结合IGF-1R多个表位的组合物
阅读：24发布：2022-08-12
专利汇可以提供结合IGF-1R多个表位的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 至少部分地基于如下发现：结合IGF-1R中不同表位的结合分子导致与结合单个IGF-1R表位的结合分子相比提高的IGF-1和/或IGF-2阻断能 力 。本发明提供结合IGF-1R多个表位的组合物，例如，单特异性结合分子或多特异性结合分子(如，双特异性分子)的组合。还提供了制备所述结合分子的方法和使用本发明的结合分子来拮抗IGF-1R 信号 传导的方法。，下面是结合IGF-1R多个表位的组合物专利的具体信息内容。
1.一种抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括将所述肿瘤细胞与结合
于IGF-1R的第一表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第一结合部分
和结合于IGF-1R的第二、不同表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第二结合部分接触，其中所述第一部分和所述第二部分对IGF-1R的结合比所述第一部分或所述第二部分单独结合在更大程度上阻断IGF-1R介导的信号传导，从而抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞的存活或生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合部分和所述第二结合部分通过不同
机制阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合部分和所述第二结合部分存在于同
一结合分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合部分和所述第二结合部分存在于不
同结合分子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结合部分和所述第二结合部分不竞争对
IGF-1R的结合。
6.一种多特异性IGF-1R结合分子，其包含结合于IGF-1R的第一IGF-1R表位并阻断
IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第一IGF-1R结合部分和结合于IGF-1R的第
二、不同表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第二结合部分。
7.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一变构IGF-1R结合部分，其特异性结合第一变构IGF-1R表位，从而变构地阻
断IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合(i)竞争性IGF-1R
表位，从而竞争性地阻断IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合；或(ii)第二变构IGF-1R表位，从而变构地阻断IGF-1而不是IGF-2对IGF-1R的结合。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第一变构表位位于跨IGF-1R的FnIII-I
结构域并包括IGF-1R的氨基酸437-586的区域中。
9.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第一变构表位包括至少3个连续或不连
续氨基酸，其中所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸位置437、438、459、460、
461、462、464、466、467、469、470、471、472、474、476、477、478、479、480、482、483、488、490、
492、493、495、496、509、513、514、515、53、544、545、546、547、548、551、564、565、568、570、
571、572、573、577、578、579、582、584、585、586和587组成的组。
10.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第一变构表位包括IGF-1R的氨基酸
461、462和464的至少一个。
11.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述竞争性表位位于包含CRR结构域一部分
的区域，该区域包含IGF-1R的氨基酸残基248-303。
12.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述竞争性表位包括至少3个连续或不连
续氨基酸，其中所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸248、250、254、257、259、
260、263、265、301和303组成的组。
13.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述竞争性表位包括IGF-1R的氨基酸248、
250和254。
14.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第二变构表位位于包含IGF-1R的CRR
和L2结构域两者的区域内，该区域包含IGF-1R的残基241-379。
15.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第二变构表位包括至少3个连续或不
连续氨基酸，其中至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸241、248、250、251、254、257、263、
265、266、301、303、308、327和379组成的组。
16.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第二变构表位包括IGF-1R的氨基酸
241、242、251、257、265和266的至少一个。
17.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第一变构结合部分衍生自M13-C06抗体
(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登记号 )。
18.根据权利要求17所述的结合分子，其中所述第一变构结合部分是包含M13-C06抗
体(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登记号 )的CDR1-6的
抗原结合位点。
19.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第一变构结合部分与M13-C06抗体
(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登记号 )竞争对IGF-1R的
结合。
20.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述竞争性结合部分衍生自M14-G11抗体
(ATCC登记号 )。
21.根据权利要求14所述的结合分子，其中所述竞争性结合部分是包含M14-G11抗体
(ATCC登记号 )的CDR1-6的抗原结合位点。
22.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述竞争性结合部分与M14-G11抗体(ATCC
登记号 )竞争对IGF-1R的结合。
23.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第二变构结合部分衍生自P1E2抗体
(ATCC登记号 )或αIR3抗体。
24.根据权利要求23所述的结合分子，其中所述第二变构结合部分是包含P1E2抗体
(ATCC登记号 )或αIR3抗体的CDR1-6的抗原结合位点。
25.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述第二变构结合部分衍生自与P1E2抗体
(ATCC登记号 )或αIR3抗体竞争对IGF-1R的结合的抗体。
26.根据权利要求6-25任一项所述的结合分子，其是双特异性的。
27.根据权利要求6-26任一项所述的结合分子，其中所述结合分子的第一结合特异性
是多价的。
28.根据权利要求6-27任一项所述的结合分子，其中所述结合分子的第二结合特异性
是多价的。
29.根据权利要求6-28任一项所述的结合分子，其中所述结合分子包括四个结合部
分。
30.根据权利要求6-29任一项所述的结合分子，其中所述结合部分的至少一个是scFv
分子。
31.根据权利要求6-30任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是包含两种scFv分
子的四价抗体分子。
32.根据权利要求31所述的结合分子，其中所述scFv分子融合到所述四价抗体分子重
链的C-末端。
33.根据权利要求31所述的结合分子，其中所述scFv分子融合到所述四价抗体分子重
链的N-末端。
34.根据权利要求31所述的结合分子，其中所述scFv分子融合到所述四价抗体分子轻
链的N-末端。
35.根据权利要求6-34任一项所述的结合分子，其包括稳定化的scFv分子。
36.根据权利要求6-35任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是完全人类的。
37.根据权利要求6-35任一项所述的结合分子，其中所述结合分子包括人源化可变
区。
38.根据权利要求6-35任一项所述的结合分子，其中所述结合分子包括嵌合可变区。
39.根据权利要求6-38任一项所述的结合分子，其包括重链恒定区或其片段。
40.根据权利要求39所述的结合分子，其中所述重链恒定区或其片段是人类IgG4。
41.根据权利要求40所述的结合分子，其中所述IgG4恒定区缺少糖基化。
42.根据权利要求41所述的结合分子，其中所述IgG4恒定区与野生型IgG4恒定区相
比包括按照EU编号系统编号为S228P和T299A的突变。
43.一种双特异性IGF-1R抗体分子，其包含衍生自M13-C06抗体(ATCC登记号
)的两个变构结合部分和衍生自M14-G11抗体(ATCC登记号 )的
两个竞争性结合部分。
44.根据权利要求43所述的抗体分子，其中所述竞争性结合部分IgG抗体提供，并且所
述变构结合部分由连接或融合至所述IgG抗体的两个scFv分子提供。
45.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述IgG抗体包括来自M14-G11抗体的轻
链(VL)和重链(VH)可变结构域。
46.根据权利要求45所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的所述VL结构域包括SEQ ID
NO：93的氨基酸序列，并且所述IgG抗体的所述VH结构域包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
47.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述变构结合部分的所述scFv分子之一或
两者包括衍生自M13-C06抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域。
48.根据权利要求47所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者是具有大于
60-61℃的T50的稳定化的C06scFv分子。
49.根据权利要求47所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者是具有比普通
C06scFv分子(pWXU092或pWXU090)的T50高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
50.根据权利要求48所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv的可变轻链结构域
(VL)除了在该VL结构域中选自以下组成的组的氨基酸位置存在一个或多个稳定化突变：
(i)M4、(ii)L11；(iii)V15、(iv)T20、(v)Q24、(vi)R30、(vii)T47、(viii)A51、(ix)G63、(x)D70、(xi)S72、(xii)T74、(xiii)S77和(xiv)I83(Kabat编号惯例)，与M13-CO6抗体的VL结构域(SEQ IDNO：78)相同。
51.根据权利要求50所述的抗体分子，所述稳定化突变选自以下组成的组：M4L、L11G、V15A、V15D、V15E、V15G、V15I、V15N、V15P、V15R、V15S、T20R、Q24K、R30N、R30T、R30Y、A51G、G63S、D70E、S72N、S72Y、T74S、S77G、I83D、I83E、I83G、I83M、I83R、I83S和I83V。
52.根据权利要求48所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv的可变重链结构域
(VH)除了在选自以下组成的组的氨基酸位置存在一个或多个稳定化突变：(i)S21、(ii)W47、(iii)R83和(iv)T110(Kabat编号惯例)，与M13-CO6抗体的VH结构域(SEQID NO：14)相同。
53.根据权利要求52所述的抗体分子，其中所述稳定化突变选自以下组成的组：S21E、W47F、R83K、R83T和T110V。
54.根据权利要求48所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合
VL L15S：VH T110V。
55.根据权利要求48所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合
VL S77G：VL I83Q。
56.根据权利要求48所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子是选自MJF-014、
MJF-015、MJF-016、MJF-017、MJF-018、MJF-019、MJF-020、MJF-021、MJF-022、MJF-023、MJF-024、MJF-025、MJF-026、MJF-027、MJF-028、MJF-029、MJF-030、MJF-031、MJF-032、MJF-033、MJF-034、MJF-035、MJF-036、MJF-037、MJF-038、MJF-039、MJF-040、MJF-041、MJF-042、MJF-043、MJF-044、MJF-045、MJF-046、MJF-047、MJF-048、MJF-049、MJF-050和MJF-051组成的组的稳定化的CO6scFv分子。
57.根据权利要求48所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子是包含MJF-045的
氨基酸序列(SEQ ID NO：128)的稳定化的CO6VH/VL(I83E)scFv分子。
58.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者由Gly/Ser连接
序列连接到所述IgG抗体。
59.根据权利要求58所述的抗体分子，其中所述Gly/Ser连接序列是(Gly4Ser)5或
Ser(Gly4Ser)3连接序列。
60.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述scFv分子经所述scFv分子的VL结构
域连接或融合至所述IgG抗体。
61.根据权利要求60所述的抗体分子，其中所述scFv分子以VH→(Gly4Ser)n连接序
列→VL的方向，且其中n是3、4、5或6。
62.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述scFv分子经所述scFv分子的VH结构
域连接或融合至所述IgG抗体。
63.根据权利要求62所述的抗体分子，其中所述scFv分子以VL→(Gly4Ser)n连接序
列→VH的方向，且其中n是3、4、5或6。
64.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者连接或融合至所
述IgG抗体的重链以形成所述双特异性抗体的重链。
65.根据权利要求64所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG
抗体的第一重链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二重链。
66.根据权利要求65所述的抗体分子，其中所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体
的所述第一重链和所述第二重链的N-末端。
67.根据权利要求66所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：
130(pXWU118)的G11轻链序列；且其中所述双特异性抗体的重链包括SEQ ID NO：
133(pXWU136)的氨基酸序列。
68.根据权利要求66所述的抗体分子，其中所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏的
细胞系产生。
69.根据权利要求65所述的抗体分子，其中所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体
的所述第一重链和所述第二重链的C-末端以形成所述双特异性抗体分子的重链。
70.根据权利要求69所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：
130(pXWU118)的G11轻链序列且其中所述scFv分子当连接到所述重链的N-末端时包括
SEQ ID NO：137(pXWU135)的序列。
71.根据权利要求69所述的抗体分子，其中所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏的
细胞系产生。
72.根据权利要求44所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者连接或融合至所
述IgG抗体的轻链。
73.根据权利要求72所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG
抗体的第一轻链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二轻链。
74.根据权利要求72所述的抗体分子，其中所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体
的所述第一轻链和所述第二轻链的N-末端。
75.根据权利要求43所述的抗体分子，其中所述变构结合部分由IgG抗体提供且所述
竞争性结合部分由连接或融合至所述IgG抗体的两个scFv分子提供。
76.根据权利要求75所述的抗体分子，其中所述IgG抗体包括来自M13-C06抗体的轻
链(VL)和重链(VH)可变结构域。
77.根据权利要求76所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的所述VL结构域包括SEQ ID
NO：78的氨基酸序列且所述IgG抗体的所述VH结构域包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
78.根据权利要求75所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者包括衍生自
M14-G11抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域。
79.根据权利要求78所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者是具有大于
50-51℃的T50的稳定化的G11scFv分子。
80.根据权利要求78所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者是具有比普通
G11(VL/GS4/VH)scFv分子(pMJF060)的T50高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分
子。
81.根据权利要求79所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv的可变轻链结构域
(VL)除了在氨基酸位置L50和/或V83(Kabat编号惯例)存在一个或多个稳定化突变，与
M14-G11抗体的VL结构域(SEQ ID NO：93)相同。
82.根据权利要求81所述的抗体分子，所述稳定化突变选自以下组成的组：L50G、
L50M、L50N和V83E。
83.根据权利要求79所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv的可变重链结构域
(VH)除了在氨基酸位置E6和/或S49(Kabat编号惯例)存在一个或多个稳定化突变，与
M14-G11抗体的VH结构域(SEQ ID NO：32)相同。
84.根据权利要求83所述的抗体分子，其中所述稳定化突变选自以下组成的组：E6Q、
S49A和S49G。
85.根据权利要求79所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合
VL L50N：VH E6Q。
86.根据权利要求79所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合
VL V83E：VH E6Q。
87.根据权利要求79所述的抗体分子，其中所述稳定化的scFv分子是选自MJF-060、
MJF-084、MJF-085、MJF-086、MJF-087、MJF-091、MJF-092和MJF-097组成的组的稳定化的G11scFv分子。
88.根据权利要求75所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者由Gly/Ser连接
序列连接到所述IgG抗体。
89.根据权利要求88所述的抗体分子，其中所述Gly/Ser连接序列是(Gly4Ser)5或
Ser(Gly4Ser)3连接序列。
90.根据权利要求75所述的抗体分子，其中所述scFv分子经所述scFv分子的VL结构
域连接或融合至所述IgG抗体。
91.根据权利要求90所述的抗体分子，其中所述scFv分子以VH→(Gly4Ser)n连接序
列→VL的方向，且其中n是3、4、5或6。
92.根据权利要求75所述的抗体分子，其中所述scFv分子经所述scFv分子的VH结构
域连接或融合至所述IgG抗体。
93.根据权利要求92所述的抗体分子，其中所述scFv分子以VL→(Gly4Ser)n连接序
列→VH的方向，且其中n是3、4、5或6。
94.根据权利要求75所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者连接或融合至所
述IgG抗体的重链。
95.根据权利要求94所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG
抗体的第一重链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二重链。
96.根据权利要求95所述的抗体分子，其中所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体
的所述第一重链和所述第二重链的N-末端。
97.根据权利要求96所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：140
的CO6轻链序列且其中所述scFv分子当连接到所述重链的N-末端时包括SEQ ID NO：144的序列。
98.根据权利要求96所述的抗体分子，其中所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏的
细胞系产生。
99.根据权利要求95所述的抗体分子，其中所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体
的所述第一重链和所述第二重链的C-末端。
100.根据权利要求99所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：140
的CO6轻链序列且其中所述scFv分子当连接到所述重链的N-末端时包括SEQ ID NO：144的序列。
101.根据权利要求99所述的抗体分子，其中所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏
的细胞系产生。
102.根据权利要求95所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一或两者连接或融合至
所述IgG抗体的轻链。
103.根据权利要求102所述的抗体分子，其中所述scFv分子之一连接或融合至所述
IgG抗体的第一轻链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二轻链。
104.根据权利要求103所述的抗体分子，其中所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗
体的所述第一轻链和所述第二轻链的N-末端。
105.根据权利要求43-104任一项所述的抗体分子，其中所述IgG抗体包括人类IgG4
同种型的重链恒定结构域。
106.根据权利要求43-104任一项所述的抗体分子，其中所述IgG抗体包括人类IgG1
同种型的重链恒定结构域。
107.根据权利要求43-104任一项所述的抗体分子，其中所述IgG抗体是两种或更多种
人类抗体同种型的重链恒定结构域部分的嵌合体。
108.根据权利要求107所述的抗体分子，其中所述IgG抗体包括Fc区，其中所述Fc区
的残基233-236和327-331来自人类IgG2抗体且所述Fc区的其余残基来自人类IgG4抗
体。
109.根据权利要求105或106所述的抗体分子，其中所述IgG抗体的重链恒定区缺少
糖基化。
110.根据权利要求109所述的抗体分子，其中所述IgG抗体包括所述完整抗体铰链结
构域中的S228P和/或所述完整抗体CH2结构域中的T299A突变，其中所述突变是相对于
野生型人类IgG抗体(EU编号系统)。
111.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子当以商业规模生产时
基本上抗聚集。
112.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子抑制IGF-1R-介导的
细胞增殖。
113.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子抑制IGF-1或
IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化。
114.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子抑制IGF-1或
IGF-2-介导的AKT磷酸化。
115.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子抑制AKT介导的存活
信号传导。
116.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子抑制肿瘤体内生长。
117.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，所述结合分子诱导IGF-1R内化。
118.根据权利要求6-104任一项所述的结合分子，其中所述结合分子轭合至选自如
下组成的组的物质：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、检测标记、聚乙二醇(PEG)和两种或更多种任何所述物质的组合。
119.根据权利要求118所述的结合分子，其中所述细胞毒性剂选自放射性核素、生物
毒素、酶活性的毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性配体、生物应答调节剂、或两种或更多种任何所述细胞毒性剂的组合组成的组。
120.一种组合物，其包括权利要求6-104任一项所述的结合分子和载体。
121.一种治疗患有过度增殖性病症的对象的方法，该方法包括向对象施用权利要求
6-104任一项所述的结合分子以使治疗发生。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述过度增殖性病症选自癌症、赘生物、肿
瘤、恶性肿瘤或其转移组成的组。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述过度增殖性病症是癌症，所述癌症选自
以下组成的组：肉瘤、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、白血病、胃癌、脑癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
124.一种核酸分子，其编码权利要求6-104任一项所述的结合分子或其重链或轻链。
125.根据权利要求124所述的核酸分子，所述核酸分子在载体中。
126.一种宿主细胞，其包含权利要求125所述的载体。
127.一种产生权利要求6-104任一项所述的结合分子的方法，该方法包括：
(i)培养权利要求126所述的宿主细胞以使所述结合分子在宿主细胞培养基中分泌并
(ii)从所述培养基分离所述结合分子。
128.一种稳定化的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子具有比普通scFv分子的
T50高至少2℃-10℃的T50。
129.根据权利要求128所述的scFv分子，其中所述分子具有大于50℃的T50。
130.根据权利要求128所述的scFv分子，其中所述分子具有大于60℃的T50。
131.根据权利要求128所述的scFv分子，其与普通scFv分子相比包括一个或多个稳
定化突变，其中所述突变存在于选自以下VL氨基酸位置组成的组的VL氨基酸位置：(i)4、(ii)11；(iii)15、(iv)20、(v)24、(vi)30、(vii)47、(viii)50、(ix)51、(x)63、(xi)70、(xii)72、(xiii)74、(xiv)77和(xv)83(Kabat编号惯例)。
132.根据权利要求131所述的scFv分子，其中所述稳定化突变选自以下组成的组：
4L、11G、15A、15D、15E、15G、15I、15N、15P、15R、15S、20R、24K、30N、30T、30Y、50G、50M、50N、
51G、63S、70E、72N、72Y、74S、77G、83D、83E、83G、83M、83R、83S和83V。
133.根据权利要求128所述的scFv分子，其与普通scFv分子相比包括一个或多个稳
定化突变，其中所述突变存在于选自以下VH氨基酸位置组成的组的VH氨基酸位置：(i)6、(ii)21、(iii)47、(iv)49和(v)110(Kabat编号惯例)。
134.根据权利要求133所述的scFv分子，其中所述稳定化突变选自以下组成的组：
6Q、21E、47F、49A、49G、83K、83T和110V。
135.根据权利要求128所述的scFv分子，其与普通scFv分子相比包括一个或多个稳
定化突变，其中所述突变存在于选自以下组成的氨基酸位置：(i)VL氨基酸位置50，(ii)VL氨基酸位置83；(iii)VH氨基酸位置6和(iv)VH氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。
136.根据权利要求128所述的scFv分子，其与普通scFv分子相比包括稳定化突变，
其中所述突变存在于：(i)VL氨基酸位置50，(ii)VL氨基酸位置83；(iii)VH氨基酸位置6和(iv)VH氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。
137.根据权利要求135或136所述的scFv分子，其中所述稳定化突变选自以下组成
的组：VL 50G、VL 50M、VL 50N、VL 83D、VL 83E、VL 83G、VL 83M、VL 83R、VL 83S、VL 83V、VH6Q、VH 49A和VH 49G。
138.根据权利要求128所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子具有比普通
C06scFv分子(pWXU092或pWXU090)的T50高至少2℃-10℃的T50。
139.根据权利要求138所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv的可变轻链结构域
(VL)除了在该VL结构域中选自以下组成的组的氨基酸位置存在一个或多个稳定化突变：
(i)M4、(ii)L11；(iii)V15、(iv)T20、(v)Q24、(vi)R30、(vii)T47、(viii)A51、(ix)G63、(x)D70、(xi)S72、(xii)T74、(xiii)S77和(xiv)I83(Kabat编号惯例)，与M13-CO6抗体的VL结构域(SEQ IDNO：78)相同。
140.根据权利要求139所述的scFv分子，所述稳定化突变选自以下组成的组：M4L、
L11G、V15A、V15D、V15E、V15G、V15I、V15N、V15P、V15R、V15S、T20R、Q24K、R30N、R30T、R30Y、A51G、G63S、D70E、S72N、S72Y、T74S、S77G、I83D、I83E、I83G、I83M、I83R、I83S和I83V。
141.根据权利要求138所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv的可变重链结构
域(VH)除了在选自以下组成的组的氨基酸位置存在一个或多个稳定化突变：(i)S21、(ii)W47、(iii)R83和(iv)T110(Kabat编号惯例)，与M13-CO6抗体的VH结构域(SEQ ID NO：
14)相同。
142.根据权利要求141所述的scFv分子，其中所述稳定化突变选自以下组成的组：
S21E、W47F、R83K、R83T和T110V。
143.根据权利要求138所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变
组合VL L15S：VHT110V。
144.根据权利要求138所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变
组合VL S77G：VL I83Q。
145.根据权利要求138所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子是选自
MJF-014、MJF-015、MJF-016、MJF-017、MJF-018、MJF-019、MJF-020、MJF-021、MJF-022、MJF-023、MJF-024、MJF-025、MJF-026、MJF-027、MJF-028、MJF-029、MJF-030、MJF-031、MJF-032、MJF-033、MJF-034、MJF-035、MJF-036、MJF-037、MJF-038、MJF-039、MJF-040、MJF-041、MJF-042、MJF-043、MJF-044、MJF-045、MJF-046、MJF-047、MJF-048、MJF-049、MJF-050和MJF-051组成的组的稳定化的CO6scFv分子。
146.根据权利要求128所述的scFv分子，所述scFv分子是具有比普通G11(VL/GS4/
VH)scFv分子(pMJF060)的T50高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
147.根据权利要求146所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv的可变轻链结构域
(VL)除了在氨基酸位置L50和/或V83(Kabat编号惯例)存在一个或多个稳定化突变，与
M14-G11抗体的VL结构域(SEQ ID NO：93)相同。
148.根据权利要求147所述的scFv分子，所述稳定化突变选自以下组成的组：L50G、
L50M、L50N和V83E。
149.根据权利要求146所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv的可变重链结构域
(VH)除了在氨基酸位置E6和/或S49(Kabat编号惯例)存在一个或多个稳定化突变，与
M14-G11抗体的VH结构域(SEQ ID NO：32)相同。
150.根据权利要求149所述的scFv分子，其中所述稳定化突变选自以下组成的组：
E6Q、S49A和S49G。
151.根据权利要求146所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变
组合VL L50N：VH E6Q。
152.根据权利要求146所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子包括以下突变
组合VL V83E：VH E6Q。
153.根据权利要求146所述的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子是选自
MJF-060、MJF-084、MJF-085、MJF-086、MJF-087、MJF-091、MJF-092和MJF-097组成的组的稳定化的G11scFv分子。
154.根据权利要求128-153任一项所述的scFv分子，其中所述scFv分子具有对
IGF-1R的结合特异性。
155.一种多价结合分子，其包含权利要求128-153任一项所述的稳定化的scFv分子。
156.根据权利要求155所述的多价结合分子，所述多价结合分子当以商业规模生产时
基本上不含聚集体。
157.根据权利要求155所述的多价结合分子，所述多价结合分子在缓冲体系(如PBS)
中孵育至少3个月后基本上不含聚集体。
158.根据权利要求155所述的多价结合分子，所述多价结合分子具有至少60℃的解链
温度(Tm)。
159.一种制备稳定化的多价结合分子的方法，该方法包括将权利要求128-154任一项
所述的稳定化的scFv分子遗传融合到抗体分子轻链或重链的氨基末端或羧基末端。
160.一种核酸分子，该核酸分子包含编码权利要求128-154任一项所述的稳定化的
scFv分子或权利要求155所述的多价结合分子的核苷酸序列。
161.根据权利要求160所述的核酸分子，该核酸分子在载体中。
162.一种宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求161所述的载体。
163.一种产生稳定化的结合分子的方法，该方法包括在使得产生稳定化的结合分子的
条件下培养权利要求162所述的宿主细胞。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述宿主细胞以商业规模(如，50L)培养且
其中每升宿主细胞培养基产生至少5mg所述稳定化的结合分子。
165.根据权利要求163所述的方法，其中所述宿主细胞以商业规模(如，50L)培养且
其中每升宿主细胞培养基产生至少50mg所述稳定化的结合分子。
166.根据权利要求163所述的方法，其中所述宿主细胞以商业规模培养且其中不多于
10％的所述结合分子以聚集形式存在。
167.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R
介导的肿瘤细胞体外生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
168.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R
介导的肿瘤细胞体内生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
169.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上阻断IGF-1R
介导的信号传导：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
170.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子比以下以更大结合亲和力结合于IGF-1R：(i)包含
所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
171.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上阻断IGF-1
和/或IGF-2对IGF-1R的结合：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
172.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子比以下具有更长的血清半衰期：(i)包含所述第一
结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
173.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1
或IGF-2介导的IGF-1R磷酸化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，
(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
174.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1
或IGF-2介导的AKT和/或MAPK磷酸化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合
分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
175.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子比以下在更大程度上交联IGF-1R受体：(i)包含
所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
176.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上诱导IGF-1R
受体内化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
177.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上诱导肿瘤细
胞周期停滞：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
178.一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：
a)至少第一IGF-1R结合部分，其特异性结合第一IGF-1R表位；和
b)至少第二IGF-1R结合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不
重叠的第二IGF-1R表位；
其中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R
介导的肿瘤细胞生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
结合IGF-1R多个表位的组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 依据美国专利法第119(e)条，本申请要求在2007年8月28日提交的名称是“结合IGF-1R多个表位的组合物”的第60/966,475号美国临时申请的权益。本申请还涉及在
2008年8月28日提交的USSN XX/XXX,XXX，其依据美国专利法第119(e)条要求在2007年
8月28日提交的名称是“抗IGF-1R抗体和其用途”的第XX/XXX,XXX号美国临时申请的权
益。本申请还涉及在2007年3月28日提交的第11/727,887号美国专利申请，其依据美国
法典第35编专利法第119(e)条要求在2006年3月28日提交的第60/786,347号美国临
时申请和在2006年12月22日提交的第60/876,554号美国临时申请的权益。上面所引用
的专利申请中的每一个特此通过引用被全文并入。
2008年8月28日提交的USSN XX/XXX,XXX，其依据美国专利法第119(e)条要求在2007年
8月28日提交的名称是“抗IGF-1R抗体和其用途”的第XX/XXX,XXX号美国临时申请的权
益。本申请还涉及在2007年3月28日提交的第11/727,887号美国专利申请，其依据美国
法典第35编专利法第119(e)条要求在2006年3月28日提交的第60/786,347号美国临
时申请和在2006年12月22日提交的第60/876,554号美国临时申请的权益。上面所引用
的专利申请中的每一个特此通过引用被全文并入。
背景技术
[0003] 在癌细胞中，受体酪氨酸激酶(TK)在将细胞外肿瘤微环境连接至细胞内信号传导途径中扮演重要角色，其中所述信号传导途径控制各种细胞功能，例如细胞分裂周期、存活、凋亡、基因表达、细胞骨架结构、细胞粘附和细胞迁移。由于控制细胞信号传导的机制被理解得较好，所以可通过在配体结合、受体表达/回收、受体激活和信号传导事件中涉及的蛋白的水平上的靶向来发展破坏这些细胞功能中一种或多种的治疗策略(Hanahan和
Weinberg，Cell 2000.100：57-70)。
Weinberg，Cell 2000.100：57-70)。
[0004] I型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R，CD221)属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族(Ullrich等人，Cell.1990.，61：203-12)。IGF-1和IGF-2是IGF-1R的两种激活性
配体。连同胰岛素样生长因子受体2(IGF-2R；CD222)和相关的IGF结合蛋白(IGFBP-1
至IGFBP-6)，这些蛋白共同形成IGF系统，该系统已显示在出生前和出生后发育、生长
激素响应、细胞转化、存活、侵袭性和转移性肿瘤表型的获得中起重要作用(Baserga，
Cell.1994.79：927-30；Baserga等人，Exp.Cell Res.1999.253：1-6，Baserga等人，Int J.Cancer.2003.107：873-77)。
配体。连同胰岛素样生长因子受体2(IGF-2R；CD222)和相关的IGF结合蛋白(IGFBP-1
至IGFBP-6)，这些蛋白共同形成IGF系统，该系统已显示在出生前和出生后发育、生长
激素响应、细胞转化、存活、侵袭性和转移性肿瘤表型的获得中起重要作用(Baserga，
Cell.1994.79：927-30；Baserga等人，Exp.Cell Res.1999.253：1-6，Baserga等人，Int J.Cancer.2003.107：873-77)。
[0005] 许多研究已经表明，大量人类肿瘤表达高水平的IGF-1R。表达IGF-1R的肿瘤接受来自循环中(肝脏产生的)IGF-1的旁分泌受体激活信号和来自肿瘤自身产生的IGF-2的
自分泌受体激活信号两者。近来早期临床试验的数据表示，抑制IGF-1R途径可导致敏感肿
瘤中的临床响应。然而已注意到，抗体诱导的向下调节IGF-1R表达通常引起IGF-1在患者
中的系统水平增加。所以，完全抑制IGF-1R途径通常是不可行的。因此，本领域存在对能
够更有效地阻断赘生性疾病(包括癌症及其转移)的细胞存活和生长的IGF-1R介导途径
的治疗方法和组合物的需求。
自分泌受体激活信号两者。近来早期临床试验的数据表示，抑制IGF-1R途径可导致敏感肿
瘤中的临床响应。然而已注意到，抗体诱导的向下调节IGF-1R表达通常引起IGF-1在患者
中的系统水平增加。所以，完全抑制IGF-1R途径通常是不可行的。因此，本领域存在对能
够更有效地阻断赘生性疾病(包括癌症及其转移)的细胞存活和生长的IGF-1R介导途径
的治疗方法和组合物的需求。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明至少部分地基于该发现：结合IGF-1R中不同表位的结合分子导致与结合单个IGF-1R表位的结合分子相比提高的IGF-1和/或IGF-2阻断能力。本发明提供结合
IGF-1R多个表位的组合物，例如，单特异性结合分子或多特异性结合分子(如，双特异性分子)的组合。还提供了制备所述结合分子的方法和使用本发明的结合分子来拮抗IGF-1R
信号传导的方法。
IGF-1R多个表位的组合物，例如，单特异性结合分子或多特异性结合分子(如，双特异性分子)的组合。还提供了制备所述结合分子的方法和使用本发明的结合分子来拮抗IGF-1R
信号传导的方法。
[0008] 在一方面，本发明涉及一种抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述肿瘤细胞与结合于IGF-1R的第一表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合
的第一结合部分和结合于IGF-1R的第二、不同表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对
IGF-1R的结合的第二结合部分接触，其中所述第一部分和所述第二部分对IGF-1R的结合
比所述第一部分或所述第二部分单独结合在更大程度上阻断IGF-1R介导的信号传导，从
而抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞的存活或生长。
的第一结合部分和结合于IGF-1R的第二、不同表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对
IGF-1R的结合的第二结合部分接触，其中所述第一部分和所述第二部分对IGF-1R的结合
比所述第一部分或所述第二部分单独结合在更大程度上阻断IGF-1R介导的信号传导，从
而抑制表达IGF-1R的肿瘤细胞的存活或生长。
[0009] 在一个实施方案中，所述第一结合部分和所述第二结合部分通过不同机制阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合。
[0010] 在一个实施方案中，第一结合部分和第二结合部分存在于同一结合分子。在另一实施方案中，第一结合部分和第二结合部分存在于不同结合分子。
[0011] 在一个实施方案中，第一结合部分和第二结合部分不竞争对IGF-1R的结合。
[0012] 在一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，包含结合于IGF-1R的第一表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第一IGF-1R结合部分和结合于
IGF-1R的第二、不同表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第二结合部
分。
IGF-1R的第二、不同表位并阻断IGF-1和IGF-2的至少一个对IGF-1R的结合的第二结合部
分。
[0013] 在一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：a)至少第一变构IGF-1R结合部分，所述第一变构IGF-1R结合部分特异性结合第一变构IGF-1R表位
从而变构地阻断IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合；和b)至少第二IGF-1R结合部分，其中
所述第二结合部分特异性结合(i)竞争性IGF-1R表位，从而竞争性地阻断IGF-1和IGF-2
对IGF-1R的结合；或(ii)第二变构IGF-1R表位，从而变构地阻断IGF-1而不是IGF-2对
IGF-1R的结合。
从而变构地阻断IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合；和b)至少第二IGF-1R结合部分，其中
所述第二结合部分特异性结合(i)竞争性IGF-1R表位，从而竞争性地阻断IGF-1和IGF-2
对IGF-1R的结合；或(ii)第二变构IGF-1R表位，从而变构地阻断IGF-1而不是IGF-2对
IGF-1R的结合。
[0014] 在一个实施方案中，所述第一变构表位位于跨IGF-1R的FnIII-I结构域并包括IGF-1R的氨基酸437-586的区域中。在另一实施方案中，所述第一变构表位包括至少3个连
续或不连续氨基酸，其中所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸位置437、438、
459、460、461、462、464、466、467、469、470、471、472、474、476、477、478、479、480、482、483、
488、490、492、493、495、496、509、513、514、515、53、544、545、546、547、548、551、564、565、
568、570、571、572、573、577、578、579、582、584、585、586和587组成的组。在另一实施方案中，所述第一变构表位包括IGF-1R的氨基酸461、462和464的至少一个。
续或不连续氨基酸，其中所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸位置437、438、
459、460、461、462、464、466、467、469、470、471、472、474、476、477、478、479、480、482、483、
488、490、492、493、495、496、509、513、514、515、53、544、545、546、547、548、551、564、565、
568、570、571、572、573、577、578、579、582、584、585、586和587组成的组。在另一实施方案中，所述第一变构表位包括IGF-1R的氨基酸461、462和464的至少一个。
[0015] 在一个实施方案中，所述竞争性表位位于包含CRR结构域一部分的区域，该区域包含IGF-1R的氨基酸残基248-303。在另一实施方案中，所述竞争性表位包括至少3个连
续或不连续氨基酸，其中所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸248、250、254、
257、259、260、263、265、301和303组成的组。在另一实施方案中，所述竞争性表位包括IGF-1R的氨基酸248、250和254。
续或不连续氨基酸，其中所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸248、250、254、
257、259、260、263、265、301和303组成的组。在另一实施方案中，所述竞争性表位包括IGF-1R的氨基酸248、250和254。
[0016] 在一个实施方案中，所述第二变构表位位于包含IGF-1R的CRR和L2结构域两者的区域，该区域包含IGF-1R的残基241-379。在另一实施方案中，所述第二变构表位包括至少3个连续或不连续氨基酸，其中至少一个氨基酸选自IGF-1R的氨基酸241、248、250、251、
254、257、263、265、266、301、303、308、327和379组成的组。在另一实施方案中，所述第二变构表位包括IGF-1R的氨基酸241、242、251、257、265和266的至少一个。
254、257、263、265、266、301、303、308、327和379组成的组。在另一实施方案中，所述第二变构表位包括IGF-1R的氨基酸241、242、251、257、265和266的至少一个。
[0017] 在一个实施方案中，所述第一变构结合部分衍生自M13-C06抗体(ATCC登记号)或M14-C03抗体(ATCC登记号 )。在另一实施方案中，所述第一
变构结合部分是包含M13-C06抗体(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登
记号 )的CDR1-6的抗原结合位点。在另一实施方案中，所述第一变构结合部
分与M13-C06抗体(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登记号
)竞争对IGF-1R的结合。
变构结合部分是包含M13-C06抗体(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登
记号 )的CDR1-6的抗原结合位点。在另一实施方案中，所述第一变构结合部
分与M13-C06抗体(ATCC登记号 )或M14-C03抗体(ATCC登记号
)竞争对IGF-1R的结合。
[0018] 在一个实施方案中，所述竞争性结合部分衍生自M14-G11抗体(ATCC登记号)。在另一实施方案中，所述竞争性结合部分是包含M14-G11抗体(ATCC登记
号 )的CDR1-6的抗原结合位点。在另一实施方案中，所述竞争性结合部分与
M14-G11抗体(ATCC登记号 )竞争对IGF-1R的结合。
号 )的CDR1-6的抗原结合位点。在另一实施方案中，所述竞争性结合部分与
M14-G11抗体(ATCC登记号 )竞争对IGF-1R的结合。
[0019] 在一个实施方案中，所述第二变构结合部分衍生自P1E2抗体(ATCC登记号)或αIR3抗体。在另一实施方案中，所述第二变构结合部分是包含P1E2抗
体(ATCC登记号 )或αIR3抗体的CDR1-6的抗原结合位点。在另一实施方案
中，所述第二变构结合部分衍生自与P1E2抗体(ATCC登记号 )或αIR3抗体
竞争对IGF-1R的结合的抗体。
体(ATCC登记号 )或αIR3抗体的CDR1-6的抗原结合位点。在另一实施方案
中，所述第二变构结合部分衍生自与P1E2抗体(ATCC登记号 )或αIR3抗体
竞争对IGF-1R的结合的抗体。
[0020] 在一方面，本发明涉及本发明的结合分子，其是双特异性的。在一个实施方案中，该结合分子对第一结合特异性是多价的。在另一实施方案中，该结合分子对第二结合特异性是多价的。
[0021] 在一个实施方案中，所述结合分子包括四个结合部分。
[0022] 在一个实施方案中，所述结合部分的至少一个是scFv分子。
[0023] 在一个实施方案中，所述结合分子是包含两个或更多个scFv分子的四价抗体分子。所述scFv分子可独立选自本文公开的任何一种scFv分子。
[0024] 在一个实施方案中，所述scFv分子融合到所述四价抗体分子重链的C-末端。在另一实施方案中，所述scFv分子融合到所述四价抗体分子重链的N-末端。在另一实施方
案中，所述scFv分子融合到所述四价抗体分子轻链的N-末端。
案中，所述scFv分子融合到所述四价抗体分子轻链的N-末端。
[0025] 在一个实施方案中，该结合分子包括稳定化的scFv分子。
[0026] 在一个实施方案中，该结合分子是完全人类的。在另一实施方案中，该结合分子包括人源化可变区。在另一实施方案中，该结合分子包括嵌合可变区。
[0027] 在一个实施方案中，该结合分子包括重链恒定区或其片段。在另一实施方案中，所述重链恒定区或其片段是人类IgG4。在一个实施方案中，所述IgG4恒定区缺少糖基化。在一个实施方案中，按照EU编号系统编号，所述IgG4恒定区包括与野生型IgG4恒定区相比
的S228P和T299A突变。
的S228P和T299A突变。
[0028] 在另一方面，本发明涉及一种双特异性IGF-1R抗体分子，包含两个变构结合部分(如，本文公开的任何两种变构结合部分，如衍生自M13-C06抗体(ATCC登记号
)的变构结合部分)和两个竞争性结合部分(如，本文公开的任何两种竞争性结合部分，如
衍生自M14-G11抗体(ATCC登记号 )的竞争性结合部分)。
)的变构结合部分)和两个竞争性结合部分(如，本文公开的任何两种竞争性结合部分，如
衍生自M14-G11抗体(ATCC登记号 )的竞争性结合部分)。
[0029] 在一个实施方案中，所述竞争性结合部分由IgG抗体提供，所述变构结合部分由连接或融合至所述IgG抗体的两个scFv分子提供。在某些实施方案中，所述scFv分子独
立选自本文公开的任何一种CO6 scFv分子。
立选自本文公开的任何一种CO6 scFv分子。
[0030] 在一个实施方案中，所述IgG抗体包括来自M14-G11抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域。在一个实施方案中，所述IgG抗体的所述VL结构域包括SEQ ID NO：93的氨
基酸序列，所述IgG抗体的所述VH结构域包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
基酸序列，所述IgG抗体的所述VH结构域包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
[0031] 在一个实施方案中，所述变构结合部分的所述scFv分子之一或两者包括衍生自M13-C06抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域。
[0032] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者是具有大于60-61℃的T50的稳定化的C06 scFv分子。在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者是具有比普通C06 scFv
分子(pWXU092或pWXU090)高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
分子(pWXU092或pWXU090)高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
[0033] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变轻链结构域(VL)与M13-CO6抗体的VL结构域(SEQ ID NO：78)相同，但在VL结构域中选自以下组成的组的氨基酸位置存在
一个或多个稳定化突变：(i)M4、(ii)L11；(iii)V15、(iv)T20、(v)Q24、(vi)R30、(vii)T47、(viii)A51、(ix)G63、(x)D70、(xi)S72、(xii)T74、(xiii)S77和(xiv)I83(Kabat编号惯
例)。
一个或多个稳定化突变：(i)M4、(ii)L11；(iii)V15、(iv)T20、(v)Q24、(vi)R30、(vii)T47、(viii)A51、(ix)G63、(x)D70、(xi)S72、(xii)T74、(xiii)S77和(xiv)I83(Kabat编号惯
例)。
[0034] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：M4L、L11G、V15A、V15D、V15E、V15G、V15I、V15N、V15P、V15R、V15S、T20R、Q24K、R30N、R30T、R30Y、A51G、G63S、D70E、S72N、S72Y、T74S、S77G、I83D、I83E、I83G、I83M、I83R、I83S和I83V。
[0035] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变重链结构域(VH)与M13-CO6抗体的VH结构域(SEQ ID NO：14)相同，但在选自以下组成的组的氨基酸位置存在一个或多个
稳定化突变：(i)S21、(ii)W47、(iii)R83和(iv)T110(Kabat编号惯例)。
稳定化突变：(i)S21、(ii)W47、(iii)R83和(iv)T110(Kabat编号惯例)。
[0036] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：S21E、W47F、R83K、R83T和T110V。在另一实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL L15S：VHT110V。在另一实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL S77G：VLI83Q。
[0037] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子之一或两者是独立选自MJF-014、MJF-015、MJF-016、MJF-017、MJF-018、MJF-019、MJF-020、MJF-021、MJF-022、MJF-023、MJF-024、MJF-025、MJF-026、MJF-027、MJF-028、MJF-029、MJF-030、MJF-031、MJF-032、MJF-033、MJF-034、MJF-035、MJF-036、MJF-037、MJF-038、MJF-039、MJF-040、MJF-041、MJF-042、MJF-043、MJF-044、MJF-045、MJF-046、MJF-047、MJF-048、MJF-049、MJF-050和MJF-051组成的组的稳定化的CO6 scFv分子。
[0038] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子是包含MJF-045的氨基酸序列(SEQID NO：128)的稳定化的CO6 VH/VL(I83E)scFv分子。
[0039] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者由Gly/Ser连接序列连接到所述IgG抗体。在另一实施方案中，所述Gly/Ser连接序列是(Gly4Ser)5或Ser(Gly4Ser)3连接
序列。
序列。
[0040] 在一个实施方案中，所述scFv分子经所述scFv分子的VL结构域连接或融合至所述IgG抗体。在一个实施方案中，所述scFv分子以VH→(Gly4Ser)n连接序列→VL的方
向，且其中n是3、4、5或6。在另一实施方案中，所述scFv分子经所述scFv分子的VH结构
域连接或融合至所述IgG抗体。在一个实施方案中，所述scFv分子以VL→(Gly4Ser)n连
接序列→VH的方向，且其中n是3、4、5或6。
向，且其中n是3、4、5或6。在另一实施方案中，所述scFv分子经所述scFv分子的VH结构
域连接或融合至所述IgG抗体。在一个实施方案中，所述scFv分子以VL→(Gly4Ser)n连
接序列→VH的方向，且其中n是3、4、5或6。
[0041] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者连接或融合至所述IgG抗体的重链以形成所述双特异性抗体的重链。在一个实施方案中，所述scFv分子之一连接或融合至所
述IgG抗体的第一重链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二重链。在
另一实施方案中，所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一重链和所述第二重
链的N-末端。
述IgG抗体的第一重链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二重链。在
另一实施方案中，所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一重链和所述第二重
链的N-末端。
[0042] 在一个实施方案中，所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：130(pXWU118)的G11轻链序列；且其中所述双特异性抗体的重链包括SEQ ID NO：133(pXWU136)的氨基酸序列。
[0043] 在一个实施方案中，所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏的细胞系产生。
[0044] 在一个实施方案中，所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一重链和所述第二重链的C-末端以形成所述双特异性抗体分子的重链。
[0045] 在一个实施方案中，所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：130(pXWU118)的G11轻链序列且其中所述scFv分子当连接到所述重链的N-末端时包括SEQ ID NO：137(pXWU135)
的序列。
的序列。
[0046] 在一个实施方案中，所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏的细胞系产生。
[0047] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者连接或融合至所述IgG抗体的轻链。
[0048] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第一轻链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二轻链。在一个实施方案中，所述scFv
分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一轻链和所述第二轻链的N-末端。
分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一轻链和所述第二轻链的N-末端。
[0049] 在一个实施方案中，所述变构结合部分由IgG抗体提供且所述竞争性结合部分由连接或融合至所述IgG抗体的两个scFv分子提供。
[0050] 在一个实施方案中，所述IgG抗体包括来自M13-C06抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域。
[0051] 在一个实施方案中，所述IgG抗体的所述VL结构域包括SEQID NO：78的氨基酸序列且所述IgG抗体的所述VH结构域包括SEQID NO：14的氨基酸序列。
[0052] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者包括衍生自M14-G11抗体的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域。
[0053] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者是具有大于50-51℃的T50的稳定化的G11 scFv分子。所述scFv分子之一或两者是具有比普通G11(VL/GS4/VH)scFv分子
(pMJF060)高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
(pMJF060)高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
[0054] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变轻链结构域(VL)与M14-G11抗体的VL结构域(SEQ ID NO：93)相同，但在氨基酸位置L50和/或V83(Kabat编号惯例)存
在一个或多个稳定化突变。
在一个或多个稳定化突变。
[0055] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：L50G、L50M、L50N和V83E。
[0056] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变重链结构域(VH)与M14-G11抗体的VH结构域(SEQ ID NO：32)相同，但在氨基酸位置E6和/或S49(Kabat编号惯例)存在
一个或多个稳定化突变。
一个或多个稳定化突变。
[0057] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：E6Q、S49A和S49G。
[0058] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL L50N：VH E6Q。
[0059] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL V83E：VH E6Q。
[0060] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子是选自MJF-060、MJF-084、MJF-085、MJF-086、MJF-087、MJF-091、MJF-092和MJF-097组成的组的稳定化的G11 scFv分子。
[0061] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者由Gly/Ser连接序列连接到所述IgG抗体。
[0062] 在一个实施方案中，所述Gly/Ser连接序列是(Gly4Ser)5或Ser(Gly4Ser)3连接序列。
[0063] 在一个实施方案中，所述scFv分子经所述scFv分子的VL结构域连接或融合至所述IgG抗体。
[0064] 在一个实施方案中，所述scFv分子以VH→(Gly4Ser)n连接序列→VL的方向，且其中n是3、4、5或6。
[0065] 在一个实施方案中，所述scFv分子经所述scFv分子的VH结构域连接或融合至所述IgG抗体。
[0066] 在一个实施方案中，所述scFv分子以VL→(Gly4Ser)n连接序列→VH的方向，且其中n是3、4、5或6。
[0067] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者连接或融合至所述IgG抗体的重链。
[0068] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第一重链且所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二重链。
[0069] 在一个实施方案中，所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一重链和所述第二重链的N-末端。
[0070] 在一个实施方案中，所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：140的CO6轻链序列且其中所述scFv分子当连接到所述重链的N-末端时包括SEQ ID NO：144的序列。
[0071] 在一个实施方案中，所述结合分子由以ATCC保藏号XXX保藏的细胞系产生。
[0072] 在一个实施方案中，所述scFv分子连接或融合至所述IgG抗体的所述第一重链和所述第二重链的C-末端。
[0073] 在一个实施方案中，所述IgG抗体的轻链包括SEQ ID NO：140的CO6轻链序列且其中所述scFv分子当连接到所述重链的N-末端时包括SEQ ID NO：144的序列。所述结合
分子由以ATCC保藏号XXX保藏的细胞系产生。
分子由以ATCC保藏号XXX保藏的细胞系产生。
[0074] 在一个实施方案中，所述scFv分子之一或两者连接或融合至所述IgG抗体的轻链。在一个实施方案中，所述scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第一轻链且所述
scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二轻链。在一个实施方案中，所述scFv分子
连接或融合至所述IgG抗体的所述第一轻链和所述第二轻链的N-末端。
scFv分子之一连接或融合至所述IgG抗体的第二轻链。在一个实施方案中，所述scFv分子
连接或融合至所述IgG抗体的所述第一轻链和所述第二轻链的N-末端。
[0075] 在一个实施方案中，所述IgG抗体包括人类IgG4同种型的重链恒定结构域。在另一实施方案中，所述IgG抗体包括人类IgG1同种型的重链恒定结构域。
[0076] 在一个实施方案中，所述IgG抗体是来自两种或更多种人类抗体同种型的重链恒定结构域部分的嵌合体。
[0077] 在一个实施方案中，所述IgG抗体包括Fc区，其中所述Fc区的残基233-236和327-331(EU编号惯例)来自人类IgG2抗体且所述Fc区的其余残基来自人类IgG4抗体。
[0078] 在一个实施方案中，所述IgG抗体的所述重链恒定区缺少糖基化。
[0080] 在一个实施方案中，所述结合分子当以商业规模生产时基本上抗聚集。
[0081] 在一个实施方案中，本发明的结合分子抑制IGF-1R-介导的细胞增殖。在一个实施方案中，本发明的结合分子抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化。在一个实施方
案中，本发明的结合分子抑制IGF-1或IGF-2-介导的AKT磷酸化。在一个实施方案中，本
发明的结合分子抑制AKT介导的存活信号传导。在一个实施方案中，本发明的结合分子抑
制肿瘤体内生长。在一个实施方案中，本发明的结合分子抑制IGF-1R内化。
案中，本发明的结合分子抑制IGF-1或IGF-2-介导的AKT磷酸化。在一个实施方案中，本
发明的结合分子抑制AKT介导的存活信号传导。在一个实施方案中，本发明的结合分子抑
制肿瘤体内生长。在一个实施方案中，本发明的结合分子抑制IGF-1R内化。
[0082] 在本发明的结合分子的一个实施方案中，所述结合分子轭合至选自如下组成的组的物质：细胞毒性剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、检测标记、聚乙二醇(PEG)和两种或更多种任何所述物质的组合。
[0083] 在本发明的结合分子的一个实施方案中，所述细胞毒性剂选自放射性核素、生物毒素、酶活性的毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性配体、生物应答调节剂、或两种或更多种任何所述细胞毒性剂的组合组成的组。
[0084] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的结合分子和载体。
[0085] 在一方面，本发明涉及一种治疗患有过度增殖性病症的受治疗者的方法，包括向受治疗者施用本发明的结合分子以使治疗发生。
[0086] 在本发明的结合分子的一个实施方案中，所述过度增殖性病症选自癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤或其转移组成的组。在一个实施方案中，所述过度增殖性病症是癌症，所述癌症选自以下组成的组：肉瘤、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、白血病、胃癌、脑癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
[0087] 在一个实施方案中，本发明涉及一种核酸分子，编码本发明的结合分子或其重链或轻链。在一个实施方案中，所述核酸分子是在载体中。在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的载体的宿主细胞。
[0088] 在一个实施方案中，本发明涉及一种产生本发明的结合分子的方法，包括：培养本发明的宿主细胞以使所述结合分子在宿主细胞培养基中分泌并(ii)从所述培养基分离所述结合分子。
[0089] 在另一方面，本发明涉及一种稳定化的scFv分子，其中所述稳定化的scFv分子具有比普通scFv分子高至少2℃-10℃的T50。在某些实施方案中，本发明的稳定化的scFv
分子具有对IGF-1R的结合特异性。
分子具有对IGF-1R的结合特异性。
[0090] 在一个实施方案中，所述scFv分子具有大于50℃的T50。在另一实施方案中，本发明的scFv分子具有大于60℃的T50。
[0091] 另一方面，与普通scFv分子相比，本发明的结合分子包括一个或多个稳定化突变，其中所述突变存在于选自以下VL氨基酸位置组成的组的VL氨基酸位置：(i)4、(ii)11；
(iii)15、(iv)20、(v)24、(vi)30、(vii)47、(viii)50、(ix)51、(x)63、(xi)70、(xii)72、(xiii)74、(xiv)77和(xv)83(Kabat编号惯例)。
(iii)15、(iv)20、(v)24、(vi)30、(vii)47、(viii)50、(ix)51、(x)63、(xi)70、(xii)72、(xiii)74、(xiv)77和(xv)83(Kabat编号惯例)。
[0092] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：4L、11G、15A、15D、15E、15G、15I、15N、15P、15R、15S、20R、24K、30N、30T、30Y、50G、50M、50N、51G、63S、70E、72N、72Y、
74S、77G、83D、83E、83G、83M、83R、83S和83V。
74S、77G、83D、83E、83G、83M、83R、83S和83V。
[0093] 在一个实施方案中，与普通scFv分子相比，本发明的结合分子包括一个或多个稳定化突变，其中所述突变存在于选自以下VH氨基酸位置组成的组的VH氨基酸位置：(i)6、
(ii)21、(iii)47、(iv)49和(v)110(Kabat编号惯例)。
(ii)21、(iii)47、(iv)49和(v)110(Kabat编号惯例)。
[0094] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：6Q、21E、47F、49A、49G、83K、83T和110V。
[0095] 在一个实施方案中，与普通scFv分子相比，本发明的结合分子包括一个或多个稳定化突变，其中所述突变存在于选自以下组成的氨基酸位置：(i)VL氨基酸位置50，(ii)VL氨基酸位置83；(iii)VH氨基酸位置6和(iv)VH氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。
[0096] 在一个实施方案中，与普通scFv分子相比，本发明的结合分子包括稳定化突变，其中所述突变存在于：(i)VL氨基酸位置50，(ii)VL氨基酸位置83；(iii)VH氨基酸位置6
和(iv)VH氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。
和(iv)VH氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。
[0097] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：vL50G、VL 50M、VL 50N、VL 83D、VL 83E、VL 83G、VL 83M、VL 83R、VL 83S、VL 83V、VH 6Q、VH 49A和VH 49G。
[0098] 在本发明的结合分子的一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子具有比普通C06scFv分子(pWXU092或pWXU090)高至少2℃-10℃的T50。
[0099] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变轻链结构域(VL)与M13-CO6抗体的VL结构域(SEQ ID NO：78)相同，但在VL结构域中选自以下组成的组的氨基酸位置存在
一个或多个稳定化突变：(i)M4、(ii)L11；(iii)V15、(iv)T20、(v)Q24、(vi)R30、(vii)T47、(viii)A51、(ix)G63、(x)D70、(xi)S72、(xii)T74、(xiii)S77和(xiv)I83(Kabat编号惯
例)。
一个或多个稳定化突变：(i)M4、(ii)L11；(iii)V15、(iv)T20、(v)Q24、(vi)R30、(vii)T47、(viii)A51、(ix)G63、(x)D70、(xi)S72、(xii)T74、(xiii)S77和(xiv)I83(Kabat编号惯
例)。
[0100] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：M4L、L11G、V15A、V15D、V15E、V15G、V15I、V15N、V15P、V15R、V15S、T20R、Q24K、R30N、R30T、R30Y、A51G、G63S、D70E、S72N、S72Y、T74S、S77G、I83D、I83E、I83G、I83M、I83R、I83S和I83V。
[0101] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变重链结构域(VH)与M13-CO6抗体的VH结构域(SEQ ID NO：14)相同，但在选自以下组成的组的氨基酸位置存在一个或多个
稳定化突变：(i)S21、(ii)W47、(iii)R83和(iv)T110(Kabat编号惯例)。
稳定化突变：(i)S21、(ii)W47、(iii)R83和(iv)T110(Kabat编号惯例)。
[0102] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：S21E、W47F、R83K、R83T和T110V。在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL L15S：VHT110V。在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL S77G：VLI83Q。
[0103] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子是选自MJF-014、M JF-015、MJF-016、MJF-017、MJF-018、MJF-019、MJF-020、MJF-021、MJF-022、MJF-023、MJF-024、MJF-025、MJF-026、MJF-027、MJF-028、MJF-029、M JF-030、MJF-031、MJF-032、MJF-033、MJF-034、MJF-035、MJF-036、MJF-037、MJF-038、MJF-039、MJF-040、MJF-041、MJF-042、MJF-043、MJF-044、MJF-045、MJF-046、MJF-047、MJF-048、MJF-049、MJF-050和MJF-051组成的组的稳定化的CO6 scFv分子。
[0104] 在一个实施方案中，本发明的结合分子是具有比普通G11(VL/GS4/VH)scFv分子(pMJF060)高至少2℃-10℃的T50的稳定化的scFv分子。
[0105] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变轻链结构域(VL)与M14-G11抗体的VL结构域(SEQ ID NO：93)相同，但在氨基酸位置L50和/或V83(Kabat编号惯例)存
在一个或多个稳定化突变。
在一个或多个稳定化突变。
[0106] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：L50G、L50M、L50N和V83E。
[0107] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv的可变重链结构域(VH)与M14-G11抗体的VH结构域(SEQ ID NO：32)相同，但在氨基酸位置E6和/或S49(Kabat编号惯例)存在
一个或多个稳定化突变。
一个或多个稳定化突变。
[0108] 在一个实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：E6Q、S49A和S49G。
[0109] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL L50N：VH E6Q。在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子包括以下突变组合VL V83E：VH E6Q。
[0110] 在一个实施方案中，所述稳定化的scFv分子是选自MJF-060、MJF-084、MJF-085、MJF-086、MJF-087、MJF-091、MJF-092和MJF-097组成的组的稳定化的G11 scFv分子。
[0111] 在一个实施方案中，本发明涉及一种多价结合分子，包含本发明的稳定化的scFv分子。
[0112] 在一个实施方案中，本发明的结合分子当以商业规模生产时基本上不含聚集体。
[0113] 在一个实施方案中，本发明的结合分子在缓冲体系(如PBS)中孵育至少3个月后基本上不含聚集体。
[0114] 在一个实施方案中，本发明的结合分子具有至少60℃的解链温度(Tm)。
[0115] 另一方面，本发明涉及一种制备稳定化的多价结合分子的方法，该方法包括将本发明的稳定化的scFv分子遗传融合到抗体分子轻链或重链的氨基末端或羧基末端。
[0116] 在一方面，本发明涉及一种核酸分子，该核酸分子包含编码本发明的稳定化的scFv分子或本发明的多价结合分子的核苷酸序列。
[0117] 在一个实施方案中，本发明涉及一种产生稳定化的结合分子的方法，包括在使得产生稳定化的结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞。
[0118] 在一个实施方案中，所述宿主细胞在商业规模(如，50L)培养且其中对于每升宿主细胞培养基产生至少5mg稳定化的结合分子。
[0119] 在一个实施方案中，所述宿主细胞在商业规模(如，50L)培养且其中对于每升宿主细胞培养基产生至少50mg稳定化的结合分子。
[0120] 在一个实施方案中，所述宿主细胞在商业规模培养且其中不多于10％的结合分子以聚集形式存在。
[0121] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：a)至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和b)至少第二IGF-1R结
合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其
中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R介导
的肿瘤细胞体外生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所
述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单
特异性结合分子的组合。
合部分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其
中所述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R介导
的肿瘤细胞体外生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所
述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单
特异性结合分子的组合。
[0122] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R介导的肿
瘤细胞体内生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第
二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异
性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R介导的肿
瘤细胞体内生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第
二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异
性结合分子的组合。
[0123] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上阻断IGF-1R介导的信
号传导：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的
第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分
子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上阻断IGF-1R介导的信
号传导：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的
第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分
子的组合。
[0124] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子比以下以更大结合亲和力结合于IGF-1R：(i)包含所述第一
结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或
(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子比以下以更大结合亲和力结合于IGF-1R：(i)包含所述第一
结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或
(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
[0125] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上阻断IGF-1和/或IGF-2
对IGF-1R的结合：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第
二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异
性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上阻断IGF-1和/或IGF-2
对IGF-1R的结合：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第
二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异
性结合分子的组合。
[0126] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子比以下具有更长的血清半衰期：(i)包含所述第一结合部分的
第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述
第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子比以下具有更长的血清半衰期：(i)包含所述第一结合部分的
第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述
第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
[0127] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1或IGF-2介
导的IGF-1R磷酸化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述
第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特
异性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1或IGF-2介
导的IGF-1R磷酸化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述
第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特
异性结合分子的组合。
[0128] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1或IGF-2介
导的AKT和/或MAPK磷酸化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)
包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述
第二单特异性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1或IGF-2介
导的AKT和/或MAPK磷酸化：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)
包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述
第二单特异性结合分子的组合。
[0129] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中
所述多特异性IGF-1R结合分子比以下在更大程度上交联IGF-1R受体：(i)包含所述第一
结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或
(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中
所述多特异性IGF-1R结合分子比以下在更大程度上交联IGF-1R受体：(i)包含所述第一
结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子，或
(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组合。
[0130] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上诱导IGF-1R受体内化：
(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单
特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组
合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上诱导IGF-1R受体内化：
(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二单
特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的组
合。
[0131] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上诱导肿瘤细胞周期停
滞：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二
单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的
组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上诱导肿瘤细胞周期停
滞：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部分的第二
单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结合分子的
组合。
[0132] 在另一方面，本发明涉及一种多特异性IGF-1R结合分子，所述分子包含：至少第一IGF-1R结合部分，该结合部分特异性结合第一IGF-1R表位；和至少第二IGF-1R结合部
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R介导的肿
瘤细胞生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部
分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结
合分子的组合。
分，其中所述第二结合部分特异性结合与所述第一表位不重叠的第二IGF-1R表位；其中所
述多特异性IGF-1R结合分子对IGF-1R的结合比以下在更大程度上抑制IGF-1R介导的肿
瘤细胞生长：(i)包含所述第一结合部分的第一单特异性结合分子，(ii)包含所述第二部
分的第二单特异性结合分子，或(iii)所述第一单特异性结合分子和所述第二单特异性结
合分子的组合。
[0134] 图1：IGF-1R结构的示意图。FnIII-2结构域包含体内被蛋白水解处理的Z字形线表示的环结构。跨膜区显示为跨磷脂双层示意图的螺旋环。IGF-1/IGF-2结合位点在
IGF-1R中的位置以星表示。已证明，只有一个IGF-1/IGF-2分子结合于每个IGF-1R异二聚
分子。
IGF-1R中的位置以星表示。已证明，只有一个IGF-1/IGF-2分子结合于每个IGF-1R异二聚
分子。
[0135] 图2：IGF-1R的成熟多肽序列(SEQ ID NO：2)。
[0136] 图3：M13-C06的原始未修饰的VH区和VL区的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQ IDNO：13)显示M13-C06的VH区的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：77)显示M13-C06的VL区
的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：14)显示M13-C06的VH区的氨基酸序列。(d)(SEQ ID
NO：78)显示M13-C06的VL区的氨基酸序列。
的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：14)显示M13-C06的VH区的氨基酸序列。(d)(SEQ ID
NO：78)显示M13-C06的VL区的氨基酸序列。
[0137] 图4：M13-C06的优化的VH区的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQ ID NO：18)显示M13-C06的序列优化的VH区的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：14)显示M13-C06的优化的
VH区的氨基酸序列。
VH区的氨基酸序列。
[0138] 图5：M14-C03的VH和VL区的原始未修饰形式的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQID NO：25)显示M14-C03的重链可变区(VH)的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：87)显示
M14-C03的轻链可变区(VL)的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：26)显示M14-C03的重链可
变区(VH)的氨基酸序列。(d)(SEQ ID NO：88)显示M14-C03的轻链可变区(VL)的氨基酸
序列。
M14-C03的轻链可变区(VL)的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：26)显示M14-C03的重链可
变区(VH)的氨基酸序列。(d)(SEQ ID NO：88)显示M14-C03的轻链可变区(VL)的氨基酸
序列。
[0139] 图6：M14-C03的优化的VH区的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQ ID NO：30)显示M14-C03的序列优化的VH区的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：26)显示M14-C03的序列优
化的VH区的氨基酸序列。
化的VH区的氨基酸序列。
[0140] 图7：M14-G11的VH和VL区的原始未修饰形式的核苷酸和氨基酸序列：(a)(SEQID NO：31)显示M14-G11的重链可变区(VH)的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：92)显示
M14-G11的轻链可变区(VL)的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：32)显示M14-G11的重链可
变区(VH)的氨基酸序列。(d)(SEQ ID NO：93)显示M14-G11的轻链可变区(VL)的氨基酸
序列。
M14-G11的轻链可变区(VL)的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：32)显示M14-G11的重链可
变区(VH)的氨基酸序列。(d)(SEQ ID NO：93)显示M14-G11的轻链可变区(VL)的氨基酸
序列。
[0141] 图8：M14-G11的优化的重链可变区(VH)的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQ ID NO：36)显示M14-G11的优化的VH区的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：32)显示M14-G11的序
列优化的VH区的氨基酸序列。
列优化的VH区的氨基酸序列。
[0142] 图9：P1E2.3B12的VH和VL区的原始未修饰形式的核苷酸和氨基酸序列。(a)(SEQID NO：62)显示P1E2.3B12的VH区的单链DNA序列。(b)(SEQ ID NO：117)显示P1E2.3B12
的VL区的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：63)显示P1E2.3B12的VH区的氨基酸序列。(d)
(SEQ ID NO：118)显示P1E2.3B12的VL区的氨基酸序列。
的VL区的单链DNA序列。(c)(SEQ ID NO：63)显示P1E2.3B12的VH区的氨基酸序列。(d)
(SEQ ID NO：118)显示P1E2.3B12的VL区的氨基酸序列。
[0143] 图10：本发明的结合分子中采用的恒定结构域的氨基酸序列。(a)(SEQ ID NO：1)显示轻链恒定结构域的氨基酸序列，(b)(SEQ IDNO：122)显示重链aglyIgG4.P恒定结构域的氨基酸序列。
[0144] 图11：IGF-1R抗体结合表位的交叉竞争结合分析。+++++＝相对其自身的抗体结合竞争(90-100％)。++++＝70-90％竞争。+++＝50-70％竞争。++＝30-50％竞争。+
＝10-30％竞争。+/-＝0-10％竞争。N/A＝结果不可得。
＝10-30％竞争。+/-＝0-10％竞争。N/A＝结果不可得。
[0145] 图12：SPR测定中与抗体对IGF-1R突变蛋白SD006(图12C；阳性结合)和SD015(图12D；阴性结合)的结合相比，M13.C06抗体对hIGF-1R-Fc(图12A)和
mIGF-1R-Fc(图12B)对照的结合实例。
mIGF-1R-Fc(图12B)对照的结合实例。
[0146] 图13：在基于SPR的竞争测定中M13-C06和M14-G11不能彼此交叉阻断。将可溶的M14-G11和M13-C06滴定到hIGF-1R-His溶液中，随后注射到包含固定化的M13-C06(图
13A)或M14-G11(图13B)的感应芯片表面上。在(a)IGF-1和(b)IGF-2存在下，IGF-1R对
M13-C06和M14-G11感应芯片表面结合的SPR信号减少分别地描绘在图13C和13D。
13A)或M14-G11(图13B)的感应芯片表面上。在(a)IGF-1和(b)IGF-2存在下，IGF-1R对
M13-C06和M14-G11感应芯片表面结合的SPR信号减少分别地描绘在图13C和13D。
[0147] 图14：抗体M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和/或αIR3抑制人类IGF-1 His(图14A)或人类IGF-2 His(图14B)对生物素化的hIGF-1R-Fc的结合。
[0148] 图15：用于检测人类IGF-1 His对生物素化的hIGF-1R(图15A；人类IGF-1 His在PBST(圆圈)和含有2μM M13-C06的PBST(方块)中连续稀释)的结合以及抗体组合
与单独单克隆抗体相比对IGF-1(图15B)或IGF-2(图15C)的阻断特征的ELISA测定。
与单独单克隆抗体相比对IGF-1(图15B)或IGF-2(图15C)的阻断特征的ELISA测定。
[0149] 图16：将其突变影响M13-C06对MGF-IR-Fc的结合的残基对同源IR胞外结构域的结构绘图。IGF-1R氨基酸残基415、427、468、478和532的突变对M13-C06抗体结合没
有可检测的影响。IGF-1R氨基酸残基466、467、533、564和565的突变对M13-C06抗体结
合有弱的负影响。IGF-1R氨基酸残基459、460、461、462、464、480、482、483、490、570和571的突变对M13-C06抗体结合有强的负影响。参见表7对突变分析结果的汇编。
有可检测的影响。IGF-1R氨基酸残基466、467、533、564和565的突变对M13-C06抗体结
合有弱的负影响。IGF-1R氨基酸残基459、460、461、462、464、480、482、483、490、570和571的突变对M13-C06抗体结合有强的负影响。参见表7对突变分析结果的汇编。
[0150] 图17：将其突变影响M14-G11对hIGF-IR-Fc的结合的残基对人类IGF-1R前三个胞外结构域的结构绘图。IGF-1R氨基酸残基28、227、237、285、286、301、327和412的突变对M14-G11抗体结合没有可检测的影响。IGF-1R氨基酸残基257、259、260、263和265的突
变对M14-G11抗体结合有弱的负影响。IGF-1R氨基酸残基254的突变对M14-G11抗体结合
有中度的负影响。IGF-1R氨基酸残基248和250的突变对M14-G11抗体结合有强的负影
响。参见表7对突变分析结果的汇编。
变对M14-G11抗体结合有弱的负影响。IGF-1R氨基酸残基254的突变对M14-G11抗体结合
有中度的负影响。IGF-1R氨基酸残基248和250的突变对M14-G11抗体结合有强的负影
响。参见表7对突变分析结果的汇编。
[0151] 图18：将其突变影响αIR3和P1E2对hIGF-1R-Fc的结合的残基对人类IGF-1R前三个胞外结构域的结构绘图。IGF-1R氨基酸残基28、227、237、250、259、260、264、285、
286、306和412突变对抗体结合没有可检测的影响。IGF-1R氨基酸残基257、263、301、303、
308、327和389的突变对抗体结合有弱的负影响。IGF-1R氨基酸残基248和254的突变对
M14-G11抗体结合有中度的负影响。IGF-1R氨基酸残基265的突变对抗体结合有强的负影
响。参见表7对突变分析结果的汇编。
286、306和412突变对抗体结合没有可检测的影响。IGF-1R氨基酸残基257、263、301、303、
308、327和389的突变对抗体结合有弱的负影响。IGF-1R氨基酸残基248和254的突变对
M14-G11抗体结合有中度的负影响。IGF-1R氨基酸残基265的突变对抗体结合有强的负影
响。参见表7对突变分析结果的汇编。
[0152] 图19：协同抗IGF-1R抑制的模型。相对于对单个表位的结合(B和C)，单独抗体对多个表位的结合(D)导致协同抑制IGF-1和IGF-2介导的信号传导。
[0153] 图20：通过组合靶向不同IGF-1R表位，IGF-1/IGF-2刺激肿瘤细胞生长的抑制增强。在无血清条件下以等摩尔剂量的C06和G11抗体(100、10和1nM(图20A)和1uM至
0.15nM(图20B))观察到BXPC3细胞生长的抑制增强。在补充有IGF-1/IGF-2的10％血清
中还观察到H322M细胞生长的抑制增强(图20C)。
0.15nM(图20B))观察到BXPC3细胞生长的抑制增强。在补充有IGF-1/IGF-2的10％血清
中还观察到H322M细胞生长的抑制增强(图20C)。
[0154] 图21：本发明示例性四价双特异性结合分子，包含具有第一结合特异性的scFv分子，所述scFv分子融合到具有不同结合特异性的二价IgG抗体。scFv分子可连接或融合至
二价抗体重链的C-末端或轻链或重链的N-末端以产生双特异性结合分子。在优选实施方
案中，scFv分子是稳定化的分子。
二价抗体重链的C-末端或轻链或重链的N-末端以产生双特异性结合分子。在优选实施方
案中，scFv分子是稳定化的分子。
[0155] 图22：本发明示例性双特异性结合分子结合后协同抗IGF-1R抑制的模型。相对于对单个表位的结合(A)，双特异性抗体对多个表位的结合(B)导致协同抑制IGF-1和IGF-2
介导的信号传导。
介导的信号传导。
[0156] 图23：IgG-样N-和C-双特异性抗体的示意图。分别使用25-或16-氨基酸柔性Gly/Ser连接序列将稳定性改造的抗Ep-1scFv遗传连接到全长重链的氨基-或羧基-末
端。全长抗体具有对Ep-2的特异性。在优选实施方案中，至少一个scFv分子是稳定化的
scFv分子。在某些实施方案中，scFv分子可融合到或连接到重链的C-末端或N-末端或抗
体轻链的N-末端。Ep＝表位。
端。全长抗体具有对Ep-2的特异性。在优选实施方案中，至少一个scFv分子是稳定化的
scFv分子。在某些实施方案中，scFv分子可融合到或连接到重链的C-末端或N-末端或抗
体轻链的N-末端。Ep＝表位。
[0157] 图24：显示用于组装实施例所述C06scFv的步骤和PCR产物的示意表示。
[0158] 图25：普 通C06(VL/GS3VH)scFv(pXWU092) 的 单 链DNA 序 列 (SEQ ID NO：123，图25A) 和 氨 基 酸 序 列(SEQ ID NO：124；图 25B)。Myc和 His标 签 序 列
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH附加到scFv的C-末端以便于纯化。
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH附加到scFv的C-末端以便于纯化。
[0159] 图 26：普 通 C06(VH/GS3/VL)scFv(pXWU090) 的 单 链 DNA 序 列 (SEQ IDNO：125，图26A)和氨 基酸序 列(SEQ ID NO：126；图26B)。Myc和His标 签序 列
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH附加到scFv的C-末端以便于纯化。
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH附加到scFv的C-末端以便于纯化。
[0160] 图27表示热攻击测定的结果，其中比较了包含(Gly4Ser)3连接序列的普通C06(VH/GS3/VL)scFv(●)、包含(Gly4Ser)4连接序列的普通C06(VH/GS4/VL)scFv(○)、
包含(Gly4Ser)3连接序列的普通C06(VL/GS3/VH)scFv(■)、和包含(Gly4Ser)4连接序列
的普通C06(VL/GS4/VH)scFv(□)的热稳定性。50％的scFv分子保持其对IGF-1R的结合
活性的温度(℃)(T50)表示在图中。
包含(Gly4Ser)3连接序列的普通C06(VL/GS3/VH)scFv(■)、和包含(Gly4Ser)4连接序列
的普通C06(VL/GS4/VH)scFv(□)的热稳定性。50％的scFv分子保持其对IGF-1R的结合
活性的温度(℃)(T50)表示在图中。
[0161] 图28显示稳定化的抗IGF-1R C06(I83E)scFv的单链DNA序 列(SEQ IDNO：127，图28A)和氨基 酸序 列(SEQ ID NO：128；图28B)。Myc和His标 签序 列
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH附加到scFv的C-末端以便于纯化。
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH附加到scFv的C-末端以便于纯化。
[0162] 图29显示抗IGF-1R G11轻链的单链DNA序列(SEQ ID NO：129，图29A)和氨基酸序列(SEQ ID NO：130；图29B)。图29A中的斜体序列表示编码信号肽
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：131)的DNA序列。
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：131)的DNA序列。
[0163] 图30显示N-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU136)的重链的单链DNA序列(SEQ IDNO：132，图30A)和氨基酸序列(SEQ IDNO：133；图30B)。图30A中的斜体序列表示编码
信号肽：MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。稳定性-改造的抗IGF-1R
scFv(MJF-045)以VL→VH方向显示并经由(GlyGlyGlyGlySer)4(SEQ ID NO：135)连接序列
附加到抗IGF-1RG11重链的N-末端。
信号肽：MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。稳定性-改造的抗IGF-1R
scFv(MJF-045)以VL→VH方向显示并经由(GlyGlyGlyGlySer)4(SEQ ID NO：135)连接序列
附加到抗IGF-1RG11重链的N-末端。
[0164] 图31显示C-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU135)的重链的单链DNA序列(SEQ IDNO：136，图31A)和氨基酸序列(SEQ IDNO：137；图31B)。图31A中的斜体序列表示编码
信号肽：MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。稳定性-改造的抗IGF-1R
scFv(MJF-045)以VL→VH方向显示并经由Ser(GlyGlyGlyGlySer)3(SEQ ID NO：138)连接
序列附加到抗IGF-1R G11重链的C-末端。
信号肽：MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。稳定性-改造的抗IGF-1R
scFv(MJF-045)以VL→VH方向显示并经由Ser(GlyGlyGlyGlySer)3(SEQ ID NO：138)连接
序列附加到抗IGF-1R G11重链的C-末端。
[0165] 图32显示抗IGF-1R C06轻链的单链DNA序列(SEQ ID NO：139，图32A)和氨基酸序列(SEQ ID NO：140；图32B)。图32A中的斜体序列表示编码信号肽：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：131)的DNA序列。
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：131)的DNA序列。
[0166] 图33显示N-抗IGF-1R双特异性抗体的重链的单链DNA序列(SEQ ID NO：141，图33A)和氨基酸序列(SEQ ID NO：142；图33B)。图33A 中的斜体序列表示编码信号肽：
MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。抗IGF-1R G11 scFv以VL→VH方向
显示并经由(GlyGlyGlyGlySer)4(SEQ ID NO：135)连接序列附加到抗IGF-1R C06重链的
N-末端。
MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。抗IGF-1R G11 scFv以VL→VH方向
显示并经由(GlyGlyGlyGlySer)4(SEQ ID NO：135)连接序列附加到抗IGF-1R C06重链的
N-末端。
[0167] 图34显示C-抗IGF-1R双特异性抗体的重链的单链DNA序列(SEQ ID NO：143，图34A)和氨基酸序列(SEQ ID NO：144；图34B)。图34A 中的斜体序列表示编码信号肽：
MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。抗IGF-1R G11 scFV以VL→VH方向
显示并经由Ser(GlyGlyGlyGlySer)3(SEQ ID NO：138)连接序列附加到抗IGF-1R C06重链
的C-末端。
MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的DNA序列。抗IGF-1R G11 scFV以VL→VH方向
显示并经由Ser(GlyGlyGlyGlySer)3(SEQ ID NO：138)连接序列附加到抗IGF-1R C06重链
的C-末端。
[0168] 图35显示纯化的稳定性-改造的C-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU135/pXWU118)的SDS-PAGE凝胶(图35A)和分析型SEC洗脱曲线(图35B)。
[0169] 图36显示纯化的稳定性-改造的N-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU136/pXWU118)的SDS-PAGE凝胶(图36A)和分析型SEC洗脱曲线(图36B)。
[0170] 图37：N-和C-末端抗IGF-1R双特异性抗体(还标为N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体)的示意图。scFv衍生自C06 MAb，IgG1抗体衍生自G11抗体。
[0171] 图38：对N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体的SDS PAGE和分析型尺寸排阻色谱(SEC)。在非还原性和还原性条件下，将纯化的N-Term.(图38A)和C-term.(图38B)
IGF-1R双特异性抗体蛋白在4-20％Tris-甘氨酸Novex 凝胶上电泳。还将N-和C-term.
∧
IGF-1R (各30□g)流经分析型SEC柱(图38C)。BsAb在基于蛋白分子量标准的～200kDa
的预期分子量洗脱。
IGF-1R双特异性抗体蛋白在4-20％Tris-甘氨酸Novex 凝胶上电泳。还将N-和C-term.
∧
IGF-1R (各30□g)流经分析型SEC柱(图38C)。BsAb在基于蛋白分子量标准的～200kDa
的预期分子量洗脱。
[0172] 图39：N-和C-末端双特异性抗体以及G11 IgG1对照抗体在10℃的近紫外光(图39A)和远紫外光(图39B)CD光谱和DSC扫描(图39C)。为了产生信噪比和由于近紫外光
CD区的非常低敏感性的可能漂移的理解，运行第二非蛋白的PBS基线，使用第一PBS基线来
基线校正并展示在曲线图上(图39A和B)。G11 IgG1证明对人类IgG1常见的是经典3转
变。N-和C-末端BsAb两者还表现对CH2、CH3和Fab结构域的3转变加上由稳定化的C06
scFv结构域解折叠产生的一个额外的转变。
CD区的非常低敏感性的可能漂移的理解，运行第二非蛋白的PBS基线，使用第一PBS基线来
基线校正并展示在曲线图上(图39A和B)。G11 IgG1证明对人类IgG1常见的是经典3转
变。N-和C-末端BsAb两者还表现对CH2、CH3和Fab结构域的3转变加上由稳定化的C06
scFv结构域解折叠产生的一个额外的转变。
[0173] 图40：ITC证明C06和G11抗体、以及N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体共同接合IGF-1R的能力(图40A和)。图40A：当首先注射C06 MAb并随后注射G11 MAb时ITC
小室中热容量的原始曲线图。图40B：将来自图40A的原始数据转化为对MAb滴定的结合
焓。图40C：当注射N-term.IGF-1R双特异性抗体(上)和C-term.IGF-1R双特异性抗体
被制成包含sIGF-1R(1-903)的溶液时，ITC小室中热容量的原始曲线图。图40D.将来自
图40C的原始数据转化为对BsAb滴定的结合焓。
小室中热容量的原始曲线图。图40B：将来自图40A的原始数据转化为对MAb滴定的结合
焓。图40C：当注射N-term.IGF-1R双特异性抗体(上)和C-term.IGF-1R双特异性抗体
被制成包含sIGF-1R(1-903)的溶液时，ITC小室中热容量的原始曲线图。图40D.将来自
图40C的原始数据转化为对BsAb滴定的结合焓。
[0174] 图41：sIGF-1R(1-903)与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体之间的平衡溶液-结合实验。C06和G11的MAb和Fab用作实验对照。图41A：在Biacore3000中使用C06作为
捕获剂的溶液结合实验。图41B：在Biacore3000中使用G11作为捕获剂的溶液结合实验。
捕获剂的溶液结合实验。图41B：在Biacore3000中使用G11作为捕获剂的溶液结合实验。
[0175] 图42：使用抗体C06和G11以及N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体的IGF-1R配体阻断ELISA。图42A：IGF-1阻断ELISA。图42B：IGF-2阻断ELISA。
[0176] 图43：辨别抑制性抗IGF-1R抗体C06和G11的变构与竞争性IGF-1和IGF-2阻断特征。图43A：加入竞争性抑制物G11到以各种IGF-1浓度进行的IGF-1阻断测定的结
果。图43B：加入变构抑制物C06到以各种IGF-1浓度进行的IGF-1阻断测定的结果。
果。图43B：加入变构抑制物C06到以各种IGF-1浓度进行的IGF-1阻断测定的结果。
[0177] 图44：使用抑制性ELISA测定，在多种IGF-1和IGF-2浓度，N-和C-末端IGF-1R双特异性蛋白的配体阻断特征。图44A：以C-term.IGF-1R双特异性抗体的IGF-1阻断。图
44B：以C-term.IGF-1R双特异性抗体的IGF-2阻断。图44C.以N-term.IGF-1R双特异性
抗体的IGF-1阻断。图44D.以N-term.IGF-1R双特异性抗体的IGF-2阻断。
44B：以C-term.IGF-1R双特异性抗体的IGF-2阻断。图44C.以N-term.IGF-1R双特异性
抗体的IGF-1阻断。图44D.以N-term.IGF-1R双特异性抗体的IGF-2阻断。
[0178] 图45：通过sIGF-1R(1-903)与C06与G11 MAb(图45A)或N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体(图45B)之间形成的复合体的尺寸排阻色谱(SEC)和静态光散射确定分子
量。
量。
[0179] 图46：IGF-1R双特异性抗体在H322M NSCLC细胞中抑制IGF-1R磷酸化(图46A)并诱导IGF-1R降解经24hr的时段(图46B)。
[0180] 图47：IGF-1R双特异性抗体诱导IGF-1R内化经24hr的时段(图47A)并抑制p-ERK(图47B)。
[0181] 图48：IGF-1R双特异性抗体抑制H322M NSCLC细胞(图48A)；A549 NSCLC细胞(图48B)；和BxPC3细胞(图48C)中的p-AKT。
[0182] 图49：在无血清培养基(SFM)中，IGF-1R双特异性抗体抑制IGF-驱动的以下细胞生长：BxPC3胰腺癌细胞(图49A)；H322MNSCLC细胞(图49B)；A431癌细胞(图49C)；和
A549 NSCLC细胞(图49D)。
A549 NSCLC细胞(图49D)。
[0183] 图50：在10％FBS中，IGF-1R双特异性抗体抑制IGF-驱动的以下细胞生长：BxPC3胰腺癌细胞(图50A)；A549 NSCLC细胞(图50B)；SJSA-1骨肉瘤细胞(图50C)；和HT-29
结肠癌细胞(图50D)。
结肠癌细胞(图50D)。
[0184] 图51：在10％FBS中，IGF-1R双特异性抗体抑制血清-驱动的A549 NSCLC细胞(图51A)和H322M NSCLC细胞(图51B)的细胞生长。
[0185] 图52：没有IGF刺激(图52A)或带有100ng/ml IGF-1和IGF-2(图52B)时，IGF-1R双特异性抗体抑制IGF-引起的BxPC3胰腺癌细胞的细胞周期。
[0186] 图53：IGF-1R双特异性抗体不引发ADCC活性(图53A)但抑制A549 NSCLC细胞的集落形成(图53B)。
[0187] 图54：C06和G11的组合导致在骨肉瘤SJSA-1模型中肿瘤生长的抑制增强。
[0189] 图56：在不带有肿瘤的雌性CB17 SCID小鼠中单次腹膜内(IP)施用后的C06、G11、C-IGF-1R双特异性抗体(图56A)和N-IGF-1R双特异性抗体(图56B)的血清浓度-时
间曲线。
间曲线。
[0190] 图57：IGF-1R(1-903)与从血清稀释的N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体之间的平衡溶液-结合实验。图57A和B表示使用C06MAb作为捕获剂和从血清稀释的C-term.
IGF-1R双特异性抗体(图57A)或N-term.IGF-1R双特异性抗体(图57B)的溶液结合实
验。图57C和D表示使用G11 MAb作为捕获剂和从血清稀释的C-term.IGF-1R双特异性抗
体(图57C)或N-term.IGF-1R双特异性抗体(图57D)的溶液结合实验。
IGF-1R双特异性抗体(图57A)或N-term.IGF-1R双特异性抗体(图57B)的溶液结合实
验。图57C和D表示使用G11 MAb作为捕获剂和从血清稀释的C-term.IGF-1R双特异性抗
体(图57C)或N-term.IGF-1R双特异性抗体(图57D)的溶液结合实验。
[0191] 发明详述
[0192] I.定义
[0193] 应该注意的是，术语“一(a)”或“一个(an)”实体指的是一个或多个该实体，例如“一个IGF-1R抗体”被理解为表示一个或多个IGF-1R抗体。像这样，术语“一(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换地使用。
[0194] 如本文所用，术语“结合分子”是指结合(例如特异性地结合或优先地结合)至感兴趣的靶分子例如抗原的分子。在特定的实施方案中，本发明的结合分子是包含特异性地
或优先地结合至IGF-1R的至少一个表位的结合位点的多肽。本发明范围内的结合分子还
包括小分子、核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物、和对本文所述IGF-1R表位具有结合特异性的其它分子。在其它实施方案中，本发明的结合分子包含是多肽、小分子、核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物、或对IGF-1R表位具有结合特异性的其它分子的结合部分。
或优先地结合至IGF-1R的至少一个表位的结合位点的多肽。本发明范围内的结合分子还
包括小分子、核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物、和对本文所述IGF-1R表位具有结合特异性的其它分子。在其它实施方案中，本发明的结合分子包含是多肽、小分子、核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物、或对IGF-1R表位具有结合特异性的其它分子的结合部分。
[0195] 如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”(如在二聚或多聚多肽的情况)，并且指的是由被酰胺键(还被称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分子。术语“多肽”是指含两个或更多个氨基酸的任何链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、低聚肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用来指含两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语被包括在“多肽”的定义之中，而且术语“多肽”可替代地或可互换地与任何这些术语使用。术语“多肽”还指多肽的表达后修饰产物，其中所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团进行的衍生作用、蛋白水解断裂或由非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可衍生自天然生物来源或由重组技术产生，但不
一定是从指定的核酸序列翻译而来。它可以以包括化学合成在内的任何方式产生。
一定是从指定的核酸序列翻译而来。它可以以包括化学合成在内的任何方式产生。
[0196] 本发明的多肽可以具有大约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、
500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定
的三维结构，虽然它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为是折叠的，而且不具有确定的三维结构却反而能够采用大量不同构象的多肽被称为是未折叠的。如本
文所用，术语糖蛋白是指轭合至至少一个碳水化合物部分的蛋白，其中所述碳水化合物部
分是通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白的。
500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定
的三维结构，虽然它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为是折叠的，而且不具有确定的三维结构却反而能够采用大量不同构象的多肽被称为是未折叠的。如本
文所用，术语糖蛋白是指轭合至至少一个碳水化合物部分的蛋白，其中所述碳水化合物部
分是通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白的。
[0197] “分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不处于其天然环境的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，可从其天生的或天然的环境取出分离的多肽。表达在宿主细胞中的重组产生的多肽和蛋白被认为是为了本发明的目的而被分离的，通过任何适合技术被分离、分级分离或者部分地或基本上纯化的天生或重组多肽也一样。优选地，本发明的多肽是分
离的。
离的。
[0198] 如本文所用，术语“衍生自”指定的蛋白是指多肽的起源。在一个实施方案中，衍生自特定的起始多肽的多肽或氨基酸序列是可变区序列(例如VH或VL)或与之相关的序列(例如CDR或骨架区域)。在一个实施方案中，衍生自特定的起始多肽的氨基酸序列不是连
续的。例如，在一个实施方案中，1、2、3、4、5或6个CDR衍生自起始抗体。在一个实施方案中，衍生自特定的起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与起始序列或其一部分
基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少3-5个氨基酸、5-10个氨基酸、至少10-20
个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸所组成，或者其中所述氨基酸序列是
可以由本领域普通技术人员鉴定为在起始序列中含有其起源的。
续的。例如，在一个实施方案中，1、2、3、4、5或6个CDR衍生自起始抗体。在一个实施方案中，衍生自特定的起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与起始序列或其一部分
基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少3-5个氨基酸、5-10个氨基酸、至少10-20
个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸所组成，或者其中所述氨基酸序列是
可以由本领域普通技术人员鉴定为在起始序列中含有其起源的。
[0199] 本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。当指本发明的结合分子时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括任何多肽，其保留相应的分子的至少一些结合特性。本发明多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，另外还包括本文在别处所讨论的特定抗体片段。本发明结合分子的变体包括上述的片段，并且
还包括含有由于氨基酸取代、缺失或插入所致的氨基酸序列改变的多肽。变体可天然地存
在或非天然地存在。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然地存在的变体。变体多肽
可包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。
还包括含有由于氨基酸取代、缺失或插入所致的氨基酸序列改变的多肽。变体可天然地存
在或非天然地存在。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然地存在的变体。变体多肽
可包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。
[0200] “保守的氨基酸取代”是这样的，在其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换。具有相似的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，多肽中的氨基酸残基可被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基所替代。在另一实施方案中，
一串氨基酸可被与侧链家族成员顺序和/或组成不同的结构类似串替代。可选地，在另一
实施方案中，可沿着多肽的全部或部分随机地引入突变。
一串氨基酸可被与侧链家族成员顺序和/或组成不同的结构类似串替代。可选地，在另一
实施方案中，可沿着多肽的全部或部分随机地引入突变。
[0201] 本发明的多肽是包括特异性地结合于靶分子(如，IGF-1R)的至少一个结合位点或部分的结合分子。例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子包括免疫球蛋白抗原结合位点或受体分子负责配体结合的部分。本发明涉及编码它们的这些结合分子或核酸分子。
在一个实施方案中，结合分子包括至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包括两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包括三个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包括四个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包括五个结合位点。在另一实施方案
中，结合分子包括六个结合位点。
在一个实施方案中，结合分子包括至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包括两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包括三个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包括四个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包括五个结合位点。在另一实施方案
中，结合分子包括六个结合位点。
[0202] 在一个实施方案中，本发明的结合分子是单体。在另一实施方案中，本发明的结合分子是多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子是二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体是同二聚体，包括两个相同的单体亚基。在另一实施方案中，本发明的二聚体是异二聚体，包括至少两个不同的单体亚基。二聚体的亚基可包括一条或多条多肽
链。例如，在一个实施方案中，该二聚体包括至少两条多肽链。在一个实施方案中，该二聚体包括两条多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括三条多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括四条多肽链(如，在抗体分子的情形)。在另一实施方案中，该二聚体包括五条
多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括六条多肽链。
链。例如，在一个实施方案中，该二聚体包括至少两条多肽链。在一个实施方案中，该二聚体包括两条多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括三条多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括四条多肽链(如，在抗体分子的情形)。在另一实施方案中，该二聚体包括五条
多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括六条多肽链。
[0203] 在一个实施方案中，本发明的结合分子是单价的，即，包括一个靶结合位点(如，在scFv分子的情形)。在单价的结合分子的情形，结合IGF-1R至少两个不同表位的本发明组合物包括至少两个这样的结合分子，其每一个具有对IGF1R的不同表位的特异性。在一
个实施方案中，本发明的结合分子是多价的，即，包括多于一个靶结合位点。在另一实施方案中，该结合分子包括至少两个结合位点。在一个实施方案中，该结合分子包括两个结合位点。在一个实施方案中，该结合分子包括三个结合位点。在另一实施方案中，该结合分子包括四个结合位点。在另一实施方案中，该结合分子包括多于四个结合位点。
个实施方案中，本发明的结合分子是多价的，即，包括多于一个靶结合位点。在另一实施方案中，该结合分子包括至少两个结合位点。在一个实施方案中，该结合分子包括两个结合位点。在一个实施方案中，该结合分子包括三个结合位点。在另一实施方案中，该结合分子包括四个结合位点。在另一实施方案中，该结合分子包括多于四个结合位点。
[0204] 如本文所用，术语“价”是指结合分子中可能的结合位点的数目。结合分子可以是“单价的”，具有单个结合位点，或结合分子可以是“多价”(如，二价、三价、四价或更高价)。每个结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位点(如，表位)。当结合分子包括
多于一个靶结合位点时(即，多价结合分子)，每个靶结合位点可以特异性结合同一分子或
不同分子(如，可结合到不同IGF-1R分子或结合到同一IGF-1R分子上的不同表位)。
多于一个靶结合位点时(即，多价结合分子)，每个靶结合位点可以特异性结合同一分子或
不同分子(如，可结合到不同IGF-1R分子或结合到同一IGF-1R分子上的不同表位)。
[0205] 如本文所用，术语“结合部分”、“结合位点”或“结合结构域”是指结合分子特异性地结合于感兴趣的靶分子(如，IGF-1R)的部分。示例性结合结构域包括抗体的抗原结合位点、抗体可变结构域(如，VL或VH结构域)、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构
域或酶促结构域。在一个实施方案中，该结合分子具有至少一个对IGF-1R特异性的结合位
点。在某些实施方案中，结合位点具有单种IGF-1R结合特异性。在其它实施方案，结合位
点可具有两种或更多种结合特异性(如，其中至少一种结合特异性是IGF-1R结合特异性)。
例如，结合分子可具有具备双重特异性的单个结合位点。
域或酶促结构域。在一个实施方案中，该结合分子具有至少一个对IGF-1R特异性的结合位
点。在某些实施方案中，结合位点具有单种IGF-1R结合特异性。在其它实施方案，结合位
点可具有两种或更多种结合特异性(如，其中至少一种结合特异性是IGF-1R结合特异性)。
例如，结合分子可具有具备双重特异性的单个结合位点。
[0206] 术语“结合特异性”或“特异性”是指结合分子与给定靶分子或表位特异性结合(如，与之免疫反应)的能力。在某些实施方案中，本发明的结合分子包括两种或更多种结
合特异性(即，其同时结合一种或多种不同抗原上存在的两个或更多个不同表位)。结合
分子可以是“单特异性的”，具有单个结合特异性，或结合分子可以是“多特异性的”(如，双特异性或三特异性或更大的多特异性)，具有两种或更多种结合特异性。在示例性实施方
案中，本发明的结合分子是“双特异性的”，包括两种结合特异性。因此，IGF-1R结合分子是“单特异性”还是“多特异性”如“双特异性”是指结合分子与之反应的不同表位的数目。在示例性实施方案中，本发明的多特异性结合分子可以是对一种或多种IGF-1R分子上的不
同表位特异性的。
合特异性(即，其同时结合一种或多种不同抗原上存在的两个或更多个不同表位)。结合
分子可以是“单特异性的”，具有单个结合特异性，或结合分子可以是“多特异性的”(如，双特异性或三特异性或更大的多特异性)，具有两种或更多种结合特异性。在示例性实施方
案中，本发明的结合分子是“双特异性的”，包括两种结合特异性。因此，IGF-1R结合分子是“单特异性”还是“多特异性”如“双特异性”是指结合分子与之反应的不同表位的数目。在示例性实施方案中，本发明的多特异性结合分子可以是对一种或多种IGF-1R分子上的不
同表位特异性的。
[0207] 在一个实施方案中，结合分子可包括双重结合特异性。如本文所用，术语“双重结合特异性”或“双重特异性”是指结合分子特异性结合一个或多个不同表位的能力。例如，结合分子可包括特异性结合靶分子上两个或更多个不同表位(如，两个或更多个不重叠或不连续表位)的至少一个结合位点的结合特异性。因此，描述具有双重结合特异性的结合
分子与两个或更多个表位交叉反应。
分子与两个或更多个表位交叉反应。
[0208] 本发明的给定结合分子对于具体结合特异性可以是单价的或多价的。例如，当IGF-1R结合分子是单特异性时，结合特异性可包括特异性结合一个表位的单个结合位点
(即，“单价的单特异性”结合分子)，这样的结合分子可以联合具有对IGF-1R不同表位的
至少一种结合特异性的第二结合分子使用。在一个实施方案中，单特异性IGF-1R结合分子
可包括特异性结合同一表位的两个结合结构域。这样的结合分子是二价和单特异性的。在
其它实施方案，当结合分子是多特异性的时，其一种或多种结合特异性可包括特异性结合
同一表位的两个或更多个结合结构域(即，“多价结合特异性”)。例如，双特异性分子可包括二价的第一结合特异性(即，结合第一表位的两个结合位点)和二价的第二结合特异性
(即，结合第二、不同表位的两个结合位点)。在另一实施方案中，双特异性分子可包括单价的第一结合特异性(即，结合第一表位的一个结合位点)和二价或单价的第二结合特异性。
(即，“单价的单特异性”结合分子)，这样的结合分子可以联合具有对IGF-1R不同表位的
至少一种结合特异性的第二结合分子使用。在一个实施方案中，单特异性IGF-1R结合分子
可包括特异性结合同一表位的两个结合结构域。这样的结合分子是二价和单特异性的。在
其它实施方案，当结合分子是多特异性的时，其一种或多种结合特异性可包括特异性结合
同一表位的两个或更多个结合结构域(即，“多价结合特异性”)。例如，双特异性分子可包括二价的第一结合特异性(即，结合第一表位的两个结合位点)和二价的第二结合特异性
(即，结合第二、不同表位的两个结合位点)。在另一实施方案中，双特异性分子可包括单价的第一结合特异性(即，结合第一表位的一个结合位点)和二价或单价的第二结合特异性。
[0209] 本文所公开的结合分子可从抗原的表位或部分方面来描述或说明，其中所述抗原例如它们识别或特异性结合的靶多肽(如IGF-1R)。与结合分子的结合位点或部分特异性
相互作用的靶多肽的部分是“表位”或“抗原决定子”。靶多肽可包括单个表位，但通常包括至少两个表位，并且可包括任何数量的表位，其取决于抗原的大小、构象和类型。此外，应该注意的是，靶多肽上的“表位”可以是或者可包括非多肽元件，例如“表位”可包括碳水化合物侧链。抗体的最小尺寸的肽或多肽表位被认为是大约4至5个氨基酸。肽或多肽表
位优选地含有至少7个，更优选地至少9个且最优选地在至少约15个和约30个氨基酸之
间。因为CDR能识别三级形式的抗原性肽或多肽，含有一个表位的氨基酸不需要是连续的，并且在一些情况下甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，由本发明IGF-1R抗体所识别
的肽或多肽表位含有具有至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，更优选地至少8个、至
少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个，或者在约15个和约30个之间的连
续或不连续的IGF-1R氨基酸的序列。
相互作用的靶多肽的部分是“表位”或“抗原决定子”。靶多肽可包括单个表位，但通常包括至少两个表位，并且可包括任何数量的表位，其取决于抗原的大小、构象和类型。此外，应该注意的是，靶多肽上的“表位”可以是或者可包括非多肽元件，例如“表位”可包括碳水化合物侧链。抗体的最小尺寸的肽或多肽表位被认为是大约4至5个氨基酸。肽或多肽表
位优选地含有至少7个，更优选地至少9个且最优选地在至少约15个和约30个氨基酸之
间。因为CDR能识别三级形式的抗原性肽或多肽，含有一个表位的氨基酸不需要是连续的，并且在一些情况下甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，由本发明IGF-1R抗体所识别
的肽或多肽表位含有具有至少4个、至少5个、至少6个、至少7个，更优选地至少8个、至
少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个，或者在约15个和约30个之间的连
续或不连续的IGF-1R氨基酸的序列。
[0210] “特异性地结合”通常是指结合分子通过结合分子的结合位点(如抗原结合结构域)结合至表位，并且所述结合需要结合位点和表位之间一定的互补性。根据此定义，当其通过结合位点比它对无关表位的结合更容易地结合至表位时，表述为结合分子“特异性地
结合”至该表位。当结合分子是多特异性的时，结合分子可经由结合分子的另一结合位点
(如，抗原结合结构域)特异性结合于第二表位(即，与第一表位无关)。
结合”至该表位。当结合分子是多特异性的时，结合分子可经由结合分子的另一结合位点
(如，抗原结合结构域)特异性结合于第二表位(即，与第一表位无关)。
[0211] “优先地结合”是指结合分子经由结合位点比其对相关的、相似的、同源的或类似的表位的结合更容易地特异性地结合至表位。因此，“优先地结合”至给定表位的抗体将比其对相关表位的结合更可能地结合至该表位，即使这样的结合分子可与相关表位交叉反
应。
应。
[0212] 如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原有特异性的结合分子或抗体与第二抗原反应的能力；是两种不同抗原性物质之间相关性的量度。因此，如果一种抗体结合至除了诱导其形成的表位之外的表位，它是交叉反应性的。交叉反应性的表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下实际上可以比原先的适合得更好。
[0213] 例如，某些结合分子具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关的但不相同的表位，所述表位例如与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少
75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性(使用本领域已知的和本文所描述的方法计算)的表位。如果抗体不结合与参考表位有小于95％、小于90％、
小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％同一性(使用本领域已知的和本文所描述的方法计算)的表位，则表述为它具有很少的或没
有交叉反应性。如果抗体不结合某一抗原或表位的任何其它类似物、直向同源物或同系物，它可被视为对该抗原或表位“高度特异性的”。
75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性(使用本领域已知的和本文所描述的方法计算)的表位。如果抗体不结合与参考表位有小于95％、小于90％、
小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％同一性(使用本领域已知的和本文所描述的方法计算)的表位，则表述为它具有很少的或没
有交叉反应性。如果抗体不结合某一抗原或表位的任何其它类似物、直向同源物或同系物，它可被视为对该抗原或表位“高度特异性的”。
[0214] 如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与结合分子的结合位点的结合强度的量度。参见，例如Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体实验手册)，(冷泉港实-2 -2验室出版社，第2版，1988)中第27-28页。优选的结合亲和力包括具有小于5×10 M、10 M、-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、
-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M或10 M的解离常数或Kd的结合亲和力。
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、
-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M或10 M的解离常数或Kd的结合亲和力。
[0215] 如本文所用，术语“亲和性”是指结合分子(如抗体)的群体与抗原之间形成的复合物的总的稳定性，也就是结合分子混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如Harlow
中第29-34页。亲和性与群体中单个结合分子与特定表位的亲和力，还有结合分子和抗原
的价二者有关。例如，二价的单克隆抗体和具有高度重复的表位结构如多聚体的抗原之间
的相互作用将是具有高度亲和性的。
中第29-34页。亲和性与群体中单个结合分子与特定表位的亲和力，还有结合分子和抗原
的价二者有关。例如，二价的单克隆抗体和具有高度重复的表位结构如多聚体的抗原之间
的相互作用将是具有高度亲和性的。
[0216] 在某些实施方案中，本发明的结合分子的结合位点是抗原结合位点。抗原结合位点由在多肽之间变化的可变区形成。在一个实施方案中，本发明的多肽包括至少两个抗原
结合位点。如本文所用，术语“抗原结合位点”包括与抗原(如，抗原的细胞表面形式或可溶形式)特异性结合(与之免疫反应)的位点。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可
变区，这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合位点包括抗体分子(如，其序列是本领域已知的或在本文描述)的至少一个重链或轻链
CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。包含至少一个CDR(如，CDR1-6)、可包括在所述抗原结合分子中的示例性结合位点是
本领域已知的，本文描述了示例性分子。
结合位点。如本文所用，术语“抗原结合位点”包括与抗原(如，抗原的细胞表面形式或可溶形式)特异性结合(与之免疫反应)的位点。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可
变区，这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合位点包括抗体分子(如，其序列是本领域已知的或在本文描述)的至少一个重链或轻链
CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合位点包括来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。包含至少一个CDR(如，CDR1-6)、可包括在所述抗原结合分子中的示例性结合位点是
本领域已知的，本文描述了示例性分子。
[0217] 本发明的优选结合分子包括衍生自人类氨基酸序列的骨架和恒定区氨基酸序列。然而，结合多肽可包括衍生自另一哺乳动物物种的骨架和/或恒定区序列。例如，包含鼠序列的结合分子可适于某些应用。在一个实施方案中，灵长类骨架区(如，非人灵长类)、重链部分、和/或铰链部分可包括在所述结合分子中。在一个实施方案中，一个或多个鼠氨基酸可存在于结合多肽的骨架区中，如，人类或非人灵长类骨架氨基酸序列可包括一个或多个
氨基酸回复突变，其中相应的鼠氨基酸残基存在，和/或可包括对起始鼠抗体中不存在的
不同氨基酸残基的一个或多个突变。本发明的优选结合分子比鼠抗体的免疫原性低。
氨基酸回复突变，其中相应的鼠氨基酸残基存在，和/或可包括对起始鼠抗体中不存在的
不同氨基酸残基的一个或多个突变。本发明的优选结合分子比鼠抗体的免疫原性低。
[0218] “融合体”或嵌合蛋白包括与自然界中非天然连接的第二氨基酸序列相连的第一氨基酸序列。氨基酸序列通常可存在于被集合在融合多肽的不同蛋白中，或者它们通常可
存在于相同蛋白中但在融合多肽中以新的排列被布置。可以通过例如化学合成或通过产生
和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，其中所述多核苷酸中的肽区域以期望的关系被编码。
存在于相同蛋白中但在融合多肽中以新的排列被布置。可以通过例如化学合成或通过产生
和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，其中所述多核苷酸中的肽区域以期望的关系被编码。
[0219] 用于多核苷酸或多肽的术语“异源性的”是指多核苷酸或多肽衍生自与被比较的实体基因型不同的实体。例如，异源性的多核苷酸或抗原可以衍生自不同物种、个体的不同细胞类型、或不同个体的相同或不同细胞类型。
[0220] 如本文所用，术语“受体结合结构域”或“受体结合部分”是指保持相应天然配体的至少定性的受体结合能力、且优选地生物活性的任何天然配体或其任何区或衍生物。
[0221] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可被互换地使用。抗体或免疫球蛋白至少包括重链的可变结构域，并且通常至少包括重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系
统中基本的免疫球蛋白结构被理解得相对较好。参见，例如Harlow等人，Antibodies：A
LaboratoryManual(抗体实验手册)，(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)。
统中基本的免疫球蛋白结构被理解得相对较好。参见，例如Harlow等人，Antibodies：A
LaboratoryManual(抗体实验手册)，(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)。
[0222] 下面将更详细地讨论到，术语“免疫球蛋白”包括多种类别的多肽，其可通过生物化学来区别。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或
epsilon(γ、μ、α、δ、ε)以及它们中的一些亚类(例如，γ1-γ4)。此链的性质决定抗体的“类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被很好地表征并已知导致功能专门化。这些类和同种型的各自的修饰
型是可由技术人员鉴于本公开而容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。所有的免疫球
蛋白类都是清楚地在本发明的范围内的，下面的讨论通常将针对IgG类的免疫球蛋白分
子。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包括两个分子量大约为23,000道尔顿的相同的轻链
多肽，和两个分子量为53,000-70,000的相同的重链多肽。该四条链通常被二硫键以“Y”
构型连结，其中所述轻链支撑所述重链，其中所述重链从“Y”的口开始并延伸通过可变区。
epsilon(γ、μ、α、δ、ε)以及它们中的一些亚类(例如，γ1-γ4)。此链的性质决定抗体的“类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被很好地表征并已知导致功能专门化。这些类和同种型的各自的修饰
型是可由技术人员鉴于本公开而容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。所有的免疫球
蛋白类都是清楚地在本发明的范围内的，下面的讨论通常将针对IgG类的免疫球蛋白分
子。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包括两个分子量大约为23,000道尔顿的相同的轻链
多肽，和两个分子量为53,000-70,000的相同的重链多肽。该四条链通常被二硫键以“Y”
构型连结，其中所述轻链支撑所述重链，其中所述重链从“Y”的口开始并延伸通过可变区。
[0223] 轻链被分类为kappa或lambda(κ，λ)。每个重链类可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价相连，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程改造的宿主细胞产生时，两条重链的“尾”部分由共价的二硫键合或非共价的键合相连。在重链中，氨基酸序列从处于Y构型叉端的N末端向处于每条链底部的C末端延伸。
[0224] 轻链和重链二者被分为结构和功能同源区。术语“恒定”和“可变”根据功能而使用。在这点上，将被了解的是，轻链(VL)和重链(VH)部分二者的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物特性
例如分泌、经胎盘的移动、Fc受体结合、补体结合以及诸如此类。按照惯例，恒定区结构域的编号随着距离抗体的抗原结合位点或氨基末端更远而增加。N末端部分是可变区而且C
末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
例如分泌、经胎盘的移动、Fc受体结合、补体结合以及诸如此类。按照惯例，恒定区结构域的编号随着距离抗体的抗原结合位点或氨基末端更远而增加。N末端部分是可变区而且C
末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
[0225] 如上指出，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体(如，在一些情况下是CH3结构域)的VL结构域和VH结构域，或者互补决定区
(CDR)的小分子团合并以形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成存在
于Y每条臂末端的抗原结合位点。在一个实施方案中，抗原结合位点是由在每条VH和VL
链上的三个CDR所定义的。在一些情况下例如衍生自骆驼(camelid)物种或根据骆驼免疫
球蛋白人工改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可仅仅由重链所组成而不
含轻链。参见，例如Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)。
(CDR)的小分子团合并以形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成存在
于Y每条臂末端的抗原结合位点。在一个实施方案中，抗原结合位点是由在每条VH和VL
链上的三个CDR所定义的。在一些情况下例如衍生自骆驼(camelid)物种或根据骆驼免疫
球蛋白人工改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可仅仅由重链所组成而不
含轻链。参见，例如Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)。
[0226] 如本文所用，术语“可变区CDR氨基酸残基”包括使用基于序列或结构的方法鉴定的CDR或互补决定区中的氨基酸。如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重
链和轻链多肽二者的可变区中发现的不连续的抗原结合位点。这些特定区已被描述于
Kabat等人，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等人，Sequencesof Proteins
of immunological interest(免疫学上重要蛋白的序列).(1991)，Chothia等人，J.Mol.
