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用于光学相干 断层扫描和双 光子 荧光成像的设备和方法

阅读：3发布：2021-10-17

专利汇可以提供用于光学相干断层扫描和双光子荧光成像的设备和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开的示例性实施例包括组合的基于导管的光学相干断层扫描-双光子荧光 (OCT-TPL)成像系统。示例性实施例还包括用于以高空间分辨率检测并且进一步表征体内的薄帽纤维粥样斑块中的细胞成分(例如，巨噬细胞、胶原纤维/弹性蛋白纤维、脂滴)的分布的方法。，下面是用于光学相干断层扫描和双光子荧光成像的设备和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种设备，包括：
光学相干断层扫描光源，所述光学相干断层扫描光源被配置成发射第一波长；
分束器，所述分束器被配置成将从所述相干断层扫描光源发射的第一波长引导至参考路径和样品路径；
短脉冲光源，所述短脉冲光源被配置成发射第二波长；
第一二向色元件；以及
第二二向色元件。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光学相干断层扫描光源被配置成扫频源光学相干断层扫描光源。
3.根据权利要求1所述的设备，其中，所述光学相干断层扫描光源被配置成宽带光学相干断层扫描光源。
4.根据权利要求1所述的设备，其中，所述样品路径通过光子晶体光纤来引导。
5.根据权利要求1所述的设备，还包括平衡式检测器。
6.根据权利要求5所述的设备，其中，所述平衡式检测器被配置成使非干涉的OCT分量最小化。
7.根据权利要求1所述的设备，还包括光子计数检测器。
8.根据权利要求7所述的设备，其中，所述光子计数检测器是光电倍增管。
9.根据权利要求7所述的设备，其中，所述光子计数检测器是雪崩光电二极管。
10.根据权利要求7所述的设备，其中，所述光子计数检测器被配置成检测双光子荧光。
11.根据权利要求1所述的设备，其中，所述第二二向色元件被配置成将双光子荧光朝向光子计数检测器引导。
12.根据权利要求1所述的设备，其中，所述第一二向色元件被配置成将所述第一波长和所述第二波长引导至所述样品路径。
13.根据权利要求1所述的设备，其中，所述样品路径被引导至包括纳米粒子的样品位置。
14.根据权利要求1所述的设备，还包括被配置成对所述样品位置的图像进行显示的可视显示器。
15.根据权利要求14所述的设备，其中，所述可视显示器被配置成基于所述设备与所述样品位置之间的距离来增强对所述样品位置的显示的一部分。
16.根据权利要求15所述的设备，其中，所述可视显示器被配置成提高所述样品位置的其中所检测的值超出归一化值的地点的亮度。
17.根据权利要求13所述的设备，其中，所述纳米粒子被配置成纳米棒。
18.根据权利要求17所述的设备，其中，所述纳米棒包括金并且所述纳米棒的表面等离子体共振为约756nm。
19.根据权利要求1所述的设备，还包括色散补偿元件。
20.根据权利要求19所述的设备，其中，所述色散补偿元件被配置成补偿所述参考路径与所述样品路径之间的色散差异。
21.根据权利要求19所述的设备，其中，所述色散补偿元件被配置成预补偿双光子荧光激发光。
22.一种对样品位置进行成像的方法，所述方法包括：
朝向样品位置发射来自光学相干断层扫描光源的第一波长；
朝向所述样品位置发射来自短脉冲光源的第二波长；
检测来自所述样品位置的光学相干断层扫描信号，其中，所述光学相干断层扫描信号根据所述第一波长而生成；以及
检测来自所述样品位置的双光子荧光发射信号，其中，所述双光子荧光发射信号由所述第二波长引起。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，检测来自多个样品位置的所述光学相干断层扫描信号和所述双光子荧光信号。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述样品包括组织。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述组织是上皮组织。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述组织是动脉组织。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述动脉组织位于冠状动脉中。
28.根据权利要求24所述的方法，其中，所述组织是血管腔表面。
29.根据权利要求24所述的方法，其中，所述组织是口腔黏膜。
30.根据权利要求22所述的方法，其中，所述光学相干断层扫描信号用于生成光学相干断层扫描断层照片。
31.根据权利要求22所述的方法，其中，所述双光子荧光信号与光学相干断层扫描断层照片相互配准。
32.根据权利要求22所述的方法，还包括：将二维双光子荧光数据显示在三维光学相干断层扫描断层照片上。
33.根据权利要求22所述的方法，其中，第一处理元件使用所述光学相干断层扫描信号并且构建光学相干断层扫描断层照片。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述第一处理元件是中央处理单元或图形处理单元。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，第二处理元件渲染以在光学相干断层扫描断层照片上查看相互配准的双光子荧光图像。
36.根据权利要求22所述的方法，其中，所述样品位置包括纳米粒子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述双光子荧光信号从所述纳米粒子发射。
38.根据权利要求22所述的方法，其中，所述双光子荧光发射信号从所述样品位置的组织发射。
39.一种用于对成像数据进行显示的方法，所述方法包括：
使用成像系统获得光学相干断层扫描数据；
使用所述成像系统从多个发荧光的粒子获得双光子荧光数据；以及
在组合图像中同时显示所述光学相干断层扫描数据和所述双光子荧光数据。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述发荧光的粒子是纳米粒子。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述成像系统是基于导管的成像系统。
42.根据权利要求41所述的方法，还包括：当所述基于导管的成像系统沿着管腔轴向地移动时，基于从所述基于导管的成像系统获得的数据来生成三维图像。
43.根据权利要求39所述的方法，其中：
所述光学相干断层扫描数据包括径向维度数据和方位维度数据；以及所述双光子荧光数据包括方位信号。
44.根据权利要求43所述的方法，还包括：将径向维度添加至所述双光子荧光数据。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，将径向维度添加至所述双光子荧光数据包括：
使用被所述双光子荧光方位信号归一化的径向概率分布函数。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述径向概率分布函数使用下述来确定：
所述成像系统的光学性质；
所述基于导管的成像系统与其中插入有所述基于导管的成像系统的管腔壁之间的距离；以及
所述管腔壁的组织的光学性质。
47.根据权利要求45所述的方法，其中，所述径向概率分布函数使用假设纳米粒子为均匀分布来确定。
48.根据权利要求41所述的方法，还包括：当所述基于导管的成像系统沿着管腔轴向地移动时，基于从所述基于导管的成像系统获得的数据来生成三维图像。

说明书全文

用于光学相干断层扫描和双 光子 荧光成像的设备和方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列号61/785,030的优先权，其内容通过引用合并至本文。

背景技术

[0003] 导致心肌梗塞的动脉粥样硬化和斑块破裂仍然是全世界造成死亡的首要原因[1]。炎症以及潜在的细胞和分子机制[2-4]使动脉粥样硬化从开始发展到斑块破裂以及最终的血栓形成。最近由Virmani[5]定义为“薄帽纤维粥样斑块”的易损斑块是由炎症引起的并且被表征为：与稳定斑块相比，通常具有厚度小于65μm的薄纤维帽，增大的巨噬细胞的浸润和减少的平滑肌细胞以及增大的脂质核心尺寸[6-8]。

[0004] 现在理解了导致薄帽纤维粥样斑块破裂的若干细胞和分子事件并且利用若干细胞和分子事件来开发新型成像方法。在薄帽纤维粥样斑块中的巨噬细胞的积累过表达基质金属蛋白酶(MMP)[9-12]，该基质金属蛋白酶被认为是促成薄帽纤维粥样斑块的易损性并且增大促凝性[13-15]。巨噬细胞是指示在冠状动脉、脑、和末梢循环中的斑块破裂的风险的重要的早期细胞标志物。由于斑块易损性与细胞成分和解剖结构相关，因此理想的是开发一种可以同时揭示成分和结构两者的诊断方法以在响应于心血管介入的纵向研究中识别易损斑块并且使得在体内能够监测巨噬细胞密度。

[0005] 血管内的OCT(IVOCT)是最近开发的用于高分辨率血管内成像的基于导管的方法。在心血管成像方式中，IVOCT是为对薄帽纤维粥样斑块进行成像提供足够的空间分辨率的唯一方法。

[0006] 然而，不能仅通过IVOCT图像容易地评估斑块破裂的风险。双光子荧光(TPL)显微镜使用组织的非线性光学性质并且已用于基于斑块成分内生的自发荧光对斑块成分例如内皮细胞、平滑肌细胞[16]、弹性纤维[17，18]、氧化LDL[19]和脂滴[20]进行成像。最近，已经报道了装载有纳米粒子的巨噬细胞可以由TPL显微镜来检测[21，22]。已经报道了基于光纤的OCT[23，24]和TPL显微镜[25-28]分别使用光子晶体光纤来传输用于实现更高的空间分辨率的宽带光或者传输用于使系统尺寸最小化的超短脉冲。然而，先前尚未实现组合的基于光纤的OCT-TPL系统。发明内容

