用于延长的血清半衰期的工程化抗体FC变体
阅读：996发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于延长的血清半衰期的工程化抗体FC变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在一些方面，提供了在体内施用后表现出提高的与FcRn的结合和延长的 半衰期 的突变体或变体Fc结构域。所述Fc结构域可包含在糖基化或无糖基化 抗体 中。还提供了使用所述突变体或变体Fc结构域或包含所述突变体或变体Fc结构域的多肽的方法。，下面是用于延长的血清半衰期的工程化抗体FC变体专利的具体信息内容。
1.包含能够在酸性pH下结合人FcRn的突变体或变体人IgG Fc结构域的多肽，其中所述Fc结构域具有以下替换突变：
(i)第309位的天冬氨酸(L/V309D)；
(ii)第311位的组氨酸(Q311H)；和
(iii)第434位的替换突变(N434)。
2.权利要求1所述的多肽，其中第434位的替换突变是丝氨酸(N434S)或酪氨酸
(N434Y)。
3.权利要求2所述的多肽，其中第434位的替换突变是丝氨酸(N434S)。
4.权利要求2所述的多肽，其中第434位的替换突变是酪氨酸(N434Y)。
5.权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域是糖基化的。
6.权利要求5所述的多肽，其中所述Fc结构域与野生型相比具有基本上等价、基本上相同、大致相同、或相同的与FcγR的结合。
7.权利要求5所述的多肽，其中所述Fc结构域与野生型相比具有基本上等价、基本上相同、大致相同、相同或等价的与FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的1种、2种或全部的结合能力。
8.权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中在酸性pH下，所述Fc结构域以高于野生型的亲和力结合FcRn。
9.权利要求8所述的多肽，其中在中性pH下，所述Fc结构域不与FcRn可检出地或选择性地结合，或者不表现出或基本上不表现出与FcRn的结合。
10.权利要求9所述的多肽，其中与野生型相比，所述Fc结构域表现出：(i)在pH 5.8下增强的与FcRn的结合，以及(ii)在pH 7.4下降低的与FcRn的结合或没有可检出的与FcRn的结合。
11.权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域是无糖基化的。
12.权利要求11所述的多肽，其中所述Fc结构域在第264位具有谷氨酸替换突变
(V264E)。
13.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG1。
14.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG2。
15.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG3。
16.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述IgG是IgG4。
17.权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域包含以下或由以下组成：
EDHS(SEQ ID NO：5；V264E；L309D；Q311H；N434S)，
EDHY(SEQ ID NO：6；V264E；L309D；Q311H；N434Y)，
DHS(SEQ ID NO：7；L309D；Q311H；N434S)，
DHY(SEQ ID NO：8；L309D；Q311H；N434Y)，
IgG2-DHS(SEQ ID NO：9；V309D；Q311H；N434S)，
IgG3-DHS(SEQ ID NO：10；L309D；Q311H；N434S)，或
IgG4-DHS(SEQ ID NO：11；L309D；Q311H；N434S)。
18.权利要求17所述的多肽，其中所述Fc结构域包含以下或由以下组成：DHS(SEQ ID NO：7；L309D；Q311H；N434S)或DHY(SEQ ID NO：8；L309D；Q311H；N434Y)。
19.权利要求1至18中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域以小于约550nM的KD值结合FcRn。
20.权利要求19所述的多肽，其中所述Fc结构域以小于约250nM的KD值结合FcRn。
21.权利要求19所述的多肽，其中所述Fc结构域以小于约125nM的KD值结合FcRn。
22.权利要求1至21中任一项所述的多肽，其还包含非Fc受体(非FcR)结合结构域。
23.权利要求22所述的多肽，其中所述非FcR结合结构域是Ig可变结构域。
24.权利要求23所述的多肽，其中所述多肽是全长抗体。
25.权利要求24所述的多肽，其中所述抗体是激动性抗体。
26.权利要求24所述的多肽，其中所述抗体是拮抗性抗体。
27.权利要求24所述的多肽，其中所述抗体选择性结合Her2/neu、CD20、CD40、IL-10、4-
1BB、PD-1、PD-L1、CTLA-4OX40、IL-1、IL-6、IL6R、TNFα、RANKL、EGFR、c-Met、CD11a、VEGF-A、VEGFR1、VEGFR2、C5或整合素-α4。
28.权利要求1至27中任一项所述的多肽，其中所述抗体与毒素化学缀合或共价结合。
29.权利要求22所述的多肽，其中所述非FcR结合区不是抗体的抗原结合位点。
30.权利要求22所述的多肽，其中所述非FcR结合区结合细胞表面蛋白。
31.权利要求22所述的多肽，其中所述非FcR结合区结合可溶性蛋白。
32.核酸，其编码权利要求1至31的任意多肽。
33.权利要求32所述的核酸，其中所述核酸是DNA片段。
34.权利要求32所述的核酸，其中所述核酸是表达载体。
35.宿主细胞，其包含权利要求32至34中任一项所述的核酸。
36.权利要求35所述的宿主细胞，其中所述细胞表达所述核酸。
37.用于制备多肽的方法，其包括：
a)获得根据权利要求36所述的宿主细胞；
b)在促进无糖基化多肽表达的条件下在培养物中孵育所述宿主细胞；以及
c)从所述宿主细胞中纯化表达的多肽。
38.权利要求37所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞或哺乳动物。
39.药物制剂，其包含在可药用载体中的权利要求1至31中任一项所述的多肽或权利要求32至34中任一项所述的核酸。
40.结合对象中蛋白质的方法，其包括向所述对象提供抗体，其中所述抗体结合所述蛋白质，并且包含根据权利要求1至31中任一项所述的Fc结构域。
41.权利要求40所述的方法，其中所述抗体能够以小于约500nM的KD特异性结合人FcRn。
42.权利要求41所述的方法，其中所述抗体能够以小于约250nM的KD特异性结合人FcRn。
43.权利要求42所述的方法，其中所述抗体能够以小于约125nM的KD特异性结合人FcRn。
44.权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述抗体是糖基化的，并且其中所述Fc结构域具有与野生型相比大致等价或等价的与FcγRI、FcγRII和FcγRIII的结合。
45.权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述抗体是糖基化治疗性抗体。
46.权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述抗体是无糖基化形式的治疗性抗体。
47.治疗患有疾病的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求39所述的制剂。
48.权利要求47所述的方法，其中所述方法诱导抗体依赖性细胞毒性。
49.权利要求47所述的方法，其中所述疾病是癌症、感染或自身免疫病。
50.权利要求47所述的方法，其中所述对象是人患者。
51.权利要求47所述的方法，其中所述制剂以以下方式施用：肿瘤内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、结膜下、囊内、黏膜、心包内、脐内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管或通过灌洗。
52.权利要求47至51中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症，并且其中所述方法还包括向所述对象施用至少第二抗癌疗法。
53.权利要求52所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
54.根据权利要求1至31中任一项所述的多肽，其用于治疗疾病。
55.权利要求54所述的多肽，其中所述疾病是癌症、感染或自身免疫病。
56.权利要求54所述的多肽，其中所述疾病是细菌感染或病毒感染。
57.根据权利要求1至31中任一项所述的多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为例如癌症、感染、细菌感染、病毒感染或自身免疫病。
58.可药用组合物，其包含根据权利要求1至31中任一项所述的多肽和可药用赋形剂。
59.用于在有此需要的对象中治疗疾病的方法中的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至31中任一项所述的多肽。
60.权利要求59所述的组合物，其中所述疾病是癌症、感染、细菌感染、病毒感染或自身免疫病。
用于延长的血清半衰期的工程化抗体FC变体
[0001] 发明背景
[0004] 当前，市场上排名前25位的重组治疗性抗体的销售额远超过435亿美元/年，并且从2010年到2015年的预期年增长率为9.2％，预计到2015年将增加到627亿美元/年(Elvin
et al.，2013)。单克隆抗体(mAb)构成了目前临床中重组蛋白质的大部分，在美国或欧盟有
1064种产品正在进行公司赞助的临床试验，其中164种处于III期(Elvin et al.，2013)。就
治疗焦点而言，mAb市场主要集中于肿瘤学和炎性疾病，并且在预测期内，这些治疗领域内
的产品将继续成为关键的增长动力。作为一个整体，与小分子药物相比，基因工程化mAb通
常具有更高的FDA批准成功的可能性。至少50家生物技术公司和所有主要制药公司都已制
定了主动抗体发现计划。1975年，Milstein和Kohler首次报道了用于分离和生产mAb的最初
方法(Kohler和Milstein 1975)，并且其涉及小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，从而产生
小鼠杂交瘤。治疗性鼠mAb在二十世纪八十年代初期进入临床研究；然而，由于患者的人抗
小鼠抗体(HAMA)的产生而导致功效不足和快速清除的问题变得明显。这些问题以及与该技
术相关的时间和成本消耗成为推动mAb生产技术发展的驱动力。聚合酶链式反应(PCR)有助
于直接从经免疫动物的淋巴细胞克隆单克隆抗体基因，以及在细菌中表达抗体片段组合文
库(Orlandi et al.，1989)。后来的文库完全通过体外克隆技术使用具有重排的互补决定
区3(CDR3)的幼稚基因(naive gene)产生(Griffths和Duncan 1998；Hoogenboom et al.，
1998)。结果，具有期望特异性的抗体片段的分离不再依赖于相应抗原的免疫原性。这些优
点促进了针对包括小分子化合物(半抗原)(Hoogenboom和Winter 1992)、分子复合物
(Chames et al.，2000)、不稳定化合物(Kjaer et al.，1998)和细胞表面蛋白(Desai et
al.，1998)在内的许多独特抗原的抗体片段的开发。
et al.，2013)。单克隆抗体(mAb)构成了目前临床中重组蛋白质的大部分，在美国或欧盟有
1064种产品正在进行公司赞助的临床试验，其中164种处于III期(Elvin et al.，2013)。就
治疗焦点而言，mAb市场主要集中于肿瘤学和炎性疾病，并且在预测期内，这些治疗领域内
的产品将继续成为关键的增长动力。作为一个整体，与小分子药物相比，基因工程化mAb通
常具有更高的FDA批准成功的可能性。至少50家生物技术公司和所有主要制药公司都已制
定了主动抗体发现计划。1975年，Milstein和Kohler首次报道了用于分离和生产mAb的最初
方法(Kohler和Milstein 1975)，并且其涉及小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，从而产生
小鼠杂交瘤。治疗性鼠mAb在二十世纪八十年代初期进入临床研究；然而，由于患者的人抗
小鼠抗体(HAMA)的产生而导致功效不足和快速清除的问题变得明显。这些问题以及与该技
术相关的时间和成本消耗成为推动mAb生产技术发展的驱动力。聚合酶链式反应(PCR)有助
于直接从经免疫动物的淋巴细胞克隆单克隆抗体基因，以及在细菌中表达抗体片段组合文
库(Orlandi et al.，1989)。后来的文库完全通过体外克隆技术使用具有重排的互补决定
区3(CDR3)的幼稚基因(naive gene)产生(Griffths和Duncan 1998；Hoogenboom et al.，
1998)。结果，具有期望特异性的抗体片段的分离不再依赖于相应抗原的免疫原性。这些优
点促进了针对包括小分子化合物(半抗原)(Hoogenboom和Winter 1992)、分子复合物
(Chames et al.，2000)、不稳定化合物(Kjaer et al.，1998)和细胞表面蛋白(Desai et
al.，1998)在内的许多独特抗原的抗体片段的开发。
[0005] 一种用于筛选大型抗体组合文库以鉴定以期望亲和力与配体结合的克隆的方法涉及在细菌细胞并且更具体地大肠杆菌表面上表达和展示抗体片段或全长抗体。将展示抗
体或抗体片段的细胞与荧光标记的配体溶液一起孵育，并通过流式细胞术分离那些凭借其
表面上展示的抗体结合所述配体的细胞。特别地，锚定周质表达(Anchored Periplasmic
Expression，APEx)是基于将抗体片段锚定在大肠杆菌内膜的周质面上，然后破坏外膜，与
荧光标记的靶标一起孵育以及对原生质球进行分选(美国专利号7,094,571，Harvey et
al.，2004；Harvey et al.，2006)。
体或抗体片段的细胞与荧光标记的配体溶液一起孵育，并通过流式细胞术分离那些凭借其
表面上展示的抗体结合所述配体的细胞。特别地，锚定周质表达(Anchored Periplasmic
Expression，APEx)是基于将抗体片段锚定在大肠杆菌内膜的周质面上，然后破坏外膜，与
荧光标记的靶标一起孵育以及对原生质球进行分选(美国专利号7,094,571，Harvey et
al.，2004；Harvey et al.，2006)。
[0006] 在人血清蛋白质中，白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)具有比人中的其他血清蛋白质更长的血清半衰期(～3周)。已知新生儿Fc受体(FcRn)发挥许多重要的生物学功能，例如再循
环和胞吞转运过程，从而导致IgG在人体内约21天的极长的血清持久性(Challa et al.，
2014)。IgG的这种细胞间运输可以调节其体内稳态，从而通过阻止IgG细胞内降解而导致体
内降低的清除率和延长的半衰期(Ober et al.，2004；Ward et al.，2015)。在几乎所有细
胞类型中，FcRn主要定位于细胞内囊泡，例如早期和再循环内体和分选小管(sorting
tubule)，并且FcRn的表达水平在细胞表面上受到限制(Ober et al.，2004)。此外，IgG-
FcRn相互作用在酸性pH下是最佳的，但在中性pH下损失。因此，公认的FcRn介导的IgG再循
环模型是IgG通过非特异性胞饮作用内化，并且IgG在酸性内体(～pH 6.0)中与FcRn结合，
并被回收回到细胞表面(生理pH 7.4)，以维持血液中IgG的高血清水平(Ghetie et al.，
1996；Ghetie和Ward，2000；Israel et al.，1996；Kim et al.，1999；Martin et al.，2001；
Roopenian和Akilesh，2007；Roopenian gt al.，2003)。但是，未在细胞表面与FcRn解离的IgG注定要进行溶酶体降解，因为其从转运回收到溶酶体，或者在受体周转(receptor
turnover)期间被分解代谢(Gan et al.，2009)。
环和胞吞转运过程，从而导致IgG在人体内约21天的极长的血清持久性(Challa et al.，
2014)。IgG的这种细胞间运输可以调节其体内稳态，从而通过阻止IgG细胞内降解而导致体
内降低的清除率和延长的半衰期(Ober et al.，2004；Ward et al.，2015)。在几乎所有细
胞类型中，FcRn主要定位于细胞内囊泡，例如早期和再循环内体和分选小管(sorting
tubule)，并且FcRn的表达水平在细胞表面上受到限制(Ober et al.，2004)。此外，IgG-
FcRn相互作用在酸性pH下是最佳的，但在中性pH下损失。因此，公认的FcRn介导的IgG再循
环模型是IgG通过非特异性胞饮作用内化，并且IgG在酸性内体(～pH 6.0)中与FcRn结合，
并被回收回到细胞表面(生理pH 7.4)，以维持血液中IgG的高血清水平(Ghetie et al.，
1996；Ghetie和Ward，2000；Israel et al.，1996；Kim et al.，1999；Martin et al.，2001；
Roopenian和Akilesh，2007；Roopenian gt al.，2003)。但是，未在细胞表面与FcRn解离的IgG注定要进行溶酶体降解，因为其从转运回收到溶酶体，或者在受体周转(receptor
turnover)期间被分解代谢(Gan et al.，2009)。
[0007] 由于Fc与FcRn结合的生理重要性以及Fc与具有治疗性抗体的FcRn结合的重要性，因此对通过增强对FcRn的pH依赖性结合而具有延长的血清半衰期的新Fc结构域具有明显
需求。
需求。
发明内容
[0008] 在一些方面，本发明通过提供对FcRn表现出增强的pH依赖性亲和力的Fc结构域变体，克服了现有技术中的限制。如以下实例中所示，提供了工程化的突变体IgG Fc结构域，
其在酸性pH下以远超过野生型人IgG的亲和力与FcRn结合，并且在一些方面，进一步观察到
突变体Fc结构域在生理pH(生理pH 7.4)下具有非常低的至可忽略不计的或不可检出的与
FcRn的结合。这样的高pH选择性FcRn亲和力对于延长血清半衰期是非常理想的。
其在酸性pH下以远超过野生型人IgG的亲和力与FcRn结合，并且在一些方面，进一步观察到
突变体Fc结构域在生理pH(生理pH 7.4)下具有非常低的至可忽略不计的或不可检出的与
FcRn的结合。这样的高pH选择性FcRn亲和力对于延长血清半衰期是非常理想的。
[0009] 在本发明的一些方面，提供了用于分离对FcRn表现出在酸性pH下的增强的亲和力和pH选择性的抗体Fc结构域的方法。在本发明的另一方面，提供了IgG1 Fc结构域中的特定
突变和突变的组合，其可以导致对FcRn的pH选择性结合和/或提高的亲和力。
突变和突变的组合，其可以导致对FcRn的pH选择性结合和/或提高的亲和力。
[0010] 更具体地，在一些实施方案中，提供了突变体或变体人Fc结构域，与相应的野生型Fc结构域相比，其对于FcRn表现出：(i)在pH 5.8下增强的结合，以及(ii)在pH 7.4下降低
的结合或不可检出的结合。突变体或变体Fc结构域可以是突变体或变体IgG结构域。突变体
或变体Fc结构域可包含在多肽(例如抗体)中。在一些实施方案中，突变体或变体Fc结构域
可包含在治疗性抗体(例如激动性或拮抗性抗体)中。在一些实施方案中，存在组合物，其包
含具有来源于人IgG1-4抗体的突变体或变体Fc结构域(“抗体Fc结构域”)的多肽。突变体Fc
结构域可以是野生型人IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：1)的变体，其中突变体或变体Fc结构域
能够在酸性pH下以提高的亲和力与FcRn结合，但是在中性pH下不能。在一些实施方案中，工
程化Fc结构域可表现出提高的对FcRn的亲和力，例如比糖基化的野生型Fc结构域高约5倍。
在另一些实施方案中，提供了所有其他野生型IgG亚类(人IgG2、IgG3和IgG4)的突变体人Fc
结构域，其在酸性pH下能够以提高的亲和力与FcRn结合，并且在中性pH下不能。相对于野生
型人IgG1 Fc(SEQ ID NO：1)、人IgG2 Fc(SEQ ID NO：2)、人IgG3 Fc(SEQ ID NO：3)或人
IgG4 Fc(SEQ ID NO：4)，突变体或变体Fc结构域可包含突变(L/V309D、Q311H、N434S/Y)和
任选地(V264E)，以提高突变体或变体Fc在酸性pH(例如，pH 5.8)下与FcRn的结合，而不在
生理pH值(pH 7.4)下。例如，在人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中进行了突变(L/V309D、Q311H、N434S)，分别产生了SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。如上所述，在酸性pH下与FcRn结合的这些改变可以改善蛋白质的药代动力学和/或延长血清半衰期。
如在以下实例中观察到的，在人FcRn转基因小鼠模型中观察到工程化Fc结构域表现出延长
的血清半衰期。
的结合或不可检出的结合。突变体或变体Fc结构域可以是突变体或变体IgG结构域。突变体
或变体Fc结构域可包含在多肽(例如抗体)中。在一些实施方案中，突变体或变体Fc结构域
可包含在治疗性抗体(例如激动性或拮抗性抗体)中。在一些实施方案中，存在组合物，其包
含具有来源于人IgG1-4抗体的突变体或变体Fc结构域(“抗体Fc结构域”)的多肽。突变体Fc
结构域可以是野生型人IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：1)的变体，其中突变体或变体Fc结构域
能够在酸性pH下以提高的亲和力与FcRn结合，但是在中性pH下不能。在一些实施方案中，工
程化Fc结构域可表现出提高的对FcRn的亲和力，例如比糖基化的野生型Fc结构域高约5倍。
在另一些实施方案中，提供了所有其他野生型IgG亚类(人IgG2、IgG3和IgG4)的突变体人Fc
结构域，其在酸性pH下能够以提高的亲和力与FcRn结合，并且在中性pH下不能。相对于野生
型人IgG1 Fc(SEQ ID NO：1)、人IgG2 Fc(SEQ ID NO：2)、人IgG3 Fc(SEQ ID NO：3)或人
IgG4 Fc(SEQ ID NO：4)，突变体或变体Fc结构域可包含突变(L/V309D、Q311H、N434S/Y)和
任选地(V264E)，以提高突变体或变体Fc在酸性pH(例如，pH 5.8)下与FcRn的结合，而不在
生理pH值(pH 7.4)下。例如，在人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中进行了突变(L/V309D、Q311H、N434S)，分别产生了SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。如上所述，在酸性pH下与FcRn结合的这些改变可以改善蛋白质的药代动力学和/或延长血清半衰期。
如在以下实例中观察到的，在人FcRn转基因小鼠模型中观察到工程化Fc结构域表现出延长
的血清半衰期。
[0011] 在一些方面，提供了用于分离对FcRn表现出提高的亲和力和pH选择性的抗体Fc结构域的方法。所述抗体Fc结构域可包含一个或更多个如本文所述的特定替换突变或替换突
变的组合，例如，以影响Fc结构域对FcRn的结合或者选择性的和提高的亲和力。
变的组合，例如，以影响Fc结构域对FcRn的结合或者选择性的和提高的亲和力。
[0012] 在一些实施方案中，存在组合物，其包含具有来自人IgG1抗体的Fc结构域(“抗体Fc结构域”)的多肽。在另一些实施方案中，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：1)的
变体或突变体，其可以表现出与FcRn的提高的或pH选择性的结合。在一些实施方案中，工程
化Fc结构域的氨基酸替换(突变L/V309D、Q311H和N434S/Y；以及任选的V264E)当引入其他
IgG亚类(IgG2、IgG3和IgG4)中时导致以下两者：(i)与FcRn的pH选择性结合以及(ii)在酸
性pH下增强的与FcRn的结合。在一些实施方案中，与具有野生型Fc结构域的多肽相比，本文
提供的工程化的Fc结构域可表现出3倍至5倍或更高的对于FcRn提高的亲和力(例如对于
FcRn的至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或5.5倍更高的增强的KD)。
变体或突变体，其可以表现出与FcRn的提高的或pH选择性的结合。在一些实施方案中，工程
化Fc结构域的氨基酸替换(突变L/V309D、Q311H和N434S/Y；以及任选的V264E)当引入其他
IgG亚类(IgG2、IgG3和IgG4)中时导致以下两者：(i)与FcRn的pH选择性结合以及(ii)在酸
性pH下增强的与FcRn的结合。在一些实施方案中，与具有野生型Fc结构域的多肽相比，本文
提供的工程化的Fc结构域可表现出3倍至5倍或更高的对于FcRn提高的亲和力(例如对于
FcRn的至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或5.5倍更高的增强的KD)。
[0013] 抗体Fc结构域可以是IgG抗体或其变体的Fc结构域。此外，抗体Fc结构域可以限定为人Fc结构域。在某些方面，Fc结构域可以是IgG1 Fc结构域，例如抗HER2抗体的Fc结构域。
还预期了多肽可包含与非来源于抗体分子的多肽融合的本文公开的工程化Fc结构域的融
合体。
还预期了多肽可包含与非来源于抗体分子的多肽融合的本文公开的工程化Fc结构域的融
合体。
[0014] 在一些实施方案中，包含抗体Fc结构域的多肽包含特定的氨基酸替换。在一些实施方案中，在来自以下所列的一个或更多个位置处具有多个氨基酸替换(264、309、311和
434)；(309、311和434)。在一些实施方案中，工程化Fc结构域可在这些位置中的2个、3个、4个或全部处具有替换突变。Fc结构域可以是糖基化的或无糖基化的。例如，包含在第264位
的突变(例如，V264E)可导致无糖基化的Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1的抗体Fc结构
域可以是第309位氨基酸处被天冬氨酸替换(L309D)，第311位氨基酸处的组氨酸替换
(Q311H)，第434位氨基酸处的丝氨酸或酪氨酸替换(N434S/Y)，或其这些替换的组合。任选
地，Fc结构域IgG1可进一步包含第264位氨基酸处的谷氨酸替换(V264E)。在另一些优选的
实施方案中，抗体Fc结构域(例如IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)可包含第309位氨基酸处被
天冬氨酸替换(V309D)，第311位氨基酸处的组氨酸替换(Q311H)，第434位氨基酸处的丝氨
酸或酪氨酸替换(N434S/Y)，或其这些替换的组合。任选地，Fc结构域IgG1可进一步包含第
264位氨基酸处的谷氨酸替换(V264E)。
434)；(309、311和434)。在一些实施方案中，工程化Fc结构域可在这些位置中的2个、3个、4个或全部处具有替换突变。Fc结构域可以是糖基化的或无糖基化的。例如，包含在第264位
的突变(例如，V264E)可导致无糖基化的Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1的抗体Fc结构
域可以是第309位氨基酸处被天冬氨酸替换(L309D)，第311位氨基酸处的组氨酸替换
(Q311H)，第434位氨基酸处的丝氨酸或酪氨酸替换(N434S/Y)，或其这些替换的组合。任选
地，Fc结构域IgG1可进一步包含第264位氨基酸处的谷氨酸替换(V264E)。在另一些优选的
实施方案中，抗体Fc结构域(例如IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)可包含第309位氨基酸处被
天冬氨酸替换(V309D)，第311位氨基酸处的组氨酸替换(Q311H)，第434位氨基酸处的丝氨
酸或酪氨酸替换(N434S/Y)，或其这些替换的组合。任选地，Fc结构域IgG1可进一步包含第
264位氨基酸处的谷氨酸替换(V264E)。
[0015] 本发明的一个方面涉及包含能够在酸性pH下结合人FcRn的突变体或变体人IgG Fc结构域的多肽，其中所述Fc结构域具有以下替换突变：(i)第309位的天冬氨酸(L/
V309D)；(ii)第311位的组氨酸(Q311H)；和(iii)第434位的替换突变(N434)。第434位的替
换突变可以是丝氨酸(N434S)或酪氨酸(N434Y)。Fc结构域可以是糖基化的。在一些实施方
案中，所述Fc结构域具有与野生型相比基本上等价、基本上相同、大致相同、或相同的与Fc
γR的结合。在一些实施方案中，所述Fc结构域具有与野生型相比基本上等价、基本上相同、大致相同、相同或等价的与FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的1种、2种或全部的结合能力。在酸性pH下，Fc结构域可以以比野生型更高的亲和力结合FcRn。在一些实施方案中，在中性pH
下，Fc结构域不与FcRn可检出地或选择性地结合，或者不表现出或基本上不表现出与FcRn
的结合。在一些实施方案中，与野生型相比，Fc结构域表现出：(i)在pH 5.8下增强的与FcRn的结合，以及(ii)在pH 7.4下降低的与FcRn的结合或没有可检出的与FcRn的结合。Fc结构
域可以是无糖基化的。例如，在一些实施方案中，Fc结构域可以具有在第264位的谷氨酸的
替换突变(V264E)。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，Fc结构域包含以下或由以下组成：EDHS(V264E、L309D、Q311H和N434S；例如SEQ ID NO：5)、EDHY(V264E、
L309D、Q311H和N434Y；例如SEQ ID NO：6)、DHS(L309D、Q311H和N434S；例如SEQ ID NO：7)、DHY(L309D、Q311H和N434Y；例如SEQ ID NO：8)、IgG2-DHS(V309D、Q311H和N434S；SEQ ID NO：9)、IgG3-DHS(L309D、Q311H和N434S；SEQ ID NO：10)、或IgG4-DHS(L309D、Q311H和
N434S；SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，Fc结构域包含或由以下组成：DHS(L309D、Q311H和N434S；例如SEQ ID NO：7)或DHY(L309D、Q311H和N434Y；例如SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中，Fc结构域以小于约550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、
225、200、175、150、125或100nM的KD值结合FcRn(例如，在pH 5.8下)。该多肽还可包含非Fc受体(非FcR)结合结构域。非FcR结合结构域可以是Ig可变结构域。该多肽可以是全长抗体。
在一些实施方案中，抗体是激动性抗体或拮抗性抗体。在一些实施方案中，抗体选择性结合
Her2/neu、CD20、CD40、IL-10、4-1BB、PD-1、PD-L1、CTLA-4OX40、IL-1、IL-6、IL6R、TNFα、RANKL、EGFR、c-Met、CD11a、VEGF-A、VEGFR1、VEGFR2、C5或整合素-α4(Integrain-α4)。抗体可与毒素化学缀合或共价结合。在一些实施方案中，非FcR结合区不是抗体的抗原结合位
点。在一些实施方案中，非FcR结合区结合细胞表面蛋白。在一些实施方案中，非FcR结合区
结合可溶性蛋白。
V309D)；(ii)第311位的组氨酸(Q311H)；和(iii)第434位的替换突变(N434)。第434位的替
换突变可以是丝氨酸(N434S)或酪氨酸(N434Y)。Fc结构域可以是糖基化的。在一些实施方
案中，所述Fc结构域具有与野生型相比基本上等价、基本上相同、大致相同、或相同的与Fc
γR的结合。在一些实施方案中，所述Fc结构域具有与野生型相比基本上等价、基本上相同、大致相同、相同或等价的与FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的1种、2种或全部的结合能力。在酸性pH下，Fc结构域可以以比野生型更高的亲和力结合FcRn。在一些实施方案中，在中性pH
下，Fc结构域不与FcRn可检出地或选择性地结合，或者不表现出或基本上不表现出与FcRn
的结合。在一些实施方案中，与野生型相比，Fc结构域表现出：(i)在pH 5.8下增强的与FcRn的结合，以及(ii)在pH 7.4下降低的与FcRn的结合或没有可检出的与FcRn的结合。Fc结构
域可以是无糖基化的。例如，在一些实施方案中，Fc结构域可以具有在第264位的谷氨酸的
替换突变(V264E)。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，Fc结构域包含以下或由以下组成：EDHS(V264E、L309D、Q311H和N434S；例如SEQ ID NO：5)、EDHY(V264E、
L309D、Q311H和N434Y；例如SEQ ID NO：6)、DHS(L309D、Q311H和N434S；例如SEQ ID NO：7)、DHY(L309D、Q311H和N434Y；例如SEQ ID NO：8)、IgG2-DHS(V309D、Q311H和N434S；SEQ ID NO：9)、IgG3-DHS(L309D、Q311H和N434S；SEQ ID NO：10)、或IgG4-DHS(L309D、Q311H和
N434S；SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，Fc结构域包含或由以下组成：DHS(L309D、Q311H和N434S；例如SEQ ID NO：7)或DHY(L309D、Q311H和N434Y；例如SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中，Fc结构域以小于约550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、
225、200、175、150、125或100nM的KD值结合FcRn(例如，在pH 5.8下)。该多肽还可包含非Fc受体(非FcR)结合结构域。非FcR结合结构域可以是Ig可变结构域。该多肽可以是全长抗体。