Biol.196：901-917(1987)和MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中所述定义包括在互相相比时交叠的氨基酸残基或氨基酸残基的小分子团。涵盖如上面引用的文
献的每一个所定义的CDR的氨基酸残基在下面的表1中被列出以作为对比。优选地，术语
“CDR”是由Kabat基于序列比较所定义的CDR。
链和轻链多肽二者的可变区中发现的不连续的抗原结合位点。这些特定区已被描述于
Kabat等人，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等人，Sequencesof Proteins
of immunological interest(免疫学上重要蛋白的序列).(1991)，Chothia等人，J.Mol.
Biol.196：901-917(1987)和MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中所述定义包括在互相相比时交叠的氨基酸残基或氨基酸残基的小分子团。涵盖如上面引用的文
献的每一个所定义的CDR的氨基酸残基在下面的表1中被列出以作为对比。优选地，术语
“CDR”是由Kabat基于序列比较所定义的CDR。
[0227] 表1：CDR定义
[0228]1
[0229] 残基编号是根据Kabat等人，上述的命名法2
[0230] 残基编号是根据Chothia等人，上述的命名法3
[0231] 残基编号是根据MacCallum等人，上述的命名法
[0232] 如本文所用，术语“可变区骨架(FR)氨基酸残基”是指Ig链的骨架区中的那些氨基酸。如本文所用，术语“骨架区”或“FR区”包括是可变区的部分但不是CDR(如，使用Kabat的CDR定义)的部分的氨基酸残基。因此，可变区骨架的长度在约100-120氨基酸，
但仅包括CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变区的具体实例和对于Kabat等人定义的
CDR，骨架区1对应于可变区中涵盖氨基酸1-30的结构域；骨架区2对应于可变区中涵盖氨
基酸36-49的结构域；骨架区3对应于可变区中涵盖氨基酸66-94的结构域，骨架区4对应
于可变区中从氨基酸103到可变区末端的结构域。轻链的骨架区类似地被每个轻链可变区
CDR分隔。类似地，使用Chothia等人或McCallum等人的CDR定义，骨架区边界由如上述的
各CDR末端分隔。在优选实施方案中，CDR是由Kabat定义的。
但仅包括CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变区的具体实例和对于Kabat等人定义的
CDR，骨架区1对应于可变区中涵盖氨基酸1-30的结构域；骨架区2对应于可变区中涵盖氨
基酸36-49的结构域；骨架区3对应于可变区中涵盖氨基酸66-94的结构域，骨架区4对应
于可变区中从氨基酸103到可变区末端的结构域。轻链的骨架区类似地被每个轻链可变区
CDR分隔。类似地，使用Chothia等人或McCallum等人的CDR定义，骨架区边界由如上述的
各CDR末端分隔。在优选实施方案中，CDR是由Kabat定义的。
[0233] 在天然存在的抗体中，每个单体抗体上存在的六个CDR是短的、不连续的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列被特别摆放以形成抗原结合位点，因为抗体采取它在水环境中
的三维构型。重链和轻链可变结构域的其余部分显示较少的分子间氨基酸差异性，称作骨
架区。骨架区很大程度地采用β折叠构象而且CDR形成连接β折叠结构且在一些情况下
形成β折叠结构的一部分的环。因此，这些骨架区起到形成支架的作用，其中所述支架有
助于通过链间非共价相互作用而将六个CDR置于正确的方向。由摆放好的CDR形成的抗原
结合位点确定与免疫活性抗原上的表位互补的表面。该互补的表面促进抗体与免疫活性抗
原表位的非共价结合。本领域技术人员可易于鉴定CDR的位置。
的三维构型。重链和轻链可变结构域的其余部分显示较少的分子间氨基酸差异性，称作骨
架区。骨架区很大程度地采用β折叠构象而且CDR形成连接β折叠结构且在一些情况下
形成β折叠结构的一部分的环。因此，这些骨架区起到形成支架的作用，其中所述支架有
助于通过链间非共价相互作用而将六个CDR置于正确的方向。由摆放好的CDR形成的抗原
结合位点确定与免疫活性抗原上的表位互补的表面。该互补的表面促进抗体与免疫活性抗
原表位的非共价结合。本领域技术人员可易于鉴定CDR的位置。
[0234] Kabat等人还定义了可变结构域序列的编号系统，其适用于任何抗体。本领域普通技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统指定给任何可变结构域序列而不依赖于除序
列自身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Healthand Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)”(1983)所阐述的编号系统。除非另外指出，否则对本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变区的编号的提及是根据Kabat编号系统。
列自身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Healthand Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)”(1983)所阐述的编号系统。除非另外指出，否则对本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变区的编号的提及是根据Kabat编号系统。
[0235] 如本文所用，术语“Fc结构域”或“Fc区”是指免疫球蛋白重链开始于铰链区中木瓜蛋白酶裂解位点(即，IgG中残基216，重链恒定区的第一残基是114)上游并结束于抗体C-末端的部分。因此，完整Fc区至少包括铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某
些实施方案中，Fc区是包含至少两个分别的重链部分的二聚体。在其它实施方案，Fc区是
包含融合或连接的(如，经Gly/Ser肽或其它肽连接序列)至少两个重链部分的单链Fc区
(“scFc”)。ScFc区详细描述在2008年5月14日提交的国际PCT申请第PCT/US2008/006260
号，其通过引用全文并入本文。
些实施方案中，Fc区是包含至少两个分别的重链部分的二聚体。在其它实施方案，Fc区是
包含融合或连接的(如，经Gly/Ser肽或其它肽连接序列)至少两个重链部分的单链Fc区
(“scFc”)。ScFc区详细描述在2008年5月14日提交的国际PCT申请第PCT/US2008/006260
号，其通过引用全文并入本文。
[0236] 如本文所用，术语“Fc结构域部分”或“Fc部分”包括衍生自Fc结构域或Fc区的氨基酸序列。包含Fc部分的多肽包括以下至少一个：铰链(如，上、中和/或下铰链区)结
构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、或其变体或片段。在一个实施方案中，本发明的多肽包括至少一个包含至少部分铰链结构域和CH2结构域的Fc区。在另一实施方案中，本
发明的多肽包括至少一个包含CH1结构域和CH3结构域的Fc区。在另一实施方案中，本发
明的多肽包括至少一个包含CH1结构域、至少部分铰链结构域和CH3结构域的Fc区。在另
一实施方案中，本发明的多肽包括至少一个包含CH3结构域的Fc区。在一个实施方案中，
本发明的多肽包括至少一个缺少至少部分CH2结构域(如，所有或部分CH2结构域)的Fc
区。如本文所列的，本领域技术人员应理解的是，任何Fc区可被修饰以使其氨基酸序列不
同于天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc区。
构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、或其变体或片段。在一个实施方案中，本发明的多肽包括至少一个包含至少部分铰链结构域和CH2结构域的Fc区。在另一实施方案中，本
发明的多肽包括至少一个包含CH1结构域和CH3结构域的Fc区。在另一实施方案中，本发
明的多肽包括至少一个包含CH1结构域、至少部分铰链结构域和CH3结构域的Fc区。在另
一实施方案中，本发明的多肽包括至少一个包含CH3结构域的Fc区。在一个实施方案中，
本发明的多肽包括至少一个缺少至少部分CH2结构域(如，所有或部分CH2结构域)的Fc
区。如本文所列的，本领域技术人员应理解的是，任何Fc区可被修饰以使其氨基酸序列不
同于天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc区。
[0237] 本发明的多肽的Fc区可衍生自不同免疫球蛋白分子(如，两种或更多种不同人类抗体同种型)。例如，多肽的Fc区可包括衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分
子的嵌合铰链区。在另一实例中，Fc区可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分
子的铰链区。在另一实例中，Fc区可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的
嵌合铰链。在另一实施方案中，Fc区可包括来自第一抗体同种型(如，IgG1或IgG2)的铰
链结构域和来自不同人类抗体同种型(如，IgG4)的CH2结构域。在另一实施方案中，Fc区
可包括来自第一抗体同种型(如，IgG1或IgG2)的CH2结构域和来自不同人类抗体同种型
(如，IgG4)的CH3结构域。在另一实施方案中，Fc区的残基233-236和327-331来自人类
IgG2抗体，Fc区的其余残基来自人类IgG4抗体。示例性嵌合Fc区公开于，例如，PCT公布
第WO/1999/58572号，其通过引用全文并入本文。
子的嵌合铰链区。在另一实例中，Fc区可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分
子的铰链区。在另一实例中，Fc区可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的
嵌合铰链。在另一实施方案中，Fc区可包括来自第一抗体同种型(如，IgG1或IgG2)的铰
链结构域和来自不同人类抗体同种型(如，IgG4)的CH2结构域。在另一实施方案中，Fc区
可包括来自第一抗体同种型(如，IgG1或IgG2)的CH2结构域和来自不同人类抗体同种型
(如，IgG4)的CH3结构域。在另一实施方案中，Fc区的残基233-236和327-331来自人类
IgG2抗体，Fc区的其余残基来自人类IgG4抗体。示例性嵌合Fc区公开于，例如，PCT公布
第WO/1999/58572号，其通过引用全文并入本文。
[0238] 重链恒定区中的氨基酸位置，包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域中的氨基酸位置，在本文根据EU索引编号系统编号(参见Kabat等人，“Sequences of Proteins of
immunological interest(免疫学上重要蛋白的序列)”，U.S.Dept.Health and Human
Services，第5版，1991)。相反，轻链恒定区(如，CL结构域)中的氨基酸位置在本文根据
Kabat索引编号系统(参见Kabat等人，上文)编号。
immunological interest(免疫学上重要蛋白的序列)”，U.S.Dept.Health and Human
Services，第5版，1991)。相反，轻链恒定区(如，CL结构域)中的氨基酸位置在本文根据
Kabat索引编号系统(参见Kabat等人，上文)编号。
[0239] 示例性结合分子包括或可以包含，例如，多克隆的、单克隆的、多特异性的、人类的、人源化的、灵长类化的或嵌合的抗体，单链抗体，表位结合片段例如Fab、Fab’和
F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗个体基因型(抗Id)抗体(包括例如本文所公开
的抗Id抗体至IGF-1R抗体)。scFv分子是本领域中已知的并被描述在例如美国专利第
5,892,019号中。包含Ig重链的本发明的结合分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如
IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗个体基因型(抗Id)抗体(包括例如本文所公开
的抗Id抗体至IGF-1R抗体)。scFv分子是本领域中已知的并被描述在例如美国专利第
5,892,019号中。包含Ig重链的本发明的结合分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如
IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
[0240] 结合分子可包括单独的可变区或与下面的整体或一部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明的结合分子可以是或可衍生自包括鸟和哺乳动物的任何动
物来源的抗体。优选地，所述抗体是人类、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，所述可变区可以是condricthoid来源的(例如来自鲨鱼)。如
本文所用，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人类免疫球蛋白文库或从转基因动物分离的抗体，其中所述转基因动物表达一种或多种人类免疫球
蛋白但不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述和例如描述于Kucherlapati等的美国专利
第5,939,598号。
物来源的抗体。优选地，所述抗体是人类、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，所述可变区可以是condricthoid来源的(例如来自鲨鱼)。如
本文所用，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人类免疫球蛋白文库或从转基因动物分离的抗体，其中所述转基因动物表达一种或多种人类免疫球
蛋白但不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述和例如描述于Kucherlapati等的美国专利
第5,939,598号。
[0241] 术语“片段”是指多肽(如，抗体或抗体链)的组成部分或部分，其包含的氨基酸残基比完整多肽或完全多肽少。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，该片段能结合抗原或与完整抗体(即与它所来源的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。如本文所用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如，抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段和单结构域抗体片段(DAb)。所述片段可以通过将完整或完全的抗体或抗体链通过例如化学或酶促处理
或者通过重组手段来获得。
或者通过重组手段来获得。
[0242] 在一个实施方案中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区。在一个实施方案中，与野生型恒定区相比，该恒定区被修饰。即，本文公开的本发明多肽可能包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一或多个和/或轻链恒定区结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一或多个结构域中一或多个氨基酸的添加、缺失或取代。其它
修饰的恒定区缺少糖基化或具有改变的聚糖结构(如，去岩藻糖化的聚糖)。可包括这种改
变来优化或减少或消除效应子功能、改进半衰期等等。
修饰的恒定区缺少糖基化或具有改变的聚糖结构(如，去岩藻糖化的聚糖)。可包括这种改
变来优化或减少或消除效应子功能、改进半衰期等等。
[0243] 在某些实施方案中，本发明的结合分子包括连接到结合分子的一个或多个结合位点的重链部分。如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列。包括重链部分的多肽包括以下至少一个：CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰
链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可
包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的
多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部
分和CH3结构域的多肽链；或者含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和
CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。
此外，本发明所用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或
部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以
使它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。在其中结合分子是多聚体的某
些实施方案中，多聚体的一条多肽链的重链部分与所述多聚体的第二条多肽链上的那些相
同。可选地，在一个实施方案中，本发明含有重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包括不同的靶结合位点，其形成例如双特异性抗体。
链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可
包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的
多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部
分和CH3结构域的多肽链；或者含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和
CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。
此外，本发明所用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或
部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以
使它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。在其中结合分子是多聚体的某
些实施方案中，多聚体的一条多肽链的重链部分与所述多聚体的第二条多肽链上的那些相
同。可选地，在一个实施方案中，本发明含有重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包括不同的靶结合位点，其形成例如双特异性抗体。
[0244] 用于本文所公开的方法的结合多肽的重链部分可衍生自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包括衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。
在另一个例子中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。
在另一个实例中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰
链。
在另一个例子中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。
在另一个实例中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰
链。
[0245] 如本文所用，术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包括至少一个VL或CL结构域。
[0246] 如前指出，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是公知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(离氨基末端最近的)恒定区结构域。所述CH1结构域与
VH结构域邻近，并且是在免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端一侧。
VH结构域邻近，并且是在免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端一侧。
[0247] 如本文所用，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(离氨基末端最近的)恒定区结构域，如从约EU位置118-215延伸。所述CH1结构域与VH结构域邻近，并且是在免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端一侧，且不形成免疫球蛋白重链Fc区的部分。在一
个实施方案中，本发明的结合分子包括衍生自免疫球蛋白重链分子(如，人类IgG1或IgG4
分子)的CH1结构域。
个实施方案中，本发明的结合分子包括衍生自免疫球蛋白重链分子(如，人类IgG1或IgG4
分子)的CH1结构域。
[0248] 如本文所用，术语“CH2结构域”包括例如从约EU位置231-340延伸的重链免疫球蛋白分子的部分。CH2结构域是独特的，因为其不与另外的结构域紧密配对。相反地，两条N连接的支链碳水化合物链被放入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实
施方案中，本发明的结合分子包括衍生自IgG1分子(如，人类IgG1分子)的CH2结构域。
在另一实施方案中，本发明的改变的多肽包括衍生自IgG4分子(如，人类IgG4分子)的
CH2结构域。在示例性实施方案中，本发明的多肽包括CH2结构域(EU位置231-340)或其
部分。
施方案中，本发明的结合分子包括衍生自IgG1分子(如，人类IgG1分子)的CH2结构域。
在另一实施方案中，本发明的改变的多肽包括衍生自IgG4分子(如，人类IgG4分子)的
CH2结构域。在示例性实施方案中，本发明的多肽包括CH2结构域(EU位置231-340)或其
部分。
[0249] 如本文所用，术语“CH3结构域”包括重链免疫球蛋白分子中从CH2结构域的N端如从大约位置341-446b(EU编号系统)延伸大约110个残基的部分。CH3结构域典型地形
成抗体的C末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可以从CH3结构域延伸出另外的结构域
以形成该分子的C末端部分(例如，IgM的μ链和IgE的ε链中的CH4结构域)。在一个
实施方案中，本发明结合分子包含衍生自IgG1分子(如，人类IgG1分子)的CH3结构域。
在另一个实施方案中，本发明结合分子包含衍生自IgG4分子(如，人类IgG4分子)的CH3
结构域。
成抗体的C末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可以从CH3结构域延伸出另外的结构域
以形成该分子的C末端部分(例如，IgM的μ链和IgE的ε链中的CH4结构域)。在一个
实施方案中，本发明结合分子包含衍生自IgG1分子(如，人类IgG1分子)的CH3结构域。
在另一个实施方案中，本发明结合分子包含衍生自IgG4分子(如，人类IgG4分子)的CH3
结构域。
[0250] 如本文所用，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包括大约25个残基并且是可弯曲的，因此其允许所述两个N末端抗原结合
区独立地移动。铰链区可被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux等人，J.Immunol.161：4083(1998))。
区独立地移动。铰链区可被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux等人，J.Immunol.161：4083(1998))。
[0251] 如本文所用，术语“效应子功能”是指Fc区或其部分结合免疫系统的蛋白质和/或细胞并介导各种生物学效应的功能性能力。效应子功能可以是抗原依赖性的或者抗原非
依赖性的。效应子功能减少是指一种或多种效应子功能减少，而保持抗体可变区(或其片
段)的抗原结合活性。效应子功能增加或减少，如，Fc对Fc受体或补体蛋白的结合，可以
倍数改变的方式表示(如，改变1倍、2倍等等)，并可基于如，使用本领域公知的测定确定
的结合活性的改变百分比而计算。
依赖性的。效应子功能减少是指一种或多种效应子功能减少，而保持抗体可变区(或其片
段)的抗原结合活性。效应子功能增加或减少，如，Fc对Fc受体或补体蛋白的结合，可以
倍数改变的方式表示(如，改变1倍、2倍等等)，并可基于如，使用本领域公知的测定确定
的结合活性的改变百分比而计算。
[0252] 如本文所用，术语“抗原依赖性效应子功能”指通常在抗体结合相应抗原后诱导的效应子功能。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白(如C1q)的能力。例如，补体的C1成分与Fc区的结合可激活经典补体系统，导致细胞病原体的调理作用和溶解，这一
过程称为补体依赖性细胞毒性(CDCC)。补体的激活还刺激炎症应答并且还可涉及在自身免
疫超敏反应中。
过程称为补体依赖性细胞毒性(CDCC)。补体的激活还刺激炎症应答并且还可涉及在自身免
疫超敏反应中。
[0253] 其它抗原依赖性效应子功能由抗体通过其Fc区与细胞上的某些Fc受体(“FcR”)的结合所介导。有多种对不同抗体类型，包括IgG(γ受体或IgγR)、IgE(ε受体或IgεR)、IgA(α受体或IgαR)和IgM(μ受体或IgμR)具有特异性的Fc受体。。抗体与细胞表
面上的Fc受体的结合触发若干重要的和各种各样的生物应答，其包括免疫复合物的内吞、
抗体涂布的颗粒或微生物的吞没和破坏(还称作抗体依赖性吞噬作用或ADCP)、免疫复合
物的清除、杀伤细胞对抗体涂布的靶细胞的溶解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或
ADCC)、炎症介质的释放、免疫系统细胞激活的调节、胎盘转移和对免疫球蛋白生成的控制。
面上的Fc受体的结合触发若干重要的和各种各样的生物应答，其包括免疫复合物的内吞、
抗体涂布的颗粒或微生物的吞没和破坏(还称作抗体依赖性吞噬作用或ADCP)、免疫复合
物的清除、杀伤细胞对抗体涂布的靶细胞的溶解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或
ADCC)、炎症介质的释放、免疫系统细胞激活的调节、胎盘转移和对免疫球蛋白生成的控制。
[0254] 如本文所用，术语“嵌合抗体”是指在其中结合位点或部分(如可变区)是从第一物种获得或衍生的而恒定区(其可以是完整的、部分的或根据本发明而修饰的)是从第二
物种获得的任何抗体。在优选的实施方案中，靶结合区域或位点将来自非人类来源(例如
小鼠或灵长类)而且恒定区是人类的。
物种获得的任何抗体。在优选的实施方案中，靶结合区域或位点将来自非人类来源(例如
小鼠或灵长类)而且恒定区是人类的。
[0255] 如本文所用，术语“scFv分子”包括由一个轻链可变结构域(VL)或其部分和一个重链可变结构域(VH)或其部分组成的结合分子，其中各可变结构域(或其部分)衍生自相
同或不同抗体。scFv分子优选地包含介于VH结构域和VL结构域之间的scFv连接序列。
ScFv分子是本领域已知的，并描述于如，美国专利第5,892,019号、Ho等人1989.Gene 77：
51；Bird等人1988 Science 242：423；Pantoliano等人1991.Biochemistry 30：10117；
Milenic等人1991.CancerResearch 51：6363；Takkinen等人1991.Protein Engineering
4：837。scFv分子的VL和VH结构域衍生自一种或多种抗体分子。本领域技术人员应理解
的是，本发明的scFv分子的可变区可被修饰以使其氨基酸序列不同于其所衍生自的抗体
分子。例如，在一个实施方案中，可进行导致氨基酸残基保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代(如，在CDR和/或骨架残基中)。可选地或此外，可使用领域公知技术对CDR氨基酸
残基进行突变以优化抗原结合。本发明的结合分子保持结合抗原的能力。
同或不同抗体。scFv分子优选地包含介于VH结构域和VL结构域之间的scFv连接序列。
ScFv分子是本领域已知的，并描述于如，美国专利第5,892,019号、Ho等人1989.Gene 77：
51；Bird等人1988 Science 242：423；Pantoliano等人1991.Biochemistry 30：10117；
Milenic等人1991.CancerResearch 51：6363；Takkinen等人1991.Protein Engineering
4：837。scFv分子的VL和VH结构域衍生自一种或多种抗体分子。本领域技术人员应理解
的是，本发明的scFv分子的可变区可被修饰以使其氨基酸序列不同于其所衍生自的抗体
分子。例如，在一个实施方案中，可进行导致氨基酸残基保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代(如，在CDR和/或骨架残基中)。可选地或此外，可使用领域公知技术对CDR氨基酸
残基进行突变以优化抗原结合。本发明的结合分子保持结合抗原的能力。
[0256] 如本文所用，“scFv连接序列”是指介于scFv的VL和VH结构域之间的部分。scFv连接序列优选地保持scFv分子为抗原结合构象。在一个实施方案中，scFv连接序列包含
scFv连接肽或由scFv连接肽组成。在某些实施方案中，scFv连接肽包含gly-ser连接肽
或由gly-ser连接肽组成。在其它实施方案中，scFv连接序列包含二硫键。
scFv连接肽或由scFv连接肽组成。在某些实施方案中，scFv连接肽包含gly-ser连接肽
或由gly-ser连接肽组成。在其它实施方案中，scFv连接序列包含二硫键。
[0257] 如本文所用，术语“gly-ser连接肽”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser连接肽包含氨基酸序列(Gly4 Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在另一个实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4，即，(Gly4 Ser)4。
在另一个实施方案中，n＝5。在另一个实施方案中，n＝6。另一示例性gly/ser连接肽包
含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在
优选的实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在
另一个实施方案中，n＝6。
在另一个实施方案中，n＝5。在另一个实施方案中，n＝6。另一示例性gly/ser连接肽包
含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在
优选的实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在
另一个实施方案中，n＝6。
[0258] 如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括巯基，其可与第二个巯基形成二硫键或桥。在天然最常见的IgG分子中，CH1和CL区是通过二硫键连接的，并且所述两条重链是在对应于使用Kabat编号系统的239和242的
位置(位置226或229，EU编号系统)通过两个二硫键连接的。
位置(位置226或229，EU编号系统)通过两个二硫键连接的。
[0259] 如本文所用，术语“普通scFv分子”是指不是稳定化的scFv分子的scFv分子。例如，典型的普通scFv分子缺少稳定化突变并包括由(G4S)3连接序列连接的VH和VL结构
域。
域。
[0260] 本发明的“稳定化的scFv分子”是与普通scFv分子相比包括至少一种导致scFv分子稳定化(即，与普通scFv分子相比)的改变或变化的scFv分子。如本文所用，术语“稳
定化突变”包括对scFv分子和/或对包含所述scFv分子的更大蛋白赋予增强的蛋白稳定
性(如，热稳定性)的突变。在一个实施方案中，稳定化突变包括用赋予增强的蛋白稳定性
的替代氨基酸(本文的“稳定化氨基酸”)取代去稳定化的氨基酸。在一个实施方案中，稳
定化突变是其中scFv连接序列的长度已被优化的突变。在一个实施方案中，本发明的稳定
化的scFv分子包括一个或多个氨基酸取代。例如，在一个实施方案中，稳定化突变包括取
代至少一个氨基酸残基，该取代导致scFv分子的VH和VL界面的稳定性增加。在一个实施
方案中，该氨基酸是在该界面中。在另一实施方案中，该氨基酸是支撑VH与VL之间相互作
用的氨基酸。在另一实施方案中，稳定化突变包括取代VH结构域或VL结构域中与在VH与
VL结构域之间的界面的两个或更多个氨基酸共变化的至少一个氨基酸。在另一实施方案
中，稳定化突变是其中引入至少一个半胱氨酸残基(即，人工改造到一个或多个VH或VL结
构域中)以使VH和VL结构域由VH中的氨基酸与VL结构域中的氨基酸之间的至少一个二
硫键连接的突变。在某些优选实施方案中，本发明的稳定化的scFv分子是其中scFv连接
序列的长度被优化，且至少一个氨基酸残基被取代和/或VH和VL结构域被VH中的氨基酸
与VL结构域中的氨基酸之间的二硫键连接的scFv分子。在一个实施方案中，与普通scFv
分子相比，对scFv分子进行的一个或多个稳定化突变同时提高scFv分子的VH和VL结构
域两者的热稳定性。在一个实施方案中，稳定化的scFv分子群体可包括相同的稳定化突变
或稳定化突变的组合。在其它实施方案，群体的单独稳定化的scFv分子包括不同稳定化突
变。示例性的稳定化突变详细描述在美国专利申请第11/725,970号，其通过引用全文并入
本文。
定化突变”包括对scFv分子和/或对包含所述scFv分子的更大蛋白赋予增强的蛋白稳定
性(如，热稳定性)的突变。在一个实施方案中，稳定化突变包括用赋予增强的蛋白稳定性
的替代氨基酸(本文的“稳定化氨基酸”)取代去稳定化的氨基酸。在一个实施方案中，稳
定化突变是其中scFv连接序列的长度已被优化的突变。在一个实施方案中，本发明的稳定
化的scFv分子包括一个或多个氨基酸取代。例如，在一个实施方案中，稳定化突变包括取
代至少一个氨基酸残基，该取代导致scFv分子的VH和VL界面的稳定性增加。在一个实施
方案中，该氨基酸是在该界面中。在另一实施方案中，该氨基酸是支撑VH与VL之间相互作
用的氨基酸。在另一实施方案中，稳定化突变包括取代VH结构域或VL结构域中与在VH与
VL结构域之间的界面的两个或更多个氨基酸共变化的至少一个氨基酸。在另一实施方案
中，稳定化突变是其中引入至少一个半胱氨酸残基(即，人工改造到一个或多个VH或VL结
构域中)以使VH和VL结构域由VH中的氨基酸与VL结构域中的氨基酸之间的至少一个二
硫键连接的突变。在某些优选实施方案中，本发明的稳定化的scFv分子是其中scFv连接
序列的长度被优化，且至少一个氨基酸残基被取代和/或VH和VL结构域被VH中的氨基酸
与VL结构域中的氨基酸之间的二硫键连接的scFv分子。在一个实施方案中，与普通scFv
分子相比，对scFv分子进行的一个或多个稳定化突变同时提高scFv分子的VH和VL结构
域两者的热稳定性。在一个实施方案中，稳定化的scFv分子群体可包括相同的稳定化突变
或稳定化突变的组合。在其它实施方案，群体的单独稳定化的scFv分子包括不同稳定化突
变。示例性的稳定化突变详细描述在美国专利申请第11/725,970号，其通过引用全文并入
本文。
[0261] 如本文所用，术语“蛋白稳定性”是指蛋白响应于环境条件(如高温或低温)保持一种或多种物理性质的领域公认的量度。在一个实施方案中，该物理性质是保持蛋白的共
价结构(如不存在蛋白水解裂解、不想要的氧化或脱酰胺)。在另一个实施方案中，该物理
性质是存在适当地折叠状态的蛋白(如不存在可溶或不溶的聚集体或沉淀)。在一个实施
方案中，蛋白的稳定性通过测定蛋白的生物物理性质来测量，例如热稳定性、pH解折叠谱、稳定去除糖基化、溶解度、生化功能(如，结合于蛋白(如，配体、受体、抗原等等)或化学部分等等的能力)、和/或其组合。在另一实施方案中，生化功能由相互作用的结合亲和力证
实。在一个实施方案中，蛋白稳定性的量度是热稳定性，即，耐受热攻击。稳定性可使用本领域已知和/或本文描述的方法测量。
价结构(如不存在蛋白水解裂解、不想要的氧化或脱酰胺)。在另一个实施方案中，该物理
性质是存在适当地折叠状态的蛋白(如不存在可溶或不溶的聚集体或沉淀)。在一个实施
方案中，蛋白的稳定性通过测定蛋白的生物物理性质来测量，例如热稳定性、pH解折叠谱、稳定去除糖基化、溶解度、生化功能(如，结合于蛋白(如，配体、受体、抗原等等)或化学部分等等的能力)、和/或其组合。在另一实施方案中，生化功能由相互作用的结合亲和力证
实。在一个实施方案中，蛋白稳定性的量度是热稳定性，即，耐受热攻击。稳定性可使用本领域已知和/或本文描述的方法测量。
[0262] 如本文所用，术语“人工改造的抗体”是指这样的抗体，在其中重链和轻链或二者的可变结构域被改变，其中所述改变是通过具有已知特异性的抗体的一个或多个CDR的至少部分的替换，并且如果必要，是通过部分的骨架区替换和序列改变。虽然CDR可衍生自与骨架区所衍生自的抗体相同的类或甚至亚类的抗体，据设想，所述CDR将衍生自不同类的
抗体并且优选地衍生自不同物种的抗体。其中来自具有已知特异性的非人类抗体的一个或
多个“供体”CDR被移植进人类重链或轻链骨架区的人工改造的抗体在本文中被称作“人源化的抗体”。可能不必须用来自供体可变区的完整的CDR来替换所有CDR以将一个可变结
构域的抗原结合能力转移至另一个。相反地，可能只需转移对于维持靶结合位点的活性必
要的那些残基。根据美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370号中所述
的解释，通过进行常规的实验或者试错法检测来获得功能性人工改造的或人源化的抗体完
全在本领域技术人员的能力之内。
抗体并且优选地衍生自不同物种的抗体。其中来自具有已知特异性的非人类抗体的一个或
多个“供体”CDR被移植进人类重链或轻链骨架区的人工改造的抗体在本文中被称作“人源化的抗体”。可能不必须用来自供体可变区的完整的CDR来替换所有CDR以将一个可变结
构域的抗原结合能力转移至另一个。相反地，可能只需转移对于维持靶结合位点的活性必
要的那些残基。根据美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370号中所述
的解释，通过进行常规的实验或者试错法检测来获得功能性人工改造的或人源化的抗体完
全在本领域技术人员的能力之内。
[0263] 如本文所用，术语“适当地折叠的多肽”包括这样的多肽(例如IGF-1R scFv分子)，在其中包括所述多肽的所有功能性结构域都是明显地有活性的。如本文所用，术语“不适当地折叠的多肽”包括这样的多肽，在其中所述多肽的至少一个功能性结构域没有活性。
在一个实施方案中，适当地折叠的多肽包括用至少一个二硫键连接的多肽链，并且相反地，不适当地折叠的多肽包括不用至少一个二硫键连接的多肽链。
在一个实施方案中，适当地折叠的多肽包括用至少一个二硫键连接的多肽链，并且相反地，不适当地折叠的多肽包括不用至少一个二硫键连接的多肽链。
[0264] 术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常见的磷酸二酯键或不常见的键(例如酰胺键，像在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”是指任何一个或多个核
酸区段，例如存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指从它的
天生环境被取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，被包含在载体中的编码IGF-1R结合分子的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的进一步的实例包括被维
持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。分
离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。本发明的分离的多核苷酸或
核酸进一步包括通过合成而产生此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是调节元件或者可
以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
酸区段，例如存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指从它的
天生环境被取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，被包含在载体中的编码IGF-1R结合分子的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的进一步的实例包括被维
持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。分
离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。本发明的分离的多核苷酸或
核酸进一步包括通过合成而产生此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是调节元件或者可
以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
[0265] 如本文所用，“编码区”是这样的一部分核酸分子，其由被翻译为氨基酸的密码子所组成。虽然“终止子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译为氨基酸，但它可被视为编码区的一部分，然而任何旁侧序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子以及类似物不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中例如在单个载体上，或者在分开的多核苷酸构建体中例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体
可含有单个编码区，或可包括两个或更多编码区，例如单个载体可各自编码免疫球蛋白重
链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源性编码区，其被融合或未被融合至编码IGF-1R结合分子或其片段、变体或衍生物的核酸。异源
性编码区包括但不限于专门的元件或模体，例如分泌信号肽或异源性功能结构域或可能便
于鉴定或纯化的标签。
可含有单个编码区，或可包括两个或更多编码区，例如单个载体可各自编码免疫球蛋白重
链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源性编码区，其被融合或未被融合至编码IGF-1R结合分子或其片段、变体或衍生物的核酸。异源
性编码区包括但不限于专门的元件或模体，例如分泌信号肽或异源性功能结构域或可能便
于鉴定或纯化的标签。
[0266] 在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸分子是DNA分子。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸在内的多核苷酸通常可包含启动子和/或与一个或多个编码区可操作地
连接的其它转录或翻译控制元件。在可操作的连接中，基因产物例如多肽的编码区以将基
因产物的表达置于所述调节序列的影响或控制之下的方式与一个或多个调节序列相连接。
如果启动子功能的诱导导致编码期望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之
间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰待转录的DNA模
板的能力，两个DNA片段(例如多肽编码区和与之相连的启动子)是“可操作地连接的”。
因此，如果所述启动子能够引起该核酸的转录，可将启动子区和编码多肽的核酸可操作地
连接。所述启动子可以是细胞特异性的启动子，其只在预先确定的细胞中指导DNA的大量
转录。除了启动子之外的其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号，能够可操作地连接至多核苷酸以指导细胞特异性的转录。适合的启动子和其它转录控制区
公开在本文中。
连接的其它转录或翻译控制元件。在可操作的连接中，基因产物例如多肽的编码区以将基
因产物的表达置于所述调节序列的影响或控制之下的方式与一个或多个调节序列相连接。
如果启动子功能的诱导导致编码期望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之
间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰待转录的DNA模
板的能力，两个DNA片段(例如多肽编码区和与之相连的启动子)是“可操作地连接的”。
因此，如果所述启动子能够引起该核酸的转录，可将启动子区和编码多肽的核酸可操作地
连接。所述启动子可以是细胞特异性的启动子，其只在预先确定的细胞中指导DNA的大量
转录。除了启动子之外的其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号，能够可操作地连接至多核苷酸以指导细胞特异性的转录。适合的启动子和其它转录控制区
公开在本文中。
[0267] 本领域技术人员知道各种转录控制区。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，其中所述转录控制区例如但不限于来自细胞巨化病毒(与内含子A一起
的立即早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启
动子和增强子区段。其它的转录控制区包括衍生自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如
可被干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
的立即早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启
动子和增强子区段。其它的转录控制区包括衍生自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如
可被干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
[0268] 相似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子以及从微小RNA病毒衍生的元件(特别是内
核糖体进入位点或IRES，其也被称作CITE序列)。
核糖体进入位点或IRES，其也被称作CITE序列)。
[0269] 在其它的实施方案中，本发明的多核苷酸是例如信使RNA(mRNA)的形式的RNA分子。
[0270] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区相连，其中所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由
哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，其在生长中的蛋白链跨粗面内质网
输出时从成熟蛋白上被切下。本领域普通技术人员知道，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常
具有融合至所述多肽N端的信号肽，其从完整的或“全长”的多肽被切下以产生分泌的或
“成熟的”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者保持指导与之可操作地连接的多肽分泌的能力的序列的功能性衍生物。可选
地，可以使用异源性哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以使用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列取代野生型前导序列。
哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，其在生长中的蛋白链跨粗面内质网
输出时从成熟蛋白上被切下。本领域普通技术人员知道，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常
具有融合至所述多肽N端的信号肽，其从完整的或“全长”的多肽被切下以产生分泌的或
“成熟的”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者保持指导与之可操作地连接的多肽分泌的能力的序列的功能性衍生物。可选
地，可以使用异源性哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以使用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列取代野生型前导序列。
[0271] 如本文所用，术语“人工改造的”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、肽的酶促或化学轭合或者这些技术的一些组合)对核酸或多肽分子的操作。
[0272] 如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”被可互换地使用。这些术语是指将两个或更多个元件或成分通过任何方法连接在一起，其中所述方法包括化学轭合或重组方法。“框内融合”是指将两个或更多个多核苷酸可读框(ORF)以维持原始ORF的正确翻译
阅读框的方式连接以形成连续的更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或多个区段的单个蛋白，其中所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(在自然中所属区段通常不如此连
接)。虽然所述阅读框因此在被融合的全区段中被变成连续的，但是所述区段可被例如框内连接序列物理地或空间地分开。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸框内融合但
被编码至少一个免疫球蛋白骨架区或另外的CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作
为连续多肽的一部分而被共同翻译。
阅读框的方式连接以形成连续的更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或多个区段的单个蛋白，其中所述区段对应于由原始ORF编码的多肽(在自然中所属区段通常不如此连
接)。虽然所述阅读框因此在被融合的全区段中被变成连续的，但是所述区段可被例如框内连接序列物理地或空间地分开。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸框内融合但
被编码至少一个免疫球蛋白骨架区或另外的CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作
为连续多肽的一部分而被共同翻译。
[0273] 在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中的氨基酸从氨基至羧基末端方向的顺序，在其中所述序列中相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
[0274] 本文所用术语“表达”是指基因通过它来产生生物化学产物例如RNA或多肽的一种过程。该过程包括对细胞中基因的功能性存在的任何操作，其包括但不限于基因敲
除以及短暂表达和稳定表达二者。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转运
RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将这种mRNA
翻译成多肽。如果最终期望的产物是生物化学产物，那么表达包括该化学产物和任何前体
的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸例如由基因转录产生的信使RNA，或者从转录物翻译而来的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰例如多腺苷酸化的核酸，或者具有翻译后修饰例如甲基化、糖基化、加脂质、与其它蛋白亚基缔合、蛋白水解切割以及诸如此类的多肽。
除以及短暂表达和稳定表达二者。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转运
RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将这种mRNA
翻译成多肽。如果最终期望的产物是生物化学产物，那么表达包括该化学产物和任何前体
的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸例如由基因转录产生的信使RNA，或者从转录物翻译而来的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰例如多腺苷酸化的核酸，或者具有翻译后修饰例如甲基化、糖基化、加脂质、与其它蛋白亚基缔合、蛋白水解切割以及诸如此类的多肽。
[0275] 如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性的治疗和预防或防止措施，其中目标是防止或延缓(减轻)不期望的生理改变或病症，例如癌症的发生或扩散。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减少、疾病的稳定(即不继续恶化的)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻和免除(部分的
或完全的)，不论是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可以指与不接受治疗时所期望的存活相比延长的存活。需要治疗的那些人包括已经患症状或病症的那些以及倾向于患症状
或病症的那些，或者其症状或病症有待预防的那些。
或完全的)，不论是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可以指与不接受治疗时所期望的存活相比延长的存活。需要治疗的那些人包括已经患症状或病症的那些以及倾向于患症状
或病症的那些，或者其症状或病症有待预防的那些。
[0276] “受治疗者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受治疗者，特别是哺乳动物受治疗者，对其的诊断、预后或治疗是期望的。哺乳动物受治疗者包括人类、家畜、农畜和动物园、体育或宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等等。
[0277] 如本文所用，短语例如“将得益于结合分子的施用的受治疗者”和“需要治疗的动物”包括将得益于结合分子的施用以及/或者得益于使用特异性结合给定靶蛋白的结合分子的例如癌症的疾病的治疗即缓和或预防的受治疗者例如哺乳动物受治疗者，其中所述结
合分子被用来例如检测被结合分子所识别的抗原(例如诊断过程)。如本文更详细所述，结
合分子可以以未轭合的形式使用或轭合至例如药物、前体药物或同位素。
合分子被用来例如检测被结合分子所识别的抗原(例如诊断过程)。如本文更详细所述，结
合分子可以以未轭合的形式使用或轭合至例如药物、前体药物或同位素。
[0278] “过度增殖性疾病或病症”是指赘生细胞的生长或增殖，无论是恶性的还是良性的，其包括转化的细胞和组织以及所有的癌细胞和组织。过度增殖性疾病或病症包括但不
限于癌症前期的损伤、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和“癌症”。在本发明的某些实施方案中，过度增殖性疾病或病症例如癌症前期的损伤、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤或“癌症”包括表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
限于癌症前期的损伤、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和“癌症”。在本发明的某些实施方案中，过度增殖性疾病或病症例如癌症前期的损伤、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤或“癌症”包括表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0279] 过度增殖性疾病、病症和/或状况的另外的例子包括但不限于瘤形成，不论是良性的还是恶性的，其位于：前列腺、结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺体(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸和泌尿生殖道。在某些实施方案中，这种瘤形成表达、过度表达或异常表达IGF-1R。
[0280] 其它的过度增殖性病症包括但不限于：高γ球蛋白血症、淋巴增殖性病症、病变蛋白血症、紫癜、肉样瘤病、塞扎里综合症、Waldenstron巨球蛋白血症、高歇氏病、组织细胞增生病以及任何其它过度增殖性疾病，除了位于上面所列器官系统中的瘤形成之外。在本
发明的某些实施方案中，疾病包括表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
发明的某些实施方案中，疾病包括表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0281] 如本文所用，术语“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由过度的细胞分裂所致的异常的组织块，在某些情况下组织包括表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。肿瘤或肿瘤组织包括“肿瘤细胞”，其为具有异常生长特性且不具有有用的具体功能的赘生细胞。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性的或恶性的。肿瘤或肿瘤组织还可包括“与肿瘤相关的非肿瘤
细胞”，例如形成血管以供给肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。可以通过肿瘤细胞来诱导非肿瘤细胞的复制和发育，例如诱导肿瘤或肿瘤组织中的血管生成。
细胞”，例如形成血管以供给肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。可以通过肿瘤细胞来诱导非肿瘤细胞的复制和发育，例如诱导肿瘤或肿瘤组织中的血管生成。
[0282] 如本文所用，术语“恶性肿瘤”是指非良性肿瘤或者癌症。如本文所用，术语“癌症”意思就是一种过度增殖性疾病，其包括特征为不被调节的或不被控制的细胞生长的恶性肿瘤。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。这种癌症的更特别的例子被记录如下且包括：鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，肺
癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如其细胞未迁移至除原始恶性肿瘤或肿瘤的位点之外的受治疗者身体中的位点的那些)和继发
恶性细胞或肿瘤(例如由转移所引起的那些，其中所述转移是恶性细胞或肿瘤细胞向不同
于原始肿瘤位点的继发位点的迁移)。本发明的治疗方法适用的癌症涉及表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如其细胞未迁移至除原始恶性肿瘤或肿瘤的位点之外的受治疗者身体中的位点的那些)和继发
恶性细胞或肿瘤(例如由转移所引起的那些，其中所述转移是恶性细胞或肿瘤细胞向不同
于原始肿瘤位点的继发位点的迁移)。本发明的治疗方法适用的癌症涉及表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0283] 癌症或恶性肿瘤的其它例子包括但不限于：急性儿童淋巴母细胞白血病，急性淋巴母细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞样白血病，肾上腺皮质癌，成人(原发性)肝细胞癌，成人(原发性)肝癌，成人急性淋巴细胞白血病，成人急性髓细胞样白血
病，成人霍奇金病，成人霍奇金淋巴瘤，成人淋巴细胞白血病，成人非霍奇金淋巴瘤，成人原发性肝癌，成人软组织肉瘤，艾滋病相关的淋巴瘤，艾滋病相关的恶性肿瘤，肛门癌，星形细胞瘤，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，肾盂和输尿管癌，中枢神经系统(原发性)淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤，子宫颈癌，儿童(原发性)肝细胞癌，儿童(原发性)肝癌，儿童急性淋巴母细胞白血病，儿童急性髓细胞样
白血病，儿童脑干胶质瘤，儿童小脑星形细胞瘤，儿童脑星形细胞瘤，儿童颅外生殖细胞肿瘤，儿童霍奇金病，儿童霍奇金淋巴瘤，儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童淋巴母细胞白血病，儿童成髓细胞瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童原发性肝癌，儿童横纹肌肉瘤，儿童软组织肉瘤，儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性骨髓性白血病，结肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，内分泌胰岛细胞癌，子宫内膜癌，室管膜瘤，上皮癌，食道癌，Ewing氏肉瘤和相关肿瘤，外分泌胰腺癌，颅外生殖细胞肿瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，眼癌，女性乳腺癌，高歇氏病，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠癌，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养母细胞肿瘤，毛细胞白血病，头颈癌，肝细胞癌，霍奇金病，霍奇金淋巴瘤，高γ球蛋白血症，下咽癌，肠癌，眼内黑素瘤，胰岛细胞癌，胰岛细胞胰腺癌，卡波西氏肉瘤，肾脏癌，喉癌，唇及口腔癌，肝癌，肺癌，淋巴增殖性病症，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，恶性间皮瘤，恶性胸腺瘤，成髓细胞瘤，黑素瘤，间皮瘤，转移隐匿原发性鳞状颈癌，转移原发性鳞状颈癌，转移性鳞状颈癌，多发性骨髓瘤，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，骨髓增生异常综合征，骨髓性白血病，粒细胞性白血病，骨髓增殖性病症，鼻腔及鼻旁窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，怀孕期间的非霍奇金淋巴瘤，非黑素瘤皮肤癌，非小细胞肺癌，隐匿原发转移性鳞状颈癌，口咽癌，骨/恶性纤维肉瘤，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性度肿瘤，胰腺癌，病变蛋白血症，紫癜，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，垂体肿瘤，浆细胞瘤/多发性骨髓瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，原发性肝癌，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌，肾盂和输尿管癌，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉样瘤病肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状颈癌，胃癌，幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤，甲状腺癌，肾盂和输尿管的移行细胞癌，移行性肾盂和输尿管癌，滋养母细胞肿瘤，输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、Wilm氏肿瘤以及任何其它过度增殖性疾病，除了位于上面所列器官系统中的瘤形成之外。
病，成人霍奇金病，成人霍奇金淋巴瘤，成人淋巴细胞白血病，成人非霍奇金淋巴瘤，成人原发性肝癌，成人软组织肉瘤，艾滋病相关的淋巴瘤，艾滋病相关的恶性肿瘤，肛门癌，星形细胞瘤，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，肾盂和输尿管癌，中枢神经系统(原发性)淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤，子宫颈癌，儿童(原发性)肝细胞癌，儿童(原发性)肝癌，儿童急性淋巴母细胞白血病，儿童急性髓细胞样
白血病，儿童脑干胶质瘤，儿童小脑星形细胞瘤，儿童脑星形细胞瘤，儿童颅外生殖细胞肿瘤，儿童霍奇金病，儿童霍奇金淋巴瘤，儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童淋巴母细胞白血病，儿童成髓细胞瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童原发性肝癌，儿童横纹肌肉瘤，儿童软组织肉瘤，儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性骨髓性白血病，结肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，内分泌胰岛细胞癌，子宫内膜癌，室管膜瘤，上皮癌，食道癌，Ewing氏肉瘤和相关肿瘤，外分泌胰腺癌，颅外生殖细胞肿瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，眼癌，女性乳腺癌，高歇氏病，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠癌，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养母细胞肿瘤，毛细胞白血病，头颈癌，肝细胞癌，霍奇金病，霍奇金淋巴瘤，高γ球蛋白血症，下咽癌，肠癌，眼内黑素瘤，胰岛细胞癌，胰岛细胞胰腺癌，卡波西氏肉瘤，肾脏癌，喉癌，唇及口腔癌，肝癌，肺癌，淋巴增殖性病症，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，恶性间皮瘤，恶性胸腺瘤，成髓细胞瘤，黑素瘤，间皮瘤，转移隐匿原发性鳞状颈癌，转移原发性鳞状颈癌，转移性鳞状颈癌，多发性骨髓瘤，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，骨髓增生异常综合征，骨髓性白血病，粒细胞性白血病，骨髓增殖性病症，鼻腔及鼻旁窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，怀孕期间的非霍奇金淋巴瘤，非黑素瘤皮肤癌，非小细胞肺癌，隐匿原发转移性鳞状颈癌，口咽癌，骨/恶性纤维肉瘤，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性度肿瘤，胰腺癌，病变蛋白血症，紫癜，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜铬细胞瘤，垂体肿瘤，浆细胞瘤/多发性骨髓瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，原发性肝癌，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌，肾盂和输尿管癌，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉样瘤病肉瘤，塞扎里综合征，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状颈癌，胃癌，幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，胸腺瘤，甲状腺癌，肾盂和输尿管的移行细胞癌，移行性肾盂和输尿管癌，滋养母细胞肿瘤，输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、Wilm氏肿瘤以及任何其它过度增殖性疾病，除了位于上面所列器官系统中的瘤形成之外。
[0284] 本发明的方法可被用来治疗恶化前的状况并预防进展至赘生或恶性状态，其包括但不限于上述的那些病症。这种用途在已知的或被怀疑为前述的向瘤形成或癌症的进展的
状况中被指出，其中所述状况特别是在发生由超常增生、组织转化或最特别地发育异常所
组成的非赘生细胞生长的时候(关于这种异常生长状况的综述，参见Robbins和Angell，
Basic Pathology(基础病理学)，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页
(1976))。使用本发明的方法，可以特别地治疗细胞开始表达、过度表达或异常表达IGF-1R的这种状况。
状况中被指出，其中所述状况特别是在发生由超常增生、组织转化或最特别地发育异常所
组成的非赘生细胞生长的时候(关于这种异常生长状况的综述，参见Robbins和Angell，
Basic Pathology(基础病理学)，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页
(1976))。使用本发明的方法，可以特别地治疗细胞开始表达、过度表达或异常表达IGF-1R的这种状况。
[0285] 超常增生是一种受控的细胞增殖形式，其包括组织或器官中细胞数量的增多，而不显著改变结构或功能。可以使用本发明的方法治疗的超常增生病症包括但不限于血管滤
泡纵膈淋巴结的超常增生、伴随嗜曙红细胞增多的血管淋巴样超常增生、非典型的黑素细
胞超常增生、基底细胞超常增生、良性大淋巴结超常增生、牙骨质增生、先天性肾上腺超常增生、先天性皮脂腺超常增生、囊性超常增生、乳腺囊性超常增生、义齿性超常增生、导管超常增生、子宫内膜超常增生、纤维肌性超常增生、局灶性上皮超常增生、牙龈超常增生、炎性纤维超常增生、炎症性乳头状超常增生、血管内乳头状内皮超常增生、前列腺结节性超常增生、结节再生性超常增生、假性上皮瘤性超常增生、老年皮脂腺超常增生和疣状超常增生。
泡纵膈淋巴结的超常增生、伴随嗜曙红细胞增多的血管淋巴样超常增生、非典型的黑素细
胞超常增生、基底细胞超常增生、良性大淋巴结超常增生、牙骨质增生、先天性肾上腺超常增生、先天性皮脂腺超常增生、囊性超常增生、乳腺囊性超常增生、义齿性超常增生、导管超常增生、子宫内膜超常增生、纤维肌性超常增生、局灶性上皮超常增生、牙龈超常增生、炎性纤维超常增生、炎症性乳头状超常增生、血管内乳头状内皮超常增生、前列腺结节性超常增生、结节再生性超常增生、假性上皮瘤性超常增生、老年皮脂腺超常增生和疣状超常增生。
[0286] 组织转化是一种受控的细胞生长形式，在其中一种类型的成年或完全分化的细胞代替另一种类型的成年细胞。可以使用本发明的方法治疗的组织转化病症包括但不限于特
发性骨髓样组织转化、顶泌腺组织转化、非典型组织转化、自发实质性组织转化、结缔组织转化、上皮组织转化、肠组织转化、组织转化性贫血、组织转化性成骨、组织转化性息肉、骨髓样组织转化、原发性骨髓样组织转化、继发性骨髓样组织转化、鳞状组织转化、羊膜的鳞状组织转化和症状性骨髓样组织转化。
发性骨髓样组织转化、顶泌腺组织转化、非典型组织转化、自发实质性组织转化、结缔组织转化、上皮组织转化、肠组织转化、组织转化性贫血、组织转化性成骨、组织转化性息肉、骨髓样组织转化、原发性骨髓样组织转化、继发性骨髓样组织转化、鳞状组织转化、羊膜的鳞状组织转化和症状性骨髓样组织转化。
[0287] 发育异常常常是癌症的先兆，并且主要在上皮细胞中被发现；它是最无序的非赘生细胞生长形式，其包括个体细胞均一性和细胞构造方向的丧失。发育异常的细胞常常具
有异常巨大的、深度染色的核，并且显示同质多形现象。发育异常特征性地发生在存在慢性刺激或炎症之处。可以使用本发明的方法治疗的发育异常病症包括但不限于无汗性外胚
层发育异常，前脸(anterofacial)发育异常，窒息性胸廓发育异常，心房手指发育异常，支气管肺发育异常，脑发育异常，宫颈发育异常，软骨外胚层发育异常，锁骨颅骨发育异常，先天性外胚层发育异常，颅骨骨干发育异常，颅腕跗发育异常，颅骨干骺端发育异常，牙本质发育异常，骨干发育异常，外胚层发育异常，釉质发育异常，脑-眼发育异常，偏侧骨骺发育异常，多发性骨骺发育异常，点状骨骺发育异常，上皮发育异常，面指生殖器发育异常，家族性颌骨纤维性发育异常，家族性白色褶皱发育异常，纤维肌性发育异常，骨纤维发育异常，旺盛骨性发育异常，遗传性肾脏-视网膜发育异常，出汗性外胚层发育异常，少汗性外胚层发育异常，淋巴细胞减少性胸腺发育异常，乳腺发育异常，颌面发育异常，干骺端发育异常，Mondini发育异常，单骨纤维发育异常，粘液上皮发育异常，多发性骨骺发育异常，眼耳脊椎发育异常，眼牙指发育异常，眼与脊椎发育异常，牙发育异常，眼下颌肢发育异常，根尖周牙骨质发育异常，多骨纤维性发育异常，假性软骨延迟性脊椎骨端发育异常，视网膜发育异常，视网中隔发育异常，延迟性脊椎骨端发育异常和室径向发育异常。
有异常巨大的、深度染色的核，并且显示同质多形现象。发育异常特征性地发生在存在慢性刺激或炎症之处。可以使用本发明的方法治疗的发育异常病症包括但不限于无汗性外胚
层发育异常，前脸(anterofacial)发育异常，窒息性胸廓发育异常，心房手指发育异常，支气管肺发育异常，脑发育异常，宫颈发育异常，软骨外胚层发育异常，锁骨颅骨发育异常，先天性外胚层发育异常，颅骨骨干发育异常，颅腕跗发育异常，颅骨干骺端发育异常，牙本质发育异常，骨干发育异常，外胚层发育异常，釉质发育异常，脑-眼发育异常，偏侧骨骺发育异常，多发性骨骺发育异常，点状骨骺发育异常，上皮发育异常，面指生殖器发育异常，家族性颌骨纤维性发育异常，家族性白色褶皱发育异常，纤维肌性发育异常，骨纤维发育异常，旺盛骨性发育异常，遗传性肾脏-视网膜发育异常，出汗性外胚层发育异常，少汗性外胚层发育异常，淋巴细胞减少性胸腺发育异常，乳腺发育异常，颌面发育异常，干骺端发育异常，Mondini发育异常，单骨纤维发育异常，粘液上皮发育异常，多发性骨骺发育异常，眼耳脊椎发育异常，眼牙指发育异常，眼与脊椎发育异常，牙发育异常，眼下颌肢发育异常，根尖周牙骨质发育异常，多骨纤维性发育异常，假性软骨延迟性脊椎骨端发育异常，视网膜发育异常，视网中隔发育异常，延迟性脊椎骨端发育异常和室径向发育异常。
[0288] 可以使用本发明的方法治疗的另外的赘生前病症包括但不限于良性增殖异常病症(例如良性肿瘤、纤维性囊肿状况、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食管发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博温氏病、农民皮肤、日光性唇炎和日光性角化病。
[0289] 在优选的实施方案中，本发明的方法被用来抑制过度增殖细胞的生长(如，表达IGF-1R的肿瘤细胞的体外或体内增殖)、癌症的进展和/或转移，特别是上面所列的那些。
[0290] 另外的过度增殖疾病、病症和/或状况包括但不限于恶性肿瘤和相关病症的进展和/或转移，其中所述相关病症例如白血病(其包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血
病、急性髓细胞白血病(其包括成髓细胞的、前髓细胞的、髓单核细胞的、单核细胞的和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、
真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，其中所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
病、急性髓细胞白血病(其包括成髓细胞的、前髓细胞的、髓单核细胞的、单核细胞的和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、
真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，其中所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
[0291] II.IGF系统
[0292] IGF系统在调节细胞增殖、分化、凋亡和转化中扮演重要角色(Jones等人，Endocrinology Rev.1995.16：3-34)，且已显示肿瘤细胞产生IGF系统的一种或多种组分。
IGF系统包括两种类型的不相关受体，即胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R；CD221)和胰岛
素样生长因子受体2(IGF-2R；CD222)；两种配体，即胰岛素样生长因子1(IGF-1和IGF-2)；
几种IGF结合蛋白(IGFBP-1至IGFBP-6)；和IGF1R远侧的胞内信号传导中牵涉的蛋白，
其包括胰岛素受体底物(IRS)家族的成员、AKT、雷帕霉素(TOR)的靶、和S6激酶。另外，
一大组IGFBP蛋白酶(例如：半胱天冬酶、金属蛋白酶、前列腺特异性抗原)将结合有IGF
的IGFBP水解以释放出游离的IGF，所述游离的IGF然后与IGF-1R和IGF-2R相互作用。
IGF系统还与胰岛素和胰岛素受体(InsR)紧密连接(Moschos等人.Oncology 2002.63：
317-32；Baserga等人，Int J.Cancer.2003.107：873-77；Pollak等人，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516)。
IGF系统包括两种类型的不相关受体，即胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R；CD221)和胰岛
素样生长因子受体2(IGF-2R；CD222)；两种配体，即胰岛素样生长因子1(IGF-1和IGF-2)；
几种IGF结合蛋白(IGFBP-1至IGFBP-6)；和IGF1R远侧的胞内信号传导中牵涉的蛋白，
其包括胰岛素受体底物(IRS)家族的成员、AKT、雷帕霉素(TOR)的靶、和S6激酶。另外，
一大组IGFBP蛋白酶(例如：半胱天冬酶、金属蛋白酶、前列腺特异性抗原)将结合有IGF
的IGFBP水解以释放出游离的IGF，所述游离的IGF然后与IGF-1R和IGF-2R相互作用。
IGF系统还与胰岛素和胰岛素受体(InsR)紧密连接(Moschos等人.Oncology 2002.63：
317-32；Baserga等人，Int J.Cancer.2003.107：873-77；Pollak等人，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516)。
[0293] (a)IGF-1
[0294] IGF-1具有循环激素和组织生长因子两者的特征。循环中的大多数IGF-1在肝脏中产生，但现在认识到，IGF-1还在其它器官中合成，在那里自分泌和旁分泌作用机制
也是重要的。IGF-1信号传导刺激细胞增殖并延长细胞存活。若干流行病学研究已经显
示，高于正常循环水平的IGF-1与患几种常见癌症的风险增加相关，所述癌症包括乳腺癌
(Hankinson等人，Lancet 1998.351：1393-6)、前列腺癌(Chan等人，Science.1998.279：
563-6)、肺癌(Yu等人，J.Natl.Cancer Inst.1999.91：151-6)和结肠直肠癌(Ma等人，
J.Natl.CancerInst.1999.91：620-5)。
也是重要的。IGF-1信号传导刺激细胞增殖并延长细胞存活。若干流行病学研究已经显
示，高于正常循环水平的IGF-1与患几种常见癌症的风险增加相关，所述癌症包括乳腺癌
(Hankinson等人，Lancet 1998.351：1393-6)、前列腺癌(Chan等人，Science.1998.279：
563-6)、肺癌(Yu等人，J.Natl.Cancer Inst.1999.91：151-6)和结肠直肠癌(Ma等人，
J.Natl.CancerInst.1999.91：620-5)。
[0295] (b)IGF-2
[0296] 还已显示，IGF-2的循环水平升高与子宫内膜癌风险增加有关(Jonathan等人，Cancer Biomarker & Prevention.2004.13：748-52)。IGF2还在肝脏和肝外部位表达。虽
然体外研究已经表明肿瘤能产生IGF-1或IGF-2，但是翻译研究表明IGF-2是肿瘤中更相
关和通常被表达的IGF。这是由于表观遗传的改变所致的肿瘤中沉默的IGF-2等位基因的
印记丢失(LOI)，其导致IGF-2基因的双等位基因表达(Fienberg等人，Nat.Rev.Cancer
2004.4：143-53；Giovannucci等人，Horm.Metab.Res.2003.35：694-04；De Souza等人，FASEB J.等人，1997.11：60-7)。这反过来导致对癌细胞以及支持肿瘤生长的微环境的
IGF-2供给的增加。
然体外研究已经表明肿瘤能产生IGF-1或IGF-2，但是翻译研究表明IGF-2是肿瘤中更相
关和通常被表达的IGF。这是由于表观遗传的改变所致的肿瘤中沉默的IGF-2等位基因的
印记丢失(LOI)，其导致IGF-2基因的双等位基因表达(Fienberg等人，Nat.Rev.Cancer
2004.4：143-53；Giovannucci等人，Horm.Metab.Res.2003.35：694-04；De Souza等人，FASEB J.等人，1997.11：60-7)。这反过来导致对癌细胞以及支持肿瘤生长的微环境的
IGF-2供给的增加。
[0297] (c)IGF-1R
[0298] IGF1和IGF2都是IGF-1R的配体，IGF-1R是细胞表面酪氨酸激酶信号传导分子。在本领域中IGF-1R还被称作CD221和JTK13。配体结合于IGF-1R之后，激活了有利于增殖
以及存活的胞内信号传导途径。对IGF-1R的初始磷酸化靶包括IRS蛋白，下游信号传导分
子包括磷脂酰肌醇3-激酶、AKT、TOR、S6激酶和细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)。
以及存活的胞内信号传导途径。对IGF-1R的初始磷酸化靶包括IRS蛋白，下游信号传导分
子包括磷脂酰肌醇3-激酶、AKT、TOR、S6激酶和细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)。
[0299] 在结构上，IGF-1R与InsR高度相关(Pierre De Meyts和Whittaker，NatureReViews Drug Discovery.2002，1：769-83)。IGF-1R在激酶结构域上与InsR有84％的序
列同一性，而近膜和c端区域分别享有61％和44％的序列同一性(Ulrich等人，EMBO J.，
1986，5：2503-12；Blakesley等人，Cytokine Growth Factor Rev.，1996.7：153-56)。尽管IGF-1R和InsR之间有高度的同源性，有证据表明两种受体具有不同的生物作用；InsR是生
理功能例如葡萄糖的转运以及糖原和脂肪的生物合成的关键调节剂，而IGF-1R是细胞生
长和分化的有力调节剂。与InsR相反，IGF-1R在组织中广泛表达，并在调节IGF-1的生长
激素(GH)的控制下对组织生长起一定作用。虽然已经显示IGF-1R的激活促进正常的细胞
生长，但实验证据表明IGF-1R不是绝对的要求(Baserga等人，Exp Cell Res.1999.253：
1-6；Baserga等人，Int.J.Cancer.2003.107：873-77)。在癌细胞中，除了早期存活和增殖信号传导之外，还已经显示IGF-1R的激活被包含在运动和侵入中(Reiss等人，Oncogene
2001.20：490-500，Nolan等人，Int.J.Cancer.1997.72：828-34，Stracke等人，J.Biol.Chem.1989.264：21544-49；Jackson等人，Oncogene，2001.20：7318-25)。
列同一性，而近膜和c端区域分别享有61％和44％的序列同一性(Ulrich等人，EMBO J.，
1986，5：2503-12；Blakesley等人，Cytokine Growth Factor Rev.，1996.7：153-56)。尽管IGF-1R和InsR之间有高度的同源性，有证据表明两种受体具有不同的生物作用；InsR是生
理功能例如葡萄糖的转运以及糖原和脂肪的生物合成的关键调节剂，而IGF-1R是细胞生
长和分化的有力调节剂。与InsR相反，IGF-1R在组织中广泛表达，并在调节IGF-1的生长
激素(GH)的控制下对组织生长起一定作用。虽然已经显示IGF-1R的激活促进正常的细胞
生长，但实验证据表明IGF-1R不是绝对的要求(Baserga等人，Exp Cell Res.1999.253：
1-6；Baserga等人，Int.J.Cancer.2003.107：873-77)。在癌细胞中，除了早期存活和增殖信号传导之外，还已经显示IGF-1R的激活被包含在运动和侵入中(Reiss等人，Oncogene
2001.20：490-500，Nolan等人，Int.J.Cancer.1997.72：828-34，Stracke等人，J.Biol.Chem.1989.264：21544-49；Jackson等人，Oncogene，2001.20：7318-25)。
[0300] IGF-1R被表达在大量的肿瘤细胞中，其中所述肿瘤包括但不限于下述的某些：膀胱肿瘤(Hum.Pathol.34：803(2003))；脑肿瘤(Clinical Cancer Res.8：1822(2002))；
乳腺肿瘤(Eur.J.Cancer30：307(1994)和Hum Pathol.36：448-449(2005))；结肠肿瘤
例如腺癌、转移和腺瘤(Human Pathol.30：1128(1999)，Virchows.Arc.443：139(2003)
和 Clin.Cancer Res.10：8434-8441(2004))；胃 肿 瘤 (Clin.Exp.Metastasis 21：
755(2004))；肾肿瘤例如透明细胞、嫌色细胞和乳头状RCC(Am.J.Clin.Pathol.122：
931-937(2004))；肺 肿 瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003) 和J.Cancer Res.Clinical
Oncol.119：665-668(1993))；卵巢肿瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003))；胰腺肿瘤例如导管腺癌(Digestive Diseases.Sci.48：1972-1978(2003)和Clinical Cancer Res.11：
3233-3242(2005))；以及前列腺肿瘤(Cancer Res.62：2942-2950(2002))。
乳腺肿瘤(Eur.J.Cancer30：307(1994)和Hum Pathol.36：448-449(2005))；结肠肿瘤
例如腺癌、转移和腺瘤(Human Pathol.30：1128(1999)，Virchows.Arc.443：139(2003)
和 Clin.Cancer Res.10：8434-8441(2004))；胃 肿 瘤 (Clin.Exp.Metastasis 21：
755(2004))；肾肿瘤例如透明细胞、嫌色细胞和乳头状RCC(Am.J.Clin.Pathol.122：
931-937(2004))；肺 肿 瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003) 和J.Cancer Res.Clinical
Oncol.119：665-668(1993))；卵巢肿瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003))；胰腺肿瘤例如导管腺癌(Digestive Diseases.Sci.48：1972-1978(2003)和Clinical Cancer Res.11：
3233-3242(2005))；以及前列腺肿瘤(Cancer Res.62：2942-2950(2002))。
[0301] IGF-1R的分子结构包括两个胞外α亚基(每个130-135kD)和两个包含胞质催化激酶结构域的跨膜β亚基(每个95kD)。IGF-1R如同胰岛素受体(InsR)因具有共价
二聚体(α2β2)结构而区别于其它RTK家族成员(Massagué，J.和Czech，M.P.J.Biol.
Chem.257：5038-5045(1992))。IGF-1R胞外区由6个蛋白结构域组成，其以如下顺序连接：
N末端富含亮氨酸的重复结构域(L1)；富含半胱氨酸的重复区(CRR)；第二富含亮氨酸的重
复结构域(L2)；和三个纤连蛋白III型结构域，标为FnIII-1、FnIII-2和FnIII-3(参见图
1)。
二聚体(α2β2)结构而区别于其它RTK家族成员(Massagué，J.和Czech，M.P.J.Biol.
Chem.257：5038-5045(1992))。IGF-1R胞外区由6个蛋白结构域组成，其以如下顺序连接：
N末端富含亮氨酸的重复结构域(L1)；富含半胱氨酸的重复区(CRR)；第二富含亮氨酸的重
复结构域(L2)；和三个纤连蛋白III型结构域，标为FnIII-1、FnIII-2和FnIII-3(参见图
1)。
[0302] 人类IGF-1R mRNA的核酸序列可在GenBank登录号NM_000875(gi|119220593)下获得。前体多肽序列可在GenBank登录号NP_000866(gi 4557665)下获得。报道氨基酸1
至30编码IGF-1R信号肽，报道氨基酸31至740编码IGF-1Rα-亚基，报道氨基酸741至
1367编码IGF-1Rβ-亚基。成熟IGF-1R多肽缺少IGF1-R信号肽。因此，本申请中IGF-1R
氨基酸的编号是指人类IGF-1R的成熟形式的氨基酸序列，如图2所示(SEQ ID NO：2)。该
序列的结构域展示在表2。
至30编码IGF-1R信号肽，报道氨基酸31至740编码IGF-1Rα-亚基，报道氨基酸741至
1367编码IGF-1Rβ-亚基。成熟IGF-1R多肽缺少IGF1-R信号肽。因此，本申请中IGF-1R
氨基酸的编号是指人类IGF-1R的成熟形式的氨基酸序列，如图2所示(SEQ ID NO：2)。该
序列的结构域展示在表2。
[0303] 表2
[0304]SEQ ID 特性
NO：2
1至796 胰岛素样生长因子1受体α链
1至205 受体L结构域(L1)
206至299 半胱氨酸重复区(CRR)
300至457 受体L结构域(L2)
458至575 纤连蛋白3型结构域(FnIII-1)
576至796 纤连蛋白3型结构域(FnIII-2)
797至1337 胰岛素样生长因子1受体β
797至899 纤连蛋白3型结构域(FnIII-3)
900至925 跨膜区
943 磷酸化
950 磷酸化
961至1238 酪氨酸激酶，催化结构域
SEQ ID 特性
NO：2
1131 磷酸化
1135 磷酸化
1136 磷酸化
NO：2
1至796 胰岛素样生长因子1受体α链
1至205 受体L结构域(L1)
206至299 半胱氨酸重复区(CRR)
300至457 受体L结构域(L2)
458至575 纤连蛋白3型结构域(FnIII-1)
576至796 纤连蛋白3型结构域(FnIII-2)
797至1337 胰岛素样生长因子1受体β
797至899 纤连蛋白3型结构域(FnIII-3)
900至925 跨膜区
943 磷酸化
950 磷酸化
961至1238 酪氨酸激酶，催化结构域
SEQ ID 特性
NO：2
1131 磷酸化
1135 磷酸化
1136 磷酸化
[0305] III.IGF-1R结合部分
[0306] 本发明的结合分子的IGF-1R结合部分可包括抗原识别位点、完整可变区、或衍生自一种或多种起始或亲本抗IGF-1R抗体的一个或多个CDR(如，六个CDR)。亲本抗体可包
括天然存在的抗体或抗体片段以及从天然存在的IGF-1R抗体改造的抗体或抗体片段。结
合部分还可衍生自使用已知对IGF-1R靶分子特异性的IGF-1R抗体或抗体片段的序列从
头构造的抗IGF-1R抗体。可能衍生自亲本抗体的序列包括重链和/或轻链可变区和/或
CDR、骨架区或其其它部分。
括天然存在的抗体或抗体片段以及从天然存在的IGF-1R抗体改造的抗体或抗体片段。结
合部分还可衍生自使用已知对IGF-1R靶分子特异性的IGF-1R抗体或抗体片段的序列从
头构造的抗IGF-1R抗体。可能衍生自亲本抗体的序列包括重链和/或轻链可变区和/或
CDR、骨架区或其其它部分。
[0307] 在某些实施方案中，IGF-1R结合部分特异性地结合至IGF-1R的至少一个表位或片段或变体，即与结合至不相关的或随机的表位相比更容易地结合至这样的表位；优先地
结合至上述IGF-1R的至少一个表位或片段或变体，即与结合至相关的、相似的、同源的或
类似的表位相比更容易地结合至这样的表位；竞争性地抑制参考抗体的结合，其中所述参
考抗体自己与上述IGF-1R的某表位或片段或变体特异性地或优先地结合；或者以由解离
常数KD所表征的亲和力结合至上述IGF-1R的至少一个表位或片段或变体，其中所述KD小
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5
于约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、
-6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约
-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约
-14 -14 -15 -15
5×10 M、约10 M、约5×10 M或约10 M。
结合至上述IGF-1R的至少一个表位或片段或变体，即与结合至相关的、相似的、同源的或
类似的表位相比更容易地结合至这样的表位；竞争性地抑制参考抗体的结合，其中所述参
考抗体自己与上述IGF-1R的某表位或片段或变体特异性地或优先地结合；或者以由解离
常数KD所表征的亲和力结合至上述IGF-1R的至少一个表位或片段或变体，其中所述KD小
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5
于约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、
-6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约
-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约5×10 M、约10 M、约
-14 -14 -15 -15
5×10 M、约10 M、约5×10 M或约10 M。
[0308] 在一特定方面，相对于鼠IGF-1R多肽或其片段，IGF-1R结合部分优先地结合至人类IGF-1R多肽或其片段。在另一特定方面，IGF-1R结合部分优先地结合至一个或多
个IGF-1R多肽或其片段例如一个或多个哺乳动物IGF-1R多肽，但不结合至胰岛素受体
(InsR)多肽。在一个实施方案中，本发明结合分子的结合部分不与InsR交叉反应。
个IGF-1R多肽或其片段例如一个或多个哺乳动物IGF-1R多肽，但不结合至胰岛素受体
(InsR)多肽。在一个实施方案中，本发明结合分子的结合部分不与InsR交叉反应。
[0309] 在特定的实施方案中，结合部分以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1-3 -1或10 sec 的解离速率(k(off))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。可选地，IGF-1R结合
-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1
部分以小于或等于5×10 sec 、10 sec 、5×10 sec 或10 sec 5×10 sec 、10 sec 、
-7 -1 -7 -1
5×10 sec 或10 sec 的解离速率(k(off))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。在其
3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1
它的实施方案中，IGF-1R结合部分以大于或等于10M sec 、5×10M sec 、10M sec 或
4 -1 -1
5×10M sec 的结合速率(k(on))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。可选地，IGF-1R结
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
合部分以大于或等于10M sec 、5×10M sec 、10M sec 或5×10M sec 或10M sec
的结合速率(k(on))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。
-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1
部分以小于或等于5×10 sec 、10 sec 、5×10 sec 或10 sec 5×10 sec 、10 sec 、
-7 -1 -7 -1
5×10 sec 或10 sec 的解离速率(k(off))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。在其
3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1
它的实施方案中，IGF-1R结合部分以大于或等于10M sec 、5×10M sec 、10M sec 或
4 -1 -1
5×10M sec 的结合速率(k(on))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。可选地，IGF-1R结
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
合部分以大于或等于10M sec 、5×10M sec 、10M sec 或5×10M sec 或10M sec
的结合速率(k(on))结合IGF-1R多肽或其片段或变体。
[0310] 在各种实施方案中，IGF-1R结合部分作用为拮抗IGF-1R的活性。在某些实施方案中，例如，IGF-1R结合部分对表达在肿瘤细胞上的IGF-1R的结合具有以下的至少一种活
性：抑制胰岛素生长因子例如IGF-1、IGF-2或IGF-1和IGF-2二者对IGF-1R的结合；促进
IGF-1R的内化从而抑制其信号传导能力；抑制IGF-1R的磷酸化；抑制在IGF-1R信号传导
途径下游的分子例如Akt或p42/44 MAPK的磷酸化；抑制肿瘤细胞增殖；抑制肿瘤细胞运
动；和/或抑制肿瘤细胞转移。
性：抑制胰岛素生长因子例如IGF-1、IGF-2或IGF-1和IGF-2二者对IGF-1R的结合；促进
IGF-1R的内化从而抑制其信号传导能力；抑制IGF-1R的磷酸化；抑制在IGF-1R信号传导
途径下游的分子例如Akt或p42/44 MAPK的磷酸化；抑制肿瘤细胞增殖；抑制肿瘤细胞运
动；和/或抑制肿瘤细胞转移。
[0311] 在一个实施方案中，结合部分包括IGF-1R抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，结合部分包括来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，结合部分包括来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，结合部分包括来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，结合部分包括来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，结合部分包括来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文描述了可被包含在主题IGF-1R结合部分(或结合分
子)中的示例性的CDR(参见例如，表3和表4)。
子)中的示例性的CDR(参见例如，表3和表4)。
[0312] 本文还描述了包括至少一个CDR的示例性的抗体分子，其中所述CDR可被包含在主题IGF-1R结合分子(或结合部分)中。在某些实施方案中，可以检查重链和/或轻链可变
结构域的氨基酸序列以通过本领域熟知的方法来鉴定互补决定区(CDR)的序列，其中所述
方法例如将其与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行对比以确定具有序列超变
性的区域。使用常规的重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入骨架区例如人类骨架区以形
成人源化结合特异性。所述骨架区可以是天然存在的或共有的骨架区，并优选地为人类骨
架区(关于人类骨架区的列表，参见例如Chothia等人，J.Mol.Biol.278：457-479(1998))。
优选地，由骨架区和CDR的结合所产生的多核苷酸编码这样的抗体，其特异性地结合至期
望的多肽例如IGF-1R的至少一个表位。优选地，可在骨架区中制备一个或多个氨基酸取
代，并且优选地，所述氨基酸取代促进抗体与其抗原的结合。另外，这种方法可被用来制备参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以便产生缺少一
个或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其它改变被包括在本发明中并且在本领域的
技术之内。
结构域的氨基酸序列以通过本领域熟知的方法来鉴定互补决定区(CDR)的序列，其中所述
方法例如将其与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行对比以确定具有序列超变
性的区域。使用常规的重组DNA技术，可将一个或多个CDR插入骨架区例如人类骨架区以形
成人源化结合特异性。所述骨架区可以是天然存在的或共有的骨架区，并优选地为人类骨
架区(关于人类骨架区的列表，参见例如Chothia等人，J.Mol.Biol.278：457-479(1998))。
优选地，由骨架区和CDR的结合所产生的多核苷酸编码这样的抗体，其特异性地结合至期
望的多肽例如IGF-1R的至少一个表位。优选地，可在骨架区中制备一个或多个氨基酸取
代，并且优选地，所述氨基酸取代促进抗体与其抗原的结合。另外，这种方法可被用来制备参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以便产生缺少一
个或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其它改变被包括在本发明中并且在本领域的
技术之内。
[0313] 在一个实施方案中，本发明提供编码结合分子或结合部分的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括、基本上由或者由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸所组成，
其中所述重链可变区的至少一个CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文公
开的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、
85％、90％、95％或100％相同。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多
核苷酸编码的VH。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的单克
隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、
95％或100％相同。因此，根据此实施方案，重链可变区(如，本发明的结合分子或结合部
分的重链可变区)具有与表3所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序
列：
其中所述重链可变区的至少一个CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文公
开的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、
85％、90％、95％或100％相同。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多
核苷酸编码的VH。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的单克
隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、
95％或100％相同。因此，根据此实施方案，重链可变区(如，本发明的结合分子或结合部
分的重链可变区)具有与表3所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序
列：
[0314] 表3：参考VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列*
[0315]抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M12-E01 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT PY SIG VR
CTCTCCTTACTCTATGCTTTGG SML SSGGST G11HYD
GTTCGCCAAGCTCCTGGTAAA (SEQ ID RYADSV ILIGRNL
GGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
ATCGGTTCTTCTGGTGGCTCTA NO：5) KG(SEQ YYYYM
CTCGTTATGCTGACTCCGTTA ID NO：6) DV(SEQ
AAGGTCGCTTCACTATCTCTA
GAGACAACTCTAAGAATACTC ID NO：7)
TCTACTTGCAGATGAACAGCT
TAAGGGCTGAGGACACCGCCA
TGTATTACTGTGCACGGGTAC
GGGGGATCCTTCATTACGATA
TTTTGATTGGTAGAAATCTCT
ACTACTACTACATGGACGTCT
GGGGCAAAGGGACCACGGTC
ACCGTCTCAAGC(SEQ ID
NO：3)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSPYSMLWVRQAPGK
GLEWVSSIGSSGGSTRYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTAMYYCARVRG11HYDILI
GRNLYYYYMDVWGKGTTVTV
SS(SEQ ID NO：4)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M12-G04 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT KY SIV DR
CTCTAAGTACACTATGCATTG TMH SSGGW SIAAAG
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID TDYADS TGWSV
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTTC
TATCGTTTCTTCTGGTGGCTGG NO：10) VKG SFVDW
ACTGATTATGCTGACTCCGTT (SEQ ID FDP
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：11) (SEQ ID
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC NO：12)
TTAAGGGCTGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAGAT
CGGAGTATAGCAGCAGCTGGT
ACCGGTTGGTCTGTGAGTTTT
GTGGACTGGTTCGACCCCTGG
GGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCAAGC(SEQ ID NO：8)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSKYTMHWVRQAPGK
GLEWVSSIVSSGGWTDYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
RAEDTAVYYCARDRSIAAAGT
GWSVSFVDWFDPWGQGTLVT
VSS(SEQ ID NO：9)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M13-C06 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT IY GIS WS
CTCTATTTACCGTATGCAGTG RMQ PSGGTT GGSGY
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID WYADS AFDI
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTGG
TATCTCTCCTTCTGGTGGCACT NO：15) VKG (SEQ ID
ACTTGGTATGCTGACTCCGTT (SEQ ID NO：17)
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：16)
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC
TTAAGGGCTGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGATGG
AGCGGGGGTTCGGGCTATGCT
TTTGATATCTGGGGCCAAGGG
ACAATGGTCACCGTCTCAAGC
(SEQ ID NO：13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTF SIYRMQWVRQAPGK
GLEWVSGISPSGGTTWYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARWSGGSGYAF
DIWGQGTMVTVSS(SEQ ID
NO：14)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M13-C06 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC IY GIS WS
TTCAGCATTTACCGTATGCAG RMQ PSGGTT GGSGY
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID WYADS AFDI
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
GGTATCTCTCCCTCTGGTGGC NO：15) VKG (SEQ ID
ACGACGTGGTATGCTGACTCC (SEQ ID NO：17)
GTGAAGGGCCGGTTCACAATC NO：16)
TCCAGAGACAATTCCAAGAAC
ACTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCTGAGGATACT
GCAGTGTACTACTGCGCCAGA
TGGTCCGGGGGCTCCGGATAC
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
GCCTTCGACATCTGGGGACAG
GGAACCATGGTCACCGTCTCA
AGC(SEQ ID NO：18)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSIYRMQWVRQAPGK
GLEWVSGISPSGGTTWYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARWSGGSGYAF
DIWGQGTMVTVSS(SEQ ID
NO：14)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M14-B01 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT NY VIS AG
CTCTAATTACCATATGGCTTG HMA PTGGRT YSYGY
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID TYADSV GYFDY
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTGT
TATCTCTCCTACTGGTGGCCGT NO：21) KG(SEQ (SEQ ID
ACTACTTATGCTGACTCCGTT ID NO：23)
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：22)
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC
TTAAGGGCTGAGGACACAGCC
ACATATTACTGTGCGAGAGCG
GGGTACAGCTATGGTTATGGC
TACTTTGACTACTGGGGCCAG
GGAACCCTGGTCACCGTCTCA
AGC(SEQ ID NO：19)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSNYHMAWVRQAPGK
GLEWVSVISPTGGRTTYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTATYYCARAGYSYGYGYF
DYWGQGTLVTVSS(SEQ ID
NO：20)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M14-B01 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC NY VIS AG
TTCAGCAATTACCACATGGCC HMA PTGGRT YSYGY
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID TYADSV GYFDY
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
GTGATCTCTCCTACCGGTGGC NO：21) KG(SEQ (SEQ ID
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
AGGACCACTTACGCTGACTCC ID NO：23)
GTGAAGGGCCGGTTCACAATC NO：22)
TCCAGAGACAATTCCAAGAAC
ACTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCTGAGGATACT
GCAACATACTACTGCGCCAGA
GCCGGGTACTCCTACGGCTAC
GGATACTTCGACTACTGGGGA
CAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCAAGC(SEQ ID NO：24)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS
CAASGFTFSNYHMAWVRQAP
GKGLEWVSVISPTGGRTTYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTATYYCARAGYS
YGYGYFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO：20)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M14-C03 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT KY YIS DG
CTCTAAGTACATGATGTCTTG MMS PSGGLT ARGYG
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID WYADS MDV
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTTA
TATCTCTCCTTCTGGTGGCCTT NO：27) VKG (SEQ ID
ACTTGGTATGCTGACTCCGTT (SEQ ID NO：29)
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：28)
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC
TTAAGGGCTGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAGAT
GGAGCTAGAGGCTACGGTATG
GACGTCTGGGGCCAAGGGACC
ACGGTCACCGTCTCAAGC
(SEQ ID NO：25)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSKYMMSWVRQAPGK
GLEWVSYISPSGGLTWYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARDGARGYGM
DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID
NO：26)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M14-C03 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC KY YIS DG
TTCAGCAAGTACATGATGTCT MMS PSGGLT ARGYG
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID WYADS MDV
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
TATATCTCTCCCTCTGGTGGCC NO：27) VKG (SEQ ID
TGACGTGGTATGCTGACTCCG (SEQ ID NO：29)
TGAAGGGCCGGTTCACAATCT NO：28)
CCAGAGACAATTCCAAGAACA
CTCTGTACCTGCAAATGAACA
GCCTGAGAGCTGAGGATACTG
CAGTGTACTACTGCGCCAGAG
ATGGGGCTAGAGGATACGGA
ATGGACGTCTGGGGACAGGG
AACCACCGTCACCGTCTCAAG
C(SEQ ID NO：30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS
CAASGFTFSKYMMSWVRQAP
GKGLEWVSYISPSGGLTWYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARDGAR
GYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：26)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M14-G11 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT NY RIS DR
CTCTAATTACCCTATGTATTGG PMY SSGGRT WSRSA
GTTCGCCAAGCTCCTGGTAAA (SEQ ID VYADS AEYGL
GGTTTGGAGTGGGTTTCTCGT
ATCTCTTCTTCTGGTGGCCGTA NO：33) VKG GGY
CTGTTTATGCTGACTCCGTTAA (SEQ ID (SEQ ID
AGGTCGCTTCACTATCTCTAG NO：34) NO：35)
AGACAACTCTAAGAATACTCT
CTACTTGCAGATGAACAGCTT
AAGGGCTGAGGACACGGCCG
TGTATTACTGTGCGAGAGATC
GATGGTCCAGATCTGCAGCTG
AATATGGGTTGGGTGGCTACT
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCA
CCGTCTCAAGC(SEQ ID
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
NO：31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSNYPMYWVRQAPGK
GLEWVSRISSSGGRTVYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTAVYYCARDRWSRSAAEY
GLGGYWGQGTLVTVSS(SEQ
ID NO：32)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M14-G11 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC NY RIS DR
TTCAGCAATTACCCCATGTAC PMY SSGGRT WSRSA
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID VYADS AEYGL
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
AGGATCTCTAGCAGCGGTGGC NO：33) VKG GGY
AGGACCGTGTACGCTGACTCC (SEQ ID (SEQ ID
GTGAAGGGCCGGTTCACAATC NO：34) NO：35)
TCCAGAGACAATTCCAAGAAC
ACTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCTGAGGATACT
GCAGTGTACTACTGCGCCAGA
GATAGGTGGTCCAGATCTGCA
GCCGAGTACGGACTGGGGGG
CTACTGGGGACAGGGAACCCT
GGTCACCGTCTCAAGC(SEQ
ID NO：36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSNYPMYWVRQAPGK
GLEWVSRISSSGGRTVYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTAVYYCARDRWSRSAAEY
GLGGYWGQGTLVTVSS(SEQ
ID NO：32)
P2A7.3E11 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT DYVIN IYPGNE GLYYY
GGACCTGAGCTAGTGAAGCCT (SEQ ID NTYYN GSRTRT
GGGGCTTCAGTGAAGATGTCC NO：39) EKFKG MDY
TGCAAGGCTTCTGGAAACACA (SEQ ID (SEQ ID
TTCACTGACTATGTTATAAAC NO：40) NO：41)
TGGGTGAAGCAGAGAACTGG
ACAGGGCCTTGAGTGGATTGG
AGAGATTTATCCTGGAAATGA
AAATACTTATTACAATGAGAA
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
GTTCAAGGGCAAGGCCACACT
GACTGCAGACAAATCCTCCAA
CACAGCCTACATGCAGCTCAG
TAGCCTGACATCTGAGGACTC
TGCGGTCTATTTCTGTGCAAG
AGGGATTTATTACTACGGTAG
TAGGACGAGGACTATGGACTA
CTGGGGTCAAGGAACCTCAGT
CACCGTCTCCTCA(SEQ ID
NO：37)
QVQLQQSGPELVKPGASVKMS
CKASGNTFTDYVINWVKQRTG
QGLEWIGEIYPGNENTYYNEKF
KGKATLTADKSSNTAYMQLSS
LTSEDSAVYFCARGLYYYGSRT
RTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ
ID NO：38)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
20C8.3B8 GACGTCCAACTGCAGGAGTCT SGYSW YIHYSG SGYGY
GGACCTGACCTGGTGAAACCT H(SEQ GTNYN RSAYYF
TCTCAGTCACTTTCACTCACCT ID PSLKS DY(SEQ
GCACTGTCACTGGCTACTCCA NO：44) (SEQ ID ID
TCACCAGTGGTTATAGCTGGC NO：45) NO：46)
ACTGGATCCGGCAGTTTCCAG
GAAACAAACTGGAATGGATG
GGCTACATACACTACAGTGGT
GGCACTAACTACAACCCATCT
CTCAAAAGTCGAATCTCTATC
ACTCGAGACACATCCAAGAAC
CAGTTCTTCCTCCAGTTGAATT
CTGTGACTACTGAGGACACAG
CCACATATTACTGTGCAAGAT
CGGGGTACGGCTACAGGAGTG
CGTACTATTTTGACTACTGGG
GCCAAGGGACCACGGTCACCG
TCTCCTCA(SEQ ID NO：42)
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTC
TVTGYSITSGYSWHWIRQFPGN
KLEWMGYIHYSGGTNYNPSLK
SRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT
EDTATYYCARSGYGYRSAYYF
DYWGQGTTVTVSS(SEQ ID
NO：43)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
P1A2.2B11 CAAATACAGTTGGTTCAGAGC NHGMN NTSTGE PLYYM
GGACCTGAGCTGAAGAAGCCT (SEQ ID PTYAD YGRYID
GGAGAGACAGTCAAGATCTCC NO：49) DFKG V(SEQ
TGCAAGGCTTCTGGGTATACC (SEQ ID ID
TTCACAAACCATGGAATGAAC NO：50) NO：51)
TGGGTGAAGCAGGCTCCAGGA
AAGGGTTTAAAGTGGATGGGC
TGGATAAACACCTCCACTGGA
GAGCCAACATATGCTGATGAC
TTCAAGGGACGTTTTGCCTTCT
CTTTGGAAACCTCTGCCAGCA
CTGCCTTTTTGCAGATCAACA
ACCTCAAAAATGAGGACACG
GCTTCATATTTCTGTGCAAGTC
CCCTCTACTATATGTACGGGC
GGTATATCGATGTCTGGGGCG
CAGGGACCGCGGTCACCGTCT
CCTCA(SEQ ID NO：47)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCK
ASGYTFTNHGMNWVKQAPGK
GLKWMGWNTSTGEPTYADDF
KGRFAFSLETSASTAFLQINNLK
NEDTASYFCASPLYYMYGRYID
VWGAGTAVTVSS(SEQ ID
NO：48)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
20D8.24B11 ACGTCCAACTGCAGGAGTCTG SGYSW YIHYSG SGYGY
GACCTGACCTGGTGAAACCTT H(SEQ GTNYN RSAYYF
CTCAGTCACTTTCACTCACCTG ID PSLKS DY(SEQ
CACTGTCACTGGCTACTCCAT NO：54) (SEQ ID ID
CACCAGTGGTTATAGCTGGCA NO：55) NO：56)
CTGGATCCGGCAGTTTCCAGG
AAACAAACTGGAATGGATGG
GCTACATACACTACAGTGGTG
GCACTAACTACAACCCATCTC
TCAAAAGTCGAATCTCTATCA
CTCGAGACACATCCAAGAACC
AGTTCTTCCTCCAGTTGAATTC
TGTGACTACTGAGGACACAGC
CACATATTACTGTGCAAGATC
GGGGTACGGCTACAGGAGTG
(SEQ ID NO：52)
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTC
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
TVTGYSITSGYSWHWIRQFPGN
KLEWMGYIHYSGGTNYNPSLK
SRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT
EDTATYYCARSGYGYRSAYYF
DYWGQGTTLTVSS(SEQ ID
NO：53)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
P1G10.2B8 CAGATCCAGTTGGTGCAGTCT NHGMN WINTNT PLYYRN
GGACCTGACCTGAAGAAGCCT (SEQ ID GEPTYA GRYFD
GGAGAGACAGTCAAGATCTCC NO：59) DDFKG V(SEQ
TGCAAGGCTTCTGGGTATACC (SEQ ID ID
TTCACAAACCATGGAATGAAC NO：60) NO：61)
TGGGTGAAGCAGGCTCCAGGA
AAGGATTTAAAGTGGATGGGC
TGGATAAACACCAACACTGGA
GAGCCAACATATGCTGATGAC
TTCAAGGGACGGTTTGCCTTC
TCTTTGGAAACCTCTGCCAGC
ACTGCCTATTTGCAGATCAAC
AACCTCAAAAATGAGGACAC
GGCTACATATTTCTGTGCAAG
TCCCCTCTACTATAGGAACGG
GCGATACTTCGATGTCTGGGG
CGCAGGGACCACGGTCACCGT
CTCC(SEQ ID NO：57)
QIQLVQSGPDLKKPGETVKISC
KASGYTFTNHGMNWVKQAPG
KDLKWMGWINTNTGEPTYAD
DFKGRFAFSLETSASTAYLQINN
LKNEDTATYFCASPLYYRNGR
YFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID
NO：58)
P1E2.3B12 SYWMH EINPTY LVRLRY
(SEQ ID GRSNY FDV
CAGGTCCAACTGCAGCA NO：64) NEKFKS (SEQ ID
(SEQ ID NO：66)
GCCTGGGGCTGAACTGGTGAA NO：65)
GCCTGGGGCTTCAGTGAAGCT
GTCCTGTAAGGCTTCTGGCTA
CACCTTCACCAGCTACTGGAT
GCACTGGGTGAAGCAGAGGC
CTGGACAAGGCCTTGAGTGGA
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
TTGGAGAGATTAATCCTACCT
ACGGTCGTAGTAATTACAATG
AGAAGTTCAAGAGTAAGGCC
ACACTGACTGTAGACAAATCC
TCCAGCACAGCCTACATGCAA
CTCAGCAGCCTGACATCTGAG
GACTCTGCGGTCTATTACTGT
GCAAGATTAGTACGCCTACGG
TACTTCGATGTCTGGGGCGCA
GGGACCACGGTCACCGTCTCC
TCA(SEQ ID NO：62)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLS
CKASGYTFTSYWMHWVKQRP
GQGLEWIGEINPTYGRSNYNEK
FKSKATLTVDKSSSTAYMQLSS
LTSEDSAVYYCARLVRLRYFDV
WGAGTTVTVSS(SEQ ID
NO：63)
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M12-E01 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT PY SIG VR
CTCTCCTTACTCTATGCTTTGG SML SSGGST G11HYD
GTTCGCCAAGCTCCTGGTAAA (SEQ ID RYADSV ILIGRNL
GGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
ATCGGTTCTTCTGGTGGCTCTA NO：5) KG(SEQ YYYYM
CTCGTTATGCTGACTCCGTTA ID NO：6) DV(SEQ
AAGGTCGCTTCACTATCTCTA
GAGACAACTCTAAGAATACTC ID NO：7)
TCTACTTGCAGATGAACAGCT
TAAGGGCTGAGGACACCGCCA
TGTATTACTGTGCACGGGTAC
GGGGGATCCTTCATTACGATA
TTTTGATTGGTAGAAATCTCT
ACTACTACTACATGGACGTCT
GGGGCAAAGGGACCACGGTC
ACCGTCTCAAGC(SEQ ID
NO：3)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSPYSMLWVRQAPGK
GLEWVSSIGSSGGSTRYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTAMYYCARVRG11HYDILI
GRNLYYYYMDVWGKGTTVTV
SS(SEQ ID NO：4)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M12-G04 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT KY SIV DR
CTCTAAGTACACTATGCATTG TMH SSGGW SIAAAG
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID TDYADS TGWSV
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTTC
TATCGTTTCTTCTGGTGGCTGG NO：10) VKG SFVDW
ACTGATTATGCTGACTCCGTT (SEQ ID FDP
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：11) (SEQ ID
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC NO：12)
TTAAGGGCTGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAGAT
CGGAGTATAGCAGCAGCTGGT
ACCGGTTGGTCTGTGAGTTTT
GTGGACTGGTTCGACCCCTGG
GGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCAAGC(SEQ ID NO：8)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSKYTMHWVRQAPGK
GLEWVSSIVSSGGWTDYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
RAEDTAVYYCARDRSIAAAGT
GWSVSFVDWFDPWGQGTLVT
VSS(SEQ ID NO：9)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M13-C06 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT IY GIS WS
CTCTATTTACCGTATGCAGTG RMQ PSGGTT GGSGY
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID WYADS AFDI
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTGG
TATCTCTCCTTCTGGTGGCACT NO：15) VKG (SEQ ID
ACTTGGTATGCTGACTCCGTT (SEQ ID NO：17)
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：16)
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC
TTAAGGGCTGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGATGG
AGCGGGGGTTCGGGCTATGCT
TTTGATATCTGGGGCCAAGGG
ACAATGGTCACCGTCTCAAGC
(SEQ ID NO：13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTF SIYRMQWVRQAPGK
GLEWVSGISPSGGTTWYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARWSGGSGYAF
DIWGQGTMVTVSS(SEQ ID
NO：14)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M13-C06 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC IY GIS WS
TTCAGCATTTACCGTATGCAG RMQ PSGGTT GGSGY
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID WYADS AFDI
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
GGTATCTCTCCCTCTGGTGGC NO：15) VKG (SEQ ID
ACGACGTGGTATGCTGACTCC (SEQ ID NO：17)
GTGAAGGGCCGGTTCACAATC NO：16)
TCCAGAGACAATTCCAAGAAC
ACTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCTGAGGATACT
GCAGTGTACTACTGCGCCAGA
TGGTCCGGGGGCTCCGGATAC
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
GCCTTCGACATCTGGGGACAG
GGAACCATGGTCACCGTCTCA
AGC(SEQ ID NO：18)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSIYRMQWVRQAPGK
GLEWVSGISPSGGTTWYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARWSGGSGYAF
DIWGQGTMVTVSS(SEQ ID
NO：14)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M14-B01 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT NY VIS AG
CTCTAATTACCATATGGCTTG HMA PTGGRT YSYGY
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID TYADSV GYFDY
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTGT
TATCTCTCCTACTGGTGGCCGT NO：21) KG(SEQ (SEQ ID
ACTACTTATGCTGACTCCGTT ID NO：23)
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：22)
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC
TTAAGGGCTGAGGACACAGCC
ACATATTACTGTGCGAGAGCG
GGGTACAGCTATGGTTATGGC
TACTTTGACTACTGGGGCCAG
GGAACCCTGGTCACCGTCTCA
AGC(SEQ ID NO：19)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSNYHMAWVRQAPGK
GLEWVSVISPTGGRTTYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTATYYCARAGYSYGYGYF
DYWGQGTLVTVSS(SEQ ID
NO：20)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M14-B01 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC NY VIS AG
TTCAGCAATTACCACATGGCC HMA PTGGRT YSYGY
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID TYADSV GYFDY
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
GTGATCTCTCCTACCGGTGGC NO：21) KG(SEQ (SEQ ID
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
AGGACCACTTACGCTGACTCC ID NO：23)
GTGAAGGGCCGGTTCACAATC NO：22)
TCCAGAGACAATTCCAAGAAC
ACTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCTGAGGATACT
GCAACATACTACTGCGCCAGA
GCCGGGTACTCCTACGGCTAC
GGATACTTCGACTACTGGGGA
CAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCAAGC(SEQ ID NO：24)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS
CAASGFTFSNYHMAWVRQAP
GKGLEWVSVISPTGGRTTYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTATYYCARAGYS
YGYGYFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO：20)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M14-C03 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT KY YIS DG
CTCTAAGTACATGATGTCTTG MMS PSGGLT ARGYG
GGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA (SEQ ID WYADS MDV
AGGTTTGGAGTGGGTTTCTTA
TATCTCTCCTTCTGGTGGCCTT NO：27) VKG (SEQ ID
ACTTGGTATGCTGACTCCGTT (SEQ ID NO：29)
AAAGGTCGCTTCACTATCTCT NO：28)
AGAGACAACTCTAAGAATACT
CTCTACTTGCAGATGAACAGC
TTAAGGGCTGAGGACACGGCC
GTGTATTACTGTGCGAGAGAT
GGAGCTAGAGGCTACGGTATG
GACGTCTGGGGCCAAGGGACC
ACGGTCACCGTCTCAAGC
(SEQ ID NO：25)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSKYMMSWVRQAPGK
GLEWVSYISPSGGLTWYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARDGARGYGM
DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID
NO：26)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M14-C03 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC KY YIS DG
TTCAGCAAGTACATGATGTCT MMS PSGGLT ARGYG
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID WYADS MDV
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
TATATCTCTCCCTCTGGTGGCC NO：27) VKG (SEQ ID
TGACGTGGTATGCTGACTCCG (SEQ ID NO：29)
TGAAGGGCCGGTTCACAATCT NO：28)
CCAGAGACAATTCCAAGAACA
CTCTGTACCTGCAAATGAACA
GCCTGAGAGCTGAGGATACTG