[0007] 本公开的示例性实施例包括组合的基于导管的光学相干断层扫描-双光子荧光(OCT-TPL)成像系统，该组合的基于导管的光学相干断层扫描-双光子荧光(OCT-TPL)成像系统用于以高空间分辨率检测并且进一步表征体内的薄帽纤维粥样斑块中的细胞成分(例如，巨噬细胞、胶原纤维/弹性蛋白纤维、脂滴)的分布。基于导管的OCT-TPL系统的部件可以包括用于OCT的光源(例如，1310nm)和用于TPL的光源(例如，800nm)、用于OCT的检测器(例如，平衡式检测器)和用于TPL的检测器(例如，光电倍增管)、补偿TPL激发脉冲的群延迟色散的传输光栅压缩器、传递来自OCT光源和TPL光源两者的光以及传输TPL发射信号的光纤(例如，光子晶体光纤)以及成像导管。本公开的实施例描述了用于以需要同时传递短脉冲激光和宽带OCT光的基于导管的模式来成像以及进行相关诊断和治疗的方法和设备。

[0008] 某些实施例包括一种设备，该设备包括：光学相干断层扫描光源，该光学相干断层扫描光源被配置成发射第一波长；分束器，该分束器被配置成将从光学相干断层扫描光源发射的第一波长引导至参考路径和样品路径；短脉冲光源，该短脉冲光源被配置成发射第二波长；第一二向色元件；以及第二二向色元件。在特定实施例中，光学相干断层扫描光源可以被配置成扫频源光学相干断层扫描光源。在某些实施例中，光学相干断层扫描光源可以被配置成宽带光学相干断层扫描光源。在一些实施例中，短脉冲光源可以是脉冲能量在10pJ至1mJ之间并且脉冲持续时间在5fs至100ps之间的短脉冲激光。在特定实施例中，样品路径可以通过光子晶体光纤来引导。某些实施例可以包括平衡式检测器，以及在特定实施例中，平衡式检测器被配置成使非干涉的OCT分量最小化。

[0009] 特定实施例可以包括光子计数检测器，以及在某些实施例中，光子计数检测器可以是光电倍增管。在特定实施例中，光子计数检测器可以是雪崩光电二极管。在一些实施例中，光子计数检测器可以被配置成检测双光子荧光。在某些实施例中，第二二向色元件可以被配置成将双光子荧光朝向光子计数检测器引导。在特定实施例中，第一二向色元件可以被配置成将第一波长和第二波长引导至样品路径。在某些实施例中，样品路径可以被引导至包括纳米粒子的样品位置。

[0010] 特定实施例还可以包括被配置成对样品位置的图像进行显示的可视显示器。在某些实施例中，可视显示器可以被配置成基于设备与样品位置之间的距离来增强对样品位置的显示的一部分。在一些实施例中，可视显示器可以被配置成提高样品位置的其中所检测的值超出归一化值的地点的亮度。在特定实施例中，纳米粒子可以被配置成纳米棒。在某些实施例中，纳米棒包括金并且纳米棒的表面等离子体共振为约756nm。特定实施例还可以包括色散补偿元件，以及在一些实施例中，色散补偿元件被配置成补偿参考路径与样品路径之间的色散差异。在某些实施例中，色散补偿元件被配置成预补偿双光子荧光激发光。

[0011] 特定实施例还可以包括对样品位置进行成像的方法，其中，该方法包括：朝向样品位置发射来自光学相干断层扫描光源的第一波长；朝向样品位置发射来自短脉冲光源的第二波长；检测来自样品位置的光学相干断层扫描信号，其中，光学相干断层扫描信号根据第一波长而生成；以及检测来自样品位置的双光子荧光发射信号，其中，双光子荧光发射信号由第二波长引起。在某些实施例中，短脉冲光源可以是脉冲能量在10pJ至1mJ之间并且脉冲持续时间在5fs至100ps之间的短脉冲激光。

[0012] 在一些实施例中，检测来自多个样品位置的光学相干断层扫描信号和双光子荧光信号。在特定实施例中，样品包括组织，以及在特定实施例中，组织可以是上皮组织或动脉组织。在某些实施例中，动脉组织可以位于冠状动脉中。在特定实施例中，组织可以是血管腔表面。在特定实施例中，组织可以是口腔黏膜。在一些实施例中，光学相干断层扫描信号可以用于生成光学相干断层扫描断层照片。在特定实施例中，双光子荧光信号可以与光学相干断层扫描断层照片相互配准。某些实施例还可以包括将二维双光子荧光数据显示在三维光学相干断层扫描断层照片上。在一些实施例中，第一处理元件可以使用光学相干断层扫描信号并且构建光学相干断层扫描断层照片。

[0013] 在一些实施例中，第一处理元件可以是中央处理单元或图形处理单元。在特定实施例中，第二处理元件渲染以在光学相干断层扫描断层照片上查看相互配准的双光子荧光图像。在某些实施例中，样品位置可以包括纳米粒子。在特定实施例中，双光子荧光信号可以从纳米粒子发射。在特定实施例中，双光子荧光发射信号可以从样品位置的组织发射。

[0014] 某些实施例包括一种用于对成像数据进行显示的方法，其中，该方法包括：使用成像系统获得光学相干断层扫描数据；使用成像系统从多个发荧光的粒子获得双光子荧光数据；在组合图像中同时显示光学相干断层扫描数据和双光子荧光数据。在一些实施例中，发荧光的粒子可以是纳米粒子。在特定实施例中，成像系统可以是基于导管的成像系统。

[0015] 在某些实施例中，光学相干断层扫描数据可以包括径向维度数据和方位维度数据；以及双光子荧光数据可以包括方位信号。特定实施例还可以包括将径向维度添加至双光子荧光数据。在某些实施例中，将径向维度添加至双光子荧光数据可以包括：使用被双光子荧光方位信号归一化的径向概率分布函数。在特定实施例中，径向概率分布函数可以使用下述来确定：成像系统的光学性质；基于导管的成像系统与其中插入有基于导管的成像系统的管腔壁之间的距离；以及管腔壁的组织的光学性质。

[0016] 在特定实施例中，径向概率分布函数可以使用假设纳米粒子为均匀分布来确定。某些实施例还可以包括：当基于导管的成像系统沿着管腔轴向地移动时，基于从基于导管的成像系统获得的数据来生成三维图像。

[0017] 在下文中，术语“耦合(coupled)”被定义为连接，然而不一定直接地连接，以及不一定机械地连接。

[0018] 在权利要求和/或说明书中，当结合用语“包括”使用时量词“一(a)”或“一(an)”的使用可以表示“一个”，但是其还与“一个或更多个”或“至少一个”的意思一致。一般地，用语“约”是指所陈述的值加上或减去5％。虽然本公开支持仅指可替选的以及“和/或”的限定，但是除非明确地指出仅指可替选地或者可替选的是相互排斥的，否则在权利要求中的用语“或”的使用用于表示“和/或”。

[0019] 用语“包括(comprise)”(以及任何形式的包括，例如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”)、“具有”(以及任何形式的具有，例如“具有(has)”和“具有(having)”)、“包括(include)”(以及任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(including)”)以及“包含”(以及任何形式的包含，例如“包含(contains)”和“包含(containing)”是开放式连系动词。因此，“包括(comprises)”、“具有(has)”、“包括(includes)”或“包含(contains)”一个或更多个步骤或元素的方法和设备拥有这些一个或更多个步骤和元素，但是不限于仅拥有这些一个或更多个元素。同样的，“包括(comprises)”、“具有(has)”、“包括(includes)”或“包含(contains)”一个或更多个特征的方法的步骤或设备的元素拥有这些一个或更多个特征，但是不限于仅拥有这些一个或更多个特征。此外，以某种方式配置的设备或结构以至少所述方式被配置，但是还可以以未列出的方式被配置。

[0020] 根据下文的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解的是，当指示本发明的特定实施例时仅以说明的方式给出详细描述和特定示例，因此根据下文的详细描述，对本领域的普通技术人员来说，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改是明显的。附图说明

[0021] 本专利文件或申请文件包含至少一个用彩色绘制的附图。在请求并且支付必要费用的情况下将由官方提供本专利或专利申请公开的具有一个或多个彩色附图的副本。

[0022] 下述附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本公开的某些方面。可以通过参照这些附图中的一个附图，结合对本文所呈现的特定实施例的详细描述来更好地理解本发明。

