本发明涉及通过使淀粉状肽与特异性识别淀粉状肽的酶起反应并通过 降解或修饰使其灭活来预防淀粉状蛋白斑形成和/或生长的方法。本发明进一 步涉及通过施用具有改良的催化活性和/或选择性的经过优化的淀粉状肽降 解酶来治疗阿耳茨海默氏病的方法。本发明还涉及医学治疗领域，特别是神 经变性疾病领域，并提供了在患有神经变性疾病、特别是阿耳茨海默氏病的 患者中引发脑淀粉状蛋白清除机制的方法。此外，本发明涉及有效引发此类 机制的蛋白质和肽的用途。
本发明描述了如何通过附着调控血浆稳定性和半衰期的分子使Aβ肽降 解分子成为治疗相关药剂。本发明中所描述的Aβ肽降解分子所具有的血浆半 衰期都短得不足以作为有效治疗剂。然而，通过将这些降解分子与本发明中 所描述的和所例示的调控分子组合，生成了可用于通过施用这些经过优化的 淀粉状肽-降解酶融合蛋白来有效治疗阿耳茨海默氏病的功能剂。
神经变性疾病，特别是阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease，AD)，严重 削弱患者的生命力。另外，这些疾病造成了巨大的健康、社会和经济负担。 AD是最常见的年龄相关神经变性疾患，影响65岁以上人群的大约10％和85 岁以上人群的高达45％(Vickers et al.，Progress in Neurobiology 2000，60： 139-165)。目前，这一数量在美国、欧洲和日本估计为1200万例。这一情况 必然将随着发达国家老龄人口的增长而恶化。AD患者脑中发生的神经病理 学特点有老年斑和意义深刻的细胞骨架变化，这与异常丝状结构的出现和神 经原纤维缠结的形成一致。家族病例和散发病例都有胞外原纤维β-淀粉状蛋 白(fibrillary β-amyloid)在脑中的沉积，而且认为这一共同病理学特点与神经 元功能损害和神经元损失有关(Younkin S.G.，Ann.Neurol.37：287-288，1995； Selkoe D.J.，Nature 399：A23-A31，1999；Borchelt D.R.et al.，Neuron 17： 1005-1013，1996)。β-淀粉状蛋白沉积物由数种淀粉状蛋白-β肽(Aβ)构成；尤 其是Aβ42在淀粉状蛋白斑中日益沉积。AD是一种进行性疾病，与记忆形成 的早期缺陷有关且最终造成高级认知功能的完全侵蚀。AD发病机理的特征 性特点是选择性攻击特定脑区和神经细胞子群使其进入变性过程。具体而 言，颞叶区和海马早期受到影响，而且在疾病进展期间更加严重。另一方面， 额皮质、枕叶皮质和小脑内的神经元大多保持完整且免于神经变性(Terry et al.，Annals ofNeurology 1981，10：184-192)。
遗传证据表明在许多(若非全部的话)引起家族性AD的遗传疾患中所 生成的Aβ42的量增加(Borchelt D.R.et al.，Neuron 17：1005-1013，1996；Duff K.et al.，Nature 383：710-713，1996；Scheuner D.et al.，Nat.Med.2：864-870， 1996；Citron M.et al.，Neurobiol.Dis.5：107-116，1998)，这指向了淀粉状蛋白 形成可能由Aβ42的生成增加或降解减少或二者兼有引起的可能性(Glabe，C.， Nat.Med.6：133-134，2000)。尽管因APP、早老素-1和早老素-2基因的遗传缺 陷引起的早期发作AD的例子很少，流行形式的晚期发作散发性AD的病因至 今未知。然而，已经鉴定出数个风险因子使人们趋向于发生AD，其中最主 要的是载脂蛋白E(ApoE)的ε4(epsilon4)等位基因和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C)的B等位基因。神经变性病症的晚期发作和复杂发病机理给治疗 剂的开发造成了艰难的挑战。
目前，尚不能治愈AD，甚至也没有以高概率诊断临死前(ante-mortem) AD的方法。然而，β-淀粉状蛋白已经成为设计用于减少其形成(Vassar，R.et al.， Science 286：735-41，1999)或用于激活加速其从脑中清除的机制的药物开发 的主要靶物。
然而，Schenk等人(Nature，400：173-177，1999；Arch.Neurol.，57：934-936， 2000)的第一份实验结果提出了新的可能的AD治疗策略。过表达突变型人 APP(其中第717位氨基酸是苯丙氨酸，而不是正常的缬氨酸)的PDAPP转 基因小鼠以年龄依赖性和脑区依赖性方式逐渐发生AD的许多神经病理学特 点。在AD型神经病理学发作前(6周龄时)或在淀粉状蛋白-β沉积和数项后 续神经病理学变化已经完全确立的晚些时候(11月龄)，用Aβ42免疫转基因 动物。对年轻动物的免疫接种基本上防止了β-淀粉状蛋白斑形成、神经炎性 营养不良(neuritic dystrophy)和星形神经胶质增生(astrogliosis)的发生。对老年 动物的处理也显著降低了这些AD样神经病理学的程度和进展。显示了Aβ42 免疫接种导致抗Aβ抗体的生成，而且剩余斑区中出现Aβ免疫反应性单核细 胞/小神经胶质细胞(microglial cell)。然而，主动免疫方法在人类受试者可引 发严重的副作用和迄今未知的并发症。
Bard等人(Nature Medicine，6(8)：916-919，2000)报告了外周施用针对淀 粉状蛋白β肽的抗体足以降低淀粉状蛋白负荷。尽管它们有相对适度的血清 水平，被动施用的抗体能够穿过血脑屏障并进入中枢神经系统，改造(decorate) 斑并诱导已有淀粉状蛋白的清除。然而，甚至是针对β肽的被动免疫在人类 患者中也可引起不良副作用。
本发明致力于使用重组蛋白来治疗阿耳茨海默氏病患者。Aβ肽代谢的合 成途径与分解途径之间的平衡是精密的。尽管相当多的努力聚焦于Aβ肽的生 成，直到最近才对这些肽的清除有了不怎么多的关注。胞外Aβ肽的清除似乎 以两种一般机制进行：细胞内在化和胞外降解。本发明描述了将补充淀粉状 蛋白β肽天然分解过程的新方法。
DeMattos(PNAS 98：8850-8855，2001)提出了槽假说(sink hypothesis)，即 可通过降低肽在血浆中的浓度间接从CNS中清除Aβ肽。他们使用抗体与血浆 中的Aβ肽结合，由此从CNS中捕捉出Aβ。这能够实现是因为由于降低了血 浆中游离Aβ的浓度，抗体改变了血浆与CNS之间的平衡和/或阻止了Aβ从血 浆到CNS的流动。抗体以外的淀粉状蛋白结合剂也显示出通过血浆中的结合 有效从CNS中清除淀粉状蛋白β肽。Matsuoka等人(J.Neuroscience，23：29-3 3， 2003)呈现了使用两种淀粉状蛋白β肽结合剂，凝溶胶蛋白(gelsolin)和GM1， 来捕捉血浆Aβ并由此减轻或防止脑淀粉样变得到的数据。
清除或消除Aβ肽的另一种方法是使用降解酶将淀粉状蛋白β肽降解成没 有毒物学效应或毒物学效应更低且更加倾向于清除的更小片段。Aβ肽的这种 酶促消化也可以通过槽假说机制来运作，即降低淀粉状蛋白β肽在血浆中的 浓度。然而，也有可能直接清除CNS和/或CSF中的淀粉状蛋白β肽。这种方 法不仅将降低游离Aβ的浓度，而且还直接清除环境中的全长肽。这种方法的 优点在于它不会提高Aβ在血浆中的总(游离的和结合的)浓度，而使用淀粉 状蛋白β肽结合剂诸如抗体的情况中会看到这种情况。文献中描述了在数个 位点降解Aβ肽的酶，例如中性溶酶(Leissring et al.，JBC.278：37314-37320， 2003)。Aβ肽在多个位点的降解将生成易于从血流中清除掉的小片段。
附图简述
图1显示了本发明中所描述的融合蛋白的整体结构的示意图，该融合蛋 白具有酶活性或催化活性淀粉状蛋白β肽降解构件和半衰期调控构件，后者 主要调控融合蛋白在血浆中的半衰期，而且还改变融合蛋白的稳定性。这两 个不同构件之间的接头是任选的，可以设计成使前两个构件处于最佳几何位 置，或者仅仅是以柔性方式共价或非共价地使前两个构件相连接。如此，前 两个构件之间的直接连接也是一种选择，因为它们可以彼此直接相连。直接 连接/联结意味着淀粉状蛋白β肽降解构件与半衰期调控构件连为一体。
图2显示了体外实验，其描述了通过降解一个区室中的游离形式的淀粉 状蛋白β肽有可能降低另一个区室中的淀粉状蛋白β肽的方法，所述两个区室 以容许淀粉状蛋白β肽在两个区室间自由转移的膜分隔。所述两个区室可以 是血浆和CNS，而膜代表了血脑屏障(BBB)。
图3显示了淀粉状蛋白β肽在游离形式、斑形成、BBB穿越、结合和降解 之间的分配。重要的是，血浆中淀粉状蛋白β肽的降解降低了CNS中游离形 式的淀粉状蛋白β肽，由此阻止了淀粉状蛋白斑的形成。在使用结合剂时产 生了相似的效果。
图4显示了淀粉状蛋白β肽的结合与降解之间的主要差异。在使用结合法 时，有可能增加血浆中的淀粉状蛋白β肽，这可以对外周系统产生不良影响。 这种结合还与淀粉状蛋白β肽的分解代谢的天然过程产生竞争。另一方面， 本发明所描述的融合蛋白将直接降解血浆中的淀粉状蛋白β肽，而且这种降 解将补充淀粉状蛋白β肽的分解代谢的天然过程。
图5显示了人淀粉状蛋白βA4蛋白[前体]的氨基酸序列。淀粉状蛋白β肽 对应于该序列中的氨基酸672-714(氨基酸1-43)，DAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIAT。淀粉状蛋白β肽的主 要形式还包括这种肽的任何缩短形式，尤其是1-38、1-40和1-42但不限于这 些形式。
图6显示了文献中已经提出和描述的淀粉状蛋白β肽中的切割位点。中性 溶酶(NEP)切割位点以字母C标示。淀粉状蛋白β肽中有13个中性溶酶潜在切 割位点。经过纯化的中性溶酶据报导在体外在五个位点处切割淀粉状蛋白β 肽(Howell et al.，1995)，对Aβ1-42的Km为2.8mM(Takaki et al.，2000).
图7显示了为延长分子在血浆中的血浆半衰期而进行的常用修饰的一些 可能性。抗体的Fc部分、PEG化和糖基化是最常用的三种方法，但本发明不 限于这些方法。
图8显示了IgG抗体的整体结构。轻链(VL和HL)与重链(VH、CH1、CH2 和CH3)经由二硫键(-S-S-)相连。Fc区由CH2和CH3结构域构成。IgG抗体是 可用于在本发明中调控融合蛋白血浆半衰期的一类抗体的例子，但也可使用 其它类型的抗体。
图9显示了IgG类可分成四个亚类(γ1、γ2、γ3、γ4)。这些亚类的Fc区 具有不同活性，例如补体激活。另外，各种免疫球蛋白分出五个类别(IgG、 IgM、IgA、IgE、IgD)。
图10显示了血浆半衰期和浓度如何因所设计的蛋白质而变化的示意图。 经PEG化修饰的蛋白质与未经修饰的蛋白质(例如重组蛋白)相比具有更长 的半衰期。该示例还显示了使用Fc部分(Fc融合物)作为调控物延长了血浆 半衰期。在有些情况中，可以通过PEG化来实现血浆半衰期的延长，与在Fc 融合蛋白的情况中所看到的相同。也可以通过糖基化来延长血浆半衰期。这 些各式各样的技术或方法是本领域众所周知的。
图11显示了中性溶酶的结构，其由小胞内部分、跨膜区和胞外区构成。 优选将胞外区(氨基酸52-749)用作淀粉状蛋白β肽降解构件，将其与调控 构件相连。胞外区的确切氨基酸序列可有所变化，而且可包含进入跨膜区的 额外的氨基酸和C端区的额外的氨基酸。
图12显示了融合蛋白的一个例子，其中淀粉状蛋白β肽降解酶是中性溶 酶而血浆半衰期调控物是Fc构件。中性溶酶的胞外部分与Fc区的N末端直接 相连，这意味着中性溶酶的C末端与Fc构件相连。可以表达并纯化此融合蛋 白，并应用于治疗。
图13显示了将淀粉状蛋白β肽降解构件与淀粉状蛋白β结合构件与血浆 半衰期调控构件连为一体的不同可能性。
图14显示了双功能融合蛋白的一个例子，其中淀粉状蛋白β肽降解构件 是中性溶酶，淀粉状蛋白β肽结合构件是Fab片段，而血浆半衰期调控构件是 Fc部分。
图15显示了构建编码中性溶酶胞外结构域与IgG4 Fc结构域(包含IgG4 的铰链区)间融合物的基因的策略。通过交叠PCR来融合中性溶酶与IgG4Fc。 将该基因导入pGEM克隆载体并对DNA测序。
图16显示了导入编码信号肽的基因的策略。使用平端限制酶来融合中性 溶酶的5’末端与信号序列的3’末端。完整片段包含Gateway序列，将其转移至 Gateway供体质粒以便于再克隆至任何表达载体。
图17显示了5升生物反应器中的酶活性(如实施例11所述生成并如实施 例18所述测量活性)。图17A显示了细胞培养液中的活性而图17b显示了校正 酶浓度后的比活。
图18显示了如实施例13所述使用生物素化中性溶酶特异性抗体和链霉 亲合素sepharose自细胞培养液提取的中性溶酶的活性测量结果。
图19的左图：Western印迹，显示了表达7天后的中性溶酶-Fc表达(最后 一道是中性溶酶对照(Nep对照))。右图：亲和纯化的蛋白质中性溶酶-Fc (IgG4)，通过亲和层析进行纯化，并用低pH进行洗脱。
图20显示了Aβ1-40的时间依赖性降解。将5μg/ml中性溶酶与豚鼠血浆一起 于37℃温育0-360分钟。实验细节见实施例19。
图21显示了Aβ1-42的时间依赖性降解。将5μg/ml中性溶酶与豚鼠血浆于一 起37℃温育0-360分钟。实验细节见实施例19。
图22显示了Aβ40的剂量依赖性降解。将0-20μg/ml中性溶酶与豚鼠血浆 一起于37℃温育210分钟。实验细节见实施例19。
图23显示了血浆中所添加中性溶酶Aβ40的降解受到添加10μM磷酰二肽 的抑制。实验细节见实施例19。
图24显示了缓冲系统中重组人中性溶酶对淀粉状蛋白β1-40肽的降解。实 验细节见实施例20。
图25显示了经过纯化的IDE-Fc的SDS-PAGE分析和Western印迹分析。在 Western印迹中使用对IDE特异的抗体来检测IDE-Fc。第1道和第2道：经过纯 化的IDE-Fc，第3道：可溶性IDE(0.1μg)。实验细节见实施例24。
图26显示了经过纯化的IDE-Fc构建物的酶活性。图A显示了含有IDE-Fc 活性的级分；图B显示了图A圆圈中的样品的详情。图B还包括没有添加任何 酶的对照。活性测量见实施例24。
发明公开
本发明的目的是提供能够降解Aβ肽的融合蛋白。因此，本发明提供了一 种融合蛋白，其具有通式A-L-M且能够在Aβ肽的氨基酸序列中的一个或多个 切割位点处降解该肽，其中A是能切割Aβ肽的构件，M是能调控血浆半衰期 的构件，而L是连接A与M的构件。
一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中L共价连接A与M。
另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是蛋白酶。所述蛋白 酶可以是改良的蛋白酶。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是支架(scaffold)蛋白。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是人中性溶酶。在这 个方面的一个实施方案中，所述中性溶酶是胞外中性溶酶。所述胞外中性溶 酶可以包含依照SEQ ID NO.1、2、3或4任一条的氨基酸序列。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是胰岛素降解酶。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中M是抗体的Fc部分。所 述M可以是来自IgG抗体的Fc部分。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中M经过PEG化和/或糖基 化。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中L选自A与M之间的直接 连接、化学接头、和具有合适序列的肽。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是人中性溶酶，M是 来自IgG抗体的Fc部分，而L是肽。所述中性溶酶可以是胞外中性溶酶，而且 可以包含依照SEQ ID NO.1、2、3或4任一项的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，所述融合蛋白包含依照SEQ ID NO.8的氨基酸序 列。
又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中构件A与构件M经由构 件L相连接的组合具有比单独的构件A更长的半衰期。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其具有通 式(B:A)-L-M且能够在一个或多个切割位点处降解Aβ肽，其中B是能与Aβ肽 结合的构件，A是能切割Aβ肽的构件，M是能延长血浆半衰期的构件，而L 是连接B和A与M的构件。
在此实施方案的一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中L共价连 接A与M。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是能 与淀粉状蛋白β肽结合的蛋白质。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是能 与淀粉状蛋白β肽结合的、依设计而合成的结构。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是来 自抗体的一部分，其包含互补决定区(CDR)，诸如例如Fab、scFv或单个结构 域。只有重链的骆驼抗体(camel antibody)可用作结合构件。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是能 与淀粉状蛋白β肽结合的支架蛋白。支架蛋白的例子有tendamistat、affibody、 anticalin和锚蛋白(ankyrin)。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A选自 蛋白酶、改良的蛋白酶、和支架蛋白。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是人 中性溶酶。所述中性溶酶可以是胞外中性溶酶，而且可以包含依照SEQ ID NO.1、2、3或4任一条的氨基酸序列。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是胰 岛素降解酶。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中M是抗 体的Fc部分。M可以是来自IgG抗体的Fc部分。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中M经过 PEG化和/或糖基化。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中L选自 A与M之间的直接连接、化学接头和肽。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是人 中性溶酶，B是Fab片段，M是来自IgG抗体的Fc部分，而L是肽。所述中性溶 酶可以是胞外中性溶酶，而且可以包含依照SEQ ID NO.1、2、3或4任一项 的氨基酸序列。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中构件A、 构件B与构件M经由构件L相连接的组合具有比单独的构件A、单独的构件B、 或连为一体的构件A与构件B更长的半衰期。
在本发明的又一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其具有通 式A-L-M-L-B且能够在一个或多个切割位点处降解Aβ肽，其中B是能与Aβ肽 结合的构件，A是能切割Aβ肽的构件，M是能延长血浆半衰期的构件，而L 是连接A与M和M与B的构件。
在此实施方案的一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中L共价连 接A与M。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A选自 蛋白酶、改良的蛋白酶、和支架蛋白。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是人 中性溶酶。所述中性溶酶可以是胞外中性溶酶，而且可以包含依照SEQ ID NO.1、2、3或4任一条的氨基酸序列。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是胰 岛素降解酶。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是能 与淀粉状蛋白β肽结合的蛋白质。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是能 与淀粉状蛋白β肽结合的、依设计而合成的结构。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是来 自抗体的一部分，其包含互补决定区(CDR)，诸如例如Fab、scFv或单个结构 域。只有重链的骆驼抗体可用作结合构件。
在此实施方案的另一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中B是能 与淀粉状蛋白β肽结合的支架蛋白。支架蛋白的例子有tendamistat、affibody、 anticalin和锚蛋白(ankyrin)。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中M是抗 体的Fc部分。M可以是来自IgG抗体的Fc部分。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中M经过 PEG化和/或糖基化。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中L选自 A与M之间的直接连接、化学接头、和肽。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中A是人 中性溶酶，B是Fab片段，M是来自IgG抗体的Fc部分，而L是肽。所述中性溶 酶可以是胞外中性溶酶，而且可以包含依照SEQ ID NO.1、2、3或4任一项 的氨基酸序列。
在此实施方案的又一方面，本发明提供了这样的融合蛋白，其中构件A、 构件B与构件M经由构件L相连接的组合具有比单独的构件A、单独的构件B、 或连为一体的构件A与构件B更长的半衰期。
本说明书全篇中所使用的术语定义如下，除非另有具体限定。
术语“调控物”指能对治疗性蛋白质阻止降解和/或延长血浆半衰期、降 低毒性、降低免疫原性或提高生物学活性的分子。例示性的调控物包括Fc结 构域，以及线性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、右旋糖苷等)；支 链聚合物(参见例如美国专利4,289,872；美国专利5,229,490；WO 93/21259)； 脂质；胆固醇(诸如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或者任何能与补救受体 (salvage receptor)结合的天然的或合成的蛋白质、多肽或肽。糖基化也是调控 物的一个例子，即通过提高融合蛋白的大小可延长血浆半衰期，主要归于清 除机制的变化。
术语“蛋白质”指具有催化活性的分子，其能通过氨基酸序列中任何可 能位点处的蛋白水解切割而降解淀粉状蛋白β肽。蛋白质的例子包括中性溶 酶以及其它能降解淀粉状蛋白β肽的催化活性酶。催化性抗体也可用作蛋白 质部分。蛋白质可以是来自任何物种(例如人、猴、小鼠)的天然存在变体 或者采用理性设计或分子进化技术而设计出的变体。蛋白质分子也可以是不 同多态性变体或剪接变体。
术语“融合(物)”指由调控物分子与蛋白质分子构成的分子。可以将 调控物部分与蛋白质部分共价相连接以生成融合蛋白。也可以采用非共价方 法连接蛋白质部分与调控物部分。
术语“降解”指一个起始分子分成两个或更多个分子的过程。更具体的 说，淀粉状蛋白β肽(任何大小，氨基酸1-43或更小)遭到切割而生成比起 始分子小的片段。切割可以通过肽键的水解或将分子拆分成更小部分的其它 类型的反应来实现。
术语“天然Fc”指包含消化完整抗体而生成的非抗原结合片段之序列的 分子或序列，无论是单体或多聚体形式。天然Fc的最初免疫球蛋白来源可以 是人起源的，而且可以是任何免疫球蛋白，但优选IgG1和IgG2。天然Fc由单 体多肽制成，其可以通过共价(即二硫键)和非共价结合而连接成二聚体或 多聚体形式。天然Fc分子单体亚基之间的分子间二硫键数目的范围为1-4个， 取决于类别(例如IgG、IgA、IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、 IgA2)。天然Fc的一个例子是由木瓜蛋白酶消化IgG生成的、以二硫键键合的 二聚体(参见Ellison et al.(1982)，Nucleic Acids Res.10：4071-9)。术语“天然 Fc”在用于本文时是单体、二聚体和多聚体形式的通称。
术语“Fc变体”指修饰天然Fc得到的但仍包含补救受体、FcRn结合位点 的分子或序列。出版物WO 97/34631和WO 96/32478记载了例示性的Fc变体 以及与补救受体的相互作用(收入本文作为参考)。如此，术语“Fc变体” 包括将非人天然Fc人源化得到的分子或序列。此外，天然Fc包含可以消除的 位点，因为它们提供的是本发明融合蛋白所不需要的结构特征或生物学活 性。如此，术语“Fc变体”包括缺少一个或多个影响或牵涉以下各项的天然 Fc位点或残基的分子或序列：(1)二硫键形成；(2)与所选宿主细胞的不相容 性；(3)在所选宿主细胞中表达时的N末端异质性；(4)糖基化；(5)与补体的相 互作用；(6)与补救受体以外的Fc受体的结合；或(7)抗体依赖性细胞的细胞 毒性(ADCC)。下文更详细的描述了Fc变体。
术语“Fc结构域”涵盖如上定义的天然Fc和Fc变体分子和序列。与Fc变 体和天然Fc一样，术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，无论是 通过消化完整抗体生成的或者是通过其它手段生成的。
术语“药理学活性”意味着所述物质经测定具有改变医学参数(例如血 压、血细胞计数、胆固醇水平)或疾病状态(例如癌症、自身免疫病、痴呆) 的活性。
术语“淀粉状蛋白β肽(amyloid beta peptide)”或“Aβ肽”指与人AβA4 蛋白[前体]中的氨基酸序列(单字母代码)DAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIAT(SEQ ID NO 50)(对应于该序列中的氨 基酸672-714)有关的任何形式的肽(氨基酸1-43)。它还包括这种肽的任何 更短形式，诸如1-38、1-40和1-42，但不限于这些形式。此外，淀粉状蛋白β 肽有数种天然存在形式。淀粉状蛋白β肽的人形式称为Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42 和Aβ43。这些肽的序列及它们与APP前体的关系见Hardy et al.，TINS 20： 155-158(1997)的图1。例如，Aβ42具有序列： H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr- Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys- Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-ValaIe-Ala-OH (SEQ ID NO 51)。Aβ41、Aβ40和Aβ39与Aβ42的不同之处在于分别从C末端删除了Ala、Ala-Ile 和Ala-Ile-Val。Aβ43与Aβ42的不同之处在于C末端存在苏氨酸残基。总之，淀 粉状蛋白β肽指牵涉引起阿耳茨海默氏病的斑形成的肽形式。
术语“半衰期”指从血浆中清除融合蛋白初始浓度的半数所花费的时间。 本发明描述了调控血浆半衰期的方法。这样的修饰可生成具有改良药动学特 性(例如体内血清半衰期延长)的融合蛋白。半衰期延长意味着从血浆中清 除融合蛋白初始浓度的半数需要更长时间。药用化合物或化学化合物的半衰 期在本领域已经清楚定义且是众所周知的。
术语“连接”指两个或更多个部分之间的共价或可逆联结。共价连接可 以是例如肽键、二硫键、碳-碳偶联或基于原子间共价连接的任何类型连接。 可逆连接可以是例如生物素-链霉亲合素、抗体-抗原或本领域已知归入可逆 连接的连接。例如，共价连接可如下直接实现，即用同一质粒以重组形式生 成融合蛋白的蛋白质部分和调控物部分，因而连接是在DNA水平设计的。
术语“切割位点”指肽序列中可被蛋白质或酶切割的具体位置/位点。切 割通常通过连接两个氨基酸的肽键的水解来实现。切割也可以使用一种或一 组蛋白质或酶在同一肽的多个位点处发生。切割位点也可以是肽键以外的其 它位点。本发明详细描述了对淀粉状蛋白β肽的切割。
术语“结合结构域”指能以有治疗意义的亲和力与淀粉状蛋白β肽结合 的分子。这些分子以大于或等于大约106、107、108、109或1010M-1的结合亲 和力与淀粉状蛋白β肽结合。典型的结合结构域有但不限于具有针对淀粉状 蛋白β肽的亲和力的抗体(例如Fab、scFv、单个结构域，它们都包含CDR)、 本发明和文献中所描述的支架蛋白(scaffold protein)、或合成分子。
术语“蛋白酶”指在肽键的水解中起作用的任何蛋白质分子。它包括天 然存在的蛋白水解酶，以及通过定点诱变或随机诱变或者任何其它蛋白质工 程方法得到的蛋白水解酶变体、蛋白水解酶的任何片段、或者包含前述蛋白 质之一的任何分子复合物或融合蛋白。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、半胱氨 酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。
术语“底物”或“肽底物”指任何氨基酸组成、序列或长度且包含蛋白 酶能催化水解的肽键的任何肽、寡肽或蛋白质分子。遭到水解的肽键称为“切 割位点”。底物中各位置的编号依照Schlechter&Berger，Biochem.Biophys. Res.Commun.27：157-162(1967)介绍的系统来进行。邻近切割位点N端的氨 基酸残基编号为P1、P2、P3等，而邻近切割位点C端的残基编号为P1′、P2′、 P3′等。本发明的底物或肽底物指淀粉状蛋白β肽。
术语“特异性”指蛋白质或蛋白酶选择性识别和水解某种肽底物而其它 剩余物不受切割的能力。特异性可以定量和定性表述。“定性特异性”指肽 底物的某些位置上被蛋白酶接受的氨基酸残基种类。只接受所有可能肽底物 中一小部分的蛋白酶具有“高特异性”。接受几乎任何肽底物的蛋白酶具有 “低特异性”。具有很低特异性的蛋白酶也称作“非特异性蛋白酶”。
术语“进化的蛋白酶”指通过随机PCR、DNA改组或在DNA/RNA水平 生成多样性的其它类型方法得到的任何蛋白酶。文献中记载了这些方法，例 如D.A.Drummond，B.L.Iverson，G.Georgiou and F.H.Arnold，Journal of Molecular Biology 350：806-816(2005)和S.McQ and D.S.Tawfik， Biochemistry 44：5444-5452(2005)。
术语“改良的蛋白质”指具有所需要的更高催化活性的任何蛋白酶变体。 然而，在有些情况中，可能优选更低的催化活性。改良的蛋白酶也可以指与 原始蛋白酶相比更有效的切割某种物质胜过另一种物质的变体。“改良的” 意味着更优选的特性，诸如催化活性和/或选择性，从而得到更优化的药用化 合物。
术语“人中性溶酶”指任何天然形式的人中性溶酶。这包括人群中天然 存在的所有剪接变体和多态性变体。本发明中描述了许多形式的人中性溶酶 (SEQ ID NO 1-4)。
术语“支架蛋白”指能与淀粉状蛋白β肽结合的任何蛋白质。支架蛋白 的例子有tendamistat、affibody、anticalin和锚蛋白。这些支架蛋白通常是人 为设计的，基于刚性核心结构和能进行随机化以鉴定结合物的部分、环、表 面或腔。这些支架蛋白在文献中有详细记载。
本发明提出了通过施用经过优化的重组Aβ降解酶降低脑Aβ水平来抑制 淀粉状蛋白斑形成的可能性。结果是，淀粉状蛋白斑相关神经星形胶质增生 也将减轻。
在本发明的一方面，治疗性化合物是完全人起源的。融合蛋白由通过接 头连为一体的完全人的蛋白质构成，其可能的免疫原性最低。
使用降解酶与结合分子诸如抗体相比的优点在于：
●酶对淀粉状蛋白β肽的降解将直接清除毒性效果，比较而言，在结合法 的情况中，若与淀粉状蛋白β肽形成复合物的结合分子的清除不够迅速， 则淀粉状蛋白β肽的浓度有可能升高。这可能是有害的，尤其在淀粉状 蛋白β肽的外周浓度升高时。
●对淀粉状蛋白β肽的催化降解将比结合法更有效的清除肽。仅仅催化量 的降解酶就足以有效清除淀粉状蛋白β肽，而对于结合分子诸如抗体， 治疗效果将需要化学计量量(stoichiometric amount)。这将对治疗性处理 所需要的量产生极大影响。
●若结合分子是抗体且穿越血脑屏障而容许与斑中的淀粉状蛋白β肽结 合，则有可能发生有害的潜在免疫学应答。另一方面，催化性融合蛋白 不会与斑结合，利用Fc反应性，但只降低淀粉状蛋白β肽的游离浓度。 如此，催化酶只会降解淀粉状蛋白β肽的游离池。结合剂，像抗体，有 可能进入CNS并通过Fc活性而溶解斑。若在斑附近释放出大量的淀粉状 蛋白β肽，这可能是不利的，它们对细胞是有毒的。
Aβ分解代谢中一种重要的酶是中性溶酶，也称为中性内肽酶-24.11或 NEP。文献中(Iwata et al.，Nature Medicine，6：143-149，2000)显示了Aβ1-42肽通 过中性溶酶进行的有限蛋白水解而发生完全降解，与生化分析的中性溶酶相 似或相同。与此一致，输注中性溶酶抑制剂导致内源Aβ42在脑中的生化和病 理两种沉积。发现中性溶酶催化的这种蛋白水解因而限制Aβ42分解代谢速 率。
中性溶酶是94kD的2型膜结合Zn金属肽酶，牵涉数种生物学活性肽的灭 活，包括脑啡肽、速激肽、缓激肽、内皮缩血管肽和心房利钠肽。中性溶酶 存在于CNS中的肽能神经元中，而且它在脑中的表达受到细胞特异性方式的 调控(Roques B.P.et al.，Pharmacol.Rev.45：87-146，1993；Lu B.et al.，J.Exp. Med.181：2271-2275，1995；Lu B.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.780：156-163， 1996)。尽管2型中性溶酶转录物不存在于CNS中，1型和3型转录物分别定位 于胼胝体的神经元和少突胶质细胞(Li C.et al.，J.Biol.Chem.270：5723-5728， 1995)。蛋白酶和内肽酶的中性溶酶家族包括与中性溶酶在结构或功能上同 源的成员，诸如最近报告的NEP II基因及其同种型(isoform)(Ouimet T.et al.， Biochem.Biophys.Res.Commun.271：565-570，2000)，它们以与中性溶酶互 补的方式在CNS中表达。该家族的另一个成员是NL-1即中性溶酶样1，一种 受到中性溶酶抑制剂磷酰二肽(phosphoramidon)有效抑制的可溶性蛋白质 (Ghaddar G.et al.，Biochem.J.347：419-429，2000)。
分解Aβ的其它酶也已有记载。锌金属肽酶胰岛素降解酶(IDE，EC. 3.4.22.11)将Aβ1-40和Aβ1-42切割成看起来无害的产物。IDE其实是肽酶；它不 水解蛋白质。该酶在体外切割有限种类的肽，包括胰岛素及胰岛素相关肽、 β内啡肽、和Aβ肽。据说IDE是生理性Aβ代谢酶之一(Qui W.Q.et al.(1998)J. Biol.Chem.273：32730-32738)。Kurichkin和Goto(Kurochkin I.V.and Gato S. (1994)FEBS Lett.345：33-37)首先报告了胰岛素降解酶能水解Aβ1-40。这一发 现得到了两项独立研究的证实(Qui W.Q.et al.(1998)J.Biol.Chem.273： 32730-32738；McDermott J.R.and Gibson A.M.(1997)Neurochem.Res.22： 49-56)。此外，最近被鉴定为Aβ降解酶(Yamin R.et al.，J.Biol.Chem.274， 18777-18784，1999)的金属蛋白酶24.15在应答Aβ注射时也没有变化。血管紧 张素转变酶(ACE)，一种无关神经元Zn金属内肽酶，也被说成是可能的Aβ肽 降解酶(Barnes N.M.et al.，Eur.J.Pharmacol.200：289-292，1991；Alvarez R.et al.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 67：733-736，1999；Amouyel P.et al.，Ann. N.Y.Acad.Sci.903：437-441，2000)，对Aβ的亲和力未知(McDermott J.R.and Gibson A.M.，Neurochem.Res.22：49-56，1997)。
来自中性溶酶的所用序列可以是该蛋白质的胞外部分。胞外部分定义为 中性溶酶中位于膜区以外的部分。本发明还包括中性溶酶完整序列作为淀粉 状蛋白β肽降解构件的用途。本发明还包括中性溶酶的更小片段，只要针对 淀粉状蛋白β肽的催化活性得到保留。本发明还包括中性溶酶的任何多态性 变体和剪接变体。
本发明描述了在Aβ肽形成淀粉状蛋白斑之前水解它们或者至少阻止现 有斑进一步发展的新的和备选的策略。也有可能通过水解与游离Aβ肽平衡的 任何斑衍生Aβ肽来清除现有的斑。
本发明的另一个实施方案涉及这样的分子，其包含能以高亲和力与淀粉 状蛋白β肽结合的一个部分。该亲和力是低于微摩尔的结合亲和力。对淀粉 状蛋白β肽的结合亲和力优选纳摩尔的结合亲和力。牵涉与淀粉状蛋白β肽相 互作用的另一个部分是能在淀粉状蛋白β肽结构中的一个或多个位点处切割 淀粉状蛋白β肽的活性构件。将都能识别淀粉状蛋白β肽的结合部分与催化活 性部分连为一体的原因是结合部分与淀粉状蛋白β肽结合，由此提高(结合 部分和催化活性部分)所结合的解离形式淀粉状蛋白β肽的局部浓度。有些 结合是对解离形式特异性的，不与聚集形式结合。有些结合聚集和解离两种 形式。有些这样的抗体与淀粉状蛋白β肽的天然存在短型Aβ(即共价或以其 它方式连为一体)结合，使之受到因双功能分子的连接改造而位于附近的活 性部分的切割。淀粉状蛋白β肽结合构件与淀粉状蛋白β肽降解构件之间的连 接优选由含有或不含接头构件的血浆半衰期调控物构件来介导。
在本发明的有些实施方案中，治疗剂包括能与淀粉状蛋白β肽或淀粉状 蛋白斑的其它成分特异性结合的融合蛋白。这样的化合物可以是单克隆或多 克隆或者任何其它淀粉状蛋白β肽结合剂的一部分。这些化合物以大于或等 于大约106、107、108、109或1010M-1的结合亲和力与淀粉状蛋白β肽结合。优 选将这些结合构件与淀粉状蛋白β肽降解构件相连。
本发明的一方面涉及融合蛋白中抗体“Fc”结构域与淀粉状蛋白β肽降 解构件的组合物。抗体包含两个功能上独立的部分，可变域称为“Fab”，其 能与抗原结合，而恒定域称为“Fc”，其与诸如补体活化和吞噬细胞攻击等 效应器功能有关。Fc的血清半衰期较长，而Fab寿命较短(Capon et al.(1989)， Nature 337：525-31)。在与治疗性蛋白质构建成一体时，Fc结构域可提供更长 的半衰期或者掺入诸如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固定和甚至可能胎盘 转移等功能。
依照本发明优选的分子是与Fc相连的淀粉状蛋白β肽降解蛋白诸如中性 溶酶相关蛋白。
题为“Modified Peptides as Therapeutic Agents”的出版物WO 99/25044 中详细讨论了通过与抗体Fc结构域的融合对蛋白质治疗剂的有用修饰。该出 版物讨论了与“媒介物(vehicle)”诸如PEG、右旋糖苷或Fc区的连接。
IgG分子与三种类别对IgG类抗体特异性的Fc受体(FcR)相互作用，即 FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在优选的实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白(Ig) 构件包含对FcγRI、FcγRII或FcγRIII中至少一种具有低结合亲和力的IgG恒定 区的至少一部分。在本发明的一方面，通过使用对细胞上Fc受体具有降低的 结合亲和力的重链同种型(isotype)作为融合配偶体，降低了融合蛋白对Fc受 体的结合亲和力。例如，人IgG1和IgG3都有报道说以高亲和力与FcRγI结合， 但IgG4的结合情况要差10倍，而IgG2根本不结合。对于IgG与Fc受体结合而 言重要的序列有报道说位于CH2结构域内。如此，在一个优选的实施方案中， 通过将至少IgG2或IgG4的CH2结构域与第二非免疫球蛋白蛋白质相连接，得 到了体内循环半衰期得到延长的基于抗体的融合蛋白。例如，在四种已知的 IgG同种型中，已知IgG1(Cγ1)和IgG3(Cγ3)以高亲和力与FcRγI结合，但IgG4 (Cγ4)具有低10倍的结合亲和力，而IgG2(Cγ2)不与FcRγI结合。
在一个实施方案中，融合蛋白的Aβ肽降解构件是酶。术语“酶”在用于 本文时指具有蛋白酶或肽酶活性的蛋白质及其类似物和片段。优选的是，酶 包括丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。优选 的是，本发明的融合蛋白展现出酶的生物学活性。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白结构域选自IgG的Fc结构域、IgG的重 链和IgG的轻链中的一种或多种。在另一个实施方案中，融合蛋白中的抗体 恒定区是人起源的，而且属于衍生自IgG类免疫球蛋白的免疫球蛋白家族， 特别是衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类，优选衍生自IgG2或IgG4类。也 有可能使用属于来自其它哺乳动物的IgG类的免疫球蛋白的恒定区，尤其来 自啮齿类或灵长类；然而，依照本发明，也有可能使用免疫球蛋白IgD、IgM、 IgA或IgE类的恒定区。通常，依照本发明的构建物中所存在的抗体片段包含 Fc结构域CH3或其部分及Fc结构域CH2的至少一部分区段。或者，也有可能 想到如下依照本发明的构建物，其包含CH3结构域和铰链区作为构件(A)以进 行二聚体。
然而，也有可能使用以天然状态发现的免疫球蛋白序列的衍生物，特别 是那些包含至少一处替代、删除和/或插入(在本文中在术语“变体”下相结 合)的变体。通常，这样的变体与天然序列具有至少90％、优选至少95％、 更优选至少98％的序列同一性。在本文中特别优选的变体是替代变体，其与 相应天然序列相比通常包含少于10处、优选少于5处、更优选少于3处替代。 注意，以下可能的替代是优选的：用Met、Val、Leu、Ile、Phe、His或Tyr替 代Trp，反之亦然；用Ser、Thr、Gly、Val、Ile或Leu替代Ala，反之亦然；用 Gln、Asp或Asn替代Glu，反之亦然；用Glu、Gln或Asn替代Asp，反之亦然； 用Lys替代Arg，反之亦然；用Thr、Ala、Val或Cys替代Ser，反之亦然；用 His、Phe或Trp替代Tyr，反之亦然；用其它19种天然氨基酸之一替代Gly或Pro， 反之亦然。
可溶性受体-IgG融合蛋白是常用的免疫学试剂，而且它们的构建方法是 本领域已知的(参见例如美国专利5,225,538)。可以将功能性淀粉状蛋白β肽 降解结构域与来自各类或亚类免疫球蛋白的免疫球蛋白Fc结构域相融合。属 于不同免疫球蛋白类或亚类的抗体的Fc结构域可激活不同次级(secondary)效 应器功能。激活在Fc结构域受到关联Fc受体结合时发生。次级效应器功能包 括激活补体系统、穿越胎盘、和与各种微生物蛋白质结合的能力。不同类和 亚类免疫球蛋白的特性见Roitt et al.，Immunology，p.4.8(Mosby-Year Book Europe Ltd.，3d ed.1993)。结合了抗原的IgG1、IgG3和IgM抗体的Fc结构域可 激活补体酶级联反应。IgG2的Fc结构域看起来不太有效，而IgG4、IgA、IgD 和IgE的Fc在激活补体方面无效。如此，可以根据其相关次级效应器功能是 否是特定免疫应答或用淀粉状蛋白β肽降解-Fc融合蛋白所治疗的疾病所需 要的来选择Fc结构域。如果破坏或杀死靶细胞是有益的，那么可以选择尤其 有活性的Fc结构域(IgG1)来构建淀粉状蛋白β肽降解-Fc融合蛋白。或者，如 果希望生成不触发补体系统的淀粉状蛋白β肽降解-Fc融合物，那么可以选择 无活性的IgG4 Fc结构域。本发明描述了这样的融合蛋白，其中催化构件与 Fc部分而非直接结合构件相连接。这意味着源自Fc的效应和活性将是有限 的，因为许多Fc效应是通过结合来介导的。例如，补体激活依赖于结合和网 络的形成。
依照本发明的融合构建物，免疫球蛋白片段的C端通常但非必需在催化 部分与调控部分之间包含过渡区，该过渡区继而可包含接头序列，该接头序 列优选是肽序列。此肽序列的长度可以是1-70个氨基酸，适当时可以有更多 个氨基酸，优选10-50个氨基酸，特别优选12-30个氨基酸。过渡序列的接头 区的侧翼可以是更短的肽序列，例如可以对应于DNA限制性切割位点。在这 部分中可以使用分子生物学领域技术人员所熟悉的任何限制性切割位点。合 适的接头序列优选包含较多脯氨酸残基(例如接头区中每隔一位)的人工序 列，另外，优选具有整体上的亲水特性。优选至少30％的残基为脯氨酸残基 组成的接头序列。亲水特性优选可以通过至少一个氨基酸带正电荷(例如赖 氨酸或精氨酸)或负电荷(例如天冬氨酸(盐/酯)或谷氨酸(盐/酯))的手 段来实现。总之，接头区因此还优选包含较多甘氨酸和/或脯氨酸残基，从而 赋予接头区以必需的柔性和/或刚性。
