用于检测MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类结合肽的方法和体系
阅读：1021发布：2021-01-03
专利汇可以提供用于检测MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类结合肽的方法和体系专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 基于这样的发现：固定于固体表面的MHC-I类和MHC-II类 单体 依然能够与合适的MHC结合肽形成复合物。本发明提供了测定肽与HLA单体结合的方法，测量两种MHC结合肽之间的相对结合度的方法，以及测量肽从MHC复合物上解离的解离率的方法。本发明也提供了用于进行本发明方法的体系和 试剂 盒 。，下面是用于检测MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类结合肽的方法和体系专利的具体信息内容。
1.一种包括固体表面的体系，其中所述表面附着有一个或多个MHC单体或修饰的MHC单体，其中所述单体从溶液中整合合适的MHC-结合肽。
2.根据权利要求1所述的体系，其中所述单体是MHC I类单体，所述单体在重构条件下整合所述MHC-结合肽。
3.根据权利要求1所述的体系，其中所述固体表面是珠。
4.根据权利要求1所述的体系，其中所述固体表面是在微量滴定板中。
5.根据权利要求1所述的体系，其中所述固体表面适合于在高流通量系统中筛选。
6.根据权利要求1所述的体系，其中所述单体在所述固体表面上的附着是可逆的。
7.根据权利要求1所述的体系，其中所述单体在所述固体表面上的附着是可分裂的。
8.根据权利要求1所述的体系，其中所述固体表面包被有第一结合配体，所述单体的C-末端提供有第二结合配体，其中所述第一结合配体与所述第二配体特异性结合。
9.根据权利要求7所述的体系，其中所述第一结合配体选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、StrepTactin、单体的抗生物素蛋白，所述第二结合配体是生物素。
10.根据权利要求8所述的体系，其中所述第二结合配体通过C-末端附着到所述单体上。
11.根据权利要求1所述的体系，其中所述单体是MHC I类单体，所述单体在变性条件下变性，在复性条件下复性以掺入MHC-结合肽。
12.根据权利要求11所述的体系，其中所述变性条件包括pH值为约2到约4。
13.根据权利要求1所述的体系，其中所述体系进一步包括特异性结合构象化表位的抗-MHC抗体，所述构象化表位存在于重构单体中而在变性单体中不存在。
14.根据权利要求1所述的体系，其中所述重构条件包括pH值约7到约8.5。
15.根据权利要求1所述的体系，其中所述体系还包括β2微球蛋白。
16.根据权利要求14所述的体系，其中所述单体是HLA I类单体。
17.根据权利要求15所述的体系，进一步包括抗-MHC I类单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异性结合重构单体，不结合变性单体。
18.根据权利要求17所述的体系，其中所述体系还包括β2微球蛋白和合适的由约8个到约12个氨基酸构成的HLA-结合肽；其中重构单体在重构条件下结合所述β2微球蛋白和所述合适的肽。
19.根据权利要求17所述的体系，其中单克隆抗体由杂交瘤B9.12.1产生。
20.根据权利要求1所述的体系，其中所述单体是HLA II类。
21.根据权利要求20所述的体系，进一步包括单克隆抗体，所述单克隆抗体区别结合到MHC-结合肽的单体和缺少MHC-结合肽的单体。
22.根据权利要求21所述的体系，其中所述单体是HLA II类，所述体系进一步包括合适的由从约10到约30个氨基酸构成的HLA-结合肽，其中重构单体在重构条件下结合到所述合适的肽上。
23.根据权利要求1、17或22所述的体系，其中所述包被有所述单体的固体表面是在干式下。
24.一种包括权利要求1、17或22所述体系的试剂盒。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，还包括一个说明书。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，进一步包括所述MHC单体在重构形式下结合到其上的对照肽。
27.一种用于确定MHC I类单体或修饰了的MHC I类单体和其推定的MHC-结合肽之间的结合作用的方法，所述方法包括：
在重构条件下，温育附着有许多MHC单体或修饰了的MHC单体的固体表面，在推定的MHC-结合肽存在和不存在的情况下，其中所述单体已经变性并在重构条件下重构形成包含有合适MHC-结合肽的复合物，和
在与单克隆抗体接触之后，测定所述MHC单体与单克隆抗体的结合，其中所述单克隆抗体结合MHC复合物而不结合MHC复合物的解离成分，与抗体结合表明所述单体与推定的MHC-结合肽的结合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中变性条件包括pH值在从约2到约4的范围内。
29.根据权利要求27所述的方法，进一步包括在重构条件下，在单克隆抗体存在下，用针对所述单体的标准MHC-结合肽单独温育所述单体，且其中所述测定包括比较由所述标准肽引起的抗体结合和由所述推定的MHC-结合肽引起的抗体结合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述单体是HLA I类，所述单克隆抗体是抗-MHC-I类抗体，所述重构条件包括存在用于单体重构的足够数量的β-2微球蛋白。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗体是HLA亚型A、B或C。
32.一种测定MHC II类单体或修饰了的MHC II类单体和其推定的MHC-结合肽之间的结合的方法，所述方法包括：
在合适的肽加载条件下，在推定的MHC-结合肽存在和不存在的情况下，温育附着有许多MHC单体或修饰了的MHC单体的固体表面，以便形成包含有合适的MHC-结合肽的复合物；和
测定所述MHC单体对推定的MHC-结合肽的结合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述单体是HLA II类单体，所述测定包括将所述复合物同测定MHC单体与推定的MHC-结合肽结合的单克隆抗体接触。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗体能区别结合到MHC-结合肽的抗体和不结合到MHC-结合肽的抗体。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述合适的肽加载条件包括pH值在从约2到约
4的范围内。
36.根据权利要求32所述的方法，进一步包括在合适的条件下，用针对所述单体的标准MHC-结合肽单独温育所述单体，且其中所述测定包括比较所述标准肽的结合和由所述推定的MHC-结合肽引起的结合。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述单体是HLA亚型D、DR、DP或DQ。
38.根据权利要求27或33所述的方法，其中所述单克隆抗体带有可检测的标记，所述测定包括检测该可检测的标记。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述可检测的标记是过氧化物酶。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述可检测的标记是特异性结合单克隆抗体的二级抗体。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述可检测标记是荧光的。
42.根据权利要求27或33所述的方法，其中所述固体表面是微量滴定板的孔，或珠，以及所述测定包括用荧光计读出荧光。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述测定还包括用高流通量扫描检测荧光。
44.根据权利要求27或32所述的方法，其中所述固体表面是用抗生物素蛋白包被的，所述单体被生物素化附着到该固体表面上。
45.根据权利要求27或21所述的方法，其中所述单体在所述固体表面上的附着是可逆的。
46.根据权利要求27或32所述的方法，其中所述单体在所述固体表面上的附着是可分裂的。
47.一种测定MHC I类单体或修饰了的MHC I类单体与它的推定的MHC-结合肽的结合亲和度的方法，所述方法包括：
用所述推定的MHC-结合肽和单克隆抗体温育至少一种附着于固体表面的变性MHC单体或修饰了的MHC单体，其中单克隆抗体特异性结合包含有相应重构MHC单体的第一复合物中的构象化表位而不结合MHC复合物的任何解离成分，其中温育是在重构条件进行；和比较单克隆抗体与包含有推定MHC-结合肽的MHC复合物的结合与单克隆抗体与包含有所述单体及一种已知MHC-结合肽的相应MHC复合物的结合，
其中，在所述结合上的差异表明，所述单体与所述推定MHC-结合肽的相对结合亲和度。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述重构条件包括温度在从约4℃到约37℃的范围内。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述重构条件包括温度在从约4℃到约8℃的范围内。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述重构条件包括pH值在从约7到约8.5的范围内。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述重构条件包括存在合适的重构缓冲液。
52.根据权利要求47所述的方法，其中所述单体在重构条件下进一步与β2微球蛋白结合，且所述单克隆抗体是抗-MHC-I类单克隆抗体。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述单克隆抗体选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤B9.12.1产生的。
55.一种测定MHC II类单体或修饰了的MHC II类单体与相应的推定MHC-结合肽的结合亲和度的方法，所述方法包括：