[0023] 图1示出了根据示例性实施例的设备的示意图。

[0024] 图2示出了从IV-OCT系统中获得的图像。

[0025] 图3示出了从IV-OCT系统中获得的图像。

[0026] 图4示出了从根据示例性实施例的设备中获得的图像。

[0027] 图5A和图5B示出了根据示例性实施例的设备的示意图。

[0028] 图6示出了根据示例性实施例的设备的示意图。

[0029] 图7示出了根据示例性实施例的设备的示意图。

[0030] 图8示出了根据示例性实施例的设备的示意图。

[0031] 图9示出了从根据示例性实施例的设备中获得的图像。

[0032] 图10示出了根据示例性实施例的设备的示意图。

[0033] 图11示出了从根据示例性实施例的设备中获得的数据。

[0034] 图12示出了从根据示例性实施例的设备中获得的数据。

[0035] 图13示出了从根据示例性实施例的设备中获得的数据。

[0036] 图14示出了从根据示例性实施例的设备中获得的数据。

[0037] 图15示出了根据示例性实施例的由计算机可读介质执行的修改对数据结果的显示的步骤的流程图。

[0038] 图16示出了从根据示例性实施例的设备中获得的图像和数据。

[0039] 图17至图20从根据示例性实施例的设备中获得的图像。

具体实施方式

[0040] 现在参照图1，设备50的一个示例性实施例包括：光学相干断层扫描光源100、分束器200、双光子荧光激发光源300、第一二向色元件400以及第二二向色元件450。在该实施例中，光学相干断层扫描光源100被配置成发射第一波长110以及分束器200被配置成将第一波长110引导至参考路径210和样品路径220。在某些实施例中，光学相干断层扫描光源100可以被配置成扫频源光学相干断层扫描光源或宽带光学相干断层扫描光源。在特定实施例中，样品路径220可以通过光子晶体光纤来引导。在示出的实施例中，双光子荧光激发光源300被配置成发射第二波长320。

[0041] 在操作期间，设备50可以被定位成使得样品路径220和第二波长320被引导至样品位置280(例如，在图1中经由第一二向色元件400以及其他部件)。

[0042] 在某些示例性实施例中，样品位置280可以包括纳米粒子260以及在特定实施例中，纳米粒子260可以被配置成纳米棒。在特定实施例中，纳米粒子260可以被配置成纳米棒，该纳米棒包括表面等离子体共振为约756nm的金。在某些实施例中，纳米棒的结构可以根据在下文提供的示例章节4中建立的过程来选择。

[0043] 设备50还包括被配置成检测双光子荧光(TPL)的光子计数检测器350以及被配置成使非干涉的OCT分量最小化的平衡式检测器250。在特定实施例中，光子计数检测器350可以被配置成一个或更多个光电倍增管(PMT)。在其他实施例中，光子计数检测器350可以被配置成雪崩光电二极管。

[0044] 在特定实施例中，图1中示出的系统的部件可以被并入基于导管的系统中，该基于导管的系统利用光子晶体光纤(PCF)以使样品路径220中的光能够传播到样品位置280并且使第二波长320能够从TPL激发光源300传播到样品位置280。PCF使得OCT和TPL激发光两者能够单模传输。在OCT成像中，需要单模传输以确保不会发生模式干涉。对于TPL成像而言，需要单模传输以确保TPL激发光的脉冲持续时间不会由于模态色散而变宽。在特定实施例中，可以将导管插入血管中以利用系统50获得血管内的图像。

[0045] 在操作期间，系统50在单个系统中提供了OCT成像技术和TPL成像技术两者的益处。在示例性实施例中，系统50的部件根据在OCT和TPL领域中的既定原则来起作用。因此，虽然将提供单个OCT和TPL的概述，但是要理解，示例性实施例可以根据环境条件或其他因素来利用参数的各种组合。例如，OCT光源100可以产生近红外光，并且使用相对较长波长的光使得能够更深地穿透进入散射介质例如动脉壁。在特定实施例中，OCT光源100可以被配置成提供波长为约1310nm的光。

[0046] 当样品路径220中的光被引导至样品位置280处时，采集所述光的从样品位置280的子表面特征反射的一小部分。在操作期间，在样品路径220中的相当大的一部分光未被反射，而是从样品反向散射。虽然反向散射光提供用于模糊常规成像中的图像的背景，但是所述光可以经由干涉法在OCT系统中被有益地使用。例如，平衡式检测器250可以用于记录所接收到的光子的光程，使得能够舍弃在检测之前在组织中多次散射的大多数光子。这可以使得能够通过舍弃背景信号来记录要被构建的厚的样品的三维图像同时采集从样品位置280中的关注区域直接反射的光。在示例性实施例中，OCT成像一般限于在样品位置280中的生物组织中的表面以下一到两毫米。在较深的深度处，光的逃逸而不是散射的比例对于检测而言通常太小了。

[0047] 在系统50的操作期间，还可以符合双光子荧光显微镜中的既定原则来使用TPL光源300和光子计数检测器350。在某些实施例中，TPL光源300可以被配置成可调谐飞秒激光器，该可调谐飞秒激光器产生第二波长320的在760nm-1040nm处的具有6nJ-5μJ的最大脉冲能量、100fs-1ps的脉冲宽度以及500kHz-80MHz的重复频率的激发能量。在特定实施例中，TPL光源300还可以被配置成产生以下光斑：光斑尺寸为10μm-30μm，光2 2
斑面积为约78μm-706.8μm以及像素驻留时间为20μs。此外，TPL光源300还可以被配置成产生10-1600个脉冲每像素，以及样品上的平均功率为500mW-2500mW，瞬时功率为
2 2
0.0625MW-5MW和瞬时功率密度为2E-4MW/μm-16E-3MW/μm。

[0048] 在图1中所示的实施例中，第一二向色元件400可以被定位成经由光子晶体光纤(PCF)将第二波长320引导至样品位置280。在特定实施例中，PCF可以具有大尺寸模场直径(20μm)(LMA-20)，其可购自NKT Photonics。在某些实施例中，PCF可以被配置成双包层光纤，以及在特定实施例中，PCF可以是双包层高NA光纤例如购自Crystal Fibre的型号DC-165-16-Passive Fiber。示例性双包层光子晶体光纤可以包括嵌入在高NA多模光纤结构中的大模场面积、单模纤芯。这样的光纤可以使单模光束在光纤中能够向前传播并且同时散射光或双光子荧光可以被采集并且向后传播用于检测。使用双包层光纤而不是单包层光子晶体光纤可以使用高NA内包层(相比于低NA纤芯)提高双光子荧光检测效率。要理解，部件的特定规格仅为了举例，而其他实施例可以包括具有不同于本文所描述的部件规格的部件。

[0049] 在系统50的操作期间，第二波长320可以将激发能量提供给纳米粒子260，该纳米粒子260可以发射荧光270，该荧光270经由第二二向色元件450被引导至光子计数检测器350。在示例性实施例中，来自光子计数检测器350的输出和平衡式检测器250的输出可以被配置成组合在单个显示器中，这使用户能够可视化OCT和TPL两者成像交叠的结果。

[0050] 对血管内OCT和TPL图像的显示提出一定的挑战：可以以对提供有用数据的方式进行快速地说明的方式将信息呈现给用户。例如，血管内OCT是二维(径向和方位)的而在一些实施例中TPL信息是一维(方位)的。TPL方位信息的作为在二维IV-OCT图像内部或外部的环或带的一维显示还被评估作为呈现组合的IV-OCT和TPL图像信息的方式。

[0051] 用于显示组合的IV-OCT和TPL的示例性实施例包括使用径向概率分布函数[P(r)]将径向维度并入TPL数据，该径向概率分布函数[P(r)]被其位置处的TPL方位信号归一化。径向概率分布函数[P(r)]可以根据(部分)下述来确定：(1)导管的光学元件；(2)导管与管腔壁之间的距离；(3)组织的光学性质。可以将该信息进行组合以假设纳米粒子260为均匀分布预测TPL信号的径向相关性[p(r)]。

[0052] 使用包括方位相关性和径向相关性两者的TPL信息，可以融合TPL图像和IV-OCT图像以在一个图像数据集中显示两个信息集。此外，对于整个拉回可以遵循相同的过程使得三维IV-OCT和TPL数据集可以融合成单个图像数据集。

[0053] 现在参照图2，IV-OCT图像500是使用被配置成产生典型的IV-OCT图像的导管510产生的且没有组合的TPL数据。如图2所示，图像500示出了具有基本均匀的壁的健康冠状动脉520。在图2的下部示出了动脉520的侧截面图530。侧截面图530是在拉回导管510期间沿着线560截取的动脉520的重构图。

