以已知量(例如，具有已知浓度)被
提供给样品的同位素编码的肽或蛋白质。例如，在一个实施方案中，所述同位素标记的标准
物是使用一种或多种同位素标记的氨基酸(例如，本说明书通篇中提供的氨基酸)合成的同
位素编码的蛋白质或肽。在一个实施方案中，此方面的方法还包括：(a)提供多个样品，其中
每种样品均具有所述分析物；(b)为每种所述样品提供所述同位素标记的标准物；(c)使用
提供分辨率等于或大于100000的质谱分析技术分析每种所述样品中的所述分析物和所述
同位素标记的标准物，从而生成每种样品的所述分析物和所述同位素标记的标准物的独立
且可区分的质谱信号；以及(e)比较每种样品中所述分析物和所述同位素标记的标准物的
质谱信号，从而确定所述多个样品中所述分析物的丰度。
[0153] 本发明还提供了包括任何本文所述的同位素编码化合物的物质组合物，所述同位素编码化合物例如以纯化状态提供的本文所述的同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准
物、同位素标记的分析物、同位素标记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白质。例如，在一个实
施方案中，本发明还提供了包括任何本文所述的同位素编码化合物的物质组合物，所述同
位素编码化合物例如作为同位素富集的组合物提供的本文所述的同位素标记的氨基酸、同
位素标记的标准物、同位素标记的分析物、同位素标记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白
质。
物、同位素标记的分析物、同位素标记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白质。例如，在一个实
施方案中，本发明还提供了包括任何本文所述的同位素编码化合物的物质组合物，所述同
位素编码化合物例如作为同位素富集的组合物提供的本文所述的同位素标记的氨基酸、同
位素标记的标准物、同位素标记的分析物、同位素标记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白
质。
[0154] 不希望局限于任何特定的理论，本文可能讨论对与本文公开的设备和方法相关的潜在原理的观点或理解。应认识到，不考虑对任何机械解释或假说的最终正确性，本发明的
实施方案仍然是可操作且有用的。
附图说明
实施方案仍然是可操作且有用的。
附图说明
[0155] 图1.说明如何计算分辨率。图1A：通过一个定义，分辨率是m/Δm＝500/1＝500。图1B：通过第二定义，相同一对峰的分辨率是m/m1/2＝500/0.481＝1040。图1C：根据第二定义，
如果分辨率是500，m/z 500和m/z 501处的两个峰刚好是勉强可辨别的。
如果分辨率是500，m/z 500和m/z 501处的两个峰刚好是勉强可辨别的。
[0156] 图2.所选的一对赖氨酸标记肽在不同的分辨率设定下的质谱结果。在Orbitrap MS系统的常规操作分辨率(30000)下，所述两个NeuCode标记的肽不可区分，作为同一物质
出现。当在240000分辨率下分析时，这对肽被基线分离。在其最高分辨率480000下操作所述
系统使在该复杂混合物中检测到的几乎每种肽都被基线分离。
出现。当在240000分辨率下分析时，这对肽被基线分离。在其最高分辨率480000下操作所述
系统使在该复杂混合物中检测到的几乎每种肽都被基线分离。
[0157] 图3.示出了通过将9个重同位素(选自15N、13C、2H和18O)掺入到氨基酸赖氨酸的不同位置而生成的41种不同的同位素体的图。所述同位素体的质量范围跨度仅为41.4mDa。X
轴代表每种同位素体的编号，Y轴为每种同位素体与正常赖氨酸残基的质量差异(Da)。
轴代表每种同位素体的编号，Y轴为每种同位素体与正常赖氨酸残基的质量差异(Da)。
[0158] 图4.是SILAC和等量异位标记方法的概述。在SILAC中，产生3个同位素簇：“轻”(增加0Da)、“中”(增加4Da)和“重”(增加8Da)。MS1分析中可区分这些信号，并且在整个洗脱谱
中提取出每一种的离子谱图，使得将每个肽约50次扫描的定量数据取平均值。等量异位标
记中，所有通路具有相同质量，使得在MS1仅产生一个同位素簇峰。在MS2的碰撞激活解离
(CAD)碎片化过程中，标签裂解并检测到报告离子信号。能够整合这些报告离子信号以确定
相对丰度。
中提取出每一种的离子谱图，使得将每个肽约50次扫描的定量数据取平均值。等量异位标
记中，所有通路具有相同质量，使得在MS1仅产生一个同位素簇峰。在MS2的碰撞激活解离
(CAD)碎片化过程中，标签裂解并检测到报告离子信号。能够整合这些报告离子信号以确定
相对丰度。
[0159] 图5-7.NeuCode标记的肽的MS/MS扫描。在低分辨率下，例如图5中所示，定量信息是不可见的且所述峰作为单峰出现。但是在高分辨率下(图6)，这些峰显示为提供其他信息
的多重峰(图7)。这些数据反映了丰度并可用于定量。
的多重峰(图7)。这些数据反映了丰度并可用于定量。
[0160] 图8.示出在R＝480000或960000时，可被区分的最小质量间隔的理论计算。图8A-在m/z 1200时(质量分辨率为103至106)能够分辨的最小m/z(理论的)差异。图8B-在不同质
量分辨率(103至106)下分辨的肽的百分比(FWOM)。
量分辨率(103至106)下分辨的肽的百分比(FWOM)。
[0161] 图9.当使用13C、2H、15N、18O原子的不同组合使赖氨酸的质量增加2Da时可能的赖氨酸同位素体。同位素体覆盖的质量范围取决于重同位素的数目和该标记分子的总体组成。
就Lys+2Da而言，能获得18.5mDa的质量范围。
就Lys+2Da而言，能获得18.5mDa的质量范围。
[0162] 图10.使用NeuCode SILAC方法，从质量相差36mDa的两个赖氨酸同位素体得到的初步数据。图10A-对胰蛋白酶酵母肽的60分钟nLC-MS/MS分析之后的基峰谱图。图10B-在
30K时MS1扫描#12590，插入图是具有m/z 827的所选母离子。图10B示出了在随后的高分辨
率MS1扫描(480K)中记录的信号，插入图表示在常规分辨率下该SILAC对被掩盖。图10C-中
子编码的SILAC对的CAD和离子阱m/z分析之后的MS/MS图谱。
30K时MS1扫描#12590，插入图是具有m/z 827的所选母离子。图10B示出了在随后的高分辨
率MS1扫描(480K)中记录的信号，插入图表示在常规分辨率下该SILAC对被掩盖。图10C-中
子编码的SILAC对的CAD和离子阱m/z分析之后的MS/MS图谱。
[0163] 图11.NeuCode提供了与传统SILAC相当的定量数据。图11A-水平虚线表示真实的比例(灰色＝1:1，黑色＝5:1)，而箱线图(boxplot)标定了中位数(横线)、25至75百分位数
(四分位数范围，箱)、四分位数范围的1.5倍(短横线(whisker))及异常点(空心圆)。根据这
些数据可得出结论，NeuCode SILAC(图中称为OMNE SILAC)提供了定量准确度以及传统
SILAC中无法分辨的精度。图11B-对于NeuCode SILAC和传统SILAC，PSM产生定量信息的次
数的百分比为母离子强度的函数。随着母离子强度降低，两种方法产生定量数据的频率降
低(以基本上相同的速率)；但是，母离子强度小于105.5(任意单位)时NeuCode SILAC产生
1824个PSM，而传统SILAC在相同范围仅检测到522个PSM。与传统SILAC相比，NeuCode SILAC
使取样深度增加，同时保持高度相当的定量准确度和精度。
(四分位数范围，箱)、四分位数范围的1.5倍(短横线(whisker))及异常点(空心圆)。根据这
些数据可得出结论，NeuCode SILAC(图中称为OMNE SILAC)提供了定量准确度以及传统
SILAC中无法分辨的精度。图11B-对于NeuCode SILAC和传统SILAC，PSM产生定量信息的次
数的百分比为母离子强度的函数。随着母离子强度降低，两种方法产生定量数据的频率降
低(以基本上相同的速率)；但是，母离子强度小于105.5(任意单位)时NeuCode SILAC产生
1824个PSM，而传统SILAC在相同范围仅检测到522个PSM。与传统SILAC相比，NeuCode SILAC
使取样深度增加，同时保持高度相当的定量准确度和精度。
[0164] 图12.NeuCode SILAC(图中标记为OMNE SILAC)和传统SILAC的所有鉴定中(1％FDR)，作为鉴定e-值(～显著性)的函数的质量误差(ppm)分布的图。与传统SILAC相比，
NeuCode标记未显著影响质量准确度。
NeuCode标记未显著影响质量准确度。
[0165] 图13.SILAC中最常用的6种氨基酸的中子编码同位素体的数目及其质量范围。
[0166] 图14.使用+8Da赖氨酸的同位素体的三路和四路NeuCode SILAC策略的说明。在480K的分辨率时，携带间距约18mDa的赖氨酸的不同NeuCode标记的肽提供了三路定量方法
(红和红/蓝同位素体)。在较高分辨率(即960K)时，所述同位素体的间隔可较小(约12mDa)
使得能够进行四路定量(蓝和红/蓝同位素体)。
(红和红/蓝同位素体)。在较高分辨率(即960K)时，所述同位素体的间隔可较小(约12mDa)
使得能够进行四路定量(蓝和红/蓝同位素体)。
[0167] 图15.+4Da、+8Da和+12Da赖氨酸同位素体的可能的同位素体、质量范围和多路复用能力的总结。所述3种标记物的组合可产生高度多路复用的定量能力。
[0168] 图16.当利用13C、2H、15N和18O原子的不同组合来增加4、8或12个额外的中子时，氨基酸赖氨酸的理论同位素体的质量和同位素组成的图。
[0169] 图17.使用双重赖氨酸同位素体(13C6/15N2Lys(+8.0142Da)或2H8(+8.0502Da))，将NeuCode SILAC策略和传统的多-Da SILAC策略结合以获得非常高度的多路复用能力的初
步结果。一旦被标记，含有双重NeuCode SILAC和mTRAQ的肽就以1:1:1:1:1:1(左)或10:10:
5:5:1:1(右)的比例混合(6路)。
步结果。一旦被标记，含有双重NeuCode SILAC和mTRAQ的肽就以1:1:1:1:1:1(左)或10:10:
5:5:1:1(右)的比例混合(6路)。
[0170] 图18.包含最高达8个13C和15N原子以及4个18O原子(无2H原子)的化学标签的不同同位素体。
[0171] 图19.在480K分辨率下使用本文所述的9路标签得到的理论图谱。C图表示定量数据，且其仅在高分辨率分析中显示。
[0172] 图20.可包含足够的C、N和O原子以提供图18所述的同位素体组合的化合物。
[0173] 图21.可用作NeuCode化学标签的另一种化合物。
[0174] 图22.使用质量相差27mDa的两种同位素标记的Leu的NeuCode策略的说明。一种同13 15 2
位素体具有6个 C原子和1个 N原子，另一种同位素体含有7个H原子。使两种酵母培养物在
亮氨酸缺陷培养基上生长，每一种所述培养基含有所述亮氨酸同位素体中的一种。将来自
每种培养物的蛋白质消化、混合在一起，并且通过使用Orbitrap MS系统的高分辨率质谱法
分析获得的肽(AAAVRDL*SE)。通过比较同位素体种类之间的峰高，进行相对蛋白质丰度测
量。
位素体具有6个 C原子和1个 N原子，另一种同位素体含有7个H原子。使两种酵母培养物在
亮氨酸缺陷培养基上生长，每一种所述培养基含有所述亮氨酸同位素体中的一种。将来自
每种培养物的蛋白质消化、混合在一起，并且通过使用Orbitrap MS系统的高分辨率质谱法
分析获得的肽(AAAVRDL*SE)。通过比较同位素体种类之间的峰高，进行相对蛋白质丰度测
量。
[0175] 图23.肽上的伯胺的氨甲酰化标记的说明。图23A-加热时脲将肽的伯胺氨甲酰化。被脲(用13C或15N2标记)氨甲酰化的肽是被单个13C或15N(对于每个添加的氨甲酰基基团)氨
甲酰化。这些氨甲酰基标签的质量差异为6.3mDa/氨甲酰化位点。图23B-用每种经标记的脲
使肽LEQNPEESQDIK氨甲酰化。所述肽的N-末端和赖氨酸链上的伯胺都被氨甲酰化，从而生
成相差12.6mDa的肽。对具有电荷(z)＝2的肽而言，观察到的差异为6.6的m/z差异。
甲酰化。这些氨甲酰基标签的质量差异为6.3mDa/氨甲酰化位点。图23B-用每种经标记的脲
使肽LEQNPEESQDIK氨甲酰化。所述肽的N-末端和赖氨酸链上的伯胺都被氨甲酰化，从而生
成相差12.6mDa的肽。对具有电荷(z)＝2的肽而言，观察到的差异为6.6的m/z差异。
[0176] 图24.示出了具有能被掺入分子的稳定的重同位素的常见元素的表格。第三列提供了每种同位素的标称质量(nominal mass)，第三列提供了精确质量。第四列提供了所述
同位素的丰度比例。
同位素的丰度比例。
[0177] 图25.可被用作同位素标记试剂的常见氨基酸的结构、化学式和编码元素式。
[0178] 图26.可被用作同位素标记试剂的肽标记物的结构、化学式和编码元素式，所述肽标记物与肽发生反应或在该肽的合成过程中被与该肽连接。
[0179] 图27.可被用作同位素标记试剂的其他肽标记物的结构、化学式和编码元素式。
[0180] 图28.可被用作同位素标记试剂的小分子标记物的结构、化学式和编码元素式。
[0181] 图29.该图示出了NeuCode SILAC和SILAC证实衍生自小鼠的C2C12成肌细胞的肌源性分化过程中的定量蛋白质变化的强相关性(m＝0.82，R2＝0.78)。
[0182] 图30.SILAC和NeuCode的基因本体富集。在从成肌细胞到肌管的分化过程中被下调(-)或上调(+)的统计上显著的基因本体生物过程项(term)(p-值，使用Benjamini-
Hochberg校正的Fisher精确检验)。
Hochberg校正的Fisher精确检验)。
具体实施方式
[0183] 通常，本文所使用的术语和短语具有其在本领域中公认的含义，所述含义能够通过参考本领域技术人员已知的标准教科书、期刊文献和上下文中找到。提供以下定义以说
明其在本发明上下文中的具体使用。
明其在本发明上下文中的具体使用。
[0184] 在一个实施方案中，将本发明的组合物或化合物(例如同位素编码的化合物，包括同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准物和/或
同位素标记的肽或蛋白质)分离或纯化。在一个实施方案中，分离或纯化的化合物至少是本
领域中所理解的部分分离或纯化。在一个实施方案中，本发明的组合物或化合物的化学纯
度为90％，任选地对一些应用而言为95％，任选地对一些应用而言为99％，任选地对一些应
用而言为99.9％，任选地对一些应用而言为99.99％，并且任选地对一些应用而言为
99.999％纯的。在一些实施方案中，本发明的分离或纯化的化合物(例如同位素编码的化合
物，包括同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准
物和/或同位素标记的肽或蛋白质)是富含同位素的组合物。
同位素标记的肽或蛋白质)分离或纯化。在一个实施方案中，分离或纯化的化合物至少是本
领域中所理解的部分分离或纯化。在一个实施方案中，本发明的组合物或化合物的化学纯
度为90％，任选地对一些应用而言为95％，任选地对一些应用而言为99％，任选地对一些应
用而言为99.9％，任选地对一些应用而言为99.99％，并且任选地对一些应用而言为
99.999％纯的。在一些实施方案中，本发明的分离或纯化的化合物(例如同位素编码的化合
物，包括同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准
物和/或同位素标记的肽或蛋白质)是富含同位素的组合物。
[0185] 许多本文公开的分子包含一个或多个可电离基团。可电离基团包括能够从其中移除质子的基团(例如，-COOH)或向其中增加质子的基团(例如，胺)以及可被季铵化
(quaternize)的基团(例如，胺)。本公开内容意欲分别包括此类分子及其盐的所有可能的
离子形式。关于本文所述化合物的盐，本领域普通技术人员能够在适用于制备用于给定应
用的本发明的盐的多种可获得平衡离子中进行选择。在特定的应用中，对用于制备盐的给
定阴离子或阳离子的选择能导致所述盐的溶解度增加或降低。
(quaternize)的基团(例如，胺)。本公开内容意欲分别包括此类分子及其盐的所有可能的
离子形式。关于本文所述化合物的盐，本领域普通技术人员能够在适用于制备用于给定应
用的本发明的盐的多种可获得平衡离子中进行选择。在特定的应用中，对用于制备盐的给
定阴离子或阳离子的选择能导致所述盐的溶解度增加或降低。
[0186] 本发明的化合物可含有一个或多个手性中心。因此，本发明意欲包括外消旋混合物、非对映异构体、对映异构体、互变异构体和富含一种或多种立体异构体的混合物。本发
明所述和所要求保护的范围包括所述化合物的外消旋形式，以及其单独的对映异构体和非
外消旋混合物。
明所述和所要求保护的范围包括所述化合物的外消旋形式，以及其单独的对映异构体和非
外消旋混合物。
[0187] 本文所使用的术语“基团”可指化合物的官能团。本发明的化合物的基团是指作为所述化合物一部分的原子或原子的集合。本发明的基团可通过一个或多个共价键与该化合
物的其他原子连接。还可通过其价态来表征基团。本发明包括特征为一价、二价、三价等价
态的基团。
物的其他原子连接。还可通过其价态来表征基团。本发明包括特征为一价、二价、三价等价
态的基团。
[0188] 本文所使用的术语“母离子”指在质谱分析的电离阶段(包括MS/MS分析的MS1电离阶段)中产生的离子。
[0189] 本文所使用的术语“产物离子”和“次级离子”在本说明书中互换使用，指在质谱分析的电离和/或碎片化过程中产生的离子。本文所使用的术语“次级产物离子”是指作为连
续碎片化的产物的离子。
续碎片化的产物的离子。
[0190] 本文所使用的术语“分析”指确定分析物的性质的过程。例如，分析能够确定分析物的物理性质，例如质量、质荷比、浓度、绝对丰度、相对丰度或者原子或取代基组成。在蛋
白质组学分析中，术语“分析”指确定样品中蛋白质或肽的组成(例如，序列)和/或丰度。
白质组学分析中，术语“分析”指确定样品中蛋白质或肽的组成(例如，序列)和/或丰度。
[0191] 本文所使用的术语“分析物”指作为分析对象的化合物、化合物的混合物或其他组合物。分析物包括但不限于：蛋白质、经修饰的蛋白质、肽、经修饰的肽、小分子、药物化合
物、寡核苷酸、糖、聚合物、代谢物、脂质及其混合物。“同位素标记的分析物”指已被一种或
多种同位素标记物(例如一种或多种稳定的重同位素)以这样的方式标记的分析物，所述方
式即允许通过质谱法根据质荷比区分同位素标记的分析物的同位素体并独立地进行定量
分析。例如，“同位素标记的分析物”包括具有氢、碳、氧、氮、硫、氯、溴和硅的一种或多种稳定的重同位素的分析物，所述稳定的重同位素例如13C、15N、2D、17O、18O、34S、37Cl、81Br、29Si和30Si。
物、寡核苷酸、糖、聚合物、代谢物、脂质及其混合物。“同位素标记的分析物”指已被一种或
多种同位素标记物(例如一种或多种稳定的重同位素)以这样的方式标记的分析物，所述方
式即允许通过质谱法根据质荷比区分同位素标记的分析物的同位素体并独立地进行定量
分析。例如，“同位素标记的分析物”包括具有氢、碳、氧、氮、硫、氯、溴和硅的一种或多种稳定的重同位素的分析物，所述稳定的重同位素例如13C、15N、2D、17O、18O、34S、37Cl、81Br、29Si和30Si。
[0193] 本文所使用的术语“质谱法”(MS)指用于确定分析物的元素组成、质荷比、绝对丰度和/或相对丰度的分析技术。质谱技术可用于说明分析物的组成和/或丰度，所述分析物
例如蛋白质、肽和其他化合物。质谱法包括以下过程，其包括使分析物电离以产生荷电物质
或物质碎片，使荷电物质或物质碎片(例如产物离子)的碎片化，以及荷电物质或物质碎片
的质荷比的测量，任选地包括基于质荷比的额外分离过程、其他碎片化过程、电荷转移过程
等。对分析物进行质谱分析产生质谱数据，例如包括所述分析物和/或分析物碎片的质荷比
和对应的强度数据。对应于分析物离子和分析物离子碎片的质谱数据通常以强度形式提
供，其作为代表所述分析物离子和分析物离子碎片质荷比的质荷比(m/z)单位的函数。通
常，质谱法使得对应于差异分析物的强度按照不同的质荷比被分辨。在串联质谱法(MS/MS
或MS2)中，进行多个连续的质谱分析。例如，能够使含有蛋白质和肽混合物的样品电离，并
根据其质荷比使所得母离子分离。然后使所选取的母离子碎片化，再根据所得碎片的质荷
比进一步分析。
例如蛋白质、肽和其他化合物。质谱法包括以下过程，其包括使分析物电离以产生荷电物质
或物质碎片，使荷电物质或物质碎片(例如产物离子)的碎片化，以及荷电物质或物质碎片