用所述推定的MHC-结合肽和单克隆抗体，在合适的结合条件下，温育至少一种附着于固体表面的MHC II单体或修饰了的MHC II单体，其中单克隆抗体特异性结合存在于包含有所述单体的第一复合物中的构象化表位而不结合MHC复合物的任何解离成分；和比较单克隆抗体与包含有推定MHC-结合肽的MHC复合物的结合与单克隆抗体与包含有所述单体及已知MHC-结合肽的相应MHC复合物的结合，其中，结合差异表明所述单体与所述推定MHC-结合肽的相对结合亲和度。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述结合条件包括pH值在从约4到约8的范围内。
57.根据权利要求47或55所述的方法，其中所述温育是进行从约12小时到约48小时的一个时期。
58.根据权利要求47或55所述的方法，其中所述抗体提供有可检测的标记，其中所述结合比较包括检测由因结合到抗体导致的可检测标记产生的各个信号的差异。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述抗体用荧光标记进行标记，且所述结合比较包括检测由因结合到抗体导致的各个荧光的差异。
60.根据权利要求59所述的方法，其中荧光标记是异硫氰酸荧光素(FITC)。
61.根据权利要求47或55所述的方法，其中固体表面是微量滴定板的孔或珠，且所述检测包括用荧光计读出荧光。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述检测进一步包括用高通量扫描检测荧光。
63.根据权利要求55所述的方法，其中所述单体选自HLA-D、DR、DP或DQ亚型。
64.根据权利要求47或55所述的方法，其中所述单体是嵌合的。
65.根据权利要求47或55所述的方法，其中所述结合差异是在包括溶解测验温度的条件下、在温育包括所述推定的MHC结合肽和所述已知肽的MHC复合物之后被比较的，其中所述温育在能够足以表明所述推定的MHC-结合肽的相对溶解率的时间里进行。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述溶解试验温度是在从约4℃到约37℃的范围内。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述时间是从约2小时到约48小时。
用于检测MHC-I类和MHC-II类结合肽的方法和体系
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
背景技术
[0004] I类组织相容性三元复合体(Class I histocompatibility ternary complex)由通过非共价键结合的三部分组成。一个跨膜蛋白，叫作主要组织相容性抗原复合体重链(MHC重链，MHC heavy chain)，大部分地暴露于细胞表面。MHC重链的细胞表面区域包括两个α-螺旋片段，这两个α-螺旋片段形成两个脊(ridge)，在脊之间有一个槽(groove)。一个短肽以非共价键的方式结合到(“装配到”)这两个α-螺旋片段之间的槽中，一个β-2-微球蛋白分子(β2微球蛋白分子)以非共价键的方式沿着MHC单体的外部两个区域侧面结合，形成三元复合体。以非共价键的方式结合到一个MHC亚型重链上的肽通常将不结合到另外一个亚型(subtype)上。然而，都与同型的β-2微球蛋白结合。MHC分子被大部分的机体细胞合成并展示(displayed)。
[0005] 在人体中，MHC分子被称为HLA分子。人体主要合成三个不同亚型的MHC-I类分子，称作HLA-A、HLA-B和HLA-C，仅在重链上有所不同。
[0006] MHC与T细胞的特化型(细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell))协同工作，来去除机体的“异体”或外源病毒蛋白。位于T细胞上的抗原受体识别一个表位(抗原决定簇，epitope)，表位是一个嵌合体(mosaic)，由被结合蛋白和位于被结合蛋白侧面的构成结合槽的部分α-螺旋组成。然后通过对外源蛋白进行切割产生肽片段，通过MHC分子呈递肽片段，使得MHC限制的细胞毒性T细胞(MHC-restricted cytotoxic T cells)来监测表达“异体”蛋白和外源病毒蛋白的细胞。一旦识别了含有结合的抗原肽的MHC分子，功能性T-细胞(functional T-cell)将显示细胞毒性免疫应答(cytotoxic immune response)，其中T-细胞对结合的抗原肽(antigenic peptide)具有特异性。
[0007] 在人体中执行这些功能时，HLA-A、B、和C重链与多个肽作用，长度为约8到约10个，可能约8到约11个，或约8到约12个氨基酸。尽管某些亚型进行交叉反应(cross-react)，只有某些肽在单体折叠时结合进位于每个HLA I类亚型的重链中的结合口袋(binding pocket)中。到1995年，43个HLA-A、89个HLA-B和11个HLA-C等位基因中的每一个的全部编码区域序列已经被测定(P.Parham et al.，Immunology Review 143：141-180，1995)。
[0008] II类组织相容性分子由两个跨膜多肽组成，这两个跨膜多肽在它们的外部端相互作用形成一个槽，该槽象I类分子中的槽，以非共价键的方式与抗原肽(antigenic peptide)缔合。然而，结合到II类分子上的抗原肽是来自细胞从其周围吸收获得的抗原。此外，结合到II类组织相容性分子上的肽长约10个到约30个的氨基酸，例如长约12个到约24个氨基酸(Marsh，S.GE.et al.(2000)The HLA Facts Book，Academic Press，p.58-59)。
[0009] 只有专门从细胞外液(extracellular fluids)中捕获抗原的细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells)和B-淋巴细胞，表达II类分子。
[0010] 长期以来，一直认为，哪种抗源片段将被I类MHC限制性细胞毒性T细胞识别的发现，能导致开发针对癌症和病毒的有效疫苗。已经开发出许多方法，其中多个算法被用于推定HLA A、B、或C-结合肽的氨基酸序列，并且一些算法可以在互联网上找到。例如，美国专利号6,037,135描述了以矩阵为基础的算法，该算法按照结合任何给定的HLA-A等位基因的可能性对肽进行分等。类似地，大部分的预测方法局限于一组等位基因。相应地，预测的肽可能不能结合到来自整个患者群体的MHC单体上，因此不可以全世界通用。用于HLA-II类分子的算法也已经被描述过，例如EPIMATRlX、SYFPEITHI、TEPITORS、PROPRED和EPIPREDICT。
[0011] 鉴定MHC结合肽的另外一个方法使用了以竞争为基础的结合测定方法。所有竞争性测定(competition assay)产生了不同肽的结合亲和力的比较。然而，这种测定方法不能得到绝对解离常数(absolute dissociation constant)，因为该结果依赖于所使用的参考肽。
[0012] 还有一种用于测定MHC结合肽的方法，是传统的重组测定(reconstitution assay)，例如使用“T2”细胞，在测定中，表达合适的MHC等位基因的细胞被“剥”掉天然结合肽，对I类分子，是通过在pH2-3下温育一小段时间进行；对II类分子而言，是通过在pH4.5-5.5下温育进行的。然后，为了测量推定的MHC-结合肽对同一MHC等位基因的亲和力，在溶液中，将剥下的MHC单体与推定的MHC-结合肽，和β2-微球蛋白(在I类单体的情形中)，和一种依赖于构象的单克隆抗体(conformation-dependent monoclonal antibody)相结合。标记之后，荧光强度上的差异能被用来测量试验肽的结合，其中荧光强度上的差异是在用和不用试验结合肽温育的细胞之间确定的，例如，直接借助标记的单克隆抗体或荧光标记的第二抗体。然而，在低pH值下所剥离的可溶性MHC单体会立即聚集，这使得它们难以运用于高流通量测定(high through-put assays)，从而不切实际。
[0013] 现在有一系列用于细胞介导免疫性(cell-mediated immunity)的体外测定方法，其中使用来自供体的细胞。这些测定包括细胞来自供体的情况。然而，许多测定方法提供其他来源的抗原呈递细胞(antigen presenting cells)，例如B细胞系。这些体外测定包括细胞毒性T淋巴细胞测定(cytotoxic T lymphocyte assay)；淋巴增殖测定(lymphoproliferative assay)例如氚化胸腺嘧啶掺入(tritiated thymidine incorporation)；蛋 白激酶测定(protein kinase assays)、离子转运 测定(ion transport assay)以及淋巴细胞移动抑制功能测定(lymphocyte migration inhibition function assay)(Hickling，J.K.et al，J.Virol.，61：3463(1987)；Hengel，H.et al，J.Immunol.，139：4196(1987)；Thorley-Lawson，D.A.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：5384(1987)；Kadival，G.J.et al，J.Immunol.，139：2447(1987)；Samuelson，L.E.et al，J.Immunol.，139：2708(1987)；Cason，J.et al，J.Immunol.Meth.，102：109(1987)；以及Tsein，R.J.et al，Nature，293：68(1982)。这些测定方法是不适宜的，因为它们缺少针对细胞介导免疫性活性的真正特异性，它们需要由同一MHC型的抗原呈递细胞(APC)处理和呈递抗原，它们是缓慢的(有时持续几天)，并且有些是主观性的和/或需要使用放射性同位素。