[0054] 现在参照图3，IV-OCT图像600是使用被配置成产生典型的IV-OCT图像的导管610产生的，也没有组合的TPL数据。如图3所示，图像600示出了具有在大约1:00点钟至
3:00点钟位置处覆盖有大量脂质核心的薄帽纤维粥样斑块640的冠状动脉620。在图3的下部示出了动脉620的侧截面图630。侧截面图630是在拉回导管610期间沿着线660截取的动脉620的重构图。

[0055] 虽然图像600示出了薄帽纤维粥样斑块640，但是根据所提供的图像不能容易地评估斑块破裂的风险。图像600提供了解剖结构的视图，但是不允许用户评估细胞成分。例如，图像600不直接提供对可以指示斑块破裂的风险的巨噬细胞、脂质沉积和胶原纤维/弹性蛋白纤维、早期细胞标志物的存在的指示。

[0056] 本发明的实施例(包括，例如，图1中所示的系统50或者图5A、图5B、图6或图7中所示的特定示例系统)被配置成提供组合的OCT-TPL图像，类似于如图4中示出的图像700的图像。图像700可以通过组合的OCT-TPL系统检查冠状动脉的一部分来产生。例如，冠状动脉720包括在大约1:00点钟至3:00点钟位置处覆盖有大量脂质核心的薄帽纤维粥样斑块640。

[0057] 不像图3中的图像，图4中所示的图像(增强型OCT-TPL图像)向用户提供了解剖结构的视图以及分析该结构的细胞成分的能力两者。例如，示例性OCT-TPL系统中的光子计数检测器可以检测来自纳米粒子的双光子荧光(TPL)750，所述纳米粒子集中在薄帽纤维粥样斑块740的细胞成分包括例如巨噬细胞、弹性蛋白纤维和/或脂滴中。解剖结构的组合图像以及对结构的细胞成分的指示可以使用户能够对与特定结构相关联的斑块破裂风险执行更透彻的分析。

[0058] 本公开的示例性实施例还可以包括定量地分析由设备获得的图像并且增强对某些方面的可视化显示的计算机可读介质(例如，软件)。例如，如果导管未在血管腔内的中心，则从远离导管的关注位置发射的光肉眼看起来可能不是明亮的(与从靠近导管的位置发射的光相比)。

[0059] 现在参照图15至图16，在一个实施例中，计算机可读介质可以被配置成执行处理800的下述步骤：(1)在步骤810中识别导管；(2)在步骤820中识别管腔(例如被分析的组织的血管壁)；(3)在步骤830中针对每个A扫描计算导管与管腔之间的距离并且计算到导管的总的平均距离(Meanoverall)；(4)在步骤840中计算比Meanoverall更靠近导管的A扫描的平均值(Acloser)以及比Meanoverall更远离导管的A扫描的平均值(Afurther)；(5)在步骤850中通过B扫描中的值的范围(最大值-最小值)来分别归一化Acloser和Afurther，得到AcloserN和AfurtherN；以及(6)在步骤860中，根据A扫描管腔相比于Meanoverall离导管是更近还是更远来将亮点识别为在每个A扫描中大于在AcloserN或AfurtherN中的对应像素的这些像素。另外，对A扫描进行平均以识别亮点可以通过用导管光束的高斯形状缩放每个A扫描以校正强度对深度来代替。

[0060] 现在具体参照图16A，示出了与图16B中的经处理的图像形成对比的未处理图像。在图16C中，以矩形的形式示出了B扫描图像。应注意，B扫描的用蓝色指示线强调的部分取自导管与管腔壁之间的距离小于平均距离的位置。同样地，B扫描的用绿色指示线强调的部分取自导管与管腔壁之间的距离小于大于平均距离的位置。图16D示出了在管腔处对准的A扫描。图16F示出了示例A扫描值(洋红色)以及针对下述这些位置的归一化参考值：其中导管与管腔壁之间的距离小于平均距离(蓝色)的位置以及导管与管腔壁之间的距离大于平均距离(绿色)的位置。

[0061] 其中在图16F中的示例扫描超出归一化值的位置可以被识别为“亮点”并且如图16B中所示图像被增强。这可以使用户能够更加客观地识别可以被进一步调查的关注的位置。

[0062] 示例性实施例还能够通过将OCT信息与TPL数据交叠来执行纹理分析。可以在三维渲染或处理期间分析数据集以给医生提供附加的信息例如斑块的位置、组织类型以及其他生理信息。该信息可以使用纹理分析、光线追迹或其他先进的处理技术根据三维数据集来计算。

[0063] 角分辨OCT系统的示例性实施例可以产生多个三维数据集，在这种情况下，可以对所有数据集进行情况分析，并且可以组合分析或可以不组合分析以给医生提供附加的信息。

[0064] 综上所述，本文所描述的组合的OCT-TPL成像系统可以提供两个光学对比机制：后向散射强度和双光子荧光。本文所描述的基于导管的设备的实施例可用于需要如用于OCT的宽带光和高峰值功率短脉冲激光两者的同时单模传递的基于光的模式。本公开的示例性实施例将IVOCT与TPL成像组合在基于导管的OCT-TPL成像系统中以同时对体内的薄帽纤维粥样斑块及其细胞成分(例如，巨噬细胞、胶原/弹性蛋白纤维、脂滴)进行成像，这决定了相对于单独IVOCT而言的优势并且给心脏病专家提供关于在心血管介入期间随着时间的推移薄帽纤维粥样斑块的易损性的重要信息。在下文提供的示例中阐述了特定实施例的特定配置、特征和方法。

[0065] 示例1-基于导管的强度OCT-TPL系统

[0066] 基于导管的强度OCT-TPL系统的示例(图5A和图5B中所示)可以包括与使用可调飞秒激光器(例如，760nm-1040nm、6nJ-5μJ、100fs-1ps、500kHz-80MHz)激发的TPL组合的在1310nm处工作的频谱域OCT系统。可以利用脉冲压缩器来预补偿飞秒激光的群色散延迟以对管腔表面提供变换极限脉冲。成像导管可以连接至OCT-TPL成像系统的光子晶体光纤(PCF)(例如，NKT Photonics的LMA-20)，这可以使得能够进行OCT光和TPL激发光两者的单模传播以及TPL发射光的传输(例如，同时传输OCT光和TPL激发光)。在某些实施例中，PCF可以包括15μm的纤芯(例如，LMA-15)。

[0067] 图5A描绘了基于导管的强度OCT-TPL成像系统，该基于导管的强度OCT-TPL成像系统包括：光束分束器(BS)、带通滤光片(BP)、短通滤光片(SP)、光电倍增管(PMT)以及光子晶体光纤(PCF)。图5A示出了其中TPL激发光没有通过二向色镜透射到PCF光纤的示例。

[0068] 图5B也描绘了基于导管的强度OCT-TPL成像系统，该基于导管的强度OCT-TPL成像系统包括：光束分束器(BS)、带通滤光片(BP)、短通滤光片(SP)、光电倍增管(PMT)以及光子晶体光纤(PCF)。然而，相比而言，图5B示出了其中TPL激发光的一部分通过二向色镜透射到PCF光纤(并且随后传输到扫描光学器件模块和样品)的示例。因此，TPL光源和OCT光源以及相关联的仪器的布置还可以与图5A和图5B中所示的不同。在任一结构中，如本领域已知的那样，色散补偿器还可以位于OCT参考臂分支中。

[0069] 在某些实施例中，图5A和图5B中所示的系统可以用于产生TPL图像与OCT图像的合并图像。在图17和图18中示出了人冠状动脉的TPL组织图像、OCT组织图像和合并的组织图像。如附图中所示，合并图像可以使用不同的颜色来指示用OCT(在该示例中，绿色)和TPL(在该示例中，红色)获得的图像的部分。

[0070] 在用于产生图17和图18中的图像的系统的操作期间，OCT参数如下：扫频激光为1310nm/110nm；光束尺寸为20μm；激光功率为1.2mW；视场为2mm×2mm以及A扫描速率为20kHz。此外，用于产生图17和图18的图像的系统的TPL参数如下：2-P激发激光器为760nm-1040nm、120fs、80MHz；像素驻留时间为4μs；激光功率为500mW；光束尺寸为20μm；发射滤光片为<700nm；视场为2mm×2mm。

[0071] 现在参照图19，显示了使用根据示例性实施例的TPL成像技术获得的图像。这些图像显示具有动脉粥样硬化斑块的兔主动脉组织切片。明亮的TPL信号是来自脂滴、胶原蛋白和弹性蛋白纤维的原本的自发荧光。