的质荷比的测量，任选地包括基于质荷比的额外分离过程、其他碎片化过程、电荷转移过程
等。对分析物进行质谱分析产生质谱数据，例如包括所述分析物和/或分析物碎片的质荷比
和对应的强度数据。对应于分析物离子和分析物离子碎片的质谱数据通常以强度形式提
供，其作为代表所述分析物离子和分析物离子碎片质荷比的质荷比(m/z)单位的函数。通
常，质谱法使得对应于差异分析物的强度按照不同的质荷比被分辨。在串联质谱法(MS/MS
或MS2)中，进行多个连续的质谱分析。例如，能够使含有蛋白质和肽混合物的样品电离，并
根据其质荷比使所得母离子分离。然后使所选取的母离子碎片化，再根据所得碎片的质荷
比进一步分析。
[0194] 本文所使用的术语“干扰”指在分析中检测到的干扰目的物质或分析物的检测的物质。干扰可以指蛋白质或蛋白质碎片的检测，所述蛋白质或蛋白质片段不是目的蛋白质
或蛋白质片段并干扰所述目的蛋白质或蛋白质碎片的准确检测或定量。干扰可被定量为干
扰比，例如干扰信号的量与分析物信号的量的比例。在质谱分析中，干扰可表现为对应于对
作为非目的分析物的物质的检测的干扰峰。
或蛋白质片段并干扰所述目的蛋白质或蛋白质碎片的准确检测或定量。干扰可被定量为干
扰比，例如干扰信号的量与分析物信号的量的比例。在质谱分析中，干扰可表现为对应于对
作为非目的分析物的物质的检测的干扰峰。
[0195] 本文所述的“分离”或“分离窗口”指离子的范围，所述离子例如被选择性地分开并碎片化、操控或分离的母离子。
[0196] 本文所使用的术语“物质”指特定的分子、化合物、离子、阴离子、原子、电子或质子。物质包括同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基酸和/或同位素标
记的肽或蛋白质。
记的肽或蛋白质。
[0197] 本文所使用的术语“信噪比”指对噪声或不想要的信号破坏的信号程度进行定量的量度。信噪比也指信号功率与破坏该信号的噪声功率的比例。比例大于1:1表明信号大于
噪声，这对一些应用而言是合乎需要的。
噪声，这对一些应用而言是合乎需要的。
[0198] 本文所使用的术语“质荷比”指物质的质量与其荷电状态的比值。术语“m/z单位”指质荷比的量度。Thomson单位(简称Th)是m/z单位的一个实例，并被定义为离子的质量(单
位：道尔顿)与该离子的电荷(关于元电荷(elemental charge))之比的绝对值。
位：道尔顿)与该离子的电荷(关于元电荷(elemental charge))之比的绝对值。
[0199] 本文所使用的术语“离子光学”指例如通过施加电场和/或磁场，辅助荷电粒子的转运和操控的装置组件。所述电场或磁场可以是静态的、交变的或可同时含有静态和交变
部分。离子光学装置组件包括但不限于使离子偏转的离子偏转器、聚焦离子的离子透镜和
将离子限制于特定空间或轨道的多极(例如四极杆)装置。离子光学装置包括多极RF装置组
件，该装置组件包括同时具有静态和交变电场和/或磁场的多个杆。
部分。离子光学装置组件包括但不限于使离子偏转的离子偏转器、聚焦离子的离子透镜和
将离子限制于特定空间或轨道的多极(例如四极杆)装置。离子光学装置包括多极RF装置组
件，该装置组件包括同时具有静态和交变电场和/或磁场的多个杆。
[0200] 本文所使用的术语“质谱仪”指从样品中产生离子、根据质荷比将离子分开并检测离子的装置，所述离子例如衍生自同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨
基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质的产物离子。质谱仪包括单级或多级质谱仪。多级质谱
仪包括串联质谱仪，其使质量-分离的离子碎片化并通过质量分离所述产物离子。
基酸和/或同位素标记的肽或蛋白质的产物离子。质谱仪包括单级或多级质谱仪。多级质谱
仪包括串联质谱仪，其使质量-分离的离子碎片化并通过质量分离所述产物离子。
[0202] 术语“肽”和“多肽”在本说明书中作为同义词使用，指由酰胺键(或肽键)化学键合在一起的氨基酸残基组成的一类化合物。肽和多肽是包含至少两个氨基酸残基或经修饰的
氨基酸残基的多聚化合物。修饰可以是天然发生的或非天然发生的，例如通过化学合成产
生的修饰。对肽中的氨基酸的修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、脂化、异戊烯化、磺化、羟
基化、乙酰化、甲基化、甲硫氨酸氧化、烷基化、酰化、氨甲酰化、碘化和添加辅因子。肽包括
蛋白质，还包括降解蛋白质(例如通过蛋白质水解消化)生成的组合物。通过对蛋白质的基
本上完全消化或部分消化能够生成肽和多肽。多肽包括，例如，包含2-100个氨基酸单位的
多肽，在一些实施方案中任选地包含2-50个氨基酸单位，在一些实施方案中任选地包含2-
20个氨基酸单位，并且在一些实施方案中任选地包含2-10个氨基酸单位。
氨基酸残基的多聚化合物。修饰可以是天然发生的或非天然发生的，例如通过化学合成产
生的修饰。对肽中的氨基酸的修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、脂化、异戊烯化、磺化、羟
基化、乙酰化、甲基化、甲硫氨酸氧化、烷基化、酰化、氨甲酰化、碘化和添加辅因子。肽包括
蛋白质，还包括降解蛋白质(例如通过蛋白质水解消化)生成的组合物。通过对蛋白质的基
本上完全消化或部分消化能够生成肽和多肽。多肽包括，例如，包含2-100个氨基酸单位的
多肽，在一些实施方案中任选地包含2-50个氨基酸单位，在一些实施方案中任选地包含2-
20个氨基酸单位，并且在一些实施方案中任选地包含2-10个氨基酸单位。
[0203] “蛋白质”指包括一个或多个多肽链和/或经修饰的多肽链的一类化合物。蛋白质能够通过天然存在的方法(例如翻译后修饰或共翻译修饰)来修饰。示例性的翻译后修饰或
共翻译修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、脂化、异戊烯化、磺化、羟基化、乙酰化、甲基化、
甲硫氨酸氧化、添加辅因子、蛋白质水解和蛋白质组装成大分子复合物。蛋白质的修饰还可
包括通过化学合成产生的非天然存在的衍生物、类似物和功能模拟物。示例性的衍生物包
括化学修饰，例如烷基化、酰基化、氨甲酰化、碘化或衍生出所述蛋白质的任何修饰。
共翻译修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、脂化、异戊烯化、磺化、羟基化、乙酰化、甲基化、
甲硫氨酸氧化、添加辅因子、蛋白质水解和蛋白质组装成大分子复合物。蛋白质的修饰还可
包括通过化学合成产生的非天然存在的衍生物、类似物和功能模拟物。示例性的衍生物包
括化学修饰，例如烷基化、酰基化、氨甲酰化、碘化或衍生出所述蛋白质的任何修饰。
[0204] 本文所使用的术语“控制器”指本领域所熟知的能够被编程以控制装置或系统的装置组件。例如，控制器能够被编程以控制质谱仪系统，从而实施本文所述的方法。本发明
包括具有控制器的质谱仪，所述控制器被配置以实施本文所述的任何方法。
包括具有控制器的质谱仪，所述控制器被配置以实施本文所述的任何方法。
[0205] 如本领域所熟知的，本文所使用的术语“分级分离的”或“分级分离”指样品的物理分离。如本领域所熟知的，可根据样品的物理特性(例如质量、长度或与另一化合物的亲和
性等)使用色谱技术对样品进行分级分离。如本领域所熟知的，分级分离可发生在分离阶
段，其作用是根据一种或多种物理特性对目的样品进行分级分离。在其他技术中，分离阶段
能够使用液相和气相色谱技术。分离阶段包括但不限于液相色谱分离系统、气相色谱分离
系统、亲和色谱分离系统和毛细管电泳分离系统。
性等)使用色谱技术对样品进行分级分离。如本领域所熟知的，分级分离可发生在分离阶
段，其作用是根据一种或多种物理特性对目的样品进行分级分离。在其他技术中，分离阶段
能够使用液相和气相色谱技术。分离阶段包括但不限于液相色谱分离系统、气相色谱分离
系统、亲和色谱分离系统和毛细管电泳分离系统。
[0206] 化学中的定量分析是确定样品中存在的一种、几种或所有特定物质的绝对或相对丰度。对于生物样品而言，通过质谱进行的定量分析能够确定肽或蛋白质的相对丰度。所述
定量过程通常涉及蛋白质和肽分析物的同位素标记，以及通过质谱法进行的分析。
定量过程通常涉及蛋白质和肽分析物的同位素标记，以及通过质谱法进行的分析。
[0207] “碎片”指分子(例如肽)的一部分。碎片可以是单电荷或多电荷离子。碎片可衍生自母体分子中的键断裂，包括母体肽中多肽键的位点特异性断裂。碎片还可从复杂断裂事
件或步骤中产生。碎片可以是截短的肽，例如母体肽的羧基末端、氨基末端或两端。碎片可
以指多肽键、C-C键、C-N键、C-O键断裂或这些过程的组合断裂时生成的产物。碎片可以指通
过移除一个或多个氨基酸侧链或移除修饰的过程或者所述过程的任何组合而形成的产物。
适用于本发明的碎片包括在亚稳态条件下形成的碎片或通过多种方法向母体分子引入能
量而产生的碎片，所述方法包括但不限于碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离(SID)、激光诱
导解离(LID)、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)，或所述方法的任何组合或在串联
质谱法领域中已知的任何等价方法。适用于本发明的碎片还包括但不限于x型碎片、y型碎
片、z型碎片、a型碎片、b型碎片、c型碎片、内部离子(或内部断裂离子)、亚胺离子(immonium
ion)或卫星离子。来自分析物(例如，同位素标记的分析物、同位素标记的标准物和/或同位
素标记的肽或蛋白质)的碎片的类型通常取决于母体的序列、碎片化的方法、母离子的荷电
状态、引入到母离子的能量的量和将能量传递到母离子的方法。碎片的特性，例如分子质
量，可通过对碎片化质谱的分析来描述。
件或步骤中产生。碎片可以是截短的肽，例如母体肽的羧基末端、氨基末端或两端。碎片可
以指多肽键、C-C键、C-N键、C-O键断裂或这些过程的组合断裂时生成的产物。碎片可以指通
过移除一个或多个氨基酸侧链或移除修饰的过程或者所述过程的任何组合而形成的产物。
适用于本发明的碎片包括在亚稳态条件下形成的碎片或通过多种方法向母体分子引入能
量而产生的碎片，所述方法包括但不限于碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离(SID)、激光诱
导解离(LID)、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)，或所述方法的任何组合或在串联
质谱法领域中已知的任何等价方法。适用于本发明的碎片还包括但不限于x型碎片、y型碎
片、z型碎片、a型碎片、b型碎片、c型碎片、内部离子(或内部断裂离子)、亚胺离子(immonium
ion)或卫星离子。来自分析物(例如，同位素标记的分析物、同位素标记的标准物和/或同位
素标记的肽或蛋白质)的碎片的类型通常取决于母体的序列、碎片化的方法、母离子的荷电
状态、引入到母离子的能量的量和将能量传递到母离子的方法。碎片的特性，例如分子质
量，可通过对碎片化质谱的分析来描述。
[0208] 标记试剂的“胺反应性基团”可以是能够与肽、蛋白质或其他分子的胺基团发生反应，从而在所述标记试剂与所述肽、蛋白质或其他分子之间形成键的任何官能团。
[0209] “氨基酸”指包含氨基团(NH2)、羧酸基团(COOH)和多种侧链基团中任意种的有机化合物。氨基酸的特征在于通式NH2CHRCOOH，其中R是侧链基团。天然氨基酸是天然生成的
氨基酸，例如异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸和组氨酸，以及鸟氨酸和硒代半胱氨酸。
氨基酸，例如异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸和组氨酸，以及鸟氨酸和硒代半胱氨酸。
[0210] 本文所使用的“同位素标记的”指具有一个或多个同位素标记物(例如一种或多种稳定的重同位素)的化合物(例如，同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准物、同位素标记
的分析物、同位素标记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白质)。“同位素标记物”指被引入到
化合物(例如，同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准物、同位素标记的分析物、同位素标
记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白质)中的一种或多种稳定的重同位素，使得在利用质谱
法分析时所述化合物产生能够与其他化合物产生的信号相区分的信号，例如能够根据质荷
比与其他同位素体相区分的信号。“重同位素的(isotopically-heavy)”指具有一个或多个
高质量或重同位素(例如，稳定的重同位素例如13C、15N、2D、17O、18O、33S、34S、37Cl、81Br、29Si和30Si)的化合物或其碎片/部分。
的分析物、同位素标记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白质)。“同位素标记物”指被引入到
化合物(例如，同位素标记的氨基酸、同位素标记的标准物、同位素标记的分析物、同位素标
记试剂和/或同位素标记的肽或蛋白质)中的一种或多种稳定的重同位素，使得在利用质谱
法分析时所述化合物产生能够与其他化合物产生的信号相区分的信号，例如能够根据质荷
比与其他同位素体相区分的信号。“重同位素的(isotopically-heavy)”指具有一个或多个
高质量或重同位素(例如，稳定的重同位素例如13C、15N、2D、17O、18O、33S、34S、37Cl、81Br、29Si和30Si)的化合物或其碎片/部分。
[0211] 在一个实施方案中，富含同位素的组合物包括具有特定同位素组成的本发明的化合物，其中与天然存在的样品中具有相同同位素组成的相同化合物相比，所述化合物的丰
度至少大10倍，在一些实施方案中至少大100倍，在一些实施方案中至少大1000倍，在一些
实施方案中至少大10000倍。在另一个实施方案中，对于具有特定同位素组成的本发明的化
合物，富含同位素的组合物有基本上较高的纯度，例如纯度等于或大于90％，在一些实施方
案中等于或大于95％，在一些实施方案中等于或大于99％，在一些实施方案中等于或大于
99.9％，在一些实施方案中等于或大于99.99％，并且在一些实施方案中等于或大于
99.999％。在另一个实施方案中，对于具有特定同位素组成的本发明的化合物，富含同位素
的组合物是例如通过使用本领域已知的同位素纯化方法进行纯化的样品。
度至少大10倍，在一些实施方案中至少大100倍，在一些实施方案中至少大1000倍，在一些
实施方案中至少大10000倍。在另一个实施方案中，对于具有特定同位素组成的本发明的化
合物，富含同位素的组合物有基本上较高的纯度，例如纯度等于或大于90％，在一些实施方
案中等于或大于95％，在一些实施方案中等于或大于99％，在一些实施方案中等于或大于
99.9％，在一些实施方案中等于或大于99.99％，并且在一些实施方案中等于或大于
99.999％。在另一个实施方案中，对于具有特定同位素组成的本发明的化合物，富含同位素
的组合物是例如通过使用本领域已知的同位素纯化方法进行纯化的样品。
[0212] “质谱仪分辨能力”通常被称为“分辨率”，是对质谱中m/z峰被分离(即分辨)情况的定量量度。存在许多计算分辨率的规定。IUPAC定义是：
[0213] 分辨率(R)：R＝m/Δm
[0214] 图1A来自Harris,Quantitative Chemical Analysis。此图和上述公式说明了如何计算分辨率(R)，其中m是对应于该峰的质量，Δm是该峰和最近的相邻峰的间距。分辨率
的另一个可用定义是：
的另一个可用定义是：
[0215] 分辨率(R)：R＝m/m1/2
[0216] 在此定义中(参见图1B)，m是对应于该峰的质量，m1/2是该峰半峰高处全峰宽的变量(m1/2＝FWHM)。按照第二个定义，如果分辨率是500，则m/z 500和m/z 501处的两个峰恰
好可以勉强分开(图1C)。这种计算分辨率的方法特别有用，因为其提供了评估峰宽的量度，
不管是否存在有相邻峰以与该峰相比较。对于本文中所含的计算，本发明人使用了这种计
算分辨率的方法。
好可以勉强分开(图1C)。这种计算分辨率的方法特别有用，因为其提供了评估峰宽的量度，
不管是否存在有相邻峰以与该峰相比较。对于本文中所含的计算，本发明人使用了这种计
算分辨率的方法。
[0217] 本文所使用的化合物的“编码的元素式”指该化合物的组成元素，以及每种元素的原子数量，所述元素适合于用稳定的重同位素标记，例如以形成可在本发明的方法中通过
质谱法分析的同位素体。与化合物的化学式相比，该化合物的编码的元素式包含相同或更
少的元素，以及每种元素数量相同或更少的原子数量，因为该化合物的一些原子可能不适
于被同位素标记以形成用于本发明方法的同位素体。例如，在本方法中，容易与溶剂(例如
水)的氢原子交换的所述化合物的氢原子不适于被同位素标记，因为此类交换过程会破坏
同位素标记的分析物和/或标准物的同位素特征。同样，如果所述化合物中包含最终不存在
于所述同位素标记物质(例如，同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基
酸和/或同位素标记的肽或蛋白质)中的离去基团或反应基团，那么在本发明中，所述离去
基团或反应基团中的原子也不适于被同位素标记，因此这些原子并不被包含于所述编码的
元素式中。例如，在所述标签和所述分析物之间的化学反应中，此类反应基团和/或离去基
团的某些元素可能被交换或者移除或丢失，因此不会被纳入该同位素标记物中。例如，在一
个实施方案中，赖氨酸的化学式是C6H14N2O2，而赖氨酸的编码元素式是C6Η9Ν2Ο。在一个实
施方案中，化合物的编码元素式不包括容易与溶剂的H原子交换的H原子。例如，在一个实施
方案中，-OH、-SH、-NH-和-NH2基团中的至少一些或任选的全部基团的H原子是化合物的化
学式的一部分，但并不是化合物的编码元素式的一部分。在其他实施方案中，-OH基团中的
至少一些或任选的全部基团的O原子不是化合物的编码元素式的一部分。在一个实施方案
中，化合物(特别是氨基酸)中的所有碳原子都是该化合物的编码元素式的一部分。在一个
实施方案中，化合物(特别是氨基酸)中的所有氮原子都是该化合物的编码元素式的一部
分。
质谱法分析的同位素体。与化合物的化学式相比，该化合物的编码的元素式包含相同或更
少的元素，以及每种元素数量相同或更少的原子数量，因为该化合物的一些原子可能不适
于被同位素标记以形成用于本发明方法的同位素体。例如，在本方法中，容易与溶剂(例如
水)的氢原子交换的所述化合物的氢原子不适于被同位素标记，因为此类交换过程会破坏
同位素标记的分析物和/或标准物的同位素特征。同样，如果所述化合物中包含最终不存在
于所述同位素标记物质(例如，同位素标记的分析物、同位素标记试剂、同位素标记的氨基
酸和/或同位素标记的肽或蛋白质)中的离去基团或反应基团，那么在本发明中，所述离去
基团或反应基团中的原子也不适于被同位素标记，因此这些原子并不被包含于所述编码的
元素式中。例如，在所述标签和所述分析物之间的化学反应中，此类反应基团和/或离去基
团的某些元素可能被交换或者移除或丢失，因此不会被纳入该同位素标记物中。例如，在一
个实施方案中，赖氨酸的化学式是C6H14N2O2，而赖氨酸的编码元素式是C6Η9Ν2Ο。在一个实
施方案中，化合物的编码元素式不包括容易与溶剂的H原子交换的H原子。例如，在一个实施
方案中，-OH、-SH、-NH-和-NH2基团中的至少一些或任选的全部基团的H原子是化合物的化
学式的一部分，但并不是化合物的编码元素式的一部分。在其他实施方案中，-OH基团中的
至少一些或任选的全部基团的O原子不是化合物的编码元素式的一部分。在一个实施方案
中，化合物(特别是氨基酸)中的所有碳原子都是该化合物的编码元素式的一部分。在一个
实施方案中，化合物(特别是氨基酸)中的所有氮原子都是该化合物的编码元素式的一部
分。
[0218] 蛋白质组学定量的简要说明
[0219] 目前有两种用于整体蛋白质组学定量的主要方法。第一种方法是SILAC(用稳定同13
位素标记细胞培养基中的氨基酸)，其大受欢迎并且已被使用近十年。在SILAC中，C原子被
掺入氨基酸使得这些氨基酸(被称为重氨基酸)比普通氨基酸重3-6Da。然后使细胞在分开
的培养基中生长，一种培养基含有重氨基酸，另一种培养基含有普通氨基酸。
位素标记细胞培养基中的氨基酸)，其大受欢迎并且已被使用近十年。在SILAC中，C原子被
掺入氨基酸使得这些氨基酸(被称为重氨基酸)比普通氨基酸重3-6Da。然后使细胞在分开