CAGTGTACTACTGCGCCAGAG
ATGGGGCTAGAGGATACGGA
ATGGACGTCTGGGGACAGGG
AACCACCGTCACCGTCTCAAG
C(SEQ ID NO：30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS
CAASGFTFSKYMMSWVRQAP
GKGLEWVSYISPSGGLTWYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARDGAR
GYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：26)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
M14-G11 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCT
GGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT
GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTT
GCGCTGCTTCCGGATTCACTTT NY RIS DR
CTCTAATTACCCTATGTATTGG PMY SSGGRT WSRSA
GTTCGCCAAGCTCCTGGTAAA (SEQ ID VYADS AEYGL
GGTTTGGAGTGGGTTTCTCGT
ATCTCTTCTTCTGGTGGCCGTA NO：33) VKG GGY
CTGTTTATGCTGACTCCGTTAA (SEQ ID (SEQ ID
AGGTCGCTTCACTATCTCTAG NO：34) NO：35)
AGACAACTCTAAGAATACTCT
CTACTTGCAGATGAACAGCTT
AAGGGCTGAGGACACGGCCG
TGTATTACTGTGCGAGAGATC
GATGGTCCAGATCTGCAGCTG
AATATGGGTTGGGTGGCTACT
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCA
CCGTCTCAAGC(SEQ ID
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
NO：31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSNYPMYWVRQAPGK
GLEWVSRISSSGGRTVYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTAVYYCARDRWSRSAAEY
GLGGYWGQGTLVTVSS(SEQ
ID NO：32)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
优化的 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCC
M14-G11 GGCGGTGGCCTGGTGCAGCCT
GGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGCGCAGCTAGCGGCTTCACC NY RIS DR
TTCAGCAATTACCCCATGTAC PMY SSGGRT WSRSA
TGGGTGCGCCAGGCTCCTGGA (SEQ ID VYADS AEYGL
AAGGGGCTGGAGTGGGTTTCC
AGGATCTCTAGCAGCGGTGGC NO：33) VKG GGY
AGGACCGTGTACGCTGACTCC (SEQ ID (SEQ ID
GTGAAGGGCCGGTTCACAATC NO：34) NO：35)
TCCAGAGACAATTCCAAGAAC
ACTCTGTACCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCTGAGGATACT
GCAGTGTACTACTGCGCCAGA
GATAGGTGGTCCAGATCTGCA
GCCGAGTACGGACTGGGGGG
CTACTGGGGACAGGGAACCCT
GGTCACCGTCTCAAGC(SEQ
ID NO：36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC
AASGFTFSNYPMYWVRQAPGK
GLEWVSRISSSGGRTVYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR
AEDTAVYYCARDRWSRSAAEY
GLGGYWGQGTLVTVSS(SEQ
ID NO：32)
P2A7.3E11 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT DYVIN IYPGNE GLYYY
GGACCTGAGCTAGTGAAGCCT (SEQ ID NTYYN GSRTRT
GGGGCTTCAGTGAAGATGTCC NO：39) EKFKG MDY
TGCAAGGCTTCTGGAAACACA (SEQ ID (SEQ ID
TTCACTGACTATGTTATAAAC NO：40) NO：41)
TGGGTGAAGCAGAGAACTGG
ACAGGGCCTTGAGTGGATTGG
AGAGATTTATCCTGGAAATGA
AAATACTTATTACAATGAGAA
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
GTTCAAGGGCAAGGCCACACT
GACTGCAGACAAATCCTCCAA
CACAGCCTACATGCAGCTCAG
TAGCCTGACATCTGAGGACTC
TGCGGTCTATTTCTGTGCAAG
AGGGATTTATTACTACGGTAG
TAGGACGAGGACTATGGACTA
CTGGGGTCAAGGAACCTCAGT
CACCGTCTCCTCA(SEQ ID
NO：37)
QVQLQQSGPELVKPGASVKMS
CKASGNTFTDYVINWVKQRTG
QGLEWIGEIYPGNENTYYNEKF
KGKATLTADKSSNTAYMQLSS
LTSEDSAVYFCARGLYYYGSRT
RTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ
ID NO：38)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
20C8.3B8 GACGTCCAACTGCAGGAGTCT SGYSW YIHYSG SGYGY
GGACCTGACCTGGTGAAACCT H(SEQ GTNYN RSAYYF
TCTCAGTCACTTTCACTCACCT ID PSLKS DY(SEQ
GCACTGTCACTGGCTACTCCA NO：44) (SEQ ID ID
TCACCAGTGGTTATAGCTGGC NO：45) NO：46)
ACTGGATCCGGCAGTTTCCAG
GAAACAAACTGGAATGGATG
GGCTACATACACTACAGTGGT
GGCACTAACTACAACCCATCT
CTCAAAAGTCGAATCTCTATC
ACTCGAGACACATCCAAGAAC
CAGTTCTTCCTCCAGTTGAATT
CTGTGACTACTGAGGACACAG
CCACATATTACTGTGCAAGAT
CGGGGTACGGCTACAGGAGTG
CGTACTATTTTGACTACTGGG
GCCAAGGGACCACGGTCACCG
TCTCCTCA(SEQ ID NO：42)
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTC
TVTGYSITSGYSWHWIRQFPGN
KLEWMGYIHYSGGTNYNPSLK
SRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT
EDTATYYCARSGYGYRSAYYF
DYWGQGTTVTVSS(SEQ ID
NO：43)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
P1A2.2B11 CAAATACAGTTGGTTCAGAGC NHGMN NTSTGE PLYYM
GGACCTGAGCTGAAGAAGCCT (SEQ ID PTYAD YGRYID
GGAGAGACAGTCAAGATCTCC NO：49) DFKG V(SEQ
TGCAAGGCTTCTGGGTATACC (SEQ ID ID
TTCACAAACCATGGAATGAAC NO：50) NO：51)
TGGGTGAAGCAGGCTCCAGGA
AAGGGTTTAAAGTGGATGGGC
TGGATAAACACCTCCACTGGA
GAGCCAACATATGCTGATGAC
TTCAAGGGACGTTTTGCCTTCT
CTTTGGAAACCTCTGCCAGCA
CTGCCTTTTTGCAGATCAACA
ACCTCAAAAATGAGGACACG
GCTTCATATTTCTGTGCAAGTC
CCCTCTACTATATGTACGGGC
GGTATATCGATGTCTGGGGCG
CAGGGACCGCGGTCACCGTCT
CCTCA(SEQ ID NO：47)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCK
ASGYTFTNHGMNWVKQAPGK
GLKWMGWNTSTGEPTYADDF
KGRFAFSLETSASTAFLQINNLK
NEDTASYFCASPLYYMYGRYID
VWGAGTAVTVSS(SEQ ID
NO：48)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
20D8.24B11 ACGTCCAACTGCAGGAGTCTG SGYSW YIHYSG SGYGY
GACCTGACCTGGTGAAACCTT H(SEQ GTNYN RSAYYF
CTCAGTCACTTTCACTCACCTG ID PSLKS DY(SEQ
CACTGTCACTGGCTACTCCAT NO：54) (SEQ ID ID
CACCAGTGGTTATAGCTGGCA NO：55) NO：56)
CTGGATCCGGCAGTTTCCAGG
AAACAAACTGGAATGGATGG
GCTACATACACTACAGTGGTG
GCACTAACTACAACCCATCTC
TCAAAAGTCGAATCTCTATCA
CTCGAGACACATCCAAGAACC
AGTTCTTCCTCCAGTTGAATTC
TGTGACTACTGAGGACACAGC
CACATATTACTGTGCAAGATC
GGGGTACGGCTACAGGAGTG
(SEQ ID NO：52)
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTC
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
TVTGYSITSGYSWHWIRQFPGN
KLEWMGYIHYSGGTNYNPSLK
SRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT
EDTATYYCARSGYGYRSAYYF
DYWGQGTTLTVSS(SEQ ID
NO：53)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
P1G10.2B8 CAGATCCAGTTGGTGCAGTCT NHGMN WINTNT PLYYRN
GGACCTGACCTGAAGAAGCCT (SEQ ID GEPTYA GRYFD
GGAGAGACAGTCAAGATCTCC NO：59) DDFKG V(SEQ
TGCAAGGCTTCTGGGTATACC (SEQ ID ID
TTCACAAACCATGGAATGAAC NO：60) NO：61)
TGGGTGAAGCAGGCTCCAGGA
AAGGATTTAAAGTGGATGGGC
TGGATAAACACCAACACTGGA
GAGCCAACATATGCTGATGAC
TTCAAGGGACGGTTTGCCTTC
TCTTTGGAAACCTCTGCCAGC
ACTGCCTATTTGCAGATCAAC
AACCTCAAAAATGAGGACAC
GGCTACATATTTCTGTGCAAG
TCCCCTCTACTATAGGAACGG
GCGATACTTCGATGTCTGGGG
CGCAGGGACCACGGTCACCGT
CTCC(SEQ ID NO：57)
QIQLVQSGPDLKKPGETVKISC
KASGYTFTNHGMNWVKQAPG
KDLKWMGWINTNTGEPTYAD
DFKGRFAFSLETSASTAYLQINN
LKNEDTATYFCASPLYYRNGR
YFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID
NO：58)
P1E2.3B12 SYWMH EINPTY LVRLRY
(SEQ ID GRSNY FDV
CAGGTCCAACTGCAGCA NO：64) NEKFKS (SEQ ID
(SEQ ID NO：66)
GCCTGGGGCTGAACTGGTGAA NO：65)
GCCTGGGGCTTCAGTGAAGCT
GTCCTGTAAGGCTTCTGGCTA
CACCTTCACCAGCTACTGGAT
GCACTGGGTGAAGCAGAGGC
CTGGACAAGGCCTTGAGTGGA
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
抗体 VH序列PN/PP(VH-CDR1、 VH VH VH
VH-CDR2和VH-CDR3，加下划 CDR1 CDR2 CDR3
线)
TTGGAGAGATTAATCCTACCT
ACGGTCGTAGTAATTACAATG
AGAAGTTCAAGAGTAAGGCC
ACACTGACTGTAGACAAATCC
TCCAGCACAGCCTACATGCAA
CTCAGCAGCCTGACATCTGAG
GACTCTGCGGTCTATTACTGT
GCAAGATTAGTACGCCTACGG
TACTTCGATGTCTGGGGCGCA
GGGACCACGGTCACCGTCTCC
TCA(SEQ ID NO：62)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLS
CKASGYTFTSYWMHWVKQRP
GQGLEWIGEINPTYGRSNYNEK
FKSKATLTVDKSSSTAYMQLSS
LTSEDSAVYYCARLVRLRYFDV
WGAGTTVTVSS(SEQ ID
NO：63)
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325]*
[0326] 由Kabat系统所确定(参见上文)。
[0327] N＝核苷酸序列，P＝多肽序列。
[0328] 如本领域所知，通过比较一条多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二条多肽或多核苷酸的序列来确定两条多肽或两条多核苷酸之间的“序列同一性”。当在本文中被
讨论时，可使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定任何特定的多肽是否与另
一条多肽至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述计算机程序/软件例如但不限于BESTFIT程序(威斯康辛序列分
析包，用于Unix的第8版，Genetics Computer Group，UniVersity Research Park，575
ScienceDrive，Madison，WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)中的局部同源性算法来找到两条序列之间最佳的同源区
段。当使用BESTFIT或任何其它序列对比程序来确定特定序列是否与本发明的参考序列例
如95％相同时，毫无疑问地设置参数以针对参考多肽序列的全长来计算同一性百分比，并
且允许参考序列中氨基酸总数的至多5％的同源性间隔。
讨论时，可使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定任何特定的多肽是否与另
一条多肽至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述计算机程序/软件例如但不限于BESTFIT程序(威斯康辛序列分
析包，用于Unix的第8版，Genetics Computer Group，UniVersity Research Park，575
ScienceDrive，Madison，WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)中的局部同源性算法来找到两条序列之间最佳的同源区
段。当使用BESTFIT或任何其它序列对比程序来确定特定序列是否与本发明的参考序列例
如95％相同时，毫无疑问地设置参数以针对参考多肽序列的全长来计算同一性百分比，并
且允许参考序列中氨基酸总数的至多5％的同源性间隔。
[0329] 在某些实施方案中，含有由多核苷酸编码的VH的结合分子或结合部分特异性地或优先地结合至IGF-1R。在某些实施方案中，改变编码VH多肽的核苷酸序列而不改变其
编码的氨基酸序列。例如，可以修改序列以提高给定物种中的密码子选择，从而除去剪接位点，或除去限制酶位点。像这些的序列优化被描述在实施例中，并且是本领域普通技术人员所熟知的和常规地进行的。
编码的氨基酸序列。例如，可以修改序列以提高给定物种中的密码子选择，从而除去剪接位点，或除去限制酶位点。像这些的序列优化被描述在实施例中，并且是本领域普通技术人员所熟知的和常规地进行的。
[0330] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸所组成，在其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与显示在表3中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同的多肽序列。因此，本发明的结合
部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VH。在某些实施方案中，含有由多核苷
酸编码的VH的结合分子或结合部分特异性地或优先地结合至IGF-1R。
部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VH。在某些实施方案中，含有由多核苷
酸编码的VH的结合分子或结合部分特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0331] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的结合部分或结合分子，其特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体
或片段与IGF-1R的结合。
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体
或片段与IGF-1R的结合。
[0332] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的结合部分或结合分子，其以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地
或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7
于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7
于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
[0333] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸所组成，其中所述轻链可变区的至少一个VL-CDR
或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链
VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。可选
地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻
链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。因
此，根据此实施方案，轻链可变区(如本发明的结合部分或结合分子的轻链可变区)具有与
表4所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：
或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链
VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。可选
地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻
链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。因
此，根据此实施方案，轻链可变区(如本发明的结合部分或结合分子的轻链可变区)具有与
表4所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：
[0334] 表4：参考VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列*
[0335]抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M12-E01 CAGTACGAATTGACTCAGCC
GCCCTCGGTGTCTGAGGCCC
CCCGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGTTCTGGAAGCAGCTCC SGS YD AA
AACATCGGAAATAATGCTAT SSNIGNN DLLPS WDDNL
AAACTGGTACCAGCAACTCC AIN(SEQ (SEQ ID NGVI
CAGGAAAGCCTCCCAAACTC
CTCATCTATTATGATGATCTG ID NO：70) (SEQ ID
TTGCCCTCAGGGGTCTCTGAC NO：69) NO：71)
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCT
GGCACCTCAGGCTCCCTGGC
CATCAGTGGGCTGCAGTCTG
AGGATGAGGCTGATTATTAC
TGTGCAGCATGGGATGACAA
CCTGAATGGTGTGATTTTCGG
CGGAGGGACCAAGCTGACCG
TCCTA(SEQ ID NO：67)
QYELTQPPSVSEAPRQRVTISC
SGSSSNIGNNAINWYQQLPGK
PPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSG
SKSGTSGSLAISGLQSEDEADY
YCAAWDDNLNGVIFGGGTKL
TVL(SEQ ID NO：68)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M12-G04 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCACTCTCCCTGTCTGCATC
TGTAGGAGACAGAGTCACCA
TCACTTGCCGGGCAAGTCAG RAS AT QQ
AGCATTAACGGCTACTTAAA QSINGYL SSLQS SYSTPP
TTGGTATCAGCAGAAACCAG N(SEQ (SEQ ID YT(SEQ
GGAAAGCCCCTAACCTCCTG
ATCTACGCTACATCCAGTTTG ID NO：75) ID
CAAAGTGGGGTCCCATCAAG NO：74) NO：76)
GTTCAGTGGCAGTGGATCTG
GGACAGATTTCACTCTCACC
ATCAGCAGTCTGCAACCTGA
AGATTTTGCAACTTACTACTG
TCAACAGAGTTACAGTACCC
CCCCGTACACTTTTGGCCAGG
GGACCAAGCTGGAGATCAAA
(SEQ ID NO：72)
DIQMTQSPLSLSASVGDRVTIT
CRASQSINGYLNWYQQKPGK
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
APNLLIYATSSLQSGVPSRFSG
SGSGTDFTLTISSLQPEDFATY
YCQQSYSTPPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO：73)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M13-C06 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCACTCTCCCTGTCTGCATC
TGTAGGAGACAGAGTCACCA
TCACTTGCCAGGCGAGTCGG QAS DA QQ
GACATTAGAAACTATTTAAA RDIRNYL SSLQT FDSLPH
TTGGTATCAACAAAAACCAG N(SEQ (SEQ ID T(SEQ
GGAAAGCCCCGAAGCTCCTG
ATCTACGATGCATCCAGTTTG ID NO：80) ID
CAAACAGGGGTCCCATCAAG NO：79) NO：81)
GTTCGGTGGCAGTGGATCTG
GGACAGACTTTAGTTTCACC
ATCGGCAGCCTGCAGCCTGA
AGATATTGCAACATATTACT
GTCAACAGTTTGATAGTCTCC
CTCACACTTTTGGCCAGGGG
ACCAAACTGGAGATCAAA
(SEQ ID NO：77)
DIQMTQSPLSLSASVGDRVTIT
CQASRDIRNYLNWYQQKPGK
APKLLIYDASSLQTGVPSRFGG
SGSGTDFSFTIGSLQPEDIATYY
CQQFDSLPHTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO：78)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M14-B01 GACATCCAGATGACCCAGTT
TCCAGCCACCCTGTCTGTGTC
TCCAGGGGAAAGAGCCACCC
TCTCCTGCAGGGCCAGTCAG RAS GA HQ
AGTGTTATGAGGAACTTAGC QSVMRN SKRAT RSTWPL
CTGGTACCAGCAGAAACCTG LA(SEQ (SEQ ID GT(SEQ
GCCAGCCTCCCAGGCTCCTC
ATCTATGGTGCATCCAAAAG ID NO：85) ID
GGCCACTGGCATCCCAGCCA NO：84) NO：86)
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACAGCCTTCACTCTCAC
CATCAGCAACCTAGAGCCTG
AAGATTTTGCAGTTTATTACT
GTCACCAACGTAGCACCTGG
CCTCTGGGGACTTTCGGCCCT
GGGACCAAACTGGAGGCCAA
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
A(SEQ ID NO：82)
DIQMTQFPATLSVSPGERATLS
CRASQSVMRNLAWYQQKPGQ
PPRLLIYGASKRATGIPARFSGS
GSGTAFTLTISNLEPEDFAVYY
CHQRSTWPLGTFGPGTKLEAK
(SEQ ID NO：83)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M14-C03 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCAGCCACCCTGTCTTTGTC
TCCAGGGGAAAGAGCCACCC
TCTCCTGCAGGGCCAGTCAG RAS DA QQ
AGTGTTAGCAGCTACTTAGC QSVSSYL SNRAT RSNWPP
CTGGTACCAACAGAAACCTG A(SEQ (SEQ ID EVT
GCCAGGCTCCCAGGCTCCTC
ATCTATGATGCATCCAACAG ID NO：90) (SEQ ID
GGCCACTGGCATCCCAGCCA NO：89) NO：91)
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACAGACTTCACTCTCAC
CATCAGCAGCCTAGAGCCTG
AAGATTTTGCAGTTTATTACT
GTCAGCAGCGTAGCAACTGG
CCTCCGGAGGTCACTTTCGGC
CCTGGGACCAAAGTGGATAT
CAAA(SEQ ID NO：87)
DIQMTQSPATLSLSPGERATLS
CRASQSVSSYLAWYQQKPGQ
APRLLIYDASNRATGIPARFSG
SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVY
YCQQRSNWPPEVTFGPGTKVD
IK(SEQ ID NO：88)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M14-G11 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCAGACTCCCTGGCTGTGTC
TCTGGGCGAGAGGGCCACCA
TCAACTGCAAGTCCAGCCAG KSS LA QQ
AGTGTTTTATACAGCTCCAAC QSVLYSS STRES YYSTW
AATAAGAACTACTTAGCTTG NNKNYL (SEQ ID T(SEQ
GTACCAGCAGAAACCAGGAC
AGCCTCCTAAGCTGCTCATTT A(SEQ NO：95) ID
ACTTGGCATCTACCCGGGAA ID NO：96)
TCCGGGGTCCCTGACCGATTC NO：94)
AGTGGCAGCGGGTCTGGGAC
AGATTTCACTCTCACCATCAG
CAGCCTGCAGGCTGAAGATG
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
TGGCAGTTTATTACTGTCAGC
AATATTATAGTACTTGGACGT
TCGGCCAAGGGACCAAGGTG
GAAATCAAA(SEQ ID NO：92)
DIQMTQSPDSLAVSLGERATIN
CKSSQSVLYSSNNKNYLAWY
QQKPGQPPKLLIYLASTRESGV
PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE
DVAVYYCQQYYSTWTFGQGT
KVEIK(SEQ ID NO：93)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
P2A7.3E11 GAAGTTGTGCTCACCCAGTCT SASSTLS RTSNLA QQGSSI
CCAACCGCCATGGCTGCATC SNYLH S(SEQ PLT
TCCCGGGGAGAAGATCACTA (SEQ ID ID (SEQ ID
TCACCTGCAGTGCCAGCTCA NO：99) NO：100) NO：101)
ACTTTAAGTTCCAATTACTTG
CATTGGTATCAGCAGAAGCC
AGGATTCTCCCCTAAACTCTT
GATTTATAGGACATCCAATCT
GGCCTCTGGAGTCCCAGGTC
GCTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACCTCTTACTCTCTCACA
ATTGGCACCATGGAGGCTGA
AGATGTTGCCACTTACTACTG
CCAGCAGGGTAGTAGTATAC
CGCTCACGTTCGGTGCTGGG
ACCAAGCTGGAGCTGAAG
(SEQ ID NO：97)
EVVLTQSPTAMAASPGEKITIT
CSASSTLSSNYLHWYQQKPGF
SPKLLIYRTSNLASGVPGRFSG
SGSGTSYSLTIGTMEAEDVAT
YYCQQGSSIPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO：98)
20C8.3B8 GACATTGTGCTGACACAGTC RASKSVS LASNLE QHSREL
TCCTGCTTCCTTAGCTGTATC TSAYSY S(SEQ PYT
TCTGGGGCAGAGGGCCACCA MH(SEQ ID (SEQ ID
TCTCATGCAGGGCCAGCAAA ID NO：105) NO：106)
AGTGTCAGTACATCTGCCTAT NO：104)
AGTTATATGCACTGGTACCA
ACAGAAACCAGGACAGCCAC
CCAAACTCCTCATCTATCTTG
CATCCAACCTAGAATCTGGG
GTCCCTGCCAGGTTCAGTGG
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
CAGTGGGTCTGGGACAGACT
TCACCCTCAACATCCATCCTG
TGGAGGAGGAGGATGCTGCA
ACCTATTACTGTCAGCACAGT
AGGGAGCTTCCGTATACGTT
CGGAGGGGGGACCAAGCTGG
AAATC(SEQ ID NO：102)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS
CRASKSVSTSAYSYMHWYQQ
KPGQPPKLLIYLASNLESGVPA
RF SGSGSGTDFTLNIHPVEEED
AATYYCQHSRELPYTFGGGTK
LEIK(SEQ ID NO：103)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
P1A2.2B11 GATATCCAGATGACACAGAC RASQDIS TSRLHS QQGKT
TACATCCTCCCTATCTGCCTC NYLN (SEQ ID LPWT
TCTGGGAGACAGAGTCACCA (SEQ ID NO：110) (SEQ ID
TCAGTTGCAGGGCAAGTCAG NO：109) NO：111)
GACATTAGCAATTATTTAAA
CTGGTATCAGCAGAAACCAG
ATGGAACTATTAAACTCCTG
ATCTACTACACATCAAGATT
ACACTCAGGAGTCCCATCAA
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGAACAGATTATTCTCTCACC
ATTAGCAACCTGGAACAAGA
AGATTTTGCCACTTACTTTTG
CCAACAGGGTAAAACGCTTC
CGTGGACGTTCGGTGGAGGC
ACCAAGCTGGAAATCAAA
(SEQ ID NO：107)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTIS
CRASQDISNYLNWYQQKPDGT
IKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDYSLTISNLEQEDFATYFC
QQGKTLPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO：108)
20D8.24B11 与20C8相同
P1G10.2B8 GATATCCAGATGACACAGAC RASQDIS TSRLH QQGKT
TACATCCTCCCTGTCTGCCTC NYLN (SEQ ID LPWT
TCTGGGAGACAGAGTCACCA (SEQ ID NO：115) (SEQ ID
TCAGTTGCAGGGCAAGTCAG NO：114) NO：116)
GACATTAGTAATTATTTAAAT
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
TGGTATCAGCAGAAACCAGA
TGGATCTGTTAAACTCCTGAT
CTACTACACATCAAGATTAC
ACTCAGGAGTCCCATCAAGG
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGG
AACAGATTATTCTCTCACCAT
TAGCAACCTGGAACAAGAAG
ATATTGCCACTTACTTTTGCC
AACAGGGAAAGACGCTTCCG
TGGACGTTCGGTGGAGGCAC
CAAGCTGGAAATCAAA(SEQ
ID NO：112)
DIQMTQTTS SLSASLGDRVTIS
CRASQDISNYLNWYQQKPDGS
VKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGS
GSGTDYSLTISNLEQEDIATYF
CQQGKTLPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO：113)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
P1E2.3B12 GATATTGTGATGACGCAGGC RSSKSLL QMSNL AQNLEL
TGCATTCTCCAATCCAGTCAC HSNGITY AS(SEQ PYT
TCTTGGAACATCAGCTTCCAT LY(SEQ ID (SEQ ID
CTCCTGCAGGTCTAGTAAGA ID NO：120) NO：121)
GTCTCCTACATAGTAATGGC NO：119)
ATCACTTATTTGTATTGGTAT
CTGCAGAAGCCAGGCCAGTC
TCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAG
GAGTCCCAGACAGGTTCAGT
AGCAGTGGGTCAGGAACTGA
TTTCACACTGAGAATCAGCA
GAGTGGAGGCTGAGGATGTG
GGTGTTTATTACTGTGCTCAA
AATCTAGAACTTCCGTACAC
GTTCGGAGGGGGGACCAAGC
TGGAAATCAAA(SEQ ID
NO：117)
DIVMTQAAFSNPVTLGTS
ASISCRSSKSLLHSNGITYLYW
YLQKPGQSPQLLIYQMSNLAS
GVPDRFSSSGSGTDFTLRISRV
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
EAEDVGVYYCAQNLELPYTFG
GGTKLEIK(SEQ ID NO：118)
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M12-E01 CAGTACGAATTGACTCAGCC
GCCCTCGGTGTCTGAGGCCC
CCCGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGTTCTGGAAGCAGCTCC SGS YD AA
AACATCGGAAATAATGCTAT SSNIGNN DLLPS WDDNL
AAACTGGTACCAGCAACTCC AIN(SEQ (SEQ ID NGVI
CAGGAAAGCCTCCCAAACTC
CTCATCTATTATGATGATCTG ID NO：70) (SEQ ID
TTGCCCTCAGGGGTCTCTGAC NO：69) NO：71)
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCT
GGCACCTCAGGCTCCCTGGC
CATCAGTGGGCTGCAGTCTG
AGGATGAGGCTGATTATTAC
TGTGCAGCATGGGATGACAA
CCTGAATGGTGTGATTTTCGG
CGGAGGGACCAAGCTGACCG
TCCTA(SEQ ID NO：67)
QYELTQPPSVSEAPRQRVTISC
SGSSSNIGNNAINWYQQLPGK
PPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSG
SKSGTSGSLAISGLQSEDEADY
YCAAWDDNLNGVIFGGGTKL
TVL(SEQ ID NO：68)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M12-G04 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCACTCTCCCTGTCTGCATC
TGTAGGAGACAGAGTCACCA
TCACTTGCCGGGCAAGTCAG RAS AT QQ
AGCATTAACGGCTACTTAAA QSINGYL SSLQS SYSTPP
TTGGTATCAGCAGAAACCAG N(SEQ (SEQ ID YT(SEQ
GGAAAGCCCCTAACCTCCTG
ATCTACGCTACATCCAGTTTG ID NO：75) ID
CAAAGTGGGGTCCCATCAAG NO：74) NO：76)
GTTCAGTGGCAGTGGATCTG
GGACAGATTTCACTCTCACC
ATCAGCAGTCTGCAACCTGA
AGATTTTGCAACTTACTACTG
TCAACAGAGTTACAGTACCC
CCCCGTACACTTTTGGCCAGG
GGACCAAGCTGGAGATCAAA
(SEQ ID NO：72)
DIQMTQSPLSLSASVGDRVTIT
CRASQSINGYLNWYQQKPGK
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
APNLLIYATSSLQSGVPSRFSG
SGSGTDFTLTISSLQPEDFATY
YCQQSYSTPPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO：73)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M13-C06 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCACTCTCCCTGTCTGCATC
TGTAGGAGACAGAGTCACCA
TCACTTGCCAGGCGAGTCGG QAS DA QQ
GACATTAGAAACTATTTAAA RDIRNYL SSLQT FDSLPH
TTGGTATCAACAAAAACCAG N(SEQ (SEQ ID T(SEQ
GGAAAGCCCCGAAGCTCCTG
ATCTACGATGCATCCAGTTTG ID NO：80) ID
CAAACAGGGGTCCCATCAAG NO：79) NO：81)
GTTCGGTGGCAGTGGATCTG
GGACAGACTTTAGTTTCACC
ATCGGCAGCCTGCAGCCTGA
AGATATTGCAACATATTACT
GTCAACAGTTTGATAGTCTCC
CTCACACTTTTGGCCAGGGG
ACCAAACTGGAGATCAAA
(SEQ ID NO：77)
DIQMTQSPLSLSASVGDRVTIT
CQASRDIRNYLNWYQQKPGK
APKLLIYDASSLQTGVPSRFGG
SGSGTDFSFTIGSLQPEDIATYY
CQQFDSLPHTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO：78)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M14-B01 GACATCCAGATGACCCAGTT
TCCAGCCACCCTGTCTGTGTC
TCCAGGGGAAAGAGCCACCC
TCTCCTGCAGGGCCAGTCAG RAS GA HQ
AGTGTTATGAGGAACTTAGC QSVMRN SKRAT RSTWPL
CTGGTACCAGCAGAAACCTG LA(SEQ (SEQ ID GT(SEQ
GCCAGCCTCCCAGGCTCCTC
ATCTATGGTGCATCCAAAAG ID NO：85) ID
GGCCACTGGCATCCCAGCCA NO：84) NO：86)
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACAGCCTTCACTCTCAC
CATCAGCAACCTAGAGCCTG
AAGATTTTGCAGTTTATTACT
GTCACCAACGTAGCACCTGG
CCTCTGGGGACTTTCGGCCCT
GGGACCAAACTGGAGGCCAA
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
A(SEQ ID NO：82)
DIQMTQFPATLSVSPGERATLS
CRASQSVMRNLAWYQQKPGQ
PPRLLIYGASKRATGIPARFSGS
GSGTAFTLTISNLEPEDFAVYY
CHQRSTWPLGTFGPGTKLEAK
(SEQ ID NO：83)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M14-C03 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCAGCCACCCTGTCTTTGTC
TCCAGGGGAAAGAGCCACCC
TCTCCTGCAGGGCCAGTCAG RAS DA QQ
AGTGTTAGCAGCTACTTAGC QSVSSYL SNRAT RSNWPP
CTGGTACCAACAGAAACCTG A(SEQ (SEQ ID EVT
GCCAGGCTCCCAGGCTCCTC
ATCTATGATGCATCCAACAG ID NO：90) (SEQ ID
GGCCACTGGCATCCCAGCCA NO：89) NO：91)
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACAGACTTCACTCTCAC
CATCAGCAGCCTAGAGCCTG
AAGATTTTGCAGTTTATTACT
GTCAGCAGCGTAGCAACTGG
CCTCCGGAGGTCACTTTCGGC
CCTGGGACCAAAGTGGATAT
CAAA(SEQ ID NO：87)
DIQMTQSPATLSLSPGERATLS
CRASQSVSSYLAWYQQKPGQ
APRLLIYDASNRATGIPARFSG
SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVY
YCQQRSNWPPEVTFGPGTKVD
IK(SEQ ID NO：88)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
M14-G11 GACATCCAGATGACCCAGTC
TCCAGACTCCCTGGCTGTGTC
TCTGGGCGAGAGGGCCACCA
TCAACTGCAAGTCCAGCCAG KSS LA QQ
AGTGTTTTATACAGCTCCAAC QSVLYSS STRES YYSTW
AATAAGAACTACTTAGCTTG NNKNYL (SEQ ID T(SEQ
GTACCAGCAGAAACCAGGAC
AGCCTCCTAAGCTGCTCATTT A(SEQ NO：95) ID
ACTTGGCATCTACCCGGGAA ID NO：96)
TCCGGGGTCCCTGACCGATTC NO：94)
AGTGGCAGCGGGTCTGGGAC
AGATTTCACTCTCACCATCAG
CAGCCTGCAGGCTGAAGATG
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
TGGCAGTTTATTACTGTCAGC
AATATTATAGTACTTGGACGT
TCGGCCAAGGGACCAAGGTG
GAAATCAAA(SEQ ID NO：92)
DIQMTQSPDSLAVSLGERATIN
CKSSQSVLYSSNNKNYLAWY
QQKPGQPPKLLIYLASTRESGV
PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE
DVAVYYCQQYYSTWTFGQGT
KVEIK(SEQ ID NO：93)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
P2A7.3E11 GAAGTTGTGCTCACCCAGTCT SASSTLS RTSNLA QQGSSI
CCAACCGCCATGGCTGCATC SNYLH S(SEQ PLT
TCCCGGGGAGAAGATCACTA (SEQ ID ID (SEQ ID
TCACCTGCAGTGCCAGCTCA NO：99) NO：100) NO：101)
ACTTTAAGTTCCAATTACTTG
CATTGGTATCAGCAGAAGCC
AGGATTCTCCCCTAAACTCTT
GATTTATAGGACATCCAATCT
GGCCTCTGGAGTCCCAGGTC
GCTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGGACCTCTTACTCTCTCACA
ATTGGCACCATGGAGGCTGA
AGATGTTGCCACTTACTACTG
CCAGCAGGGTAGTAGTATAC
CGCTCACGTTCGGTGCTGGG
ACCAAGCTGGAGCTGAAG
(SEQ ID NO：97)
EVVLTQSPTAMAASPGEKITIT
CSASSTLSSNYLHWYQQKPGF
SPKLLIYRTSNLASGVPGRFSG
SGSGTSYSLTIGTMEAEDVAT
YYCQQGSSIPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO：98)
20C8.3B8 GACATTGTGCTGACACAGTC RASKSVS LASNLE QHSREL
TCCTGCTTCCTTAGCTGTATC TSAYSY S(SEQ PYT
TCTGGGGCAGAGGGCCACCA MH(SEQ ID (SEQ ID
TCTCATGCAGGGCCAGCAAA ID NO：105) NO：106)
AGTGTCAGTACATCTGCCTAT NO：104)
AGTTATATGCACTGGTACCA
ACAGAAACCAGGACAGCCAC
CCAAACTCCTCATCTATCTTG
CATCCAACCTAGAATCTGGG
GTCCCTGCCAGGTTCAGTGG
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
CAGTGGGTCTGGGACAGACT
TCACCCTCAACATCCATCCTG
TGGAGGAGGAGGATGCTGCA
ACCTATTACTGTCAGCACAGT
AGGGAGCTTCCGTATACGTT
CGGAGGGGGGACCAAGCTGG
AAATC(SEQ ID NO：102)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS
CRASKSVSTSAYSYMHWYQQ
KPGQPPKLLIYLASNLESGVPA
RF SGSGSGTDFTLNIHPVEEED
AATYYCQHSRELPYTFGGGTK
LEIK(SEQ ID NO：103)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
P1A2.2B11 GATATCCAGATGACACAGAC RASQDIS TSRLHS QQGKT
TACATCCTCCCTATCTGCCTC NYLN (SEQ ID LPWT
TCTGGGAGACAGAGTCACCA (SEQ ID NO：110) (SEQ ID
TCAGTTGCAGGGCAAGTCAG NO：109) NO：111)
GACATTAGCAATTATTTAAA
CTGGTATCAGCAGAAACCAG
ATGGAACTATTAAACTCCTG
ATCTACTACACATCAAGATT
ACACTCAGGAGTCCCATCAA
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
GGAACAGATTATTCTCTCACC
ATTAGCAACCTGGAACAAGA
AGATTTTGCCACTTACTTTTG
CCAACAGGGTAAAACGCTTC
CGTGGACGTTCGGTGGAGGC
ACCAAGCTGGAAATCAAA
(SEQ ID NO：107)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTIS
CRASQDISNYLNWYQQKPDGT
IKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDYSLTISNLEQEDFATYFC
QQGKTLPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO：108)
20D8.24B11 与20C8相同
P1G10.2B8 GATATCCAGATGACACAGAC RASQDIS TSRLH QQGKT
TACATCCTCCCTGTCTGCCTC NYLN (SEQ ID LPWT
TCTGGGAGACAGAGTCACCA (SEQ ID NO：115) (SEQ ID
TCAGTTGCAGGGCAAGTCAG NO：114) NO：116)
GACATTAGTAATTATTTAAAT
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
TGGTATCAGCAGAAACCAGA
TGGATCTGTTAAACTCCTGAT
CTACTACACATCAAGATTAC
ACTCAGGAGTCCCATCAAGG
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGG
AACAGATTATTCTCTCACCAT
TAGCAACCTGGAACAAGAAG
ATATTGCCACTTACTTTTGCC
AACAGGGAAAGACGCTTCCG
TGGACGTTCGGTGGAGGCAC
CAAGCTGGAAATCAAA(SEQ
ID NO：112)
DIQMTQTTS SLSASLGDRVTIS
CRASQDISNYLNWYQQKPDGS
VKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGS
GSGTDYSLTISNLEQEDIATYF
CQQGKTLPWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO：113)
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
P1E2.3B12 GATATTGTGATGACGCAGGC RSSKSLL QMSNL AQNLEL
TGCATTCTCCAATCCAGTCAC HSNGITY AS(SEQ PYT
TCTTGGAACATCAGCTTCCAT LY(SEQ ID (SEQ ID
CTCCTGCAGGTCTAGTAAGA ID NO：120) NO：121)
GTCTCCTACATAGTAATGGC NO：119)
ATCACTTATTTGTATTGGTAT
CTGCAGAAGCCAGGCCAGTC
TCCTCAGCTCCTGATTTATCA
GATGTCCAACCTTGCCTCAG
GAGTCCCAGACAGGTTCAGT
AGCAGTGGGTCAGGAACTGA
TTTCACACTGAGAATCAGCA
GAGTGGAGGCTGAGGATGTG
GGTGTTTATTACTGTGCTCAA
AATCTAGAACTTCCGTACAC
GTTCGGAGGGGGGACCAAGC
TGGAAATCAAA(SEQ ID
NO：117)
DIVMTQAAFSNPVTLGTS
ASISCRSSKSLLHSNGITYLYW
YLQKPGQSPQLLIYQMSNLAS
GVPDRFSSSGSGTDFTLRISRV
抗体 VL序列PN/PP(VL-CDR1、 VL CDR1 VL VL
VL-CDR2和VL-CDR3序列，加 CDR2 CDR3
下划线)
EAEDVGVYYCAQNLELPYTFG
GGTKLEIK(SEQ ID NO：118)
[0336]
[0337]
[0338]
[0339]
[0340]
[0341]
[0342] *由Kabat系统所确定(参见上文)。
[0343] PN＝核苷酸序列，PP＝多肽序列。
[0344] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸所组成，在其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与显示在表4中的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团相同的多肽序列。因此，本发明的结合
部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VL。在某些实施方案中，含有由多核苷
酸编码的VL的结合部分(或结合分子)特异性地或优先地结合至IGF-1R。
部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VL。在某些实施方案中，含有由多核苷
酸编码的VL的结合部分(或结合分子)特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0345] 在又一方面，本发明提供分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸所组成，在其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区是由与编码显示在表4中的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团的核苷酸序列相同的核苷酸序列所编码的。
因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VL。在某些实施方
案中，含有由多核苷酸编码的VL的结合部分或结合分子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VL。在某些实施方
案中，含有由多核苷酸编码的VL的结合部分或结合分子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0346] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的结合部分或结合分子，其特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体
或片段与IGF-1R的结合。
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体
或片段与IGF-1R的结合。
[0347] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的结合部分(或结合分子)，其以解离常数(KD)所表征的亲和力
特异性地或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6
数(KD)不 大 于 5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
特异性地或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6
数(KD)不 大 于 5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
[0348] 在进一步的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码VH的核酸所组成，其中所述VH与参考VH多肽序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考VH多肽序列选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VH。
在某些实施方案中，含有由多核苷酸编码的VH的结合部分或结合分子特异性地或优先地
结合至IGF-1R。
在某些实施方案中，含有由多核苷酸编码的VH的结合部分或结合分子特异性地或优先地
结合至IGF-1R。
[0349] 在另一方面，本发明包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码VH的核酸序列所组成，其中所述VH具有选自SEQ IDNO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63所组成的组的多肽序列。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸
编码的VH。在某些实施方案中，含有由多核苷酸编码的VH的结合部分或结合分子特异性地
或优先地结合至IGF-1R。
编码的VH。在某些实施方案中，含有由多核苷酸编码的VH的结合部分或结合分子特异性地
或优先地结合至IGF-1R。
[0350] 在进一步的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码VH的核酸所组成，其中所述核酸与参考核酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考核酸序列选自SEQ ID NO：3、8、13、18、19、24、25、30、31、36、37、42、47、52、57和62所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码
的VH。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VH的结合部分或结合分子特异性地
或优先地结合至IGF-1R。
的VH。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VH的结合部分或结合分子特异性地
或优先地结合至IGF-1R。
[0351] 在另一方面，本发明包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码本发明VH的核酸序列所组成，其中所述VH的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63所组成的组。本发明还包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码本发明VH的核酸序列所组成，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO：3、8、13、18、19、24、25、
30、31、36、37、42、47、52、57和62所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VH。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VH的结合
部分或结合分子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
30、31、36、37、42、47、52、57和62所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VH。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VH的结合
部分或结合分子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0352] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的结合部分或结合分子，其特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆
抗体或片段与IGF-1R的结合，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体与IGF-1R的结合。
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆
抗体或片段与IGF-1R的结合，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体与IGF-1R的结合。
[0353] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VH所组成的结合部分或结合分子，其以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地
或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7
于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7
于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
[0354] 在进一步的实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码VL的核酸所组成，其中所述核酸与参考VL多肽序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考VL多肽序列具有选自SEQ ID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118所组成的组的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明包括分离的多核
苷酸，其包括，基本上由或者由编码VL的核酸所组成，其中所述核酸与参考核酸序列至少
80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考核酸序列选自SEQ ID NO：67、72、77、82、
87、92、97、102、107、112和117所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VL。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VL的结合部
分或结合分子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
苷酸，其包括，基本上由或者由编码VL的核酸所组成，其中所述核酸与参考核酸序列至少
80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考核酸序列选自SEQ ID NO：67、72、77、82、
87、92、97、102、107、112和117所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多核苷酸编码的VL。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VL的结合部
分或结合分子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0355] 在另一方面，本发明包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码VL的核酸序列所组成，其中所述VL具有选自SEQ IDNO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和
118所组成的组的多肽序列。本发明还包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码本发明VL的核酸序列所组成，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO：67、72、77、82、87、92、97、
102、107、112和117所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多
核苷酸编码的VL。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VL的结合部分或结合分
子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
118所组成的组的多肽序列。本发明还包括分离的多核苷酸，其包括，基本上由或者由编码本发明VL的核酸序列所组成，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO：67、72、77、82、87、92、97、
102、107、112和117所组成的组。因此，本发明的结合部分(或结合分子)可包含由所述多
核苷酸编码的VL。在某些实施方案中，含有由这种多核苷酸编码的VL的结合部分或结合分
子特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0356] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的结合部分或结合分子，其特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆
抗体或片段与IGF-1R的结合。
抗体片段(选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)
或杂交瘤(选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆
抗体或片段与IGF-1R的结合。
[0357] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由被一种或多种上述多核苷酸编码的VL所组成的结合部分或结合分子，其以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地
或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7
于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
或优先地结合至IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大
-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7
于5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-13 -13 -14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
[0358] 上述多核苷酸中的任一个还可包括编码例如信号肽的另外的核酸以指导被编码的多肽、本文所述抗体恒定区或本文所述其它异源性多肽的分泌。
[0359] 而且，如本文其它地方更详细所述，本发明包括含有一种或多种上述的多核苷酸的组合物。在一个实施方案中，本发明包括含有第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码本文所述的VH多肽而且其中所述第二多核苷酸编码本文所述的
VL多肽。特别地，组合物包括，基本上由或者由VH多核苷酸和VL多核苷酸所组成，其中所
述VH多核苷酸和VL多核苷酸编码分别与参考VL和VL多肽氨基酸序列至少80％、85％、
90％、95％或100％相同的多肽，其中所述参考VL和VL多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO：4
和68、8和73、14和78、20和83、26和88、32和93、38和98、43和103、48和108、53和103、
58和113以及63和118所组成的组。或者可选地，组合物包括，基本上由或者由VH多核
苷酸和VL多核苷酸所组成，其中所述VH多核苷酸和VL 多核苷酸分别与参考VL和VL核
酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考VL和VL核酸序列选自SEQ IDNO：3和67、8和72、13和77、18和77、19和82、24和82、25和87、30和87、31和92、36
和92、37和97、42和102、47和107、58和102、57和112以及62和117所组成的组。在某
些实施方案中，含有由这种组合物中的多核苷酸所编码的VH和VL的抗体或抗原结合片段
特异性地或优先地结合至IGF-1R。
VL多肽。特别地，组合物包括，基本上由或者由VH多核苷酸和VL多核苷酸所组成，其中所
述VH多核苷酸和VL多核苷酸编码分别与参考VL和VL多肽氨基酸序列至少80％、85％、
90％、95％或100％相同的多肽，其中所述参考VL和VL多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO：4
和68、8和73、14和78、20和83、26和88、32和93、38和98、43和103、48和108、53和103、
58和113以及63和118所组成的组。或者可选地，组合物包括，基本上由或者由VH多核
苷酸和VL多核苷酸所组成，其中所述VH多核苷酸和VL 多核苷酸分别与参考VL和VL核
酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考VL和VL核酸序列选自SEQ IDNO：3和67、8和72、13和77、18和77、19和82、24和82、25和87、30和87、31和92、36
和92、37和97、42和102、47和107、58和102、57和112以及62和117所组成的组。在某
些实施方案中，含有由这种组合物中的多核苷酸所编码的VH和VL的抗体或抗原结合片段
特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0360] 可通过本领域任何已知方法来产生或制造多核苷酸。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么可以从化学合成的低聚核苷酸(例如如Kutmeier等人，BioTechniques
17：242(1994)中所述)组装编码抗体的多核苷酸，其简单地包括合成重叠的含有编码抗体
的序列部分的低聚核苷酸，将那些低聚核苷酸退火并连接，并且然后将连接的低聚核苷酸
通过PCR进行扩增。
17：242(1994)中所述)组装编码抗体的多核苷酸，其简单地包括合成重叠的含有编码抗体
的序列部分的低聚核苷酸，将那些低聚核苷酸退火并连接，并且然后将连接的低聚核苷酸
通过PCR进行扩增。
[0361] 可选地，可以由来自适合来源的核酸产生编码IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆是不可得的但是已知抗体分
子的序列，那么可以化学合成或者从适合的来源(例如抗体cDNA文库，或者从表达所述抗
体或其它IGF-1R抗体的任何组织或细胞所产生的cDNA文库或所分离的核酸优选为poly
A+RNA，其中所述组织或细胞例如被选来表达抗体的杂交瘤细胞)获得编码抗体的核酸以
便从编码所述抗体或其它IGF-1R抗体的cDNA文库鉴定例如cDNA克隆，其通过使用可与序
列的3’和5’端杂交的合成引物的PCR扩增或者通过使用对特定基因序列有特异性的低聚
核苷酸探针的克隆。然后使用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增的核酸克隆进可复
制的克隆载体。
子的序列，那么可以化学合成或者从适合的来源(例如抗体cDNA文库，或者从表达所述抗
体或其它IGF-1R抗体的任何组织或细胞所产生的cDNA文库或所分离的核酸优选为poly
A+RNA，其中所述组织或细胞例如被选来表达抗体的杂交瘤细胞)获得编码抗体的核酸以
便从编码所述抗体或其它IGF-1R抗体的cDNA文库鉴定例如cDNA克隆，其通过使用可与序
列的3’和5’端杂交的合成引物的PCR扩增或者通过使用对特定基因序列有特异性的低聚
核苷酸探针的克隆。然后使用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增的核酸克隆进可复
制的克隆载体。
[0362] 一旦确定了IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，可以使用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、位点定
向诱变、PCR等(参见例如在Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，
N.Y.(1990)和Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学
最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1998)中所描述的技术，其二者都通过引用以其整体被并入本文)来操作它的核苷酸序列以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基
酸取代、缺失和/或插入。
向诱变、PCR等(参见例如在Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，
N.Y.(1990)和Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学
最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1998)中所描述的技术，其二者都通过引用以其整体被并入本文)来操作它的核苷酸序列以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基
酸取代、缺失和/或插入。
[0363] 编码IGF-结合分子的多核苷酸可由多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸所组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，编码IGF-结合分子的多
核苷酸可由单和双链DNA、作为单和双链区域的混合物的DNA、单和双链RNA以及作为单和
双链区域的混合物的RNA、包括可能是单链或更通常地是双链的DNA和RNA或者单和双链
区域混合物在内的杂交分子所组成。另外，编码IGF-结合分子的多核苷酸可由三链区域所
组成，其包括RNA或DNA或RNA和DNA二者。编码IGF-结合分子的多核苷酸还可含有一个
或多个被修饰的碱基或者为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA骨架。“被修饰的”
碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基例如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修
饰；因此，“多核苷酸”包括化学地、酶促地或代谢地修饰的形式。
核苷酸可由单和双链DNA、作为单和双链区域的混合物的DNA、单和双链RNA以及作为单和
双链区域的混合物的RNA、包括可能是单链或更通常地是双链的DNA和RNA或者单和双链
区域混合物在内的杂交分子所组成。另外，编码IGF-结合分子的多核苷酸可由三链区域所
组成，其包括RNA或DNA或RNA和DNA二者。编码IGF-结合分子的多核苷酸还可含有一个
或多个被修饰的碱基或者为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA骨架。“被修饰的”
碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基例如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修
饰；因此，“多核苷酸”包括化学地、酶促地或代谢地修饰的形式。
[0364] 可通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入被编码的蛋白来产生编码衍生自免疫球蛋白的
多肽(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离的多核苷酸。可以通过
标准的技术例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。优选地，在一个或多个非必
需氨基酸残基上进行保守的氨基酸取代。
多肽(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离的多核苷酸。可以通过
标准的技术例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。优选地，在一个或多个非必
需氨基酸残基上进行保守的氨基酸取代。
[0365] 本发明还涉及构成IGF-1R抗体的分离的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸。本发明的IGF-1R结合分子包括多肽例如编码衍生自免疫球蛋白分子的IGF-1R特异性抗原结
合区的氨基酸序列。“衍生自”指定蛋白的多肽或氨基酸序列是指具有某种氨基酸序列的多肽的起源。在某些情况下，衍生自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与
起始序列或其一部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分是由至少10-20个氨基酸、
至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸所组成的，或者其中所述部分是可以由本领域普
通技术人员鉴定为在起始序列中含有其起源的。
合区的氨基酸序列。“衍生自”指定蛋白的多肽或氨基酸序列是指具有某种氨基酸序列的多肽的起源。在某些情况下，衍生自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与
起始序列或其一部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分是由至少10-20个氨基酸、
至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸所组成的，或者其中所述部分是可以由本领域普
通技术人员鉴定为在起始序列中含有其起源的。
[0366] 在一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VH)所组成，其中所述重链可变区的至少一个VH-CDR或所述重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或
VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。可选地，VH的VH-CDR1、
VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2
和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。因此，根据此实施方案，本发明的重链可变区具有与前面表3所示的基团相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽
序列。虽然表3显示由Kabat系统定义的VH-CDR，但是其它CDR定义例如由Chothia系统
定义的VH-CDR也被包括在本发明中。在某些实施方案中，含有所述VH的抗体或抗原结合
片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。可选地，VH的VH-CDR1、
VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2
和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。因此，根据此实施方案，本发明的重链可变区具有与前面表3所示的基团相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽
序列。虽然表3显示由Kabat系统定义的VH-CDR，但是其它CDR定义例如由Chothia系统
定义的VH-CDR也被包括在本发明中。在某些实施方案中，含有所述VH的抗体或抗原结合
片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0367] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VH)所组成，在其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与显示在表3中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同的多肽序列。在某些实施方案中，含有所述VH的抗
体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0368] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白重链可变区(VH)所组成，在其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与显示在表3中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同的多肽序列，除了在任一个VH-CDR中的1个、2个、
3个、4个、5个或6个氨基酸取代之外。在较大的CDR例如VH-CDR3中，可在CDR中进行另
外的取代，只要含有VH-CDR的VH特异性地或优先地结合至IGF-1R。在某些实施方案中，氨
基酸取代是保守的。在某些实施方案中，含有所述VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优
先地结合至IGF-1R。
3个、4个、5个或6个氨基酸取代之外。在较大的CDR例如VH-CDR3中，可在CDR中进行另
外的取代，只要含有VH-CDR的VH特异性地或优先地结合至IGF-1R。在某些实施方案中，氨
基酸取代是保守的。在某些实施方案中，含有所述VH的抗体或抗原结合片段特异性地或优
先地结合至IGF-1R。
[0369] 在进一步的实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包括，基本上由或者由与参考VH多肽氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VH多肽所组成，其中所述参考VH多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63所组成的组。在某些实施方案中，含有所述VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0370] 在另一方面，本发明包括分离的多肽，其包括，基本上由或者由选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63所组成的组的VH多肽所组成。在某些实施方案中，含有所述VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0371] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由一种或多种上述VH多肽所组成的结合部分或结合分子，其特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选
自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)或杂交瘤(选
自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段
与IGF-1R的结合。
自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)或杂交瘤(选
自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段
与IGF-1R的结合。
[0372] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由一种或多种上述VH多肽所组成的结合部分或结合分子，其以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至
-2 -2
IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10 M、10 M、
-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、
-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
-2 -2
IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10 M、10 M、
-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、
-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
[0373] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白轻链可变区(VL)所组成，其中所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或
VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。可选地，VL的VL-CDR1、
VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2
和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。因此，根据此实施方案，本发明的轻链可变区具有与前面表4所示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽
序列。虽然表4显示由Kabat系统定义的VL-CDR，但是其它CDR定义例如由Chothia系统
定义的VL-CDR也被包括在本发明中。在某些实施方案中，含有所述VL多肽的抗体或抗原
结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。可选地，VL的VL-CDR1、
VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2
和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同。因此，根据此实施方案，本发明的轻链可变区具有与前面表4所示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽
序列。虽然表4显示由Kabat系统定义的VL-CDR，但是其它CDR定义例如由Chothia系统
定义的VL-CDR也被包括在本发明中。在某些实施方案中，含有所述VL多肽的抗体或抗原
结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0374] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白轻链可变区(VL)所组成，在其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与显示在表4中的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团相同的多肽序列。在某些实施方案中，含有所述VL多肽
的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0375] 在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括，基本上由或者由免疫球蛋白轻链可变区(VL)所组成，在其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与显示在表4中的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团相同的多肽序列，除了在任一个VL-CDR中的1个、2个、
3个、4个、5个或6个氨基酸取代之外。在较大的CDR中，可在VL-CDR中进行另外的取代，
只要含有VL-CDR的VL特异性地或优先地结合至IGF-1R。在某些实施方案中，氨基酸取代
是保守的。在某些实施方案中，含有所述VL的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合
至IGF-1R。
3个、4个、5个或6个氨基酸取代之外。在较大的CDR中，可在VL-CDR中进行另外的取代，
只要含有VL-CDR的VL特异性地或优先地结合至IGF-1R。在某些实施方案中，氨基酸取代
是保守的。在某些实施方案中，含有所述VL的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合
至IGF-1R。
[0376] 在进一步的实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包括，基本上由或者由与参考VL多肽序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VL多肽所组成，其中所述参考VL多肽序列选自SEQID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118所组成的组。在某些实施方案中，含有所述VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0377] 在另一方面，本发明包括分离的多肽，其包括，基本上由或者由选自SEQ ID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118所组成的组的VL多肽所组成。在某些实施方案中，含有所述VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0378] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由一种或多种上述VL多肽所组成的结合部分或结合分子，其特异性地或优先地结合至与参考单克隆Fab抗体片段(选自
M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)或杂交瘤(选自
P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与
IGF-1R的结合。
M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04所组成的组)或杂交瘤(选自
P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8所组成的组)产生的参考单克隆抗体相同的IGF-1R表位，或者将竞争性地抑制这样的单克隆抗体或片段与
IGF-1R的结合。
[0379] 在某些实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由一种或多种上述VL多肽所组成的结合部分或结合分子，其以解离常数(KD)所表征的亲和力特异性地或优先地结合至
-2 -2
IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10 M、10 M、
-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、
-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
-2 -2
IGF-1R多肽或其片段或者IGF-1R变体多肽，其中所述解离常数(KD)不大于5×10 M、10 M、
-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8
5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、
-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、5×10 M、10 M、
-14 -14 -15 -15
5×10 M、10 M、5×10 M或10 M。
[0380] 在其它实施方案中，本发明涉及包括、基本上由或者由VH多肽和VL多肽所组成的结合部分或结合分子，其中所述VH多肽和VL多肽分别与参考VL和VL多肽氨基酸序列至
少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考VL和VL多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO：4和68、8和73、14和78、20和83、26和88、32和93、38和98、43和103、48和108、53
和103、58和113以及63和118所组成的组。在某些实施方案中，含有这些VH和VL多肽
的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
少80％、85％、90％、95％或100％相同，其中所述参考VL和VL多肽氨基酸序列选自SEQ ID NO：4和68、8和73、14和78、20和83、26和88、32和93、38和98、43和103、48和108、53
和103、58和113以及63和118所组成的组。在某些实施方案中，含有这些VH和VL多肽
的抗体或抗原结合片段特异性地或优先地结合至IGF-1R。
[0381] 上述多核苷酸还可包括另外的多肽例如信号肽以指导被编码的多肽、本文所述抗体恒定区或本文所述其它异源性多肽的分泌。
[0382] 而且，如本文其它地方更详细所述，本发明包括含有上述多肽的结合部分或结合分子。
[0383] 本领域普通技术人员还将理解，可以修饰本文所公开的IGF-1R抗体多肽以使它们在氨基酸序列上与天然存在的结合多肽不同，其中所述IGF-1R抗体多肽衍生自这些天
然存在的结合多肽。例如，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如与起
始序列具有某种百分比同一性，例如它可以与起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％或100％相同。
然存在的结合多肽。例如，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如与起
始序列具有某种百分比同一性，例如它可以与起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％或100％相同。
[0384] 此外，可以进行核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入，导致在“非必需的”氨基酸区域的保守取代或改变。例如，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以与起始序列相同，除了一个或多个单个氨基酸取代、插入或缺失之外，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多单个氨基酸取代、插入或缺失。在其它实施方案中，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以与起始序列相同，除了2个或更少、3个或更少、4个或更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少、10个或更少、15个或更少或者20个或更少的单个氨基酸取代、插入或缺失之外。在某些实施方案中，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个
单个氨基酸取代、插入或缺失。
单个氨基酸取代、插入或缺失。
[0385] 本发明某些IGF-1R结合部分或结合分子包括、基本上由或者由衍生自包含人类氨基酸序列的人类多肽的氨基酸序列所组成。然而，某些IGF-1R抗体多肽包括衍生自另一
种哺乳动物物种的一个或多个连续的氨基酸。例如，本发明的IGF-1R抗体可包括灵长类重
链部分、铰链部分或抗原结合区。在另一个例子中，一种或多种衍生自鼠的氨基酸可存在于非鼠抗体多肽例如IGF-1R抗体的抗原结合位点中。在另一个例子中，IGF-1R抗体的抗原
结合位点完全是鼠的。在某些治疗应用中，设计IGF-1R特异性的抗体或其抗原结合片段、
变体或类似物以使其在施用所述抗体的动物中不是免疫原性的。
种哺乳动物物种的一个或多个连续的氨基酸。例如，本发明的IGF-1R抗体可包括灵长类重
链部分、铰链部分或抗原结合区。在另一个例子中，一种或多种衍生自鼠的氨基酸可存在于非鼠抗体多肽例如IGF-1R抗体的抗原结合位点中。在另一个例子中，IGF-1R抗体的抗原
结合位点完全是鼠的。在某些治疗应用中，设计IGF-1R特异性的抗体或其抗原结合片段、
变体或类似物以使其在施用所述抗体的动物中不是免疫原性的。
[0386] 在某些实施方案中，IGF-1R结合部分或结合分子包括通常不与抗体缔合的氨基酸序列或者一个或多个部分。下面更详细地描述了示例性的修饰。例如，本发明的单链Fv抗
体片段可包括柔性连接序列，和/或可被修饰以添加功能性部分(例如PEG、药物、毒素或标记物)。
体片段可包括柔性连接序列，和/或可被修饰以添加功能性部分(例如PEG、药物、毒素或标记物)。
[0387] 本发明的IGF-1R结合部分或结合分子可包括，基本上由或者由融合蛋白所组成。融合蛋白是嵌合分子，其包括例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构
域，以及至少一个异源性部分即在性质上是非天然连接的部分。氨基酸序列通常可存在于
被集合在融合多肽的不同蛋白中，或者它们通常可存在于相同蛋白中但在融合多肽中以新
的排列被布置。可以通过例如化学合成或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，其中
所述多核苷酸中的肽区域以期望的关系被编码。
域，以及至少一个异源性部分即在性质上是非天然连接的部分。氨基酸序列通常可存在于
被集合在融合多肽的不同蛋白中，或者它们通常可存在于相同蛋白中但在融合多肽中以新
的排列被布置。可以通过例如化学合成或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，其中
所述多核苷酸中的肽区域以期望的关系被编码。
[0388] 用于多核苷酸或多肽的术语“异源性的”是指多核苷酸或多肽衍生自与被比较的其它实体不同的实体。例如，如本文所用，待融合至IGF-1R结合部分的“异源性的多肽”可衍生自相同物种的非免疫球蛋白多肽，或者不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
[0389] “保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义，其中所述侧链包括碱
性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基所替换。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被结构上相似但在侧链家族成员的
顺序和/或组成上不同的一串所替换。
性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基所替换。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被结构上相似但在侧链家族成员的
顺序和/或组成上不同的一串所替换。
[0390] 可选地，在另一个实施方案中，可沿着免疫球蛋白编码序列的全部或部分通过例如饱和诱变来随机地引入突变，而且可将所得的突变体并入IGF-1R抗体以用于本文公开
的诊断和治疗方法，并筛选其结合至期望的抗原例如IGF-1R的能力。
的诊断和治疗方法，并筛选其结合至期望的抗原例如IGF-1R的能力。
[0391] 在其他的实施方案中，本发明范围内的结合部分或结合分子包括核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物和具有对本文所述IGF-1R表位的结合特异性的其它分子。在一个实施
方案中，结合分子包括是核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物、或具有对本文所述IGF-1R表位的结合特异性的其它分子的结合位点。例如，本发明的结合分子或结合部分包括能够以高
亲和力结合本文所述的IGF-1R表位的核酸分子(如，小RNA或适体)。选择或筛选具有期
望特异性的核酸分子的方法是本领域公知的(参见如，Ellington和Szostak，Nature346：
818(1990)，Tuerk和Gold，Science 249：505(1990)，美国专利第5,582,981号、PCT公
布第WO 00/20040号、美国专利第5,270,163号、Lorsch和Szostak，Biochemistry，33：
973(1994)，Mannironi等人，Biochemistry 36：9726(1997)，Blind，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA96：3606-3610(1999)，Huizenga 和 Szostak，Biochemistry，34：656-665(1995)，PCT公布第WO 99/54506、WO 99/27133、WO 97/42317号和美国专利第5,756,291号)。本
领域公知的示例性筛选方法是SELEX方法(指数富集的配体系统进化，参见例如，美国专利
第5,270,163和5,567,588号；通过引用并入本文)。
方案中，结合分子包括是核酸、肽、模拟肽、树枝状聚合物、或具有对本文所述IGF-1R表位的结合特异性的其它分子的结合位点。例如，本发明的结合分子或结合部分包括能够以高
亲和力结合本文所述的IGF-1R表位的核酸分子(如，小RNA或适体)。选择或筛选具有期
望特异性的核酸分子的方法是本领域公知的(参见如，Ellington和Szostak，Nature346：
818(1990)，Tuerk和Gold，Science 249：505(1990)，美国专利第5,582,981号、PCT公
布第WO 00/20040号、美国专利第5,270,163号、Lorsch和Szostak，Biochemistry，33：
973(1994)，Mannironi等人，Biochemistry 36：9726(1997)，Blind，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA96：3606-3610(1999)，Huizenga 和 Szostak，Biochemistry，34：656-665(1995)，PCT公布第WO 99/54506、WO 99/27133、WO 97/42317号和美国专利第5,756,291号)。本
领域公知的示例性筛选方法是SELEX方法(指数富集的配体系统进化，参见例如，美国专利
第5,270,163和5,567,588号；通过引用并入本文)。
[0392] 在另一实施方案中，本发明的结合分子或结合部分是模拟物，如模拟肽。各种结构的大量模拟肽是本领域公知的。例如，WO00/68185公开了模拟某些蛋白的螺旋状部分的
模拟肽。在另一实施方案中，本发明涉及模拟本文所述的结合多肽(如，抗体)的结合位
点(如，CDR、抗原结合位点或互补位)的3维结构的化合物或分子。如本文所用，术语“模
拟”是指模拟物原子的3维放置以使在模拟物的原子与抗原结合位点或表位的原子之间存
在相似的离子力、共价力、范德华力或其它力、和相似的电荷互补性或静电互补性，和/或以使模拟物具有与本文所述的结合多肽相似的对抗原性表位(如，IGF-1R表位)的结合亲
和力，和/或以使模拟物具有对抗原功能的相似体外或体内作用。分离或筛选模拟结合位
点的化合物或模拟物的方法是本领域公知的。例如，可能使用识别位于本文所述的IGF-1R
结合多肽上的独特的个体遗传型决定子的抗独特型抗体。这些决定子位于结合特定IGF-1R
表位的结合多肽的结合位点中(如，抗体的高度可变区)。可用感兴趣的结合多肽免疫动物
来制备抗独特型抗体，以使产生识别结合位点的个体遗传型决定子的抗体。针对第一结合
位点制备的抗独特型单克隆抗体将具有是由第一结合位点结合的表位的反映的结合位点。
通过使用免疫动物的抗独特型抗体，可能鉴定与用于免疫的抗体具有相同独特型的其它抗
体。两种抗体之间的独特型同一性证明，这两种抗体在它们识别相同表位方面是相同的。因此，通过使用抗独特型抗体，可能鉴定具有相同表位结合特异性的其它抗体。由于抗独特型抗体是被第一结合多肽结合的表位的反映，且由于抗独特型抗体如同抗原有效作用，可能
用它来从小化学分子、肽或其它分子的组合文库，诸如肽噬菌体展示文库分离模拟物(参
见如，Scott等人，Science，249：386-390(1990)；Scott等人，Curr.Opin.Biotechnol.，5：
40-48(1992)；Bonnycastle等人，J.Mol.Biol.，258：747-762(1996)，通过引用并入本文)。
例如，可以克隆肽或有限的肽模拟物，包括带有脂质、糖类或其它部分的肽模拟物(参见
Harris等人，PNAS，94：2454-2459(1997))。
模拟肽。在另一实施方案中，本发明涉及模拟本文所述的结合多肽(如，抗体)的结合位
点(如，CDR、抗原结合位点或互补位)的3维结构的化合物或分子。如本文所用，术语“模
拟”是指模拟物原子的3维放置以使在模拟物的原子与抗原结合位点或表位的原子之间存
在相似的离子力、共价力、范德华力或其它力、和相似的电荷互补性或静电互补性，和/或以使模拟物具有与本文所述的结合多肽相似的对抗原性表位(如，IGF-1R表位)的结合亲
和力，和/或以使模拟物具有对抗原功能的相似体外或体内作用。分离或筛选模拟结合位
点的化合物或模拟物的方法是本领域公知的。例如，可能使用识别位于本文所述的IGF-1R
结合多肽上的独特的个体遗传型决定子的抗独特型抗体。这些决定子位于结合特定IGF-1R
表位的结合多肽的结合位点中(如，抗体的高度可变区)。可用感兴趣的结合多肽免疫动物
来制备抗独特型抗体，以使产生识别结合位点的个体遗传型决定子的抗体。针对第一结合
位点制备的抗独特型单克隆抗体将具有是由第一结合位点结合的表位的反映的结合位点。
通过使用免疫动物的抗独特型抗体，可能鉴定与用于免疫的抗体具有相同独特型的其它抗
体。两种抗体之间的独特型同一性证明，这两种抗体在它们识别相同表位方面是相同的。因此，通过使用抗独特型抗体，可能鉴定具有相同表位结合特异性的其它抗体。由于抗独特型抗体是被第一结合多肽结合的表位的反映，且由于抗独特型抗体如同抗原有效作用，可能
用它来从小化学分子、肽或其它分子的组合文库，诸如肽噬菌体展示文库分离模拟物(参
见如，Scott等人，Science，249：386-390(1990)；Scott等人，Curr.Opin.Biotechnol.，5：
40-48(1992)；Bonnycastle等人，J.Mol.Biol.，258：747-762(1996)，通过引用并入本文)。
例如，可以克隆肽或有限的肽模拟物，包括带有脂质、糖类或其它部分的肽模拟物(参见
Harris等人，PNAS，94：2454-2459(1997))。
[0393] 通过本领域公知的技术，还可鉴于本文公开的结合分子的核酸和氨基酸序列和如对结合分子的X射线晶体照相术或NMR确定的结合分子的氨基酸的三维排列或构象来设
计化合物或模拟物(参见如，美国专利第5,648,379号；Colman等人，Protein Science，
3：1687-1696(1994)；Malby等人，Structure等人，2：733-746(1994)；McCoy等人，J.Mol.Biol.，268：570-584(1997)；Pallaghy等人，Biochemistry，34：3782-3794(1995)，各通过引用并入本文)。因此，通过分析结合位点与IGF-1R表位在两种分子的晶体中或在包含两
种分子的溶液中的相互作用，可设计模拟本文所述的结合位点或部分(如，互补位)的3维
结构的模拟物或分子。可通过原子的3维放置设计完全合成的结合分子，以使在模拟物的
原子与结合分子或部分的原子之间存在相似的离子力、共价力、范德华力或其它力、和相似的电荷互补性。随后可筛选这些模拟物体外和体内对抗原性表位的高亲和力结合和对B细
胞功能的抑制。
计化合物或模拟物(参见如，美国专利第5,648,379号；Colman等人，Protein Science，
3：1687-1696(1994)；Malby等人，Structure等人，2：733-746(1994)；McCoy等人，J.Mol.Biol.，268：570-584(1997)；Pallaghy等人，Biochemistry，34：3782-3794(1995)，各通过引用并入本文)。因此，通过分析结合位点与IGF-1R表位在两种分子的晶体中或在包含两
种分子的溶液中的相互作用，可设计模拟本文所述的结合位点或部分(如，互补位)的3维
结构的模拟物或分子。可通过原子的3维放置设计完全合成的结合分子，以使在模拟物的
原子与结合分子或部分的原子之间存在相似的离子力、共价力、范德华力或其它力、和相似的电荷互补性。随后可筛选这些模拟物体外和体内对抗原性表位的高亲和力结合和对B细
胞功能的抑制。
[0394] IV.IGF-1R表位
[0395] A.导致结合的竞争性抑制的表位
[0396] 在某些实施方案中，IGF-1R结合部分可结合至IGF-1R的竞争性表位以至于它竞争性地阻断配体(例如IGF1和/或IGF2)与IGF-1R的结合。这样的结合特异性在本文被
称作“竞争性结合部分”。在一个实施方案中，竞争性结合部分竞争性地阻断IGF-1(而非
IGF-2)与IGF-1R的结合。在另一个实施方案中，竞争性结合部分竞争性地阻断IGF-2(而
非IGF-1)与IGF-1R的结合。在又一个实施方案中，竞争性结合部分竞争性地阻断IGF-1
和IGF-2二者与IGF-1R的结合。
称作“竞争性结合部分”。在一个实施方案中，竞争性结合部分竞争性地阻断IGF-1(而非
IGF-2)与IGF-1R的结合。在另一个实施方案中，竞争性结合部分竞争性地阻断IGF-2(而
非IGF-1)与IGF-1R的结合。在又一个实施方案中，竞争性结合部分竞争性地阻断IGF-1
和IGF-2二者与IGF-1R的结合。
[0397] 如果它在配体(例如IGF)与IGF-1R的结合以依赖于配体浓度的方式被抑制或阻断(例如空间阻断)的程度特异性地或优先地结合至表位，则说结合分子“竞争性地抑制”
或“竞争性地阻断”配体的结合。例如，当生化测量时，在结合分子的给定浓度下的竞争性抑制可通过增加配体浓度来克服，在这种情况下，配体将在结合靶分子(例如IGF-1R)上胜过
结合分子。不受任何特定理论所束缚，认为竞争是在结合分子所结合的表位被定位于或接
近配体结合位点时发生的，从而防止配体的结合。可通过本领域熟知的和/或实施例中描
述的方法来确定竞争性抑制，其包括例如竞争ELISA测定。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争性地抑制配体与给定表位的结合的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％
或至少50％。
或“竞争性地阻断”配体的结合。例如，当生化测量时，在结合分子的给定浓度下的竞争性抑制可通过增加配体浓度来克服，在这种情况下，配体将在结合靶分子(例如IGF-1R)上胜过
结合分子。不受任何特定理论所束缚，认为竞争是在结合分子所结合的表位被定位于或接
近配体结合位点时发生的，从而防止配体的结合。可通过本领域熟知的和/或实施例中描
述的方法来确定竞争性抑制，其包括例如竞争ELISA测定。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争性地抑制配体与给定表位的结合的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％
或至少50％。
[0398] 示例性的竞争性表位位于这样的区域内，其涵盖位于IGF-1R的残基248-303的CRR结构域的中间和C末端区域。IGF-1R的该表位与L1结构域的IGF-1/IGF-2配体结合
位点相邻(在三维空间内)。竞争性地结合至该表位的示例性抗体是被称为M14-G11的人
类抗体。已经显示，M14-G11抗体竞争性地阻断IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R的结合。表
达M14-G11的Fab抗体片段的中国仓鼠卵巢细胞系在2006年8月29日被保藏于美国典型
培养物保藏中心(“ATCC”)，并被赋予PTA-7855的ATCC保藏号。
位点相邻(在三维空间内)。竞争性地结合至该表位的示例性抗体是被称为M14-G11的人
类抗体。已经显示，M14-G11抗体竞争性地阻断IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R的结合。表
达M14-G11的Fab抗体片段的中国仓鼠卵巢细胞系在2006年8月29日被保藏于美国典型
培养物保藏中心(“ATCC”)，并被赋予PTA-7855的ATCC保藏号。
[0399] 因此，在某些实施方案中，用于本发明的组合物的结合部分可结合至与M14-G11抗体相同的竞争性表位。例如，结合部分可衍生自这样的抗体，其对M14-G11抗体交叉阻断(即与其竞争结合)或否则干扰M14-G11抗体的结合。在其它实施方案中，结合部分可包括
M14-G11抗体本身或其片段、变体或衍生物。在其它实施方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL或VH)或从其中来的CDR。例如，竞争性结合部分可包括M14-G11抗体
的所有6个CDR(即CDR 1-6)或者它可包括来自M14-G11抗体的少于所有6个的CDR(例
如1个、2个、3个、4个或5个CDR)。在一个示例性的实施方案中，竞争性结合特异性包括
来自M14-G11抗体的CDR-H3。
M14-G11抗体本身或其片段、变体或衍生物。在其它实施方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL或VH)或从其中来的CDR。例如，竞争性结合部分可包括M14-G11抗体
的所有6个CDR(即CDR 1-6)或者它可包括来自M14-G11抗体的少于所有6个的CDR(例
如1个、2个、3个、4个或5个CDR)。在一个示例性的实施方案中，竞争性结合特异性包括
来自M14-G11抗体的CDR-H3。
[0400] 可以使用本领域公认的方法来鉴定结合至IGF-1R的竞争性表位的其它抗体。例如，一旦产生了针对不含信号序列的各种IGF-1R片段或全长IGF-1R的抗体，可通过本文所
述的表位定位方案以及本领域已知的方法(例如“第11章-免疫学”，Current Protocols
inMolecular Biology(分子生物学最新实验方案)，Ausubel等人编辑，第2版，John Wiley & Sons，Inc.(1996)中所述的双抗体夹心ELISA)来确定抗体或抗原结合片段所结合的
IGF-1R的氨基酸或表位。可在Morris，G Epitope Mapping Protocols(表位定位方案)，
新泽西：Humana Press(1996)中找到另外的表位定位方案，其二者以其整体通过引用被并
入本文。还可通过商业上可得的方法(即ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))来进
行表位定位。另外，然后可筛选所产生的结合至IGF-1R竞争性表位的抗体竞争性地抑制胰
岛素生长因子例如IGF-1、IGF-2或IGF-1和IGF-2二者对IGF-1R的结合的能力。可根据
实施例中所详细描述的方法来筛选抗体的这些或其它特性。
述的表位定位方案以及本领域已知的方法(例如“第11章-免疫学”，Current Protocols
inMolecular Biology(分子生物学最新实验方案)，Ausubel等人编辑，第2版，John Wiley & Sons，Inc.(1996)中所述的双抗体夹心ELISA)来确定抗体或抗原结合片段所结合的
IGF-1R的氨基酸或表位。可在Morris，G Epitope Mapping Protocols(表位定位方案)，
新泽西：Humana Press(1996)中找到另外的表位定位方案，其二者以其整体通过引用被并
入本文。还可通过商业上可得的方法(即ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))来进
行表位定位。另外，然后可筛选所产生的结合至IGF-1R竞争性表位的抗体竞争性地抑制胰
岛素生长因子例如IGF-1、IGF-2或IGF-1和IGF-2二者对IGF-1R的结合的能力。可根据
实施例中所详细描述的方法来筛选抗体的这些或其它特性。
[0401] 在其它实施方案中，竞争性IGF-1R结合部分特异性地或优先地结合至竞争性表位，其包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的残基248-303(含)的序列的至少约4至5个氨
基酸所组成。例如，在一个实施方案中，竞争性IGF-1R结合部分包括跨越IGF-1R的残基
248-303的序列的至少7个、至少9个或在至少约15至约30个之间的氨基酸。给定表位
的氨基酸可以是但不必是连续的或线性的。在某些实施方案中，竞争性表位包括，基本上由或者由非线性表位所组成，其中所述非线性表位是当其被表达在细胞表面上或例如将可溶
性片段融合至IGF的Fc区域之时由CRR和L2结构域界面所形成的。因此，在某些实施方
案中，IGF-1R的竞争性表位包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的残基248-303的序列的至
少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15
个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间或者至少10、15、20、25、30、35、40或45个连续的或不连续的氨基酸所组成。在不连续的氨基酸的情况下，所述氨基酸通过蛋白折叠
而形成表位。
基酸所组成。例如，在一个实施方案中，竞争性IGF-1R结合部分包括跨越IGF-1R的残基
248-303的序列的至少7个、至少9个或在至少约15至约30个之间的氨基酸。给定表位
的氨基酸可以是但不必是连续的或线性的。在某些实施方案中，竞争性表位包括，基本上由或者由非线性表位所组成，其中所述非线性表位是当其被表达在细胞表面上或例如将可溶
性片段融合至IGF的Fc区域之时由CRR和L2结构域界面所形成的。因此，在某些实施方
案中，IGF-1R的竞争性表位包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的残基248-303的序列的至
少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15
个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间或者至少10、15、20、25、30、35、40或45个连续的或不连续的氨基酸所组成。在不连续的氨基酸的情况下，所述氨基酸通过蛋白折叠
而形成表位。
[0402] 在其它实施方案中，结合部分所结合的竞争性表位包括，基本上由或者由IGF-1R的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至
少15个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间的连续的或不连续的氨基酸所组成，而
且所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的编号为248、250、254、257、259、260、263、265、
301和303的氨基酸所组成的组。
少15个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间的连续的或不连续的氨基酸所组成，而
且所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的编号为248、250、254、257、259、260、263、265、
301和303的氨基酸所组成的组。
[0403] 在其它实施方案中，由本发明的结合部分所结合的氨基酸存在于跨越IGF-1R的氨基酸248-303的表位中。在一个实施方案中，由本发明的结合部分所结合的表位包括至
少一个氨基酸例如IGF-1R残基248和/或250，其在被突变时导致抗体亲和力的消失或大
量减少(例如亲和力的＞100倍减少)。在另一个实施方案中，所述表位可包括IGF-1R的一
个或多个氨基酸，其在被突变时导致抗体对受体的亲和力的中度减少(超过野生型IGF-1R
的10≥KD≥100倍)。在其他实施方案中，所述表位可包括IGF-1R的一个氨基酸例如
IGF-1R残基254、257、259、260、263、265、301或303的一个或多个，其在被突变时导致抗体亲和力与野生型人类IGF-1R相比的小幅减少(例如2.5≥KD≥10nM)。在一个优选的实
施方案中，由本发明的结合部分所结合的表位包括IGF-1R残基248、250和/或254中任一
个、任两个或所有三个。在一个特别优选的实施方案中，竞争性结合部分结合至包含所有三个氨基酸248、250和254的表位，并同时识别这些氨基酸残基。
少一个氨基酸例如IGF-1R残基248和/或250，其在被突变时导致抗体亲和力的消失或大
量减少(例如亲和力的＞100倍减少)。在另一个实施方案中，所述表位可包括IGF-1R的一
个或多个氨基酸，其在被突变时导致抗体对受体的亲和力的中度减少(超过野生型IGF-1R
的10≥KD≥100倍)。在其他实施方案中，所述表位可包括IGF-1R的一个氨基酸例如
IGF-1R残基254、257、259、260、263、265、301或303的一个或多个，其在被突变时导致抗体亲和力与野生型人类IGF-1R相比的小幅减少(例如2.5≥KD≥10nM)。在一个优选的实
施方案中，由本发明的结合部分所结合的表位包括IGF-1R残基248、250和/或254中任一
个、任两个或所有三个。在一个特别优选的实施方案中，竞争性结合部分结合至包含所有三个氨基酸248、250和254的表位，并同时识别这些氨基酸残基。
[0404] B.导致结合的变构抑制的表位
[0405] 在某些实施方案中，结合部分可结合至变构表位以便它变构地阻断IGF配体与IGF-1R的结合。这样的结合特异性在本文被称作“变构结合部分”。在一个实施方案中，变构结合部分变构地阻断IGF-1(而非IGF-2)与IGF-1R的结合。在另一个实施方案中，变构
结合部分变构地阻断IGF-2(而非IGF-1)与IGF-1R的结合。在又一个实施方案中，变构结
合部分变构地阻断IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R的结合。
结合部分变构地阻断IGF-2(而非IGF-1)与IGF-1R的结合。在又一个实施方案中，变构结
合部分变构地阻断IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R的结合。
[0406] 如果它在配体(例如IGF1和/或IGF2)与IGF-1R的结合以不依赖于结合分子浓度的方式被抑制或阻断的程度特异性地或优先地结合至表位，则说结合分子“变构地抑制”或“变构地阻断”配体的结合。例如，配体的浓度增加将不影响抑制的效力(例如IC50或结合分子在其导致最大配体抑制减少50％时的浓度)。不受任何特定理论所束缚，据信变构
抑制是在存在由结合分子与变构表位的结合所引起的靶分子(例如IGF-1R)构象或动态改
变时发生的，从而减少配体对靶的亲和力。可通过本领域熟知的和/或实施例中描述的方
法来确定变构抑制，其包括例如竞争ELISA测定。在一个实施方案中，结合分子可变构地抑制配体与给定表位的结合的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
抑制是在存在由结合分子与变构表位的结合所引起的靶分子(例如IGF-1R)构象或动态改
变时发生的，从而减少配体对靶的亲和力。可通过本领域熟知的和/或实施例中描述的方
法来确定变构抑制，其包括例如竞争ELISA测定。在一个实施方案中，结合分子可变构地抑制配体与给定表位的结合的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
[0407] (i)导致IGF-1和IGF-2的变构阻断的表位
[0408] 在某些示例性的实施方案中，本发明的结合分子包括与位于跨越IGF-1R的整个FnIII-1结构域并包括IGF-1R的残基440-586的区域内的变构表位结合的结合部分。变构
地结合至该区域内的表位的示例性抗体是被称为M13-C06和M14-C03的人类抗体。已经在
实施例中显示，M13-C06抗体和M14-C03抗体二者变构地阻断IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R
的结合。表达M13-C06和M14-C03的全长抗体的中国仓鼠卵巢细胞系在2006年3月28日
被保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，并被分别赋予PTA-7444和PTA-7445的ATCC
保藏号。因此，在某些实施方案中，用于本发明的组合物的结合部分可结合至与M13-C06抗体或M14-C03抗体相同的变构表位。例如，结合特异性可衍生自这样的抗体，其对M13-C06
抗体或M14-C03抗体交叉阻断(与其竞争)或否则干扰M13-C06抗体或M14-C03抗体的结
合。在其它实施方案中，结合部分可包括M13-C06或M14-C03抗体本身或其片段、变体或衍
生物。在其它实施方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL和/或VH)或从其
中来的CDR。例如，变构结合部分可包括M13-C06抗体或M14-C03抗体的所有6个CDR或者
它可包括来自M13-C06抗体或M14-C03抗体的少于所有6个的CDR(例如1个、2个、3个、
4个或5个CDR)。在一个示例性的实施方案中，变构结合特异性包括来自M13-C06抗体或
M14-C03抗体的CDR-H3。
地结合至该区域内的表位的示例性抗体是被称为M13-C06和M14-C03的人类抗体。已经在
实施例中显示，M13-C06抗体和M14-C03抗体二者变构地阻断IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R
的结合。表达M13-C06和M14-C03的全长抗体的中国仓鼠卵巢细胞系在2006年3月28日
被保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，并被分别赋予PTA-7444和PTA-7445的ATCC
保藏号。因此，在某些实施方案中，用于本发明的组合物的结合部分可结合至与M13-C06抗体或M14-C03抗体相同的变构表位。例如，结合特异性可衍生自这样的抗体，其对M13-C06
抗体或M14-C03抗体交叉阻断(与其竞争)或否则干扰M13-C06抗体或M14-C03抗体的结
合。在其它实施方案中，结合部分可包括M13-C06或M14-C03抗体本身或其片段、变体或衍
生物。在其它实施方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL和/或VH)或从其
中来的CDR。例如，变构结合部分可包括M13-C06抗体或M14-C03抗体的所有6个CDR或者
它可包括来自M13-C06抗体或M14-C03抗体的少于所有6个的CDR(例如1个、2个、3个、
4个或5个CDR)。在一个示例性的实施方案中，变构结合特异性包括来自M13-C06抗体或
M14-C03抗体的CDR-H3。
[0409] 在某些实施方案中，变构的IGF-1R结合部分特异性地或优先地结合至变构表位，其包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的残基440-586的序列的至少约4至5个氨基酸，跨
越IGF-1R的残基440-586的序列的至少7个、至少9个或在至少约15至约30个之间的氨
基酸所组成。给定表位的氨基酸可以是但不必是连续的或线性的。
越IGF-1R的残基440-586的序列的至少7个、至少9个或在至少约15至约30个之间的氨
基酸所组成。给定表位的氨基酸可以是但不必是连续的或线性的。
[0410] 在某些实施方案中，变构的表位包括，基本上由或者由位于IGF-1R的L2和/或FnIII-1结构域中的非线性的表位所组成，这是在其被表达在细胞表面上或例如将可溶性
片段融合至IGF的Fc区域之时。因此，在某些实施方案中，变构的表位包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的氨基酸位置440-586的序列的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、
至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15至约30
个之间或者至少10、15、20、25、30或更多个连续的或不连续的氨基酸所组成，其中所述不连续的氨基酸通过蛋白折叠而形成表位。
片段融合至IGF的Fc区域之时。因此，在某些实施方案中，变构的表位包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的氨基酸位置440-586的序列的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、
至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15至约30
个之间或者至少10、15、20、25、30或更多个连续的或不连续的氨基酸所组成，其中所述不连续的氨基酸通过蛋白折叠而形成表位。
[0411] 在另一个实施方案中，结合部分所结合的变构表位包括，基本上由或者由IGF-1R的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至
少15个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间的连续的或不连续的氨基酸所组成，而
且所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的编号为437、438、459、460、461、462、464、466、
467、469、470、471、472、474、476、477、478、479、480、482、483、488、490、492、493、495、496、
509、513、514、515、533、544、545、546、547、548、551、564、565、568、570、571、572、573、577、
578、579、582、584、585、586和587的氨基酸所组成的组。
少15个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间的连续的或不连续的氨基酸所组成，而
且所述表位的至少一个氨基酸选自IGF-1R的编号为437、438、459、460、461、462、464、466、
467、469、470、471、472、474、476、477、478、479、480、482、483、488、490、492、493、495、496、
509、513、514、515、533、544、545、546、547、548、551、564、565、568、570、571、572、573、577、
578、579、582、584、585、586和587的氨基酸所组成的组。
[0412] 在其它实施方案中，由本发明的结合部分所结合的表位包括IGF-1R的至少一个氨基酸，其选自IGF-1R的FnIII-1结构域表面上的在残基462-464的 半径之内的残
基，例如残基S437、E438、E469、N470、E471、L472、K474、S476、Y477、I478、R479、R488、E490、Y492、W493、P495、D496、E509、Q513、N514、V515、K544、S545、Q546、N547、H548、W551、R577、T578、Y579、K582、D584、I585、I586和Y587。在其它实施方案中，本发明的结合部分结合至选自IGF-1R的位置440-586之中残基的至少一个氨基酸例如IGF-1R残基459、460、461、
462、464、480、482、483、490、533、570或571，其在被突变时导致抗体亲和力的消失或大量减少(例如亲和力的＞100倍减少)。在又一个实施方案中，所述表位可包括IGF-1R的一
个氨基酸例如IGF-1R的残基466、467、478、533、564、565或568，其在被突变时导致抗体亲和力与野生型人类IGF-1R相比的小幅减少(例如2.5≥KD≥10nM)。在一个特别优选的实
施方案中，由本发明的结合部分所结合的表位包括IGF-1R残基461、462和464中任一个、
任两个或所有三个。
基，例如残基S437、E438、E469、N470、E471、L472、K474、S476、Y477、I478、R479、R488、E490、Y492、W493、P495、D496、E509、Q513、N514、V515、K544、S545、Q546、N547、H548、W551、R577、T578、Y579、K582、D584、I585、I586和Y587。在其它实施方案中，本发明的结合部分结合至选自IGF-1R的位置440-586之中残基的至少一个氨基酸例如IGF-1R残基459、460、461、
462、464、480、482、483、490、533、570或571，其在被突变时导致抗体亲和力的消失或大量减少(例如亲和力的＞100倍减少)。在又一个实施方案中，所述表位可包括IGF-1R的一
个氨基酸例如IGF-1R的残基466、467、478、533、564、565或568，其在被突变时导致抗体亲和力与野生型人类IGF-1R相比的小幅减少(例如2.5≥KD≥10nM)。在一个特别优选的实
施方案中，由本发明的结合部分所结合的表位包括IGF-1R残基461、462和464中任一个、
任两个或所有三个。
[0413] (ii)导致IGF-1而非IGF-2的变构阻断的表位
[0414] 另一个示例性的变构表位位于在受体的一个面上的IGF-1R的CRR结构域的表面上，其中所述受体被稍微旋转离开IGF-1/IGF-2结合袋。所述表位可跨越CRR和L2结构域
二者的广大区域。在一个实施方案中，变构表位位于含有IGF-1R的残基241-379的区域
内。在某些实施方案中，变构表位位于含有IGF-1R的CRR结构域的残基241-266或IGF-1R
的L2结构域的残基301-308和327-379的区域内。变构地结合至此表位的示例性抗体包
括被称作P1E2和αIR3的抗体。P1E2抗体和αIR3抗体二者已被显示在实施例中，其变
构地阻断IGF-1(而非IGF-2)与IGF-1R的结合。在一个实施方案中，P1E2抗体是含有小
鼠VH和VL的嵌合抗体，其衍生自P1E2.3B12小鼠杂交瘤所表达的小鼠抗体并被融合至人
类IgG4Palgy/κ恒定结构域(例如包括取代S228P和T299A(EU编号惯例)在内的IgG4
恒定结构域)。表达全长小鼠抗体P1E2.3B12的杂交瘤细胞系在2006年7月11日被保藏
于ATCC，并被赋予PTA-7730的ATCC保藏号。
二者的广大区域。在一个实施方案中，变构表位位于含有IGF-1R的残基241-379的区域
内。在某些实施方案中，变构表位位于含有IGF-1R的CRR结构域的残基241-266或IGF-1R
的L2结构域的残基301-308和327-379的区域内。变构地结合至此表位的示例性抗体包
括被称作P1E2和αIR3的抗体。P1E2抗体和αIR3抗体二者已被显示在实施例中，其变
构地阻断IGF-1(而非IGF-2)与IGF-1R的结合。在一个实施方案中，P1E2抗体是含有小
鼠VH和VL的嵌合抗体，其衍生自P1E2.3B12小鼠杂交瘤所表达的小鼠抗体并被融合至人
类IgG4Palgy/κ恒定结构域(例如包括取代S228P和T299A(EU编号惯例)在内的IgG4
恒定结构域)。表达全长小鼠抗体P1E2.3B12的杂交瘤细胞系在2006年7月11日被保藏
于ATCC，并被赋予PTA-7730的ATCC保藏号。
[0415] 因此，在某些实施方案中，用于本发明的组合物的结合部分可结合至与P1E2抗体或αIR3抗体相同的变构表位。例如，结合特异性可衍生自这样的抗体，其对P1E2抗体或
αIR3抗体交叉阻断(与其竞争)或否则干扰P1E2抗体或αIR3抗体的结合。在其它实施
方案中，结合特异性可包括P1E2或αIR3抗体本身或其片段、变体或衍生物。在其它实施
方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL和/或VH)或从其中来的CDR。例如，
变构结合部分可包括P1E2抗体或αIR3抗体的所有6个CDR或者它可包括来自P1E2抗体
或αIR3抗体的少于所有6个的CDR(例如1个、2个、3个、4个或5个CDR)。在一个示例
性的实施方案中，变构结合特异性包括来自P1E2抗体或αIR3抗体的CDR-H3。
αIR3抗体交叉阻断(与其竞争)或否则干扰P1E2抗体或αIR3抗体的结合。在其它实施
方案中，结合特异性可包括P1E2或αIR3抗体本身或其片段、变体或衍生物。在其它实施
方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL和/或VH)或从其中来的CDR。例如，
变构结合部分可包括P1E2抗体或αIR3抗体的所有6个CDR或者它可包括来自P1E2抗体
或αIR3抗体的少于所有6个的CDR(例如1个、2个、3个、4个或5个CDR)。在一个示例
性的实施方案中，变构结合特异性包括来自P1E2抗体或αIR3抗体的CDR-H3。
[0416] 可以使用本领域公认的方法例如上述那些来鉴定结合至IGF-1R的变构表位的其它抗体。另外，然后可以筛选所产生的结合至IGF-1R的变构表位的抗体变构地阻断胰岛素
生长因子例如IGF-1、IGF-2或者IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R结合的能力。可根据实施
例中详述的方法筛选抗体的这些和其它特性。
生长因子例如IGF-1、IGF-2或者IGF-1和IGF-2二者与IGF-1R结合的能力。可根据实施
例中详述的方法筛选抗体的这些和其它特性。
[0417] 在其他实施方案中，变构的IGF-1R结合部分特异性地或优先地结合至变构的表位，其包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的残基241-266的序列的至少约4至5个氨基酸，
跨越IGF-1R的残基241-266的序列的至少7个、至少9个或在至少约15至约25个之间的
氨基酸。所述表位的氨基酸可以是但不必是连续的或线性的。在某些实施方案中，变构表
位包括，基本上由或者由非线性表位所组成，所述非线性表位当其被表达在细胞表面上或
例如将可溶性片段融合至IGF的Fc区域之时存在于IGF-1R的CRR结构域的细胞外表面上。
因此，在某些实施方案中，变构表位包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的氨基酸残基约241至约379(例如残基241-266或301-308或327-379)的序列的至少3个、至少4个、至少5
个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15至约25个之间或者至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的或不连续的氨基酸所组成，其中所述不连续的氨基酸通过蛋白折叠而形成表位。
跨越IGF-1R的残基241-266的序列的至少7个、至少9个或在至少约15至约25个之间的
氨基酸。所述表位的氨基酸可以是但不必是连续的或线性的。在某些实施方案中，变构表
位包括，基本上由或者由非线性表位所组成，所述非线性表位当其被表达在细胞表面上或
例如将可溶性片段融合至IGF的Fc区域之时存在于IGF-1R的CRR结构域的细胞外表面上。
因此，在某些实施方案中，变构表位包括，基本上由或者由跨越IGF-1R的氨基酸残基约241至约379(例如残基241-266或301-308或327-379)的序列的至少3个、至少4个、至少5
个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15至约25个之间或者至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的或不连续的氨基酸所组成，其中所述不连续的氨基酸通过蛋白折叠而形成表位。
[0418] 在其它实施方案中，结合部分所结合的变构表位包括，基本上由或者由至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15至约30个之间的连续的或不连续的氨基酸所组成，其中所述表位的
至少一个氨基酸(优选地所述表位的所有氨基酸)选自241、248、250、251、254、257、263、
265、266、301、303、308、327和379所组成的组。
至少一个氨基酸(优选地所述表位的所有氨基酸)选自241、248、250、251、254、257、263、
265、266、301、303、308、327和379所组成的组。
[0419] 在其它实施方案中，由本发明的结合部分所识别的表位包括IGF-1R的氨基酸241-266中的一个或多个例如IGF-1R残基248、254或265的至少一个或全部，其在被突变
时导致抗体亲和力的消失或大量减少(例如亲和力的＞100倍减少)。在另一个实施方案
中，所述表位可包括至少一个氨基酸例如IGF-1R残基254和/或257，其在被突变时导致
结合亲和力的中度减少(例如超过野生型IGF-1R的10≥KD≥100倍)。在又一个实施方
案中，所述表位可包括IGF-1R的一个氨基酸例如IGF-1R残基248、263、301、303、308、327或379的一个或多个，其在被突变时导致抗体亲和力与野生型人类IGF-1R相比的小幅减少
(例如2.5≥KD≥10nM)。在一个特别优选的实施方案中，所述表位包括IGF-1R残基241、
242、251、257、265和266中任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或所有六个。
时导致抗体亲和力的消失或大量减少(例如亲和力的＞100倍减少)。在另一个实施方案
中，所述表位可包括至少一个氨基酸例如IGF-1R残基254和/或257，其在被突变时导致
结合亲和力的中度减少(例如超过野生型IGF-1R的10≥KD≥100倍)。在又一个实施方
案中，所述表位可包括IGF-1R的一个氨基酸例如IGF-1R残基248、263、301、303、308、327或379的一个或多个，其在被突变时导致抗体亲和力与野生型人类IGF-1R相比的小幅减少
(例如2.5≥KD≥10nM)。在一个特别优选的实施方案中，所述表位包括IGF-1R残基241、
242、251、257、265和266中任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或所有六个。
[0420] C.其它IGF-1R表位
[0421] 在某些实施方案中，IGF-1R结合部分可结合至与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体相同的表位。在本发明一个示例
性的实施方案中，本发明结合分子的IGF-1R结合部分衍生自选自P2A7.3E11、20C8.3B8、
P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的亲本鼠抗体。表达抗体P2A7.3E11、
20C8.3B8和P1A2.2B11的杂交瘤细胞系分别在2006年3月28日、2006年6月13日和2006
