一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法
阅读：94发布：2023-03-11
专利汇可以提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法。所述提取剂包括无机盐，还可进一步包括 水 溶性 聚合物 ，所述无机盐选自 硫酸 铵、氯化 钙 、 氯化钠 、氯化镁或 柠檬酸 钠中的一种或几种，所述 水溶性 聚合物选自聚乙二醇PEG、甲基 纤维 素MC，及聚乙烯亚胺PEI中的一种。所述提取方法是将所述提取剂和体液混合形成待提取体系，盐析后离心后即得。本发明使用盐析法进行胞外囊泡提取有三点优势，1)得率高，约70％；2)操作快捷简便，能够在30-45分钟内完成胞外囊泡的提取；3)不受样本体积限制，适合大体积样本的提取。，下面是一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法专利的具体信息内容。
1.一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，其特征在于，包括无机盐；所述无机盐选自硫酸铵、氯化钙、氯化钠、氯化镁或柠檬酸钠中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的提取剂，其特征在于，还包括水溶性聚合物，所述水溶性聚合物选自聚乙二醇PEG、甲基纤维素MC，及聚乙烯亚胺PEI中的一种；
优选地，所述提取剂由所述无机盐和所述水溶性聚合物组成；所述提取剂中，所述无机盐和水溶性聚合物的质量比为(1-40)∶(1-2)。
3.根据权利要求1或2所述的提取剂，其特征在于，所述提取剂由硫酸铵和甲基纤维素组成，优选，所述硫酸铵和所述甲基纤维素的质量比为(8-10)∶(0.5-1)；
或，
所述提取剂由柠檬酸钠和聚乙烯亚胺组成，优选，所述柠檬酸钠和聚乙烯亚胺的质量为(0.5-1)∶(1-3)；
或，
所述提取剂由氯化钙和聚乙二醇组成，优选，所述氯化钙和所述聚乙二醇的质量比为(1-2)∶(1-5)；更优选，所述聚乙二醇为PEG6000。
4.一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的提取剂；将所述提取剂和体液混合形成待提取体系，盐析后离心后即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述待提取体系中，所述无机盐的浓度为0.1-20wt％；
优选地，所述水溶性聚合物的浓度为0.5-5wt％。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述提取剂以提取溶液的形式提供，以去离子水作为溶剂，所述体液与所述提取溶液的体积比为1∶(0.5-2)。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述盐析是通过将所述提取剂和体液样本充分混合并在0-25℃下静置孵育1-30分钟完成的；
所述孵育时，优选地，调节体系的pH值为5-8；和/或，孵育温度为4-10℃；和/或，孵育时间为10分钟。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，在盐析后，所述离心的条件为
5000g-10000g离心5-10min；所述离心时以0.20-0.25μm滤膜进行离心过滤；
所述滤膜优选0.22μm。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，所述体液样本包括血浆、血清、尿液；
所述体液样本在所述提取体系中的浓度范围为10-95％；
优选地，所述体液样本在所述待提取体系中的浓度为80-95％。
10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，
所述提取剂由硫酸铵和甲基纤维素组成，在所述待提取体系中，所述硫酸铵的浓度为
8-10wt％；所述甲基纤维素的浓度为0.5-1wt％；优选地，所述孵育时，体系的pH值控制在5-
6；
或，
所述提取剂由柠檬酸钠和聚乙烯亚胺组成，在所述待提取体系中，所述柠檬酸钠的浓度为0.5-1wt％；所述聚乙烯亚胺的浓度为1-3wt％；优选地，所述孵育时，体系的pH值控制在7-8；
或，
所述提取剂由氯化钙和聚乙二醇组成，在所述待提取体系中，所述氯化钙的浓度为1-
2wt％；所述聚乙二醇的浓度为1-5wt％；优选地，所述聚乙二醇为PEG6000；和/或，所述孵育时，体系的pH值控制在6-7。
一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法