的培养基中生长，一种培养基含有重氨基酸，另一种培养基含有普通氨基酸。
[0220] 在所述培养基中合成的新蛋白质掺入有重氨基酸或普通氨基酸，然后通过微扰(perturbation)处理所述细胞，并且合并所述蛋白质。在酶消化之后，所生成的肽具有相同
的序列，但因为重氨基酸中的13C原子而具有稍微不同的质量。当用MS分析时，可看见相同肽
的两个分离峰——轻峰和重峰。这些峰通常相差约3-8Da。但是，由于为了使同位素分布重
叠最小，需要被标记的肽之间最小差异为3Da，因此很难用SILAC实现多路复用(同时比较4
个或更多样品)。由于最大范围是10Da，复用被限制为约3个样品。
的序列，但因为重氨基酸中的13C原子而具有稍微不同的质量。当用MS分析时，可看见相同肽
的两个分离峰——轻峰和重峰。这些峰通常相差约3-8Da。但是，由于为了使同位素分布重
叠最小，需要被标记的肽之间最小差异为3Da，因此很难用SILAC实现多路复用(同时比较4
个或更多样品)。由于最大范围是10Da，复用被限制为约3个样品。
[0221] 因为缺少多路复用(>3)的能力，研究者对等量异位标记(TMT或iTRAQ商品)越来越感兴趣。等量异位标记涉及为分析物肽添加标签。等量异位标签被设计为具有三个组分：
(1)用于结合分析物的反应性基团、(2)平衡基团和(3)可电离的报告基团。所述平衡基团和
报告基团被设计具有稳定同位素的分布，使得它们有约6-8个不同的标签、具有相同的质
量。当将样品洗脱到质谱仪中时，所有被标记的样品质量相同，因此获得单峰。分离此峰中
的目标物，并且切开所述报告基团。每个报告基团的质量与下一个报告基团的质量相差约
1Da，因此利用MS/MS可区分6-8个分析物。然而，等量异位标记有两个真正的问题。首先，分
离目标物的窗口较大(约2-3m/z)，因此在MS/MS过程中干扰物被共同分离然后被共同碎片
化，并在相同m/z值处产生报告峰，导致较低的动态范围和定量准确度。第二个问题是，要获
得定量数据必需进行MS/MS扫描。对于多次重复这会带来问题，因为在一次实验和下一次实
验中为进行MS/MS所分离的产物之间的重叠可能很少。
(1)用于结合分析物的反应性基团、(2)平衡基团和(3)可电离的报告基团。所述平衡基团和
报告基团被设计具有稳定同位素的分布，使得它们有约6-8个不同的标签、具有相同的质
量。当将样品洗脱到质谱仪中时，所有被标记的样品质量相同，因此获得单峰。分离此峰中
的目标物，并且切开所述报告基团。每个报告基团的质量与下一个报告基团的质量相差约
1Da，因此利用MS/MS可区分6-8个分析物。然而，等量异位标记有两个真正的问题。首先，分
离目标物的窗口较大(约2-3m/z)，因此在MS/MS过程中干扰物被共同分离然后被共同碎片
化，并在相同m/z值处产生报告峰，导致较低的动态范围和定量准确度。第二个问题是，要获
得定量数据必需进行MS/MS扫描。对于多次重复这会带来问题，因为在一次实验和下一次实
验中为进行MS/MS所分离的产物之间的重叠可能很少。
[0222] TMT等量异位标签的开发者最近发表的工作表明，由于N和C之间的中子结合差异12 13 15 14
的能量学，将TMT试剂中的 C交换成 C，同时将 N换成 N，能够获得具有6mDa质量差异的新
试剂。这种微小的质量差异使得可使用高分辨率质谱仪来区分所述试剂。通过所述方法，他
们将他们的TMT试剂从6路系统扩展为8路系统。
的能量学，将TMT试剂中的 C交换成 C，同时将 N换成 N，能够获得具有6mDa质量差异的新
试剂。这种微小的质量差异使得可使用高分辨率质谱仪来区分所述试剂。通过所述方法，他
们将他们的TMT试剂从6路系统扩展为8路系统。
[0223] 本发明标记系统的简要说明
[0224] 本发明公开了通常被称为“中子编码的质量标记”或“NeuCode”的用于质谱蛋白质组学定量的新方法和定制标签试剂。本文中该方法还被称为“偏移质量中子编码(offset
mass neutron encoding)”或“OMNE”。在此方法中，重同位素(例如N和C)之间的中子质量差
异能够同氨基酸和新型试剂标签相结合以产生基于MS1的定量方法，该方法在许多方面优
于常规SILAC和等量异位标记。最初使用两种+8Da重赖氨酸来测试这一想法，其中一种重赖
氨酸含有6个13C和2个15N，另一种重赖氨酸含有8个氘(2H)。
mass neutron encoding)”或“OMNE”。在此方法中，重同位素(例如N和C)之间的中子质量差
异能够同氨基酸和新型试剂标签相结合以产生基于MS1的定量方法，该方法在许多方面优
于常规SILAC和等量异位标记。最初使用两种+8Da重赖氨酸来测试这一想法，其中一种重赖
氨酸含有6个13C和2个15N，另一种重赖氨酸含有8个氘(2H)。
[0225] 图2示出了在不同的分辨率设定下，所选的赖氨酸标记的肽对的结果。在Orbitrap MS系统通常的操作分辨率(30000)下，所述两种NeuCode标记的肽无法被区分并作为一种物
质出现。但是，在240000分辨率下分析时，所述肽对被基线分辨，并能够确定各分析物的相
对丰度。
质出现。但是，在240000分辨率下分析时，所述肽对被基线分辨，并能够确定各分析物的相
对丰度。
[0226] 这些中子标签可被掺入到氨基酸中，所述修饰氨基酸可随后在类似于SILAC的细胞培养过程中使用。使用此标记系统将减少与SILAC相关的光谱复杂性问题，并允许提高的
多路复用。对将9个不同的重同位素(15N、13C、2H或18O原子)掺入到氨基酸赖氨酸中的最初计
算表明，可能构建质量跨度仅为41.4mDa的41种不同的同位素体(如图3所示)。
多路复用。对将9个不同的重同位素(15N、13C、2H或18O原子)掺入到氨基酸赖氨酸中的最初计
算表明，可能构建质量跨度仅为41.4mDa的41种不同的同位素体(如图3所示)。
[0227] 此外，该标记系统可与新型标记试剂一起使用，而不限于SILAC相关的方法。这将允许分析与组织培养不相容的组织和其他体液。NHS酯技术是广泛应用的将标签连接到肽
上以用于蛋白质组学分析的化学。两种商用的等量异位标记法(iTRAQ和TMT)都使用了该方
法。因此，本发明的标记系统能够使用二肽样标签或能够与肽结合的其他标签，所述标签易
于合成并且也使用NHS酯连接化学。但是，不同于等量异位标签，本发明的标记系统不需要
掺入报告基团、接头和荷电位点的专门设计。相反，本发明的标签被设计为保持其与肽的结
合并且当仅在高分辨率条件下检测时提供定量测量。用电脑模拟(in silico)测试此标签
的初始版本，表明能在目前的MS分辨率下实现5路分析。可以合理地预期在几年内质谱系统
的分辨率会加倍，这意味着到那时使用此标签能实现9路分析。
上以用于蛋白质组学分析的化学。两种商用的等量异位标记法(iTRAQ和TMT)都使用了该方
法。因此，本发明的标记系统能够使用二肽样标签或能够与肽结合的其他标签，所述标签易
于合成并且也使用NHS酯连接化学。但是，不同于等量异位标签，本发明的标记系统不需要
掺入报告基团、接头和荷电位点的专门设计。相反，本发明的标签被设计为保持其与肽的结
合并且当仅在高分辨率条件下检测时提供定量测量。用电脑模拟(in silico)测试此标签
的初始版本，表明能在目前的MS分辨率下实现5路分析。可以合理地预期在几年内质谱系统
的分辨率会加倍，这意味着到那时使用此标签能实现9路分析。
[0228] 因此，与常规SILAC方法相比，使用所述标记系统和细胞培养允许更高的多路复用，同时还减小了与SILAC相关的光谱复杂性问题。与等量异位标记法相比，使用具有新型
试剂标签的所述标记系统允许类似的多路复用，但是没有因共分离的干扰物导致的问题或
不需要进行MS/MS。
试剂标签的所述标记系统允许类似的多路复用，但是没有因共分离的干扰物导致的问题或
不需要进行MS/MS。
[0229] 实施例
[0230] 实施例1——SILAC和等量异位标记法的背景以及中子编码的质量标记的概述
[0231] 蛋白质鉴定技术已经快速成熟使得使用质谱法构建细胞中存在的几千种蛋白质的编目现在变得相对简单。但是，了解所述分子的丰度在不同条件下如何变化并不简单。稳
定同位素掺入是许多基于MS的蛋白质定量策略的重要部分。目前有两种主要的方法用于完
成这一点。第一种方法是在细胞生长过程中通过代谢方法将稳定的重同位素(即13C、18O、
15N、2H)引入蛋白质。在SILAC中，将掺入稳定同位素的氨基酸——其通常比普通氨基酸重4-
8Da——包含在细胞培养基中，使得所有合成的蛋白质都掺入了所述重氨基酸。以重和轻培
养基培养的细胞的组合产生相同的蛋白质组，除了包含重氨基酸的每种肽，所述重氨基酸
与其轻的对应物相差+4Da。使用这种技术，能够通过对重肽和轻肽的质谱分析同时比较蛋
白质组。
定同位素掺入是许多基于MS的蛋白质定量策略的重要部分。目前有两种主要的方法用于完
成这一点。第一种方法是在细胞生长过程中通过代谢方法将稳定的重同位素(即13C、18O、
15N、2H)引入蛋白质。在SILAC中，将掺入稳定同位素的氨基酸——其通常比普通氨基酸重4-
8Da——包含在细胞培养基中，使得所有合成的蛋白质都掺入了所述重氨基酸。以重和轻培
养基培养的细胞的组合产生相同的蛋白质组，除了包含重氨基酸的每种肽，所述重氨基酸
与其轻的对应物相差+4Da。使用这种技术，能够通过对重肽和轻肽的质谱分析同时比较蛋
白质组。
[0232] 等量异位标记是所述问题的简洁的解决方案，允许对最高达8个蛋白质组同时进行相对定量。此外，与代谢标记方法不同，等量异位标记与哺乳动物组织和体液相容。尽管
具备上述潜力，等量异位标记尚未被广泛应用于大规模研究中——主要是因为母离子干扰
的问题。这个问题不存在于SILAC中，因为丰度测量是通过高分辨率测量质谱(MS1)获得的。
即使对含有几百种共洗脱肽的非常复杂的样品而言，高分辨率质量分析器仍能够容易地将
靶峰与距离小于0.01Th的相邻峰区分开。等量异位标签被设计为含有三个组分：(1)用于结
合分析物的反应基团、(2)平衡基团和(3)可电离的报告基团。所述平衡基团和报告基团被
设计为含有稳定同位素，以使它们含有6-8个不同的标签并具有相同的聚集体质量。以这种
方式共同分析6-8个样品。当所述被标记的样品被洗脱到质谱仪中时，所述样品全部具有相
同质量，因此只产生一个峰。当进行MS/MS时，被标记的肽被碎片化，导致所述报告基团被切
开并被检测到。每个报告基团与下一个报告基团的质量相差约1Da，因此在MS/MS分析中可
区分6-8个分析物。由此能够确定6-8种条件中每一种条件下所述分析物的丰度。
具备上述潜力，等量异位标记尚未被广泛应用于大规模研究中——主要是因为母离子干扰
的问题。这个问题不存在于SILAC中，因为丰度测量是通过高分辨率测量质谱(MS1)获得的。
即使对含有几百种共洗脱肽的非常复杂的样品而言，高分辨率质量分析器仍能够容易地将
靶峰与距离小于0.01Th的相邻峰区分开。等量异位标签被设计为含有三个组分：(1)用于结
合分析物的反应基团、(2)平衡基团和(3)可电离的报告基团。所述平衡基团和报告基团被
设计为含有稳定同位素，以使它们含有6-8个不同的标签并具有相同的聚集体质量。以这种
方式共同分析6-8个样品。当所述被标记的样品被洗脱到质谱仪中时，所述样品全部具有相
同质量，因此只产生一个峰。当进行MS/MS时，被标记的肽被碎片化，导致所述报告基团被切
开并被检测到。每个报告基团与下一个报告基团的质量相差约1Da，因此在MS/MS分析中可
区分6-8个分析物。由此能够确定6-8种条件中每一种条件下所述分析物的丰度。
[0233] MS1和MS2定量分析
[0234] SILAC是用于蛋白质定量的最广泛使用的多路复用策略。通过从MS1扫描获得定量数据，与等量异位标记法相比，SILAC能够提供改善的定量性能，主要原因有三。首先，MS1丰
度测量允许对每条肽的若干数据点进行平均。另一方面，等量异位标记通常从单次MS/MS扫
描获取全部信息。基于MS1对比MS2的定量的第二个益处在于，肽鉴定时，每次重复中能够仅
从MS1数据中提取所述肽的定量信息。但是等量异位标记在每次重复分析中需要MS2扫描的
集合和鉴定。在光谱鉴定中约50-75％批次重叠下，这种条件限制了对多次实验中鉴定的
1
肽/蛋白质的子集的统计学显著性检验。以MS为中心的定量的第三个优势是显著提高的定
量准确度。具体而言，等量异位标记受到大量文件所记载的母离子干扰-杂质共分离问题的
困扰。SILAC中不存在这个问题，因为通过高分辨MS1扫描来测定丰度，甚至对含有几百种共
洗脱肽的非常复杂的样品而言，高分辨率质量分析器仍能够容易地将靶峰与其距离小于
0.01m/z的相邻峰区分开。在等量异位标记方法中，靶肽是以低得多的分辨率(通常为1-3m/
z)分离，然后被分解以生成报告标签。因此，在报告区域的定量信号是从分离窗中的每个物
质收集的。多种物质的共分离是规律，对于更高度分级分离的样品也不例外。
度测量允许对每条肽的若干数据点进行平均。另一方面，等量异位标记通常从单次MS/MS扫
描获取全部信息。基于MS1对比MS2的定量的第二个益处在于，肽鉴定时，每次重复中能够仅
从MS1数据中提取所述肽的定量信息。但是等量异位标记在每次重复分析中需要MS2扫描的
集合和鉴定。在光谱鉴定中约50-75％批次重叠下，这种条件限制了对多次实验中鉴定的
1
肽/蛋白质的子集的统计学显著性检验。以MS为中心的定量的第三个优势是显著提高的定
量准确度。具体而言，等量异位标记受到大量文件所记载的母离子干扰-杂质共分离问题的
困扰。SILAC中不存在这个问题，因为通过高分辨MS1扫描来测定丰度，甚至对含有几百种共
洗脱肽的非常复杂的样品而言，高分辨率质量分析器仍能够容易地将靶峰与其距离小于
0.01m/z的相邻峰区分开。在等量异位标记方法中，靶肽是以低得多的分辨率(通常为1-3m/
z)分离，然后被分解以生成报告标签。因此，在报告区域的定量信号是从分离窗中的每个物
质收集的。多种物质的共分离是规律，对于更高度分级分离的样品也不例外。
[0235] 多路复用
[0236] 尽管有这些基本的限制，两个主要的优势——组织相容性和高度多路复用能力——推动了等量异位标记的广泛应用。因为等量异位标记是化学上的而非代谢上的标记
策略，研究人员能够容易地比较最高达8个哺乳动物组织样品。对于将蛋白质组学应用于转
化医学而言，分析生物体液和组织的能力是至关重要的。除了对人组织的明显的直接分析
以外，无数哺乳动物疾病模型(例如，癌症、糖尿病、多发性硬化症等)，其中蛋白质组学的表
征需要组织相容性技术。将定量蛋白质组学从细胞培养发展到更复杂的基于动物的疾病模
型需要增加的重复分析并通常需要若干生物学状态。在检测小鼠中热量限制(CR)和脱乙酰
酶Sirt3的影响的简单实验中，存在四种情况——wt(对照)、Sirt3敲除型、wt CR和Sirt3敲
除型CR。对统计学显著性检验而言，每种情况必须至少分析3只动物，以获得最少12个样品。
此实验仅考虑分析一个组织、一个年龄和一个压力。因此，获得具有高定量准确度和再现性
的扩展的多路复用蛋白质组学比较的能力将深刻影响现代生物学和医学。
策略，研究人员能够容易地比较最高达8个哺乳动物组织样品。对于将蛋白质组学应用于转
化医学而言，分析生物体液和组织的能力是至关重要的。除了对人组织的明显的直接分析
以外，无数哺乳动物疾病模型(例如，癌症、糖尿病、多发性硬化症等)，其中蛋白质组学的表
征需要组织相容性技术。将定量蛋白质组学从细胞培养发展到更复杂的基于动物的疾病模
型需要增加的重复分析并通常需要若干生物学状态。在检测小鼠中热量限制(CR)和脱乙酰
酶Sirt3的影响的简单实验中，存在四种情况——wt(对照)、Sirt3敲除型、wt CR和Sirt3敲
除型CR。对统计学显著性检验而言，每种情况必须至少分析3只动物，以获得最少12个样品。
此实验仅考虑分析一个组织、一个年龄和一个压力。因此，获得具有高定量准确度和再现性
的扩展的多路复用蛋白质组学比较的能力将深刻影响现代生物学和医学。
[0237] MS2定量的准确度问题未得到普遍认可的解决
[0238] 尽管MS2方法已经给出了多路复用能力，但仍然需要提高数据质量和定量重叠(再现性，参见上文)。已做出努力来克服所述缺陷。例如，已研究用于气相母离子纯化的离子/
离子反应以及基于MS3的策略。尽管在模型系统上定量准确度提高(约-20％准确度偏差，即
真实值10:1，检测值为8:1)，两种方法的作业周期(duty cycle)、灵敏度和可用性仍存在问
题。MS3和QuantMode获取方法都降低了作业周期，因此与通常的鸟枪法分析相比产生约50-
70％的鉴定。任一种方法的灵敏度同样受限于有限的取样深度(作业周期)和减弱的报告离
子强度(纯化损失)。最终，两种方法都需要离子阱的存在，QuantMode需要ETD能力。关于这
些纯化方法的经验表明，对于上述作业周期、灵敏度和相容性问题没有直接的补救方法。这
些问题，与基于MS2定量对于多次重复分析的不可再现性(参见上文)结合，强烈表明开发多
路复用的以MS1为中心的方法是推动定量蛋白质组学发展的关键，特别是推动其应用于转
化医学的关键。
离子反应以及基于MS3的策略。尽管在模型系统上定量准确度提高(约-20％准确度偏差，即
真实值10:1，检测值为8:1)，两种方法的作业周期(duty cycle)、灵敏度和可用性仍存在问
题。MS3和QuantMode获取方法都降低了作业周期，因此与通常的鸟枪法分析相比产生约50-
70％的鉴定。任一种方法的灵敏度同样受限于有限的取样深度(作业周期)和减弱的报告离
子强度(纯化损失)。最终，两种方法都需要离子阱的存在，QuantMode需要ETD能力。关于这
些纯化方法的经验表明，对于上述作业周期、灵敏度和相容性问题没有直接的补救方法。这
些问题，与基于MS2定量对于多次重复分析的不可再现性(参见上文)结合，强烈表明开发多
路复用的以MS1为中心的方法是推动定量蛋白质组学发展的关键，特别是推动其应用于转
化医学的关键。
[0239] MS1多路复用——向前发展
[0240] 不幸的是，通过基于MS1的技术实现多路复用分析是富有挑战性的。SILAC提供了进行二元或三元对比的方法，并且通过这些实验的交错能够获得更高数量级的对比；但是，
获得此类测量是费力的，其仅被为数不多的专业实验室报道。实际上，由于为了使同位素分
布重叠最小，需要被标记的肽之间最小相差4Da，因此SILAC局限于三路对比。当母离子电荷
为3或更大时，这一间距被大大压缩。
获得此类测量是费力的，其仅被为数不多的专业实验室报道。实际上，由于为了使同位素分
布重叠最小，需要被标记的肽之间最小相差4Da，因此SILAC局限于三路对比。当母离子电荷
为3或更大时，这一间距被大大压缩。
[0241] 在SILAC中，对于被定量的每个额外的通路(最高达3路)，产生多个同位素簇，其通常相差4Da(参见图4)。这些信号在MS1分析过程中被区分，并且从整个洗脱谱中提取每个信
号的离子色谱图，使得每条肽的定量数据是约50次扫描的平均。在等量异位标记中，所有通
路均具有相同的质量，使得在MS1过程中仅产生一个同位素簇峰。在MS2过程中，所述标签断
裂并检测到报告离子信号。这些可被整合以确定相对丰度。但是，这种方法通常从单次扫描
获得定量数据并且需要MS2事件。
号的离子色谱图，使得每条肽的定量数据是约50次扫描的平均。在等量异位标记中，所有通
路均具有相同的质量，使得在MS1过程中仅产生一个同位素簇峰。在MS2过程中，所述标签断
裂并检测到报告离子信号。这些可被整合以确定相对丰度。但是，这种方法通常从单次扫描
获得定量数据并且需要MS2事件。
[0242] 对SILAC而言，将重同位素引入赖氨酸的能力是受赖氨酸的组成(6个碳原子和2个氮原子)的限制；因此，市售的最重形式是+8Da。已报道一些提高SILAC多路复用的尝试，但
是需要复杂的计算以及每条肽中存在精氨酸。这些限制阻止了其被大范围采用。SILAC多路
复用的第二个问题是增加的光谱复杂性。具体而言，对于每条肽，各SILAC通道产生额外的
一组m/z峰。对这些峰中一个以上的MS/MS取样产生冗余的鉴定并因此消耗MS/MS带宽，使得
丰度较低的m/z峰经常没有被取样。总之，增加的复杂性降低了蛋白质组覆盖度。
是需要复杂的计算以及每条肽中存在精氨酸。这些限制阻止了其被大范围采用。SILAC多路
复用的第二个问题是增加的光谱复杂性。具体而言，对于每条肽，各SILAC通道产生额外的
一组m/z峰。对这些峰中一个以上的MS/MS取样产生冗余的鉴定并因此消耗MS/MS带宽，使得
丰度较低的m/z峰经常没有被取样。总之，增加的复杂性降低了蛋白质组覆盖度。
[0243] 等量异位中子编码的质量标记
[0244] TMT等量异位标签的开发者最近发现，通过将TMT试剂中的12C换成13C，同时将15N换成14N，能够获得具有6mDa质量差异的新试剂。所述质量变化是由N和C之间中子结合的能量
学差异造成，并可在m/z 130下以50000的质量分辨率区分。通过完成所述方法，能够将所述
TMT试剂从6路系统扩展成8路系统。这种新的TMT等量异位概念仍然依赖于基于MS2的定量，