年3月28日被保藏于ATCC，并被分别赋予PTA-7458、PTA-7732和PTA-7457的ATCC保藏
号。表达全长抗体20D8.24B11和P1G10.2B8的杂交瘤细胞系分别在2006年3月28日和
2006年7月11日被保藏于ATCC，并被分别赋予PTA-7456和PTA-7731的ATCC保藏号。
性的实施方案中，本发明结合分子的IGF-1R结合部分衍生自选自P2A7.3E11、20C8.3B8、
P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的亲本鼠抗体。表达抗体P2A7.3E11、
20C8.3B8和P1A2.2B11的杂交瘤细胞系分别在2006年3月28日、2006年6月13日和2006
年3月28日被保藏于ATCC，并被分别赋予PTA-7458、PTA-7732和PTA-7457的ATCC保藏
号。表达全长抗体20D8.24B11和P1G10.2B8的杂交瘤细胞系分别在2006年3月28日和
2006年7月11日被保藏于ATCC，并被分别赋予PTA-7456和PTA-7731的ATCC保藏号。
[0422] 在其它实施方案中，用于本发明的组合物的结合部分可衍生自这样的抗体，其对选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的任何抗
体组成的组的抗体交叉阻断(与之竞争)或以其它方式干扰选自P2A7.3E11、20C8.3B8、
P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的结合。在其它实施方案中，结合
部分可包括选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组
的抗体或其片段、变体或衍生物。在其它实施方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL和/或VH)或从其中来的CDR。例如，结合部分可包括选自P2A7.3E11、20C8.3B8、
P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的所有6个CDR或者它可包括来自
选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的少于所有6个的CDR(例如1个、2个、3个、4个或5个CDR)。在一个示例性的实施方案中，结合
特异性包括来自选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的CDR-H3。
体组成的组的抗体交叉阻断(与之竞争)或以其它方式干扰选自P2A7.3E11、20C8.3B8、
P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的结合。在其它实施方案中，结合
部分可包括选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组
的抗体或其片段、变体或衍生物。在其它实施方案中，结合部分可包括抗原结合结构域、可变区(VL和/或VH)或从其中来的CDR。例如，结合部分可包括选自P2A7.3E11、20C8.3B8、
P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的所有6个CDR或者它可包括来自
选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的少于所有6个的CDR(例如1个、2个、3个、4个或5个CDR)。在一个示例性的实施方案中，结合
特异性包括来自选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11和P1G10.2B8所组成的组的抗体的CDR-H3。
[0423] V.包含结合于IGF-1R不同表位的结合分子的组合物
[0424] 本发明提供包含结合于IGF-1R不同表位的结合分子的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物包括具有不同IGF-1R结合特异性的两种IGF-1R结合部分或结合分
子。在其它实施方案，本发明的结合组合物包括具有多种IGF-1R结合特异性的一种IGF-1R
结合分子(即，多特异性IGF-1R结合分子)。在优选实施方案中，本发明的结合组合物对
IGF-1R的结合导致与具有对IGF-1R的单特异性的一种结合分子的使用相比，IGF-1R信号
传导减少。例如，在某些实施方案中，本发明的组合物可导致IGF-1/IGF-2-介导的信号传
导协同减少和/或肿瘤细胞增殖协同减少。这样的组合物可导致更大效力的完全IGF配体
阻断，并还可扩增可通过阻断IGF-1R信号传导有效抑制的靶细胞群。
子。在其它实施方案，本发明的结合组合物包括具有多种IGF-1R结合特异性的一种IGF-1R
结合分子(即，多特异性IGF-1R结合分子)。在优选实施方案中，本发明的结合组合物对
IGF-1R的结合导致与具有对IGF-1R的单特异性的一种结合分子的使用相比，IGF-1R信号
传导减少。例如，在某些实施方案中，本发明的组合物可导致IGF-1/IGF-2-介导的信号传
导协同减少和/或肿瘤细胞增殖协同减少。这样的组合物可导致更大效力的完全IGF配体
阻断，并还可扩增可通过阻断IGF-1R信号传导有效抑制的靶细胞群。
[0425] 在某些实施方案中，本发明的结合组合物或结合分子包括独立地选自以上公开的任何一种结合分子或结合部分的第一和第二结合分子或结合部分。在某些实施方案中，第
一结合部分和第二结合部分对IGF-1R的结合比第一结合部分或第二结合部分单独结合在
更大程度上阻断IGF-1R-介导的信号传导。如本文所用，关于结合分子对IGF-1R的结合
的术语“在更大程度上阻断IGF-1R介导的信号传导”是指这样的一种情况，在其中结合至
IGF-1R的第一表位的第一结合部分(其阻断IGF-1和IGF-2中至少一个对IGF-1R的结
合)与结合至IGF-1R的第二不同表位的第二结合部分(其阻断IGF-1和IGF-2中至少一
个对IGF-1R的结合)之间的结合对于IGF-1R介导的信号传导的阻断超过第一部分或第
二部分单独的结合。可通过若干不同方法测量IGF-1R介导的信号传导的抑制，例如，肿瘤
生长的向下调节(例如肿瘤生长延迟)、肿瘤大小或转移的减少、癌症的临床损伤或症状
的改善或最小化、超过不经这种处理的情况下所期望的受治疗者存活的延长以及在施用前
未形成肿瘤的动物体内(即预防性施用)肿瘤生长的预防。如本文所用，术语“向下调节
(downmodulate)”、“向下调节(downmodulating)”或“向下调节(downmodulation)”是指减少特定的过程发生的速率，抑制特定的过程，逆转特定的过程和/或阻止特定过程的起始。
因此，如果该特定的过程是肿瘤生长或转移，术语“向下调节”包括但不限于减少肿瘤生长和/或转移发生的速率，抑制肿瘤生长和/或转移，逆转肿瘤生长和/或转移(包括肿瘤收
缩和/或根除)和/或预防肿瘤生长和/或转移。
一结合部分和第二结合部分对IGF-1R的结合比第一结合部分或第二结合部分单独结合在
更大程度上阻断IGF-1R-介导的信号传导。如本文所用，关于结合分子对IGF-1R的结合
的术语“在更大程度上阻断IGF-1R介导的信号传导”是指这样的一种情况，在其中结合至
IGF-1R的第一表位的第一结合部分(其阻断IGF-1和IGF-2中至少一个对IGF-1R的结
合)与结合至IGF-1R的第二不同表位的第二结合部分(其阻断IGF-1和IGF-2中至少一
个对IGF-1R的结合)之间的结合对于IGF-1R介导的信号传导的阻断超过第一部分或第
二部分单独的结合。可通过若干不同方法测量IGF-1R介导的信号传导的抑制，例如，肿瘤
生长的向下调节(例如肿瘤生长延迟)、肿瘤大小或转移的减少、癌症的临床损伤或症状
的改善或最小化、超过不经这种处理的情况下所期望的受治疗者存活的延长以及在施用前
未形成肿瘤的动物体内(即预防性施用)肿瘤生长的预防。如本文所用，术语“向下调节
(downmodulate)”、“向下调节(downmodulating)”或“向下调节(downmodulation)”是指减少特定的过程发生的速率，抑制特定的过程，逆转特定的过程和/或阻止特定过程的起始。
因此，如果该特定的过程是肿瘤生长或转移，术语“向下调节”包括但不限于减少肿瘤生长和/或转移发生的速率，抑制肿瘤生长和/或转移，逆转肿瘤生长和/或转移(包括肿瘤收
缩和/或根除)和/或预防肿瘤生长和/或转移。
[0426] 在一个实施方案中，当IGF-1R介导的信号传导在较大程度上被阻断时，观察到加和效应。如本文所用，术语“加和效应”是指这样的情况，在其中第一结合部分和第二结合部分组合的结合总效应大约等于在第一结合部分或第二结合部分单独结合时观察到的效应。
加和效应通常是在这样的条件下被测量的，其中第一结合部分或第二结合部分(单独的)
对IGF-1R的摩尔比值与第一结合部分和第二结合部分(一起的)对IGF-1R的摩尔比值大
约相同。
加和效应通常是在这样的条件下被测量的，其中第一结合部分或第二结合部分(单独的)
对IGF-1R的摩尔比值与第一结合部分和第二结合部分(一起的)对IGF-1R的摩尔比值大
约相同。
[0427] 在一个实施方案中，当IGF-1R介导的信号传导在较大程度上被阻断时，观察到协同效应。如本文所用，术语“协同效应”是指在第一结合部分和第二结合部分结合之时产生比加和大的效应，并且超过单独各自施用第一结合部分或第二结合部分所致的效应。协同
效应通常是在这样的条件下测量，其中第一结合部分或第二结合部分(单独的)对IGF-1R
的摩尔比值与第一结合部分和第二结合部分(一起的)对IGF-1R的摩尔比值大约相同。本
发明的实施方案包括通过使用所述第一IGF-1R结合部分和第二IGF-1R结合部分来产生向
下调节IGF-1R介导的信号传导的协同效应的方法，其中所述效应比对应的加和效应大至
少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
效应通常是在这样的条件下测量，其中第一结合部分或第二结合部分(单独的)对IGF-1R
的摩尔比值与第一结合部分和第二结合部分(一起的)对IGF-1R的摩尔比值大约相同。本
发明的实施方案包括通过使用所述第一IGF-1R结合部分和第二IGF-1R结合部分来产生向
下调节IGF-1R介导的信号传导的协同效应的方法，其中所述效应比对应的加和效应大至
少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
[0428] 在一个实施方案中，使用Chou和Talalay的基于中值效应原理的组合指数(CI)方法(参见Chang等人，Cancer Res.45：2434-2439，(1985))来测量协同效应。此方法计
算在各种细胞毒性水平下两种药物之间的协同、加和或拮抗作用的程度。当CI值小于1时，在两种药物之间存在协同。当CI值是1时，具有加和效应但没有协同效应。大于1的CI
值指示拮抗作用。CI值越小，协同效应越大。在另一个实施方案中，通过使用分级抑制浓度(FIC)来确定协同效应。通过将组合起作用的药物的IC50表示为单独起作用的药物的IC50
的函数来确定该分级值。对于两种相互作用的药物，每种药物的FIC值的总和表示协同相
互作用的量度。当FIC小于1时，在两种药物之间具有协同性。为1的FIC值指示加和效
应。FIC值越小，协同相互作用越大。
算在各种细胞毒性水平下两种药物之间的协同、加和或拮抗作用的程度。当CI值小于1时，在两种药物之间存在协同。当CI值是1时，具有加和效应但没有协同效应。大于1的CI
值指示拮抗作用。CI值越小，协同效应越大。在另一个实施方案中，通过使用分级抑制浓度(FIC)来确定协同效应。通过将组合起作用的药物的IC50表示为单独起作用的药物的IC50
的函数来确定该分级值。对于两种相互作用的药物，每种药物的FIC值的总和表示协同相
互作用的量度。当FIC小于1时，在两种药物之间具有协同性。为1的FIC值指示加和效
应。FIC值越小，协同相互作用越大。
[0429] 在某些可选的实施方案中，当将两种不同化合物(例如不同的结合部分)组合之后发生比使用饱和浓度或剂量的每种化合物所能获得的大的调节时观察到协同效应。这种
形式的协同可发生在单个结合部分本身不能导致完全效应(例如不论使用的药物的浓度
有多高，都达不到100％的向下调节)时。在此情况下，协同效应未被EC50或IC50值的分析
所充分记录。如果两种化合物(例如结合部分)的组合导致比单个化合物所能获得的大的
向下调节，这被认为是强烈的协同效应。
形式的协同可发生在单个结合部分本身不能导致完全效应(例如不论使用的药物的浓度
有多高，都达不到100％的向下调节)时。在此情况下，协同效应未被EC50或IC50值的分析
所充分记录。如果两种化合物(例如结合部分)的组合导致比单个化合物所能获得的大的
向下调节，这被认为是强烈的协同效应。
[0430] 在某些实施方案中，本发明的结合组合物可靶向IGF-1R胞外区上的两个或更多个不同表位(如，两个或更多个不重叠表位)。在一个实施方案中，本发明的结合组合物可
包括结合第一IGF-1R表位的第一结合分子和结合第二IGF-1R表位的第二结合分子。本领
域技术人员将理解，第一和第二IGF-1R表位可位于同一IGF-1R分子上或不同IGF-1R分子
上。
包括结合第一IGF-1R表位的第一结合分子和结合第二IGF-1R表位的第二结合分子。本领
域技术人员将理解，第一和第二IGF-1R表位可位于同一IGF-1R分子上或不同IGF-1R分子
上。
[0431] 在一个实施方案中，本发明的结合组合物结合两个或更多个不同表位，其中该表位独立地选自以下组成的组：位于L1结构域的表位、位于CRR结构域的表位、位于L2结构
域的表位、位于Fn-1结构域的表位、位于Fn-2结构域的表位、位于Fn-3结构域的表位。例
如，本发明的结合组合物可结合位于L2结构域的第一表位和位于CRR结构域的第二表位。
在另一实施方案中，本发明的结合组合物可结合位于同一结构域的两个或更多个表位。在
另一个实施方案中，本发明的结合组合物结合两个或更多个表位，其中至少一个表位由两
个或更多个结构域形成(如，L2结构域与CRR结构域的结合界面中的表位)。
域的表位、位于Fn-1结构域的表位、位于Fn-2结构域的表位、位于Fn-3结构域的表位。例
如，本发明的结合组合物可结合位于L2结构域的第一表位和位于CRR结构域的第二表位。
在另一实施方案中，本发明的结合组合物可结合位于同一结构域的两个或更多个表位。在
另一个实施方案中，本发明的结合组合物结合两个或更多个表位，其中至少一个表位由两
个或更多个结构域形成(如，L2结构域与CRR结构域的结合界面中的表位)。
[0432] 在一个实施方案中，本发明的组合物包括靶向IGF-1R的两个不同表位的一种或多种结合分子，其中每个表位当被结合部分结合时，经由不同机制抑制IGF-1R信号传导。
在一个实施方案中，本发明的结合组合物可靶向变构表位和竞争性表位。
在一个实施方案中，本发明的结合组合物可靶向变构表位和竞争性表位。
[0433] 本发明的结合组合物可结合于IGF-1R中的竞争性表位或变构表位。如本文所用，术语“竞争性表位”是指当被结合分子结合时导致竞争性抑制配体对其受体结合的(如，
IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合)的表位。竞争性表位通常位于受体的配体结合位点
中。IGF-1R的示例性竞争性表位位于CRR结构域靠近IGF-1和IGF-2结合位点的内面上
(参见图1)。对该表位的结合导致竞争性抑制IGF-1和IGF-2结合。如本文所用，术语“变
构表位”是指当被结合分子结合时导致变构抑制配体对其受体的结合的表位。变构表位通
常位于受体中远离配体结合位点的位点。IGF-1R的示例性变构表位位于CRR/L2区的暴露
面(参见图1)。对该表位的结合导致变构IGF-1阻断，但对IGF-2结合几乎无作用。另一
种示例性变构表位位于FnIII-1结构域的外表面(参见图1)。对该表位的结合导致变构阻
断IGF-1和IGF-2两者。
IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合)的表位。竞争性表位通常位于受体的配体结合位点
中。IGF-1R的示例性竞争性表位位于CRR结构域靠近IGF-1和IGF-2结合位点的内面上
(参见图1)。对该表位的结合导致竞争性抑制IGF-1和IGF-2结合。如本文所用，术语“变
构表位”是指当被结合分子结合时导致变构抑制配体对其受体的结合的表位。变构表位通
常位于受体中远离配体结合位点的位点。IGF-1R的示例性变构表位位于CRR/L2区的暴露
面(参见图1)。对该表位的结合导致变构IGF-1阻断，但对IGF-2结合几乎无作用。另一
种示例性变构表位位于FnIII-1结构域的外表面(参见图1)。对该表位的结合导致变构阻
断IGF-1和IGF-2两者。
[0434] 在一个实施方案中，本发明的组合物包括靶向IGF-1R两个不同表位的一种或多种结合分子，其中结合于第一表位的结合部分不交叉阻断(即，与之竞争)结合于第二表位
的第二结合部分。
的第二结合部分。
[0435] A.多种结合分子的组合
[0436] 在本发明某些方面，提供了包含具有不同IGF-1R结合特异性的抑制性抗IGF-1R结合分子的组合(如，两种或更多种抗IGF-1R抗体、抗体片段、抗体变体、适体、或其衍生物)的组合物。例如，本发明的组合物可包括具有第一IGF-1结合特异性的第一抗IGF-1R
结合分子和具有第二IGF-1R结合特异性的第二抗IGF-1R结合分子。在优选实施方案中，
第一和第二结合特异性结合IGF-1R胞外结构域中的不重叠表位。组合物的结合分子可单
独或组合地施用于受治疗者。所述组合物可导致比普通组合物以更高效价(如，更低浓度)
完全阻断配体。在其它实施方案，组合物可导致肿瘤细胞增殖的协同减少。
结合分子和具有第二IGF-1R结合特异性的第二抗IGF-1R结合分子。在优选实施方案中，
第一和第二结合特异性结合IGF-1R胞外结构域中的不重叠表位。组合物的结合分子可单
独或组合地施用于受治疗者。所述组合物可导致比普通组合物以更高效价(如，更低浓度)
完全阻断配体。在其它实施方案，组合物可导致肿瘤细胞增殖的协同减少。
[0437] 本领域技术人员应理解的是，本发明的组合物中结合分子的组合可包括本文公开的结合分子的任何组合。例如，本发明的组合物可包括至少第一和第二结合分子的组合，其中所述结合分子独立地选自本文公开的任何一种结合分子。优选地，结合分子的组合包括：
包含变构结合部分的第一结合分子和包含竞争性结合部分的第二结合分子。在一个实施方
案中，该组合包括：包含变构结合部分的第一抗体或scFv分子(如，本文公开的任何一种稳定化的scFv分子)和包含竞争性结合部分的第二抗体或scFv分子。
包含变构结合部分的第一结合分子和包含竞争性结合部分的第二结合分子。在一个实施方
案中，该组合包括：包含变构结合部分的第一抗体或scFv分子(如，本文公开的任何一种稳定化的scFv分子)和包含竞争性结合部分的第二抗体或scFv分子。
[0438] 本发明的结合分子可以是单价的，即，包括一个靶结合位点(如，在scFv分子的情形)或多于一个靶结合位点。在一个实施方案中，结合分子包括至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包括三个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包括四个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包括大于四个结合位点。
[0439] 在一个实施方案中，本发明的结合分子是单体。在另一实施方案中，本发明的结合分子是多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子是二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体是同二聚体，包括两个相同的单体亚基。在另一实施方案中，本发明的二聚体是异二聚体，包括两个不同的单体亚基。二聚体的亚基可包括一条或多条多肽链。例如，在一个实施方案中，该二聚体包括至少两条多肽链。在一个实施方案中，该二聚体包括两条多肽链。在另一实施方案中，该二聚体包括四条多肽链(如，在抗体分子的情形)。
[0440] B.多特异性结合分子
[0441] 在其它方面，本发明提供包含多特异性IGF-1R结合分子(如，具有两种或更多种IGF-1R结合特异性的多特异性抗IGF-1R抗体、抗体变体、抗体片段或适体)的组合物。本
发明的多特异性IGF-1R结合分子具有两种或更多种不同IGF-1R结合特异性。例如，多特
异性IGF-1R结合分子可包括第一IGF-1R结合特异性和第二IGF-1R结合特异性。在优选
实施方案中，结合特异性识别IGF-1R胞外结构域中的不重叠表位。在一个实施方案中，本
发明的多特异性IGF-1R结合分子可结合同一IGF-1R分子中的不重叠表位。在其它实施方
案，多特异性IGF-1R可结合不同IGF-1R分子中的不重叠表位。在某些实施方案中，本发明
的多特异性结合分子包括来自以上讨论的组合之一中采用的至少一种抗体(优选地两种)
的结合特异性。在其它实施方案，本发明的多特异性结合分子包括连接或融合至具有不同
特异性的第二结合部分的任何以上鉴定的结合分子。
发明的多特异性IGF-1R结合分子具有两种或更多种不同IGF-1R结合特异性。例如，多特
异性IGF-1R结合分子可包括第一IGF-1R结合特异性和第二IGF-1R结合特异性。在优选
实施方案中，结合特异性识别IGF-1R胞外结构域中的不重叠表位。在一个实施方案中，本
发明的多特异性IGF-1R结合分子可结合同一IGF-1R分子中的不重叠表位。在其它实施方
案，多特异性IGF-1R可结合不同IGF-1R分子中的不重叠表位。在某些实施方案中，本发明
的多特异性结合分子包括来自以上讨论的组合之一中采用的至少一种抗体(优选地两种)
的结合特异性。在其它实施方案，本发明的多特异性结合分子包括连接或融合至具有不同
特异性的第二结合部分的任何以上鉴定的结合分子。
[0442] 在某些方面，本发明的多特异性结合分子以比给定参考单特异性抗体更大的亲和性特异性结合IGF-1R多肽或其片段、或IGF-1R变体多肽。结合分子和参考抗体的表观亲
和性可使用本领域已知或实施例中描述的任何方法(如，BIAcore分析)来测量。在具体
实施方案，本发明的多特异性结合分子以比参考抗体的k(off)速率更低(如，小2倍、5倍、
10倍、50倍、或100倍)的k(off)速率结合IGF-1R多肽或其片段或变体。在其它实施方
案，本发明的多特异性结合分子以比参考抗体的结合速率(k(on))更大(如，大2倍、5倍、
10倍、50倍、或100倍)的结合速率结合IGF-1R多肽或其片段或变体。
和性可使用本领域已知或实施例中描述的任何方法(如，BIAcore分析)来测量。在具体
实施方案，本发明的多特异性结合分子以比参考抗体的k(off)速率更低(如，小2倍、5倍、
10倍、50倍、或100倍)的k(off)速率结合IGF-1R多肽或其片段或变体。在其它实施方
案，本发明的多特异性结合分子以比参考抗体的结合速率(k(on))更大(如，大2倍、5倍、
10倍、50倍、或100倍)的结合速率结合IGF-1R多肽或其片段或变体。
[0443] 在一个实施方案中，本发明的结合分子是多特异性的，即，具有结合于第一靶IGF-1R分子或靶分子表位的至少一种结合特异性和结合于第二、不同靶IGF-1R分子或结
合于第一靶IGF-1R分子的第二、不同表位的至少一种第二结合特异性。在某些实施方案
中，本发明的多特异性结合分子(如，双特异性结合分子)包括独立地选自上述结合特异性
的至少两种结合特异性。本发明的结合分子可结合于存在于细胞表面上或可溶的IGF-1R。
合于第一靶IGF-1R分子的第二、不同表位的至少一种第二结合特异性。在某些实施方案
中，本发明的多特异性结合分子(如，双特异性结合分子)包括独立地选自上述结合特异性
的至少两种结合特异性。本发明的结合分子可结合于存在于细胞表面上或可溶的IGF-1R。
[0444] 在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括具有针对细胞表面IGF-1R的至少一个结合部分和针对可溶IGF-1R分子的至少一个结合部分的多特异性结合分子。
在优选实施方案中，本发明的多特异性结合分子具有结合细胞表面IGF-1R分子的两个结
合位点。
在优选实施方案中，本发明的多特异性结合分子具有结合细胞表面IGF-1R分子的两个结
合位点。
[0445] 本领域技术人员应理解的是，本发明的多特异性结合分子可包括本文公开的结合部分的任何组合。例如，在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包括至少第一
和第二结合部分，其中所述第一和第二结合部分独立地选自衍生自本文公开的保藏抗体的
结合部分。在其它实施方案，一种或多种所述结合部分是独立地选自本文公开的任何一种
scFv分子(如，任何一种稳定化的scFv分子)的scFv分子。在其它实施方案，一种或多种
所述结合部分是独立地选自本文公开的抗体的抗体。所述抗体可以是任何IgG同种型(如，
IgG1或IgG4)或糖基化状态(如，糖基化或去糖基化的)。
和第二结合部分，其中所述第一和第二结合部分独立地选自衍生自本文公开的保藏抗体的
结合部分。在其它实施方案，一种或多种所述结合部分是独立地选自本文公开的任何一种
scFv分子(如，任何一种稳定化的scFv分子)的scFv分子。在其它实施方案，一种或多种
所述结合部分是独立地选自本文公开的抗体的抗体。所述抗体可以是任何IgG同种型(如，
IgG1或IgG4)或糖基化状态(如，糖基化或去糖基化的)。
[0446] 在一个实施方案中，本发明的结合分子包括至少一个抑制性IGF-1R结合特异性或结合部分和至少一个变构IGF-1R结合特异性或结合部分。例如，在优选实施方案中，本
发明的结合分子包括竞争性地阻断IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的至少一个竞争
性结合特异性或结合部分和变构地阻断IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的至少一个
变构结合特异性或结合部分。
发明的结合分子包括竞争性地阻断IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的至少一个竞争
性结合特异性或结合部分和变构地阻断IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的至少一个
变构结合特异性或结合部分。
[0447] 在另一实施方案中，本发明的结合分子包括变构地阻断IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合的至少一个变构结合特异性或结合部分和变构地阻断IGF-1(但不是IGF-2)对
IGF-1R的结合的至少一个变构结合特异性或结合部分。
IGF-1R的结合的至少一个变构结合特异性或结合部分。
[0448] 在一个实施方案中，本发明的IGF-1R结合分子是具有对多于一个表位，如，多于一个抗原或同一抗原上的多于一个表位的结合特异性的双特异性IGF-1R结合分子，如，双
特异性抗体、微型抗体、结构域缺失的抗体、或融合蛋白。双特异性IGF-1R结合分子可结合于，如，同一IGF-1R分子上或不同IGF-1R分子上的两个不同靶位点。例如，本发明的双特
异性分子可结合于，如，同一IGF-1R抗原上或两种不同IGF-1R抗原上的两个不同表位。
特异性抗体、微型抗体、结构域缺失的抗体、或融合蛋白。双特异性IGF-1R结合分子可结合于，如，同一IGF-1R分子上或不同IGF-1R分子上的两个不同靶位点。例如，本发明的双特
异性分子可结合于，如，同一IGF-1R抗原上或两种不同IGF-1R抗原上的两个不同表位。
[0449] 在一个实施方案中，双特异性IGF-1R抗体具有对本文公开的靶多肽即IGF-1R上的至少一个表位特异性的至少一个结合结构域。在一个实施方案中，双特异性IGF-1R抗体
具有至少一种对IGF-1R上的竞争性表位的结合特异性或结合部分和至少一种对IGF-1R上
的变构表位的结合特异性。双特异性IGF-1R抗体可以是四价抗体，具有两种对本文公开的
靶IGF-1R多肽的第一表位特异性的结合特异性或结合部分和两个对靶IGF-1R靶多肽的第
二表位特异性的靶结合结构域。因此，四价双特异性IGF-1R抗体对每种特异性可以是二价
的。
具有至少一种对IGF-1R上的竞争性表位的结合特异性或结合部分和至少一种对IGF-1R上
的变构表位的结合特异性。双特异性IGF-1R抗体可以是四价抗体，具有两种对本文公开的
靶IGF-1R多肽的第一表位特异性的结合特异性或结合部分和两个对靶IGF-1R靶多肽的第
二表位特异性的靶结合结构域。因此，四价双特异性IGF-1R抗体对每种特异性可以是二价
的。
[0450] 本发明的多特异性结合分子对每种特异性可以是多价的，或对每种特异性是多价的。在一个实施方案中，本发明的双特异性结合分子可包括与第一IGF-1R分子相互作用
的一个结合位点和与第二靶IGF-1R分子相互作用的一个结合位点(如，双特异性抗体分
子、融合蛋白或微型抗体)。在另一实施方案中，本发明的双特异性结合分子可包括与第一IGF-1R靶分子相互作用的两个结合位点和与第二IGF-1R靶分子相互作用的两个结合位点
(如，双特异性scFv2四价抗体、四价微型抗体或双抗体)。
的一个结合位点和与第二靶IGF-1R分子相互作用的一个结合位点(如，双特异性抗体分
子、融合蛋白或微型抗体)。在另一实施方案中，本发明的双特异性结合分子可包括与第一IGF-1R靶分子相互作用的两个结合位点和与第二IGF-1R靶分子相互作用的两个结合位点
(如，双特异性scFv2四价抗体、四价微型抗体或双抗体)。
[0451] 在另一实施方案中，双特异性结合分子能够结合的第一和第二IGF-1R分子位于同一细胞上或相同细胞类型上。通过交联同一细胞上的第一和第二受体，本发明的双特异
性结合分子可抑制与第一和第二受体之一或两者相关的活性(如，信号转导活性)或导致
增强的受体向下调节或内化。
性结合分子可抑制与第一和第二受体之一或两者相关的活性(如，信号转导活性)或导致
增强的受体向下调节或内化。
[0452] 在一个实施方案中，本发明的多特异性IGF-1R结合分子可包括对抗原而不是IGF-1R的结合部分。例如，本发明的多特异性结合分子可具有对药物或毒素特异性的结合
部分。在另一个示例性实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包括对IGF-2R或胰岛素
受体的结合部分。
部分。在另一个示例性实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包括对IGF-2R或胰岛素
受体的结合部分。
[0453] 产生多特异性分子的方法是本领域公知的。例如，重组技术可用于产生多特异性分子，如，双抗体、单链双抗体、串联scFv等等。用于产生多特异性分子的示例性技术是本领域已知的(如，Kontermann等人.Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)第
248卷：Antibody Engineering：Methods and Protocols(抗体人工改造的方法和实验方
案).第227-242页、US 2003/0207346 A1和其中引用的参考文献)。在一个实施方案中，
使用诸如以下描述的方法制备多聚的多特异性分子，如，US 2003/0207346 A1或美国专利
第5,821,333号、或US2004/0058400。
248卷：Antibody Engineering：Methods and Protocols(抗体人工改造的方法和实验方
案).第227-242页、US 2003/0207346 A1和其中引用的参考文献)。在一个实施方案中，
使用诸如以下描述的方法制备多聚的多特异性分子，如，US 2003/0207346 A1或美国专利
第5,821,333号、或US2004/0058400。
[0454] VI.结合分子的示例性形式
[0455] A单特异性结合分子
[0456] i)IGF-1R抗体
[0457] 在某些实施方案中，本发明的IGF-1R结合分子是抗体或包括抗体作为结合分子中的一种或多种结合部分。本发明的抗体可由本领域已知用于合成抗体的任何方法产生，
特别是通过化学合成，或优选地通过本文所述的重组表达技术。例如，可以使用技术人员
熟知的技术选择和培养产生抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物
中都有描述。在这点上，如下所述适合用于本发明的技术描述在Current Protocols in
Immunology(免疫学最新实验方案)，Coligan等人编辑，Green Publishing Associates
andWiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)包括附录中，其通过引用整体并入本文。
特别是通过化学合成，或优选地通过本文所述的重组表达技术。例如，可以使用技术人员
熟知的技术选择和培养产生抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物
中都有描述。在这点上，如下所述适合用于本发明的技术描述在Current Protocols in
Immunology(免疫学最新实验方案)，Coligan等人编辑，Green Publishing Associates
andWiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)包括附录中，其通过引用整体并入本文。
[0458] 然而本发明的其它实施方案包括在不能够产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中生产人类的或基本上是人类的抗体(参见例如美国专利第6,075,181、
5,939,598、5,591,669和5,589,369号，其每一个都通过引用并入本文)。例如已经描述，
嵌合的和种系突变小鼠中抗体重链连接区纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人
类免疫球蛋白基因阵列转移至这种种系突变小鼠将在抗原攻击时导致人类抗体的产生。使
用SCID小鼠产生人类抗体的另一个优选的方法公开在美国专利第5,811,524号中，其通过
引用被并入本文。将会理解的是，还可按照本文所述来分离并操作与这些人类抗体相关的
遗传物质。
5,939,598、5,591,669和5,589,369号，其每一个都通过引用并入本文)。例如已经描述，
嵌合的和种系突变小鼠中抗体重链连接区纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人
类免疫球蛋白基因阵列转移至这种种系突变小鼠将在抗原攻击时导致人类抗体的产生。使
用SCID小鼠产生人类抗体的另一个优选的方法公开在美国专利第5,811,524号中，其通过
引用被并入本文。将会理解的是，还可按照本文所述来分离并操作与这些人类抗体相关的
遗传物质。
[0459] 在另一个实施方案中，可通过显微操作来选择淋巴细胞，并且分离可变基因。例如，可从免疫接种的哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养大约7天。可筛选培养物
中符合筛选标准的特异性IgG。可以分离来自阳性孔的细胞。可通过FACS或在补体介导的
溶血斑测定中鉴定单个的产生Ig的B细胞来分离它们。可将产生Ig的B细胞显微操作进
入管中，并使用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。可将VH和VL基因克隆进抗体表达载体中
并转染进细胞(例如真核或原核细胞)以表达。
中符合筛选标准的特异性IgG。可以分离来自阳性孔的细胞。可通过FACS或在补体介导的
溶血斑测定中鉴定单个的产生Ig的B细胞来分离它们。可将产生Ig的B细胞显微操作进
入管中，并使用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。可将VH和VL基因克隆进抗体表达载体中
并转染进细胞(例如真核或原核细胞)以表达。
[0460] 某些实施方案中，IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变和恒定区二者都完全是人类的。可以使用本领域已知的和本文所描述的技术来制备完全是人类的抗
体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物来制备针对特异性抗原的完全是人类的抗体，其中所述转基因动物被修饰以产生这种抗体而作为对抗原性攻击的响应，但是其内源性基
因座已失去功能。可被用来制备这种抗体的示例性的技术被描述于美国专利：6,150,584；
6,458,592；6,420,140。其它技术是本领域已知的。可以通过各种展示技术例如噬菌体展
示或其它病毒展示系统来同样地产生完全是人类的抗体，如本文其它地方更详细所述。
体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物来制备针对特异性抗原的完全是人类的抗体，其中所述转基因动物被修饰以产生这种抗体而作为对抗原性攻击的响应，但是其内源性基
因座已失去功能。可被用来制备这种抗体的示例性的技术被描述于美国专利：6,150,584；
6,458,592；6,420,140。其它技术是本领域已知的。可以通过各种展示技术例如噬菌体展
示或其它病毒展示系统来同样地产生完全是人类的抗体，如本文其它地方更详细所述。
[0461] 可通过本领域熟知的各种程序产生感兴趣的表位的多克隆抗体。例如，可将包含感兴趣的表位的抗原施用于各种宿主动物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等)以诱导含有对该抗原有特异性的多克隆抗体的血清的产生。可以根据宿主的物种
来使用各种佐剂以增加免疫应答，而且佐剂包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿
物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、多聚阴离子、肽、油乳化液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌
(Corynebacterium parvum)。这样的佐剂也是本领域中熟知的。
来使用各种佐剂以增加免疫应答，而且佐剂包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、矿
物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、多聚阴离子、肽、油乳化液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌
(Corynebacterium parvum)。这样的佐剂也是本领域中熟知的。
[0462] 可以使用本领域已知的各种各样的技术来制备单克隆IGF-1R抗体，其中所述技术包括杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克
隆抗体，其中所述杂交瘤技术包括本领域已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies：
ALaboratory Manual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版
(1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中所教导的那些(所述参考文献以其整体
通过引用被并入)。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。
术语“单克隆抗体”是指衍生自包括任何真核的、原核的或噬菌体克隆在内的单个克隆的抗体，而不是指产生它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。可以使用IGF-1R敲除小鼠制备单克隆抗体以增加表位识别的区域。可以使用本领域
已知的各种各样的技术来制备单克隆抗体，包括使用如本文其他地方所述的杂交瘤和重组
和噬菌体展示技术。
隆抗体，其中所述杂交瘤技术包括本领域已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies：
ALaboratory Manual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版
(1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中所教导的那些(所述参考文献以其整体
通过引用被并入)。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。
术语“单克隆抗体”是指衍生自包括任何真核的、原核的或噬菌体克隆在内的单个克隆的抗体，而不是指产生它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。可以使用IGF-1R敲除小鼠制备单克隆抗体以增加表位识别的区域。可以使用本领域
已知的各种各样的技术来制备单克隆抗体，包括使用如本文其他地方所述的杂交瘤和重组
和噬菌体展示技术。
[0463] 在一个实例中，使用本领域公认的方案，通过多次在皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的IGF-1R或者含IGF-1R的细胞或细胞提取物)和佐剂来在哺乳动物体内产生
抗体。此免疫接种通常引发这样的免疫应答，其包括来自激活的脾细胞或淋巴细胞的抗原
反应性抗体的产生。虽然所得的抗体可从动物血清收集以提供多克隆制品，但是常常期望
从脾脏、淋巴结或外周血来分离单独的淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的同源制品。优
选地，从脾脏获得淋巴细胞。在这个熟知的过程(Kohler等人，Nature 256：495(1975))
中，与抗原一起被注射的来自哺乳动物的相对短命的或必死的淋巴细胞与不死的肿瘤细胞
系(例如骨髓瘤细胞系)融合，因此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是不死的又能够产生B细胞的遗传编码的抗体。通过选择、稀释和再生长而将所得的杂交物分离成单个的遗传品
系，而每个单个的品系包括形成单个抗体的特定基因。它们产生对期望的抗原有同源性的
抗体，并且根据它们纯的遗传谱系被称为“单克隆的”。
抗体。此免疫接种通常引发这样的免疫应答，其包括来自激活的脾细胞或淋巴细胞的抗原
反应性抗体的产生。虽然所得的抗体可从动物血清收集以提供多克隆制品，但是常常期望
从脾脏、淋巴结或外周血来分离单独的淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的同源制品。优
选地，从脾脏获得淋巴细胞。在这个熟知的过程(Kohler等人，Nature 256：495(1975))
中，与抗原一起被注射的来自哺乳动物的相对短命的或必死的淋巴细胞与不死的肿瘤细胞
系(例如骨髓瘤细胞系)融合，因此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是不死的又能够产生B细胞的遗传编码的抗体。通过选择、稀释和再生长而将所得的杂交物分离成单个的遗传品
系，而每个单个的品系包括形成单个抗体的特定基因。它们产生对期望的抗原有同源性的
抗体，并且根据它们纯的遗传谱系被称为“单克隆的”。
[0464] 如此制备的杂交瘤细胞被接种并生长在适合的培养基中，其优选地含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。本领域技术人员将会理解，杂交
瘤的形成、选择和生长所需的试剂、细胞系和培养基是可从若干商业来源获得的，而且很
好地建立了标准化方案。通常，对杂交瘤细胞所生长的培养基进行测定以鉴定针对期望
抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过体外测定来确定杂交瘤细胞所产生的单克隆抗
体的结合特异性，其中所述测定例如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定
(ELISA)。在确认产生有希望的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通
过限制稀释程序对所述克隆进行亚克隆，并通过标准方法使其生长(Goding，Monoclonal
Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体的原理和实践)，Academic Press，
第59-103页(1986))。还将理解的是，由亚克隆所分泌的单克隆抗体可通过常规的纯化步
骤而从培养基、腹水或血清中分离，其中所述步骤例如蛋白A、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、透析或亲和色谱法。
瘤的形成、选择和生长所需的试剂、细胞系和培养基是可从若干商业来源获得的，而且很
好地建立了标准化方案。通常，对杂交瘤细胞所生长的培养基进行测定以鉴定针对期望
抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过体外测定来确定杂交瘤细胞所产生的单克隆抗
体的结合特异性，其中所述测定例如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定
(ELISA)。在确认产生有希望的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可通
过限制稀释程序对所述克隆进行亚克隆，并通过标准方法使其生长(Goding，Monoclonal
Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体的原理和实践)，Academic Press，
第59-103页(1986))。还将理解的是，由亚克隆所分泌的单克隆抗体可通过常规的纯化步
骤而从培养基、腹水或血清中分离，其中所述步骤例如蛋白A、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、透析或亲和色谱法。
[0465] 本领域技术人员还将理解，编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)的DNA还可衍生自抗体文库，例如噬菌体展示文库。特别地，这种噬菌体可用来展示从所有组成成分或组合抗体文库(例如人类或鼠的)表达的抗原结合结构域。可以使用抗原来选择或鉴定
表达结合至感兴趣抗原的抗原结合结构域的噬菌体，其使用例如标记的抗原或者被结合或
俘获在固体表面或珠子上的抗原。用在这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括从
含有Fab的噬菌体表达的fd和M13结合结构域、Fv OE DAB(来自轻链或重链的单个Fv区)
或者重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的用二硫键稳定的Fv抗体结构域。示
例性的方法列在例如EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames，
Immunol.Today21：371(2000)；Nagy等人.Nat.Med.8：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui等人，J.Mol.Biol.315：1063(2002)中，其每一个都通过引用被并入本文。一些出版物(例如Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))
描述了通过链改组来产生高亲和性人类抗体，以及作为构建大噬菌体文库的策略的组合感
染和体内重组。在另一个实施方案中，核糖体展示可被用来替代噬菌体而作为展示平台
(参见例如Hanes等人，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 98：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在另一
个实施方案中，可以筛选细胞表面文库以寻找抗体(Boder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
97：10701(2000)；Daugherty等人，J.Immunol.Methods243：211(2000))。在另一个示例
性实施方案中，通过组合衍生自人类供体的免疫球蛋白序列与所选的互补决定区诸如CDR
H1和CDR H2中的合成多样性来设计高亲和力人类Fab文库(参见如，Hoet等人，Nature
Biotechnol，23：344-348(2005)，通过引用并入本文)。这样的程序为分离和随后克隆单克隆抗体的传统杂交瘤技术提供替代。
表达结合至感兴趣抗原的抗原结合结构域的噬菌体，其使用例如标记的抗原或者被结合或
俘获在固体表面或珠子上的抗原。用在这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括从
含有Fab的噬菌体表达的fd和M13结合结构域、Fv OE DAB(来自轻链或重链的单个Fv区)
或者重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的用二硫键稳定的Fv抗体结构域。示
例性的方法列在例如EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames，
Immunol.Today21：371(2000)；Nagy等人.Nat.Med.8：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui等人，J.Mol.Biol.315：1063(2002)中，其每一个都通过引用被并入本文。一些出版物(例如Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))
描述了通过链改组来产生高亲和性人类抗体，以及作为构建大噬菌体文库的策略的组合感
染和体内重组。在另一个实施方案中，核糖体展示可被用来替代噬菌体而作为展示平台
(参见例如Hanes等人，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 98：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在另一
个实施方案中，可以筛选细胞表面文库以寻找抗体(Boder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
97：10701(2000)；Daugherty等人，J.Immunol.Methods243：211(2000))。在另一个示例
性实施方案中，通过组合衍生自人类供体的免疫球蛋白序列与所选的互补决定区诸如CDR
H1和CDR H2中的合成多样性来设计高亲和力人类Fab文库(参见如，Hoet等人，Nature
Biotechnol，23：344-348(2005)，通过引用并入本文)。这样的程序为分离和随后克隆单克隆抗体的传统杂交瘤技术提供替代。
[0466] 在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在噬菌体颗粒的表面上，其载有编码它们的多核苷酸序列。例如，编码VH和VL区的DNA序列被扩增或以其它方式从动物
cDNA文库(例如人类或鼠淋巴样组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库中分离。在某些
实施方案中，编码VH和VL区的DNA通过PCR被scFv连接序列连接在一起，并被克隆进噬
菌粒载体(例如p CANTAB 6或pComb 3 HSS)。将所述载体经过电穿孔导入大肠杆菌，并
用辅助噬菌体将大肠杆菌感染。用于这些方法的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌
体，而且VH或VL区常常被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII。可以使用抗原来选
择或鉴定表达结合至感兴趣抗原的抗原结合结构域(即IGF-1R多肽或其片段)的噬菌体，
其使用例如标记的抗原或者被结合或俘获在固体表面或珠子上的抗原。
cDNA文库(例如人类或鼠淋巴样组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库中分离。在某些
实施方案中，编码VH和VL区的DNA通过PCR被scFv连接序列连接在一起，并被克隆进噬
菌粒载体(例如p CANTAB 6或pComb 3 HSS)。将所述载体经过电穿孔导入大肠杆菌，并
用辅助噬菌体将大肠杆菌感染。用于这些方法的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌
体，而且VH或VL区常常被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII。可以使用抗原来选
择或鉴定表达结合至感兴趣抗原的抗原结合结构域(即IGF-1R多肽或其片段)的噬菌体，
其使用例如标记的抗原或者被结合或俘获在固体表面或珠子上的抗原。
[0467] 可被用来制备抗体的噬菌体展示方法的另外的实例包括在Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames 等 人，J.Immunol.Methods 184：
177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO95/20401；以 及 美 国 专 利 第 5,698,426、5,223,409、
5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、
5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108号中所公开的那些，其每一个都通过引用以其整体被并入本文。
177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO95/20401；以 及 美 国 专 利 第 5,698,426、5,223,409、
5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、
5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108号中所公开的那些，其每一个都通过引用以其整体被并入本文。
[0468] 如上面的参考文献所述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的编码抗体的区域可被分离并用来产生包括人类抗体在内的完整抗体或任何其它期望的抗原结合片段，而且被表
达在任何期望的宿主中，其中所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，还可利用使用本领域已知的方法来重组地产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技
术，其中所述方法例如公开在PCT公布WO92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：
864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；以及Better等人，Science240：
1041-1043(1988)中的那些(所述参考文献以其整体通过引用被并入)。
达在任何期望的宿主中，其中所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，还可利用使用本领域已知的方法来重组地产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技
术，其中所述方法例如公开在PCT公布WO92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：
864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；以及Better等人，Science240：
1041-1043(1988)中的那些(所述参考文献以其整体通过引用被并入)。
[0469] 可被用来产生单链Fv和抗体的技术的例子包括在美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston等人，Methods in Enzymology203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：
7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)中所述的那些。
7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)中所述的那些。
[0470] 对于一些用途(其包括人类抗体的体内用途和体外检测测定)，优选使用嵌合的、人源化的或人类的抗体。
[0471] 完全人类的抗体是在人类患者的治疗中特别期望的。可通过本领域已知的各种方法制备人类抗体，其包括上述的使用衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体
展示方法。还参见美国专利第4,444,887和4,716,111号；和PCT公布WO 98/46645、WO
98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，其每一个都通过引用以其整体被并入本文。
展示方法。还参见美国专利第4,444,887和4,716,111号；和PCT公布WO 98/46645、WO
98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741，其每一个都通过引用以其整体被并入本文。
[0472] 还可使用转基因小鼠来产生人类抗体，其中所述转基因小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但是能表达人类免疫球蛋白基因。例如，可将人类重链和轻链免疫球蛋白
基因复合物随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除人类重链和轻链基因
之外，人类可变区、恒定区和多变区可被引入小鼠胚胎干细胞。随着通过同源重组将人类免疫球蛋白基因座引入，小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可被分别或同时变得无功能。特别
地，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞展开并微注射进胚泡以
产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠繁殖以产生表达人类抗体的纯合子后代。以通常方式用所
选的抗原例如期望的靶多肽的全部或一部分来对转基因小鼠进行免疫接种。可使用常规的
杂交瘤技术从被免疫接种的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所
含的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化时重排，并且随后进行类转换和体细胞突变。因
此，使用这种技术可能产生治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于产生人类抗体的该
技术的概况，参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。关于产生人类
抗体和人类单克隆抗体的该技术以及产生这种抗体的程序的详细讨论，参见例如PCT公布
WO 98/24893、WO 96/34096、WO96/33735；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、
5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，其通过引用以其整体被
并入本文。另外，可委托例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，
Calif.)等公司使用与上述相似的技术来提供针对所选抗原的人类抗体。
基因复合物随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除人类重链和轻链基因
之外，人类可变区、恒定区和多变区可被引入小鼠胚胎干细胞。随着通过同源重组将人类免疫球蛋白基因座引入，小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可被分别或同时变得无功能。特别
地，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞展开并微注射进胚泡以
产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠繁殖以产生表达人类抗体的纯合子后代。以通常方式用所
选的抗原例如期望的靶多肽的全部或一部分来对转基因小鼠进行免疫接种。可使用常规的
杂交瘤技术从被免疫接种的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所
含的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化时重排，并且随后进行类转换和体细胞突变。因
此，使用这种技术可能产生治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于产生人类抗体的该
技术的概况，参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。关于产生人类
抗体和人类单克隆抗体的该技术以及产生这种抗体的程序的详细讨论，参见例如PCT公布
WO 98/24893、WO 96/34096、WO96/33735；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、
5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，其通过引用以其整体被
并入本文。另外，可委托例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，
Calif.)等公司使用与上述相似的技术来提供针对所选抗原的人类抗体。
[0473] 可使用称作“定向选择”的技术产生识别所选的表位的完全人类的抗体。在该方法中，所选的非人类单克隆抗体例如小鼠抗体被用来指导对识别相同表位的完全人类的
抗体的选择。(Jespers等人，Bio/Technology 12：899-903(1994)。还参见美国专利第
5,565,332号。)
抗体的选择。(Jespers等人，Bio/Technology 12：899-903(1994)。还参见美国专利第
5,565,332号。)
[0474] 此外，可以反过来利用本发明靶多肽的抗体通过本领域技术人员熟知的技术来产生“模仿”靶多肽的抗独特型抗体。(参见例如Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：
437-444(1989)和Nisinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合至并且竞争性地抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体结合的抗体可被用来产生“模仿”多肽多
聚化和/或结合结构域的抗独特型，并且因此结合至而且中和多肽和/或其配体。这种中
和的抗独特型或这种抗独特型的Fab片段可被用在治疗方案中以中和多肽配体。例如，这
种抗独特型抗体可被用来结合期望的靶多肽和/或结合它的配体/受体，并且从而阻断它
的生物活性。
437-444(1989)和Nisinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合至并且竞争性地抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体结合的抗体可被用来产生“模仿”多肽多
聚化和/或结合结构域的抗独特型，并且因此结合至而且中和多肽和/或其配体。这种中
和的抗独特型或这种抗独特型的Fab片段可被用在治疗方案中以中和多肽配体。例如，这
种抗独特型抗体可被用来结合期望的靶多肽和/或结合它的配体/受体，并且从而阻断它
的生物活性。
[0475] ii 单链结合分子
[0476] 在其它实施方案，本发明的结合分子可以是单链结合分子(如，单链可变区或scFv)或可包括所述单链结合分子作为结合部分。优选地，该单链结合分子特异性地或优先地结合IGF-1R。所述的生产单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science242：
423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；和Ward等
人，Nature 334：544-554(1989))可被修改以产生单链结合分子。通过氨基酸桥将Fv区的
重链和轻链片段连接以形成单链抗体，从而得到单链抗体。还可以使用在大肠杆菌中装配
功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science242：1038-1041(1988))。
423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；和Ward等
人，Nature 334：544-554(1989))可被修改以产生单链结合分子。通过氨基酸桥将Fv区的
重链和轻链片段连接以形成单链抗体，从而得到单链抗体。还可以使用在大肠杆菌中装配
功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science242：1038-1041(1988))。
[0477] 在某些实施方案中，本发明的结合分子是scFv分子(如，由scFv连接序列连接的VH和VL结构域)或包括这样的分子。scFv分子可以是普通scFv分子或稳定化的scFv
分子。包含稳定化突变、二硫键、或对scFv或对包含scFv的结合分子赋予提高的稳定
性(如，提高的热稳定性)的优化的连接序列的稳定化的scFv详细描述在美国专利申请
第11/725,970号，其通过引用全文并入本文。在其它实施方案，本发明的结合分子是包含
scFv分子的多肽。当本发明的稳定化的scFv分子融合到第二分子时，第二分子也可对融
合蛋白赋予结合特异性。稳定化的scFv分子具有提高的热稳定性(如，解链温度(Tm)值
大于54℃(如，55、56、57、58、59、60℃或更高)或T50值大于39℃(如，大于40、41、42、43、
44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80℃)。在一个优选的实施方案中，稳定化的scFv分子具有大于50℃的T50。在另一个优选的实施方案中，稳定化的scFv分子具有大于60℃的
T50。
分子。包含稳定化突变、二硫键、或对scFv或对包含scFv的结合分子赋予提高的稳定
性(如，提高的热稳定性)的优化的连接序列的稳定化的scFv详细描述在美国专利申请
第11/725,970号，其通过引用全文并入本文。在其它实施方案，本发明的结合分子是包含
scFv分子的多肽。当本发明的稳定化的scFv分子融合到第二分子时，第二分子也可对融
合蛋白赋予结合特异性。稳定化的scFv分子具有提高的热稳定性(如，解链温度(Tm)值
大于54℃(如，55、56、57、58、59、60℃或更高)或T50值大于39℃(如，大于40、41、42、43、
44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80℃)。在一个优选的实施方案中，稳定化的scFv分子具有大于50℃的T50。在另一个优选的实施方案中，稳定化的scFv分子具有大于60℃的
T50。
[0478] 本发明的scFv分子的稳定性可使用本领域已知的方法确定，如美国专利申请第11/725,970号(美国专利申请公布第2008/0050370号)中描述的方法，该申请的内容通过
引用并入本文。
引用并入本文。
[0479] 本发明的scFv分子或包含其的融合蛋白的稳定性可参照普通(非稳定化的)scFv分子或包含普通scFv分子的结合分子的生物物理特征(如，热稳定性)来评价。在一个实
施方案中，本发明的结合分子具有比对照结合分子(如，普通scFv分子)大约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10摄氏度的热稳定性。
施方案中，本发明的结合分子具有比对照结合分子(如，普通scFv分子)大约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10摄氏度的热稳定性。
[0480] 在一个实施方案中，scFv连接序列由氨基酸序列(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：135)组成或包括(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：135)序列。其它示例性连接序列包括(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)和(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)序列或由其组成。本发明的scFv连接序列可具有
不同的长度。在一个实施方案中，本发明的scFv连接序列长度从约5个到约50个氨基酸。
在另一实施方案中，本发明的scFv连接序列长度从约10个到约40个氨基酸。在另一实施
方案中，本发明的scFv连接序列长度从约15个到约30个氨基酸。在另一实施方案中，本
发明的scFv连接序列长度从约17个到约28个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的scFv
连接序列长度从约19个到约26个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的scFv连接序列长
度从约21个到约24个氨基酸。
不同的长度。在一个实施方案中，本发明的scFv连接序列长度从约5个到约50个氨基酸。
在另一实施方案中，本发明的scFv连接序列长度从约10个到约40个氨基酸。在另一实施
方案中，本发明的scFv连接序列长度从约15个到约30个氨基酸。在另一实施方案中，本
发明的scFv连接序列长度从约17个到约28个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的scFv
连接序列长度从约19个到约26个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的scFv连接序列长
度从约21个到约24个氨基酸。
[0481] 在某些实施方案中，本发明的稳定化的scFv分子包括连接VL结构域中的氨基酸与VH结构域中的氨基酸的至少一个二硫键。半胱氨酸残基对于提供二硫键是必需的。二硫
键可被包括在本发明的scFv分子中，如，以连接VL的FR4与VH的FR2或以连接VL的FR2与
VH的FR4。根据Kabat编号，成二硫键的示例性位置包括：VH的43、44、45、46、47、103、104、
105和106与VL的42、43、44、45、46、98、99、100和101。被突变为半胱氨酸残基的示例性氨基酸位置的组合包括：VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44和VH103-VL45。
在一个实施方案中，二硫键连接VH氨基酸44和VL氨基酸100。
键可被包括在本发明的scFv分子中，如，以连接VL的FR4与VH的FR2或以连接VL的FR2与
VH的FR4。根据Kabat编号，成二硫键的示例性位置包括：VH的43、44、45、46、47、103、104、
105和106与VL的42、43、44、45、46、98、99、100和101。被突变为半胱氨酸残基的示例性氨基酸位置的组合包括：VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44和VH103-VL45。
在一个实施方案中，二硫键连接VH氨基酸44和VL氨基酸100。
[0482] 在一个实施方案中，本发明的稳定化的scFv分子包括介于VH结构域和VL结构域之间、具有氨基酸序列(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：135)的scFv连接序列，其中VH和VL结构域
由VH中在氨基酸位置44的氨基酸与VL中在氨基酸位置100的氨基酸之间的二硫键连接。
由VH中在氨基酸位置44的氨基酸与VL中在氨基酸位置100的氨基酸之间的二硫键连接。
[0483] 在其它实施方案中，本发明的稳定化的scFv分子包括scFv的可变结构域(VH或VL)中的一个或多个(如，2、3、4、5或更多)稳定化突变。在某些实施方案中，稳定化突变被引入本文公开的任何VH或VL可变结构域(如，来自M13-CO6抗体(SEQ ID NO：78)或
M14-G11抗体(SEQ ID NO：93)的VL结构域或来自M13-CO6抗体(SEQ ID NO：14)或M14-G11
抗体(SEQ ID NO：32)的VH结构域)。
M14-G11抗体(SEQ ID NO：93)的VL结构域或来自M13-CO6抗体(SEQ ID NO：14)或M14-G11
抗体(SEQ ID NO：32)的VH结构域)。
[0484] 在一个实施方案中，该稳定化突变选自以下组成的组：a)用例如丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、天冬氨酸或甘氨酸取代VL的Kabat位置3的氨基酸(如，谷氨酰胺)；(b)用例如亮氨酸取代VL的Kabat位置46的氨基酸(如，丝氨酸)；(c)用例如酪氨酸或丝氨酸取代
VL的Kabat位置49的氨基酸(如，丝氨酸)；(d)用例如丝氨酸、苏氨酸、和精氨酸、天冬氨
酸、甘氨酸或赖氨酸取代VL的Kabat位置50的氨基酸(如，丝氨酸或缬氨酸)；(e)分别用
酪氨酸和丝氨酸；酪氨酸和苏氨酸；酪氨酸和精氨酸；酪氨酸和甘氨酸；丝氨酸和精氨酸；
或丝氨酸和赖氨酸取代VL的Kabat位置49的氨基酸(如，丝氨酸)和Kabat位置50的氨
基酸(如，丝氨酸)；(f)用例如异亮氨酸取代VL的Kabat位置75的氨基酸(如，缬氨酸)；
(g)用例如丝氨酸或甘氨酸取代VL的Kabat位置80的氨基酸(如，脯氨酸)；(h)用例如
丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸取代VL的Kabat位置83的氨基酸(如，苯丙氨酸)；(i)
用例如谷氨酰胺取代VH的Kabat位置6的氨基酸(如，谷氨酸)；(j)用例如谷氨酸酯取
代VH的Kabat位置13的氨基酸(如，赖氨酸)；(k)用例如谷氨酸酯或谷氨酰胺取代VH的
Kabat位置16的氨基酸(如，丝氨酸)；(l)用例如异亮氨酸取代VH的Kabat位置20的氨
基酸(如，缬氨酸)；(m)用例如丝氨酸取代VH的Kabat位置32的氨基酸(如，天冬酰胺)；
(n)用例如赖氨酸或精氨酸取代VH的Kabat位置43的氨基酸(如，谷氨酰胺)；(o)用例
如异亮氨酸或甘氨酸取代VH的Kabat位置48的氨基酸(如，甲硫氨酸)；(p)用例如甘氨
酸或丙氨酸取代VH的Kabat位置49的氨基酸(如，丝氨酸)；(q)用例如甘氨酸取代VH的
Kabat位置55的氨基酸(如，缬氨酸)；(r)用例如异亮氨酸或亮氨酸取代VH的Kabat位
置67的氨基酸(如，缬氨酸)；(s)用例如天冬氨酸酯或天冬酰胺取代VH的Kabat位置72
的氨基酸(如，谷氨酸)；(t)用例如丝氨酸、缬氨酸或酪氨酸取代VH的Kabat位置79的氨
基酸(如，苯丙氨酸)；和(u)用例如天冬氨酸取代VH的Kabat位置101的氨基酸(如，脯
氨酸)。
VL的Kabat位置49的氨基酸(如，丝氨酸)；(d)用例如丝氨酸、苏氨酸、和精氨酸、天冬氨
酸、甘氨酸或赖氨酸取代VL的Kabat位置50的氨基酸(如，丝氨酸或缬氨酸)；(e)分别用
酪氨酸和丝氨酸；酪氨酸和苏氨酸；酪氨酸和精氨酸；酪氨酸和甘氨酸；丝氨酸和精氨酸；
或丝氨酸和赖氨酸取代VL的Kabat位置49的氨基酸(如，丝氨酸)和Kabat位置50的氨
基酸(如，丝氨酸)；(f)用例如异亮氨酸取代VL的Kabat位置75的氨基酸(如，缬氨酸)；
(g)用例如丝氨酸或甘氨酸取代VL的Kabat位置80的氨基酸(如，脯氨酸)；(h)用例如
丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸取代VL的Kabat位置83的氨基酸(如，苯丙氨酸)；(i)
用例如谷氨酰胺取代VH的Kabat位置6的氨基酸(如，谷氨酸)；(j)用例如谷氨酸酯取
代VH的Kabat位置13的氨基酸(如，赖氨酸)；(k)用例如谷氨酸酯或谷氨酰胺取代VH的
Kabat位置16的氨基酸(如，丝氨酸)；(l)用例如异亮氨酸取代VH的Kabat位置20的氨
基酸(如，缬氨酸)；(m)用例如丝氨酸取代VH的Kabat位置32的氨基酸(如，天冬酰胺)；
(n)用例如赖氨酸或精氨酸取代VH的Kabat位置43的氨基酸(如，谷氨酰胺)；(o)用例
如异亮氨酸或甘氨酸取代VH的Kabat位置48的氨基酸(如，甲硫氨酸)；(p)用例如甘氨
酸或丙氨酸取代VH的Kabat位置49的氨基酸(如，丝氨酸)；(q)用例如甘氨酸取代VH的
Kabat位置55的氨基酸(如，缬氨酸)；(r)用例如异亮氨酸或亮氨酸取代VH的Kabat位
置67的氨基酸(如，缬氨酸)；(s)用例如天冬氨酸酯或天冬酰胺取代VH的Kabat位置72
的氨基酸(如，谷氨酸)；(t)用例如丝氨酸、缬氨酸或酪氨酸取代VH的Kabat位置79的氨
基酸(如，苯丙氨酸)；和(u)用例如天冬氨酸取代VH的Kabat位置101的氨基酸(如，脯
氨酸)。
[0485] 在另一实施方案中，该稳定化突变选自以下组成的组：a)用例如亮氨酸取代VL的Kabat位置4的氨基酸(如，甲硫氨酸)；(b)用例如甘氨酸取代VL的Kabat位置11的氨
基酸；(c)用例如丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸或丝氨酸取代VL的Kabat位置15的氨基酸(如，缬氨酸)；(d)用例如精氨酸取代VL的
Kabat位置20的氨基酸；(e)用例如赖氨酸取代VL的Kabat位置24的氨基酸；(f)用例如
天冬酰胺、苏氨酸或酪氨酸取代VL的Kabat位置30的氨基酸(如，精氨酸)；(g)用例如丝
氨酸取代VL的Kabat位置47的氨基酸(如，苏氨酸)；(h)用例如甘氨酸、甲硫氨酸或天冬
酰胺取代VL的Kabat位置50的氨基酸；(i)用例如甘氨酸取代VL的Kabat位置51的氨
基酸(如，丙氨酸)；(j)用例如丝氨酸取代VL的Kabat位置63的氨基酸；(k)用例如谷氨
酸取代VL的Kabat位置70的氨基酸；(l)用例如天冬酰胺或酪氨酸取代VL的Kabat位置
72的氨基酸(如，丝氨酸)；(m)用例如丝氨酸取代VL的Kabat位置74的氨基酸(如，天
冬氨酸)；(n)用例如甘氨酸取代VL的Kabat位置77的氨基酸；(o)用例如天冬氨酸、谷氨
酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸或缬氨酸取代VL的Kabat位置83的氨基酸(如，异
亮氨酸)；(p)用例如谷氨酰胺取代VH的Kabat位置6的氨基酸；(q)用例如谷氨酸取代VH
的Kabat位置21的氨基酸；(r)用例如苯丙氨酸取代VH的Kabat位置47的氨基酸(如，
色氨酸)；(s)用例如丙氨酸取代VH的Kabat位置49的氨基酸；(t)用例如赖氨酸或苏氨
酸取代VH的Kabat位置83的氨基酸(如，精氨酸)；和(u)用例如缬氨酸取代VH的Kabat
位置110的氨基酸(如，苏氨酸)。
基酸；(c)用例如丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸或丝氨酸取代VL的Kabat位置15的氨基酸(如，缬氨酸)；(d)用例如精氨酸取代VL的
Kabat位置20的氨基酸；(e)用例如赖氨酸取代VL的Kabat位置24的氨基酸；(f)用例如
天冬酰胺、苏氨酸或酪氨酸取代VL的Kabat位置30的氨基酸(如，精氨酸)；(g)用例如丝
氨酸取代VL的Kabat位置47的氨基酸(如，苏氨酸)；(h)用例如甘氨酸、甲硫氨酸或天冬
酰胺取代VL的Kabat位置50的氨基酸；(i)用例如甘氨酸取代VL的Kabat位置51的氨
基酸(如，丙氨酸)；(j)用例如丝氨酸取代VL的Kabat位置63的氨基酸；(k)用例如谷氨
酸取代VL的Kabat位置70的氨基酸；(l)用例如天冬酰胺或酪氨酸取代VL的Kabat位置
72的氨基酸(如，丝氨酸)；(m)用例如丝氨酸取代VL的Kabat位置74的氨基酸(如，天
冬氨酸)；(n)用例如甘氨酸取代VL的Kabat位置77的氨基酸；(o)用例如天冬氨酸、谷氨
酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸或缬氨酸取代VL的Kabat位置83的氨基酸(如，异
亮氨酸)；(p)用例如谷氨酰胺取代VH的Kabat位置6的氨基酸；(q)用例如谷氨酸取代VH
的Kabat位置21的氨基酸；(r)用例如苯丙氨酸取代VH的Kabat位置47的氨基酸(如，
色氨酸)；(s)用例如丙氨酸取代VH的Kabat位置49的氨基酸；(t)用例如赖氨酸或苏氨
酸取代VH的Kabat位置83的氨基酸(如，精氨酸)；和(u)用例如缬氨酸取代VH的Kabat
位置110的氨基酸(如，苏氨酸)。
[0486] 在另一个实施方案中，scFv分子与普通scFv分子相比包括稳定化突变，其中所述突变位于：(i)VL氨基酸位置50，(ii)VL氨基酸位置83；(iii)VH氨基酸位置6和(iv)VH
氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。在另一实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：
6Q、21E、47F、49A、49G、83K、83T和110V。
氨基酸位置49(Kabat编号惯例)。在另一实施方案中，所述稳定化突变选自以下组成的组：
6Q、21E、47F、49A、49G、83K、83T和110V。
[0487] 在一个实施方案中，本发明提供稳定化的scFv分子，其包含由与选自SEQ ID NO：123、125或127组成的组的参考多核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的多核苷酸编码的序列。在其它示例性实施方案中，稳定化的scFv分子包括与选自SEQ IDNO：
124、126或128组成的组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，稳定化的scFv特异性地或优先地结合于IGF-1R。
124、126或128组成的组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，稳定化的scFv特异性地或优先地结合于IGF-1R。
[0488] 本领域技术人员应理解的是，以上讨论的任何稳定化突变可引入其它、非scFv的结合分子(如，本文公开的任何IGF-1R结合分子)的合适的可变区(VL或VH)以实现蛋白
稳定性的相似增加。例如，以上公开的一种或多种稳定化突变可引入Fab分子或全长IgG抗
体分子的VL或VH结构域的相当的氨基酸位置(按照Kabat编号)以增加分子的稳定性。
稳定性的相似增加。例如，以上公开的一种或多种稳定化突变可引入Fab分子或全长IgG抗
体分子的VL或VH结构域的相当的氨基酸位置(按照Kabat编号)以增加分子的稳定性。
[0489] iii 单结构域结合分子
[0490] 在某些实施方案中，结合分子是单结构域结合分子或包括单结构域结合分子(如单结构域抗体)，还称为纳米抗体。示例性单结构域分子包括抗体的分离的重链可变结构域(VH)，即，无轻链可变结构域的重链可变结构域，和抗体的分离的轻链可变结构域(VL)，即，无重链可变结构域的轻链可变结构域。本发明结合分子采用的示例性单结构域抗体包括，
例如，骆驼重链可变结构域(约118至136氨基酸残基)，如Hamers-Casterman等人，Nature
363：446-448(1993)和Dumoulin等人，Protein Science 11：500-515(2002)所述的。单
结构域抗体的多聚体也在本发明的范围中。其它的单结构域抗体包括鲨鱼抗体(如，鲨鱼
Ig-NAR)。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C-样恒定结构域(C-NAR)的
同二聚体，其中多样性集中在长度从5个至23个残基的延伸CDR3区。在骆驼科动物物种
(如，美洲驼)中，称为VHH的重链可变区形成完整抗原-结合结构域。骆驼VHH可变区与
衍生自常规抗体的可变区(VH)的主要区别包括(a)与VHH中相应区相比，VH的轻链接触
表面中疏水氨基酸更多，(b)VHH中CDR3更长，和(c)VHH中CDR1和CDR3之间频繁出现二
硫键。制备单结构域结合分子的方法描述于美国专利第6.005,079和6,765,087号，两者
通过引用并入本文。
例如，骆驼重链可变结构域(约118至136氨基酸残基)，如Hamers-Casterman等人，Nature
363：446-448(1993)和Dumoulin等人，Protein Science 11：500-515(2002)所述的。单
结构域抗体的多聚体也在本发明的范围中。其它的单结构域抗体包括鲨鱼抗体(如，鲨鱼
Ig-NAR)。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C-样恒定结构域(C-NAR)的
同二聚体，其中多样性集中在长度从5个至23个残基的延伸CDR3区。在骆驼科动物物种
(如，美洲驼)中，称为VHH的重链可变区形成完整抗原-结合结构域。骆驼VHH可变区与
衍生自常规抗体的可变区(VH)的主要区别包括(a)与VHH中相应区相比，VH的轻链接触
表面中疏水氨基酸更多，(b)VHH中CDR3更长，和(c)VHH中CDR1和CDR3之间频繁出现二
硫键。制备单结构域结合分子的方法描述于美国专利第6.005,079和6,765,087号，两者
通过引用并入本文。
[0491] iv 微型抗体
[0492] 在某些实施方案中，本发明的结合分子是微型抗体或包括微型抗体。可使用本领域所描述的方法来制备微型抗体(参见例如美国专利第5,837,821号或WO 94/09817A1)。
在某些实施方案中，微型抗体是包括天然存在或非天然存在(如，诱变的)重链可变结构域
或轻链可变结构域或其组合的仅2个互补决定区(CDR)的结合分子。这种微型抗体的实例
描述在Pessi等人，Nature 362：367-369(1993)。另一种示例性微型抗体包括连接或融合
至CH3结构域或完整Fc区的scFv分子。微型抗体的多聚体也在本发明的范围中。
在某些实施方案中，微型抗体是包括天然存在或非天然存在(如，诱变的)重链可变结构域
或轻链可变结构域或其组合的仅2个互补决定区(CDR)的结合分子。这种微型抗体的实例
描述在Pessi等人，Nature 362：367-369(1993)。另一种示例性微型抗体包括连接或融合
至CH3结构域或完整Fc区的scFv分子。微型抗体的多聚体也在本发明的范围中。
[0493] v.非免疫球蛋白结合分子
[0494] 在某些实施方案中，本发明的结合分子是非免疫球蛋白结合分子或包括一个或多个衍生自非免疫球蛋白结合分子的结合部分。如本文所用，术语“非免疫球蛋白结合分子”是这样的结合分子，其结合位点包括衍生自除免疫球蛋白之外的多肽但可被人工改造(例
如诱变)以带来期望的结合特异性的一部分(例如支架或骨架)。
如诱变)以带来期望的结合特异性的一部分(例如支架或骨架)。
[0495] 非免疫球蛋白结合分子可包括衍生自并非免疫球蛋白的免疫球蛋白超家族成员(例如T细胞受体或细胞粘附蛋白(例如CTLA-4、N-CAM、端蛋白))的结合位点部分。这
种结合分子包括这样的结合位点部分，其保持免疫球蛋白折叠的构象且能够特异性地结合
IGF-1R表位。在其它的实施方案中，本发明的非免疫球蛋白结合分子还包括具有这样的蛋
白拓扑的结合位点，其中所述蛋白拓扑不是基于免疫球蛋白折叠(例如锚蛋白重复蛋白或
纤连蛋白)，但却能够特异性地结合至靶(例如IGF-1R表位)。
种结合分子包括这样的结合位点部分，其保持免疫球蛋白折叠的构象且能够特异性地结合
IGF-1R表位。在其它的实施方案中，本发明的非免疫球蛋白结合分子还包括具有这样的蛋
白拓扑的结合位点，其中所述蛋白拓扑不是基于免疫球蛋白折叠(例如锚蛋白重复蛋白或
纤连蛋白)，但却能够特异性地结合至靶(例如IGF-1R表位)。
[0496] 可以通过从具有人工多样化的结合位点的结合分子文库中选择或分离靶结合变体来鉴定非免疫球蛋白结合分子。可以使用完全随机的方法(例如错配PCR、外显子改组
或定向进化)来生成多样化的文库，或通过本领域公认的设计策略进行辅助。例如，可通
过在编码结合位点的核酸中的对应位置处插入简并密码子、三核苷酸、随机肽或整个环来
将氨基酸位置进行随机化，其中所述氨基酸位置通常在结合位点与它的同源靶分子相互作
用时被包括(参见例如美国公布第20040132028号)。可通过研究与靶分子复合的结合
位点的晶体结构来鉴定氨基酸位置所处的地方。随机化的候选位置包括环、平面、螺旋和
结合位点的结合腔。在某些实施方案中，在可能是多样化的候选位点的结合位点中的氨基
酸可通过它们与免疫球蛋白折叠的同源性来鉴定。例如，在纤连蛋白的CDR样环中的残基
可被随机化以产生纤连蛋白结合分子的文库(参见例如Koide等人，J.Mol.Biol.，284：
1141-1151(1998))。可被随机化的结合位点的其它部分包括平面。随机化之后，然后可对
多样化的文库进行选择或筛选程序以获得具有期望的结合特性的结合分子，其中所述结合
特性例如对上述IGF-1R表位的特异性结合。例如，可以通过本领域公认的方法例如噬菌体
展示、酵母展示或核糖体展示来实现选择。
或定向进化)来生成多样化的文库，或通过本领域公认的设计策略进行辅助。例如，可通
过在编码结合位点的核酸中的对应位置处插入简并密码子、三核苷酸、随机肽或整个环来
将氨基酸位置进行随机化，其中所述氨基酸位置通常在结合位点与它的同源靶分子相互作
用时被包括(参见例如美国公布第20040132028号)。可通过研究与靶分子复合的结合
位点的晶体结构来鉴定氨基酸位置所处的地方。随机化的候选位置包括环、平面、螺旋和
结合位点的结合腔。在某些实施方案中，在可能是多样化的候选位点的结合位点中的氨基
酸可通过它们与免疫球蛋白折叠的同源性来鉴定。例如，在纤连蛋白的CDR样环中的残基
可被随机化以产生纤连蛋白结合分子的文库(参见例如Koide等人，J.Mol.Biol.，284：
1141-1151(1998))。可被随机化的结合位点的其它部分包括平面。随机化之后，然后可对
多样化的文库进行选择或筛选程序以获得具有期望的结合特性的结合分子，其中所述结合
特性例如对上述IGF-1R表位的特异性结合。例如，可以通过本领域公认的方法例如噬菌体
展示、酵母展示或核糖体展示来实现选择。
[0497] 在一个实施方案中，本发明的结合分子包括来自纤连蛋白结合分子的结合位点。纤连蛋白结合分子(例如包括I、II或III类纤连蛋白结构域的分子)展示CDR样环，
与免疫球蛋白相反其不依赖于链内二硫键。制备纤连蛋白结合多肽的方法描述在例如
WO01/64942和美国专利第6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171号中，其通过引
用被并入本文。
与免疫球蛋白相反其不依赖于链内二硫键。制备纤连蛋白结合多肽的方法描述在例如
WO01/64942和美国专利第6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171号中，其通过引
用被并入本文。
[0498] 在另一个实施方案中，本发明的结合位点包括来自亲和体(affibody)的结合位点。亲和体衍生自葡萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白结合结构域(参见例如Nord等人，
Nat.Biotechnol.，15：772-777(1997))。本发明所用的亲和体结合位点可通过诱变衍生自SPA结构域(例如结构域B)的SPA相关蛋白(例如蛋白Z)并且选择具有对IGF-1R表位的
结合亲和力的突变SPA相关多肽来合成。制备亲和体结合位点的其它方法被描述在美国专
利6,740,734和6,602,977和WO 00/63243中，其每个通过引用被并入本文。
Nat.Biotechnol.，15：772-777(1997))。本发明所用的亲和体结合位点可通过诱变衍生自SPA结构域(例如结构域B)的SPA相关蛋白(例如蛋白Z)并且选择具有对IGF-1R表位的
结合亲和力的突变SPA相关多肽来合成。制备亲和体结合位点的其它方法被描述在美国专
利6,740,734和6,602,977和WO 00/63243中，其每个通过引用被并入本文。
[0499] 在另一个实施方案中，本发明的结合分子包括来自抗运载蛋白(anticalin)的结合位点。抗运载蛋白(还被称作脂运载蛋白(lipocalin))是不同的β桶蛋白家族的成
员，其功能是结合在它们的桶/环区域的靶分子。脂运载蛋白结合位点可被人工改造以通
过将连接桶的链的环序列随机化来结合IGF-1R表位(参见例如Schlehuber等人，Drug
Discov.Today，10：23-33(2005)；Beste等人，PNAS，96：1898-1903(1999))。本发明的结合分子中所用的抗运载蛋白结合位点可以是可以从脂运载蛋白家族的多肽开始获得的，其中
所述脂运载蛋白家族的多肽在对应于线性多肽序列的序列位置的四个区段中被突变，其包
括甘兰菜粉蝶(Pieris brassica)的胆汁三烯结合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45、58
至69、86至99和114至129。制备抗运载蛋白结合位点的其它方法描述在WO99/16873和
WO 05/019254中，其每个通过引用被并入本文。
员，其功能是结合在它们的桶/环区域的靶分子。脂运载蛋白结合位点可被人工改造以通
过将连接桶的链的环序列随机化来结合IGF-1R表位(参见例如Schlehuber等人，Drug
Discov.Today，10：23-33(2005)；Beste等人，PNAS，96：1898-1903(1999))。本发明的结合分子中所用的抗运载蛋白结合位点可以是可以从脂运载蛋白家族的多肽开始获得的，其中
所述脂运载蛋白家族的多肽在对应于线性多肽序列的序列位置的四个区段中被突变，其包
括甘兰菜粉蝶(Pieris brassica)的胆汁三烯结合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45、58
至69、86至99和114至129。制备抗运载蛋白结合位点的其它方法描述在WO99/16873和
WO 05/019254中，其每个通过引用被并入本文。
[0500] 在另一个实施方案中，本发明的结合分子包括来自富含半胱氨酸的多肽的结合位点。被用在本发明的实践中的富含半胱氨酸的结构域通常不形成α-螺旋、β折叠或β
桶结构。典型地，二硫键促进结构域折叠成三维结构。通常，富含半胱氨酸的结构域具有至少两个二硫键，更典型地具有至少三个二硫键。示例性的富含半胱氨酸的多肽是A结构域
蛋白。A结构域(有时候被称作“互补型重复”)含有约30-50或30-65个氨基酸。在一些
实施方案中，所述结构域包括约35-45个氨基酸并且在一些情况下约40个氨基酸。在所述
30-50个氨基酸中，有大约6个半胱氨酸残基。在所述6个半胱氨酸中，通常在下述半胱氨
酸之间发现二硫键：C1和C3、C2和C5、C4和C6。所述A结构域构成配体结合部分。该结
构域的半胱氨酸残基被二硫键连接以形成紧凑的、稳定的、功能性独立的部分。这些重复的聚集体构成配体结合结构域，并且差异性聚集能影响配体结合的特异性。含有A结构域的
示例性的蛋白包括例如补体成分(C6、C7、C8、C9和因子I)、丝氨酸蛋白酶(例如肠肽酶、
matriptase(蛋白裂解酶)和corin)、跨膜蛋白(例如ST7、LRP3、LRP5和LRP6)和胞吞受
体(例如分拣蛋白相关受体、LDL受体、VLDLR、LRP1、LRP2和ApoER2)。制备具有期望的结
合特异性的A结构域蛋白的方法被公开在例如WO 02/088171和WO 04/044011中，其每个
通过引用被并入本文。
桶结构。典型地，二硫键促进结构域折叠成三维结构。通常，富含半胱氨酸的结构域具有至少两个二硫键，更典型地具有至少三个二硫键。示例性的富含半胱氨酸的多肽是A结构域
蛋白。A结构域(有时候被称作“互补型重复”)含有约30-50或30-65个氨基酸。在一些
实施方案中，所述结构域包括约35-45个氨基酸并且在一些情况下约40个氨基酸。在所述
30-50个氨基酸中，有大约6个半胱氨酸残基。在所述6个半胱氨酸中，通常在下述半胱氨
酸之间发现二硫键：C1和C3、C2和C5、C4和C6。所述A结构域构成配体结合部分。该结
构域的半胱氨酸残基被二硫键连接以形成紧凑的、稳定的、功能性独立的部分。这些重复的聚集体构成配体结合结构域，并且差异性聚集能影响配体结合的特异性。含有A结构域的
示例性的蛋白包括例如补体成分(C6、C7、C8、C9和因子I)、丝氨酸蛋白酶(例如肠肽酶、
matriptase(蛋白裂解酶)和corin)、跨膜蛋白(例如ST7、LRP3、LRP5和LRP6)和胞吞受
体(例如分拣蛋白相关受体、LDL受体、VLDLR、LRP1、LRP2和ApoER2)。制备具有期望的结
合特异性的A结构域蛋白的方法被公开在例如WO 02/088171和WO 04/044011中，其每个
通过引用被并入本文。
[0501] 在其它的实施方案中，本发明的结合分子包括来自重复蛋白的结合位点。重复蛋白是含有连续的拷贝的小(例如约20至约40个氨基酸残基)结构单元或重复的蛋白，其层
叠在一起以形成连续的结构域。重复蛋白可被修饰以通过调整蛋白中的重复的数量来适合
特定的靶结合位点。示例性的重复蛋白包括设计的锚蛋白重复蛋白(即DARPin)(参见例
如Binz等人，Nat.Biotechnol.，22：575-582(2004))或富含亮氨酸的重复蛋白(即LRRP)
(参见例如Pancer等人，Nature，430：174-180(2004))。所有至今所确定的锚蛋白重复单
元的三级结构共有这样的一种特性，其由β-发夹接着是两个反向平行的α-螺旋以及具
有连接重复单元和下一个重复单元的环的末端所组成。由锚蛋白重复单元构建的结构域是
通过将重复单元层叠为延伸的和弯曲的结构而形成的。LRRP结合位点构成海八目鳗和其它
无颌鱼适应性免疫系统的一部分，并且在其是在淋巴细胞成熟过程中通过一系列富含亮氨
酸重复基因的重组而形成的这一事实上类似于抗体。制备DARpin或LRRP结合位点的方法
描述在WO02/20565和WO 06/083275中，其每个通过引用被并入本文。
叠在一起以形成连续的结构域。重复蛋白可被修饰以通过调整蛋白中的重复的数量来适合
特定的靶结合位点。示例性的重复蛋白包括设计的锚蛋白重复蛋白(即DARPin)(参见例
如Binz等人，Nat.Biotechnol.，22：575-582(2004))或富含亮氨酸的重复蛋白(即LRRP)
(参见例如Pancer等人，Nature，430：174-180(2004))。所有至今所确定的锚蛋白重复单
元的三级结构共有这样的一种特性，其由β-发夹接着是两个反向平行的α-螺旋以及具
有连接重复单元和下一个重复单元的环的末端所组成。由锚蛋白重复单元构建的结构域是
通过将重复单元层叠为延伸的和弯曲的结构而形成的。LRRP结合位点构成海八目鳗和其它
无颌鱼适应性免疫系统的一部分，并且在其是在淋巴细胞成熟过程中通过一系列富含亮氨
酸重复基因的重组而形成的这一事实上类似于抗体。制备DARpin或LRRP结合位点的方法
描述在WO02/20565和WO 06/083275中，其每个通过引用被并入本文。
[0502] 可被用于本发明的结合分子的其它非免疫球蛋白结合位点包括衍生自Src同源结构域(例如SH2或SH3结构域)、PDZ结构域、β-内酰胺酶、高亲和力蛋白酶抑制剂
或小二硫结合蛋白支架例如蝎毒素的结合位点。制备衍生自这些分子的结合位点的方
法已被公开在本领域中，参见例如Panni等人，J.Biol.Chem.，277：21666-21674(2002)，Schneider等人，Nat.Biotechnol.，17：170-175(1999)；Legendre等人，Protein Sci.，
11：1506-1518(2002)；Stoop等人，Nat.Biotechnol.，21：1063-1068(2003)；以及Vita等人，PNAS，92：6404-6408(1995)。但是其它结合位点可衍生自选自如下组成的组的结合结构域：EGF样结构域、Kringle结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、Kunitz/牛
胰蛋白酶抑制剂结构域、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶草(P型)结构域、von
Willebrand因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复、LDL
受体A级结构域、Sushi结构域、Link结构域、血小板反应蛋白I型结构域、类免疫球蛋白结构域、C型凝集素结构域、MAM结构域、von Willebrand因子A型结构域、生长调节素B结构
域、WAP型四二硫核心结构域、F5/8C型结构域、血液结合素结构域、层粘连蛋白型类EGF样结构域、C2结构域和本领域普通技术人员已知的其它这种结构域及其衍生物和/或变体。
或小二硫结合蛋白支架例如蝎毒素的结合位点。制备衍生自这些分子的结合位点的方
法已被公开在本领域中，参见例如Panni等人，J.Biol.Chem.，277：21666-21674(2002)，Schneider等人，Nat.Biotechnol.，17：170-175(1999)；Legendre等人，Protein Sci.，
11：1506-1518(2002)；Stoop等人，Nat.Biotechnol.，21：1063-1068(2003)；以及Vita等人，PNAS，92：6404-6408(1995)。但是其它结合位点可衍生自选自如下组成的组的结合结构域：EGF样结构域、Kringle结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、Kunitz/牛
胰蛋白酶抑制剂结构域、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶草(P型)结构域、von
Willebrand因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复、LDL
受体A级结构域、Sushi结构域、Link结构域、血小板反应蛋白I型结构域、类免疫球蛋白结构域、C型凝集素结构域、MAM结构域、von Willebrand因子A型结构域、生长调节素B结构
域、WAP型四二硫核心结构域、F5/8C型结构域、血液结合素结构域、层粘连蛋白型类EGF样结构域、C2结构域和本领域普通技术人员已知的其它这种结构域及其衍生物和/或变体。
[0503] vi.结合分子片段
[0504] 除非具体指出，否则如本文所用，关于结合分子的“片段”是指抗原结合片段，即，特异性地结合于抗原的结合部分。在一个实施方案中，本发明的结合分子是抗体片段或包括这样的片段。识别特定表位的抗体片段可由已知技术产生。例如，可重组产生Fab和
F(ab’)2片段，或通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生
F(ab’)2片段)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子。F(ab’)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
F(ab’)2片段，或通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生
F(ab’)2片段)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子。F(ab’)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
[0505] B.多特异性结合分子
[0506] 本发明的多特异性结合分子可包括至少两个结合位点或结合部分，其中至少一个结合位点或结合部分衍生自或包括上述单特异性结合分子之一或其结合部分。在某些实施
方案中，本发明的多特异性结合分子的至少一个结合位点是抗体或其抗原结合片段(如，
上述抗体或抗原结合片段)的抗原结合区。
方案中，本发明的多特异性结合分子的至少一个结合位点是抗体或其抗原结合片段(如，
上述抗体或抗原结合片段)的抗原结合区。
[0507] (i)双特异性抗体
[0508] 在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子是双特异性的。双特异性结合分子可以是二价或更高价的(如，三价、四价、六价、和类似价)。双特异性的二价抗体以及
制备它们的方法描述在例如美国专利第5,731,168、5,807,706、5,821,333号以及美国申
请公布第2003/020734和2002/0155537号中，其所有公开通过引用被并入本文。双特异
性的四价抗体以及制备它们的方法描述在例如WO02/096948和WO 00/44788中，其所有公
开通过引用被并入本文。通常参见PCT公布WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO
92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利第4,474,893、4,714,681、
4,925,648、5,573,920、5,601,819号；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
制备它们的方法描述在例如美国专利第5,731,168、5,807,706、5,821,333号以及美国申
请公布第2003/020734和2002/0155537号中，其所有公开通过引用被并入本文。双特异
性的四价抗体以及制备它们的方法描述在例如WO02/096948和WO 00/44788中，其所有公
开通过引用被并入本文。通常参见PCT公布WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO
92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利第4,474,893、4,714,681、
4,925,648、5,573,920、5,601,819号；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
[0509] 本发明的双特异性抗体可包括上述任何一种单特异性结合分子(如，上述任何一种抗体)或任何一种结合部分。例如，在某些实施方案中，双特异性抗体可包括本文公开
的任何一种保藏抗体作为第一结合部分和本文公开的任何一种scFv分子作为第二结合部
分，条件是所述第一结合部分与第二结合部分具有不同的结合特异性。在一个示例性实施
方案中，本发明的双特异性抗体可包括连接或融合至衍生自M13.C06 IgG抗体可变区的一
种或多种scFv分子(如，一种或多种稳定化的scFv分子)的M14.G11 IgG抗体。在另一个
示例性实施方案中，双特异性抗体可包括连接或融合至衍生自M14.G11抗体可变区的scFv
分子(如，稳定化的scFv分子)的M13.C06 IgG抗体。所述双特异性抗体的M14.G11 IgG
抗体或M13.CO6 IgG抗体可包括任何同种型(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型)的重
链恒定区。在某些实施方案中，该重链恒定区是完全糖基化的。在其它实施方案，该重链恒定区缺少糖基化(如，IgG抗体是“agly”抗体，如，agly IgG1或agly IgG4抗体)。在一
个实施方案中，scFv连接或融合至M14.G11或M13.C06 IgG抗体重链的成熟N-末端。在其
它实施方案，scFv连接或融合至IgG抗体重链的成熟C-末端。在其他的实施方案中，scFv
连接或融合至M14.G11或M13.C06 IgG抗体轻链的成熟N-末端。在某些实施方案中，gly/
ser连接肽(如，(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)连接序列)可用于将scFv连接到所述双特
异性抗体的IgG抗体。
的任何一种保藏抗体作为第一结合部分和本文公开的任何一种scFv分子作为第二结合部
分，条件是所述第一结合部分与第二结合部分具有不同的结合特异性。在一个示例性实施
方案中，本发明的双特异性抗体可包括连接或融合至衍生自M13.C06 IgG抗体可变区的一
种或多种scFv分子(如，一种或多种稳定化的scFv分子)的M14.G11 IgG抗体。在另一个
示例性实施方案中，双特异性抗体可包括连接或融合至衍生自M14.G11抗体可变区的scFv
分子(如，稳定化的scFv分子)的M13.C06 IgG抗体。所述双特异性抗体的M14.G11 IgG
抗体或M13.CO6 IgG抗体可包括任何同种型(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型)的重
链恒定区。在某些实施方案中，该重链恒定区是完全糖基化的。在其它实施方案，该重链恒定区缺少糖基化(如，IgG抗体是“agly”抗体，如，agly IgG1或agly IgG4抗体)。在一
个实施方案中，scFv连接或融合至M14.G11或M13.C06 IgG抗体重链的成熟N-末端。在其
它实施方案，scFv连接或融合至IgG抗体重链的成熟C-末端。在其他的实施方案中，scFv
连接或融合至M14.G11或M13.C06 IgG抗体轻链的成熟N-末端。在某些实施方案中，gly/
ser连接肽(如，(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)连接序列)可用于将scFv连接到所述双特
异性抗体的IgG抗体。
[0510] 在进一步的示例性实施方案中，本发明提供一种双特异性结合分子，其包含由与选自SEQ ID NO：132、136、141或143组成的组的参考多核苷酸序列至少80％、85％、90％、
95％或100％相同的多核苷酸编码的重链。在其它示例性实施方案中，双特异性分子包括
与选自SEQ ID NO：133、137、142或144组成的组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的重链。在某些实施方案中，该双特异性氨基酸进一步包括由与SEQ ID NO：
129或SEQID NO：139的参考多核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的多核苷酸编码的轻链。在其它示例性实施方案中，双特异性分子进一步包括与SEQ ID NO：130
或SEQ ID NO：140至少80％、85％、90％、95％或100％相同的轻链。在某些实施方案中，双特异性抗体特异性地或优先地结合于IGF-1R。
95％或100％相同的多核苷酸编码的重链。在其它示例性实施方案中，双特异性分子包括
与选自SEQ ID NO：133、137、142或144组成的组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的重链。在某些实施方案中，该双特异性氨基酸进一步包括由与SEQ ID NO：
129或SEQID NO：139的参考多核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的多核苷酸编码的轻链。在其它示例性实施方案中，双特异性分子进一步包括与SEQ ID NO：130
或SEQ ID NO：140至少80％、85％、90％、95％或100％相同的轻链。在某些实施方案中，双特异性抗体特异性地或优先地结合于IGF-1R。
[0511] (ii)含有scFv的多特异性结合分子
[0512] 在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是包含至少一个scFv分子，如前述的scFv分子的任何一个的多特异性结合分子。在其它实施方案中，本发明的多特异性结
合分子包含两个scFv分子，如双特异性scFv(Bis-scFv)。所述scFv分子可以相同或不同。
在某些实施方案中，scFv分子是普通scFv分子。在其它实施方案中，scFv分子是前述的稳
定化的scFv分子。在某些实施方案中，多特异性结合分子可通过连接scFv分子(如，稳定
化的scFv分子)与选自上述任何结合分子的任何亲本结合分子而产生，其中scFv分子与
亲本结合分子具有不同IGF-1R结合部分(如，竞争性结合部分和变构结合部分)。例如，本
发明结合分子可包含连接于第二scFv分子或非scFv结合分子(如，IGF-1R抗体)、具有第
一结合特异性的scFv分子，该第二scFv分子或非scFv结合分子赋予第二IGF-1R结合特
异性。在一个实施方案中，本发明结合分子是天然存在的抗体，已融合了稳定化的scFv分
子。
合分子包含两个scFv分子，如双特异性scFv(Bis-scFv)。所述scFv分子可以相同或不同。
在某些实施方案中，scFv分子是普通scFv分子。在其它实施方案中，scFv分子是前述的稳
定化的scFv分子。在某些实施方案中，多特异性结合分子可通过连接scFv分子(如，稳定
化的scFv分子)与选自上述任何结合分子的任何亲本结合分子而产生，其中scFv分子与
亲本结合分子具有不同IGF-1R结合部分(如，竞争性结合部分和变构结合部分)。例如，本
发明结合分子可包含连接于第二scFv分子或非scFv结合分子(如，IGF-1R抗体)、具有第
一结合特异性的scFv分子，该第二scFv分子或非scFv结合分子赋予第二IGF-1R结合特
异性。在一个实施方案中，本发明结合分子是天然存在的抗体，已融合了稳定化的scFv分
子。
[0513] 当稳定化的scFv连接于亲本结合分子时，稳定化的scFv分子的键合优选地提高结合分子的热稳定性至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与普通结合分子相比，含有
scFv的本发明结合分子具有提高1℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与普通结合分子
相比，本发明的结合分子具有提高2℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与普通结合分子相比，本发明的结合分子具有提高4、5、6℃的热稳定性。
scFv的本发明结合分子具有提高1℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与普通结合分子
相比，本发明的结合分子具有提高2℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与普通结合分子相比，本发明的结合分子具有提高4、5、6℃的热稳定性。
[0514] 在一个实施方案中，本发明的结合分子是稳定化的“抗体”或“免疫球蛋白”分子，如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子(或其抗原结合片段)或以与抗体分子相似的方式结合抗原并包括本发明的scFv分子的遗传改造的抗体分子。如本文所用，术语“免疫球蛋
白”包括具有两条重链和两条轻链的组合的多肽，无论其是否具备任何相关的特异性免疫
反应性。
白”包括具有两条重链和两条轻链的组合的多肽，无论其是否具备任何相关的特异性免疫
反应性。
[0515] 在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体重链C-末端的至少一个scFv(如，2、3或4个scFv，如，稳定化的scFv)，其中scFv与抗体具有不同结合
特异性。在另一实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体重链N-末端的至
少一个scFv(如，2、3或4个scFv，如，稳定化的scFv)，其中scFv与抗体具有不同结合特
异性。在另一实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体轻链N-末端的至
少一个scFv(如，2、3或4个scFv或稳定化的scFv)，其中scFv与抗体具有不同结合特异
性。在另一实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体重链或轻链N-末端的
至少一个scFv(如，2、3或4个scFv或稳定化的scFv)和连接到重链C-末端的至少一个
scFv(如，2、3或4个scFv或稳定化的scFv)，其中这些scFv具有不同结合特异性。
特异性。在另一实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体重链N-末端的至
少一个scFv(如，2、3或4个scFv，如，稳定化的scFv)，其中scFv与抗体具有不同结合特
异性。在另一实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体轻链N-末端的至
少一个scFv(如，2、3或4个scFv或稳定化的scFv)，其中scFv与抗体具有不同结合特异
性。在另一实施方案中，本发明的多特异性结合分子包括连接到抗体重链或轻链N-末端的
至少一个scFv(如，2、3或4个scFv或稳定化的scFv)和连接到重链C-末端的至少一个
scFv(如，2、3或4个scFv或稳定化的scFv)，其中这些scFv具有不同结合特异性。
[0516] (iii)多价微型抗体
[0517] 在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是多价微型抗体，包含具有第一结合特异性的至少一个scFv片段和具有第二结合特异性的至少一个scFv。在优选实施方
案中，至少一个scFv分子是稳定化的。示例性双特异性二价微型抗体构建体包括其N-末
端融合到连接肽的CH3结构域，所述连接肽在其N-末端融合到VH结构域，VH结构域经其
N-末端融合到(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：182)柔性连接序列，该连接序列在其N-末端融合
到VL结构域。在某些实施方案中，多价微型抗体可以是二价、三价(如，三抗体)、双特异性(如，双抗体)、或四价(如，四体)。
案中，至少一个scFv分子是稳定化的。示例性双特异性二价微型抗体构建体包括其N-末
端融合到连接肽的CH3结构域，所述连接肽在其N-末端融合到VH结构域，VH结构域经其
N-末端融合到(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：182)柔性连接序列，该连接序列在其N-末端融合
到VL结构域。在某些实施方案中，多价微型抗体可以是二价、三价(如，三抗体)、双特异性(如，双抗体)、或四价(如，四体)。
[0518] 在另一实施方案中，本发明的结合分子是scFv四价微型抗体，该scFv四价微型抗体的每个重链部分包含具有不同结合特异性的第一和第二scFv片段。优选实施方案中，至
少一个scFv分子是稳定化的。所述第二scFv片段可连接到第一scFv片段的N-末端(如，
双特异性NH scFv四价微型抗体或双特异性NL scFv四价微型抗体)。可选地，第二scFv片
段可连接到包含所述第一scFv片段的所述重链部分的C-末端(如，双特异性C-scFv四价
微型抗体)。当双特异性四价微型抗体的第一重链部分的第一scFv片段和第二scFv片段
结合同一靶IGF-1R分子时，双特异性四价微型抗体的第二重链部分的第一scFv片段和第
二scFv片段的至少一个可结合同一或不同IGF-1R靶分子。
少一个scFv分子是稳定化的。所述第二scFv片段可连接到第一scFv片段的N-末端(如，
双特异性NH scFv四价微型抗体或双特异性NL scFv四价微型抗体)。可选地，第二scFv片
段可连接到包含所述第一scFv片段的所述重链部分的C-末端(如，双特异性C-scFv四价
微型抗体)。当双特异性四价微型抗体的第一重链部分的第一scFv片段和第二scFv片段
结合同一靶IGF-1R分子时，双特异性四价微型抗体的第二重链部分的第一scFv片段和第
二scFv片段的至少一个可结合同一或不同IGF-1R靶分子。
[0519] (iv)多特异性双抗体
[0520] 在其它实施方案，本发明的结合分子是多特异性双抗体。在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是双特异性双抗体，该双抗体的每个臂包含串联scFv片段。在优选实施方案中，至少一个scFv片段是稳定化的。在一个实施方案中，双特异性双抗体可包
括具有第一结合特异性的第一臂和具有第二结合特异性的第二臂。在另一实施方案中，双
抗体的每个臂可包括具有第一结合特异性的第一scFv片段和具有第二结合特异性的第二
scFv片段。在某些实施方案中，多特异性双抗体可直接融合到完整Fc区或Fc部分(如，
CH3结构域)。
括具有第一结合特异性的第一臂和具有第二结合特异性的第二臂。在另一实施方案中，双
抗体的每个臂可包括具有第一结合特异性的第一scFv片段和具有第二结合特异性的第二
scFv片段。在某些实施方案中，多特异性双抗体可直接融合到完整Fc区或Fc部分(如，
CH3结构域)。
[0521] (v)scFv2四价抗体
[0522] 在其它实施方案，本发明的多特异性结合分子是scFv2四价抗体，该scFv2四价抗体的每个重链部分包含scFv分子。所述scFv分子可独立地选自本文公开的任何一种scFv
分子。在优选实施方案中，至少一个scFv分子是稳定化的。scFv片段可连接到重链部分
可变区的N-末端(如，双特异性NH scFv2四价抗体或双特异性NLscFv2四价抗体)。可选
地，scFv片段可连接到scFv2四价抗体重链部分的C-末端。scFv2四价抗体的每个重链部
分可具有结合同一或不同靶IGF-1R分子或表位的可变区和scFv片段。当双特异性scFc2
四价抗体的第一重链部分的scFv片段和可变区结合同一靶分子或表位时，双特异性四价
微型抗体的第二重链部分的第一scFv片段和第二scFv片段至少一个结合不同靶分子或表
位。
分子。在优选实施方案中，至少一个scFv分子是稳定化的。scFv片段可连接到重链部分
可变区的N-末端(如，双特异性NH scFv2四价抗体或双特异性NLscFv2四价抗体)。可选
地，scFv片段可连接到scFv2四价抗体重链部分的C-末端。scFv2四价抗体的每个重链部
分可具有结合同一或不同靶IGF-1R分子或表位的可变区和scFv片段。当双特异性scFc2
四价抗体的第一重链部分的scFv片段和可变区结合同一靶分子或表位时，双特异性四价
微型抗体的第二重链部分的第一scFv片段和第二scFv片段至少一个结合不同靶分子或表
位。
[0523] (vi)多特异性结合分子片段
[0524] 在某些实施方案中，本发明的结合分子片段可制备为多特异性的。本发明的多特异性结合分子包括双特异性Fab2或多特异性(如三特异性)Fab3分子。例如，多特异性结
合分子片段可包含具有不同特异性的Fab或scFv分子的化学轭合的多聚体(如二聚体、三
聚体或四聚体)。
合分子片段可包含具有不同特异性的Fab或scFv分子的化学轭合的多聚体(如二聚体、三
聚体或四聚体)。
[0525] (vii)串联可变结构域结合分子
[0526] 在其它实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包括包含有串联抗原结合位点的结合分子。例如，可变结构域可包含被工程化以包含直接串联融合或连接的至少两个
(如，两个、三个、四个或更多)可变重链结构域(VH结构域)的抗体重链，被工程化以包含
直接串联融合或连接的至少两个(如，两个、三个、四个或更多)可变轻链结构域(VL结构
域)的抗体轻链。VH结构域与相应的VL结构域相互作用以形成一串抗原结合位点，其中至
少两个结合位点结合IGF-1R的不同表位。例如，结合位点之一可与上述竞争性表位交叉反
应，而另一个抗原结合位点与上述变构表位交叉反应。串联可变结构域结合分子可包含两
个或更多个重链或轻链并具有更高级别的价(如，二价或四价)。制备串联可变结构域结合
分子的方法是本领域已知的，参见如WO 2007/024715。
(如，两个、三个、四个或更多)可变重链结构域(VH结构域)的抗体重链，被工程化以包含
直接串联融合或连接的至少两个(如，两个、三个、四个或更多)可变轻链结构域(VL结构
域)的抗体轻链。VH结构域与相应的VL结构域相互作用以形成一串抗原结合位点，其中至
少两个结合位点结合IGF-1R的不同表位。例如，结合位点之一可与上述竞争性表位交叉反
应，而另一个抗原结合位点与上述变构表位交叉反应。串联可变结构域结合分子可包含两
个或更多个重链或轻链并具有更高级别的价(如，二价或四价)。制备串联可变结构域结合
分子的方法是本领域已知的，参见如WO 2007/024715。
[0527] (viii)双重特异性结合分子
[0528] 在其它实施方案中，本发明多特异性结合分子可包含具有双重结合特异性的单个结合位点。例如，本发明的双重特异性结合分子可包括与上述竞争性表位和上述变构表位
交叉反应的结合位点。在另一实施方案中，本发明的双重特异性结合分子可包括与上述任
何两种变构表位(如，变构地阻断IGF-1和IGF-2的变构表位和变构地阻断IGF-1而不是
IGF-2的变构表位)交叉反应的结合位点。产生双重特异性结合分子的领域公认的方法是
本领域已知的。例如，双重特异性结合分子可通过筛选结合第一表位两者的结合分子并反
筛选分离的结合分子结合第二表位的能力而分离。
交叉反应的结合位点。在另一实施方案中，本发明的双重特异性结合分子可包括与上述任
何两种变构表位(如，变构地阻断IGF-1和IGF-2的变构表位和变构地阻断IGF-1而不是
IGF-2的变构表位)交叉反应的结合位点。产生双重特异性结合分子的领域公认的方法是
本领域已知的。例如，双重特异性结合分子可通过筛选结合第一表位两者的结合分子并反
筛选分离的结合分子结合第二表位的能力而分离。
[0529] (ix)多特异性融合蛋白
[0530] 在另一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是多特异性融合蛋白。如本文所用，术语″多特异性融合蛋白″指具有至少两个上述结合特异性的融合蛋白(如上
定义的)。多特异性融合蛋白可组装为如，异二聚体、异三聚体或异四聚体，实质上公开于WO89/02922(1989年4月6日公布)、EP 314,317(1989年5月3日公布)和1992年5月
2日授权的美国专利第5,116,964号。优选的多特异性融合蛋白是双特异性的。在某些实
施方案中，多特异性融合蛋白的至少结合特异性包含scFv，如，稳定化的scFv。
定义的)。多特异性融合蛋白可组装为如，异二聚体、异三聚体或异四聚体，实质上公开于WO89/02922(1989年4月6日公布)、EP 314,317(1989年5月3日公布)和1992年5月
2日授权的美国专利第5,116,964号。优选的多特异性融合蛋白是双特异性的。在某些实
施方案中，多特异性融合蛋白的至少结合特异性包含scFv，如，稳定化的scFv。
[0531] 本领域技术人员使用常规重组DNA技术可开发多种其它多价抗体构建体，例如描述于PCT国际申请第PCT/US86/02269号；欧洲专利申请第184,187号；欧洲专利申请
第171,496号；欧洲专利申请第173,494号；PCT国际公布第WO 86/01533号；美国专利第
4,816,567号；欧洲专利申请第125,023号；Better等人(1988)Science240：1041-1043；
Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：
3521-3526；Sun 等 人 (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura 等 人
(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood 等 人 (1985)Nature 314：446-449；Shaw 等 人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；
Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；美国专利第5,225,539号；Jones等人(1986)
Nature 321：552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；Beidler等人(1988)
J.Immunol.141：4053-4060；以及Winter和Milstein，Nature，349，第293-99页(1991))。
优选地，非人类的抗体是通过连接非人类的抗原结合结构域与人类恒定结构域而被“人源
化的”(如Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.，81，第6851-55页(1984))。
第171,496号；欧洲专利申请第173,494号；PCT国际公布第WO 86/01533号；美国专利第
4,816,567号；欧洲专利申请第125,023号；Better等人(1988)Science240：1041-1043；
Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：
3521-3526；Sun 等 人 (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura 等 人
(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood 等 人 (1985)Nature 314：446-449；Shaw 等 人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；
Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；美国专利第5,225,539号；Jones等人(1986)
Nature 321：552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；Beidler等人(1988)
J.Immunol.141：4053-4060；以及Winter和Milstein，Nature，349，第293-99页(1991))。
优选地，非人类的抗体是通过连接非人类的抗原结合结构域与人类恒定结构域而被“人源
化的”(如Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.，81，第6851-55页(1984))。
[0532] 可用于制备多价抗体构建体的其它方法描述在以下出版物：Ghetie，Maria-Ana等人(2001)Blood 97：1392-1398；Wolff，Edith A.等人(1993)Cancer Research 53：
2560-2565；Ghetie，Maria-Ana 等 人 (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-7514；Kim，J.C.等人(2002)Int.J.Cancer 97(4)：542-547；Todorovska，Aneta等人(2001)Journal
ofImmunological Methods 248：47-66；Coloma M.J.等人(1997)NatureBiotechnology
15：159-163；Zuo，Zhuang等人(2000)ProteinEngineering(增刊)13(5)：361-367；Santos A.D.，等人(1999)ClinicalCancer Research 5：3118s-3123s；Presta，Leonard G.(2002)CurrentPharmaceutical Biotechnology3：237-256；van Spriel，Annemiek等人，(2000)Review Immunology Today 21(8)391-397。
2560-2565；Ghetie，Maria-Ana 等 人 (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-7514；Kim，J.C.等人(2002)Int.J.Cancer 97(4)：542-547；Todorovska，Aneta等人(2001)Journal
ofImmunological Methods 248：47-66；Coloma M.J.等人(1997)NatureBiotechnology
15：159-163；Zuo，Zhuang等人(2000)ProteinEngineering(增刊)13(5)：361-367；Santos A.D.，等人(1999)ClinicalCancer Research 5：3118s-3123s；Presta，Leonard G.(2002)CurrentPharmaceutical Biotechnology3：237-256；van Spriel，Annemiek等人，(2000)Review Immunology Today 21(8)391-397。
[0533] C.修饰的结合分子
[0534] 在某些实施方案中，至少一种本发明的结合分子(如，本发明的多特异性结合分子或本发明的组合中采用的单特异性结合分子)可包括一种或多种修饰。可以使用本领域
已知的技术从完整的前体或亲本抗体来制备本发明的IGF-1R结合分子的修饰型。
已知的技术从完整的前体或亲本抗体来制备本发明的IGF-1R结合分子的修饰型。
[0535] 在某些实施方案中，本发明的修饰的IGF-1R结合分子是已被改变以展现天然多肽中未出现的另外的特性的多肽。在一个实施方案中，结合分子的一个或多个残基可通过
功能侧基的反应而化学衍生。在一个实施方案中，结合分子可被修饰以包括二十种标准氨
基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基
赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；而且鸟氨酸
可取代赖氨酸。
功能侧基的反应而化学衍生。在一个实施方案中，结合分子可被修饰以包括二十种标准氨
基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基
赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；而且鸟氨酸
可取代赖氨酸。
[0536] 在一个实施方案中，本发明的IGF-1R结合分子包括合成的恒定区，其中部分地或全部地缺失了一个或多个结构域(“缺失结构域的结合分子”)。在某些实施方案中，适合
的修饰的结合分子将包括缺失了结构域的构建体或变体，其中完整的CH2结构域已被除去
(ΔCH2构建体)。对于其它实施方案，短连接肽可取代缺失的结构域以便为可变区提供柔
性和移动自由。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体分解代谢率的调节特性，这种构建体是特别优选的。可使用编码IgG1人类恒定结构域的载体来衍生缺失结构域的构
建体(参见例如WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。此载体被人工改造以缺失CH2结构
域并提供表达缺失结构域的IgG1恒定区的合成载体。
的修饰的结合分子将包括缺失了结构域的构建体或变体，其中完整的CH2结构域已被除去
(ΔCH2构建体)。对于其它实施方案，短连接肽可取代缺失的结构域以便为可变区提供柔
性和移动自由。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体分解代谢率的调节特性，这种构建体是特别优选的。可使用编码IgG1人类恒定结构域的载体来衍生缺失结构域的构
建体(参见例如WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。此载体被人工改造以缺失CH2结构
域并提供表达缺失结构域的IgG1恒定区的合成载体。
[0537] 在一个实施方案中，本发明的IGF-1R结合分子包括免疫球蛋白重链，其具有一些或甚至一个氨基酸的缺失或取代，只要它允许单体亚基之间的缔合。例如，CH2结构域所选区域中单个氨基酸的突变可足以基本上减少Fc结合并因此增加肿瘤定位。相似地，可以期
望简单地缺失控制待调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部
分。恒定区的这种部分缺失可改进抗体的所选特征(血清半衰期)，同时保留与所述恒定区
结构域相关的其它期望的功能。此外，如上面所提到的，结合分子的恒定区可以是通过突变或取代一个或多个氨基酸而合成的，其中所述氨基酸增强所得构建体的特性。在这方面，可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)所提供的活性，同时基本上保持被修饰的结合分子
的构型和免疫原性概况。然而其它的实施方案包括将一个或多个氨基酸加入恒定区以增强
期望的特征例如效应子功能，或者提供更多细胞毒素或碳水化合物附着。在这些实施方案
中，可以期望插入或复制衍生自所选恒定区结构域的特定序列。
望简单地缺失控制待调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部
分。恒定区的这种部分缺失可改进抗体的所选特征(血清半衰期)，同时保留与所述恒定区
结构域相关的其它期望的功能。此外，如上面所提到的，结合分子的恒定区可以是通过突变或取代一个或多个氨基酸而合成的，其中所述氨基酸增强所得构建体的特性。在这方面，可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)所提供的活性，同时基本上保持被修饰的结合分子
的构型和免疫原性概况。然而其它的实施方案包括将一个或多个氨基酸加入恒定区以增强
期望的特征例如效应子功能，或者提供更多细胞毒素或碳水化合物附着。在这些实施方案
中，可以期望插入或复制衍生自所选恒定区结构域的特定序列。
[0538] 本发明还提供这样的结合分子，其包括、基本上由或者由本文所述的结合部分(例如抗体分子的VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)所组成，所述结合部分或其片
段免疫特异性地结合至IGF-1R多肽或者其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的
标准技术来将突变引入编码IGF-1R结合分子的核苷酸序列，其中所述技术包括但不限于
导致氨基酸取代的位点定向诱变和PCR介导的诱变。优选地，所述变体(包括衍生物)编
码相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的
少于50个氨基酸的取代，少于40个氨基酸的取代，少于30个氨基酸的取代，少于25个氨
基酸的取代，少于20个氨基酸的取代，少于15个氨基酸的取代，少于10个氨基酸的取代，
少于5个氨基酸的取代，少于4个氨基酸的取代，少于3个氨基酸的取代，或少于2个氨基
酸的取代。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基所替换的氨基酸取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义。这
些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、
苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可选地，可沿着编码序列的全部或部分通过例如饱和诱变来随机地引入突变，而且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保持活性(例如结
合IGF-1R多肽的能力)的突变体。
段免疫特异性地结合至IGF-1R多肽或者其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的
标准技术来将突变引入编码IGF-1R结合分子的核苷酸序列，其中所述技术包括但不限于
导致氨基酸取代的位点定向诱变和PCR介导的诱变。优选地，所述变体(包括衍生物)编
码相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的
少于50个氨基酸的取代，少于40个氨基酸的取代，少于30个氨基酸的取代，少于25个氨
基酸的取代，少于20个氨基酸的取代，少于15个氨基酸的取代，少于10个氨基酸的取代，
少于5个氨基酸的取代，少于4个氨基酸的取代，少于3个氨基酸的取代，或少于2个氨基
酸的取代。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基所替换的氨基酸取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义。这
些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、
苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可选地，可沿着编码序列的全部或部分通过例如饱和诱变来随机地引入突变，而且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保持活性(例如结
合IGF-1R多肽的能力)的突变体。
[0539] 例如，可能在本发明的结合分子(如抗体分子)的仅骨架区或仅CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默的或中性的错义突变，即对于结合抗原的能力没有作用或作用很
少，实际上一些这种突变对于氨基酸序列没有任何改变。这些类型的突变对于优化密码子
选择或者促进杂交瘤的抗体产生可能是有用的。在本文其它地方公开了编码本发明IGF-1R
结合分子的密码子被优化的编码区。可选地，非中性错义突变可改变结合分子结合抗原的
能力。例如，抗体中大部分沉默和中性的错义突变的位置可能是在骨架区，而大部分非中性的错义突变的位置可能是在CDR，虽然这不是绝对要求。本领域技术人员能够设计和测试
具有期望特性的突变分子，其中所述特性例如不改变抗原结合活性或改变结合活性(例如
改进抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，可常规地表达被编码的蛋白，并且可以使用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术来确定被编码的蛋白的功能的和/
或生物的活性(例如免疫特异性地结合IGF-1R多肽的至少一个表位的能力)。
少，实际上一些这种突变对于氨基酸序列没有任何改变。这些类型的突变对于优化密码子
选择或者促进杂交瘤的抗体产生可能是有用的。在本文其它地方公开了编码本发明IGF-1R
结合分子的密码子被优化的编码区。可选地，非中性错义突变可改变结合分子结合抗原的
能力。例如，抗体中大部分沉默和中性的错义突变的位置可能是在骨架区，而大部分非中性的错义突变的位置可能是在CDR，虽然这不是绝对要求。本领域技术人员能够设计和测试
具有期望特性的突变分子，其中所述特性例如不改变抗原结合活性或改变结合活性(例如
改进抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，可常规地表达被编码的蛋白，并且可以使用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术来确定被编码的蛋白的功能的和/
或生物的活性(例如免疫特异性地结合IGF-1R多肽的至少一个表位的能力)。
[0540] (i)共价连接
[0541] 本发明的IGF-1R结合分子还可被修饰，其中所述修饰是例如通过将分子共价连接至结合分子以使共价连接不阻止结合分子与其同源表位的特异性结合。例如但不进行限
制，本发明的结合分子可通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解性裂解、对细胞配体或其它蛋白的连接等而被修饰。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，其包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外地，衍生物可含有一种或多种非经典的氨基酸。
制，本发明的结合分子可通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解性裂解、对细胞配体或其它蛋白的连接等而被修饰。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，其包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外地，衍生物可含有一种或多种非经典的氨基酸。
[0542] 如本文其它地方更详细地讨论的，本发明的结合分子还可被重组地融合至异源性多肽的N或C末端，或化学地轭合(包括共价和非共价轭合)至多肽或其它组合物。例
如，IGF-1R特异性的IGF-1R结合分子可被重组地融合或轭合至在检测测定中作为标记
物有用的分子和效应分子如异源性多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如PCT公布WO
92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号和EP 396,387。
如，IGF-1R特异性的IGF-1R结合分子可被重组地融合或轭合至在检测测定中作为标记
物有用的分子和效应分子如异源性多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如PCT公布WO
92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号和EP 396,387。
[0543] 本发明的IGF-1R结合分子可由这样的氨基酸所组成，其被肽键或修饰的肽键即肽等排体互相连接，并且可含有除了20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。可通过天然
过程来修饰IGF-1R特异性结合分子，例如翻译后加工或本领域公知的化学修饰技术。在
基础教科书中很好地，在专题著作中更详细地，并在大量的研究文献中描述了这些修饰。
修饰可发生在IGF-1R特异性结合分子中任何地方，其包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或
羧基末端，或如碳水化合物的部分上。将理解的是，相同类型的修饰可以相同或不同程度
地存在于给定的IGF-1R特异性结合分子的若干位点。而且，给定的IGF-1R特异性结合
分子可含有许多类型的修饰。IGF-1R特异性结合分子可以例如由于泛素化而是分支的，
而且它们可以是含有或不含分支的环状。环状的、分支的和分支环状的IGF-1R特异性结
合分子可从翻译后天然过程得到，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白的加成例如精氨酸化和泛素化。(参见例如Proteins-Structure And Molecular Properties(蛋白-结
构和分子特性)，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York第2版，(1993)；
Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白的翻译后共价修饰)，
B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth.
Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann.NY Acad.Sci.663：48-62(1992))。
过程来修饰IGF-1R特异性结合分子，例如翻译后加工或本领域公知的化学修饰技术。在
基础教科书中很好地，在专题著作中更详细地，并在大量的研究文献中描述了这些修饰。
修饰可发生在IGF-1R特异性结合分子中任何地方，其包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或
羧基末端，或如碳水化合物的部分上。将理解的是，相同类型的修饰可以相同或不同程度
地存在于给定的IGF-1R特异性结合分子的若干位点。而且，给定的IGF-1R特异性结合
分子可含有许多类型的修饰。IGF-1R特异性结合分子可以例如由于泛素化而是分支的，
而且它们可以是含有或不含分支的环状。环状的、分支的和分支环状的IGF-1R特异性结
合分子可从翻译后天然过程得到，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白的加成例如精氨酸化和泛素化。(参见例如Proteins-Structure And Molecular Properties(蛋白-结
构和分子特性)，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York第2版，(1993)；
Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白的翻译后共价修饰)，
B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth.
Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann.NY Acad.Sci.663：48-62(1992))。
[0544] 本发明还提供这样的融合蛋白，其包括IGF-1R结合分子和异源性多肽。抗体所与之融合的异源性多肽对功能可能是有用的，或者对靶向表达IGF-1R多肽的细胞是有用的。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包括、基本上由或者由这样的多肽所组成，其具有本发明结合分子的任一个或多个结合位点的氨基酸序列和异源性多肽序列。在另一个实施方
案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括、基本上由或者由这样的多肽所组
成，其具有IGF-1R特异性结合分子的任一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列，或者IGF-1R特异性结合分子的任一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列，和异源性多肽序列。在一个实施方案中，融合蛋白包括这样的多肽，其具有本发明IGF-1R特异性结合分子的VH-CDR3的
氨基酸序列和异源性多肽序列，其中所述融合蛋白特异性地结合至IGF-1R的至少一个表
位。在另一个实施方案中，融合蛋白包括这样的多肽，其具有本发明IGF-1R特异性结合分
子的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明IGF-1R特异性结合分子的至少一个VL区的氨
基酸序列，或者其片段、衍生物或变体，以及异源性多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性地结合IGF-1R的至少一个表位的单个来源的结合分子。在又一个实施方
案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括这样的多肽，其具有IGF-1R特异性
结合分子的任一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和IGF-1R特异性结合分子的
任一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列，和异源性多肽序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多个VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单个来源的结合分子。编码这
些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包括、基本上由或者由这样的多肽所组成，其具有本发明结合分子的任一个或多个结合位点的氨基酸序列和异源性多肽序列。在另一个实施方
案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括、基本上由或者由这样的多肽所组
成，其具有IGF-1R特异性结合分子的任一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列，或者IGF-1R特异性结合分子的任一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列，和异源性多肽序列。在一个实施方案中，融合蛋白包括这样的多肽，其具有本发明IGF-1R特异性结合分子的VH-CDR3的
氨基酸序列和异源性多肽序列，其中所述融合蛋白特异性地结合至IGF-1R的至少一个表
位。在另一个实施方案中，融合蛋白包括这样的多肽，其具有本发明IGF-1R特异性结合分
子的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明IGF-1R特异性结合分子的至少一个VL区的氨
基酸序列，或者其片段、衍生物或变体，以及异源性多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性地结合IGF-1R的至少一个表位的单个来源的结合分子。在又一个实施方
案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包括这样的多肽，其具有IGF-1R特异性
结合分子的任一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和IGF-1R特异性结合分子的
任一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列，和异源性多肽序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多个VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单个来源的结合分子。编码这
些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
[0545] 在文献中报道的示例性的融合蛋白包括T细胞受体(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))、CD4(Capon 等 人，Nature 337：
525-531(1989)；Traunecker 等 人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl 等 人，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等 人，Nature 344：667-670(1990))、L- 选
择蛋白(归巢受体)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等
人，Nature 349：164-167(1991))、CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))、CD28和 B7(Linsley 等 人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))、CTLA-4(Lisley 等 人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))、CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))、TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等人，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.第115卷，摘要第1448号(1991))的融
合。
525-531(1989)；Traunecker 等 人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl 等 人，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等 人，Nature 344：667-670(1990))、L- 选
择蛋白(归巢受体)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等
人，Nature 349：164-167(1991))、CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))、CD28和 B7(Linsley 等 人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))、CTLA-4(Lisley 等 人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))、CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))、TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等人，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.第115卷，摘要第1448号(1991))的融
合。
[0546] 如本文其它地方所讨论的，本发明的IGF-1R抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至异源性多肽以增加多肽的体内半衰期或者用于使用本领域已知方法的
免疫测定。例如，在一个实施方案中，可将PEG轭合至本发明的IGF-1R结合分子以增加
其体内半衰期。Leong，S.R.等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in DrugDeliv.Rev.54：
531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions30：512(2002)。
免疫测定。例如，在一个实施方案中，可将PEG轭合至本发明的IGF-1R结合分子以增加
其体内半衰期。Leong，S.R.等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in DrugDeliv.Rev.54：
531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions30：512(2002)。
[0547] 此外，本发明的IGF-1R结合分子可被融合至标志物序列例如肽以促进它们的纯化或检测。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体
(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签及其他，其中许多是商业上可得的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)中所
述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的方便的纯化。对纯化有用的其他肽标记物包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等，Cell 37：767(1984))以及
“flag”标签。
(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签及其他，其中许多是商业上可得的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)中所
述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的方便的纯化。对纯化有用的其他肽标记物包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等，Cell 37：767(1984))以及
“flag”标签。
[0548] 可使用本领域熟知的方法制备融合蛋白(参见例如美国专利第5,116,964和5,225,538号)。可以凭经验选择进行融合的精确位点以将融合蛋白的分泌或结合特性最
佳化。然后将编码融合蛋白的DNA转染进宿主细胞以表达。
佳化。然后将编码融合蛋白的DNA转染进宿主细胞以表达。
[0550] 在一个实施方案中，可以以未轭合的形式使用本发明的IGF-1R结合分子，或可将其轭合至各种分子中至少一个以例如改进该分子的治疗特性，促进靶检测或用于患者的成
像或疗法。当进行纯化时，本发明的IGF-1R结合分子可在纯化之前或之后被标记或轭合。
像或疗法。当进行纯化时，本发明的IGF-1R结合分子可在纯化之前或之后被标记或轭合。
[0551] 特别地，本发明的IGF-1R结合分子可被轭合至治疗剂、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂或PEG。
[0552] 本领域技术人员将理解，还可使用各种技术将轭合物组装，其取决于待轭合的所选剂。例如，通过将结合多肽与激活的生物素的酯例如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯进行反
应来制备含生物素的轭合物。相似地，可在轭合剂例如本文所列的那些存在下，或通过与异硫氰酸(优选为荧光素-异硫氰酸酯)进行反应来制备含荧光标志物的轭合物。以类似的
方式来制备本发明IGF-1R结合分子的轭合物。
应来制备含生物素的轭合物。相似地，可在轭合剂例如本文所列的那些存在下，或通过与异硫氰酸(优选为荧光素-异硫氰酸酯)进行反应来制备含荧光标志物的轭合物。以类似的
方式来制备本发明IGF-1R结合分子的轭合物。
[0553] 本发明还包括轭合至诊断或治疗剂的本发明IGF-1R结合分子。可诊断性地使用IGF-1R结合分子以例如监测神经疾病的发展或进展，其被作为临床测试程序的一部分以例
如确定给定治疗和/或预防疗法的效力。可通过将IGF-1R结合分子轭合至可检测的物质
以协助检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属(其使用各种正电子发射拓扑)和非放射性顺磁金属离子。
参见例如美国专利第4,741,900号中可被轭合至本发明中用于诊断的抗体的金属离子。适
合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括链霉抗生素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物
质的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、虫荧光素
125 131 111 99
和水母发光蛋白；而且适合的放射性物质的例子包括 I、I、 In或 Tc。
如确定给定治疗和/或预防疗法的效力。可通过将IGF-1R结合分子轭合至可检测的物质
以协助检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属(其使用各种正电子发射拓扑)和非放射性顺磁金属离子。
参见例如美国专利第4,741,900号中可被轭合至本发明中用于诊断的抗体的金属离子。适
合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括链霉抗生素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物
质的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、虫荧光素
125 131 111 99
和水母发光蛋白；而且适合的放射性物质的例子包括 I、I、 In或 Tc。
[0554] IGF-1R结合分子还可被可检测地标记，其通过将它轭合至化学发光化合物来进行。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的IGF-1R结
合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
[0555] 可将IGF-1R结合分子可检测地标记的方法中的一种是通过将其连接至酶并将被连接的产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，“The Enzyme Linked Immunosorbent
Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))”Microbiological Associates Quarterly
Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等 人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；
Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等人，(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。结合至IGF-1R结合分子的酶将与合适的底物优选地为显色底物以产生可
通过例如分光光度计测量的、荧光的或目视方法被检测的化学部分的方式发生反应。可被
用来可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用酶的显色底物的比色法来完成检测。还可通过将底物的酶反应程度与相似地制备的标准物进行视觉对比来完成检测。
Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))”Microbiological Associates Quarterly
Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等 人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；
Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等人，(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。结合至IGF-1R结合分子的酶将与合适的底物优选地为显色底物以产生可
通过例如分光光度计测量的、荧光的或目视方法被检测的化学部分的方式发生反应。可被
用来可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用酶的显色底物的比色法来完成检测。还可通过将底物的酶反应程度与相似地制备的标准物进行视觉对比来完成检测。
[0556] 还可使用各种其它免疫测定中的任一种来完成检测。例如，通过IGF-1R结合分子的放射性标记，可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测结合分子(参见例如Weintraub，
B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand
AssayTechniques(放射免疫测定原理，放射配体测定技术的第七次培训课程)，The
Endocrine Society，(1986年3月)，其通过引用被并入本文)。可通过一些方法来检测放
射性同位素，其包括但不限于伽玛计数器、闪烁计数器或放射自显影法。
B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand
AssayTechniques(放射免疫测定原理，放射配体测定技术的第七次培训课程)，The
Endocrine Society，(1986年3月)，其通过引用被并入本文)。可通过一些方法来检测放
射性同位素，其包括但不限于伽玛计数器、闪烁计数器或放射自显影法。
[0557] 还可使用发射荧光的金属例如152Eu或其它镧系来可检测地标记IGF-1R结合分子。可使用金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)来将这些金
属连接至所述结合分子。
属连接至所述结合分子。
[0558] 将各种部分轭合至IGF-1R结合分子的技术是熟知的，参见例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy(癌症疗法
中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(单
克隆抗体和癌症疗法)中，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.
(1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，
Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等人(编辑)，
Marcel Dekker，Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview″(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)，
MonoclonalAntibodies ′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体’84：
生物和临床应用)中，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In
Cancer Therapy(癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗用途的分析、结果和未来展望)”，
Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和疗法的单
克隆抗体)中，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页(1985)；以及Thorpe
等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒素特性)”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(单
克隆抗体和癌症疗法)中，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.
(1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，
Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等人(编辑)，
Marcel Dekker，Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview″(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)，
MonoclonalAntibodies ′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体’84：
生物和临床应用)中，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In
Cancer Therapy(癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗用途的分析、结果和未来展望)”，
Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和疗法的单
克隆抗体)中，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页(1985)；以及Thorpe
等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒素特性)”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
[0559] 特别地，用于本文公开的诊断和治疗方法的结合分子可被轭合至细胞毒素(例如放射性同位素、细胞毒药物或毒素)治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、免疫活性配体(例如，淋巴因子或其它抗体，其中所得的分子结合至赘生细胞和效应细胞如T细胞二者)或PEG。在另一个实施方案中，用于本
文公开的诊断和治疗方法的结合分子可被轭合至减少肿瘤血管化的分子。在其它实施方案
中，公开的组合物可包括轭合至药物或前体药物的结合分子。本发明其它的实施方案包括
使用轭合至特定生物毒素或它们的细胞毒性片段如蓖麻毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素
或白喉毒素的结合分子。关于使用哪个轭合的或未轭合的结合分子的选择将取决于癌症的
类型和阶段，辅助治疗(例如化疗或外部辐射)的使用和患者状况。将理解的是，本领域技
术人员可根据本文的教导来容易地进行这种选择。
文公开的诊断和治疗方法的结合分子可被轭合至减少肿瘤血管化的分子。在其它实施方案
中，公开的组合物可包括轭合至药物或前体药物的结合分子。本发明其它的实施方案包括
使用轭合至特定生物毒素或它们的细胞毒性片段如蓖麻毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素
或白喉毒素的结合分子。关于使用哪个轭合的或未轭合的结合分子的选择将取决于癌症的
类型和阶段，辅助治疗(例如化疗或外部辐射)的使用和患者状况。将理解的是，本领域技
术人员可根据本文的教导来容易地进行这种选择。
[0560] 将理解的是，在之前的研究中，用同位素标记的抗肿瘤抗体已被成功用来破坏实体瘤以及动物模型和一些情况下的人类中的淋巴瘤/白血病中的细胞。示例性的放射性同
90 125 131 123 111 105 153 67 67 166 177 186 188
位素包括：Y、 I、I、 I、In、 Rh、Sm、Cu、Ga、 Ho、Lu、 Re和 Re。放射性核素
通过产生电离辐射而起作用，其导致核DNA中多处链断裂，导致细胞死亡。用来产生治疗轭合物的同位素通常产生具有短程长度的高能α或β粒子。这种放射性核素杀死与它们极
为贴近的细胞，例如轭合物所连接或进入的赘生细胞。它们对于非定域的细胞具有很少或
者没有作用。放射性核素基本上是非免疫原性的。
90 125 131 123 111 105 153 67 67 166 177 186 188
位素包括：Y、 I、I、 I、In、 Rh、Sm、Cu、Ga、 Ho、Lu、 Re和 Re。放射性核素
通过产生电离辐射而起作用，其导致核DNA中多处链断裂，导致细胞死亡。用来产生治疗轭合物的同位素通常产生具有短程长度的高能α或β粒子。这种放射性核素杀死与它们极
为贴近的细胞，例如轭合物所连接或进入的赘生细胞。它们对于非定域的细胞具有很少或
者没有作用。放射性核素基本上是非免疫原性的。
[0561] 关于与本发明结合的放射性标记的轭合物的用途，结合分子可被直接地标记(例如通过碘化作用)或可通过使用螯合剂而被间接地标记。如本文所用，短语“间接标记”和“间接标记方法”二者都指螯合剂共价连接至结合分子而且至少一个放射性核素与螯合剂
连接。这种螯合剂通常是指双功能螯合剂，因为它们结合至多肽和放射性同位素二者。特
别优选的螯合剂包括1-异硫氰酰苄基(isothiocycmatobenzyl)-3-methyldiothelene三
胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二乙烯三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合剂
111 90
包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于间接标记的特别优选的放射性核素包括 In和 Y。
连接。这种螯合剂通常是指双功能螯合剂，因为它们结合至多肽和放射性同位素二者。特
别优选的螯合剂包括1-异硫氰酰苄基(isothiocycmatobenzyl)-3-methyldiothelene三
胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二乙烯三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合剂
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包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于间接标记的特别优选的放射性核素包括 In和 Y。
[0562] 如本文所用，短语“直接标记”和“直接标记方法”二者都指放射性核素被直接地共价连接至多肽(通常通过氨基酸残基)。更特别地，这些连接技术包括随机标记和位点定向标记。在后一种情况下，标记是针对多肽上特定位点的，例如只存在于轭合物Fc部分的N联糖残基。此外，各种直接标记技术和方案与本发明是适合的。例如，锝-99标记的多肽可-
通过配体交换程序，通过减少高锝酸盐(TcO4)与亚锡离子溶液、将减少的锝螯合至葡聚糖
凝胶柱并将结合多肽应用于该柱，或者通过批标记技术例如通过孵育高锝酸盐、例如SnCl2的还原剂、例如邻苯二甲酸钠-钾溶液的缓冲液以及结合分子来制备。在任何情况下，直接标记结合分子的优选的放射性核素是本领域熟知的，而且用于直接标记的特别优选的放射
131
性核素是通过酪氨酸残基共价连接的 I。用于本文公开的诊断和治疗方法的结合分子可
用例如放射性碘化钠或钾和化学氧化剂例如次氯酸钠、氯胺T以及类似物，或者酶氧化剂
例如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖来衍生。
通过配体交换程序，通过减少高锝酸盐(TcO4)与亚锡离子溶液、将减少的锝螯合至葡聚糖
凝胶柱并将结合多肽应用于该柱，或者通过批标记技术例如通过孵育高锝酸盐、例如SnCl2的还原剂、例如邻苯二甲酸钠-钾溶液的缓冲液以及结合分子来制备。在任何情况下，直接标记结合分子的优选的放射性核素是本领域熟知的，而且用于直接标记的特别优选的放射
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性核素是通过酪氨酸残基共价连接的 I。用于本文公开的诊断和治疗方法的结合分子可
用例如放射性碘化钠或钾和化学氧化剂例如次氯酸钠、氯胺T以及类似物，或者酶氧化剂
例如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖来衍生。
[0563] 关于螯合剂和螯合剂轭合物的专利是本领域已知的。例如，Gansow的美国专利第4,831,175号涉及多取代的二乙烯三胺五乙酸螯合物和含有它的蛋白轭合物，以及制
备它们的方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和
5,124,471号也涉及多取代的DTPA螯合物。这些专利通过引用以其整体被并入本文。适
合的金属螯合物的其它例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，
11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧杂-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸或者类似物。环己基-DTPA或CHX-DTPA是特别优选的并
且在下面被广泛地举例说明。技术人员可容易地辨认其它适合的螯合剂包括尚待发现的那
些，而且其清楚地在本发明的范围内。
备它们的方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和
5,124,471号也涉及多取代的DTPA螯合物。这些专利通过引用以其整体被并入本文。适
合的金属螯合物的其它例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，
11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧杂-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸或者类似物。环己基-DTPA或CHX-DTPA是特别优选的并
且在下面被广泛地举例说明。技术人员可容易地辨认其它适合的螯合剂包括尚待发现的那
些，而且其清楚地在本发明的范围内。
[0564] 优选地选择适合的螯合剂包括美国专利第6,682,134、6,399,061和5,843,439号(其通过引用以其整体被并入本文)中的用来促进螯合的特异性双功能螯合剂，以便提供
对三价金属的高亲和力，展现增加的肿瘤对非肿瘤比率，并减少骨吸收，以及放射性核素在靶位点即B细胞淋巴瘤肿瘤位点的更大体内保持。然而，可以或可以不具有所有这些特性
的其它双功能螯合剂是本领域已知的，并且在肿瘤治疗中还可以是有益的。
对三价金属的高亲和力，展现增加的肿瘤对非肿瘤比率，并减少骨吸收，以及放射性核素在靶位点即B细胞淋巴瘤肿瘤位点的更大体内保持。然而，可以或可以不具有所有这些特性
的其它双功能螯合剂是本领域已知的，并且在肿瘤治疗中还可以是有益的。
[0565] 还将理解的是，根据本文的教导，为了诊断和治疗目的，可将结合分子轭合至不同的放射性标记。为此目的，前面提到的美国专利第6,682,134、6,399,061和5,843,439号公开了在施用治疗抗体之前用于肿瘤的诊断“成像”的放射性标记的治疗轭合物。“In2B8”
111
轭合物包括对通过双功能螯合剂即MX-DTPA(二乙烯三胺五乙酸)连接至 In的人类CD20
抗原有特异性的鼠单克隆抗体2B8，其中所述MX-DTPA包括1-异硫氰酰苄基-3-甲基-DTPA
111
和1-甲基-3-异硫氰酰苄基-DTPA的1∶1混合物。 In作为诊断放射性核素是特别优
选的，因为其可在约1至约10mCi之间安全地施用而没有可检测的毒性；而且成像数据通
90 111
常可预测 Y-标记的抗体接下来的分布。大多数成像研究利用5mCi的 In-标记的抗体，
因为此剂量既安全又与较低剂量相比增加成像效率，而最佳的成像发生在抗体施用之后3
至6天。参见例如Murray等人，J.Nucl.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.
Med.26：67(1985)。
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轭合物包括对通过双功能螯合剂即MX-DTPA(二乙烯三胺五乙酸)连接至 In的人类CD20
抗原有特异性的鼠单克隆抗体2B8，其中所述MX-DTPA包括1-异硫氰酰苄基-3-甲基-DTPA
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和1-甲基-3-异硫氰酰苄基-DTPA的1∶1混合物。 In作为诊断放射性核素是特别优
选的，因为其可在约1至约10mCi之间安全地施用而没有可检测的毒性；而且成像数据通
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常可预测 Y-标记的抗体接下来的分布。大多数成像研究利用5mCi的 In-标记的抗体，
因为此剂量既安全又与较低剂量相比增加成像效率，而最佳的成像发生在抗体施用之后3
至6天。参见例如Murray等人，J.Nucl.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.
Med.26：67(1985)。
[0566] 如上面所指出，若干放射性核素适用于本发明，而且本领域技术人员可容易地确131
定哪种放射性核素在各种情况下最适合。例如， I是用于靶向的免疫疗法的熟知的放射性
131
核素。然而，几种因素可限制 I的临床有用性，其包括：8天的物理半衰期、血液和肿瘤位点二者中的碘化抗体的脱卤以及对于肿瘤中定域的剂量沉积可能是次佳的发射特性(例
如巨大γ成分)。随着优良螯合剂的出现，将金属螯合基团连接至蛋白的可能性使得利用
111 90 90
其它放射性核素例如 In和 Y的可能性增加。 Y提供在放射免疫治疗应用中利用的几
90 131 90
种好处：Y的64小时的半衰期足够长以允许肿瘤的抗体堆积，而且不像例如 I，Y是纯
的高能β发射体而在它的衰退中不伴随γ照射，其在组织中的范围是100至1,000个细
90
胞直径。此外，最小量的穿透辐射允许将 Y标记的抗体施用于门诊病人。另外，标记的抗
体的内化对于细胞杀死是不必需的，而且电离辐射的局部发射应该对缺少靶分子的相邻肿
瘤细胞是致死的。
定哪种放射性核素在各种情况下最适合。例如， I是用于靶向的免疫疗法的熟知的放射性
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核素。然而，几种因素可限制 I的临床有用性，其包括：8天的物理半衰期、血液和肿瘤位点二者中的碘化抗体的脱卤以及对于肿瘤中定域的剂量沉积可能是次佳的发射特性(例
如巨大γ成分)。随着优良螯合剂的出现，将金属螯合基团连接至蛋白的可能性使得利用
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其它放射性核素例如 In和 Y的可能性增加。 Y提供在放射免疫治疗应用中利用的几
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种好处：Y的64小时的半衰期足够长以允许肿瘤的抗体堆积，而且不像例如 I，Y是纯
的高能β发射体而在它的衰退中不伴随γ照射，其在组织中的范围是100至1,000个细
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胞直径。此外，最小量的穿透辐射允许将 Y标记的抗体施用于门诊病人。另外，标记的抗
体的内化对于细胞杀死是不必需的，而且电离辐射的局部发射应该对缺少靶分子的相邻肿
瘤细胞是致死的。
[0567] 轭合至结合分子的另外的优选的剂是细胞毒药物，特别是用于癌症疗法的那些。如本文所用，“细胞毒素或细胞毒性剂”是指对于细胞生长和增殖有害的任何剂，而且其可对减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤起作用。示例性的细胞毒素包括但不限于放射性核素、生物毒素、酶活性的毒素、细胞抑制或细胞毒性的治疗剂、前体药物、免疫活性的配体和生物应答调节剂如细胞因子。对于延缓或减缓免疫活性细胞或恶性细胞的生长起作用的任何
细胞毒素是在本发明的范围内的。
细胞毒素是在本发明的范围内的。
[0568] 示例性的细胞毒素通常包括细胞抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂以及类似物。适用于本发明的示例性的细胞抑制剂包括烷化物质例如氮芥、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，还有亚硝基脲化合物例如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。其它优选的类的细胞毒性剂包括例如类美登醇家族的药物。其它优选的类的细胞毒性剂包括例如蒽环霉素家族的药
物、长春花药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族的药物、二烯类(diynenes)和鬼臼脂素。那些类的特别有用的成员包括例如阿霉素、洋红霉素、道诺红菌素(柔红霉
素)、多柔比星、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、光辉霉素、链黑菌素、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、鬼臼脂素或鬼臼脂素衍生物如依托泊苷或磷酸依托泊苷、美法仑、长春花碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱以及类似物。与本文的教导适合的其它细胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙素、羟基炭疽杆菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物。激素和激素拮抗剂例如皮质类固醇如泼尼松，孕酮如羟基孕酮或
甲羟孕酮，雌激素如己烯雌酚，雌激素对抗剂如他莫昔芬，雄激素如睾酮，以及芳香酶抑制剂如氨鲁米特与本文的教导也是适合的。本领域技术人员可以对期望的化合物进行化学修
饰以使得该化合物的反应对于本发明制备轭合物的目的来说更方便。
物、长春花药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族的药物、二烯类(diynenes)和鬼臼脂素。那些类的特别有用的成员包括例如阿霉素、洋红霉素、道诺红菌素(柔红霉
素)、多柔比星、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、光辉霉素、链黑菌素、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、鬼臼脂素或鬼臼脂素衍生物如依托泊苷或磷酸依托泊苷、美法仑、长春花碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱以及类似物。与本文的教导适合的其它细胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙素、羟基炭疽杆菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物。激素和激素拮抗剂例如皮质类固醇如泼尼松，孕酮如羟基孕酮或
甲羟孕酮，雌激素如己烯雌酚，雌激素对抗剂如他莫昔芬，雄激素如睾酮，以及芳香酶抑制剂如氨鲁米特与本文的教导也是适合的。本领域技术人员可以对期望的化合物进行化学修
饰以使得该化合物的反应对于本发明制备轭合物的目的来说更方便。
[0569] 特别优选的细胞毒素的实例包括抗肿瘤抗生素的烯二炔家族的成员或衍生物，其包括刺孢霉素、埃斯培拉霉素或蒽环类抗生素。这些毒素非常强，并且通过裂解核DNA来起作用，导致细胞死亡。与可在体内裂解以得到许多无活性但具有免疫原性的多肽片段的蛋
白毒素不同，例如刺孢霉素、埃斯培拉霉素和其它烯二炔的毒素是基本上无免疫原性的小
分子。通过之前已用来标记单克隆抗体和其它分子的技术来将这些非肽毒素化学地连接至
二聚体或四聚体。这些连接技术包括经由只存在于构建体的Fc部分上的N联糖残基的位
点特异性连接。这种位点定向连接方法具有减少连接对于构建体结合特性的可能作用的优
势。
白毒素不同，例如刺孢霉素、埃斯培拉霉素和其它烯二炔的毒素是基本上无免疫原性的小
分子。通过之前已用来标记单克隆抗体和其它分子的技术来将这些非肽毒素化学地连接至
二聚体或四聚体。这些连接技术包括经由只存在于构建体的Fc部分上的N联糖残基的位
点特异性连接。这种位点定向连接方法具有减少连接对于构建体结合特性的可能作用的优
势。
[0570] 如之前所提及，制备轭合物的适合的细胞毒素可包括前体药物。如本文所用，术语“前体药物”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞具有较少的细胞毒性，并且能够被酶激活或转化为更有活性的母体形式。适合于本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐的前体药物、含有硫代磷酸盐的前体药物、含有硫酸盐的前体药
物、含有肽的前体药物、含有β内酰胺的前体药物、含有任选地取代的苯氧基乙酰胺的前
体药物或含有任选地取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它可被转化成更有活性
的细胞毒性游离药物的5-氟尿苷前体药物。可被衍生为前体药物形式而用于本发明的细
胞毒性药物的进一步的例子包括上述那些化疗剂。
物、含有肽的前体药物、含有β内酰胺的前体药物、含有任选地取代的苯氧基乙酰胺的前
体药物或含有任选地取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它可被转化成更有活性
的细胞毒性游离药物的5-氟尿苷前体药物。可被衍生为前体药物形式而用于本发明的细
胞毒性药物的进一步的例子包括上述那些化疗剂。
[0571] 在其它细胞毒素中，将被理解的是，本文公开的结合分子还可与生物毒素例如蓖麻毒素A、相思豆毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、蓝藻毒素、蛤蚌毒素、志贺毒素、破伤风、河豚毒素、单端孢霉烯毒素、震颤真菌毒素或毒性酶相连或轭合。优选地，将使用允许抗体毒素构建体的直接表达的遗传工程技术来制备这种构建体。与本文公开的结合分子相连的其
它的生物应答调节剂包括细胞因子例如淋巴因子和干扰素。鉴于本公开，认为，本领域技术人员可容易地使用常规技术形成这种构建体。
它的生物应答调节剂包括细胞因子例如淋巴因子和干扰素。鉴于本公开，认为，本领域技术人员可容易地使用常规技术形成这种构建体。
[0572] 可被用来与所公开的结合分子结合或轭合的另一类的适合的细胞毒素是放射性敏化药物，其可有效地针对肿瘤或免疫活性细胞。这种药物增强对电离辐射的敏感性，从而增加放射疗法的效力。被肿瘤细胞内化的结合分子轭合物将把放射性敏化剂递送至较接近
核，在该处放射性敏化作用将是最大的。连接了未结合的放射性敏化剂的本发明的结合分
子将被快速地从血液清除，将余下的放射性敏化剂定位在靶肿瘤中并在正常组织中提供最
小吸收。在从血液快速清除之后，将以下面三种方法之一与相同靶向抗体一起施用附属放
射疗法：1.)特别针对肿瘤的外部激光辐射，2.)直接植入肿瘤的放射性或3.)全身放射免
疫疗法。该方法潜在的有吸引力的变化是将治疗性放射性同位素连接至放射性敏化的免疫
轭合物，从而为了给患者施用单种药物提供方便。
核，在该处放射性敏化作用将是最大的。连接了未结合的放射性敏化剂的本发明的结合分
子将被快速地从血液清除，将余下的放射性敏化剂定位在靶肿瘤中并在正常组织中提供最
小吸收。在从血液快速清除之后，将以下面三种方法之一与相同靶向抗体一起施用附属放
射疗法：1.)特别针对肿瘤的外部激光辐射，2.)直接植入肿瘤的放射性或3.)全身放射免
疫疗法。该方法潜在的有吸引力的变化是将治疗性放射性同位素连接至放射性敏化的免疫
轭合物，从而为了给患者施用单种药物提供方便。
[0573] 在某些实施方案中，可以轭合增强结合分子的稳定性或效力的部分。例如，在一个实施方案中，可将PEG轭合至本发明的结合分子以增加它们的体内半衰期。Leong，S.R.，等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
[0574] 本发明还包括轭合至诊断或治疗剂的结合分子的用途。可诊断性地使用结合分子以例如监测肿瘤的发展或进展，其被作为临床测试程序的一部分以例如确定给定治疗和
/或预防疗法的效力。可通过将结合分子轭合至可检测的物质以协助检测。可检测的物
质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属(其使用各种正电子发射拓扑)和非放射性顺磁金属离子。参见例如美国专利第
4,741,900号中可被轭合至本发明中用于诊断的抗体的金属离子。适合的酶的例子包括辣
根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括链霉抗生素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物质的例子包括伞形花
内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；而
125 131 111 99
且适合的放射性物质的例子包括 I、 I、In或 Tc。
/或预防疗法的效力。可通过将结合分子轭合至可检测的物质以协助检测。可检测的物
质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属(其使用各种正电子发射拓扑)和非放射性顺磁金属离子。参见例如美国专利第
4,741,900号中可被轭合至本发明中用于诊断的抗体的金属离子。适合的酶的例子包括辣
根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括链霉抗生素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物质的例子包括伞形花
内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；而
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且适合的放射性物质的例子包括 I、 I、In或 Tc。
[0575] 结合分子还可被可检测地标记，其通过将它轭合至化学发光化合物来进行。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的结合分子的存
在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪
唑、吖啶盐和草酸酯。可将结合分子可检测地标记的方法中的一种是通过将其连接至酶并
将被连接的产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))”Microbiological Associates Quarterly
Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等 人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；
Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等人，(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。结合至结合分子的酶将与合适的底物优选地为显色底物以产生可通过例如
分光光度计测量的、荧光的或目视方法被检测的化学部分的方式发生反应。可被用来可检
测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用酶的显色底物的比色法来完成检测。
还可通过将底物的酶反应程度与相似地制备的标准物进行视觉对比来完成检测。
在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪
唑、吖啶盐和草酸酯。可将结合分子可检测地标记的方法中的一种是通过将其连接至酶并
将被连接的产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))”Microbiological Associates Quarterly
Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等 人，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；
Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.等人，(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。结合至结合分子的酶将与合适的底物优选地为显色底物以产生可通过例如
分光光度计测量的、荧光的或目视方法被检测的化学部分的方式发生反应。可被用来可检
测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用酶的显色底物的比色法来完成检测。
还可通过将底物的酶反应程度与相似地制备的标准物进行视觉对比来完成检测。
[0576] 还可使用各种其它免疫测定中的任一种来完成检测。例如，通过结合分子的放射性标记，可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测癌症抗原(参见例如Weintraub，
B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand
AssayTechniques(放射免疫测定原理，放射配体测定技术的第七次培训课程)，The
Endocrine Society，(1986年3月)，其通过引用被并入本文)。可通过一些方法来检测放
射性同位素，其包括但不限于伽玛计数器、闪烁计数器或放射自显影法。
B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand
AssayTechniques(放射免疫测定原理，放射配体测定技术的第七次培训课程)，The
Endocrine Society，(1986年3月)，其通过引用被并入本文)。可通过一些方法来检测放
射性同位素，其包括但不限于伽玛计数器、闪烁计数器或放射自显影法。
[0577] 还可使用发射荧光的金属例如152Eu或其它镧系来可检测地标记结合分子。可使用金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)来将这些金属连接至
所述结合分子。
所述结合分子。
[0578] 将各种部分轭合至结合分子的技术是熟知的，参见例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy(癌症疗法中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(单克隆抗
体和癌症疗法)中，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.(1985)；
Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等人(编辑)，Marcel Dekker，
Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)”，MonoclonalAntibodies ′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体’84：生物和临床应用)
中，Pinchera等 人(编 辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future
Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy(癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗用途的分析、结果和未来展望)”，Monoclonal
AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和疗法的单克隆抗体)
中，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页(1985)；以及Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭
合物的制备和细胞毒性特性)”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
体和癌症疗法)中，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.(1985)；
Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等人(编辑)，Marcel Dekker，
Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview(癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述)”，MonoclonalAntibodies ′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体’84：生物和临床应用)
中，Pinchera等 人(编 辑)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future
Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy(癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗用途的分析、结果和未来展望)”，Monoclonal
AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和疗法的单克隆抗体)
中，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页(1985)；以及Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭
合物的制备和细胞毒性特性)”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
[0579] (ii)减少免疫原性
[0580] 在某些实施方案中，使用本领域公认的技术来修饰本发明的IGF-1R结合分子或其部分以减少它们的免疫原性。例如，结合分子或其部分可以被人源化、灵长类化或者去
免疫化。在一个实施方案中，可制备嵌合的结合分子或结合分子可包括至少一部分的嵌合
抗体分子。这种情况下，构建了非人类的IGF-1R结合分子，通常是鼠或灵长类结合分子，
保留或基本上保留亲本结合分子的抗原结合特性，但是在人类中具有较少的免疫原性。这
可通过各种方法来实现，其包括(a)将完整的非人类可变结构域嫁接到人类恒定区以产
生嵌合结合分子；(b)将至少一部分的一种或多种非人类互补决定区(CDR)嫁接到保留
或不保留关键骨架残基的人类骨架和恒定区；或者(c)移植完整的非人类可变结构域，
但通过替换表面残基来用类似于人类的部分将它们“覆盖”。这种方法公开在Morrison
等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison 等 人，Adv.Immunol.44：
65-92(1989)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：
489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)和 美 国 专利 第 5,585,089、
5,693,761、5,693,762和6,190,370号，所有这些都通过引用以其整体被并入。
免疫化。在一个实施方案中，可制备嵌合的结合分子或结合分子可包括至少一部分的嵌合
抗体分子。这种情况下，构建了非人类的IGF-1R结合分子，通常是鼠或灵长类结合分子，
保留或基本上保留亲本结合分子的抗原结合特性，但是在人类中具有较少的免疫原性。这
可通过各种方法来实现，其包括(a)将完整的非人类可变结构域嫁接到人类恒定区以产
生嵌合结合分子；(b)将至少一部分的一种或多种非人类互补决定区(CDR)嫁接到保留
或不保留关键骨架残基的人类骨架和恒定区；或者(c)移植完整的非人类可变结构域，
但通过替换表面残基来用类似于人类的部分将它们“覆盖”。这种方法公开在Morrison
等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison 等 人，Adv.Immunol.44：
65-92(1989)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：
489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)和 美 国 专利 第 5,585,089、
5,693,761、5,693,762和6,190,370号，所有这些都通过引用以其整体被并入。
[0581] 在一个实施方案中，本发明的结合分子(如，抗体)或其部分可以是嵌合的。嵌合结合分子是这样的结合分子，在其中结合分子的不同部分衍生自不同动物物种，例如具有
衍生自鼠单克隆抗体可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合结合分子的方法是
本领域已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques
4：214(1986)；Glllies等 人，J.Immunol.Methods125：191-202(1989)；美 国 专 利 第
5,807,715；4,816,567和4,816397号，其通过引用以其整体被并入本文。可以使用为产
生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；
Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))来合成所述分子。例如，编码小鼠IGF-1R抗体分子的结合特异性的遗传序列可与来自适当
生物活性的人类抗体分子的序列融合在一起，并可使用。如本文所用，嵌合结合分子是这样的分子，其中不同的部分衍生自不同的动物物种，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区
和人类免疫球蛋白恒定区的那些，例如人源化的抗体。
衍生自鼠单克隆抗体可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合结合分子的方法是
本领域已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques
4：214(1986)；Glllies等 人，J.Immunol.Methods125：191-202(1989)；美 国 专 利 第
5,807,715；4,816,567和4,816397号，其通过引用以其整体被并入本文。可以使用为产
生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；
Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314：452-454(1985))来合成所述分子。例如，编码小鼠IGF-1R抗体分子的结合特异性的遗传序列可与来自适当
生物活性的人类抗体分子的序列融合在一起，并可使用。如本文所用，嵌合结合分子是这样的分子，其中不同的部分衍生自不同的动物物种，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区
和人类免疫球蛋白恒定区的那些，例如人源化的抗体。
[0582] 在另一实施方案中，本发明的结合分子或其部分是灵长类化的。Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)公开了灵长类化抗体的方法。特别地，此技术导致产生含有猴可变区和人类恒定序列的抗体。此文献以其整体通过引用被并入本文。此外，此
技术还被描述于共同转让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号之中，其每
一个都通过引用被并入本文。
技术还被描述于共同转让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号之中，其每
一个都通过引用被并入本文。
[0583] 在另一实施方案中，本发明的结合分子(如，抗体)或其部分是人源化的。人源化的结合分子是具有来自非人类物种抗体的结合特异性的结合分子，其结合期望的抗原，
其中所述抗原具有来自非人类物种抗体的一个或多个互补决定区(CDR)以及来自人类免
疫球蛋白分子的骨架区。通常，人类骨架区中的骨架残基将被来自CDR供体抗体的相应残
基所取代以改变，优选地促进抗原结合。使用本领域中熟知的方法鉴定这些骨架取代，例
如通过对CDR和骨架残基的相互作用进行建模以鉴定对于抗原结合重要的骨架残基，并
且通过序列对比来鉴定在特定位置的不常见骨架残基。(参见例如Queen等人，美国专利
第5,585,089号；Riechmann等人，Nature332：323(1988)，其通过引用以其整体被并入本
文。)可以使用本领域已知的各种技术将抗体人源化，其中所述技术包括例如CDR嫁接(EP
239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利第5,225,539、5,530,101和5,585,089号)、表
面修饰(veneering)或表面重建(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology
28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；
Roguska等人，PNAS 91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。
其中所述抗原具有来自非人类物种抗体的一个或多个互补决定区(CDR)以及来自人类免
疫球蛋白分子的骨架区。通常，人类骨架区中的骨架残基将被来自CDR供体抗体的相应残
基所取代以改变，优选地促进抗原结合。使用本领域中熟知的方法鉴定这些骨架取代，例
如通过对CDR和骨架残基的相互作用进行建模以鉴定对于抗原结合重要的骨架残基，并
且通过序列对比来鉴定在特定位置的不常见骨架残基。(参见例如Queen等人，美国专利
第5,585,089号；Riechmann等人，Nature332：323(1988)，其通过引用以其整体被并入本
文。)可以使用本领域已知的各种技术将抗体人源化，其中所述技术包括例如CDR嫁接(EP
239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利第5,225,539、5,530,101和5,585,089号)、表
面修饰(veneering)或表面重建(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology
28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；
Roguska等人，PNAS 91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。
[0584] 还可使用去免疫作用来减少结合分子的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫作用”包括改变结合分子以修饰T细胞表位(参见例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，
可分析来自起始抗体的VH和VL序列，以及来自每个V区的显示与互补决定区(CDR)相关
的表位位置和序列中的其它关键残基的人类T细胞表位“图”。分析来自T细胞表位定位
的单个T细胞表位以鉴定具有低的改变最终抗体活性的风险的可选的氨基酸取代。设计了
一系列可选的VH和VL序列，其包括氨基酸取代的组合，而且这些序列随后被并入一系列结
合多肽例如IGF-1R特异性抗体或其免疫特异性片段中以用于本文所公开的诊断和治疗方
法，然后测试其功能。通常地，产生并测试12至24个变体抗体。然后将包括修饰的V和人
类C区域的完整的重链和轻链基因克隆进表达载体，并将所得的质粒引入细胞系以产生完
整的抗体。然后在适当的生化和生物测定中比较所述抗体，并鉴定最佳的变体。
可分析来自起始抗体的VH和VL序列，以及来自每个V区的显示与互补决定区(CDR)相关
的表位位置和序列中的其它关键残基的人类T细胞表位“图”。分析来自T细胞表位定位
的单个T细胞表位以鉴定具有低的改变最终抗体活性的风险的可选的氨基酸取代。设计了
一系列可选的VH和VL序列，其包括氨基酸取代的组合，而且这些序列随后被并入一系列结
合多肽例如IGF-1R特异性抗体或其免疫特异性片段中以用于本文所公开的诊断和治疗方
法，然后测试其功能。通常地，产生并测试12至24个变体抗体。然后将包括修饰的V和人
类C区域的完整的重链和轻链基因克隆进表达载体，并将所得的质粒引入细胞系以产生完
整的抗体。然后在适当的生化和生物测定中比较所述抗体，并鉴定最佳的变体。
[0585] (iii)效应子功能和Fc修饰
[0586] 本发明的IGF-1R结合分子可包括介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1成分与抗体恒定区的结合可激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理作用
和溶解中是重要的。补体的激活还刺激炎症应答并且还可涉及在自身免疫性超敏作用中。
此外，抗体通过Fc区域结合至各种细胞上的受体，而抗体Fc区域上的Fc受体结合位点结
合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在若干对不同类的抗体有特异性的Fc受体，其包括IgG(γ
受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结
合触发若干重要的和各种各样的生物应答，其包括抗体包被的颗粒的吞没和破坏、免疫复
合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的溶解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和对免疫球蛋白生成的控制。
和溶解中是重要的。补体的激活还刺激炎症应答并且还可涉及在自身免疫性超敏作用中。
此外，抗体通过Fc区域结合至各种细胞上的受体，而抗体Fc区域上的Fc受体结合位点结
合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在若干对不同类的抗体有特异性的Fc受体，其包括IgG(γ
受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结
合触发若干重要的和各种各样的生物应答，其包括抗体包被的颗粒的吞没和破坏、免疫复
合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的溶解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和对免疫球蛋白生成的控制。
[0587] 本发明的某些实施方案包括IGF-1R结合分子，在其中一个或多个恒定区结构域中的至少一个氨基酸已缺失或以其它方式被改变以提供期望的生化特性例如与具有大约
相同的免疫原性的完整的、未改变的抗体相比减少的效应子功能、非共价二聚化的能力、增加的定位于肿瘤位点的能力、减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些结合分子是缺失了结构域的抗体，其包括与免疫球蛋白重链相似
的多肽链，但是缺少至少一部分的一个或多个重链结构域。举例来说，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如CH2结构域的全部或部分将缺失。
相同的免疫原性的完整的、未改变的抗体相比减少的效应子功能、非共价二聚化的能力、增加的定位于肿瘤位点的能力、减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些结合分子是缺失了结构域的抗体，其包括与免疫球蛋白重链相似
的多肽链，但是缺少至少一部分的一个或多个重链结构域。举例来说，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如CH2结构域的全部或部分将缺失。
[0588] 在某些IGF-1R结合分子中，可使用本领域已知的技术对Fc部分进行突变以减少效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方法)可减少循环修饰
的结合分子与Fc受体的结合，从而增加肿瘤定位。在其它情况下，与本发明一致的恒定区
修饰可能减缓补体结合并因此减少轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。但是恒
定区的其它修饰可被用来修饰二硫键或低聚糖部分，其因为增加的抗原特异性或柔性而允
许增强的定位。所述修饰的所得的生理概况、生物利用率和其它生化作用，例如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期，可使用熟知的免疫学技术容易地测量和定量而不需过度的实验。
的结合分子与Fc受体的结合，从而增加肿瘤定位。在其它情况下，与本发明一致的恒定区
修饰可能减缓补体结合并因此减少轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。但是恒
定区的其它修饰可被用来修饰二硫键或低聚糖部分，其因为增加的抗原特异性或柔性而允
许增强的定位。所述修饰的所得的生理概况、生物利用率和其它生化作用，例如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期，可使用熟知的免疫学技术容易地测量和定量而不需过度的实验。
[0589] 在某些实施方案中，本发明的结合多肽中采用的Fc结构域是Fc变体。如本文所用，术语“Fc变体”是指相对于所述Fc结构域所衍生自的野生型Fc结构域具有至少一个氨
基酸取代的Fc结构域。例如，其中Fc结构域衍生自人类IgG1抗体时，所述人类IgG1Fc结
构域的Fc变体包括相对于所述Fc结构域的至少一个氨基酸取代。
基酸取代的Fc结构域。例如，其中Fc结构域衍生自人类IgG1抗体时，所述人类IgG1Fc结
构域的Fc变体包括相对于所述Fc结构域的至少一个氨基酸取代。
[0590] Fc变体的氨基酸取代可位于Fc结构域中的任何位置(即，任何EU惯例氨基酸位置)。在一个实施方案中，Fc变体包括在位于铰链结构域或其部分的氨基酸位置的取代。
在另一实施方案中，Fc变体包括在位于CH2结构域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一
实施方案中，Fc变体包括位于CH3结构域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一实施方案
中，Fc变体包括在位于CH4结构域或其部分的氨基酸位置的取代。
在另一实施方案中，Fc变体包括在位于CH2结构域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一
实施方案中，Fc变体包括位于CH3结构域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一实施方案
中，Fc变体包括在位于CH4结构域或其部分的氨基酸位置的取代。
[0591] 本发明的结合多肽可采用已知赋予效应子功能和/或FcR结合的改进(如，减少或增强)的任何领域公认的Fc变体。所述Fc变体可包括，例如，在以下中公开的任何一种
氨基酸取代：国际PCT公布第WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、
WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、
WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、
WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、
WO06/047350A2和WO06/085967A2或 美 国 专 利 第5,648,260；5,739,277；5,834,250；
5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；
6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253和7,083,784号，其各自通过引用并入本
文。
氨基酸取代：国际PCT公布第WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、
WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、
WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、
WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、
WO06/047350A2和WO06/085967A2或 美 国 专 利 第5,648,260；5,739,277；5,834,250；
5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；
6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253和7,083,784号，其各自通过引用并入本
文。
[0592] 在优选的实施方案中，结合多肽可包括在Fc结构域的“15埃接触区”中的EU氨基酸位置包含氨基酸取代的Fc变体。15埃区包括位于Fc区的EU位置243至261、275至
280、282-293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408和424-440的残基。
280、282-293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408和424-440的残基。
[0593] 在某些实施方案中，本发明的结合多肽包括包含氨基酸取代的Fc变体，所述氨基酸取代改变抗体的抗原-不依赖性效应子功能，尤其是抗体的循环半衰期。与缺少这些取
代的结合多肽相比，这种结合多肽表现出对FcRn的结合增加或减少，并因此分别具有血清
中增加的或减少的半衰期。预料对FcRn有改进的亲和力的Fc变体具有更长的血清半衰
期，且这种分子在期望施用的多肽半衰期长的哺乳动物治疗方法中具有有用的应用，如，治疗慢性疾病或疾患。相反，预料具有减少的FcRn结合亲和力的Fc变体具有短的半衰期，这
种分子可用于例如，施用于短的循环时间可为有益的哺乳动物，如用于体内诊断成像或起
始多肽长时间存在于循环中时具有毒副作用的情况。具有减少的FcRn结合亲和力的Fc变
体也较不可能穿过胎盘，因此，可用于治疗孕妇的疾病或紊乱。此外，期望FcRn结合亲和力减少的其它应用包括其中期望定位脑、肾和/或肝的那些应用。在一个示例性实施方案中，本发明的改变的多肽表现出从脉管系统跨肾小球上皮的转运减少。在另一个实施方案中，
本发明的改变的多肽表现从脑跨血脑屏障(BBB)进入血管空间的转运减少。在一个实施方
案中，具有改变的FcRn结合的结合多肽包含在Fc结构域的“FcRn结合环”中具有一个或多
个氨基酸取代的Fc结构域。FcRn结合环包含氨基酸残基280-299(根据EU编号)。在其
它实施方案中，具有改变的FcRn结合亲合力的本发明结合多肽包含在 FcRn“接触区”
中具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。如本文所用，术语 FcRn“接触区”包括
在以下位置的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、
393、408、424、425-440(EU编号)。在优选的实施方案中，具有改变的FcRn结合亲合力的
本发明结合多肽包含在以下任何一个位置具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域：256、
277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434和438。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布第WO05/047327号，其通过引用并入本文。
代的结合多肽相比，这种结合多肽表现出对FcRn的结合增加或减少，并因此分别具有血清
中增加的或减少的半衰期。预料对FcRn有改进的亲和力的Fc变体具有更长的血清半衰
期，且这种分子在期望施用的多肽半衰期长的哺乳动物治疗方法中具有有用的应用，如，治疗慢性疾病或疾患。相反，预料具有减少的FcRn结合亲和力的Fc变体具有短的半衰期，这
种分子可用于例如，施用于短的循环时间可为有益的哺乳动物，如用于体内诊断成像或起
始多肽长时间存在于循环中时具有毒副作用的情况。具有减少的FcRn结合亲和力的Fc变
体也较不可能穿过胎盘，因此，可用于治疗孕妇的疾病或紊乱。此外，期望FcRn结合亲和力减少的其它应用包括其中期望定位脑、肾和/或肝的那些应用。在一个示例性实施方案中，本发明的改变的多肽表现出从脉管系统跨肾小球上皮的转运减少。在另一个实施方案中，
本发明的改变的多肽表现从脑跨血脑屏障(BBB)进入血管空间的转运减少。在一个实施方
案中，具有改变的FcRn结合的结合多肽包含在Fc结构域的“FcRn结合环”中具有一个或多
个氨基酸取代的Fc结构域。FcRn结合环包含氨基酸残基280-299(根据EU编号)。在其
它实施方案中，具有改变的FcRn结合亲合力的本发明结合多肽包含在 FcRn“接触区”
中具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。如本文所用，术语 FcRn“接触区”包括
在以下位置的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、
393、408、424、425-440(EU编号)。在优选的实施方案中，具有改变的FcRn结合亲合力的
本发明结合多肽包含在以下任何一个位置具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域：256、
277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434和438。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布第WO05/047327号，其通过引用并入本文。
[0594] 在其它实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些结合分子具有恒定区，如，IgG4重链恒定区，其被改变以减少或消除糖基化。例如，本发明的结合多肽还可包括包含改变结合多肽糖基化的氨基酸取代的Fc变体。例如，所述Fc变体可具有减少的糖基
化(如，N-或O-连接的糖基化)或可包含野生型Fc结构域的改变的糖形(如，低岩藻糖或
无岩藻糖的聚糖)。在示例性实施方案中，Fc变体包括N-连接的聚糖减少的糖基化，通常
见于氨基酸位置297(EU编号)。在另一示例性实施方案中，Fc变体在氨基酸位置297(EU
编号)包含低岩藻糖或无岩藻糖的聚糖。在另一实施方案中，结合多肽具有靠近糖基化基
序或糖基化基序中的氨基酸取代，例如，包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基
序。在特定实施方案中，结合多肽包括在氨基酸位置228或299(EU编号)包含氨基酸取代
的Fc变体。在更特定的实施方案中，结合分子包括包含S228P和T299A突变(EU编号)的
IgG4恒定区。
化(如，N-或O-连接的糖基化)或可包含野生型Fc结构域的改变的糖形(如，低岩藻糖或
无岩藻糖的聚糖)。在示例性实施方案中，Fc变体包括N-连接的聚糖减少的糖基化，通常
见于氨基酸位置297(EU编号)。在另一示例性实施方案中，Fc变体在氨基酸位置297(EU
编号)包含低岩藻糖或无岩藻糖的聚糖。在另一实施方案中，结合多肽具有靠近糖基化基
序或糖基化基序中的氨基酸取代，例如，包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基
序。在特定实施方案中，结合多肽包括在氨基酸位置228或299(EU编号)包含氨基酸取代
的Fc变体。在更特定的实施方案中，结合分子包括包含S228P和T299A突变(EU编号)的
IgG4恒定区。
[0595] 赋予减少或改变糖基化的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布第WO05/018572号，其通过引用并入本文。在优选实施方案中，本发明的结合分子被改变以除去糖基化。这样的结合分子可称作“agly”结合分子(如，“agly”抗体)。未受理论所限制，相信“agly”结合分子可具有增强的体内安全性和稳定性概况。示例性agly结合分子包括IgG4抗体
(“IgG4.P”)的去糖基化的Fc区，其缺乏Fc-效应子功能从而消除Fc介导的对表达IGF-1R
的正常生命器官的毒性的可能。在特定实施方案中，本发明的agly结合分子可包括如SEQ
IDNO：132所列的IgG4.P恒定区(参见图10(b))。
(“IgG4.P”)的去糖基化的Fc区，其缺乏Fc-效应子功能从而消除Fc介导的对表达IGF-1R
的正常生命器官的毒性的可能。在特定实施方案中，本发明的agly结合分子可包括如SEQ
IDNO：132所列的IgG4.P恒定区(参见图10(b))。
[0596] VII.制备结合分子的方法
[0597] 如所熟知，可从原始的杂交瘤细胞或从通过标准技术转化的其它细胞来分离RNA，其中所述标准技术例如异硫氰酸胍提取和沉淀接着是离心或层析。当期望时，可通过标准技术例如寡dT纤维素上的层析来从总RNA分离mRNA。适合的技术是本领域所熟悉的。
[0598] 在一个实施方案中，可以根据公知方法使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或分别制备编码本发明结合分子不同链例如抗体轻链和重链的eDNA。例如，可通过共有恒定区引
物或通过基于公布的DNA和氨基酸序列的更特异性的引物来起始PCR。如上所讨论，还可将
PCR用于分离编码结合分子不同链的DNA克隆。在该情况下，可通过共有引物或更大的同源
性探针如小鼠恒定区探针来筛选文库。可使用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常是质粒DNA，并根据前面关于重组DNA技术的文献详细阐述的标准的公知技术来绘制其限制
性图谱并测序。当然，根据本发明，在分离过程之中或之后的分析中任一点，所述DNA可以是合成的。在操作分离的遗传物质以提供本发明的结合分子之后，编码IGF-1R结合分子的
多核苷酸通常被插入将被引入宿主细胞的表达载体，其中所述宿主细胞可被用来产生期望
量的IGF-1R结合分子。
物或通过基于公布的DNA和氨基酸序列的更特异性的引物来起始PCR。如上所讨论，还可将
PCR用于分离编码结合分子不同链的DNA克隆。在该情况下，可通过共有引物或更大的同源
性探针如小鼠恒定区探针来筛选文库。可使用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常是质粒DNA，并根据前面关于重组DNA技术的文献详细阐述的标准的公知技术来绘制其限制
性图谱并测序。当然，根据本发明，在分离过程之中或之后的分析中任一点，所述DNA可以是合成的。在操作分离的遗传物质以提供本发明的结合分子之后，编码IGF-1R结合分子的
多核苷酸通常被插入将被引入宿主细胞的表达载体，其中所述宿主细胞可被用来产生期望
量的IGF-1R结合分子。
[0599] 结合分子例如结合至本文所述靶分子如IGF-1R的抗体的重链或轻链的重组表达，需要构建含有编码所述结合分子的多核苷酸的表达载体。获得编码本发明的结合分子
(或者一条链或其部分)的多核苷酸之后，可通过使用本领域公知技术的重组DNA技术来产
生用于产生结合分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码结合分子的核苷酸序列
的多核苷酸而制备蛋白的方法。本领域技术人员公知的方法可被用来构建表达载体，其含
有编码结合分子的序列和适合的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技
术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制的载体，其包含编码本发明的结合分子或一条链或其结构域的可操作地连接至启动子的核苷酸序列。这种载体可包含编码抗
体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公布WO 86/05807、PCT公布WO89/01036和美
国专利第5,122,464号)，而且编码结合分子(或其链或结构域)的核苷酸可被克隆进这种
载体以表达整个结合分子。
(或者一条链或其部分)的多核苷酸之后，可通过使用本领域公知技术的重组DNA技术来产
生用于产生结合分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码结合分子的核苷酸序列
的多核苷酸而制备蛋白的方法。本领域技术人员公知的方法可被用来构建表达载体，其含
有编码结合分子的序列和适合的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技
术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制的载体，其包含编码本发明的结合分子或一条链或其结构域的可操作地连接至启动子的核苷酸序列。这种载体可包含编码抗
体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公布WO 86/05807、PCT公布WO89/01036和美
国专利第5,122,464号)，而且编码结合分子(或其链或结构域)的核苷酸可被克隆进这种
载体以表达整个结合分子。
[0600] 当本发明的结合分子是二聚体时，可用本发明的两种表达载体共同转染宿主细胞，其中第一载体编码第一多肽单体并且第二载体编码第二多肽单体。两种载体可含有相
同的可选标志物，其使得两种单体均等表达。可选地，可以使用编码两种单体的单个载体。
在两种单体是抗体轻链和抗体重链的实施方案中，轻链被有利地置于重链之前以避免过量
的毒性游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
77：2197(1980))。结合分子的单体的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。本文使用术语
“载体”或“表达载体”来指根据本发明被用作在宿主细胞中引入和表达期望基因的媒介物的载体。如本领域技术人员所知，这种载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒所组成的组。通常，与本发明适合的载体将包括选择标志物、促进期望基因克隆的适合的限制位点以及进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
同的可选标志物，其使得两种单体均等表达。可选地，可以使用编码两种单体的单个载体。
在两种单体是抗体轻链和抗体重链的实施方案中，轻链被有利地置于重链之前以避免过量
的毒性游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
77：2197(1980))。结合分子的单体的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。本文使用术语
“载体”或“表达载体”来指根据本发明被用作在宿主细胞中引入和表达期望基因的媒介物的载体。如本领域技术人员所知，这种载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒所组成的组。通常，与本发明适合的载体将包括选择标志物、促进期望基因克隆的适合的限制位点以及进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
[0601] 为了本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一类载体使用衍生自动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它的包括使用具有内核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，可通过引入一个或多个允许选择转染宿主细胞的标志物来选择已经将DNA整合进它
们的染色体的细胞。所述标志物可提供对营养缺陷型宿主的原营养、对杀生物剂(例如抗
生素)的抗性或对重金属例如铜的抗性。可将可选的标志物基因直接连接至待表达的DNA
序列，或者通过共同转化引入相同细胞。对于mRNA的最优化合成还可需要另外的元件。这
些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在特别优选的实
施方案中，克隆的可变区基因与按上面所讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选为人类
的)一起插入表达载体。在一个实施方案中，使用Biogen IDEC，Inc.的被称作NEOSPLA的
有专利权的表达载体(公开于美国专利第6,159,730号)来使其实现。该载体含有细胞巨
化病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起始区、牛生长激素多腺苷
酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经
发现，在引入可变和恒定区基因、转染进CHO细胞然后在含有G418的培养基中选择并用氨
甲蝶呤扩增时，该载体导致非常高水平的抗体表达。当然，能够在真核细胞中引发表达的
任何表达载体可被用于本发明。适合的载体的例子包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)以及质粒pCI(可从Promega，Madison，
WI获得)。通常，如果免疫球蛋白重链和轻链可通过例如机器人系统来进行的常规实验，则筛选大量的转化细胞中表达适当高水平的那些。还在美国专利第5,736,137和5,658,570
号中教导了载体系统，其每一个都通过引用以其整体被并入本文。该系统提供了高表达水
平，例如＞30pg/细胞/天。其它示例性的载体系统被公开于例如美国专利第6,413,777
号中。
们的染色体的细胞。所述标志物可提供对营养缺陷型宿主的原营养、对杀生物剂(例如抗
生素)的抗性或对重金属例如铜的抗性。可将可选的标志物基因直接连接至待表达的DNA
序列，或者通过共同转化引入相同细胞。对于mRNA的最优化合成还可需要另外的元件。这
些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在特别优选的实
施方案中，克隆的可变区基因与按上面所讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选为人类
的)一起插入表达载体。在一个实施方案中，使用Biogen IDEC，Inc.的被称作NEOSPLA的
有专利权的表达载体(公开于美国专利第6,159,730号)来使其实现。该载体含有细胞巨
化病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起始区、牛生长激素多腺苷
酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经
发现，在引入可变和恒定区基因、转染进CHO细胞然后在含有G418的培养基中选择并用氨
甲蝶呤扩增时，该载体导致非常高水平的抗体表达。当然，能够在真核细胞中引发表达的
任何表达载体可被用于本发明。适合的载体的例子包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)以及质粒pCI(可从Promega，Madison，
WI获得)。通常，如果免疫球蛋白重链和轻链可通过例如机器人系统来进行的常规实验，则筛选大量的转化细胞中表达适当高水平的那些。还在美国专利第5,736,137和5,658,570
号中教导了载体系统，其每一个都通过引用以其整体被并入本文。该系统提供了高表达水
平，例如＞30pg/细胞/天。其它示例性的载体系统被公开于例如美国专利第6,413,777
号中。
[0602] 在其它优选的实施方案中，可以使用多顺反子构建体来表达本发明的结合分子，其中所述多顺反子构建体例如在2002年11月18日提交的美国专利申请公布第
2003-0157641 A1号中所公开的那些，其整体被并入本文。在这些全新的表达系统中，可以从单个多顺反子构建体来产生感兴趣的多基因产物例如抗体的重链和轻链。这些系统有利
地使用内核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的IGF-1R结合分
子。适合的IRES序列被公开在美国专利第6,193,980号中，其也被并入本文。本领域技术
人员将了解，这种表达系统可用来有效地产生公开在本申请中的全范围的IGF-1R结合分
子。
2003-0157641 A1号中所公开的那些，其整体被并入本文。在这些全新的表达系统中，可以从单个多顺反子构建体来产生感兴趣的多基因产物例如抗体的重链和轻链。这些系统有利
地使用内核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的IGF-1R结合分
子。适合的IRES序列被公开在美国专利第6,193,980号中，其也被并入本文。本领域技术
人员将了解，这种表达系统可用来有效地产生公开在本申请中的全范围的IGF-1R结合分
子。
[0603] 更通常地，一旦制备了编码IGF-1R结合分子的单体亚基的载体或DNA序列，可将表达载体引入适合的宿主细胞。可通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现质粒向宿主
细胞的引入。这些包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、
与有包膜DNA的细胞融合、微注射和完整病毒的感染。参见Ridgway，A.A.G.″Mammalian
Expression Vectors(哺乳动物表达载体)″Vectors(载体)，Rodriguez和Denhardt编
辑，Butterworths，波士顿，马萨诸塞州，第24.2章，第470-472页(1988)。通常，向宿主引入质粒是通过电穿孔。含有表达构建体的宿主细胞是在适合产生结合分子的条件下生长
的，并且被测定了结合分子的合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学以及类似物。
细胞的引入。这些包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、
与有包膜DNA的细胞融合、微注射和完整病毒的感染。参见Ridgway，A.A.G.″Mammalian
Expression Vectors(哺乳动物表达载体)″Vectors(载体)，Rodriguez和Denhardt编
辑，Butterworths，波士顿，马萨诸塞州，第24.2章，第470-472页(1988)。通常，向宿主引入质粒是通过电穿孔。含有表达构建体的宿主细胞是在适合产生结合分子的条件下生长
的，并且被测定了结合分子的合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学以及类似物。
[0604] 通过常规技术将表达载体转移进宿主细胞，然后通过常规技术培养转染细胞以产生用于本文所述方法的结合分子。因此，本发明包括含有编码本发明结合分子或其单体或
链的多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸被可操作地连接至异源性启动子。在表达双
链或二聚结合分子的优选的实施方案中，分别编码结合分子的载体可被共同表达在宿主细
胞中以表达整个结合分子，如下所详述。
链的多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸被可操作地连接至异源性启动子。在表达双
链或二聚结合分子的优选的实施方案中，分别编码结合分子的载体可被共同表达在宿主细
胞中以表达整个结合分子，如下所详述。
[0605] 如本文所用，“宿主细胞”是指含有使用重组DNA技术构建的并编码至少一个异源性基因的载体的细胞。在描述从重组宿主分离结合分子的过程中，术语“细胞”和“细胞培养物”被可互换地使用以表示结合分子的来源，除非它被另外清楚地说明。换言之，从“细胞”中回收多肽可以指从旋转沉淀的全细胞或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物中。
[0606] 可以利用各种宿主表达载体系统来表达用于本文所述方法的结合分子。这种宿主表达系统表示感兴趣的编码序列可通过其被产生并接着被纯化的媒介物，但是还代表当用
适合的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明抗体分子的细胞。这些包括但不限
于微生物例如用含有结合分子编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转
化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)、用含有结合分子编码序列的重组酵母表达载体转化
的酵母(例如酵母菌属、毕赤酵母属)、用含有结合分子编码序列的重组病毒表达载体(例
如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统、用含有结合分子编码序列的重组病毒表达载体(例如
花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有结合分子编码序列的重组质
粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统、或者包括含有衍生自哺乳动物细胞基因
组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启
动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细
胞)。优选地，细菌细胞例如大肠杆菌，以及更优选地，特别是用来表达整个重组结合分子的真核细胞被用来表达重组结合分子。例如，与载体(例如来自人类细胞巨化病毒的主要立
即早期基因启动子元件)合并在一起的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体
和其它结合分子的有效表达系统(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology 8：2(1990))。
适合的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明抗体分子的细胞。这些包括但不限
于微生物例如用含有结合分子编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转
化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)、用含有结合分子编码序列的重组酵母表达载体转化
的酵母(例如酵母菌属、毕赤酵母属)、用含有结合分子编码序列的重组病毒表达载体(例
如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统、用含有结合分子编码序列的重组病毒表达载体(例如
花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有结合分子编码序列的重组质
粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统、或者包括含有衍生自哺乳动物细胞基因
组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启
动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细
胞)。优选地，细菌细胞例如大肠杆菌，以及更优选地，特别是用来表达整个重组结合分子的真核细胞被用来表达重组结合分子。例如，与载体(例如来自人类细胞巨化病毒的主要立
即早期基因启动子元件)合并在一起的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体
和其它结合分子的有效表达系统(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology 8：2(1990))。
[0607] 用于蛋白表达的宿主细胞系通常具有哺乳动物来源；本领域技术人员具有优先地确定最适合于期望基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系
-
包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系、DHFR)、HELA(人宫
颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(含SV40 T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、
293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、
SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人
淋巴细胞)和293(人肾)。CHO细胞是特别优选的。宿主细胞系通常是可以从商业服务即
美国典型培养物保藏中心或者发表的文献获得。
-
包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系、DHFR)、HELA(人宫
颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(含SV40 T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、
293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、
SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人
淋巴细胞)和293(人肾)。CHO细胞是特别优选的。宿主细胞系通常是可以从商业服务即
美国典型培养物保藏中心或者发表的文献获得。
[0608] 此外，可以选择调节插入序列表达或以期望的特定形式来修饰并加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白的功能
可能是重要的。不同宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性的或特
定的机制。可以选择适合的细胞系或宿主系统来保证所表达的外来蛋白的正确修饰和加
工。为此目的，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞器的真核宿主细胞。
可能是重要的。不同宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性的或特
定的机制。可以选择适合的细胞系或宿主系统来保证所表达的外来蛋白的正确修饰和加
工。为此目的，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞器的真核宿主细胞。
[0609] 对于长期高产率的重组蛋白产生，稳定的表达是优选的。例如，稳定表达结合分子的细胞系可被人工改造。并非使用含有复制的病毒来源的表达载体，可将宿主细胞用DNA和可选的标志物转化，其中所述DNA是由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的。在引入外来DNA之后，可允许人工改造的细胞在
增菌培养基中生长1-2天，然后被转入选择培养基中。重组质粒中可选的标志物给予对选
择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体并生长以形成集中点，其反过来
又能被克隆并扩展进细胞系中。该方法可被有利地用来对稳定表达结合分子的细胞系进行
人工改造。
增菌培养基中生长1-2天，然后被转入选择培养基中。重组质粒中可选的标志物给予对选
择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体并生长以形成集中点，其反过来
又能被克隆并扩展进细胞系中。该方法可被有利地用来对稳定表达结合分子的细胞系进行
人工改造。
[0610] 可以使用若干选择系统，其包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell 22：
8171980)基因，其可被分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，抗代谢物抗性可被用
作选择下述基因的基础：dhfr，其带来对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.
USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其带来对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其带来对氨基葡糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy
3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；
Mulligan，Science260：926-932(1993)；和 Morgan 和 Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：
191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(1993年5月))；以及hygro，其带来对匀霉素的抗性(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。可以使用的重组DNA技术的领域中通常已知
的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(分
子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达的实验手册)，Stockton Press，
NY(1990)；和第12和13章，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human
Genetics(人类遗传学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)中，其通过引用以其整体被并入本文。
8171980)基因，其可被分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。而且，抗代谢物抗性可被用
作选择下述基因的基础：dhfr，其带来对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.
USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其带来对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其带来对氨基葡糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy
3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；
Mulligan，Science260：926-932(1993)；和 Morgan 和 Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：
191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(1993年5月))；以及hygro，其带来对匀霉素的抗性(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。可以使用的重组DNA技术的领域中通常已知
的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(分
子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达的实验手册)，Stockton Press，
NY(1990)；和第12和13章，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human
Genetics(人类遗传学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)中，其通过引用以其整体被并入本文。
[0611] 可通过载体扩增来增加结合分子的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel，THe use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning(在DNA克隆中使用基于基因扩增的载
体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因)，Academic Press，New York，第3卷.(1987))。当
表达结合分子的载体系统中的标志物是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水
平的增加将增加标志物基因的拷贝数。因为扩增的区域与结合分子相关，结合分子的产生
也将增加(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因)，Academic Press，New York，第3卷.(1987))。当
表达结合分子的载体系统中的标志物是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水
平的增加将增加标志物基因的拷贝数。因为扩增的区域与结合分子相关，结合分子的产生
也将增加(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
[0612] 体外生产允许规模扩大以便得到大量的期望多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的并且包括在例如气升式反应器中或在连续的搅拌反应器中
的均质悬浮培养，或者在例如空心纤维、微囊、琼脂糖玻璃细珠或陶瓷管壳中的固定化或捕获的细胞培养。如果必要和/或期望，可在例如合成的铰链区多肽的优先生物合成之后或
在本文所述HIC色谱步骤之前或之后使用常规色谱方法来纯化多肽的溶液，其中所述方法
例如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE-纤维素上的色谱或者(免疫)亲和色谱。
的均质悬浮培养，或者在例如空心纤维、微囊、琼脂糖玻璃细珠或陶瓷管壳中的固定化或捕获的细胞培养。如果必要和/或期望，可在例如合成的铰链区多肽的优先生物合成之后或
在本文所述HIC色谱步骤之前或之后使用常规色谱方法来纯化多肽的溶液，其中所述方法
例如凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE-纤维素上的色谱或者(免疫)亲和色谱。
[0613] 在某些实施方案中，本发明的结合分子当以商业规模产生时以高产率产生(如，在25L、50L、100L、1000L体积或更大体积的细胞培养或生物反应器中)。例如，本发明的结合分子可由宿主细胞产生，以使每升宿主细胞培养基产生至少5mg(如，至少10mg、20mg、
30mg、40mg、50mg、75mg、100mg、200mg、500mg、750mg、1g、1.5g、2g、2.5g或5g)的结合分子。
30mg、40mg、50mg、75mg、100mg、200mg、500mg、750mg、1g、1.5g、2g、2.5g或5g)的结合分子。
[0614] 优选地，本发明的结合分子不具有形成聚集体的倾向。聚集可由多种非限制性的生化和生物物理技术来测量。例如，本发明的组合物的聚集可使用色谱法评价，如，尺寸排阻色谱(SEC)。SEC基于分子大小来分离分子。柱填充有半固态的聚合凝胶珠，将允许离子
和小分子进入其内部，而大分子不能进入。当将蛋白组合物上样到柱顶端时，紧密折叠的蛋白(即，非聚集的蛋白)分布到比大的蛋白聚集体可获得的更大体积溶剂中。因而，大的聚
集体更快地移动通过柱，以这种方式，混合物可分离或分级分离为其组分。每种级分当其从凝胶洗脱时可单独地定量(如，通过光散射)。因此，通过比较级分的浓度与上样到凝胶的
蛋白总浓度，可确定本发明的组合物的聚集百分比。稳定组合物作为基本上单种级分从柱
洗脱，在洗脱曲线或色谱中表现为基本上单个峰。
和小分子进入其内部，而大分子不能进入。当将蛋白组合物上样到柱顶端时，紧密折叠的蛋白(即，非聚集的蛋白)分布到比大的蛋白聚集体可获得的更大体积溶剂中。因而，大的聚
集体更快地移动通过柱，以这种方式，混合物可分离或分级分离为其组分。每种级分当其从凝胶洗脱时可单独地定量(如，通过光散射)。因此，通过比较级分的浓度与上样到凝胶的
蛋白总浓度，可确定本发明的组合物的聚集百分比。稳定组合物作为基本上单种级分从柱
洗脱，在洗脱曲线或色谱中表现为基本上单个峰。
[0615] 在优选实施方案中，SEC联合在线的光散射(如，经典或动态光散射)使用以确定组合物的聚集百分比。在某些优选实施方案中，静态光散射用于测量每种级分或峰的质量，而不论分子形状或洗脱位置。在其它优选实施方案中，动态光散射用于测量组合物的流体
动力学大小。用于评价蛋白稳定性的其它示例性方法包括高速SEC(参见如，Corbett等人，Biochemistry.23(8)：1888-94，1984)。
动力学大小。用于评价蛋白稳定性的其它示例性方法包括高速SEC(参见如，Corbett等人，Biochemistry.23(8)：1888-94，1984)。
[0616] 编码本发明IGF-1R结合分子的基因还可被表达在非哺乳动物细胞例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中。容易地吸收核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌或沙
门氏菌(Salmonella)等品种；芽胞杆菌科的成员，例如枯草芽孢杆菌、肺炎球菌、链球菌和流感嗜血杆菌。还将理解的是，当表达在细菌中时，异源性多肽通常变为包涵体的一部分。
异源性多肽一定是被分离，纯化然后组装成功能性分子。当期望四价形式的结合分子时，亚基然后将自装配为四价结合分子(如四价抗体(WO02/096948A2))。
门氏菌(Salmonella)等品种；芽胞杆菌科的成员，例如枯草芽孢杆菌、肺炎球菌、链球菌和流感嗜血杆菌。还将理解的是，当表达在细菌中时，异源性多肽通常变为包涵体的一部分。
异源性多肽一定是被分离，纯化然后组装成功能性分子。当期望四价形式的结合分子时，亚基然后将自装配为四价结合分子(如四价抗体(WO02/096948A2))。
[0617] 在细菌系统中，取决于被表达的结合分子期望的用途，可以有利地选择若干表达载体。例如，当大量这种蛋白待产生时，为了产生结合分子的药物组合物，可以期待指导
融合蛋白产物高水平表达的载体，其中所述融合蛋白产物被容易地纯化。这种载体包括
但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，在其中抗体编
码序列可被单独地与lacZ编码区框内连接入载体以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye
& Inouye，Nucleic AcidsRes.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.
Chem.24：5503-5509(1989))；以及类似物。还可使用pGEX载体来表达作为与谷胱甘肽S转
移酶(GST)的融合蛋白的外来多肽。通常，这种融合蛋白是可溶的并且可容易地从溶解的
细胞来纯化，其中所述纯化是通过吸附和结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠并接着在游离谷胱
甘肽存在下洗脱。设计pGEX载体而包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以致于可从GST
部分释放克隆的靶基因产物。
融合蛋白产物高水平表达的载体，其中所述融合蛋白产物被容易地纯化。这种载体包括
但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，在其中抗体编
码序列可被单独地与lacZ编码区框内连接入载体以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye
& Inouye，Nucleic AcidsRes.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.
Chem.24：5503-5509(1989))；以及类似物。还可使用pGEX载体来表达作为与谷胱甘肽S转
移酶(GST)的融合蛋白的外来多肽。通常，这种融合蛋白是可溶的并且可容易地从溶解的
细胞来纯化，其中所述纯化是通过吸附和结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠并接着在游离谷胱
甘肽存在下洗脱。设计pGEX载体而包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以致于可从GST
部分释放克隆的靶基因产物。
[0619] 为了在酵母中表达，常用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature 282：39(1979)；Kingsman等人，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene 10：157(1980))。该质粒已经含有TRP1基因，所述TRP1基因给缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如
ATCC第44076或PEP4-1号提供选择标志物(Jones，Genetics 85(1)：23-33(1977))。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特性的trp1损伤的存在提供有效的环境以通过在不含色氨酸
条件下生长来检测转化。
ATCC第44076或PEP4-1号提供选择标志物(Jones，Genetics 85(1)：23-33(1977))。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特性的trp1损伤的存在提供有效的环境以通过在不含色氨酸
条件下生长来检测转化。
[0620] 在昆虫系统中，夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)通常被用作载体来表达外来基因。该病毒生长在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。编
码抗体的序列可被单独克隆进病毒的非必须区域(例如多角体蛋白基因)并被置于AcNPV
启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
码抗体的序列可被单独克隆进病毒的非必须区域(例如多角体蛋白基因)并被置于AcNPV
启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
[0621] 重组地表达本发明的结合分子后，可通过本领域任何已知的纯化结合分子的方法来将它纯化，其中所述方法例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱，特别是对蛋
白A后的特定抗原的亲和性色谱以及分筛柱色谱)、离心、差异溶解或蛋白纯化的任何其它
标准技术。可选地，增加本发明结合分子(如抗体)亲和性的优选的方法公开在US 2002
0123057 A1。
白A后的特定抗原的亲和性色谱以及分筛柱色谱)、离心、差异溶解或蛋白纯化的任何其它
标准技术。可选地，增加本发明结合分子(如抗体)亲和性的优选的方法公开在US 2002
0123057 A1。
[0622] VIII.使用包含结合IGF-1R不同表位的结合分子的组合物的方法
[0623] 本发明的结合分子减少或抑制细胞，如，表达IGF-1R的肿瘤细胞中IGF-1R-介导的对细胞的作用，诸如增殖。在另一实施方案中，本发明的结合分子抑制细胞，如，表达IGF-1R的肿瘤细胞中IGF-1R-介导的信号传导。对IGF-1R-介导的信号传导的抑制可通过
确定一种或多种信号传导途径的激活或通过确定更下游的激活量度诸如细胞增殖来测量。
这样的测量可使用本领域已知或本文所述如实施例中所述的标准方法进行。
确定一种或多种信号传导途径的激活或通过确定更下游的激活量度诸如细胞增殖来测量。
这样的测量可使用本领域已知或本文所述如实施例中所述的标准方法进行。
[0624] 例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子减少或抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化、AKT或MAPK磷酸化、AKT介导的存活信号传导。在另一实施方案中，本发明
的结合分子抑制肿瘤细胞的如体外或体内生长。在另一个实施方案中，本发明的结合分子
诱导IGF-1R内化。在一个实施方案中，本发明的结合分子比分子中存在的单独结合部分之
一(如，比包含该结合特异性的单克隆抗体)或比包含(i)包含所述第一结合部分的第一
单特异性结合分子和(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子的组合在更大程度
上抑制IGF-1R-介导的细胞激活的参数。
的结合分子抑制肿瘤细胞的如体外或体内生长。在另一个实施方案中，本发明的结合分子
诱导IGF-1R内化。在一个实施方案中，本发明的结合分子比分子中存在的单独结合部分之
一(如，比包含该结合特异性的单克隆抗体)或比包含(i)包含所述第一结合部分的第一
单特异性结合分子和(ii)包含所述第二部分的第二单特异性结合分子的组合在更大程度
上抑制IGF-1R-介导的细胞激活的参数。
[0625] 本发明的一个实施方案提供治疗动物的过度增殖性疾病或病症例如癌症、恶性肿瘤、肿瘤或其转移(如，减慢其进程，缓解其至少一种症状，减少其扩散)的方法，其中所述动物正遭受这种疾病或易患这种疾病，所述方法包括、基本上由或者由对动物施用有效量
的本文所述的本发明的结合分子或组合物组成。
的本文所述的本发明的结合分子或组合物组成。
[0626] 待用于本文公开的治疗方法的特异性地结合至IGF-1R或其变体的本发明的结合分子可被制备并用作治疗剂，其终止、减少、阻止或抑制牵涉在细胞过度增殖中的细胞活
动，例如诱导通常与过度增殖性疾病或病症相关的改变的或异常的类型的血管化的细胞活
动。
动，例如诱导通常与过度增殖性疾病或病症相关的改变的或异常的类型的血管化的细胞活
动。
[0627] 根据本发明的结合分子可以以未标记的或未轭合的形式被使用，或者可被轭合或连接至细胞毒性部分例如放射性标记和生化细胞毒素以产生发挥治疗作用的剂。
[0628] 本发明提供治疗哺乳动物的各种过度增殖性病症的方法，例如通过抑制肿瘤生长，其包括、基本上由或者由对哺乳动物施用有效量的特异性地或优先地结合至IGF-1R例
如人类IGF-1R的结合分子组成。
如人类IGF-1R的结合分子组成。
[0629] 本发明更特别地涉及治疗动物例如哺乳动物例如人类的过度增殖性疾病的方法，例如抑制或阻止肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤侵入和/或转移形成，其包括、基本上由或者由向对其有需要的动物施用有效量的本发明的结合分子组成。
[0630] 在其它实施方案中，本发明包括治疗动物例如人类患者的过度增殖性疾病的方法，例如抑制或减少肿瘤形成、肿瘤生长(如，细胞增殖)、肿瘤侵入和/或转移形成，其中所述方法包括对需要这种治疗的动物施用有效量的组合物，所述组合物除了药学上可接受的
载体之外，包括、基本上由或者由本发明的结合分子(如，本发明的多特异性结合分子)或
结合分子的组合(如，结合不同IGF-1R表位的两种或更多种单特异性结合分子)组成。
载体之外，包括、基本上由或者由本发明的结合分子(如，本发明的多特异性结合分子)或
结合分子的组合(如，结合不同IGF-1R表位的两种或更多种单特异性结合分子)组成。
[0631] 在其它实施方案中，本发明包括治疗动物例如人类患者的过度增殖性疾病的方法，例如抑制肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤侵入和/或转移形成，其中所述方法包括对需要这种治疗的动物施用有效量的组合物，所述组合物除了药学上可接受的载体之外，包括、基本上由或者由本发明的结合分子(如，本发明的多特异性结合分子)或结合分子的组合(如，
结合不同IGF-1R表位的两种或更多种单特异性结合分子)以及修饰结合分子的另外部分
所组成，例如碳水化合物部分可被包括以致结合分子以高于未修饰型蛋白的亲和力与修饰
的靶蛋白相结合。可选择地，结合分子根本不结合未修饰型的靶蛋白。
结合不同IGF-1R表位的两种或更多种单特异性结合分子)以及修饰结合分子的另外部分
所组成，例如碳水化合物部分可被包括以致结合分子以高于未修饰型蛋白的亲和力与修饰
的靶蛋白相结合。可选择地，结合分子根本不结合未修饰型的靶蛋白。
[0632] 更特别地，本发明提供治疗人类癌症的方法，包括对需要治疗的人施用一种组合物，所述组合物包括有效量的本发明IGF-1R-特异性结合分子(如，本发明的多特异性结合
分子)或结合分子的组合(如，结合不同IGF-1R表位的两种或更多种单特异性结合分子)，
以及药学上可接受的载体。待治疗的癌症类型包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
分子)或结合分子的组合(如，结合不同IGF-1R表位的两种或更多种单特异性结合分子)，
以及药学上可接受的载体。待治疗的癌症类型包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
[0633] IX.使用IGF-1R特异性结合分子和核酸扩增测定的诊断或预后方法
[0634] 本发明的IGF-1R特异性结合分子或组合物可被用于诊断目的以检测、诊断或监测与IGF-1R的异常的表达和/或活性相关的疾病、病症和/或状况。IGF-1R表达在肿瘤组
织和其它赘生状况中增加。
织和其它赘生状况中增加。
[0635] IGF-1R特异性结合分子对于哺乳动物优选地为人类中过度增殖性病症的诊断、治疗、预防和/或预后是有用的。这种病症包括但不限于癌症、赘生物、肿瘤和/或如本文下
面其它地方所述的特别是IGF-1R相关的癌症例如胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
面其它地方所述的特别是IGF-1R相关的癌症例如胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
[0636] 例如，如本文所公开，IGF-1R表达至少与胃、肾、脑、膀胱、结肠、肺、乳腺、胰腺、卵巢和前列腺肿瘤组织相关。因此，本发明的结合分子可被用来检测表达升高水平的IGF-1R的特定组织。这些诊断测定可以在体内或在体外例如在血液样品、活检组织或尸检组织上
进行。
进行。
[0637] 因此，本发明提供在诊断癌症和其它过度增殖性病症过程中有用的诊断方法，其包括测量来自个体的组织或其它细胞或体液中的IGF-1R蛋白或转录物的表达水平，以及
将所测量的表达水平与正常组织或体液中标准的IGF-1R表达水平进行比较，由此，表达水
平与标准相比的增加表明了病症。
将所测量的表达水平与正常组织或体液中标准的IGF-1R表达水平进行比较，由此，表达水
平与标准相比的增加表明了病症。
[0638] 一个实施方案提供了检测异常过度增殖细胞例如液体或组织样品中异常过度增殖细胞例如癌症前期或癌细胞的存在的方法，其包括测定个体的组织或体液样品中IGF-1R
的表达，以及将样品中IGF-1R表达的存在或水平与一组标准组织或体液样品中IGF-1R表
达的存在或水平进行比较，其中IGF-1R表达的检测或者IGF-1R表达与标准相比的增加表
明了异常的过度增殖细胞生长。
的表达，以及将样品中IGF-1R表达的存在或水平与一组标准组织或体液样品中IGF-1R表
达的存在或水平进行比较，其中IGF-1R表达的检测或者IGF-1R表达与标准相比的增加表
明了异常的过度增殖细胞生长。
[0639] 更特别地，本发明提供检测体液或组织样品中异常的过度增殖细胞存在的方法，其包括(a)使用本发明的IGF-1R特异性结合分子来测定个体的组织或体液样品中IGF-1R
的表达，以及(b)将样品中IGF-1R表达的存在或水平与一组标准组织或体液样品中IGF-1R
表达的存在或水平进行比较，由此，IGF-1R表达的检测或者IGF-1R表达与标准相比的增加
表明了异常的过度增殖细胞生长。
的表达，以及(b)将样品中IGF-1R表达的存在或水平与一组标准组织或体液样品中IGF-1R
表达的存在或水平进行比较，由此，IGF-1R表达的检测或者IGF-1R表达与标准相比的增加
表明了异常的过度增殖细胞生长。
[0640] 关于癌症，来自个体的活检组织中相对高含量的IGF-1R蛋白的存在可表明肿瘤或其它恶性生长的存在，可表明这种恶性肿瘤或肿瘤的发展的素因，或者可提供在实际的
临床症状显现之前检测疾病的方法。此类型的更确定的诊断可允许健康专业人士更早地使
用预防措施或大胆治疗，从而预防癌症的发展或进一步进展。
临床症状显现之前检测疾病的方法。此类型的更确定的诊断可允许健康专业人士更早地使
用预防措施或大胆治疗，从而预防癌症的发展或进一步进展。
[0641] 本发明的IGF-1R特异性结合分子可被用来测定生物样品中的蛋白水平，其使用本领域技术人员已知的经典的免疫组织化学方法(例如，参见Jalkanen等人，J.Cell.
Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。对于检测蛋白表达有用的其它基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和
放射免疫测定(RIA)。适合的抗体测定标记物是本领域已知的，并且包括酶标记物，例如
125 121 14 35 3 112
葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘( I、I)、碳( C)、硫( S)、氚(H)、铟( In)和锝
99
( Tc)；发光标记物，例如鲁米诺；以及荧光标记物，例如荧光素和若丹明，和生物素。适合的测定在本文其它地方更详细地描述。
Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。对于检测蛋白表达有用的其它基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和
放射免疫测定(RIA)。适合的抗体测定标记物是本领域已知的，并且包括酶标记物，例如
125 121 14 35 3 112
葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘( I、I)、碳( C)、硫( S)、氚(H)、铟( In)和锝
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( Tc)；发光标记物，例如鲁米诺；以及荧光标记物，例如荧光素和若丹明，和生物素。适合的测定在本文其它地方更详细地描述。
[0642] 本发明的一个方面是体内检测或诊断过度增殖疾病或病症的方法，其中所述过度增殖性疾病或病症是与动物，优选地为哺乳动物，以及最优选地为人类的IGF-1R的异常表
达相关的。在一个实施方案中，诊断包括：a)对受治疗者施用(例如，在肠胃外、皮下或腹膜内)有效量的特异性结合至IGF-1R的本发明的标记的结合分子；b)施用后等待一段时
间间隔以允许标记的结合分子优先地集中在受治疗者中IGF-1R被表达的位点(而且未结
合的标记的分子被清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测受治疗者体内标记的分
子，以至于背景水平以上的标记的分子的检测表明受治疗者具有与IGF-1R异常表达相关
的特定疾病或病症。可通过各种方法来确定背景水平，其包括将所检测的标记的分子的量
与之前在特定系统中确定的标准值进行比较。
达相关的。在一个实施方案中，诊断包括：a)对受治疗者施用(例如，在肠胃外、皮下或腹膜内)有效量的特异性结合至IGF-1R的本发明的标记的结合分子；b)施用后等待一段时
间间隔以允许标记的结合分子优先地集中在受治疗者中IGF-1R被表达的位点(而且未结
合的标记的分子被清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测受治疗者体内标记的分
子，以至于背景水平以上的标记的分子的检测表明受治疗者具有与IGF-1R异常表达相关
的特定疾病或病症。可通过各种方法来确定背景水平，其包括将所检测的标记的分子的量
与之前在特定系统中确定的标准值进行比较。
[0643] 本领域中将被理解的是，受治疗者的尺寸和所用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受治疗者，所注入的放射性
99
的量将通常在从约5至20毫居里范围内的例如 Tc。然后，标记的结合分子例如抗体或抗体
片段将优先地聚集在细胞中含有特定蛋白的位置处。体内肿瘤成像被描述在S.W.Burchiel
等人，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments(放射标记的抗体和其片段的免疫药代动力学)”，第13章，Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：癌症的放射化学检测)，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编
辑，Masson Publishing Inc.(1982)。
99
的量将通常在从约5至20毫居里范围内的例如 Tc。然后，标记的结合分子例如抗体或抗体
片段将优先地聚集在细胞中含有特定蛋白的位置处。体内肿瘤成像被描述在S.W.Burchiel
等人，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments(放射标记的抗体和其片段的免疫药代动力学)”，第13章，Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：癌症的放射化学检测)，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编
辑，Masson Publishing Inc.(1982)。
[0644] 取决于若干可变的因素，包括所用的标记物类型和施用的模式，允许标记的分子优先地集中在受治疗者中位点以及使未结合的标记的分子被清除至背景水平的施用后时
间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间
间隔是5至20天或7至10天。
间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间
间隔是5至20天或7至10天。
[0645] 可以使用本领域已知的用于体内扫描的方法来检测患者体内标记的结合分子的存在。这些方法取决于所用的标记物的类型。技术人员将能够确定检测特殊标记物的适合
方法。可被用于本发明的诊断方法的方法和装置包括但不限于计算机断层成像(CT)，全身
扫描例如正电子发射断层成像(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波成像。
方法。可被用于本发明的诊断方法的方法和装置包括但不限于计算机断层成像(CT)，全身
扫描例如正电子发射断层成像(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波成像。
[0646] 在特定的实施方案中，用放射性同位素标记结合分子，并且用辐射响应外科仪器在患者中检测(Thurston等人，美国专利第5,441,050号)。在另一个实施方案中，用荧光
化合物标记结合分子，并且用荧光响应扫描仪器在患者中检测。在另一个实施方案中，用发射正电子的金属标记结合分子，并且用正电子发射断层成像在患者中检测。在另一个实施
方案中，用顺磁标记物来标记结合分子，并且用磁共振成像(MRI)在患者中检测。
化合物标记结合分子，并且用荧光响应扫描仪器在患者中检测。在另一个实施方案中，用发射正电子的金属标记结合分子，并且用正电子发射断层成像在患者中检测。在另一个实施
方案中，用顺磁标记物来标记结合分子，并且用磁共振成像(MRI)在患者中检测。
[0647] 用于IGF-1R表达的体内成像的抗体标记物或标志物包括通过X-放射显影、核磁共振成像(NMR)、MRI、CAT扫描或电子自旋共振成像(ESR)可检测的那些。对于X-放射显
影，适合的标记物包括放射性同位素例如钡或铯，其发射可检测的辐射但不过度有害于受
治疗者。对于NMR和ESR，适合的标志物包括具有可检测的特征性自旋的那些，例如氘，其可通过对相关杂交瘤的营养物进行标记而被并入抗体。当为了在人体中诊断而使用体内成像
来检测增高水平的IGF-1R表达时，可以优选地使用如本文其它地方所述的人类抗体或“人
源化的”嵌合单克隆抗体。
影，适合的标记物包括放射性同位素例如钡或铯，其发射可检测的辐射但不过度有害于受
治疗者。对于NMR和ESR，适合的标志物包括具有可检测的特征性自旋的那些，例如氘，其可通过对相关杂交瘤的营养物进行标记而被并入抗体。当为了在人体中诊断而使用体内成像
来检测增高水平的IGF-1R表达时，可以优选地使用如本文其它地方所述的人类抗体或“人
源化的”嵌合单克隆抗体。
[0648] 在与上述的那些相关的实施方案中，通过重复任一个诊断疾病或病症的方法来对已经诊断的疾病或病症进行监测，其中所述重复是在例如最初诊断之后一个月、最初诊断
之后六个月、最初诊断之后一年、等等。
之后六个月、最初诊断之后一年、等等。
[0649] 在已经根据传统方法进行了病症的诊断包括肿瘤的诊断的情况下，本文公开的检测方法作为预后的指示器是有用的，由此，继续展现增强的IGF-1R表达的患者将经历与表
达水平降低到更接近标准水平的患者相比更糟的临床后果。
达水平降低到更接近标准水平的患者相比更糟的临床后果。
[0650] “测定肿瘤相关的IGF-1R多肽的表达水平”是指定性地或定量地、直接地(例如通过确定或估计绝对蛋白水平)或相对地(例如通过比较第二生物样品中癌症相关的多肽水平)测量或估计第一生物样品中IGF-1R多肽的水平。优选地，测量或估计第一生物样品中
IGF-1R多肽的表达水平，并将其与标准IGF-1R多肽水平比较，所述标准是从第二生物样品
取得的，其中所述第二生物样品是从不具有该病症的个体或通过将来自不具有该病症的个
体的群体中的水平进行平均而被确定的个体中获得的。本领域将会理解，一旦知道了“标
准”IGF-1R多肽水平，它可被反复地用作比较的标准。
IGF-1R多肽的表达水平，并将其与标准IGF-1R多肽水平比较，所述标准是从第二生物样品
取得的，其中所述第二生物样品是从不具有该病症的个体或通过将来自不具有该病症的个
体的群体中的水平进行平均而被确定的个体中获得的。本领域将会理解，一旦知道了“标
准”IGF-1R多肽水平，它可被反复地用作比较的标准。
[0651] “生物样品”是指从潜在表达IGF-1R的个体、细胞系、组织培养或其它细胞来源获得的任何生物样品。如所指出，生物样品包括体液(例如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)和含有潜在表达IGF-1R的细胞的其它组织来源。获得哺乳动物的活检组织和体液的方法是本领域熟知的。
[0652] 在另外的实施方案中，本发明的结合分子可被用来定量地或定性地检测IGF-1R基因产物或者其保守的变体或肽片段的存在。这可通过例如免疫荧光技术来完成，其利用
与光学显微的、流式细胞计量的或荧光的检测相偶联的荧光标记的结合分子。
与光学显微的、流式细胞计量的或荧光的检测相偶联的荧光标记的结合分子。
[0653] 可使用上述方法诊断和/或预后的癌症包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
[0654] X.免疫测定
[0655] 可以通过本领域任何已知方法来测定本文公开的IGF-1R特异性结合分子。可以使用的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用技术例如Western印
迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，仅举几个例子。这种测定是本领域中常规的和熟知的(参见例
如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验
方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)，其通过引用以其整体并入本文)。示例性的免疫测定简短地描述如下(但不意在进行限制)。
迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，仅举几个例子。这种测定是本领域中常规的和熟知的(参见例
如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验
方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)，其通过引用以其整体并入本文)。示例性的免疫测定简短地描述如下(但不意在进行限制)。
[0656] 免疫沉定方案一般包括将细胞群体在裂解缓冲液例如补充有蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑酞酶、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton
X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％Trasylol)中裂解，将感兴趣的结合分子加入细胞裂解产物，在4℃孵育一段时间(例如1-4小时)，将蛋白
A和/或蛋白G琼脂糖珠加入细胞裂解产物，在4℃孵育约1小时或更长，在裂解缓冲液中冲
洗珠子并且将珠子重新悬浮在SDS/样品缓冲液中。可通过例如Western印迹分析来评估感
兴趣的结合分子将特定抗原免疫沉淀的能力。本领域技术人员将知道可被修改以增加结合
分子对抗原结合以及减少背景(例如用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解产物)的参数。关于免
疫沉淀方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节10.16.1。
X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％Trasylol)中裂解，将感兴趣的结合分子加入细胞裂解产物，在4℃孵育一段时间(例如1-4小时)，将蛋白
A和/或蛋白G琼脂糖珠加入细胞裂解产物，在4℃孵育约1小时或更长，在裂解缓冲液中冲
洗珠子并且将珠子重新悬浮在SDS/样品缓冲液中。可通过例如Western印迹分析来评估感
兴趣的结合分子将特定抗原免疫沉淀的能力。本领域技术人员将知道可被修改以增加结合
分子对抗原结合以及减少背景(例如用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解产物)的参数。关于免
疫沉淀方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节10.16.1。
[0657] Western印迹分析通常包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中进行蛋白样品的电泳，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶
转移至膜例如硝化纤维素、PVDF或尼龙上，在阻断溶液(例如含有3％BSA或脱脂奶的PBS)
中阻断所述膜，在冲洗缓冲液(例如PBS-吐温20)中冲洗所述膜，用在阻断缓冲液中稀释
的第一结合分子(感兴趣的结合分子)阻断所述膜，在冲洗缓冲液中冲洗所述膜，用在阻断
缓冲液中稀释的轭合至酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如
32p或1251)的第二结合分子(其识别一抗，例如抗人抗体)阻断所述膜，在冲洗缓冲液中
冲洗所述膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员将知道可被修改以增加被检测的信号
并减少背景噪声的参数。关于Western印迹方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编
辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节10.8.1。
转移至膜例如硝化纤维素、PVDF或尼龙上，在阻断溶液(例如含有3％BSA或脱脂奶的PBS)
中阻断所述膜，在冲洗缓冲液(例如PBS-吐温20)中冲洗所述膜，用在阻断缓冲液中稀释
的第一结合分子(感兴趣的结合分子)阻断所述膜，在冲洗缓冲液中冲洗所述膜，用在阻断
缓冲液中稀释的轭合至酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如
32p或1251)的第二结合分子(其识别一抗，例如抗人抗体)阻断所述膜，在冲洗缓冲液中
冲洗所述膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员将知道可被修改以增加被检测的信号
并减少背景噪声的参数。关于Western印迹方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编
辑，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第1卷(1994)章节10.8.1。
[0658] ELISA包括制备抗原，用所述抗原涂布96孔微量滴定板的孔，将轭合至可检测的化合物例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣的结合分子加入孔中并
孵育一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的结合分子不必轭合至可检测
的化合物；相反，可将轭合至可检测的化合物的第二抗体(其识别感兴趣的结合分子)加
入孔中。进一步地，可将结合分子涂布孔，而不是用抗原来涂布孔。在这种情况下，在将感兴趣的抗原加入被涂布的孔中之后，可加入轭合至可检测的化合物的第二结合分子。本领
域技术人员将知道可被修改以增加被检测的信号的参数，以及本领域已知的其它ELISA变
化形式。关于ELISA的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in
Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第
1卷(1994)章节11.2.1。
孵育一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的结合分子不必轭合至可检测
的化合物；相反，可将轭合至可检测的化合物的第二抗体(其识别感兴趣的结合分子)加
入孔中。进一步地，可将结合分子涂布孔，而不是用抗原来涂布孔。在这种情况下，在将感兴趣的抗原加入被涂布的孔中之后，可加入轭合至可检测的化合物的第二结合分子。本领
域技术人员将知道可被修改以增加被检测的信号的参数，以及本领域已知的其它ELISA变
化形式。关于ELISA的进一步讨论，参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in
Molecular Biology(分子生物学最新实验方案)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第
1卷(1994)章节11.2.1。
[0659] 可通过竞争性结合测定来确定结合分子对抗原的结合亲和力以及结合分子-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合测定的一个例子是放射免疫测定，其包括用感兴趣的
3 125
结合分子在增加量的未标记抗原的存在下孵育被标记的抗原(例如 H或 I)，以及检测结
合至被标记的抗原的结合分子。可以从Scatchard图形分析的数据来确定感兴趣的结合分
子对特定抗原的亲和力以及结合的解离速率。可使用放射免疫测定来确定与第二结合分子
的竞争。在这种情况下，在增加量的未标记的第二结合分子的存在下，将抗原与轭合至被标
3 125
记的化合物(例如 H或 I)的感兴趣的抗体孵育。
3 125
结合分子在增加量的未标记抗原的存在下孵育被标记的抗原(例如 H或 I)，以及检测结
合至被标记的抗原的结合分子。可以从Scatchard图形分析的数据来确定感兴趣的结合分
子对特定抗原的亲和力以及结合的解离速率。可使用放射免疫测定来确定与第二结合分子
的竞争。在这种情况下，在增加量的未标记的第二结合分子的存在下，将抗原与轭合至被标
3 125
记的化合物(例如 H或 I)的感兴趣的抗体孵育。
[0660] IGF-1R特异性结合分子可被另外地用于组织学，如在免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫测定中，以原位检测癌症抗原基因产物或者其保守的变体或肽片段。可通过从患
者取出组织学标本并对其应用标记的IGF-1R特异性结合分子来完成原位检测，其中所述
应用优选地是通过将被标记的抗体(或片段)覆盖在生物样品上。通过使用这种程序，不
仅能够确定IGF-1R蛋白或者保守的变体或肽片段的存在，而且还能确定它在被检验的组
织中的分布。使用本发明，普通技术人员将容易理解，可以修改许多组织学方法(例如染色程序)中的任一种以便实现这种原位检测。
者取出组织学标本并对其应用标记的IGF-1R特异性结合分子来完成原位检测，其中所述
应用优选地是通过将被标记的抗体(或片段)覆盖在生物样品上。通过使用这种程序，不
仅能够确定IGF-1R蛋白或者保守的变体或肽片段的存在，而且还能确定它在被检验的组
织中的分布。使用本发明，普通技术人员将容易理解，可以修改许多组织学方法(例如染色程序)中的任一种以便实现这种原位检测。
[0661] IGF-1R基因产物或者其保守的变体或肽片段的免疫测定和非免疫测定通常将包括在能够结合至IGF-1R或者其保守的变体或肽片段的可检测地标记的结合分子的存在下
孵育已经在细胞培养物中孵育的样品例如生物液、组织提取物、新鲜地收集的细胞或细胞
溶解产物，以及通过本领域熟知的若干技术中的任一种来检测结合的结合分子。
孵育已经在细胞培养物中孵育的样品例如生物液、组织提取物、新鲜地收集的细胞或细胞
溶解产物，以及通过本领域熟知的若干技术中的任一种来检测结合的结合分子。
[0662] 可将生物样品与固相支持体或载体例如硝化纤维素或者能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的其它固相支持体接触并固定于其上。然后可用适合的缓冲液冲洗所述支持
体，之后用可检测地标记的IGF-1R特异性结合分子进行治疗。然后可用缓冲液再一次冲洗
所述固相支持体以除去未结合的抗体。任选地，接下来将结合分子进行标记。然后可用传
统方法来检测固相支持体上的结合的标记物的量。
体，之后用可检测地标记的IGF-1R特异性结合分子进行治疗。然后可用缓冲液再一次冲洗
所述固相支持体以除去未结合的抗体。任选地，接下来将结合分子进行标记。然后可用传
统方法来检测固相支持体上的结合的标记物的量。
[0663] “固相支持体或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持体。熟知的支持体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿石。载体的性质可以是在某种程度上可溶的或对于本发明的目的来说是不可溶的。支持体材料实际上可具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够
结合至抗原或抗体。因此，支持体的构型可以是如珠子般的球形的，或者如试管的内表面或杆子的外表面一样的圆柱状的。可选地，表面可以是如纸张、测试条等一样的平的。优选的支持体包括聚苯乙烯珠子。本领域技术人员将知道或能够通过使用常规实验确定用来结合
抗体或抗原的许多其他适合的载体。
结合至抗原或抗体。因此，支持体的构型可以是如珠子般的球形的，或者如试管的内表面或杆子的外表面一样的圆柱状的。可选地，表面可以是如纸张、测试条等一样的平的。优选的支持体包括聚苯乙烯珠子。本领域技术人员将知道或能够通过使用常规实验确定用来结合
抗体或抗原的许多其他适合的载体。
[0664] 可根据熟知的方法来确定给定批次的IGF-1R特异性结合分子的结合活性。本领域技术人员通过使用常规的实验方法将能够针对每次测定来确定可操作的和最佳的测定
条件。
条件。
[0665] 有许多方法能够用来测量结合分子-抗原相互作用的亲和力，但确定速率常数的方法相对较少。大多数方法依赖于对结合分子或抗原进行标记，其不可避免地使常规测量
变得复杂，并且给被测量的量带来不确定性。
变得复杂，并且给被测量的量带来不确定性。
[0666] 在BIAcore上进行的表面等离子体共振(SPR)提供优于测量抗体-抗原相互作用亲和力的传统方法的许多优点：(i)不需要标记抗体或抗原；(ii)不需要提前纯化抗体，并可直接使用细胞培养物上清液；(iii)允许快速地对不同单克隆抗体相互作用进行半定量
对比的实时测量被变得可能，而且足以用于许多评估目的；(iv)可再生双特异性表面以便
在相同条件下容易地对比一系列不同的单克隆抗体；(v)分析程序完全是自动化的，并且
不需要使用者介入就能进行广泛系列的测量。BIAapplications手册，第AB版(1998年重
印)，BIACORE序号BR-1001-86；BIAtechnology手册，第AB版(1998年重印)，BIACORE序
号BR-1001-84。
对比的实时测量被变得可能，而且足以用于许多评估目的；(iv)可再生双特异性表面以便
在相同条件下容易地对比一系列不同的单克隆抗体；(v)分析程序完全是自动化的，并且
不需要使用者介入就能进行广泛系列的测量。BIAapplications手册，第AB版(1998年重
印)，BIACORE序号BR-1001-86；BIAtechnology手册，第AB版(1998年重印)，BIACORE序
号BR-1001-84。
[0667] 基于SPR的结合研究需要结合对的一个成员被固定在感应器表面上。被固定的结合配偶体被称作配体。溶液中的结合配偶体被称作分析物。在一些情况下，通过结合至另
一个固定的分子而将配体间接地结合至表面上，其中所述固定的分子被称作捕获分子。SPR响应反映了在分析物结合或解离时检测器表面上的质量浓度的变化。
一个固定的分子而将配体间接地结合至表面上，其中所述固定的分子被称作捕获分子。SPR响应反映了在分析物结合或解离时检测器表面上的质量浓度的变化。
[0668] 根据SPR，实时BIAcore测量在它们发生时直接监测相互作用。此技术十分适合于动力学参数的确定。进行对比亲和力的排序是极简单的，而且动力学和亲和力常数二者都
可衍生自感应图数据。
可衍生自感应图数据。
[0669] 当在穿过配体表面的离散脉冲中注入分析物时，所得的感应图可被分成三个基本阶段：(i)在注射样品的过程中将分析物与配体缔合；(ii)在注射样品的过程中的平衡或
稳态，其中分析物结合的速率通过从复合物解离而被平衡；(iii)在缓冲液流动过程中将
分析物从表面上解离。
稳态，其中分析物结合的速率通过从复合物解离而被平衡；(iii)在缓冲液流动过程中将
分析物从表面上解离。
[0670] 缔合和解离阶段提供关于分析物-配体相互作用的动力学信息(ka和kd，复合物形成和解离的速率，kd/ka＝KD)。平衡阶段提供关于分析物-配体相互作用的亲和力信息
(KD)。
(KD)。
[0671] BIAevaluation软件提供使用数值积分和全局拟合算法二者进行曲线拟合的广泛的便利。通过数据的适当分析，可从简单的BIAcore研究中获得相互作用的单独速率和亲
和力常数。该技术可测量的亲和力的范围是非常宽的，其从mM至pM变动。
和力常数。该技术可测量的亲和力的范围是非常宽的，其从mM至pM变动。
[0672] 表位特异性是结合分子的重要特性。与使用放射免疫测定、ELISA或其它表面吸附方法的传统技术相反，使用BIAcore的表位定位不需要标记或纯化结合分子，而且允许
使用一系列的一些结合分子来进行多位点特异性测试。另外，大量的分析可被自动处理。
使用一系列的一些结合分子来进行多位点特异性测试。另外，大量的分析可被自动处理。
[0673] 配对的结合实验测试两个结合分子同时结合至同一个抗原的能力。针对不同表位的结合分子将独立地结合，而针对相同的或密切相关的表位的MAb将干扰彼此的结合。可
以直接进行使用BIAcore的这些结合实验。
以直接进行使用BIAcore的这些结合实验。
[0674] 例如，人们可使用捕获分子来结合第一结合分子，然后相继加入抗原和第二结合分子。感应图将揭示：1.有多少抗原结合至第一结合分子，2.第二结合分子以什么程度结
合至连接在表面的抗原，3.如果第二结合分子不结合，配对测试的顺序的颠倒是否改变结
果。
合至连接在表面的抗原，3.如果第二结合分子不结合，配对测试的顺序的颠倒是否改变结
果。
[0675] 肽抑制是用于表位定位的另一种技术。此方法可为配对的抗体结合研究进行补充，并且在知道抗原的一级序列的时候能将功能性表位与结构特征相联系。测试了肽或抗
原片段对于不同结合分子与固定的抗原之间结合的抑制。据假设，干扰给定结合分子的结
合的肽与该结合分子所确定的表位在结构上相关。
原片段对于不同结合分子与固定的抗原之间结合的抑制。据假设，干扰给定结合分子的结
合的肽与该结合分子所确定的表位在结构上相关。
[0676] XI.药物组合物和施用方法
[0677] 制备和向对其有需要的受治疗者施用IGF-1R特异性结合分子的方法是本领域技术人员熟知的或容易确定的。结合分子的施用途径可以是例如口服的、肠胃外的、吸入的或局部的。本文所用术语肠胃外的包括例如静脉内的、动脉内的、腹膜内的、肌肉内的、皮下的、直肠的或阴道的施用。虽然所有这些形式的施用都被清楚地视为在本发明的范围内，一种施用形式是用于注射、特别是静脉内的或动脉内的注射或点滴的溶液。通常，用于注射
的适合的药物组合物可包括缓冲液(例如醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，表面活性剂
(例如聚山梨醇酯)，任选地稳定剂(例如人类白蛋白)等。然而，在与本文的教导相适应
的其它方法中，结合分子可被直接输送到有害的细胞群体的位置处，从而增加疾病组织对
治疗剂的暴露。
的适合的药物组合物可包括缓冲液(例如醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，表面活性剂
(例如聚山梨醇酯)，任选地稳定剂(例如人类白蛋白)等。然而，在与本文的教导相适应
的其它方法中，结合分子可被直接输送到有害的细胞群体的位置处，从而增加疾病组织对
治疗剂的暴露。
[0678] 肠胃外施用的制剂包括无菌的水或非水溶液、悬浮液和乳状液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，其包括盐水和缓冲的介质。在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M以及优选地0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的盐水。其它常
见的肠胃外载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏葡萄糖的那些，以及类似物。还可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体以及类似物。
见的肠胃外载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏葡萄糖的那些，以及类似物。还可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体以及类似物。
[0679] 更特别地，适合于注射用途的药物组合物包括无菌的水溶液(当可溶于水时)或分散体，以及用于无菌的注射溶液或分散体的临时制剂的无菌粉末。在这种情况下，所述组合物必须是无菌的并且应该是流体的以达到容易注射的程度。它在制造和储存条件下应该
是稳定的，并且其保藏将优选地防止微生物例如细菌和真菌的污染活动。载体可以是溶剂
或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物)及其适合的混合物。可例如通过使用例如卵磷脂的涂布，通过在分散的情况下维持所需要
的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。用于本文公开的治疗方法的适合的
制剂被描述在Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药学)，Mack Publishing
Co.，第16版(1980)中。
是稳定的，并且其保藏将优选地防止微生物例如细菌和真菌的污染活动。载体可以是溶剂
或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物)及其适合的混合物。可例如通过使用例如卵磷脂的涂布，通过在分散的情况下维持所需要
的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。用于本文公开的治疗方法的适合的
制剂被描述在Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药学)，Mack Publishing
Co.，第16版(1980)中。
[0680] 可通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞以及类似物来实现对微生物活动的预防。在许多情况下，组合物中将优选地包括等渗剂例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或者氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射的组合物延长的吸收。
[0681] 在任何情况下，可通过引入适当溶剂中的所需量的活性化合物(例如本发明的结合分子)以及所需的本文所列举的成分中的一种或组合、接着是过滤灭菌来制备无菌的可
注射溶液。通常，通过将活性化合物引入无菌的载体来制备分散体，其中所述载体含有基本的分散介质和来自上述列举的那些所需的其它成分。在用于制备无菌的可注射的溶液的无
菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自之前无
菌过滤的其溶液的任何另外的期望成分所组成的粉末。用于注射的制剂被加工，填充到容
器例如安瓿、袋子、瓶子、注射器或管形瓶中，并且在无菌条件下根据本领域已知的方法密封。进一步地，可将所述制剂进行包装并以试剂盒的形式销售，其中所述试剂盒例如共同待审的U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1)中所述的那些，其通过引用以其整体被并
入本文。这些产品将优选地具有标签或包装说明书以表明相关的组合物对于治疗患有或易
患自身免疫性或赘生病症的受治疗者是有用的。
注射溶液。通常，通过将活性化合物引入无菌的载体来制备分散体，其中所述载体含有基本的分散介质和来自上述列举的那些所需的其它成分。在用于制备无菌的可注射的溶液的无
菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自之前无
菌过滤的其溶液的任何另外的期望成分所组成的粉末。用于注射的制剂被加工，填充到容
器例如安瓿、袋子、瓶子、注射器或管形瓶中，并且在无菌条件下根据本领域已知的方法密封。进一步地，可将所述制剂进行包装并以试剂盒的形式销售，其中所述试剂盒例如共同待审的U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1)中所述的那些，其通过引用以其整体被并
入本文。这些产品将优选地具有标签或包装说明书以表明相关的组合物对于治疗患有或易
患自身免疫性或赘生病症的受治疗者是有用的。
[0682] 用于治疗本文所述的过度增殖性病症的本发明的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，其包括施用方法、靶位点、患者的生理状况、患者是人类还是动物、所施用的其它药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但也可治疗非人类的动物包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定治疗剂量以将安全性
和效力最佳化。
和效力最佳化。
[0683] 为了用抗体或其片段治疗过度增殖性病症，剂量可在例如从约0.0001至100mg/kg宿主体重的范围内变动，而且更通常地为0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、
0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地为至少1mg/kg。介于上述范围内的剂量也被认为是在本
发明的范围内。可每天、隔天、每周或根据经验分析所确定的任何其它时间表来对受治疗者施用这种剂量。示例性的治疗需要以多种剂量在延长的时间例如至少六个月内施用。另外
的示例性治疗方案需要每两周一次或一月一次或每3至6个月一次的施用。示例性的剂
量安排表包括在连续的日子里的1-10mg/kg或15mg/kg、隔天的30mg/kg或者每周的60mg/
kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在该情况下所施用的每种抗体的剂量落在所指明的范围内。
0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地为至少1mg/kg。介于上述范围内的剂量也被认为是在本
发明的范围内。可每天、隔天、每周或根据经验分析所确定的任何其它时间表来对受治疗者施用这种剂量。示例性的治疗需要以多种剂量在延长的时间例如至少六个月内施用。另外
的示例性治疗方案需要每两周一次或一月一次或每3至6个月一次的施用。示例性的剂
量安排表包括在连续的日子里的1-10mg/kg或15mg/kg、隔天的30mg/kg或者每周的60mg/
kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在该情况下所施用的每种抗体的剂量落在所指明的范围内。
[0684] 可在多种情况下施用本文公开的IGF-1R特异性结合分子。单次剂量之间的间隔可以是每周一次、每月一次或每年一次。间隔还可以是不规则的，如通过测量患者体内靶多肽或靶分子的血液水平所表明。在一些方法中，调节剂量以获得1-1000μg/ml的血浆多肽
浓度而且在一些方法中为25-300μg/ml。可选地，可将结合分子作为持续释放制剂来施用，在该情况下需要较低频率的施用。剂量和频率根据患者体内抗体的半衰期而变化。还可通
过融合至稳定多肽或部分例如白蛋白或PEG来延长结合分子的半衰期。通常地，人源化的
抗体显示最长的半衰期，接着是嵌合抗体和非人类抗体。在一个实施方案中，可以以未轭合的形式施用本发明的结合分子。在另一个实施方案中，可以以轭合的形式多次施用用于本
文所公开的方法的结合分子。在又一个实施方案中，可以以未轭合的形式然后以轭合的形
式，或者反过来施用本发明的结合分子。
浓度而且在一些方法中为25-300μg/ml。可选地，可将结合分子作为持续释放制剂来施用，在该情况下需要较低频率的施用。剂量和频率根据患者体内抗体的半衰期而变化。还可通
过融合至稳定多肽或部分例如白蛋白或PEG来延长结合分子的半衰期。通常地，人源化的
抗体显示最长的半衰期，接着是嵌合抗体和非人类抗体。在一个实施方案中，可以以未轭合的形式施用本发明的结合分子。在另一个实施方案中，可以以轭合的形式多次施用用于本
文所公开的方法的结合分子。在又一个实施方案中，可以以未轭合的形式然后以轭合的形
式，或者反过来施用本发明的结合分子。
[0685] 施用剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而改变。在预防性的应用中，包含抗体或其混合物的组合物被施用于未处在疾病状态下的或处于患病前状态下的患
者以增强患者的抵抗力。这种量被定义为“预防有效剂量”。在使用中，精确的量再次取决于患者的健康状况和一般免疫性，但通常在每剂0.1至25mg的范围内，特别地每剂0.5至
2.5mg。以相对不频繁的间隔在长时间内施用相对低的剂量。一些患者在他们的余生中继
续接受治疗。
者以增强患者的抵抗力。这种量被定义为“预防有效剂量”。在使用中，精确的量再次取决于患者的健康状况和一般免疫性，但通常在每剂0.1至25mg的范围内，特别地每剂0.5至
2.5mg。以相对不频繁的间隔在长时间内施用相对低的剂量。一些患者在他们的余生中继
续接受治疗。
[0686] 在治疗性应用中，有时候需要相对短间隔的相对高剂量(例如，每剂从约1至400mg/kg结合分子例如抗体，对于放射免疫轭合物更常用从5至25mg的剂量，而对于细胞
毒素-药物轭合的分子常用较高的剂量)，直至疾病进展被减轻或终止，并优选地直至患者
显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可对患者施用预防性的方案。
毒素-药物轭合的分子常用较高的剂量)，直至疾病进展被减轻或终止，并优选地直至患者
显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可对患者施用预防性的方案。
[0687] 在一个实施方案中，可用编码IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段(例如在载体中)的核酸分子处理受治疗者。编码多肽的核酸的剂量在每位患者约10ng至1g，
100ng至100mg，1μg至10mg或30-300μg DNA的范围内变动。感染性病毒载体的剂量在
每剂10-100或更多个病毒体变动。
100ng至100mg，1μg至10mg或30-300μg DNA的范围内变动。感染性病毒载体的剂量在
每剂10-100或更多个病毒体变动。
[0688] 可通过肠胃外的、局部的、静脉内的、口服的、皮下的、动脉内的、颅内的、腹膜内的、鼻内的或肌肉内的途径施用治疗剂以用于预防性的和/或治疗性的治疗。在一些方法中，将剂直接注射进特定组织中，其中表达IGF-1R的细胞聚集了例如颅内注射。对于抗体
的施用优选的是肌肉内注射或静脉内输入。在一些方法中，将特定的治疗性抗体直接注射
TM
进颅内。在一些方法中，作为持续释放组合物或装置例如Medipad 装置来施用抗体。
的施用优选的是肌肉内注射或静脉内输入。在一些方法中，将特定的治疗性抗体直接注射
TM
进颅内。在一些方法中，作为持续释放组合物或装置例如Medipad 装置来施用抗体。
[0689] 任选地可将本发明的IGF-1R结合分子与其它剂联合施用，其中所述其它剂对于治疗需要治疗(例如预防性的或治疗性的)的病症或状况是有效的。
[0690] 90Y标记的结合多肽的有效单次治疗剂量(即治疗有效量)在约5和约75mCi之131
间，更优选地在约10和约40mCi之间的范围内。 I标记的抗体的有效单次治疗非骨髓烧
131
蚀剂量在约5和约70mCi之间，更优选地在约5和约40mCi之间的范围内。 I标记的抗体
的有效单次治疗烧蚀剂量(即可能需要自体骨髓移植)在约30和约600mCi之间，更优选
地在约50和少于约500mCi之间的范围内。与嵌合抗体一起，由于相对于鼠抗体较长的循
环半衰期，碘131标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓烧蚀剂量在约5和约40mCi之间
111
的范围内，更优选地少于约30mCi。对于例如 In标记物的成像标准通常少于约5mCi。
间，更优选地在约10和约40mCi之间的范围内。 I标记的抗体的有效单次治疗非骨髓烧
131
蚀剂量在约5和约70mCi之间，更优选地在约5和约40mCi之间的范围内。 I标记的抗体
的有效单次治疗烧蚀剂量(即可能需要自体骨髓移植)在约30和约600mCi之间，更优选
地在约50和少于约500mCi之间的范围内。与嵌合抗体一起，由于相对于鼠抗体较长的循
环半衰期，碘131标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓烧蚀剂量在约5和约40mCi之间
111
的范围内，更优选地少于约30mCi。对于例如 In标记物的成像标准通常少于约5mCi。
[0691] 虽然已经使用131I和90Y获得了大量的临床经验，其它放射性标记物是本领域中已知的，并且已被用于相似的目的。其它放射性同位素仍被用于成像。例如，与本发明的范围123 125 32 57 64 67 77 81 81 87
适合的另外的放射性同位素包括但不限于 I、 I、P、Co、Cu、Cu、Br、Rb、Kr、Sr、
113 127 129 132 197 203 206 177 186 212 212 105 109 153 188
In、 Cs、 Cs、 I、 Hg、 Pb、 Bi、 Lu、 Re、 Pb、 Bi、47Sc、 Rh、 Pd、 Sm、 Re、
199 225 211 213
Au、 Ac、At和 Bi。在这方面，α、γ和β发射体都与本发明适合。进一步地，鉴于
本公开，应理解，本领域技术人员可容易地确定哪种放射性核素与所选疗程相称而不需过
125 123 99 43 52 67
度的实验。为此，已经被用于临床诊断的另外的放射性核素包括 I、 I、Tc、K、Fe、Ga、
68 111
Ga以及 In。为了在靶向的免疫疗法中的潜在用途，还已经用各种放射性核素标记了抗
体(Peirersz等人.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核素在较小程
188 186 199 67
度上包括 Re和 Re以及 Au和 Cu。美国专利第5,460,785号提供关于放射性核素的
另外的数据，而且通过引用被并入本文。
适合的另外的放射性同位素包括但不限于 I、 I、P、Co、Cu、Cu、Br、Rb、Kr、Sr、
113 127 129 132 197 203 206 177 186 212 212 105 109 153 188
In、 Cs、 Cs、 I、 Hg、 Pb、 Bi、 Lu、 Re、 Pb、 Bi、47Sc、 Rh、 Pd、 Sm、 Re、
199 225 211 213
Au、 Ac、At和 Bi。在这方面，α、γ和β发射体都与本发明适合。进一步地，鉴于
本公开，应理解，本领域技术人员可容易地确定哪种放射性核素与所选疗程相称而不需过
125 123 99 43 52 67
度的实验。为此，已经被用于临床诊断的另外的放射性核素包括 I、 I、Tc、K、Fe、Ga、
68 111
Ga以及 In。为了在靶向的免疫疗法中的潜在用途，还已经用各种放射性核素标记了抗
体(Peirersz等人.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核素在较小程
188 186 199 67
度上包括 Re和 Re以及 Au和 Cu。美国专利第5,460,785号提供关于放射性核素的
另外的数据，而且通过引用被并入本文。
[0692] 不管是以轭合的还是未轭合的形式使用本文公开的IGF-1R特异性结合分子，将理解的是，本发明的主要优点是将这些分子用于骨髓抑制患者，特别是正在经受或已经经
受辅助疗法例如放疗或化疗的那些人的能力。也就是说，分子的有益的输送概况(即相对
短的血清停留时间、高结合亲和力和增强的定位)使它们特别有用于治疗具有减少的红骨
髓储量并对骨髓毒性敏感的患者。在这点上，分子的特殊输送概况使它们在将放射标记的
轭合物施用于骨髓抑制的癌症患者时非常有效。像这样，轭合的或未轭合的形式的本文公
开的IGF-1R特异性结合分子在之前经受过辅助疗法例如外部照射放疗或化疗的患者中是
有用的。在其它优选的实施方案中，本发明的结合分子(再一次以轭合的或未轭合的形式)
可与化疗剂一起用于组合的治疗方案。本领域技术人员将理解，这种治疗方案可包括所公
开的抗体或其它结合分子和一种或多种化疗剂的相继的、同时的、并发的或共延的施用。本发明该方面特别优选的实施方案将包括放射标记的结合多肽的施用。
受辅助疗法例如放疗或化疗的那些人的能力。也就是说，分子的有益的输送概况(即相对
短的血清停留时间、高结合亲和力和增强的定位)使它们特别有用于治疗具有减少的红骨
髓储量并对骨髓毒性敏感的患者。在这点上，分子的特殊输送概况使它们在将放射标记的
轭合物施用于骨髓抑制的癌症患者时非常有效。像这样，轭合的或未轭合的形式的本文公
开的IGF-1R特异性结合分子在之前经受过辅助疗法例如外部照射放疗或化疗的患者中是
有用的。在其它优选的实施方案中，本发明的结合分子(再一次以轭合的或未轭合的形式)
可与化疗剂一起用于组合的治疗方案。本领域技术人员将理解，这种治疗方案可包括所公
开的抗体或其它结合分子和一种或多种化疗剂的相继的、同时的、并发的或共延的施用。本发明该方面特别优选的实施方案将包括放射标记的结合多肽的施用。
[0693] 虽然可按上面刚刚所述来施用IGF-1R特异性结合分子，必须强调的是，在其它实施方案中，轭合的和未轭合的结合分子可作为一线治疗剂被另外施用于健康患者。在这种
实施方案中，可将结合分子施用于具有正常或平均水平的红骨髓储量的患者和/或未经受
和未正在经受辅助疗法例如外部照射放疗或化疗的患者。然而，如上所讨论，如上所讨论，本发明所选的实施方案包括将IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段施用于骨髓抑
制的患者或与一种或多种辅助疗法例如放疗或化疗组合或联合地施用(即组合的治疗方
案)。如本文所用，与辅助疗法联合或组合地施用IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片
段是指疗法和公开的结合分子的相继的、同时的、共延的、并发的、伴随的或同时期的施用或应用。本领域技术人员将理解，可为组合的治疗方案的各种成分的施用或应用定时以增
强治疗的整体效果。例如，可在标准的熟知的疗程中施用化疗剂，接着在几周内施用本文所述的放射免疫轭合物。相反地，可在静脉内施用轭合了细胞毒素的结合分子，接着是定位
于肿瘤的外部照射放疗。在其他的实施方案中，可以在一次看病过程中将结合分子与一种
或多种选择的放疗剂一起并发地施用。基于所选的辅助疗法和本说明书的教导，技术人员
(例如有经验的肿瘤学家)将能够容易地辨别有效的组合治疗方案而不需过度实验。
实施方案中，可将结合分子施用于具有正常或平均水平的红骨髓储量的患者和/或未经受
和未正在经受辅助疗法例如外部照射放疗或化疗的患者。然而，如上所讨论，如上所讨论，本发明所选的实施方案包括将IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段施用于骨髓抑
制的患者或与一种或多种辅助疗法例如放疗或化疗组合或联合地施用(即组合的治疗方
案)。如本文所用，与辅助疗法联合或组合地施用IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片
段是指疗法和公开的结合分子的相继的、同时的、共延的、并发的、伴随的或同时期的施用或应用。本领域技术人员将理解，可为组合的治疗方案的各种成分的施用或应用定时以增
强治疗的整体效果。例如，可在标准的熟知的疗程中施用化疗剂，接着在几周内施用本文所述的放射免疫轭合物。相反地，可在静脉内施用轭合了细胞毒素的结合分子，接着是定位
于肿瘤的外部照射放疗。在其他的实施方案中，可以在一次看病过程中将结合分子与一种
或多种选择的放疗剂一起并发地施用。基于所选的辅助疗法和本说明书的教导，技术人员
(例如有经验的肿瘤学家)将能够容易地辨别有效的组合治疗方案而不需过度实验。
[0694] 在这点上，将理解的是，可以以为患者提供治疗益处的任何顺序和在任意时间框架内施用结合分子(含有或不含细胞毒素)和化疗剂的组合。也就是说，可以以任何顺序或
并发地施用化疗剂和IGF-1R特异性结合分子。在所选的实施方案中，本发明的IGF-1R特
异性结合分子将被施用于之前经受过化疗的患者。在其他的实施方案中，将与化疗治疗基
本上同时或并发地施用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段。例如，可以在
进行化疗疗程中把结合分子给患者。在优选的实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的1年
内施用结合分子。在其他优选的实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的10、8、6、4或2个月内施用多肽。在其他优选的实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的4、3、2或1周内施用结
合分子。在其他的实施方案中，将在所选的化疗剂或治疗的5、4、3、2或1天内施用结合分子。将进一步理解的是，可在几小时或几分钟内(即基本上同时地)对患者施用两种剂或
治疗。
并发地施用化疗剂和IGF-1R特异性结合分子。在所选的实施方案中，本发明的IGF-1R特
异性结合分子将被施用于之前经受过化疗的患者。在其他的实施方案中，将与化疗治疗基
本上同时或并发地施用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段。例如，可以在
进行化疗疗程中把结合分子给患者。在优选的实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的1年
内施用结合分子。在其他优选的实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的10、8、6、4或2个月内施用多肽。在其他优选的实施方案中，将在任何化疗剂或治疗的4、3、2或1周内施用结
合分子。在其他的实施方案中，将在所选的化疗剂或治疗的5、4、3、2或1天内施用结合分子。将进一步理解的是，可在几小时或几分钟内(即基本上同时地)对患者施用两种剂或
治疗。
[0695] 此外，根据本发明，骨髓抑制的患者将指的是展现较低的血细胞计数的任何患者。本领域技术人员将理解，有几种血细胞计数参数被传统地用作骨髓抑制的临床指示器，而
且人们可容易地测量发生在患者中的骨髓抑制的程度。本领域公认的骨髓抑制测量法的例
子是嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分的骨髓清除可能是
各种生化病症或疾病的结果，或者更可能地，作为之前化疗或放疗的结果。在这方面，本领域技术人员将理解，经受了传统化疗的患者通常展现减少的红骨髓储量。如上所讨论，常常不能用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)来治疗这种受治疗者，这是由于导致死亡率
或发病率增加的不可接受的副作用，例如贫血或免疫抑制。
且人们可容易地测量发生在患者中的骨髓抑制的程度。本领域公认的骨髓抑制测量法的例
子是嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分的骨髓清除可能是
各种生化病症或疾病的结果，或者更可能地，作为之前化疗或放疗的结果。在这方面，本领域技术人员将理解，经受了传统化疗的患者通常展现减少的红骨髓储量。如上所讨论，常常不能用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)来治疗这种受治疗者，这是由于导致死亡率
或发病率增加的不可接受的副作用，例如贫血或免疫抑制。
[0696] 更特别地，轭合的或未轭合的本发明的IGF-1R特异性结合分子可被有效地用来3 3
治疗这样的患者，其具有低于约2000/mm 的ANC或低于约150,000/mm 的血小板计数。更
优选地，本发明的IGF-1R特异性结合分子可被用来治疗这样的患者，其具有低于约1500/
3 3 3
mm，低于约1000/mm 或更优选地低于约500/mm 的ANC。相似地，本发明的IGF-1R特异性
3 3
结合分子可被用来治疗这样的患者，其具有低于约75,000/mm，低于约50,000/mm 或甚至
3
低于约10,000/mm 的血小板计数。在更一般的意义上，使用政府定制的准则和步骤，本领
域技术人员将能容易地确定患者何时被骨髓抑制。
治疗这样的患者，其具有低于约2000/mm 的ANC或低于约150,000/mm 的血小板计数。更
优选地，本发明的IGF-1R特异性结合分子可被用来治疗这样的患者，其具有低于约1500/
3 3 3
mm，低于约1000/mm 或更优选地低于约500/mm 的ANC。相似地，本发明的IGF-1R特异性
3 3
结合分子可被用来治疗这样的患者，其具有低于约75,000/mm，低于约50,000/mm 或甚至
3
低于约10,000/mm 的血小板计数。在更一般的意义上，使用政府定制的准则和步骤，本领
域技术人员将能容易地确定患者何时被骨髓抑制。
[0697] 如上面所指明，许多骨髓抑制的患者已经经受了包括化疗、植入放疗或外部照射放疗在内的疗程。在后一种情况下，外部辐射源是针对恶性肿瘤的局部照射。关于放疗植
入方法，通过外科手术将放射性试剂放置在恶性肿瘤中，从而选择性地照射疾病位置。在任何事件中，本发明的IGF-1R特异性结合分子可被用来治疗展示无论病因的骨髓抑制的患
者中的病症。
入方法，通过外科手术将放射性试剂放置在恶性肿瘤中，从而选择性地照射疾病位置。在任何事件中，本发明的IGF-1R特异性结合分子可被用来治疗展示无论病因的骨髓抑制的患
者中的病症。
[0698] 在这点上，将进一步理解的是，可与消除、减少、抑制或控制体内瘤细胞生长的任何化疗剂(例如提供组合治疗方案)联合或组合地使用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段。正如已经讨论过的，这种剂常常导致红骨髓储量的减少。该减少可被
本发明化合物减少的骨髓毒性全部或部分地补偿，其有利地允许对这种患者中的瘤形成进
行积极的治疗。在其他实施方案中，本文公开的放射性标记的免疫轭合物可被有效地与放
射性敏化剂一起使用，其中所述放射性敏化剂增加赘生细胞对放射性核素的易感性。例如，可在将放射性标记的结合分子大部分清除出血流但仍然以治疗有效水平在肿瘤的位置保
留之后，施用放射性敏化化合物。
本发明化合物减少的骨髓毒性全部或部分地补偿，其有利地允许对这种患者中的瘤形成进
行积极的治疗。在其他实施方案中，本文公开的放射性标记的免疫轭合物可被有效地与放
射性敏化剂一起使用，其中所述放射性敏化剂增加赘生细胞对放射性核素的易感性。例如，可在将放射性标记的结合分子大部分清除出血流但仍然以治疗有效水平在肿瘤的位置保
留之后，施用放射性敏化化合物。
[0699] 关于本发明这些方面，与本发明适合的示例性化疗剂包括烷化剂、长春花生物碱(例如长春新碱和长春花碱)、甲基苄肼、氨甲蝶呤和泼尼松。四种药物的组合MOPP(甲二
氯二乙胺(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲基苄肼和泼尼松)在治疗各种类型的淋巴瘤方
面非常有效，并且包括本发明优选的实施方案。在MOPP抗性的患者中，可以使用ABVD(例
如阿霉素、博莱霉素、长春花碱和氮烯唑胺)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花碱、甲基苄肼和泼尼松)、CABS(洛莫司汀、多柔比星、博莱霉素和链唑霉素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(多柔比星、博莱霉素和长春花碱)或者BCVPP(卡莫司汀、环磷酰胺、长春花碱、甲基苄肼和泼尼松)的组合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas(恶性淋巴
瘤)，Harrison′s Principles of Internal Medicine(内科学原理)1774-1788(Kurt
J.Isselbacher等人编辑，第13版1994)和V.T.DeVita等人，(1997)，以及在其中引用的
有关标准的给药和时间安排的参考文献。可不经改变或根据特定患者的需要进行改变而与
本发明的一种或多种IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段组合使用这些疗法。
氯二乙胺(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲基苄肼和泼尼松)在治疗各种类型的淋巴瘤方
面非常有效，并且包括本发明优选的实施方案。在MOPP抗性的患者中，可以使用ABVD(例
如阿霉素、博莱霉素、长春花碱和氮烯唑胺)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花碱、甲基苄肼和泼尼松)、CABS(洛莫司汀、多柔比星、博莱霉素和链唑霉素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(多柔比星、博莱霉素和长春花碱)或者BCVPP(卡莫司汀、环磷酰胺、长春花碱、甲基苄肼和泼尼松)的组合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas(恶性淋巴
瘤)，Harrison′s Principles of Internal Medicine(内科学原理)1774-1788(Kurt
J.Isselbacher等人编辑，第13版1994)和V.T.DeVita等人，(1997)，以及在其中引用的
有关标准的给药和时间安排的参考文献。可不经改变或根据特定患者的需要进行改变而与
本发明的一种或多种IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段组合使用这些疗法。
[0700] 在本发明的上下文中有用的另外的疗法包括使用单种烷化剂例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥，或者例如CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、CHOP(CVP和多柔比星)、
C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)、CAP-BOP(CHOP加上甲基苄肼和博
莱霉素)、m-BACOD(CHOP加上氨甲蝶呤、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)、ProMACE-MOPP(泼
尼松、氨甲蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加上标准的MOPP)、
ProMACE-CytaBOM(泼尼松、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博莱霉素、长春新碱、氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸)和MACOP-B(氨甲蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量的泼尼松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)的组合。本领域技术人员将能够容易地为这些疗
法中的每种来确定标准剂量和时间安排。还将CHOP与博莱霉素、氨甲蝶呤、甲基苄肼、氮
芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷和依托泊苷组合。其它适合的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷
(2-CDA)、2’-脱氧柯福霉素和氟达拉滨。
C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松和甲基苄肼)、CAP-BOP(CHOP加上甲基苄肼和博
莱霉素)、m-BACOD(CHOP加上氨甲蝶呤、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)、ProMACE-MOPP(泼
尼松、氨甲蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加上标准的MOPP)、
ProMACE-CytaBOM(泼尼松、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博莱霉素、长春新碱、氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸)和MACOP-B(氨甲蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量的泼尼松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)的组合。本领域技术人员将能够容易地为这些疗
法中的每种来确定标准剂量和时间安排。还将CHOP与博莱霉素、氨甲蝶呤、甲基苄肼、氮
芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷和依托泊苷组合。其它适合的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷
(2-CDA)、2’-脱氧柯福霉素和氟达拉滨。
[0701] 对于患有中等级和高等级恶性肿瘤未能获得缓解或复发的患者，使用抢救疗法(salvage therapy)。抢救疗法使用单独或组合施用的药物例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、顺铂、碳铂、依托泊苷和异环磷酰胺。在复发或攻击性形式的某种赘生病症中，常常使用如下方
案：IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量的阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲基脱氢皮质醇、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、泼尼松和博莱霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松)，其每一个都具有熟知的给药速率和时
间安排。
案：IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量的阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲基脱氢皮质醇、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、泼尼松和博莱霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松)，其每一个都具有熟知的给药速率和时
间安排。
[0702] 待与本发明的IGF-1R特异性结合分子组合使用的化疗剂的量可由受治疗者改变，或可根据本领域已知的来施用。参见例如BruceA Chabner等人，Antineoplastic
Agents( 抗 肿 瘤 剂 )，Goodman &Gilman ′ s The Pharmacological Basis of
Therapeutics(治疗的药理学基础)1233-1287(Joel G.Hardman等人编辑，第9版(1996))。
Agents( 抗 肿 瘤 剂 )，Goodman &Gilman ′ s The Pharmacological Basis of
Therapeutics(治疗的药理学基础)1233-1287(Joel G.Hardman等人编辑，第9版(1996))。
[0703] 在另一个实施方案中，本发明的IGF-1R特异性结合分子与生物制剂联合施用。对于治疗癌症有用的生物制剂是本领域已知的，而且可例如与这种已知的生物制剂联合施用
本发明的结合分子。
本发明的结合分子。
[0704] 例如，FDA已经批准如下用于治疗乳腺癌的生物制品：Herceptin (曲妥单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA；在HER2阳性乳腺癌中具有抗肿瘤活
性的人源化的单克隆抗体)；Faslodex (氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，
LP，Wilmington，DE；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；Arimidex (阿纳托唑，
AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；阻断芳香酶即产生雌激素所需的酶的非类固醇芳香酶抑制剂)；Aromasin (依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；用于治疗乳腺癌的不可逆
的类固醇芳香酶灭活剂)；Femara (来曲唑，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ；FDA批准的用于治疗乳腺癌的非类固醇芳香酶抑制剂)；和Nolvadex (他莫昔芬，
AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；FDA批准的用于治疗乳腺癌的非类固醇抗雌激素)。
TM
可与本发明的结合分子组合的其他生物制剂包括：Avastin (贝伐单抗，Genentech Inc.；
FDA批准的第一个被设计为抑制血管生成的疗法)；和Zevalin (替伊莫单抗，Biogen
Idec，Cambridge，MA；当前被批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
性的人源化的单克隆抗体)；Faslodex (氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，
LP，Wilmington，DE；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；Arimidex (阿纳托唑，
AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；阻断芳香酶即产生雌激素所需的酶的非类固醇芳香酶抑制剂)；Aromasin (依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；用于治疗乳腺癌的不可逆
的类固醇芳香酶灭活剂)；Femara (来曲唑，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ；FDA批准的用于治疗乳腺癌的非类固醇芳香酶抑制剂)；和Nolvadex (他莫昔芬，
AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；FDA批准的用于治疗乳腺癌的非类固醇抗雌激素)。
TM
可与本发明的结合分子组合的其他生物制剂包括：Avastin (贝伐单抗，Genentech Inc.；
FDA批准的第一个被设计为抑制血管生成的疗法)；和Zevalin (替伊莫单抗，Biogen
Idec，Cambridge，MA；当前被批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
[0705] 此外，FDA已经批准如下用于治疗结肠直肠癌的生物制品：AvastinTM；TM
Erbitux ( 西 妥 昔 单 抗，ImClone Systems Inc.，New York，NY 和 Bristol-Myers
Squibb，New York，NY；针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；Gleevec
(甲磺酸伊马替尼；一种蛋白激酶抑制剂)；和Ergamisol (盐酸左旋咪唑，Janssen
PharmaceuticaProducts，LP，Titusville，NJ；FDA在1990年批准的在对患有杜克斯C阶段结肠癌的患者进行手术切除后与5-氟尿嘧啶一起作为辅助治疗的免疫调节剂)。
Erbitux ( 西 妥 昔 单 抗，ImClone Systems Inc.，New York，NY 和 Bristol-Myers
Squibb，New York，NY；针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；Gleevec
(甲磺酸伊马替尼；一种蛋白激酶抑制剂)；和Ergamisol (盐酸左旋咪唑，Janssen
PharmaceuticaProducts，LP，Titusville，NJ；FDA在1990年批准的在对患有杜克斯C阶段结肠癌的患者进行手术切除后与5-氟尿嘧啶一起作为辅助治疗的免疫调节剂)。
[0706] 目前批准的用于治疗非霍奇金淋巴瘤的疗法包括：Bexxar (托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research TrianglePark，NC；包括连接至放射性分子(碘I-131)的小鼠单克隆抗体(托西莫单抗)在内的多步治疗)；Intron A(干扰素
α-2b，ScheringCorporation，Kenilworth，NJ；批准的与含有蒽环霉素的组合疗法(例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松[CHOP])一起用于治疗滤泡性非霍奇金淋巴瘤的
一种干扰素)；Rituxan (利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA和
Biogen Idec，Cambridge，MA；批准的用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体)；Ontak
(地尼白介素-毒素连接物，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA；由通常被融合至白细胞介素-2的白喉毒素片段所组成的融合蛋白)；和Zevalin (替伊莫单抗，Biogen
Idec；FDA批准的用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
α-2b，ScheringCorporation，Kenilworth，NJ；批准的与含有蒽环霉素的组合疗法(例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松[CHOP])一起用于治疗滤泡性非霍奇金淋巴瘤的
一种干扰素)；Rituxan (利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA和
Biogen Idec，Cambridge，MA；批准的用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体)；Ontak
(地尼白介素-毒素连接物，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA；由通常被融合至白细胞介素-2的白喉毒素片段所组成的融合蛋白)；和Zevalin (替伊莫单抗，Biogen
Idec；FDA批准的用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
[0707] 用于治疗白血病的可与本发明的结合分子组合使用的示例性的生物制剂包括Gleevec ；Campath -1H(阿仑单抗，BerlexLaboratories，Richmond，CA；用于治疗慢
性淋巴细胞性白血病的一种单克隆抗体)。另外，可与所要求保护的结合分子一起施用
Genasense(oblimersen，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；可以例如单独地或与一种或多种化疗药物例如氟达拉滨和环磷酰胺一起使用正在开发中的用来治疗白血病的
BCL-2反义疗法)。
性淋巴细胞性白血病的一种单克隆抗体)。另外，可与所要求保护的结合分子一起施用
Genasense(oblimersen，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；可以例如单独地或与一种或多种化疗药物例如氟达拉滨和环磷酰胺一起使用正在开发中的用来治疗白血病的
BCL-2反义疗法)。
[0708] 用于治疗肺癌的示例性的生物制剂包括TarcevaTM(盐酸埃罗替尼，OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，NY；被设计为靶向人类表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
[0709] 用于治疗多发性骨髓瘤的示例性的生物制剂包括Velcade Velcade(硼替佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge MA；蛋白酶体抑制剂)。另外的生物制剂包括
Thalidomid (沙利度胺，Clegene Corporation，Warren，NJ；一种免疫调节剂，其表现为具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及抑制抗血管生成的能力)。
Thalidomid (沙利度胺，Clegene Corporation，Warren，NJ；一种免疫调节剂，其表现为具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及抑制抗血管生成的能力)。
[0710] 其它示例性的生物制剂包括由ImClone Systems，Inc.，New York，NY开发的MOAB IMC-C225。
[0711] 如前面所讨论，可以以药学上有效的量施用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段或者其重组体，以便在体内治疗哺乳动物的过度增殖性病症。在这点上，将被理解的是，将配制所公开的抗体以促进活性剂的施用并提高活性剂的稳定性。优选地，
本发明的药物组合物包括药学上可接受的无毒无菌载体，例如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂以及类似物。为了本申请的目的，轭合或未轭合至治疗剂的药学上有效的量的本发明的
IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段或者其重组体，将指的是足以获得与靶的有效结
合以及获得例如改善疾病或病症的症状或检测一种物质或细胞的益处的量。在肿瘤细胞的
情况下，结合分子将优选地能够与赘生或免疫活性细胞上或者非赘生细胞例如与赘生细胞
相关的血管细胞上所选的免疫活性抗原相互作用，并提供那些细胞死亡的增加。当然，可以以单或多剂来施用本发明的药物组合物以提供药学上有效的量的结合分子。
本发明的药物组合物包括药学上可接受的无毒无菌载体，例如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂以及类似物。为了本申请的目的，轭合或未轭合至治疗剂的药学上有效的量的本发明的
IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段或者其重组体，将指的是足以获得与靶的有效结
合以及获得例如改善疾病或病症的症状或检测一种物质或细胞的益处的量。在肿瘤细胞的
情况下，结合分子将优选地能够与赘生或免疫活性细胞上或者非赘生细胞例如与赘生细胞
相关的血管细胞上所选的免疫活性抗原相互作用，并提供那些细胞死亡的增加。当然，可以以单或多剂来施用本发明的药物组合物以提供药学上有效的量的结合分子。
[0712] 与本公开的范围一致，可根据前面提到的以足以产生治疗或预防作用的量治疗的方法来对人或其他动物施用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段。可以以
常规剂型对这些人或其他动物施用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段，
其中所述常规剂型是通过将本发明的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂根据已
知技术组合而制备的。本领域技术人员将发现，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特
性取决于它将与之组合的活性成分的量、施用途径和其他熟知变量。本领域技术人员将进
一步理解，包含本发明一种或多种结合分子的混合物可被证明是特别有效的。
常规剂型对这些人或其他动物施用本发明的IGF-1R特异性的抗体或其免疫特异性片段，
其中所述常规剂型是通过将本发明的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂根据已
知技术组合而制备的。本领域技术人员将发现，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特
性取决于它将与之组合的活性成分的量、施用途径和其他熟知变量。本领域技术人员将进
一步理解，包含本发明一种或多种结合分子的混合物可被证明是特别有效的。
[0713] 除非另作说明，本发明的实践将利用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域的技术之中。这些技术在文献中被充分地说明。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual(分子克隆实
验手册)，第2版，Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress：(1989)；
Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Sambrook等人编辑，
Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning(DNA克隆)，D.N.Glover编辑，卷I和II(1985)；Oligonucleotide Synthesis(低聚核苷酸合成)，M.J.Gait编辑，
(1984)；Mullis等人.美国专利第4,683,195号；Nucleic AcidHybridization(核酸杂
交)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Transcription And Translation(转录和翻
译)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Culture Of Animal Cells(动物细胞培养)，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes(固定化的细胞和酶)，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(分子克隆实用指南)(1984)；专题论文，Methods In Enzymology(酶学方法)，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移
载体)，J.H.Miller和M.P.Calos编辑，Cold Spring HarborLaboratory(1987)；Methods
In Enzymology(酶学方法)，卷154和155(Wu等人编辑)；Immunochemical Methods In
Cell And MolecularBiology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)，Mayer和Walker编
辑，Academic Press，London(1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology(实验免疫
学手册)，卷I-IV，D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，(1986)；Manipulating the Mouse
Embryo(小鼠胚胎操作)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学
最新实验方案)，John Wiley和Sohs，Baltimore，Maryland(1989)。
验手册)，第2版，Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress：(1989)；
Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Sambrook等人编辑，
Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning(DNA克隆)，D.N.Glover编辑，卷I和II(1985)；Oligonucleotide Synthesis(低聚核苷酸合成)，M.J.Gait编辑，
(1984)；Mullis等人.美国专利第4,683,195号；Nucleic AcidHybridization(核酸杂
交)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Transcription And Translation(转录和翻
译)，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Culture Of Animal Cells(动物细胞培养)，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes(固定化的细胞和酶)，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(分子克隆实用指南)(1984)；专题论文，Methods In Enzymology(酶学方法)，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移
载体)，J.H.Miller和M.P.Calos编辑，Cold Spring HarborLaboratory(1987)；Methods
In Enzymology(酶学方法)，卷154和155(Wu等人编辑)；Immunochemical Methods In
Cell And MolecularBiology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)，Mayer和Walker编
辑，Academic Press，London(1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology(实验免疫
学手册)，卷I-IV，D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，(1986)；Manipulating the Mouse
Embryo(小鼠胚胎操作)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学
最新实验方案)，John Wiley和Sohs，Baltimore，Maryland(1989)。
[0714] 抗体工程的一般原理阐述在Antibody Engineering，第2版，C.A.K.Borrebaeck编辑，牛津大学出版社(1995)中。蛋白质工程的一般原理阐述在Protein Engineering，A Practical Approach(蛋白工程的实用方法)，Rickwood，D.等人编辑，IRL Press，牛津大学出版社，牛津，英格兰(1995)中。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理阐述在：Nisonoff，A.，Molecular Immunology(分子免疫学)，第2版，Sinauer Associates，Sunderland，
MA(1984)；和Steward，M.W.，Antibodies，Their，Structure and Function(抗体，它们的结构和功能).Chapman和Hall，New York，NY(1984)。另外，本领域已知的和未特别描述的免疫学标准方法通常是按照Current Protocols inImmunology(免疫学最新实验方案)，
John Wiley & Sons，New York；Stites等人.(编辑)，Basic and Clinical-Immunology(基础和临床免疫学)(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)和Mishell和
Shiigi(编辑)，Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学中的精选方法)，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
MA(1984)；和Steward，M.W.，Antibodies，Their，Structure and Function(抗体，它们的结构和功能).Chapman和Hall，New York，NY(1984)。另外，本领域已知的和未特别描述的免疫学标准方法通常是按照Current Protocols inImmunology(免疫学最新实验方案)，
John Wiley & Sons，New York；Stites等人.(编辑)，Basic and Clinical-Immunology(基础和临床免疫学)(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)和Mishell和
Shiigi(编辑)，Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学中的精选方法)，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
[0715] 阐述免疫学的一般原理的标准参考文献包括Current ProtocolsinImmunology(免疫学最新实验方案)，John Wiley & Sons，NewYork；Klein，J.，Immunology：
The Science of Self-NonselfDiscrimination(免疫学：辨别自身-非自身的科学)，
John Wiley &Sons，New York(1982)；Kennett，R等人编辑，Monoclonal Antibodies，
Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(单克隆抗体，杂交瘤：生物学
分析的新尺度)，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，“Monoclonal Antibody Technology(单克隆抗体技术)”，Burden，R等人编辑，Laboratory Techniques in
Biochemistry andMolecular Biology(生物化学和分子生物学实验技术)，卷13，
Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunology(免疫学)第4版，编辑Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt和Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；Roitt，I.，Brostoff，J.和Male D.，Immunology(免疫学)第6版London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.和
Lichtman，A.，Celluar and Molecular Immunology(细胞和分子免疫学)第5版，Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel，Antibody Engineering(抗体工
程)，Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册).Cold Spring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII(基
因VIID，Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor Press(1988)；Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer(PCR
引物)Cold SpringHarbor Press(2003)。
The Science of Self-NonselfDiscrimination(免疫学：辨别自身-非自身的科学)，
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分析的新尺度)，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，“Monoclonal Antibody Technology(单克隆抗体技术)”，Burden，R等人编辑，Laboratory Techniques in
Biochemistry andMolecular Biology(生物化学和分子生物学实验技术)，卷13，
Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunology(免疫学)第4版，编辑Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt和Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；Roitt，I.，Brostoff，J.和Male D.，Immunology(免疫学)第6版London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.和
Lichtman，A.，Celluar and Molecular Immunology(细胞和分子免疫学)第5版，Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel，Antibody Engineering(抗体工
程)，Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册).Cold Spring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII(基
因VIID，Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体实验手册)，Cold Spring Harbor Press(1988)；Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer(PCR
引物)Cold SpringHarbor Press(2003)。
[0716] 上面所引用的所有文献，以及本文所引用的所有文献，通过引用以其整体被并入本文。此外，本发明的进一步方面列在说明书的序列表部分和附图。
实施例
实施例
[0717] 实施例1.M13.C06抗体识别不同于其它抑制性抗IGF-1R抗体的表位
[0718] 进行了交叉竞争抗体结合研究以比较M13.C06.G4.P.agly与其它IGF-1R抗体的IGF-1R抗体结合表位。参见图11。分析了未标记的竞争抗体与五种不同标记的抗体对
可溶性IGF-1R结合的交叉竞争能力。所用的五种标记的抗体是生物素标记的M13.C06.
G4.P.agly(“生物素-C06”)、生物素标记的M14-G11(“生物素-G11”)、zenon标记的
P1B10-1A10(“Zenon-O”)、zenon标记的20C8-3B4(“Zenon-M”)或zenon标记的IR3抗
体(“Zenon-IR3”)。参见图11。使用来自Pierce Chemical(#21335)的生物素酰化试剂
盒以生物素标记抗体。使用来自Molecular Probes(Z25000)的Zenon小鼠IgG标记试剂
盒进行Zenon标记。
可溶性IGF-1R结合的交叉竞争能力。所用的五种标记的抗体是生物素标记的M13.C06.
G4.P.agly(“生物素-C06”)、生物素标记的M14-G11(“生物素-G11”)、zenon标记的
P1B10-1A10(“Zenon-O”)、zenon标记的20C8-3B4(“Zenon-M”)或zenon标记的IR3抗
体(“Zenon-IR3”)。参见图11。使用来自Pierce Chemical(#21335)的生物素酰化试剂
盒以生物素标记抗体。使用来自Molecular Probes(Z25000)的Zenon小鼠IgG标记试剂
盒进行Zenon标记。
[0719] 该分析的结果表明，M13.C06.G4.P.agly和M14.C03.G4.P.agly抗体结合至IGF-1R的相同或相似区域，其与所测试的所有其它抗体不同。特别地，只有生物素标记的
M13.C06.G4.P.agly抗体与未标记的M13.C06.G4.P.agly或未标记的M14.C03.G4.P.agly
对IGF-1R的结合有效地竞争。还值得注意的是，M13.C06.G4.P.agly不与充分研究的IR3
抗体交叉竞争。因此，这两种抗体特别地结合至不同IGF-1R表位。
M13.C06.G4.P.agly抗体与未标记的M13.C06.G4.P.agly或未标记的M14.C03.G4.P.agly
对IGF-1R的结合有效地竞争。还值得注意的是，M13.C06.G4.P.agly不与充分研究的IR3
抗体交叉竞争。因此，这两种抗体特别地结合至不同IGF-1R表位。
[0720] 实施例2.M13.C06抗体结合到FnIII-1结构域的N-末端区并变构地减少IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合亲和力
[0721] a.方法：
[0722] i.在M13-C06抗体存在和不存在下的IGF-1/IGF-1R结合实验
[0723] 使用几种构建体来研究抗体/IGF-1与IGF-1R受体或胰岛素受体的结合：人 类IGF-1R(1-902)-His10(表 示 为hIGF-1R-His10，来 自R&D systems)、人 类
INSR(28-956)-His10(表示为INSR，来自R&Dsystems)、人类IGF-1R(1-903)-Fc(表示为
hIGF-1R-Fc，由Biogen Idec产生)、人类IGF-1R(1-462)-Fc(表示为hIGF-1R(1-462)-Fc，
由BiogenIdec产生)和鼠IGF-1R(1-903)-Fc(表示为mIGF-1R-Fc，由BiogenIdec产生)。
“His10”表示在构建体C末端的10个残基的组氨酸标签。“Fc”表示C末端的人类IgG1-Fc
标签。
INSR(28-956)-His10(表示为INSR，来自R&Dsystems)、人类IGF-1R(1-903)-Fc(表示为
hIGF-1R-Fc，由Biogen Idec产生)、人类IGF-1R(1-462)-Fc(表示为hIGF-1R(1-462)-Fc，
由BiogenIdec产生)和鼠IGF-1R(1-903)-Fc(表示为mIGF-1R-Fc，由BiogenIdec产生)。
“His10”表示在构建体C末端的10个残基的组氨酸标签。“Fc”表示C末端的人类IgG1-Fc
标签。
[0724] 人类IGF-1购自Millipore。使用表面等离子体共振(SPR)确定了IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和力。将生物素标记的抗His标签抗体(生物素-PENTA-His，Qiagen
目录号34440)以HBS-EP缓冲液中500nM注射来饱和地固定在Biacore SA芯片(目录号
BR-1000-32)表面上。对于每张感应图，通过以2μL/min注射20μL的40nM蛋白来在生
物素-PENTA-His表面上捕获hIGF-1R-His10。在注射hIGF-1R-His10之后，将流速增加至
20μL/min。再一次，进行含有IGF-1的130μL的注射以研究生长激素与它的受体的相互作
用。将IGF-1从64nM连续稀释至0.125nM以获得浓度依赖的动力学结合曲线。以20μL/
min注射10mM醋酸(pH 4.0)3×10μL以再生每个注射系列。将每条曲线双重参考，其使
用(1)从缺乏PENTA-His抗体的链霉抗生素蛋白表面获得的数据以及(2)来自第一次注射
hIGF-1R-His10接着第二次注射HBS-EP缓冲液的数据。将IGF-1的浓度系列拟合至制造商
的BiaEvaluation软件中提供的1∶1结合模型。在电泳缓冲液、hIGF-1R-His10注射缓冲
液和IGF-1注射缓冲液中获得了两组数据，一组不存在而另一组存在400nM的M13-C06。
目录号34440)以HBS-EP缓冲液中500nM注射来饱和地固定在Biacore SA芯片(目录号
BR-1000-32)表面上。对于每张感应图，通过以2μL/min注射20μL的40nM蛋白来在生
物素-PENTA-His表面上捕获hIGF-1R-His10。在注射hIGF-1R-His10之后，将流速增加至
20μL/min。再一次，进行含有IGF-1的130μL的注射以研究生长激素与它的受体的相互作
用。将IGF-1从64nM连续稀释至0.125nM以获得浓度依赖的动力学结合曲线。以20μL/
min注射10mM醋酸(pH 4.0)3×10μL以再生每个注射系列。将每条曲线双重参考，其使
用(1)从缺乏PENTA-His抗体的链霉抗生素蛋白表面获得的数据以及(2)来自第一次注射
hIGF-1R-His10接着第二次注射HBS-EP缓冲液的数据。将IGF-1的浓度系列拟合至制造商
的BiaEvaluation软件中提供的1∶1结合模型。在电泳缓冲液、hIGF-1R-His10注射缓冲
液和IGF-1注射缓冲液中获得了两组数据，一组不存在而另一组存在400nM的M13-C06。
[0725] ii.IGF-1/IGF-1R/M13-C06抗体三元复合物的牵出(pulldown)和Western印迹分析
[0726] 将重新悬浮的蛋白A/G珠子(300μl，Pierce目录号20422)用1×PBS冲洗并将其在室温下的旋转振动器上的1.5ml的Eppendorf管中与1.0mg的M13-C06混合两小
时。在分开的管中，在室温下将12μg的hIGF-1R-His10(R&D systems)和460ng的人类
IGF-1(Chemicon International目录号GF006)混合(1∶1的蛋白∶蛋白比例)一小时。
用PBS冲洗结合了M13-C06的蛋白A/G，并用hIGF-1R-His10/IGF-1混合物在室温下培养
了30分钟。用PBS冲洗带有结合蛋白的蛋白A/G，接着用300μL的100mM甘氨酸(pH3.0)
洗脱结合蛋白。对于阴性对照，省去了12μg人类IGF-1R(1-902)-His10的加入。使用抗
人IGF-1抗体(兔抗人IGF-1生物素，USBiological目录号I7661-01B)和抗人IGF-1R
抗体(IGF-1Rα1H7，Santa Cruz Biotechnology目录号sc-461)作为一抗，接着用HRP
标记的链霉抗生素蛋白(Southern Biotech目录号7100-05)和HRP标记的山羊抗小鼠
IgG(USBiological目录号I1904-40J)作为二抗，通过Western印迹检测了洗脱的蛋白。为
了证明IGF-1/IGF-1R/M13-C06形成三元复合物的能力，用于此实验的IGF-1和IGF-1R的
浓度远远超出(＞15倍以上)了这些蛋白的正常生理水平(特别是血清中的IGF-1)以及
所测量的IGF-1R/IGF-1的平衡解离常数。参见例如Hankinson等人，1997。
时。在分开的管中，在室温下将12μg的hIGF-1R-His10(R&D systems)和460ng的人类
IGF-1(Chemicon International目录号GF006)混合(1∶1的蛋白∶蛋白比例)一小时。
用PBS冲洗结合了M13-C06的蛋白A/G，并用hIGF-1R-His10/IGF-1混合物在室温下培养
了30分钟。用PBS冲洗带有结合蛋白的蛋白A/G，接着用300μL的100mM甘氨酸(pH3.0)
洗脱结合蛋白。对于阴性对照，省去了12μg人类IGF-1R(1-902)-His10的加入。使用抗
人IGF-1抗体(兔抗人IGF-1生物素，USBiological目录号I7661-01B)和抗人IGF-1R
抗体(IGF-1Rα1H7，Santa Cruz Biotechnology目录号sc-461)作为一抗，接着用HRP
标记的链霉抗生素蛋白(Southern Biotech目录号7100-05)和HRP标记的山羊抗小鼠
IgG(USBiological目录号I1904-40J)作为二抗，通过Western印迹检测了洗脱的蛋白。为
了证明IGF-1/IGF-1R/M13-C06形成三元复合物的能力，用于此实验的IGF-1和IGF-1R的
浓度远远超出(＞15倍以上)了这些蛋白的正常生理水平(特别是血清中的IGF-1)以及
所测量的IGF-1R/IGF-1的平衡解离常数。参见例如Hankinson等人，1997。
[0727] iii.IGF-1R(1-462)-Fc的构建和针对全长受体胞外结构域的比较抗体结合研究
[0728] 以前发表了人类IGF-1R的IGF-1/IGF-2结合结构域L1-CR-L2(残基1-462)的构建(McKern 1997)。使用此信息，我们将人类IGF-1R残基1-462(与N末端信号序列一起)亚
克隆进相同的自制的PV90载体，其中所述PV90载体被用来产生全长人类胞外结构域(残
基1-903，hIGF-1R-Fc)。使用之前描述的方法促进了CHO中的表达(Brezinsky 2003)。通
过将其穿过如之前所述的用于其他Fc融合蛋白的蛋白A亲和柱来从CHO上清液中纯化蛋
白(Demarest2006)。蛋白构建体被表示为hIGF-1R(1-462)-Fc。
克隆进相同的自制的PV90载体，其中所述PV90载体被用来产生全长人类胞外结构域(残
基1-903，hIGF-1R-Fc)。使用之前描述的方法促进了CHO中的表达(Brezinsky 2003)。通
过将其穿过如之前所述的用于其他Fc融合蛋白的蛋白A亲和柱来从CHO上清液中纯化蛋
白(Demarest2006)。蛋白构建体被表示为hIGF-1R(1-462)-Fc。
[0729] 使用Biacore 3000通过SPR确定了M13-C06、M14-C03和M14-G11抗体结合hIGF-1R(1-462)-Fc和全长胞外结构域构建体hIGF-1R-Fc的能力。将仪器设置为25℃
而电泳缓冲液是HBS-EP(pH7.2)(Biacore，目录号BR-1001-88)。根据Biacore提供的方
案，使用标准的NHS/EDC-胺反应化学，将完全人类的抗体M13-C06、M14-C03和M14-G11
以～10,000RU固定在Biacore CM5研究级感应芯片(目录号BR-1000-14)表面上。为
了固定，在10mM醋酸(pH 4.0)缓冲液中将抗体稀释至40μg/mL。为了研究hIGF-1R-Fc
和hIGF-1R(1-462)-Fc与每种人类抗体的缔合和解离的相对动力学，将增加浓度的每种受
体构建体注射至感应芯片表面上。hIGF-1R-Fc浓度系列是在1.0nM至100nM范围内，而
hIGF-1R(1-462)-Fc浓度系列是在1.0nM至2μM范围内。用100mM甘氨酸(pH 2.0)可靠
地再生所有抗体表面。反复的再生未导致任何抗体表面的活性丧失。流速是20μl/min。
而电泳缓冲液是HBS-EP(pH7.2)(Biacore，目录号BR-1001-88)。根据Biacore提供的方
案，使用标准的NHS/EDC-胺反应化学，将完全人类的抗体M13-C06、M14-C03和M14-G11
以～10,000RU固定在Biacore CM5研究级感应芯片(目录号BR-1000-14)表面上。为
了固定，在10mM醋酸(pH 4.0)缓冲液中将抗体稀释至40μg/mL。为了研究hIGF-1R-Fc
和hIGF-1R(1-462)-Fc与每种人类抗体的缔合和解离的相对动力学，将增加浓度的每种受
体构建体注射至感应芯片表面上。hIGF-1R-Fc浓度系列是在1.0nM至100nM范围内，而
hIGF-1R(1-462)-Fc浓度系列是在1.0nM至2μM范围内。用100mM甘氨酸(pH 2.0)可靠
地再生所有抗体表面。反复的再生未导致任何抗体表面的活性丧失。流速是20μl/min。
[0730] b.结果
[0731] 如之前所述，证明了M13-C06对IGF-1和/或IGF-2与hIGF-1R-Fc结合的抑制。即使在饱和条件下，大多数抗体不完全抑制IGF-1或IGF-2与hIGF-1R-Fc的结合。特别
对于M13-C06，假设配体结合的抑制可能是非竞争性的或变构的。为了检验该假设，在存
在和不存在400nM的M13-C06抗体(超过抗体对hIGF-1R-His10的亲和力的～4000倍)
下，确定IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和力。通过SPR，使用抗His标签抗体接着注射增加
浓度的IGF-1(高达64nM)，将hIGF-1R-His10固定在芯片表面。在不存在和存在400nM的
M13-C06下，IGF-1对hIGF-1R-His10的结合是明显的。(数据未显示：表面等离子体共振证
明在不存在和存在400nM的M13-C06下IGF-1对hIGF-1R-His10的结合。SPR缔合阶段是在
1400-1800秒而解离阶段是在1800-3000秒。在M13-C06不存在下，IGF-1以KD＝17nM(ka＝
-5
2.4×10 /M*s)对hIGF-1R-His10结合。在400nM的M13-C06存在下，IGF-1以KD＝59nM(ka
-4
＝7.1×10 /M*s)对hIGF-1R-His10结合。)在M13-C06存在下，IGF-1与hIGF-1R-His10的
结合的动力学缔合速率常数减少大约3倍，表明M13-C06变构地减少配体对受体的亲和力。
对于M13-C06，假设配体结合的抑制可能是非竞争性的或变构的。为了检验该假设，在存
在和不存在400nM的M13-C06抗体(超过抗体对hIGF-1R-His10的亲和力的～4000倍)
下，确定IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和力。通过SPR，使用抗His标签抗体接着注射增加
浓度的IGF-1(高达64nM)，将hIGF-1R-His10固定在芯片表面。在不存在和存在400nM的
M13-C06下，IGF-1对hIGF-1R-His10的结合是明显的。(数据未显示：表面等离子体共振证
明在不存在和存在400nM的M13-C06下IGF-1对hIGF-1R-His10的结合。SPR缔合阶段是在
1400-1800秒而解离阶段是在1800-3000秒。在M13-C06不存在下，IGF-1以KD＝17nM(ka＝
-5
2.4×10 /M*s)对hIGF-1R-His10结合。在400nM的M13-C06存在下，IGF-1以KD＝59nM(ka
-4
＝7.1×10 /M*s)对hIGF-1R-His10结合。)在M13-C06存在下，IGF-1与hIGF-1R-His10的
结合的动力学缔合速率常数减少大约3倍，表明M13-C06变构地减少配体对受体的亲和力。
[0732] 通过使用大大高于IGF-1和M13-C06二者对hIGF-1R-His10的表观亲和力的浓度的M13-C06来进行hIGF-1R-His10和IGF-1的共同免疫沉淀，以产生这样的支持证据，即
M13-C06在对hIGF-1R-His10结合方面不直接与IGF-1竞争。Western印迹杂交分析证明，与
hIGF-1R-His10混合的～70-100％的IGF-1物质与M13-C06一起被牵出，从而证明M13-C06
和IGF-1与hIGF-1R-His10的共同衔接以形成三元复合物是可能的(数据未显示)。这些结
果证明在正常IGF-1血清浓度下M13-C06对IGF-1结合的抑制的变构性质，并表示M13-C06
的结合位点不与IGF-1R配体结合袋重叠。
M13-C06在对hIGF-1R-His10结合方面不直接与IGF-1竞争。Western印迹杂交分析证明，与
hIGF-1R-His10混合的～70-100％的IGF-1物质与M13-C06一起被牵出，从而证明M13-C06
和IGF-1与hIGF-1R-His10的共同衔接以形成三元复合物是可能的(数据未显示)。这些结
果证明在正常IGF-1血清浓度下M13-C06对IGF-1结合的抑制的变构性质，并表示M13-C06
的结合位点不与IGF-1R配体结合袋重叠。
[0733] 接下来，确定M13-C06是否结合IGF-1R的推定的配体结合结构域(L1-CR-L2)。产生含有融合至IgG1-Fc的N末端三个结构域
[0734] (残基1-462)的截短型受体，并使用表面等离子体共振(SPR)比较了它与全长受体胞外结构域构建体hIGF-1R-Fc相比结合M13-C06、M14-C03和M14-G11的能力。M14-G11
显示了与截短型受体相当的结合，而M13-C06和M14-C03的结合显著减少。(数据未显示：
测试了固定在表面的M13-C06、M14-C03和M14-G11抗体在2μM、100nM、30nM、10nM、5nM和
1nM的浓度范围内对hIGF-1R(1-903)Fc和截短的hIGF-1R(1-462)-Fc的结合。SPR缔合阶
段是在480-960秒而解离阶段是在960-1170秒。)对于M13-C06和M14-C03二者，残余结
合是明显的；然而，数据表示，这些抗体的至少相当一部分表位位于配体结合结构域之外的IGF-1R区域中。
显示了与截短型受体相当的结合，而M13-C06和M14-C03的结合显著减少。(数据未显示：
测试了固定在表面的M13-C06、M14-C03和M14-G11抗体在2μM、100nM、30nM、10nM、5nM和
1nM的浓度范围内对hIGF-1R(1-903)Fc和截短的hIGF-1R(1-462)-Fc的结合。SPR缔合阶
段是在480-960秒而解离阶段是在960-1170秒。)对于M13-C06和M14-C03二者，残余结
合是明显的；然而，数据表示，这些抗体的至少相当一部分表位位于配体结合结构域之外的IGF-1R区域中。
[0735] 总之，证明M13-C06抗体不通过与生长因子结合位点竞争性地相互作用而阻断IGF-1和IGF-2对IGF-1R的结合，相反结合于FnIII-I并变构地抑制IGF-l/IGF-2结合和
信号传导。认为FnIII-I促进IGF-1R和INSR二者的受体同二聚化(McKern 2006)，且在结
合配体后通过四级结构变化经跨膜区传递激活信号到C-末端酪氨酸激酶结构域。本实施
例的数据表示，M13-C06抗体抑制IGF-1/IGF-2诱导的导致下游受体信号传导的构象变化。
信号传导。认为FnIII-I促进IGF-1R和INSR二者的受体同二聚化(McKern 2006)，且在结
合配体后通过四级结构变化经跨膜区传递激活信号到C-末端酪氨酸激酶结构域。本实施
例的数据表示，M13-C06抗体抑制IGF-1/IGF-2诱导的导致下游受体信号传导的构象变化。
[0736] 实施例3.M13.C06抗体的初步表位定位
[0737] a.方法
[0738] i.表位定位突变
[0739] 用于探测IGF-1R上M13-C06抗体的表位的突变体选择是基于这样的观察结果，即M13-C06对小鼠IGF-1R的结合亲和力在Biacore和FRET结合实验中显著地减少或不可
检测。小鼠和人类IGF-1R有95％的一级氨基酸序列同一性。人类IGF-1R和人类INSR有
57％的同一性(73％相似性)。在小鼠和人类IGF-1R胞外结构域之间不同的33个残基(表
5)。这些残基中的20个是突变的靶，因为根据最近的INSR晶体结构(pdb编号2DTG，McKern
2006)，INSR胞外结构域中的同源位置被暴露于溶剂。通过StrucTools(http://molbio.
info.nih.gov/structbio/basic.html)使用 探针半径计算了可接近的表面积。还
将四个不在INSR结构中的另外的残基选来进行诱变，因为它们位于已被证明为对IGF-1/
IGF-2结合重要的FnIII-2结构域的无结构的环区域中(Whittaker 2001；Sorensen2004)。
选作表位定位研究的24个突变的列表显示在表6中。
检测。小鼠和人类IGF-1R有95％的一级氨基酸序列同一性。人类IGF-1R和人类INSR有
57％的同一性(73％相似性)。在小鼠和人类IGF-1R胞外结构域之间不同的33个残基(表
5)。这些残基中的20个是突变的靶，因为根据最近的INSR晶体结构(pdb编号2DTG，McKern
2006)，INSR胞外结构域中的同源位置被暴露于溶剂。通过StrucTools(http://molbio.
info.nih.gov/structbio/basic.html)使用 探针半径计算了可接近的表面积。还
将四个不在INSR结构中的另外的残基选来进行诱变，因为它们位于已被证明为对IGF-1/
IGF-2结合重要的FnIII-2结构域的无结构的环区域中(Whittaker 2001；Sorensen2004)。
选作表位定位研究的24个突变的列表显示在表6中。
[0740] 表5：人类和小鼠IGF-1R之间的氨基酸差异。根据公开可得的同源INSR胞外结构域的结构确定了每个残基位置的溶剂可接近性。以粗体/斜体显示的残基将它们的表面
积的超过30％暴露于溶剂，并被诱变以筛选M13-C06的IGF-1R表位。
积的超过30％暴露于溶剂，并被诱变以筛选M13-C06的IGF-1R表位。
[0741]
[0742]
[0743] 根据制造商的方案，使用Stratagene位点定向诱变试剂盒，通过将野生型hIGF-1R-Fc PV-90质粒诱变而构建了24突变体表位定位文库。通过我们自制的DNA测序装
置确认了每种突变体(或双突变体，在SD004、SD011、SD014、SD016和SD019文库成员的情
况下)向PV-90载体的并入。分别使用Qiagen小量制备试剂盒和Qiagen无内毒素大量抽
提试剂盒来小量制备和大量制备质粒。使用用来将可溶性蛋白分泌至培养基中的PolyFect
转染试剂盒(Qiagen)，以2×106个细胞/mL将200μg的每种突变体质粒瞬时转染进100mL
的HEK293T细胞中。在DMEM(Ivrine Scientific)、10％FBS(低IgG牛血清，Invitrogen-将
其通过20mL蛋白A柱子而进一步清除牛IgG)、37℃的CO2培养箱中培养细胞。7天后，通过
1200rpm离心并通过0.2μm过滤器过滤来收集含有每种IGF-1R-Fc突变体的上清液。将
上清液通过用1×PBS预平衡的1.2mL蛋白A琼脂糖FF柱来对每种突变体进行亲和提纯。
使用0.1M甘氨酸(pH 3.0)从柱子上将突变体洗脱，用1M的Tris(pH 8.5)、0.1％吐温-80
中和，并使用VivaSpin 6 MWCO 30,000离心浓缩装置(Sartorius，目录号VS0621)将其浓
缩至～300μL。
置确认了每种突变体(或双突变体，在SD004、SD011、SD014、SD016和SD019文库成员的情
况下)向PV-90载体的并入。分别使用Qiagen小量制备试剂盒和Qiagen无内毒素大量抽
提试剂盒来小量制备和大量制备质粒。使用用来将可溶性蛋白分泌至培养基中的PolyFect
转染试剂盒(Qiagen)，以2×106个细胞/mL将200μg的每种突变体质粒瞬时转染进100mL
的HEK293T细胞中。在DMEM(Ivrine Scientific)、10％FBS(低IgG牛血清，Invitrogen-将
其通过20mL蛋白A柱子而进一步清除牛IgG)、37℃的CO2培养箱中培养细胞。7天后，通过
1200rpm离心并通过0.2μm过滤器过滤来收集含有每种IGF-1R-Fc突变体的上清液。将
上清液通过用1×PBS预平衡的1.2mL蛋白A琼脂糖FF柱来对每种突变体进行亲和提纯。
使用0.1M甘氨酸(pH 3.0)从柱子上将突变体洗脱，用1M的Tris(pH 8.5)、0.1％吐温-80
中和，并使用VivaSpin 6 MWCO 30,000离心浓缩装置(Sartorius，目录号VS0621)将其浓
缩至～300μL。
[0744] ii.IGF-1R突变体的Western印迹分析
[0745] 根据制造商标准的方案，使用Xcell SureLock Mini Cell(Invitrogen目录号EI0001)将hIGF-1R-Fc突变体样品在4-20％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen目录号
EC6028)上电泳。根据制造商标准的方案，使用iBlot干印迹系统(Invitrogen目录号
IB1001)和Transfer Stacks(Invitrogen目录号IB3010-01或3010-02)将样品转移至硝
化纤维素。在25ml的PBST中用5mg/ml脱脂奶粉将膜在4℃下阻断过夜。阻断后，用25ml
的PBST在室温下将膜冲洗一次5min。用第一抗IGF-1Rβ抗体(Santa Cruz Biotechnology
目录号sc-9038)在室温下以1∶100在10ml的PBST中将膜孵育1hr。接下来用25ml
的PBST将膜冲洗三次5min。为了检测，用第二个轭合至HRP的山羊抗兔IgG-Fc抗体(US
Biological目录号I1904-40J)在室温下以1∶1000的稀释在10ml的PBST中将膜孵育
1hr。用25ml的PBST将膜冲洗三次5min，接着用25ml的PBST冲洗一次20min。根据制造商
标准的方案，使用Amersham ECL Western印迹分析系统(GE Healthcare目录号RPN2108)
检测了蛋白条带。
EC6028)上电泳。根据制造商标准的方案，使用iBlot干印迹系统(Invitrogen目录号
IB1001)和Transfer Stacks(Invitrogen目录号IB3010-01或3010-02)将样品转移至硝
化纤维素。在25ml的PBST中用5mg/ml脱脂奶粉将膜在4℃下阻断过夜。阻断后，用25ml
的PBST在室温下将膜冲洗一次5min。用第一抗IGF-1Rβ抗体(Santa Cruz Biotechnology
目录号sc-9038)在室温下以1∶100在10ml的PBST中将膜孵育1hr。接下来用25ml
的PBST将膜冲洗三次5min。为了检测，用第二个轭合至HRP的山羊抗兔IgG-Fc抗体(US
Biological目录号I1904-40J)在室温下以1∶1000的稀释在10ml的PBST中将膜孵育
1hr。用25ml的PBST将膜冲洗三次5min，接着用25ml的PBST冲洗一次20min。根据制造商
标准的方案，使用Amersham ECL Western印迹分析系统(GE Healthcare目录号RPN2108)
检测了蛋白条带。
[0746] iii.IGF-1R-Fc突变体文库的Biacore分析
[0747] mIGF-1R-Fc和hIGF-1R-Fc二者都以高表观亲和力结合至上述M13-C06、M14-C03和M14-G11感应芯片表面，这是由于它们高度的多价性质，其中所述多价性质是由并入两
个不同的同二聚体区域(IGF-1R和IgG1-Fc)所诱导的。为了区别hIGF-1R-Fc对M13-C06
实际的高亲和力结合与mIGF-1R-Fc对M13-C06的低亲和力结合，将受体-Fc融合物捕获在
M13-C06感应芯片表面，接下来是另外的可溶性M13-C06Fab结合事件。以1μl/min流速
注射60μl的亲和提纯的、浓缩的物质而将受体-Fc构建体捕获在M13-C06芯片表面(按
上述制备的)。在完成了受体-Fc装入步骤之后，将流速提高到5μl/min。在装入每种受
体-Fc构建体之后，注射(50μL)浓度为10nM、3nM和1nM的M13-C06 Fab。在每张感应图
的最后，将流速提高到30μl/min，并以2×10μL注射0.1M的甘氨酸(pH 2)来再生芯片表
面。
个不同的同二聚体区域(IGF-1R和IgG1-Fc)所诱导的。为了区别hIGF-1R-Fc对M13-C06
实际的高亲和力结合与mIGF-1R-Fc对M13-C06的低亲和力结合，将受体-Fc融合物捕获在
M13-C06感应芯片表面，接下来是另外的可溶性M13-C06Fab结合事件。以1μl/min流速
注射60μl的亲和提纯的、浓缩的物质而将受体-Fc构建体捕获在M13-C06芯片表面(按
上述制备的)。在完成了受体-Fc装入步骤之后，将流速提高到5μl/min。在装入每种受
体-Fc构建体之后，注射(50μL)浓度为10nM、3nM和1nM的M13-C06 Fab。在每张感应图
的最后，将流速提高到30μl/min，并以2×10μL注射0.1M的甘氨酸(pH 2)来再生芯片表
面。
[0748] iv.为了IGF-1R-Fc突变体筛选的时间分辨的荧光共振能量转移(tr-FRET)测定
[0749] 从0.25-0.5μg(25μl) 开 始 的 连 续 稀 释 的 突 变 受 体 与0.05μg 的IGF1R-His10-Cy5(12.5μl)和0.00375μg的Eu∶C06(12.5μl)在384孔微量滴定板(白
色，来自Costar)中混合。IGF1R-His10-Cy5的轭合水平是6.8∶1 Cy5∶IGF1R-His10，而
Eu-C06是10.3∶1 Eu∶C06。每种样品的总体积是50μl。在室温下的板搅动器上将板
2
孵育1hr。在Wallac Victor 荧光板读数器(Perkin Elmer)上使用LANCE方案以激发波
长340nm和发射波长665nm进行荧光测量。将所有数据拟合至单位点结合模型，并从其中
确定对应的IC50值。
色，来自Costar)中混合。IGF1R-His10-Cy5的轭合水平是6.8∶1 Cy5∶IGF1R-His10，而
Eu-C06是10.3∶1 Eu∶C06。每种样品的总体积是50μl。在室温下的板搅动器上将板
2
孵育1hr。在Wallac Victor 荧光板读数器(Perkin Elmer)上使用LANCE方案以激发波
长340nm和发射波长665nm进行荧光测量。将所有数据拟合至单位点结合模型，并从其中
确定对应的IC50值。
[0750] 鼠IGF-1R不结合M13-C06抗体的事实用于设计hIGF-1R-Fc中小鼠突变的文库以评估IGF-1R上M13-C06结合位点的位置。被测的hIGF-1R中的各种突变被显示在表6中。
使用Western印迹分析来确认每种hIGF-1R-Fc突变体的表达并发展出将每种突变体蛋白
的相对浓度近似的标准曲线；其使用纯化的hIGF-1R-Fc作为阳性对照(数据未显示)。
使用Western印迹分析来确认每种hIGF-1R-Fc突变体的表达并发展出将每种突变体蛋白
的相对浓度近似的标准曲线；其使用纯化的hIGF-1R-Fc作为阳性对照(数据未显示)。
[0751] 表6：突变对IGF-1R与M13-C06结合的影响。SD015是粗体的，因为它是在这两种测定形式中唯一显示很少至没有对M13-C06结合的残基。ND＝未确定。
[0752]
[0753]
[0754] 使用SPR和tr-FRET来筛选抑制IGF-1R-Fc与M13-C06结合的突变。除了SD015突变体，所有突变体IGF-1R构建体在SPR实验中显示了M13-C06结合活性或M13-C06 Fab
结合活性。参见：图12；表6；以及数据未显示(使用竞争性抑制分析来建立结合曲线，以
便通过增加未标记的hIGF1R-Fc(SDWT)、小鼠IGF1R-Fc(mIGF1R-Fc)和突变体hIGF1R-Fc构
建体的浓度来取代结合至Cy5标记的IGF1R的Eu-M13-C06)。
结合活性。参见：图12；表6；以及数据未显示(使用竞争性抑制分析来建立结合曲线，以
便通过增加未标记的hIGF1R-Fc(SDWT)、小鼠IGF1R-Fc(mIGF1R-Fc)和突变体hIGF1R-Fc构
建体的浓度来取代结合至Cy5标记的IGF1R的Eu-M13-C06)。
[0755] 由于Western印迹的表达和定量上的自然差异，在使用tr-FRET确定的IC50值和使用SPR确定的相对结合强度上存在一些偏差；然而，SD015是在这两种测定中都几乎未
显示对M13-C06的结合活性并且与在mIGF-1R-Fc对照上确定的结果平行的唯一突变体。
His464在一级氨基酸序列中位于截短型hIGF-1R-Fc构建体(即hIGF-1R(1-462)-Fc)C末
端的C末端方向2个氨基酸处。M13-C06对截短的hIGF-1R(1-462)的残留结合活性表明，
M13-C06结合表位最低限度地包括残基Val462-His464。抗体-表位结合相互作用很可能
包括另外的残基，因为证据表明，M13-C06的表位是构象依赖性的。显著地，然而，据预测残基Val462和His464位于FnIII-1结构域的外表面(图1)。
显示对M13-C06的结合活性并且与在mIGF-1R-Fc对照上确定的结果平行的唯一突变体。
His464在一级氨基酸序列中位于截短型hIGF-1R-Fc构建体(即hIGF-1R(1-462)-Fc)C末
端的C末端方向2个氨基酸处。M13-C06对截短的hIGF-1R(1-462)的残留结合活性表明，
M13-C06结合表位最低限度地包括残基Val462-His464。抗体-表位结合相互作用很可能
包括另外的残基，因为证据表明，M13-C06的表位是构象依赖性的。显著地，然而，据预测残基Val462和His464位于FnIII-1结构域的外表面(图1)。
[0756] 在试图表征M13-C06表位的范围(即462-464周围的哪些残基对于抗体结合和活性是重要的)时，采用了结构建模方法。人类IGF-1R和人类INSR共享57％同一性(73％
相似性)和相似的三级结构。之前对X射线晶体结构蛋白抗原：抗体结合表面的分析暗示，
平均结合表面为 (平方阿姆斯特朗)并且到结合表位的中心的半径大概为
(Davies 1996)。使用INSR的同源胞外结构域的X射线晶体结构(pdb编号2DTG，(McKern
2006))，通过将IGF-1R残基V462至H464定位到INSR残基L472和K474来计算FnIII-1
结构域表面上在残基462-464的 半径之内的残基。对于 之内的任何原子至原
子的距离应用距离截止，而从L472和K474到表面块中的每个残基的Cα至Cα的距离计
算了平均距离。关于Cα至Cα的距离超过 而侧链在 截止范围内的残基，计算
的平均距离被列为 对于M13-C06结合和活性可能重要的残基列在表7中。
相似性)和相似的三级结构。之前对X射线晶体结构蛋白抗原：抗体结合表面的分析暗示，
平均结合表面为 (平方阿姆斯特朗)并且到结合表位的中心的半径大概为
(Davies 1996)。使用INSR的同源胞外结构域的X射线晶体结构(pdb编号2DTG，(McKern
2006))，通过将IGF-1R残基V462至H464定位到INSR残基L472和K474来计算FnIII-1
结构域表面上在残基462-464的 半径之内的残基。对于 之内的任何原子至原
子的距离应用距离截止，而从L472和K474到表面块中的每个残基的Cα至Cα的距离计
算了平均距离。关于Cα至Cα的距离超过 而侧链在 截止范围内的残基，计算
的平均距离被列为 对于M13-C06结合和活性可能重要的残基列在表7中。
[0757] 表7.IGF-1R中被预测为对M13-C06结合和活性重要的残基。残基462和464用斜体表示，因为这些代表预测的IGF-1R结合表位的中心，而且实验数据证明这些残基在
M13-C06结合中的重要性。
M13-C06结合中的重要性。
[0758]
[0759]E490 0.37206 H 480 9.18 5.84 7.51
Y492 0.313493 Y 482 10.45 11.24 10.845
W493 0.87318 R 483 11.17 13.03 12.1
P495 0.824499 P 485 14 14 14
D496 1 D 486 14 14 14
E509 0.520884 E 499 14 14 14
Q513 0.515108 K 503 14 14 14
N514 0.68983 N 504 14 14 14
V515 0.644094 V 505 14 14 14
K544 0.865258 N 529 14 14 14
S545 0.699624 K 530 14 14 14
Q546 1 D 531 14 14 14
N547 0.87424 V 532 14 14 14
H548 0.406778 E 533 14 10.89 12.445
W551 0.523908 I 536 14 14 14
R577 0.41477 H 563 14 14 14
T578 0.43254 I 564 13.19 14 13.595
Y579 0.603591 R 565 9.54 14 11.77
K582 0.34027 K 568 5.54 8.98 7.26
D584 0.602475 E 570 7.01 7.4 7.205
I585 0.340515 I 571 10.79 10 10.395
I586 0.308085 L 572 13.04 10.49 11.765
Y587 0.580196 Y 573 14 13.65 13.825
Y492 0.313493 Y 482 10.45 11.24 10.845
W493 0.87318 R 483 11.17 13.03 12.1
P495 0.824499 P 485 14 14 14
D496 1 D 486 14 14 14
E509 0.520884 E 499 14 14 14
Q513 0.515108 K 503 14 14 14
N514 0.68983 N 504 14 14 14
V515 0.644094 V 505 14 14 14
K544 0.865258 N 529 14 14 14
S545 0.699624 K 530 14 14 14
Q546 1 D 531 14 14 14
N547 0.87424 V 532 14 14 14
H548 0.406778 E 533 14 10.89 12.445
W551 0.523908 I 536 14 14 14
R577 0.41477 H 563 14 14 14
T578 0.43254 I 564 13.19 14 13.595
Y579 0.603591 R 565 9.54 14 11.77
K582 0.34027 K 568 5.54 8.98 7.26
D584 0.602475 E 570 7.01 7.4 7.205
I585 0.340515 I 571 10.79 10 10.395
I586 0.308085 L 572 13.04 10.49 11.765
Y587 0.580196 Y 573 14 13.65 13.825
[0760] 发表的文章已经显示，识别残基440-586的抗体对IGF-1结合可以是抑制性的和激动性的(Soos 1992；Keyhanfar 2007)。440-586代表着具有可被抗IGF-1R抗体接近的许
多潜在的非重叠表面的所有L2和FnIII-1。本实施例提供了IGF-1R的抑制性表位被定位
在特定残基的何处的第一个研究。最近的INSR结构与已知抑制胰岛素与它的受体结合的
抗INSR抗体共同结晶(Soos 1986；McKern2006)。与IGF-1R的His464同源的残基(INSR
的K474)是该抗体与INSR结合表面的一部分。M13-C06与拮抗性的抗INSR抗体共享相似
的抑制IGF-1与IGF-1R结合的机制是可能。
多潜在的非重叠表面的所有L2和FnIII-1。本实施例提供了IGF-1R的抑制性表位被定位
在特定残基的何处的第一个研究。最近的INSR结构与已知抑制胰岛素与它的受体结合的
抗INSR抗体共同结晶(Soos 1986；McKern2006)。与IGF-1R的His464同源的残基(INSR
的K474)是该抗体与INSR结合表面的一部分。M13-C06与拮抗性的抗INSR抗体共享相似
的抑制IGF-1与IGF-1R结合的机制是可能。
[0761] 实施例4.抗IGF-1R抗体的交叉阻断研究
[0762] a.材料
[0763] 如以前所述地亚克隆、表达和纯化抗IGF-1R抗体M13-C06、M14-G11、M13-C06、M14-C03和P1E2(参见美国专利申请第11/727,887号，通过引用并入本文)。商业上可得
的抑制性IGF-1R抗体(αIR3，(Jacobs 1986))购自Calbiochem(目录号GR11LSP5)。在
2+
毕赤酵母中重组地产生带有N末端八组氨酸标签的人类IGF-1和IGF-2，并使用Ni -NTA
琼脂糖纯化。标为hIGF-1R(1-902)-His10的含有C末端10组氨酸标签的重组可溶性人
类IGF-1R胞外结构域构建体购自R&D systems(目录号305-GR-050)。构建了人类和小鼠
IGF-1R(1-903)-IgG1-Fc融合蛋白并使用标准的蛋白A色谱法纯化。
的抑制性IGF-1R抗体(αIR3，(Jacobs 1986))购自Calbiochem(目录号GR11LSP5)。在
2+
毕赤酵母中重组地产生带有N末端八组氨酸标签的人类IGF-1和IGF-2，并使用Ni -NTA
琼脂糖纯化。标为hIGF-1R(1-902)-His10的含有C末端10组氨酸标签的重组可溶性人
类IGF-1R胞外结构域构建体购自R&D systems(目录号305-GR-050)。构建了人类和小鼠
IGF-1R(1-903)-IgG1-Fc融合蛋白并使用标准的蛋白A色谱法纯化。
[0764] b.方法
[0765] (i)抗体：抗体交叉阻断研究
[0766] 使用生物素酰化型的抗体和hIGF-1R-Fc确定了各种抗体阻断M13-C06或M14-G11结合hIGF-1R的能力。简要地说，室温下在96孔透明MaxiSorp板(Nunc)中用1×PBS中
50μL的2μg/mL的hIGF-1R-Fc包被每孔2小时(RT，无振荡)。用1×PBS洗涤板并在
2-8℃下使用PBS/1％BSA溶液阻断过夜。洗涤板并用生物素酰化的M13-C06或生物素酰化
的M14-G11(80ng/mL)和抑制剂抗体的100μL混合物在RT下孵育1小时。将抑制剂抗体
从40μg/mL连续稀释(5倍稀释)至3ng/mL。根据制造商提供的实验方案，使用EZ-Link
Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce目录号21335)将M13-C06和M14-G11生物素酰化。通过用
生物素酰化的M13-C06或生物素酰化的M14-G11将非IGF-1R特异性的IgG4同种型对照抗
体连续稀释来进行对照。洗涤板并在RT下与100μL/孔的链霉抗生素蛋白-HRP(1∶4000
稀释在阻断缓冲液中，Southern Biotech目录号7100-05)一起振荡1小时。洗涤板并将
100μL/孔的SureBlue ReserveTMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，目录号53-00-01)
加入孔中。在650nm使用Wallac 1420-041 Multilabel Counter板读数器每5分钟对吸
光度读数以检测生物素酰化的M13-C06或M14-G11的存在。
50μL的2μg/mL的hIGF-1R-Fc包被每孔2小时(RT，无振荡)。用1×PBS洗涤板并在
2-8℃下使用PBS/1％BSA溶液阻断过夜。洗涤板并用生物素酰化的M13-C06或生物素酰化
的M14-G11(80ng/mL)和抑制剂抗体的100μL混合物在RT下孵育1小时。将抑制剂抗体
从40μg/mL连续稀释(5倍稀释)至3ng/mL。根据制造商提供的实验方案，使用EZ-Link
Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce目录号21335)将M13-C06和M14-G11生物素酰化。通过用
生物素酰化的M13-C06或生物素酰化的M14-G11将非IGF-1R特异性的IgG4同种型对照抗
体连续稀释来进行对照。洗涤板并在RT下与100μL/孔的链霉抗生素蛋白-HRP(1∶4000
稀释在阻断缓冲液中，Southern Biotech目录号7100-05)一起振荡1小时。洗涤板并将
100μL/孔的SureBlue ReserveTMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，目录号53-00-01)
加入孔中。在650nm使用Wallac 1420-041 Multilabel Counter板读数器每5分钟对吸
光度读数以检测生物素酰化的M13-C06或M14-G11的存在。
[0767] 使用“Zenon-Fab-HRP”标记的αIR3和hIGF-1R-Fc确定了各种抗体阻断鼠αIR3的能力。如制造商所描述，αIR(IgG1)是Zenon -Fab-HRP标记的(Invitrogen目录号
Z25054)。简要地说，RT下在96孔透明MaxiSorp板(Nunc)中用50μL 1×PBS中的2μg/
mL的hIGF-1R-Fc包被每个孔2小时(无振荡)。用1×PBS洗涤板并在2-8℃使用PBS/1％
BSA溶液阻断过夜。洗涤板并用Zenon标记的αIR3(40ng/mL)和抑制剂抗体的100μL混
合物在RT孵育1小时。将抑制剂抗体从40μg/mL连续稀释(5倍稀释)至3ng/mL。通过
用Zenon标记的αIR3将非IGF-1R特异性的IgG4同种型对照抗体连续稀释来进行对照抑
制。洗涤板并将100μL/孔的SureBlueReserve TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，目
录号53-00-01)加入孔中。在650nm使用Wallac 1420-041 Multilabel Counter板读数
器每5分钟对吸光度读数以检测Zenon标记的αIR3。
Z25054)。简要地说，RT下在96孔透明MaxiSorp板(Nunc)中用50μL 1×PBS中的2μg/
mL的hIGF-1R-Fc包被每个孔2小时(无振荡)。用1×PBS洗涤板并在2-8℃使用PBS/1％
BSA溶液阻断过夜。洗涤板并用Zenon标记的αIR3(40ng/mL)和抑制剂抗体的100μL混
合物在RT孵育1小时。将抑制剂抗体从40μg/mL连续稀释(5倍稀释)至3ng/mL。通过
用Zenon标记的αIR3将非IGF-1R特异性的IgG4同种型对照抗体连续稀释来进行对照抑
制。洗涤板并将100μL/孔的SureBlueReserve TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，目
录号53-00-01)加入孔中。在650nm使用Wallac 1420-041 Multilabel Counter板读数
器每5分钟对吸光度读数以检测Zenon标记的αIR3。
[0768] (ii)IGF-1/IGF-2配体：抗体交叉阻断研究
[0769] 使用Biacore3000通过SPR确定IGF-1和IGF-2阻断hIGF-1R-His对M13-C06和M14-G11的结合的能力。使用制造商(Biacore)的标准的NHS/EDC-化学反应实验方案，将
以10mM乙酸盐pH 4.0中40μg/mL的M13-C06和M14-G11以～2,000RU固定在Biacore
CM5研究级感应芯片(目录号BR-1000-14)上。为了检验IGF-1或IGF-2抑制hIGF-1R-His
对固定化的抗体表面结合的能力，在浓度从500pM到4μM变化的IGF-1或IGF-2存在时
将160μL 40nM hIGF-1R-His以20μL/min注射至感应芯片表面上。另外，抗IGF-1R抗体
M13-C06和M14-G11以及其抗体Fab用于研究其阻断IGF-1R对相同感应芯片表面结合的能
力。如用于IGF-1和IGF-2阻断实验的进行相似抗体连续稀释(在hIGF-1R-His存在下)。
通过三次注射10μL的0.1M甘氨酸、pH 2.0实现再生。hIGF-1R-His对每种抗体的100％
结合由信号高于在质量运输限制性条件下注射60秒的基线确定。在60秒时基于溶液中存
在IGF-1或IGF-2的信号衰减用作配体-介导的阻断抗体结合的量度。
以10mM乙酸盐pH 4.0中40μg/mL的M13-C06和M14-G11以～2,000RU固定在Biacore
CM5研究级感应芯片(目录号BR-1000-14)上。为了检验IGF-1或IGF-2抑制hIGF-1R-His
对固定化的抗体表面结合的能力，在浓度从500pM到4μM变化的IGF-1或IGF-2存在时
将160μL 40nM hIGF-1R-His以20μL/min注射至感应芯片表面上。另外，抗IGF-1R抗体
M13-C06和M14-G11以及其抗体Fab用于研究其阻断IGF-1R对相同感应芯片表面结合的能
力。如用于IGF-1和IGF-2阻断实验的进行相似抗体连续稀释(在hIGF-1R-His存在下)。
通过三次注射10μL的0.1M甘氨酸、pH 2.0实现再生。hIGF-1R-His对每种抗体的100％
结合由信号高于在质量运输限制性条件下注射60秒的基线确定。在60秒时基于溶液中存
在IGF-1或IGF-2的信号衰减用作配体-介导的阻断抗体结合的量度。
[0770] (iii)单种抗体和抗体组合对IGF-1/IGF-2配体的阻断
[0771] 根据制造商提供的实验方案，使用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce目录号21335)将hIGF-1R-Fc生物素酰化。以100μL/孔将5μg/ml的生物素酰化的人类
IGF-1R-Fc(NB12453-9)加入用SigmaScreen链霉抗生素蛋白包被的96孔板(Sigma目录号
M5432-5EA)的孔中，并在2-8℃下孵育过夜。然后用200μL/孔的PBST将板洗涤四次。在含
1.0mg/ml BSA的PBST中制备320nM的人类IGF-1His(NB12111-85)。在320nM的IGF-1His
溶液中制备连续稀释的抗IGF-1R抗体M13-C06(NB11054-82)、M14-C03(NB11055-147)、
M14-G11(NB11016-120)、P1E2(DE12嵌合体，包含衍生自P1E2杂交瘤细胞系表达的抗体
的小鼠VH和VL融合到人类IgG4agly/κ恒定结构域)和αIR3(Calbiochem，目录号
GR11LSP5)。将M13-C06和M14-C03从1.3μM稀释至10pM，将M14-G11从5.2μM稀释至
10pM，并将P1E2和αIR3二者从2.6μM稀释至10pM。在含1.0mg/ml BSA的PBST中制
备320nM的人类IGF-2His(NB12110-10)。使用320nM的IGF-2His溶液将抗体连续稀释
(M13-C06和M14-C03从1.3μM稀释至5pM，M14-G11和αIR3从5.2μM稀释至5pM，而P1E2
从5.2μM稀释至20pM)。以100μL/孔两份地将稀释液加入板中，并在RT下孵育板1小
时。然后以200μL/孔PBST洗涤板四次。在PBST中1∶1000地稀释HRP轭合的抗His
标签抗体(五-His HRP轭合物，QIAGEN，目录号1014992)并以100μL/孔加入板中，在RT
下孵育板一小时。然后以200μL/孔PBST洗涤板四次。观察到期望的反应后，将100μL/
孔的SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，目录号53-00-01)加入板
中，接着加入100μL/孔的1％磷酸。确定每孔在450nm处的吸光度，将结果归一化并针对
抗体浓度的对数作图。
IGF-1R-Fc(NB12453-9)加入用SigmaScreen链霉抗生素蛋白包被的96孔板(Sigma目录号
M5432-5EA)的孔中，并在2-8℃下孵育过夜。然后用200μL/孔的PBST将板洗涤四次。在含
1.0mg/ml BSA的PBST中制备320nM的人类IGF-1His(NB12111-85)。在320nM的IGF-1His
溶液中制备连续稀释的抗IGF-1R抗体M13-C06(NB11054-82)、M14-C03(NB11055-147)、
M14-G11(NB11016-120)、P1E2(DE12嵌合体，包含衍生自P1E2杂交瘤细胞系表达的抗体
的小鼠VH和VL融合到人类IgG4agly/κ恒定结构域)和αIR3(Calbiochem，目录号
GR11LSP5)。将M13-C06和M14-C03从1.3μM稀释至10pM，将M14-G11从5.2μM稀释至
10pM，并将P1E2和αIR3二者从2.6μM稀释至10pM。在含1.0mg/ml BSA的PBST中制
备320nM的人类IGF-2His(NB12110-10)。使用320nM的IGF-2His溶液将抗体连续稀释
(M13-C06和M14-C03从1.3μM稀释至5pM，M14-G11和αIR3从5.2μM稀释至5pM，而P1E2
从5.2μM稀释至20pM)。以100μL/孔两份地将稀释液加入板中，并在RT下孵育板1小
时。然后以200μL/孔PBST洗涤板四次。在PBST中1∶1000地稀释HRP轭合的抗His
标签抗体(五-His HRP轭合物，QIAGEN，目录号1014992)并以100μL/孔加入板中，在RT
下孵育板一小时。然后以200μL/孔PBST洗涤板四次。观察到期望的反应后，将100μL/
孔的SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，目录号53-00-01)加入板
中，接着加入100μL/孔的1％磷酸。确定每孔在450nm处的吸光度，将结果归一化并针对
抗体浓度的对数作图。
[0772] c.结果
[0773] (i)抗IGF-1R抗体的交叉阻断特性
[0774] 在IGF-1R的ELISA结合测定中检验了所有抗体互相交叉阻断的能力(表8)。在测定中M13-C06和M14-C03互相交叉阻断，但在测定中针对P1E2、αIR3或M14-G11没有
交叉阻断活性。在测定中P1E2和αIR3二者都能完全交叉阻断标记的αIR3和M14-G11。
M14-G11显示了针对αIR3的中等的交叉阻断活性，这表明M14-G11的表位可能重叠，但不
与αIR3和P1E2的表位相同。
交叉阻断活性。在测定中P1E2和αIR3二者都能完全交叉阻断标记的αIR3和M14-G11。
M14-G11显示了针对αIR3的中等的交叉阻断活性，这表明M14-G11的表位可能重叠，但不
与αIR3和P1E2的表位相同。
[0775] 表8.抗体交叉阻断实验的概述结果
[0776]抗体抑制剂 M13-C06交叉阻 M14-G11交叉阻 αIR3交叉阻断
断 断
M13-C06 +++++ - -
M14-C03 +++++ - -
M14-G11 - +++++ +++
αIR3 - +++++ +++++
P1E2 - +++++ +++++
断 断
M13-C06 +++++ - -
M14-C03 +++++ - -
M14-G11 - +++++ +++
αIR3 - +++++ +++++
P1E2 - +++++ +++++
[0777] +++++＝相对于自身的抗体结合竞争(90-100％)
[0778] ++++＝70-90％竞争
[0779] +++＝50-70％竞争
[0780] ++＝30-50％竞争
[0781] +＝10-30％竞争
[0782] +/-＝0-10％竞争
[0783] N/A＝结果不可得
[0784] 使用基于SPR的测定获得相似的交叉阻断结果(图13A、B)。交叉阻断研究在40nMIGF-1R浓度(比M13-C06和M14-G11对IGF-1R的亲和力高～400倍)进行。因此，每种抗
体能够完全交叉阻断自身的浓度应是抗体/IGF-1R化学计量的量度。M13-C06和M14-G11
二者分别在40nM和80nM抗体和Fab浓度达到自身交叉阻断饱和(图13A、B；Fab数据未显
示)。数据表示，两种抗体识别IGF-1R同二聚体上的两个位点。尽管有两个位点，每种抗体的表位对于分子上特定结构位点可能是唯一的，其由于受体的同二聚性质而出现两次。进
行分析性尺寸排阻/静态光散射实验以证明hIGF-1R-His胞外结构域构建体在溶液中是同
二聚体。
体能够完全交叉阻断自身的浓度应是抗体/IGF-1R化学计量的量度。M13-C06和M14-G11
二者分别在40nM和80nM抗体和Fab浓度达到自身交叉阻断饱和(图13A、B；Fab数据未显
示)。数据表示，两种抗体识别IGF-1R同二聚体上的两个位点。尽管有两个位点，每种抗体的表位对于分子上特定结构位点可能是唯一的，其由于受体的同二聚性质而出现两次。进
行分析性尺寸排阻/静态光散射实验以证明hIGF-1R-His胞外结构域构建体在溶液中是同
二聚体。
[0785] (ii)配体：抗体交叉阻断特性
[0786] SPR测定中，IGF-1和IGF-2都减少hIGF-1R-His结合到M13-C06和M14-G11表面的能力(图13C和D)。即使在饱和水平的IGF-1和IGF-2，IGF-1R对M13-C06表面结合的
减少仅是～20-25％，说明配体变构地减少IGF-1R对M13-C06的亲和力。IGF-1和IGF-2
抑制曲线对于IGF-1R对M14-G11表面的结合从不达到饱和，说明可能的直接抗体/配体竞
争。IGF-1和IGF-2结合受体的化学计量是1∶1，即使受体中存在两个可能的结合位点。
结合这些位点之一的配体表现为排除识别受体相对侧的第二位点的能力。IGF-1化学计量
结果与公开的文献一致(Jannson M.等人，J.Biol.Chem.，(1997)8189-8197)。
减少仅是～20-25％，说明配体变构地减少IGF-1R对M13-C06的亲和力。IGF-1和IGF-2
抑制曲线对于IGF-1R对M14-G11表面的结合从不达到饱和，说明可能的直接抗体/配体竞
争。IGF-1和IGF-2结合受体的化学计量是1∶1，即使受体中存在两个可能的结合位点。
结合这些位点之一的配体表现为排除识别受体相对侧的第二位点的能力。IGF-1化学计量
结果与公开的文献一致(Jannson M.等人，J.Biol.Chem.，(1997)8189-8197)。
[0787] (iii)抗IGF-1R抗体的IGF-1和IGF-2阻断特性
[0788] 在基于ELISA的竞争测定中检验五种抗体(M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和αIR3)阻断IGF-1和IGF-2对IGF-1R结合的能力。M13-C06和M14-C03阻断IGF-1和
IGF-2二者对IGF-1R的结合(图13A-D)。通过增加测定中配体浓度，可恢复部分IGF-1或
IGF-2结合，即使在饱和水平的M13-C06或M14-C03存在下。另外，M13-C06和M14-C03抑
制曲线的中点(IC50)独立于测定中IGF-1或IGF-2的浓度。两种结果说明配体阻断的变构
机制。在测定中在存在和不存在饱和水平的M13-C06时滴定人类IGF-1His允许我们测量配
体对hIGF-1R-Fc的表观亲和力丧失。该数据说明，M13-C06抗体的存在导致人类IGF-1His