在一些实施方案中，抗体是激动性抗体或拮抗性抗体。在一些实施方案中，抗体选择性结合
Her2/neu、CD20、CD40、IL-10、4-1BB、PD-1、PD-L1、CTLA-4OX40、IL-1、IL-6、IL6R、TNFα、RANKL、EGFR、c-Met、CD11a、VEGF-A、VEGFR1、VEGFR2、C5或整合素-α4(Integrain-α4)。抗体可与毒素化学缀合或共价结合。在一些实施方案中，非FcR结合区不是抗体的抗原结合位
点。在一些实施方案中，非FcR结合区结合细胞表面蛋白。在一些实施方案中，非FcR结合区
结合可溶性蛋白。
[0016] 本发明的另一方面涉及编码本发明或如上所述的任何多肽的核酸。核酸可以是DNA片段。在一些实施方案中，核酸是表达载体。
[0017] 本发明的另一方面涉及包含本发明或如上所述的核酸的宿主细胞。所述细胞可以表达核酸。
[0018] 本发明的另一方面涉及用于制备多肽的方法，其包括：a)获得本发明或如上所述的宿主细胞；b)在促进无糖基化多肽表达的条件下在培养物中孵育宿主细胞；以及c)从宿
主细胞中纯化表达的多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或哺乳动物细胞。
主细胞中纯化表达的多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或哺乳动物细胞。
[0019] 本发明的另一方面涉及药物制剂，其包含在可药用载体中的本发明或如上所述的多肽，或者本发明或如上所述的核酸。
[0020] 本发明的另一方面涉及结合对象中蛋白质的方法，其包括向对象提供抗体，其中所述抗体结合所述蛋白质，并且包含本发明或如上所述的Fc结构域。在一些实施方案中，所
述抗体能够以小于约550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、
200、175、150、125或100nM的KD特异性结合人FcRn。在一些实施方案中，所述抗体是糖基化的，并且其中所述Fc结构域具有与野生型相比大致等价或等价的与FcγRI、FcγRII和Fcγ
RIII的结合。在一些实施方案中，抗体是糖基化治疗性抗体。在一些实施方案中，抗体是无
糖基化形式的治疗性抗体。
述抗体能够以小于约550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、
200、175、150、125或100nM的KD特异性结合人FcRn。在一些实施方案中，所述抗体是糖基化的，并且其中所述Fc结构域具有与野生型相比大致等价或等价的与FcγRI、FcγRII和Fcγ
RIII的结合。在一些实施方案中，抗体是糖基化治疗性抗体。在一些实施方案中，抗体是无
糖基化形式的治疗性抗体。
[0021] 本发明的另一方面涉及治疗患有疾病的对象的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本发明或如上所述的制剂。所述方法可诱导抗体依赖性细胞毒性。在一些实施方案
中，所述疾病是癌症、感染或自身免疫病(例如类风湿性关节炎)。对象可以是人患者。制剂
可以以下方式施用：肿瘤内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、结膜下、囊内(intravesicularlly)、黏膜、心包内、脐内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管或通过灌洗。在一些实施方案中，所述疾病
是癌症，并且其中所述方法还包括向所述对象施用至少第二抗癌疗法。第二抗癌疗法可以
是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。所述疾病可包括肿瘤，例如实体瘤或血液学肿瘤。
中，所述疾病是癌症、感染或自身免疫病(例如类风湿性关节炎)。对象可以是人患者。制剂
可以以下方式施用：肿瘤内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、结膜下、囊内(intravesicularlly)、黏膜、心包内、脐内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管或通过灌洗。在一些实施方案中，所述疾病
是癌症，并且其中所述方法还包括向所述对象施用至少第二抗癌疗法。第二抗癌疗法可以
是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。所述疾病可包括肿瘤，例如实体瘤或血液学肿瘤。
[0022] 在一个实施方案中，提供了包含本实施方案的变体Fc结构域或编码本实施方案的变体Fc结构域的核酸的组合物，其用于治疗疾病(例如，癌症、感染、自身免疫病、细菌感染或病毒感染)。治疗疾病可涉及结合选择的蛋白质以达到治疗效果(例如，由于毒素的结合
或激动性抗体对受体的刺激等)，同时产生降低的免疫激活或降低的补体依赖性细胞毒性。
在一些方面，所述疾病可以是癌症、自身免疫病、炎性疾病或感染性疾病。在另一个实施方
案中，提供了根据本发明实施方案的多肽或编码根据本发明实施方案的多肽的核酸在制备
用于治疗疾病(例如癌症)的药物中的用途。
或激动性抗体对受体的刺激等)，同时产生降低的免疫激活或降低的补体依赖性细胞毒性。
在一些方面，所述疾病可以是癌症、自身免疫病、炎性疾病或感染性疾病。在另一个实施方
案中，提供了根据本发明实施方案的多肽或编码根据本发明实施方案的多肽的核酸在制备
用于治疗疾病(例如癌症)的药物中的用途。
[0023] 在一些实施方案中，提供了包含根据本发明或如上所述的多肽和可药用赋形剂的可药用组合物。在一些实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗疾病的方法中的
组合物，所述组合物包含根据本发明或如上所述的多肽。所述疾病可以是癌症、感染、细菌
感染、病毒感染或自身免疫病。
组合物，所述组合物包含根据本发明或如上所述的多肽。所述疾病可以是癌症、感染、细菌
感染、病毒感染或自身免疫病。
[0024] 变体Fc结构域多肽(也称为突变体或工程化Fc结构域)可以被表征为与未经修饰的多肽(例如，野生型Fc结构域多肽，例如野生型IgG Fc结构域或人野生型IgG Fc结构域)
或本文公开的任何多肽序列相比具有一定百分比的同一性。经修饰的多肽的未经修饰的部
分(即，排除任何指定替换的经修饰的多肽的序列)与相应野生型多肽之间的百分比同一性
可以为约至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％(或其中可推导出的任何范围)。例如，对于排除指定的替换突变(例如，L/V309D、Q311H和N434S/Y；以及任选的V264E)的变体Fc结构域的区域，变体Fc结构域与野生型Fc结构域(例如野生型人IgG
Fc结构域，例如SEQ ID NO：1-4中的任一个)相比可具有例如至少90％、至少约95％、至少
99％或100％序列同一性。除了突变体Fc结构域中指定的替换突变以外，变体Fc结构域与野
生型Fc结构域相比可包含其他突变。还预期了上文讨论的同一性百分比可涉及变体Fc结构
域多肽的整体与野生型Fc结构域(例如，人IgG Fc结构域)相比。例如，特征在于与野生型Fc
结构域具有至少90％同一性的变体Fc结构域多肽意指该变体多肽中至少90％的氨基酸与
野生型多肽中的氨基酸相同。
或本文公开的任何多肽序列相比具有一定百分比的同一性。经修饰的多肽的未经修饰的部
分(即，排除任何指定替换的经修饰的多肽的序列)与相应野生型多肽之间的百分比同一性
可以为约至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％(或其中可推导出的任何范围)。例如，对于排除指定的替换突变(例如，L/V309D、Q311H和N434S/Y；以及任选的V264E)的变体Fc结构域的区域，变体Fc结构域与野生型Fc结构域(例如野生型人IgG
Fc结构域，例如SEQ ID NO：1-4中的任一个)相比可具有例如至少90％、至少约95％、至少
99％或100％序列同一性。除了突变体Fc结构域中指定的替换突变以外，变体Fc结构域与野
生型Fc结构域相比可包含其他突变。还预期了上文讨论的同一性百分比可涉及变体Fc结构
域多肽的整体与野生型Fc结构域(例如，人IgG Fc结构域)相比。例如，特征在于与野生型Fc
结构域具有至少90％同一性的变体Fc结构域多肽意指该变体多肽中至少90％的氨基酸与
野生型多肽中的氨基酸相同。
[0025] 抗体Fc结构域可以是人IgG抗体的突变体或变体Fc结构域(例如Fc结构域可以是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域)。还预期了多肽可以包含与非来源于抗体分子的多肽
融合的如本文所公开的工程化变体Fc结构域的融合体。在一些实施方案中，本发明的工程
化Fc结构域包含在激动性抗体中，例如靶向CD40、死亡受体5(DR5)、PD-1或TNF受体(TNFR)
分子的抗体。
融合的如本文所公开的工程化变体Fc结构域的融合体。在一些实施方案中，本发明的工程
化Fc结构域包含在激动性抗体中，例如靶向CD40、死亡受体5(DR5)、PD-1或TNF受体(TNFR)
分子的抗体。
[0026] 在一些实施方案中，包含本文所述的变体Fc结构域的多肽可包含接头。在另一些实施方案中，所述接头是可缀合的接头。在一些实施方案中，多肽包含来自抗体的Fc结构
域。其可包含来自抗体的其他区域，例如另一结合结构域。在一些实施方案中，另外的结合
结构域可以不是FcR结合结构域。在一些实施方案中，多肽可包含来自抗体的抗原结合位点
或结构域，例如来自抗体的可变区的全部或一部分。多肽可包含来自抗体的Fc结构域和为
非FcR结合结构域的另一结合结构域。在一些实施方案中，非Fc结合区不是抗体的抗原结合
位点，但是特异性结合细胞表面蛋白或可溶性蛋白。在某些情况下，非Fc结合区识别的细胞
表面蛋白是受体，例如在细胞表面上表达的受体。
域。其可包含来自抗体的其他区域，例如另一结合结构域。在一些实施方案中，另外的结合
结构域可以不是FcR结合结构域。在一些实施方案中，多肽可包含来自抗体的抗原结合位点
或结构域，例如来自抗体的可变区的全部或一部分。多肽可包含来自抗体的Fc结构域和为
非FcR结合结构域的另一结合结构域。在一些实施方案中，非Fc结合区不是抗体的抗原结合
位点，但是特异性结合细胞表面蛋白或可溶性蛋白。在某些情况下，非Fc结合区识别的细胞
表面蛋白是受体，例如在细胞表面上表达的受体。
[0027] 其他多肽包括具有Fc结构域变体(例如，能够在酸性pH下增强与FcRn多肽的结合，而在生理或中性pH下表现出降低的或不可检出的与FcRn的结合)和为非Fc受体结合结构域
的第二结合结构域的那些，其中第二结合结构域能够特异性结合细胞表面分子或可溶性蛋
白。在一些实施方案中，第二结合结构域是抗体的抗原结合结构域(“Ig可变结构域”)。在一些方面，多肽可以是全长抗体。在一些情况下，第二结合结构域不是抗体抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第二结合结构域能够特异性结合为蛋白质或蛋白质分子的细胞表面分
子。在一些方面，第二结合结构域能够特异性结合可溶性蛋白。
的第二结合结构域的那些，其中第二结合结构域能够特异性结合细胞表面分子或可溶性蛋
白。在一些实施方案中，第二结合结构域是抗体的抗原结合结构域(“Ig可变结构域”)。在一些方面，多肽可以是全长抗体。在一些情况下，第二结合结构域不是抗体抗原结合结构域。
在一些实施方案中，第二结合结构域能够特异性结合为蛋白质或蛋白质分子的细胞表面分
子。在一些方面，第二结合结构域能够特异性结合可溶性蛋白。
[0028] 一些方面涉及编码本文讨论的任何多肽的核酸。核酸可以是分离的和/或重组的。其可以是分离的和/或重组的核酸片段。在一些实施方案中，核酸是DNA或RNA。在一些实施
方案中，核酸是DNA片段。在一些实施方案中，核酸是表达载体，所述表达载体能够表达特异性结合FcγRn的具有含一个或更多个替换的Fc结合结构域的任何多肽。核酸可以编码本文
中的一种或更多种多肽，取决于某些突变的存在与否以及多肽的产生方式，其可以是糖基
化的或可以不是糖基化的。
方案中，核酸是DNA片段。在一些实施方案中，核酸是表达载体，所述表达载体能够表达特异性结合FcγRn的具有含一个或更多个替换的Fc结合结构域的任何多肽。核酸可以编码本文
中的一种或更多种多肽，取决于某些突变的存在与否以及多肽的产生方式，其可以是糖基
化的或可以不是糖基化的。
[0029] 在一些实施方案中，核酸编码包含以下或由以下组成的多肽：如本文所述的能够pH选择性地结合FcRn的变体或突变体Fc结构域。可以将核酸放置(例如转染或转化)到可以
表达多肽(例如无糖基化形式的多肽)的宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌
细胞。或者，宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体，尽管其也可以包含第二表达载体。因为一些抗体由多种多肽构成，所以在
一些实施方案中可以利用包含表达多肽所需的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，
宿主细胞表达第一表达载体，所述第一表达载体编码包含免疫球蛋白重链(例如，包含在酸
性pH下以增强的亲和力结合FcRn但在中性pH下不结合的变体或突变体Fc结构域)或由免疫
球蛋白重链组成的多肽。在一些实施方案中，宿主细胞包含第二表达载体，所述第二表达载
体编码包含免疫球蛋白轻链或由免疫球蛋白轻链组成的多肽。宿主细胞可包含例如一种或
两种表达载体，以表达包含重链和轻链的抗体。
表达多肽(例如无糖基化形式的多肽)的宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌
细胞。或者，宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一表达载体，尽管其也可以包含第二表达载体。因为一些抗体由多种多肽构成，所以在
一些实施方案中可以利用包含表达多肽所需的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，
宿主细胞表达第一表达载体，所述第一表达载体编码包含免疫球蛋白重链(例如，包含在酸
性pH下以增强的亲和力结合FcRn但在中性pH下不结合的变体或突变体Fc结构域)或由免疫
球蛋白重链组成的多肽。在一些实施方案中，宿主细胞包含第二表达载体，所述第二表达载
体编码包含免疫球蛋白轻链或由免疫球蛋白轻链组成的多肽。宿主细胞可包含例如一种或
两种表达载体，以表达包含重链和轻链的抗体。
[0030] 在一些方面，提供了宿主细胞群，其中所述群包含表达具有不同Fc结构域的多肽的多个宿主细胞。预期任何两个不同的Fc结构域的氨基酸序列的同一性可以相差小于
20％、15％、10％、5％或更少。
20％、15％、10％、5％或更少。
[0031] 在一些方面，提供了制备本文所述的多肽(例如，具有在酸性pH下以增强的亲和力结合FcRn但在中性pH下不结合的Fc区的多肽)的方法以及使用这些多肽的方法。预期本文
所述或本领域普通技术人员已知的方法可产生或使用本文所述的任何多肽。
所述或本领域普通技术人员已知的方法可产生或使用本文所述的任何多肽。
[0032] 在一些实施方案中，方法涉及从上清液中纯化多肽。这可涉及使来自上清液的多肽经受过滤、HPLC、阴离子或阳离子交换、高效液相色谱法(HPLC)、亲和色谱法或其组合。在一些实施方案中，方法涉及使用结合IgG Fc区的葡萄球菌(staphylococcal)蛋白A的亲和
色谱法。其他纯化方法是本领域普通技术人员公知的。
色谱法。其他纯化方法是本领域普通技术人员公知的。
[0033] 在一些实施方案中，提供了包含在可药用载体中的本发明实施方案的多肽或核酸的药物制剂或包含赋形剂的药物制剂。
[0034] 在一些实施方案中，可以通过包括向对象提供或施用(例如静脉内等)抗体的方法在对象中诱导免疫应答，其中所述抗体包含如本文所述的在酸性pH下以增强的亲和力与
FcRn结合但是在中性pH或生理pH下不结合的Fc结构域。
FcRn结合但是在中性pH或生理pH下不结合的Fc结构域。
[0035] 在另一个实施方案中，可以通过施用治疗性多肽来治疗癌症、感染、自身免疫或炎性疾病，所述治疗性多肽包含如本文所述的在酸性pH下以增强的亲和力与FcRn结合但是在
中性pH或生理pH下不结合的变体或突变体Fc结构域。设想了与由包含野生型人IgG Fc区的
多肽诱导的CDC相比，包含本文所述的突变体或变体Fc结构域的多肽可表现出类似的补体
依赖性细胞毒性(CDC)。在另一个实施方案中，与野生型人IgG抗体相比，根据本发明的多肽
可以表现出类似的ADCC或ADCP。
中性pH或生理pH下不结合的变体或突变体Fc结构域。设想了与由包含野生型人IgG Fc区的
多肽诱导的CDC相比，包含本文所述的突变体或变体Fc结构域的多肽可表现出类似的补体
依赖性细胞毒性(CDC)。在另一个实施方案中，与野生型人IgG抗体相比，根据本发明的多肽
可以表现出类似的ADCC或ADCP。
[0036] 如本文所用，“pH选择性地结合FcRn”或“以pH选择性方式与FcRn结合”是指具有在酸性pH(例如pH 5.8)下结合FcRn的能力的多肽，例如Fc结构域(例如，突变体或变体IgG Fc结构域)的性质，并且优选地与野生型Fc结构域(例如野生型Fc IgG结构域)相比，所述多肽
或Fc结构域具有在酸性pH下显示出提高的与FcRn结合的能力。在一些实施方案中，pH选择
性地结合FcRn的Fc结构域或多肽还显示出在生理pH下与野生型(例如野生型IgG Fc结构
域)相比降低的与FcRn的结合，或者在生理pH下不可检出的FcRn结合。
或Fc结构域具有在酸性pH下显示出提高的与FcRn结合的能力。在一些实施方案中，pH选择
性地结合FcRn的Fc结构域或多肽还显示出在生理pH下与野生型(例如野生型IgG Fc结构
域)相比降低的与FcRn的结合，或者在生理pH下不可检出的FcRn结合。
[0037] 如本文所用，就指定组分而言，“基本上不含”在本文中意指没有将指定组分故意地配制到组合物中和/或其仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导
致的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不
能检测到指定组分的量的组合物。
致的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不
能检测到指定组分的量的组合物。
[0038] 如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为KD。结合结构域与其靶标的亲和力可以为例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM，约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)；或者，其可以为100nM至1nM或0.1nM至10nM。此外，当两种试剂之间存在在上述亲和力范围内的亲和力时，预期试剂特异性结合。
[0039] 如本文所用，就核酸而言，术语“编码”用于使本领域技术人员易于理解本发明；但是，这些术语可以分别与“包含”互换使用。
[0041] 权利要求中使用术语“或”来表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互斥的，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可表示至少第二或更多。
[0042] 在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于测量变量的设备、用于确定值的方法的误差的固有变化或在研究对象之间存在的变化。
[0043] 通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应该理解，详细说明和特定实例虽然指示了本发明的一些优选实施方案，但是其仅通过示例的方式给出，因为从该详细描述中，本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员
将是明显的。
附图说明
将是明显的。
附图说明
[0044] 以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述并参考这些附图中的一个或更多个，
可以更好地理解本发明。
可以更好地理解本发明。
[0045] 图1A-B.用于曲妥珠单抗轻链(图1A)和曲妥珠单抗重链(图1B)的细菌周质展示的两种质粒系统的简要图解。
[0046] 图2.IgG1的Fc结构域与FcRn-β2m的复合结构。基于FcRn-Fc复合结构(PDB ID：4N0U)(Oganesyan V.et al.，2014)突出显示了在FcRn附近的Fc结构域的相邻残基
Fc结构域中FcRn的相邻残基的侧链以突出的结构显示。Fc结构域中FcRn的相邻
残基用含有简并密码子的引物随机化。IgG1-Fc结构域(左)，FcRn-β2m(右)。
Fc结构域中FcRn的相邻残基的侧链以突出的结构显示。Fc结构域中FcRn的相邻
残基用含有简并密码子的引物随机化。IgG1-Fc结构域(左)，FcRn-β2m(右)。
[0047] 图3A-B.Fc文库的筛选策略和结果。图3A，用pH 5.8的单链FcRn(scFcRn)-APC标记然后用pH 7-4的二聚体FcRn-FITC标记展示IgG的原生质球。图3B，用FcRn筛选Fc文库五轮，
并示出了所得的FcRn结合活性。
并示出了所得的FcRn结合活性。
[0048] 图4.分离的Fc变体的FACS分析。用pH 5.8的10nM scFcRn-FITC或pH 7.4的50nM dFcRn-APC标记表达Fc变体的大肠杆菌原生质球。
[0049] 图5A-F.Herceptin(图4A)以及所选IgG变体EDH(图4B)、EDHY(图4C)、EDHS(图4D)、Herceptin-LS(图4E)、Herceptin-YTE(图4F)的表面等离激元共振(SPR)传感图。将每种抗
体固定在CM5芯片上，并将在pH5.8PBS中连续稀释的scFcRn蛋白注入CM5芯片中。
体固定在CM5芯片上，并将在pH5.8PBS中连续稀释的scFcRn蛋白注入CM5芯片中。
[0050] 图6.抗体变体与dFcRn在pH 7.4下的结合活性。将每种抗体包被在96孔中，并通过抗GST HRP检测dFcRn的结合活性。
[0051] 图7A-F.野生型Herceptin和选择的IgG变体Herceptin-EDHS对FcγR的ELISA结果；单体FcγRI(图7A)、二聚体FcγRIIAH131(图7B)、二聚体FcγRIIAR131(图7C)、二聚体FcγRIIB(图7D)、二聚体FcγRIIIAV157(图7E)和二聚体FcγRIIIAF157(图7F)。
[0052] 图8.Herceptin-DHS的表面等离激元共振(SPR)传感图。将抗体固定在CM5芯片上，并将在pH 5.8PBS中连续稀释的scFcRn蛋白注入CM5芯片中。
[0053] 图9.抗体变体与二聚体FcRn(dFcRn)在pH 7.4下的结合活性。将每种抗体包被在96孔中，并通过抗GST HRP检测dFcRn的结合活性。
[0054] 图10A-F.野生型Herceptin和选择的IgG变体Herceptin-DHS对FcγR的ELISA结果；单体FcγRI(图10A)、二聚体FcγRIIAH131(图10B)、二聚体FcγRIIAR131(图10C)、二聚体FcγRIIB(图10D)、二聚体FcγRIIIAV157(图10E)和二聚体FcγRIIIAF157(图10F)。
[0055] 图11A-B.Herceptin-DHS介导的ADCC和ADCP测定。对于每种测定，将抗体与Her2阳性SK-BR3细胞和PBMC或巨噬细胞一起孵育。
[0056] 图12.Herceptin、Herceptin-DHS、Herceptin-LS和Herceptin-YTE与三种不同密度的scFcRn的表面等离激元共振(SPR)传感图。将scFcRn以500RU、2000RU和4000RU三种不
同水平固定在CM5芯片上，并将在pH 7.4PBS中的连续稀释的抗体蛋白注入CM5芯片中。
同水平固定在CM5芯片上，并将在pH 7.4PBS中的连续稀释的抗体蛋白注入CM5芯片中。
[0057] 图13A-C.Herceptin、Herceptin-DHS、Herceptin-LS和Herceptin-YTE与三种不同密度的scFcRn的表面等离激元共振(SPR)传感图。将scFcRn以500RU、2000RU和4000RU三种
不同水平固定在CM5芯片上，并将具有不同pH的1μM抗体蛋白注入CM5芯片中。
不同水平固定在CM5芯片上，并将具有不同pH的1μM抗体蛋白注入CM5芯片中。
[0058] 图14.抗体在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
[0059] 图15A-F.IgG2(图15A)、IgG2-DHS(图15B)、IgG3(图15C)、IgG3-DHS(图15D)、IgG4(图15E)和IgG4-DHS(图15F)对于scFcRn的表面等离激元共振(SPR)测定。
[0060] 图16A-C.IgG2-DHS、IgG3-DHS和IgG4-DHS的ELISA测定。与其野生型IgG相比，IgG变体的FcγR结合活性。用IgG变体测定了400、80、16、3.2nM的FcγR。
[0061] 图17.抗体在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
[0062] 图18.抗体变体的SPR分析。将每种抗体固定在CM5芯片上，并以30μl/min注射连续稀释的FcγR或C1q。所有实验独立重复3次，并且每种抗体的动力学值列于表12中。
[0063] 图19.抗体在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学。
[0064] 图20：抗体变体的类风湿因子结合测定。
具体实施方式
[0065] 本文提供了涉及具有工程化抗体Fc结构域的多肽的方法和组合物，所述抗体Fc结构域显示出对FcRn的改善的pH依赖性结合。在一些优选的方面，在体内施用于哺乳动物对
象后，突变体Fc结构域可表现出改善的半衰期或降低的降解。如以下实例所示，在可存在于
多种抗体类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的糖基化或无糖基化抗体中的突变体Fc结构域
中，已观察到FcRn结合的这些改善。由于在一些情况下，无糖基化抗体与某些风险(例如免
疫原性、差的体内稳定性或不利的药代动力学)有关，因此在一些实施方案中，可能希望在
糖基化抗体中包含突变体Fc结构域。然而，无糖基化抗体可用于多种有用或治疗方法，因此
在无糖基化抗体中包含突变体Fc结构域也可产生益处，例如，无糖基化抗体的改善的体内
半衰期。在一些实施方案中，突变体Fc结构域在酸性pH下与FcRn结合，但是在中性pH下不与
FcRn结合，并且具有与野生型Fc结构域等价的FcγR结合能力。例如，多肽可包含突变体或
变体Fc结构域，其以pH选择性方式结合FcRn，同时具有与野生型等价的对于结合FcγRI、Fc
γRII和/或FcγRIII的结合能力。
象后，突变体Fc结构域可表现出改善的半衰期或降低的降解。如以下实例所示，在可存在于
多种抗体类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的糖基化或无糖基化抗体中的突变体Fc结构域
中，已观察到FcRn结合的这些改善。由于在一些情况下，无糖基化抗体与某些风险(例如免
疫原性、差的体内稳定性或不利的药代动力学)有关，因此在一些实施方案中，可能希望在
糖基化抗体中包含突变体Fc结构域。然而，无糖基化抗体可用于多种有用或治疗方法，因此
在无糖基化抗体中包含突变体Fc结构域也可产生益处，例如，无糖基化抗体的改善的体内
半衰期。在一些实施方案中，突变体Fc结构域在酸性pH下与FcRn结合，但是在中性pH下不与
FcRn结合，并且具有与野生型Fc结构域等价的FcγR结合能力。例如，多肽可包含突变体或
变体Fc结构域，其以pH选择性方式结合FcRn，同时具有与野生型等价的对于结合FcγRI、Fc
γRII和/或FcγRIII的结合能力。
[0066] I.抗体Fc结构域
[0067] 公知的是，在哺乳动物中，新生儿Fc受体(FcRn)在血清IgG水平的调节中起着中心作用(Ghetie，V.，和Ward，E.S.2000)。结合Fc的FcRn是异二聚体，其包含β2-微球蛋白(β2m)和与主要组织相容性复合物I类(MHC I类)分子的链相关的膜锚定链。IgG-FcRn相互作用表
现出显著的pH依赖性，从微酸性pH下的强相互作用到中性和碱性pH下的弱相互作用
(Rodewald，R.1976和Raghavan，M.et al.，1995)。普遍接受的FcRn介导的IgG再循环机制为以下过程。1)通过胞饮作用将IgG内化，2)内体的酸化(早期内体：～pH 6.0，晚期内体：～pH
4.5)以及IgG和FcRn的相互作用，3)胞吐作用以及IgG从FcRn解离，4)未释放的IgG通过胞吞
作用重新内化，5)溶酶体融合和IgG降解。结果，与其他血清蛋白相比，再循环的IgG表现出
明显延长的血清半衰期(Ghetie，V.et al.，1996和Borvak，J.et al.，1998)。在中性pH下保持与FcRn的显著结合的IgG具有显著降低的血清持久性(Dall'Acqua，W.F.et al.，2003)。
现出显著的pH依赖性，从微酸性pH下的强相互作用到中性和碱性pH下的弱相互作用
(Rodewald，R.1976和Raghavan，M.et al.，1995)。普遍接受的FcRn介导的IgG再循环机制为以下过程。1)通过胞饮作用将IgG内化，2)内体的酸化(早期内体：～pH 6.0，晚期内体：～pH
4.5)以及IgG和FcRn的相互作用，3)胞吐作用以及IgG从FcRn解离，4)未释放的IgG通过胞吞
作用重新内化，5)溶酶体融合和IgG降解。结果，与其他血清蛋白相比，再循环的IgG表现出
明显延长的血清半衰期(Ghetie，V.et al.，1996和Borvak，J.et al.，1998)。在中性pH下保持与FcRn的显著结合的IgG具有显著降低的血清持久性(Dall'Acqua，W.F.et al.，2003)。
[0068] 当由于持续的血清浓度、降低的施用频率和/或较低的成本而提高功效时，具有更长的血清半衰期的治疗性抗体是有益的。尽管操纵Fc-FcRn相互作用以延长血浆半衰期似
乎是明智的，但与FcRn的IgG转运功能相关的许多潜在生物学后果是公知的。特别地，该功
能包括IgG通过人胎盘(Firan et al.，2001)和肠(Israel et al.，1997和Dickinson et
al.，1999)的胞吞转运以及IgG在人肾中的重吸收(Haymann et al.，2000)。
乎是明智的，但与FcRn的IgG转运功能相关的许多潜在生物学后果是公知的。特别地，该功
能包括IgG通过人胎盘(Firan et al.，2001)和肠(Israel et al.，1997和Dickinson et
al.，1999)的胞吞转运以及IgG在人肾中的重吸收(Haymann et al.，2000)。
[0069] 基于FcRn介导的体内平衡，提高血清半衰期的Fc工程通常集中于增强在酸性pH下Fc对FcRn的亲和力并保持原始的pH依赖性结合特性。已开发了FcRn的许多工程化Fc变体，
例如包含M428L/N434S(LS)或M252Y/S254T/T256E(YTE)氨基酸替换的Fc结构域，并且LS和
YTE在内体pH值下显示出与野生型IgG1(WT)相比增强10至20倍的亲和力并且在pH7.4下没
有明显的亲和力，从而导致转基因人FcRn(hFcRn)小鼠、灵长类动物和/或人中延长的血清
半衰期(Acqua et al.，2002；Zalevsky et al.，2010；Ko et al.，2014；Deng et al.，
2010；Hinton et al.，2004和2006；Yeung et al.，2009和2010；Borrok et al.，2015；
Robbie et al.，2013)。值得注意的是，具有“YTE”变体的抗体正在一些临床试验中进行评估。具有“YTE”突变的抗体已显示具有长至3个月的血清半衰期，该特性可显著减少给药，使患者更好地依从并获得更好的治疗效果。然而，在酸性pH下较高的FcRn亲和力与血清半衰
期的提高没有明显相关性，并且在酸性pH下具有类似或更好的改善FcRn结合特性的某些工
程化变体未能显示出预期的体内半衰期延长(Borrok et al.，2015，Datta-Mannan et
al.，2007和2012，以及Zheng et al.，2011)。另一方面，与酸性pH下相比，抗体在中性pH下的亲和力显示出更好的与PK的相关性(Cooper et al.，2014和Wang et al.，2011)。基于
FcRn再循环机制，IgG在pH 7.4的亲和力是抗体再循环的关键因素。对于抗体在中性pH值下
的亲和力的准确和精确测量是非常关键的。近来，已报道尝试使用非常高水平的固定化
FcRn通过SPR在pH 7.4下测量抗体对FcRn的亲和力。通过高密度FcRn的动力学分析，YTE变
体在pH 7.4时显示出比野生型IgG1高约57倍的亲和力，而在低密度FcRn的测定中未显示
(Walters et al.，2016)。
例如包含M428L/N434S(LS)或M252Y/S254T/T256E(YTE)氨基酸替换的Fc结构域，并且LS和
YTE在内体pH值下显示出与野生型IgG1(WT)相比增强10至20倍的亲和力并且在pH7.4下没
有明显的亲和力，从而导致转基因人FcRn(hFcRn)小鼠、灵长类动物和/或人中延长的血清
半衰期(Acqua et al.，2002；Zalevsky et al.，2010；Ko et al.，2014；Deng et al.，
2010；Hinton et al.，2004和2006；Yeung et al.，2009和2010；Borrok et al.，2015；
Robbie et al.，2013)。值得注意的是，具有“YTE”变体的抗体正在一些临床试验中进行评估。具有“YTE”突变的抗体已显示具有长至3个月的血清半衰期，该特性可显著减少给药，使患者更好地依从并获得更好的治疗效果。然而，在酸性pH下较高的FcRn亲和力与血清半衰
期的提高没有明显相关性，并且在酸性pH下具有类似或更好的改善FcRn结合特性的某些工
程化变体未能显示出预期的体内半衰期延长(Borrok et al.，2015，Datta-Mannan et
al.，2007和2012，以及Zheng et al.，2011)。另一方面，与酸性pH下相比，抗体在中性pH下的亲和力显示出更好的与PK的相关性(Cooper et al.，2014和Wang et al.，2011)。基于
FcRn再循环机制，IgG在pH 7.4的亲和力是抗体再循环的关键因素。对于抗体在中性pH值下
的亲和力的准确和精确测量是非常关键的。近来，已报道尝试使用非常高水平的固定化