然而，天然序列，例如那些属于中性溶酶家族的配体中处于胞外但紧挨 着细胞膜即在细胞膜之前的片段也适于用作接头，其中对天然序列进行替 代、删除或插入后也是适宜的。这些片段优选胞外在跨膜区之后的50个氨基 酸，或者这前50个氨基酸的子片段。然而，优选这些与相应天然人序列具有 至少85％、优选至少95％、更优选至少99％序列同一性的片段，从而限制依 照本发明的融合蛋白中这些接头区的免疫原性且不会引发任何内在体液防 御反应。在本发明的上下文中，接头区应优选没有任何免疫原性。
然而，作为经由酰胺键与淀粉状蛋白β肽降解构件和血浆半衰期调控物 构件相连接的肽序列的备选方案，也有可能使用本质为非肽或假肽或者基于 非共价键的化合物。在这部分中可以提及的例子具体有N-羟基琥珀酰亚胺酯 和异双功能接头，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)或 类似交联剂。
调控血浆半衰期的其它方法有利用PEG化或提高分子量的其它类型修 饰诸如糖基化。
如上所述，也可以使用聚合物调控物。目前可利用多种方法来附着可用 作调控物的化学模块，参见例如公布号为WO 96/11953、题为“N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods”的专利合作条约 (Patent Cooperation Treaty，PCT)国际申请(完整收入本文作为参考)。此PCT 申请披露了水溶性聚合物对蛋白质N末端的选择性附着等。
一种优选的聚合物调控物是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以是任何便利 的分子量，而且可以是线性的或分支的。PEG的平均分子量的范围优选大约 2kDa到大约100kDa，更优选大约5kDa到大约50kDa，最优选大约5kDa到 大约10kDa。通常经由PEG模块上反应性基团(例如醛基、氨基、巯基或酯 基)对本发明化合物上反应性基团(例如醛基、氨基或酯基)的酰化或还原 性烷化将PEG基团附着于本发明的化合物。
用于蛋白质PEG化的有用策略包括通过在溶液中形成偶联(conjugate)连 接而使蛋白质与PEG模块相组合，二者各自携带彼此有反应性的特定官能 基。可以采用常规重组表达技术来制备蛋白质。用合适官能基在特定位点处 使蛋白质“预活化”。对前体进行纯化和全面表征，然后与PEG模块进行反 应。蛋白质与PEG的连接通常在水相中进行，而且可以通过反相分析性HPLC 容易地监测。PEG化蛋白质可以通过制备性HPLC容易地纯化，并通过分析 性HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱进行表征。
多糖聚合物是可用于蛋白质修饰的另一类水溶性聚合物。右旋糖苷是由 葡萄糖亚基构成的多糖聚合物，其中各个葡萄糖亚基主要以α1-6连接相连 接。可以得到许多分子量范围的右旋糖苷，而且可得到大约1kD到大约70kD 的分子量的右旋糖苷。右旋糖苷是适于以自身或与另一调控物(例如Fc)相 结合用作本发明中调控物的水溶性聚合物。参见例如WO 96/11953和WO 96/05309。与治疗性或诊断性免疫球蛋白相偶联的右旋糖苷的使用已有报道； 参见例如欧洲专利申请No.0315456(收入本文作为参考)。在将右旋糖苷用 作依照本发明的媒介物时，优选大约1kD到大约20kD的右旋糖苷。
可以方便将碳水化合物(寡糖)基团附着于蛋白质中已知为糖基化位点 的位点。一般而言，将O-连接的寡糖附着于丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基， 而将N-连接的寡糖附着于作为序列Asn-X-Ser/Thr(其中X可以是除脯氨酸外 的任何氨基酸)一部分的天冬酰胺(Asn)残基。X优选是除脯氨酸外的19种天 然存在氨基酸之一。N-连接和O-连接寡糖的结构及在每种类型中找到的糖残 基是不同的。在二者中都常见的一类糖是N-乙酰基神经氨酸(也称为唾液 酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接两类寡糖的末端残基，而且因其负电荷 可赋予糖基化化合物以酸性特性。可以将这样的位点掺入本发明化合物的接 头，而且优选在重组生产多肽化合物的过程中(例如在哺乳动物细胞诸如 CHO、BHK、COS中)由细胞糖基化。然而，这样的位点也可以通过本领域 已知的合成或半合成规程来糖基化。可以将适于糖基化的氨基酸掺入调控物 和蛋白质两个部分中的特定位点。优选用于工程改造这些特定氨基酸的技术 是定点诱变或相当的方法。
其它可能的修饰脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酸或苏氨酸残基的羟基 磷酸化、半胱氨酸的硫原子氧化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的侧链α氨基甲 基化(Creighton，Proteins：Structure and Molecule Properties(W.H.Freeman &Co.，San Francisco)，pp.79-86(1983))。如此，可以工程改造淀粉状蛋白β肽 降解构件中的糖基化位点。例如，可以修饰残基(优选中性溶酶结构表面上 的残基)以容许糖基化。可以使用中性溶酶的3D结构来选择用于导入糖基化 和PEG化位点的合适氨基酸替代。使用例如Asn-X-Ser/Thr序列来导入糖基化 位点。对于PEG化，将合适的表面暴露氨基酸用例如半胱氨酸残基替代以特 异性且高效偶联PEG化构件。
也可以在DNA水平来改变本发明的化合物。可以将化合物任何部分的 DNA序列改变成与所选宿主细胞更加相容的密码子。对于大肠杆菌(优选的 宿主细胞)，优化的密码子是本领域已知的。可以替代密码子以消除限制性 位点或掺入沉默限制性位点，这会有助于在所选宿主细胞中加工DNA。可以 修饰媒介物、接头和肽DNA序列以掺入任何前述序列改变。
接头：任何“接头”基团都是任选的。如果有的话，它的化学结构不是 至关重要的，因为它主要充当间隔物。接头优选由通过肽键连为一体的氨基 酸构成。如此，在优选的实施方案中，接头由通过肽键连为一体的1-20个氨 基酸构成，其中所述氨基酸选自20种天然存在氨基酸。这些氨基酸中的一些 可以是糖基化的，正如本领域技术人员充分理解的。在一个更优选的实施方 案中，从甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸中选择1-20 个氨基酸。甚至更优选的是，接头主要由没有空间位阻的氨基酸诸如甘氨酸 和丙氨酸构成。如此，优选的接头有聚甘氨酸(具体有(Gly)4、(Gly)5)、聚 (Gly-Ala)和聚丙氨酸。
蛋白酶的数量特异性(quantitative specificity)广泛变化。已知有特异性很 低的蛋白酶，诸如木瓜蛋白酶(它切割所有包含苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸 残基的多肽)或胰蛋白酶(它切割所有包含精氨酸或赖氨酸的多肽)。另一 方面，已知有特异性很高的蛋白酶，诸如组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(它 只在一种特定序列处切割纤溶酶原)。具有高底物特异性的蛋白酶在活生物 体中蛋白功能的调控中发挥重要作用。例如，对多肽底物的特异性切割活化 前体蛋白质或灭活活性蛋白质或酶，由此调控其功能。医学应用中使用了具 有高底物特异性的数种蛋白酶。通过切割特定多肽底物来进行活化或灭活的 药物的例子有在急性心脏梗塞中应用t-PA(它活化纤溶酶原以溶解纤维蛋白 凝块)或在中风中应用安克洛酶(Ancrod)(它灭活纤维蛋白原，由此降低血 液粘度和增强其运输能力)。尽管t-PA是具有人血液调控所必需的活性的人蛋 白酶，但是Ancrod是非人蛋白酶。它分离自毒蛇Agkistrodon rhodostoma，且 构成蛇毒的主要成分。因此，有少数非人蛋白酶具有治疗应用性。然而，它 们的鉴定通常是非常偶然的。通过施用药物来治疗疾病通常基于由该药物活 化或灭活患者体内特定蛋白质功能而启动的分子机制，所述蛋白质是内源蛋 白质或者感染性微生物或病毒的蛋白质。尽管化学药物对这些靶物的作用仍 然难以理解或预测，但是蛋白质药物能够在数以百万计的其它蛋白质中特异 性的识别这些靶蛋白质。具有识别其它蛋白质的内在可能性的蛋白质的突出 例子有抗体、受体和蛋白酶。尽管有众多潜在靶蛋白质，今天只能利用非常 少的针对这些靶蛋白质的蛋白酶。由于其蛋白水解活性，蛋白酶特别适于灭 活靶蛋白质或肽。在只考虑人蛋白质时，潜在靶蛋白质的数目仍然是巨大的。 估计人类基因组包含30,000-100,000种基因，每一种基因编码不同的蛋白质。 许多这些蛋白质或肽牵涉人类疾病，因此是潜在的药物靶。可能不可能通过 筛选天然分离物而找到具有特定质量特异性(qualitative specificity)的蛋白 酶。因此，需要优化已知蛋白酶或其它支架蛋白包括催化性抗体的催化选择 性。
具有已知特异性的蛋白酶的选择系统是本领域已知的，例如参见Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，Vol.88(1991)。例如，该系统包括酵母转录 因子GAL4作为选择标记，与TEV蛋白酶组合在GAL4中插入确定的且可切割 的靶序列。所述切割将DNA结合结构域与转录激活结构域分开，使得转录因 子失活。所得细胞在半乳糖代谢方面的表型无能可以通过量热法(calorimetric assay)或者通过自杀底物2-脱氧半乳糖的选择来检测。
此外，可以通过使用具有修饰的肽底物来进行选择，所述修饰例如基于 像ACC那样的基团的荧光模块，如Harris等人先前所述(US 2002/022243)。
如本发明所述，可以使用相同或相似的方法来鉴定或生成有效的淀粉状 蛋白β肽降解构件。工程改造此淀粉状蛋白β肽降解构件的该起点可以是具有 针对淀粉状蛋白β肽的一些活性的酶或根本没有活性的酶。其它构件可以是 支架蛋白，其中将特定区域进行随机化以具有针对淀粉状蛋白β肽的活性。 文献中描述了多种支架蛋白，其中支架结构的一部分是以相对固定的位置支 撑随机化部分以生成结合或活性位点的核心结构。
用于生成序列特异性发生了改变的蛋白水解酶的实验室技术大体上是 已知的。它们可以根据其表达和选择系统来分类。遗传选择指在生物体中生 成蛋白酶或任何其它蛋白质，该蛋白酶或任何其它蛋白质能够切割前体蛋白 质，继而导致生产生物体生长行为的改变。可以从具有不同蛋白酶的一群生 物体中选择出那些生长行为发生了改变的生物体。该原理是由Davis等人报 告的(美国专利No.5,258,289)。噬菌体系统的生成依赖于噬菌体蛋白质的切 割，它在存在蛋白水解酶或能够切割噬菌体蛋白质的抗体时得到激活。所选 蛋白水解酶、支架或抗体将有能力切割氨基酸序列，供激活噬菌体生成之用。
报道了一种用于生成序列特异性发生了改变的蛋白水解酶的系统。 Iverson等人(WO 98/49286)记载了展示在细胞表面上的膜结合型蛋白酶的表 达载体。该实验设计的一个重要元素是催化反应必须在细胞表面上进行，即 底物和产物必须与表达酶的细菌在表面保持结合。选择系统的另一个例子是 使用FACS分选术(Varadarajan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，102：6855 (2005))，即在细胞表面上表达活性蛋白质并分选携带具有改良特性的变体的 细胞。它们显示出蛋白酶切割位点特异性的3x106倍变化。
还知道一种用于生成对自身分泌蛋白酶的序列特异性发生了改变的蛋 白水解酶的系统。Duff等人(WO 98/11237)描述了自身分泌蛋白酶的表达系 统。该实验设计的一个重要元素是催化反应通过膜结合型前体分子的自我蛋 白水解加工而作用于蛋白酶自身，从而将成熟蛋白酶从细胞膜释放到胞外环 境。
Broad等人(WO 99/11801)披露了适于改变蛋白酶特异性的异源细胞系 统。该系统包含转录因子前体，其中转移因子与膜锚定结构域经蛋白酶切割 位点相连接。蛋白酶对该蛋白酶切割位点的切割释放出转录因子，该转录因 子继而启动受相应启动子控制的靶基因的表达。改变特异性的实验设计包括 插入具有经修饰序列的蛋白酶切割位点并对蛋白酶进行诱变。
依照本发明，可以直接使用任何蛋白质或肽或者作为起点来生成合适的 淀粉状蛋白β肽降解构件。例如，依照本发明，可以使用任何蛋白酶作为第 一蛋白酶。优选的是，可以使用人起源的任何蛋白质或肽。若使用在人体中 天然存在的天然蛋白质或肽，则优选最小的可能变化。在有些方法中，同时 施用具有不同结合特异性和/或降解活性的两种或多种融合蛋白，在这种情况 中，每种融合蛋白的施用剂量落在指示的范围内。通常在多个时刻施用融合 蛋白。各剂之间的时间间隔可以是例如每周一次、每月一次、每季一次或每 年一次。时间间隔可以是不规则的，通过测量患者血浆中融合蛋白血液水平 来决定。在有些方法中，对剂量进行调整以实现1-1000μg/ml的血浆融合蛋白 浓度，而在有些方法中是25-300μg/ml。还有，在有些方法中，对剂量进行调 整以实现1-1000ng/ml的血浆融合蛋白浓度，而在有些方法中是25-300ng/ml。 或者，可以作为持续释放剂型来施用融合蛋白，在这种情况中，所需要的施 用频率较低。剂量和频率随融合蛋白在患者中的半衰期而变化。一般而言， 具有Fc部分的融合蛋白显示出较长的半衰期。施用的剂量和频率可以随治疗 是治疗性的还是预防性的而变化。在预防性应用中，在较长的一段时间里以 较低频率的时间间隔施用较低的剂量。有些患者在其余生继续接受治疗。在 治疗性应用中，有时需要以较短的时间间隔施用较高的剂量，直到疾病的进 展减缓或停止，优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可 以对患者施行预防性方案。预测可以以与结合剂诸如例如抗体相比的较低剂 量施用催化活性淀粉状蛋白β肽降解融合蛋白。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以有所变化，从而得到 对于特定患者、组合物、和施用模式而言有效实现所需治疗应答且对患者无 毒的活性成分的量。所选剂量水平取决于多种药动学因素，包括所采用的本 发明特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用路径；施用时间；所采用的 特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定组合物联合使用 的其它药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、整 体健康和以前的医疗史；及医学领域众所周知的类似因素。
将本文中所引用的所有出版物或专利完整收入本文作为参考，因为它们 显示了本领域在本发明所处时间的状态和/或提供了对本发明的说明并使本 发明得以实现。出版物指任何科学出版物或专利出版物，或者可获得的任何 介质形式的任何其它信息，包括所有记录的、电子的或印刷的形式。将以下 参考文献完整收入本文作为参考：Ausubel，et al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2001)；Sambrook， et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor， N.Y.(1989)；Harlow and Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Colligan，et al.，eds.，Current Protocols in Immunology， John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)。
本发明的一方面是修饰天然野生型蛋白质使之变得在降解淀粉状蛋白β 肽方面甚至更具选择性的可能性。可以通过定点诱变在野生型序列中导入/ 替代氨基酸。一种方法是通过研究降解酶的活性位点进行的合理设计。可以 用其它氨基酸替代可能会改变选择性(淀粉状蛋白β肽与其它肽/蛋白质的降 解相比)的氨基酸，并且可以在本领域已知的切割测定法中测试新的变体。 优选的是，与其它相关肽相比对淀粉状蛋白β肽具有更高催化降解活性的变 体是有用的。其它相关肽包括但不限于脑啡肽、神经肽Y、物质P、somastatin、 胆囊收缩素。
本发明的一个目标是提供适于开发神经变性疾病治疗方法和适于鉴定 可用于此类疾病治疗性干预的化合物的方法和物质。基于β-淀粉状蛋白可以 通过经过优化的酶介导的机制来清除的发现，本发明提供了正如权利要求部 分所列出的和下文所描述的方法和物质。
本发明提供了用于预防和治疗神经变性病症的方法，包括对哺乳动物的 外周系统施用有效量的经过优化的酶活性化合物。具体而言，酶活性化合物 是融合蛋白，其中一部分具有酶活性而另一方面调控血浆半衰期。该方法适 于预防和治疗脑淀粉样变，诸如阿耳茨海默氏病。本发明还提供了不同测定 原理-生化的，特别是细胞的测定法，用于测试经过优化的酶活性化合物， 优选筛选多种化合物，用于调控活性和血浆半衰期。
在另一个实施方案中，测定法包括在检测所述酶活性之前添加中性溶酶 家族成员的已知抑制剂。合适的抑制剂有例如磷酰二肽、thiorphan、 spinorphin、或前述物质的功能性衍生物。
在一般意义上，依照本发明的测定法在体外和在体内测量酶活性和血浆 半衰期。
另一方面，本发明提供了用于生成药物的方法，其包括以下步骤：(i)鉴 定能降解Aβ肽的化合物，优选高度特异性的且具有高Aβ肽降解活性的化合 物；(ii)将此Aβ肽降解化合物与决定血浆半衰期的调控物化合物相连接。
可以采用重组DNA技术在经过转化的宿主细胞中生成本发明的化合物。 为此，制备编码融合蛋白的重组DNA分子。用于制备这样的DNA分子的方 法是本领域众所周知的。例如，可以使用合适的限制酶从DNA中切出编码调 控物和蛋白质的序列。或者，可以采用化学合成技术诸如氨基磷酸酯 (phosphoramidate)法来合成DNA分子。还有，可以使用这些技术的组合。
本发明还包括能够在适宜的宿主中表达调控物、蛋白质或融合物的载 体。载体包含编码调控物、蛋白质和/或融合物的DNA分子，该DNA分子与 表达控制序列可操作连接。在将DNA分子插入载体之前或之后实现这种可操 作连接的方法是众所周知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、 操纵基因、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、聚腺苷酸化 信号、和转录或翻译控制所牵涉的其它信号。
用其中具有DNA分子的所得载体转化适宜的宿主。这种转化可以使用本 领域众所周知的方法来进行。可以使用可利用的且众所周知的多种宿主细胞 来实施本发明。具体宿主的选择取决于本领域所认识到的许多因素，包括例 如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的融合物的毒性、转化率、回 收融合物的容易性、表达特性、生物安全性和成本。这些因素的平衡必然受 到以下理解的冲击，即不是所有的宿主都能同等有效的表达特定DNA序列。 在这些一般性指导中，有用的微生物宿主包括细菌(诸如大肠杆菌)、酵母 (诸如糖酵母)和其它真菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人)细胞培养物、 和本领域已知的其它宿主。
接着，对经过转化的宿主进行培养和纯化。可以在常规发酵条件下培养 宿主细胞，使得所需化合物表达。这样的发酵条件是本领域众所周知的。最 后，通过本领域众所周知的方法从培养物中纯化融合物。在使用Fc部分作为 调控物时，一种优选的方法是使用蛋白A或类似技术来纯化融合蛋白。还可 以通过合成方法来生成调控物、蛋白质和融合物。例如，可以使用固相合成 技术。合适的技术是本领域众所周知的，包括以下文献中所记载的那些技术： Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis and Panayotis eds.)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85：2149；Davis et al.(1985)， Biochem.Intl.10：394-414；Stewart and Young(1969)，Solid Phase Peptide Synthesis；U.S.Pat.No.3,941,763；Finn et al.(1976)，The Proteins(3rd ed.)2： 105-253；Erickson et al.(1976)，The Proteins(3rd ed.)2：257-527。固相合成是 制备各个肽或蛋白质的优选技术，因为它是制备小肽或蛋白质的最省钱且有 效的方法。
一般而言，本发明的化合物具有源自其在体内降解淀粉状蛋白β肽能力 的药理学活性。这些化合物的活性可以通过本领域已知测定法来测量。对于 Nep-Fc化合物，本文实施例部分进一步详细描述了体内测定法。
一般而言，本发明还提出了使用本发明的药物组合物的可能性。这样的 药物组合物可进行注射、口服、经肺、经鼻、透皮、其它形式的施用。一般 而言，本发明涵盖包含有效量的本发明化合物及制药学可接受稀释剂、防腐 剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。这样的组合物包括稀释 剂，其具有各种缓冲容量(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度； 添加剂，诸如洗涤剂和增溶剂(例如Tween 80、Polysorbate 80)、抗氧化剂 (例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如Thimersol、苯甲醇)和填充 剂(例如乳糖、甘露醇)；将物质掺入聚合化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等 的微粒制备物或者脂质体。也可使用透明质酸，而且这可具有促进循环中持 续时程的效果。这样的组合物可影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态 (physical state)、稳定性、体内释放速率、和体内清除速率。参见例如 《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第18版(1990，Mack Publishing Co.， Easton，Pa.18042)第1435-1712页(收入本文作为参考)。组合物可以制备成 液体形式，或者可以是干粉形式，诸如冻干形式。还设想了可植入的持续释 放剂型，像透皮剂型。这些施用选项是本领域众所周知的。
用于治疗上述疾患的方法所牵涉的剂量方案将由主治医师在考虑影响 药物作用的以下各种因素后决定，例如患者的年龄、状态、体重、性别和饮 食；任何感染的严重程度；施用的时间；及其它临床因素。一般而言，日常 剂量应当在每千克体重0.1-1000微克本发明化合物、优选每千克体重0.1-150 微克本发明化合物的范围内。
实施例
实施例1：融合蛋白构建
蛋白质结构域的描述
中性溶酶的胞外结构域定义为氨基酸51-749(不包括第一个甲硫氨酸) (SEQ ID NO 1-4)。在此结构域中鉴定出两处导致氨基酸差异的多态性，不同 变体的氨基酸序列见SEQ ID NO 1-4。将中性溶酶的胞外结构域与IgG4Fc结 构域(包括铰链区)相融合。导入信号序列(SEQ ID NO 5)，从而能够在表 达过程中将蛋白质分泌到培养液中。铰链区的序列见SEQ ID NO 6，而IgG4 Fc结构域的序列见SEQ ID NO 7。整个融合蛋白(包含对应于SEQ ID NO 1 的人中性溶酶变体)见SEQ ID NO 8。最终的融合蛋白(不包括信号序列) 的预测分子量为211kDa(作为二聚体)。
融合蛋白编码基因的构建的描述
作为与IgG4Fc结构域编码基因的融合物，将中性溶酶胞外结构域编码 基因导入pGEM克隆载体。分子生物学操作以PCR为基础，使用对所包含基 因的3’末端和5’末端特异的引物。用于扩增人中性溶酶胞外结构域的正向引 物见SEQ ID NO 9，其中添加了第一个GTA序列以产生BstZ17I独特平端限制 性位点(GTATAC)，这将用于克隆信号肽。所使用的反向引物见SEQ ID NO 10，其包含与IgG4铰链序列(SEQ ID NO 11)对应的序列。这是为了生成与 IgG4的交叠区。
使用SEQ ID NO 12所示正向引物通过PCR扩增人IgG4Fc结构域。该引 物包含与人中性溶酶C端部分(SEQ ID NO 13)对应的部分以生成与中性溶 酶的交叠区。用于扩增IgG4Fc结构域(SEQ ID NO 14)的反向引物包含供 Gateway克隆之用、与ATTB2序列对应的序列及终止密码子(SEQ ID NO 15)。
使用所扩增的人中性溶酶和Fc IgG4结构域编码基因作为模板及引物 SEQ ID NO 9、10、12和14(引物SEQ ID NO 10和12具有交叠特异性)进行 的交叠PCR反应产生了与中性溶酶-Fc(Nep-Fc)融合蛋白编码基因对应的片 段(总体见图15)。
使用BstZ17I平端限制性位点，将合成DNA寡聚物连接入pGEM克隆载 体，位于中性溶酶-Fc融合蛋白编码基因的上游，由此添加鼠κ轻链信号肽。 使用正向引物扩增信号肽，该正向引物(SEQ ID NO 16)包含与ATTB1 Gateway共有序列对应的序列(SEQ ID NO 17)，接着是增强子序列、核糖体 结合位点、TATA盒、Kozak序列和起始密码子。所使用的反向引物见SEQ ID NO 18。用于导入信号序列的策略见图16。
首先将完整基因(编码Nep-Fc融合蛋白和信号序列)插入pGEM载体， 然后插入Gateway供体载体。Gateway供体载体用于将完整Nep-Fc基因导入数 种表达载体。通过使用Gateway系统，从供体载体到表达载体的转移可以高 效进行，以重组代替限制酶。所调查的哺乳动物表达载体主要是pCEP4、 pEAK10和pcDNA3.1(经过Gateway适应性修改)。所有这些载体都是基于 CMV启动子的标准哺乳动物表达载体。在所有克隆步骤后对基因进行测序以 检验DNA序列。
实施例2：Fc-Nep蛋白的表达和纯化
在哺乳动物细胞中瞬时表达Nep-Fc融合蛋白。使用了数种细胞系，包括 HEK293T和HEK293EBNA细胞。在悬浮适应细胞或贴壁细胞培养物中进行 融合蛋白的表达，并使用不同转染试剂、不同细胞密度和不同转染试剂与质 粒比例进行研究。在小规模优化实验中检验融合蛋白的活性。以蛋白A亲和 层析作为主要步骤，从培养物上清液中直接纯化Nep-Fc。在需要第二纯化步 骤时，使用例如离子交换或凝胶过滤。在适于体内使用(小鼠研究)的缓冲 液中配制最终的融合蛋白，所述缓冲液例如含有稳定剂(例如蔗糖、盐或洗 涤剂)的缓冲液。对最终经过纯化的融合蛋白分析浓度(例如A280、BCA)、 身份(例如使用中性溶酶或IgG4特异性抗体进行的Western印迹、质谱)和 纯度(例如SDS-PAGE、分析性凝胶过滤)。为了确保对信号肽的加工，通过 N端测序来分析蛋白质。将最后一批蛋白质用于体外和体内研究以检验功能。
实施例3：Nep-Fc酶活性
使用两步显色测定法对重组Nep-Fc评估中性溶酶酶活性。在第一步反应 中，戊二酸单酰基-Ala-Ala-Phe-4-甲氧基-2-萘酰胺(glutaryl-Ala-Ala-Phe-4- methoxy-2-naphthylamide)被中性溶酶切割成Phe-4-甲氧基-2-萘酰胺 (Phe-4-methoxy-2-naphthylamide)；而在第二步反应中，使用氨肽酶来生成发 荧光的4-甲氧基-2-萘胺(4-methoxy-2-naphthylamine)。将100μL反应混合物(含 有100μM戊二酸单酰基-Ala-Ala-Phe-4-甲氧基萘酰胺、50-100μg膜级分、 和20mM MES缓冲液)添加至96孔微量滴定板。在水浴中于37℃温育2小时。 在温育期结束时，通过添加磷酰二肽(phosphoramidon)来终止反应。添加亮 氨酸氨肽酶，并将混合物再温育15分钟。通过分光光度法对4-甲氧基-2-萘胺 定量，激发波长为340nM而发射波长为425nM。使用游离4-甲氧基萘胺来测 绘标准曲线。
实施例4：淀粉状蛋白β肽浓度测量
此测定法描述了淀粉状蛋白β肽的测量。此测定法基于两种检测未被蛋 白质或酶降解的淀粉状蛋白β肽的抗体。此具体实例描述了细胞上清液的使 用，但可用于各种样品，诸如纯的缓冲液或血浆。
在细胞达到80-90％汇合时收获HEKAPP。将细胞以DMEM中0.2x106/ml 的浓度接种至聚-D-赖氨酸包被的96孔板(BD，Falcon)。使用多道移液器，向 每个孔中加入100μl细胞悬浮液。将细胞板于37℃、5％CO2温育过夜。将 Nep-Fc于37℃、5％CO2温育24小时(或任何合适时间)。然后将100μl培养液 转移至圆底96孔板(Greiner，polypropylene)。添加50μl检测液(需要5ml IGEN 测定缓冲液中的0.5μg/ml RαAβ40和0.25μg/ml生物素-4G8。RαAβ40原液为 1.22mg/ml RαAβ40(Biosource 44-348)。添加2μl RαAβ40原液+5000μl IGEN 测定缓冲液。测定中的终浓度为0.125μg/ml。生物素-4G8原液为1mg/ml bio-4G8。添加1.25μl Bio-4G8原液至前述RαAβ40溶液。测定中的终浓度为 0.063μg/ml)，并于4℃温育成7小时以上。然后添加50μl Dynabead&Ru-GαR 溶液，并于22℃摇动(剧烈的)1小时。最后，以IGEN/BioVeris M8分析程 序Aβ细胞测定法读板。实施了淀粉状蛋白β肽浓度测量的一个实例，其中标 准曲线实验具有优良的相关性(R2＝0.9959)。
实施例5：淀粉状蛋白β肽的催化降解改变淀粉状蛋白β肽游离池之间的平衡
进行实验以调查通过一个区室中的降解来清除经膜相通的另一个区室 中的淀粉状蛋白β肽的可能性。使用抗体作为淀粉状蛋白β肽试剂进行类似的 实验。该实验见由DeMattos等人描述(PNAS，2001)。通过用中性溶酶和/或 NEP-Fc降解一个区室中的淀粉状蛋白β肽，另一个区室中的淀粉状蛋白β肽浓 度降低了。重要的是，中性溶酶或NEP-Fc不能穿越膜，因为它们的分子量高 (分别为161.000Da和211.000Da)。
实施例6：对Aβ1-40片段在淀粉状蛋白斑上沉积的抑制
使用如下方案，首先将淀粉状蛋白β1-40(Aβ1-40)沉积在96孔微量滴定板 上。然后向该板的各孔中添加反应性(125I标记的)Aβ1-40，它进一步添加至 所沉积的Aβ1-40。这模拟了在阿耳茨海默氏病患者的脑中看到的Aβ1-40沉积。 此实验的目标是看中性溶酶是否能将Aβ1-40降解成不再沉积到淀粉状蛋白斑 上的片段。这证明了中性溶酶能阻止阿耳茨海默氏病中淀粉状蛋白沉积物的 持续形成。
将96孔板预先用Aβ1-40包被。在对照中，将100pM 125I-Aβ1-40沉积到预先 沉积的Aβ1-40斑上达3小时。与125I-Aβ1-40一起向各孔中以500ng、50ng和5ng的 浓度添加中性溶酶达3小时。然后对各种浓度的中性溶酶检测125I-Aβ1-40沉积 的抑制。
实施例7：Aβ肽切割位点的测定
将纯化后的中性溶酶和/或Nep-Fc与25μM Aβ1-40一起在pH7.2的40mM磷 酸钾缓冲液中于37℃温育1小时。将反应产物加载到C4反相HPLC柱上并使用 65分钟的5-75％乙腈线性梯度解析产物。使用Waters 484检测仪通过214nm吸 光度来检测产物，并手动收集各个产物峰。还可以通过HPLC对产物尚未解 析的完整反应混合液进行产物分析。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质 谱法(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS)来鉴定产物。以类似方式进行中性溶酶和/或Nep-Fc与Aβ1-42 的反应，其产物通过反应混合物的直接MALDI-TOF-MS鉴定。
实施例8：Aβ1-40沉积测定法
β-淀粉状蛋白沉积测定法如Esler等人所述进行(Esler et al.(1997)Nat Biotech 15：268-263)。简言之，将96孔微量滴定板用聚集的淀粉状蛋白β1-40 (QCB/Biosource，Hopkinton，Mass.)预包被，并用200μl 50mM Tris-HCl pH7.5 中的0.1％牛血清清蛋白溶液包被20分钟以预防非特异性结合。为了测量存在 或不存在中性溶酶时的Aβ1-40沉积，将150μl 50mM Tris-HCl pH7.5中的0.1nM 125I标记的Aβ1-40溶液添加至经预包被的孔，并温育4小时。在添加时，在时间 零点直接将中性溶酶(0.5-500ng)置于孔中。通过用50mM Tris-HCl pH7.5 洗去过量的未沉积的放射性标记的Aβ1-40来终止反应。在伽马计数器中对清 洗后的孔上沉积的放射性标记物进行计数。在这个方案的一个变化的方案 中，可以将中性溶酶与1nM 125I-Aβ1-40一起预温育60分钟，然后添加至沉积测 定法。
实施例9：神经保护测定法
神经毒性测定法如Estus等人所述进行(Estus et al.(1997)J Neurosci17： 7736-7745)，其中使用胚胎期18日大鼠胚胎来建立原代大鼠皮质神经元培养 物。首先将大鼠脑皮质细胞以1x105个细胞每孔的密度在用聚乙烯亚胺预包 被的16孔腔式载玻片(Nalge Nunc International，Rochester，N.Y.)中在AM0培养 基中培养3-5小时。通过用含100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2％B27 血清补充物(Life Technologies，Rockville，Md.)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养 基(DMEM，Life Technologies，Rockville，Md.)替换AM0培养基来富集培养物 中的神经元。将细胞用Aβ肽处理，然后用4％低聚甲醛于室温固定15分钟。 将细胞用PBS清洗后，将它们用1μg/ml Hoechst 33258染色10分钟。然后通过 荧光显微术来显现神经元。将那些染色质均匀散布的细胞评为存活者，而将 那些染色质凝聚的细胞评为不活者。读数通常进行一式三份，每个孔最少对 250个神经元评分。使用配备有Hoffman调制反差镜头(modulation contrast lens) 的Nikon显微镜显现如上所述处理的细胞。使用ANOVA对样品进行统计学分 析。使用经中性溶酶或Nep-Fc预处理的Aβ肽进行相同处理。这显示了降解过 程清除了Aβ肽的毒性效果。
实施例10：
蛋白质结构域IDE、IDE Fc(IgG4)、ECE1和ECE1Fc(IgG4)的描述
IDE即胰岛素降解酶是长1018个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO 19)。IDE 的剪接变体和多态性变体已有记载。在一种剪接变体中，一个外显子被相同 大小、编码与野生型(“wt”)外显子(见SEQ ID NO 20)相似的肽序列的另一 个外显子所替换。该变体据记载在降解胰岛素和Aβ方面都不太有效。还描述 了IDE基因的数种多态性，它们导致这个结构域中所鉴定的氨基酸差异： D947N(SEQ ID NO 21)、E612K(SEQ ID NO 22)、L298F(SEQ ID NO 23)和 E408G(SEQ ID NO 24)。
ECE1即内皮缩血管肽转变酶1(见SEQ ID NO 26)的胞外结构域是长681 个氨基酸的蛋白质，定义为全长、膜结合型ECE1蛋白的氨基酸90-770。
在构建最终融合蛋白时，将IDE和ECE1(胞外结构域)与IgG4Fc结构 域(包括铰链区)融合，并在融合蛋白的N末端添加信号序列(SEQ ID NO 5)。 信号序列使蛋白质能在表达过程中分泌到培养液中。铰链区的序列见SEQ ID NO 6，而IgG4Fc结构域的序列见SEQ ID NO 7。完整IDE-Fc(IgG4)融合蛋白 (包括对应于SEQ ID NO 19的人IDE变体)见SEQ ID NO 25。最终融合蛋白 IDE-Fc(IgG4)的预测分子量为147kDa(作为单体)或294kDa(作为二聚体)。
ECE1-Fc(IgG4)融合蛋白(包括对应于SEQ ID NO 26的人ECE1变体)见 SEQ ID NO 27，预测分子量为103kDa(作为单体)或206kDa(作为二聚体)。
蛋白质结构域Nep-Fc(IgG2)的描述
以与实施例1相似的方式，将中性溶酶(SEQ ID NO 1)的胞外结构域与 IgG2Fc结构域(包括铰链区)相融合。将信号序列(SEQ ID NO 5)添加在融 合蛋白的N末端，使蛋白质能在表达过程中分泌到培养液中。IgG2铰链区的 序列见SEQ ID NO 28，而IgG2Fc结构域的序列见SEQ ID NO 29。完整 Nep-Fc(IgG2)融合蛋白(包括对应于SEQ ID NO 1的人中性溶酶变体)见SEQ ID NO 30。最终融合蛋白Nep-Fc(IgG2)的预测分子量为105.5kDa(作为单体) 或211kDa(作为二聚体)。
融合蛋白IDE-Fc(IgG4)编码基因的构建的描述
通过PCR(寡核苷酸SEQ ID NO 31和SEQ ID NO 32)自人骨骼肌cDNA (Clontech cat#637234)扩增编码人IDE的基因，并克隆到pGEM-T克隆载体中。 然后通过PCR(寡核苷酸SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 34)在IDE的5’端导入 人κ轻链信号序列，并将产物克隆到pGEM-T载体中。类似的，通过PCR(寡 核苷酸SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36)从内部用质粒(in-house plasmid) (Nep-IgG4，见实施例1)扩增人IgG4Fc结构域，并克隆到pGEM-T中。IDE 基因的最后一个密码子与IgG4铰链区的第一个密码子构成独特的XhoI位点。 将此位点用于将IgG4转移至pGEM-T-IDE质粒并生成融合构建物。进行第二 PCR，在融合基因的两个末端都添加attB位点(寡核苷酸SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38)。通过Gateway BP重组将PCR产物导入pDONR221。检验所得克隆 的序列，并用于通过Gateway LR重组将融合基因转移至pCEP4/GW和 pEAK 10/GW表达载体。
融合蛋白ECE1-Fc (IgG4)编码基因的构建的描述
使用在5’端导入人κ轻链信号序列和在3’端导入独特EcoRI位点的寡核苷 酸(寡核苷酸SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 40)通过PCR自内部用(in house) cDNA源(质粒DNA)扩增编码人ECE1的基因。类似的，通过PCR自质粒DNA 扩增人IgG4Fc结构域，但在5’端导入EcoRI位点(寡核苷酸SEQ ID NO 41和 SEQ ID NO 36)。将ECE1和IgG4分别克隆到pGEM-T载体中。利用EcoRI位 点将IgG4转移至pGEM-T-ECE1质粒，生成融合构建物。然后，通过定点诱 变(寡核苷酸SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 43)来再生原始序列并删除EcoRI 位点。进行PCR，在融合基因的两个末端都添加attB重组位点(寡核苷酸SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38)。通过Gateway BP重组将PCR产物导入 pDONR221。检验所得克隆的序列，并用于将融合基因转移至pCEP4/GW和 pEAK10/GW表达载体。
融合蛋白Nep-Fc(IgG2)编码基因的构建的描述
通过融合2个交叠PCR片段，生成编码融合蛋白Nep-Fc(IgG2)的基因。 第一个片段对应于中性溶酶的可溶性结构域，自单位内部质粒 (pGEM-NEP-IgG4，见实施例1)扩增，所使用的正向引物对应于Gateway attB1共有序列(寡核苷酸SEQ ID NO 44)以在中性溶酶的5’端包含κ轻链信 号肽，而所使用的反向引物(寡核苷酸SEQ ID NO 45)包含中性溶酶编码区 的末端(不含终止密码子)，接着是对应于人IgG2铰链区的序列以生成与第 二个片段的交叠区。第二个片段对应于人IgG2的铰链区和Fc结构域，扩增所 使用的寡核苷酸在5’端包含中性溶酶的最后25个编码核苷酸(以生成与第一 个片段的交叠区)，在3’端包含attB2共有序列(SEQ C和D)。将寡核苷酸SEQ ID NO 46和寡核苷酸SEQ ID NO 47用于最后的交叠PCR，然后通过Gateway BP重组将片段导入pDONR221。检验所得克隆的序列，并用于通过Gateway LR重组将融合基因转移至pCEP4/GW和pEAK10/GW表达载体。
中性溶酶编码基因的构建的描述
自内部用质粒(in-house plasmid)(pGEM-NEP-IgG4，见实施例1)扩增 编码中性溶酶可溶性结构域的基因，正向寡核苷酸对应于attB1共有序列(寡 核苷酸SEQ ID NO 48)以包含κ轻链信号肽，而反向引物在3’末端导入终止 密码子(TGA)和attB2共有序列(寡核苷酸SEQ ID NO 49)。然后通过Gateway BP重组将所述片段导入pDONR221。检验所得克隆的序列，并用于通过 Gateway LR重组将融合基因转移至pCEP4/GW和pEAK10/GW表达载体。
实施例11：中性溶酶胞外结构域及融合蛋白Nep-Fc(IgG4)、Nep-Fc(IgG2)和 IDE-Fc(IgG4)的表达
在适应了悬浮培养的哺乳动物中瞬时表达蛋白质中性溶酶(只有胞外结 构域)、Nep-Fc(IgG4)、Nep-Fc(IgG2)和IDE-Fc(IgG4)。生产实验中所使用的 细胞系是衍生自HEK293的细胞系，包括HEK293S、HEK293S-T和 HEK293S-EBNA细胞。测试了用编码目的蛋白的质粒pCEP4和PEAK10进行 的表达。以大约0.5-1x106的细胞密度用浓度范围0.3-0.8μg/ml细胞悬浮液(终 浓度)的质粒DNA进行转染。所测试的转染试剂是2μg/ml细胞悬浮液(终浓 度)的聚乙烯亚胺(Polyscience)和1μl/ml细胞悬浮液(终浓度)的RO1539 (Roche)。在200ml摇瓶(用于蛋白质Nep-Fc(IgG4)和IDE-Fc(IgG4))、400ml 转瓶(用于蛋白质中性溶酶和Nep-Fc(IgG2))、1L生物反应器(用于融合蛋 白Nep-Fc(IgG4))、5L生物反应器(用于蛋白质中性溶酶)和10L生物反应器 (用于融合蛋白Nep-Fc(IgG4))的细胞培养物中进行表达。为了监测表达， 在不同的天数自培养物上清液采集样品并分析细胞密度、细胞生存力、蛋白 质表达和酶活性。7或10天后通过离心收获细胞培养物，并将细胞培养液用 于蛋白质纯化实验。来自生产中性溶酶的5升生物反应器的培养液的活性分 析结果见图17。转染试剂与质粒浓度的所有组合都是成功的，得到了不同水 平的产量，通常在2-3mg/L范围内。
实施例12：中性溶酶的无血清表达
在适应了悬浮培养的哺乳动物细胞(293-F和HEK293S-EBNA)中在无 血清条件下用表达载体pCEP4-Nep瞬时表达中性溶酶胞外结构域。
以大约0.5-1x106的细胞密度用浓度范围0.3-0.8μg/ml细胞悬浮液(终浓 度)的DNA进行转染。所使用的转染试剂是1.3μl/ml细胞悬浮液(终浓度) 的293fectin(InVitrogen)、2μg/ml细胞悬浮液(终浓度)的聚乙烯亚胺 (Polyscience)和1μl/ml细胞悬浮液(终浓度)的RO1539(Roche)。在200ml规 模(摇瓶)中进行实验。
为了监测表达和细胞生长，在不同的天数采集样品并分析细胞密度、细 胞生存力、蛋白质表达和酶活性。7天后通过离心收获细胞培养物，并将含 所表达蛋白质的细胞培养液用于蛋白质纯化实验。
表达水平通常在1-2mg/L范围内，只有用RO1539转染的培养物的表达低 于检测水平或很低(＜0.5mg/L)。
实施例13：通过固相提取来纯化所表达的中性溶酶蛋白质
直接从培养物上清液中亲和纯化中性溶酶。使用与链霉亲合素sepharose (GE Healthcare)结合的生物素化抗中性溶酶抗体(R&D Systems)来纯化可溶 性中性溶酶。将14μg生物素化抗中性溶酶抗体(R&D systems)添加至140μl链 霉亲合素sepharose浆(GE Healthcare)，并在温和搅动中于室温温育2小时。将 sepharose清洗两次并重悬于140μl PBS。将结合有抗中性溶酶抗体的sepharose 浆添加至10ml培养物上清液，并将样品于4℃温育5小时。温育后，将sepharose 用PBS清洗一次，并重悬于1200μl 50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl。将 600μl浆用于活性测量，另将600μl浆沉淀，重悬于60μl 0.1M柠檬酸盐 pH3.2，并于室温温育10分钟。将sepharose沉淀，并通过280nm吸光度测量上 清液中纯化后蛋白质的浓度。纯化后蛋白质的活性见图18。还依照上文所述 进行中性溶酶的纯化，但添加200μM ZnCl2。添加了锌与未添加锌的样品之 间没有活性差异。图中的差异依赖于浓度测量的不确定性。
实施例14：通过固相提取来纯化所表达的IDE-Fc蛋白质
使用蛋白A sepharose(GE Healthcare)来纯化IDE-Fc。将100μl蛋白A sepharose添加至50ml细胞上清液，并于4℃温育过夜。温育后，将sepharose 用PBS清洗一次，并重悬于1200μl 50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl。将 600μl浆用于活性测量，另将600μl浆沉淀，重悬于60μl 0.1M柠檬酸盐 pH3.2，并于室温温育10分钟。将sepharose沉淀，并通过280nm吸光度测量上 清液中纯化后蛋白质的浓度。
实施例15：通过亲和层析和低pH洗脱来纯化所表达的Fc融合蛋白