[0014] 鉴定MHC I类或II类-结合肽的再一个另外方法利用MHC四聚体的形成，其中MHC四聚体为四个MHC单体和链霉抗生物素蛋白形成的复合体，其中链霉抗生物素蛋白是一种具有四个生物素结合位点的分子，在其上结合荧光染料，例如藻红蛋白。例如，对于I类单体，β-2微球蛋白的可溶性亚基，以及MHC重链或对应于感兴趣的肽段的推定的MHC亚型的MHC的可溶性亚基，可以通过在宿主中表达多肽而获得，其中β-2微球蛋白是包含有推定的T-细胞表位的肽段。包含在MHC四聚体中的四个单体中的每一个都是以单体形式产生的，例如，在有利于将这些可溶性单元装配的条件下，通过重新折叠这些可溶性单元形成重构单体(reconstituted monomers)，每一个重构单体包括β-2微球蛋白、肽片段、和相应的MHC重链。MHC四聚体由单体构建而得，是通过生物素化单体、然后将生物素化的重构单体与荧光染料标记的链霉抗生物素蛋白接触构建而得。当与相异种群的T细胞接触时，诸如包含于一个患者的外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)的样品中的T细胞种群，那些包含有被样品中的T细胞识别的重构单体的四聚体将结合到匹配的T细胞上。用荧光流式细胞计数术(fluorescence flow cytometry)分析反应的所含成分，来确定、量化和/或分离那些在其上结合有MHC四聚体的T细胞(见美国专利5,635,363)。
[0015] 需要至少一种其他试验，来确定四聚体测定中被T-细胞识别的试验肽(test peptide)是否将激活T-细胞来产生免疫应答，即所谓的“功能试验”。酶联免疫斑点(ELISpot)测定已经被适应性修改，用于检测单个细胞，这些单个细胞分泌特定细胞因子或其他效应分子，是通过在微量板上将对细胞因子或效应分子具有特异性的单克隆抗体进行附着而检测。将受到抗原刺激的细胞与固定化抗体接触。在洗去细胞和任何未结合的物质之后，将对同一细胞因子或其他效应物分子具有特异性的带标记的多克隆抗体，或更经常地是单克隆抗体加入到孔中。洗涤之后，加入能结合带标记抗体的着色剂，以便在细胞因子定位的位点形成蓝-黑色沉淀(或斑点)。可以人工或用自动酶联免疫斑点读出系统(automated ELISpot reader system)计数斑点，以便量化应答。试验肽对T细胞激活的最终确认可能要求进行体内测验，例如在小鼠模型中。因此，MHC-结合肽的功效的最终确认的路线是昂贵且耗时的。
[0016] 随后又发展了一种形成MHC II类四聚体的类似方法，只是α和β链不是由大肠杆菌产生，而是由昆虫细胞产生。用α和β链转染昆虫细胞，并分泌在上清中。分泌的分子是空心的，可以装载需要的MHC-结合肽。在装载上肽之后，单体进行生物素化并与结合到荧光染料上的链霉抗生物素蛋白四聚体化。
[0017] 因此，本领域还需要用于初步筛选测定，即鉴定推定的MHC I类和II类结合肽的新颖的、更好的体系和方法，也需要用于测量肽结合MHC等位基因，如HLA-A、B、C或D，DR，DP或DQ的新颖的、更好的体系和方法，尤其是固相形式的体外测定。本领域还需要开发出确定MHC结合肽的MHC结合亲和力的方法，以及需要对已结合肽从MHC分子解离下来的解离速率的测量技术。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明基于这样的发现：当固定于一个固体表面上时，MHC-I类和MHC-II类单体依然能够从溶液中整合MHC结合肽，并形成MHC复合物。
[0020] 相应地，在一个实施方案中，本发明提供了包括一个固体表面的体系，其中，表面附着有一个或多个MHC I类或II类单体，或修饰了的MHC I类或II类单体。I类单体在变性条件下变性；并在重构条件下重构，形成在结合口袋中包含有合适的MHC结合肽的三元复合物。在pH范围从4到约8的范围内，MHC II类单体从溶液中结合MHC结合肽(MHC-binding peptide)。在另外一个实施方案中，也提供了包括本发明体系的试剂盒。
[0021] 在另外的一个实施方案中，本发明提供了用于确定MHC I类单体或修饰的MHC I类单体和推定的MHC结合肽之间的结合作用的方法，包括，在重构条件下，在存在和不存在推定的MHC结合肽的情况下，温育附着有许多预先变性的MHC I类单体或修饰了的MHC I类单体的固体表面，以便单体在重构条件下重构形成包括合适的MHC结合肽的三元复合物。不结合MHC复合物的解离部分的单克隆抗体与三元复合物的结合，显示出推定的MHC结合肽和单体之间的结合。另一个方法包括使用荧光标记的肽，去确定未知肽是否能与荧光标记的肽竞争结合到HLA分子上。
[0022] 仍然在另外的一个实施方案中，本发明提供了用于确定MHC II类单体或修饰了的MHC II类单体和与其有关的推定的MHC结合肽之间的结合作用的方法，通过在合适的肽加载条件(peptide loading condition)下，在存在和不存在推定的MHC结合肽的情况下，温育其上附着有许多MHC单体或修饰了的MHC单体的固体表面，以便形成包含有合适的MHC结合肽的复合物，并确定MHC单体和推定的MHC结合肽的结合。
[0023] 在另外的一个实施方案中，本发明提供了用于确定MHC I类单体或修饰了的MHC I类单体相对于它们的推定的MHC结合肽的结合亲和度(degree of binding affinity)的方法，通过在重构条件下，用推定的MHC结合肽和单克隆抗体与至少一种附着到固体表面上的此类变性MHC单体或修饰了的MHC单体进行温育，其中单克隆抗体特异性地结合到包含相应的重构MHC单体的第一复合物中的一个构象化表位上，而不结合到MHC复合物的任意解离的组分上；并将，单克隆抗体与包含有推定的MHC结合肽的MHC复合物的结合作用，和单克隆抗体与相应的含有该单体和已知MHC结合肽的复合物的结合作用进行比较。结合作用上的差异表明，重构单体与推定MHC-结合肽的结合亲和的相对程度。
[0024] 仍然在另外一个实施方案中，本发明提供了用于确定MHC II类单体或修饰了的MHCII类单体与相对于它们的推定的MHC结合肽的结合亲和程度的方法，通过在合适的肽加载的条件下，用推定的MHC结合肽和单克隆抗体与至少一种附着到固体表面上的MHC II类单体或修饰了的MHCII类单体温育，其中单克隆抗体特异性结合到包含该MHC单体的第一复合物中的一个表位上，而不结合到MHC复合物的任何解离成分上；并比较单克隆抗体与包含有推定MHC结合肽的MHC复合物的结合和单克隆抗体与含有该单体和已知MHC结合肽的相应复合物的结合。在结合上的差异表明，重构单体对推定的MHC-结合肽的结合亲和性的相对程度。
[0025] 在另外的一个实施方案中，本发明提供了用于确定MHC单体或修饰了的MHC单体与其推定的MHC结合肽在不同温度下，特别是在37℃下的稳定性的方法。在这个实施方案中，在重构条件下，用推定的MHC结合肽和特异性结合相应重构MHC单体的一个构象化表位的单克隆抗体与至少一种附着到固体表面的变性MHC单体或修饰了的MHC单体温育，相应重构MHC单体不存在于该变性单体中。用单克隆抗体对重构的三元复合物，在不同温度下和不同时间里进行温育之后。在不同温度和不同时间里获得的信号上的差异显示出，重构单体与推定的MHC结合肽的相对稳定性。附图说明
[0026] 图1是免疫测定的示意图。
[0027] 图2是一个曲线图，显示荧光测定中的抗-HLA-I类-FITC单克隆抗体(anti-HLA-class I-FITC mAb)的校准。
[0028] 图3是一个曲线图，显示随着温度增加，抗-HLA-I类-FITC单克隆抗体对重构HLA重链单体Mart l 26-35的结合性的降低，依据已结合抗体的荧光测定。
[0029] 图4是一个曲线图，显示抗-HLA-I类-FITC单克隆抗体与人和小鼠等位基因的结合作用，依据已结合抗体的荧光测定。
[0030] 10028]图5是显示附着到板上的MHC重链单体在各种缓冲液中的复性的曲线图，用抗-HLA-I类-FITC单克隆抗体检测。
[0031] 图6是一个曲线图，显示1到2μg/ml浓度的抗-HLA-I类单克隆抗体与各种HLA重链单体浓度的结合，以确定用于微量滴定板测定的抗-HLA-I类抗体的最适浓度。
[0032] 图7A和7B是曲线图，显示在两种不同的HLA重链单体下的剂量应答曲线。图7A显示HLA-A*0201/Martl 2635L的结果(线性回归方程：y＝1555.5x+39.787；R2＝0.9889)；图7B显示HLA重链单体HLA-A*0201/HIVpol的结果(线性回归方程：y＝1487.1x+13.927；
R2＝0.9982)。
R2＝0.9982)。
[0033] 图8是一个曲线图，显示抗-HLA-I类抗体对各种HLA-A和HLA-B等位基因的特异性。
[0034] 图9是一个示意性图画，显示根据本发明的人-小鼠嵌合MHC修饰单体的形成。
[0035] 图10A-D是显示复性肽的解离曲线的曲线图(分别是HBV核心肽；26-35L；26-35；27-35)。
[0036] 图10E-H分别显示了肽HBV核心区；26-35L；26-35；和27-35的脱离率的曲线图。
[0037] 图10I显示了温度对于单体解离的影响。
[0038] 发明详述
[0039] 本发明主要涉及免疫测定，特指MHC I类和II类单体，尤其是是固定于固体表面的MHC I类和II类单体与推定的MHC结合肽的结合亲和力的检测和测量。本发明发现，固定于固体表面的MHC单体或修饰了的MHC单体依然能够重折叠(refolding)，以致可以通过从溶液中结合具有必要亲和力的MHC结合肽来形成MHC复合物。此外，本发明也发现此种结合可以以免疫测定的形式被检测，例如一种是利用构象依赖性单克隆抗体，构象依赖性单克隆抗体能特异性结合包含此种重折叠的或重构的MHC单体的MHC复合物，但不结合MHC复合物的解离组分。
[0040] 如本文中所使用的，术语“MHC单体”和“HLA单体”，当用于表示MHC I类分子时，是指在复性条件下保持与合适的MHC结合肽或HLA结合肽和β-2微球蛋白组装成三元复合物的能力的I类重链。这些术语也用于表示变性形式的I类单体，其通过将各个复合物置于变性条件下，导致单体解折叠并从MHC结合肽(对I类单体来说，包括从β-2微球蛋白上)上解离下来而产生。当用于表示MHC II类分子时，术语“MHC单体”和“HLA单体”是指保持组装成异源二聚体能力的II类α和β链，异源二聚体在合适的肽加载条件下、从溶液中结合合适的MHC结合肽或HLA结合肽形成MHC复合物。II类单体不需要变性，并在MHC结合肽存在的情况下复性，从溶液中结合这种肽，例如在pH值约4到约8的范围内。
[0041] 如本文中所用的，术语“修饰的MHC单体”和“修饰的HLA单体”是指上述描述的I类和II类单体，但其已经被工程化从而引入如下述描述的修饰。这些术语也包括MHC单体的功能片段，其保持在复性条件下与合适的MHC结合肽或HLA结合肽(对I类单体来说，还有β-2微球蛋白)组装成MHC复合物的能力，以及在变性条件解离的能力。例如，功能片段可以只包括I类重链的α-1，α-2，α-3区域，或只包括α-1，α-2区域，即细胞表面区域，其参与三元复合物的形成。