不能解决上述所有问题。本发明改进此中子编码概念，以开发出超多路的(最高达45路)基
于MS1的定量技术，该技术结合了SILAC和等量异位标记的最优方面。
学差异造成，并可在m/z 130下以50000的质量分辨率区分。通过完成所述方法，能够将所述
TMT试剂从6路系统扩展成8路系统。这种新的TMT等量异位概念仍然依赖于基于MS2的定量，
不能解决上述所有问题。本发明改进此中子编码概念，以开发出超多路的(最高达45路)基
于MS1的定量技术，该技术结合了SILAC和等量异位标记的最优方面。
[0245] 中子编码和常规等量异位标记之间的差异
[0246] 常规的等量异位标记依赖于将化学标签引入肽。所述化学标签被设计为具有三个特定的组分：反应基团、平衡基团和报告基团。在MS1分析过程中，用等量异位标签标记的分
析物显示为单个m/z峰，并且不管分辨率多高都无法从MS1分析中获得定量数据。定量数据
只能在通过碰撞激活来碎片化母离子时获得。在此过程中，荷电报告基团从平衡基团上被
释放，并在确定的质量处产生可检测的m/z峰。目前等量异位标签提供最高达8通道的定量。
各通道之间报告离子的质量相差1Da。例如，m/z 126、127和128。因此，仅能通过首先进行碰
撞激活并通过MS/MS监测产物离子来测定定量数据。
析物显示为单个m/z峰，并且不管分辨率多高都无法从MS1分析中获得定量数据。定量数据
只能在通过碰撞激活来碎片化母离子时获得。在此过程中，荷电报告基团从平衡基团上被
释放，并在确定的质量处产生可检测的m/z峰。目前等量异位标签提供最高达8通道的定量。
各通道之间报告离子的质量相差1Da。例如，m/z 126、127和128。因此，仅能通过首先进行碰
撞激活并通过MS/MS监测产物离子来测定定量数据。
[0247] 这种方法的限制有许多。首先，因为从MS1扫描中没有获取数据，如果没有获得给定的母离子的MS/MS事件，那么就不会记录任何类型的定量数据。第二，MS/MS分离窗中的所
有母离子(通常约1-3m/z)都要经历碰撞并产生报告标签。这意味着定量信号是分离窗口中
所有母离子的卷积(convolution)。这个缺陷严重限制了定量准确度。第三，等量异位标记
仅与一种解离——碰撞激活兼容。等量异位标记的关键是报告基团被从平衡基团上切开并
被检测到。对商用产品而言，这些已针对碰撞激活被优化；但是，还可获得许多类型的解离，
包括电子捕获和转移解离，以及使用光子的那些解离。
有母离子(通常约1-3m/z)都要经历碰撞并产生报告标签。这意味着定量信号是分离窗口中
所有母离子的卷积(convolution)。这个缺陷严重限制了定量准确度。第三，等量异位标记
仅与一种解离——碰撞激活兼容。等量异位标记的关键是报告基团被从平衡基团上切开并
被检测到。对商用产品而言，这些已针对碰撞激活被优化；但是，还可获得许多类型的解离，
包括电子捕获和转移解离，以及使用光子的那些解离。
[0248] 本发明的中子编码策略将非常小的质量差异引入分析物中，用于定量目的。这些差异如此之小(<50mDa)，以致无法在正常的MS分辨率下分辨。但是，在高分辨率条件下(>
100000)进行的分析能够分开这些间距非常小的峰并揭示定量信息。通过使细胞在定制的
氨基酸同位素体上生长或通过将化学标签置于肽上，能够引入中子编码。对于后一种情况
而言，化学试剂不具有常规等量异位标签的特征，即没有报告或平衡基团。相反，所述标签
只是将中子指纹引入每种分析物中的输送工具。然后仅在高分辨率条件下分析样品时(通
常在MS1扫描中)才检测到所述指纹。
100000)进行的分析能够分开这些间距非常小的峰并揭示定量信息。通过使细胞在定制的
氨基酸同位素体上生长或通过将化学标签置于肽上，能够引入中子编码。对于后一种情况
而言，化学试剂不具有常规等量异位标签的特征，即没有报告或平衡基团。相反，所述标签
只是将中子指纹引入每种分析物中的输送工具。然后仅在高分辨率条件下分析样品时(通
常在MS1扫描中)才检测到所述指纹。
[0249] 图5-7示出了中子编码的标记肽的MS/MS扫描。在低分辨率下，例如图5中所示，看不见定量数据，所述峰作为单峰出现。但是在高分辨率下(图6)，所述峰显示为提供额外数
据(图7)的多峰。这些数据反映了丰度并可用于定量。
据(图7)的多峰。这些数据反映了丰度并可用于定量。
[0250] 与常规等量异位标记的另一个主要差异是本发明的中子编码特征在解离后和肽保持在一起。可通过任何碎片化方法来完成解离。如果在高分辨率条件下分析(>100000)，
将检测到由包含中子编码标签(氨基酸标签或化学标签)的肽骨架断裂而产生的产物离子。
与常规等量异位标记不同，对于每个母离子，这些信号不出现在相同质量处(报告碎片质
量)，它们与所述肽的骨架碎片一起出现，并出现在包含中子标签的每个碎片处。这意味着
还可从MS/MS光谱收集定量数据，但仅限于在高分辨率下扫描时并在所述肽碎片的m/z峰
处。因此，对中子编码而言，消除了常规等量异位标签的干扰问题。
将检测到由包含中子编码标签(氨基酸标签或化学标签)的肽骨架断裂而产生的产物离子。
与常规等量异位标记不同，对于每个母离子，这些信号不出现在相同质量处(报告碎片质
量)，它们与所述肽的骨架碎片一起出现，并出现在包含中子标签的每个碎片处。这意味着
还可从MS/MS光谱收集定量数据，但仅限于在高分辨率下扫描时并在所述肽碎片的m/z峰
处。因此，对中子编码而言，消除了常规等量异位标签的干扰问题。
[0251] NeuCode概述
[0252] 被利用来扩大等量异位标记多路复用能力的中子编码的质量差异能够被用来创建MS1定量方法——一种比常规SILAC和等量异位标记更优异的方法。
[0253] 为了确定NeuCode的可行性，调查105067个经鉴定的串联质谱的文库，确定了99.4％的肽母离子的m/z值等于或小于1200。然后，计算1200Th母离子的最小可分辨差异
(在1％峰高处的全宽(full width at 1％max)，FWOM，即峰面积中仅有1％重叠)，其作为范
围为103至107的分辨率的函数(图8A)。目前可商购的Orbitrap的分辨率能达到480000，其能
够分离间距小至11.1mTh的母离子。在报道的Orbitrap最高分辨率960000下，这个值下降到
原来的一半(5.6mTh)。平均母离子具有低得多的m/z(约750)，在480000和960000下分别能
够以7.0和3.5mTh分辨。使用这些计算作为指导，所述肽文库被用于构建肽组(peptidome)
的百分比的模型，当以12、18和36mDa的间距标记时，所述肽组可被定量(即在FWOM分离)(图
8B)。这考虑了在鸟枪实验中通常观察到的母离子m、z和m/z的多样性。这些数据表明，在分
辨率480000时，当间距18mDa时，>85％的被鉴定的肽可被定量(即分辨)。在分辨率960000
时，当间距12mDa时，能实现>90％的覆盖度。
(在1％峰高处的全宽(full width at 1％max)，FWOM，即峰面积中仅有1％重叠)，其作为范
围为103至107的分辨率的函数(图8A)。目前可商购的Orbitrap的分辨率能达到480000，其能
够分离间距小至11.1mTh的母离子。在报道的Orbitrap最高分辨率960000下，这个值下降到
原来的一半(5.6mTh)。平均母离子具有低得多的m/z(约750)，在480000和960000下分别能
够以7.0和3.5mTh分辨。使用这些计算作为指导，所述肽文库被用于构建肽组(peptidome)
的百分比的模型，当以12、18和36mDa的间距标记时，所述肽组可被定量(即在FWOM分离)(图
8B)。这考虑了在鸟枪实验中通常观察到的母离子m、z和m/z的多样性。这些数据表明，在分
辨率480000时，当间距18mDa时，>85％的被鉴定的肽可被定量(即分辨)。在分辨率960000
时，当间距12mDa时，能实现>90％的覆盖度。
[0254] 这些数据确认了，以目前商用Orbitrap的480000的分辨率，可以对几乎整个肽组实现使用NeuCode标记策略的检测和鉴定，所述肽组的标记的峰的间距约为18mDa。在报道
的Orbitrap的960000的最高分辨率下，在峰间距仅为12mDa时能够实现类似的覆盖度。接下
来确定，使用在生物系统中发现的常见元素(即C、H、N和O)能获得的间距范围和缺口大小。
图9示出了通过以不同组合掺入13C、2H、15N、18O而获得的包含+2Da偏移的氨基酸赖氨酸的所
有理论的同位素体。以仅为2Da的中等质量差异，能够生成跨度为18.5mDa的质量范围(本文
中被称为偏移质量)的7种同位素体，提供双路或三路标记(即约9和18mDa间距)。掺入更多
稳定的同位素(+8Da)能提供超过50mDa的偏移质量范围。结合上述理论计算可得出结论，能
够引入充分的偏移质量以在目前可获得的质量分辨率下实现NeuCode策略。
的Orbitrap的960000的最高分辨率下，在峰间距仅为12mDa时能够实现类似的覆盖度。接下
来确定，使用在生物系统中发现的常见元素(即C、H、N和O)能获得的间距范围和缺口大小。
图9示出了通过以不同组合掺入13C、2H、15N、18O而获得的包含+2Da偏移的氨基酸赖氨酸的所
有理论的同位素体。以仅为2Da的中等质量差异，能够生成跨度为18.5mDa的质量范围(本文
中被称为偏移质量)的7种同位素体，提供双路或三路标记(即约9和18mDa间距)。掺入更多
稳定的同位素(+8Da)能提供超过50mDa的偏移质量范围。结合上述理论计算可得出结论，能
够引入充分的偏移质量以在目前可获得的质量分辨率下实现NeuCode策略。
[0255] 用于多路复用SILAC的中子编码的氨基酸(NeuCode SILAC)
[0256] 基本原理：包含NeuCode标记策略的氨基酸的合成将产生SILAC试剂，其极大地扩展了金标准蛋白质定量技术——SILAC的多路复用能力(4-10X)。与常规SILAC策略相比，这
种增大的多路复用能力既不会增加MS1光谱复杂性也不会降低肽鉴定速率。
种增大的多路复用能力既不会增加MS1光谱复杂性也不会降低肽鉴定速率。
[0257] 假设：使用常规多Da同位素间距将SILAC限制于二元和三元对比。高度多路复用实验允许时程实验(time-course experiment)的测量，允许生物重复数据的集合，并且允许
直接对比转录组学和蛋白质组学数据。通过掺入多种赖氨酸的同位素体(每种相差约
10mDa)，生成一组氨基酸，当组合时产生12个用于定量的通道。与SILAC相比，这些氨基酸产
生极大提高的多路复用水平和性能。
直接对比转录组学和蛋白质组学数据。通过掺入多种赖氨酸的同位素体(每种相差约
10mDa)，生成一组氨基酸，当组合时产生12个用于定量的通道。与SILAC相比，这些氨基酸产
生极大提高的多路复用水平和性能。
[0258] 初步数据：为了检验氨基酸的等量异位同位素体能够允许SILAC高度多路复用这一假设，购买两种+8Da重赖氨酸，一种含有6个13C原子和2个15N原子，另一种含有8个2H原子。
所述两种同位素体质量相差36mDa，并且在目前可商购的Orbitrap系统的分辨率(480K)下
能够容易地分辨。使两个酵母培养物(BY4741Lys1Δ)生长在已知成分的完全合成的缺陷培
养基中，所述培养基补充了“轻”赖氨酸(+0Da)、“重1”13C6/15N2赖氨酸(+8.0142Da)或“重2”
2H8赖氨酸(+8.0502Da)。为了保证赖氨酸的完全掺入，使细胞增殖至少10次加倍，然后在对
数中期通过以3000g离心3分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于5mL裂解缓冲液中，并通过玻璃
珠研磨提取蛋白质。将来自裂解的酵母细胞的蛋白质还原、烷基化，并用endo-LysC消化。接
下来，通过以1:1和1:5(质量)的比例使“轻”(+0Da)和“重1”(+8.0142Da)标记的肽结合，制
备具有已知混合比例的三个常规SILAC样品。以完全相同的方法制备NeuCode SILAC比例，
除了通过使用“重1”(+8.0142Da)和“重2”(+8.0502Da)标记的肽。
所述两种同位素体质量相差36mDa，并且在目前可商购的Orbitrap系统的分辨率(480K)下
能够容易地分辨。使两个酵母培养物(BY4741Lys1Δ)生长在已知成分的完全合成的缺陷培
养基中，所述培养基补充了“轻”赖氨酸(+0Da)、“重1”13C6/15N2赖氨酸(+8.0142Da)或“重2”
2H8赖氨酸(+8.0502Da)。为了保证赖氨酸的完全掺入，使细胞增殖至少10次加倍，然后在对
数中期通过以3000g离心3分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于5mL裂解缓冲液中，并通过玻璃
珠研磨提取蛋白质。将来自裂解的酵母细胞的蛋白质还原、烷基化，并用endo-LysC消化。接
下来，通过以1:1和1:5(质量)的比例使“轻”(+0Da)和“重1”(+8.0142Da)标记的肽结合，制
备具有已知混合比例的三个常规SILAC样品。以完全相同的方法制备NeuCode SILAC比例，
除了通过使用“重1”(+8.0142Da)和“重2”(+8.0502Da)标记的肽。
[0259] 将来自每种方法(即NeuCode SILAC和常规SILAC)的样品单独地进样到毛细管nLC柱，并在60分钟内梯度洗脱到离子阱-Orbitrap混合质谱仪中。对于常规SILAC，在分辨率
30000下进行MS1分析，选择前10种最强的母离子进行MS/MS分析(离子阱CAD)。对于NeuCode
1
SILAC分析，在第一次30000分辨率全扫描之后立即在分辨率480000下再次进行MS扫描。所
述高分辨率扫描分辨NeuCode SILAC对——有效解码被植入的定量数据。该分析的示例光
谱如图10所示；图A表示MS1扫描(R＝30K)，图B表示在m/z 827处所选母离子的同位素簇。在
此处，绘制了在通常的30K分辨率和高分辨率定量扫描(480K)所产生的信号。观察到间距仅
为36mDa的两种“重”赖氨酸同位素体。这些NeuCode SILAC对(partner)的非常小的m/z间距
对MS/MS扫描而言是理想的，因为两种同位素体被共分离并一起被碎片化和质量分析。实际
上，因为MS/MS通常在低分辨率(即<7500)下进行，NeuCode SILAC MS/MS光谱基本上与未标
记、非多路复用样品的光谱相同。图10C表示图10B中所示的分离的母离子的离子阱MS/MS。
在这些低分辨率下，所编码的丰度信息被掩盖，在似乎没有进行多路复用的情况下进行光
谱匹配。应当注意，完成高分辨率扫描需要约1.6秒；但是，系统在这段时间中进行离子阱
MS/MS分析(前10种母离子)，因此会对开销(overhead)产生非常小的影响(NeuCode SILAC
和常规SILAC分别获得16852和18973个MS/MS光谱)。NeuCode SILAC实验产生独特得多的肽
光谱匹配(PSM)——2935对2401。这是因为在常规SILAC中，每种独特的肽母离子在间距4Da
的两个不同的m/z值处出现。这意味着肽鉴定中有大量的冗余，因为丰度最高的肽对
(partner)都被选择。其结果是有限的取样深度。NeuCode SILAC消除了这个问题，因为每种
母离子的全部定量信息被编码于单个m/z峰中(图10B的插入图)，使得不会获得对伴侣峰的
多余的MS/MS扫描。
30000下进行MS1分析，选择前10种最强的母离子进行MS/MS分析(离子阱CAD)。对于NeuCode
1
SILAC分析，在第一次30000分辨率全扫描之后立即在分辨率480000下再次进行MS扫描。所
述高分辨率扫描分辨NeuCode SILAC对——有效解码被植入的定量数据。该分析的示例光
谱如图10所示；图A表示MS1扫描(R＝30K)，图B表示在m/z 827处所选母离子的同位素簇。在
此处，绘制了在通常的30K分辨率和高分辨率定量扫描(480K)所产生的信号。观察到间距仅
为36mDa的两种“重”赖氨酸同位素体。这些NeuCode SILAC对(partner)的非常小的m/z间距
对MS/MS扫描而言是理想的，因为两种同位素体被共分离并一起被碎片化和质量分析。实际
上，因为MS/MS通常在低分辨率(即<7500)下进行，NeuCode SILAC MS/MS光谱基本上与未标
记、非多路复用样品的光谱相同。图10C表示图10B中所示的分离的母离子的离子阱MS/MS。
在这些低分辨率下，所编码的丰度信息被掩盖，在似乎没有进行多路复用的情况下进行光
谱匹配。应当注意，完成高分辨率扫描需要约1.6秒；但是，系统在这段时间中进行离子阱
MS/MS分析(前10种母离子)，因此会对开销(overhead)产生非常小的影响(NeuCode SILAC
和常规SILAC分别获得16852和18973个MS/MS光谱)。NeuCode SILAC实验产生独特得多的肽
光谱匹配(PSM)——2935对2401。这是因为在常规SILAC中，每种独特的肽母离子在间距4Da
的两个不同的m/z值处出现。这意味着肽鉴定中有大量的冗余，因为丰度最高的肽对
(partner)都被选择。其结果是有限的取样深度。NeuCode SILAC消除了这个问题，因为每种
母离子的全部定量信息被编码于单个m/z峰中(图10B的插入图)，使得不会获得对伴侣峰的
多余的MS/MS扫描。
[0260] NeuCode SILAC的定量准确度和精度
[0261] 接下来评估与常规SILAC相比通过NeuCode SILAC(还被称为OMNE SILAC)产生的定量数据的质量。图11A捕获到两种方法的定量量度：水平虚线表示真实比例(灰色＝1:1，
黑色＝5:1)，而箱线图标定了中位数(横线)、25至75百分位数(内四分位距，箱)、内四分位
距的1.5倍(短横线(whisker))和异常点(空心圆)。根据这些数据可得出结论，NeuCode
SILAC提供了常规SILAC无法区分的定量准确度及精度。在NeuCode SILAC提供的2935个PSM
中，80％是可定量的(2572个)。对常规SILAC而言，2120个PSM生成定量数据，是2401个总PSM
的88％。想知道为什么NeuCode SILAC具有更低的可定量比率？应当注意，只有在检测到肽
对(partner)双方的S/N比例都大于2:1时，才对PSM定量。可以推测，因为NeuCode SILAC允
许更大的取样深度，因此允许对较低S/N母离子更多的鉴定，所述两种方法在可用于定量肽
的频率上可能没有根本性差异。为了检验这一假说，在NeuCode SILAC和常规SILAC两种方
法中，将PSM生成定量数据次数的百分数作为母离子强度的函数作图(图11B)。随着母离子
强度降低，两种方法生成定量数据的频率降低(以基本上相同的速率)；但是，母离子强度低
于105.5(任意单位)时，NeuCode SILAC产生1824个PSM，而在相同范围内常规SILAC仅检测到
522个。与常规SILAC相比，NeuCode SILAC允许取样深度增大，同时保持高度相当的定量准
确度和精度。
黑色＝5:1)，而箱线图标定了中位数(横线)、25至75百分位数(内四分位距，箱)、内四分位
距的1.5倍(短横线(whisker))和异常点(空心圆)。根据这些数据可得出结论，NeuCode
SILAC提供了常规SILAC无法区分的定量准确度及精度。在NeuCode SILAC提供的2935个PSM
中，80％是可定量的(2572个)。对常规SILAC而言，2120个PSM生成定量数据，是2401个总PSM
的88％。想知道为什么NeuCode SILAC具有更低的可定量比率？应当注意，只有在检测到肽
对(partner)双方的S/N比例都大于2:1时，才对PSM定量。可以推测，因为NeuCode SILAC允
许更大的取样深度，因此允许对较低S/N母离子更多的鉴定，所述两种方法在可用于定量肽
的频率上可能没有根本性差异。为了检验这一假说，在NeuCode SILAC和常规SILAC两种方
法中，将PSM生成定量数据次数的百分数作为母离子强度的函数作图(图11B)。随着母离子
强度降低，两种方法生成定量数据的频率降低(以基本上相同的速率)；但是，母离子强度低
于105.5(任意单位)时，NeuCode SILAC产生1824个PSM，而在相同范围内常规SILAC仅检测到
522个。与常规SILAC相比，NeuCode SILAC允许取样深度增大，同时保持高度相当的定量准
确度和精度。
[0262] 使用在低分辨率设定(30K)下的MS1扫描，初步产生对NeuCode SILAC数据的所有鉴定(图10B)。因为这些峰包含质量相差36mDa的每种肽的两个未分开的形式，想知道是否
会导致任何质量准确度的较大降低。为了检验这个问题，将NeuCode SILAC和常规SILAC的
所有鉴定的质量误差(ppm)的分布作为鉴定e值(约等于显著性)的函数进行作图(1％FDR，
图12)。NeuCode SILAC的质量准确度出现非常小的降低——3.5对比2.5ppm，精度与常规