FcRn通过SPR在pH 7.4下测量抗体对FcRn的亲和力。通过高密度FcRn的动力学分析，YTE变
体在pH 7.4时显示出比野生型IgG1高约57倍的亲和力，而在低密度FcRn的测定中未显示
(Walters et al.，2016)。
[0070] 在某些实施方案中，存在包含已相对于天然或野生型蛋白质进行了修饰的蛋白质分子的组合物。在一些实施方案中，蛋白质化合物已经缺失了氨基酸残基；在另一些实施方
案中，蛋白质化合物的氨基酸残基已被替换；而在另一些实施方案中，已经进行了蛋白质化
合物中氨基酸残基的缺失和替换两者。此外，蛋白质化合物可包括包含多于一个多肽实体
的氨基酸分子。如本文所用，“蛋白质分子”、“蛋白质组合物”、“蛋白质化合物”、“蛋白质链”或“蛋白质材料”通常是指但不限于大于约200个氨基酸或从基因翻译的全长内源序列的蛋
白质；100个或更多氨基酸的多肽；和/或3至100个氨基酸的肽。上述所有“蛋白质”术语在本文中均可互换使用；然而，特别预期的是，实施方案可限于特定类型的蛋白质化合物，例如
多肽。此外，这些术语也可应用于融合蛋白或蛋白质缀合物。蛋白质可包含多于一个多肽。
IgG抗体例如具有通过二硫键相互连接的两个重链多肽和两个轻链多肽。
案中，蛋白质化合物的氨基酸残基已被替换；而在另一些实施方案中，已经进行了蛋白质化
合物中氨基酸残基的缺失和替换两者。此外，蛋白质化合物可包括包含多于一个多肽实体
的氨基酸分子。如本文所用，“蛋白质分子”、“蛋白质组合物”、“蛋白质化合物”、“蛋白质链”或“蛋白质材料”通常是指但不限于大于约200个氨基酸或从基因翻译的全长内源序列的蛋
白质；100个或更多氨基酸的多肽；和/或3至100个氨基酸的肽。上述所有“蛋白质”术语在本文中均可互换使用；然而，特别预期的是，实施方案可限于特定类型的蛋白质化合物，例如
多肽。此外，这些术语也可应用于融合蛋白或蛋白质缀合物。蛋白质可包含多于一个多肽。
IgG抗体例如具有通过二硫键相互连接的两个重链多肽和两个轻链多肽。
[0071] 如本文所用，蛋白质或肽通常是指但不限于大于约200个氨基酸至从基因翻译的全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便
起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。
起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。
[0072] 如本文所用，“氨基酸残基”是指本领域普通技术人员已知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质分子的残基是连续的，没有任何非氨基
酸残基中断氨基酸残基的序列。在另一些实施方案中，序列可以包含一个或更多个非氨基
酸部分。在一些特定的实施方案中，蛋白质分子的残基序列可以被一个或更多个非氨基酸
部分中断。
酸残基中断氨基酸残基的序列。在另一些实施方案中，序列可以包含一个或更多个非氨基
酸部分。在一些特定的实施方案中，蛋白质分子的残基序列可以被一个或更多个非氨基酸
部分中断。
[0073] 如本文所用，“独特Fc结构域”可以定义为与另一Fc相差少至一个氨基酸的结构域。用于制备独特抗体Fc结构域或编码抗体的核酸的文库的方法是本领域公知的。例如，在
一些情况下，可以通过易错PCR扩增Fc结构域。此外，在某些情况下，多个抗体Fc结构域可包含已经随机化的一段氨基酸(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)。在某些情况下，可以将特定的突变工程化到Fc结构域中。例如，在一些方面，可使抗体Fc结构域中通常被糖基化的残
基突变。此外，在某些方面，通常被糖基化的残基(或相邻残基)可以用作1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10或更多个氨基酸的插入位点。
一些情况下，可以通过易错PCR扩增Fc结构域。此外，在某些情况下，多个抗体Fc结构域可包含已经随机化的一段氨基酸(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)。在某些情况下，可以将特定的突变工程化到Fc结构域中。例如，在一些方面，可使抗体Fc结构域中通常被糖基化的残
基突变。此外，在某些方面，通常被糖基化的残基(或相邻残基)可以用作1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10或更多个氨基酸的插入位点。
[0074] 多肽可以包含能够结合FcR多肽的突变体或变体抗体Fc结构域。在一些方面，Fc结构域可进一步定义为在生理条件下对FcR多肽具有特定亲和力。例如，在生理条件下，Fc结
构域可具有约10-6M至约10-9M的平衡解离常数。此外，在一些方面，无糖基化的Fc结构域可
定义为相对于野生型序列(例如人野生型序列)包含一个或更多个氨基酸替换或插入。Fc结
构域可以是糖基化的或无糖基化的。
构域可具有约10-6M至约10-9M的平衡解离常数。此外，在一些方面，无糖基化的Fc结构域可
定义为相对于野生型序列(例如人野生型序列)包含一个或更多个氨基酸替换或插入。Fc结
构域可以是糖基化的或无糖基化的。
[0075] 制备这样的多肽的方法包括在PCT公开WO 2008/137475(其通过引用并入本文)中讨论的那些。可以替代地通过基因工程技术直接制备这样的多肽，例如，通过将选择的氨基
酸替换或插入引入到已知Fc背景中，其中如上所述，插入或替换为无糖基化Fc区提供了改
善的FcR结合能力。在一些实施方案中，将Fc结构域工程化为结合一种或更多种特定Fc受
体。另外地或替代地，可以对Fc结构域进行工程化，以使其不特异性结合一种或更多种特定
Fc受体。
酸替换或插入引入到已知Fc背景中，其中如上所述，插入或替换为无糖基化Fc区提供了改
善的FcR结合能力。在一些实施方案中，将Fc结构域工程化为结合一种或更多种特定Fc受
体。另外地或替代地，可以对Fc结构域进行工程化，以使其不特异性结合一种或更多种特定
Fc受体。
[0076] 在一些实施方案中，Fc结构域包含对FcR例如人FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、FcγRIIIb、FcαRI或对C1q的特异性结合亲和力。在一些实施方案中，抗体是糖基化抗体，其显示出与野生型抗体(例如相应IgG2、IgG3或IgG4抗体)的FcR结合相比
类似、基本上相同或相同的FcR结合。在一些实施方案中，抗体是糖基化的。在一些实施方案中，抗体是无糖基化抗体。抗体Fc或其他结合蛋白的结合亲和力可以例如通过Munson和
Pollard的Scatchard分析(1980)来确定。或者，可以通过表面等离激元共振或用于确定蛋
白质：蛋白质相互作用的动力学和平衡常数的任何其他公知的方法来确定结合亲和力。在
下表1中提供了分离的IgG变体。在多个实施方案中，可以将突变引入IgG1 Fc结构域(例如，
SEQ ID NO：5-8)中，或者可以根据需要在IgG2 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：9)、IgG3 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：10)或IgG4 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：11)中进行相应突变。
类似、基本上相同或相同的FcR结合。在一些实施方案中，抗体是糖基化的。在一些实施方案中，抗体是无糖基化抗体。抗体Fc或其他结合蛋白的结合亲和力可以例如通过Munson和
Pollard的Scatchard分析(1980)来确定。或者，可以通过表面等离激元共振或用于确定蛋
白质：蛋白质相互作用的动力学和平衡常数的任何其他公知的方法来确定结合亲和力。在
下表1中提供了分离的IgG变体。在多个实施方案中，可以将突变引入IgG1 Fc结构域(例如，
SEQ ID NO：5-8)中，或者可以根据需要在IgG2 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：9)、IgG3 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：10)或IgG4 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：11)中进行相应突变。
[0077] 表1：分离的IgG变体(序列编号基于Kabat，并且在下面指出了突变)
[0078] EDHS(V264E，L309D，Q311H，N434S；SEQ ID NO：5)，
[0079] EDHY(V264E，L309D，Q311H，N434Y；SEQ ID NO：6)，
[0080] DHS(L309D，Q311H，N434S；SEQ ID NO：7)，
[0081] DHY(L309D，Q311H，N434Y；SEQ ID NO：8)，
[0082] IgG2-DHS(V309D，Q311H，N434S；SEQ ID NO：9)，
[0083] IgG3-DHS(L309D，Q311H，N434S；SEQ ID NO：10)，
[0084] IgG4-DHS(L309D，Q311H，N434S；SEQ ID NO：11)
[0085] 如本文所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。位置可以顺序编号，或者根据既定格式编号，例如用于抗体编号的EU索引。
[0086] 对于本发明中讨论的所有位置，编号是根据EU索引进行的。“EU索引”或“Kabat中的EU索引”或“EU编号方案”是指EU抗体编号(Edelman et al.，1969；Kabat et al.，1991；
二者均通过引用整体并入本文)。
二者均通过引用整体并入本文)。
[0087] 在某些实施方案中，至少一个Fc多肽蛋白质分子的大小可包括但不限于约或至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、
230、240、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多个氨基分子残基，以及其中可推导的任何范围。化合物可以包含来自SEQ ID NO：1-4
(人IgG1-4Fc多肽)或来自SEQ ID NO：5-11的上述数目的连续氨基酸，并且这些可以被进一
步鉴定为与野生型人IgG Fc结构域具有百分比序列同一性或同源性(例如，与SEQ ID NO：
1-4中任一个的百分比序列同一性)。
60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、
230、240、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多个氨基分子残基，以及其中可推导的任何范围。化合物可以包含来自SEQ ID NO：1-4
(人IgG1-4Fc多肽)或来自SEQ ID NO：5-11的上述数目的连续氨基酸，并且这些可以被进一
步鉴定为与野生型人IgG Fc结构域具有百分比序列同一性或同源性(例如，与SEQ ID NO：
1-4中任一个的百分比序列同一性)。
[0088] A.经修饰的蛋白质和多肽
[0089] 一些实施方案涉及经修饰的蛋白质和多肽，特别是表现出与未经修饰的形式相当的至少一种功能活性的经修饰的蛋白质或多肽，但是经修饰的蛋白质或多肽相对于未经修
饰的形式具有另外的优势，例如抑制B细胞活化，生产更容易或更便宜，引起更少的副作用，和/或具有更好或更长的功效或生物利用度。因此，当本申请涉及“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”的功能或活性时，本领域普通技术人员应理解这包括例如这样的蛋白质或多
肽，其1)与未经修饰的蛋白质或多肽相比执行至少一种相同的活性或者具有至少一种相同
的特异性，但是可具有不同水平的另一种活性或特异性；以及2)相对于未经修饰的蛋白质
或多肽具有另外的优势。活性的确定可以使用本领域技术人员熟悉的测定，特别是关于蛋
白质活性的测定来实现，并且出于比较目的，可以包括例如使用经修饰的或未经修饰的蛋
白质或多肽的天然和/或重组形式。特别预期了关于“经修饰的蛋白质”的实施方案可以对
于“经修饰的多肽”来实施，反之亦然。除了本文讨论的经修饰的蛋白质和多肽之外，实施方案可涉及PCT公开WO 2008/137475(其特别地通过引用并入本文)中描述的结构域、多肽和
蛋白质。
饰的形式具有另外的优势，例如抑制B细胞活化，生产更容易或更便宜，引起更少的副作用，和/或具有更好或更长的功效或生物利用度。因此，当本申请涉及“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”的功能或活性时，本领域普通技术人员应理解这包括例如这样的蛋白质或多
肽，其1)与未经修饰的蛋白质或多肽相比执行至少一种相同的活性或者具有至少一种相同
的特异性，但是可具有不同水平的另一种活性或特异性；以及2)相对于未经修饰的蛋白质
或多肽具有另外的优势。活性的确定可以使用本领域技术人员熟悉的测定，特别是关于蛋
白质活性的测定来实现，并且出于比较目的，可以包括例如使用经修饰的或未经修饰的蛋
白质或多肽的天然和/或重组形式。特别预期了关于“经修饰的蛋白质”的实施方案可以对
于“经修饰的多肽”来实施，反之亦然。除了本文讨论的经修饰的蛋白质和多肽之外，实施方案可涉及PCT公开WO 2008/137475(其特别地通过引用并入本文)中描述的结构域、多肽和
蛋白质。
[0090] 经修饰的蛋白质可以具有氨基酸的缺失和/或替换；因此，具有缺失的蛋白质、具有替换的蛋白质以及具有缺失和替换的蛋白质是经修饰的蛋白质。在一些实施方案中，这
些经修饰的蛋白质可进一步包含插入或添加的氨基酸，例如具有融合蛋白或具有接头的蛋
白质。这可以包括插入靶向肽或多肽或仅单个残基。下面讨论被称为融合蛋白的末端添加。
些经修饰的蛋白质可进一步包含插入或添加的氨基酸，例如具有融合蛋白或具有接头的蛋
白质。这可以包括插入靶向肽或多肽或仅单个残基。下面讨论被称为融合蛋白的末端添加。
[0091] “经修饰的缺失蛋白质”缺少天然蛋白质的一个或更多个残基，但是具有天然蛋白质的特异性和/或活性。“经修饰的缺失蛋白质”也可能具有降低的免疫原性或抗原性。经修饰的缺失蛋白质的一个实例是从至少一个抗原区域(即，在特定生物体中，例如可施用经修
饰的蛋白质的生物体类型中被确定为具有抗原性的蛋白质区域)缺失氨基酸残基的蛋白
质。
饰的蛋白质的生物体类型中被确定为具有抗原性的蛋白质区域)缺失氨基酸残基的蛋白
质。
[0092] 替换或取代变体通常包含在蛋白质内一个或更多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可以被设计为调节多肽的一个或更多个特性，特别是其效应物功能
和/或生物利用度。替换可以是或可以不是保守的，即一种氨基酸被类似形状和电荷的一种
取代。保守替换在本领域中是公知的，并且包括例如以下改变：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到
赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺
到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨
酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或
异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。
和/或生物利用度。替换可以是或可以不是保守的，即一种氨基酸被类似形状和电荷的一种
取代。保守替换在本领域中是公知的，并且包括例如以下改变：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到
赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺
到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨
酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或
异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。
[0093] 术语“生物学功能等同”在本领域中是公知的，并且在本文中进一步详细定义。因此，包括了约70％至约80％、或约81％至约90％、或甚至约91％至约99％的氨基酸与天然多
肽的氨基酸相同或功能等同的序列，只要保持蛋白质的生物活性即可。经修饰的蛋白质可
以与其天然对应物是生物学功能等同的。
肽的氨基酸相同或功能等同的序列，只要保持蛋白质的生物活性即可。经修饰的蛋白质可
以与其天然对应物是生物学功能等同的。
[0094] 还应理解的是，氨基酸和核酸序列可包含另外的残基，例如另外的N-或C-末端氨基酸或5′或3′序列，但仍然是基本上如本文公开的序列之一所述的，只要序列满足上述标
准即可，包括涉及蛋白质表达的生物学蛋白质活性的维持。末端序列的添加特别适用于核
酸序列，其可以例如包含位于编码区的5′或3′部分侧翼的多种非编码序列，或者可以包含
已知在基因内存在的多种内部序列，即内含子。
准即可，包括涉及蛋白质表达的生物学蛋白质活性的维持。末端序列的添加特别适用于核
酸序列，其可以例如包含位于编码区的5′或3′部分侧翼的多种非编码序列，或者可以包含
已知在基因内存在的多种内部序列，即内含子。
[0095] 以下是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等同的或甚至改善的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以替换蛋白质结构中的其他氨基酸，而具有或不具有与结构(例如底物
分子的结合位点)的相互作用结合能力的显著损失。由于决定蛋白质的生物学功能活性的
是蛋白质的相互作用能力和性质，因此可以在蛋白质序列及其基础DNA编码序列中进行某
些氨基酸替换，从而产生具有类似特性的蛋白质。因此预期如下所述，可以在基因的DNA序
列中进行多种改变而不明显损失其生物学效用或活性。如果满足以下“同源性标准”之一，
则蛋白质分子与第二蛋白质分子具有“同源性”或被认为与第二蛋白质分子“同源”：1)蛋白质分子的至少30％与第二蛋白质分子在相同位置具有序列同一性；2)在与第二蛋白质分子
的相同位置处具有一些序列同一性，并且在相对于第二蛋白质分子的非相同残基处，其中
至少30％是如本文所述的保守差异；或3)蛋白质分子的至少30％与第二蛋白质分子具有序
列同一性，但在相同残基之间可能存在不同残基的间隙。如本文所用，术语“同源的”可同样地应用于蛋白质分子的区域，而不是整个分子。如果术语“同源性”或“同源”由数字限定，例如“50％同源性”或“50％同源”，则关于1)、2)和3)的同源性标准从“至少30％”调整为“至少
50％”。因此，预期了在两个蛋白质分子或蛋白质分子的部分之间可有至少30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。
分子的结合位点)的相互作用结合能力的显著损失。由于决定蛋白质的生物学功能活性的
是蛋白质的相互作用能力和性质，因此可以在蛋白质序列及其基础DNA编码序列中进行某
些氨基酸替换，从而产生具有类似特性的蛋白质。因此预期如下所述，可以在基因的DNA序
列中进行多种改变而不明显损失其生物学效用或活性。如果满足以下“同源性标准”之一，
则蛋白质分子与第二蛋白质分子具有“同源性”或被认为与第二蛋白质分子“同源”：1)蛋白质分子的至少30％与第二蛋白质分子在相同位置具有序列同一性；2)在与第二蛋白质分子
的相同位置处具有一些序列同一性，并且在相对于第二蛋白质分子的非相同残基处，其中
至少30％是如本文所述的保守差异；或3)蛋白质分子的至少30％与第二蛋白质分子具有序
列同一性，但在相同残基之间可能存在不同残基的间隙。如本文所用，术语“同源的”可同样地应用于蛋白质分子的区域，而不是整个分子。如果术语“同源性”或“同源”由数字限定，例如“50％同源性”或“50％同源”，则关于1)、2)和3)的同源性标准从“至少30％”调整为“至少
50％”。因此，预期了在两个蛋白质分子或蛋白质分子的部分之间可有至少30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。
[0096] 或者，经修饰的多肽可以表征为与未经修饰的多肽或与本文公开的任何多肽序列，包括本文所述的任何突变体或变体Fc结构域或序列(例如，SEQ ID NO：5-11)具有一定
百分比的同一性。两个蛋白质分子或蛋白质分子的部分之间，百分比同一性可以为至多或
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％(或其中可推导的任何范围)。预期以上讨论的同一性百分比可涉及多肽的特定区域
与多肽的未经修饰的区域相比。例如，多肽可以包含经修饰的或突变体Fc结构域，其可以基
于经修饰的或突变体Fc结构域与来自相同物种的未经修饰的或突变体Fc结构域的氨基酸
序列的同一性来表征。经修饰的或突变体人Fc结构域表征为例如与未经修饰的Fc结构域具
有90％的同一性，意指该结构域中90％的氨基酸与未经修饰的人Fc结构域(例如，SEQ ID
NO：1-4)中的氨基酸相同。
百分比的同一性。两个蛋白质分子或蛋白质分子的部分之间，百分比同一性可以为至多或
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％(或其中可推导的任何范围)。预期以上讨论的同一性百分比可涉及多肽的特定区域
与多肽的未经修饰的区域相比。例如，多肽可以包含经修饰的或突变体Fc结构域，其可以基
于经修饰的或突变体Fc结构域与来自相同物种的未经修饰的或突变体Fc结构域的氨基酸
序列的同一性来表征。经修饰的或突变体人Fc结构域表征为例如与未经修饰的Fc结构域具
有90％的同一性，意指该结构域中90％的氨基酸与未经修饰的人Fc结构域(例如，SEQ ID
NO：1-4)中的氨基酸相同。
[0097] 在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性在本领域中是公知的(Kyte和Doolittle，1982)。公认
的是，氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其
他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
的是，氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其
他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
[0098] 在本领域中还应理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利号4,554,101(其通过引用并入本文)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性由其相邻氨基酸
的亲水性决定，其与蛋白质的生物学特性相关。如在美国专利号4,554,101中详细描述的，
已将以下亲水性值赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷
氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-
0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；
缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-
3.4)。应理解的是氨基酸可以替换具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍产生生物学
上等同和免疫上等同的蛋白质。在这样的变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸的替换是优
选的，在±1之内的那些氨基酸是特别优选的，并且在±0.5之内的那些氨基酸是甚至更特
别优选的。
的亲水性决定，其与蛋白质的生物学特性相关。如在美国专利号4,554,101中详细描述的，
已将以下亲水性值赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷
氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-
0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；
缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-
3.4)。应理解的是氨基酸可以替换具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍产生生物学
上等同和免疫上等同的蛋白质。在这样的变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸的替换是优
选的，在±1之内的那些氨基酸是特别优选的，并且在±0.5之内的那些氨基酸是甚至更特
别优选的。
[0099] 如上所述，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷，尺寸等。考虑了多种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，包括：
精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0100] B.具有异源区域的经修饰的抗体和蛋白质化合物
[0101] 一旦分离了Fc结构域，可希望将分子连接至至少一种试剂以形成缀合物从而增强该分子的效用。例如，为了提高Fc结构域或抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，常规的是
连接或共价结合或复合至少一种期望的分子或部分。这样的分子或部分可以是但不限于至
少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有期望活性(例如细胞毒性活性)的分子。已
附着于抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性标记的核苷
酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子定义为可以使用测定进行检测的任何部分。已经与抗体缀合的报道分子的非限制性实例包括
酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒、或配体(例如生物素)。另一种这样的实例是形成包含与细胞毒性或抗细胞剂
连接的抗体的缀合物，其可以称为“免疫毒素”。用于标记这样的分子的技术是本领域技术
人员已知的并且已经在上文中进行了描述。
连接或共价结合或复合至少一种期望的分子或部分。这样的分子或部分可以是但不限于至
少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有期望活性(例如细胞毒性活性)的分子。已
附着于抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性标记的核苷
酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子定义为可以使用测定进行检测的任何部分。已经与抗体缀合的报道分子的非限制性实例包括
酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒、或配体(例如生物素)。另一种这样的实例是形成包含与细胞毒性或抗细胞剂
连接的抗体的缀合物，其可以称为“免疫毒素”。用于标记这样的分子的技术是本领域技术
人员已知的并且已经在上文中进行了描述。
[0102] 然后还可以将根据本发明制备的经标记的蛋白质(例如Fc结构域)用于例如免疫检测方法，以用于结合、纯化、去除、定量和/或以其他方式一般地检测生物成分，例如蛋白质、多肽或肽。一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免
疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和Western印迹等。多种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中进行了描述，例如，Doolittle和Ben-Zeev，1999；
Gulbis和Galand，1993；以及De Jager et al.，1993，其各自通过引用并入本文。
疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和Western印迹等。多种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中进行了描述，例如，Doolittle和Ben-Zeev，1999；
Gulbis和Galand，1993；以及De Jager et al.，1993，其各自通过引用并入本文。
[0103] Fc结构域分子(包括抗体)可以例如与制备用于通过免疫组织化学(IHC)进行研究的新鲜冷冻和/或福尔马林固定的石蜡包埋的组织块一起使用。由这些颗粒状试样制备组
织块的方法已成功用于多种预后因素的先前IHC研究中，和/或是本领域技术人员所公知的
(Abbondanzo et al.，1990)。
织块的方法已成功用于多种预后因素的先前IHC研究中，和/或是本领域技术人员所公知的
(Abbondanzo et al.，1990)。
[0104] 一些实施方案涉及Fc多肽蛋白质化合物，其可以包含来自多于一种天然存在的或天然的多肽或蛋白质的氨基酸序列。预期以上讨论的实施方案适用于该部分，反之亦然。例
如，经修饰的抗体是包含具有抗原结合结构域的经修饰的Fc结构域的抗体。此外，抗体可以
具有两个不同的抗原结合区域，例如在两个重链中的每一个上的不同区域。替代地或另外，
在一些实施方案中，存在包含多个异源肽和/或多肽(“异源”意味着它们不是源自相同的多
肽)的多肽。例如，蛋白质化合物或分子可以包含具有不是来自抗体的蛋白质结合区域的经
修饰的Fc结构域。在一些实施方案中，存在包含经修饰的Fc结构域的多肽，所述经修饰的Fc
结构域具有结合细胞表面受体的蛋白质结合区域。这些包含多个功能结构域的蛋白质分子
可以是彼此化学缀合的两个或更多个结构域，或者其可以是由相同核酸分子编码的两个或
更多个多肽的融合蛋白。预期蛋白质或多肽可以包含两个或更多个异源多肽的全部或一部
分。
如，经修饰的抗体是包含具有抗原结合结构域的经修饰的Fc结构域的抗体。此外，抗体可以
具有两个不同的抗原结合区域，例如在两个重链中的每一个上的不同区域。替代地或另外，
在一些实施方案中，存在包含多个异源肽和/或多肽(“异源”意味着它们不是源自相同的多
肽)的多肽。例如，蛋白质化合物或分子可以包含具有不是来自抗体的蛋白质结合区域的经
修饰的Fc结构域。在一些实施方案中，存在包含经修饰的Fc结构域的多肽，所述经修饰的Fc
结构域具有结合细胞表面受体的蛋白质结合区域。这些包含多个功能结构域的蛋白质分子
可以是彼此化学缀合的两个或更多个结构域，或者其可以是由相同核酸分子编码的两个或
更多个多肽的融合蛋白。预期蛋白质或多肽可以包含两个或更多个异源多肽的全部或一部
分。
[0105] 因此，多重多肽蛋白质化合物可以包含第一多肽的全部或一部分以及第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽、第六多肽、第七多肽、第八多肽、第九多肽、第十多肽或更多多肽的全部或一部分。
[0106] 氨基酸，例如可选择性切割的接头、合成接头或其他氨基酸序列可用于分离蛋白质部分。
[0107] 具有抗体的抗原结合结构域或区域以及突变体或变体Fc结构域的多肽或蛋白质(包括抗体)可用于针对任何抗原或表位，包括但不限于属于以下靶标列表的蛋白质、亚基、
结构域、基序和/或表位：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIA ALK-2、激活蛋白RIB ALK-4、激活蛋白RIIA、激活蛋白RIIB、ADAM、
ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B淋巴细胞刺激物(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨蛋白(BMP-3Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-
6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-
2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、b-NGF、BOK、铃蟾肽(Bombesin)、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/ZIP、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒梭菌
(Clostridium botulinum)毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、
CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变加速因子、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、eotaxin1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、分形趋化因子
(Fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌生成抑制蛋白，Myostatin)、GDF-9、GDF-15
(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白IIb/IIJa(GP JIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gpl20、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4
(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MM)、HIV gp120、HIV IIIB gp120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心脏肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人类生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层黏连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在TGF-1、潜在TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-