[0042] MHC II类单体由两个跨膜多肽链组成，每条链包含胞外区，跨膜区和胞内尾。胞外区结合在一起，形成MHC II类异源二聚体。这些多肽的每一个(已知为α和β)折叠形成两个独立的胞外区：对α多肽来说，为α-1和α-2；对β多肽来说，为β-1和β-2。在α-1和β-1结构域之间，有一个已知为结合口袋(binding pocket)或“槽(groove)”的区域，结合口袋在底部以β-折叠片为界，在侧面以两个α-螺旋为界，并能够结合(通过非共价相互作用)MHC II类结合肽。该MHC II类结合肽被“提呈”到TH-细胞上，并确定抗原“表位”，TH-细胞对其进行识别。修饰了的MHC II类单体可以是只包含有α和β链的胞外区的异源二聚体。
[0043] 在另外的一个实施方案中，修饰了的MHC单体可以是I类重链分子，或其功能片段，包含在融合蛋白或“单链”分子中，并且还可以包括充当单体的细胞表面区域之间的接头的氨基酸序列、充当可测定标记的氨基酸序列、或充当将分子附着到固体支持物上的配体的氨基酸序列，其中固体支持物包被有融合蛋白中的配体与之反应的第二配体。此外，术语“修饰的MHC单体”和“修饰了的HLA单体”旨在包括嵌合体，其中包含来自一个以上物种的MHC I类和II类分子的结构域或来自一个以上的I类或II类亚型的MHC I类和II类分子的结构域。本文中的图9示例性说明了制备嵌合体，是通过用小鼠H-2Kb区域取代人HLA-A2片段中的三个α区域中的一个α区域来制备。如同本技术领域所已知的，此种分子便利地表达为单链，在亚基之间有任选的氨基酸接头(linker)或表达为融合蛋白。
[0044] 在另外的一个实施方案中，修饰了的MHC单体可以是只包含有α和β链胞外区域的II类异源二聚体。每个多肽链还可以在C-末端加入亮氨酸拉链序列(如或者Fos或者Jun)，其中一条链可以进一步被修饰，加入包含有BirA酶的天然识别位点的氨基酸片段(segment)，发现其存在于MHC II DR4β链中，充当该融合蛋白的C-末端的生物素化标签。
[0045] 单体的制备
[0046] 位于人类6号染色体上，I类MHC有三个基因座：HLA-A、HLA-B和HLA-C。前两个位点具有大量编码同种抗原(alloantigens)的等位基因。发现它们由一个44Kd的重链亚基和一个12Kb的β2微球蛋白亚基组成，这对于所有的抗原特异性是共同的。例如，木瓜蛋白酶将纯合人类淋巴母细胞细胞系J-Y的质膜消化之后，可以纯化到可溶性HLA-A2，正如由Tumer，M.J.et al.，J.Biol.Chem.(1977)252：7555-7567所描述的。木瓜蛋白酶在靠近跨膜区处切割该44Kd重链，形成一个包括α1、α2和α3区域和β2微球蛋白的分子。
[0047] MHC单体可以从合适的细胞分离，或可以重组产生，例如，正如由Paul et al，Fundamental Immunology，2d Ed.，W.E.Paul，ed.，Ravens Press N.Y.1989，第16-18章中所描述的，并容易用下述方法修饰。
[0048] 术语“分离的”，在本文中当运用于MHC单体时，是指MHC I类或II类的MHC糖蛋白，其不同于它的天然状态，例如，不结合于正常表达MHC的细胞的细胞膜。该术语囊括全长的亚基链，以及MHC单体的功能片段(功能片段)。功能片段是一个包括抗原结合位点以及被合适的T细胞受体识别所必须的序列的片段。它通常包括占全长链的序列的至少约60-80％，一般90-95％的序列。如本文中描述的，“分离的”MHC亚基组分可以重组产生，或从合适的细胞来源中增溶得到。
[0049] 众所周知，因为序列中的一个或者多个氨基酸的删除、置换和插入或添加的缘故，“成熟的”MHC糖蛋白单体的天然形式在长度上将稍有变化。因此，MHC单体容易必定遭遇重大的天然修饰，而依然有能力保持它们的功能。修饰了的蛋白链也可以容易地被设计出来，并利用本领域技术人员熟知的和下面详细描述的各种重组DNA技术制备而得。例如，可以通过氨基酸的置换、增加、删除及其类似方法，这些链可以在一级结构水平上由天然产生的序列变化而来。这些修饰可以以许多组合方式使用，以便产生最终的修饰蛋白链。
[0050] 通常，编码MHC单体的基因的修饰可以由许多已知的技术很容易地完成，如定点突变(site-directed mutagenesis)。任何特定的修饰效果可以通过在合适的测定方法中常规筛选所需要的特征来评估。例如，亚基免疫学特征的改变，可以用合适的抗体，由竞争性免疫测定(competitive immunoassay)来检测。单体激活T细胞的能力的修饰效果可以用标准体外细胞测定(standard in vitro cellular assay)或下述实施例部分描述的方法来测试。其他特性的修饰，如氧化还原或热稳定性、疏水性、对蛋白酶解的敏感性、或聚集的趋向性(tendency to aggregate)的修饰都根据标准技术进行测定。
[0051] 本发明提供了，依据各种所能想到的目的，所可以制备的MHC单体的氨基酸序列修饰，包括增加亚基与抗原性肽和/或T细胞受体的亲和力；促进稳定性；纯化和制备亚基。也可以修改变单体，以便修改血浆半衰期(plasma half-life)；改善治疗效果；或减小在本发明复合物的治疗使用时的副作用的严重性和发生。亚基的氨基酸序列的修饰通常是预先设定的变体，其未见于自然界中或天然存在的等位基因中。变体通常显示出与天然发生等同物同样的生物学活性(如，MHC-肽结合作用)。
[0052] 本发明的插入型修饰是指那些在其中将一个或多个氨基酸残基引入进MHC单体中的预先确定的位点、并替换先前存在的残基的修饰。例如，插入性修饰可以是将异源蛋白质或多肽融合到这些亚单位的氨基末端或羧基末端。
[0053] 其他修饰包括，将单体与异源信号序列融合和将单体与具有加强了的血浆半衰期(通常＞约20小时)的多肽，诸如本领域已知的免疫球蛋白链及其片段的融合。
[0054] 置换修饰(substitutional modifications)是指那些其中至少一个残基被去除、并在其位置上插入一个不同的残基的修饰。非天然氨基酸(也就是，通常不在天然蛋白质中发现的氨基酸)，以及同构类似物(氨基酸或其他物质)也适用于在本发明中。
[0055] 功能或免疫学鉴定上的实质性改变是通过选择置换残基实现的，这些置换残基在维持多肽骨架结构(例如片或螺旋构象)、该分子在靶位点的电荷或疏水性、或侧链的大小上具有不同的作用。一般希望在功能上产生最大改变的置换是那些(a)亲水性残基，如丝氨酸或苏氨酸替换为(或者被...替换)疏水性残基，如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸；(b)半胱氨酸或脯氨酸替换为((或者被...替换)任何其他残基；(c)具有正电荷侧链的残基，如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，被替换为(或者被...替换)负电荷残基如谷氨酸或天冬氨酸；或，(d)具有大侧链的残基，如苯丙氨酸被替换为(或者被...替换)不具有侧链的残基如甘氨酸。
[0056] 单体的置换修饰也包括其他蛋白质的功能上的同源(具有至少70％的同源性)区域依据常规的方法被一个或多个MHC亚基区域置换。用于这种目的的特别优选的蛋白质是来自其他物种，如本文图9中显示的鼠类物种的结构域。
[0057] 修饰的另一个类别是删除修饰。删除是以从MHC单体序列中去除一个或多个氨基酸残基为特征。通常，跨膜和胞质结构域被删除掉。删除胱氨酸或其他不稳定氨基酸也是可取的，例如在增加MHC复合物的氧化稳定性时。删除或置换潜在的蛋白水解位点，如ArgArg，可以通过删除其中一个碱性氨基酸残基或通过用谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基置换其中一个碱性氨基酸残基予以实现。
[0058] 置换或删除修饰的优选类型包括那些涉及亚基的跨膜区域的修饰类型。MHC单体的跨膜区域是高度疏水性的或亲脂性的区域，其大小正好横跨细胞膜的脂双层。人们认为它们在细胞膜上锚定MHC分子。跨膜区域的失活，通常通过删除或置换跨膜区域的羟基化作用残基，将有助于回收和制成制剂，是通过减少它的细胞内或膜脂亲和力和改善它的水溶性而实现。替代性地，跨膜和胞质区域可以被删除，以避免引入潜在的免疫原性表位。细胞膜结合功能的失活作用通过删除足够的残基以在这一位置产生充分亲水的亲水性分布图来实现，或通过用异性残基(heterologous residues)置换实现，其获得同样的结果。
[0059] 跨膜失活MHC单体的一个主要优点是，它可以被分泌到重组宿主的培养基中。该变体在体液中，如在血液中是可溶性的，并且对细胞膜脂质不具有可觉察到的亲和力，因此大大地简化其从重组细胞培养基中的回收过程。典型地，本发明的修饰了的MHC单体将不具有功能性跨膜区域，且更优选不具有功能性胞质区序列。这种修饰了的MHC单体将主要由MHC单体胞外区域的有效部分组成。在一些情况下，该单体包括来自跨膜区域的序列(最多达到大约10个氨基酸)，只要不明显影响溶解性。
[0060] 例如，跨膜区域可以被任何氨基酸序列，如随机的或预先确定的约5到50个丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和类似的亲水性残基序列置换，它们一起显示出亲水的亲水性分布图。同删除(截短)的单体一样，这些单体被分泌到重组宿主的培养基中。
[0061] 糖基化变体(变异体，variants)也包括在本发明的范围之内。它们包括完全缺少糖基化作用(未糖基化的)的变体和比天然形式(去糖基化的)至少少一个糖基化位点的变体，以及糖基化作用已经被改变的变体。包括去糖基化和未糖基化的氨基酸序列变体，具有天然未修饰氨基酸序列的去糖基化和未糖基化的亚基。例如，置换或删除突变被用于消除亚基的N-或O-连接的糖基化位点，例如天冬氨酸残基被删除或被其他碱性氨基酸如赖氨酸或组氨酸置换。替代性地，即使天冬氨酸残基保持不变，为了通过消除糖基化识别位点来防止糖基化作用，置换或删除构成糖基化位点的侧翼残基(flanking residues)。还有，在重组原核细胞培养物中产生具有天然单体的氨基酸序列的未糖基化MHC单体，这是因为原核细胞不能将糖基化引入多肽中。
[0062] 通过选择合适的宿主细胞或通过体外方法，能容易地产生糖基化变体。例如，酵母引入糖基化作用，显著不同于哺乳动物系统所引入的糖基化作用。类似地，哺乳动物细胞，具有与MHC来源不同的物种(如仓鼠、鼠、昆虫、猪、牛或羊)或者组织起源(如肺、肝、淋巴、间充质的、表皮的)，是通常依据引入变体糖基化的能力进行筛选，特征在于，例如以高甘露糖水平，或者甘露糖、海藻糖、唾液酸和其他在哺乳动物糖蛋白中常见的糖的比例不同为特征。亚基的体外加工通常通过酶促水解来完成，如神经氨酸酶消化。