[0072] 图20显示了使用根据示例性实施例的基于光纤的系统获得的人冠状动脉组织的TPL图像、OCT图像以及合并的TCL-OCT图像。此外，图20的右下部分包括指示脂质的分布的染色组织切片。

[0073] 示例2-基于导管的偏振敏感OCT-TPL系统

[0074] 基于导管的偏振敏感OCT-TPL系统的一个示例(图6中所示)可以包括与使用可调飞秒激光器(例如，760nm-1040nm、6nJ-5μJ、100fs-1ps、500kHz-80MHz)激发的TPL组合的在1310nm处工作的频谱域偏振敏感OCT(PSOCT)系统。图6中的系统包括：用作同轴光纤偏振计的保偏光纤段(PM1和PM2)、偏振光束分束器(PBS)、带通滤光片(BP)、短通滤光片(SP)、光电倍增管(PMT)以及光子晶体光纤(PCF)。

[0075] PSOCT系统利用平衡式检测和同轴光纤偏振计[29]来测量参考光和干涉条纹两者的偏振态。在干涉仪的样品路径中的打开的光开关使得能够对仅包含参考光的偏振态的信号(没有参考光与样品光之间的干涉条纹)进行测量。可以利用脉冲压缩器来预补偿飞秒激光的群延迟色散以对管腔表面提供变换极限脉冲。成像导管可以连接至OCT-TPL成像系统的光子晶体光纤(PCF)(例如，NKT Photonics的LMA-20)，这可以使得能够进行OCT光和TPL激发/发射光两者的传播。

[0076] 示例3-基于导管的频谱域相位敏感OCT-TPL系统

[0077] 基于导管的相位敏感OCT-TPL系统的一个示例(图7中所示)可以包括与使用可调飞秒激光器(例如，760nm-1040nm、6nJ-5μJ、100fs-1ps、500kHz-80MHz)激发的TPL组合的在1310nm处工作的频谱域相位敏感OCT(PhSOCT)系统。图7的系统包括：偏振光束分束器(BS)、带通滤光片(BP)、短通滤光片(SP)、光电倍增管(PMT)以及光子晶体光纤(PCF)。

[0078] 可以利用脉冲压缩器来预补偿飞秒激光的群延迟色散以对被成像的血管的管腔表面提供变换极限脉冲入射。成像导管可以连接至OCT-TPL成像系统的光子晶体光纤(PCF)(例如，NKT Photonics的LMA-20)，这可以使得能够进行OCT光和TPL激发光两者的单模传播以及TPL发射光的传输。

[0079] 示例4-使用ZEMAX的OCT-TPL导管设计和光学仿真

[0080] 在该示例中，OCT-TPL导管将修改当前OCT导管以包括TPL激发和发射。以前，使用客户定制的多光子显微镜[30]执行对载有纳米粒子的巨噬细胞的检测。因此，理想的是将所提出的基于导管的OCT-TPL成像系统的TPL激发效率与多光子显微镜的TPL激发效率进行比较。表1示出了对根据两个成像系统的激光激发的表征。

[0081]

[0082] 表1.多光子显微镜的TPL激发效率与所提出的基于导管的OCT-TPL系统的TPL激发

[0083] 效率的比较

[0084] 由于PCF将用于传递TPL激发光，所以可以被传递的瞬时功率受限于在PCF中的非线性效应的发生，这可以使用非线性薛定谔方程来描述：

[0085]

[0086] 其中，|A|2、β2、γ、z和t分别为脉冲瞬时功率[W]、群速度色散参数[fs2cm-1]、非线性参数[W-1km-1]、位置[cm]和时间[s]。对于在该示例中使用的PCF，给出γ＝21W-1km-1[17]，β2＝-172fs2cm-1，λ＝800nm，c＝3×108m/s，低于在PCF中的非线性效应的阈值的最大瞬时功率根据非线性薛定谔方程求解：|A|2＝-2π2c2β2/(λ2γ)＝4.49MW。
虽然OCT-TPL系统中的飞秒激光器可以提供5MW的瞬时功率(参见表1)，但是在PCF中传播的实际瞬时功率可被限制为小于非线性效应的阈值的约4.49MW。PCF中允许一些非线性可以提供用于频谱展宽和附加脉冲压缩。

[0087] ZEMAX是可以在光学系统的设计中进行建模、分析以及协助的软件程序。可以使用ZEMAX仿真和验证OCT-TPL导管的示例性实施例。建立了OCT-TPL导管的ZEMAX模型来仿真OCT光和TPL光与包含金纳米粒子的动脉组织的相互作用(例如参见图8，其中提供了：(A)OCT-TPL导管的2-D侧视图和(B)OCT-TPL导管的3-D正视图)。

[0088] 导管使用自聚焦透镜(材料：GTAG)、棱镜(BK7)、护套(THV_GENERIC)和冲洗流体(seawater)来建模。动脉组织使用两层几何体来建模。顶层包含金纳米粒子(μa＝-1 -1181cm )和内膜(μs＝239cm )，而底层仅由内膜构成。忽略内膜组织的吸收系数和纳米粒子的散射系数，原因在于其分别与金纳米粒子和内膜组织的吸收系数和散射系数相比是可忽略的。

[0089] 对OCT光和TPL光与动脉组织的相互作用进行ZEMAX仿真按照三个步骤执行：(1)将OCT(1310nm)和TPL(800nm、1.35MW、NA＝0.04)的激发光线从位于自聚焦透镜的前表面的中心处的点源入射到动脉组织上。(2)在光束-组织界面处的单个巨噬细胞(包含金纳米粒子)被激发并且发射TPL。(3)来自巨噬细胞的TPL发射光线被追迹回到导管并且通过位于自聚焦透镜的前表面处的检测器(图6中未示出)检测。

[0090] 根据ZEMAX仿真计算三个重要参数，包括：TPL光程(OPL)、在自聚焦透镜的前表面处的OCT发射光斑尺寸和TPL发射光斑尺寸，以及在自聚焦透镜的前表面处的可以耦合到PCF中的TPL发射功率。特别地，表2示出了TPL激发的范围为798nm-802nm中的五个不同波长在主光线方向和边缘光线方向两者处的OPL。结果指示出在5nm范围内的TPL激发脉冲从自聚焦透镜的前表面到动脉组织表面的色散小于1fs。

[0091]

[0092] 表2.范围为798nm-802nm的TPL激发光在主光线方向和边缘光线方向两者处的色散

[0093] 在ZEMAX中，在自聚焦透镜的前表面处的OCT光斑尺寸和TPL光斑尺寸由位于相同位置处的检测器来测量(图9示出了由位于相同位置处的检测器测量的在自聚焦透镜的前表面处的OCT光斑尺寸和TPL光斑尺寸。检测器的尺寸与自聚焦透镜的直径相同。)。因为OCT光的NA(0.05)高于TPL激发的NA(0.04)，因此OCT光斑尺寸(17.1μm)略微小于TPL发射光斑尺寸(21.8μm)。要被使用的PCF具有例如25μm的纤芯直径，这表明OCT光斑大小和TPL光斑大小两者都可以适合纤芯。

[0094] 然后，根据图5中所示的检测器来计算可以耦合到PCF纤芯中的TPL发射功率，仅包括自光斑尺寸的中心25μm直径内的光线。基于TPL激发瞬时功率(1.35MW)，在检测器-4处25μm直径内所检测的TPL发射瞬时功率被计算为1.51×10 W，这表明，单个TPL激发脉冲(800fs)能够生成425光子/脉冲。当TPL激发和OCT重复率分别是500kHz和50kHz时，在单次OCT A扫描内可以记录10个TPL激发脉冲，这导致4250光子/OCT A扫描。相比较而言，用于采集数据的多光子显微镜记录0.7光子/脉冲(根据滨松PMT规格[31]计算，未示出数据)以及来自多光子显微镜的纳米团簇(nanoroses)的典型TPL图像中的累积的光子/像素限于133光子/像素。因此，基于导管的OCT-TPL系统的检测效率比目前使用的多光子显微镜高不止一个数量级。

[0095] 示例5-纳米棒的选择

[0096] 金纳米棒可以被巨噬细胞(动脉粥样硬化和癌症中涉及的重要的早期细胞标志物)内在化，并且用作用于巨噬细胞靶向的各种成像技术的造影剂。本研究的目的是比较表面等离子共振分别在700nm、756nm、844nm和1060nm的四个尺寸的金纳米棒的双光子荧光(TPL)性质。使用激光扫描TPL显微镜测量来自单个纳米棒和罗丹明6G粒子的TPL。通过具有光电倍增CCD的光谱仪来记录来自纳米棒的TPL发射光谱。所有四个尺寸的纳米棒都产生与激发波长相关的强TPL强度，指示双光子作用截面(TPACS)是等离子增强的。在低功率水平处观察到发光强度对激发功率(确认TPL处理)的二次相关性，随后在高功率水平处由于光漂白效应而导致强度饱和或减小。与单个罗丹明6G粒子在760nm激发处的25GM相比，测量到单个纳米棒的最大TPACS为12271GM。纳米棒TPL发射光谱的特性可以通过费米能级附近的电子与在布里渊区中的X和L对称点附近的空穴的复合来解释。纳米棒的TPL亮度、TPACS和发射光谱的比较结果可以用于针对选定的成像应用指导对最亮造影剂的选择。