使用来自哺乳动物细胞表达的细胞培养液进行融合蛋白纯化。纯化通过 亲和层析(蛋白A)接着低pH洗脱来进行，且在层析系统(GE Healthcare)上进行。将XK16柱(GE Healthcare)中大约2ml重组蛋白A Sepharose FF(GE Healthcare)用20ml PBS(2.7mM KCl、138mM NaCl、1.5mM KH2PO4、 8mM Na2HPO4-7H2O，pH 6.7-7.0，自10倍原液制备，Invitrogen)平衡。将50ml 含所表达融合蛋白(Nep-Fc(IgG2)、Nep-Fc(IgG4)或IDE-Fc(IgG4))的细胞培 养液以1ml/min施加到柱上。将柱用50ml PBS清洗，然后用洗脱缓冲液(0.1M 柠檬酸pH3.2)洗脱所结合的蛋白质。通过添加200μl 1M Tris碱至1ml洗脱的 蛋白质，立即中和纯化后的级分。合并纯化后的级分，并使用离心滤器 (Amicon，Mw截留值5kDa)将所合并蛋白质的缓冲液换成50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl。在SDS-PAGE上分析纯化后的蛋白质，发现纯度为大 约90％。纯化后的与Fc部分融合的中性溶酶蛋白质的一个例子见图19。
实施例16：通过高盐洗脱来纯化Nep-Fc(IgG2)、Nep-Fc(IgG4)和IDE-Fc(IgG4) 蛋白质
使用来自哺乳动物细胞表达的细胞培养液进行所表达融合蛋白的纯化。 纯化基本上如文献Dwyer et al 1999所述进行。将1ml HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare)用20ml结合缓冲液(25mM Hepes pH7.2、1mM CaCl2)平衡，然后 将50ml含所表达Nep-Fc(IgG2)、Nep-Fc(IgG4)或IDE-Fc(IgG4)的细胞培养液施 加到柱上。流速为大约1ml/min。将柱用50ml结合缓冲液清洗，然后用水中 的3.5M MgCl2洗脱所结合的蛋白质。洗脱是时间依赖性的，并将柱在每个柱 体积的洗脱缓冲液之间温育大约15分钟。合并纯化后的级分，并使用离心滤 器(Amicon，Mw截留值5kDa)将所合并蛋白质的缓冲液换成50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl。在SDS-PAGE上分析纯化后的蛋白质，发现纯度为大 约80％。
实施例17：中性溶酶、Nep-Fc(IgG4)和Nep-Fc(IgG2)表达的Western印迹分 析
通过Western印迹分析来自哺乳动物细胞表达的细胞培养液。
将15μl细胞培养液用含额外甘油(5％，终浓度)和DTT(10％，终浓度) 的4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)稀释。将样品加热至75℃达10分钟，并施加 到SDS-PAGE凝胶(4-12％梯度凝胶，10个孔(1mm)，Invitrogen)上。使用 MES缓冲液作为电泳缓冲液。使用市售中性溶酶(R&D Systems)作为阳性对 照(将大约0.7μg加载到凝胶上)。将凝胶于200V电泳30分钟。
电印迹于30V进行1小时，将蛋白质转移至PVDF膜。将膜在TBST(TBS (20mM Tris、500mM NaCl pH7.5，BioRad)加0.05％Tween-20)中封闭过夜， 然后将它们在15ml TBST中与45μl一抗(生物素化抗中性溶酶(Anti-Nep) (R&D Systems))一起温育。将膜于室温温育1小时，并用TBST清洗3次，再 与偶联有HRP的链霉亲合素(GE Healthcare，1∶10000稀释(15ml TBST中 添加1.5μl))一起温育1小时。将膜用TBST清洗3次，用水清洗3次，然后用 ECL plus试剂(GE Healthcare)和ECL胶片(GE Healthcare)显现条带。典型结果 见图19。
实施例18：中性溶酶酶活性FRET测定法
通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)测 定法来测定中性溶酶酶活性。将重组人中性溶酶(R&D Systems)、来自中性 溶酶/Nep-Fc生产细胞(AZ)的培养液或纯化后的中性溶酶/Nep-Fc 添加到含有荧光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(Dnp)-OH (R&D Systems)(SEQ ID NO 52)的96孔板中。对照重组人中性溶酶的终浓度 为0.25μg/ml(及不同浓度的多种中性溶酶构建物)，而肽底物的终浓度为 10μM。将10μM中性溶酶抑制剂磷酰二肽(BIOMOL)添加到有些孔中，以作 为测定信号特异性的对照并检验特异性中性溶酶活性。将所有成分添加到孔 中后，立即将板置于荧光读板仪(Ascent)中，记录每分钟的信号达20分钟， 激发波长为340nm而发射波长为405nm。通过计算反应速率(斜率(slope coefficient)＝∑ΔRFU/Δt)来评估酶的活性。将此斜率用于各种中性溶酶构 建物和产量之间的精确比较，并与中性溶酶的对照样品进行比较。
实施例19：豚鼠血浆中中性溶酶对淀粉状蛋白β肽1-40和淀粉状蛋白β肽1-42的 降解
使用来自体重250-300g的雄性Dunkin Hartley豚鼠(ka)的肝 素化血浆研究了中性溶酶对淀粉状蛋白β肽1-40(Aβ40)和淀粉状蛋白β肽 1-42(Aβ42)的降解。通过心脏穿刺自麻醉后的豚鼠采集血液。将血液收集到预 冷的肝素-血浆管中，并在采样后20分钟内于4℃以3000xg离心10分钟。将血 浆样品转移至预冷的聚丙烯管，并立即在干冰上冷冻，使用前保存于-70℃。 对来自5-6只豚鼠的血浆合并液进行实验。
将含25mM Tris和100mM NaCl pH8的缓冲液中的人重组中性溶酶(R&D Systems)或仅有缓冲液(即媒介物)与豚鼠血浆一起在存在或不存在10μM磷 酰二肽(Biomol)的条件下于37℃温育0-360分钟。将终浓度4.7mM的EDTA添 加到管中，然后使用购自Biosource(用于Aβ1-40)或Innogenetics(用于Aβ1-42) 的市售ELISA试剂盒分析Aβ1-40或Aβ1-42的量。
中性溶酶以时间依赖性方式降解Aβ1-40和Aβ1-42(见图20和图21)。中性 溶酶以剂量依赖性方式降解Aβ1-40(见图22)。Aβ40的降解受到添加10μM磷酰 二肽(phosphoramidon)的抑制(见图23)。
实施例20：可溶性中性溶酶对淀粉状蛋白β肽的降解
此实验的目标是证明中性溶酶能够降解淀粉状蛋白β1-40肽。测定法是在 存在中性溶酶(R&D Systems)且存在或不存在中性溶酶抑制剂的条件下温育 后测量剩余淀粉状蛋白β1-40肽(Bachem)浓度。将100μl含淀粉状蛋白β1-40肽(终 浓度为1或10μM)和/或中性溶酶(1.8μg/ml)和/或磷酰二肽(10μM)的反 应混合物在圆底96孔聚丙烯板中于37℃温育3小时。温育后，将50μl含抗Aβ40 (终浓度0.125μg/ml；Biosource)和生物素化6E10(终浓度0.125μg/ml；Signet) 抗体的抗体溶液添加到每个孔中。将板于室温温育3小时。温育后，将 50μlDynabeads M280(Dynal Biotech ASA)和二抗Ru-GαR(终浓度 0.132μg/ml)的检测混合液添加到每个孔中。将板在摇床上于室温温育1小时， 并在IGEN/BioVeris M8分析仪上记录结果。根据存在中性溶酶的条件下温育 后剩余的淀粉状蛋白β1-40肽与不存在中性溶酶的条件下的淀粉状蛋白β1-40肽 浓度相比的百分比来计算中性溶酶对淀粉状蛋白β1-40肽的降解。
浓度为1.8μg/ml的重组人中性溶酶在于37℃温育3小时后降解88％的淀 粉状蛋白β1-40肽(1nM)。此中性溶酶活性在存在10μM磷酰二肽时遭到完全 消除(见图24)。此实施例显示了中性溶酶有效降解淀粉状蛋白β肽，而且在 较低Aβ肽浓度甚至有趋向更高效率的趋势。
实施例21：细胞培养物上清液中中性溶酶浓度的测量
使用GyrosTM BioaffyTM CD微量实验室方法和Gyrolab Workstation LIF设 备(Gyros AB，Sweden)测量细胞培养物上清液中的中性溶酶浓度。此实验的 目标是鉴定生产中性溶酶的最佳条件。将来自不同细胞培养物的样品用样品 稀释剂(Gyros AB)1∶10稀释，并置于Thermo-96孔PCR板(Abgene，UK) 中。将单克隆小鼠生物素化抗人中性溶酶抗体(Serotec)用作捕捉剂(终浓度 0.05mg/ml)，而将用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes)标记的多克隆山羊 抗人中性溶酶抗体(R&D Systems)用作检测抗体(终浓度100nM)。使用市售 中性溶酶(R&D Systems)作为标准品，浓度范围为31.6nM到2000nM，从而测 绘标准曲线。将标准品、捕捉抗体和检测抗体置于另一个Thermo-96 孔PCR板(Abgene)中。将这两块板及Gyrolab Bioaffy TM 1CD置于Gyrolab Workstation LIF设备中，并依照制造商的方案使用Gyrolab BioaffyTM软件包 1.8板(Gyros AB)进行浓度测量。此测定法还可用于经过纯化或部分纯化的中 性溶酶或中性溶酶融合构建物。
实施例22：豚鼠血浆中单位内部生产的Nep/Fc-Nep对淀粉状蛋白β肽1-40和淀 粉状蛋白β肽1-42的降解(体内研究)
实验规程
用豚鼠进行体内研究以测试单位内部生产的Nep/Fc-Nep对血浆可溶性 Aβ水平的影响。使用γ-分泌酶抑制剂ZR-M550426(M550426)作为参照(降 低血浆Aβ水平的阳性对照)。
将豚鼠称重，并静脉内施用适当的剂量。在相同时间点观察动物的健康 状况。在0小时、3小时和24小时后(只有Fc-Nep)分别处死6只动物。用异 氟烷麻醉动物，并通过心脏穿刺采集血样。为了得到关于血样的信息，操作 并分析可溶性Aβ1-40或Aβ1-42(见实施例19)。对所有血浆样品进行药动学研 究以测定药物暴露情况(见实施例23)。
单位内部生产的中性溶酶的研究设计
动物             雄性Dunkin Hartley豚鼠，250-300g
剂量             施用的蛋白质剂量使3小时后的血浆浓度达到0、20、200
                 μg/ml(通过药动学研究来测定)
施用路径和频率   静脉内，单剂
时间点           3小时
每组动物数目     6只(3只用于空白，3只用于参照)
组数             5组
动物总数         24只
伦理批准号       S58-04
读数             通过ELISA测定血浆中的可溶性Aβ40/42(见实施例19)及
                 药物浓度(见实施例23)
单位内部生产的Fc-Nep的研究设计
动物              雄性Dunkin Hartley豚鼠，250-300g
剂量              施用的蛋白质剂量使3小时和24小时后的血浆浓度达到0、
                  20、200μg/ml
施用路径和频率    静脉内，单剂
时间点            3小时、24小时
每组动物数目      6只(3只用于空白，3只用于参照)
组数              8组
动物总数          42只
伦理批准号        S58-04
读数              通过ELISA测定血浆中的可溶性Aβ40/42及药物浓度
实施例23：Nep-Fc和单独的中性溶酶的药动学
对Nep-Fc融合蛋白进行研发以改进中性溶酶的药动学特性，具体目标是 降低清除和延长半衰期。为了测试，如下所述，给6只豚鼠分别静脉内施用 单剂Nep-Fc(3只豚鼠)或中性溶酶(3只豚鼠)。在适应动物单位后，在每 只动物中插入2根导管：一根插入颈动脉，一根插入颈静脉。自手术中恢复 后，通常短于一周，临给药前自插入颈静脉的导管采集基线样品。经插入颈 动脉的导管给予一剂1mg/kg活性化合物。在给药后1、2、3、4、6、8、24、 48、72、96、168、216、264和336小时经插入颈静脉的导管采集150μl血样。 将血样收集到装有抗凝血剂的管中后，将等分试样置于冰上。通过将样品离 心15分钟来制备血浆(通常是1500g 4℃10min)，并立即冷冻。如实施例21 所述使用捕捉抗体和检测抗体通过免疫测定法测定Nep-Fc和中性溶酶的血 浆浓度，或者采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)。使用软件包(WinNonlin， Pharsight Corporation，USA)计算药动学参数。
实施例24：IDE-Fc纯化和通过FRET测定法测定的酶活性
使用蛋白A sepharose(GE Healthcare)来纯化IDE-Fc。将100μl蛋白A sepharose添加至50ml细胞上清液，并于4℃温育6小时。温育后，将sepharose 用PBS清洗一次，并重悬于1200μl 50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl。将 600μl用于活性测量，另将600μl沉淀，重悬于60μl 0.1M柠檬酸盐pH3.2， 并于室温温育10分钟。将sepharose沉淀，并通过280nm吸光度测量上清液中 纯化后蛋白质的浓度。通过SDS-PAGE和Western印迹来分析上清液。将15μl 细胞培养液用含额外甘油(5％，终浓度)和DTT(10％，终浓度)的4x LDS 样品缓冲液(Invitrogen)稀释。将样品加热至75℃达10分钟，并施加到 SDS-PAGE凝胶(4-12％梯度凝胶，12个孔(1mm)，Invitrogen)上。使用 MES缓冲液作为电泳缓冲液。使用市售IDE(R&D Systems)作为阳性对照(将 0.1μg加载到凝胶上)。将凝胶于200V电泳35分钟。将SDS-PAGE用SyproRuby 染色剂(Molecular Probes)染色过夜，并在50％甲醇、7％乙酸中固定30分钟。
电印迹于15V进行20分钟，将蛋白质转移至PVDF膜。将膜在溶于PBS加 0.05％Tween-20(PBST)的5％脱脂奶粉(BioRad)中封闭过夜，然后将它们在 10ml TBST中与0.2μg/ml一抗(抗IDE(R&D Systems))一起温育。将膜于室 温温育2小时，并用PBST清洗3次，再与偶联有HRP的抗山羊抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)一起温育1小时。将膜用PB ST清洗3次，然后用 ECL plus试剂(GE Healthcare)和ECL胶片(GE Healthcare)显现条带。纯化后的 IDE-Fc的SDS-PAGE和Western印迹见图25。
通过荧光共振能量转移(FRET)测定法来评估IDE酶活性。将60μl重组人 IDE(R&D Systems)或经过sepharose纯化的来自IDE-Fc生产细胞的培养液(用 HEPES缓冲液1∶2稀释)(AZ)添加到装有30μl荧光肽底物V- Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(Dnp)-OH(R&D Systems)(SEQ ID NO 52)的96孔板中。重组人IDE的终浓度为0.1μg/ml，而底物的终浓度为10μM。 将10μl(1mM)IDE抑制剂菲咯啉(phenanthroline)(Sigma-Aldrich)添加到有些 孔中，以作为信号特异性的对照。将所有成分添加到孔中后，立即将板置于 荧光读板仪(Ascent)中，并记录每分钟的信号达20分钟，激发波长为340nm 而发射波长为405nm。通过计算反应速率(斜率＝∑ΔRFU/Δt)来评估酶的 活性。纯化后的IDE-Fc的酶活性数据见图26。
实施例25：IDE和ECE的多态性变体
IDE即胰岛素降解酶是长1018个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO 19)。IDE 的剪接变体和多态性变体已有记载。在一种剪接变体中，一个外显子(15a) 被相同大小、编码与15a外显子相似的肽序列的另一个外显子(15b)所替换(剪 接变体(15b)描述于SEQ ID NO 20)。该变体据记载在降解胰岛素和Aβ方面都 不太有效。还描述了IDE基因的数种多态性，它们导致这个结构域中所鉴定 的氨基酸差异：D947N、E612K、L298F和E408G。这些多态性的所有组合都 是可能的。
ECE1即内皮缩血管肽转变酶1(endothelin-converting enzyme)(见SEQ ID NO 26)的胞外结构域是长681个氨基酸的蛋白质，定义为全长、膜结合型 ECE1蛋白的氨基酸90-770。ECE1基因包含数种可能的多态性，它们导致氨 基酸差异：R665C、W541R、L494Q和T252I。这些多态性的所有组合也都是 可能的。
序列表
SEQ ID NO 1
1型中性溶酶胞外结构域的氨基酸序列：
YDDGICKS SDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSS
RYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRG
GEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLIN
LFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISV
ARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNK
MTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLT
KLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTS
ETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFI
QTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELN
YKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRN
QIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGD
LVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNF SWDLAGGQHLNGINTLGENIA
DNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTY
RPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRV
W
SEQ ID NO 2
2型中性溶酶胞外结构域的氨基酸序列：
YDDGICKS SDCIKSAARLIQNMDATTEPCRDFFKYACGGWLKRNVIPETSS
RYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRG
GEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLIN
LFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISV
ARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNK
MTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLT
KLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTS
ETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFI
QTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELN
YKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRN
QIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGD
LVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIA
DNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTY
RPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEF SEAFHCRKNSYMNPEKKCRV
W
SEQ ID NO 3
3型中性溶酶胞外结构域的氨基酸序列：
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSS
RYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRG
GEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLIN
LFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISV
ARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNK
MRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLT
KLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTS
ETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFI
QTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELN
YKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRN
QIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGD
LVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIA
DNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNEAQVWCGTY
RPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRV
W
SEQ ID NO 4
4型中性溶酶胞外结构域的氨基酸序列：
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCRDFFKYACGGWLKRNVIPETSS
RYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRG
GEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLIN
LFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISV
ARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNK
MRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLT
KLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTS
ETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFI
QTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELN
YKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRN
QIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGD
LVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIA
DNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTY
RPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEF SEAFHCRKNSYMNPEKKCRV
W
SEQ ID NO 5
信号序列的氨基酸序列：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
SEQ ID NO 6
铰链区(来自IgG4)的氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCP
SEQ ID NO 7
Fc结构域(来自IgG4)的氨基酸序列：
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH
EALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO 8
完整融合蛋白的氨基酸序列：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPC
TDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIV
AVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGAS
WTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDY
YECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEK
EIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIM
STVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSS
LSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEA
AFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERI
GYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKV
DKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGM
VIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGN
FSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPG
LDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDV
HSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWESKYGPPCPSCP
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH
EALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO 9
用于克隆人中性溶酶的正向引物的核酸序列：
GTATACGATGATGGTATTTGC
SEQ ID NO 10
用于克隆人中性溶酶的反向引物的核酸序列：
GGCATGGGGGACCATATTTGGACTCCCAAACCCGGCACTTCTTTTC
SEQ ID NO 11
SEQ ID 10中与Fc IgG4交叠的区域的核酸序列：
GGCATGGGGGACCATATTTGGACTC
SEQ ID NO 12
用于从hIgG4中克隆Fc和铰链的正向引物的核酸序列：
TCCAGAAAAGAAGTGCCGGGTTTGGGAGTCCAAATATGGTCCCCCATG
SEQ ID NO 13
SEQ ID 12中与人中性溶酶交叠的区域的核酸序列：
TCCAGAAAAGAAGTGCCGGGTTTGG
SEQ ID NO 14
用于从hIgG4中克隆Fc和铰链的反向引物的核酸序列：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTACCCAGAGACAG
GGAG
SEQ ID NO 15
SEQ ID 14中gateway序列和终止密码子的核酸序列
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCA
SEQ ID NO 16
用于克隆鼠κ轻链信号肽的正向引物的核酸序列：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTTTAACTTTAAGAAGGA
GATATAACCATGGAGACAGACACACTCCT
SEQ ID NO 17
SEQ ID 16中gateway序列的核酸序列：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTTTAACTTTAAGAAGGA
GATATAACCATG
SEQ ID NO 18
用于克隆鼠κ轻链信号肽的反向引物的核酸序列：
GTCACCAGTGGAACCTGGAAC
SEQ ID NO 19
IDE蛋白，变体1：
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRI
GNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPP
NIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYF
DVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWR
LFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYS
SNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ
LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKS
KGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLR
AEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTA
EYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQ
EAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDT
VMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDS
LNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEI
DEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEA
LDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAH
TKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTS
ENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPP
HYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKY
WGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVH
VLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV
KPHINFMAAKL
SEQ ID NO 20
IDE蛋白，变体2(剪接变体)：
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRI
GNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPP
NIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYF
DVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWR
LFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYS
SNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ
LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKS
KGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLR
AEGPQGWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTA
EYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQ
EAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDT
AMSKLWFKQDDKFFLPKACLNFEFFSRYIYADPLHCNMTYLFIRLLKDDL
KEYTYAARLSGLSYGIASGMNAILLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEID
EKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEAL
DDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHT
KPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSE
NMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQGLRFIIQSEKPPH
YLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKY
WGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVH
VLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV
KPHINFMAAKL
SEQ ID NO 21
IDE蛋白，变体3，D947N(以下划线标示多态性)：
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRI
GNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPP
NIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYF
DVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWR
LFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYS
SNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ
LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKS
KGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLR
AEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTA
EYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQ
EAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDT
VMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDS
LNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEI
DEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEA
LDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAH
TKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTS
ENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPP
HYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKY
WGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVNAPRRHKVSVH
VLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV
KPHINFMAAKL
SEQ ID NO 22
IDE蛋白，变体4，多态性E612K(以下划线标示多态性)：
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRI
GNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPP
NIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYF
DVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWR
LFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYS
SNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ
LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKS
KGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLR
AEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTA
EYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQ
EAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDT
VMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDS
LNEYAYAAKLAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFE
IDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKE
ALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHA
HTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQST
SENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPP
HYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKY
WGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVH
VLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV
KPHINFMAAKL
SEQ ID NO 23
IDE蛋白，变体5，多态性L298F(以下划线标示多态性)：
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRI
GNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPP
NIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYF
DVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWR
LFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYS
SNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHFKQ
LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKS
KGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLR
AEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTA
EYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQ
EAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDT
VMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDS
LNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEI
DEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEA
LDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAH
TKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTS
ENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPP
HYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKY
WGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVH
VLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV
KPHINFMAAKL
SEQ ID NO 24
IDE蛋白，变体6，多态性E408G(以下划线标示多态性)：
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRI
GNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPP
NIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYF
DVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWR
LFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYS
SNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ
LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKS
KGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLR
AEGPQGWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTA
EYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQ
EAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDT
VMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDS
LNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEI
DEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEA
LDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAH
TKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTS
ENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPP
HYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKY
WGEIISQQYNFDRDNTEVYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVH
VLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV
KPHINFMAAKL
SEQ ID NO 25
IDE-Fc(IgG4)融合蛋白(包括信号序列)的氨基酸序列(IDE变体见SEQ ID NO 19)：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPER
LCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSD
PTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFL
SEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDR
EVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRP
NQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVEN
KNVPLPEFPEHPFQEEHLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGH
YLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEE
GLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRG
YTSKIAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKS
FEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPT
NFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAY
VDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKG
YNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMY
YLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITK
QAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNE
VHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSG
PRRANGIQSLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQA
LAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKF
YKEMLAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQ
PEVIQNMTEFKRGLPLFPLVKPHINFMAAKLESKYGPPCPSCPAPEFLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK
SEQ ID NO 26
ECE1蛋白的氨基酸序列：
QYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGWIKANPVP
DGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNET
RIEELRAKPLMELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSV
YVSADSKNSNSNVIQVDQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQL
GKLLGGGDEEAIRPQMQQILDFETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAEL
QTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIVVYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNN
YMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKFMEVMYGTKKTCLPRWKFCVSDTE
NNLGFALGPMFVKATFAEDSKSIATEIILEIKKAFEESLSTLKWMDEETRKS
AKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPDLYFENAMRFFNFS
WRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGILQAPFYTR
SSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEAF
KRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGENIADNGGLKAAYRAYQNW
VKKNGAEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSR
FRVIGSLSNSKEFSEHFRCPPGSPMNPPHKCEVW
SEQ ID NO 27
ECE1-Fc(IgG4)融合蛋白(包括信号序列)的氨基酸序列：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPT
VDPCHDFFSYACGGWIKANPVPDGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENST
ASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEELRAKPLMELIERLGGWNITGPWAK
DNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNSNSNVIQVDQSGLGLPSRDY
YLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQMQQILDFETALAN
ITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIVV
YDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKFME
VMYGTKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKSIATEIILE
IKKAFEESLSTLKWMDEETRKSAKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVF
NDYTAVPDLYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAY
YSPTKNEIVFPAGILQAPFYTRSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGRE
YDKDGNLRPWWKNSSVEAFKRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLG
ENIADNGGLKAAYRAYQNWVKKNGAEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVW
CSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKEFSEHFRCPPGSPMNPPHKC
EVWESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS
RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO 28
IgG2的铰链区：
ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO 29
IgG2 Fc结构域的氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK
CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC
KVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 30
Nep-Fc(IgG2)融合蛋白(包括信号序列)的氨基酸序列：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPC
TDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIV
AVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGAS
WTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDY
YECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEK
EIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIM
STVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSS
LSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEA
AFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERI
GYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKV
DKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGM
VIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGN
FSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPG
LDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAE
FSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF
NSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP
QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK
SEQ ID NO 31
ATGCGGTACCGGCTAGCGTGGCT
SEQ ID NO 32
TCAGAGTTTTGCAGCCATGAAGTTA
SEQ ID NO 33
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA
GGTTCCACTGGTGACCGGTACCGGCTAGCGTGGCTTCT
SEQ ID NO 34
AATACCGGTTCTAGACTCGAGTTTTGCAGCCATGAAGTTAAT
SEQ ID NO 35
ATTCTCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATG
SEQ ID NO 36
AATACCGGTTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG
SEQ ID NO 37
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTATAACCATGGAGACAG
ACACACTCCTGC
SEQ ID NO 38
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTACCCAGAGACAG
GGAGAG
SEQ ID NO 39
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA
GGTTCCACTGGTGACCAGTACCAGACAAGATCCCCC
SEQ ID NO 40
AATACCGGTTCTAGAGAATTCGCACTTGTGAGGCGGGTT
SEQ ID NO 41
GCGAATTCTGGGAGTCCAAATATGGTCCCCCATG
SEQ ID NO 42
CCTCACAAGTGCGAAGTCTGGGAGTCCAAATATG
SEQ ID NO 43
CATATTTGGACTCCCAGACTTCGCACTTGTGAGG
SEQ ID NO 44
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC
SEQ ID NO 45
GGCACTCGACACAACATTTGCGCTCCCAAACCCGGCACTTCTTTTC
SEQ ID NO 46
TCCAGAAAAGAAGTGCCGGGTTTGGGAGCGCAAATGTTGTGTCGA
SEQ ID NO 47
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTACCCGGAGACAG
GGAGAGGCTCTTC
SEQ ID NO 48
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC
SEQ ID NO 49
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACCAAACCCGGCACT
TCTTTTC
SEQ ID NO 50
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe
Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly
Val Val Ile Ala Thr
SEQ ID NO 51
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe
Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly
Val Val Ile Ile Ala
SEQ ID NO 52
Arg Pro Gly Phe Ser Ala Phe Lys
序列表
<110>阿斯利康(瑞典)有限公司(Astrazeneca AB)
<120>具有受调控的血浆半衰期的融合蛋白
<130>102030-1 WO
<160>52
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>699
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala Ala
1               5                   10                  15
Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Thr Asp Phe
            20                  25                  30
Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro Glu
        35                  40                  45
Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu
    50                  55                  60
Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile Val
65                  70                  75                  80
Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu Ser
                85                  90                  95
Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro Asp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys Tyr
    130                 135                 140
Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys Asn
145                 150                 155                 160
Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro
                165                 170                 175
Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr
            180                 185                 190
Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu
        195                 200                 205
Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn Lys
    210                 215                 220
Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro Glu
225                 230                 235                 240
Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu Ala Gln
                245                 250                 255
Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp
            260                 265                 270
Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr
        275                 280                 285
Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu
    290                 295                 300
Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met
305                 310                 315                 320
Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr
                325                 330                 335
Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser
            340                 345                 350
Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met
        355                 360                 365
Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu
    370                 375                 380
Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Ar gGlu Val Phe
385                 390                 395                 400
Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys
                405                 410                 415
Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro
            420                 425                 430
Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu
        435                 440                 445
Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu
    450                 455                 460
Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp
465                 470                 475                 480
Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser
                485                 490                 495
Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro
            500                 505                 510
Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly
        515                 520                 525
Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg
    530                 535                 540
Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser
545                 550                 555                 560
Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly
                565                 570                 575
Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn
            580                 585                 590
Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr
        595                 600                 605
Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu
    610                 615                 620
Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala
625                 630                 635                 640
Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile
                645                 650                 655
Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu
            660                 665                 670
Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser
        675                 680                 685
Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp
    690                 695
<210>2
<211>699
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala Ala
1               5                   10                  15
Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Arg Asp Phe
            20                  25                  30
Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro Glu
        35                  40                  45
Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu
    50                  55                  60
Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile Val
65                  70                  75                  80
Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu Ser
                85                  90                  95
Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro Asp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys Tyr
    130                 135                 140
Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys Asn
145                 150                 155                 160
Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro
                165                 170                 175
Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr
            180                 185                 190
Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu
        195                 200                 205
Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn Lys
    210                 215                 220
Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro Glu
225                 230                 235                 240
Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr Leu Ala Gln
                245                 250                 255
Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp
            260                 265                 270
Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr
        275                 280                 285
Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu
    290                 295                 300
Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met
305                 310                 315                 320
Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr
                325                 330                 335
Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser
            340                 345                 350
Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met
        355                 360                 365
Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu
    370                 375                 380
Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe
385                 390                 395                 400
Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys
                405                 410                 415
Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro
            420                 425                 430
Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu
        435                 440                 445
Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu
    450                 455                 460
Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp
465                 470                 475                 480
Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser
                485                 490                 495
Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro
            500                 505                 510
Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly
        515                 520                 525
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<210>3
<211>699
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>3
Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala Ala
  1             5                   10                  15
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Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro
                165                 170                 175
Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr
            180                 185                 190
Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu
        195                 200                 205
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                245                 250                 255
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            260                 265                 270
Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr
        275                 280                 285
Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu
    290                 295                 300
Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met
305                 310                 315                 320
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        355                 360                 365
Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu
    370                 375                 380
Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe
385                 390                 395                 400
Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys
                405                 410                 415
Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro
            420                 425                 430
Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu
        435                 440                 445
Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu
    450                 455                 460
Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp
465                 470                 475                 480
Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser
                485                 490                 495
Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro
            500                 505                 510
Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly
        515                 520                 525
Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg
    530                 535                 540
Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser
545                 550                 555                 560
Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly
                565                 570                 575
Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn
            580                 585                 590
Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr
        595                 600                 605
Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu
    610                 615                 620
Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala
625                 630                 635                 640
Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile
                645                 650                 655
Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu
            660                 665                 670
Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser
        675                 680                 685
Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp
    690                 695
<210>4
<211>699
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>4
Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys Ser Ala Ala
 1              5                   10                  15
Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys Arg Asp Phe
            20                  25                  30
Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val Ile Pro Glu
        35                  40                  45
Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp Glu Leu Glu
    50                  55                  60
Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu Asp Ile Val
65                  70                  75                  80
Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile Asn Glu Ser
                85                  90                  95
Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu Leu Pro Asp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln Lys Tyr Gly
        115                 120                 125
Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn Ser Lys Tyr
    130                 135                 140
Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp Asp Lys Asn
145                 150                 155                 160
Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu Gly Leu Pro
                165                 170                 175
Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu Ala Cys Thr