对hIGF-1R-Fc的亲和力的大约50倍丧失(图14A)。P1E2和αIR3还变构地阻断IGF-1，
但对IGF-2对IGF-1R的结合几乎无作用(图13A-D)。对αIR3的这些结果与公开的结果
一致(Jacobs 1986)。M14-G11表现为以竞争性方式阻断IGF-1和IGF-2二者(图13A-D)。
M14-G11的IC50取决于测定中使用的IGF-1浓度。饱和水平的M14-G11设法阻断100％的
两种配体，虽然在比变构阻断剂的IC50更高的M14-G11浓度。
IGF-2二者对IGF-1R的结合(图13A-D)。通过增加测定中配体浓度，可恢复部分IGF-1或
IGF-2结合，即使在饱和水平的M13-C06或M14-C03存在下。另外，M13-C06和M14-C03抑
制曲线的中点(IC50)独立于测定中IGF-1或IGF-2的浓度。两种结果说明配体阻断的变构
机制。在测定中在存在和不存在饱和水平的M13-C06时滴定人类IGF-1His允许我们测量配
体对hIGF-1R-Fc的表观亲和力丧失。该数据说明，M13-C06抗体的存在导致人类IGF-1His
对hIGF-1R-Fc的亲和力的大约50倍丧失(图14A)。P1E2和αIR3还变构地阻断IGF-1，
但对IGF-2对IGF-1R的结合几乎无作用(图13A-D)。对αIR3的这些结果与公开的结果
一致(Jacobs 1986)。M14-G11表现为以竞争性方式阻断IGF-1和IGF-2二者(图13A-D)。
M14-G11的IC50取决于测定中使用的IGF-1浓度。饱和水平的M14-G11设法阻断100％的
两种配体，虽然在比变构阻断剂的IC50更高的M14-G11浓度。
[0789] 具有唯一和不重叠表位的抗体的组合导致抗IGF-1R抗体的阻断效价(IC50)增加以及表观完全配体阻断(图15B和C)。已显示M13-C06结合FnIII-1结构域上与配体-结
合位点相对和远离的大的表面-与变构阻断机制一致。M14-G11和αIR3结合到CRR和L2
结构域上的重叠表面。M14-G11的表位位于CRR结构域的表面上，与配体结合位点紧邻-与
其表观竞争性配体-阻断行为一致。αIR3的表位位于与配体结合位点正交的表面-与其
表现的变构阻断行为一致。变构抑制剂M13-C06与竞争性抑制剂M14-G11或变构抑制剂
αIR3的组合导致实质上100％地阻断IGF-1和IGF-2，IC50值低于分离状态的抗体的IC50
值。表示抑制性抗IGF-1R抗体组合的协同活性的该数据显示在表9和表10)。
合位点相对和远离的大的表面-与变构阻断机制一致。M14-G11和αIR3结合到CRR和L2
结构域上的重叠表面。M14-G11的表位位于CRR结构域的表面上，与配体结合位点紧邻-与
其表观竞争性配体-阻断行为一致。αIR3的表位位于与配体结合位点正交的表面-与其
表现的变构阻断行为一致。变构抑制剂M13-C06与竞争性抑制剂M14-G11或变构抑制剂
αIR3的组合导致实质上100％地阻断IGF-1和IGF-2，IC50值低于分离状态的抗体的IC50
值。表示抑制性抗IGF-1R抗体组合的协同活性的该数据显示在表9和表10)。
[0790] 表9.抗IGF-1R抗体M13-C06、M14-G11和αIR3的IGF-1阻断效价和IGF-1抑制百分比
[0791]抗体(组合) IC50(IGF-1阻 IGF-2(在320nM)以饱和抗体浓度结
断，nM) 合到IGF-1R的百分比
M13-C06 1.3 25％
M14-G11 13.0 1％
αIR3 4.9 23％
M13-C06+□IR3 1.0 1％
M13-C06+ 0.67 1％
M14-G11
断，nM) 合到IGF-1R的百分比
M13-C06 1.3 25％
M14-G11 13.0 1％
αIR3 4.9 23％
M13-C06+□IR3 1.0 1％
M13-C06+ 0.67 1％
M14-G11
[0792] 表10.抗IGF-1R抗体M13-C06、M14-G11和□IR3的IGF-2阻断效价和IGF-2抑制百分比
[0793]抗体(组合) IC50(IGF-2阻 IGF-2(在640nM)以饱和抗体浓度结
断，nM) 合到IGF-1R的百分比
M13-C06 1.9 16％
M14-G11 7.9 1％
αIR3 N/A 不阻断
M13-C06+ 0.87 1％
M14-G11
断，nM) 合到IGF-1R的百分比
M13-C06 1.9 16％
M14-G11 7.9 1％
αIR3 N/A 不阻断
M13-C06+ 0.87 1％
M14-G11
[0794] 实施例5.IGF-1R的变构和竞争性抗体抑制剂的残基特异性表位定位
[0795] a.方法
[0796] i.表位定位突变
[0797] 根据制造商的方案，使用STRATAGENETM位点定向诱变试剂盒，通过将野生型hIGF-1R-Fc PV-90质粒诱变而构建了46突变体表位定位文库。通过DNA测序确认
了每种突变体(或双突变体)向PV-90载体的并入。对于DNA的产生，将质粒转化进
DH5α(Invitrogen，目录号18258-012)，在37℃下过夜培养并分别使用Qiagen小量制备试
剂盒和Qiagen无内毒素大量抽提试剂盒来小量制备和大量制备质粒。使用用来将可溶性
蛋白分泌至培养基中的PolyFect转染试剂盒(Qiagen)，以2×106个细胞/mL将200μg的
每种突变体质粒瞬时转染进100mL的HEK293T细胞中。在DMEM(IvrineScientific)、10％
FBS(低IgG牛血清，Invitrogen-将其通过20mL蛋白A柱子而进一步清除牛IgG)、37℃的
CO2培养箱中培养细胞。7天后，通过1200rpm离心并通过0.2μm过滤器过滤来收集含有
每种IGF-1R-Fc突变体的上清液。将上清液通过用1×PBS预平衡的1.2mL蛋白A琼脂糖
FF柱来对每种突变体进行亲和提纯。使用0.1M甘氨酸(pH 3.0)从柱子上将突变体洗脱，
用1M的Tris(pH 8.5)、0.1％吐温-80中和，并使用VivaSpin 6 MWCO30,000离心浓缩装置
(Sartorius，目录号VS0621)将其浓缩至～300μL。
了每种突变体(或双突变体)向PV-90载体的并入。对于DNA的产生，将质粒转化进
DH5α(Invitrogen，目录号18258-012)，在37℃下过夜培养并分别使用Qiagen小量制备试
剂盒和Qiagen无内毒素大量抽提试剂盒来小量制备和大量制备质粒。使用用来将可溶性
蛋白分泌至培养基中的PolyFect转染试剂盒(Qiagen)，以2×106个细胞/mL将200μg的
每种突变体质粒瞬时转染进100mL的HEK293T细胞中。在DMEM(IvrineScientific)、10％
FBS(低IgG牛血清，Invitrogen-将其通过20mL蛋白A柱子而进一步清除牛IgG)、37℃的
CO2培养箱中培养细胞。7天后，通过1200rpm离心并通过0.2μm过滤器过滤来收集含有
每种IGF-1R-Fc突变体的上清液。将上清液通过用1×PBS预平衡的1.2mL蛋白A琼脂糖
FF柱来对每种突变体进行亲和提纯。使用0.1M甘氨酸(pH 3.0)从柱子上将突变体洗脱，
用1M的Tris(pH 8.5)、0.1％吐温-80中和，并使用VivaSpin 6 MWCO30,000离心浓缩装置
(Sartorius，目录号VS0621)将其浓缩至～300μL。
[0798] ii.IGF-1R突变体的Western印迹分析
[0799] 根据制造商标准的方案，使用Xcell SureLock Mini Cell(Invitrogen目录号EI0001)将hIGF-1R-Fc突变体样品在4-20％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen目录号
EC6028)上电泳。根据制造商标准的方案，使用iBlot干印迹系统(Invitrogen目录号
IB1001)和Transfer Stacks(Invitrogen目录号IB3010-01或3010-02)将样品转移至硝
化纤维素。在25ml的PBST中用5mg/ml脱脂奶粉将膜在4℃下阻断过夜。阻断后，用25ml
的PBST在室温下将膜冲洗一次5min。用第一抗IGF-1Rβ抗体(Santa Cruz Biotechnology
目录号sc-9038)在室温下以1∶100在10ml的PBST中将膜孵育1hr。接下来用25ml
的PBST将膜冲洗三次5min。为了检测，用第二个轭合至HRP的山羊抗兔IgG-Fc抗体(US
Biological目录号I1904-40J)在室温下以1∶1000的稀释在10ml的PBST中将膜孵育
1hr。用25ml的PBST将膜冲洗三次5min，接着用25ml的PBST冲洗一次20min。根据制造商
标准的方案，使用Amersham ECL Western印迹分析系统(GE Healthcare目录号RPN2108)
检测了蛋白条带。
EC6028)上电泳。根据制造商标准的方案，使用iBlot干印迹系统(Invitrogen目录号
IB1001)和Transfer Stacks(Invitrogen目录号IB3010-01或3010-02)将样品转移至硝
化纤维素。在25ml的PBST中用5mg/ml脱脂奶粉将膜在4℃下阻断过夜。阻断后，用25ml
的PBST在室温下将膜冲洗一次5min。用第一抗IGF-1Rβ抗体(Santa Cruz Biotechnology
目录号sc-9038)在室温下以1∶100在10ml的PBST中将膜孵育1hr。接下来用25ml
的PBST将膜冲洗三次5min。为了检测，用第二个轭合至HRP的山羊抗兔IgG-Fc抗体(US
Biological目录号I1904-40J)在室温下以1∶1000的稀释在10ml的PBST中将膜孵育
1hr。用25ml的PBST将膜冲洗三次5min，接着用25ml的PBST冲洗一次20min。根据制造商
标准的方案，使用Amersham ECL Western印迹分析系统(GE Healthcare目录号RPN2108)
检测了蛋白条带。
[0800] iii.IGF-1R-Fc突变体文库的表面等离子体共振分析
[0801] 在设置为25℃的Biacore 3000仪器上进行表面等离子体共振(SPR)实验。mIGF-1R-Fc和hIGF-1R-Fc二者都以高的表观亲和力结合至含有固定的M13-C06、M14-C03
和M14-G11的研究级CM5感应芯片表面。根据制造商标准的方案，通过将每种抗体(在10mM
醋酸(pH 4.0)中稀释至100μg/mL)注射至EDC/NHS激活的感应芯片表面来制备抗体感应
芯片表面。mIGF-1R-Fc结合抗体表面的能力是蛋白高的表观亲和力的结果。由于两个不
同的同二聚体区域(IGF-1R和IgG1-Fc)的并入，hIGF-1R-Fc和mIGF-1R-Fc蛋白二者都低
聚化。为了区分对hIGF-1R-Fc的实际的高亲和力抗体结合以及对mIGF-1R-Fc的低亲和力
抗体结合，将受体-Fc融合物捕获在M13-C06和M14-G11感应芯片表面上，接着是另外的抗
体(αIR3和P1E2)或抗体Fab(M13-C06、M14-C03和M14-G11)注射。通过以1μl/min将
60μL的亲和提纯的、浓缩的物质注射到感应芯片表面来将受体-Fc构建体捕获在抗体表
面。在完成了受体-Fc装入步骤之后，将流速提高到5μl/min。在装入每种受体-Fc构建
体之后，注射(50μL)含有浓度为10nM、3nM或1nM的M13-C06 Fab或αIR3抗体或者浓度
为30nM、10nM或3nM的M14-C03 Fab、M14-G11 Fab或P1E2抗体的溶液。在抗体注射完成
后7分钟，测量了解离。最后，将流速提高到30μl/min，并以2×10μL注射0.1M的甘氨酸
(pH 2)来再生芯片表面。
和M14-G11的研究级CM5感应芯片表面。根据制造商标准的方案，通过将每种抗体(在10mM
醋酸(pH 4.0)中稀释至100μg/mL)注射至EDC/NHS激活的感应芯片表面来制备抗体感应
芯片表面。mIGF-1R-Fc结合抗体表面的能力是蛋白高的表观亲和力的结果。由于两个不
同的同二聚体区域(IGF-1R和IgG1-Fc)的并入，hIGF-1R-Fc和mIGF-1R-Fc蛋白二者都低
聚化。为了区分对hIGF-1R-Fc的实际的高亲和力抗体结合以及对mIGF-1R-Fc的低亲和力
抗体结合，将受体-Fc融合物捕获在M13-C06和M14-G11感应芯片表面上，接着是另外的抗
体(αIR3和P1E2)或抗体Fab(M13-C06、M14-C03和M14-G11)注射。通过以1μl/min将
60μL的亲和提纯的、浓缩的物质注射到感应芯片表面来将受体-Fc构建体捕获在抗体表
面。在完成了受体-Fc装入步骤之后，将流速提高到5μl/min。在装入每种受体-Fc构建
体之后，注射(50μL)含有浓度为10nM、3nM或1nM的M13-C06 Fab或αIR3抗体或者浓度
为30nM、10nM或3nM的M14-C03 Fab、M14-G11 Fab或P1E2抗体的溶液。在抗体注射完成
后7分钟，测量了解离。最后，将流速提高到30μl/min，并以2×10μL注射0.1M的甘氨酸
(pH 2)来再生芯片表面。
[0802] b.结果
[0803] i.初步的表位定位-表位位置的确定
[0804] 构建了初步的一组19个突变以确定抑制性抗IGF-1R抗体表位的位置。基于M13-C06、M14-C03和M14-G11几乎未显示针对小鼠IGF-1R的活性的观察，我们在人类
IGF-1R中鉴定了一组有限的突变，其使得我们定位抑制性抗IGF-1R抗体的表位的能力成
为可能。小鼠和人类IGF-1R共享95％一级氨基酸序列同一性。小鼠和人类IGF-1R的胞外
结构域之间有三十三(33)个残基不同。这些残基中的二十(20)个是突变靶，因为它们在
同源INSR胞外结构域的结构中的同源位置暴露于溶剂(pdb编号2DTG，(McKern2006))。使
用StrucTools(http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html)用 探测半径
来计算可接近的表面积。鉴定了这些突变中的四对，其中所提出的突变在一级序列上彼此
相邻。在这些情况下，在单个构建体中将每对进行双重突变。因此，20个残基位置导致16
个最初的突变构建体。由于被认为对于IGF-1/IGF-2结合重要的FnIII-2结构域的无结构
的环区中的小鼠/人类IGF-1R氨基酸差异(Whittaker 2001；Sorensen2004)，构建了四个
另外的突变。这些位置中的两个在一级序列上是接近的，并可在单个突变体构建体中合并。
19个初步的突变(SD001-SD019)的最终列表提供在表11中。显示在表11中的残基编号假
设30个残基的IGF-1R信号序列已被切割。通过在100mL的HEK293细胞中瞬时转染1周
来表达每种构建体并使用蛋白A色谱对其提纯。将纯化的突变体IGF-1R构建体浓缩并通
过Western印迹分析来测定表达/折叠。对于所有突变体构建体，表达是10-30μg。
IGF-1R中鉴定了一组有限的突变，其使得我们定位抑制性抗IGF-1R抗体的表位的能力成
为可能。小鼠和人类IGF-1R共享95％一级氨基酸序列同一性。小鼠和人类IGF-1R的胞外
结构域之间有三十三(33)个残基不同。这些残基中的二十(20)个是突变靶，因为它们在
同源INSR胞外结构域的结构中的同源位置暴露于溶剂(pdb编号2DTG，(McKern2006))。使
用StrucTools(http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html)用 探测半径
来计算可接近的表面积。鉴定了这些突变中的四对，其中所提出的突变在一级序列上彼此
相邻。在这些情况下，在单个构建体中将每对进行双重突变。因此，20个残基位置导致16
个最初的突变构建体。由于被认为对于IGF-1/IGF-2结合重要的FnIII-2结构域的无结构
的环区中的小鼠/人类IGF-1R氨基酸差异(Whittaker 2001；Sorensen2004)，构建了四个
另外的突变。这些位置中的两个在一级序列上是接近的，并可在单个突变体构建体中合并。
19个初步的突变(SD001-SD019)的最终列表提供在表11中。显示在表11中的残基编号假
设30个残基的IGF-1R信号序列已被切割。通过在100mL的HEK293细胞中瞬时转染1周
来表达每种构建体并使用蛋白A色谱对其提纯。将纯化的突变体IGF-1R构建体浓缩并通
过Western印迹分析来测定表达/折叠。对于所有突变体构建体，表达是10-30μg。
[0805] 使用表面等离子体共振(Biacore)测定了M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和αIR3与每种突变体IGF-1R-Fc融合构建体相互作用的能力。为了除去作为测定中一个变
量的IGF-1R-Fc融合构建体的不确定浓度，在含有～10,000RU的研究级CM5芯片上捕获了
每种突变体构建体，其中所述CM5芯片上固定有M13-C03、M14-C03和M14-G11抗体。为了
提高我们观察抗体与被捕获的突变体IGF-1R构建体结合的减弱的能力，我们使用了酶促
衍生的M13-C06、M14-C03和M14-G11抗原结合片段(Fab)。
量的IGF-1R-Fc融合构建体的不确定浓度，在含有～10,000RU的研究级CM5芯片上捕获了
每种突变体构建体，其中所述CM5芯片上固定有M13-C03、M14-C03和M14-G11抗体。为了
提高我们观察抗体与被捕获的突变体IGF-1R构建体结合的减弱的能力，我们使用了酶促
衍生的M13-C06、M14-C03和M14-G11抗原结合片段(Fab)。
[0806] 在这些初步的19个突变体构建体中，只有SD015(E464H)影响了M13-C06和M14-C03 Fab结合IGF-1R的能力。残基464向组氨酸的突变导致对两种Fab的结合反应
的完全消失。所有其他突变体IGF-1R构建体以比较平衡解离常数(分别地，M13-C06和
M14-C03 Fab的KD＝1nM和5nM)结合。这些实验将M13-C06和M14-C03抗体的表位定位
于FnIII-1结构域的表面。这两种抗体的VH CDR区域高度相似(38个残基中的26个是相
同的)而VL结构域的CDR区是不相关的，这表明了对抗原识别的强烈VH偏向。毫不奇怪，
这两种抗体互相有效地交叉阻断。Soos及其同事已经使用IR/IGF-1R嵌合体显示，第二个
富含亮氨酸的重复结构域(L2)和第一个III型纤维粘连蛋白结构域(FnIII-1)中的一个
或多个表位可导致受体抑制(Soos 1992)。这跨越了残基333-609；总共276个残基。相
反，本文描述的详细的表位定位研究证明，表位跨越多个不重叠残基，且FnIII-1结构域中的单个残基E464是对于抗体结合特别重要的残基。
的完全消失。所有其他突变体IGF-1R构建体以比较平衡解离常数(分别地，M13-C06和
M14-C03 Fab的KD＝1nM和5nM)结合。这些实验将M13-C06和M14-C03抗体的表位定位
于FnIII-1结构域的表面。这两种抗体的VH CDR区域高度相似(38个残基中的26个是相
同的)而VL结构域的CDR区是不相关的，这表明了对抗原识别的强烈VH偏向。毫不奇怪，
这两种抗体互相有效地交叉阻断。Soos及其同事已经使用IR/IGF-1R嵌合体显示，第二个
富含亮氨酸的重复结构域(L2)和第一个III型纤维粘连蛋白结构域(FnIII-1)中的一个
或多个表位可导致受体抑制(Soos 1992)。这跨越了残基333-609；总共276个残基。相
反，本文描述的详细的表位定位研究证明，表位跨越多个不重叠残基，且FnIII-1结构域中的单个残基E464是对于抗体结合特别重要的残基。
[0807] 在这19个突变体中，只有SD008(S257F)和SD012(E303G)即分别在富含半胱氨酸的重复(CRR)和L2结构域中的突变，减弱了M14-G11 Fab识别人类IGF-1R的能力(表
11)。在这两种情况下，突变导致基于所测量KD的亲和力的大约3倍丧失。包括SD015在
内的未显示对M13-C06和M14-C03的反应性的所有其他突变体IGF-1R构建体，以野生型亲
和力(KD～4-6nM)结合M14-G11Fab。
11)。在这两种情况下，突变导致基于所测量KD的亲和力的大约3倍丧失。包括SD015在
内的未显示对M13-C06和M14-C03的反应性的所有其他突变体IGF-1R构建体，以野生型亲
和力(KD～4-6nM)结合M14-G11Fab。
[0808] 还针对初步的突变体文库筛选了αIR3和P1E2。这两种抗体都在对SD012的亲和力方面展现了与野生型人类IGF-1R-Fc相似的减少；然而，只有P1E2展示了对SD008的减
弱的结合(表11)。
弱的结合(表11)。
[0809] ii.详细的表位定位-M13-C06和M14-C03抗体表位的残基特异性定义
[0810] 基于将M13-C06和M14-C03表位定位于IGF-1R的FnIII-1结构域的初步的IGF-1R突变体文库的结果，设计了第二组突变以探测环绕最初的突变E464H的IGF-1R表面，其中
所述突变E464H导致抗体结合的消失。基于它们对E464的3D接近程度(包括不同于最初
的组氨酸突变的残基464的突变)，将总共21个残基选作诱变。胰岛素受体的3D结构被用
来估计环绕464的残基的接近程度。鉴定了在一级序列上相邻的7对残基的突变。这些残
基对的突变同时进行以产生双重突变。因此，第二组突变由总共14个构建体所组成，其作
为SD101-SD114被列在表11中。
所述突变E464H导致抗体结合的消失。基于它们对E464的3D接近程度(包括不同于最初
的组氨酸突变的残基464的突变)，将总共21个残基选作诱变。胰岛素受体的3D结构被用
来估计环绕464的残基的接近程度。鉴定了在一级序列上相邻的7对残基的突变。这些残
基对的突变同时进行以产生双重突变。因此，第二组突变由总共14个构建体所组成，其作
为SD101-SD114被列在表11中。
[0811] 如第一组初步突变(SD001-SD019)所描述进行了这14个突变体构建体的表达、纯化和质量控制。根据Western印迹分析，所有14个构建体很好地表达，并且看上去是折叠
的，除了SD144。该构建体表达得不好，并且在我们的Biacore实验中不与M13-C06、M14-C03或M14-G11反应-其识别完全不同的表位。因此，不考虑该突变体构建体的数据。其他13
个构建体允许M13-C06和M14-C03表位的精确的、残基特异性的定义。残基特异性的结果
被列在表11中。总之，M13-C06和M14-C03的表位几乎相同并被完全地包含在FnIII-1结
构域中。最关键的(或许中央的)残基是461和462。含有在残基461和462的突变的
SD103未显示对M13-C06和M14-C03 Fab的反应性以及对M13-C06和M14-C03表面的反应
性。SD103对M14-G11表面的结合与对任何其他FnIII-2突变体构建体的结合没有不同，这
表明这种完全消失是表位特异性的。导致对IGF-1R的抗体亲和力消失或大量减少(亲和
力＞100倍的减少)的其他突变被发现是在IGF-1R残基459、460、464、480、482、483、533、
570和571上。导致抗体亲和力(2.5≥KD≥10nM)与野生型人类IGF-1R相比小幅减少的
突变被发现是在残基466、467、564、565和568上。这些残基的位置被定位于同源IR结构
的表面(图16，参考McKern)。
的，除了SD144。该构建体表达得不好，并且在我们的Biacore实验中不与M13-C06、M14-C03或M14-G11反应-其识别完全不同的表位。因此，不考虑该突变体构建体的数据。其他13
个构建体允许M13-C06和M14-C03表位的精确的、残基特异性的定义。残基特异性的结果
被列在表11中。总之，M13-C06和M14-C03的表位几乎相同并被完全地包含在FnIII-1结
构域中。最关键的(或许中央的)残基是461和462。含有在残基461和462的突变的
SD103未显示对M13-C06和M14-C03 Fab的反应性以及对M13-C06和M14-C03表面的反应
性。SD103对M14-G11表面的结合与对任何其他FnIII-2突变体构建体的结合没有不同，这
表明这种完全消失是表位特异性的。导致对IGF-1R的抗体亲和力消失或大量减少(亲和
力＞100倍的减少)的其他突变被发现是在IGF-1R残基459、460、464、480、482、483、533、
570和571上。导致抗体亲和力(2.5≥KD≥10nM)与野生型人类IGF-1R相比小幅减少的
突变被发现是在残基466、467、564、565和568上。这些残基的位置被定位于同源IR结构
的表面(图16，参考McKern)。
[0812] 根据表位的位置和表面积覆盖，不惊讶于M13-C06和M14-C03二者都显示了对IGF-1和IGF-2与IGF-1R结合的变构抑制。该表位是在与已知配体结合表面相对的受体
表面上(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。发表的文章已经显示，识别残基440-586的抗
体对IGF-1结合可以是抑制性的和激动性的(Soos 1992；Keyhanfar2007)。在IGF-1R中，
氨基酸残基440-586代表着具有可被抗IGF-1R抗体接近的许多潜在的非重叠表面的所有
L2和FnIII-1。我们的研究是使我们知道了抑制表位以残基特异性的分辨率被定位在受体
上的何处的第一个研究。最近的胰岛素受体(IR)结构与已知抑制胰岛素与它的受体结合
的抗IR抗体共同结晶(McKern 2006)。与IGF-1R的His464同源的残基(IR的K474)是
该抗体与IR结合表面的一部分。M13-C06与拮抗性的抗IR抗体共享相似的抑制IGF-1与
IGF-1R结合的机制是可能的。基于Biacore结果，M13-C06看上去通过降低动力学缔合速
率来抑制IGF-1(且很可能是IGF-2)。该抗体看上去以一种使得IGF-1和IGF-2很难接近
受体结合位点的构象来捕获受体胞外结构域。
表面上(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。发表的文章已经显示，识别残基440-586的抗
体对IGF-1结合可以是抑制性的和激动性的(Soos 1992；Keyhanfar2007)。在IGF-1R中，
氨基酸残基440-586代表着具有可被抗IGF-1R抗体接近的许多潜在的非重叠表面的所有
L2和FnIII-1。我们的研究是使我们知道了抑制表位以残基特异性的分辨率被定位在受体
上的何处的第一个研究。最近的胰岛素受体(IR)结构与已知抑制胰岛素与它的受体结合
的抗IR抗体共同结晶(McKern 2006)。与IGF-1R的His464同源的残基(IR的K474)是
该抗体与IR结合表面的一部分。M13-C06与拮抗性的抗IR抗体共享相似的抑制IGF-1与
IGF-1R结合的机制是可能的。基于Biacore结果，M13-C06看上去通过降低动力学缔合速
率来抑制IGF-1(且很可能是IGF-2)。该抗体看上去以一种使得IGF-1和IGF-2很难接近
受体结合位点的构象来捕获受体胞外结构域。
[0813] iii.详细的表位定位-M14-G11、P1E2和αIR3抗体表位的残基特异性定义
[0814] 基于将M14-G11、P1E2和αIR3表位定位于IGF-1R的CRR和L2结构域的初步的IGF-1R突变体文库的结果，设计了第三组突变以包括环绕最初的突变S257F和E303G的
IGF-1R表面，其中所述突变S257F和E303G导致抗体对受体亲和力的减少。基于它们对
S257和E303的3D接近程度(包括不同于最初的苯丙氨酸突变的残基257的突变)，将总
共15个残基选作诱变。胰岛素受体的3D结构被用来估计环绕S257和E303的残基的接近
程度。鉴定了在一级序列上相邻的两(2)对残基的突变。这些残基对的突变同时进行以产
生双重突变体。因此，第二组突变由总共13个构建体所组成，其作为SD201-SD213被列在
表11中。
IGF-1R表面，其中所述突变S257F和E303G导致抗体对受体亲和力的减少。基于它们对
S257和E303的3D接近程度(包括不同于最初的苯丙氨酸突变的残基257的突变)，将总
共15个残基选作诱变。胰岛素受体的3D结构被用来估计环绕S257和E303的残基的接近
程度。鉴定了在一级序列上相邻的两(2)对残基的突变。这些残基对的突变同时进行以产
生双重突变体。因此，第二组突变由总共13个构建体所组成，其作为SD201-SD213被列在
表11中。
[0815] 如第一组初步突变(SD001-SD019)所描述进行了这13个突变体构建体的表达、纯化和质量控制。根据Western印迹分析所有这些构建体很好地表达，并且看上去是折叠
的，除了SD213。由于环绕折叠状态的受体的模糊性，不考虑SD213的数据。其他12个突
变体构建体导致M14-G11、P1E2和αIR3表位的精确的、残基特异性的定义。残基特异性
的结果被列在表11中。M14-G11、P1E2和αIR3之间的表位不同。考虑到M14-G11被显示
为IGF-1和IGF-2二者的竞争性抑制剂而P1E2和αIR3被显示只变构地抑制IGF-1的结
合，这不令人惊讶。M14-G11的表位接近CRR结构域的中央，其是在与已知具有对配体结合
的作用的残基直接接触的表面上(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。减弱M14-G11结合
的突变被发现是在位置248和250上。在残基254上的突变导致抗体对受体的亲和力的中
度减少(10≥KD≥100倍高于野生型IGF-1R)。主要在CRR中的许多其他突变轻微减少
了M14-G11对受体的亲和力(2.5≥KD≥10倍高于野生型IGF-1R)，其包括残基257、259、
260、263、265和303。这些残基的位置被定位于IGF-1R的前三个胞外结构域的公布的结构
的表面上(图17(Garrett 1998))。
的，除了SD213。由于环绕折叠状态的受体的模糊性，不考虑SD213的数据。其他12个突
变体构建体导致M14-G11、P1E2和αIR3表位的精确的、残基特异性的定义。残基特异性
的结果被列在表11中。M14-G11、P1E2和αIR3之间的表位不同。考虑到M14-G11被显示
为IGF-1和IGF-2二者的竞争性抑制剂而P1E2和αIR3被显示只变构地抑制IGF-1的结
合，这不令人惊讶。M14-G11的表位接近CRR结构域的中央，其是在与已知具有对配体结合
的作用的残基直接接触的表面上(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。减弱M14-G11结合
的突变被发现是在位置248和250上。在残基254上的突变导致抗体对受体的亲和力的中
度减少(10≥KD≥100倍高于野生型IGF-1R)。主要在CRR中的许多其他突变轻微减少
了M14-G11对受体的亲和力(2.5≥KD≥10倍高于野生型IGF-1R)，其包括残基257、259、
260、263、265和303。这些残基的位置被定位于IGF-1R的前三个胞外结构域的公布的结构
的表面上(图17(Garrett 1998))。
[0816] P1E2和αIR3的表位互相相似，而只有一些微小的差别。该表位主要在CRR结构域之中与M14-G11的那些重叠但位于稍微旋转远离IGF-1/IGF-2结合袋的受体的表面上
的残基上。另外，在CRR结构域C末端并深入L2结构域(超过对M14-G11的结合有任何
作用的那些)的残基被发现轻微减少单独的αIR3的亲和力(表11)。P1E2对IGF-1R的
结合被残基254和265的突变消除；被残基257的突变中度地减少(10≥KD≥100倍高
于野生型IGF-1R)；而且被残基248和303的突变轻微减少(2.5≥KD≥10倍高于野生型
IGF-1R)。αIR3对IGF-1R的结合被残基248和265的突变消除；被残基254的突变中度地
减少(10≥KD≥100倍高于野生型IGF-1R)；而且被残基263、301、303、308、327和379的
突变轻微减少(2.5≥KD≥10倍高于野生型IGF-1R)。影响P1E2和αIR3与IGF-1R结合
(对两种抗体的平均作用)的残基的位置被定位于IGF-1R的前三个胞外结构域的公布的
结构的表面上(图18(Garrett 1998))。αIR3和P1E2看上去具有相同的最近在文献中描
述的两种抗体的变构的/仅IGF-1的阻断特性(Keyhanfar 2007)。据显示，残基241、242、
251和266影响这些抗体对受体结合的能力。我们的数据与该报道一致并且表明残基257
和265的另外的重要性。
的残基上。另外，在CRR结构域C末端并深入L2结构域(超过对M14-G11的结合有任何
作用的那些)的残基被发现轻微减少单独的αIR3的亲和力(表11)。P1E2对IGF-1R的
结合被残基254和265的突变消除；被残基257的突变中度地减少(10≥KD≥100倍高
于野生型IGF-1R)；而且被残基248和303的突变轻微减少(2.5≥KD≥10倍高于野生型
IGF-1R)。αIR3对IGF-1R的结合被残基248和265的突变消除；被残基254的突变中度地
减少(10≥KD≥100倍高于野生型IGF-1R)；而且被残基263、301、303、308、327和379的
突变轻微减少(2.5≥KD≥10倍高于野生型IGF-1R)。影响P1E2和αIR3与IGF-1R结合
(对两种抗体的平均作用)的残基的位置被定位于IGF-1R的前三个胞外结构域的公布的
结构的表面上(图18(Garrett 1998))。αIR3和P1E2看上去具有相同的最近在文献中描
述的两种抗体的变构的/仅IGF-1的阻断特性(Keyhanfar 2007)。据显示，残基241、242、
251和266影响这些抗体对受体结合的能力。我们的数据与该报道一致并且表明残基257
和265的另外的重要性。
[0817] M14-G11(竞争性的IGF-1和IGF-2阻断剂)和P1E2/αIR3表位之间的主要区别是在与IGF-1结合位点相邻的区域。同时识别残基248、250和254的能力可以是使得M14-G11
完全阻断IGF-1和IGF-2二者的结合的决定性因素。P1E2和αIR3二者完全不受D250S突
变的影响，其完全消除M14-G11与受体的结合。M14-G11与IGF-1R的结合还被IGF-1结合
位点(残基259和260，图17&18)附近的CRR结构域的内侧裂口上的突变所削弱，这或许解
释了该抗体如何空间地和竞争性地阻断配体与受体的接合。这些位置上的突变对P1E2或
αIR3的结合没有作用。P1E2和αIR3的亲和力被IGF-1结合沟槽稍微靠外的表面上的突
变所削弱(图17&18)。因此，看上去被M14-G11特异性地识别并可导致竞争性配体阻断的
残基是D250、E259和S260。
完全阻断IGF-1和IGF-2二者的结合的决定性因素。P1E2和αIR3二者完全不受D250S突
变的影响，其完全消除M14-G11与受体的结合。M14-G11与IGF-1R的结合还被IGF-1结合
位点(残基259和260，图17&18)附近的CRR结构域的内侧裂口上的突变所削弱，这或许解
释了该抗体如何空间地和竞争性地阻断配体与受体的接合。这些位置上的突变对P1E2或
αIR3的结合没有作用。P1E2和αIR3的亲和力被IGF-1结合沟槽稍微靠外的表面上的突
变所削弱(图17&18)。因此，看上去被M14-G11特异性地识别并可导致竞争性配体阻断的
残基是D250、E259和S260。
[0818] 削弱αIR3和M14-G11与IGF-1R结合的残基突变从CRR结构域的中央延伸至L2结构域中。不太可能的是，根据发表的描述平均抗体表位面积的结果(Davies 1996)，所有这些残基都参加与抗体同时直接的相互作用。最近的数据已经表明，重复蛋白的稳定性和
折叠不同于大多数的球形结构域(Kajander 2005)。重复结构域往往是伸长的结构，其进行与分离的α螺旋的螺旋-卷曲转化相似的非合作性折叠/解折叠反应。从简单化的角度
来看，球形结构域通常是合作地折叠的，并以单独的天然折叠状态或变性状态存在。球形结构域的结构不被单个突变部分地破坏，条件是该突变不导致结构域的全面解折叠。与此相
反，突变之后，折叠的重复结构域可逐渐地恢复为未折叠的结构域。因此，影响抗体结合的沿着IGF-1R的CRR或L2结构域表面的突变可通过修饰这些结构域的整体结构(或顺序)
来这么做。该机制还解释特定CRR或L2结构域构象可如何影响带有配体的CRR结构域的
动态结合反应。预计这将以变构的方式发生(如对P1E2和αIR3所观察的)，条件是抗体
也不立体地阻断配体结合(如对M14-G11所观察的)。
折叠不同于大多数的球形结构域(Kajander 2005)。重复结构域往往是伸长的结构，其进行与分离的α螺旋的螺旋-卷曲转化相似的非合作性折叠/解折叠反应。从简单化的角度
来看，球形结构域通常是合作地折叠的，并以单独的天然折叠状态或变性状态存在。球形结构域的结构不被单个突变部分地破坏，条件是该突变不导致结构域的全面解折叠。与此相
反，突变之后，折叠的重复结构域可逐渐地恢复为未折叠的结构域。因此，影响抗体结合的沿着IGF-1R的CRR或L2结构域表面的突变可通过修饰这些结构域的整体结构(或顺序)
来这么做。该机制还解释特定CRR或L2结构域构象可如何影响带有配体的CRR结构域的
动态结合反应。预计这将以变构的方式发生(如对P1E2和αIR3所观察的)，条件是抗体
也不立体地阻断配体结合(如对M14-G11所观察的)。
[0819] 表11.IGF-1R突变体的完整列表及其对抗体结合的影响
[0820]突变 SD# IR IGF- M13-C C03结 G11 P1E2 αIR3
IGF-1R 3D 1R结 06 合 结合 结合 结合
位置 结构# 构域 结合a
(无信
号)
Y28A SD001 32 L1 NE nd NE nd nd
M156A SD002 163 L1 NE nd NE nd nd
T188F SD003 195 L1 NE nd NE nd nd
S210H SD004 218 CRR NE NE NE nd nd
A211Q
A217T SD005 224 CRR NE NE NE nd nd
A227K SD006 234 CRR NE NE NE NE NE
N237G SD007 244 CRR NE NE NE NE NE
S257F SD008 264 CRR NE NE W W NE
E264K SD009 275 CRR NE NE NE NE NE
G271D SD010 282 CRR NE NE NE NE NE
G285S SD011 295 CRR NE NE NE NE NE
S286T 296
E303G SD012 313 L2 NE NE W W W
D405K SD013 415 L2 NE NE NE nd Nd
K412A SD014 422 L2 NE NE NE NE NE
A413Q
H464E SD015 474 FnIII- S S NE nd nd
1
D531Q SD016 547 FnIII- NE NE NE nd nd
V532N 1
I650S SD017 * FnIII- NE NE NE nd nd
2环
突变 SD# IR IGF- M13-C C03结 G11 P1E2 αIR3
IGF-1R 3D 1R结 06 合 结合 结合 结合
位置 结构# 构域 结合a
(无信
号)
E665A SD018 * FnIII- NE NE NE nd nd
2环
E739W SD019 * FnIII- NE NE NE nd nd
L741F 2环
S427L SD101 437 L2 NE NE nd nd nd
E459A SD102 469 FnIII- S S nd nd nd
S460A 470 1
D461A SD103 471 FnIII- S-最关 S-最关 nd nd nd
V462T 472 1 键的 键的
H464A SD104 474 FnIII- S S nd nd nd
1
T466L SD105 476 FnIII- W W nd nd nd
S467Y 477 1
T468R SD106 478 FnIII- NE NE nd nd nd
1
T478R SD107 488 FnIII- NE W nd nd nd
1
H480E SD108 490 FnIII- S S nd nd nd
1
Y482A SD109 492 FnIII- S S nd nd nd
R483W 493 1
E533H SD110 548 FnIII- W S nd nd nd
1
I564T SD111 578 FnIII- W W nd nd nd
R565A 579 1
突变 SD# IR IGF- M13-C C03结 G11 P1E2 αIR3
IGF-1R 3D 1R结 06 合 结合 结合 结合
位置 结构# 构域 结合a
(无信
号)
K568A SD112 582 FnIII- NE W nd nd nd
1
E570A SD113 584 FnIII- S S nd nd nd
I571T 585 1
L572D SD114 586 FnIII- *折叠 *折叠 nd nd nd
Y573D 587 1 受影响 受影响
D248A SD201 255 CRR nd nd S W S
D250S SD202 257 CRR nd nd S NE NE
N254A SD203 261 CRR nd nd M S M
S257K SD204 264 CRR nd nd W M NE
E259K SD205 270 CRR nd nd W NE NE
S260N 271
S263R SD206 274 CRR nd nd W NE W
G265Y SD207 276 CRR nd nd W S S
V301Y SD208 311 L2 nd nd NE NE W
K306E SD209 316 L2 nd nd NE NE NE
T308E SD210 318 L2 nd nd NE NE W
K327N SD211 337 L2 nd nd NE NE W
L379R SD212 389 L2 nd nd NE NE W
E381K SD213 391 L2 nd nd *折叠 *折叠 *折叠
E382L 392 受影 受影 受影
响 响 响
IGF-1R 3D 1R结 06 合 结合 结合 结合
位置 结构# 构域 结合a
(无信
号)
Y28A SD001 32 L1 NE nd NE nd nd
M156A SD002 163 L1 NE nd NE nd nd
T188F SD003 195 L1 NE nd NE nd nd
S210H SD004 218 CRR NE NE NE nd nd
A211Q
A217T SD005 224 CRR NE NE NE nd nd
A227K SD006 234 CRR NE NE NE NE NE
N237G SD007 244 CRR NE NE NE NE NE
S257F SD008 264 CRR NE NE W W NE
E264K SD009 275 CRR NE NE NE NE NE
G271D SD010 282 CRR NE NE NE NE NE
G285S SD011 295 CRR NE NE NE NE NE
S286T 296
E303G SD012 313 L2 NE NE W W W
D405K SD013 415 L2 NE NE NE nd Nd
K412A SD014 422 L2 NE NE NE NE NE
A413Q
H464E SD015 474 FnIII- S S NE nd nd
1
D531Q SD016 547 FnIII- NE NE NE nd nd
V532N 1
I650S SD017 * FnIII- NE NE NE nd nd
2环
突变 SD# IR IGF- M13-C C03结 G11 P1E2 αIR3
IGF-1R 3D 1R结 06 合 结合 结合 结合
位置 结构# 构域 结合a
(无信
号)
E665A SD018 * FnIII- NE NE NE nd nd
2环
E739W SD019 * FnIII- NE NE NE nd nd
L741F 2环
S427L SD101 437 L2 NE NE nd nd nd
E459A SD102 469 FnIII- S S nd nd nd
S460A 470 1
D461A SD103 471 FnIII- S-最关 S-最关 nd nd nd
V462T 472 1 键的 键的
H464A SD104 474 FnIII- S S nd nd nd
1
T466L SD105 476 FnIII- W W nd nd nd
S467Y 477 1
T468R SD106 478 FnIII- NE NE nd nd nd
1
T478R SD107 488 FnIII- NE W nd nd nd
1
H480E SD108 490 FnIII- S S nd nd nd
1
Y482A SD109 492 FnIII- S S nd nd nd
R483W 493 1
E533H SD110 548 FnIII- W S nd nd nd
1
I564T SD111 578 FnIII- W W nd nd nd
R565A 579 1
突变 SD# IR IGF- M13-C C03结 G11 P1E2 αIR3
IGF-1R 3D 1R结 06 合 结合 结合 结合
位置 结构# 构域 结合a
(无信
号)
K568A SD112 582 FnIII- NE W nd nd nd
1
E570A SD113 584 FnIII- S S nd nd nd
I571T 585 1
L572D SD114 586 FnIII- *折叠 *折叠 nd nd nd
Y573D 587 1 受影响 受影响
D248A SD201 255 CRR nd nd S W S
D250S SD202 257 CRR nd nd S NE NE
N254A SD203 261 CRR nd nd M S M
S257K SD204 264 CRR nd nd W M NE
E259K SD205 270 CRR nd nd W NE NE
S260N 271
S263R SD206 274 CRR nd nd W NE W
G265Y SD207 276 CRR nd nd W S S
V301Y SD208 311 L2 nd nd NE NE W
K306E SD209 316 L2 nd nd NE NE NE
T308E SD210 318 L2 nd nd NE NE W
K327N SD211 337 L2 nd nd NE NE W
L379R SD212 389 L2 nd nd NE NE W
E381K SD213 391 L2 nd nd *折叠 *折叠 *折叠
E382L 392 受影 受影 受影
响 响 响
[0821]
[0822]
[0823] a无作用(NE)：测量的KD在WT hIGF-1R-Fc的2.5倍以内；弱(W)：测量的KD在高于WT的2.5-10倍之间；中(M)：测量的KD在高于WT的10-100倍之间；强(S)：对抗体的
结合被突变所消除；和nd：未确定。*“折叠受影响”意思是突变受体表达被减弱并且蛋白以异常的方式工作，这大概是因为受体的“折叠”“受影响”了。
结合被突变所消除；和nd：未确定。*“折叠受影响”意思是突变受体表达被减弱并且蛋白以异常的方式工作，这大概是因为受体的“折叠”“受影响”了。
[0824] 总之，证明了IGF-1R胞外结构域的表面上两个不同的表位可导致受体的抑制。基于46个单的或双的IGF-1R突变的数据集，产生了有关这两个表位的新的残基特异性的表
位定位信息。第一个表位位于FnIII-1中并导致IGF-1和IGF-2结合的变构阻断。第二个
表位是在CRR结构域之中并靠近推定的IGF-1/IGF-2结合位点。发现该区域中抗体表位的
微小差异将变构地阻断单种配体IGF-1结合的能力与竞争性地阻断IGF-1和IGF-2二者的
能力区分开。在此第一次鉴定了必须被靶向以获得二种配体的竞争性阻断的特定残基。
位定位信息。第一个表位位于FnIII-1中并导致IGF-1和IGF-2结合的变构阻断。第二个
表位是在CRR结构域之中并靠近推定的IGF-1/IGF-2结合位点。发现该区域中抗体表位的
微小差异将变构地阻断单种配体IGF-1结合的能力与竞争性地阻断IGF-1和IGF-2二者的
能力区分开。在此第一次鉴定了必须被靶向以获得二种配体的竞争性阻断的特定残基。
[0825] 实施例6.不同的IGF-1R表位与阻断配体的抗体的联合靶向导致肿瘤细胞生长的增强抑制
[0826] a.方法
[0827] 结合不同IGF-1R表位的抗体与其单独抗体本身相比可能表现增强的肿瘤细胞生长抑制是有依据的(参见图19)。因此，使用细胞存活力测定来测试抗体对IGF-1和IGF-2
驱使的肿瘤细胞生长的阻断能力。BxPC3(人类胰腺腺癌)和H322M(人类非小细胞肺肿
瘤)(ATCC)肿瘤系是购自ATCC的。细胞系生长在含有RPMI-1640(ATCC)和10％胎牛血清
(Irvine Scientific Inc.)的完全生长培养基中。胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)被用来从
培养瓶除去附着的细胞。磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)是来自MediaTech Inc.。用于发光测
定的96孔透明底板是购自Wallac Inc。将生长至80％单层的细胞胰蛋白酶化、冲洗、重新
3
悬浮并铺板在96孔板中200μl的0.5％生长培养基中，以8×10 个细胞/孔对BxPC3和
H322M细胞二者铺板。24小时后，用50μl或100μl不含血清的培养基(SFM)替换所述培
养基，并加入50μl以4×浓度连续稀释的抗体。在37℃下再培养30分钟之后，以4×浓度
加入50μl的IGF-1和IGF-2，使得终浓度为1×。一式三份地进行所有处理。将细胞再培
TM
养72小时直到溶解，以使用CELL TITER-GLO 发光细胞存活力测定(PromegaCorporation，
2800 Woods Hollow Rd.，Madison，WI 53711 USA)来确定存在的ATP的量。以200μl/孔加入裂解反应物和SFM(发光底物)的1∶1混合物。在Wallac(Boston，MA)板读数器上检测
发光。按照[1-(Ab-SFM)/(IGF-SFM)]×100％来计算抑制。同种型匹配的抗体IDEC-151(人
类G4)用作阴性对照(“ctr”或“ctrl”)。
驱使的肿瘤细胞生长的阻断能力。BxPC3(人类胰腺腺癌)和H322M(人类非小细胞肺肿
瘤)(ATCC)肿瘤系是购自ATCC的。细胞系生长在含有RPMI-1640(ATCC)和10％胎牛血清
(Irvine Scientific Inc.)的完全生长培养基中。胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)被用来从
培养瓶除去附着的细胞。磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)是来自MediaTech Inc.。用于发光测
定的96孔透明底板是购自Wallac Inc。将生长至80％单层的细胞胰蛋白酶化、冲洗、重新
3
悬浮并铺板在96孔板中200μl的0.5％生长培养基中，以8×10 个细胞/孔对BxPC3和
H322M细胞二者铺板。24小时后，用50μl或100μl不含血清的培养基(SFM)替换所述培
养基，并加入50μl以4×浓度连续稀释的抗体。在37℃下再培养30分钟之后，以4×浓度
加入50μl的IGF-1和IGF-2，使得终浓度为1×。一式三份地进行所有处理。将细胞再培
TM
养72小时直到溶解，以使用CELL TITER-GLO 发光细胞存活力测定(PromegaCorporation，
2800 Woods Hollow Rd.，Madison，WI 53711 USA)来确定存在的ATP的量。以200μl/孔加入裂解反应物和SFM(发光底物)的1∶1混合物。在Wallac(Boston，MA)板读数器上检测
发光。按照[1-(Ab-SFM)/(IGF-SFM)]×100％来计算抑制。同种型匹配的抗体IDEC-151(人
类G4)用作阴性对照(“ctr”或“ctrl”)。
[0828] b.结果
[0829] 直接通过作为代谢活性量度的细胞ATP的相对比较，测量了M13.C06.G4.P.agly(C06)和M14.G11.G4.P.agly(G11)抗IGF1-R抗体在体外抑制肿瘤细胞生长的能
力。在不含血清的条件下，C06和G11二者以剂量依赖的方式抑制了IGF-1和IGF-2刺激
的BxPC3胰腺肿瘤细胞系的生长(图20A)。重要地，暴露于等摩尔量的C06和G11抗体的
细胞导致了在10和1nM浓度下与任一种单独的抗体相比显著增强的生长抑制(图20A)。
在实验中进一步确认了这些结果，在所述实验中在多种抗体浓度下(1uM至0.15nM)测试了
C06和G11的组合。图20B显示，等摩尔量的C06和G11抗体的组合在500nM和5nM浓度之
间导致了与对应抗体浓度下的任一种单独的抗体所观察到的细胞生长抑制相比显著增强
的细胞生长抑制。
力。在不含血清的条件下，C06和G11二者以剂量依赖的方式抑制了IGF-1和IGF-2刺激
的BxPC3胰腺肿瘤细胞系的生长(图20A)。重要地，暴露于等摩尔量的C06和G11抗体的
细胞导致了在10和1nM浓度下与任一种单独的抗体相比显著增强的生长抑制(图20A)。
在实验中进一步确认了这些结果，在所述实验中在多种抗体浓度下(1uM至0.15nM)测试了
C06和G11的组合。图20B显示，等摩尔量的C06和G11抗体的组合在500nM和5nM浓度之
间导致了与对应抗体浓度下的任一种单独的抗体所观察到的细胞生长抑制相比显著增强
的细胞生长抑制。
[0830] 为了证明在胰腺癌细胞系(BxPC3)所观察的抑制也适用于其他肿瘤类型，在具有非小细胞肺癌来源的H322M细胞系中评估了C06和G11的组合。图20C显示在生长于含有
10％胎牛血清的标准细胞培养条件下的H322M中观察到的作用的例子，其中由C06/G11抗
体组合观察到细胞生长抑制与任一种单独的抗体相比显著较大。
10％胎牛血清的标准细胞培养条件下的H322M中观察到的作用的例子，其中由C06/G11抗
体组合观察到细胞生长抑制与任一种单独的抗体相比显著较大。
[0831] 实施例7.以四价双特异性抗体组合靶向不同IGF-1R表位
[0832] 可设计四价双特异性抗体，其组合不同结合特异性的两种单特异性抗体的结合位点，所述结合位点当组合时表现增强或协同的抗IGF-1R特性。本发明的示例性四价双特异
性结合分子包括具有第一结合特异性的scFv分子和具有第二结合特异性的二价抗体(参
见图21)。scFv分子可连接到或融合到二价抗体重链的C-末端或轻链(NL)或重链(NH)
的N-末端来产生双特异性结合分子。还可能使用本发明所述的方法来改造仅由直接融合
到二价抗体的铰链区或CH2或CH3结构域的稳定化的scFv组成的四价双特异性抗体。所
述抗体可包括全长Fc区或CH2-结构域缺失的Fc区。在其它示例性实施方案中，两个或更
多个scFv结构域可融合到重链或轻链的同一末端。在优选实施方案，至少一个scFv分子
是稳定化的scFv分子。scFv分子可经由PCR-指导的诱变在VH 44和VL 100之间引入二
硫键和/或在scFv的VH和VL结构域之间引入长度优化的连接序列(如，Gly4Ser4)(SEQ
ID NO：135)而被稳定化。
性结合分子包括具有第一结合特异性的scFv分子和具有第二结合特异性的二价抗体(参
见图21)。scFv分子可连接到或融合到二价抗体重链的C-末端或轻链(NL)或重链(NH)
的N-末端来产生双特异性结合分子。还可能使用本发明所述的方法来改造仅由直接融合
到二价抗体的铰链区或CH2或CH3结构域的稳定化的scFv组成的四价双特异性抗体。所
述抗体可包括全长Fc区或CH2-结构域缺失的Fc区。在其它示例性实施方案中，两个或更
多个scFv结构域可融合到重链或轻链的同一末端。在优选实施方案，至少一个scFv分子
是稳定化的scFv分子。scFv分子可经由PCR-指导的诱变在VH 44和VL 100之间引入二
硫键和/或在scFv的VH和VL结构域之间引入长度优化的连接序列(如，Gly4Ser4)(SEQ
ID NO：135)而被稳定化。
[0833] 在某些示例性实施方案中，四价双特异性抗体可包括连接到或融合到衍生自M14.G11.G4.P.agly(G11)可变区的稳定化的scFv分子的M13.C06.G4.P.agly(C06)抗体。可选
地，四价双特异性抗体可包括连接到或融合到衍生自M13.C06.G4.P.agly(C06)可变区的
scFv分子的M14.G11.G4.P.agly(G11)抗体。例如，(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)连接序列
可用于连接(经由PCR扩增)scFv到抗体重链成熟N-或C-末端或抗体轻链N-末端。
地，四价双特异性抗体可包括连接到或融合到衍生自M13.C06.G4.P.agly(C06)可变区的
scFv分子的M14.G11.G4.P.agly(G11)抗体。例如，(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)连接序列
可用于连接(经由PCR扩增)scFv到抗体重链成熟N-或C-末端或抗体轻链N-末端。
[0834] 可纯化编码scFv的PCR产物并连接到含有重链或轻链的全长前体多肽序列的哺乳动物载体(如，pN5KG1)。哺乳动物表达载体pN5KG1包含翻译受损的、修饰的(含有
内含子的)新霉素磷酸转移酶基因来选择转录活性整合事件，并包含鼠二氢叶酸还原酶
基因以允许用甲氨蝶呤扩增(Barnett等人，Antibody Expression andEngineering(抗
体表达和工程化).(Imanaka，H.Y.W.a.T.编辑)，第27-40页，Oxford University
Press，New York，NY，(1995))。连接混合物可用于转化大肠杆菌菌株TOP 10感受态细胞
(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。筛选转化有氨苄西林药物抗性的大肠杆菌菌落中插入子的存在。DNA序列分析可用于证实最终构建体的正确序列。
内含子的)新霉素磷酸转移酶基因来选择转录活性整合事件，并包含鼠二氢叶酸还原酶
基因以允许用甲氨蝶呤扩增(Barnett等人，Antibody Expression andEngineering(抗
体表达和工程化).(Imanaka，H.Y.W.a.T.编辑)，第27-40页，Oxford University
Press，New York，NY，(1995))。连接混合物可用于转化大肠杆菌菌株TOP 10感受态细胞
(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。筛选转化有氨苄西林药物抗性的大肠杆菌菌落中插入子的存在。DNA序列分析可用于证实最终构建体的正确序列。
[0835] 质粒DNA用于转化CHO DG44细胞来瞬时产生抗体蛋白。将20ug的每种质粒DNA6
与4×10 细胞组合到0.4ml 1×PBS的体积中。将混合物加入到0.4cm比色杯(BioRad)并
放在冰上15min。将细胞用Gene Pulser电转化仪(BioRad)在600uF和350伏电穿孔。将
细胞置于T-25烧瓶中含有100uM次黄嘌呤和16uM胸苷的CHO-SSFM II培养基，在37℃培
养4天。
与4×10 细胞组合到0.4ml 1×PBS的体积中。将混合物加入到0.4cm比色杯(BioRad)并
放在冰上15min。将细胞用Gene Pulser电转化仪(BioRad)在600uF和350伏电穿孔。将
细胞置于T-25烧瓶中含有100uM次黄嘌呤和16uM胸苷的CHO-SSFM II培养基，在37℃培
养4天。
[0836] 收集含有由这种瞬时CHO表达系统产生的含有四价双特异性抗体的上清液并用Western印迹评价或在ELISA测定中检验对重组产生的IGF-1R受体的单独结合活性。随
后可使用体外细胞存活力测定或体内肿瘤生长抑制测定检验抗体。例如，将一种人类结肠
癌细胞系肿瘤细胞系WiDr(ATCC CCL-218)、一种人类宫颈上皮癌细胞系Me180(ATCC HTB
33)和一种人类乳腺癌细胞系MDA231(Dajun Yang博士，University of Michigan)培养在
带有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、0.5mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素的
MEM-Earles。用PBS漂洗肿瘤细胞系一次，通过用胰蛋白酶消化来释放细胞。通过离心收
集细胞，重悬在完全培养基中，计数，对WiDr和Me180以5000细胞/孔、对MDA231以1500
细胞/孔接种到96-孔组织培养板。
后可使用体外细胞存活力测定或体内肿瘤生长抑制测定检验抗体。例如，将一种人类结肠
癌细胞系肿瘤细胞系WiDr(ATCC CCL-218)、一种人类宫颈上皮癌细胞系Me180(ATCC HTB
33)和一种人类乳腺癌细胞系MDA231(Dajun Yang博士，University of Michigan)培养在
带有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、0.5mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素的
MEM-Earles。用PBS漂洗肿瘤细胞系一次，通过用胰蛋白酶消化来释放细胞。通过离心收
集细胞，重悬在完全培养基中，计数，对WiDr和Me180以5000细胞/孔、对MDA231以1500
细胞/孔接种到96-孔组织培养板。
[0837] 双特异性四价IGF-1R抗体相对于单特异性IGF-1R抗体可产生增强的肿瘤细胞杀伤。例如，双特异性四价IGF-1R抗体可结合到IGF-1R中的变构表位或竞争性表位并引发
IGF-1R内化(参见结合事件#1，图22A)。可选地，双特异性四价IGF-1R抗体可结合到两个
或更多个表位(参见结合事件#2，图22B)从而引发增强的IGF-1R内化。
IGF-1R内化(参见结合事件#1，图22A)。可选地，双特异性四价IGF-1R抗体可结合到两个
或更多个表位(参见结合事件#2，图22B)从而引发增强的IGF-1R内化。
[0838] 实施例8.抗IGF-1R双特异性抗体的稳定性-改造、分子生物学和蛋白表达
[0839] 图23显示本发明的抗IGF-1R IgG-样双特异性抗体(“BsAb”)的示意表示。该设计由结合于IGF-1R上存在的表位(如，Ep-1)并经由柔性连接序列遗传连接于特异性地结
合于第二不同表位(如，Ep-2)的全长抗IGF-1R抗体的氨基(N-BsAb)或羧基末端(C-BsAb)
的稳定化的scFv构成。在图23所示的实施例中，scFv以VL→VH方向构建，但scFv还可
设计为以VH→VL形式起作用。
合于第二不同表位(如，Ep-2)的全长抗IGF-1R抗体的氨基(N-BsAb)或羧基末端(C-BsAb)
的稳定化的scFv构成。在图23所示的实施例中，scFv以VL→VH方向构建，但scFv还可
设计为以VH→VL形式起作用。
[0840] i.表达构建体
[0841] 大体上，除非另外指明，否则以下实施例中用于scFv和抗体重链的表达构建体包括编码具有氨基酸序列MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：134)的N-末端信号肽的核苷
酸序列。用于抗体轻链的表达构建体包括编码氨基酸序列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ
ID NO：131)的 核苷 酸序 列。用于 scFv分子 的表达 构建 体包 括包 含序 列
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH的C-末端标签以便于纯化。
酸序列。用于抗体轻链的表达构建体包括编码氨基酸序列MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ
ID NO：131)的 核苷 酸序 列。用于 scFv分子 的表达 构建 体包 括包 含序 列
DDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH的C-末端标签以便于纯化。
[0842] b.制备抗IGF-1R scFv和Fab蛋白
[0843] 使用美国专利申请第20070243194号中所述的两步骤PCR扩增实验方案从质粒亚克隆抗IGF-1R C06scFv并组装。以所示方向和所示连接序列制备以下四种C06 scFv：
1)VH→(Gly4Ser)3连接序列(SEQ ID NO：185)→VL(VH/GS3/VL)、2)VH→(Gly4Ser)4连
接序列(SEQ ID NO：135)→VL(VH/GS4/VL)、3)VL→(Gly4Ser)3连接序列(SEQ ID NO：
185)→VH(VL/GS3/VH)、和4)VL→(Gly4Ser)4连接序列(SEQ ID NO：135)→VH(VL/GS4/
VH)。图24显示用于两步骤PCR组装C06 scFv的实验方案的示意表示。用于构建的寡核
苷酸显示在表12。作为一个实例，通过首先产生两种分别的PCR产物-scFv的5’半部分
和3’半部分，构建C06(VL/GS3/VH)scFv。随后经由第二PCR反应中共有(Gly4Ser)3(SEQ
ID NO：185)重叠区连接两个半部分。简要地说，使用正向5’VL引物092-F1和反向3’VL
引物092-R2通过PCR产生C06(VL/GS3/VH)scFv的5’半部分，该正向引物由编码gpIII
前导序列的部分的28个碱基随后是C06 N-末端轻链可变结构域基因互补序列的22个
碱基组成，该反向引物由C06 C-末端轻链可变结构域基因互补序列的22个碱基和编码
(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)连接肽的核苷酸序列组成。使用正向5’VH引物092-F2和反
向3’VH引物092-R1通过PCR产生C06(VL/GS3/VH)scFv的3’半部分，该正向引物由编码
(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)连接肽的核苷酸序列和C06N-末端重链可变结构域基因互补
序列的22个碱基组成，该反向引物由C06C-末端重链可变结构域基因互补序列的22个碱
基随后是编码Myc-标签的核苷酸序列组成。随后在第二PCR反应中最终组装C06(VH/GS3/
VL)scFv，使用两个预先合成的各含有编码重叠(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)连接肽的序列的5’和3’半部分基因片段、包含独特的Nde I核酸内切酶位点随后是编码gpIII前导序
列的N-末端部分的序列的5’正向引物GeneIII-F和包含Sal I位点和编码Myc-标签的
序列的3’反向引物IEH083-R。
1)VH→(Gly4Ser)3连接序列(SEQ ID NO：185)→VL(VH/GS3/VL)、2)VH→(Gly4Ser)4连
接序列(SEQ ID NO：135)→VL(VH/GS4/VL)、3)VL→(Gly4Ser)3连接序列(SEQ ID NO：
185)→VH(VL/GS3/VH)、和4)VL→(Gly4Ser)4连接序列(SEQ ID NO：135)→VH(VL/GS4/
VH)。图24显示用于两步骤PCR组装C06 scFv的实验方案的示意表示。用于构建的寡核
苷酸显示在表12。作为一个实例，通过首先产生两种分别的PCR产物-scFv的5’半部分
和3’半部分，构建C06(VL/GS3/VH)scFv。随后经由第二PCR反应中共有(Gly4Ser)3(SEQ
ID NO：185)重叠区连接两个半部分。简要地说，使用正向5’VL引物092-F1和反向3’VL
引物092-R2通过PCR产生C06(VL/GS3/VH)scFv的5’半部分，该正向引物由编码gpIII
前导序列的部分的28个碱基随后是C06 N-末端轻链可变结构域基因互补序列的22个
碱基组成，该反向引物由C06 C-末端轻链可变结构域基因互补序列的22个碱基和编码
(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)连接肽的核苷酸序列组成。使用正向5’VH引物092-F2和反
向3’VH引物092-R1通过PCR产生C06(VL/GS3/VH)scFv的3’半部分，该正向引物由编码
(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)连接肽的核苷酸序列和C06N-末端重链可变结构域基因互补
序列的22个碱基组成，该反向引物由C06C-末端重链可变结构域基因互补序列的22个碱
基随后是编码Myc-标签的核苷酸序列组成。随后在第二PCR反应中最终组装C06(VH/GS3/
VL)scFv，使用两个预先合成的各含有编码重叠(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：185)连接肽的序列的5’和3’半部分基因片段、包含独特的Nde I核酸内切酶位点随后是编码gpIII前导序
列的N-末端部分的序列的5’正向引物GeneIII-F和包含Sal I位点和编码Myc-标签的
序列的3’反向引物IEH083-R。
[0844] 通过琼脂糖凝胶电泳拆分对应预期大小的PCR产物，切除，根据制造商的说明书使用Millipore Ultrafree-DA提取试剂盒(Millipore；Bedford，MA)纯化。随后用Nde I
和Sal I消化纯化的PCR产物，克隆到设计为在诱导型ara C启动子控制下驱动重组蛋白
表达的修饰的大肠杆菌表达载体的Nde I/Sal I位点。表达载体包含编码与C06 scFv的
起始密码子重叠的独特Nde I位点的修饰和C-末端的His-标签，随后是终止密码子。将
凝胶纯化的PCR产物连接到Nde I/Sal I消化的表达质粒，部分连接混合物用于转化大肠
杆菌菌株XL1-Blue。筛选氨苄西林药物抗性菌落，DNA序列分析证实编码C06(VL/GS3/VH)
scFv的最终质粒pXWU092的正确序列。scFv构建体包含gIII信号肽，终止于c-myc-Hisβ
检测标签。
和Sal I消化纯化的PCR产物，克隆到设计为在诱导型ara C启动子控制下驱动重组蛋白
表达的修饰的大肠杆菌表达载体的Nde I/Sal I位点。表达载体包含编码与C06 scFv的
起始密码子重叠的独特Nde I位点的修饰和C-末端的His-标签，随后是终止密码子。将
凝胶纯化的PCR产物连接到Nde I/Sal I消化的表达质粒，部分连接混合物用于转化大肠
杆菌菌株XL1-Blue。筛选氨苄西林药物抗性菌落，DNA序列分析证实编码C06(VL/GS3/VH)
scFv的最终质粒pXWU092的正确序列。scFv构建体包含gIII信号肽，终止于c-myc-Hisβ
检测标签。
[0845] 以与上述相似的方式制备其余的三种抗IGF-1R C06 scFv，使用表12所列的寡核苷酸并按照图24所示的图解。质粒pXWU090编码C06(VH/GS3/VL)scFv，pXWU091编码
C06(VH/GS4/VL)scFv，质粒pXWU093编码C06(VL/GS4/VH)scFv。示例性scFv C06(VL/GS3/
VH)scFv(pXWU092)和C06(VH/GS3/VL)scFv(pXWU090)的DNA和氨基酸序列分别显示在图
25A和25B，图26A和26B。
C06(VH/GS4/VL)scFv，质粒pXWU093编码C06(VL/GS4/VH)scFv。示例性scFv C06(VL/GS3/
VH)scFv(pXWU092)和C06(VH/GS3/VL)scFv(pXWU090)的DNA和氨基酸序列分别显示在图
25A和25B，图26A和26B。
[0846] 表12.用于PCR扩增普通C06 scFv的寡核苷酸
[0847]引物 序列
GeneIII-F 5’-GAATTACATATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTG
(SEQ ID GTGGT GCCGTTCTATAGC-3’
NO：145)
IEH083-R 5’-ATGATGGTCGACGGCGCTATTCAGATCCTCTTCTGAGAT
(SEQ ID GAGTTTTTGTTCTAGAAAGC-3’
NO：146)
090-F1 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGTGAAGTTCAATT
(SEQ ID GTTAGAGTCTGG-3’
NO：147)
090-F2 5’-TCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGTAGTGACAT
(SEQ ID CCAGATGACCCAGTCTCC-3’
NO：148)
引物 序列
090-R1 5’-GAGTTTTTGTTCTAGAAAGCTTTTGTCGTCGTCGTCTTT
(SEQ ID GATCTCCAGTTTGGTCCCCTG-3’
NO：149)
090-R2 5’-
(SEQ ID CCGGACCCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCGCTTGAG
NO：150) ACGGTGACCATTGTC-3’
091-F2 5’-
(SEQ ID GGGCGGATCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGTA
NO：151) GTGACATCCAGATGACCCAGTCTC-3’
091-R2 5’-CCCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCGGACCCTCCAC
(SEQ ID CGCCGCTTGAGACGGTGACCATTGTC-3’
NO：152)
092-F1 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGTGACATCCAGA
(SEQ ID TGACCCAGTCTC-3’
NO：153)
092-F2 5’-ATCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGTAGTGAA
(SEQ ID GTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGG-3’
NO：154)
092-R1 5’-GAGTTTTTGTTCTAGAAAGCTTTTGTCGTCGTCGTCGCT
(SEQ ID TGAGACGGTGACCATTGTC-3’
NO：155)
092-R2 5’-ACCGGACCCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCTTTGA
(SEQ ID TCTCCAGTTTGGTCCCCTG-3’
NO：156)
093-F2 5’-GGGCGGATCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGT
(SEQ ID AGTGAAGTTCAATTGTTAGAGTCTG-3’
NO：157)
引物 序列
093-R2 5’-CCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCGGACCCTCC
(SEQ ID ACCGCCTTTGATCTCCAGTTTGGTCCCCTG-3’
NO：158)
GeneIII-F 5’-GAATTACATATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTG
(SEQ ID GTGGT GCCGTTCTATAGC-3’
NO：145)
IEH083-R 5’-ATGATGGTCGACGGCGCTATTCAGATCCTCTTCTGAGAT
(SEQ ID GAGTTTTTGTTCTAGAAAGC-3’
NO：146)
090-F1 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGTGAAGTTCAATT
(SEQ ID GTTAGAGTCTGG-3’
NO：147)
090-F2 5’-TCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGTAGTGACAT
(SEQ ID CCAGATGACCCAGTCTCC-3’
NO：148)
引物 序列
090-R1 5’-GAGTTTTTGTTCTAGAAAGCTTTTGTCGTCGTCGTCTTT
(SEQ ID GATCTCCAGTTTGGTCCCCTG-3’
NO：149)
090-R2 5’-
(SEQ ID CCGGACCCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCGCTTGAG
NO：150) ACGGTGACCATTGTC-3’
091-F2 5’-
(SEQ ID GGGCGGATCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGTA
NO：151) GTGACATCCAGATGACCCAGTCTC-3’
091-R2 5’-CCCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCGGACCCTCCAC
(SEQ ID CGCCGCTTGAGACGGTGACCATTGTC-3’
NO：152)
092-F1 5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGTGACATCCAGA
(SEQ ID TGACCCAGTCTC-3’
NO：153)
092-F2 5’-ATCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGTAGTGAA
(SEQ ID GTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGG-3’
NO：154)
092-R1 5’-GAGTTTTTGTTCTAGAAAGCTTTTGTCGTCGTCGTCGCT
(SEQ ID TGAGACGGTGACCATTGTC-3’
NO：155)
092-R2 5’-ACCGGACCCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCTTTGA
(SEQ ID TCTCCAGTTTGGTCCCCTG-3’
NO：156)
093-F2 5’-GGGCGGATCTGGGGGCGGCGGGTCCGGTGGTGGTGGT
(SEQ ID AGTGAAGTTCAATTGTTAGAGTCTG-3’
NO：157)
引物 序列
093-R2 5’-CCGCCGCCCCCAGATCCGCCCCCACCGGACCCTCC
(SEQ ID ACCGCCTTTGATCTCCAGTTTGGTCCCCTG-3’
NO：158)
[0848]
[0849] 对于普通C06 scFv的表达，培养转化有质粒pXWU090、pXWU091、pXWU092和pXWU093的大肠杆菌菌株W3110(ATCC，Manassas，Va.目录号27325)的新分离的菌落，如美
国专利申请第11/725,970号所述的制备培养上清液或周质提取物，该申请通过引用全文
并入本文。通过酶促消化C06 IgG制备C06 FAb。将纯化的FAb浓缩到～2mg/mL。使用
-1 -1
ε280nm＝1.5mL mg cm 确定Fab浓度。
国专利申请第11/725,970号所述的制备培养上清液或周质提取物，该申请通过引用全文
并入本文。通过酶促消化C06 IgG制备C06 FAb。将纯化的FAb浓缩到～2mg/mL。使用
-1 -1
ε280nm＝1.5mL mg cm 确定Fab浓度。
[0850] c.普通C06 scFv抗体的热稳定性
[0851] 采用美国专利申请第11/725,970号所述的热攻击测定作为稳定性筛选来确定在热攻击事件后50％的C06(VL/GS3/VH)和C06(VH/GS3/VL)scFv分子保持其抗原结合活性的
温度。
温度。
[0852] 在诱导型ara C启动子控制下用编码各种C06 scFv的质粒pXWU090、pXWU091、pXWU092和pXWU093转化大肠杆菌菌株W3110(ATCC，Manassas，Va.目录号27325)。将转
化体在由补充有0.6％甘氨酸、0.6％Triton X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄西林
的SB(Teknova，Half Moon Bay，Ca.目录号S0140)组成的表达培养基中在30℃生长过夜。
通过离心使细菌成团，收集上清液用于进一步处理。
化体在由补充有0.6％甘氨酸、0.6％Triton X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄西林
的SB(Teknova，Half Moon Bay，Ca.目录号S0140)组成的表达培养基中在30℃生长过夜。
通过离心使细菌成团，收集上清液用于进一步处理。
[0853] 热攻击后，通过离心除去聚集的材料，由DELFIA测定测量处理的、澄清上清液中剩余的可溶的scFv样品对同源可溶的IGF-1R-Fc抗原的结合。在4℃用PBS中1μg/ml可
溶的IGF-1R-Fc抗原包被96-孔板(MaxiSorp，Nalge Nunc，Rochester，NY，目录号437111)过夜，随后用DELFIA测定缓冲液(DAB，10mM Tris HCl、150mM NaCl、20μM EDTA、0.5％BSA、
0.02％Tween 20、0.01％NaN3、pH 7.4)在室温阻断一小时，伴随摇动。用无BSA的DAB(洗
涤缓冲液)洗涤板3次，将DAB中稀释的检验样品加入板，终体积是100□l。在室温伴随
摇动培养板一小时，随后用洗涤缓冲液洗涤3次以除去未结合的和功能上失活的scFv分
子。通过加入100□l/孔含有250ng/ml Eu-标记的抗His6抗体(Perkin Elmer，Boston，
MA，目录号AD0109)的DAB来检测结合的scFv并在室温伴随摇动培养一小时。用洗涤缓
冲液洗涤板3次，每孔加入100□l DELFIA强化溶液(Perkin Elmer，Boston，MA，目录号
4001-0010)。培养15分钟后，使用铕方法在Victor 2(Perkin Elmer，Boston，MA)上读取
板。使用Prism 4软件(GraphPad Software，San Diego，Ca)分析数据，使用斜率可变的S
形剂量响应作为模型。对热变性曲线中点获得的值称为T50值，不解释为与生物物理地推算的Tm值相等。
溶的IGF-1R-Fc抗原包被96-孔板(MaxiSorp，Nalge Nunc，Rochester，NY，目录号437111)过夜，随后用DELFIA测定缓冲液(DAB，10mM Tris HCl、150mM NaCl、20μM EDTA、0.5％BSA、
0.02％Tween 20、0.01％NaN3、pH 7.4)在室温阻断一小时，伴随摇动。用无BSA的DAB(洗
涤缓冲液)洗涤板3次，将DAB中稀释的检验样品加入板，终体积是100□l。在室温伴随
摇动培养板一小时，随后用洗涤缓冲液洗涤3次以除去未结合的和功能上失活的scFv分
子。通过加入100□l/孔含有250ng/ml Eu-标记的抗His6抗体(Perkin Elmer，Boston，
MA，目录号AD0109)的DAB来检测结合的scFv并在室温伴随摇动培养一小时。用洗涤缓
冲液洗涤板3次，每孔加入100□l DELFIA强化溶液(Perkin Elmer，Boston，MA，目录号
4001-0010)。培养15分钟后，使用铕方法在Victor 2(Perkin Elmer，Boston，MA)上读取
板。使用Prism 4软件(GraphPad Software，San Diego，Ca)分析数据，使用斜率可变的S
形剂量响应作为模型。对热变性曲线中点获得的值称为T50值，不解释为与生物物理地推算的Tm值相等。
[0854] 该测定的结果确定C06(VL/GS3/VH)的T50值是57.46℃，C06(VH/GS3/VL)T50值略低，是55.71℃(图27)。考虑到仅连接序列长度不同的构建体的T50值不存在有意义的差
异，以及观察到两种方向中C06(VL→(Gly4Ser)n＝3或4(SEQ ID NO：185或135)→VH)scFv
比C06(VH→(Gly4Ser)n＝3或4(SEQ ID NO：185或135)→VL)scFv略微更热稳定，选择含有
(Gly4Ser)3连接序列的C06(VL/GS3/VH)(SEQ ID NO：185)(质粒pXWU092)用于进一步稳定
性改造。
异，以及观察到两种方向中C06(VL→(Gly4Ser)n＝3或4(SEQ ID NO：185或135)→VH)scFv
比C06(VH→(Gly4Ser)n＝3或4(SEQ ID NO：185或135)→VL)scFv略微更热稳定，选择含有
(Gly4Ser)3连接序列的C06(VL/GS3/VH)(SEQ ID NO：185)(质粒pXWU092)用于进一步稳定
性改造。
[0855] d.构建具有提高的热稳定性的C06 scFv分子
[0856] 使用列在表13的寡核苷酸，将单独变体和文库设计为普通C06(VL/GS3/VH)scFv(pXWU092)中包含期望的氨基酸取代。表13中，每种寡核苷酸名称提供按照Kabat编
号系统对在VH或VL中的位置中期望的氨基酸取代的参考。
号系统对在VH或VL中的位置中期望的氨基酸取代的参考。
[0857] 表13.构建变体C06(VL/GS3/VH)scFv的寡核苷酸和基本原理。
[0858]寡核苷酸名称 基本原理 序列 SEQ ID
NO：
VL_M4L COVAR CATAGTGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCACTC 159
VH_W47IF COMP GGTAAAGGTTTGGAGWTCGTTTCTGGTATCTCTC 160
VL_V15PLDSAG COMP，COVAR CTCCCTGTCTGCATCTVNCGGAGACAGAGTCACC 161
VL_Q24AKR CONS GTCACCATCACTTGCRVGGCGAGTCGGGACATTAG 162
VL_T20R COVAR GTAGGAGACAGAGTCCGCATCACTTGCCAGGCG 163
VL_R30TN COMP GCGAGTCGGGACATTAMCAACTATTTAAATTGG 164
VH_S21E COMP GGTTCTTTACGTCTTGAATGCGCTGCTTCCGG 165
VL_A51G COMP CTCCTGATCTACGATGGCTCCAGTTTGCAAACAG 166
VL_S72TY COVAR CTGGGACAGACTTTWMCTTCACCATCGGCAGC 167
VL_I83ETALFS COVAR，COMP CTGCAGCCTGAAGATNNKGCAACATATTACTGTC 168
VH_R83KT COVAR，COMP CTGCAGCCTGAAGATNNKGCAACATATTACTGTC 169
VH_T110V COVAR CAAGGGACAATGGTCGTGGTCTCAAGCGACGAC 170
NO：
VL_M4L COVAR CATAGTGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCACTC 159
VH_W47IF COMP GGTAAAGGTTTGGAGWTCGTTTCTGGTATCTCTC 160
VL_V15PLDSAG COMP，COVAR CTCCCTGTCTGCATCTVNCGGAGACAGAGTCACC 161
VL_Q24AKR CONS GTCACCATCACTTGCRVGGCGAGTCGGGACATTAG 162
VL_T20R COVAR GTAGGAGACAGAGTCCGCATCACTTGCCAGGCG 163
VL_R30TN COMP GCGAGTCGGGACATTAMCAACTATTTAAATTGG 164
VH_S21E COMP GGTTCTTTACGTCTTGAATGCGCTGCTTCCGG 165
VL_A51G COMP CTCCTGATCTACGATGGCTCCAGTTTGCAAACAG 166
VL_S72TY COVAR CTGGGACAGACTTTWMCTTCACCATCGGCAGC 167
VL_I83ETALFS COVAR，COMP CTGCAGCCTGAAGATNNKGCAACATATTACTGTC 168
VH_R83KT COVAR，COMP CTGCAGCCTGAAGATNNKGCAACATATTACTGTC 169
VH_T110V COVAR CAAGGGACAATGGTCGTGGTCTCAAGCGACGAC 170
[0859] “基本原理”是指采用的设计方法。所述方法详细描述在美国专利申请第11/725,970号。缩写：“COMP”-计算分析，“COVAR”-共变分析，“CONS”-一致性打分，“DEGEN”-简并密码子，
[0860] 多义碱基缩写如下：W＝A或T，V＝A或C或G，Y＝C或T，S＝C或G，M＝A或C，N＝A或C或G或T，R＝A或G，K＝G或T，B＝C或G或T(J Biol Chem.261(1)：
13-7(1986))。
13-7(1986))。
[0861] 进行诱变反应，挑取单独转化的菌落到深-孔96孔盘，根据美国专利申请第11/725,970号详述的方法加工和筛选。转化体在由补充有0.6％甘氨酸、0.6％Triton
X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄西林的SB(Teknova，HalfMoon Bay，CA目录号
S0140)组成的表达培养基中在30℃或32℃生长过夜。
X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄西林的SB(Teknova，HalfMoon Bay，CA目录号
S0140)组成的表达培养基中在30℃或32℃生长过夜。
[0862] 使用热攻击测定两份地筛选每种文库，使来自一份的上清液经受处理条件，第二种上清液作为未处理的参考。热攻击后，由离心除去聚集的材料，在可溶的IGF-1R Fc
DELFIA中测定，如实施例3所述。
DELFIA中测定，如实施例3所述。
[0863] 使用Spotfire DecisionSite软件(Spotfire，Somerville，MA.)加工测定数据，表示为对每种克隆在攻击温度观察到的DELFIA计数与在参考温度观察到的DELFIA计数
的比值。可再生地获得大于或等于对亲本质粒观察到的值的两倍的值的克隆认为是击中
(hit)。由微制备(Wizard Plus，Promega，Madison，WI)分离来自这些阳性克隆的质粒DNA，再转化回到大肠杆菌W3110中以证实第二次热攻击测定以及确定DNA序列。
的比值。可再生地获得大于或等于对亲本质粒观察到的值的两倍的值的克隆认为是击中
(hit)。由微制备(Wizard Plus，Promega，Madison，WI)分离来自这些阳性克隆的质粒DNA，再转化回到大肠杆菌W3110中以证实第二次热攻击测定以及确定DNA序列。
[0864] 来自这些测定的最初结果和证实结果显示在表14。与普通C06scFv(pXWU092)相比，本发明的许多稳定化的scFv分子导致结合活性改进(T50＞58℃)。特别是，从文
库位置VL4(M4L)、文库位置VL15(V15N、V15S、V15D、V15I、V15R、V15A和V15P)、文库位置VL24(Q24K)、文库位置VL30(R30T)、文库位置VL51(A51G)、文库位置VL72(S72N)和文库位置VL83(I83M、I83V、I83G、I83D、I83Q、I83E和I83S)的变异C06 scFv的T50值相对于普通
C06scFv表现范围从+3℃到+7℃的热稳定性(□T50值)增加。从文库位置VH47(W47F)、
文库位置VH83(R83K和R83T)、和文库位置VH110(T110V)的变异C06 scFv的T50值相对于
普通C06 scFv表现范围从+4℃至+6℃的热稳定性增加。从文库位置VL72(S72Y和S72N)
的变异C06scFv的T50值相对于普通C06 scFv分别表现+2℃至+5℃的热稳定性增加。
库位置VL4(M4L)、文库位置VL15(V15N、V15S、V15D、V15I、V15R、V15A和V15P)、文库位置VL24(Q24K)、文库位置VL30(R30T)、文库位置VL51(A51G)、文库位置VL72(S72N)和文库位置VL83(I83M、I83V、I83G、I83D、I83Q、I83E和I83S)的变异C06 scFv的T50值相对于普通
C06scFv表现范围从+3℃到+7℃的热稳定性(□T50值)增加。从文库位置VH47(W47F)、
文库位置VH83(R83K和R83T)、和文库位置VH110(T110V)的变异C06 scFv的T50值相对于
普通C06 scFv表现范围从+4℃至+6℃的热稳定性增加。从文库位置VL72(S72Y和S72N)
的变异C06scFv的T50值相对于普通C06 scFv分别表现+2℃至+5℃的热稳定性增加。
[0865] 两种变异C06 scFv包含偶然地来自寡核苷酸引物的PCR错误或突变的稳定化突变VL D70E和VL T74S，相对于普通C06 scFv表现热稳定性分别增加+4℃和+5℃，并包括
在进一步分析中。
在进一步分析中。
[0866] 表14.C06VH和VL文库位置、文库组成和筛选结果
[0867]位置 文库 观察到的击中序列 ΔT50(℃)
VL4 L M4L +4
VL15 N，T，I，S，H，P，R，L， V15N，V15I，V15S， +6，+3.+3，
D，A，G，V V15D，V15R， +3，+3，
V15P，V15A，V15G +3，+3，+3，
VL24 K，T，R，E，A，G Q24K +3
VL30 N，T R30T +3
VL47 * T47S +5
VL51 G A51G +7
位置 文库 观察到的击中序列 ΔT50(℃)
VL72 N，T，Y，S S72N，S72Y +5，+2
VL74 * D70E +4
VL83 所有氨基酸 I83M，I83V，I83D， +5，+4，+4，
I83Q，I83E，I83S， +5，+6，+5，
I83G +6
VH47 F W47F +6
VH83 K，T R83K，R83T +5，+4
VH110 V T110V +6
VL4 L M4L +4
VL15 N，T，I，S，H，P，R，L， V15N，V15I，V15S， +6，+3.+3，
D，A，G，V V15D，V15R， +3，+3，
V15P，V15A，V15G +3，+3，+3，
VL24 K，T，R，E，A，G Q24K +3
VL30 N，T R30T +3
VL47 * T47S +5
VL51 G A51G +7
位置 文库 观察到的击中序列 ΔT50(℃)
VL72 N，T，Y，S S72N，S72Y +5，+2
VL74 * D70E +4
VL83 所有氨基酸 I83M，I83V，I83D， +5，+4，+4，
I83Q，I83E，I83S， +5，+6，+5，
I83G +6
VH47 F W47F +6
VH83 K，T R83K，R83T +5，+4
VH110 V T110V +6
[0868] *由PCR人为现象产生的非目标突变
[0869] 随后构建由稳定化突变VL V15N、VL V15S、VL T20R、VLR30N、VL R30Y、VL G63S、VL S72N、VL S72Y、VL S77G、VL I83G、VL I83Q和VH T110V的各种排列组成的质粒以鉴定进一步增强热稳定性的组合。挑取单独转化的菌落到深-孔96孔盘，如上所述地加工用于筛选。对含有单独和组合的稳定化突变的C06 scFv蛋白检验以下：1)在T50热攻击测定中的热稳
定性，和2)由生物层干涉(biolayer interferometry)(Octet QK System，ForteBio，Inc.MenloPark，CA)检验对IGF-1R-Fc的动力学解离速率(解离常数或kd)。对于解离速率分
析，将IGF-1R Fc固定到蛋白A生物感应器的表面。将含有来自三十个克隆的变异C06 scFv
的培养上清液筛选对抗原的结合，随后进行解离常数分析。允许ScFv对固定的IGF-1R Fc
结合300秒。随后测定解离速率600秒。使用制造商提供的软件计算解离常数(kd)，比较
解离速率与普通C06scFv的kd。表15概述了T50热攻击测定和解离速率分析的结果。鉴定
相对于普通C06 scFv表现范围从+8℃到+10℃的热稳定性增加的单独和组合的稳定化突
变。在位置VL15与VH110(VL L15S：VH T110V)和位置VL77与VL83(S77G：I83Q)组合的C06
突变的T50值相对于普通C06 scFv增强scFv的热稳定性(T50)+8-10℃。
定性，和2)由生物层干涉(biolayer interferometry)(Octet QK System，ForteBio，Inc.MenloPark，CA)检验对IGF-1R-Fc的动力学解离速率(解离常数或kd)。对于解离速率分
析，将IGF-1R Fc固定到蛋白A生物感应器的表面。将含有来自三十个克隆的变异C06 scFv
的培养上清液筛选对抗原的结合，随后进行解离常数分析。允许ScFv对固定的IGF-1R Fc
结合300秒。随后测定解离速率600秒。使用制造商提供的软件计算解离常数(kd)，比较
解离速率与普通C06scFv的kd。表15概述了T50热攻击测定和解离速率分析的结果。鉴定
相对于普通C06 scFv表现范围从+8℃到+10℃的热稳定性增加的单独和组合的稳定化突
变。在位置VL15与VH110(VL L15S：VH T110V)和位置VL77与VL83(S77G：I83Q)组合的C06
突变的T50值相对于普通C06 scFv增强scFv的热稳定性(T50)+8-10℃。
[0870] 与普通C06 scFv(pXWU092)相比，检验的所有稳定性-改造的C06 scFv具有小于2倍的解离速率改变。基于稳定性(高T50值)和解离速率特性，一种选择稳定性-改造的
C06 scFv：MJF045作为用于构建和产生稳定的抗IGF-1R双特异性抗体的实例。
C06 scFv：MJF045作为用于构建和产生稳定的抗IGF-1R双特异性抗体的实例。
[0871] 表15.稳定化的C06 scFv蛋白的氨基酸取代，来自热攻击测定的T50结果，和解离速率确定。表现T50≥66℃的蛋白显示为粗体。
[0872]
[0873] e.稳定化的抗IGF-1R双特异性抗体的产生
[0874] 本发明的稳定化的C06VL I83E scFv(MJF045)用于构建双特异性抗体为N-末端和C-末端scFv融合蛋白两者，如图23所示。C06MJF045scFv的DNA和氨基酸序列分别显
示在图28A和28B。
示在图28A和28B。
[0875] i.构建N-末端抗IGF-IR双特异性抗体
[0876] 使用与美国专利申请第11/725,970号所述的相似方法，以上实施例4中所述的MJF045 C06 scFv DNA用于构建N-末端抗IGF-1R双特异性抗体。(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：
184)连接序列用于连接稳定化的C06 scFv到G11 IgG lys(-)重链的成熟氨基末端。首
先，通过亚克隆编码来自美国专利申请第20070243194号中所述的抗IGF-1R G11质粒的
G11 IgGlys(-)序列的MluI+BamHI DNA片段来构建中间N-末端抗IGF-1R BsAb重链载体。
中间载体pXWU117包含合成的重链前导序列、G11 IgG lys(-)序列随后是在IgG1 CH3结
构域羧基末端的BamH I位点。然后，亚克隆MJF045 C06 scFv并使用表16中所述的寡核
苷酸引物，使用两步骤PCR扩增实验方案修饰。简要地说，在第一反应中，使用稳定化的C06 scFv(MJF045)作为模板产生PCR产物，正向5’C06 scFv VL PCR引物136-F包括Mlu I限
制性核酸内切酶位点、随后是编码重链信号肽最后三个氨基酸的序列、随后是与C06 scFv VL氨基末端互补的序列，反向3’C06 scFv VH引物是136-R2。136-R2由与C06 scFv VH
羧基末端互补的序列、随后是编码部分(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)连接序列的核苷酸序
列组成。几个PCR循环后，将由与(Gly4Ser)5(SEQ IDNO：184)连接序列和G11 VH的N-末
端互补的序列、随后是内部Nhe I位点组成的第二反向引物136-R1a加到PCR混合物中，反
应继续另外20个循环。
184)连接序列用于连接稳定化的C06 scFv到G11 IgG lys(-)重链的成熟氨基末端。首
先，通过亚克隆编码来自美国专利申请第20070243194号中所述的抗IGF-1R G11质粒的
G11 IgGlys(-)序列的MluI+BamHI DNA片段来构建中间N-末端抗IGF-1R BsAb重链载体。
中间载体pXWU117包含合成的重链前导序列、G11 IgG lys(-)序列随后是在IgG1 CH3结
构域羧基末端的BamH I位点。然后，亚克隆MJF045 C06 scFv并使用表16中所述的寡核
苷酸引物，使用两步骤PCR扩增实验方案修饰。简要地说，在第一反应中，使用稳定化的C06 scFv(MJF045)作为模板产生PCR产物，正向5’C06 scFv VL PCR引物136-F包括Mlu I限
制性核酸内切酶位点、随后是编码重链信号肽最后三个氨基酸的序列、随后是与C06 scFv VL氨基末端互补的序列，反向3’C06 scFv VH引物是136-R2。136-R2由与C06 scFv VH
羧基末端互补的序列、随后是编码部分(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：184)连接序列的核苷酸序
列组成。几个PCR循环后，将由与(Gly4Ser)5(SEQ IDNO：184)连接序列和G11 VH的N-末
端互补的序列、随后是内部Nhe I位点组成的第二反向引物136-R1a加到PCR混合物中，反
应继续另外20个循环。
[0877] 用Mlu I和Nhe I消化内切酶消化所获得的PCR片段，连接到Mlu I/Nhe I消化的中间载体pXWU117。这获得稳定化的C06 scFv经由25个氨基酸的(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：
184)连接序列与G11抗体VH结构域氨基末端的融合产物。连接混合物用于转化大肠杆菌
菌株TOP 10感受态细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。筛选转化有氨苄西林
药物抗性的大肠杆菌菌落中插入子的存在。DNA序列分析用于证实编码包含稳定性-改造
的C06 scFv和G11 IgG的N-末端抗IGF-1R双特异性抗体的最终构建体pXWU136的正确
序列。使用的G11轻链(pXWU118)是抗IGF-1R N-和C-双特异性抗体之间共同的，DNA和
氨基酸序列分别显示在图29A和29B。包含稳定化的MJF045 scFv的N-末端抗IGF-1R双
特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列(pXWU136)分别显示在图30A和30B。
184)连接序列与G11抗体VH结构域氨基末端的融合产物。连接混合物用于转化大肠杆菌
菌株TOP 10感受态细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。筛选转化有氨苄西林
药物抗性的大肠杆菌菌落中插入子的存在。DNA序列分析用于证实编码包含稳定性-改造
的C06 scFv和G11 IgG的N-末端抗IGF-1R双特异性抗体的最终构建体pXWU136的正确
序列。使用的G11轻链(pXWU118)是抗IGF-1R N-和C-双特异性抗体之间共同的，DNA和
氨基酸序列分别显示在图29A和29B。包含稳定化的MJF045 scFv的N-末端抗IGF-1R双
特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列(pXWU136)分别显示在图30A和30B。
[0878] 表16.用于构建带有稳定化的C06 scFv的N-末端抗IGF-1R双特异性抗体的寡核苷酸。限制性核酸内切酶位点以下划线显示。
[0879]136-F 5’-GTTGCTACGCGTGTCCTGTCCGACATCCAGATGACCCAG
(SEQ ID TC-3’
NO：171)
136-R1a 5’-
(SEQ ID GAAGCCGCTAGCTGCGCAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCC
NO：172) AGGCTGCACCAGGCCACCGCCGGACTCCAACAGCTGGAC
CTC
GGAGCCACCTCCCCCGGATCCACC-3’
136-R2 5’-ACCTCCCCCGGATCCACCGCCCCCTGAACCGCCCCCTCC
(SEQ ID AGAGCCCCCTCCACCGGACCCTCCACCGCCGCTTGAGACG
GTGACCATTG-3’
NO：173)
(SEQ ID TC-3’
NO：171)
136-R1a 5’-
(SEQ ID GAAGCCGCTAGCTGCGCAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCC
NO：172) AGGCTGCACCAGGCCACCGCCGGACTCCAACAGCTGGAC
CTC
GGAGCCACCTCCCCCGGATCCACC-3’
136-R2 5’-ACCTCCCCCGGATCCACCGCCCCCTGAACCGCCCCCTCC
(SEQ ID AGAGCCCCCTCCACCGGACCCTCCACCGCCGCTTGAGACG
GTGACCATTG-3’
NO：173)
[0880] ii.构建C-末端抗IGF-1R双特异性抗体
[0881] 使用与美国专利申请第11/725,970号所述的相似方法，以上实施例4中所述的MJF045 C06 scFv DNA用于构建C-末端抗IGF-1R双特异性抗体。Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID
NO：138)连接序列用于连接稳定化的C06 scFv到G11 IgG重链的羧基末端。首先，通过
亚克隆编码来自美国专利申请公布第20070243194号中所述的抗IGF-1RG11质粒的G11
IgG序列的PCR-产生的DNA片段来构建中间C-末端抗IGF-1R BsAb重链载体。PCR反应
包括的正向5’-引物MB-04F(表17)包含与IgG CH2恒定结构域互补的序列，并包括用
于克隆的Age I限制性核酸内切酶位点，反向3’-引物106mR2包含与IgG重链的羧基末
端互补的序列，随后是编码含有内部BamH I位点、随后是Dra III位点和末端Bgl II位
点的框内Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)连接序列的部分的序列(表17)，G11重链作为
模板。所得的PCR产物除去了在IgG重链基因3’端存在的终止密码子，加入了编码部分
Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)连接序列的核苷酸，随后紧接着BamH I限制性核酸内切酶位点、Dra III位点，终止于Bgl II位点。用Age I和Bgl I限制性核酸内切酶消化PCR
片段，连接到Age I/Bgl I消化的修饰的pV90载体。这获得包含合成的重链前导序列、G11 IgG序列、和编码含有内部BamH I位点、随后是Dra III位点的Ser(G1y4Ser)3(SEQ ID NO：
138)连接序列的部分的序列的中间载体pXWU106m2。
NO：138)连接序列用于连接稳定化的C06 scFv到G11 IgG重链的羧基末端。首先，通过
亚克隆编码来自美国专利申请公布第20070243194号中所述的抗IGF-1RG11质粒的G11
IgG序列的PCR-产生的DNA片段来构建中间C-末端抗IGF-1R BsAb重链载体。PCR反应
包括的正向5’-引物MB-04F(表17)包含与IgG CH2恒定结构域互补的序列，并包括用
于克隆的Age I限制性核酸内切酶位点，反向3’-引物106mR2包含与IgG重链的羧基末
端互补的序列，随后是编码含有内部BamH I位点、随后是Dra III位点和末端Bgl II位
点的框内Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)连接序列的部分的序列(表17)，G11重链作为
模板。所得的PCR产物除去了在IgG重链基因3’端存在的终止密码子，加入了编码部分
Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)连接序列的核苷酸，随后紧接着BamH I限制性核酸内切酶位点、Dra III位点，终止于Bgl II位点。用Age I和Bgl I限制性核酸内切酶消化PCR
片段，连接到Age I/Bgl I消化的修饰的pV90载体。这获得包含合成的重链前导序列、G11 IgG序列、和编码含有内部BamH I位点、随后是Dra III位点的Ser(G1y4Ser)3(SEQ ID NO：
138)连接序列的部分的序列的中间载体pXWU106m2。
[0882] 接下来，通过PCR扩增来自稳定化的C06 scFv(MJF045)的DNA序列，使用正向5’VL PCR引物135-F(包括BamH I限制性核酸内切酶位点，随后是编码Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)连接肽的其余部分和C06 scFv VL氨基末端的序列)和反向3’VHPCR引物
135-R(包括C06 scFv VH的羧基末端和终止密码子，随后是DraIII位点)。凝胶分离PCR
产物，用BamHI和DraIII限制性核酸内切酶消化，连接到BamHI/DraIII消化的中间载体
pXWU106m2。这获得稳定化的C06 scFv经由16个氨基酸的Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)
连接序列与G11抗体CH3结构域羧基末端的融合产物。连接混合物用于转化大肠杆菌菌株
TOP10感受态细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。筛选转化有氨苄西林药物抗性的大肠杆菌菌落中插入子的存在。DNA序列分析用于证实编码包含稳定性-改造的C06
scFv和G11 IgG的C-末端抗IGF-1R双特异性抗体的最终构建体pXWU135的正确序列。
135-R(包括C06 scFv VH的羧基末端和终止密码子，随后是DraIII位点)。凝胶分离PCR
产物，用BamHI和DraIII限制性核酸内切酶消化，连接到BamHI/DraIII消化的中间载体
pXWU106m2。这获得稳定化的C06 scFv经由16个氨基酸的Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：138)
连接序列与G11抗体CH3结构域羧基末端的融合产物。连接混合物用于转化大肠杆菌菌株
TOP10感受态细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。筛选转化有氨苄西林药物抗性的大肠杆菌菌落中插入子的存在。DNA序列分析用于证实编码包含稳定性-改造的C06
scFv和G11 IgG的C-末端抗IGF-1R双特异性抗体的最终构建体pXWU135的正确序列。
[0883] 表17.用于构建带有稳定化的C06 scFv的C-末端抗IGF-1R双特异性抗体的寡核苷酸。限制性核酸内切酶位点以下划线显示。
[0884]135-F 5’-
(SEQ ID GGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGG
NO：174) CGGGTCCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’
135-R 5’-GGATCTCACTGGGTGTCAGCTTGAGACGGTGACC
(SEQ ID ATTG-3’
NO：175)
MB-04F 5’-CTTCCCCGAACCGGTGACGGTG-3’
(SEQ ID
NO：176)
106mR2 5’-GGGCAGAGATCTCACTGGGTGTCAGCCGGGATC
(SEQ ID CACCCCCGCCGGATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG
-3’
NO：177)
(SEQ ID GGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGG
NO：174) CGGGTCCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’
135-R 5’-GGATCTCACTGGGTGTCAGCTTGAGACGGTGACC
(SEQ ID ATTG-3’
NO：175)
MB-04F 5’-CTTCCCCGAACCGGTGACGGTG-3’
(SEQ ID
NO：176)
106mR2 5’-GGGCAGAGATCTCACTGGGTGTCAGCCGGGATC
(SEQ ID CACCCCCGCCGGATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG
-3’
NO：177)
[0885] 使用的G11轻链(pXWU118)是抗IGF-1R N-和C-双特异性抗体之间共同的，DNA和氨基酸序列分别显示在图29A和29B。包含稳定化的MJF045 scFv的C-末端抗IGF-1R
双特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列(pXWU135)分别显示在图31A和31B。
双特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列(pXWU135)分别显示在图31A和31B。
[0886] f.构建替代的抗IGF-1R双特异性抗体
[0887] 使用与上述相似的方法，编码表15所列的稳定性-改造的C06scFv分子的质粒还可用于构建稳定性-改造的N-和C-末端抗IGF-1R双特异性抗体。表18列出了质粒名称
和按照Kabat编号系统，C06scFv中稳定化VH和VL突变的位置。VH和VL突变的位置按照
使用图30B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和31B(C-抗IGF-1R双特异性抗体)作为参考序
列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体和N-抗IGF-1R双特异性抗体二者的全
长重链序列中。
和按照Kabat编号系统，C06scFv中稳定化VH和VL突变的位置。VH和VL突变的位置按照
使用图30B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和31B(C-抗IGF-1R双特异性抗体)作为参考序
列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体和N-抗IGF-1R双特异性抗体二者的全
长重链序列中。
[0888] 表18.用于构建抗IGF-1R双特异性抗体的抗IGF-1R C06 scFv中稳定化的氨基酸残基。稳定化VH和VL突变的位置按照Kabat编号系统(Kabat:)显示。VH和VL突变
的位置按照分别使用图30B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和31B(C-抗IGF-1R双特异性抗
体)作为参考序列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体(C:)和N-抗IGF-1R双
特异性抗体(N:)二者的全长重链序列中。
的位置按照分别使用图30B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和31B(C-抗IGF-1R双特异性抗
体)作为参考序列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体(C:)和N-抗IGF-1R双
特异性抗体(N:)二者的全长重链序列中。
[0889]
[0890] wt＝野生型序列。
[0891] g.构建具有改进的热稳定性的G11 scFv分子
[0892] 使用与上述相似和美国专利申请第11/725,970号所述的方法，通过稳定性-改造从G11 IgG制备的scFv可设计抗IGF-1R双特异性抗体。通过将scFv融合到全长C06 IgG
重链的氨基或羧基末端，稳定性-改造的G11 scFv可用于构建作为N-末端和C-末端scFv
融合蛋白两者的双特异性抗体，如图23所示。C06轻链将是抗IGF-1R N-与C-双特异性抗
体共同的，DNA和氨基酸序列分别显示在图32A和32B。编码从G11 scFv和C06 IgG构建
的抗IGF-1R N-双特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列的实例显示在图33A和33B。编码
从G11 scFv和C06 IgG构建的抗IGF-1R C-双特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列的实
例显示在图34A和34B。
重链的氨基或羧基末端，稳定性-改造的G11 scFv可用于构建作为N-末端和C-末端scFv
融合蛋白两者的双特异性抗体，如图23所示。C06轻链将是抗IGF-1R N-与C-双特异性抗
体共同的，DNA和氨基酸序列分别显示在图32A和32B。编码从G11 scFv和C06 IgG构建
的抗IGF-1R N-双特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列的实例显示在图33A和33B。编码
从G11 scFv和C06 IgG构建的抗IGF-1R C-双特异性抗体的重链DNA和氨基酸序列的实
例显示在图34A和34B。
[0893] 使用列在表19的寡核苷酸，将单独变体和文库设计为普通G11(VL/GS4/VH)scFv(pMJF060)中包含期望的氨基酸取代。表19中，每种寡核苷酸名称提供按照Kabat编
号系统对在VH或VL中的位置中期望的氨基酸取代的参考。
号系统对在VH或VL中的位置中期望的氨基酸取代的参考。
[0894] 表19.用于构建变异G11(VL/GS4/VH)scFv的寡核苷酸和基本原理
[0895]寡核苷酸 基本原理 序列 SEQ
名称 ID
NO：
VH_E6Q COMP GAGGTCCAGCTGTTGCAGTCCGGCGGTGGCCTG 178
VH_S49AG COVAR GGGCTGGAGTGGGTTGSCAGGATCTCTAGCAGC 179
VL_L50nnk COMP AAGCTGCTCATTTACNNKGCATCTACCCGGGAATC 180
VL_V83EF COVAR， CTGCAGGCTGAAGATKWKGCAGTTTATTACTGTC 181
CONS
名称 ID
NO：
VH_E6Q COMP GAGGTCCAGCTGTTGCAGTCCGGCGGTGGCCTG 178
VH_S49AG COVAR GGGCTGGAGTGGGTTGSCAGGATCTCTAGCAGC 179
VL_L50nnk COMP AAGCTGCTCATTTACNNKGCATCTACCCGGGAATC 180
VL_V83EF COVAR， CTGCAGGCTGAAGATKWKGCAGTTTATTACTGTC 181
CONS
[0896] “基本原理”是指采用的设计方法。所述方法详细描述在美国专利申请第11/725,970号。缩写：“COMP”-计算分析，“COVAR”-共变分析，“CONS”-一致性打分，“DEGEN”-简并密码子，多义碱基缩写如下：W＝A或T，V＝A或C或G，Y＝C或T，S＝
C或G，M＝A或C，N＝A或C或G或T，R＝A或G，K＝G或T，B＝C或G或T(J Biol
Chem.261(1)：13-7(1986))。
C或G，M＝A或C，N＝A或C或G或T，R＝A或G，K＝G或T，B＝C或G或T(J Biol
Chem.261(1)：13-7(1986))。
[0897] 进行诱变反应，挑取单独转化的菌落到深-孔96孔盘，根据美国专利申请第11/725,970号详述的方法加工和筛选。转化体在由补充有0.6％甘氨酸、0.6％Triton
X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄西林的SB(Teknova，Half Moon Bay，CA目录号
S0140)组成的表达培养基中在30℃或32℃生长过夜。
X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄西林的SB(Teknova，Half Moon Bay，CA目录号
S0140)组成的表达培养基中在30℃或32℃生长过夜。
[0898] 使用热攻击测定两份地筛选每种文库，使来自一份的上清液经受处理条件，第二种上清液作为未处理的参考。热攻击后，由离心除去聚集的材料，在可溶的IGF-1R Fc
DELFIA中测定，如实施例8c所述。
DELFIA中测定，如实施例8c所述。
[0899] 使用Spotfire DecisionSite软件(Spotfire，Somerville，MA.)加工测定数据，表示为对每种克隆在攻击温度观察到的DELFIA计数与在参考温度观察到的DELFIA计数的
比值。可再生地获得大于或等于对亲本质粒观察到的值的两倍的值的克隆认为是击中。由
微制备(Wizard Plus，Promega，Madison，WI)分离来自这些阳性克隆的质粒DNA，再转化回到大肠杆菌W3110中以证实第二次热攻击测定以及确定DNA序列。
比值。可再生地获得大于或等于对亲本质粒观察到的值的两倍的值的克隆认为是击中。由
微制备(Wizard Plus，Promega，Madison，WI)分离来自这些阳性克隆的质粒DNA，再转化回到大肠杆菌W3110中以证实第二次热攻击测定以及确定DNA序列。
[0900] 来自这些测定的最初结果和证实结果显示在表20。与普通G11scFv(pMJF060)相比，本发明的许多稳定化的scFv分子导致结合活性改进(T50＝50℃)。特别是，从文库
位置VL50(L50G、L50E、L50M、L50N)、文库位置VL83(V83E)、文库位置VH6(E6Q)、和文库位置VH50(S49A、S49G)的变异G11 scFv的T50值相对于普通G11 scFv表现范围从+2℃到+6℃
的热稳定性(□T50值)增加。
位置VL50(L50G、L50E、L50M、L50N)、文库位置VL83(V83E)、文库位置VH6(E6Q)、和文库位置VH50(S49A、S49G)的变异G11 scFv的T50值相对于普通G11 scFv表现范围从+2℃到+6℃
的热稳定性(□T50值)增加。
[0901] 表20.G11 VH和VL文库位置、文库组成和筛选结果
[0902]位置 文库 观察到的击中序列 T50(℃)
VH6 Q，S E6Q +2
VH495 A，G S49A，S49G +4，+3
VL50 所有氨基酸 L50G，L50M，L50N +3，+3，+6
VL83 E，F V83E +3
VH6 Q，S E6Q +2
VH495 A，G S49A，S49G +4，+3
VL50 所有氨基酸 L50G，L50M，L50N +3，+3，+6
VL83 E，F V83E +3
[0903] 随后构建由稳定化突变的两种排列组成的质粒以鉴定进一步增强热稳定性的组合。挑取单独转化的菌落到深-孔96孔盘，如上所述地加工用于筛选。对含有单独和组
合的稳定化突变的G11 scFv蛋白检验以下：在T50热攻击测定中的热稳定性。表21概述
了T50热攻击测定的结果。鉴定相对于普通G11 scFv表现范围从+2℃到+10℃的热稳定
性增加的单独和组合的稳定化突变。在位置VL50与VH6(VL L50N：VH E6Q)和位置VL83与
VH6(VL V83E：VH E6Q)组合的G11突变的T50值相对于普通G11 scFv增强scFv的热稳定性
(T50)+4-10℃。
合的稳定化突变的G11 scFv蛋白检验以下：在T50热攻击测定中的热稳定性。表21概述
了T50热攻击测定的结果。鉴定相对于普通G11 scFv表现范围从+2℃到+10℃的热稳定
性增加的单独和组合的稳定化突变。在位置VL50与VH6(VL L50N：VH E6Q)和位置VL83与
VH6(VL V83E：VH E6Q)组合的G11突变的T50值相对于普通G11 scFv增强scFv的热稳定性
(T50)+4-10℃。
[0904] 表21.稳定化的G11 scFv蛋白的氨基酸取代，来自热攻击测定的T50结果。N/A＝不适用
[0905]名称 突变 T50(℃)
MJF-060 N/A 50
MJF-084 VL L50G 53
MJF-085 VL L50N 56
MJF-086 VL L50M 53
MJF-087 VL V83E 53
MJF-091 VL L50N，VH E6Q 60
名称 突变 T50(℃)
MJF-092 VL V83E，VH E6Q 54
MJF-097 VH S49G 53
MJF-060 N/A 50
MJF-084 VL L50G 53
MJF-085 VL L50N 56
MJF-086 VL L50M 53
MJF-087 VL V83E 53
MJF-091 VL L50N，VH E6Q 60
名称 突变 T50(℃)
MJF-092 VL V83E，VH E6Q 54
MJF-097 VH S49G 53
[0906] 表22列出了质粒名称和按照Kabat编号系统，G11 scFv中稳定化VH和VL突变的位置。VH和VL突变的位置按照分别使用图33B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和34B(C-抗
IGF-1R双特异性抗体)作为参考序列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体和
N-抗IGF-1R双特异性抗体二者的全长重链序列中。
IGF-1R双特异性抗体)作为参考序列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体和
N-抗IGF-1R双特异性抗体二者的全长重链序列中。
[0907] 表22.用于构建抗IGF-1R双特异性抗体的抗IGF-1R G116scFv中稳定化的氨基酸残基。稳定化VH和VL突变的位置按照Kabat编号系统(Kabat:)显示。VH和VL突变的
位置按照使用图33B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和34B(C-抗IGF-1R双特异性抗体)作
为参考序列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体(C:)和N-抗IGF-1R双特异性
抗体(N:)二者的全长重链序列中。wt＝野生型。
位置按照使用图33B(N-抗IGF-1R双特异性抗体)和34B(C-抗IGF-1R双特异性抗体)作
为参考序列的顺序编号，显示在C-抗IGF-1R双特异性抗体(C:)和N-抗IGF-1R双特异性
抗体(N:)二者的全长重链序列中。wt＝野生型。
[0908]
[0909] h.抗IGF-1R双特异性抗体在CHO细胞中的稳定表达，抗体纯化和表征
[0910] 质粒DNA pXWU135、pXWU136和pXWU118用于转化DHFR-缺陷型CHO DG44细胞以稳定产生抗体蛋白。将转染的细胞生长在含有2mM谷氨酰胺，补充有10％透析的胎牛血清
(InvitrogenCorporation)的α-MEM培养基，使用荧光标记的抗体和反复荧光激活的细胞
分选(FACS)富集为稳定的大容量培养池(Brezinsky等人.JImmunol Methods.277(1-2)：
141-55(2003))。FACS还用于产生单独细胞系。使细胞池或细胞系适应无血清条件，放大规模用于产生抗体。
(InvitrogenCorporation)的α-MEM培养基，使用荧光标记的抗体和反复荧光激活的细胞
分选(FACS)富集为稳定的大容量培养池(Brezinsky等人.JImmunol Methods.277(1-2)：
141-55(2003))。FACS还用于产生单独细胞系。使细胞池或细胞系适应无血清条件，放大规模用于产生抗体。
[0911] 从运行10天的生物反应器收集50L C-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU135/pXWU118)上清液，通过超滤预澄清。使用蛋白A琼脂糖凝胶FF(GE Healthcare)从上清液
捕获双特异性抗体。使用pH3.0的0.1M甘氨酸从蛋白A洗脱双特异性抗体，用Tris碱中
和，透析到PBS中而不经进一步纯化。使用EndoSafe PTC试剂盒(Charles River Labs)
通过动力学定量生色LAL分析测定内毒素水平。单体四价抗体产物的纯度和百分比分别通
过4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE和分析性尺寸排阻HPLC评价。该过程产生浓度5.4mg/
ml、纯度96.7％的289mg C-抗IGF-1R双特异性抗体，残留内毒素浓度是0.67EU/mg蛋白。
捕获双特异性抗体。使用pH3.0的0.1M甘氨酸从蛋白A洗脱双特异性抗体，用Tris碱中
和，透析到PBS中而不经进一步纯化。使用EndoSafe PTC试剂盒(Charles River Labs)
通过动力学定量生色LAL分析测定内毒素水平。单体四价抗体产物的纯度和百分比分别通
过4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE和分析性尺寸排阻HPLC评价。该过程产生浓度5.4mg/
ml、纯度96.7％的289mg C-抗IGF-1R双特异性抗体，残留内毒素浓度是0.67EU/mg蛋白。
[0912] 图35A显示纯化的稳定性-改造的C-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU135/pXWU118)的SDS-PAGE凝胶。还原性的泳道显示重链和轻链蛋白的预期大小。重要的是，没有检测到
显著水平的降解的或不需要的较低分子量的副产物。
显著水平的降解的或不需要的较低分子量的副产物。
[0913] 图35B显示纯化的稳定性-改造的C-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU135/pXWU118)的分析性SEC洗脱谱。这一分析证明，稳定性-改造的C-抗IGF-1R双特异性抗体基本上
＞96.7％纯的、单体的，且没有分子量更高的物质。
＞96.7％纯的、单体的，且没有分子量更高的物质。
[0914] 从运行10天的生物反应器收集25L N-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU136/pXWU118)上清液，通过超滤预澄清。如以上对C-抗IGF-1R双特异性抗体所述的纯化N-抗
IGF-1R双特异性抗体。单体四价抗体产物的纯度和百分比分别通过4-20％Tris-甘氨酸
SDS-PAGE和分析性尺寸排阻HPLC评价。该过程产生浓度9.2mg/ml、纯度97.3％的1401mg
N-抗IGF-1R双特异性抗体，残留内毒素浓度是0.09EU/mg蛋白。
IGF-1R双特异性抗体。单体四价抗体产物的纯度和百分比分别通过4-20％Tris-甘氨酸
SDS-PAGE和分析性尺寸排阻HPLC评价。该过程产生浓度9.2mg/ml、纯度97.3％的1401mg
N-抗IGF-1R双特异性抗体，残留内毒素浓度是0.09EU/mg蛋白。
[0915] 图36A显示纯化的稳定性-改造的N-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU136/pXWU118)的SDS-PAGE凝胶。还原性的泳道显示重链和轻链蛋白的预期大小。仍然没有检测到显著
水平的降解的或不需要的较低分子量的副产物。
水平的降解的或不需要的较低分子量的副产物。
[0916] 图36B显示纯化的稳定性-改造的N-抗IGF-1R双特异性抗体(pXWU136/pXWU118)的分析性SEC洗脱谱。这一分析证明，稳定性-改造的N-抗IGF-1R双特异性抗体基本上
＞97.3％纯的、单体的，且没有分子量更高的物质。
＞97.3％纯的、单体的，且没有分子量更高的物质。
[0917] 实施例9.抗IGF-1R双特异性抗体的生化表征
[0918] a.带有融合到稳定化的C06 scFv的N-或C-末端的G11κ轻链和G11 IgG1重链骨架的N-和C-末端抗IGF-1R BsAb的纯化和生化/生物物理表征。
[0919] 在抗体改造领域中双特异性IgG-样抗体(“BsAb”)已经广泛地遇到了产物生产和质量问题(Demarest，S.J.，Glaser，S.M.(2008)Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5，印刷中(9月期))。在此证明，使用稳定化的C06 scFv来构建N-和C-末端G11 IgG1/C06 scFv
IgG-样双特异性抗体(标为N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体，图37)导致具有强的操纵
性质、高质量和稳定性的重组蛋白。
IgG-样双特异性抗体(标为N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体，图37)导致具有强的操纵
性质、高质量和稳定性的重组蛋白。
[0920] i.方法
[0921] BsAb表达：将单独地含有BsAb重链和轻链的自用哺乳动物表达载体转染到DHFR-CHO DG44中，如以上实施例8e和美国专利申请第11/725,970号所述的。如以前所述
地分离产生N-和C-末端BsAb的CHO细胞系(Brezinsky，S.C.G.，Chiang，G.G.，Szilvasi，A.，Mohan，S.，Shapiro，R.I.，MacLean，A.，Sisk，W.和Thill，G.(2003)J.Immunol.Methods
277，141-155)。大规模CHO细胞培养以表达N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体蛋白的方
法描述在以上实施例8e和美国专利申请第11/725,970号。通过捕获到预调节到中性pH
的MAbSelect蛋白A亲和力树脂(GE Healthcare)而从CHO细胞上清液分离N-和C-末端
BsAb。以5个柱体积的0.5M Tris-HCl、pH 8.5、0.5M NaCl洗涤捕获的材料，以0.1M甘氨
酸、pH 3.0洗脱蛋白。立即使用1M Tris-碱中和蛋白洗脱液，并对PBS透析。蛋白浓度使
-1
用消光系数1.6L cm g 的UV-Vis确定。内毒素水平使用Endosafe -PTS LAL检验系统
(Charles River Labs)确定。产生用于表达G11 IgG1抗体的质粒作为产生BsAb的前体。
选择G11 IgG1细胞系并放大规模用于生产，如对BsAb所描述的，纯化实验方案相同。
地分离产生N-和C-末端BsAb的CHO细胞系(Brezinsky，S.C.G.，Chiang，G.G.，Szilvasi，A.，Mohan，S.，Shapiro，R.I.，MacLean，A.，Sisk，W.和Thill，G.(2003)J.Immunol.Methods
277，141-155)。大规模CHO细胞培养以表达N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体蛋白的方
法描述在以上实施例8e和美国专利申请第11/725,970号。通过捕获到预调节到中性pH
的MAbSelect蛋白A亲和力树脂(GE Healthcare)而从CHO细胞上清液分离N-和C-末端
BsAb。以5个柱体积的0.5M Tris-HCl、pH 8.5、0.5M NaCl洗涤捕获的材料，以0.1M甘氨
酸、pH 3.0洗脱蛋白。立即使用1M Tris-碱中和蛋白洗脱液，并对PBS透析。蛋白浓度使
-1
用消光系数1.6L cm g 的UV-Vis确定。内毒素水平使用Endosafe -PTS LAL检验系统
(Charles River Labs)确定。产生用于表达G11 IgG1抗体的质粒作为产生BsAb的前体。
选择G11 IgG1细胞系并放大规模用于生产，如对BsAb所描述的，纯化实验方案相同。
[0922] SDS-PAGE和分析性尺寸排阻色谱(SEC)：使用SDS-PAGE和分析性SEC色谱法检验N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体的纯度。将每种BsAb(5·g/孔)与Novex SDS上
样缓冲液混合，对于非还原性和还原性条件分别带有或不带有～0.1M β-巯基乙醇。样品
TM
在95℃加热～10分钟，使用XCell SureLock 微型池和Tris-甘氨酸电泳缓冲液施加到
Novex 4-20％Tris甘氨酸凝胶，并根据制造商的说明书(Invitrogen)电泳。
样缓冲液混合，对于非还原性和还原性条件分别带有或不带有～0.1M β-巯基乙醇。样品
TM
在95℃加热～10分钟，使用XCell SureLock 微型池和Tris-甘氨酸电泳缓冲液施加到
Novex 4-20％Tris甘氨酸凝胶，并根据制造商的说明书(Invitrogen)电泳。
[0923] 分析性SEC在pH 6.8的10mM磷酸盐、150mM NaCl、0.02％叠氮化钠中平衡的BioSep 3000 300×7.8mm(Phenomenex)SEC柱上进行，使用Agilent 1100 HPLC系统。将
30-100μg之间的蛋白以0.5mL/min施加到柱。洗脱的蛋白由在280nm的UV吸光值检测。
30-100μg之间的蛋白以0.5mL/min施加到柱。洗脱的蛋白由在280nm的UV吸光值检测。
[0924] 圆二色(CD)谱学：CD测量使用装备有用于控制温度的热电peltier装置和作为散热件的外部水浴的Jasco J-810旋光分光计进行。以1□M蛋白进行近和远UV扫描，分别
使用1cm和0.1cm比色杯。对于近和远UV测量的光谱范围分别是197-260nm和250-320nm。
在10℃以连续方式(100nm/min)进行扫描，响应时间是2sec，数据斜度是0.1nm，对于近和
远UV扫描带宽分别是2nm和1nm。所有测量在“高灵敏度”模式进行。所有蛋白光谱的基
线使用以PBS的背景扫描校正。
使用1cm和0.1cm比色杯。对于近和远UV测量的光谱范围分别是197-260nm和250-320nm。
在10℃以连续方式(100nm/min)进行扫描，响应时间是2sec，数据斜度是0.1nm，对于近和
远UV扫描带宽分别是2nm和1nm。所有测量在“高灵敏度”模式进行。所有蛋白光谱的基
线使用以PBS的背景扫描校正。
[0925] 差示扫描量热法(DSC)：DSC扫描使用自动毛细管DSC(capDSC，MicroCal，LLC)进行。蛋白和参考溶液使用机械臂从96-孔板自动取样。每次蛋白扫描之前，进行两次缓冲
液扫描以界定用来减去的基线。将含有蛋白的所有96-孔板在6℃储存在设备中。将浓缩
的G11 IgG1蛋白(3.9mg/mL)和N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体(分别9.2mg/mL和
5.4mg/mL)对PBS透析。随后在实验前用PBS稀释样品到1.0mg/mL G11 IgG1和1.3mg/mL
的两种BsAb以达到量热计中等摩尔量的蛋白。每次使用样品毛细管中的蛋白和参考毛细
管中的PBS透析物的蛋白扫描前，在样品毛细管和参考毛细管中进行使用PBS透析物的两
次背景扫描。在低反馈模式以2℃/min进行10-100℃的扫描。使用制造商提供的Origin
软件分析扫描。减去参考基线扫描之后，使用三次多项式校正非零蛋白扫描基线。
液扫描以界定用来减去的基线。将含有蛋白的所有96-孔板在6℃储存在设备中。将浓缩
的G11 IgG1蛋白(3.9mg/mL)和N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体(分别9.2mg/mL和
5.4mg/mL)对PBS透析。随后在实验前用PBS稀释样品到1.0mg/mL G11 IgG1和1.3mg/mL
的两种BsAb以达到量热计中等摩尔量的蛋白。每次使用样品毛细管中的蛋白和参考毛细
管中的PBS透析物的蛋白扫描前，在样品毛细管和参考毛细管中进行使用PBS透析物的两
次背景扫描。在低反馈模式以2℃/min进行10-100℃的扫描。使用制造商提供的Origin
软件分析扫描。减去参考基线扫描之后，使用三次多项式校正非零蛋白扫描基线。
[0926] ii.结果
[0927] N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体使用以上实施例8e和美国专利申请第11/725,970号所述的方法在CHO细胞产生。产生分开的两批的每种BsAb，第一批来自转染
的稳定大容量CHO细胞池，第二批来自选择以表达BsAb的CHO细胞系。从稳定的大容量
池纯化的材料产生高质量的N-末端(从5L产生20.4mg)和C-末端(从4L产生5.6mg)
IGF-1R双特异性抗体材料，基于SDS-PAGE和分析性SEC色谱法有＞98％的单体纯度(即，
对于非还原BsAb的200kDa单条带，分别对于还原和分离的重链和轻链的75kDa和25kDa
条带，图38A、B)。来自稳定大容量培养物的BsAb两者都洗脱为单峰，对基于蛋白分子量标准的大约200kDa蛋白在预料时间以高纯度离开分析性SEC柱(图38C)。选择以产生N-和
C-末端IGF-1R双特异性抗体的CHO细胞系分别放大规模到25L和50L。基于非还原性和还
原性SDS PAGE分析以及分析性SEC两者，两种生产运行都产生具有正确的分子量的～97％
纯的材料。从50L培养物产生289mg C-末端BsAb，从25L培养物产生1.4g N-末端BsAb。
的稳定大容量CHO细胞池，第二批来自选择以表达BsAb的CHO细胞系。从稳定的大容量
池纯化的材料产生高质量的N-末端(从5L产生20.4mg)和C-末端(从4L产生5.6mg)
IGF-1R双特异性抗体材料，基于SDS-PAGE和分析性SEC色谱法有＞98％的单体纯度(即，
对于非还原BsAb的200kDa单条带，分别对于还原和分离的重链和轻链的75kDa和25kDa
条带，图38A、B)。来自稳定大容量培养物的BsAb两者都洗脱为单峰，对基于蛋白分子量标准的大约200kDa蛋白在预料时间以高纯度离开分析性SEC柱(图38C)。选择以产生N-和
C-末端IGF-1R双特异性抗体的CHO细胞系分别放大规模到25L和50L。基于非还原性和还
原性SDS PAGE分析以及分析性SEC两者，两种生产运行都产生具有正确的分子量的～97％
纯的材料。从50L培养物产生289mg C-末端BsAb，从25L培养物产生1.4g N-末端BsAb。
[0928] BsAb的圆二色(CD)测量证明蛋白是正确折叠的。N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体的远UV CD光谱非常相似于对缺少scFv的G11 IgG1蛋白观察到的(图39A)。预料，
另外的scFv仅仅增加另外的Ig-折叠蛋白结构域，其具有成为亲本G11 IgG1分子的结构
域的相当的□-折叠倾向。N-和C-末端IGF-1R^在217nm的光谱的微小差异可能反映融
合蛋白中主要是G11 IgG1的C-类Ig-折叠和另外的scFv的V-类Ig-折叠的总平均结构
的小差异。尽管近紫外CD光谱的信噪比差，G11 IgG1与N-和C-末端IGF-1R BsAb的光谱
都非常相似(图39B)。大多数NUV信号来自内部Trp残基，该残基在V-类和C-类Ig-折
叠中是规范和不变的，埋入与规范Ig-折叠内部二硫键相邻的相同位置。G11 IgG1与N-和
C-末端IGF-1R双特异性抗体的NUV光谱都相似，如同基于每种分子中的蛋白结构域的性质
所预料的。
另外的scFv仅仅增加另外的Ig-折叠蛋白结构域，其具有成为亲本G11 IgG1分子的结构
域的相当的□-折叠倾向。N-和C-末端IGF-1R^在217nm的光谱的微小差异可能反映融
合蛋白中主要是G11 IgG1的C-类Ig-折叠和另外的scFv的V-类Ig-折叠的总平均结构
的小差异。尽管近紫外CD光谱的信噪比差，G11 IgG1与N-和C-末端IGF-1R BsAb的光谱
都非常相似(图39B)。大多数NUV信号来自内部Trp残基，该残基在V-类和C-类Ig-折
叠中是规范和不变的，埋入与规范Ig-折叠内部二硫键相邻的相同位置。G11 IgG1与N-和
C-末端IGF-1R双特异性抗体的NUV光谱都相似，如同基于每种分子中的蛋白结构域的性质
所预料的。
[0929] 差示扫描量热法(DSC)研究证明，N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体中的所有结构域正确地折叠并具有理想的(高温)热解折叠特性。亲本G11 IgG1分子与N-和C-末端
IGF-1R双特异性抗体都是多-结构域蛋白(图39C)。研究显示，IgG1分子通常展示3次分
别的解折叠转变，对单个CH2和CH3结构域各一次和对Fab的四个结构域(VH、VL、CH1和CL，Garber，E.，Demarest，S.J.(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.355，751-757)的单次大的和明显协同的转变。G11 IgG1表明对人类IgG1通常的经典的3次转变(图39C)。N-和
C-末端BsAb两者还表现对CH2、CH3和Fab结构域的3次转变加解折叠稳定化的C06 scFv
结构域产生的一次额外转变(图39C)。G11 IgG1与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体的
解折叠曲线分别拟合于3次和4次转变，数据提供在表23。C-末端IGF-1R双特异性抗体
的IgG转变与对G11 IgG1观察到的几乎相同，说明融合蛋白的稳定化的C06 scFv与IgG1
部分之间几乎没有相互作用。另外，稳定化的C06 scFv表明TM 66℃的单次转变和大的相
当的解折叠焓(表23)。对scFv测量的单次解折叠转变说明，VH与VL结构域在相似温度解
折叠或协同地解折叠。尤其是，对scFv测量的高TM值说明scFv的热稳定性不可能造成产
物质量问题。N-末端IGF-1R双特异性抗体的数据与对C-末端BsAb观察到的相似；然而，
C06 scFv TM略高而G11 Fab TM略低(表23)。数据说明，融合蛋白的scFv与Fab区之间
可能有非常弱的相互作用-尽管可能不会导致产物质量问题。
IGF-1R双特异性抗体都是多-结构域蛋白(图39C)。研究显示，IgG1分子通常展示3次分
别的解折叠转变，对单个CH2和CH3结构域各一次和对Fab的四个结构域(VH、VL、CH1和CL，Garber，E.，Demarest，S.J.(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.355，751-757)的单次大的和明显协同的转变。G11 IgG1表明对人类IgG1通常的经典的3次转变(图39C)。N-和
C-末端BsAb两者还表现对CH2、CH3和Fab结构域的3次转变加解折叠稳定化的C06 scFv
结构域产生的一次额外转变(图39C)。G11 IgG1与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体的
解折叠曲线分别拟合于3次和4次转变，数据提供在表23。C-末端IGF-1R双特异性抗体
的IgG转变与对G11 IgG1观察到的几乎相同，说明融合蛋白的稳定化的C06 scFv与IgG1
部分之间几乎没有相互作用。另外，稳定化的C06 scFv表明TM 66℃的单次转变和大的相
当的解折叠焓(表23)。对scFv测量的单次解折叠转变说明，VH与VL结构域在相似温度解
折叠或协同地解折叠。尤其是，对scFv测量的高TM值说明scFv的热稳定性不可能造成产
物质量问题。N-末端IGF-1R双特异性抗体的数据与对C-末端BsAb观察到的相似；然而，
C06 scFv TM略高而G11 Fab TM略低(表23)。数据说明，融合蛋白的scFv与Fab区之间
可能有非常弱的相互作用-尽管可能不会导致产物质量问题。
[0930] 监测纯化的N-和C-末端IGF-1R^2蛋白在PBS中在2-8℃经3个月时段聚集体的累积。在这样的条件下储存对蛋白试剂是常见的。许多蛋白-尤其是较不稳定或可溶的蛋
白-表明当在溶液中保持任何时间长度时累积可溶的聚集体。本文收集的数据证明，N-和
C-末端IGF-1R双特异性抗体是高度稳定的，经3个月的时程几乎不显示聚集的迹象(在我
们的检测限值内)(表24)。
白-表明当在溶液中保持任何时间长度时累积可溶的聚集体。本文收集的数据证明，N-和
C-末端IGF-1R双特异性抗体是高度稳定的，经3个月的时程几乎不显示聚集的迹象(在我
们的检测限值内)(表24)。
[0932]构建体 CH2 TM Fab TM CH3 TM C06 scFva
(Hcal (Hcal (Hcal TM(Hcal
kcal/mol) kcal/mol) kcal/mol) kcal/mol)
G11 IgG1 71.6(235) 77.8(415) 85.0(85) -
C-term.IGF-1R BsAb 71.0(110) 76.8(555) 85.1(95) 65.8(360)
N-term.IGF-1R BsAb 70.6(110) 76.1(415) 84.6(115) 67.3(410)
(Hcal (Hcal (Hcal TM(Hcal
kcal/mol) kcal/mol) kcal/mol) kcal/mol)
G11 IgG1 71.6(235) 77.8(415) 85.0(85) -
C-term.IGF-1R BsAb 71.0(110) 76.8(555) 85.1(95) 65.8(360)
N-term.IGF-1R BsAb 70.6(110) 76.1(415) 84.6(115) 67.3(410)
[0933] aC06 scFv是使用我们的BIIB平台设计/筛选技术稳定化的-导致Ile 83突变为Glu(I83E)。
[0934] 表24：由分析性SEC测量的IGF-1R双特异性抗体在2-8℃在PBS中经3个月的稳定性研究。N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体分别保持在4.5mg/mL和1.7mg/mL。
[0935]构建体 ％单体 ％聚集体
C-term.IGF-1R BsAb T＝0 100.0 0.0
C-term.IGF-1R BsAb T＝1周 100.0 0.0
C-term.IGF-1R BsAb T＝1个月 99.2 0.8
C-term.IGF-1R BsAb T＝3个月 99.2 0.8
N-term.IGF-1R BsAb T＝0 100.0 0.0
N-term.IGF-1R BsAb T＝1周 99.7 0.3
N-term.IGF-1R BsAb T＝1个月 100.0 0.0
N-term.IGF-1R BsAb T＝3个月 99.6 0.4
C-term.IGF-1R BsAb T＝0 100.0 0.0
C-term.IGF-1R BsAb T＝1周 100.0 0.0
C-term.IGF-1R BsAb T＝1个月 99.2 0.8
C-term.IGF-1R BsAb T＝3个月 99.2 0.8
N-term.IGF-1R BsAb T＝0 100.0 0.0
N-term.IGF-1R BsAb T＝1周 99.7 0.3
N-term.IGF-1R BsAb T＝1个月 100.0 0.0
N-term.IGF-1R BsAb T＝3个月 99.6 0.4
[0936] b.由等温滴定量热法(ITC)测量的(i)C06和G11 MAb和(ii)N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体的IGF-1R结合
[0937] 通过衔接受体上多个抑制性表位实现增强的IGF-1R抑制的假设要求每个表位可被抑制性抗IGF-1R抗体衔接而不阻碍其它抑制性表位。等温滴定量热法(ITC)用于测量
识别受体不同表位的抑制性C06和G11 MAb的IGF-1R结合。实验决定性地证明，C06和
G11MAb可共同衔接受体。还进行ITC实验以显示，C-和N-末端BsAb强有力地结合IGF-1R
并以预料的化学计量饱和受体。
识别受体不同表位的抑制性C06和G11 MAb的IGF-1R结合。实验决定性地证明，C06和
G11MAb可共同衔接受体。还进行ITC实验以显示，C-和N-末端BsAb强有力地结合IGF-1R
并以预料的化学计量饱和受体。
[0938] i.方法
[0939] 抗体.C06和G11抗体与sIGF-1R(1-903)胞外结构域蛋白如美国专利申请第2007/0243194号所述的产生和纯化。
[0940] 等温滴定量热法(ITC)。C06 MAb(100□M)、G11 MAb(67□M)和sIGF-1R(1-903)(5□M)用于抗体/受体结合实验。将试剂对PBS、pH 7.2共透析。通过使用PBS透析物稀释
将蛋白溶液调整到上述浓度。以BsAb的实验使用25□M C-term.IGF-1R^2、30μM N-term.