技术领域
背景技术
[0002] 活细胞会持续分泌胞外囊泡，其主要类型包括，外泌体(exosome，粒径50-100nm)、微囊泡(microvesicle，粒径20-1000nm)。在人体中，内源性胞外囊泡被证实在凝血、细胞间信号传递以及废物管理中发挥作用。与此同时，胞外囊泡因为内含核酸、蛋白质、脂类等多种生物分子，在疾病的诊断和治疗方面均具有很大的潜力。
[0003] 目前，从体液中分离胞外囊泡的方法包括，超速离心、免疫捕获、超滤、聚合物沉降以及静电吸附等。其中，超速离心法所需设备昂贵，操作复杂，而且回收率不高。免疫捕获法利用特异性抗体识别并分离胞外囊泡，特异性高，但是价格昂贵不适合处理大体积样本，而且容易丢失抗原表达偏低的囊泡。超滤法可以根据粒径或分子量大小，快速分离体液中的囊泡，但是囊泡可能被微米或者纳米孔径的超滤膜所复活影响最终的提取效率。聚合物沉淀法得率高，但是产物中存在大量蛋白质杂质，而且沉降过程需要孵育一段时间(0.5小时-过夜不等)，完成一次操作所需时间依旧很长。静电吸附法无需大型设备，装置简单，产物纯度高，但不适合处理大体积样本。
发明内容
[0004] 本发明的目的，是提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法，所述提取剂是特定的无机盐，可以通过吸引大量水分子与这些无机盐离子水合，或者改变表面电荷的方式，从而改变胞外囊泡(EVs)在溶液中的溶解度或聚集状态。使用该提取剂，即通过向体液中加入无机盐，该方法能够让胞外囊泡从体液中快速析出，不仅操作简单，而且不受样本体积限制。在30-45分钟内即可回收体液中约70％的胞外囊泡。
[0005] 本发明技术方案如下：
[0007] 本发明所述的提取剂，是指意外的发现的上述无机盐可作为提取体液中胞外囊泡的提取剂的应用。
[0009] 优选地，所述提取剂由所述无机盐和所述水溶性聚合物组成。
[0010] 本发明所述的提取剂，优选地，所述提取剂中，所述无机盐和水溶性聚合物的质量比为(1-40)：(1-2)。在上述质量比的范围下，可有效地提取EVs。
[0011] 本发明所述的提取剂，优选地，所述无机盐选自硫酸铵、氯化钙、柠檬酸钠中的一种。
[0012] 作为本发明的优选技术方案，优选地，所述提取剂由硫酸铵和甲基纤维素组成，更优选，所述硫酸铵和所述甲基纤维素的质量比为(8-10)：(0.5-1)。
[0013] 或，
[0014] 优选地，所述提取剂由柠檬酸钠和聚乙烯亚胺组成，更优选，所述柠檬酸钠和聚乙烯亚胺的质量为(0.5-1)：(1-3)。
[0015] 或，
[0016] 优选地，所述提取剂由氯化钙和聚乙二醇组成，更优选，所述氯化钙和所述聚乙二醇的质量比为(1-2)：(1-5)；更进一步优选地，所述聚乙二醇为PEG6000。
[0017] 本发明一并提供一种利用上述任意一项所述的提取剂以提取体液中胞外囊泡的方法，是将所述提取剂和体液混合形成待提取体系，盐析后离心后即得。
[0018] 优选地，在所述待提取体系中，所述无机盐的浓度为0.1-20wt％；
[0019] 更优选地，水溶性聚合物的浓度为0.5-5wt％。在上述浓度范围下，提取效果比较稳定，而且能协同增加析出作用。
[0020] 和/或，所述提取剂以提取溶液的形式提供，以去离子水作为溶剂，所述体液与所述提取溶液的浓度比为1：(0.5-2)。
[0021] 所述盐析是通过将所述提取剂(提取溶液)和体液样本充分混合并在0-25℃下静置孵育1-30分钟完成的；所述孵育时，优选地，调节体系的pH值为5-8；和/或，孵育温度为4-10℃；和/或，孵育时间为10分钟。本发明所述的方法，在盐析后，所述离心的条件为5000g-
10000g离心5-10分钟；所述离心时以0.1-0.45μm(优选0.22μm)滤膜进行离心过滤。
10000g离心5-10分钟；所述离心时以0.1-0.45μm(优选0.22μm)滤膜进行离心过滤。
[0022] 视不同的条件(提取溶液中盐的种类及浓度)，析出的胞外囊泡可能位于体液样本的顶部或底部；当析出物位于管的顶部时，可将体液样本加入含0.22μm滤膜的离心管中，采用5000g离心后，析出的胞外囊泡会滞留在滤膜之上；当析出物位于管的底部时，采用10000g离心后收集沉淀，即为胞外囊泡。
[0023] 本发明所述的方法中，所述体液样本包括血浆、尿液等。
[0024] 对于血浆的处理按照如下方式：解冻后离心以除去细胞残骸，并以0.45μm滤膜过滤待用。
[0025] 对于尿液的处理按照如下方式：取中段尿液以0.45μm滤膜过滤待用。
[0026] 作为本发明的优选技术方案，所述方法包括如下步骤：