            180                 185                 190
Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile Arg Gln Glu
        195                 200                 205
Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu Met Asn Lys
    210                 215                 220
Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala Lys Pro Glu
225                 230                 235                 240
Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Arg Leu Ala Gln
                245                 250                 255
Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Ser Trp
            260                 265                 270
Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile Ser Ile Thr
        275                 280                 285
Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu Thr Lys Leu
    290                 295                 300
Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Asn Leu Met
305                 310                 315                 320
Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr
                325                 330                 335
Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Ser
            340                 345                 350
Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn Gly Asn Met
        355                 360                 365
Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe Ala Gly Glu
    370                 375                 380
Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg Glu Val Phe
385                 390                 395                 400
Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu Thr Lys Lys
                405                 410                 415
Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile Gly Tyr Pro
            420                 425                 430
Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Leu Glu
        435                 440                 445
Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Gln Asn Leu
    450                 455                 460
Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp
465                 470                 475                 480
Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser
                485                 490                 495
Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro
            500                 505                 510
Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Gly Ile Gly
        515                 520                 525
Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg
    530                 535                 540
Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr Gln Gln Ser
545                 550                 555                 560
Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly
                565                 570                 575
Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn
            580                 585                 590
Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr
        595                 600                 605
Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu
    610                 615                 620
Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala
625                 630                 635                 640
Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile
                645                 650                 655
Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu
            660                 665                 670
Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser
        675                 680                 685
Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp
    690                 695
<210>5
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>信号序列
<400>5
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1              5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp
            20
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自IgG4的铰链区
<400>6
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
 1              5                   10
<210>7
<211>217
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>7
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
 1              5                   10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215
<210>8
<211>949
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1              5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys
            20                  25                  30
Ile Lys Ser Ala Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu
        35                  40                  45
Pro Cys Thr Asp Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg
    50                  55                  60
Asn Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu
65                  70                  75                  80
Arg Asp Glu Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys
                85                  90                  95
Thr Glu Asp  le Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser
            100                 105                 110
Cys Ile Asn Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Leu Leu Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp
    130                 135                 140
Glu Gln Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly
                165                 170                 175
Thr Asp Asp Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro
            180                 185                 190
Arg Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr
        195                 200                 205
Lys Glu Ala Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg
    210                 215                 220
Leu Ile Arg Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala
225                 230                 235                 240
Leu Glu Met Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala
                245                 250                 255
Thr Ala Lys Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys
            260                 265                 270
Met Thr Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly
        275                 280                 285
Lys Pro Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val
    290                 295                 300
Asn Ile Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp
                325                 330                 335
Leu Gln Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser
            340                 345                 350
Leu Ser Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu
        355                 360                 365
Tyr Gly Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr
    370                 375                 380
Val Asn Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala
385                 390                 395                 400
Ala Phe Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln
                405                 410                 415
Ile Arg Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp
            420                 425                 430
Ala Glu Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu
        435                 440                 445
Arg Ile Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn
    450                 455                 460
Asn Glu Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn
465                 470                 475                 480
Ile Ile Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu
                485                 490                 495
Arg Glu Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val
            500                 505                 510
Asn Ala Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly
        515                 520                 525
Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn
    530                 535                 540
Tyr Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe
545                 550                 555                 560
Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp
                565                 570                 575
Trp Thr Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met
            580                 585                 590
Val Tyr Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His
        595                 600                 605
Leu Asn Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly
    610                 615                 620
Leu Gly Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly
625                 630                 635                 640
Glu Glu Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe
                645                 650                 655
Phe Leu Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr
            660                 665                 670
Ala Val Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg
        675                 680                 685
Ile Ile Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His
    690                 695                 700
Cys Arg Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp
705                 710                 715                 720
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
                725                 730                 735
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            740                 745                 750
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        755                 760                 765
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    770                 775                 780
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
785                 790                 795                 800
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                805                 810                 815
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
            820                 825                 830
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        835                 840                 845
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    850                 855                 860
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
865                 870                 875                 880
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                885                 890                 895
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
            900                 905                 910
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        915                 920                 925
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Leu Gly Lys
945
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<211>21
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>10
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
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<210>11
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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ggcatggggg accatatttg gactc                                                     25
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<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
tccagaaaag aagtgccggg tttgg                                                     25
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>15
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>16
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<400>16
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctttaacttt aagaaggaga tataaccatg               60
gagacagaca cactcct                                                              77
<210>17
<211>60
<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>17
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctttaacttt aagaaggaga tataaccatg               60
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>19
<211>1019
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>19
Met Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala Leu Pro Ser Thr
 1               5                  10                  15
Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro Glu Arg Leu Cys
            20                  25                  30
Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn Pro Ala Ile Lys
        35                  40                  45
Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp Lys Arg Glu Tyr
    50                  55                  60
Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Leu Met Ser Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val His Ile Gly Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Glu His
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Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
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Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro Leu Phe Asp Glu
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Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser Glu His Glu Lys
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Gly Asn Pro Lys His Pro Phe Ser Lys Phe Gly Thr Gly Asn Lys Tyr
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp Val Arg Gln Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Met Ala Val
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Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Leu Asp Asp Leu Thr Asn Leu Val Val
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Val Pro Ile Lys Asp Ile Arg Asn Leu Tyr Val Thr Phe Pro Ile Pro
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Asp Leu Gln Lys Tyr Tyr Lys Ser Asn Pro Gly His Tyr Leu Gly His
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Leu Ile Gly His Glu Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ser Glu Leu Lys Ser
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Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln Tyr Ile Gln Lys
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Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Glu Trp Val Phe Gln Glu Cys Lys Asp
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Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu Arg Pro Arg Gly
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    450                 455                 460
Glu Met Val Leu Asp Lys Leu Arg Pro Glu Asn Val Arg Val Ala Ile
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    530                 535                 540
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545                 550                 555                 560
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                565                 570                 575
Glu Phe Phe Ser Pro Phe Ala Tyr Val Asp Pro Leu His Cys Asn Met
            580                 585                 590
Ala Tyr Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Asn Glu Tyr Ala
        595                 600                 605
Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Gly Leu Ser Tyr Asp Leu Gln Asn Thr Ile
    610                 615                 620
Tyr Gly Met Tyr Leu Ser Val Lys Gly Tyr Asn Asp Lys Gln Pro Ile
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Asp Asp Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ala Phe Ile Pro Gln Leu Leu
705                 710                 715                 720
Ser Arg Leu His Ile Glu Ala Leu Leu His Gly Asn Ile Thr Lys Gln
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    850                 855                 860
Ala Phe Leu Ile Thr Met Glu Lys Ser Ile Glu Asp Met Thr Glu Glu
865                 870                 875                 880
Ala Phe Gln Lys His Ile Gln Ala Leu Ala Ile Arg Arg Leu Asp Lys
                885                 890                 895
Pro Lys Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys Tyr Trp Gly Glu Ile Ile
            900                 905                 910
Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu Val Ala Tyr Leu
        915                 920                 925
Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Met Leu
    930                 935                 940
Ala Val Asp Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val His Val Leu Ala
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Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile
            980                 985                 990
Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu Phe Pro Leu Val
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    1010                1015
<210>20
<211>1019
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>20
Met Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala Leu Pro Ser Thr
 1               5                  10                  15
Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro Glu Arg Leu Cys
            20                  25                  30
Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn Pro Ala Ile Lys
        35                  40                  45
Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp Lys Arg Glu Tyr
    50                  55                  60
Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Leu Ile Ser Asp
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Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val His Ile Gly Ser
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Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Glu His
            100                 105                 110
Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Ser Glu His Ala Gly Ser Ser Asn Ala Phe Thr Ser Gly
    130                 135                 140
Glu His Thr Asn Tyr Tyr Phe Asp Val Ser His Glu His Leu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro Leu Phe Asp Glu
                165                 170                 175
Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser Glu His Glu Lys
            180                 185                 190
Asn Val Met Asn Asp Ala Trp Arg Leu Phe Gln Leu Glu Lys Ala Thr
        195                 200                 205
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Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp Val Arg Gln Glu
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Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Met Ala Val
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    370                 375                 380
Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln Tyr Ile Gln Lys
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Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Gly Trp Val Phe Gln Glu Cys Lys Asp
                405                 410                 415
Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu Arg Pro Arg Gly
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    450                 455                 460
Glu Met Val Leu Asp Lys Leu Arg Pro Glu Asn Val Arg Val Ala Ile
465                 470                 475                 480
Val Ser Lys Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asp Arg Thr Glu Glu Trp Tyr
                485                 490                 495
Gly Thr Gln Tyr Lys Gln Glu Ala Ile Pro Asp Glu Val Ile Lys Lys
            500                 505                 510
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        515                 520                 525
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Phe Lys Gln Asp Asp Lys Phe Phe Leu Pro Lys Ala Cys Leu Asn Phe
                565                 570                 575
Glu Phe Phe Ser Arg Tyr Ile Tyr Ala Asp Pro Leu His Cys Asn Met
            580                 585                 590
Thr Tyr Leu Phe Ile Arg Leu Leu Lys Asp Asp Leu Lys Glu Tyr Thr
        595                 600                 605
Tyr Ala Ala Arg Leu Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Ile Ala Ser Gly Met
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Leu Leu Lys Lys Ile Ile Glu Lys Met Ala Thr Phe Glu Ile Asp Glu