[0097] 最常见的心血管疾病之一动脉粥样硬化占美国全部死亡的三分之一[32]。在血流中的巨噬细胞渗入血管的含有粥样硬化斑块的内膜层并且变成基于斑块的巨噬细胞(PBM)。PBM通过释放侵蚀薄纤维帽(厚度小于65μm)的基质金属蛋白酶(MMP)来加速炎症，并且使斑块更易于破裂[33，34]。已知肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在许多癌症(例如，乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌和皮肤黑色素瘤)的发展中发挥基础性作用[35]。在肿瘤中，渗入的TAM为肿瘤生长提供免疫微环境(通过直接和间接抑制细胞毒性T细胞的活性)，促进血管生成，并且产生支持恶性细胞的增殖和存活的可溶性介质[36]。由于这些原因，在实体肿瘤中的TAM密度一般被描述为与患者的预后负相关[35]。此外，在许多癌症中已经建立了TAM存在与局部浸润进入异位组织和/或转移之间的关联[35，36]。因此，巨噬细胞是提供有关未来斑块破裂的风险以及癌症的分期和转移的信息的重要的早期细胞标志物。体内的巨噬细胞检测具有重要的临床意义并且已促进了巨噬细胞靶向造影剂例如金纳米粒子的发展。

[0098] 由于金纳米粒子的独特的光学性质(即，吸收、散射和荧光)、可忽略的细胞毒性和良好的生物相容性，已针对靶向巨噬细胞开发了具有不同涂层的各种金纳米粒子，包括：纳米球[37，38]、纳米壳[39，40]、纳米笼[41，42]、纳米团簇(nanoroses)[43，44]、纳米棒-10
[45，46]等。虽然观察到块状金荧光的量子产率极弱(约10 )[47]，但是金纳米粒子可以通过表面等离子体共振(SPR)效应[51-53]强烈地增强局部光场振幅[48，49]并且将量子-4
产率显著提高到10 水平[49]，表面等离子体共振(SPR)效应被称为与光的入射电磁光场共振的金纳米粒子的导带中的电子的相干振荡。由于大幅抑制带间阻尼，因此纳米棒与小的纳米球相比表现出较高的局部场增强因子[54]。Mohamed等人通过在块状金上的单光子
6
等离子体激发而观察到金纳米棒的量子产率超过10倍的增强[55]。不同于其具有对称形状的相对物(例如，纳米球、纳米壳和纳米笼)，纳米棒可以通过改变长宽比很容易地将SPR调到近红外波长(其中组织吸收最小)[56-59]。此外，很好的建立了纳米棒的合成过程，与其他复杂的纳米结构(例如，纳米团簇和纳米笼)的合成相比，纳米棒的合成过程提供较好的单分散性和稳定性。比单光子激发处理更好的双光子激发处理或多光子激发处理提供附加的局部场增强，因此，对量子产率的增强越大，发射信号越强。虽然纳米棒的单光子量子-4
产率在10 的量级，但是已经报道了纳米棒的双光子作用截面(TPACS)可以达到2320GM，这在量子点(2000GM-47000GM)的双光子作用截面(TPACS)的范围内[60]，并且比有机荧光团(例如，罗丹明6G)的双光子作用截面(TPACS)高得多，提供了一种使用双光子激发检测生物组织中的这些纳米棒的有前途的方法。

[0099] 双光子荧光显微镜(TPLM)因为其近红外激发而被特别关注，在近红外激发处，组织散射较弱并且具有较少吸收。与其他成像模式(例如，MRI，CT，PET，OCT和超声)相比，TPLM可以提供纳米棒的最佳对比度以及最高的3-D空间分辨率[61-63]。对单个纳米棒的几个TPLM研究已经报道了二次功率相关性[64，65]、在纳米棒的特定位置处的局部场增强[65]、荧光极化和光谱[60，67]的详细描述。然而，需要对来自不同尺寸的纳米棒的在多个激发波长处的双光子荧光(TPL)进一步表征和比较，其包括：(1)纳米棒的TPL亮度的比较，(2)纳米棒的TPL处理的激发功率范围和光漂白效应，(3)纳米棒的TPACS以及(4)纳米棒的TPL光谱。这些研究可以对来自纳米棒的TPL提供更深的认识并且指导对造影剂的选择和优化。

[0100] 在该研究中，使用激光扫描TPL显微镜来研究不同尺寸的纳米棒在多个激发波长处的TPL特性。在760nm激发处的全部四个尺寸的纳米棒之中，等离子体共振在756nm处的纳米棒被认为是最亮的(在相同激发功率处)。所有纳米棒在低功率水平处表现出TPL强度对激发功率的二次相关性，随后在高功率水平处由于光漂白效应而导致强度饱和或减小。计算并且比较了四个纳米棒在三个激发波长处的TPACS。纳米棒的TPL发射光谱通过电子-空穴复合来解释并且与TPL亮度测量一致。这些实验和分析的结果表明，纳米棒尺寸不仅确定SPR位置，而且确定TPL亮度、TPACS以及TPL发射光谱。

[0101] 材料和方法

[0102] 样品制备

[0103] 使用如先前所描述的种子生长方法来在溶液中合成金纳米棒[68]。从Nanopartz购买表面等离子体共振分别在700nm、756nm、844nm和1060nm处的四个尺寸的纳米棒，在使用前经短暂的超声波处理并且从原液浓度稀释10倍。通过将5μl稀释液分散到载玻片并且用盖玻片覆盖形成5μm厚的纳米棒溶液来准备纳米棒样品。载玻片上的四个尺寸的纳10 10 10
米棒的最终浓度分别是5.7×10 纳米粒子/ml、4×10 纳米粒子/ml、7.2×10 纳米粒子
10
/ml以及2.8×10 纳米粒子/ml。透射式电子显微镜(TEM)揭示纳米棒的形态并且TPL图像显示单个纳米棒在衍射极限处的形状(图10a至图10d)。图10提供了在下述研究中使用的金纳米棒的TEM图像：(a)Au700，(b)Au756，(c)Au844，(d)Au1060。在(a，b，c，d)中的插图是单个纳米棒在840nm激发处的400nm-700nm的光谱范围内的TPL图像。在TEM图像和TPL图像中的比例尺分别表示20nm和1μm。(e)激光扫描TPL显微镜的示意图。EOM：
电光调制器；PMT：光电倍增管。

[0104] 金纳米棒的长轴是在35nm-67nm的范围内，对应长宽比分别为2.9，3.5，4.4和6.7。将罗丹明6G(密苏里州，圣路易斯，Sigma-Aldrich公司)在DI(去离子)水中稀释成两种浓度：110μM和1pM。将110μM的样品密封到试管中，而将1pM的样品分散在载玻片上然后在载玻片上干燥(形成单个罗丹明6G粒子的分布)。针对试管和干燥后的罗丹明
6G样品两者测量TPACS光谱。

[0105] TPL显微镜

[0106] 使用激光扫描TPL显微镜(图10b，威斯康星州，米德尔顿，Prairie Technologies公司)来测量来自纳米棒的TPL。使用在波长760nm-1040nm(80MHz，100fs)处发射的飞秒钛宝石激光器(加利福尼亚州尔湾市，Newport公司，Mai Tai HP)作为激发光源。进入显微镜的激光束的强度由电光调制器(美国康乃狄克州，丹伯里市，ConOptics公司，350-80)来调制并且由Pick-off反射镜(反射率1％)和用于测量传递到样品的功率的功率计来监测。使用一对振镜扫描镜相对于样品沿x-y平面扫描物镜(宾西法尼亚州，森特瓦利，Olympus公司，40×，NA＝0.8，水浸)的聚焦体积(focal volume)以产生2-D图像。来自样品的TPL发射通过同一物镜采集，通过720nm的长通二向色镜与激发激光线分离，被引导至四个通道并且由光谱范围分别为640nm-680nm，570nm-620nm，490nm-560nm和435nm-485nm的四个光电倍增管(新泽西州，布里奇沃特，Hamamatsu公司，PMT 1、PMT 2：H7422P-40；PMT3、PMT 4：R3896)来检测。为了使来自激发激光线的光子数最小化，短通滤光片(弗吉尼亚州，贝洛斯福尔斯，Chroma Technology公司，et720sp)置于二向色镜之后。在该研究中，在检测光路径中不存在二向色镜和带通滤光片的情况下仅PMT1用于采集TPL发射信号(小于720nm)。还通过用具有光电倍增CCD的耦合光纤的光谱仪(爱尔兰贝尔法斯特，Andor Technology公司，Shamrock 303i)代替PMT1来测量TPL。