IGF-1R^2和2.5□M sIGF-1R(1-903)。蛋白溶液如以上对MAb结合实验所述的制备。所
有ITC实验在25℃在ITC200微量热计(MicroCal，LLC)进行。对于每次反应，将反应池填充
hIGF-1R(1-903)。为了研究MAb或BsAb对sIGF-1R(1-903)的结合，将注射器填充MAb或
BsAb并滴定到反应池，对C06MAb使用15×1.5□L注射，对G11MAb使用18×2.0μL射，对
N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体两者使用20×1.8μL注射。所有注射之间使用四分钟
的平衡时段，初始延迟60秒。数据的数字积分使用MicroCal(Origin)供应的ITC数据分
析软件进行。ΔHA°(T)值基于注射的结合期间释放/吸收的平均热与受体IGF-1R被MAb
或BsAb饱和后冲淡的平均热之间的差异计算。在25℃，C06和G11MAb与C-末端IGF-1R
双特异性抗体对IGF-1R的结合亲和力太高而不能用ITC测量-如由在MAb和C-term.BsAb
饱和了所有受体结合位点的滴定区中不存在多次转变点所示。
将蛋白溶液调整到上述浓度。以BsAb的实验使用25□M C-term.IGF-1R^2、30μM N-term.
IGF-1R^2和2.5□M sIGF-1R(1-903)。蛋白溶液如以上对MAb结合实验所述的制备。所
有ITC实验在25℃在ITC200微量热计(MicroCal，LLC)进行。对于每次反应，将反应池填充
hIGF-1R(1-903)。为了研究MAb或BsAb对sIGF-1R(1-903)的结合，将注射器填充MAb或
BsAb并滴定到反应池，对C06MAb使用15×1.5□L注射，对G11MAb使用18×2.0μL射，对
N-和C-term.IGF-1R双特异性抗体两者使用20×1.8μL注射。所有注射之间使用四分钟
的平衡时段，初始延迟60秒。数据的数字积分使用MicroCal(Origin)供应的ITC数据分
析软件进行。ΔHA°(T)值基于注射的结合期间释放/吸收的平均热与受体IGF-1R被MAb
或BsAb饱和后冲淡的平均热之间的差异计算。在25℃，C06和G11MAb与C-末端IGF-1R
双特异性抗体对IGF-1R的结合亲和力太高而不能用ITC测量-如由在MAb和C-term.BsAb
饱和了所有受体结合位点的滴定区中不存在多次转变点所示。
[0941] ii.结果
[0942] 等温滴定量热法用于证明抑制性抗IG-1R MAb、C06和G11可经由其不重叠表位共同衔接受体。首先，将C06滴定到含有重组可溶的IGF-1R胞外结构域sIGF-1R(1-903)
的溶液，表明典型的抗体结合曲线(图40A、B)。已经由SDS-PAGE和尺寸排阻色谱/静态
光散射显示sIGF-1R(1-903)蛋白是二聚的(数据未显示)。二聚受体和二价MAb两者包
含两个可能的结合位点。结合的化学计量是1∶1，如基于sIGF-1R(1-903)与MAb之间等
摩尔数的结合位点预测的。随后，在～2倍过量C06 MAb存在下，将G11 MAb滴定到含有
sIGF-1R(1-903)的溶液(图40A、B)。C06 MAb的存在不阻止G11MAb强有力地衔接受体。
G11 MAb对sIGF-1R(1-903)的结合的化学计量也是1∶1。该实验证明C06和G11 MAb共
同衔接IGF-1R的能力。
的溶液，表明典型的抗体结合曲线(图40A、B)。已经由SDS-PAGE和尺寸排阻色谱/静态
光散射显示sIGF-1R(1-903)蛋白是二聚的(数据未显示)。二聚受体和二价MAb两者包
含两个可能的结合位点。结合的化学计量是1∶1，如基于sIGF-1R(1-903)与MAb之间等
摩尔数的结合位点预测的。随后，在～2倍过量C06 MAb存在下，将G11 MAb滴定到含有
sIGF-1R(1-903)的溶液(图40A、B)。C06 MAb的存在不阻止G11MAb强有力地衔接受体。
G11 MAb对sIGF-1R(1-903)的结合的化学计量也是1∶1。该实验证明C06和G11 MAb共
同衔接IGF-1R的能力。
[0943] 然后，将C-和N-末端IGF-1R双特异性抗体滴定到sIGF-1R(1-903)中(图40C、D)。在1∶1摩尔比两种BsAb都强有力地结合和饱和受体。C-term.IGF-1R双特异性抗
体表明非常强的结合焓(-54kcal/mol，表25)，甚至大于基于对C06和G11抗体测量的焓
的组合而预料的。与C06和G11 MAb相似，在其中发生受体的饱和的转变区中有非常少
的滴定点-表示非常紧密的结合(图40D)。N-term.IGF-1R双特异性抗体还显示强的焓
(-43kcal/mol，表25)，虽然比对C-term.IGF-1R双特异性抗体观察到的小。另外，在界定
N-term.IGF-1R双特异性抗体对sIGF-1R(1-903)的亲和力的转变区中有更多弯曲(和更多
滴定点)。这使得能够测量表观平衡解离常数KD为11nM(图40D、表25)。这些结果表示，
N-末端IGF-1R双特异性抗体的结合亲和力可能比C-末端IGF-IR双特异性抗体的低。
体表明非常强的结合焓(-54kcal/mol，表25)，甚至大于基于对C06和G11抗体测量的焓
的组合而预料的。与C06和G11 MAb相似，在其中发生受体的饱和的转变区中有非常少
的滴定点-表示非常紧密的结合(图40D)。N-term.IGF-1R双特异性抗体还显示强的焓
(-43kcal/mol，表25)，虽然比对C-term.IGF-1R双特异性抗体观察到的小。另外，在界定
N-term.IGF-1R双特异性抗体对sIGF-1R(1-903)的亲和力的转变区中有更多弯曲(和更多
滴定点)。这使得能够测量表观平衡解离常数KD为11nM(图40D、表25)。这些结果表示，
N-末端IGF-1R双特异性抗体的结合亲和力可能比C-末端IGF-IR双特异性抗体的低。
[0944] ITC实验的一个有趣方面是，不能区分BsAb的IgG1部分中的C06 scFv还是G11Fv能够互相咬合以结合受体。即使它们100％互相排斥，分子中仍有两个活性末端，使得观察到1∶1化学计量。然而，两种分子结合焓的差异连同N-末端IGF-1R双特异性抗体的
较弱表观亲和力说明，N-末端BsAb可能不完全能够使用其所有结合位点结合IGF-1R。结
合部分(即，C06 scFv和G11抗体Fv)在两种四价形式是相同的；然而，两种形式中的其相
对位置/间隔是显著不同的。scFv与Fv之间的空间障碍可能会导致C-和N-term.IGF-1R
双特异性抗体结合特性之间的微小差异。
较弱表观亲和力说明，N-末端BsAb可能不完全能够使用其所有结合位点结合IGF-1R。结
合部分(即，C06 scFv和G11抗体Fv)在两种四价形式是相同的；然而，两种形式中的其相
对位置/间隔是显著不同的。scFv与Fv之间的空间障碍可能会导致C-和N-term.IGF-1R
双特异性抗体结合特性之间的微小差异。
[0945] 表25：使用ITC测量的IGF-1R对C06和G11 Mab单独和组合结合的热力学参数以及对C-和N-末端IGF-1R双特异性抗体结合的参数。
[0946]构建体 H° -T S G KD n
(kcal (kcal (kcal (nM)
mol-1) mol-1) mol-1)
a a a
C06 MAb -21.9 10.6 -11.3 5 0.95
a a a
G11 MAb -26.6 14.8 -11.2 6 0.90
a a a
C06 MAb随后G11 -21.9 - - - 0.95
MAb系列滴定 (C06) 0.91
-16.2
(G11)
b a a a
C-term.IGF-1R BsAb -53.9 42.3 -11.6 3 0.87
b
N-term IGF-1R BsAb -42.5 31.6 -10.9 11 1.07
(kcal (kcal (kcal (nM)
mol-1) mol-1) mol-1)
a a a
C06 MAb -21.9 10.6 -11.3 5 0.95
a a a
G11 MAb -26.6 14.8 -11.2 6 0.90
a a a
C06 MAb随后G11 -21.9 - - - 0.95
MAb系列滴定 (C06) 0.91
-16.2
(G11)
b a a a
C-term.IGF-1R BsAb -53.9 42.3 -11.6 3 0.87
b
N-term IGF-1R BsAb -42.5 31.6 -10.9 11 1.07
[0947] a亲和力太高而不能准确测量。
[0948] b两次单独测量的平均值。
[0949] c.使用基于溶液的表面等离子体共振确定IGF-1R对以下结合的化学计量和亲和力：(i)C06和G11 Fab、(ii)C06和G11 MAb和(iii)N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体
[0950] C06和G11 MAb结合IGF-1R上的不同和不重叠表位；C06在受体的第一III型纤连蛋白结构域(FnIII-1)结构域表面上，G11在富含半胱氨酸的区(CRR)表面上。进行溶
液相结合实验来研究N-和C-末端BsAb结合IGF-1R的能力，使用对IGF-1R上每个表位的
所有4个可能结合位点-2位点。
液相结合实验来研究N-和C-末端BsAb结合IGF-1R的能力，使用对IGF-1R上每个表位的
所有4个可能结合位点-2位点。
[0951] i.方法
[0952] 使用表面等离子体共振，平衡Fab、MAb和BsAb对IGF-1R的结合。所有实验在Biacore3000设备(Biacore)上进行。使用制造商提供的标准胺化学实验方案，将C06
和G11 MAb分别固定到标准CM5芯片表面的两种不同流动细胞表面。在这些高固定水
平的MAb，sIGF-1R(1-903)(＜50nM)的流动低浓度导致质量转移有限的线性结合曲线，
其初始结合速率Vi(RU/s)线性地依赖于流经芯片表面的sIGF-1R(1-903)溶液的浓度。
sIGF-1R(1-903)(实施例9b所述的)与Fab/MAb/BsAb之间结合的结合常数和化学计量可
通过将sIGF-1R(1-903)和抗体的混合物流经含有C06或G11的感应芯片表面来确定。C06
和G11感应芯片表面测量包含sIGF-1R(1-903)和抗体的溶液中未结合的sIGF-1R(1-903)
的浓度。抗体与sIGF-1R(1-903)之间的平衡解离常数KD和结合化学计量从未结合的
sIGF-1R(1-903)的浓度使用以下等式确定：
和G11 MAb分别固定到标准CM5芯片表面的两种不同流动细胞表面。在这些高固定水
平的MAb，sIGF-1R(1-903)(＜50nM)的流动低浓度导致质量转移有限的线性结合曲线，
其初始结合速率Vi(RU/s)线性地依赖于流经芯片表面的sIGF-1R(1-903)溶液的浓度。
sIGF-1R(1-903)(实施例9b所述的)与Fab/MAb/BsAb之间结合的结合常数和化学计量可
通过将sIGF-1R(1-903)和抗体的混合物流经含有C06或G11的感应芯片表面来确定。C06
和G11感应芯片表面测量包含sIGF-1R(1-903)和抗体的溶液中未结合的sIGF-1R(1-903)
的浓度。抗体与sIGF-1R(1-903)之间的平衡解离常数KD和结合化学计量从未结合的
sIGF-1R(1-903)的浓度使用以下等式确定：
[0953]
[0954] 其中Vi＝初始结合速率，m＝sIGF-1R(1-903)浓度-依赖性标准曲线的斜率，[IGF-1R]f＝未结合的IGF-1R浓度，[IGF-1R]t＝IGF-1总浓度，且[Ab]t＝Fab/MAb/
BsAb总浓度(Day，E.S.，Cachero，T.G，Qian，F.，Sun，Y.，Wen，D.，Pelletier，M.，Hsu，Y.-M.，Whitty，A.(2005).“Selectivity of BAFF/BLyS and APRIL for binding to the TNFFamily Receptors BAFFR/BR3 and BCMA(BAFF/BlyS和APRIL结合TNF家族受体BAFFR/
BR3和BCMA的灵敏度)”Biochemistry44：1919-1931)。
BsAb总浓度(Day，E.S.，Cachero，T.G，Qian，F.，Sun，Y.，Wen，D.，Pelletier，M.，Hsu，Y.-M.，Whitty，A.(2005).“Selectivity of BAFF/BLyS and APRIL for binding to the TNFFamily Receptors BAFFR/BR3 and BCMA(BAFF/BlyS和APRIL结合TNF家族受体BAFFR/
BR3和BCMA的灵敏度)”Biochemistry44：1919-1931)。
[0955] ii.结果
[0956] 进行平衡溶液相表面等离子体共振实验来研究四价IGF-1R双特异性抗体的所有四个结合位点结合其合适表位的能力。为了检验对每个表位的结合，将C06和G11固定到
不同感应芯片表面并用于探测sIGF-1R(-1903)上的FnIII-1和CRR表位是否分别地不受
阻碍。在不同量的N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体存在下检验可溶的IGF-1R胞外结构
域对C06表面和G11表面的结合(图41A、B)。C06和G11Mab和Fab用作证实结合化学计
量分别是1∶1和2∶1抗体∶受体的对照。重要的是，注意到C06 Mab和Fab不导致抑
制G11对sIGF-1R(1-903)的表面结合，G11 Mab和Fab不导致抑制C06对sIGF-1R(1-903)
的表面结合-表明每种表面提供其所结合的sIGF-1R(1-903)上的表位的可达性的独有量
度。
不同感应芯片表面并用于探测sIGF-1R(-1903)上的FnIII-1和CRR表位是否分别地不受
阻碍。在不同量的N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体存在下检验可溶的IGF-1R胞外结构
域对C06表面和G11表面的结合(图41A、B)。C06和G11Mab和Fab用作证实结合化学计
量分别是1∶1和2∶1抗体∶受体的对照。重要的是，注意到C06 Mab和Fab不导致抑
制G11对sIGF-1R(1-903)的表面结合，G11 Mab和Fab不导致抑制C06对sIGF-1R(1-903)
的表面结合-表明每种表面提供其所结合的sIGF-1R(1-903)上的表位的可达性的独有量
度。
[0957] 实验结果清楚地显示，C-末端IGF-1R双特异性抗体的两个G11Fab臂和两个scFv臂完全能够结合其相应的CRR和FnIII-1表位，亲和力与对G11和C06 Mab观察到的相同
(图41A、B)。C-term.IGF-1R双特异性抗体的抑制曲线与观察到的C06 Mab对C06表面和
G11 Mab对G11表面的抑制曲线相同。Mab和C-末端BsAb关于SIGF-1R(1-903)的结合化
学计量是1∶1，如基于受体是同二聚体的事实预测的(表26)。C06和G11 Fab表明对其各
自表位的结合的2∶1化学计量，也如预测的(表26)。Fab还证明较低的表观亲和力-实
际上与此前经动力学biacore实验测量的亲和力相同(表26)。
(图41A、B)。C-term.IGF-1R双特异性抗体的抑制曲线与观察到的C06 Mab对C06表面和
G11 Mab对G11表面的抑制曲线相同。Mab和C-末端BsAb关于SIGF-1R(1-903)的结合化
学计量是1∶1，如基于受体是同二聚体的事实预测的(表26)。C06和G11 Fab表明对其各
自表位的结合的2∶1化学计量，也如预测的(表26)。Fab还证明较低的表观亲和力-实
际上与此前经动力学biacore实验测量的亲和力相同(表26)。
[0958] 不同于对C-末端IGF-1R双特异性抗体观察到的结果，N-末端IGF-1R双特异性抗体的结果表示，被分子的IgG1部分的C06 scFv和G11 Fv结合不是互相排斥的。N-末端
BsAb以1.5∶1的表观化学计量饱和受体(在两个表位)-在对Mab和Fab观察到的值的
中间(图41A、B；表26)。
BsAb以1.5∶1的表观化学计量饱和受体(在两个表位)-在对Mab和Fab观察到的值的
中间(图41A、B；表26)。
[0959] 总之，平衡溶液-相表面等离子体共振实验清楚地表明N-和C-末端BsAb之间的不同结合能力。尽管C-末端IGF-1R双特异性抗体表现理想，所有四个结合位点独立地能
够衔接受体而不被在BsAb的其它结合位点的结合阻碍。或者，N-末端BsAb表现为不能同
时将其所有四个结合部分衔接于溶液中的IGF-1R。一种可能性是，N-末端形式中C06 scFv
与G11 Fv的接近导致空间障碍。
够衔接受体而不被在BsAb的其它结合位点的结合阻碍。或者，N-末端BsAb表现为不能同
时将其所有四个结合部分衔接于溶液中的IGF-1R。一种可能性是，N-末端形式中C06 scFv
与G11 Fv的接近导致空间障碍。
[0960] 表26：IGF-1R双特异性抗体以及对照C06和G11 MAb和Fab的动力学和平衡(溶液相)亲和力测量。
[0961]构建体 kaa kda KDa KD(nM n(#C06 KD n(#G11
-1 -1
(M (s ) (nM) vs.C06 特异性 (nM 特异性
s-1) 表面) 结合位 vs. 结合位
点) G11 点)
表面)
C06 Fab 8.8e5 1.1e-3 1.3 0.6±0.4 2.0±0.3 - -
G11 Fab 3.0e5 1.2e-3 4.0 - - 4.0±2.0 1.7±0.3
C06 MAb 1.9e6b 2.4e-4b 0.13b 0.1±0.3 1.0±0.1 - -
b b b
G11 MAb 1.1e6 1.1e-4 0.11 - - 0.1±0.1 1.1±0.1
CtermBsAb -b -b -b 0.03±0.1 1.1±0.1 0.1±0.5 1.1±0.1
NtermBsAb -b -b -b 0.2±0.2 1.5±0.1 0.7±0.7 1.5±0.3
-1 -1
(M (s ) (nM) vs.C06 特异性 (nM 特异性
s-1) 表面) 结合位 vs. 结合位
点) G11 点)
表面)
C06 Fab 8.8e5 1.1e-3 1.3 0.6±0.4 2.0±0.3 - -
G11 Fab 3.0e5 1.2e-3 4.0 - - 4.0±2.0 1.7±0.3
C06 MAb 1.9e6b 2.4e-4b 0.13b 0.1±0.3 1.0±0.1 - -
b b b
G11 MAb 1.1e6 1.1e-4 0.11 - - 0.1±0.1 1.1±0.1
CtermBsAb -b -b -b 0.03±0.1 1.1±0.1 0.1±0.5 1.1±0.1
NtermBsAb -b -b -b 0.2±0.2 1.5±0.1 0.7±0.7 1.5±0.3
[0962] a描述在US PCT 2007/0243194：Anti-IGF-1R antibodies and uses thereof(抗IGF-1R抗体和其应用)。
[0963] b复杂/多相结合动力学。
[0964] d.基于溶液的表面等离子体共振确定IGF-1R对以下结合的化学计量和亲和力：(i)C06和G11 Fab、(ii)C06和G11 MAb、和(iii)N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体
[0965] 如以上实施例4所述，组合识别不重叠表位的多种抑制性抗IGF-1R抗体可导致比使用单种单克隆抗体获得的配体阻断增强的配体阻断。为了将两种抑制性抗IGF-1R抗
体的活性组合到单种蛋白构建体，我们产生了组合G11抗体的竞争性配体阻断行为和C06
抗体的变构阻断活性的四价双特异性抗体(BsAb)。BsAb由来自C06抗体的稳定化的scFv
重组地融合到IgG1形式的G11抗体的N-或C-末端而构成(图37)。如美国专利申请第
2008/0050370号：“Stabilized polypeptide compositions(稳定化的多肽组合物)”所
述，scFv的稳定化是用于产生高质量四价IgG-样双特异性或多价抗体的促因步骤。本实
施例中的数据显示，N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体表现比单种单克隆抗体增强的配体
阻断。
体的活性组合到单种蛋白构建体，我们产生了组合G11抗体的竞争性配体阻断行为和C06
抗体的变构阻断活性的四价双特异性抗体(BsAb)。BsAb由来自C06抗体的稳定化的scFv
重组地融合到IgG1形式的G11抗体的N-或C-末端而构成(图37)。如美国专利申请第
2008/0050370号：“Stabilized polypeptide compositions(稳定化的多肽组合物)”所
述，scFv的稳定化是用于产生高质量四价IgG-样双特异性或多价抗体的促因步骤。本实
施例中的数据显示，N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体表现比单种单克隆抗体增强的配体
阻断。
[0966] i.方法
[0967] 配体阻断特性.MAb和BsAb阻断IGF-1和IGF-2的能力使用实施例4中描述的IGF-1和IGF-2阻断ELISA来确定。测定中的IGF-1和IGF-2浓度分别是320nM和640nM。
为了研究配体浓度对C06和G11 MAb以及N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体阻断能力的
依赖性，测定在不同配体浓度进行。单独的阻断ELISA使用20nM、80nM、320nM或1300nM
IGF-1或40nM、160nM、640nM或2600nM IGF-2进行。IGF-2浓度较高，因为IGF-2对受体的
亲和力略低。为了保持在ELISA曲线的线性范围内，我们需要在比IGF-1阻断ELISA高的
IGF-2浓度进行测定来获得相当的结果。
为了研究配体浓度对C06和G11 MAb以及N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体阻断能力的
依赖性，测定在不同配体浓度进行。单独的阻断ELISA使用20nM、80nM、320nM或1300nM
IGF-1或40nM、160nM、640nM或2600nM IGF-2进行。IGF-2浓度较高，因为IGF-2对受体的
亲和力略低。为了保持在ELISA曲线的线性范围内，我们需要在比IGF-1阻断ELISA高的
IGF-2浓度进行测定来获得相当的结果。
[0968] ii.结果
[0969] C06和G11抗体与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体在IGF-1和IGF-2阻断ELISA中并列地检验(图42A-B)，使用320nM IGF-1和640nM IGF-2。N-和C-末端BsAb两者具
有～1nM IC50值，与较高亲和力的抗体C06相当。C06和G11抗体两者在抗体浓度＜100nM
不能完全消除IGF-1或IGF-2对IGF-1R的结合(图42A-B)。N-和C-term.IGF-1R双特异
性抗体在低浓度能够完全消除IGF-1和IGF-2对受体的结合(＜10nM，图42A-B)。
有～1nM IC50值，与较高亲和力的抗体C06相当。C06和G11抗体两者在抗体浓度＜100nM
不能完全消除IGF-1或IGF-2对IGF-1R的结合(图42A-B)。N-和C-term.IGF-1R双特异
性抗体在低浓度能够完全消除IGF-1和IGF-2对受体的结合(＜10nM，图42A-B)。
[0970] 随着测定中使用的配体浓度增加，人类抗体C06失去其一些IGF-1阻断活性(即，随着配体浓度升高，当受体被C06饱和时能够结合IGF-1R的IGF-1的百分比升高，图43A)。
这是C06是纯粹变构抑制物的结果。G11抗体不同地响应于配体浓度增加。作为竞争性抑
制物，人类抗体G11必须直接与配体竞争结合受体。随着配体浓度增加，G11抗体的表观效
价减少(图43B)。通过组合在配体存在下结合变构位点的受体的能力和使用变构和竞争性
机制抑制的能力，BsAb能够完全消除IGF-1和IGF-2两者对受体的结合-而不论配体浓度
(图44A-D)。另外，对N-和C-term.IGF-1R^2抗体两者测量的IC50值独立于测定中使用的
配体浓度，并与以下测定中对C06抗体观察到的IC50值相当：
这是C06是纯粹变构抑制物的结果。G11抗体不同地响应于配体浓度增加。作为竞争性抑
制物，人类抗体G11必须直接与配体竞争结合受体。随着配体浓度增加，G11抗体的表观效
价减少(图43B)。通过组合在配体存在下结合变构位点的受体的能力和使用变构和竞争性
机制抑制的能力，BsAb能够完全消除IGF-1和IGF-2两者对受体的结合-而不论配体浓度
(图44A-D)。另外，对N-和C-term.IGF-1R^2抗体两者测量的IC50值独立于测定中使用的
配体浓度，并与以下测定中对C06抗体观察到的IC50值相当：
[0971] C-末端IGF-1R BsAb：IC50 IGF-1阻断＝2.0+0.3
[0972] C-末端IGF-1R BsAb：IC50 IGF-2阻断＝1.7+0.2
[0973] N-末端IGF-1R BsAb：IC50 IGF-1阻断＝1.4+0.2
[0974] N-末端IGF-1R BsAb：IC50 IGF-2阻断＝2.7+0.9。
[0975] 这些结果证明，通过识别C06和G11抑制性表位的能力，N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体表明在所有配体浓度比标准人类抗体C06和G11增强的配体阻断。
[0976] e.C06和G11 MAb和N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体交联IGF-1R
[0977] 针对IGF-1R的不同抑制性抗体的一种可能的区别特征是其交联细胞表面上受体的能力。许多受体酪氨酸激酶家族成员经由配体-介导的同二聚化或异二聚化发出信号。
然而，IGF-1R(和胰岛素受体)不经由此机制发出信号。IGF-1R是组成型同二聚体，其信号
传导取决于配体结合诱导的构象变化，与二聚化无关。
然而，IGF-1R(和胰岛素受体)不经由此机制发出信号。IGF-1R是组成型同二聚体，其信号
传导取决于配体结合诱导的构象变化，与二聚化无关。
[0978] 针对IGF-1R的一些抗体已经证明了经由内化和降解向下调节受体的能力。交联通常伴随着细胞表面蛋白内化的功效(如，FcεRI通过交联内化)。以这种方式，交联可能
对针对细胞表面蛋白(本例中的IGF-1R)的抗体的活性有显著影响。另外，抗体-介导的
细胞表面上IGF-1R交联的程度可能影响抗体的Fc-区对FcγR受体或补体的结合-影响
抗体与宿主免疫系统的活性。
对针对细胞表面蛋白(本例中的IGF-1R)的抗体的活性有显著影响。另外，抗体-介导的
细胞表面上IGF-1R交联的程度可能影响抗体的Fc-区对FcγR受体或补体的结合-影响
抗体与宿主免疫系统的活性。
[0979] 我们在本文证明，当与可溶形式的IGF-1R胞外结构域一起孵育时，C06和G11 MAb导致溶液中不同大小的IGF-1R/MAb免疫复合物。我们还研究了通过同时向含有IGF-1R的
溶液引入C06和G11MAb而形成的所得的复合物。最后，我们研究了由N-和C-末端IGF-1R
双特异性抗体形成的免疫复合物的特性。
溶液引入C06和G11MAb而形成的所得的复合物。最后，我们研究了由N-和C-末端IGF-1R
双特异性抗体形成的免疫复合物的特性。
[0980] i.方法
[0981] 具有在线静态光散射的分析性尺寸排阻色谱(SEC).SEC样品以(i)C06 MAb、(ii)G11 MAb、和(iii)sIGF-1R(1-903)；以二重混合物(iv)C06 MAb和sIGF-1R(1-903)或(v)
G11 MAb和sIGF-1R(1-903)；或以三重混合物(vi)C06 MAb、G11 MAb和sIGF-1R(1-903)制
备。所有样品含有25μg每种蛋白，在PBS、pH 7.2中稀释到终体积50μL，随后注射到pH
6.8的10mM磷酸盐、150mM NaCl、0.02％叠氮化钠中平衡的SEC柱、TSKgel G3000SW XL，
5mm， 分析性SEC柱(Tosoh Biosciences)，使用Agilent 1100HPLC系统。从SEC柱洗
脱的材料的光散射数据使用偶联到在线折光指数计的miniDAWN静态光散射检测仪(Wyatt
Technologies)收集。光散射数据使用制造商提供的ASTRA V软件分析。
G11 MAb和sIGF-1R(1-903)；或以三重混合物(vi)C06 MAb、G11 MAb和sIGF-1R(1-903)制
备。所有样品含有25μg每种蛋白，在PBS、pH 7.2中稀释到终体积50μL，随后注射到pH
6.8的10mM磷酸盐、150mM NaCl、0.02％叠氮化钠中平衡的SEC柱、TSKgel G3000SW XL，
5mm， 分析性SEC柱(Tosoh Biosciences)，使用Agilent 1100HPLC系统。从SEC柱洗
脱的材料的光散射数据使用偶联到在线折光指数计的miniDAWN静态光散射检测仪(Wyatt
Technologies)收集。光散射数据使用制造商提供的ASTRA V软件分析。
[0982] 另外的SEC样品使用(i)C-term.IGF-1R双特异性抗体(BsAb)、(ii)N-term.IGF-1R BsAb、和 (iii)sIGF-1R(1-903)；或 复 合 体 (iV)C-term.IGF-1R BsAb 和
sIGF-1R(1-903)或(v)N-term.IGF-1R BsAb和sIGF-1R(1-903)制备。实验中使用的
sIGF-1R(1-903)和BsAb的量分别是30μg和45μg。在SEC/静态光散射分析前，所有样
品在PBS、pH 7.2中稀释到终体积50μL。
sIGF-1R(1-903)或(v)N-term.IGF-1R BsAb和sIGF-1R(1-903)制备。实验中使用的
sIGF-1R(1-903)和BsAb的量分别是30μg和45μg。在SEC/静态光散射分析前，所有样
品在PBS、pH 7.2中稀释到终体积50μL。
[0983] ii.结果
[0984] 以分离的C06和G11 MAb以及以分离的sIGF-1R(1-903)的SEC/静态光散射结果表明，蛋白都表现预期的分子量(对于抗体150kDa，对于sIGF-1R(1-903)～250kDa，图
45A)。基于观察到的分子量840kDa，G11 MAb与sIGF-1R(1-903)之间形成的复合体表现为
偏好4个分子的物质(2分子的G11 MAb和2分子的sIGF-1R(1-903))(图45A)。C06MAb
与可溶的IGF-1R胞外结构域形成大得多的复合物，2MDa图45A。当将C06和G11 MAb两者
同时引入到可溶的受体胞外结构域以形成三重混合物时，免疫复合物的平均大小显著增加
到＞10MDa，超出我们的测量范围(图45A)。这表示，向细胞表面上IGF-1R加入识别不重
叠表位的两种抗体可能导致新的交联和可能的向下调节行为。
45A)。基于观察到的分子量840kDa，G11 MAb与sIGF-1R(1-903)之间形成的复合体表现为
偏好4个分子的物质(2分子的G11 MAb和2分子的sIGF-1R(1-903))(图45A)。C06MAb
与可溶的IGF-1R胞外结构域形成大得多的复合物，2MDa图45A。当将C06和G11 MAb两者
同时引入到可溶的受体胞外结构域以形成三重混合物时，免疫复合物的平均大小显著增加
到＞10MDa，超出我们的测量范围(图45A)。这表示，向细胞表面上IGF-1R加入识别不重
叠表位的两种抗体可能导致新的交联和可能的向下调节行为。
[0985] 还由SEC/静态光散射检查了N-和C-末端IGF-1R双特异性抗 体与SIGF-1R(1-903)的混合物(图45B)。分离时，BsAb和sIGF-1R(1-903)都表现其预期分子量
(对于BsAb～210kDa，对于sIGF-1R(1-903)～250kDa)。有趣的是，当与sIGF-1R(1-903)
复合时，BsAb导致与对G11MAb测量的相似复合物大小(对于C-term.IGF-1R BsAb/
sIGF-1R(1-903)复合物～1.0MDa，对于N-term.IGF-1RBsAb/sIGF-1R(1-903)复合物～
1.3MDa)。由于BsAb与sIGF-1R(1-903)的相似分子量，仅基于这些研究我们不能够确定免
疫复合物的实际组成(即，BsAb相对sIGF-1R(1-903分子)的数目)是否与对G11 MAb观
察到的相似。
(对于BsAb～210kDa，对于sIGF-1R(1-903)～250kDa)。有趣的是，当与sIGF-1R(1-903)
复合时，BsAb导致与对G11MAb测量的相似复合物大小(对于C-term.IGF-1R BsAb/
sIGF-1R(1-903)复合物～1.0MDa，对于N-term.IGF-1RBsAb/sIGF-1R(1-903)复合物～
1.3MDa)。由于BsAb与sIGF-1R(1-903)的相似分子量，仅基于这些研究我们不能够确定免
疫复合物的实际组成(即，BsAb相对sIGF-1R(1-903分子)的数目)是否与对G11 MAb观
察到的相似。
[0986] 总之，我们证明，C06和G11 MAb导致形成非常不同的与sIGF-1R(1-903)的免疫复合物，形成三重混合物的MAb的组合导致免疫复合物尺寸非常大的增加。C06和G11抗体
转变为双特异性形式不导致在IGF-1R结合于BsAb后，免疫复合物的复杂度和尺寸的伴随
的增加。有趣的是，可能是由于空间影响，由BsAb形成的复合物是小的-与对分离时G11
MAb观察到的相似。
转变为双特异性形式不导致在IGF-1R结合于BsAb后，免疫复合物的复杂度和尺寸的伴随
的增加。有趣的是，可能是由于空间影响，由BsAb形成的复合物是小的-与对分离时G11
MAb观察到的相似。
[0987] 实施例10.靶向IGF-1R上两个不同表位的IGF-1R双特异性抗体的功能活性
[0988] 本实施例中概述的实验结果提供如下生物基本原理和概念验证(poor-of-concept)：针对IGF-1R抗体的两个不同表位的双特异性抗体表明超过单特异性
抗体的增强的生物活性并导致更好的体内抗肿瘤活性。
抗体的增强的生物活性并导致更好的体内抗肿瘤活性。
[0989] C06和G11是靶向IGF-1R上两个不同表位的两种抑制性抗IGF-1R抗体，分别通过变构机制和竞争性机制阻断IGF-1和IGF-2结合。C06和G11的组合可增强配体阻断并抑
制肿瘤细胞生长。因此构建两种形式的双特异性抗体N-IGF-1R双特异性抗体(使用带有
I83E突变的C06 scFv，具有G11 IgG1骨架的N-末端IGF-1R^2)和C-IGF-1R双特异性抗
体(使用带有I83E突变的C06 scFv，具有G11IgG1骨架的C-末端IGF-1R双特异性抗体)
作为单独双特异性分子来靶向IGF-1R上的C06和G11表位两者。以C06和G11组合、或单
独双特异性剂N-IGF-1R双特异性抗体和C-IGF-1R双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同
抑制性表位的生物作用已在以下测定中评价，概述在本文所述的实施例中：抑制IGF-1R磷
酸化；诱导IGF-1R向下调节；抑制AKT和MAPK抑制；抑制细胞在-/+IGF的SFM和血清中
生长；细胞周期停滞；ADCC活性；抑制不依赖支持物的生长；抑制SJSA-1肿瘤体内生长；和小鼠中的PK研究。
制肿瘤细胞生长。因此构建两种形式的双特异性抗体N-IGF-1R双特异性抗体(使用带有
I83E突变的C06 scFv，具有G11 IgG1骨架的N-末端IGF-1R^2)和C-IGF-1R双特异性抗
体(使用带有I83E突变的C06 scFv，具有G11IgG1骨架的C-末端IGF-1R双特异性抗体)
作为单独双特异性分子来靶向IGF-1R上的C06和G11表位两者。以C06和G11组合、或单
独双特异性剂N-IGF-1R双特异性抗体和C-IGF-1R双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同
抑制性表位的生物作用已在以下测定中评价，概述在本文所述的实施例中：抑制IGF-1R磷
酸化；诱导IGF-1R向下调节；抑制AKT和MAPK抑制；抑制细胞在-/+IGF的SFM和血清中
生长；细胞周期停滞；ADCC活性；抑制不依赖支持物的生长；抑制SJSA-1肿瘤体内生长；和小鼠中的PK研究。
[0990] a.以C06和G11的组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位比单种单克隆抗体更有效地抑制IGF-1R磷酸化
[0991] 通过用C06/G11组合或C-IGF-1R双特异性抗体处理细胞来评价双重靶向两个IGF-1R表位对IGF-1R磷酸化的作用。简要地说，将人类非小细胞肺癌来源的H322M细
胞接种到12-孔培养板并生长在含有10％胎牛血清(FBS，Irvine Scientific，#3000A)
的RPMI-1640培养基中过夜。将细胞血清饥饿24小时，随后用0.1nM、1nM、10nM或100nM
C2B8(抗CD20，IgG1同种型对照抗体，BiogenIdec)、C06、G11、C06/G11组合或C-IGF-1R双特异性抗体在37℃处理1小时，随后用100ng/ml IGF-1和100ng/ml IGF-2(R & DSystems，
#291-G1，#292-G2)刺激20分钟。在细胞裂解缓冲液(MesoScale Discovery，目录号
R60TX-3)中提取细胞蛋白。裂解液中的蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，目录号
23227)测量，将等量的蛋白分离到NUPAGE 4-12％Tris-Bis凝胶上，并转移到硝化纤维素
膜(0.45μm孔)。用抗磷酸-IGF-1R(Cell Signaling technology，目录号3021和3024)
和抗完整-IGF-1R(Cell Signaling technology，目录号3027)探测各印迹，随后用检测抗
体山羊抗兔-IgG-HRP轭合物(Jackson ImmunoResearch，目录号111-035-003)探测各印
迹。用Supersignal Western底物试剂盒(Pierce，目录号34095)对各印迹显色，将化学
发光图像捕获到BioRad的VersaDoc 5000成像系统。如图46A所示，C06与G11组合和
C-IGF-1R双特异性抗体两者表明比单独C06或G11更强地抑制IGF-1R磷酸化。有趣的是，
G11和C06组合比单种抗体更有效地向下调节IGF-1R总质量，而C-IGF-1R双特异性抗体
在向下调节IGF-1R方面比C06和G11组合表现得较不有效。C-IGF-1R双特异性抗体可与
组合相当地抑制IGF-1R磷酸化而由western印迹杂交检测到没有相同程度的受体向下调
节的事实表示，C-IGF-1R双特异性抗体对IGF-1R磷酸化提高的抑制活性主要是由于其增
加的IGF1/2配体阻断，如此前所示的。对A549非小细胞肺癌细胞和N-IGF-1R双特异性抗
体(数据未显示)观察到相似结果，说明使用两种单独抗体的组合或单种双特异性抗体靶
向IGF-1R两个表位可比单种单克隆抗IGF-1R抗体更有效地在肿瘤细胞中抑制IGF-1R活
化。
胞接种到12-孔培养板并生长在含有10％胎牛血清(FBS，Irvine Scientific，#3000A)
的RPMI-1640培养基中过夜。将细胞血清饥饿24小时，随后用0.1nM、1nM、10nM或100nM
C2B8(抗CD20，IgG1同种型对照抗体，BiogenIdec)、C06、G11、C06/G11组合或C-IGF-1R双特异性抗体在37℃处理1小时，随后用100ng/ml IGF-1和100ng/ml IGF-2(R & DSystems，
#291-G1，#292-G2)刺激20分钟。在细胞裂解缓冲液(MesoScale Discovery，目录号
R60TX-3)中提取细胞蛋白。裂解液中的蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，目录号
23227)测量，将等量的蛋白分离到NUPAGE 4-12％Tris-Bis凝胶上，并转移到硝化纤维素
膜(0.45μm孔)。用抗磷酸-IGF-1R(Cell Signaling technology，目录号3021和3024)
和抗完整-IGF-1R(Cell Signaling technology，目录号3027)探测各印迹，随后用检测抗
体山羊抗兔-IgG-HRP轭合物(Jackson ImmunoResearch，目录号111-035-003)探测各印
迹。用Supersignal Western底物试剂盒(Pierce，目录号34095)对各印迹显色，将化学
发光图像捕获到BioRad的VersaDoc 5000成像系统。如图46A所示，C06与G11组合和
C-IGF-1R双特异性抗体两者表明比单独C06或G11更强地抑制IGF-1R磷酸化。有趣的是，
G11和C06组合比单种抗体更有效地向下调节IGF-1R总质量，而C-IGF-1R双特异性抗体
在向下调节IGF-1R方面比C06和G11组合表现得较不有效。C-IGF-1R双特异性抗体可与
组合相当地抑制IGF-1R磷酸化而由western印迹杂交检测到没有相同程度的受体向下调
节的事实表示，C-IGF-1R双特异性抗体对IGF-1R磷酸化提高的抑制活性主要是由于其增
加的IGF1/2配体阻断，如此前所示的。对A549非小细胞肺癌细胞和N-IGF-1R双特异性抗
体(数据未显示)观察到相似结果，说明使用两种单独抗体的组合或单种双特异性抗体靶
向IGF-1R两个表位可比单种单克隆抗IGF-1R抗体更有效地在肿瘤细胞中抑制IGF-1R活
化。
[0992] b.以C06和G11组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位有效地诱导IGF-1R向下调节
[0993] 如实施例10a所证明的，当用抗体处理细胞时，一小时后G11和C06组合比单种抗体更有效地向下调节IGF-1R的总质量。我们进一步研究C06/G11组合和BsAb在时程实验
中降解IGF-1R质量的能力。将H322M细胞铺板到12-孔培养板并用15μg/ml C06、G11、C06
和G11组合、C-IGF-1R双特异性抗体或N-IGF-1R双特异性抗体处理1、4或24小时。提取
细胞蛋白并NUPAGE 4-12％Tris-Bis凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜，如以上实施例10a
所示的。用抗完整-IGF-1R随后用第二抗体轭合物抗兔-IgG-HRP探测各印迹，随后用来自
Pierce的Supersignal Western底物试剂盒显色。图46B显示，1-小时处理后，C06和G11
组合以及N-IGF-1R双特异性抗体比单种抗体促进更有效的降解IGF-1R，而C-IGF-1R双特
异性抗体降解IGF-1R到与单种抗体处理相似程度。然而，加入抗体4小时和24小时后，细
胞中的大多数IGF-1R被所有抗体处理降解，用单种抗体或C-BsAb处理的细胞与用C06和
G11组合或N-IGF-1R处理的细胞之间剩余IGF-1R的量差异很小。
中降解IGF-1R质量的能力。将H322M细胞铺板到12-孔培养板并用15μg/ml C06、G11、C06
和G11组合、C-IGF-1R双特异性抗体或N-IGF-1R双特异性抗体处理1、4或24小时。提取
细胞蛋白并NUPAGE 4-12％Tris-Bis凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜，如以上实施例10a
所示的。用抗完整-IGF-1R随后用第二抗体轭合物抗兔-IgG-HRP探测各印迹，随后用来自
Pierce的Supersignal Western底物试剂盒显色。图46B显示，1-小时处理后，C06和G11
组合以及N-IGF-1R双特异性抗体比单种抗体促进更有效的降解IGF-1R，而C-IGF-1R双特
异性抗体降解IGF-1R到与单种抗体处理相似程度。然而，加入抗体4小时和24小时后，细
胞中的大多数IGF-1R被所有抗体处理降解，用单种抗体或C-BsAb处理的细胞与用C06和
G11组合或N-IGF-1R处理的细胞之间剩余IGF-1R的量差异很小。
[0994] 此外，我们通过FACS(荧光激活的细胞分选)检查了以各种抗体处理条件的IGF-1R内化率。将H322M细胞生长在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中48小时。随后
将细胞与100nM C2B8(同种型阴性对照)、C06、G11、C06和G11组合、N-和C-IGF-1R双特
异性抗体在冰上孵育1小时以允许细胞表面IGF-1R被抗体标记。将用每种抗体染色的细
胞样品保持在冰上以阻止内化，称为零时(t＝0)。这用作100％Ab结合的对照。将抗体
染色的其余细胞培养在生长培养基1、4或24小时。每个培养时间段结束时，用细胞解离缓
冲液(Gibco，目录号13151-014)将细胞从烧瓶取出，用PBS(FACS缓冲液)中0.1％叠氮化
钠/1％BSA在冰上终止内化。用FACS缓冲液中的PE-标记的第二F(ab’)2片段山羊抗人
类IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch Lab，目录号109-116-088；2.5μg/ml)染色细胞1
小时以检测细胞表面上剩余的抗体。将细胞固定在2％多聚甲醛中(Electron Microscopy
Sciences(EMS)；目录号15710)。随后在FACSCalibur(BD)上运行样品并确定荧光手段
(MFI)。处理1、4或24小时后细胞表面上剩余的每种抗体标记的IGF-1R的分数计算为在
每个时间点的MFI比在零时的MFI的百分比。如图47A所示，C06和G11组合促进略微更高
的受体内化率，而全部的所有IGF-1R抗体可相当有效地诱导IGF-1R内化，抗体处理24小
时后减少表面的IGF-1R超过70％。总之，这些研究表示，G06和G11组合可比单克隆抗体
更有效地向下调节IGF-1R，然而包括单克隆抗体和双特异性抗体的所有抗体最终可相当有
效地向下调节(使内化和降解)IGF-1R。
将细胞与100nM C2B8(同种型阴性对照)、C06、G11、C06和G11组合、N-和C-IGF-1R双特
异性抗体在冰上孵育1小时以允许细胞表面IGF-1R被抗体标记。将用每种抗体染色的细
胞样品保持在冰上以阻止内化，称为零时(t＝0)。这用作100％Ab结合的对照。将抗体
染色的其余细胞培养在生长培养基1、4或24小时。每个培养时间段结束时，用细胞解离缓
冲液(Gibco，目录号13151-014)将细胞从烧瓶取出，用PBS(FACS缓冲液)中0.1％叠氮化
钠/1％BSA在冰上终止内化。用FACS缓冲液中的PE-标记的第二F(ab’)2片段山羊抗人
类IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch Lab，目录号109-116-088；2.5μg/ml)染色细胞1
小时以检测细胞表面上剩余的抗体。将细胞固定在2％多聚甲醛中(Electron Microscopy
Sciences(EMS)；目录号15710)。随后在FACSCalibur(BD)上运行样品并确定荧光手段
(MFI)。处理1、4或24小时后细胞表面上剩余的每种抗体标记的IGF-1R的分数计算为在
每个时间点的MFI比在零时的MFI的百分比。如图47A所示，C06和G11组合促进略微更高
的受体内化率，而全部的所有IGF-1R抗体可相当有效地诱导IGF-1R内化，抗体处理24小
时后减少表面的IGF-1R超过70％。总之，这些研究表示，G06和G11组合可比单克隆抗体
更有效地向下调节IGF-1R，然而包括单克隆抗体和双特异性抗体的所有抗体最终可相当有
效地向下调节(使内化和降解)IGF-1R。
[0995] c.以C06和G11组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位比单种单克隆抗体更有效地抑制AKT存活和MAPK增殖信号传导途径
[0996] 检查了组合C06和G11或靶向IGF-1R两个表位的双特异性抗体对下游信号传导事件诸如Akt和MAPK磷酸化的作用。用0.1nM、1nM、10nM和100nM C2B8、C06、G11、C06/
G11、N-和C-IGF-1R双特异性抗体处理细胞1小时，随后用100ng/ml IGF1和IGF2刺激20
分钟，如实施例10a所述。根据制造商的实验方案使用p-AKT(Ser 473)MSD试剂盒(Meso
Scale Discovery，目录号K15100D)对AKT磷酸化定量。简要地说，将细胞在MSD试剂盒提
供的细胞裂解缓冲液中裂解，将等量蛋白加到电极上包被抗磷酸-AKT抗体的板，用以MSD
SULFO-TAG试剂标记的抗完整AKT抗体检测磷酸化的AKT，在SECTOR Imager 2400上读出
电化学发光。根据式[1-(Ab-SFM)/(IGF-SFM)]×100％计算抑制百分比。如图48所示，与
单独C06和G11相比，C06和G11组合、C-和N-IGF-1R双特异性抗体在H322M(图48A)、
A549(图48B)和BxPC3(图48C，胰腺癌)细胞中都显示增强地抑制AKT磷酸化。在A549细
胞中，N-IGF-1R双特异性抗体显示比C-IGF-1R双特异性抗体略低的活性，说明不同结构的
两种双特异性抗体可具有不同的功能。对于确定ERK磷酸化，按照与实施例10A所述的相似
实验方案进行与抗磷酸-ERK(Cell signaling，目录号9101)和完整ERK(Cen signaling，
目录号9102)的western印迹杂交。图47B显示，ERK磷酸化被C06与G11组合和C-IGF-1R
双特异性抗体比单独C06或G11更有效地抑制。以C06/G11组合或C-和N-IGF-1R双特异
性抗体靶向IGF 1-R两个表位导致增强ERK磷酸化抑制的相似结果还在BxPC3细胞观察
到。这些结果支持：以双特异性抗体或抗体组合靶向IGF-1R上两个不同表位在IGF-1R途
径敏感肿瘤中将具有对IGF-1R下游信号传导诸如AKT存活和/或ERK增殖信号传导的更
强抑制，导致增强的抗肿瘤活性。
G11、N-和C-IGF-1R双特异性抗体处理细胞1小时，随后用100ng/ml IGF1和IGF2刺激20
分钟，如实施例10a所述。根据制造商的实验方案使用p-AKT(Ser 473)MSD试剂盒(Meso
Scale Discovery，目录号K15100D)对AKT磷酸化定量。简要地说，将细胞在MSD试剂盒提
供的细胞裂解缓冲液中裂解，将等量蛋白加到电极上包被抗磷酸-AKT抗体的板，用以MSD
SULFO-TAG试剂标记的抗完整AKT抗体检测磷酸化的AKT，在SECTOR Imager 2400上读出
电化学发光。根据式[1-(Ab-SFM)/(IGF-SFM)]×100％计算抑制百分比。如图48所示，与
单独C06和G11相比，C06和G11组合、C-和N-IGF-1R双特异性抗体在H322M(图48A)、
A549(图48B)和BxPC3(图48C，胰腺癌)细胞中都显示增强地抑制AKT磷酸化。在A549细
胞中，N-IGF-1R双特异性抗体显示比C-IGF-1R双特异性抗体略低的活性，说明不同结构的
两种双特异性抗体可具有不同的功能。对于确定ERK磷酸化，按照与实施例10A所述的相似
实验方案进行与抗磷酸-ERK(Cell signaling，目录号9101)和完整ERK(Cen signaling，
目录号9102)的western印迹杂交。图47B显示，ERK磷酸化被C06与G11组合和C-IGF-1R
双特异性抗体比单独C06或G11更有效地抑制。以C06/G11组合或C-和N-IGF-1R双特异
性抗体靶向IGF 1-R两个表位导致增强ERK磷酸化抑制的相似结果还在BxPC3细胞观察
到。这些结果支持：以双特异性抗体或抗体组合靶向IGF-1R上两个不同表位在IGF-1R途
径敏感肿瘤中将具有对IGF-1R下游信号传导诸如AKT存活和/或ERK增殖信号传导的更
强抑制，导致增强的抗肿瘤活性。
[0997] d.以C06和G11组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位与单种单克隆抗体相比导致增强抑制各种肿瘤的细胞生长
[0998] 我们使用细胞存活力测定检查了在不同生长条件下，C06/G11组合、N-和C-IGF-1R双特异性抗体对不同来源的肿瘤的细胞生长的作用，同单克隆抗体C06和G11的
作用比较。
作用比较。
[0999] 首先，将胰腺癌BxPC3细胞、非小细胞肺癌H322M和A549细胞、表皮样癌A431细胞以5000-8000细胞/孔接种到96-孔培养板并在含有血清的常规培养基中生长过夜，随
后将细胞转移到无血清培养基，在补充有0.1nM、1nM、10nM或100nM C2B8、C06、G11、C06和G11组合、C-或N-IGF-1R双特异性抗体、和100ng/mlIGF-1和IGF-2的培养基中培养另外
三天。通过用Cell Titer Glo试剂(Promega，目录号G7571)测量ATP水平来确定细胞存
活力。图49显示，N-IGF-1R双特异性抗体、C-IGF-1R双特异性抗体、C06和G11组合都比
C06和G11单独在BxPC3(图49A)、H322M(图49B)、A431(图49C)和A549(图49D)细胞中
表现增强的抗肿瘤生长活性。有趣的是，N-IGF-1R双特异性抗体在测试的大多数细胞系中
表现得不如C-IGF-1R双特异性抗体有效，再次强调两种双特异性分子的结构-功能关系的
可能差异。
后将细胞转移到无血清培养基，在补充有0.1nM、1nM、10nM或100nM C2B8、C06、G11、C06和G11组合、C-或N-IGF-1R双特异性抗体、和100ng/mlIGF-1和IGF-2的培养基中培养另外
三天。通过用Cell Titer Glo试剂(Promega，目录号G7571)测量ATP水平来确定细胞存
活力。图49显示，N-IGF-1R双特异性抗体、C-IGF-1R双特异性抗体、C06和G11组合都比
C06和G11单独在BxPC3(图49A)、H322M(图49B)、A431(图49C)和A549(图49D)细胞中
表现增强的抗肿瘤生长活性。有趣的是，N-IGF-1R双特异性抗体在测试的大多数细胞系中
表现得不如C-IGF-1R双特异性抗体有效，再次强调两种双特异性分子的结构-功能关系的
可能差异。
[1000] 为了进一步检验抗体在生理更相关条件下的抗肿瘤细胞生长作用，将细胞在含有10％血清(FBS，Hyclone目录号SH30071.03)、补充有0.1nM、1nM、10nM或100nM各种抗体和
200ng/ml IGF1和IGF2的培养基中生长3天，随后如上述地确定细胞存活力。如图50所
示，以BxPC3(图50A)、A549(图50B)、骨肉瘤SJSA-1(图50C)和结肠癌HT-29(图50D)细
胞观察到IGF-1R^2和C06/G11组合相似地增强的活性。另外，在以上含有血清的细胞生长
条件但细胞培养基中不补充IGF1或IGF2检验抗体。图51显示，IGF-1R^2和C06/G11组
合表明比单独C06和G11在A549(图51A)和H322M(图51B)的血清-驱动的细胞生长中
更好的抗肿瘤细胞生长活性。一致地，C-IGF-1R双特异性抗体在检验的多种肿瘤细胞系展
示比N-IGF-1R^2高的抗肿瘤活性，特别是H322M和A549细胞。
200ng/ml IGF1和IGF2的培养基中生长3天，随后如上述地确定细胞存活力。如图50所
示，以BxPC3(图50A)、A549(图50B)、骨肉瘤SJSA-1(图50C)和结肠癌HT-29(图50D)细
胞观察到IGF-1R^2和C06/G11组合相似地增强的活性。另外，在以上含有血清的细胞生长
条件但细胞培养基中不补充IGF1或IGF2检验抗体。图51显示，IGF-1R^2和C06/G11组
合表明比单独C06和G11在A549(图51A)和H322M(图51B)的血清-驱动的细胞生长中
更好的抗肿瘤细胞生长活性。一致地，C-IGF-1R双特异性抗体在检验的多种肿瘤细胞系展
示比N-IGF-1R^2高的抗肿瘤活性，特别是H322M和A549细胞。
[1001] 总之这些结果说明，在各种细胞生长条件下，以组合的C06和G11或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位与单种单克隆抗体相比可导致增强的抗肿瘤细胞
生长活性。
生长活性。
[1002] e.以C06和G11组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位导致肿瘤细胞周期停滞
[1003] IGF-1R信号传导对于细胞存活和细胞周期进展是关键的。使用基于FACS的分5
析评价抗IGF-1R抗体对IGF-诱导的肿瘤细胞周期进展的作用。将BxPC3细胞以4×10
细胞/孔接种到6-孔板并在含有5％FBS的RPMI-1640培养基培养过夜。随后对细胞血
清-饥饿24小时，然后以100ng/ml IGF 1和IGF-2在15μg/ml C2B8、C06、G11、C06/G11
组合、N-和C-IGF-1R双特异性存在下处理另外24小时。将细胞取出板并随后固定在预冷
的70％乙醇中。用碘化丙锭(PI，Molecular Probes，目录号P3566)染色溶液(PBS+0.1％
BSA+Triton X-100中20μg/ml)将固定的细胞在室温染色30分钟，随后FACS分析DNA含
量。使用FlowJo 7.7.2软件从柱状图计算处在G0/G1、S和G2/M期的细胞的相对百分比。
图52显示，在无血清条件(图52A)，多于60％的细胞处在G0/G1期，而IGF-1和IGF-2刺
激(图52B)显著减少处在G0/G1期的细胞百分比到大约40％并增加处在S期的细胞百分
比大约两倍。所有抗IGF-1R抗体能够逆转IGF刺激的作用，通过增加处在G0/G1期的细胞
百分比同时减少处在S期的细胞百分比。C06和G11组合、和C-IGF-1R双特异性表现为最
有效地阻断肿瘤细胞周期进展到S期并诱导细胞周期停滞在G0/G1期。
析评价抗IGF-1R抗体对IGF-诱导的肿瘤细胞周期进展的作用。将BxPC3细胞以4×10
细胞/孔接种到6-孔板并在含有5％FBS的RPMI-1640培养基培养过夜。随后对细胞血
清-饥饿24小时，然后以100ng/ml IGF 1和IGF-2在15μg/ml C2B8、C06、G11、C06/G11
组合、N-和C-IGF-1R双特异性存在下处理另外24小时。将细胞取出板并随后固定在预冷
的70％乙醇中。用碘化丙锭(PI，Molecular Probes，目录号P3566)染色溶液(PBS+0.1％
BSA+Triton X-100中20μg/ml)将固定的细胞在室温染色30分钟，随后FACS分析DNA含
量。使用FlowJo 7.7.2软件从柱状图计算处在G0/G1、S和G2/M期的细胞的相对百分比。
图52显示，在无血清条件(图52A)，多于60％的细胞处在G0/G1期，而IGF-1和IGF-2刺
激(图52B)显著减少处在G0/G1期的细胞百分比到大约40％并增加处在S期的细胞百分
比大约两倍。所有抗IGF-1R抗体能够逆转IGF刺激的作用，通过增加处在G0/G1期的细胞
百分比同时减少处在S期的细胞百分比。C06和G11组合、和C-IGF-1R双特异性表现为最
有效地阻断肿瘤细胞周期进展到S期并诱导细胞周期停滞在G0/G1期。
[1004] f.以C06和G11组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位不诱导ADCC活性
[1005] 显示M13-C06不具有抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)。C06/G11组合51
和双特异性抗IGF-1R抗体诱导ADCC的能力在 Cr释放ADCC测定中检验。将表达高IGF-1R
51 51 4
的H322M细胞用 Cr标记1小时，随后洗涤以除去未掺入的 Cr。将标记的靶细胞以1×10
细胞/孔加入含有20μg/ml C06、G11、N-和C-IGF-1R双特异性抗体的各孔。加入效应细
胞，E：T比在0.1至10的范围中。在37℃在5％C02培养箱中培养4小时后，靶细胞释放
51
的 Cr使用Isodataγ计数器测量。自发释放是仅以培养基从靶细胞的释放，最大释放是
在去垢剂Triton X-100存在下从靶的释放。细胞裂解百分比(％)使用式(cpm样品释放-cpm
自发释放)/(cpm最大释放-cpm自发释放)计算。如图53A所示，所有抗IGF-1R抗体、C06、G11、N-和C-IGF-1R双特异性展示与阴性对照抗体相似的活性，少于20％细胞的裂解，而阳性对照抗
EGFR抗体在10的E∶T比例诱导大约60％细胞的裂解。数据表示，使用双特异性抗体或
C06/G11组合靶向IGF-1R的两个表位不促进ADCC活性，与对单克隆抗体C06和G11的IgG1
形式观察到的结果相似。这一结果与以下事实一致：所有这些抗IGF-1R抗体可有效诱导
IGF1-R向下调节，导致不足够的表面受体用于有效的抗体-NK细胞衔接。这些结果清楚地
说明，这些抗IGF-1R抗体的抗肿瘤活性依赖于其阻断受体信号传导和生物功能的能力，不
依赖于ADCC。
和双特异性抗IGF-1R抗体诱导ADCC的能力在 Cr释放ADCC测定中检验。将表达高IGF-1R
51 51 4
的H322M细胞用 Cr标记1小时，随后洗涤以除去未掺入的 Cr。将标记的靶细胞以1×10
细胞/孔加入含有20μg/ml C06、G11、N-和C-IGF-1R双特异性抗体的各孔。加入效应细
胞，E：T比在0.1至10的范围中。在37℃在5％C02培养箱中培养4小时后，靶细胞释放
51
的 Cr使用Isodataγ计数器测量。自发释放是仅以培养基从靶细胞的释放，最大释放是
在去垢剂Triton X-100存在下从靶的释放。细胞裂解百分比(％)使用式(cpm样品释放-cpm
自发释放)/(cpm最大释放-cpm自发释放)计算。如图53A所示，所有抗IGF-1R抗体、C06、G11、N-和C-IGF-1R双特异性展示与阴性对照抗体相似的活性，少于20％细胞的裂解，而阳性对照抗
EGFR抗体在10的E∶T比例诱导大约60％细胞的裂解。数据表示，使用双特异性抗体或
C06/G11组合靶向IGF-1R的两个表位不促进ADCC活性，与对单克隆抗体C06和G11的IgG1
形式观察到的结果相似。这一结果与以下事实一致：所有这些抗IGF-1R抗体可有效诱导
IGF1-R向下调节，导致不足够的表面受体用于有效的抗体-NK细胞衔接。这些结果清楚地
说明，这些抗IGF-1R抗体的抗肿瘤活性依赖于其阻断受体信号传导和生物功能的能力，不
依赖于ADCC。
[1006] g.以C06和G11组合或单剂双特异性抗体靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位导致增强的抑制不依赖支持物的肿瘤细胞生长
[1007] 不依赖支持物的生长是赘生性转化的标志。为了评价抗IGF-1R抗体抑制不依赖支持物的生长的能力，在24-孔培养板进行软琼脂集落形成测定。首先，以
RPMI-1640(Sigma，目录号Rl 145)制备0.6％琼脂(Sigma，目录号A5431-250G)的底层并
倒入10％胎牛血清(Irvine Scientific，目录号3000A)，允许固化。随后，在38℃至42℃
的控制温度，将混合了在含有10％FBS和15μg/ml C06、G11、N-IGF-1R双特异性、C06/G11组合或CE9.1(抗CD4，IgG1同种型阴性对照抗体，Biogen Idec)的培养基中以50000细
胞/孔的A549细胞的0.3％琼脂顶层倒入。在37℃在5％CO2培养箱中培养板2-3周，以
自动哺乳动物细胞集落计数器(Oxford Optronix GELCOUNT)计数大于30μm的集落。图
53B显示在每种抗体处理条件下形成的集落数，表示所有抗IGF-1R抗体强有力地抑制软琼
脂中肿瘤细胞的不依赖支持物的生长，而N-IGF-1R双特异性和组合C06/G11与单独C06或
G11相比展示略微增强的抑制。结果表示，组合靶向IGF1-R上的两个表位可能比单克隆抗
体有效地抑制肿瘤形成和体内生长。
RPMI-1640(Sigma，目录号Rl 145)制备0.6％琼脂(Sigma，目录号A5431-250G)的底层并
倒入10％胎牛血清(Irvine Scientific，目录号3000A)，允许固化。随后，在38℃至42℃
的控制温度，将混合了在含有10％FBS和15μg/ml C06、G11、N-IGF-1R双特异性、C06/G11组合或CE9.1(抗CD4，IgG1同种型阴性对照抗体，Biogen Idec)的培养基中以50000细
胞/孔的A549细胞的0.3％琼脂顶层倒入。在37℃在5％CO2培养箱中培养板2-3周，以
自动哺乳动物细胞集落计数器(Oxford Optronix GELCOUNT)计数大于30μm的集落。图
53B显示在每种抗体处理条件下形成的集落数，表示所有抗IGF-1R抗体强有力地抑制软琼
脂中肿瘤细胞的不依赖支持物的生长，而N-IGF-1R双特异性和组合C06/G11与单独C06或
G11相比展示略微增强的抑制。结果表示，组合靶向IGF1-R上的两个表位可能比单克隆抗
体有效地抑制肿瘤形成和体内生长。
[1008] h.以C06和G11组合靶向IGF-1R的两个不同抑制性表位导致增强的抑制肿瘤体内生长
[1009] SJSA-1骨肉瘤模型用于检验M13-C06和G11组合或作为单剂的体内抗肿瘤活性。6
用20％基质胶中的5×10 SJSA-1细胞皮下接种裸小鼠(8-10周大)的胁腹区。在第15
天，把带有肿瘤的小鼠随机分为4组(n＝8)。处理开始时各组的平均肿瘤体积是大约～
3
150mm。每周一次向小鼠腹膜内注射M13-C06.G4P.agly(15mg/kg)、G11.G4P.agly(15mg/
kg)、C06.G4P.agly+G11.G4P.agly(15mg/kg+15mg/kg)或对照抗体IDEC151(15mg/kg)，共3
2
个剂量。每周两次测量肿瘤，使用V＝L×W/2计算肿瘤大小。图54显示不同处理方案的
肿瘤生长曲线。显示M13-C06和G11两者作为单剂比对照IDEC151显著减少肿瘤生长，而
C06和G11组合导致比单独C06或G11显著更强地抑制肿瘤生长。正在SJSA-1肉瘤模型和
其它模型中体内检验双特异性抗体的抗肿瘤活性，预料与对C06和G11组合观察到的相当，
而比单独G11和C06的更好。
用20％基质胶中的5×10 SJSA-1细胞皮下接种裸小鼠(8-10周大)的胁腹区。在第15
天，把带有肿瘤的小鼠随机分为4组(n＝8)。处理开始时各组的平均肿瘤体积是大约～
3
150mm。每周一次向小鼠腹膜内注射M13-C06.G4P.agly(15mg/kg)、G11.G4P.agly(15mg/
kg)、C06.G4P.agly+G11.G4P.agly(15mg/kg+15mg/kg)或对照抗体IDEC151(15mg/kg)，共3
2
个剂量。每周两次测量肿瘤，使用V＝L×W/2计算肿瘤大小。图54显示不同处理方案的
肿瘤生长曲线。显示M13-C06和G11两者作为单剂比对照IDEC151显著减少肿瘤生长，而
C06和G11组合导致比单独C06或G11显著更强地抑制肿瘤生长。正在SJSA-1肉瘤模型和
其它模型中体内检验双特异性抗体的抗肿瘤活性，预料与对C06和G11组合观察到的相当，
而比单独G11和C06的更好。
[1010] i.由流式细胞术比较C06和G11单克隆抗体与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体对人类癌细胞的结合
[1011] 对抗体与人类癌细胞系的结合进行基于细胞的流式细胞术分析以扩展双特异性抗体生物物理特征的分析到具有可能更大的生物和治疗相关性的系统。分析双特异性抗体
与相关的单克隆抗体相比对人类癌细胞系复杂表面上存在的靶抗原和表位的结合特征提
供了进一步定义双特异性抗体的独特特征的机会。
与相关的单克隆抗体相比对人类癌细胞系复杂表面上存在的靶抗原和表位的结合特征提
供了进一步定义双特异性抗体的独特特征的机会。
[1012] 细胞系.这些研究中分析的细胞系包括NCI-H322M(来自NCI的人类非小细胞肺癌细胞系)、NCI-MCF-7(来自NCI的人类乳腺癌细胞系)和A431(来自ATCC的人类上皮癌
细胞系)。在分析前通过传代24小时常规培养细胞到80％汇合。所有细胞系生长在含有
RPMI-1640(Gibco #11875)和10％胎牛血清(Irvine Scientific Inc)的完全生长培养基。
常规培养细胞系不超过20代。
细胞系)。在分析前通过传代24小时常规培养细胞到80％汇合。所有细胞系生长在含有
RPMI-1640(Gibco #11875)和10％胎牛血清(Irvine Scientific Inc)的完全生长培养基。
常规培养细胞系不超过20代。
[1013] 抗体对人类癌细胞的结合的流式细胞术分析.用细胞解离缓冲液(Gibco目录号6 5
13151-014)浮起细胞，计数，洗涤并调整到5×10 细胞/ml。将细胞(2.5×10 ；50uL)加到
96-孔圆底板(Costar #3799)的每个孔。以起始浓度300nM检验纯化的抗体，在FACS缓
冲液中连续半-log稀释。整个测定中使用的FACS缓冲液是含有5％FBS的PBS(无Ca++/
Mg++)。在冰上孵育样品30分钟，用200uL FACS缓冲液洗涤3×，在4℃在1200rpm离心3
分钟。C2B8(利妥昔单抗，IgG1)用作阴性对照。吸出上清液，加入100μl PE-轭合的、亲
和纯化的F(ab’)2片段-特异性山羊抗人类-IgG第二检测抗体(JacksonImmunoResearch
Lab，目录#109-116-097；以1∶200稀释使用)或PE-轭合的亲和纯化的Fc-特异性小鼠
6
抗人类-IgG第二检测抗体(LeincoTechnologies目录#1-127；以5uL/1×10 细胞稀释使
用)FACS缓冲液中每个相应的孔。在冰上避光孵育样品另外的30分钟。如上述地洗涤细
胞，重悬在含有碘化丙锭(PI)的100μl FACS缓冲液中以排除死细胞(BD Pharmingen，目
录#51-66211E或556463；以在FACS缓冲液中最终1∶500使用)。使用FACSArray流式
细胞计(BectonDickinson)三份地运行样品，每种样品收集5000个活事件。数据分析使用
GraphPad Prism版本5.0软件(GraphPad Software Inc.，11452El Camino Real #215，San Diego，CA 92130)进行。
13151-014)浮起细胞，计数，洗涤并调整到5×10 细胞/ml。将细胞(2.5×10 ；50uL)加到
96-孔圆底板(Costar #3799)的每个孔。以起始浓度300nM检验纯化的抗体，在FACS缓
冲液中连续半-log稀释。整个测定中使用的FACS缓冲液是含有5％FBS的PBS(无Ca++/
Mg++)。在冰上孵育样品30分钟，用200uL FACS缓冲液洗涤3×，在4℃在1200rpm离心3
分钟。C2B8(利妥昔单抗，IgG1)用作阴性对照。吸出上清液，加入100μl PE-轭合的、亲
和纯化的F(ab’)2片段-特异性山羊抗人类-IgG第二检测抗体(JacksonImmunoResearch
Lab，目录#109-116-097；以1∶200稀释使用)或PE-轭合的亲和纯化的Fc-特异性小鼠
6
抗人类-IgG第二检测抗体(LeincoTechnologies目录#1-127；以5uL/1×10 细胞稀释使
用)FACS缓冲液中每个相应的孔。在冰上避光孵育样品另外的30分钟。如上述地洗涤细
胞，重悬在含有碘化丙锭(PI)的100μl FACS缓冲液中以排除死细胞(BD Pharmingen，目
录#51-66211E或556463；以在FACS缓冲液中最终1∶500使用)。使用FACSArray流式
细胞计(BectonDickinson)三份地运行样品，每种样品收集5000个活事件。数据分析使用
GraphPad Prism版本5.0软件(GraphPad Software Inc.，11452El Camino Real #215，San Diego，CA 92130)进行。
[1014] 结果.分析抗IGF-1R双特异性抗体(C-末端和N-末端形式)和相关单克隆抗体对人类癌细胞系的结合通过流式细胞术进行。C06和G11单克隆抗体两者表明显著的、剂
量依赖性地结合于非小细胞肺癌细胞系H322M(图55)，在小于1nM观察到对两种抗体的半
2 2
最大结合(图55A：C06 EC50 0.20nM、R 0.98；G11 EC50 0.44nM、R 0.99；图55B：C06 EC50
2 2
0.25nM、R 0.97；G11 EC50 0.72nM、R 0.75)。N-末端双特异性抗体G11-C06scFv(N-term)在这些测定中表现的细胞-结合特征与单种C06和G11单克隆抗体两者相似(图55A：
2 2
G11-C06scFv(N-term)EC50 0.47nM、R 0.97；图55B：G11-C06scFv(N-term)EC50 0.48nM、R
0.96)。然而，C-末端双特异性抗体G11-C06scFv(C-term)不仅与单种单克隆抗体C06和
G11相比，而且与N-末端双特异性抗体相比表明显著更大的总结合。在MCF-7人类乳腺癌
细胞系以及A431人类非小细胞肺癌细胞系的分析中获得相似结果(数据未显示)。
量依赖性地结合于非小细胞肺癌细胞系H322M(图55)，在小于1nM观察到对两种抗体的半
2 2
最大结合(图55A：C06 EC50 0.20nM、R 0.98；G11 EC50 0.44nM、R 0.99；图55B：C06 EC50
2 2
0.25nM、R 0.97；G11 EC50 0.72nM、R 0.75)。N-末端双特异性抗体G11-C06scFv(N-term)在这些测定中表现的细胞-结合特征与单种C06和G11单克隆抗体两者相似(图55A：
2 2
G11-C06scFv(N-term)EC50 0.47nM、R 0.97；图55B：G11-C06scFv(N-term)EC50 0.48nM、R
0.96)。然而，C-末端双特异性抗体G11-C06scFv(C-term)不仅与单种单克隆抗体C06和
G11相比，而且与N-末端双特异性抗体相比表明显著更大的总结合。在MCF-7人类乳腺癌
细胞系以及A431人类非小细胞肺癌细胞系的分析中获得相似结果(数据未显示)。
[1015] 评价单克隆和双特异性抗体的结合使用针对人类Fab或人类Fcγ的独立的第二试剂(分别是图55A和55B)进行以排除观察到的结合可能反映第二试剂结合单克隆和结
合双特异性抗体的能力差异，或第二试剂结合不同双特异性抗体形式(如，N-末端与C-末
端融合)的能力差异的可能性。使用两种第二试剂，对C-末端双特异性抗体不仅与相应的
单克隆抗体相比，而且与N-末端双特异性抗体相比观察到增强的结合。这些结果因此支持
结论：观察到的结合差异反映抗体对肿瘤细胞结合的差异，而不是第二抗体试剂对第一单
克隆和双特异性抗体的结合差异。
合双特异性抗体的能力差异，或第二试剂结合不同双特异性抗体形式(如，N-末端与C-末
端融合)的能力差异的可能性。使用两种第二试剂，对C-末端双特异性抗体不仅与相应的
单克隆抗体相比，而且与N-末端双特异性抗体相比观察到增强的结合。这些结果因此支持
结论：观察到的结合差异反映抗体对肿瘤细胞结合的差异，而不是第二抗体试剂对第一单
克隆和双特异性抗体的结合差异。
[1016] 这些结果证明，G11-C06scFv(C-term)双特异性抗体以不同于双特异性抗体所衍生自的任何一种单克隆抗体的结合方式结合于人类癌细胞。此外，C-末端双特异性抗体与
N-末端双特异性抗体相比结合特征的差异进一步说明，双特异性抗体的特定构象影响对人
类癌细胞的结合。
N-末端双特异性抗体相比结合特征的差异进一步说明，双特异性抗体的特定构象影响对人
类癌细胞的结合。
[1017] 实施例11.IGF-1R双特异性抗体在小鼠的体内活性
[1018] a.药理动力学
[1019] 进行单剂量药理动力学(PK)研究来评价双特异性Ab在不带有肿瘤的小鼠中的稳定性，以帮助用于异种移植模型中效力研究的剂量给药选择。对CB17 SCID雌性小鼠给
药7.4mg/kg G11、10mg/kgC06、N-或C-IGF-1R双特异性抗体。在给药后不同时间点，处死
小鼠，由心脏穿刺收集血液，分离以回收血清。待实验的时间点包括给药前；给药后0.25、
0.5、1、2、6和24小时和2、4、7、9、11和14天。在收集时冷冻血清样品，之后由ELISA测试抗体的存在。简要地说，将ELISA板(Terma Electron Corp.，目录号3455)用山羊抗人类
IgG(Southern Biotech，目录号2040-01)在4℃包被过夜，随后用PBS中1％脱脂牛奶和
0.05％Tween 20在室温阻断1小时。将样品血清的连续稀释液加到包被的板并孵育1小
时，随后用检测抗体山羊抗人类κ-HRP(Southern Biotech目录号2060-05)在室温另外孵
育1小时。包括在1∶25正常小鼠血清(Chemicon，目录号S-25)中连续稀释的已知浓度
的对照抗体以产生标准曲线。孵育之间进行洗涤。通过加入TMB底物(3.3’，5.5’-四甲联苯胺，KIRKEGAARD &PERRY LABS，目录号50-76-00)而将板显色，用H2SO4终止反应。使用微板读板器(SpectraMax M2，Molecular Devices)测量每孔在450nm的OD(光密度)。使用
SoftMax Pro分析数据，从标准曲线确定小鼠血清中人类抗体的浓度。图56显示单次给药
后经14天时段，小鼠血清中G11、C06、C-IGF-1R双特异性(图56A)和N-IGF-1R双特异性
(图56B)的浓度。数据表示，N-和C-IGF-1R BsAb分子两者在体内都相当稳定，清除率与
G11和C06相似。基于WinNonlinPK分析，C06、G11、C-IGF-1R双特异性抗体和N-IGF-1R双
特异性抗体的半衰期(T1/2)分别是大约18.8、10.6、11和7.5天。长的半衰期说明，IGF-1R双特异性抗体具备适于癌症治疗的体内效力研究和可能的治疗应用的IgG-样药物动力学
特征，具有与单克隆抗体相似的给药方案。
药7.4mg/kg G11、10mg/kgC06、N-或C-IGF-1R双特异性抗体。在给药后不同时间点，处死
小鼠，由心脏穿刺收集血液，分离以回收血清。待实验的时间点包括给药前；给药后0.25、
0.5、1、2、6和24小时和2、4、7、9、11和14天。在收集时冷冻血清样品，之后由ELISA测试抗体的存在。简要地说，将ELISA板(Terma Electron Corp.，目录号3455)用山羊抗人类
IgG(Southern Biotech，目录号2040-01)在4℃包被过夜，随后用PBS中1％脱脂牛奶和
0.05％Tween 20在室温阻断1小时。将样品血清的连续稀释液加到包被的板并孵育1小
时，随后用检测抗体山羊抗人类κ-HRP(Southern Biotech目录号2060-05)在室温另外孵
育1小时。包括在1∶25正常小鼠血清(Chemicon，目录号S-25)中连续稀释的已知浓度
的对照抗体以产生标准曲线。孵育之间进行洗涤。通过加入TMB底物(3.3’，5.5’-四甲联苯胺，KIRKEGAARD &PERRY LABS，目录号50-76-00)而将板显色，用H2SO4终止反应。使用微板读板器(SpectraMax M2，Molecular Devices)测量每孔在450nm的OD(光密度)。使用
SoftMax Pro分析数据，从标准曲线确定小鼠血清中人类抗体的浓度。图56显示单次给药
后经14天时段，小鼠血清中G11、C06、C-IGF-1R双特异性(图56A)和N-IGF-1R双特异性
(图56B)的浓度。数据表示，N-和C-IGF-1R BsAb分子两者在体内都相当稳定，清除率与
G11和C06相似。基于WinNonlinPK分析，C06、G11、C-IGF-1R双特异性抗体和N-IGF-1R双
特异性抗体的半衰期(T1/2)分别是大约18.8、10.6、11和7.5天。长的半衰期说明，IGF-1R双特异性抗体具备适于癌症治疗的体内效力研究和可能的治疗应用的IgG-样药物动力学
特征，具有与单克隆抗体相似的给药方案。
[1020] b.结合活性的保持
[1021] 许多研究报道了使用一个或多个scFv部分作为抗原识别结构域来产生IgG-样BsAb(Qu，Blood，111：2211-2219(2008)；Lu，J.Biol.Chem.280：19665-19672(2006))。这些研究中，显示BsAb材料失去对靶的活性或在体内不再现使用体外肿瘤细胞增殖/活性测定
时观察到的分子的活性。我们在这里测试了在小鼠IP注射后经一周的过程，包含融合到稳
定化的C06 scFv的G11 IgG1骨架的抗IGF-1RBsAb结合到C06和G11表位两者的能力。
时观察到的分子的活性。我们在这里测试了在小鼠IP注射后经一周的过程，包含融合到稳
定化的C06 scFv的G11 IgG1骨架的抗IGF-1RBsAb结合到C06和G11表位两者的能力。
[1022] i.方法
[1023] 使用表面等离子体共振，平衡BsAb(血清中)对IGF-1R多个表位的结合。所有实验在Biacore3000设备(Biacore)上进行。使用制造商提供的标准胺化学实验方案，
将C06和G11 MAb分别固定到标准CM5芯片表面的两种不同流动细胞表面。在这种高固
定水平的MAb，sIGF-1R(1-903)的流动低浓度(＜50nM)导致质量转移有限的线性结合
曲线，其初始结合速率Vi(RU/s)线性地依赖于流经芯片表面的sIGF-1R(1-903)溶液的浓
度。sIGF-1R(1-903)与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体之间结合的化学计量通过将
sIGF-1R(1-903)和BsAb(从血清连续稀释)的混合物流经感应芯片表面来确定，所述感应
芯片表面包含C06 MAb、G11 MAb或空白表面，其使用标准NHC/EDC固定化学活化后被乙醇
胺阻断。C06和G11感应芯片表面测量包含sIGF-1R(1-903)和BsAb的溶液中未结合的
sIGF-1R(1-903)的浓度。BsAb与每个sIGF-1R(1-903)表位之间的结合化学计量n从未结
合的sIGF-1R(1-903)的浓度使用以下等式确定：
将C06和G11 MAb分别固定到标准CM5芯片表面的两种不同流动细胞表面。在这种高固
定水平的MAb，sIGF-1R(1-903)的流动低浓度(＜50nM)导致质量转移有限的线性结合
曲线，其初始结合速率Vi(RU/s)线性地依赖于流经芯片表面的sIGF-1R(1-903)溶液的浓
度。sIGF-1R(1-903)与N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体之间结合的化学计量通过将
sIGF-1R(1-903)和BsAb(从血清连续稀释)的混合物流经感应芯片表面来确定，所述感应
芯片表面包含C06 MAb、G11 MAb或空白表面，其使用标准NHC/EDC固定化学活化后被乙醇
胺阻断。C06和G11感应芯片表面测量包含sIGF-1R(1-903)和BsAb的溶液中未结合的
sIGF-1R(1-903)的浓度。BsAb与每个sIGF-1R(1-903)表位之间的结合化学计量n从未结
合的sIGF-1R(1-903)的浓度使用以下等式确定：
[1024]
[1025] 其中Vi＝初始结合速率，m＝sIGF-1R(1-903)浓度-依赖性标准曲线的斜率，[IGF-1R]f＝未结合的IGF-1R浓度＝Vi/m，[IGF-1R]t＝IGF-1总浓度且[BsAb]t＝BsAb
总浓度(Day 2005)。BsAb母液浓度(血清中)由ELISA如在BsAb PK实施例中所述的确
定。
总浓度(Day 2005)。BsAb母液浓度(血清中)由ELISA如在BsAb PK实施例中所述的确
定。
[1026] ii.结果
[1027] 注射10mg/kg每种BsAb 1、6、24和168hr后从小鼠收集的血清中，完整/活性C-和N-末端IGF-1R双特异性抗体的量使用溶液Biacore测量来评价。BsAb的活性测量
为其以完全容量结合G11和C06表位两者的能力。掺有sIGF-1R(1-903)(30nM自用胞外结
构域试剂)的每种血清样品用30nM sIGF-1R(1-903)的溶液连续稀释。在C06和G11固定
化感应芯片上运行样品以检测BsAb阻断sIGF-1R(1-903)结合到感应芯片表面的能力的能
力。在PK研究2周时段的时间点不测量活性，因为预料血清水平下降到低于使用我们的
Biacore方法能够准确确定结合活性/化学计量的水平。
为其以完全容量结合G11和C06表位两者的能力。掺有sIGF-1R(1-903)(30nM自用胞外结
构域试剂)的每种血清样品用30nM sIGF-1R(1-903)的溶液连续稀释。在C06和G11固定
化感应芯片上运行样品以检测BsAb阻断sIGF-1R(1-903)结合到感应芯片表面的能力的能
力。在PK研究2周时段的时间点不测量活性，因为预料血清水平下降到低于使用我们的
Biacore方法能够准确确定结合活性/化学计量的水平。
[1028] C-和N-末端IGF-1R双特异性抗体两者表现为在血清中被循环经过1周过程后保持完全的活性。如图57所示，C-和N-term.IGF-1R双特异性抗体两者表明在所有时间点
的相似抑制曲线-与此前研究纯化的双特异性抗体对IGF-1R的化学计量和亲和力的实施
例中测量的曲线相似。曲线斜率在实验误差内是相似的，没有观察到趋向产物降解的趋势
(表26)。C-末端BsAb表现为完全活性的(即，能够在较低浓度抑制sIGF-1R(1-903)-这
一浓度说明C-term.四价分子的所有4个结合位点是活性的，表26)。N-末端BsAb未表明
1∶1化学计量(即，n＝1.0)，但相反针对C06和G11表面分别具有n＝1.3和1.6(表
26)。有趣的是，这一结果是此前实施例中对纯化的蛋白观察到的结果的再现，说明即使纯化的N-term.IGF-1R双特异性抗体不完全能够衔接其所有结合位点。因此，基于纯化的蛋
白的活性，经研究的时间过程，N-末端BsAb分子没有表现可检测的体内活性损失。总之，
包含稳定化的C06 scFv的N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体表现为在血清中1周后保持
小鼠中的完全活性。
的相似抑制曲线-与此前研究纯化的双特异性抗体对IGF-1R的化学计量和亲和力的实施
例中测量的曲线相似。曲线斜率在实验误差内是相似的，没有观察到趋向产物降解的趋势
(表26)。C-末端BsAb表现为完全活性的(即，能够在较低浓度抑制sIGF-1R(1-903)-这
一浓度说明C-term.四价分子的所有4个结合位点是活性的，表26)。N-末端BsAb未表明
1∶1化学计量(即，n＝1.0)，但相反针对C06和G11表面分别具有n＝1.3和1.6(表
26)。有趣的是，这一结果是此前实施例中对纯化的蛋白观察到的结果的再现，说明即使纯化的N-term.IGF-1R双特异性抗体不完全能够衔接其所有结合位点。因此，基于纯化的蛋
白的活性，经研究的时间过程，N-末端BsAb分子没有表现可检测的体内活性损失。总之，
包含稳定化的C06 scFv的N-和C-末端IGF-1R双特异性抗体表现为在血清中1周后保持
小鼠中的完全活性。
[1029] 表26.IGF-1R双特异性抗体结合到C06或G11表位的平衡(溶液相)化学计量测量值。
[1030]构建体(在血清中 n(C06表面， n(G11表面，
的时间) sIGF-1R/BsAb) sIGF-1R/BsAb)
C-term. IGF-1R
BsAb
1hr 0.8±0.2 1.3±0.5
6hr 1.3±0.2 1.4±0.4
24hr 1.1±0.2 1.3±0.4
7天 1.1±0.2 1.3±0.4
平均化学计量 1.1±0.1 1.3±0.1
N-term. IGF-1R
BsAb
1hr 1.4±0.2 1.7±0.7
6hr 1.3±0.2 1.6±0.6
24hr 1.0±0.3 1.4±0.4
7天 1.4±0.2 1.5±0.6
平均化学计量 1.3±0.1 1.6±0.1
的时间) sIGF-1R/BsAb) sIGF-1R/BsAb)
C-term. IGF-1R
BsAb
1hr 0.8±0.2 1.3±0.5
6hr 1.3±0.2 1.4±0.4
24hr 1.1±0.2 1.3±0.4
7天 1.1±0.2 1.3±0.4
平均化学计量 1.1±0.1 1.3±0.1
N-term. IGF-1R
BsAb
1hr 1.4±0.2 1.7±0.7
6hr 1.3±0.2 1.6±0.6
24hr 1.0±0.3 1.4±0.4
7天 1.4±0.2 1.5±0.6
平均化学计量 1.3±0.1 1.6±0.1
[1031]
[1032] 实施例12.使用双特异性IGF-1R双特异性抗体治疗人类癌症
[1033] 本实施例描述了治疗癌症的方法，使用双特异性抗IGF-1R抗体(还称为IGF-1R^2)来靶向上皮和非上皮(如，肉瘤、淋巴瘤)恶性细胞，例如其中在mRNA或蛋白水
平可检测IGF-1R表达的过度增殖性病症。
平可检测IGF-1R表达的过度增殖性病症。
[1034] 用两种抗IGF1-1R抗体C06和G11的混合物治疗带有肿瘤的小鼠与仅C06或G11相比显示增强的抗肿瘤活性。基于该观察结果和体外证实的增强的生物活性，预料在该实
施方案中描述的抗IGF-1R双特异性抗体(N-和C-形式)将证实在多种上皮、非上皮(如，
肉瘤)和血液恶性肿瘤(如，淋巴瘤、多发性骨髓瘤)中与包括C06和G11的任何单种抗
IGF-1R抗体相比更大的抗肿瘤活性。
施方案中描述的抗IGF-1R双特异性抗体(N-和C-形式)将证实在多种上皮、非上皮(如，
肉瘤)和血液恶性肿瘤(如，淋巴瘤、多发性骨髓瘤)中与包括C06和G11的任何单种抗
IGF-1R抗体相比更大的抗肿瘤活性。
[1035] 预料IGF-1R双特异性抗体在IGF-1R途径敏感肿瘤中的抗肿瘤活性增强，所述肿瘤包括依赖于肿瘤生长和存活的IGF-2/IGF-1R自分泌中枢的肿瘤。IGF-1R途径敏感肿瘤
的实例是乳腺癌、非小细胞肺癌(腺癌和非腺癌)、小细胞肺癌、前列腺癌、结肠癌、头颈癌(鳞状)、肝细胞癌、胰腺癌、肠癌和胃癌、肾细胞癌、Wilm氏肿瘤、膀胱癌、黑素瘤、肾上腺皮质癌、多形性成胶质细胞瘤、肉瘤(超过70种不同类型，包括Ewing氏肉瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、颅咽管瘤)、胃肠道间质瘤(GIST)、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(B和T细胞)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和
其它白血病(B和T细胞)和霍奇金病。还预料，双特异性IGF-1R双特异性抗体将不仅在
已知对单种抗IGF-1R抗体高度响应性的肿瘤亚型而且在对单克隆IGF-1R抗体治疗略微响
应或较不响应的肿瘤类型中表明更大的抗肿瘤活性。双特异性IGF-1R双特异性抗体在大
量肿瘤有效抑制Akt存活途径的能力表示，本实施例中描述的IGF-1R双特异性抗体是强效
Akt抑制物，可能成为治疗癌症中比其它Akt拮抗模式优选的拮抗。
的实例是乳腺癌、非小细胞肺癌(腺癌和非腺癌)、小细胞肺癌、前列腺癌、结肠癌、头颈癌(鳞状)、肝细胞癌、胰腺癌、肠癌和胃癌、肾细胞癌、Wilm氏肿瘤、膀胱癌、黑素瘤、肾上腺皮质癌、多形性成胶质细胞瘤、肉瘤(超过70种不同类型，包括Ewing氏肉瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、颅咽管瘤)、胃肠道间质瘤(GIST)、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(B和T细胞)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和
其它白血病(B和T细胞)和霍奇金病。还预料，双特异性IGF-1R双特异性抗体将不仅在
已知对单种抗IGF-1R抗体高度响应性的肿瘤亚型而且在对单克隆IGF-1R抗体治疗略微响
应或较不响应的肿瘤类型中表明更大的抗肿瘤活性。双特异性IGF-1R双特异性抗体在大
量肿瘤有效抑制Akt存活途径的能力表示，本实施例中描述的IGF-1R双特异性抗体是强效
Akt抑制物，可能成为治疗癌症中比其它Akt拮抗模式优选的拮抗。
[1036] 在某些实施方案中，双特异性IGF-1R双特异性抗体(-C和-N末端)是纯化的，并与适合注射的药物赋形剂配制。对患有过度增殖性病症的人类患者由静脉输注提供在1mg/
kg体重到约100kg/mg体重的范围的多剂量的双特异性IGF-1R双特异性。每周一次或每2、
3或4周一次进行给药直到观察到疾病进展的临床迹象或死亡。给药间隔可根据治疗过程
中测量的预后指标而变化。抗体可在每种适应症的标准疗法(化疗、放疗、其它靶向疗法、手术切除)之前、同时或之后施用。通过评价以下参数的一个或多个来监控患者以确定治
疗是否导致抗肿瘤响应：CT扫描测量的肿瘤消退/新损伤(肿瘤)发生的减少、FDG-PET扫
描测量的对葡萄糖摄取(代谢响应)的作用、和对用于评价疾病预后的预后生物标志物的
调节。
kg体重到约100kg/mg体重的范围的多剂量的双特异性IGF-1R双特异性。每周一次或每2、
3或4周一次进行给药直到观察到疾病进展的临床迹象或死亡。给药间隔可根据治疗过程
中测量的预后指标而变化。抗体可在每种适应症的标准疗法(化疗、放疗、其它靶向疗法、手术切除)之前、同时或之后施用。通过评价以下参数的一个或多个来监控患者以确定治
疗是否导致抗肿瘤响应：CT扫描测量的肿瘤消退/新损伤(肿瘤)发生的减少、FDG-PET扫
描测量的对葡萄糖摄取(代谢响应)的作用、和对用于评价疾病预后的预后生物标志物的
调节。
[1037] 等同替代
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