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Val Gln Leu Pro Asp Arg Gly Trp Phe Val Tyr Gln Gln Arg Asn Glu
    770                 775                 780
Val His Asn Asn Cys Gly Ile Glu Ile Tyr Tyr Gln Thr Asp Met Gln
785                 790                 795                 800
Ser Thr Ser Glu Asn Met Phe Leu Glu Leu Phe Cys Gln Ile Ile Ser
                805                 810                 815
Glu Pro Cys Phe Asn Thr Leu Arg Thr Lys Glu Gln Leu Gly Tyr Ile
            820                 825                 830
Val Phe Ser Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gly Ile Gln Gly Leu Arg Phe
        835                 840                 845
Ile Ile Gln Ser Glu Lys Pro Pro His Tyr Leu Glu Ser Arg Val Glu
    850                 855                 860
Ala Phe Leu Ile Thr Met Glu Lys Ser Ile Glu Asp Met Thr Glu Glu
865                 870                 875                 880
Ala Phe Gln Lys His Ile Gln Ala Leu Ala Ile Arg Arg Leu Asp Lys
                885                 890                 895
Pro Lys Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys Tyr Trp Gly Glu Ile Ile
            900                 905                 910
Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu Val Ala Tyr Leu
        915                 920                 925
Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Met Leu
    930                 935                 940
Ala Val Asp Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val His Val Leu Ala
945                 950                 955                 960
Arg Glu Met Asp Ser Cys Pro Val Val Gly Glu Phe Pro Cys Gln Asn
                965                 970                 975
Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile
            980                 985                 990
Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu Phe Pro Leu Val
        995                 1000                1005
Lys Pro His Ile Asn Phe Met Ala Ala Lys Leu
    1010                1015
<210>21
<211>1019
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>21
Met Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala Leu Pro Ser Thr
 1               5                  10                  15
Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro Glu Arg Leu Cys
            20                  25                  30
Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn Pro Ala Ile Lys
        35                  40                  45
Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp Lys Arg Glu Tyr
    50                  55                  60
Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Leu Met Ser Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val His Ile Gly Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Glu His
            100                 105                 110
Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Ser Glu His Ala Gly Ser Ser Asn Ala Phe Thr Ser Gly
    130                 135                 140
Glu His Thr Asn Tyr Tyr Phe Asp Val Ser His Glu His Leu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro Leu Phe Asp Glu
                165                 170                 175
Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser Glu His Glu Lys
            180                 185                 190
Asn Val Met Asn Asp Ala Trp Arg Leu Phe Gln Leu Glu Lys Ala Thr
        195                 200                 205
Gly Asn Pro Lys His Pro Phe Ser Lys Phe Gly Thr Gly Asn Lys Tyr
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp Val Arg Gln Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Met Ala Val
                245                 250                 255
Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Leu Asp Asp Leu Thr Asn Leu Val Val
            260                 265                 270
Lys Leu Phe Ser Glu Val Glu Asn Lys Asn Val Pro Leu Pro Glu Phe
        275                 280                 285
Pro Glu His Pro Phe Gln Glu Glu His Leu Lys Gln Leu Tyr Lys Ile
    290                 295                 300
Val Pro Ile Lys Asp Ile Arg Asn Leu Tyr Val Thr Phe Pro Ile Pro
305                 310                 315                 320
Asp Leu Gln Lys Tyr Tyr Lys Ser Asn Pro Gly His Tyr Leu Gly His
                325                 330                 335
Leu Ile Gly His Glu Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ser Glu Leu Lys Ser
            340                 345                 350
Lys  Gly Trp Val Asn Thr Leu Val Gly Gly Gln Lys Glu Gly Ala Arg
        355                 360                 365
Gly Phe Met Phe Phe Ile Ile Asn Val Asp Leu Thr Glu Glu Gly Leu
    370                 375                 380
Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln Tyr Ile Gln Lys
385                 390                 395                 400
Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Glu Trp Val Phe Gln Glu Cys Lys Asp
                405                 410                 415
Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu Arg Pro Arg Gly
            420                 425                 430
Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Gly Ile Leu His Tyr Tyr Pro Leu Glu Glu
        435                 440                 445
Val Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Phe Arg Pro Asp Leu Ile
    450                 455                 460
Glu Met Val Leu Asp Lys Leu Arg Pro Glu Asn Val Arg Val Ala Ile
465                 470                 475                 480
Val Ser Lys Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asp Arg Thr Glu Glu Trp Tyr
                485                 490                 495
Gly Thr Gln Tyr Lys Gln Glu Ala Ile Pro Asp Glu Val Ile Lys Lys
            500                 505                 510
Trp Gln Asn Ala Asp Leu Asn Gly Lys Phe Lys Leu Pro Thr Lys Asn
        515                 520                 525
Glu Phe Ile Pro Thr Asn Phe Glu Ile Leu Pro Leu Glu Lys Glu Ala
    530                 535                 540
Thr Pro Tyr Pro Ala Leu Ile Lys Asp Thr Val Met Ser Lys Leu Trp
545                 550                 555                 560
Phe Lys Gln Asp Asp Lys Lys Lys Lys Pro Lys Ala Cys Leu Asn Phe
                565                 570                 575
Glu Phe Phe Ser Pro Phe Ala Tyr Val Asp Pro Leu His Cys Asn Met
            580                 585                 590
Ala Tyr Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Asn Glu Tyr Ala
        595                 600                 605
Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Gly Leu Ser Tyr Asp Leu Gln Asn Thr Ile
    610                 615                 620
Tyr Gly Met Tyr Leu Ser Val Lys Gly Tyr Asn Asp Lys Gln Pro Ile
625                 630                 635                 640
Leu Leu Lys Lys Ile Ile Glu Lys Met Ala Thr Phe Glu Ile Asp Glu
                645                 650                 655
Lys Arg Phe Glu Ile Ile Lys Glu Ala Tyr Met Arg Ser Leu Asn Asn
            660                 665                 670
Phe Arg Ala Glu Gln Pro His Gln His Ala Met Tyr Tyr Leu Arg Leu
        675                 680                 685
Leu Met Thr Glu Val Ala Trp Thr Lys Asp Glu Leu Lys Glu Ala Leu
    690                 695                 700
Asp Asp Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ala Phe Ile Pro Gln Leu Leu
705                 710                 715                 720
Ser Arg Leu His Ile Glu Ala Leu Leu His Gly Asn Ile Thr Lys Gln
725             730                 735
Ala Ala Leu Gly Ile Met Gln Met Val Glu Asp Thr Leu Ile Glu His
            740                 745                 750
Ala His Thr Lys Pro Leu Leu Pro Ser Gln Leu Val Arg Tyr Arg Glu
        755                 760                 765
Val Gln Leu Pro Asp Arg Gly Trp Phe Val Tyr Gln Gln Arg Asn Glu
    770                 775                 780
Val His Asn Asn Cys Gly Ile Glu Ile Tyr Tyr Gln Thr Asp Met Gln
785                 790                 795                 800
Ser Thr Ser Glu Asn Met Phe Leu Glu Leu Phe Cys Gln Ile Ile Ser
                805                 810                 815
Glu Pro Cys Phe Asn Thr Leu Arg Thr Lys Glu Gln Leu Gly Tyr Ile
            820                 825                 830
Val Phe Ser Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gly Ile Gln Ser Leu Arg Phe
        835                 840                 845
Ile Ile Gln Ser Glu Lys Pro Pro His Tyr Leu Glu Ser Arg Val Glu
    850                 855                 860
Ala Phe Leu Ile Thr Met Glu Lys Ser Ile Glu Asp Met Thr Glu Glu
865                 870                 875                 880
Ala Phe Gln Lys His Ile Gln Ala Leu Ala Ile Arg Arg Leu Asp Lys
                885                 890                 895
Pro Lys Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys Tyr Trp Gly Glu Ile Ile
            900                 905                 910
Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu Val Ala Tyr Leu
        915                 920                 925
Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Met Leu
    930                 935                 940
Ala Val Asn Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val His Val Leu Ala
945                 950                 955                 960
Arg Glu Met Asp Ser Cys Pro Val Val Gly Glu Phe Pro Cys Gln Asn
                965                 970                 975
Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile
            980                 985                 990
Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu Phe Pro Leu Val
        995                 1000                1005
Lys Pro His Ile Asn Phe Met Ala Ala Lys Leu
    1010                1015
<210>22
<211>1019
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>22
Met Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala Leu Pro Ser Thr
 1               5                  10                  15
Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro Glu Arg Leu Cys
            20                  25                  30
Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn Pro Ala Ile Lys
        35                  40                  45
Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp Lys Arg Glu Tyr
    50                  55                  60
Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Leu Met Ser Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val His Ile Gly Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Glu His
            100                 105                 110
Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Ser Glu His Ala Gly Ser Ser Asn Ala Phe Thr Ser Gly
    130                 135                 140
Glu His Thr Asn Tyr Tyr Phe Asp Val Ser His Glu His Leu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro Leu Phe Asp Glu
                165                 170                 175
Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser Glu His Glu Lys
            180                 185                 190
Asn Val Met Asn Asp Ala Trp Arg Leu Phe Gln Leu Glu Lys Ala Thr
        195                 200                 205
Gly Asn Pro Lys His Pro Phe Ser Lys Phe Gly Thr Gly Asn Lys Tyr
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp Val Arg Gln Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Met Ala Val
                245                 250                 255
Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Leu Asp Asp Leu Thr Asn Leu Val Val
            260                 265                 270
Lys Leu Phe Ser Glu Val Glu Asn Lys Asn Val Pro Leu Pro Glu Phe
        275                 280                 285
Pro Glu His Pro Phe Gln Glu Glu His Leu Lys Gln Leu Tyr Lys Ile
    290                 295                 300
Val Pro Ile Lys Asp Ile Arg Asn Leu Tyr Val Thr Phe Pro Ile Pro
305                 310                 315                 320
Asp Leu Gln Lys Tyr Tyr Lys Ser Asn Pro Gly His Tyr Leu Gly His
                325                 330                 335
Leu Ile Gly His Glu Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ser Glu Leu Lys Ser
            340                 345                 350
Lys Gly Trp Val Asn Thr Leu Val Gly Gly Gln Lys Glu Gly Ala Arg
        355                 360                 365
Gly Phe Met Phe Phe Ile Ile Asn Val Asp Leu Thr Glu Glu Gly Leu
    370                 375                 380
Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln Tyr Ile Gln Lys
38                 5390                 395                 400
Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Glu Trp Val Phe Gln Glu Cys Lys Asp
                405                 410                 415
Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu Arg Pro Arg Gly
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    450                 455                 460
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465                 470                 475                 480
Val Ser Lys Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asp Arg Thr Glu Glu Trp Tyr
                485                 490                 495
Gly Thr Gln Tyr Lys Gln Glu Ala Ile Pro Asp Glu Val Ile Lys Lys
            500                 505                 510
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    530                 535                 540
Thr Pro Tyr Pro Ala Leu Ile Lys Asp Thr Val Met Ser Lys Leu Trp
545                 550                 555                 560
Phe Lys Gln Asp Asp Lys Lys Lys Lys Pro Lys Ala Cys Leu Asn Phe
                565                 570                 575
Glu Phe Phe Ser Pro Phe Ala Tyr Val Asp Pro Leu His Cys Asn Met
            580                 585                 590
Ala Tyr Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Asn Glu Tyr Ala
        595                 600                 605
Tyr Ala Ala Lys Leu Ala Gly Leu Ser Tyr Asp Leu Gln Asn Thr Ile
    610                 615                 620
Tyr Gly Met Tyr Leu Ser Val Lys Gly Tyr Asn Asp Lys Gln Pro Ile
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    690                 695                 700
Asp Asp Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ala Phe Ile Pro Gln Leu Leu
705                 710                 715                 720
Ser Arg Leu His Ile Glu Ala Leu Leu His Gly Asn Ile Thr Lys Gln
                725                 730                 735
Ala Ala Leu Gly Ile Met Gln Met Val Glu Asp Thr Leu Ile Glu His
            740                 745                 750
Ala His Thr Lys Pro Leu Leu Pro Ser Gln Leu Val Arg Tyr Arg Glu
        755                 760                 765
Val Gln Leu Pro Asp Arg Gly Trp Phe Val Tyr Gln Gln Arg Asn Glu
    770                 775                 780
Val His Asn Asn Cys Gly Ile Glu Ile Tyr Tyr Gln Thr Asp Met Gln
785                 790                 795                 800
Ser Thr Ser Glu Asn Met Phe Leu Glu Leu Phe Cys Gln Ile Ile Ser
                805                 8l0                 815
Glu Pro Cys Phe Asn Thr Leu Arg Thr Lys Glu Gln Leu Gly Tyr Ile
            820                 825                 830
Val Phe Ser Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gly Ile Gln Ser Leu Arg Phe
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Pro Lys Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys Tyr Trp Gly Glu Ile Ile
            900                 905                 910
Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu Val Ala Tyr Leu
        915                 920                 925
Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Met Leu
    930                 935                 940
Ala Val Asp Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val His Val Leu Ala
945                 950                 955                 960
Arg Glu Met Asp Ser Cys Pro Val Val Gly Glu Phe Pro Cys Gln Asn
                965                 970                 975
Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile
            980                 985                 990
Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu Phe Pro Leu Val
        995                 1000                1005
Lys Pro His Ile Asn Phe Met Ala Ala Lys Leu
    1010                1015
<210>23
<211>1019
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>23
Met Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala Leu Pro Ser Thr
 1               5                  10                  15
Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro Glu Arg Leu Cys
            20                  25                  30
Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn Pro Ala Ile Lys
        35                  40                  45
Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp Lys Arg Glu Tyr
    50                  55                  60
Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Leu Met Ser Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val His Ile Gly Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Glu His
            100                 105                 110
Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Ser Glu His Ala Gly Ser Ser Asn Ala Phe Thr Ser Gly
    130                 135                 140
Glu His Thr Asn Tyr Tyr Phe Asp Val Ser His Glu His Leu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro Leu Phe Asp Glu
                165                 170                 175
Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser Glu His Glu Lys
            180                 185                 190
Asn Val Met Asn Asp Ala Trp Arg Leu Phe Gln Leu Glu Lys Ala Thr
        195                 200                 205
Gly Asn Pro Lys His Pro Phe Ser Lys Phe Gly Thr Gly Asn Lys Tyr
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp Val Arg Gln Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Met Ala Val
                245                 250                 255
Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Leu Asp Asp Leu Thr Asn Leu Val Val
            260                 265                 270
Lys Leu Phe Ser Glu Val Glu Asn Lys Asn Val Pro Leu Pro Glu Phe
        275                 280                 285
Pro Glu His Pro Phe Gln Glu Glu His Phe Lys Gln Leu Tyr Lys Ile
    290                 295                 300
Val Pro Ile Lys Asp Ile Arg Asn Leu Tyr Val Thr Phe Pro Ile Pro
305                 310                 315                 320
Asp Leu Gln Lys Tyr Tyr Lys Ser Asn Pro Gly His Tyr Leu Gly His
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Leu Ile Gly His Glu Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ser Glu Leu Lys Ser
            340                 345                 350
Lys Gly Trp Val Asn Thr Leu Val Gly Gly Gln Lys Glu Gly Ala Arg
        355                 360                 365
Gly Phe Met Phe Phe Ile Ile Asn Val Asp Leu Thr Glu Glu Gly Leu
    370                 375                 380
Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln Tyr Ile Gln Lys
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Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Glu Trp Val Phe Gln Glu Cys Lys Asp
                405                 410                 415
Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu Arg Pro Arg Gly
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Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Gly Ile Leu His Tyr Tyr Pro Leu Glu Glu
        435                 440                 445
Val Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Phe Arg Pro Asp Leu Ile
    450                 455                 460
Glu Met Val Leu Asp Lys Leu Arg Pro Glu Asn Val Arg Val Ala Ile
465                 470                 475                 480
Val Ser Lys Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asp Arg Thr Glu Glu Trp Tyr
                485                 490                 495
Gly Thr Gln Tyr Lys Gln Glu Ala Ile Pro Asp Glu Val Ile Lys Lys
            500                 505                 510
Trp Gln Asn Ala Asp Leu Asn Gly Lys Phe Lys Leu Pro Thr Lys Asn
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Glu Phe Ile Pro Thr Asn Phe Glu Ile Leu Pro Leu Glu Lys Glu Ala
    530                 535                 540
Thr Pro Tyr Pro Ala Leu Ile Lys Asp Thr Val Met Ser Lys Leu Trp
545                 550                 555                 560