SILAC相当。结论是，这种质量误差的微小增大并不会成为问题，因为大多数数据库搜索会
1
采用±7至±25ppm的母离子质量容许误差。还注意到，使用来自高分辨率MS 扫描(其中解
析同位素体)的质量值能够完全消除这一微小误差。
会导致任何质量准确度的较大降低。为了检验这个问题，将NeuCode SILAC和常规SILAC的
所有鉴定的质量误差(ppm)的分布作为鉴定e值(约等于显著性)的函数进行作图(1％FDR，
图12)。NeuCode SILAC的质量准确度出现非常小的降低——3.5对比2.5ppm，精度与常规
SILAC相当。结论是，这种质量误差的微小增大并不会成为问题，因为大多数数据库搜索会
1
采用±7至±25ppm的母离子质量容许误差。还注意到，使用来自高分辨率MS 扫描(其中解
析同位素体)的质量值能够完全消除这一微小误差。
[0263] 样品制备。使酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株BY4741Lys1Δ在已知成分的完全合成(SC,Sunrise Science)的缺陷培养基上生长，所述培养基补充了轻赖氨酸(+
13 15
0Da)、重6 C/2 N赖氨酸(+8.0142Da，Cambridge Isotopes)或重8D赖氨酸(+8.0502Da，
Cambridge Isotopes)。为了保证赖氨酸完全掺入，使细胞增殖至少10次加倍。在到达对数
中期后，通过以3000g离心3分钟收获细胞，用冰冷的ddH2O冲洗三次。将细胞沉淀重悬于5mL
裂解缓冲液(50mM Tris pH8、8M脲、75mM氯化钠、100mM丁酸钠、1mM原钒酸钠、蛋白酶和磷酸
酶抑制剂片剂)中，并通过玻璃珠研磨(Retsch)提取总蛋白质。用BCA(Pierce)测定裂解物
的蛋白质浓度。
13 15
0Da)、重6 C/2 N赖氨酸(+8.0142Da，Cambridge Isotopes)或重8D赖氨酸(+8.0502Da，
Cambridge Isotopes)。为了保证赖氨酸完全掺入，使细胞增殖至少10次加倍。在到达对数
中期后，通过以3000g离心3分钟收获细胞，用冰冷的ddH2O冲洗三次。将细胞沉淀重悬于5mL
裂解缓冲液(50mM Tris pH8、8M脲、75mM氯化钠、100mM丁酸钠、1mM原钒酸钠、蛋白酶和磷酸
酶抑制剂片剂)中，并通过玻璃珠研磨(Retsch)提取总蛋白质。用BCA(Pierce)测定裂解物
的蛋白质浓度。
[0264] 通过添加5mM二硫苏糖醇(dithiothitriol)并在室温下孵育30分钟，还原来自裂解的酵母细胞的蛋白质。通过添加15mM碘乙酰胺，在室温、黑暗中孵育30分钟，然后用5mM二
硫苏糖醇终止反应，使游离硫醇烷基化。用50mM Tris pH 8.0将脲浓度稀释到4M。以酶与蛋
白质1:50的比例添加LysC(Wako)并在室温温育16小时，进行蛋白质水解消化。通过添加TFA
并用tC18sep-pak(Waters)脱盐来终止所述消化反应。
硫苏糖醇终止反应，使游离硫醇烷基化。用50mM Tris pH 8.0将脲浓度稀释到4M。以酶与蛋
白质1:50的比例添加LysC(Wako)并在室温温育16小时，进行蛋白质水解消化。通过添加TFA
并用tC18sep-pak(Waters)脱盐来终止所述消化反应。
[0265] 通过以“轻”/“重”质量比为1:1、1:5和1:10混合“轻”＝+0Da和“重”＝+8Da标记的肽，制备SILAC已知比例。以完全相同的方法制备NeuCode比例，除了“轻”＝+8.0142Da和
“重”＝+8.0502Da。
“重”＝+8.0502Da。
[0266] 通过根据制造商的方案，用三个mTRAQ标签(AB SCIEX)标记每种NeuCode SILAC酵母肽来制备6路样品，除了在2小时后添加羟胺以终止所述标记反应。以10:10:5:5:1:1的质
量比混合所述肽。
量比混合所述肽。
[0267] LC-MS/MS。为了对比NeuCode SILAC和SILAC，分别将每种样品上样到75μm毛细管(用在流动相A(含0.2％甲酸的水)中的5μm Magic C18(Michrome)颗粒装填)中。将肽用流
动相B(含0.2％甲酸的乙腈)梯度洗脱60分钟。通过Orbitrap elite质谱仪(Thermo
Scientific)分析被洗脱的肽。用Orbitrap在30000分辨率下进行检查扫描以鉴定母离子，
以便为依赖数据的前10位离子阱CAD串联质谱取样。在所述检查扫描之后，NeuCode SILAC
分析立刻进行分辨率480000的另外的定量扫描。启用预览模式，将带未知电荷或电荷＝+1
的母离子从MS2取样中排除。将MS1和MS2目标离子累积值分别设定为1×106和4×104。将所
选母离子的-0.55m/z和+2.55m/z的动态排除设定为30秒。除了以下变化以外，按上文分析
MS1的6路样品。以90分钟梯度洗脱样品。通过在HCD单元中的HCD碎片化，然后在分辨率
15000的Orbitrap中检测，进行串联质谱。最后，将MS2目标离子累积值设定为5×104。
动相B(含0.2％甲酸的乙腈)梯度洗脱60分钟。通过Orbitrap elite质谱仪(Thermo
Scientific)分析被洗脱的肽。用Orbitrap在30000分辨率下进行检查扫描以鉴定母离子，
以便为依赖数据的前10位离子阱CAD串联质谱取样。在所述检查扫描之后，NeuCode SILAC
分析立刻进行分辨率480000的另外的定量扫描。启用预览模式，将带未知电荷或电荷＝+1
的母离子从MS2取样中排除。将MS1和MS2目标离子累积值分别设定为1×106和4×104。将所
选母离子的-0.55m/z和+2.55m/z的动态排除设定为30秒。除了以下变化以外，按上文分析
MS1的6路样品。以90分钟梯度洗脱样品。通过在HCD单元中的HCD碎片化，然后在分辨率
15000的Orbitrap中检测，进行串联质谱。最后，将MS2目标离子累积值设定为5×104。
[0268] 数据分析。将MS原始文件转换为可搜索的文本文件，并使用开源质谱搜索算法(OMSSA)在目标-诱饵数据库(酵母属基因组数据库(酵母)，www.yeastgenome.org；UniProt
(小鼠)，www.uniprot.org)中搜索。对所有样品而言，分别搜索作为变量和固定修饰的甲硫
氨酸氧化和半胱氨酸脲基甲基化。用未修饰的赖氨酸和+8.014199固定修饰独立地搜索
SILAC样品，然后在错误发现率(FDR)筛选中结合。用代表从613C/215N和82H同位素体(+
8.0322)的平均质量偏移的单一固定修饰搜索NeuCode SILAC样品。母离子质量允差被规定
为100ppm，碎片离子质量允差被设定为0.5Da。使用这种相对较宽的母离子质量允差来说明
观察到的同位素体之间质量差异。根据E值，将搜索结果筛选到1％FDR。除了以下变化以外，
如上文所述搜索6路样品。独立地搜索mTRAQ的轻(l)、中(m)和重(h)版本。肽的N-末端固定
修饰：+140.0953(l)、+144.1024(m)或+148.104(h)；赖氨酸固定修饰：+148.1275(l)、+
152.1346(m)或+156.1362(h)；酪氨酸可变修饰：+140.0953、+144.1024或+148.104。将碎片
离子质量允差减小至0.1Da。在FDR筛选中，使三次独立搜索结合。根据上述规则，将肽分组
成蛋白质并筛选至1％FDR。
(小鼠)，www.uniprot.org)中搜索。对所有样品而言，分别搜索作为变量和固定修饰的甲硫
氨酸氧化和半胱氨酸脲基甲基化。用未修饰的赖氨酸和+8.014199固定修饰独立地搜索
SILAC样品，然后在错误发现率(FDR)筛选中结合。用代表从613C/215N和82H同位素体(+
8.0322)的平均质量偏移的单一固定修饰搜索NeuCode SILAC样品。母离子质量允差被规定
为100ppm，碎片离子质量允差被设定为0.5Da。使用这种相对较宽的母离子质量允差来说明
观察到的同位素体之间质量差异。根据E值，将搜索结果筛选到1％FDR。除了以下变化以外，
如上文所述搜索6路样品。独立地搜索mTRAQ的轻(l)、中(m)和重(h)版本。肽的N-末端固定
修饰：+140.0953(l)、+144.1024(m)或+148.104(h)；赖氨酸固定修饰：+148.1275(l)、+
152.1346(m)或+156.1362(h)；酪氨酸可变修饰：+140.0953、+144.1024或+148.104。将碎片
离子质量允差减小至0.1Da。在FDR筛选中，使三次独立搜索结合。根据上述规则，将肽分组
成蛋白质并筛选至1％FDR。
[0269] 定量。在数据库搜索之后，首先使用经过FDR筛选的肽光谱匹配的列表计算与数据集相关的系统母离子质量误差。在为这一误差调整“轻”和“重”母离子质量后，用一种算法
在30秒内检查全部PSM的每一次高分辨MS1扫描，鉴定出独特的肽序列。在每次MS1扫描中，
分离该同位素簇的前4个同位素的“轻”和“重”峰。如果在所规定的允差(NeuCode为±5ppm；
SILAC为±10ppm)内发现至少两个S/N大于3的峰，则产生SILAC对。低于该噪音水平的峰仅
为适合的缺失“轻”或“重”通道贡献基于噪音的强度。从定量中排除表现出可能的峰合并的
峰，所述峰合并是通过以注射时间去标准化(denormalizing)强度来确定。沿着其洗脱图谱
计算“轻”和“重”通道的强度总和。为了排除在肽洗脱图谱边缘将定量比缩小至1:1的被噪
音覆盖的峰，抛弃强度在最大强度1/2e以下的峰。适用于定量的肽需要具有最少3个提供比
例的对(即通过至少3次MS1扫描定量)。通过计算所有对应肽的比例的平均值完成蛋白质定
量。将所得到的蛋白质比例标准化至约0的中位数倍数变化以满足不均匀混合。使用这种算
法来定量常规的和NeuCode SILAC数据集。
在30秒内检查全部PSM的每一次高分辨MS1扫描，鉴定出独特的肽序列。在每次MS1扫描中，
分离该同位素簇的前4个同位素的“轻”和“重”峰。如果在所规定的允差(NeuCode为±5ppm；
SILAC为±10ppm)内发现至少两个S/N大于3的峰，则产生SILAC对。低于该噪音水平的峰仅
为适合的缺失“轻”或“重”通道贡献基于噪音的强度。从定量中排除表现出可能的峰合并的
峰，所述峰合并是通过以注射时间去标准化(denormalizing)强度来确定。沿着其洗脱图谱
计算“轻”和“重”通道的强度总和。为了排除在肽洗脱图谱边缘将定量比缩小至1:1的被噪
音覆盖的峰，抛弃强度在最大强度1/2e以下的峰。适用于定量的肽需要具有最少3个提供比
例的对(即通过至少3次MS1扫描定量)。通过计算所有对应肽的比例的平均值完成蛋白质定
量。将所得到的蛋白质比例标准化至约0的中位数倍数变化以满足不均匀混合。使用这种算
法来定量常规的和NeuCode SILAC数据集。
[0270] 实施例2——多路复用蛋白质定量的中子编码标记(signature)
[0271] 将中子编码的标记系统应用到蛋白质定量，包括利用微小质量差异，所述质量差异是由C、N、O、S、CI、Br、Si和H原子中不同的中子结合能引起。例如，通过将分析物分子中
的14N换成15N，同时将13C换成12C，能够引起6mDa的质量差异。在分析物分子的范围内，以不同
组合进行这一过程产生多种化学上相同的同位素体，其在常规质谱分析条件(质量分辨率<
30000)下分析时无法被区分，即产生一个m/z峰。然而，高分辨率(分辨率>100000)分析表明
有不同的m/z峰，能够获得所述峰的丰度并使用其确定在多种条件下分析物的量。这种技术
允许非常高水平的多路复用(例如45路复用系统、超多路复用)，同时避免SILAC和等量异位
标记的缺陷。此类标记系统的应用包括分析对人类健康至关重要的骨骼肌线粒体蛋白质组
(1098种蛋白质)。例如，本发明的标记系统可被用于精确监测线粒体蛋白质和磷蛋白质水
平的变化，这一变化是对世界范围内最多的营养失调——细胞缺铁做出的反应。
的14N换成15N，同时将13C换成12C，能够引起6mDa的质量差异。在分析物分子的范围内，以不同
组合进行这一过程产生多种化学上相同的同位素体，其在常规质谱分析条件(质量分辨率<
30000)下分析时无法被区分，即产生一个m/z峰。然而，高分辨率(分辨率>100000)分析表明
有不同的m/z峰，能够获得所述峰的丰度并使用其确定在多种条件下分析物的量。这种技术
允许非常高水平的多路复用(例如45路复用系统、超多路复用)，同时避免SILAC和等量异位
标记的缺陷。此类标记系统的应用包括分析对人类健康至关重要的骨骼肌线粒体蛋白质组
(1098种蛋白质)。例如，本发明的标记系统可被用于精确监测线粒体蛋白质和磷蛋白质水
平的变化，这一变化是对世界范围内最多的营养失调——细胞缺铁做出的反应。
[0272] 用于多路复用SILAC的中子编码的氨基酸
[0273] 赖氨酸和精氨酸的中子编码同位素形式允许最高达11路SILAC定量。但是，与常规3路SILAC相比，所述高度多路复用的SILAC试剂带来更低的光谱复杂性。这通过以下方法实
现：引入每种氨基酸的多种同位素体(每种相差约6mDa)，以产生一组5路和6路精氨酸/赖氨
酸，当其结合时产生11个定量通道。所述氨基酸向目前金标准蛋白质定量技术SILAC赋予了
前所未有的多路复用水平和性能。
现：引入每种氨基酸的多种同位素体(每种相差约6mDa)，以产生一组5路和6路精氨酸/赖氨
酸，当其结合时产生11个定量通道。所述氨基酸向目前金标准蛋白质定量技术SILAC赋予了
前所未有的多路复用水平和性能。
[0274] 复杂生物系统中的NeuCode SILAC性能
[0275] 为评估复杂生物系统中NeuCode相对于常规SILAC的性能，分别将NeuCode和SILAC标记用于在小鼠成肌细胞及其肌源性分化为肌管的过程中定量蛋白质。来自小鼠的C2C12
成肌细胞的分化是用于骨骼肌肌细胞发育的广泛研究的模型系统。NeuCode比常规SILAC多
定量x％蛋白质(1458对比1031)，同时可比较地估计了相对蛋白质丰度(m＝0.82,R2＝
0.78；图29)。两种方法都测量了支持正在进行的肌源性分化的蛋白质变化，如GO注释(例如
电子传递链和肌肉系统过程)的富集所证明(图30)。
成肌细胞的分化是用于骨骼肌肌细胞发育的广泛研究的模型系统。NeuCode比常规SILAC多
定量x％蛋白质(1458对比1031)，同时可比较地估计了相对蛋白质丰度(m＝0.82,R2＝
0.78；图29)。两种方法都测量了支持正在进行的肌源性分化的蛋白质变化，如GO注释(例如
电子传递链和肌肉系统过程)的富集所证明(图30)。
[0276] 实施例3——中子编码的氨基酸
[0277] 上述数据证明NeuCode标记策略的可行性，并且将SILAC提供的复用能力加倍。为了增加多路复用，合成SILAC氨基酸的定制同位素体。为了确定最合适的策略，计算用于
SILAC的6种氨基酸(Ser、Leu、Tyr、Lys、Met和Arg)中每一种的NeuCode同位素体的质量范围
和数目。仅操控所述6种氨基酸即能够产生3004种同位素体(图13)。平均下来，所述同位素
体在26-63mDa范围内相差1.07mDa。这意味着通过使同位素体偏移质量间距与目前可获得
的质量分辨率精确匹配，能够使多路复用能力达到最大。精氨酸提供了最宽的偏移质量范
围(62.8mDa)，因此提供最高水平的多路复用能力。
SILAC的6种氨基酸(Ser、Leu、Tyr、Lys、Met和Arg)中每一种的NeuCode同位素体的质量范围
和数目。仅操控所述6种氨基酸即能够产生3004种同位素体(图13)。平均下来，所述同位素
体在26-63mDa范围内相差1.07mDa。这意味着通过使同位素体偏移质量间距与目前可获得
的质量分辨率精确匹配，能够使多路复用能力达到最大。精氨酸提供了最宽的偏移质量范
围(62.8mDa)，因此提供最高水平的多路复用能力。
[0278] 但是，常规的SILAC实验单独使用赖氨酸或者联合使用赖氨酸和精氨酸。因为定制氨基酸合成价格昂贵，最初仅制备了赖氨酸的定制同位素体。如果在SILAC中仅使用赖氨
酸，使用蛋白酶endo LysC可获得最佳结果。这种酶在赖氨酸处切割肽，保证每个生成的肽
都包含标记。Endo LysC正在迅速成为蛋白质组学中优选的蛋白酶，通常被用来代替胰蛋白
酶。LycC平均仅产生稍大的肽，与胰蛋白酶相比(11个残基对比13个残基，酵母)。除此之外，
由于LysC在非常大量的变性剂(例如脲，最高达8M)中仍保持蛋白质水解活性，因此通常优
选LysC。
酸，使用蛋白酶endo LysC可获得最佳结果。这种酶在赖氨酸处切割肽，保证每个生成的肽
都包含标记。Endo LysC正在迅速成为蛋白质组学中优选的蛋白酶，通常被用来代替胰蛋白
酶。LycC平均仅产生稍大的肽，与胰蛋白酶相比(11个残基对比13个残基，酵母)。除此之外，
由于LysC在非常大量的变性剂(例如脲，最高达8M)中仍保持蛋白质水解活性，因此通常优
选LysC。
[0279] NeuCode赖氨酸同位素体的开发
[0280] 图14示出了比未标记的赖氨酸重+8Da的39种赖氨酸同位素体的同位素组成和分子量。能够实现38.5mDa的偏移质量范围(加入共10Da重同位素产生图13中所示的最大偏
移)。仅有两种+8Da同位素体是可商购的(13C62H015N2和13C02H815N0，图14中的红色/蓝色条纹
柱)。所述的两种同位素体几乎跨越整个偏移质量范围(36.0mDa)并且在本实验中，在三路
或四路NeuCode SILAC策略中用作两种最极端的标签(即最轻和最重)。+8Da赖氨酸同位素
体13C32H415N1的合成将产生与“重”和“轻”标签刚好相差18.0mDa的“中”标签(红色柱，图14)。
此间距与480K分辨率——Orbitrap系统目前商用的能力和用于本文所示的初步数据的分
辨率——兼容。预计在不远的将来，将实现Orbitrap系统上的960K分辨率的广泛商业应用。
对所述系统和FT-ICR-MS系统而言，通过合成两种其他的+8Da赖氨酸同位素体13C52H215N1
和13C42H415N0，能够完成四路NeuCode SILAC方法。所述两种定制的同位素体以及可商购的
“重”和“轻”+8Da赖氨酸残基，间距同样为约12mDa(蓝色柱，图14)。质谱分辨率从480K至
960K的翻倍，以及使用所述定制同位素体，将允许实现四路NeuCode SILAC方法，当在常规
条件(即分辨率<100K)下分析时，所述方法提供未标记样品的光谱复杂性。
移)。仅有两种+8Da同位素体是可商购的(13C62H015N2和13C02H815N0，图14中的红色/蓝色条纹
柱)。所述的两种同位素体几乎跨越整个偏移质量范围(36.0mDa)并且在本实验中，在三路
或四路NeuCode SILAC策略中用作两种最极端的标签(即最轻和最重)。+8Da赖氨酸同位素
体13C32H415N1的合成将产生与“重”和“轻”标签刚好相差18.0mDa的“中”标签(红色柱，图14)。
此间距与480K分辨率——Orbitrap系统目前商用的能力和用于本文所示的初步数据的分
辨率——兼容。预计在不远的将来，将实现Orbitrap系统上的960K分辨率的广泛商业应用。
对所述系统和FT-ICR-MS系统而言，通过合成两种其他的+8Da赖氨酸同位素体13C52H215N1
和13C42H415N0，能够完成四路NeuCode SILAC方法。所述两种定制的同位素体以及可商购的
“重”和“轻”+8Da赖氨酸残基，间距同样为约12mDa(蓝色柱，图14)。质谱分辨率从480K至
960K的翻倍，以及使用所述定制同位素体，将允许实现四路NeuCode SILAC方法，当在常规
条件(即分辨率<100K)下分析时，所述方法提供未标记样品的光谱复杂性。
[0281] 达到11路NeuCode SILAC途径
[0282] 如上所述，NeuCode SILAC降低了SILAC实验的光谱复杂性；此外，其极大提高了多路复用能力(最高达四路)。有理由认为，将上述NeuCode SILAC策略与常规的多Da SILAC策
略结合将允许更高量级的基于MS1的多路复用。这可直接通过制备上述有不同偏移质量(例
如，+4、+8、+12Da)的NeuCode同位素体实现。图15示出了通过掺入稳定的重同位素使赖氨酸
质量增加4、8和12Da时可获得的同位素体的数量。通过划分所述同位素体以6、12或18mDa的
确定偏移质量跨越的质量范围，能够计算每一种提供的路数(图15)。通过结合所述三组赖
氨酸(即+4、+8和+12Da)，能够产生8路(18mDa间距)或11路(12mDa间距)NeuCode SILAC。图
13 2 15 18
16示出了当使用 C、H、N、O原子的不同组合来增加4、8或12个额外中子时，赖氨酸同位
素体的质量和同位素组成。
略结合将允许更高量级的基于MS1的多路复用。这可直接通过制备上述有不同偏移质量(例
如，+4、+8、+12Da)的NeuCode同位素体实现。图15示出了通过掺入稳定的重同位素使赖氨酸