[0063] 通过使用许多技术，包括用木瓜蛋白酶处理、用3M KCl处理和用去污剂处理的溶解作用，已经从多种细胞中分离得到适于本发明使用的MHC糖蛋白。例如，对I类蛋白，可以应用去污剂提取，再进行亲和纯化。然后，可以通过透析或选择性结合珠去除去污剂。这些分子能从任何带有MHC I类的细胞中分离得到，例如，从患有目标癌症或病毒性疾病的个体上获得。
[0064] 通过使用本领域技术人员熟悉的标准技术，可以容易地从分离的MHC糖蛋白上分离得到单个重链。例如，重链可以使用SDS/PAGE分开，并从凝胶上电洗脱重链(例如，参见Dornmair et al.，见上文；和Hunkapiller，et al.，Methods in Enzymol.91：227-236(1983)。MHC分子的单独亚基也可以用SDS/PAGE和随后的电洗脱分离得到，如在Gorga et al.J.Biol.Chem.262：16087-16094(1987)和Dommair et al.Cold Spring Harbor Symmp.Quant.Biol.54：409-416(1989)中所描述的。本领域技术人员将认识到可以使用许多其他的用于分离分子的方法，如离子交换层析、尺寸排阻层析或亲和层析。
[0065] 可选择地，许多MHC单体蛋白的氨基酸序列是已知的，基因已经被克隆到；因此，使用重组体方法可以表达单体。这些技术可以实现上面描述的对MHC单体的多种修饰。例如，重组体技术提供了用于羧基末端截短的方法，其删除了疏水性跨膜区域。可以人为地选择羧基端，以便于结合配体或标记物，例如将半胱氨酸和/或赖氨酸残基引入到该分子中。合成基因通常包括限制性位点，以帮助插入到表达载体中，以及操作基因序列。然后，将编码合适单体的基因插入到表达载体中，在合适的宿主例如大肠杆菌、酵母、昆虫或其他合适的细胞中表达，并获得重组蛋白。
[0066] 由于基因的可得性，使得可以容易的操作序列，构建的第二世代包括嵌合构建物，例如，如图9中所示。I类重链的α1、α2、α3区域通常由I类α3区域与β-2微球蛋白连接，并共表达以稳定MHC复合物。也可以任选地包括I类基因的跨膜和胞内区域。
[0067] 表达载体的构建并由合适的DNA序列产生重组子，是用本领域已知的方法进行。用标准方法进行DNA和RNA分离、扩增和克隆。通常，涉及DNA连接酶、NDA聚合酶、限制性内切酶和类似酶的酶反应是依据厂家说明书操作。这些技术和各种其他技术通常依据Sambrook et al.，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989进行操作。本文中的程序相信是本领域公知的。
[0068] 可以在原核细胞或真核细胞系统中进行表达。合适的真核细胞包括酵母、植物和昆虫系统，诸如处于诱导启动子下的果蝇表达载体。最常见的原核细胞是以各种大肠杆菌(E.coli)菌株为代表。然而，其他微生物菌株也可以使用，例如杆菌，如枯草杆菌(Bacillus subtilis)，假单胞菌属(Pseudomonas)的各种，或其他细菌菌株。在这种原核细胞系统中，使用来自与宿主相容的物种的、包含复制点和控制序列的质粒载体。例如，大肠杆菌通常用pBR322的衍生物转化，pBR322是来自一个大肠杆菌物种的质粒，如Bolivar et al.，Gene(1977)2：95中描述的。在此定义中，经常使用的原核细胞控制序列旨在包括用于转录起始的启动子，也任选地包括操纵子，以及核糖体结合位点序列，包括这么些经常使用的启动子：如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Change etal.，Nature(1977)198：1056)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel etal.，Nucleic Acids Res.(1980)8：4057)和λ衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake et al.，Nature(1981)292：128)。任何与原核生物相容的可以得到的启动子都可以使用。
[0069] 在真核宿主中有用的表达系统，包括来自合适的真核基因的启动子。一类用于酵母的启动子，例如，包括用于合成丙酮酸激酶的启动子，包括那些用于3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman，et al.，J.Biol.Chem.(1980)255：2073)。其他启动子包括，例如那些来自烯醇化酶基因的启动子(Holland，M.J.，et al.J.Biol.Chem.(1981)256：1385)或来自YEp 13的Leu2基因(Broach，J.，et al.，Gene(1978)。在诱导型启动子下的果蝇表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)也是可以使用的。
[0070] 适用的哺乳动物启动子包括来自SV40的早期或者晚期启动子(Fier，et al.，Nature(1978)273：113)或其他病毒启动子，如那些来自多形瘤病毒、腺病毒II、牛乳头瘤病毒或禽类肉瘤病毒的启动子。上面引用了适用的病毒和哺乳动物增强子。
[0071] 使用标准方法，利用标准连接和限制技术(其为本领域所理解)，通过将前述的调控元件可操作性地连接到MHC序列上，从而构建表达系统。分离的质粒、DNA序列、或合成的寡核苷酸以想要的形式切割、加尾和重新连接。
[0072] 点特异性DNA切割，是通过使用合适的限制性酶(或数种酶)处理而进行，酶处理在通常为本领域所理解的条件下进行，具体细节由这些商品化的限制性酶的厂家予以详细说明。一般来说，约1μg的质粒或DNA序列用处于约20μl缓冲液中的1单位酶切割；可以用过量的限制性酶以确保DNA底物完全消化。每一次温育之后，用苯酚/氯仿抽提去除蛋白质，可以再用醚抽提一次。用乙醇沉淀，然后在Sephadex G-50旋转柱(Sephadex G-50spin column)上过柱，从水相中回收核酸。如果需要，可以对切割片段进行大小分离。
[0073] 通过用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)，在四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)存在下，对限制性切割片段的末端处理成平末端。用Klenow进行处理之后，混合物用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，再在Sephadex G-50旋转柱上过柱。
[0074] 使用商购的自动寡核苷酸合成仪，制备合成的寡核苷酸。然而在本发明的蛋白质中，适宜用合成基因。基因设计可包括限制性位点，这使得容易对基因进行操作，以用这些编码类似物替代编码序列部分。
[0075] 可以通过首先用连接混合物转化来自大肠杆菌遗传学存放中心CGSC#6135(E.coli Genetic Stock Center，CGSC#6135)的大肠杆菌菌株MM294或其他合适宿主，来证实用于质粒构建的正确连接。可以通过氨苄青霉素、四环素或其他抗生素抗性或通过使用其他标记(依据质粒构建类型)来筛选成功的转化子，这些为本领域所知。然后可以制备来自转化子的质粒，任选地是在通过氯霉素扩增后。用限制酶来分析分离到的DNA，和/或用Sanger，F.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)74：5463中描述的和在Messing，et al.，Nucleic Acids Res.(1981)9：309中进一步描述的双脱氧法来测序，或用Maxam，et al.，Methods in Enzymology(1980)65：499中描述的方法来测序。
[0076] 然后将构建的载体转化到合适的宿主中，以生产该蛋白质。依据所使用的宿主细胞，使用适合此种细胞的标准技术完成转化。应用氯化钙的钙处理法，如Cohen，S.N.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1972)69：2110中描述，或描述于Maniatis，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)Cold Spring Harbor Press，p.254中的RbCl方法，用于具有坚实细胞壁阻隔物的原核细胞或其他细胞。对于没有此种细胞壁的哺乳动物来说，优选描述于Graham and van der Eb，Virology(1978)52：546中的磷酸钙沉淀法(calcium phosphate precipitation)或电穿孔技术。依据Van Solingen，P.，et al.，J.Bacter.(1977)130：946和Hsiao，C.L.，et al.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA中的方法将载体转化到酵母中。
[0077] 然后，转化的细胞在有助于表达MHC序列的条件下培养，并从培养基中回收重组产生的蛋白。
[0078] MHC-结合肽
[0079] 据认为抗原肽经蛋白水解成较小的肽单位之后，抗原被MHC糖蛋白提呈到抗原提呈细胞(APCs)的表面。这些较小的片段在抗原蛋白中的位置可以依据经验确定。I类MHC结合肽据认为长度约8到约10，可能约8到约11，或约8到约12个残基。II类MHC结合肽据认为长度约10到约30个氨基酸残基，例如，大约12个，或者在长度上到24个氨基酸残基。这些肽包含抗原限制位(被MHC分子识别)和表位(被T-细胞上的T-细胞受体识别)。表位是一个由约5到6个氨基酸组成的连续或不连续的序列，其被抗原特异性的T细胞受体识别。抗原限制位是一个负责肽与MHC I类糖蛋白结合的连续或不连续的序列。本发明提供了用来评价推定的MHC结合肽的体系、试剂盒和测定方法，以便测定此种片段是否能和MHC单体或修饰了的MHC单体结合成三元复合物。
[0080] 因此，本发明提供了用于筛选在诊断测定、疫苗和其他治疗形式中具有用途的候选肽的体系、试剂盒和筛选方法。用于本发明方法的推定的MHC结合肽可以用任何本领域已知的方法制得，最方便的是利用肽合成方法，合成长度为8到12个氨基酸的片段。