Phe Lys Gln Asp Asp Lys Lys Lys Lys Pro Lys Ala Cys Leu Asn Phe
                565                 570                 575
Glu Phe Phe Ser Pro Phe Ala Tyr Val Asp Pro Leu His Cys Asn Met
            580                 585                 590
Ala Tyr Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Asn Glu Tyr Ala
        595                 600                 605
Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Gly Leu Ser Tyr Asp Leu Gln Asn Thr Ile
    610                 615                 620
Tyr Gly Met Tyr Leu Ser Val Lys Gly Tyr Asn Asp Lys Gln Pro Ile
625                 630                 635                 640
Leu Leu Lys Lys Ile Ile Glu Lys Met Ala Thr Phe Glu Ile Asp Glu
                645                 650                 655
Lys Arg Phe Glu Ile Ile Lys Glu Ala Tyr Met Arg Ser Leu Asn Asn
            660                 665                 670
Phe Arg Ala Glu Gln Pro His Gln His Ala Met Tyr Tyr Leu Arg Leu
        675                 680                 685
Leu Met Thr Glu Val Ala Trp Thr Lys Asp Glu Leu Lys Glu Ala Leu
    690                 695                 700
Asp Asp Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ala Phe Ile Pro Gln Leu Leu
705                 710                 715                 720
Ser Arg Leu His Ile Glu Ala Leu Leu His Gly Asn Ile Thr Lys Gln
                725                 730                 735
Ala Ala Leu Gly Ile Met Gln Met Val Glu Asp Thr Leu Ile Glu His
            740                 745                 750
Ala His Thr Lys Pro Leu Leu Pro Ser Gln Leu Val Arg Tyr Arg Glu
        755                 760                 765
Val Gln Leu Pro Asp Arg Gly Trp Phe Val Tyr Gln Gln Arg Asn Glu
    770                 775                 780
Val His Asn Asn Cys Gly Ile Glu Ile Tyr Tyr Gln Thr Asp Met Gln
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Ser Thr Ser Glu Asn Met Phe Leu Glu Leu Phe Cys Gln Ile Ile Ser
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Val Phe Ser Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gly Ile Gln Ser Leu Arg Phe
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Ile Ile Gln Ser Glu Lys Pro Pro His Tyr Leu Glu Ser Arg Val Glu
    850                 855                 860
Ala Phe Leu Ile Thr Met Glu Lys Ser Ile Glu Asp Met Thr Glu Glu
865                 870                 875                 880
Ala Phe Gln Lys His Ile Gln Ala Leu Ala Ile Arg Arg Leu Asp Lys
                885                 890                 895
Pro Lys Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys Tyr Trp Gly Glu Ile Ile
            900                 905                 910
Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu Val Ala Tyr Leu
        915                 920                 925
Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Met Leu
    930                 935                 940
Ala Val Asp Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val His Val Leu Ala
945                 950                 955                 960
Arg Glu Met Asp Ser Cys Pro Val Val Gly Glu Phe Pro Cys Gln Asn
                965                 970                 975
Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile
            980                 985                 990
Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu Phe Pro Leu Val
        995                 1000                1005
Lys Pro His Ile Asn Phe Met Ala Ala Lys Leu
    1010                1015
<210>24
<211>1019
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>24
Met Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala Leu Pro Ser Thr
 1               5                  10                  15
Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro Glu Arg Leu Cys
            20                  25                  30
Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn Pro Ala Ile Lys
        35                  40                  45
Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp Lys Arg Glu Tyr
    50                  55                  60
Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Leu Met Ser Asp
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Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val His Ile Gly Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Glu His
            100                 105                 110
Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu Asn Glu Tyr Ser
        115                 120                 125
Gln Phe Leu Ser Glu His Ala Gly Ser Ser Asn Ala Phe Thr Ser Gly
    130                 135                 140
Glu His Thr Asn Tyr Tyr Phe Asp Val Ser His Glu His Leu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro Leu Phe Asp Glu
                165                 170                 175
Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser Glu His Glu Lys
            180v185                 190
Asn Val Met Asn Asp Ala Trp Arg Leu Phe Gln Leu Glu Lys Ala Thr
        195                 200                 205
Gly Asn Pro Lys His Pro Phe Ser Lys Phe Gly Thr Gly Asn Lys Tyr
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp Val Arg Gln Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Met Ala Val
                245                 250                 255
Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Leu Asp Asp Leu Thr Asn Leu Val Val
            260                 265                 270
Lys Leu Phe Ser Glu Val Glu Asn Lys Asn Val Pro Leu Pro Glu Phe
        275                 280                 285
Pro Glu His Pro Phe Gln Glu Glu His Leu Lys Gln Leu Tyr Lys Ile
    290                 295                 300
Val Pro Ile Lys Asp Ile Arg Asn Leu Tyr Val Thr Phe Pro Ile Pro
305                 310                 315                 320
Asp Leu Gln Lys Tyr Tyr Lys Ser Asn Pro Gly His Tyr Leu Gly His
                325                 330                 335
Leu Ile Gly His Glu Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ser Glu Leu Lys Ser
            340                 345                 350
Lys Gly Trp Val Asn Thr Leu Val Gly Gly Gln Lys Glu Gly Ala Arg
        355                 360                 365
Gly Phe Met Phe Phe Ile Ile Asn Val Asp Leu Thr Glu Glu Gly Leu
    370                 375                 380
Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln Tyr Ile Gln Lys
385                 390                 395                 400
Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Gly Trp Val Phe Gln Glu Cys Lys Asp
                405                 410                 415
Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu Arg Pro Arg Gly
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Glu Met Val Leu Asp Lys Leu Arg Pro Glu Asn Val Arg Val Ala Ile
465                 470                 475                 480
Val Ser Lys Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asp Arg Thr Glu Glu Trp Tyr
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Gly Thr Gln Tyr Lys Gln Glu Ala Ile Pro Asp Glu Val Ile Lys Lys
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Ala Tyr Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Asn Glu Tyr Ala
        595                 600                 605
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Asp Asp Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ala Phe Ile Pro Gln Leu Leu
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Ala His Thr Lys Pro Leu Leu Pro Ser Gln Leu Val Arg Tyr Arg Glu
        755                 760                 765
Val Gln Leu Pro Asp Arg Gly Trp Phe Val Tyr Gln Gln Arg Asn Glu
    770                 775                 780
Val His Asn Asn Cys Gly Ile Glu Ile Tyr Tyr Gln Thr Asp Met Gln
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Ser Thr Ser Glu Asn Met Phe Leu Glu Leu Phe Cys Gln Ile Ile Ser
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                885                 890                 895
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            900                 905                 910
Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu Val Ala Tyr Leu
        915                 920                 925
Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Met Leu
    930                 935                 940
Ala Val Asp Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val His Val Leu Ala
945                 950                 955                 960
Arg Glu Met Asp Ser Cys Pro Val Val Gly Glu Phe Pro Cys Gln Asn
                965                 970                 975
Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile
            980                 985                 990
Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu Phe Pro Leu Val
        995                 1000                1005
Lys Pro His Ile Asn Phe Met Ala Ala Lys Leu
    1010                1015
<210>25
<211>1268
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Arg Tyr Arg Leu Ala Trp Leu Leu His Pro Ala
            20                  25                  30
Leu Pro Ser Thr Phe Arg Ser Val Leu Gly Ala Arg Leu Pro Pro Pro
        35                  40                  45
Glu Arg Leu Cys Gly Phe Gln Lys Lys Thr Tyr Ser Lys Met Asn Asn
    50                  55                  60
Pro Ala Ile Lys Arg Ile Gly Asn His Ile Thr Lys Ser Pro Glu Asp
65                  70                  75                  80
Lys Arg Glu Tyr Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu
                85                  90                  95
Leu Met Ser Asp Pro Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ala Leu Asp Val
            100                 105                 110
His Ile Gly Ser Leu Ser Asp Pro Pro Asn Ile Ala Gly Leu Ser His
        115                 120                 125
Phe Cys Glu His Met Leu Phe Leu Gly Thr Lys Lys Tyr Pro Lys Glu
    130                 135                 140
Asn Glu Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Glu His Ala Gly Ser Ser Asn Ala
14                 5150                 155                 160
Phe Thr Ser Gly Glu His Thr Asn Tyr Tyr Phe Asp Val Ser His Glu
                165                 170                 175
His Leu Glu Gly Ala Leu Asp Arg Phe Ala Gln Phe Phe Leu Cys Pro
            180                 185                 190
Leu Phe Asp Glu Ser Cys Lys Asp Arg Glu Val Asn Ala Val Asp Ser
        195                 200                 205
Glu His Glu Lys Asn Val Met Asn Asp Ala Trp Arg Leu Phe Gln Leu
    210                 215                 220
Glu Lys Ala Thr Gly Asn Pro Lys His Pro Phe Ser Lys Phe Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gly Asn Lys Tyr Thr Leu Glu Thr Arg Pro Asn Gln Glu Gly Ile Asp
                245                 250                 255
Val Arg Gln Glu Leu Leu Lys Phe His Ser Ala Tyr Tyr Ser Ser Asn
            260                 265                 270
Leu Met Ala Val Cys Val Leu Gly Arg Glu Ser Leu Asp Asp Leu Thr
        275                 280                 285
Asn Leu Val Val Lys Leu Phe Ser Glu Val Glu Asn Lys Asn Val Pro
    290                 295                 300
Leu Pro Glu Phe Pro Glu His Pro Phe Gln Glu Glu His Leu Lys Gln
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Lys Ile Val Pro Ile Lys Asp Ile Arg Asn Leu Tyr Val Thr
                325                 330                 335
Phe Pro Ile Pro Asp Leu Gln Lys Tyr Tyr Lys Ser Asn Pro Gly His
            340                 345                 350
Tyr Leu Gly His Leu Ile Gly His Glu Gly Pro Gly Ser Leu Leu Ser
        355                 360                 365
Glu Leu Lys Ser Lys Gly Trp Val Asn Thr Leu Val Gly Gly Gln Lys
    370                 375                 380
Glu Gly Ala Arg Gly Phe Met Phe Phe Ile Ile Asn Val Asp Leu Thr
385                 390                 395                 400
Glu Glu Gly Leu Leu His Val Glu Asp Ile Ile Leu His Met Phe Gln
                405                 410                 415
Tyr Ile Gln Lys Leu Arg Ala Glu Gly Pro Gln Glu Trp Val Phe Gln
            420                 425                 430
Glu Cys Lys Asp Leu Asn Ala Val Ala Phe Arg Phe Lys Asp Lys Glu
        435                 440                 445
Arg Pro Arg Gly Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Gly Ile Leu His Tyr Tyr
    450                 455                 460
Pro Leu Glu Glu Val Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Phe Arg
465                 470                 475                 480
Pro Asp Leu Ile Glu Met Val Leu Asp Lys Leu Arg Pro Glu Asn Val
                485                 490                 495
Arg Val Ala Ile Val Ser Lys Ser Phe Glu Gly Lys Thr Asp Arg Thr
            500                 505                 510
Glu Glu Trp Tyr Gly Thr Gln Tyr Lys Gln Glu Ala Ile Pro Asp Glu
        515                 520                 525
Val Ile Lys Lys Trp Gln Asn Ala Asp Leu Asn Gly Lys Phe Lys Leu
    530                 535                 540
Pro Thr Lys Asn Glu Phe Ile Pro Thr Asn Phe Glu Ile Leu Pro Leu
545                 550                 555                 560
Glu Lys Glu Ala Thr Pro Tyr Pro Ala Leu Ile Lys Asp Thr Val Met
                565                 570                 575
Ser Lys Leu Trp Phe Lys Gln Asp Asp Lys Lys Lys Lys Pro Lys Ala
            580                 585                 590
Cys Leu Asn Phe Glu Phe Phe Ser Pro Phe Ala Tyr Val Asp Pro Leu
        595                 600                 605
His Cys Asn Met Ala Tyr Leu Tyr Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Leu
    610                 615                 620
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Gly Leu Ser Tyr Asp Leu
625                 630                 635                 640
Gln Asn Thr Ile Tyr Gly Met Tyr Leu Ser Val Lys Gly Tyr Asn Asp
                645                 650                 655
Lys Gln Pro Ile Leu Leu Lys Lys Ile Ile Glu Lys Met Ala Thr Phe
            660                 665                 670
Glu Ile Asp Glu Lys Arg Phe Glu Ile Ile Lys Glu Ala Tyr Met Arg
        675                 680                 685
Ser Leu Asn Asn Phe Arg Ala Glu Gln Pro His Gln His Ala Met Tyr
    690                 695                 700
Tyr Leu Arg Leu Leu Met Thr Glu Val Ala Trp Thr Lys Asp Glu Leu
705                 710                 715                 720
Lys Glu Ala Leu Asp Asp Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ala Phe Ile
                725                 730                 735
Pro Gln Leu Leu Ser Arg Leu His Ile Glu Ala Leu Leu His Gly Asn
            740                 745                 750
Ile Thr Lys Gln Ala Ala Leu Gly Ile Met Gln Met Val Glu Asp Thr
        755                 760                 765
Leu Ile Glu His Ala His Thr Lys Pro Leu Leu Pro Ser Gln Leu Val
    770                 775                 780
Arg Tyr Arg Glu Val Gln Leu Pro Asp Arg Gly Trp Phe Val Tyr Gln
785                 790                 795                 800
Gln Arg Asn Glu Val His Asn Asn Cys Gly Ile Glu Ile Tyr Tyr Gln
                805                 810                 815
Thr Asp Met Gln Ser Thr Ser Glu Asn Met Phe Leu Glu Leu Phe Cys
            820                 825                 830
Gln Ile Ile Ser Glu Pro Cys Phe Asn Thr Leu Arg Thr Lys Glu Gln
        835                 840                 845
Leu Gly Tyr Ile Val Phe Ser Gly Pro Arg Arg Ala Asn Gly Ile Gln
    850                 855                 860
Ser Leu Arg Phe Ile Ile Gln Ser Glu Lys Pro Pro His Tyr Leu Glu
865                 870                 875                 880
Ser Arg Val Glu Ala Phe Leu Ile Thr Met Glu Lys Ser Ile Glu Asp
                885                 890                 895
Met Thr Glu Glu Ala Phe Gln Lys His  le Gln Ala Leu Ala Ile Arg
            900v905                 910
Arg Leu Asp Lys Pro Lys Lys Leu Ser Ala Glu Cys Ala Lys Tyr Trp
        915                 920                 925
Gly Glu Ile Ile Ser Gln Gln Tyr Asn Phe Asp Arg Asp Asn Thr Glu
    930                 935                 940
Val Ala Tyr Leu Lys Thr Leu Thr Lys Glu Asp Ile Ile Lys Phe Tyr
945                 950                 955                 960
Lys Glu Met Leu Ala Val Asp Ala Pro Arg Arg His Lys Val Ser Val
                965                 970                 975
His Val Leu Ala Arg Glu Met Asp Ser Cys Pro Val Val Gly Glu Phe
            980                 985                 990
Pro Cys Gln Asn Asp Ile Asn Leu Ser Gln Ala Pro Ala Leu Pro Gln
        995                 1000                1005
Pro Glu Val Ile Gln Asn Met Thr Glu Phe Lys Arg Gly Leu Pro Leu
    1010                1015                1020
Phe Pro Leu Val Lys Pro His Ile Asn Phe Met Ala Ala Lys Leu Glu
1025                1030                1035                1040
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
                1045                1050                1055
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            1060                1065                1070
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        1075                1080                1085
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    1090                1095                1100
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
1105                1110                1115                1120
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                1125                1130                1135
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
            1140                1145                1150
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        1155                1160                1165
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    1170                1175                1180
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
1185                1190                1195                1200
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                1205                1210                1215
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
            1220                1225                1230
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        1235                1240                1245
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    1250                1255                1260
Ser Leu Gly Lys
1265
<210>26
<211>681
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>26
Gln Tyr Gln Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys Val
 1               5                  10                  15
Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro
            20                  25                  30
Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Ile Lys Ala Asn
        35                  40                  45
Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp
    50                  55                  60
Glu His Asn Gln Ala Ile Ile Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala
65                  70                  75                  80
Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gln Val Tyr Tyr Arg Ala Cys
                85                  90                  95
Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg Ala Lys Pro Leu Met Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Ala Lys
        115                 120                 125
Asp Asn Phe Gln Asp Thr Leu Gln Val Val Thr Ala His Tyr Arg Thr
    130                 135                 140
Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn
145                 150                 155                 160
Ser Asn Val Ile Gln Val Asp Gln Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg
                165                 170                 175
Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr
            180                 185                 190
Leu Asn Tyr Met Val Gln Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Asp Glu
        195                 200                 205
Glu Ala Ile Arg Pro Gln Met Gln Gln Ile Leu Asp Phe Glu Thr Ala
    210                 215                 220
Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gln Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu
225                 230                 235                 240
Ile Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu Gln Thr Leu Ala Pro Ala
                245                 250                 255
Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile
            260                 265                 270
Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Glu Gln
        275                 280                 285
Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr Asp Arg Cys Leu Leu Asn Asn Tyr
    290                 295                 300
Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gln Arg
305                 310                 315                 320
Phe Gln Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys
                325                 330                 335
Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn
            340                 345                 350
Asn Lau Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Ala Thr Phe Ala
        355                 360                 365
Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala Thr Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys
    370                 375                 380
Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Glu Thr
385                 390                 395                 400
Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile Gly
                405                 410                 415
Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn
            420                 425                 430
Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe
        435                 440                 445
Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gln Leu Arg Lys Ala Pro
    450                 455                 460
Asn Arg Asp Gln Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr
465                 470                 475                 480
Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Ala
                485                 490                 495
Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile
            500                 505                 510
Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gln Gly
        515                 520                 525
Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser
    530                 535                 540
Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gln Thr Glu Cys Met Val Glu Gln Tyr
545                 550                 555                 560
Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu
                565                 570                 575
Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala
            580                 585                 590
Tyr Gln Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu His Ser Leu Pro Thr
        595                 600                 605
Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gln Leu Phe Phe Leu Gly Phe Ala Gln Val
    610                 615                 620
Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr
625                 630                 635                 640
Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly Ser Leu Ser Asn
                645                 650                 655
Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met
            660                 665                 670
Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp
        675                 680
<210>27
<211>931
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>27
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Gln Tyr Gln Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys Leu
            20                  25                  30
Ser Glu Ala Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met Asp
        35                  40                  45
Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly Gly
    50                  55                  60
Trp Ile Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly Thr
65                  70                  75                  80
Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gln Ala Ile Ile Lys His Leu Leu
                85                  90                  95
Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gln Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg Ala
        115                 120                 125
Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr
    130                 135                 140
Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gln Asp Thr Leu Gln Val Val Thr
145                 150                 155                 160
Ala His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gln Val Asp Gln Ser Gly Leu
            180                 185                 190
Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys
        195                 200                 205
Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gln Leu Gly Lys Leu Leu
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gln Met Gln Gln Ile Leu
225                 230                 235                 240
Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gln Glu Lys Arg
                245                 250                 255
Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu Gln
            260                 265                 270
Thr Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr Ile Phe
        275                 280                 285
Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp Lys
    290                 295                 300
Glu Tyr Leu Glu Gln Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr Asp Arg Cys
305                 310                 315                 320
Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser
                325                 330                 335
Phe Leu Asp Gln Arg Phe Gln Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val
            340                 345                 350
Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val
        355                 360                 365
Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe Val
    370                 375                 380
Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala Thr Glu Ile Ile
385                 390                 395                 400
Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp
                405                 410                 415
Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala Ile
            420                 425                 430
Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu
        435                 440                 445
Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu
    450                 455                 460
Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gln
465                 470                 475                 480
Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gln Trp Ser Met Thr Pro Pro Met
                485                 490                 495
Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala
            500                 505                 510
Gly Ile Leu Gln Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala Leu
        515                 520                 525
Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala
    530                 535                 540
Phe Asp Asp Gln Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro
545                 550                 555                 560
Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gln Thr Glu Cys
                565                 570                 575
Met Val Glu Gln Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn
            580                 585                 590
Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys
        595                 600                 605
Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu
    610                 615                 620
His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gln Leu Phe Phe Leu
625                 630                 635                 640
Gly Phe Ala Gln Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His
                645                 650                 655
Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile
            660                 665                 670
Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys Pro
        675                 680                 685
Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp Glu Ser
    690                 695                 700
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
705                 710                 715                 720
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                725                 730                 735
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
            740                 745                 750
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        755                 760                 765
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
    770                 775                 780
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
785                 790                 795                 800
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
                805                 810                 815
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            820                 825                 830
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
        835                 840                 845
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    850                 855                 860
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
865                 870                 875                 880
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
                885                 890                 895
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            900                 905                 910
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        915                 920                 925
Leu Gly Lys
    930
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2的铰链区
<400>28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
 1               5                  10
<210>29
<211>326
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>30
<211>948
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>30
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys
            20                  25                  30
Ile Lys Ser Ala Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu
        35                  40                  45
Pro Cys Thr Asp Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg
    50                  55                  60
Asn Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu
65                  70                  75                  80
Arg Asp Glu Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys
                85                  90                  95
Thr Glu Asp Ile Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser
            100                 105                 110
Cys Ile Asn Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu
        115                 120                 125
Lys Leu Leu Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp
    130                 135                 140
Glu Gln Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly
                165                 170                 175
Thr Asp Asp Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro
            180                 185                 190
Arg Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr
        195                 200                 205
Lys Glu Ala Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg
    210                 215                 220
Leu Ile Arg Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala
225                 230                 235                 240
Leu Glu Met Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala
                245                 250                 255
Thr Ala Lys Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys
            260                 265                 270
Met Thr Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly
        275                 280                 285
Lys Pro Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val
    290                 295                 300
Asn Ile Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp
                325                 330                 335
Leu Gln Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser
            340                 345                 350
Leu Ser Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu
        355                 360                 365
Tyr Gly Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr
    370                 375                 380
Val Asn Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala
385                 390                 395                 400
Ala Phe Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln
                405                 410                 415
Ile Arg Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp
            420                 425                 430
Ala Glu Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu
        435                 440                 445
Arg Ile Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn
    450                 455                 460
Asn Glu Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn
465                 470                 475                 480
Ile Ile Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu
                485                 490                 495
Arg Glu Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val
            500                 505                 510
Asn Ala Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly
        515                 520                 525
Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn
    530                 535                 540
Tyr Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe
545                 550                 555                 560
Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp
                565                 570                 575
Trp Thr Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met
            580                 585                 590
Val Tyr Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His
        595                 600                 605
Leu Asn Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly
    610                 615                 620
Leu Gly Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly
625                 630                 635                 640
Glu Glu Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe
                645                 650                 655
Phe Leu Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr
            660                 665                 670
Ala Val Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg
        675                 680                 685
Ile Ile Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His
    690                 695                 700
Cys Arg Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp
705                 710                 715                 720
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
                725                 730                 735
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            740                 745                 750
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        755                 760                 765
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    770                 775                 780
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
785                 790                 795                 800
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
                805                 810                 815
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
            820                 825                 830
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        835                 840                 845
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
    850                 855                 860
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
865                 870                 875                 880
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                885                 890                 895
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            900                 905                 910
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        915                 920                 925
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    930                 935                 940
Ser Pro Gly Lys
945
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
atgcggtacc ggctagcgtg gct                                                       23
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
tcagagtttt gcagccatga agtta                                                     25
<210>33
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt               60
gaccggtacc ggctagcgtg gcttct                                                    86
<210>34
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
aataccggtt ctagactcga gttttgcagc catgaagtta at                                  42
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
attctcgagt ccaaatatgg tcccccatg                                                 29
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
aataccggtt catttaccca gagacaggga gag                                            33
<210>37
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctataaccat ggagacagac acactcctgc               60
<210>38
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatttaccc agagacaggg agag                     54
<210>39
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt               60
gaccagtacc agacaagatc cccc                                                      84
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
aataccggtt ctagagaatt cgcacttgtg aggcgggtt                                      39
<210>41
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
gcgaattctg ggagtccaaa tatggtcccc catg                                           34
<210>42
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
cctcacaagt gcgaagtctg ggagtccaaa tatg                                           34
<210>43
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
catatttgga ctcccagact tcgcacttgt gagg                                           34
<210>44
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt c                                              31
<210>45
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
ggcactcgac acaacatttg cgctcccaaa cccggcactt cttttc                              46
<210>46
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
tccagaaaag aagtgccggg tttgggagcg caaatgttgt gtcga                               45
<210>47
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatttaccc ggagacaggg agaggctctt               60
c                                                                               61
<210>48
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt c                                              31
<210>49
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcaccaaacc cggcacttct tttc                     54
<210>50
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>50
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1                5                  10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
        35                  40
<210>51
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>天然存在的肽
<400>51
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
 1               5                  10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ile Ala
        35                  40
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光肽底物
<220>
<221>MOD_RES
<222>1
<223>Mca＝(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基
<220>
<221>MOD_RES
<222>8
<223>Dnp＝2，4-二硝基苯基
<400>52
Arg Pro Gly Phe Ser Ala Phe Lys
 1               5