1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMACl、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、Muellerian-抑制素物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙黏着蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养因子3、4或6、Neurturin、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏着蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PIGF、PLP、PPl4、胰岛素原、Prorelaxin、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性、TGF-β RI(ALK-5)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、
TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITRAITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF
RICD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3
(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6
(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、
TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23
(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体，TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、
DR3配体)、TNFSF13(APRILTALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(ITb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转移受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA 125、表达与Lewis Y相关的碳水化合物的肿瘤相关抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏着蛋白、VE-钙黏着蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(fit-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、冯·维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生长因子的受体。在一些实施方案中，多肽或蛋白质具有对一种或更多种细胞表面肿瘤抗原或B细
胞抗原具有特异性的抗原结合结构域。可以采用方法和组合物靶向肿瘤细胞或B细胞。
结构域、基序和/或表位：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIA ALK-2、激活蛋白RIB ALK-4、激活蛋白RIIA、激活蛋白RIIB、ADAM、
ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B淋巴细胞刺激物(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨蛋白(BMP-3Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-
6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-
2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、b-NGF、BOK、铃蟾肽(Bombesin)、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/ZIP、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒梭菌
(Clostridium botulinum)毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、
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(Fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌生成抑制蛋白，Myostatin)、GDF-9、GDF-15
(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白IIb/IIJa(GP JIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gpl20、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4
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1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMACl、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、Muellerian-抑制素物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙黏着蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养因子3、4或6、Neurturin、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏着蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PIGF、PLP、PPl4、胰岛素原、Prorelaxin、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性、TGF-β RI(ALK-5)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、
TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITRAITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF
RICD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3
(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6
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TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23
(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体，TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、
DR3配体)、TNFSF13(APRILTALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(ITb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转移受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA 125、表达与Lewis Y相关的碳水化合物的肿瘤相关抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏着蛋白、VE-钙黏着蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(fit-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、冯·维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生长因子的受体。在一些实施方案中，多肽或蛋白质具有对一种或更多种细胞表面肿瘤抗原或B细
胞抗原具有特异性的抗原结合结构域。可以采用方法和组合物靶向肿瘤细胞或B细胞。
[0108] 具有足够选择性、特异性或亲和力的任何抗体都可以用作抗体缀合物的基础。可以使用本领域技术人员已知的常规免疫学筛选方法来评估这样的性质。除经典抗原结合位
点外，抗体分子中用于与生物活性分子结合的位点还包括位于可变结构域中的位点，该可
变域可结合病原体、B细胞超抗原、T细胞共受体CD4和HIV-1包膜(Silverman，1995；Cleary et al.，1994；Lenert et al.，1990；Berberian et al.，1993；Kreier et al.，1981)。另外，可变结构域参与抗体的自结合(Kang et al.，1988)，并包含被抗抗体识别的表位(独特
位)(Bhattacharya et al.，1989)。
点外，抗体分子中用于与生物活性分子结合的位点还包括位于可变结构域中的位点，该可
变域可结合病原体、B细胞超抗原、T细胞共受体CD4和HIV-1包膜(Silverman，1995；Cleary et al.，1994；Lenert et al.，1990；Berberian et al.，1993；Kreier et al.，1981)。另外，可变结构域参与抗体的自结合(Kang et al.，1988)，并包含被抗抗体识别的表位(独特
位)(Bhattacharya et al.，1989)。
[0109] Fc结构域可与FcR结合；然而，预期免疫应答的调节不仅可以通过包含Fc结构域的多肽上的抗原结合结构域来进行，而且可以通过一些其他蛋白质结合结构域来进行。因此，
一些实施方案可能涉及Fc结构域和异源非抗原结合结构域。在某些实施方案中，非抗原结
合结构域结合至细胞表面。因此，这些试剂需要与能够结合特定靶细胞的试剂/蛋白质化学
缀合或融合。实施方案可进一步包括使突变体或变体Fc结构域的全部或一部分与表2中列
出的任何蛋白质的全部或一部分邻接。预期实施方案包括但不限于表2中提供的实例和本
文的描述。
一些实施方案可能涉及Fc结构域和异源非抗原结合结构域。在某些实施方案中，非抗原结
合结构域结合至细胞表面。因此，这些试剂需要与能够结合特定靶细胞的试剂/蛋白质化学
缀合或融合。实施方案可进一步包括使突变体或变体Fc结构域的全部或一部分与表2中列
出的任何蛋白质的全部或一部分邻接。预期实施方案包括但不限于表2中提供的实例和本
文的描述。
[0110] 受体的配体可用于靶向在其表面上表达该配体的受体的细胞。配体还包括例如CD95配体、TRAIL、TNF(例如TNF-α或TNF-β)、生长因子(包括以上讨论的那些)，例如VEGF和细胞因子，例如干扰素或白介素，及其变体。还考虑了具有多个结构域的实施方案，例如包
含VEGF受体1(Flt-1)的第二胞外结构域和VEGF受体2(KDR/FIK-1)的第三结构域以及IgG
Fc区的VEGF Trap融合蛋白。
含VEGF受体1(Flt-1)的第二胞外结构域和VEGF受体2(KDR/FIK-1)的第三结构域以及IgG
Fc区的VEGF Trap融合蛋白。
[0111] 表2.能够结合特定靶细胞的试剂/蛋白质
[0112]
[0113] C.抗体Fc文库
[0114] 可以与用于产生多种抗体Fc结构域和/或包含这样的结构域的抗体的实施方案结合使用的技术的实例可以采用与美国专利号5,824,520中描述的用于表达免疫球蛋白重链
文库的技术类似的技术。先前使用的Fc文库在PCT公开WO 2008/137475中讨论，其特别地通
过引用并入本文。
文库的技术类似的技术。先前使用的Fc文库在PCT公开WO 2008/137475中讨论，其特别地通
过引用并入本文。
[0115] II.抗体结合多肽
[0116] 多种抗体结合结构域(例如，FcR多肽)是本领域已知的，并且可以用于本发明的方法和组合物中。例如，在一些方面，FcR可对特定类型或亚型的Ig例如IgA、IgM、IgE或IgG(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)具有特异性。因此，在一些实施方案中，抗体结合结构域可以定义为IgG结合结构域。FcR多肽可包含真核、原核或合成FcR结构域。例如，抗体Fc结合结构域可以定义为哺乳动物、细菌或合成结合结构域。用于本发明的一些Fc结合结构域
包括但不限于来自表3的多肽之一的结合结构域。例如，Fc结合多肽可以由FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FCGR1A、Fcgr1、FCGR2、FCGR2、Fcgr2、Fcgr2、FCGR3、FCGR3、Fcgr3、FCGR3、Fcgr3、FCGRT、mrp4、spa或spg基因编码。优选地，根据本发明使用的FcR多肽可以是来自人FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、FcγRIIIb、FcαRI或C1q的Fc结合区。Fc结构域结合的多种Fc受体在本领域中是公知的，并且受体的一些实例在下表3中列
出。
包括但不限于来自表3的多肽之一的结合结构域。例如，Fc结合多肽可以由FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FCGR1A、Fcgr1、FCGR2、FCGR2、Fcgr2、Fcgr2、FCGR3、FCGR3、Fcgr3、FCGR3、Fcgr3、FCGRT、mrp4、spa或spg基因编码。优选地，根据本发明使用的FcR多肽可以是来自人FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、FcγRIIIb、FcαRI或C1q的Fc结合区。Fc结构域结合的多种Fc受体在本领域中是公知的，并且受体的一些实例在下表3中列
出。
[0117] 表3.选择的FcR多肽
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123] III.用于筛选抗体Fc结构域的方法
[0124] 在某些方面，存在用于鉴定对靶配体(例如抗体结合多肽，例如Fc受体)具有特异性亲和力的抗体Fc结构域的方法。这样的方法在本文中以及在PCT公开WO 2008/137475(其
特别地通过引用整体并入本文)中进行了描述。例如，方法可用于鉴定除了本文公开的Fc结
构域替换突变之外(例如，除了人IgG Fc结构域中的L309D、Q311H和N434S/Y之外)，在突变
体或变体Fc结构域或抗体中可进一步包含的另外突变。用于鉴定另外突变的多种方法是本
领域已知的，并且可以在本文中使用(例如，美国专利号7094571、7419783、7611866和美国
专利公开号2003/0219870；Harvey et al.，2004；Harvey et al.，2006)。
特别地通过引用整体并入本文)中进行了描述。例如，方法可用于鉴定除了本文公开的Fc结
构域替换突变之外(例如，除了人IgG Fc结构域中的L309D、Q311H和N434S/Y之外)，在突变
体或变体Fc结构域或抗体中可进一步包含的另外突变。用于鉴定另外突变的多种方法是本
领域已知的，并且可以在本文中使用(例如，美国专利号7094571、7419783、7611866和美国
专利公开号2003/0219870；Harvey et al.，2004；Harvey et al.，2006)。
[0125] IV.基于核酸的表达系统
[0126] 在本发明的某些实施方案中，基于核酸的表达系统可用于表达重组蛋白。例如，本发明的一个实施方案涉及用抗体Fc结构域或优选地多个不同的Fc结构域的编码序列转化
革兰氏阴性细菌。
革兰氏阴性细菌。
[0127] A.核酸递送方法
[0128] 本发明的某些方面可以包括将核酸递送至靶细胞(例如，革兰氏阴性细菌)。例如，可用编码潜在地能够结合FcR的候选Fc结构域的核酸转化细菌宿主细胞。在本发明的一些
特定实施方案中，可期望将表达靶向细菌的周质。真核宿主细胞的转化可以类似地用于表
达被鉴定为能够结合靶配体的多种候选分子。
特定实施方案中，可期望将表达靶向细菌的周质。真核宿主细胞的转化可以类似地用于表
达被鉴定为能够结合靶配体的多种候选分子。
[0129] 用于核酸递送以转化细胞的合适方法是本领域公知的。在一些方面，在核酸表达载体中编码突变体或变体Fc结构域，所述核酸表达载体可用于转化细胞，例如细菌或真核
细胞。
细胞。
[0130] 术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的基因产物的至少一部分的核酸序列的载体。表达载体可以包含多种“控制序列”，其是指对于可操作地连接的编码序列在特定
宿主生物体中的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。另外，表达载体可以包含启动子、增
强子、起始信号、多克隆位点(MCS)、终止信号、一个或更多个复制起始位点(通常称为
“ori”)、选择和/或筛选标志物(例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)或组氨醇(histidinol)的抗性；或蛋白质，例如GFP或氯霉素乙酰基转移酶
(CAT))。
宿主生物体中的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。另外，表达载体可以包含启动子、增
强子、起始信号、多克隆位点(MCS)、终止信号、一个或更多个复制起始位点(通常称为
“ori”)、选择和/或筛选标志物(例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)或组氨醇(histidinol)的抗性；或蛋白质，例如GFP或氯霉素乙酰基转移酶
(CAT))。
[0131] “启动子”是控制序列，其是在此控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。其可包含调控蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可以结合的遗传元件。短语“可操作
地定位”、“可操作地连接”、“在控制之下”和“在转录控制之下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以或可以
不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。分子生物学领域的技术人员通常熟悉使用启动子、增强子和细胞类型组合以进行蛋白质表达，
例如，参见Sambrook et al.(1989)，其通过引用并入本文。
地定位”、“可操作地连接”、“在控制之下”和“在转录控制之下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以或可以
不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。分子生物学领域的技术人员通常熟悉使用启动子、增强子和细胞类型组合以进行蛋白质表达，
例如，参见Sambrook et al.(1989)，其通过引用并入本文。
[0132] B.宿主细胞
[0133] 在表达异源核酸序列的情况下，“宿主细胞”是指原核细胞，并且其包括能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的任何可转化生物体。宿主细胞可以并且已经用作
载体的接受体。宿主细胞可以“转染”或“转化”，这是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。
载体的接受体。宿主细胞可以“转染”或“转化”，这是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。
[0134] 在本发明的一些特定实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。这些细菌适用于本发明，因为它们具有在内膜和外膜之间的周质空间，特别是在周质和细胞质之间的
上述内膜，也称为细胞质膜。因此，根据本发明可以使用具有这种周质空间的任何其他细
胞。可用于本发明的革兰氏阴性细菌的实例可包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单
胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio choler)、鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、流感嗜血杆菌
(Haemophilus influenza)、百日咳鲍特菌(Bordotella pertussi)、解淀粉欧文氏菌
(Erwinia amylovora)、根瘤菌属(Rhizobiumsp)。
上述内膜，也称为细胞质膜。因此，根据本发明可以使用具有这种周质空间的任何其他细
胞。可用于本发明的革兰氏阴性细菌的实例可包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单
胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio choler)、鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、流感嗜血杆菌
(Haemophilus influenza)、百日咳鲍特菌(Bordotella pertussi)、解淀粉欧文氏菌
(Erwinia amylovora)、根瘤菌属(Rhizobiumsp)。
[0135] 本领域技术人员可以基于载体骨架和期望结果确定合适的宿主。例如，可以将质粒或黏粒引入原核宿主细胞中以复制许多载体。用作用于载体复制和/或表达的宿主细胞
的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及许多市售细菌宿主，例如 感受态细胞和
SolopackTM金细胞( La Jolla)。或者，细菌细胞(例如大肠杆菌LE392)可以用
作噬菌体的宿主细胞。
的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及许多市售细菌宿主，例如 感受态细胞和
SolopackTM金细胞( La Jolla)。或者，细菌细胞(例如大肠杆菌LE392)可以用
作噬菌体的宿主细胞。
[0136] 哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61)、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCCCRL
1548)、SV40转化猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠类胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC
CRL1658)。前述内容是本领域已知的许多可能的宿主生物体的示例性的但非限制性的内
容。
1548)、SV40转化猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠类胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC
CRL1658)。前述内容是本领域已知的许多可能的宿主生物体的示例性的但非限制性的内
容。
[0137] 表达多肽的哺乳动物宿主细胞在通常用于培养亲本细胞系的条件下培养。通常，将细胞培养在含有生理盐和营养物的标准培养基中，例如标准的RPMI、MEM、IMEM或DMEM，通常补充有5％-10％的血清，例如胎牛血清。培养条件也是标准的，例如，将培养物在37℃下
在固定或滚动培养中孵育直至获得期望水平的蛋白质。
在固定或滚动培养中孵育直至获得期望水平的蛋白质。
[0138] 来自多种细胞类型和生物体的许多宿主细胞是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。类似地，病毒载体可以与原核宿主细胞联合使用，特别是允许载体复制或表达的原
核宿主细胞。一些载体可以采用允许其在原核细胞和真核细胞两者中复制和/或表达的控
制序列。本领域技术人员将进一步理解孵育上述所有宿主细胞以维持它们并允许载体复制
的条件。还理解和已知的是允许大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其同源多
肽、蛋白质或肽的技术和条件。
核宿主细胞。一些载体可以采用允许其在原核细胞和真核细胞两者中复制和/或表达的控
制序列。本领域技术人员将进一步理解孵育上述所有宿主细胞以维持它们并允许载体复制
的条件。还理解和已知的是允许大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其同源多
肽、蛋白质或肽的技术和条件。
[0139] C.表达系统
[0140] 存在包含以上讨论的组合物中的至少一部分或全部的许多表达系统。这样的系统可用于例如产生根据本发明鉴定为能够结合特定配体的多肽产物。基于原核生物的系统可
用于本发明使用以产生核酸序列，或其同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是商业上可
广泛获得的。表达系统的其他实例包括含有强原核启动子如T7、Tac、Trc、BAD、λpL、四环素或Lac启动子的载体，pET表达系统和大肠杆菌表达系统。
用于本发明使用以产生核酸序列，或其同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是商业上可
广泛获得的。表达系统的其他实例包括含有强原核启动子如T7、Tac、Trc、BAD、λpL、四环素或Lac启动子的载体，pET表达系统和大肠杆菌表达系统。
[0141] 在本发明的某些方面，公开了编码多肽的核酸序列。根据所使用的表达系统，可以基于常规方法选择核酸序列。例如，如果多肽来源于人多肽并且包含多个在大肠杆菌中很
少使用的密码子，那么其可能会干扰在大肠杆菌中的表达。因此，可以针对大肠杆菌表达对
各个基因或其变体进行密码子优化。多种载体也可以用于表达目的蛋白质。示例性载体包
括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
少使用的密码子，那么其可能会干扰在大肠杆菌中的表达。因此，可以针对大肠杆菌表达对
各个基因或其变体进行密码子优化。多种载体也可以用于表达目的蛋白质。示例性载体包
括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
[0142] V.蛋白质纯化
[0143] 蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个层面上涉及将细胞、组织或器官均质化和粗略分级为多肽和非多肽级分。除非另有说明，否则可以使用色谱和
电泳技术进一步纯化目的蛋白质或多肽，以实现部分或全部纯化(或纯化至均质)。特别适
合于制备纯肽的分析方法包括离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法(SEC)、反相色谱法、羟基
磷灰石色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱法、免疫亲和色谱法和等电聚焦。纯化肽的
特别有效的方法是快速液相色谱法(FPLC)或甚至高性能液相色谱法(也称为高压液相色谱
法或HPLC)。如本领域通常已知的，认为可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略
某些步骤，并且仍然导致用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
电泳技术进一步纯化目的蛋白质或多肽，以实现部分或全部纯化(或纯化至均质)。特别适
合于制备纯肽的分析方法包括离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法(SEC)、反相色谱法、羟基
磷灰石色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱法、免疫亲和色谱法和等电聚焦。纯化肽的
特别有效的方法是快速液相色谱法(FPLC)或甚至高性能液相色谱法(也称为高压液相色谱
法或HPLC)。如本领域通常已知的，认为可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略
某些步骤，并且仍然导致用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
[0144] 纯化的蛋白质或肽旨在指可与其他组分分离的组合物，其中所述蛋白质或肽相对于其天然可获得的状态被纯化至任何程度。因此，分离或纯化的蛋白质或肽还指没有在其
天然可能存在的环境的蛋白质或肽。通常，“纯化的”是指已经过分级以去除多种其他组分
的蛋白质或肽组合物，并且该组合物基本上保留了其表达的生物学活性。在使用术语“基本
上纯化的”的情况下，该指示将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，
例如构成组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。
天然可能存在的环境的蛋白质或肽。通常，“纯化的”是指已经过分级以去除多种其他组分
的蛋白质或肽组合物，并且该组合物基本上保留了其表达的生物学活性。在使用术语“基本
上纯化的”的情况下，该指示将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，
例如构成组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。
[0145] 根据本公开内容，用于量化蛋白质或肽的纯化程度的多种方法是本领域技术人员已知的。这些包括例如，确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内的多肽数
目。评估级分的纯度的一种优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进
行比较，从而计算其中通过“纯化倍数”评估的纯度。当然，用于表示活性的量的实际单位将取决于纯化后选择的特定测定技术，以及表达的蛋白质或多肽是否表现出可检出的活性。
目。评估级分的纯度的一种优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进
行比较，从而计算其中通过“纯化倍数”评估的纯度。当然，用于表示活性的量的实际单位将取决于纯化后选择的特定测定技术，以及表达的蛋白质或多肽是否表现出可检出的活性。
[0146] 没有一般要求蛋白质或肽将总是以其最纯化的状态提供。实际上，预期基本上较不纯化的产物在某些实施方案中可具有效用。可以通过组合使用较少的纯化步骤或通过利
用相同一般纯化方案的不同形式来实现部分纯化。例如，应当理解，与使用低压色谱系统的
相同技术相比，利用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱法通常将导致更大的“倍数”纯化。
表现出较低的相对纯化程度的方法可在蛋白质产物的总回收或维持表达的蛋白质的活性
方面具有优势。
用相同一般纯化方案的不同形式来实现部分纯化。例如，应当理解，与使用低压色谱系统的
相同技术相比，利用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱法通常将导致更大的“倍数”纯化。
表现出较低的相对纯化程度的方法可在蛋白质产物的总回收或维持表达的蛋白质的活性
方面具有优势。
[0147] VI.药物组合物
[0148] 在进行包含多肽或抗体的药物组合物的临床应用的情况下，制备适合于预期应用的药物或治疗组合物通常将是有益的。通常，药物组合物可包含有效量的一种或更多种溶
解或分散在可药用载体中的多肽或其他试剂。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如
至少约0.1％的多肽或抗体。在另一些实施方案中，多肽或抗体可占单位重量的约2％至约
75％，或例如约25％至约60％，以及其中可推导的任何范围。每种治疗上有用的组合物中活
性化合物的量可以以这样的方式制备：在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂
量。制备这样的药物制剂的领域的技术人员将考虑因素例如溶解度、生物利用度、生物学半
衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑因素，因此，多种剂量和治疗方案可以
是期望的。
解或分散在可药用载体中的多肽或其他试剂。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如
至少约0.1％的多肽或抗体。在另一些实施方案中，多肽或抗体可占单位重量的约2％至约
75％，或例如约25％至约60％，以及其中可推导的任何范围。每种治疗上有用的组合物中活
性化合物的量可以以这样的方式制备：在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂
量。制备这样的药物制剂的领域的技术人员将考虑因素例如溶解度、生物利用度、生物学半
衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑因素，因此，多种剂量和治疗方案可以
是期望的。
[0149] 短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物例如人时不产生不利、变态或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员将知道包
含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备，如Remington′s Pharmaceutical