[0081] 相应地，在一种实施方案中，本发明提供了一种体系，该体系包括附着有一个或多个MHC单体或修饰的MHC单体的固体表面，其中单体在变性条件下变性并在复性条件下重构形成包含有合适的MHC结合肽的功能性结合口袋。例如，多个单体能够结合到单个表面上。体系的表面可以是任何已知的或以后发现的固体表面，包括，但不局限于，任何固体、聚合物、膜、合成表面和类似物。例如，本发明的固体发明可以是微量滴定板，如微量滴定板的孔，或珠，如琼脂糖A珠、琼脂糖G珠和类似物。一方面，本发明体系的固体表面适用于高流通量扫描系统，如表面是与高流通量系统相容的，或使得体系同与表面结合的实体一起以高流通量方式工作，如荧光测定流式细胞计数术。
[0082] 最近，鉴定到了一个短肽序列(Strep Tag IITM)，其显示出与突变链霉抗生物素蛋-6白分子(称作StrepTactin)的生物素结合位点的结合亲和力(Kd～1×10 M)。分子d-生-13
物素，其以较高亲和力(Kd-1×10 M)和链霉抗生物素蛋白结合，有效地与StrepTag II竞争结合位点(Knabel，M.，Franz，T.J.，Schiemann，M.，WulF，A.，Villmow，B.，Schmidt，B.，Bernhard，H.，Wagner，H.，Busch，D.H.(2002)Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer.Nature Medicine Vol.8No.6，June 2002.PP：631-637)。通过任何本领域的已知的方法，可以将MHC单体结合到固体表面。例如，固体表面可以包被上第一结合配体，如抗生物素蛋白，然后提供带有第二结合配体如生物素的单体，其中第一配体特异性地与第二配体结合。第二配体可以任选地通过C-末端结合到单体上。一个或多个单体与固体表面的结合，任选地是可逆的或可切割的。例如，可切割结合复合物可购自Amersham Bioscience Bioscience(法国奥赛市Orsay France)，如因子Xa、PreScission蛋白酶和凝血酶。所有这些蛋白酶可以与来自用pGEX-T载体表达的蛋白的GST亲和标记一起使用。
物素，其以较高亲和力(Kd-1×10 M)和链霉抗生物素蛋白结合，有效地与StrepTag II竞争结合位点(Knabel，M.，Franz，T.J.，Schiemann，M.，WulF，A.，Villmow，B.，Schmidt，B.，Bernhard，H.，Wagner，H.，Busch，D.H.(2002)Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer.Nature Medicine Vol.8No.6，June 2002.PP：631-637)。通过任何本领域的已知的方法，可以将MHC单体结合到固体表面。例如，固体表面可以包被上第一结合配体，如抗生物素蛋白，然后提供带有第二结合配体如生物素的单体，其中第一配体特异性地与第二配体结合。第二配体可以任选地通过C-末端结合到单体上。一个或多个单体与固体表面的结合，任选地是可逆的或可切割的。例如，可切割结合复合物可购自Amersham Bioscience Bioscience(法国奥赛市Orsay France)，如因子Xa、PreScission蛋白酶和凝血酶。所有这些蛋白酶可以与来自用pGEX-T载体表达的蛋白的GST亲和标记一起使用。
[0083] 本发明体系包括附着有MHC I类或II类单体的固体表面。附着有MHC I类单体的固体支持物优选保藏于复性条件下，以引起与在结合口袋中包含MHC结合肽的MHC I类单体形成MHC复合物，如本文中所述。对于MHC I类单体，MHC复合物是三元复合物，还包含结合于MHC I类单体上的β-2微球蛋白分子。
[0084] 包含有结合到固体表面的MHC I类单体或修饰的MHC I类单体的MHC复合物的形成，在本文中，称为“复性”，并在本领域已知和本文中描述的复性条件下完成。例如，复性条件通常包括存在针对单体的合适的MHC结合肽和合适的重折叠缓冲液，对MHC I类单体来说，缓冲液的pH值从约7到约8.5。对I类MHC单体来说，合适的复性条件也包括存在β-2微球蛋白。合适的重折叠缓冲液阐述于本文实施例中，且是本领域已知的。在进一步的贮藏制备中，结合有MHC单体的固体支持物可以被干燥(对I类单体来说，在复性条件下)，例如通过暴露于含有糖的缓冲液来干燥。在准备将本发明固体支持物用来测验推定的MHC-结合肽时，将固体支持物和附着的MHC I类单体暴露于变性条件下，使单体解离和解折叠。例如，复性条件可以包括将固体支持物和结合的单体暴露于pH约2到约4中足够长的时间，以引起单体复合物解离，而不破坏单体。
[0085] 不象MHC I类单体，II类单体在pH约5到约8范围内发生肽的加载，并在存在需要装载的肽的存在下，从溶液中实现，无需变性和复性单体。
[0086] 任选地，本发明体系还可以包含单克隆抗体，下面将详细描述，该单克隆抗体特异性地结合到构象化的表位上，该构象化的表位存在于MHC复合物中，但不存在于此种MHC复合物的解离部分中。例如，构象化的表位可以在本体系中使用的重构MHC单体或修饰了的MHC单体中形成，而不存在于变性的单体中。可替代地，单克隆抗体可以区分已经结合MHC结合肽的单体和没有结合MHC结合肽的单体。本发明体系还可以包含β-2微球蛋白的供应。
[0087] 用于本发明体系和方法的MHC单体，可以是任何MHC单体或修饰了的MHC单体，如I类重链，其能结合MHC结合肽，如本文所述。MHC单体可以由任何部分修饰或全长修饰的或未修饰的MHC基因序列编码，这些MHC基因序列来自任何种或亚型，或其重组，包括(不局限于)人和鼠的种，及其其嵌合体。优选的MHC编码基因序列是那些编码任何HLA等位基因基因型和任何变异或其多态形式的序列。例如，用于本发明体系和方法的MHC单体可以是任何部分或全长的HLA单体，其在复性条件下结合HLA结合肽，如HLA-A、HLA-B、HLA-C、或HLA-D的任何亚型或等位基因。
[0088] 例如，在一个实施方案中，MHC单体通过截短而修饰，以仅包括HLA I类重链的α1、α2和α3区域或HLA II类单体的α1、α2和β1、β2区域，其结合在一起形成MHC II类异源二聚体。在另外一个实施方案中，MHC单体可以是嵌合的，诸如融合蛋白，其含有这些MHC区域和锚定区域，其中MHC区域结合MHC结合肽，如本文所述，而锚定区域用于将MHC单体固定化在表面上。锚定区域可以是与HLA区域融合形成融合蛋白的多肽，或可以是通过本领域已知的合适方法与HLA区域偶联的实体，如生物素化的MHC单体。
[0089] 通过任何本领域已知的方法可以将MHC单体结合到固体表面。例如，MHC单体，通过锚定或连接实体，直接或者间接，固定到表面上。在一个实施方案中，本发明体系的固体表面包被有第一配体实体，其与连接到MHC单体或位于MHC单体中的第二配体结合或相互作用，如通过共价键或非共价键。在另外一种实施方案中，表面包被有抗生物素蛋白或其衍生物，如链霉抗生物素蛋白，且MHC单体包含生物素或其衍生物作为它的锚定区域。在本发明的一种实施方案中，MHC单体与固体表面的结合是可逆的或可切割的。
[0090] 包被或固定到固体表面的MHC单体可以被变性，如在变性条件下剥离或解离，然后复性，如在非变性条件或复性条件下由变性形式重新折叠，以便结合合适的MHC结合肽。在一种实施方案中，本发明提供的涂覆有MHC单体的表面，可以被干燥并保存起来以备后用。优选地，保存在约4℃下。
[0091] 除了涂覆有MHC单体的表面外，本发明体系还可以包括单克隆抗体和肽。肽可以是任何结合HLA单体的肽，如MHC结合肽。在一种实施方案中，肽与MHC单体具有高亲和性，如HBc高亲和力肽(HBc high affinity peptide)。
[0092] 用于本发明体系和方法的单克隆抗体可以是任何特异性地结合到表位上的单克隆抗体，该表位仅仅存在于MHC单体复合物中，但不存在于MHC单体复合物的解离部分中。例如，对I类MHC单体复合物来说，单克隆抗体能够结合到存在于β-2微球蛋白中的构象化表位上，构象化表位仅当结合形成三元复合物时存在于β-2微球蛋白上。替代性地，单克隆抗体能够识别构象化表位，该构象化的表位存在于正被用于特定的本发明体系或方法中的MHC单体或修饰了的MHC单体中。单克隆抗体对MHC单体可以是种匹配型的(species-matched)，例如，当固体支持物附着HLA I类单体时，单克隆抗体是鼠、人或人源抗-MHC I类单克隆抗体。而当修饰了的MHC单体是包含有来自超过一个种的结构域的嵌合体时，可以选择抗-MHC单克隆抗体来结合仅存在于其中一个结构域中的表位(如构象化表位)。例如，如图9所示，包含有修饰了的MHC单体的三元复合能够被结合鼠α-3区的构象化区域的鼠单克隆抗体检测，其中该修饰了的MHC单体是包含有HLA-A2重链的α-1和α-2区域和鼠H-2Kb的α-3区域的嵌合体。
[0093] 当HMC单体是HLA单体时，单克隆抗体可以是任何抗-MHC I类单克隆抗体，其识别三元复合物中的HLA单体的任何亚型，即，HLA-A、HLA-B或HLA-C。用于本发明体系和方法的优选的抗-MHC-I类单克隆抗体是由杂交瘤B9.12.1产生的小鼠IgG2a构象依赖性抗-HLA单克隆抗体，该杂交瘤已经依据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约和其下的规则(布达佩斯条约)，保藏在法国的微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所25，Rue du Docteur Roux，F75724Paris Cedex 15France，登记号为CNCM I-2941。可确保从保藏之日起，培养物在30年里有活力。公众依据布达佩斯条约可以由CNCM获得该微生物，并保证一旦相关美国专利颁发或任何美国专利或外国专利申请公开(无论哪个在前)，公众可以永久地不受限制地得到该微生物的子代，也保证美国经专利和商标委员会审订有权获得该微生物的个人或单位依据35U.S.C.122和Commissioner′s rules pursuant(包括37CFR1.14，特别依据886OG638)获得该微生物的子代。