质量增加4、8和12Da时可获得的同位素体的数量。通过划分所述同位素体以6、12或18mDa的
确定偏移质量跨越的质量范围，能够计算每一种提供的路数(图15)。通过结合所述三组赖
氨酸(即+4、+8和+12Da)，能够产生8路(18mDa间距)或11路(12mDa间距)NeuCode SILAC。图
13 2 15 18
16示出了当使用 C、H、N、O原子的不同组合来增加4、8或12个额外中子时，赖氨酸同位
素体的质量和同位素组成。
[0283] 为了将定制的四路赖氨酸同位素体转换为12路实验，使用的同位素体，使用商用的mTRAQ标签对NeuCode SILAC肽进行化学标记。mTRAQ为所有伯胺(即赖氨酸和N末端)加上
1
+0、+4和+8Da标签。在本策略中，具有相同序列的肽分布于3个MS同位素簇——每个簇包含
仅在高分辨率MS1扫描中显示的四路定量信息。应当注意的是，mTRAQ带来产生3个不同的同
位素簇的总质量差异。如果可以得到上述赖氨酸同位素体，这种化学标记可用于模拟可得
到的结果。图17示出了以使用双路赖氨酸同位素体(13C6/15N2Lys(+8.0142Da)或2H8(+
8.0502Da))的该策略所获得的初步结果。标记之后，将包含二路NeuCode SILAC和mTRAQ的
肽以1:1:1:1:1:1(图17，左)或10:10:5:5:1:1(图17，右)的比例混合(6路)，并用上述相同
的nLC-MS/MS方法分析。
1
+0、+4和+8Da标签。在本策略中，具有相同序列的肽分布于3个MS同位素簇——每个簇包含
仅在高分辨率MS1扫描中显示的四路定量信息。应当注意的是，mTRAQ带来产生3个不同的同
位素簇的总质量差异。如果可以得到上述赖氨酸同位素体，这种化学标记可用于模拟可得
到的结果。图17示出了以使用双路赖氨酸同位素体(13C6/15N2Lys(+8.0142Da)或2H8(+
8.0502Da))的该策略所获得的初步结果。标记之后，将包含二路NeuCode SILAC和mTRAQ的
肽以1:1:1:1:1:1(图17，左)或10:10:5:5:1:1(图17，右)的比例混合(6路)，并用上述相同
的nLC-MS/MS方法分析。
[0284] 图14示出了偏移质量为+4、+8和+12Da时赖氨酸所有理论上的同位素体的质量的图。每一种分别具有18、39和35种独特的同位素体，跨越26.8、38.5和35.6mDa。目前仪器还
不具有足以区分这些同位素体中每一种的分辨率，因此用目前的商用仪器无法实现92路
SILAC能力。但是，使用目前的技术能够分辨间距约10-20mDa的同位素体。如图8所示，在
480K分辨率(目前商用的Orbitrap的最大分辨率)下，间距为10mDa时约40％的肽是可定量
的。在此分辨率下，间距为20mDa时接近90％是可定量的。在960K分辨率下——其最近被公
布并且正在为Orbitraps商业开发，间距为10mDa时约90％观测到的肽是可定量的。使用约
10-12mDa的间距，从+4、+8和+12Da偏移质量组中选择3、5和4种同位素体。在组合时，所述残
基将提供与目前FT-MS仪器兼容的最高达12路SILAC。
不具有足以区分这些同位素体中每一种的分辨率，因此用目前的商用仪器无法实现92路
SILAC能力。但是，使用目前的技术能够分辨间距约10-20mDa的同位素体。如图8所示，在
480K分辨率(目前商用的Orbitrap的最大分辨率)下，间距为10mDa时约40％的肽是可定量
的。在此分辨率下，间距为20mDa时接近90％是可定量的。在960K分辨率下——其最近被公
布并且正在为Orbitraps商业开发，间距为10mDa时约90％观测到的肽是可定量的。使用约
10-12mDa的间距，从+4、+8和+12Da偏移质量组中选择3、5和4种同位素体。在组合时，所述残
基将提供与目前FT-MS仪器兼容的最高达12路SILAC。
[0285] 通过仅使用13C、15N和18O能够编码同位素体质量差异。图18示出了能够被引入化学标签的不同同位素体，所述化学标签包括最多达8个13C和15N原子，以及最多达4个18O原子
2 13 15 18
(无H原子)。图18中突出显示的同位素体只示出了使用0-8个 C原子和0-8个 N原子(无 O
原子或2H原子)的同位素体。在本发明的一个实施方案中，理想地，合成标签仅使用13C和15N，
因为氘(2H)能够诱导色谱峰偏移并通过仅使用13C和15N来避免。在这个实施方案中，优选不
使用18O，因为18O无法提供像13C和15N原子一样大的质量差异。在6mDa间距时，仅使用13C和15N
即可制备能够提供9路定量的化学试剂。以这种方式还可精简合成策略，因为仅需要改变两
种元素。
2 13 15 18
(无H原子)。图18中突出显示的同位素体只示出了使用0-8个 C原子和0-8个 N原子(无 O
原子或2H原子)的同位素体。在本发明的一个实施方案中，理想地，合成标签仅使用13C和15N，
因为氘(2H)能够诱导色谱峰偏移并通过仅使用13C和15N来避免。在这个实施方案中，优选不
使用18O，因为18O无法提供像13C和15N原子一样大的质量差异。在6mDa间距时，仅使用13C和15N
即可制备能够提供9路定量的化学试剂。以这种方式还可精简合成策略，因为仅需要改变两
种元素。
[0286] 图19示出了如果使用图18中突出显示的同位素体(仅重C和N原子)来标记肽(假定所述肽上有两个标签)，其所产生的理论模拟情况。使用480K分辨率能够区分这些标签中的
每一种并获得9路定量数据(突出显示小鼠)。
每一种并获得9路定量数据(突出显示小鼠)。
[0287] 图20示出了包含足够的C、N和O原子以提供图18的同位素体组合的可能化合物的结构。
[0288] 图21示出了同样能够被编码以提供大量同位素体的其他化学标签。
[0289] 其他实验参数
[0290] 取样——开发较高水平的多路复用将需要增加同位素体标记的肽的MS1簇的数量。MS1簇数量会增加光谱复杂性并可能减少作业周期。可以使用用于动态排除的仪器控制
选项以鉴定哪些峰来自相同的肽种类，然后仅对其中丰度最高的取样，同时从MS2取样中排
除其他的。这可避免对具有不同形式的同一种类取样。还可分析缩小的质量范围以使鉴定
最大化。
选项以鉴定哪些峰来自相同的肽种类，然后仅对其中丰度最高的取样，同时从MS2取样中排
除其他的。这可避免对具有不同形式的同一种类取样。还可分析缩小的质量范围以使鉴定
最大化。
[0291] AGC目标——对于每种肽母离子而言，在定量扫描中分析的离子越多，NeuCode对将合并的可能性越大。对于总离子计数在较少肽母离子上分布的分级分离样品而言，这更
是一个问题。减少定量的AGC目标将降低合并的可能性，但也会导致更弱的信号和更小的噪
音。因此，与指示灵敏度的信噪比不同，它可以变化。
是一个问题。减少定量的AGC目标将降低合并的可能性，但也会导致更弱的信号和更小的噪
音。因此，与指示灵敏度的信噪比不同，它可以变化。
[0292] 碎片化——尽管使用离子阱HCD和ETD同样是可能的，但是目前的策略使用离子阱CAD碎片化和MS分析。所述扫描功能的作业周期与CAD类似，但可能使带更多电荷的来自
LysC消化的肽产物碎片化得更好。
LysC消化的肽产物碎片化得更好。
[0293] 分辨率检测——根据以上实验，R＝480K时能够分辨7个NeuCode SILAC对，R＝960K时能够分辨9个。预计在用7个或9个NeuCode SILAC对标记、以1:1比例混合的肽中，超
过80％在FWOM处具有完整的一系列可分辨的肽对。
过80％在FWOM处具有完整的一系列可分辨的肽对。
[0294] 扫描速率——当在扫描序列中包含其他480K或960K分辨率定量扫描时，能够评估对收集的MS1和MS2光谱数量的影响。可能几乎没有来自其他定量扫描的影响，因为能够同
时收集离子阱MS2光谱和定量扫描。
时收集离子阱MS2光谱和定量扫描。
[0295] 肽鉴定的数量——NeuCode SILAC 7路或11路实验中作出的肽光谱鉴定数量类似于SILAC 3路实验。所作出的鉴定的数量可能间接与存在的MS1簇的数量相关。因此，上述实
验与SILAC 3路最为相似，因此应当与其相比较。
验与SILAC 3路最为相似，因此应当与其相比较。
[0296] 动态范围/准确度/精度——将NeuCode SILAC对和SILAC对以1:1、1:2、1:5和1:10的比例混合证明，每一比例的NeuCode SILAC和SILAC的中位数值(准确度)和标准差(精度)
是类似的。
是类似的。
[0297] 信息学工具
[0298] 信息学工具将收集的光谱转换为高度多路复用的、以MS1为中心的肽定量。这是通13 15
过使用两个形式的赖氨酸——“轻”( C6 N2，+8.0142Da)和“重”(D8，+8.0502Da)——的双
路实验来说明。首先，数据库搜索将低分辨率MS/MS光谱与给定实验中具有“平均”赖氨酸组
成的肽匹配(即对赖氨酸的固定修饰等于所使用的全部不同赖氨酸形式之间的平均质量差
异，在此处为+8.0322Da)。然后肽-光谱匹配的列表将指向一种算法，该算法在全部PSM的某
个保留时间窗内的每个高分辨率MS1扫描迭代，鉴定独特的肽序列。在各次MS1扫描中，将鉴
定生成的峰分离。因为此时所述峰是“轻”或“重”仍然未知，利用通过序列和荷电状态信息
计算的适合质量差异同时在所述鉴定峰的低侧和高侧搜索其伴侣峰。如果发现一个峰的质
量落入允差(0.002Da)范围内并且其强度大于所述鉴定峰的噪音水平，则此峰被认为是伴
侣峰并形成一对峰。如果未找到此类峰，噪音峰将被替代作为所述鉴定峰的伴侣峰，来为比
例估计提供峰对。一旦从适合范围内的所有MS1扫描中提取出峰对以组合成“轻”和“重”图
谱，将所述“轻”和“重”图谱转换以使得“轻”和“重”峰顶端成一直线。这种重新定位校正了保留时间色谱偏移，所述色谱偏移是由阻碍准确的比例估计的氨基酸的某些同位素标记形
式(最值得注意的是包含氘的同位素体)引起。对于对齐(aligned)的图谱，抛弃强度在图谱
最大值的1/e以下并且在所报告的其余对的中位数比例以下的对。需要具有最少3个提供比
例的对以进行定量。
过使用两个形式的赖氨酸——“轻”( C6 N2，+8.0142Da)和“重”(D8，+8.0502Da)——的双
路实验来说明。首先，数据库搜索将低分辨率MS/MS光谱与给定实验中具有“平均”赖氨酸组
成的肽匹配(即对赖氨酸的固定修饰等于所使用的全部不同赖氨酸形式之间的平均质量差
异，在此处为+8.0322Da)。然后肽-光谱匹配的列表将指向一种算法，该算法在全部PSM的某
个保留时间窗内的每个高分辨率MS1扫描迭代，鉴定独特的肽序列。在各次MS1扫描中，将鉴
定生成的峰分离。因为此时所述峰是“轻”或“重”仍然未知，利用通过序列和荷电状态信息
计算的适合质量差异同时在所述鉴定峰的低侧和高侧搜索其伴侣峰。如果发现一个峰的质
量落入允差(0.002Da)范围内并且其强度大于所述鉴定峰的噪音水平，则此峰被认为是伴
侣峰并形成一对峰。如果未找到此类峰，噪音峰将被替代作为所述鉴定峰的伴侣峰，来为比
例估计提供峰对。一旦从适合范围内的所有MS1扫描中提取出峰对以组合成“轻”和“重”图
谱，将所述“轻”和“重”图谱转换以使得“轻”和“重”峰顶端成一直线。这种重新定位校正了保留时间色谱偏移，所述色谱偏移是由阻碍准确的比例估计的氨基酸的某些同位素标记形
式(最值得注意的是包含氘的同位素体)引起。对于对齐(aligned)的图谱，抛弃强度在图谱
最大值的1/e以下并且在所报告的其余对的中位数比例以下的对。需要具有最少3个提供比
例的对以进行定量。
[0299] 实施例4——用于最高达45路蛋白质组对比的中子编码的化学试剂的合成
[0300] 为了实现最大多路复用能力(即超多路复用)并保证与生物组织和体液分析的相容性，合成一组中子编码的试剂，所述试剂允许前所未有的45路分析。所述试剂利用被广泛
研究的NHS酯反应基团并且将标签放置于肽的游离胺上。改变肽母离子的15N和13C含量提供
各间距6mDa的9种变体。通过将所述9种同位素体与也在标签上的13C/18O的+0、+4、+8、+12和
+16Da同位素结合，实现超多路复用。在此超多路复用模式中，将在MS1光谱中观察到5个同
位素簇峰。高分辨率分析显示所述5个簇中每一个簇下的9个不同的同位素峰。
研究的NHS酯反应基团并且将标签放置于肽的游离胺上。改变肽母离子的15N和13C含量提供
各间距6mDa的9种变体。通过将所述9种同位素体与也在标签上的13C/18O的+0、+4、+8、+12和
+16Da同位素结合，实现超多路复用。在此超多路复用模式中，将在MS1光谱中观察到5个同
位素簇峰。高分辨率分析显示所述5个簇中每一个簇下的9个不同的同位素峰。
[0301] 实验设计：两种+8Da重赖氨酸，一种含有6个13C原子和2个15N原子，另一种含有8个2H原子。所述两种同位素体质量相差36mDa，并且根据计算在目前可商购的Orbitrap系统的
分辨率(480K)下可容易地被区分。使两种酵母培养物在包含任一种所述赖氨酸同位素体的
赖氨酸缺陷培养基上生长。然后消化来自各培养物的蛋白质，将其混合并通过使用
Orbitrap质谱系统的高分辨率质谱法分析所述肽。
分辨率(480K)下可容易地被区分。使两种酵母培养物在包含任一种所述赖氨酸同位素体的
赖氨酸缺陷培养基上生长。然后消化来自各培养物的蛋白质，将其混合并通过使用
Orbitrap质谱系统的高分辨率质谱法分析所述肽。
[0302] 赖氨酸选择。为确定NeuCode SILAC能够提供的多路复用的最大数量，考虑使用哪种氨基酸及其各种同位素体。常规SILAC实验单独使用赖氨酸或结合使用赖氨酸和精氨酸。
Endo LysC正迅速成为蛋白质组学中优选的蛋白酶，并且通常被用来代替胰蛋白酶。平均起
来，LysC仅产生稍大的肽，与胰蛋白酶相比(11vs.13残基，酵母)。除此之外，通常优选LysC，
因为其在非常大量变性剂(例如脲，最高达8M)下仍保持蛋白质水解活性。因为LysC的稳固
性能，选择赖氨酸的同位素体用于合成。理论是简单易懂的——LysC通常是用于鸟枪法蛋
白质组学的优选酶，并且使用LysC允许仅使用赖氨酸同位素体，这简化了实验。即能够使定
制的合成努力仅集中于一种氨基酸(赖氨酸)并仍旧通过用酶LysC检验获得优良的蛋白质
组深度和性能，其保证每种生成的肽包含中子编码的赖氨酸残基。
Endo LysC正迅速成为蛋白质组学中优选的蛋白酶，并且通常被用来代替胰蛋白酶。平均起
来，LysC仅产生稍大的肽，与胰蛋白酶相比(11vs.13残基，酵母)。除此之外，通常优选LysC，
因为其在非常大量变性剂(例如脲，最高达8M)下仍保持蛋白质水解活性。因为LysC的稳固
性能，选择赖氨酸的同位素体用于合成。理论是简单易懂的——LysC通常是用于鸟枪法蛋
白质组学的优选酶，并且使用LysC允许仅使用赖氨酸同位素体，这简化了实验。即能够使定
制的合成努力仅集中于一种氨基酸(赖氨酸)并仍旧通过用酶LysC检验获得优良的蛋白质
组深度和性能，其保证每种生成的肽包含中子编码的赖氨酸残基。
[0303] 图14示出了偏移质量为+4、+8和+12Da时赖氨酸所有理论上的同位素体的质量的图。每一种分别具有18、39和35种独特的同位素体，其分别跨越26.8、38.5和35.6mDa。目前
仪器的分辨率不足以区分每种所述同位素体，因此用目前的商用仪器不能实现92路SILAC
的能力。但是，使用目前的商业化技术能够分辨间距约10-20mDa的同位素体。图8表示在
480K分辨率(目前商用的Orbitrap的最大分辨率)下，间距为10mDa时约40％的肽是可定量
的。在该分辨率下，间距为20mDa时接近90％是可定量的。间距为10mDa时，960K分辨率可定
量约90％的所观察的肽。使用约10-12mDa的间距，从+4、+8和+12Da偏移质量组中选择3、5和
4种同位素体。在结合时所述残基将提供与目前FT-MS仪器兼容的最高达12路SILAC。
仪器的分辨率不足以区分每种所述同位素体，因此用目前的商用仪器不能实现92路SILAC
的能力。但是，使用目前的商业化技术能够分辨间距约10-20mDa的同位素体。图8表示在
480K分辨率(目前商用的Orbitrap的最大分辨率)下，间距为10mDa时约40％的肽是可定量
的。在该分辨率下，间距为20mDa时接近90％是可定量的。间距为10mDa时，960K分辨率可定
量约90％的所观察的肽。使用约10-12mDa的间距，从+4、+8和+12Da偏移质量组中选择3、5和
4种同位素体。在结合时所述残基将提供与目前FT-MS仪器兼容的最高达12路SILAC。
[0304] NeuCode SILAC
[0305] 产生允许最高达11路SILAC定量的赖氨酸和精氨酸的中子编码同位素形式。但是，所述高度多路复用的SILAC试剂提供低于常规3路SILAC的光谱复杂性。引入每种氨基酸的
多种同位素体(各相差约6mDa)，以产生一组5路和6路精氨酸/赖氨酸，当其结合时产生11个
用于定量的通道。与SILAC相比，这些氨基酸产生提高的多路复用水平和性能。
多种同位素体(各相差约6mDa)，以产生一组5路和6路精氨酸/赖氨酸，当其结合时产生11个
用于定量的通道。与SILAC相比，这些氨基酸产生提高的多路复用水平和性能。
[0306] NeuCode ULTRA
[0307] 为了实现最大多路复用能力(即超多路复用)并保证与生物组织和体液分析的兼容性，合成一组中子编码的试剂，所述试剂允许前所未有的45路分析。所述试剂利用被广泛
研究的NHS酯反应基团并且将标签放置于肽的游离胺上。改变肽母离子的15N和13C含量提供
每一种均间距6mDa的9种变体。通过将所述9种同位素体与也在标签上的13C/18O的+0、+4、+
8、+12和+16Da同位素结合，实现超多路复用。在此超多路复用模式中，将在MS1光谱中观察
到5个同位素簇峰。高分辨率分析显示所述5个簇中的每一簇下的9个不同的同位素峰。
研究的NHS酯反应基团并且将标签放置于肽的游离胺上。改变肽母离子的15N和13C含量提供
每一种均间距6mDa的9种变体。通过将所述9种同位素体与也在标签上的13C/18O的+0、+4、+
8、+12和+16Da同位素结合，实现超多路复用。在此超多路复用模式中，将在MS1光谱中观察
到5个同位素簇峰。高分辨率分析显示所述5个簇中的每一簇下的9个不同的同位素峰。
[0308] 使用中子编码的定量蛋白质组学——O质量中子编码(Quantitative Proteomics with Neutron Encoding-O Mass Neutron Encorded)
[0309] 能够将中子编码掺入1)氨基酸和2)新型试剂标签以建立在许多方面优于常规SILAC和等量异位标记的基于MS1的定量方法。两种+8Da重赖氨酸，一种含有6个13C和2个
15 2
N，另一种含有8个氘(H)。使两种酵母培养物在包含任一种所述赖氨酸同位素体的赖氨酸
缺陷培养基上生长。将来自每种培养物的蛋白质消化、混合并通过使用Orbitrap质谱系统
的高分辨率质谱法分析肽。
15 2
N，另一种含有8个氘(H)。使两种酵母培养物在包含任一种所述赖氨酸同位素体的赖氨酸
缺陷培养基上生长。将来自每种培养物的蛋白质消化、混合并通过使用Orbitrap质谱系统
的高分辨率质谱法分析肽。
[0310] 需要用来分离用所述赖氨酸标记的肽的分辨率随着肽质量的增加而增大。用Orbitrap分析器可达到的分辨率以m/z值的平方根的函数下降。因此，在肽母离子的高m/z
值和多荷电状态下，目前最先进质谱仪器还无法立即显而易见地区分中子引起的微小质量
差异。应当注意的是，上述TMT工作需要分辨非常小的标签(约100m/z且仅处于+1荷电状
态)。要进行中子编码的质量标记，必须能够在高得多的质量和高荷电状态下分辨这种差
异。随着每次增加荷电状态，m/z间距减小至原来的1/2，因此需要更高的分辨率来分离它
们。
值和多荷电状态下，目前最先进质谱仪器还无法立即显而易见地区分中子引起的微小质量
差异。应当注意的是，上述TMT工作需要分辨非常小的标签(约100m/z且仅处于+1荷电状
态)。要进行中子编码的质量标记，必须能够在高得多的质量和高荷电状态下分辨这种差
异。随着每次增加荷电状态，m/z间距减小至原来的1/2，因此需要更高的分辨率来分离它
们。
[0311] 图2表示在不同的分辨率设定下，选定的一对赖氨酸标记的肽对的结果。应当注意的是，在Orbitrap质谱系统的常规操作分辨率(30000)下，所述两个NeuCode标记的肽无法
区分且作为同种肽出现。但是在240000分辨率下分析时，所述肽对基线分辨，并且能够确定
每种分析物的相对丰度。在最高分辨率480000下操作所述系统产生对在复杂混合物中检测
到的几乎每种肽种类的基线分离。
区分且作为同种肽出现。但是在240000分辨率下分析时，所述肽对基线分辨，并且能够确定
每种分析物的相对丰度。在最高分辨率480000下操作所述系统产生对在复杂混合物中检测
到的几乎每种肽种类的基线分离。
[0312] 用于NeuCode的SILAC氨基酸