Sciences，18th Ed.，1990所举例说明的，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应理解的是，制剂应符合FDA生物标准局要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标
准。
含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备，如Remington′s Pharmaceutical
Sciences，18th Ed.，1990所举例说明的，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应理解的是，制剂应符合FDA生物标准局要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标
准。
[0150] 进一步根据本发明的某些方面，适合于施用的组合物可以在具有或不具有惰性稀释剂的可药用载体中提供。载体应是可吸收的，并且包括液体、半固体(即糊状)或固体载
体。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、黏合剂、填充剂等，或其组合。如本文所用，“可药用载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、乙醇、盐水溶液、肠胃外载剂，例如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包衣(例如卵磷脂)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等渗剂(例如糖、氯化钠)、吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝、明胶)、盐、药物、药物稳定剂(例如缓冲剂、氨基酸(例如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露醇等)、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、流体和营养补充剂，这样的材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对于接受者或对于其中所含组合物的治疗效果是有害的，否则其在用于实施所述
方法的可施用的组合物中的使用是合适的。根据公知的参数调节药物组合物中各种组分的
pH和确切浓度。根据本发明的某些方面，以任何方便和实用的方式，即通过溶液、悬浮液、乳化、混合、包封、吸收、研磨等将组合物与载体结合。对于本领域技术人员而言，这样的程序是常规的。
体。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、黏合剂、填充剂等，或其组合。如本文所用，“可药用载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、乙醇、盐水溶液、肠胃外载剂，例如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包衣(例如卵磷脂)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等渗剂(例如糖、氯化钠)、吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝、明胶)、盐、药物、药物稳定剂(例如缓冲剂、氨基酸(例如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露醇等)、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、流体和营养补充剂，这样的材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对于接受者或对于其中所含组合物的治疗效果是有害的，否则其在用于实施所述
方法的可施用的组合物中的使用是合适的。根据公知的参数调节药物组合物中各种组分的
pH和确切浓度。根据本发明的某些方面，以任何方便和实用的方式，即通过溶液、悬浮液、乳化、混合、包封、吸收、研磨等将组合物与载体结合。对于本领域技术人员而言，这样的程序是常规的。
[0151] 本发明的某些实施方案可包括不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及施用途径(例如注射)是否需要无菌。可以将组合物配制成通过以下
施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、黏膜、经口、表面、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在脂质组合物(例如脂质体)中、或者通过其
他方法或任何前述方法的组合，如本领域普通技术人员已知的(参见例如Remington′s
Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，1990，其通过引用并入本文)。通常，这样的组合物可以制备成液体溶液剂或混悬剂；还可以制备成适于在注射前添加液体来制备溶液剂或混悬
剂的固体形式；并且，该制剂也可以被乳化。在一些实施方案中，通过注射或静脉内施用将
包含突变体或变体Fc结构域的治疗性蛋白质施用给哺乳动物对象(例如人)。
施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、黏膜、经口、表面、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在脂质组合物(例如脂质体)中、或者通过其
他方法或任何前述方法的组合，如本领域普通技术人员已知的(参见例如Remington′s
Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，1990，其通过引用并入本文)。通常，这样的组合物可以制备成液体溶液剂或混悬剂；还可以制备成适于在注射前添加液体来制备溶液剂或混悬
剂的固体形式；并且，该制剂也可以被乳化。在一些实施方案中，通过注射或静脉内施用将
包含突变体或变体Fc结构域的治疗性蛋白质施用给哺乳动物对象(例如人)。
[0152] 可以将多肽以游离碱、中性或盐形式配制成组合物。可药用盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或与无机酸例如盐酸或磷酸或者有机酸例如乙
酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、
钾、铵、钙或铁氢氧化物；或有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。
酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、
钾、铵、钙或铁氢氧化物；或有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。
[0153] 在另一些实施方案中，本发明可以涉及使用包含多肽、一种或更多种脂质和水性溶剂的药物脂质载剂组合物。如本文所用，术语“脂质”被定义为包括特征性地不溶于水并
且可以用有机溶剂提取的宽范围物质中的任一种。这种宽泛类别的化合物是本领域技术人
员公知的，并且在本文中使用术语“脂质”时，其不限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或产生)。但
是，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域中是公知的，包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质，可聚合的脂质、及其组合。当然，本文具体描述的那些以外的被本领域技术人员理解
为脂质的化合物也被所述组合物和方法所涵盖。
且可以用有机溶剂提取的宽范围物质中的任一种。这种宽泛类别的化合物是本领域技术人
员公知的，并且在本文中使用术语“脂质”时，其不限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或产生)。但
是，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域中是公知的，包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质，可聚合的脂质、及其组合。当然，本文具体描述的那些以外的被本领域技术人员理解
为脂质的化合物也被所述组合物和方法所涵盖。
[0154] 本领域普通技术人员熟悉可用于将组合物分散在脂质载剂中的一系列技术。例如，通过本领域普通技术人员已知的任何方式，多肽或其融合蛋白可以分散在包含脂质的
溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价结合，作为悬浮液包含在脂质中，与胶束或脂质体一起包含或复合，或其他方法与脂质或脂质结构缔合。分散
可以或可以不导致形成脂质体。在一些实施方案中，包含如本文所述的突变体或变体Fc结
构域的抗体可包含在靶向抗体的脂质体中。
溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价结合，作为悬浮液包含在脂质中，与胶束或脂质体一起包含或复合，或其他方法与脂质或脂质结构缔合。分散
可以或可以不导致形成脂质体。在一些实施方案中，包含如本文所述的突变体或变体Fc结
构域的抗体可包含在靶向抗体的脂质体中。
[0155] 术语“单位剂量”或“剂量”是指适合在对象中使用的物理上离散的单位，每个单位包含与其施用(即，合适的途径和治疗方案)相关联的经计算产生上述期望响应的预定量的治疗性组合物。根据治疗次数和单位剂量两者的施用量取决于期望的效果。向患者或对象
施用的本实施方案的组合物的确切剂量可通过物理和生理因素确定，例如对象的体重、年
龄、健康状况和性别、所治疗的疾病的类型、疾病渗透程度、先前或同时进行的治疗性干预、患者的特发病、施用途径以及特定治疗性物质的功效、稳定性和毒性。在另一些非限制性实
例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约
50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微
克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约
1000毫克/kg/体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在从本文列出的数字可推导的范
围的非限制性实例中，基于上述数字，可施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重，约5
微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等。无论如何，负责施用的从业者将决定组合物中活性
成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。
施用的本实施方案的组合物的确切剂量可通过物理和生理因素确定，例如对象的体重、年
龄、健康状况和性别、所治疗的疾病的类型、疾病渗透程度、先前或同时进行的治疗性干预、患者的特发病、施用途径以及特定治疗性物质的功效、稳定性和毒性。在另一些非限制性实
例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约
50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微
克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约
1000毫克/kg/体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在从本文列出的数字可推导的范
围的非限制性实例中，基于上述数字，可施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重，约5
微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等。无论如何，负责施用的从业者将决定组合物中活性
成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。
[0156] 无意于将本发明限于治疗制剂的特殊性质。例如，这样的组合物可以以与生理上可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂和赋形剂一起的制剂形式提供。可以将这些治疗制
剂以类似于其他治疗剂的方式施用于哺乳动物以用于兽医用途，例如家养动物，以及在人
中的临床用途。通常，治疗功效所需的剂量将根据使用类型和施用方式以及个体对象的具
体要求而变化。施用于动物患者的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来确定，例
如体重、病症严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、以及施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可以根据对象的响应而
变化。无论如何，负责施用的从业者将决定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂
量。
剂以类似于其他治疗剂的方式施用于哺乳动物以用于兽医用途，例如家养动物，以及在人
中的临床用途。通常，治疗功效所需的剂量将根据使用类型和施用方式以及个体对象的具
体要求而变化。施用于动物患者的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来确定，例
如体重、病症严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、以及施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可以根据对象的响应而
变化。无论如何，负责施用的从业者将决定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂
量。
[0157] VII.治疗方法
[0158] 本发明的某些方面提供了用于治疗疾病(例如肿瘤)的多肽，例如，使用包含本文所述的突变体或变体Fc结构域的治疗性蛋白质或抗体。特别地，该多肽可以具有人多肽序
列，因此可以防止在人患者中的变态反应，允许重复给药并提高治疗功效。
列，因此可以防止在人患者中的变态反应，允许重复给药并提高治疗功效。
[0159] “治疗”是指为了获得疾病或健康相关状况的治疗益处而向对象施用或应用治疗剂或对对象进行程序或方式(modality)。例如，治疗可以包括将药学上有效量的靶向CDC的
抗体施用于癌细胞而不触发癌细胞增殖。
抗体施用于癌细胞而不触发癌细胞增殖。
[0160] “对象”和“患者”是指人或非人，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在一些特定的实施方案中，对象是人。
[0161] 在本申请全文中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指就该病症的医学治疗而言促进或增强对象的健康的任何事物。这包括但不限于减少疾病体征或症状的频率或严
重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如减小肿瘤尺寸、降低肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长
速率或防止转移。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的对象的存活。
重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如减小肿瘤尺寸、降低肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长
速率或防止转移。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的对象的存活。
[0162] 可使用本治疗方法的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液学肿瘤中发现的那些。示例性实体瘤可包括但不限于选自以下的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳腺。血液学肿瘤的实例包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、多种类型的头颈癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、雀斑样痣恶性黑色素瘤
(1entigo malignant melanoma)、肢端雀斑样痣黑色素瘤(acral lentiginous
melanomas)、结节性黑色素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；
小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥散性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度淋巴母细胞NHL；高度小非分裂细胞NHL；巨块型NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤(mantle
cell lymphoma)；AIDS相关淋巴瘤；和Waldenstrom巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病
(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病。
(1entigo malignant melanoma)、肢端雀斑样痣黑色素瘤(acral lentiginous
melanomas)、结节性黑色素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；
小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥散性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度淋巴母细胞NHL；高度小非分裂细胞NHL；巨块型NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤(mantle
cell lymphoma)；AIDS相关淋巴瘤；和Waldenstrom巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病
(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病。
[0163] 癌症可以具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨大细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；
毛母质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；
胆管癌；肝细胞癌；混合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌(acidophil carcinoma)；嗜酸性腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱性癌
(basophil carcinoma)；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包膜硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；
皮肤附着物癌；大汗腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌(ceruminous adenocarcinoma)；黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)；囊腺癌
(cystadenocarcinoma)；乳头状囊腺癌(papillary cystadenocarcinoma)；乳头状浆液性
囊腺癌(papillary serous cystadenocarcinoma)；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；
浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；w/鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤(thecoma，malignant)；恶性颗粒细胞瘤；恶性雄性母细胞瘤；支持细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性睾丸间质细胞瘤
(leydig cell tumor，malignan)；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺旁神经节
瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤
(amelanotic melanoma)；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤(malignant
melanoma in giant pigmented nevus)；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉
瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤(myxosarcoma)；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor，malignant)；恶性叶状瘤
(phyllodes tumor，malignant)；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤(dysgerminoma)；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤(struma ovarii，malignant)；绒毛膜癌；恶性中肾瘤
(mesonephroma，malignant)；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi′s
sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤(juxtacortical
osteosarcoma)；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤
(ewing′s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤(ameloblastic odontosarcoma)；
恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质
瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；
视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin′s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样肉芽肿病(mycosis
fungoides)；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞
肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血
病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
毛母质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；
胆管癌；肝细胞癌；混合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌(acidophil carcinoma)；嗜酸性腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱性癌
(basophil carcinoma)；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包膜硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；
皮肤附着物癌；大汗腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌(ceruminous adenocarcinoma)；黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)；囊腺癌
(cystadenocarcinoma)；乳头状囊腺癌(papillary cystadenocarcinoma)；乳头状浆液性
囊腺癌(papillary serous cystadenocarcinoma)；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；
浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；w/鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤(thecoma，malignant)；恶性颗粒细胞瘤；恶性雄性母细胞瘤；支持细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性睾丸间质细胞瘤
(leydig cell tumor，malignan)；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺旁神经节
瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤
(amelanotic melanoma)；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤(malignant
melanoma in giant pigmented nevus)；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉
瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤(myxosarcoma)；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor，malignant)；恶性叶状瘤
(phyllodes tumor，malignant)；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤(dysgerminoma)；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤(struma ovarii，malignant)；绒毛膜癌；恶性中肾瘤
(mesonephroma，malignant)；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi′s
sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤(juxtacortical
osteosarcoma)；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤
(ewing′s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤(ameloblastic odontosarcoma)；
恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质
瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；
视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin′s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样肉芽肿病(mycosis
fungoides)；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞
肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血
病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
[0164] 多肽在本文中可以多种方式用作抗肿瘤剂，以触发肿瘤组织中的补体激活或在需要时触发补体激活。在一个特定的实施方案中，本发明考虑了使用多肽作为抗肿瘤剂的方
法，因此包括使肿瘤细胞群与治疗有效量的多肽接触足以抑制肿瘤细胞生长的时间。
法，因此包括使肿瘤细胞群与治疗有效量的多肽接触足以抑制肿瘤细胞生长的时间。
[0165] 在一个实施方案中，通过静脉内、腹膜内或肿瘤内注射向患者施用治疗有效量的生理学耐受的包含本发明多肽的组合物来实现体内接触。多肽可以通过注射或随着时间逐
渐输注来肠胃外施用。多肽可以静脉内、腹膜内、经口、肌内、皮下、腔内、经皮、真皮施用，可以通过蠕动装置递送，或者可以直接注射到含有肿瘤细胞的组织中。
渐输注来肠胃外施用。多肽可以静脉内、腹膜内、经口、肌内、皮下、腔内、经皮、真皮施用，可以通过蠕动装置递送，或者可以直接注射到含有肿瘤细胞的组织中。
[0166] 包含多肽的治疗组合物常规地静脉内施用，例如通过注射例如单位剂量。当用于提及治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于对象的单位剂量的物理上离散的单
位，每个单位包含与所需稀释剂(即载体或载剂)相关联的经计算产生期望的治疗效果的预
定量的活性物质。
位，每个单位包含与所需稀释剂(即载体或载剂)相关联的经计算产生期望的治疗效果的预
定量的活性物质。
[0167] 以与剂量制剂相容的方式和治疗有效量施用组合物。施用量取决于待治疗的对象，对象的系统利用活性成分的能力以及期望的治疗效果程度。需要施用的活性成分的精
确量取决于从业者的判断，并且对于每个个体是特有的。但是，本文公开了适合全身施用的
合适剂量范围，并且取决于施用途径。还考虑了用于初次施用和加强施用的合适方案，其特
征在于初次施用，然后通过随后的注射或其他施用以一个或更多个小时的间隔重复给药。
本文描述了示例性的多次施用，并且特别优选地是维持持续高的多肽血清和组织水平。或
者，考虑了足以将血液中的浓度维持在体内疗法规定的范围内的持续静脉内输注。
确量取决于从业者的判断，并且对于每个个体是特有的。但是，本文公开了适合全身施用的
合适剂量范围，并且取决于施用途径。还考虑了用于初次施用和加强施用的合适方案，其特
征在于初次施用，然后通过随后的注射或其他施用以一个或更多个小时的间隔重复给药。
本文描述了示例性的多次施用，并且特别优选地是维持持续高的多肽血清和组织水平。或
者，考虑了足以将血液中的浓度维持在体内疗法规定的范围内的持续静脉内输注。
[0168] 预期本发明的多肽可以全身或局部施用以治疗疾病，例如在患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中抑制肿瘤细胞生长或杀伤癌细胞。其可以静脉内、鞘内和/或腹膜内施
用。其可以单独施用或与抗增殖药组合。在一个实施方案中，其在手术或其他程序之前施用
以降低患者的癌症负荷。或者，其可以在手术之后施用以确保任何剩余的癌症(例如，手术
未能消除的癌症)不能存活。
用。其可以单独施用或与抗增殖药组合。在一个实施方案中，其在手术或其他程序之前施用
以降低患者的癌症负荷。或者，其可以在手术之后施用以确保任何剩余的癌症(例如，手术
未能消除的癌症)不能存活。
[0169] 多肽的治疗有效量是经计算实现期望效果，即触发肿瘤组织中的CDC，并从而介导消融肿瘤的促炎响应的预定量。因此，本发明的多肽的施用剂量范围是足够大以产生期望
效果的剂量范围，其中肿瘤细胞分裂和细胞周期的症状得以减轻。剂量不应过大而引起不
良副作用，例如高黏滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭、神经系统影响等。通常，剂量将随着患者的年龄、状况，性别和患者中疾病的程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。
在任何并发症的情况下，剂量可以由个别医师进行调整。
效果的剂量范围，其中肿瘤细胞分裂和细胞周期的症状得以减轻。剂量不应过大而引起不
良副作用，例如高黏滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭、神经系统影响等。通常，剂量将随着患者的年龄、状况，性别和患者中疾病的程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。
在任何并发症的情况下，剂量可以由个别医师进行调整。
[0170] VIII.联合治疗
[0171] 在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与第二或另外的疗法组合施用多肽或抗体。这样的疗法可用于治疗对CDC有响应的任何疾病。例如，疾病可以是癌
症。
症。
[0172] 包括联合治疗在内的方法和组合物增强了治疗或保护作用，和/或提高了另一抗癌或抗过度增殖疗法的治疗作用。治疗和预防方法和组合物可以有效地实现期望作用的组
合量提供，例如杀伤癌细胞和/或抑制细胞过度增殖。该过程可涉及施用多肽或抗体以及第
二疗法。第二疗法可具有或可没有直接细胞毒性作用。例如，第二疗法可以是上调免疫系统
而没有直接细胞毒性作用的药剂。组织、肿瘤或细胞可暴露于包含一种或更多种药剂(例如
多肽或抗癌剂)的一种或更多种组合物或药理制剂，或通过使组织、肿瘤和/或细胞暴露于
两种或更多种不同的组合物或制剂，其中一种组合物提供1)多肽或抗体，2)抗癌剂，或3)多