[0107] TPACS计算

[0108] 纳米棒的TPACS通过来自参考罗丹明6G样品的TPL发射的比较方法来确定。来自样品的TPL发射可以用具有相关参数的公式(1)来表示[69]：

[0109]

[0110] 其中，F(单位：光子/秒)为每单位时间采集的TPL光子，φ(无量纲)为测量系统的TPL采集效率，C(单位：mol/ml)为荧光团浓度(即，纳米棒和罗丹明6G)，gp(无量纲)为激发源的二阶时间相干性的程度，f为激光调制频率，τ为FWHM脉冲宽度，n为样品的折射率，P(单位：光子/秒)为激发激光功率，λ为激发波长，η2σ2(单位：GM；1GM＝10-50cm4s/光子)为TPACS，其中η2和σ2分别为量子产率和双光子吸收截面。通过在TPL图像中测量来自单个粒子的TPL发射强度，获得Fn(纳米棒)和Fr(罗丹明6G)。文中，所有TPL信号是在同一系统中使用相同的实验条件在相同激发波长下测量的，因此，对于纳米棒样品和罗丹明6G样品而言， gp、f、τ和λ相同。对两个样品使用公式(1)并且将P改变为平均功率 (单位：瓦)，纳米棒的TPACS((η2σ2)n)可以通过与已知的罗丹明6G的TPACS((η2σ2)r)进行比较来确定，如公式(2)所示：

[0111]

[0112] 结果

[0113] 纳米棒的亮度的功率相关性

[0114] 图11a示出了四个尺寸的纳米棒的在4×1011纳米粒子/ml的浓度下测量的单光子吸收光谱。图11b示出了MPL强度对纳米棒在760nm，840nm和1040nm波长处的激发激光功率(132μW-4.8mW)的相关性。图11c示出了在图(b)中的较低功率水平处的纳米棒的荧光强度对发射激光功率的二次相关性。1.7-2.2的斜率(针对在不同的激发波长下每个尺寸的纳米棒)确认TPL处理。

[0115] 对于每个纳米棒，可见两个表面等离子体共振(SPR)吸收峰，在520nm附近的一个吸收峰是由于电子的横向振荡以及对纳米棒尺寸的不敏感引起的。另一吸收峰红移到更长的波长并且是由于电子的纵向振荡引起的，其中，峰值波长随纳米棒的长宽比的增大而增大[55，69]。纵向SPR的振幅还随着长宽比的增大而增大(除Au844以外)，与理论计算[56]一致。由TPL显微镜来测量四个尺寸的纳米棒在三个激发波长(即，760nm、840nm、1060nm)处的多光子荧光(MPL)。图11b示出了用对数标度的纳米棒亮度对用对数标度的激发激光功率(132μW-4.8mW)的相关性。对于每个纳米棒，观察到MPL信号强度在较低发射功率处首先线性地增大(即，斜率≈2)，然后，曲线开始弯曲并且形成指数样增大，随后信号饱和(例如，Au700-Ex760、Au700-Ex840、Au700-Ex1040、Au756-Ex760、Au844-Ex840、Au844-Ex1060、Au1060-Ex840)或者信号减小 (Au760-Ex1040，Au1060-Ex1040)。在相同的激发功率下，当激发波长越靠近纳米棒的纵向SPR时，MPL信号强度越高。当激发处于(或靠近)纵向SPR波长时，观察到MPL信号强度(即，纳米棒亮度)遵循：
Au756>Au700>Au844>Au1060，其中在激发功率为372μW处Au756看起来比Au1060亮11倍。
图11c示出了在图11b的较低激发功率水平处的纳米棒MPL。斜率范围为1.7-2.2的所有曲线示出了荧光信号强度对激光激发功率的二次相关性，指示TPL处理。值得注意的是，该TPL处理功率范围因纳米棒尺寸而异，其中，较大的纳米棒(例如，Au844，Au1060)看起来比较小的纳米棒(例如，Au700，Au756)具有更宽的功率范围。

[0116] 对根据时间的MPL响应进行测量以测试纳米棒的MPL漂白性质。如图12a所2
示，以2mW照射较小视场(20×20μm)中的纳米棒30秒并且通过立即缩放至较大视场
2
(80×80μm)来记录TPL图像，其中红色框指示较小视场。对于每个激发波长，在红色框中的纳米棒的平均强度被归一化到在较大视场中的红色框外侧的纳米棒的平均强度并且结果为图11b中所示。虽然与其中纳米棒经受更短照射时间的较大视场中的MPL信号相比，红色框中的所有尺寸的纳米棒在30s激光照射之后示出了MPL信号下降，但是观察到在纵向SPR激发波长处，与较小的纳米棒(例如，对于Au756在760nm激发处下降2％)相比，较大尺寸的纳米棒(即，Au844、Au1060)示出了更显著的信号下降(例如，对于Au1060在
1040nm激发处下降35％)。纳米棒的MPL时间响应表明光漂白效应是明显的，尤其在较大尺寸的纳米棒中。

[0117] 图12a示出了在(a)中在红色框(20×20μm2)中以2mW的激光照射30s之后获取2
的Au1060的在844nm激发处的典型的TPL图像(80×80μm)，其中，观察到纳米棒的MPL信号下降。图12b示出了针对四个纳米棒在三个激发波长处，红色框中的纳米棒的平均MPL信号(相同颜色的第二条)被归一化到较大视场中的红色框外侧的纳米棒的平均MPL信号(相同颜色的第一条)。误差条表示标准偏差。

[0118] 对纳米棒的TPACS测量

[0119] 在可以确定纳米棒的TPACS之前需要测量罗丹明6G的TPACS。Albota等人已经报道了发射波长范围为690nm-960nm的罗丹明6G溶液的TPACS[71]，然而，这个数据不包括波长范围960nm-1040nm。在该研究中，使用公式(1)在将Albota等人的数据扩展80nm的激发波长范围760nm-1040nm处测量并且计算罗丹明6G溶液和单个粒子两者的归一化TPACS。在所有的激发波长和施加的功率范围(未显示数据)处观察到罗丹明6G的TPL处理。在
760nm-960nm范围中，对罗丹明6G溶液的测量结果与所报道的值合理地相匹配，其中，主吸收峰在820nm处交叠。单个罗丹明粒子的吸收峰具有到800nm的蓝移而在1000nm处单个罗丹明粒子的第二峰与罗丹明6G溶液相比显著地衰减。然后，根据公式(2)将单个罗丹明
6G粒子的TPACS用作用于与纳米棒进行比较的亮度基准。

[0120] 在其中可以保证TPL处理的小于1mW激发功率处测量纳米棒的TPL信号。然后使用公式(2)将单个纳米棒的TPL亮度与单个罗丹明6G粒子的TPL亮度进行比较以及结果在表3中示出。观察到：(1)所有的纳米棒在纵向SPR波长处或在靠近纵向SPR波长处具有最大TPACS，与先前对纵向SPR在820nm处的金纳米棒的测量结果[60]一致。随着激发波长远离纵向SPR，TPACS单调减小；(2)激发波长在纵向SPR处或靠近纵向SPR处的情况下，较小的纳米棒比较大的纳米棒具有更大的TPACS(例如，对于Au756和Au700的Ex760与对于Au844的Ex840以及对于Au1060的Ex1040相比)。Au756在760nm激发处的TPACS在被调查的所有纳米棒以及激发波长中是最大的(与单个罗丹明6G粒子的25GM相比的12271GM)并且比Au1060在1040nm激发处的TPACS大约15倍。Au844在840nm激发处的TPACS是2039GM，这非常接近先前报道的稍微较大尺寸的纳米棒在830nm处激发的TPACS
2320GM[60]。

[0121] 图13示出了罗丹明6G单个粒子、罗丹明6G溶液以及根据Albota等人所报道的值[41]在波长范围为760nm-1040nm处的归一化TPACS。单个罗丹明6G粒子从干燥的水溶液中形成；溶解于DI水中的罗丹明6G溶液的浓度为110μM；报道的数据使用溶解于MeOH(甲醇)中的浓度为110μM的罗丹明6G。