[0313] 使用这种方法，能够将中子标签掺入到被引入细胞培养物中的氨基酸。在SILAC中进行类似的方法，但是使用相差3-6Da的同位素以在质谱分析中分开m/z峰。目前大间距
SILAC存在一个主要的限制。这个限制是，仅能够进行2路或3路复用，因为使用全部双重峰
或三重峰对(doublet or triplet partner)使质谱过于复杂。NeuCode技术允许多路复用，
使得在正常分辨率下不同通道重叠，因此不存在光谱复杂的问题。
SILAC存在一个主要的限制。这个限制是，仅能够进行2路或3路复用，因为使用全部双重峰
或三重峰对(doublet or triplet partner)使质谱过于复杂。NeuCode技术允许多路复用，
使得在正常分辨率下不同通道重叠，因此不存在光谱复杂的问题。
[0314] 能够将9种重同位素掺入到赖氨酸的不同位置(不同的15N、13C、2H和18O原子)。以此构建质量间距仅为41.4mDa的41种不同的同位素体。图3示出了它们的质量差异的图。X轴代
表每种同位素体标号，Y轴代表与普通赖氨酸残基的质量差异(Da)。在质谱仪分辨率允许的
情况下，能够选择合成尽可能多的同位素体并将其掺入细胞培养物。可以预见，目前的技术
将允许至少4-6路系统，然后分辨率的加倍能够使这个数字加倍。尽管在本实验中以赖氨酸
为例进行说明，但是能够对任意氨基酸进行这种实验。
表每种同位素体标号，Y轴代表与普通赖氨酸残基的质量差异(Da)。在质谱仪分辨率允许的
情况下，能够选择合成尽可能多的同位素体并将其掺入细胞培养物。可以预见，目前的技术
将允许至少4-6路系统，然后分辨率的加倍能够使这个数字加倍。尽管在本实验中以赖氨酸
为例进行说明，但是能够对任意氨基酸进行这种实验。
[0315] 用于NeuCode的化学试剂
[0316] 此标记系统可与新型标记试剂一起使用，并且不限于SILAC相关方法。这将允许分析与组织培养物不相容的组织和其他体液。NHS酯技术是广泛应用的将标签与肽连接以用
于蛋白质组学分析的化学方法，包括两种商用的等量异位标记法(iTRAQ和TMT)。图20和21
示出了合成简单、与中子编码兼容的可能的标签，其也使用NHS酯连接化学方法。但是，不同
于等量异位标签，本标记系统不需要并入报告基团、接头和带电位点的特殊设计。相反，本
发明的标签被设计为与肽保持结合并且仅在高分辨率下检测时提供定量测量。
于蛋白质组学分析的化学方法，包括两种商用的等量异位标记法(iTRAQ和TMT)。图20和21
示出了合成简单、与中子编码兼容的可能的标签，其也使用NHS酯连接化学方法。但是，不同
于等量异位标签，本标记系统不需要并入报告基团、接头和带电位点的特殊设计。相反，本
发明的标签被设计为与肽保持结合并且仅在高分辨率下检测时提供定量测量。
[0317] NeuCode的优势
[0318] 与目前最受欢迎的两种蛋白质组学定量方法——SILAC和等量异位标记相比，本方法具有相当大的优势：
[0319] 1.SILAC——SILAC将重氨基酸(通常具有3-6Da质量差异)引入细胞培养物，使得在分析过程中肽对表现为双重峰，其间距约3-6Da。NeuCode能够被用于SILAC的氨基酸中，
但是将(1)与常规SILAC相比，能提供更大的取样深度的能力；以及(2)允许高得多的多路复
用(即对比4-6个样品Vs.2-3个样品)。
但是将(1)与常规SILAC相比，能提供更大的取样深度的能力；以及(2)允许高得多的多路复
用(即对比4-6个样品Vs.2-3个样品)。
[0320] 2.等量异位标记——等量异位标记提供多路复用，但是有两个明显缺陷：(1)它会受到来自重叠的标记分析物的干扰，所述干扰降低了动态范围和定量准确度；(2)它需要
MS/MS事件的集合以实现定量。NeuCode是基于MS1的方法，因此干扰不再是问题，并且不再
需要获得MS/MS扫描。但是NeuCode仍能够像等量异位标记一样提供多路复用。
MS/MS事件的集合以实现定量。NeuCode是基于MS1的方法，因此干扰不再是问题，并且不再
需要获得MS/MS扫描。但是NeuCode仍能够像等量异位标记一样提供多路复用。
[0321] 实施例5——用赖氨酸以外的氨基酸证明NeuCode
[0322] 还已经以使用亮氨酸的NeuCode收集数据。有两个形式的同位素标记亮氨酸——一种同位素体含有6个13C原子和1个15N原子，另一种同位素体含有7个2H原子。这些同位素体
质量相差27mDa。如图22示出的，使两种酵母培养物生长在分别包含这些亮氨酸同位素体中
一种的亮氨酸缺陷培养基上。将来自每种培养物的蛋白质消化、混合并使用Orbitrap质谱
系统用高分辨率质谱法分析所得的肽。所得的肽具有在高分辨率下可分辨的亮氨酸残基。
按照上述用赖氨酸标记的实例所述的，通过比较同位素体之间的峰高进行相对蛋白质丰度
测量。
质量相差27mDa。如图22示出的，使两种酵母培养物生长在分别包含这些亮氨酸同位素体中
一种的亮氨酸缺陷培养基上。将来自每种培养物的蛋白质消化、混合并使用Orbitrap质谱
系统用高分辨率质谱法分析所得的肽。所得的肽具有在高分辨率下可分辨的亮氨酸残基。
按照上述用赖氨酸标记的实例所述的，通过比较同位素体之间的峰高进行相对蛋白质丰度
测量。
[0323] 实施例6——用于NeuCode的化学试剂
[0324] 可使用胺反应性同位素体标签以将NeuCode标记策略引入肽以外的分析物。这种类型的化学方法不需要在细胞培养中引入标记，因此与所有样品类型兼容。例如，当暴露于
热时，脲使肽的伯胺氨甲酰化。肽被用13C或15N2标记的脲同位素体氨甲酰化。对于每种添加
13 15
的氨甲酰基团，所述肽的伯胺被单个 C或 N氨甲酰化，从而生成每个氨甲酰化位点质量相
差6.3mDa的肽。
热时，脲使肽的伯胺氨甲酰化。肽被用13C或15N2标记的脲同位素体氨甲酰化。对于每种添加
13 15
的氨甲酰基团，所述肽的伯胺被单个 C或 N氨甲酰化，从而生成每个氨甲酰化位点质量相
差6.3mDa的肽。
[0325] 图23示出了用脲的每种同位素体使肽LEQNPEESQDIK氨甲酰化。该肽的N末端和赖氨酸侧链上的伯胺被氨甲酰化，生成相差12.6mDa的肽。使用480K分辨率分辨所述被标记的
肽，该分辨率允许进行被这些NeuCode同位素体标记的样品之间的相对丰度测量。
肽，该分辨率允许进行被这些NeuCode同位素体标记的样品之间的相对丰度测量。
[0326] 实施例7——可用于中子编码的元素和组成
[0327] 并非所有的元素都适用于中子编码。图24的表格示出了具有稳定重同位素的常见元素，所述稳定重同位素可被掺入分子中。第三列提供了每种同位素的标称质量，第三列提
供了精确质量。精确质量和标称质量之间的差异大部分是由每种元素的中子结合能的变化
引起。第四列提供了所述同位素的丰度比例。以下表1列出了用于本方法的最合乎需要的元
素。按照用一种同位素替换另一种时所编码的额外中子数(例如，用13C替换12C，增加一个中
子)和替换所引入的质量亏损(3.3mDa，对于后一种情况)对所述元素进行分组。组A是增加
一个中子和正质量亏损的合乎需要的元素。组B增加两个中子，质量亏损为正。组C增加一个
中子，但是引入负质量亏损，组D增加两个中子并引入负质量亏损。使用所述分组系统，计算
可被植入中子编码标记系统用于中子编码的几种可能的中子编码的标记同位素体组成。这
些计算考虑使用最高达36个来自组A的原子，8个来自组B的原子，12个来自组C的原子和最
高达16个来自组D的原子。当添加最高达36个额外中子时，即通过使用表1中不同组的元素
添加36个中子时，检查所述元素的所有可能的组合。
供了精确质量。精确质量和标称质量之间的差异大部分是由每种元素的中子结合能的变化
引起。第四列提供了所述同位素的丰度比例。以下表1列出了用于本方法的最合乎需要的元
素。按照用一种同位素替换另一种时所编码的额外中子数(例如，用13C替换12C，增加一个中
子)和替换所引入的质量亏损(3.3mDa，对于后一种情况)对所述元素进行分组。组A是增加
一个中子和正质量亏损的合乎需要的元素。组B增加两个中子，质量亏损为正。组C增加一个
中子，但是引入负质量亏损，组D增加两个中子并引入负质量亏损。使用所述分组系统，计算
可被植入中子编码标记系统用于中子编码的几种可能的中子编码的标记同位素体组成。这
些计算考虑使用最高达36个来自组A的原子，8个来自组B的原子，12个来自组C的原子和最
高达16个来自组D的原子。当添加最高达36个额外中子时，即通过使用表1中不同组的元素
添加36个中子时，检查所述元素的所有可能的组合。
[0328] 表1.可用于中子编码的同位素对的列表。根据所添加的中子数，以及所引入的质量亏损是正还是负，将同位素划分成4组中的1组中。
[0329] 组A
[0330]
[0331] 组B
[0332]
[0333] 组C
[0334]
[0335] 组D
[0336]
[0337] 对所述计算的总结如表2所示，其中报道了含有1个重原子(1中子)至最高达36个额外中子的标签的可能的排列组合数。例如，如果包含4个额外的中子，存在总共有4个额外
中子的组A、B、C和D元素的14种组合。各组中所述元素的变化产生大量同位素体，其质量范
围跨度最高达37mDa。表3示出了使用所述四组的元素而实现添加4个额外中子的各种组合，
以及能达到的最大质量亏损(使用每组内有最大质量亏损的元素计算)。从此处可见，实现
最大正质量亏损的同位素式从组A的元素中选取全部4个中子。具有最大负质量亏损的同位
素式从组C的元素中选取全部4个中子。这种方法允许制备标签大小和元素组成具有高度灵
活性的用于中子编码的同位素体，同时使质量范围和同位素体间距最大。
中子的组A、B、C和D元素的14种组合。各组中所述元素的变化产生大量同位素体，其质量范
围跨度最高达37mDa。表3示出了使用所述四组的元素而实现添加4个额外中子的各种组合，
以及能达到的最大质量亏损(使用每组内有最大质量亏损的元素计算)。从此处可见，实现
最大正质量亏损的同位素式从组A的元素中选取全部4个中子。具有最大负质量亏损的同位
素式从组C的元素中选取全部4个中子。这种方法允许制备标签大小和元素组成具有高度灵
活性的用于中子编码的同位素体，同时使质量范围和同位素体间距最大。
[0338] 表2.能够组成同位素体的组A、B、C和D的组合数总结，所述同位素体具有特定的添加中子数(左栏)。随着添加的中子数增多，可能的组合数增多(中栏)。右栏代表所述组合的
最大质量范围。
最大质量范围。
[0339]
[0340] 表3.该表描述了当编码4个额外的中子时，组A、B、C和D的14种可能的排列组合。右栏示出了每种排列组合所编码的最大质量偏移。总体上能够实现37mDa质量差异。
[0341] 增加的中子数：4
[0342]
[0343] 实施例8——化学同位素体的数学表达
[0344] 在化合物中被稳定重同位素进行同位素标记以生成化学同位素体的元素包括但不限于C、H、N、O、S、Br、Cl和Si。因此，在一个实施方案中，通过以下公式定义化合物的不同可能的同位素体：
[0345] (1)
[0346] 12CA-i13Ci1HB-j2Hj14NC-n15Nn16OD-o18Oo32SE-p34Sp79BrF-l81Brl35ClG-m37Clm28SiH-q30Siq[0347] 其中：
[0348] A是该编码的元素式中碳(C)原子总数；
[0349] B是该编码的元素式中氢(H)原子总数；
[0350] C是该编码的元素式中氮(N)原子总数；
[0351] D是该编码的元素式中氧(O)原子总数；
[0352] E是该编码的元素式中硫(S)原子总数；
[0353] F是该编码的元素式中溴(Br)原子总数；
[0354] G是该编码的元素式中氯(Cl)原子总数；
[0355] H是该编码的元素式中硅(Si)原子总数；且
[0356] i、j、n、o、p、l、m、q是代表每种元素的重同位素数的整数并且≥0。
[0357] 每种元素的重同位素数等于或小于所述编码的元素式中此元素的原子总数。每种元素的轻同位素数为所述编码的元素式中此元素的原子总数减去此元素的重同位素数。例
13 12
如，碳原子总数为A，C总数为i，因此 C原子数为A-i。
13 12
如，碳原子总数为A，C总数为i，因此 C原子数为A-i。
[0358] 通过以下等式描述通过同位素标记添加的中子数(X)：
[0359] (2)X＝i+j+n+2(o)+2(p)+2(l)+2(m)+2(q)
[0360] 添加每个13C、2H和15N导致增加1个中子，而添加每个18O、34S、81Br、37Cl和30Si导致增加2个中子。
[0361] 举例来说，赖氨酸的化学式为C6H14N2O2。但是，因为赖氨酸中的一些原子与中子编码不兼容(例如，可与溶剂互换的H原子)，所编码的元素式比化学式少5个氢原子和1个氧原
子。对于赖氨酸，所编码的元素式C6H9N2O1提供了与同位素标记兼容的原子数，所述同位素
标记使用稳定的重同位素以形成用于质谱分析的同位素体。使用赖氨酸的编码的元素式，
等式(1)被修改为以下等式：
子。对于赖氨酸，所编码的元素式C6H9N2O1提供了与同位素标记兼容的原子数，所述同位素
标记使用稳定的重同位素以形成用于质谱分析的同位素体。使用赖氨酸的编码的元素式，
等式(1)被修改为以下等式：
[0362] (3)12C6-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo，其中i≤6；j≤9；n≤2；o≤1并且i、j、n和o≥0。
[0363] 对于赖氨酸，等式(2)同样被修改为：
[0364] (4)X＝i+j+n+2(o)
[0365] 图9表示所有可能的赖氨酸+2中子同位素体(X＝2)，且可使用等式(3)描述这些条目中的每一种。例如，第一行的条目13C02H015N218O0仅掺入两个重原子，都是15N。在此情况下，X＝2且n＝2，因此i、j和o＝0。如果将这些数字代入等式(3)，可得到以下化学式：
[0366] 12C613C01H92H014N015N216O218O0。
[0367] 使用赖氨酸的编码的元素式和等式(1)，可确定所有可能的赖氨酸的同位素体。
[0368] 实施例9——使用同位素标记的氨基酸
[0369] 为了形成同位素标记的分析物，合成分析物或使同位素标记试剂与分析物反应。为了确定多个样品中分析物的相对峰度，为每种样品中的分析物提供不同的同位素标记试
剂，其中所述不同的同位素标记试剂是同位素体。
剂，其中所述不同的同位素标记试剂是同位素体。
[0370] 在一个实施方案中，所述同位素标记试剂是同位素标记的氨基酸。使所述同位素标记的氨基酸与分析物反应，从而使得所述同位素标记的氨基酸与分析物共价结合。或者，
当分析物是肽时，合成所述肽以使得所述同位素标记的氨基酸被掺入到所述肽自身的骨架
中。
当分析物是肽时，合成所述肽以使得所述同位素标记的氨基酸被掺入到所述肽自身的骨架
中。
[0371] 图25提供了可用作同位素标记试剂的20种常见氨基酸的结构。图25的第二列(被标记为“组成”)提供了每种化合物的化学式，第三列提供了编码的元素式。使用每种化合物
的编码的元素式，修正上述等式(1)从而为每种化合物提供描述该化合物所有可能的同位
素体的等式。
的编码的元素式，修正上述等式(1)从而为每种化合物提供描述该化合物所有可能的同位
素体的等式。
[0372] 表4a提供了每种氨基酸的经修正的公式，其描述了每种氨基酸的不同可能的同位素体。在第三列中提供了每种经修正的公式中每种重同位素的最大数量。例如，在表4a和图
25中，赖氨酸被提供为项12，表4a中存在的赖氨酸的经修正的公式与上述等式(3)相同：
25中，赖氨酸被提供为项12，表4a中存在的赖氨酸的经修正的公式与上述等式(3)相同：
[0373] (3)12C6-i13Ci1H9-j2Hj14N2-n15Nn16O1-o18Oo
[0374] 向每种样品中的分析物提供赖氨酸同位素体，根据其分子质量上的微小差异在质谱中检测所述同位素体。然后通过比较被检测到的同位素体的相对量，确定每种样品中分
析物的相对定量。如果所述样品之一中包含赖氨酸标准物(即以已知量存在的赖氨酸同位
素体)，则可实现对每种样品中分析物进行绝对定量。
析物的相对定量。如果所述样品之一中包含赖氨酸标准物(即以已知量存在的赖氨酸同位
素体)，则可实现对每种样品中分析物进行绝对定量。
[0375] 表4a——对于所有以下等式，i≥0，j≥0，l≥0，m≥0，n≥0，o≥0，p≥0且q≥0。
[0376]
[0377] 作为附录提供的表4b是本文提供的说明书的一部分，其也通过引用的方式纳入本文。表4b提供了可能的编码元素组合，所述组合产生可用于本发明实施方案的20种氨基酸
的同位素体。
的同位素体。
[0378] 实施例10——使用同位素肽标记物
[0379] 在其他实施方案中，所述同位素标记试剂是氨基酸以外的化合物。所述同位素标记试剂是能够与分析物共价结合或能够在分析物合成中被掺入分析物(特别是当分析物是
肽时)的任何化合物。
肽时)的任何化合物。
[0380] 图26提供了28种肽标记物的结构，所述肽记物能够被同位素标记并且与肽反应，或在合成该肽时与肽结合。图26第二列提供了每种化合物的化学式，第三列提供了编码的
元素式。使用每种化合物的编码的元素式可修正等式(1)，以为每种化合物提供描述该化合
物的所有可能的同位素体的等式。
元素式。使用每种化合物的编码的元素式可修正等式(1)，以为每种化合物提供描述该化合
物的所有可能的同位素体的等式。
[0381] 图27提供了13种其他肽标记物的结构，所述肽标记物能够被同位素标记并且与肽反应。每种肽标记物包含离去基团(在所述结构中以“LG”标明)，其在所述肽标记物与肽分
析物反应时离开所述肽标记物。因此，离去基团并非同位素标记的肽的一部分。所述离去基
团是允许所述肽标记物与肽的官能团反应的任何功能基团，例如胺反应基团或羧基反应基
团。图27的第二列提供了每种化合物的化学式(不包括任何离去基团(LG))，第三列提供了
编码的元素式。使用每种化合物的编码的元素式可修正上述等式(1)，以为每种化合物提供
描述该化合物的所有可能的同位素体的等式。为了继续图26中结束处的编号，图27中化合
物的编号从数字29开始。
析物反应时离开所述肽标记物。因此，离去基团并非同位素标记的肽的一部分。所述离去基
团是允许所述肽标记物与肽的官能团反应的任何功能基团，例如胺反应基团或羧基反应基
团。图27的第二列提供了每种化合物的化学式(不包括任何离去基团(LG))，第三列提供了
编码的元素式。使用每种化合物的编码的元素式可修正上述等式(1)，以为每种化合物提供
描述该化合物的所有可能的同位素体的等式。为了继续图26中结束处的编号，图27中化合
物的编号从数字29开始。
[0382] 表5提供了图26和27的肽标记物的修正等式，其中所述修正等式描述了每种肽标记物的不同可能的同位素体。第三列提供了每种修正等式中每种重同位素的最大数量。例
如，图26中的化合物1在表5中作为项1提供，该化合物的修正等式是：
如，图26中的化合物1在表5中作为项1提供，该化合物的修正等式是：
[0383] (4)12C9-i13Ci1H7-j2Hj35Cl1-m37Clm14N1-n15Nn16O1-o18Oo
[0384] 类似地，图27中的化合物29在表5中作为项29提供，该化合物的修正等式是：
[0385] (5)12C14-i13Ci1H12-j2Hj14N8-n15Nn16O1-o18Oo
[0386] 这些化合物的可能的同位素体落在其各自给定的修正等式范围内。
[0387] 为每种样品中的分析物提供特定蛋白质标记物的同位素体，根据其分子质量的微小差异在质谱中检测所述同位素体。然后通过比较被检测到的同位素体的相对量，确定每
种样品中分析物的相对定量。通过将标准物(即以已知量存在的特定的同位素体)掺入所述
样品之一中进行绝对定量。
种样品中分析物的相对定量。通过将标准物(即以已知量存在的特定的同位素体)掺入所述
样品之一中进行绝对定量。
[0388] 表5——对于以下等式，i≥0，j≥0，l≥0，m≥0，n≥0，o≥0，p≥0且q≥0。
[0389]
[0390]
[0391] 实施例11——使用同位素小分子标记物
[0392] 在其他实施方案中，所述分析物是除肽以外的小分子。在这种情况下，所述同位素标记试剂是能够与小分子分析物共价结合或能够在该分析物合成中被掺入分析物的任何
化合物。
化合物。
[0393] 图28提供了42种小分子标记物的结构，所述标记物可被同位素标记并且与小分子结合。所述小分子标记物包含一个或多个原子或离去基团(在所述结构中以“LG”标明)，所
述原子或离去基团在该标记物与分析物反应时离开该小分子标记物。因此，这些原子或离
去基团并非同位素标记的分析物的一部分。所述离去基团是允许该肽标记物与肽的官能团
反应的任何官能团，例如胺反应基团或羧基反应基团。图28的第二列提供了每种化合物的
化学式(不包括任何离去基团(LG))，第三列提供了编码的元素式。使用每种化合物的编码
的元素式，能够修正上述等式(1)，以为每种化合物提供描述该化合物的所有可能的同位素
体的公式。
述原子或离去基团在该标记物与分析物反应时离开该小分子标记物。因此，这些原子或离