肽或抗体和抗癌剂两者。另外，预期这样的联合疗法可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法
或免疫疗法结合使用。
合量提供，例如杀伤癌细胞和/或抑制细胞过度增殖。该过程可涉及施用多肽或抗体以及第
二疗法。第二疗法可具有或可没有直接细胞毒性作用。例如，第二疗法可以是上调免疫系统
而没有直接细胞毒性作用的药剂。组织、肿瘤或细胞可暴露于包含一种或更多种药剂(例如
多肽或抗癌剂)的一种或更多种组合物或药理制剂，或通过使组织、肿瘤和/或细胞暴露于
两种或更多种不同的组合物或制剂，其中一种组合物提供1)多肽或抗体，2)抗癌剂，或3)多
肽或抗体和抗癌剂两者。另外，预期这样的联合疗法可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法
或免疫疗法结合使用。
[0173] 当用于细胞时，术语“接触的”和“暴露的”在本文中用于描述将治疗性多肽或抗体以及化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置的过程。为了实现细胞杀伤，例如，将两种药剂以有效杀伤细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。
[0174] 多肽或抗体可以在相对于抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用间隔可以从同时至数分钟至数天至数周。在多肽或抗体与抗癌剂分开提供给患者的实施方案
中，通常将确保每次递送之间有意义的时间段没有到期，以使得两种化合物仍然能够对患
者发挥有利的组合作用。在这种情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更特别地在
彼此约6-12小时内为患者提供多肽和抗癌疗法。在某些情况下，可希望将治疗时间显著延
长，其中在各施用之间流逝数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
中，通常将确保每次递送之间有意义的时间段没有到期，以使得两种化合物仍然能够对患
者发挥有利的组合作用。在这种情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更特别地在
彼此约6-12小时内为患者提供多肽和抗癌疗法。在某些情况下，可希望将治疗时间显著延
长，其中在各施用之间流逝数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
[0175] 在某些实施方案中，治疗过程将持续1-90天或更长时间(该范围包括中间天数)。预期可以在第1天至第90天的任一天(该范围包括中间天数)或其任何组合施用一种药剂，
并且在第1天至第90天的任一天(该范围包括中间天数)或其任何组合施用另一药剂。在一
天(24小时内)内，可以给予患者药剂的一次或多次施用。而且，在治疗过程之后，预期存在
不施用抗癌治疗的时期。该时期可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间
(该范围包括中间天数)，这取决于患者的状况，例如其预后、力量、健康等。预计可以根据需要重复治疗周期。
并且在第1天至第90天的任一天(该范围包括中间天数)或其任何组合施用另一药剂。在一
天(24小时内)内，可以给予患者药剂的一次或多次施用。而且，在治疗过程之后，预期存在
不施用抗癌治疗的时期。该时期可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间
(该范围包括中间天数)，这取决于患者的状况，例如其预后、力量、健康等。预计可以根据需要重复治疗周期。
[0176] 可以采用多种组合。对于下面的实例，多肽或抗体为“A”，并且抗癌疗法为“B”：
[0177]
[0178] 将本发明实施方案的任何多肽或疗法施用于患者将在考虑药剂的毒性(如果有的话)的情况下遵循施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归
因于联合疗法的毒性的步骤。在涉及治疗对象的癌症的一些实施方案中，第二疗法可以是
例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、基因疗法或手术。
因于联合疗法的毒性的步骤。在涉及治疗对象的癌症的一些实施方案中，第二疗法可以是
例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、基因疗法或手术。
[0179] A.化学疗法
[0180] 根据本发明的一些实施方案，可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些
药剂或药物通过其在细胞内的活动方式进行分类，例如，其是否以及在哪个阶段影响细胞
周期。或者，可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成而诱导染色体和有丝分
裂异常的能力来表征药剂。
药剂或药物通过其在细胞内的活动方式进行分类，例如，其是否以及在哪个阶段影响细胞
周期。或者，可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成而诱导染色体和有丝分
裂异常的能力来表征药剂。
[0181] 化疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸盐类(alkyl sulfonates)，例如白消安(busulfan)、英丙
舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯佐替派
(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚
胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、
三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑
硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；
番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮
(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托扑替康(topotecan))；苔藓
抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新
(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐
藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，
KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮
芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰
胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide
hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇
(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥
(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素
(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)
和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素
(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I；dynemicin，包括dynemicin
A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素
(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素
发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素
(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C
(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星
(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比
星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素
(mitomycin)例如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄
霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素
(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素
(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司
(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤
(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸
(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸
如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和
硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷
(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷
(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷
(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone
propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯
(testolactone)；抗肾上腺类，诸如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充
剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷
(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶
(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙
(edatraxate)地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；
elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁
(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明
(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌
素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇
(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；
吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙
基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物
(PSKpolysaccharide complex)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰
(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌
(triaziquone)；2，2′，2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦
(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；
二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；
gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；类紫烷醇(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-
硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂配位复合物(platinum
coordination complexes)，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂
(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺
(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨
(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐
(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，例如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨
(capecitabine)；卡铂(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂
(transplatinum)和上述任一种的可药用盐、酸或衍生物。
舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯佐替派
(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚
胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、
三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑
硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；
番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮
(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托扑替康(topotecan))；苔藓
抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新
(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐
藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，
KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮
芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰
胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide
hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇
(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥
(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素
(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)
和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素
(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I；dynemicin，包括dynemicin
A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素
(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素
发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素
(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C
(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星
(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比
星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素
(mitomycin)例如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄
霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素
(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素
(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司
(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤
(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸
(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸
如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和
硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷
(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷
(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷
(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone
propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯
(testolactone)；抗肾上腺类，诸如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充
剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷
(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶
(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙
(edatraxate)地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；
elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁
(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明
(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌
素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇
(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；
吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙
基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物
(PSKpolysaccharide complex)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰
(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌
(triaziquone)；2，2′，2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦
(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；
二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；
gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；类紫烷醇(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-
硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂配位复合物(platinum
coordination complexes)，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂
(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺
(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨
(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐
(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，例如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨
(capecitabine)；卡铂(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂
(transplatinum)和上述任一种的可药用盐、酸或衍生物。
[0182] B.放射疗法
[0183] 引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或将放射性同位素直接递送至肿瘤细胞。还可以考虑其他形式的DNA损伤因子，例如微波、质子
束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。所有这些因素最有可能引起对DNA、
DNA前体、DNA复制和修复以及染色体装配和维持的广泛损害。X射线的剂量范围从50至200
伦琴的每日剂量持续延长的时间(3至4周)到单次剂量的2000至6000伦琴。放射性同位素的
剂量范围差异很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及赘生细胞
的吸收。
束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。所有这些因素最有可能引起对DNA、
DNA前体、DNA复制和修复以及染色体装配和维持的广泛损害。X射线的剂量范围从50至200
伦琴的每日剂量持续延长的时间(3至4周)到单次剂量的2000至6000伦琴。放射性同位素的
剂量范围差异很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及赘生细胞
的吸收。
[0184] C.免疫疗法
[0185] 本领域技术人员将理解免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的情况下，免疫疗法通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向和抑制免疫细胞。博纳
吐单抗(Blinatumomab) 就是这样的例子。检查点抑制剂如伊匹单抗
(ipilumimab)是另一个这样的例子。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志
物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当治疗的效应物，或者可以募集其他细胞来实际
影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱
毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
吐单抗(Blinatumomab) 就是这样的例子。检查点抑制剂如伊匹单抗
(ipilumimab)是另一个这样的例子。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志
物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当治疗的效应物，或者可以募集其他细胞来实际
影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱
毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
[0186] 在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有一些适合于靶向的标志物，即，在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标志物，并且在本发明实施方案的情况下，这些肿瘤标志
物中的任一种都可适于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、
gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。
免疫疗法的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用结合起来。还存在免疫刺激分子，包
括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生长因子，例如FLT3配体。
物中的任一种都可适于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、
gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。
免疫疗法的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用结合起来。还存在免疫刺激分子，包
括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生长因子，例如FLT3配体。
[0187] 目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化
合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides et al.，
1998)；细胞因子疗法，例如α、β和γ干扰素、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski et al.，1998；
Davidson et al.，1998；Hellstrand et al.，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi et
al.，1998；美国专利5,824,311)。预期一种或更多种抗癌疗法可以与本文所述的抗体疗法
一起使用。
合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides et al.，
1998)；细胞因子疗法，例如α、β和γ干扰素、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski et al.，1998；
Davidson et al.，1998；Hellstrand et al.，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al.，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi et
al.，1998；美国专利5,824,311)。预期一种或更多种抗癌疗法可以与本文所述的抗体疗法
一起使用。
[0188] D.手术
[0189] 大约60％的患有癌症的人将接受某种类型的手术，其包括预防、诊断或分期、治愈和姑息手术。治愈手术包括切除术，其中物理去除、切除和/或破坏癌组织全部或一部分，并且可与其他疗法例如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法结合使用。肿瘤切除术是物理去除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除术
外，通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制手术(莫氏手术)。
外，通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制手术(莫氏手术)。
[0190] 在切除癌细胞、组织或肿瘤的一部分或全部之后，可在体内形成腔。可以通过对该区域进行灌注、直接注射或局部应用其他抗癌疗法来完成治疗。这样的治疗可以重复，例如
每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
这些治疗也可以具有不同的剂量。
每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
这些治疗也可以具有不同的剂量。
[0191] E.其他药剂
[0192] 预期可以将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的功效。这些其他药剂包括实现细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞
黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导物敏感性的药剂或其他生物剂。通过增加GAP连
接数来提高细胞间信号转导可提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些
实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面结合使用以改善治疗
的抗过度增殖功效。预期细胞黏附抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞黏附抑制剂
的例子是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑到可以将提高过度增殖细胞对
凋亡的敏感性的其他药剂(例如抗体c225)与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善
治疗功效。
黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导物敏感性的药剂或其他生物剂。通过增加GAP连
接数来提高细胞间信号转导可提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些
实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面结合使用以改善治疗
的抗过度增殖功效。预期细胞黏附抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞黏附抑制剂
的例子是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑到可以将提高过度增殖细胞对
凋亡的敏感性的其他药剂(例如抗体c225)与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善
治疗功效。
[0193] IX.试剂盒
[0194] 本发明的某些方面可以提供试剂盒，例如治疗试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或更多种本文所述的药物组合物以及任选的其使用说明。试剂盒还可包含一种或更多种用于
完成这样的组合物的施用的装置。例如，主题试剂盒可包含药物组合物和用于完成将组合
物直接静脉内注射到癌性肿瘤中导管。在另一些实施方案中，主题试剂盒可包含预先填充
的多肽的安瓿，任选地配制成药物或冻干，以与递送装置一起使用。
完成这样的组合物的施用的装置。例如，主题试剂盒可包含药物组合物和用于完成将组合
物直接静脉内注射到癌性肿瘤中导管。在另一些实施方案中，主题试剂盒可包含预先填充
的多肽的安瓿，任选地配制成药物或冻干，以与递送装置一起使用。
[0195] 试剂盒可包含带有标签的容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器可以容纳包含对例如上述治疗或非治疗应用有效的
多肽的组合物。容器上的标签可以指示该组合物用于特定疗法或非治疗性应用，并且也可
以指示体内或体外使用的方向，例如上文所述那些。本发明的试剂盒通常将包含上述容器
和一个或更多个其他容器，所述其他容器包含从商业和用户的角度来看期望的材料，包括
缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装插页。
多肽的组合物。容器上的标签可以指示该组合物用于特定疗法或非治疗性应用，并且也可
以指示体内或体外使用的方向，例如上文所述那些。本发明的试剂盒通常将包含上述容器
和一个或更多个其他容器，所述其他容器包含从商业和用户的角度来看期望的材料，包括
缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装插页。
[0196] X.实施例
[0197] 包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此
可以认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以
在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的特定实施方案进行许多改变，并且仍可
获得相同或相似的结果。
可以认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以
在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的特定实施方案进行许多改变，并且仍可
获得相同或相似的结果。
[0198] 实施例1-用于分离IgG1 Fc结构域的文库构建策略
[0199] 大肠杆菌不编码蛋白质糖基化机器，因此在大肠杆菌的周质中表达的IgG的Fc结构域是无糖基化的，缺乏通常附接到Fc结构域的N297的聚糖。无糖基化的Fc结构域表现出
更高程度的构象柔性，这导致高度减弱的或无可检出的与效应物FcγR(FcγRIA、Fcγ
RIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、FcγRIIIB)和C1q的结合(Jefferis et al.，2005；
Borrok et al.，2012)，但聚糖的丢失不影响IgG的pH依赖性FcRn结合特性。为了分离包含
与野生型IgG相比能够增强与FcRn的结合的突变的Fc结构域变体，将Fc结构域对于FcRn的
结合位点随机化。在Asp249、Thr250、Leu251、Met252、Ile253、Ser254、Arg255、Val308、Leu309、Gln311、Asp312、Leu314、Glu430、Leu432、Tyr436和Gln438处引入随机氨基酸替换。
如以下实施例2中所述(表4)，设计了八种引物(SEQ ID NO：12-19)并用于诱变。
更高程度的构象柔性，这导致高度减弱的或无可检出的与效应物FcγR(FcγRIA、Fcγ
RIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、FcγRIIIB)和C1q的结合(Jefferis et al.，2005；
Borrok et al.，2012)，但聚糖的丢失不影响IgG的pH依赖性FcRn结合特性。为了分离包含
与野生型IgG相比能够增强与FcRn的结合的突变的Fc结构域变体，将Fc结构域对于FcRn的
结合位点随机化。在Asp249、Thr250、Leu251、Met252、Ile253、Ser254、Arg255、Val308、Leu309、Gln311、Asp312、Leu314、Glu430、Leu432、Tyr436和Gln438处引入随机氨基酸替换。
如以下实施例2中所述(表4)，设计了八种引物(SEQ ID NO：12-19)并用于诱变。
[0200] 表4.本研究中使用的引物(提供为SEQ ID NO：12-19)
[0201]
[0202] 实施例2-用于工程化Fc结构域的文库的构建
[0203] 所有质粒和引物描述于表4、10和11中。所有引物由Integrated DNA Technologies合成。使用以下载体表达IgG多肽并展示在大肠杆菌的内膜上：pBAD30-PelB-
VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc和pMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAG(Jung et al.，
2012和Lee et al.，2017)(图1-2)。为了使Fc结构域的FcRn结合位点随机化，设计了八种引
物(SEQ ID NO：12-19)(表4和图2)。用八种引物扩增IgG1的重链基因的四个片段，并通过重
叠延伸与PCHT01(SEQ ID NO：12)和PCHT08(SEQ ID NO：19)缝合在一起。Fc文库基因通过以
下热循环程序扩增：94℃持续5分钟的一个循环；94℃持续1分钟，55℃持续1分钟，并且72℃持续1.5分钟的30个循环；72℃持续5分钟的一个循环。将扩增的重链文库基因在框内连接
到经SfiI消化的pMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAG载体中。将得到的质粒转化到
含有质粒pBAD30-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc的大肠杆菌JUDE-1细胞中(Jung et
al.，2010；Jung et al.，2012；Lee et al.，2017)。文库的大小为1×108。
VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc和pMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAG(Jung et al.，
2012和Lee et al.，2017)(图1-2)。为了使Fc结构域的FcRn结合位点随机化，设计了八种引
物(SEQ ID NO：12-19)(表4和图2)。用八种引物扩增IgG1的重链基因的四个片段，并通过重
叠延伸与PCHT01(SEQ ID NO：12)和PCHT08(SEQ ID NO：19)缝合在一起。Fc文库基因通过以
下热循环程序扩增：94℃持续5分钟的一个循环；94℃持续1分钟，55℃持续1分钟，并且72℃持续1.5分钟的30个循环；72℃持续5分钟的一个循环。将扩增的重链文库基因在框内连接
到经SfiI消化的pMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAG载体中。将得到的质粒转化到
含有质粒pBAD30-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc的大肠杆菌JUDE-1细胞中(Jung et
al.，2010；Jung et al.，2012；Lee et al.，2017)。文库的大小为1×108。
[0204] 实施例3-人FcRn-β2m-GST的制备
[0205] 如先前所述(Lee et al.，2017)构建用于FcRn的哺乳动物表达的质粒。通过使用pcDNA3.4(Thermofisher)瞬时转染HEK293F细胞(Invitrogen)来产生FcRn-β2m-GST。将转
染的HEK293F细胞在5％CO2培养箱中于37℃培养5天。通过以4,000×g离心10分钟收集上清
液，并使用0.22μm的聚醚砜(PES)膜滤器(PALL)过滤。根据制造商的说明用谷胱甘肽琼脂糖
(GE Healthcare)亲和柱来纯化FcRn-β2m-GST。为了去除脂多糖(LPS)和非特异性结合的蛋
白质，将FcRn-β2m-GST结合的树脂用50mL含0.1％ X-114(Sigma-Aldrich)的PBS和
50mL PBS洗涤。用含有10mM还原型L-谷胱甘肽的PBS洗脱FcRn-β2m-GST。使用AmiconUltra-
4(Millipore)单元将洗脱的FcRn-β2m-GST的缓冲液交换为PBS。并且单链FcRn-β2m-his
(scFcRn)购自Acro Biosystems(目录号FCM-H5286)。根据制造商的说明，使用FITC快速缀
合试剂盒(Abcam，目录号ab188285)用FITC标记人scFcRn。此外，根据制造商的说明，使用
EasyLink R-PE缀合试剂盒(Abcam)用R-藻红蛋白(R-PE)标记人FcRn-β2m-GST。
染的HEK293F细胞在5％CO2培养箱中于37℃培养5天。通过以4,000×g离心10分钟收集上清
液，并使用0.22μm的聚醚砜(PES)膜滤器(PALL)过滤。根据制造商的说明用谷胱甘肽琼脂糖
(GE Healthcare)亲和柱来纯化FcRn-β2m-GST。为了去除脂多糖(LPS)和非特异性结合的蛋
白质，将FcRn-β2m-GST结合的树脂用50mL含0.1％ X-114(Sigma-Aldrich)的PBS和
50mL PBS洗涤。用含有10mM还原型L-谷胱甘肽的PBS洗脱FcRn-β2m-GST。使用AmiconUltra-
4(Millipore)单元将洗脱的FcRn-β2m-GST的缓冲液交换为PBS。并且单链FcRn-β2m-his
(scFcRn)购自Acro Biosystems(目录号FCM-H5286)。根据制造商的说明，使用FITC快速缀
合试剂盒(Abcam，目录号ab188285)用FITC标记人scFcRn。此外，根据制造商的说明，使用
EasyLink R-PE缀合试剂盒(Abcam)用R-藻红蛋白(R-PE)标记人FcRn-β2m-GST。
[0206] 如先前所述(Jung et al.，2012和Lee et al.，2017)构建用于FcγR的哺乳动物表达的质粒。通过使用表11中描述的pMAZ-IgH(美国专利号8,043,621)来源的表达载体瞬
时转染HEK293F细胞(Invitrogen)来产生FcγRI-His、FcγRIIa-H131-GST、FcγRIIa-R131-
GST、FcγRIIb-GST、FcγRIIIa-V158-GST和FcγRIIIa-F158-GST。详细程序如上段所述。根据制造商的说明用Ni-NTA(GE Healthcare)亲和柱纯化FcγRI-His。用含有250mM咪唑的PBS
洗脱FcγRI-His。用与FcRn-β2m-GST相同的方法纯化FcγR-GST。通过Amicon Ultra-4
(Millipore)将所有洗脱的FcγR的缓冲液交换为PBS。
时转染HEK293F细胞(Invitrogen)来产生FcγRI-His、FcγRIIa-H131-GST、FcγRIIa-R131-
GST、FcγRIIb-GST、FcγRIIIa-V158-GST和FcγRIIIa-F158-GST。详细程序如上段所述。根据制造商的说明用Ni-NTA(GE Healthcare)亲和柱纯化FcγRI-His。用含有250mM咪唑的PBS
洗脱FcγRI-His。用与FcRn-β2m-GST相同的方法纯化FcγR-GST。通过Amicon Ultra-4
(Millipore)将所有洗脱的FcγR的缓冲液交换为PBS。
[0207] 实施例4-用于FcRn的Fc文库的筛选
[0208] 将大肠杆菌JUDE-1细胞在37℃和250rpm下在具有氯霉素(40μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的Terrific Broth(TB)中培养过夜。在过夜生长后，将细胞在具有两种抗生素的
新鲜100mL TB培养基中以1∶50稀释。在37℃和250rpm下培养大肠杆菌JUDE-1细胞，直到
OD600达到约0.4的值。然后，将1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，SigmaAldrich)和2％L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich)添加到大肠杆菌JUDE-1细胞以促进蛋白质表达，然后将
细胞在25℃进一步孵育20小时。通过离心收获培养物(8mL培养物体积)，并在1mL冰冷的
10mM Tris-HCl(pH8.0)中洗涤两次。将洗涤的细胞重悬于1mL冰冷的STE溶液(0.5M蔗糖，
10mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)中，并在37℃下孵育30分钟。将细胞以13,000rpm离心1分钟，并用1mL溶液A(0.5M蔗糖，20mM MgCl2、10mM MOPS，pH6.8)洗涤。将经洗涤的细胞在具有1mg/mL鸡卵溶菌酶(Sigma-Aldrich)的1mL溶液A中在37℃下孵育15分钟。在13,000rpm离
心1分钟后，将沉淀的原生质球重悬于1mL冷PBS中(Jung et al.，2010；Jung et al.，2012；
Lee et al.，2017)。
新鲜100mL TB培养基中以1∶50稀释。在37℃和250rpm下培养大肠杆菌JUDE-1细胞，直到
OD600达到约0.4的值。然后，将1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，SigmaAldrich)和2％L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich)添加到大肠杆菌JUDE-1细胞以促进蛋白质表达，然后将
细胞在25℃进一步孵育20小时。通过离心收获培养物(8mL培养物体积)，并在1mL冰冷的
10mM Tris-HCl(pH8.0)中洗涤两次。将洗涤的细胞重悬于1mL冰冷的STE溶液(0.5M蔗糖，
10mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)中，并在37℃下孵育30分钟。将细胞以13,000rpm离心1分钟，并用1mL溶液A(0.5M蔗糖，20mM MgCl2、10mM MOPS，pH6.8)洗涤。将经洗涤的细胞在具有1mg/mL鸡卵溶菌酶(Sigma-Aldrich)的1mL溶液A中在37℃下孵育15分钟。在13,000rpm离
心1分钟后，将沉淀的原生质球重悬于1mL冷PBS中(Jung et al.，2010；Jung et al.，2012；
Lee et al.，2017)。
[0209] 为了分离增强的结合FcRn的IgG1变体，用100nM FcRn-β2m-FITC标记表达实施例1和2中描述的文库的细胞，并在FACSAriaTM(BD Biosciences)上进行筛选。对于四轮FACS筛
选中的每一轮，回收显示出最高荧光的前3％群，并立即对这些分选的原生质球进行再分
选，以除去假阳性。在煮沸5分钟后，使用两种引物(PCHT01和PCHT08)通过PCR拯救分选的原
生质球中的重链基因，并将其连接到SfiI切割的pMopac12载体中。将连接的质粒转化到大
肠杆菌JUDE-1细胞中。在含氯霉素和卡那霉素的培养基上选择转化子，并使用100nM FcRn-
β2m-FITC制备原生质球用于下一轮筛选(图3A-B)。为了分离针对FcRn的pH依赖性结合IgG
变体，将原生质球在pH 5.8PBS中用100nM单链FcRn-β2m-FITC进行标记，然后在pH 7.4PBS
中与FcRn-β2m-GST-APC一起孵育(图3A)。接下来，分选具有FITC阳性和APC阴性信号的原生
质球(图3B)。
选中的每一轮，回收显示出最高荧光的前3％群，并立即对这些分选的原生质球进行再分
选，以除去假阳性。在煮沸5分钟后，使用两种引物(PCHT01和PCHT08)通过PCR拯救分选的原
生质球中的重链基因，并将其连接到SfiI切割的pMopac12载体中。将连接的质粒转化到大
肠杆菌JUDE-1细胞中。在含氯霉素和卡那霉素的培养基上选择转化子，并使用100nM FcRn-
β2m-FITC制备原生质球用于下一轮筛选(图3A-B)。为了分离针对FcRn的pH依赖性结合IgG
变体，将原生质球在pH 5.8PBS中用100nM单链FcRn-β2m-FITC进行标记，然后在pH 7.4PBS
中与FcRn-β2m-GST-APC一起孵育(图3A)。接下来，分选具有FITC阳性和APC阴性信号的原生
质球(图3B)。
[0210] 实施例5-IgG变体的FACS分析
[0211] 鉴定了四种IgG变体，EDH(V264E、L309D和Q311H)，EDHS(SEQ ID NO：5；V264E、L309D、Q311H和N434S)，EDHY(SEQ ID NO：6；V264E、L309D，Q311H和N434Y)和TEDHY(A231T、V264E、L309D、Q311H和N434Y)。将各基因转化到大肠杆菌JUDE-1中，将细胞原生质球化并通过FACS用pH 5.8PBS中的10nM FcRn-β2m-FITC或pH 7.4PBS中的50nM FcRn-β2m-GST-APC进
行分析。如图4所示，对于FcRn-β2m-FITC，相对于野生型无糖基化IgG，四种IgG变体显示出
2.6-5.1倍高的平均荧光强度(MFI)值。对于pH 7.4PBS中的FcRn-β2m-GST-APC，EDHY和
TEDHY显示出比野生型IgG1显著更高的结合活性，而EDH和EDHS显示出与野生型IgG1类似或
稍微升高的结合活性。
行分析。如图4所示，对于FcRn-β2m-FITC，相对于野生型无糖基化IgG，四种IgG变体显示出
2.6-5.1倍高的平均荧光强度(MFI)值。对于pH 7.4PBS中的FcRn-β2m-GST-APC，EDHY和
TEDHY显示出比野生型IgG1显著更高的结合活性，而EDH和EDHS显示出与野生型IgG1类似或
稍微升高的结合活性。
[0212] 实施例6-所选突变体IgG变体的表达和纯化
[0213] 表4、10和11中描述了所有质粒和引物。使用两种特异性引物(TH083(SEQ ID NO：20)和TH084(SEQ ID NO：21))从pMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAG扩增了四种突
变体Fc基因。使用两种特异性引物(TH081(SEQ ID NO：22)和TH082(SEQ ID NO：23))扩增
pcDNA3.4-IgH质粒。根据制造商的说明使用Gibson 克隆试剂盒(NEB)将四种
Fc基因克隆到pcDNA3.4中(Lee et al.，2017)。将Gibson组装混合物转化到大肠杆菌JUDE-
1细胞中，并确认其序列。并使用曲妥珠单抗的Fab。将四种曲妥珠单抗-Fc变体的重链基因
与等量的轻链质粒一起在HEK293F细胞(Invitrogen)中进行瞬时转染。在5％CO2培养箱中
于37℃孵育6天后，以4,000×g离心10分钟收集上清液，并且使用0.22μm PES膜滤器(PALL)
过滤。将过滤的上清液通过蛋白A高容量琼脂糖树脂(Thermo Scientific)3次。为了去除
LPS和非特异性结合的蛋白质，将IgG结合的树脂用含有0.1％ X-114(Sigma-
Aldrich)的50mL PBS和50mL PBS进行洗涤。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所有IgG变
体，并立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和。通过 Ultra-4(Millipore)将
所有洗脱的曲妥珠单抗-Fc抗体变体的缓冲液交换为PBS。在还原和非还原条件下，通过
4％-20％梯度SDS-PAGE凝胶(NuSep)评估上述HEK293细胞中表达的曲妥珠单抗-Fc抗体变
体和真实(w.t.)曲妥珠单抗的还原或未还原蛋白质的纯度。
变体Fc基因。使用两种特异性引物(TH081(SEQ ID NO：22)和TH082(SEQ ID NO：23))扩增
pcDNA3.4-IgH质粒。根据制造商的说明使用Gibson 克隆试剂盒(NEB)将四种
Fc基因克隆到pcDNA3.4中(Lee et al.，2017)。将Gibson组装混合物转化到大肠杆菌JUDE-
1细胞中，并确认其序列。并使用曲妥珠单抗的Fab。将四种曲妥珠单抗-Fc变体的重链基因
与等量的轻链质粒一起在HEK293F细胞(Invitrogen)中进行瞬时转染。在5％CO2培养箱中
于37℃孵育6天后，以4,000×g离心10分钟收集上清液，并且使用0.22μm PES膜滤器(PALL)
过滤。将过滤的上清液通过蛋白A高容量琼脂糖树脂(Thermo Scientific)3次。为了去除
LPS和非特异性结合的蛋白质，将IgG结合的树脂用含有0.1％ X-114(Sigma-
Aldrich)的50mL PBS和50mL PBS进行洗涤。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所有IgG变
体，并立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和。通过 Ultra-4(Millipore)将
所有洗脱的曲妥珠单抗-Fc抗体变体的缓冲液交换为PBS。在还原和非还原条件下，通过
4％-20％梯度SDS-PAGE凝胶(NuSep)评估上述HEK293细胞中表达的曲妥珠单抗-Fc抗体变
体和真实(w.t.)曲妥珠单抗的还原或未还原蛋白质的纯度。
[0214] 实施例7-所选IgG变体与人FcRn和FcγR的结合特性
[0215] 通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离激元共振(SPR)评估三种IgG变体EDH、EDHS和EDHY与人FcRn的结合亲和力。
[0216] SPR测量：SPR测量在 3000(GE Healthcare)仪器上进行。在没有固定任何蛋白质的情况下关闭CM5传感器芯片的参照通道，以消除缓冲液效应和非特异性结合
信号。通过胺偶联法在pH 5.0下将临床级Herceptin、EDH、EDHY和EDHS固定在CM5传感器芯
片上。将连续稀释的FcRn(400-25nM)蛋白在pH 5.8的磷酸盐缓冲盐水(PBS，1.8mMKH2PO4、
10mM Na2HPO4、2.7mM KCl和137mM NaCl)中以30μL/分钟注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分钟的接触时间进行芯片再生。使用
Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir模型拟合(图5；表5)。作为对照组，通过相同方法将先前报道的Herceptin-LS(M428L/N434S，Xencor)和Herceptin-YTE
(M252Y/S254T/T256E，Medimmune)固定在CM5传感器芯片上并进行分析。Herceptin-EDH显
示出与野生型Herceptin相比类似的亲和力(图5A-B；表5)。另一方面，Herceptin-EDHY和
Herceptin-EDHS分别显示出比Herceptin高19.6和5.9倍的亲和力(图5C-D；表5)。
Herceptin-LS和Herceptin-YTE分别显示出比Herceptin高10倍和23.9倍的亲和力，并且这
些结果与先前的报道一致(图5E-F；表5)。
信号。通过胺偶联法在pH 5.0下将临床级Herceptin、EDH、EDHY和EDHS固定在CM5传感器芯
片上。将连续稀释的FcRn(400-25nM)蛋白在pH 5.8的磷酸盐缓冲盐水(PBS，1.8mMKH2PO4、
10mM Na2HPO4、2.7mM KCl和137mM NaCl)中以30μL/分钟注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分钟的接触时间进行芯片再生。使用
Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir模型拟合(图5；表5)。作为对照组，通过相同方法将先前报道的Herceptin-LS(M428L/N434S，Xencor)和Herceptin-YTE
(M252Y/S254T/T256E，Medimmune)固定在CM5传感器芯片上并进行分析。Herceptin-EDH显
示出与野生型Herceptin相比类似的亲和力(图5A-B；表5)。另一方面，Herceptin-EDHY和
Herceptin-EDHS分别显示出比Herceptin高19.6和5.9倍的亲和力(图5C-D；表5)。
Herceptin-LS和Herceptin-YTE分别显示出比Herceptin高10倍和23.9倍的亲和力，并且这
些结果与先前的报道一致(图5E-F；表5)。
[0217] 表5.在pH5.8下分离的Fc变体对FcRn的KD值
[0218] Kon(105M-1sec-1) Koff(10-2sec-1) KD(nM)Herceptin 5.4±0.30 29±0.85 550±46
Herceptin-LS 6.2±1.6 3.3±0.07 55±3.2
Herceptin-YTE 8.2±1.4 2.3±0.1 23±1.0
Herceptin-EDH 4.65±0.38 23±0.01 487±35
Herceptin-EDHY 14±2.0 3.8±0.11 28±4.7
Herceptin-EDHS 12±1.3 11±1.0 93±1.3
Herceptin-DHS 7.77±0.24 8.7±0.09 111±20
Herceptin-LS 6.2±1.6 3.3±0.07 55±3.2
Herceptin-YTE 8.2±1.4 2.3±0.1 23±1.0
Herceptin-EDH 4.65±0.38 23±0.01 487±35
Herceptin-EDHY 14±2.0 3.8±0.11 28±4.7
Herceptin-EDHS 12±1.3 11±1.0 93±1.3
Herceptin-DHS 7.77±0.24 8.7±0.09 111±20
[0219] IgG变体与hFcRn的ELISA测量：在4℃下将EDH、EDHY、EDHS或Herceptin各自1μg在96孔EIA/RIA板(Qiagen)上包被过夜，并将板用含有0.05％ 20的PBS(PBST)洗涤3
次。将板在室温下用PBS中的1x鱼明胶封闭溶液(Biotium)封闭1小时，并用PBST洗涤3次。然
后将连续稀释的二聚体FcRn-β2m-GST(100nM-0.8125nM)添加到板。在室温下孵育1小时后，
将板用PBST洗涤，然后与50μL含1∶5000山羊抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。
在用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。野生型Herceptin、Herceptin-EDH和Herceptin-EDHS
在生理pH 7.4下对二聚体FcRn-β2m-GST没有显示出任何结合活性。另一方面，Herceptin-
LS和Herceptin-EDHY在生理pH 7.4下显示出对二聚体FcRn-β2m-GST的显著结合活性。
次。将板在室温下用PBS中的1x鱼明胶封闭溶液(Biotium)封闭1小时，并用PBST洗涤3次。然
后将连续稀释的二聚体FcRn-β2m-GST(100nM-0.8125nM)添加到板。在室温下孵育1小时后，
将板用PBST洗涤，然后与50μL含1∶5000山羊抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。
在用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。野生型Herceptin、Herceptin-EDH和Herceptin-EDHS
在生理pH 7.4下对二聚体FcRn-β2m-GST没有显示出任何结合活性。另一方面，Herceptin-
LS和Herceptin-EDHY在生理pH 7.4下显示出对二聚体FcRn-β2m-GST的显著结合活性。
[0220] 值得注意的是，对于FcRn，EDHS在pH 5.8下显示出5.9倍增强的KD，并且pH 7.4下没有结合信号。
[0221] IgG变体与hFcγR的ELISA测量：测定了EDHS与人FcγR的结合特性。简单地说，在4℃下将野生型Herceptin或Herceptin-EDHS各自1μg在96孔EIA/RIA板(Qiagen)上包被过
夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗涤3次。
然后将连续稀释的单体His-FcγRI、二聚体GST-FcγRIIaR131、二聚体GST-FcγRIIaH131、二聚体GST-FcγRIIb、二聚体GST-FcγRIIIaV158和二聚体GST-FcγRIIIaF158添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并与50μL含1∶5000山羊抗His或抗GST HRP(GE
Healthcare)的PBS孵育1小时。用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo
Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。与野生型
Herceptin相比，Herceptin-EDHS显示与所有FcγR的显著降低的结合信号(图7A-F)。
夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗涤3次。
然后将连续稀释的单体His-FcγRI、二聚体GST-FcγRIIaR131、二聚体GST-FcγRIIaH131、二聚体GST-FcγRIIb、二聚体GST-FcγRIIIaV158和二聚体GST-FcγRIIIaF158添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并与50μL含1∶5000山羊抗His或抗GST HRP(GE
Healthcare)的PBS孵育1小时。用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo
Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。与野生型
Herceptin相比，Herceptin-EDHS显示与所有FcγR的显著降低的结合信号(图7A-F)。
[0222] 实施例8-DHS-Fc变体的构建和表征
[0223] FcγR的效应物功能是去除病原体的必需的抗体介导的免疫应答。Herceptin-EDHS不能与效应物FcγR结合。Herceptin-EDHS包含四个氨基酸替换：V264E、L309D、Q311H
和N434S。V264E损害了IgG的糖基化，这对于与效应物FcR的结合是至关重要的(Xiaojie Yu
et al.，2013)。因此，我们构建了没有V264E突变的Herceptin-DHS(SEQ ID NO：7；L309D；
Q311H；N434S)。用酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离激元共振(SPR)评估DHS与人FcRn
和FcγR的结合亲和力。
和N434S。V264E损害了IgG的糖基化，这对于与效应物FcR的结合是至关重要的(Xiaojie Yu
et al.，2013)。因此，我们构建了没有V264E突变的Herceptin-DHS(SEQ ID NO：7；L309D；
Q311H；N434S)。用酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离激元共振(SPR)评估DHS与人FcRn
和FcγR的结合亲和力。
[0224] SPR测量：SPR测量在 3000(GE Healthcare)仪器上进行。在没有固定任何蛋白质的情况下关闭CM5传感器芯片的参照通道，以消除缓冲液效应和非特异性结合信
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将Herceptin-DHS固定在CM5传感器芯片上(Lee et al.，
2017)。将连续稀释的FcRn(400-25nM)蛋白在pH 5.8的PBS中以30μL/分钟注射到CM5芯片
上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分钟的接触时间进行芯片再
生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir模型拟合(图8)。与
Herceptin-EDHS相比，Herceptin-DHS显示出类似的亲和力，KD为111±20nM(图5和8；表5)。
从Herceptin-EDHS中去除V264E不影响FcRn结合能力。
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将Herceptin-DHS固定在CM5传感器芯片上(Lee et al.，
2017)。将连续稀释的FcRn(400-25nM)蛋白在pH 5.8的PBS中以30μL/分钟注射到CM5芯片
上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分钟的接触时间进行芯片再
生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir模型拟合(图8)。与
Herceptin-EDHS相比，Herceptin-DHS显示出类似的亲和力，KD为111±20nM(图5和8；表5)。
从Herceptin-EDHS中去除V264E不影响FcRn结合能力。
[0225] IgG变体与hFcRn的ELISA测量：在4℃下将Herceptin-DHS各自1μg在96孔EIA/RIA板(Qiagen)上包被过夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1x鱼明胶封闭溶
液(Biotium)封闭1小时，并用PBST洗涤3次。然后将连续稀释的二聚体FcRn-β2m-GST
(100nM-0.8125nM)添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，然后与50μL含1∶
5000山羊抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。在用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。
与野生型Herceptin相比，Herceptin-DHS在生理pH 7.4下没有显示出对二聚体FcRn-β2m-
GST的任何结合活性。作为对照，同时测试了Herceptin-LS和Herceptin-N434S。
液(Biotium)封闭1小时，并用PBST洗涤3次。然后将连续稀释的二聚体FcRn-β2m-GST
(100nM-0.8125nM)添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，然后与50μL含1∶
5000山羊抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。在用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。
与野生型Herceptin相比，Herceptin-DHS在生理pH 7.4下没有显示出对二聚体FcRn-β2m-
GST的任何结合活性。作为对照，同时测试了Herceptin-LS和Herceptin-N434S。
[0226] IgG变体与hFcγR的ELISA测量：如上所述测定了EDHS与人FcγR的结合特性。简单地说，在4℃下将野生型Herceptin或Herceptin-EDHS各自1μg在96孔EIA/RIA板(Qiagen)上
包被过夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗
涤3次。然后将连续稀释的单体His-FcγRI、二聚体GST-FcγRIIaR131、二聚体GST-Fcγ
RIIaH131、二聚体GST-FcγRIIb、二聚体GST-FcγRIIIaV158和二聚体GST-FcγRIIIaF158添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并与50μL含1∶5000山羊抗His或抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo
Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。对于所有FcγR，Herceptin-DHS显示出与野生型Herceptin相比相同的结合谱(图10A-F)。
包被过夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗
涤3次。然后将连续稀释的单体His-FcγRI、二聚体GST-FcγRIIaR131、二聚体GST-Fcγ
RIIaH131、二聚体GST-FcγRIIb、二聚体GST-FcγRIIIaV158和二聚体GST-FcγRIIIaF158添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并与50μL含1∶5000山羊抗His或抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。用PBST洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo
Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。对于所有FcγR，Herceptin-DHS显示出与野生型Herceptin相比相同的结合谱(图10A-F)。
[0227] SPR测量：SPR测量在 3000(GE Healthcare)仪器上进行。在没有固定任何蛋白质的情况下关闭CM5传感器芯片的参照通道，以消除缓冲液效应和非特异性结合信
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将野生型Herceptin、Herceptin-DHS、Herceptin-LS和
Herceptin-YTE固定在CM5传感器芯片上。将连续稀释的FcγR或C1q(400-25nM)蛋白在pH
7.4的HBS-EP中以30μL/分钟的注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM甘氨酸(pH 5.0)以1分钟的接触时间进行芯片再生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传
感图用1∶1Langmuir模型或等同结合模型拟合(图18和表12)。Fc受体的动力学分析结果与
ELISA结果一致。与野生型Herceptin相比，Herceptin-DHS对FcγR和C1q表现出相同的动力
学值，但Herceptin-LS和Herceptin-YTE显著丧失了FcγR结合能力，尤其是对作为ADCC关
键受体的FcγRIIIa(图18和表12)。
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将野生型Herceptin、Herceptin-DHS、Herceptin-LS和
Herceptin-YTE固定在CM5传感器芯片上。将连续稀释的FcγR或C1q(400-25nM)蛋白在pH
7.4的HBS-EP中以30μL/分钟的注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM甘氨酸(pH 5.0)以1分钟的接触时间进行芯片再生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传
感图用1∶1Langmuir模型或等同结合模型拟合(图18和表12)。Fc受体的动力学分析结果与
ELISA结果一致。与野生型Herceptin相比，Herceptin-DHS对FcγR和C1q表现出相同的动力
学值，但Herceptin-LS和Herceptin-YTE显著丧失了FcγR结合能力，尤其是对作为ADCC关
键受体的FcγRIIIa(图18和表12)。
[0228] 总之，除去V264E不影响Herceptin-EDHS对FcRn的pH依赖性FcRn结合能力，但是恢复了对FcγR的结合能力。
[0229] 表12.IgG变体对于Fc受体的动力学值
[0230]
[0231] 实施例9-Herceptin-DHS的效应物功能
[0232] ADCC测定：在ADCC测定的前一天，从健康供体的人血液中分离出人外周血单核细胞(PBMC)。将50mL人血液收集在肝素化的小瓶(BD biosciences)中，并通过轻轻颠倒管数
次使其充分混合。将25mL血液在50mL锥形管中的25mL室温Ficoll Histopaque
(Invitrogen)上分层。将管在不带制动器的摆桶式转子中以2500rpm离心30分钟。在
histopaque和介质之间的界面中吸出人PBMC。将人PBMC重悬于红细胞(RBC)裂解缓冲液
(155mM NH4Cl、12mM NaHCO3和0.1mM EDTA)中，并用PBS洗涤两次。将分离的人PBMC与钙黄绿素AM标记的SK-BR3 Her2阳性癌细胞和多种浓度的IgG变体在96孔板中混合。肿瘤与效应细
胞的比为1∶10，并将板在37℃、5％CO2下孵育4小时。根据以下公式计算肿瘤细胞裂解的百
分比：100×(E-S)/(M-S)，其中E是实验孔的荧光，S是在没有抗体的情况下(肿瘤细胞与培
养基和效应细胞孵育)的荧光，并且M是具有裂解缓冲液的肿瘤细胞的荧光。如实施例8所
述，Herceptin-DHS显示出与Herceptin相比等价的对PBMC的ADCC活性，因为Herceptin-DHS
与Herceptin相比具有相同的对FcγR的亲和力(图10A-F和11A)。
次使其充分混合。将25mL血液在50mL锥形管中的25mL室温Ficoll Histopaque
(Invitrogen)上分层。将管在不带制动器的摆桶式转子中以2500rpm离心30分钟。在
histopaque和介质之间的界面中吸出人PBMC。将人PBMC重悬于红细胞(RBC)裂解缓冲液
(155mM NH4Cl、12mM NaHCO3和0.1mM EDTA)中，并用PBS洗涤两次。将分离的人PBMC与钙黄绿素AM标记的SK-BR3 Her2阳性癌细胞和多种浓度的IgG变体在96孔板中混合。肿瘤与效应细
胞的比为1∶10，并将板在37℃、5％CO2下孵育4小时。根据以下公式计算肿瘤细胞裂解的百
分比：100×(E-S)/(M-S)，其中E是实验孔的荧光，S是在没有抗体的情况下(肿瘤细胞与培
养基和效应细胞孵育)的荧光，并且M是具有裂解缓冲液的肿瘤细胞的荧光。如实施例8所
述，Herceptin-DHS显示出与Herceptin相比等价的对PBMC的ADCC活性，因为Herceptin-DHS
与Herceptin相比具有相同的对FcγR的亲和力(图10A-F和11A)。
[0233] ADCP测定：使用CD14 MicroBead试剂盒(Miltenyi Biotec)从PBMC中纯化CD14阳性单核细胞。然后，通过在含有15％FBS和50ng/ml GM-CSF的RPMI培养基中培养7天使单核
细胞分化为巨噬细胞，然后以10∶1的效应物：肿瘤细胞比与钙黄绿素标记的SK-BR3细胞组
合。对于ADCP测定，将SK-BR3细胞与多种浓度的抗体和巨噬细胞孵育。在37℃下2小时后，将细胞用抗CD11b-APC和抗CD14-APC标记。通过在LSRFortessa(BD Bioscience)上的FACS评
价吞噬作用，并报告为双阳性细胞占样品中肿瘤细胞总数的分数。Herceptin-DHS显示出与
Herceptin相比等价的对PBMC的ADCC活性，因为Herceptin-DHS与Herceptin相比具有相同
的对FcγR的亲和力(图10A-F和11B)。
细胞分化为巨噬细胞，然后以10∶1的效应物：肿瘤细胞比与钙黄绿素标记的SK-BR3细胞组
合。对于ADCP测定，将SK-BR3细胞与多种浓度的抗体和巨噬细胞孵育。在37℃下2小时后，将细胞用抗CD11b-APC和抗CD14-APC标记。通过在LSRFortessa(BD Bioscience)上的FACS评
价吞噬作用，并报告为双阳性细胞占样品中肿瘤细胞总数的分数。Herceptin-DHS显示出与
Herceptin相比等价的对PBMC的ADCC活性，因为Herceptin-DHS与Herceptin相比具有相同
的对FcγR的亲和力(图10A-F和11B)。
[0234] 实施例10-Herceptin-DHS与FcRn的结合特性
[0235] 为了检查Herceptin-DHS的详细的pH依赖性结合活性，通过SPR用三种不同密度的scFcRn或不同pH条件评估抗体。
[0236] SPR测量：SPR测量在 3000(GE Healthcare)仪器上进行。在没有固定任何蛋白质的情况下关闭CM5传感器芯片的参照通道，以消除缓冲液效应和非特异性结合信
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将scFcRn以三种不同的固定水平(500RU、2000RU和4000RU)固
定在CM5传感器芯片上。将连续稀释的抗体(400-25nM)蛋白在pH 7.4PBS中以30μL/分钟注
射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分钟的接触时间
进行芯片再生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir模型拟合(图
12和表6)。Herceptin-DHS和野生型Herceptin在低、中和高密度的scFcRn下没有显示任何
结合信号。Herceptin-LS和Herceptin-YTE在低密度scFcRn下没有显示任何结合信号，但是
显示与以中密度和高密度固定的scFcRn的显著结合(表6)。Herceptin-LS对于中密度的
FcRn的KD为58.7nM，并且对于高密度的FcRn为22.7nM。Herceptin-YTE对于中密度的FcRn的
KD为4.73nM，并且对于高密度的FcRn为4.29μM。
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将scFcRn以三种不同的固定水平(500RU、2000RU和4000RU)固
定在CM5传感器芯片上。将连续稀释的抗体(400-25nM)蛋白在pH 7.4PBS中以30μL/分钟注
射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分钟的接触时间
进行芯片再生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir模型拟合(图
12和表6)。Herceptin-DHS和野生型Herceptin在低、中和高密度的scFcRn下没有显示任何
结合信号。Herceptin-LS和Herceptin-YTE在低密度scFcRn下没有显示任何结合信号，但是
显示与以中密度和高密度固定的scFcRn的显著结合(表6)。Herceptin-LS对于中密度的
FcRn的KD为58.7nM，并且对于高密度的FcRn为22.7nM。Herceptin-YTE对于中密度的FcRn的
KD为4.73nM，并且对于高密度的FcRn为4.29μM。
[0237] 表6.pH 7.4下分离的Fc变体对FcRn的KD值
[0238]
[0239] 接下来，为了检查抗体的详细的pH依赖性结合活性，在多种pH条件下对抗体进行测定。将1μM野生型Herceptin、Herceptin-DHS、Herceptin-LS和Herceptin-YTE在pH 4.5-
8.5PBS中以30μL/分钟注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH
8.0)以1分钟的接触时间进行芯片再生。如图13A-C所示，在三种不同FcRn密度的条件下，
Herceptin-DHS显示出比野生型Herceptin更好的结合活性，但是在从pH6.2至pH 6.5，
Herceptin-DHS明显损失了FcRn结合活性。并且Herceptin-DHS在pH 6.8时完全丧失了FcRn
结合活性。
8.5PBS中以30μL/分钟注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH
8.0)以1分钟的接触时间进行芯片再生。如图13A-C所示，在三种不同FcRn密度的条件下，
Herceptin-DHS显示出比野生型Herceptin更好的结合活性，但是在从pH6.2至pH 6.5，
Herceptin-DHS明显损失了FcRn结合活性。并且Herceptin-DHS在pH 6.8时完全丧失了FcRn
结合活性。
[0240] 实施例11-Herceptin-DHS在人FcRn转基因小鼠中的药代动力学
[0241] 在由鼠FcRn缺陷型B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJ和hFcRn cDNA转基因品系B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ(Roopenian et al.，2003和Chaudhury et al.，
2003)的F1杂交产生的半合子hFcRn转基因小鼠(品系276)中进行经修饰的IgG的药代动力
学。在第0天给hFcRn小鼠静脉内推注(IV)2mg/kg抗体的剂量。每种抗体使用11只小鼠。在整
个2-3周的研究中的不同时间点使用毛细管移液器从尾静脉获得血液样品。定量ELISA用于
监测受试抗体的血清浓度。简单地说，将96孔板用2μg/ml的山羊抗人F(ab’)2片段特异性F
(ab')2(Jackson Immunoresearch)进行包被。将板用PBS中的1％鱼明胶(AMRESCO-inc)封
闭1小时，然后与适当稀释的血清样品(较早时间点为1∶200，较晚时间点为1∶50或1∶100)一起孵育。将抗κ轻链抗体-HRP(Abcam)用于检测人抗体(稀释度为1∶5,000)。在用TMB底物
(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)根据制造商的指示显色后，测量450nm处的吸光度。
对于稀释到1∶100出血前小鼠血清中的每种抗体变体生成标准曲线。然后将Prism
(GraphPad软件)中生成的标准曲线的线性部分用于定量血清样品中的人IgG。使用对数-线
性梯形法计算AUCinf(到无穷大的曲线下面积)。使用浓度数据的对数-线性回归计算终末
半衰期(T1/2)，浓度数据包括至少具有可测量浓度的最后三个采样时间点。血清清除率估
计为：CL＝剂量/AUCinf。然后计算主要PK参数的描述统计学。结果，与野生型Herceptin相
比，Herceptin-DHS显示延长6.8倍的β期血清半哀期(β期T1/2=336±24.8小时)(图14和表
7)。与野生型Herceptin相比，Herceptin-DHS还显示出慢9.5倍的清除率(0.061±0.003ml/
天/kg)，增强7.9倍的AUCinf(326.6±17.9μg*天/ml)和低3.96倍的组织分布(0.28±
0.01ml/kg)。
2003)的F1杂交产生的半合子hFcRn转基因小鼠(品系276)中进行经修饰的IgG的药代动力
学。在第0天给hFcRn小鼠静脉内推注(IV)2mg/kg抗体的剂量。每种抗体使用11只小鼠。在整
个2-3周的研究中的不同时间点使用毛细管移液器从尾静脉获得血液样品。定量ELISA用于
监测受试抗体的血清浓度。简单地说，将96孔板用2μg/ml的山羊抗人F(ab’)2片段特异性F
(ab')2(Jackson Immunoresearch)进行包被。将板用PBS中的1％鱼明胶(AMRESCO-inc)封
闭1小时，然后与适当稀释的血清样品(较早时间点为1∶200，较晚时间点为1∶50或1∶100)一起孵育。将抗κ轻链抗体-HRP(Abcam)用于检测人抗体(稀释度为1∶5,000)。在用TMB底物
(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)根据制造商的指示显色后，测量450nm处的吸光度。
对于稀释到1∶100出血前小鼠血清中的每种抗体变体生成标准曲线。然后将Prism
(GraphPad软件)中生成的标准曲线的线性部分用于定量血清样品中的人IgG。使用对数-线
性梯形法计算AUCinf(到无穷大的曲线下面积)。使用浓度数据的对数-线性回归计算终末
半衰期(T1/2)，浓度数据包括至少具有可测量浓度的最后三个采样时间点。血清清除率估
计为：CL＝剂量/AUCinf。然后计算主要PK参数的描述统计学。结果，与野生型Herceptin相
比，Herceptin-DHS显示延长6.8倍的β期血清半哀期(β期T1/2=336±24.8小时)(图14和表
7)。与野生型Herceptin相比，Herceptin-DHS还显示出慢9.5倍的清除率(0.061±0.003ml/
天/kg)，增强7.9倍的AUCinf(326.6±17.9μg*天/ml)和低3.96倍的组织分布(0.28±
0.01ml/kg)。
[0242] 表7.分离的Fc变体的药代动力学值
[0243] 清除率(ml/天/kg) B期T1/2(hrs) AUCinf.(μg*天/ml) Vss(ml/kg)野生型Herceptin 0.58±0.17 49.3±4.4 41.2±23.6 1.11±0.15
Herceptin-DHS 0.061±0.003 336±24.8 326.6±17.9 0.28±0.01
Herceptin-LS 0.099±0.004 107±7.2 200.7±9.4 0.34±0.01
Herceptin-YTE 0.111±0.028 204.3±8.7 178.7±12.5 0.42±0.01
Herceptin-DHS 0.061±0.003 336±24.8 326.6±17.9 0.28±0.01
Herceptin-LS 0.099±0.004 107±7.2 200.7±9.4 0.34±0.01
Herceptin-YTE 0.111±0.028 204.3±8.7 178.7±12.5 0.42±0.01
[0244] 实施例12-IgG亚类中的DHS突变
[0245] IgG具有四个亚类成员：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG亚类中的FcRn结合位点高度保守，因此IgG2和IgG4的血清半衰期与IgG1相当。IgG第435位残基有两种单核苷酸多态性：
IgG3-R435具有较短的血清半衰期(～8天)，但IgG3-H435具有与其他IgG亚类相比类似的半
衰期(～21天)。为了检查DHS突变(L309D、Q311H和N434S)突变是否能够增强其他IgG亚类中
的FcRn结合活性，将DHS突变引入IgG2、IgG3-H435和IgG4的重链基因中。通过IDT合成IgG2-
DHS、IgG3-DHS和IgG4-DHS的Fc基因，并根据制造商的说明使用Gibson 克隆
试剂盒(NEB)将Fc基因克隆到pcDNA3.4中(Lee et al.，2017)。将Gibson组装混合物转化到
大肠杆菌JUDE-1细胞中，并确认其序列。并使用曲妥珠单抗的Fab。将四种曲妥珠单抗-Fc变
体的重链基因与等量的轻链质粒一起在HEK293F细胞(Invitrogen)中进行瞬时转染。在5％
CO2培养箱中于37℃孵育6天后，以4,000×g离心10分钟收集上清液，并且使用0.22μm PES
膜滤器(PALL)过滤。将过滤的上清液通过蛋白A高容量琼脂糖树脂(Thermo Scientific)3
次。为了去除LPS和非特异性结合的蛋白质，将IgG结合的树脂用含有0.1％ X-114
(Sigma-Aldrich)的50mL PBS和50mL PBS进行洗涤。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所
有IgG变体，并立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和。通过 Ultra-4
(Millipore)将所有洗脱的曲妥珠单抗-Fc抗体变体的缓冲液交换为PBS。在还原和非还原
条件下，通过4％-20％梯度SDS-PAGE凝胶(NuSep)评估上述HEK293细胞中表达的曲妥珠单
抗-Fc抗体变体和真实(w.t.)曲妥珠单抗的还原或未还原蛋白质的纯度。
IgG3-R435具有较短的血清半衰期(～8天)，但IgG3-H435具有与其他IgG亚类相比类似的半
衰期(～21天)。为了检查DHS突变(L309D、Q311H和N434S)突变是否能够增强其他IgG亚类中
的FcRn结合活性，将DHS突变引入IgG2、IgG3-H435和IgG4的重链基因中。通过IDT合成IgG2-
DHS、IgG3-DHS和IgG4-DHS的Fc基因，并根据制造商的说明使用Gibson 克隆
试剂盒(NEB)将Fc基因克隆到pcDNA3.4中(Lee et al.，2017)。将Gibson组装混合物转化到
大肠杆菌JUDE-1细胞中，并确认其序列。并使用曲妥珠单抗的Fab。将四种曲妥珠单抗-Fc变
体的重链基因与等量的轻链质粒一起在HEK293F细胞(Invitrogen)中进行瞬时转染。在5％
CO2培养箱中于37℃孵育6天后，以4,000×g离心10分钟收集上清液，并且使用0.22μm PES
膜滤器(PALL)过滤。将过滤的上清液通过蛋白A高容量琼脂糖树脂(Thermo Scientific)3
次。为了去除LPS和非特异性结合的蛋白质，将IgG结合的树脂用含有0.1％ X-114
(Sigma-Aldrich)的50mL PBS和50mL PBS进行洗涤。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所
有IgG变体，并立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中和。通过 Ultra-4
(Millipore)将所有洗脱的曲妥珠单抗-Fc抗体变体的缓冲液交换为PBS。在还原和非还原
条件下，通过4％-20％梯度SDS-PAGE凝胶(NuSep)评估上述HEK293细胞中表达的曲妥珠单
抗-Fc抗体变体和真实(w.t.)曲妥珠单抗的还原或未还原蛋白质的纯度。
[0246] SPR测量：SPR测量在 3000(GE Healthcare)仪器上进行。在没有固定任何蛋白质的情况下关闭CM5传感器芯片的参照通道，以消除缓冲液效应和非特异性结合信
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将野生型IgG2、野生型IgG3、野生型IgG4、IgG2-DHS、IgG3-DHS和IgG4-DHS固定在CM5传感器芯片上。将连续稀释的FcRn(400-25nM)蛋白在pH 5.8PBS中以
30μL/分钟注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分
钟的接触时间进行芯片再生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir
模型拟合(图15)。与野生型IgG2相比，IgG2-DHS对scFcRn显示出增强5.7倍的KD(377±
26nM)(图15A-B；表8)。与野生型IgG3相比，IgG3-DHS对scFcRn显示出增强5.5倍的KD(739±
75nM)(图15C-D；表8)。与野生型IgG4相比，IgG4-DHS对scFcRn显示出增强3.0倍的KD(832±
16nM)(图15E-F；表8)。
号。通过胺偶联法在pH 5.0下将野生型IgG2、野生型IgG3、野生型IgG4、IgG2-DHS、IgG3-DHS和IgG4-DHS固定在CM5传感器芯片上。将连续稀释的FcRn(400-25nM)蛋白在pH 5.8PBS中以
30μL/分钟注射到CM5芯片上，持续1分钟。在每次结合事件后，用10mM tris(pH 8.0)以1分
钟的接触时间进行芯片再生。使用Biaevaluation 3.0软件将得到的传感图用1∶1Langmuir
模型拟合(图15)。与野生型IgG2相比，IgG2-DHS对scFcRn显示出增强5.7倍的KD(377±
26nM)(图15A-B；表8)。与野生型IgG3相比，IgG3-DHS对scFcRn显示出增强5.5倍的KD(739±
75nM)(图15C-D；表8)。与野生型IgG4相比，IgG4-DHS对scFcRn显示出增强3.0倍的KD(832±
16nM)(图15E-F；表8)。
[0247] 表8.在pH 5.8下DHS-Fc变体对FcRn的动力学值
[0248]
[0249] IgG变体与hFcγR的ELISA测量：测定了EDHS与人FcγR的结合特性。详细程序与上段相同。简单地说，在4℃下将野生型IgG2、IgG2-DHS、野生型IgG3、IgG3-DHS、野生型IgG4和IgG4-DHS各自1μg在96孔EIA/RIA板(Qiagen)上包被过夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室
温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗涤3次。然后将连续稀释的单体His-FcγRI、
二聚体GST-FcγRIIaR131、二聚体GST-FcγRIIaH131、二聚体GST-FcγRIIb、二聚体GST-FcγRIIIaV158和二聚体GST-FcγRIIIaF158添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并与50μL含1∶5000山羊抗His或抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。用PBST洗涤3次
后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在
450nm处的吸光度。对于所有FcγR，IgG2-DHS显示出与野生型IgG2相比相同的结合活性(图
16A)。对于所有FcγR，IgG3-DHS显示出与野生型IgG3相比相同的结合活性(图16B)。对于所
有FcγR，IgG4-DHS显示出与野生型IgG4相比相同的结合活性(图16C)。总之，三种氨基酸替
换不影响IgG亚类的FcγR结合活性。
温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗涤3次。然后将连续稀释的单体His-FcγRI、
二聚体GST-FcγRIIaR131、二聚体GST-FcγRIIaH131、二聚体GST-FcγRIIb、二聚体GST-FcγRIIIaV158和二聚体GST-FcγRIIIaF158添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并与50μL含1∶5000山羊抗His或抗GST HRP(GE Healthcare)的PBS孵育1小时。用PBST洗涤3次
后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在
450nm处的吸光度。对于所有FcγR，IgG2-DHS显示出与野生型IgG2相比相同的结合活性(图
16A)。对于所有FcγR，IgG3-DHS显示出与野生型IgG3相比相同的结合活性(图16B)。对于所
有FcγR，IgG4-DHS显示出与野生型IgG4相比相同的结合活性(图16C)。总之，三种氨基酸替
换不影响IgG亚类的FcγR结合活性。
[0250] PK研究：使用与实施例11相同的方法，评估了IgG2-DHS和IgG4-DHS的药代动力学。结果，与野生型IgG2相比，IgG2-DHS显示出提高2.9倍的β期血清半衰期(β期T1/2＝199.8±
4.9小时)(图17和表9)。与野生型IgG2相比，IgG2-DHS还显示出慢1.9倍的清除率(0.067±
0.015ml/天/kg)，增强1.9倍的AUCinf(148.3±7.5μg*天/ml)和低1.5倍的组织分布(0.57
±0.02ml/kg)。并且，与野生型IgG4相比，IgG4-DHS显示出提高3.6倍的β期血清半衰期(β期T1/2＝277.4±14.9小时)(图16和表9)。与野生型IgG4相比，IgG4-DHS还显示出慢2.4倍的清
除率(0.067±0.048ml/天/kg)，增强2.4倍的AUCinf(149.2±6.3μg*天/ml)和低1.7倍的组
织分布(0.58±0.03ml/kg)。与野生型IgG3相比，IgG3-DHS显示出提高4.4倍的β期血清半衰
期(β期T1/2＝286.3±14.6小时)(图19和表13)。与野生型IgG3相比，IgG3-DHS还显示出慢
3.8倍的清除率(0.076±0.007ml/天/kg)，增强3.9倍的AUCinf(269.0±22.4μg*天/ml)和
低2.1倍的组织分布(0.41±0.05ml/kg)(图19和表13)。
4.9小时)(图17和表9)。与野生型IgG2相比，IgG2-DHS还显示出慢1.9倍的清除率(0.067±
0.015ml/天/kg)，增强1.9倍的AUCinf(148.3±7.5μg*天/ml)和低1.5倍的组织分布(0.57
±0.02ml/kg)。并且，与野生型IgG4相比，IgG4-DHS显示出提高3.6倍的β期血清半衰期(β期T1/2＝277.4±14.9小时)(图16和表9)。与野生型IgG4相比，IgG4-DHS还显示出慢2.4倍的清
除率(0.067±0.048ml/天/kg)，增强2.4倍的AUCinf(149.2±6.3μg*天/ml)和低1.7倍的组
织分布(0.58±0.03ml/kg)。与野生型IgG3相比，IgG3-DHS显示出提高4.4倍的β期血清半衰
期(β期T1/2＝286.3±14.6小时)(图19和表13)。与野生型IgG3相比，IgG3-DHS还显示出慢
3.8倍的清除率(0.076±0.007ml/天/kg)，增强3.9倍的AUCinf(269.0±22.4μg*天/ml)和
低2.1倍的组织分布(0.41±0.05ml/kg)(图19和表13)。
[0251] 表9.DHS-Fc变体的药代动力学值
[0252]
[0253] 表13.DHS-Fc变体的药代动力学值
[0254]
[0255] 实施例13-类风湿因子结合特性
[0256] 在患有自身免疫病(包括类风湿性关节炎(RA))的患者中，经常观察到类风湿因子(RF)并通过从血液中除去血清抗体来削弱治疗性抗体的治疗功效(Newkirk 2002，
Ingegnoli et al.，2013，Maeda et al.，2017)。因此，我们通过ELISA测试了抗体变体的RF结合能力。
Ingegnoli et al.，2013，Maeda et al.，2017)。因此，我们通过ELISA测试了抗体变体的RF结合能力。
[0257] IgG变体与类风湿因子的ELISA测量：测定DHS与RF的结合特性。简单地说，在4℃下将50μl的类风湿因子阳性血清(Lee Biosolutions)在在96孔EIA/RIA板(Qiagen)上包被过
夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗涤3次。
然后将连续稀释的生物素化抗体变体添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，
并与50μL含1∶5000链霉亲和素-HRP(Thermo Fisher Scientific)的PBS孵育1小时。用PBST
洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。Herceptin-DHS显示出与野生型Herceptin相当的结合响应水平，
但是Herceptin-YTE和Herceptin-LS显示出比野生型Herceptin更强的结合活性(图20)。
夜，并将板用PBST洗涤3次。将板在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时，并用PBST洗涤3次。
然后将连续稀释的生物素化抗体变体添加到板。在室温下孵育1小时后，将板用PBST洗涤，
并与50μL含1∶5000链霉亲和素-HRP(Thermo Fisher Scientific)的PBS孵育1小时。用PBST
洗涤3次后，每孔添加50μL TMB底物(Thermo Scientific)，添加50μL 1M H2SO4进行中和，并记录在450nm处的吸光度。Herceptin-DHS显示出与野生型Herceptin相当的结合响应水平，
但是Herceptin-YTE和Herceptin-LS显示出比野生型Herceptin更强的结合活性(图20)。
[0258] 表10.本研究中使用的引物(提供为SEQ ID NO：12-19)
[0259]
[0260] 表11.本研究中使用的质粒
[0261]
[0262]
[0263]
[0264] 根据本公开内容，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据一些优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对
于本领域技术人员而言明显是，可以对本文所述的方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变
化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，化学和生理两者相关的某些物质可以代替本文所述的物质，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员明显的
所有这些类似的替代和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念
之内。
于本领域技术人员而言明显是，可以对本文所述的方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变
化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，化学和生理两者相关的某些物质可以代替本文所述的物质，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员明显的
所有这些类似的替代和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念
之内。
[0265] 参考文献
[0266] 下面的参考文献以其向本文所示的内容补充其他细节或提供示例性程序的程度具体地通过引用并入本文。
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[0275] 美国专利7,419,783
[0276] 美国专利7,611,866
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