[0094] 在一种实施方案中，用于本发明体系和方法的单克隆抗体与可检测标记一起提供，即，产生本领域已知的可检测信号的标记物。标记可以使用任何本领域已知的多种方法中的任意一个结合到抗体上。替代性地，可以制备包括标记，如放射性氨基酸的抗体。适用于本发明体系、试剂盒和方法的标记包括，但不局限于，放射性同位素、荧光染料、酶、生物素和电子致密分子(electron dense molecules)。单克隆抗体的结合表明通过MHC结合肽结合到单体上形成了三元复合物，并在洗去未结合的抗体和体系的其他组分之后，通过检测由信号实体产生的信号很容易地被检测和/或量化。可测定的标记目前优选荧光标记，如FITC。使用荧光计或通过荧光确定流式细胞计数术，能容易地测定荧光标记的抗体在固体表面的结合。
[0095] 作为使用单克隆抗体来测定单体和合适的MHC结合肽的结合应用的替代方法，本领域技术人员将认识到任何基于质量和电子特性来分离复合物的方法，如凝胶分离或电泳可以用来测定I类单体或II类单体是否结合MHC结合肽。
[0096] 本发明体系可以被提供，或者以另外一个体系的部分或者作为一个试剂盒的形式。例如，包被有MHC单体或修饰了单体的微量滴定板，例如，以干燥的形式，可以被提供在一个试剂盒中，试剂盒还可以任意地包括——在独立的小瓶或容器中——如本文中描述的一种抗-MHC单克隆抗体或一种抗-β-2微球蛋白抗体，以及特异性结合附着在固体表面上的单体的一种对照肽。在一种实施方案中，试剂盒包括一个解释使用该体系进行免疫测定的程序的说明书，如本发明所提供的方法。试剂盒也可以任意地包括任何或所有下述物质：变性或重折叠缓冲液，HMC单体的对照组，肽，或单克隆抗体。
[0097] 在另外一种实施方案中，本发明提供了测量结合作用的方法，用于测量MHC单体或修饰了的MHC单体和将要被测试的、与单体发生结合的推定MHC结合肽之间的结合作用的方法。在这个分析推定的MHC结合肽的结合作用的方法中，在推定的MHC结合肽存在和不存在的情况下，温育其上附着有许多MHC单体或修饰了的MHC单体的固体表面。优选地，固体表面是一种属于本发明体系或试剂盒的固体表面，并由本文中描述的方法制得。如果在测定程序开始时，附着于固体表面的MHC单体是处于重折叠的形式中，通过暴露于如本文中所述的变性条件下，制得MHC单体，用于测定，例如，暴露于pH值从约2到约4的范围内的条件下，或过夜暴露于一个高于大约37℃的温度下。变性之后，洗去未结合的MHC-结合肽。
[0098] 对于该测定，附着有变性的MHC单体或修饰的MHC单体的固体表面，是与推定的MHC结合肽在重构条件下温育合适的时间区间，以便允许形成复合物。进行重构的条件也可以包括温度在约负18℃到约37℃的范围内，例如，在约4℃到约8℃的范围内。对于I类单体来说，重构条件将包括存在足够数量的β-2微球蛋白(或者，为了增加结合作用或稳定三元复合物形成而进行修饰的β-2微球蛋白)，以便饱和MHC单体。例如，可以考虑通过将β-2微球蛋白结合到稳定作用分子(stabilizing molecule)，如亮氨酸拉链或类似物上来稳定三元复合物的形成，从而对β-2微球蛋白进行修饰。用推定的MHC-结合肽和β-2微球蛋白进行温育，通常需要从约12小时或过夜到约48小时，以便允许形成复合物。
[0099] 重构温育之后，可以通过将固体支持物上的MHC单体与单克隆抗体相接触，来测定推定的MHC结合肽与MHC单体的结合，其中单克隆抗体能结合只存在于MHC复合物上的构象化表位，例如存在于I类三元复合物的重折叠MHC单体上的一个构象化表位，而不存在于变性的MHC单体上。抗体与附着于固体表面上的MHC复合物的结合表明，推定的MHC结合肽是一个MHC结合肽，对于用在该测定中的MHC单体或修饰了的MHC单体具有特异性。为了比较推定的MHC结合肽的结合作用和标准MHC结合肽的结合作用的目的，可以使用单体进行平行分析(parallel assay)(例如，在同样的重构条件下，同样的单体，和在同样的单克隆抗体存在下)。在平行分析中，可以将单克隆抗体与包含有标准MHC结合肽的三元复合物的结合，与单克隆抗体与测试试验中的相应复合物的结合相比较，以助于使用本领域已知的计算方法确定推定的MHC结合肽的结合效率。
[0100] 仍然在一种实施方案中，本发明提供了确定MHC单体或修饰了的MHC单体与推定的MHC结合肽之间的结合亲和度的方法。在这种实施方案中，在重构条件下，用推定的MHC-结合肽和单克隆抗体来温育至少一种附着于固体表面的变性MHC单体或修饰了的MHC单体，其中单克隆抗体特异性结合因为包括有相应的重构MHC单体的复合物的形成而生成的构象化表位，该构象化表位不存在于MHC复合物的任何解离成分中。将单克隆抗体和如此形成的MHC复合物的这种结合，与单克隆抗体和包含有同样的MHC单体或修饰了的MHC单体以及一种已知MHC结合肽的复合物的结合相比较。在结合作用上的差异表明，重构单体或修饰了的单体与推定的MHC-结合肽的相对结合亲和度。对于MHC I类单体的重构，测定中也必须存在相应于全部数量的单体形成复合物的合适数量的β-2微球蛋白。对于肽结合亲和力的确定，试验是通过在每一个平行试验中以多重方式使用不同肽浓度而完成的。在实践本发明方法时，MHC单体可以是任何物种的MHC单体，合适的I类结合肽测定对于该种MHC单体是需要的，包括，但不受局限，鼠的和人的或包括来自种或亚型组合的单体亚基的嵌合体。
[0101] 各种可利用的手段也可以用来测量单克隆抗体和包含有重构MHC单体的MHC复合物的特异性结合。例如，结合可以通过如下方法进行检测：直接用可检测标记物，即可以产生可检测信号的标记来直接标记单克隆抗体；和检测该信号或通过二级抗体，该二级抗体是可检测标记的，并能识别结合到包含有测定中所使用的MHC单体的MHC复合物的抗体。能用于此目的的合适的可检测标记是本领域熟知的，包括选自放射性同位素、荧光染料、酶、生物素、电子致密分子和类似物的标记。目前，优选荧光染料或荧光标记，原因是通过将固体支持物置于荧光计下能容易地检测结合。例如，当固体支持物是一个板时，如96孔微量滴定板或颗粒，如琼脂糖A或琼脂糖G颗粒时，测定可以使用任何本领域已知的方法进行高通量荧光扫描。
[0102] 下述实施例旨在，以任何方式、形态或形式，或者经验性地或者非经验性地，示例说明本发明，但不是限制本发明。尽管它们是可以使用的方法中的典型，但是其他本领域技术人员知道的其他程序、方法学或技术可以替代地使用。
[0103] 实施例1
[0104] 正确折叠的HLA重链单体的检测
[0105] 本实验显示当附着于固体支持物时，MHC单体能够重构，以致形成三元复合物，并被构象依赖性的抗-MHC单克隆抗体识别和特异性结合。换句话说，附着到固体支持物上的MHC单体将正确折叠，来结合MHC-结合肽。下表1概述了用于检测一旦发生肽结合作用的正确折叠HLA单体的主要步骤。(也参见图1)
[0106] 表1
[0107]
[0108] 实施例2
[0109] 抗-HLA-FITC抗体的校准
[0110] 在本实施例中，制备BSA-生物素-抗生物素蛋白包被的96-孔微量滴定板，用于荧光测定。用0、0.25、0.5、1、2、和4μg/ml浓度的抗-HLA-ABC-FITC或抗-HLA-FITC单克隆抗体，将处于三元复合物中的HLA-A2m单体在不同浓度下与结合肽Mart-126-35L进行温育。特别地，对于每一抗体浓度来说，HLA单体以0、0.0078、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、和0.5μg/ml的浓度加入。
[0111] 在这个实验中，在室温和振荡下，将HLA重链和抗-HLA-FITC抗体一起温育40分钟。在洗涤板除去未结合抗体之前，读出总荧光值。然后，洗涤板3次，以除去未结合的抗体，并读出结合抗体的荧光。
[0112] 如图2所示，当抗体浓度到达0.25和0.5μg/ml时，发生饱和。然而，当抗体以1、2和4μg/ml加入时，荧光信号增加。此观察结果表明，当加入在0.5和0.25μg/ml时，抗体结合到两个MHC单体上。相反，当在1、2或4μg/ml温育时，抗体只结合一个HLA单体。这解释了信号增加，例如，抗体浓度0.5μg/ml、HLA重链浓度0.5μg/ml时的300荧光单位，相比起抗体浓度1μg/ml、HLA重链浓度0.5μg/ml时的600FU。另外一个观察结果是，抗体浓度在2和4μg/ml之间时，信号保持恒定。所以，确定的是，对于测定应用而言，2μg/ml的抗-HLA-FITC单克隆抗体(anti-HLA-FITC mAb)是个合适的饱和浓度。
[0113] 实施例3
[0114] 抗-HLA-FITC单克隆抗体的特异性
[0115] A.构象特异性
[0116] 设计实验，以确定由抗-HLA-I类-FITC抗体所产生的信号作为应激HLA单体(stressed HLA monomer)的解离度系数是否不同。用于本实验的特别的HLA单体是HLA重链单体HLA-A*0201，其包含处于三元复合物中的结合肽Martl 27-35。
[0117] 制备包含10μg/ml三元复合物的不同溶液，并在37℃、30℃、25℃或4-8℃温度下温育过夜。用2μg/ml的抗-HLA-FITC偶联物进行实施例2中描述的抗体结合实验，目的在于可检测性地标记保留在附着到固体支持物上的三元复合物中的HLA单体。在-18℃下，温育含有HLA单体的三元复合物和Mart 27-35的浓度640μg/ml溶液，作为对照组。不同于其他样品，以该相同浓度稀释来自保存在-18℃下、浓度640μg/ml的样品的溶液，其中含有HLA-单体和Mart-127-35的三元复合物，被将该溶液包括在内作为对照组。
[0118] 如图3中所示，发现，在最高的温度下温育附着到固体支持物上的三元复合物产生最微弱的荧光信号，这表明随着温度的增加，HLA重链单体的三元复合物逐渐解离。在一个点上，因为三元复合物解离程度的缘故，抗-HLA-FITC偶联物不能再识别HLA单体；并且荧光信号相应地减少，这表明抗-HLA-FITC偶联物特异性识别正确折叠的重构HLA单体，而不识别变性的单体。
[0119] B.重链单体特异性
[0120] 如表2中所示，用抗-HLA-I类-FITC抗体温育人等位基因A2、A3、A11、B7、B8以及一个小鼠等位基因Kd的不同的HLA重链单体。
[0121] 表2
[0122]
[0123] 抗体结合实验按上面描述的方法进行。所用的抗-HLA-I类-FITC抗体的浓度是2μg/ml。
[0124] 如图4所示，用抗-HLA-I类单克隆抗体可以侦测所有重构HLA-A和HLA-B单体。如期望的，当将含有小鼠等位基因(H-2Kd/Flu)的三元复合物附着到板上时，没有检测到信号，这就证实了抗体对人HLA的特异性。不同等位基因之间的信号变化可能是由于HLA单体的浓度精确度和保藏条件，如冷冻、解冻等的缘故。
[0125] MHC重链单体包被到板，板保藏和重构(reconstitution)