去基团并非同位素标记的分析物的一部分。所述离去基团是允许该肽标记物与肽的官能团
反应的任何官能团，例如胺反应基团或羧基反应基团。图28的第二列提供了每种化合物的
化学式(不包括任何离去基团(LG))，第三列提供了编码的元素式。使用每种化合物的编码
的元素式，能够修正上述等式(1)，以为每种化合物提供描述该化合物的所有可能的同位素
体的公式。
[0394] 表6a提供了图28的小分子标记物的修正等式，其中所述修正等式描述了每种标记物的不同可能的同位素体。第三列提供了每种修正等式中每种重同位素的最大数量。例如，
图28的化合物2——其包含不构成同位素标记的分析物一部分的离去基团——在表6a中作
为项2提供，其修正等式是：
图28的化合物2——其包含不构成同位素标记的分析物一部分的离去基团——在表6a中作
为项2提供，其修正等式是：
[0395] (6)12C3-i13Ci1H9-j2Hj28Si1-q30Siq
[0396] 该化合物可能的同位素体落在其各自给定的修正等式范围内。
[0397] 向每种样品中的分析物提供特定小分子标记物的同位素体，根据其分子质量的微小差异在质谱中检测所述同位素体。然后通过比较被检测到的同位素体的相对量，确定每
种样品中分析物的相对定量。通过将标准物(即以已知量存在的特定的同位素体)掺入所述
样品之一进行绝对定量。
种样品中分析物的相对定量。通过将标准物(即以已知量存在的特定的同位素体)掺入所述
样品之一进行绝对定量。
[0398] 表6a——对于以下公式，i≥0，j≥0，l≥0，m≥0，n≥0，o≥0，p≥0且q≥0。
[0399]
[0400]
[0401] 作为附录提供的表6b是本文提供的说明书的一部分，其也通过引用的方式纳入本文。表6b提供了可能的编码的元素组合，所述组合产生可用于本发明实施方案的42种小分
子标记物的同位素体。
子标记物的同位素体。
[0402] 参考文献
[0403] 1.A.Ducret，I.Van Oostveen，J.K.Eng，J.R.Yates，and R.Aebersold，High throughput protein characterization by automated reverse-phase chromatography
electrospray tandem mass spectrometry.Protein Science，1998.7(3)：p.706-719.
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[0404] 2.A.J.Link，J.Eng，D.M.Schieltz，E.Carmack，G.J.Mize，D.R.Morris，B.M.Garvik，and J.R.Yates，Direct analysis of protein complexes using mass
spectrometry.Nature Biotechnology，1999.17(7)：p.676-682.
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[0405] 3.H.B.Liu，R.G.Sadygov，and J.R.Yates，A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.Analytical
Chemistry，2004.76(14)：p.4193-4201.
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[0406] 4.C.C.Wu，M.J.MacCoss，K.E.Howell，and J.R.Yates，A method for the comprehensive proteomic analysis of membrane proteins.Nature Biotechnology，
2003.21(5)：p.532-538.
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[0407] 5.D.L.Tabb，L.Vega-Montoto，P.A.Rudnick，A.M.Variyath，A.J.L.Ham，D.M.Bunk，L.E.Kilpatrick，D.D.Billheimer，R.K.Blackman，H.L.Cardasis，S.A.Carr，
K.R.Clauser，J.D.Jaffe，K.A.Kowalski，T.A.Neubert，F.E.Regnier，B.Schilling，
T.J.Tegeler，M.Wang，P.Wang，J.R.Whiteaker，L.J.Zimmerman，S.J.Fisher，B.W.Gibson，
C.R.Kinsinger，M.Mesri，H.Rodriguez，S.E.Stein，P.Tempst，A.G.Paulovich，
D.C.Liebler，and C.Spiegelman，Repeatability and Reproducibility in Proteomic
Identifications by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.Journal of
Proteome Research，2010.9(2)：p.761-776.
K.R.Clauser，J.D.Jaffe，K.A.Kowalski，T.A.Neubert，F.E.Regnier，B.Schilling，
T.J.Tegeler，M.Wang，P.Wang，J.R.Whiteaker，L.J.Zimmerman，S.J.Fisher，B.W.Gibson，
C.R.Kinsinger，M.Mesri，H.Rodriguez，S.E.Stein，P.Tempst，A.G.Paulovich，
D.C.Liebler，and C.Spiegelman，Repeatability and Reproducibility in Proteomic
Identifications by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.Journal of
Proteome Research，2010.9(2)：p.761-776.
[0408] 6.J.V.Olsen，M.Vermeulen，A.Santamaria，C.Kumar，M.L.Miller，L.J.Jensen，F.Gnad，J.Cox，T.S.Jensen，E.A.Nigg，S.Brunak，and M.Mann，Quantitative
Phosphoproteomics Reveals Widespread Full Phosphorylation Site Occupancy
During Mitosis.Science Signaling，2010.3(104).
Phosphoproteomics Reveals Widespread Full Phosphorylation Site Occupancy
During Mitosis.Science Signaling，2010.3(104).
[0409] 7.A.Moritz，Y.Li，A.L.Guo，J.Villen，Y.Wang，J.MacNeill，J.Kornhauser，K.Sprott，J.Zhou，A.Possemato，J.M.Ren，P.Hornbeck，L.C.Cantley，S.P.Gygi，J.Rush，
and M.J.Comb，Akt-RSK-S6 Kinase Signaling Networks Activated by Oncogenic
Receptor Tyrosine Kinases.Science Signaling，2010.3(136).
and M.J.Comb，Akt-RSK-S6 Kinase Signaling Networks Activated by Oncogenic
Receptor Tyrosine Kinases.Science Signaling，2010.3(136).
[0410] 8.F.S.Oppermann，F.Gnad，J.V.Olsen，R.Hornberger，Z.Greff，G.Keri，M.Mann，and H.Daub，Large-scale Proteomics Analysis of the Human Kinome.Molecular&
Cellular Proteomics，2009.8(7)：p.1751-1764.
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[0411] 9.J.R.Wisniewski，A.Zougman，N.Nagaraj，and M.Mann，Universal sample preparation method for proteome analysis.Nature Methods，2009.6(5)：p.359-U60.
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+.
+.
[0413] 11.M.Ashburner，C.A.Ball，J.A.Blake，D.Botstein，H.Butler，J.M.Cherry，A.P.Davis，K.Dolinski，S.S.Dwight，J.T.Eppig，M.A.Harris，D.P.Hill，L.Issel-Tarver，
A.Kasarskis，S.Lewis，J.C.Matese，J.E.Richardson，M.Ringwald，G.M.Rubin，
G.Sherlock，and C.Gene Ontology，Gene Ontology：tool for the unification of
biology.Nature Genetics，2000.25(1)：p.25-29.
A.Kasarskis，S.Lewis，J.C.Matese，J.E.Richardson，M.Ringwald，G.M.Rubin，
G.Sherlock，and C.Gene Ontology，Gene Ontology：tool for the unification of
biology.Nature Genetics，2000.25(1)：p.25-29.
[0414] 关于通过引用和变更纳入的声明
[0415] 本申请通篇中所有参考文献，例如专利文件包括公布的或授权的专利或对等物、专利申请公开文本和非专利文献文件或其他来源材料，在此通过引用的方式全文纳入本
文，如同单独地以引用的形式纳入本文，只要每篇参考文献至少部分与本申请的公开内容
一致(例如，部分相悖的参考文献除去所述参考文献的部分相悖的部分，以引用的方式纳入
本文)。
文，如同单独地以引用的形式纳入本文，只要每篇参考文献至少部分与本申请的公开内容
一致(例如，部分相悖的参考文献除去所述参考文献的部分相悖的部分，以引用的方式纳入
本文)。
[0416] 本文所使用的术语和表达被用作描述性而非限制性术语，在该术语和表达的使用中不意欲排除所示出的或所描述的所述特征的任何对等物或其部分，但是应了解在本发明
要求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应当了解，尽管已经通过优选实施方案、示例
性实施方案和任选的特征具体地公开本发明，但是本领域技术人员可对本文公开的概念进
行修改和变化，并且所述修饰和变化被认为在所附权利要求限定的本发明范围内。本文提
供的具体实施方案是可用的本发明的实施方案的实例，对本领域技术人员来说显而易见的
是，使用本说明书中所述的设备、设备组件、方法步骤的多种变化来实施本发明。对本领域
技术人员来说显而易见的是，可用于本发明的方法和设备可包括许多任选的组成、加工元
素和步骤。
要求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应当了解，尽管已经通过优选实施方案、示例
性实施方案和任选的特征具体地公开本发明，但是本领域技术人员可对本文公开的概念进
行修改和变化，并且所述修饰和变化被认为在所附权利要求限定的本发明范围内。本文提
供的具体实施方案是可用的本发明的实施方案的实例，对本领域技术人员来说显而易见的
是，使用本说明书中所述的设备、设备组件、方法步骤的多种变化来实施本发明。对本领域
技术人员来说显而易见的是，可用于本发明的方法和设备可包括许多任选的组成、加工元
素和步骤。
[0417] 当本文公开一组取代基时，应当理解为分别公开了所述组和所有亚组中的全部个体成员，包括该组成员的任何异构体、对映异构体和非对映异构体。当本文使用马库什群组
或其他组时，本公开内容意欲分别包括该组的全部个体成员，以及该组的全部可能组合和
亚组合。当本文描述化合物时，并未在例如结构式或化学名称中具体说明该化合物的特定
异构体、对映异构体或非对映异构体，该描述意欲包括单独地或以任何组合方式描述的所
述化合物的每种异构体和对映异构体。此外，除非另有说明，本公开内容意欲包括本文公开
的化合物的全部同位素变体。例如，应理解在所公开的分子中的任何一个或多个氢可被氘
或氚取代。在用于分子的测定中和与所述分子或其用途相关的化学和生物学研究中，所述
分子的同位素变体通常被用作标准物。制备所述同位素变体的方法在本领域中是已知的。
化合物的具体名称意在是示例性的，因为已知本领域技术人员能够对相同化合物进行不同
的命名。
或其他组时，本公开内容意欲分别包括该组的全部个体成员，以及该组的全部可能组合和
亚组合。当本文描述化合物时，并未在例如结构式或化学名称中具体说明该化合物的特定
异构体、对映异构体或非对映异构体，该描述意欲包括单独地或以任何组合方式描述的所
述化合物的每种异构体和对映异构体。此外，除非另有说明，本公开内容意欲包括本文公开
的化合物的全部同位素变体。例如，应理解在所公开的分子中的任何一个或多个氢可被氘
或氚取代。在用于分子的测定中和与所述分子或其用途相关的化学和生物学研究中，所述
分子的同位素变体通常被用作标准物。制备所述同位素变体的方法在本领域中是已知的。
化合物的具体名称意在是示例性的，因为已知本领域技术人员能够对相同化合物进行不同
的命名。
[0418] 本文公开的许多分子包含一个或多个可电离基团(可从其去除质子的基团(例如-COOH)或增加质子的基团(例如胺)，或者是能够被季铵化的基团(例如胺))。本公开内容意
欲分别包括所述分子及其盐的所有可能的离子形式。关于本文中化合物的盐，本领域技术
人员能够从多种可获得的平衡离子中选择，所述平衡离子适用于为给定的应用制备本发明
的盐。在具体应用中，选择用于制备盐的给定阴离子或阳离子能使该盐的溶解度增加或降
低。
欲分别包括所述分子及其盐的所有可能的离子形式。关于本文中化合物的盐，本领域技术
人员能够从多种可获得的平衡离子中选择，所述平衡离子适用于为给定的应用制备本发明
的盐。在具体应用中，选择用于制备盐的给定阴离子或阳离子能使该盐的溶解度增加或降
低。
[0419] 除非另有说明，本文所述或举例说明的每个公式或成分的组合可被用于实施本发明。
[0420] 当说明书中给定范围时，例如温度范围、时间范围或者组成或浓度范围，本公开内容意欲包括所有中间范围和亚范围，以及给定范围中包括的所有单个数值。应了解，本说明
书包括的范围或亚范围中的任何亚范围或单个数值可被排除于本文权利要求之外。
书包括的范围或亚范围中的任何亚范围或单个数值可被排除于本文权利要求之外。
[0421] 本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域技术人员的水平。本文引用的参考文献以引用的形式全文纳入本文，以说明截至其公开日或申请日的技术状态，
并且如果需要，意在能够使用此信息来排除现有技术中的具体实施方案。例如，当要求保护
物质的组成时，应当理解为，本文要求保护的物质的组成不意欲包括早于申请人的发明的
现有技术中已知且可获得的化合物，包括本文引用的参考文献中提供的可能公开内容中的
化合物。
并且如果需要，意在能够使用此信息来排除现有技术中的具体实施方案。例如，当要求保护
物质的组成时，应当理解为，本文要求保护的物质的组成不意欲包括早于申请人的发明的
现有技术中已知且可获得的化合物，包括本文引用的参考文献中提供的可能公开内容中的
化合物。
[0422] 本文所使用的“包括”是“包含”、“含有”或“其特征在于”的同义词，并且是包含性的或开放式的，不排除其他未列举的要素或方法步骤。本文所使用的“由……组成”排除要求保护的要素中未具体说明的任何要素、步骤或成分。本文所使用的“基本上由……组成”
不排除未实质上影响权利要求的基本特征和新特征的材料或步骤。在本文的每个实例中，
术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中任何一个可被其他两个术语之一取
代。当不存在本文未具体公开的任何要素和限制时，可以适当方式实施本文说明性描述的
发明。
不排除未实质上影响权利要求的基本特征和新特征的材料或步骤。在本文的每个实例中，
术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中任何一个可被其他两个术语之一取
代。当不存在本文未具体公开的任何要素和限制时，可以适当方式实施本文说明性描述的
发明。
[0423] 必须注意的是，本文和所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文中另有明确指示。因此，例如，提到“一个细胞”包括多个所述
细胞，以及本领域技术人员已知的其对等物等。同样，在本文中，术语“一”、“一个或多个”和“至少一个”也能够互换使用。还需注意的是，术语“包括”、“包含”和“具有”能够互换使用。
表述“权利要求XX-YY中任一项的”(其中XX和YY指权利要求编号)意欲以另一种形式提供多
项从属权利要求，在一些实施方案中可与表述“如权利要求XX-YY中任一项所述的”互换。
细胞，以及本领域技术人员已知的其对等物等。同样，在本文中，术语“一”、“一个或多个”和“至少一个”也能够互换使用。还需注意的是，术语“包括”、“包含”和“具有”能够互换使用。
表述“权利要求XX-YY中任一项的”(其中XX和YY指权利要求编号)意欲以另一种形式提供多
项从属权利要求，在一些实施方案中可与表述“如权利要求XX-YY中任一项所述的”互换。
[0424] 本领域普通技术人员要意识到，不需要进行过多的实验即可在本发明的实施过程中使用本文未具体举例说明的起始材料、生物材料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、
测定方法和生物方法。本发明意欲包括任何所述材料和方法的所有本领域已知的功能对等
物。所使用的术语和表达被用作描述性而非限制性术语，在所述术语和表达的使用中不意
欲排除任何所示出且描述的特征的对等物或其部分，但应注意在本发明要求保护的范围内
可以进行各种修改。因此，应当了解，尽管本发明已通过优选实施方案和任选的特征具体地
公开，但是本领域技术人员可对本文所公开的内容进行修改和变化，并且所述修改和变化
被认为在所附权利要求限定的本发明范围内。
测定方法和生物方法。本发明意欲包括任何所述材料和方法的所有本领域已知的功能对等
物。所使用的术语和表达被用作描述性而非限制性术语，在所述术语和表达的使用中不意
欲排除任何所示出且描述的特征的对等物或其部分，但应注意在本发明要求保护的范围内
可以进行各种修改。因此，应当了解，尽管本发明已通过优选实施方案和任选的特征具体地
公开，但是本领域技术人员可对本文所公开的内容进行修改和变化，并且所述修改和变化
被认为在所附权利要求限定的本发明范围内。
[0425] 表4b
[0426] 表4b.
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[0429]
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| 多电极离子阱 | 2020-05-13 | 344 |
| 多电极离子阱 | 2020-05-13 | 624 |
| 高产出的四极离子阱 | 2020-05-16 | 950 |
| 圆环离子阱及圆环离子阱阵列 | 2020-05-15 | 428 |
| 一种串联离子阱 | 2020-05-14 | 788 |
| 离子阱 | 2020-05-11 | 1268 |
| 离子阱质谱仪 | 2020-05-14 | 182 |
| 离子阱和质量分析设备 | 2020-05-16 | 293 |
| 一种双重离子阱质谱仪 | 2020-05-17 | 674 |
| 离子阱用基座、离子阱 | 2020-05-15 | 391 |
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