[0122] 表3.单个纳米棒分别在760nm、840nm和1040nm的激发波长处的TPACS(单位：GM)[0123]

[0124] 3.3纳米棒的TPL发射光谱

[0125] 为了更好地表征纳米棒的TPL发射，在多个激发波长(即，760，800，840和1040纳米)处，从纳米棒溶液(视场为80×80μm2)中采集光谱范围为350nm-700nm的TPL发射光谱。对所有纳米棒的平均激发功率保持低于1mW使得可以满足TPL处理。然后，TPL发射被入射光子的数量和纳米棒浓度归一化并且示出在图14中。

[0126] 图14示出了(a)Au700，(b)Au756，(c)Au844和(d)Au1060在760nm，800nm，840nm和1040nm的激发波长处的TPL发射光谱。(a)中的插图表示检测系统的包括光谱仪的光栅和光电倍增CCD的总的量子效率。针对量子效率校正光谱并且对入射光子的数量和纳米棒浓度归一化光谱。

[0127] 针对光谱仪的光栅和光电倍增CCD的总的量子效率校正所有TPL光谱(图14a中的插图)。对于每个纳米棒尺寸，TPL发射强度在纳米棒的纵向SPR波长处看起来最高并且随着激发波长远离纵向SPR峰而单调减小，表明由于SPR吸收而产生的电场增强。激发波长偏移远离SPR越远，TPL发射信号下降越急剧，这与如图11b中所示的纳米棒的亮度的PMT测量的结果一致。对于激发波长(除了Au1060在1040nm激发)所位于的地方的较低光子能量，所有发射光谱强度增大，这可以归因于局部化的SPR的色散[72]。发射光谱范围可以分成三个波长带：400nm-575nm，575nm-640nm和640nm-700nm。在所有尺寸的纳米棒中都可见在575nm和640nm周围的两个下跌，并且对于Au756、Au844和Au1060更加明显。对于较小的纳米棒(即，Au700，Au756)，与较大的纳米棒(即，Au844)相比，TPL发射强度在640nm-700nm波段中比在另外两个波段中增大更迅速。有趣的是，Au1060的TPL发射在
400nm-575nm波段中表现平稳而随后在575nm-640nm和640nm-700nm波段中信号下降。因为对于金纳米棒的TPL机制与对于块状金金属的TPL机制相同[72]，所以发射峰区域应该归因于在费米能级的激发电子与在d带中的空穴之间的能隙。注意到，对于在1040nm激发处的纳米棒还观察到二次谐波信号，而在所有其他激发波长处都没有看到。以下讨论光谱特征的细节。

[0128] 讨论

[0129] 因为纳米棒亮度在巨噬细胞靶向和检测中是非常重要的参数，并且还确定成像系统的灵敏度，所以选择产生最强TPL信号的纳米棒的尺寸具有重要的临床利益和意义。在该研究中，比较了四个尺寸的纳米棒，并且发现在相同的激发功率处以及在相应的纵向SPR的激发波长处，Au756发射最强。实际上，从金纳米棒通过单光子激发的荧光发射由Eustis和El-Sayed在他们的实验和仿真研究[73]中证明的三个因素来确定：(1)在纵向SPR波长处的单光子吸收的强度，这应该随着纳米棒的长宽比的增大而增大(图11a)。(2)SPR吸收带与带间跃迁之间的交叠，该带间跃迁归因于d带与导带之间电子跃迁，并且开始于大约1.8eV(689纳米)的阈值能量处[74，75]。(3)SPR吸收带与块状金的荧光带之间的交叠，该块状金的荧光带的峰值在525nm周围，之后降低并且超出750nm后逐渐消失[47]。第一个因素是其他两个因素的竞争组分，其净效应确定TPL发射的增强。在该研究中，当纳米棒的长宽比从2.9增加到6.7时，纵向SPR的增强增大同时SPR吸收带与带间跃迁之间的交叠或金的体荧光两者都减小。因此，观察到最强增大导致Au756的长宽比为3.5，这比Au1060高约12倍。该观察结果与针对纳米棒采用单光子激发所报道的结果非常相似，其中，对于长宽比低于3.4，纳米棒的量子产率成平方地增大而后减小[76]，并且当长宽比增大超过
3.25时荧光发射开始下降，到长宽比为6时减弱一个数量级[73]。

[0130] 不像单光子激发，其中与来自量子点或染料的荧光形成对比，纳米棒对于光漂白基本上是惰性的并且光在纳米棒上的散射可以在数小时的测量时间内保持不变[77]，来自纳米棒的TPL发射信号根据纳米棒的尺寸显示出各种水平的光漂白(图12)。事实上，TPL发射由瞬时入射功率来确定。当增大激发功率时，由于由入射场引起的发射的增强而使TPL发射信号首先增大，然后，由于纳米棒形状转变或损坏引起增强的消失而使TPL发射信号减小并且最终逐渐消失。Link和El-Sayed等人[78]证明了纳米棒的完全熔化的阈值为2 2 2
在800nm激发处的脉冲持续时间为100fs的约0.01J/cm(100GW/cm)，而在10GW/cm处观察到纳米棒的明显的形状转变以及纵向SPR带的减小。Bouhelier等人[79]已示出了在高激发功率处纳米棒可以转变为球形形状并且相应的荧光峰蓝移，其中，发射增强会大大减
2
小。在该研究中，在光束焦点处的瞬时功率密度在1040nm激发处为13GW/cm的(平均功率
2
为2mW)，其超过10GW/cm并且很可能重塑纳米棒在视场中的一部分。因此，预期荧光发射会降低，此外，该光漂白效应归因于重塑或部分纳米棒损坏，尤其对于具有较大尺寸(即，Au844，Au1060)并且与入射激光的偏振对准的纳米棒。

[0131] 已知金晶体结构在第一布里渊区中具有几个对称点，其中在X和L对称点附近优先出现电子跃迁[67，80]。在金纳米棒中，X和L对称点可以是分别沿着纳米棒的长轴和对角线方向[67]。在纳米棒中的TPL发射处理可以分三步[46，54，74]：(1)在被占用的d带(或者可能是在费米能级以下的sp导带[67])中的电子通过双光子吸收激发至在费米能级之上的未被占用的sp导带并且产生电子空穴对。(2)然后，激发的电子失去能量(例如，通过带内散射)以有力地移动靠近费米能级。(3)电子空穴对的复合导致荧光发射。根据金的能带结构的计算[72，81]，发射峰区域应当处于1.8eV-1.9eV(652nm-689nm)、2.3eV-2.4eV(517nm-539nm)以及3.1eV-3.3eV(376nm-400nm)的光谱范围内，其分别归因于6-5X，6-5L和6-4L的对称点。在该研究中，观察到纳米棒的在对应的纵向SPR激发波长处的TPL发射峰都位于680nm和530nm周围，以及尖锐上升沿呈现在400nm周围，这与对分别根据6-5X，6-5L和6-4L对称点的发射的频带计算非常一致。值得注意的是，第二谐波信号仅在1040nm激发处是明显的(与所报道的观察结果一致[71])，但是在其他激发波长处未观察到，这可能是由于弱二次谐波信号淹没在TPL发射的色散中而引起的。

[0132] 结论

[0133] 通过利用TPLM，研究和表征了金纳米棒的TPL性能。纵向SPR波长为700nm、756nm、844nm和1060nm的四个尺寸的纳米棒在多个激发波长(即，760nm，840nm，1040nm)处被激发。观察到在所有纳米棒中，在相同的激发功率下，Au756在760nm激发处发射最强的TPL信号。在较低功率水平处(例如，<1.6mW)满足TPL强度对激发功率的二次相关性，而在较高功率水平处(例如>1.6mW)，尤其对于较大尺寸的纳米棒，光漂白效应明显。基于对单个罗丹明6G粒子的归一化TPACS光谱的测量计算纳米棒在三个激发波长处的TPACS。
纳米棒的TPL发射光谱与对金的电子带计算相匹配并且与TPL亮度测量结果一致。结果表明，金纳米棒是用于TPLM的有前提的成像造影剂，以及最亮的纳米棒可以通过对纳米棒的TPL亮度、TPACS和发射光谱的比较来确定。

[0134] 根据本公开，在无需进行过度实验的情况下，可以构成并且执行本文所公开并且要求保护的所有设备、系统和/或方法。虽然以特定实施例的形式描述了本发明的设备、系统和方法，但是对于本领域技术的普通技术人员而言明显的是在不背离本本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对在本文所描述的方法的步骤或顺序的步骤中的设备、系统和/或方法进行变化。对本领域的所有普通技术人员而言，所有这样的相似替代和修改显然在如由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

[0135] 参考文献

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