[0126] 存在于同Martl 27-35肽形成的三元复合物中的、浓度为5μg/ml的生物素化的MHC单体，被附着到抗生物素蛋白包被的板上。用含糖缓冲液在4℃到8℃下过夜饱和该板后，在30℃、湿度为19％下过夜干燥板。板在这些条件下干燥后，发现HLA单体从三元复合物中解离下来。因此，在制备用于结合测定中的板时，用低pH值将MHC结合肽从单体上剥离下来是不必要的。
[0127] 对于抗体结合测定，用10μg/ml β-2微球蛋白温育10nM到100μM的HBc高亲和力肽(亲和力计算为1.8×10-7M)。并用三种含有下面所述组分的不同缓冲液中的其中一种缓冲液来温育单体包被板。
[0128] -缓冲液1：Tris、精氨酸、EDTA、GSH、GSSG和BSA
[0129] -缓冲液2：Tris、NaCl、EDTA、NaN3、BSA和0.05％TWEEN 去污剂
[0130] -缓冲液3：Tris、NaCl、EDTA、NaN3、BSA和0.05％ P40去污剂。
[0131] 发现在两个温度下发生肽结合和单体重构：4℃-8℃和室温。
[0132] 与2μg/ml的抗-HLA-I类-FITC偶联物温育24和48小时后，测试HLA单体的复性。如图5所示，FITC信号增加是肽浓度的函数。这个结果表明，HLA单体通过整合成三元复合物而复性；也表明MHC单体复性能够被抗-HLA-I类-FITC抗体有效地检测到。发现最好的复性缓冲液是包含TWEEN 的缓冲液2。有意思的是，用缓冲液1没有测量到重折叠。
[0133] 在这里试验条件下，抗体结合测定的最好温度是4℃到8℃，允许复性的最佳温育时间是24小时。
[0134] 材料和方法
[0135] A.试剂
[0136] 精细化学药品，除非另外指出，来自Merck(德国，达姆斯塔特；Darmstadt，Germany)和Carlo Erba(意大利罗德诺；Rodeno，Italy)。生物素化BSA以及抗生物素蛋白来自Immunotech(法国马赛；Marseille，France)。LUMITRAC-600白色96-孔微量滴定板来自Greiner[PN：655074LUMITRAC 600；(德国的Frickenhausen)。SA-PE以及HLA-A*0301/EBVHLA重链来自Immunomics(加利福尼亚州的圣地亚哥)。抗-HLA-I类单克隆抗体与FITC的偶联物(克隆：B9.12.1)来自Immunotech的抗体生产服务部(Antibody Manufacturing Service)。产品号(Part Number)：IM1838。该抗体是小鼠IgG2a单克隆抗体。
[0137] B.抗生物素蛋白包被的96-孔微量滴定板的制备
[0138] 用200μl的浓度为5μg/ml的于PBS中的生物素化BSA溶液包被白色96-孔微量滴定板的每个孔，然后将这些板在4℃下温育16小时。洗涤这些板，然后以200μl/孔加入5μg/ml的抗生物素蛋白溶液。然后这些板在4℃下再温育16小时。然后洗涤这些板，加入一种封闭性、干燥性溶液。然后再次温育板16小时。然后，倒掉溶液，将板面朝下拍在纸巾上。然后将这些板置于特殊的干燥室中24小时。之后，将板单个放置于自锁袋(self-locking bag)中，直到使用。
[0139] C.单体免疫测定程序
[0140] 测定程序如下。以200μl/孔，将含有处于三元复合物中的HLA单体(浓度为0.25μg/ml)、并稀释于Tris 10mM、NaCl 150mM、EDTA0.5mM、NaN30.1％、BSA 0.2％中的每一个样品，装载到抗生物素蛋白包被的板的孔中，并在室温下、在黑暗中、在定轨摇床(orbital shaker)中温育1小时。然后，用自动洗涤机(SLT，奥地利萨尔斯堡)，使用含有
0.05％TWEEN 的300μ19g/l NaCl溶液将孔漂洗三次。然后，以200μl/孔，加入2μg/ml的FITC-偶联的抗-HLA-I类抗体。在室温下、在黑暗中，在定轨摇床上温育板45分钟，洗涤3次，以200μl/孔加入Tris 10mM、NaCl 150mM、EDTA 0.5mM、NaN30.1％、BSA 0.2％。
用Perkin ElmerLS-50B荧光计，用下述参数测量FITC荧光：
0.05％TWEEN 的300μ19g/l NaCl溶液将孔漂洗三次。然后，以200μl/孔，加入2μg/ml的FITC-偶联的抗-HLA-I类抗体。在室温下、在黑暗中，在定轨摇床上温育板45分钟，洗涤3次，以200μl/孔加入Tris 10mM、NaCl 150mM、EDTA 0.5mM、NaN30.1％、BSA 0.2％。
用Perkin ElmerLS-50B荧光计，用下述参数测量FITC荧光：
[0141] 激发＝405nm
[0142] 发射＝525nm
[0143] 发射滤波＝515nm
[0144] 带通(Exc，Emi)＝5.15nm
[0145] 0.5秒/孔
[0146] 测定程序在下表3中进一步概述。
[0147] 表3
[0148]
[0149] 抗-HLA-I类-FITC抗体的校准
[0150] 用不同浓度的抗-HLA-I类-FITC单克隆抗体温育不同浓度的HLA-A*0201/Martl重构单体。如图6所示，对所有的HLA重链单体浓度来说，抗-HLA-I类单克隆抗体浓度在1到2μg/ml时达到一个平台(plateau)。
[0151] 使用2μg/ml的抗-HLA-ABC单克隆抗体绘制不同浓度的重构单体的剂量应答曲线。如图7A和7B所示，随着浓度增加信号保持线性，直到使用0.5μg/ml的重构HLA单体。高于0.5μg/ml的重构单体浓度提供了非常接近于平台的信号。图7A和7B中所总结的数据显示，为了获得最好的结果，测定条件应该包括0.25μg/ml的重构HLA单体和2μg/ml的抗-HLA-I类FITC单克隆抗体。这些数据也显示，测定敏感度为约4到6ng/ml的重构HLA单体。
[0152] 特异性
[0153] 对不同的人等位基因，测试了抗-HLA-I类-FITC抗体对三元复合物中的HLA单体的特异性。对每一个下述HLA单体/肽三元复合物，按照上述方法制备了剂量应答曲线。
[0154] -HLA-A*0201/Martl 2635L
[0155] -HLA-A*0301/EBV
[0156] -HLA-B*0702/HIV
[0157] -HLA-B*0801/HIV
[0158] -HLA-A-*1101/EBV
[0159] -H-2Db/HAl
[0160] 如图8所示，所有人等位基因可以被同样的抗-HLA-I类-FITC抗体很好地识别。当人等位基因被小鼠等位基因替换时，没有得到信号。这表明，所用的抗体对人等位基因是特异性的，应该只用于涉及人等位基因的测定中。发现构象性抗-小鼠H-2抗体适用于涉及小鼠HLA单体的测定。
[0161] 实施例4
[0162] 肽-MHC脱离率的测量
[0163] 对于有效的CD8+T细胞应答，I类MHC单体必须在一个长期的时间区段里充分丰富地结合许多具有多样性序列的肽。许多肿瘤细胞似乎逃避了免疫应答，这是因为抗原肽不能很好地结合呈递它们的I类MHC分子。如果肽不能有效地结合MHC分子，循环T细胞将不会识别MHC三元复合物，呈递它们的细胞将不会被消除。
[0164] 免疫显性肽典型的半衰期在37℃下是大于20小时(Stuber，et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24，765-768， 和 Pogue，et al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.US 92，8166-8170)。依据这个证据，开展试验，去使用本发明固相测定来测定各种复合物在不同温度下的稳定性，从而计算出肽的脱离率(off rate)。这个参数对于了解什么时候将肽用于引发免疫应答目的的接种是非常有价值的。
[0165] 肽脱离率的度量：将单体HLA-A*0201/Mart-12635L装载于四个不同的96-孔抗生物素蛋白包被板中。将板在室温下振荡温育2小时。用pH 3.2的柠檬酸磷酸盐(citrate phosphate)缓冲液洗涤、剥离之后，用高亲和力肽HbV核心区，Mart-12635L；用中间亲和力肽Mart-126-35；以及低亲和力肽Mart-127-35重构该单体。与肽同时加入游离的β-2微球蛋白以及抗-HLA-ABC-FITC单克隆抗体。板在21℃下，振荡温育过夜。之后，洗涤板，测定荧光水平。这之后，每个孔中加入含有BSA的Tris缓冲液，并在不同温度下再温育板，分别地，一个板在4℃下、一个在21℃下、一个在32.5℃下、一个在37℃下。在不同的时间—4小时、24小时和48小时——洗涤每一板的一些剥离物(strips)，并测定不同时间的荧光。
[0166] B0是在0时刻时测定的荧光。0时刻对应于一旦单体被重构和板被置于不同温度的时刻时的板被洗涤的时刻。B是每一次获得的荧光。在N1(荧光发射)作为时间的函数作图后，计算出线性回归，半衰期按如下计算：T1/2＝0.69/曲线斜率。替代地，该数据与使用非线性回归也非常相符，应用单相指数衰减，且平台等于0。
[0167] 这些测定的结果显示在下面的表4中：
[0168] 表4
[0169]
[0170] 观察到高亲和力肽，诸如HBV核心区和Mart-1 27-35，在37℃和32.5℃下具有很好的稳定性。相反，肽Mart-1 26-35和肽Mart-1 27-35在37℃下显示出很高的脱离率。当复合物在21℃下温育时也发现了差异。这些结果显示，该测定可以用于测定肽从MHC三元复合物中解离下来的解离率(见图10：图10 A-D显示了复性肽的解离曲线的曲线图；图
10E-H是显示了肽的解离率的曲线图；图10I显示了温度对单体解离的影响)。
10E-H是显示了肽的解离率的曲线图；图10I显示了温度对单体解离的影响)。
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| 一种表征触变性流体流变学的三阶段触变性测试方法 | 2020-05-12 | 153 |
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| 一种环保触变性防锈油 | 2020-05-11 | 842 |
| 一种双组份高触变性的聚氨酯胶粘剂 | 2020-05-14 | 701 |
| 一种配制触变性胶体电解质的方法 | 2020-05-14 | 345 |
| 触变性水泥组合物 | 2020-05-12 | 310 |
| 触变性导电组合物 | 2020-05-11 | 77 |
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