[0027] 向体液样本中加入所述提取剂混合并在0-25℃下静置孵育1-30分钟后离心即得；
[0028] 优选地，所述提取剂由硫酸铵和甲基纤维素组成，在所述待提取体系中，所述硫酸铵的浓度为8-10wt％；所述甲基纤维素的浓度为0.5-1wt％；
[0029] 更优选地，所述孵育时，体系的pH值控制在5-6(更优选5)。
[0030] 或，
[0031] 优选地，所述提取剂由柠檬酸钠和聚乙烯亚胺组成，在所述待提取体系中，所述柠檬酸钠的浓度为0.5-1wt％；所述聚乙烯亚胺的浓度为1-3wt％；
[0032] 优选地，所述孵育时，体系的pH值控制在7-8(更优选8)。
[0033] 或，
[0034] 优选地，所述提取剂由氯化钙和聚乙二醇组成，在所述待提取体系中，所述氯化钙的浓度为1-2wt％；所述聚乙二醇的浓度为1-5wt％；更优选地，所述聚乙二醇为PEG6000；
[0035] 优选地，所述孵育时，体系的pH值控制在6-7(更优选6)。
[0036] 作为本发明最优选的技术方案，一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，包括向体液样本中加入无机盐溶液和促进盐析的水溶性聚合物，充分混合后于0～25℃下静置1-30分钟，将样本加入到含有0.22μm滤膜的离心管中，离心后得到滞留在滤膜上的胞外囊泡。
[0037] 进一步地，优选的无机盐为浓度1％wt的氯化钙。
[0038] 进一步地，优选的水溶性聚合物为浓度为1％wt PEG 6000。
[0039] 进一步地，优选的pH值为6。
[0040] 进一步地，优选的孵育温度为4～10℃。
[0041] 进一步地，优选的孵育时间为10分钟。
[0042] 本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。
[0043] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，均属于本发明的发明构思。
[0045] 图1为五种不同浓度的无机盐对胞外囊泡(EVs)的盐析作用示意图。
[0046] 图2为无机盐对胞外囊泡(EVs)粒径的影响。
[0047] 图3为五种不同浓度的无机盐对血浆蛋白的盐析作用。
[0048] 图4水溶性聚合物对胞外囊泡(EVs)盐析的影响；其中a)为硫酸铵-PEG不同浓度时对EVs盐析的影响；b)为氯化钙-PEG不同浓度时对EVs盐析的影响；c)为柠檬酸钠-PEG不同浓度时对EVs盐析的影响；d)为硫酸铵-PEI不同浓度时对EVs盐析的影响；e)为氯化钙-PEI不同浓度时对EVs盐析的影响；f)为柠檬酸钠-PEI不同浓度时对EVs盐析的影响；g)为硫酸铵-MC不同浓度时对EVs盐析的影响；h)为氯化钙-MC不同浓度时对EVs盐析的影响；i)为柠檬酸钠-MC不同浓度时对EVs盐析的影响。
[0049] 图5为孵育温度对EVs得率的影响。
[0050] 图6为pH值对EVs得率的影响。
[0051] 图7为孵育时间对EVs得率的影响。
[0052] 图8为不同聚合物/无机盐对产物RT-PCR结果的影响。
[0053] 图9为不同分子量的PEG对RT-PCR结果的影响。
[0054] 图10为使用1％氯化钙+1％PEG和ExoQuick提取EVs总量的比较。
具体实施方式
[0055] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0057] 以下各实施例、实验例中如非特别说明，所涉及的配置或稀释溶液所用去离子水均事先经过0.22μm滤膜过滤。
[0058] 实施例1
[0059] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用硫酸铵作为提取剂。
[0060] 实施例2
[0061] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用柠檬酸钠作为提取剂。
[0062] 实施例3
[0063] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用氯化钙作为提取剂。
[0064] 实施例4
[0065] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用氯化镁作为提取剂。
[0066] 实施例5
[0067] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用氯化钠作为提取剂。
[0068] 实施例6
[0069] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用硫酸铵和MC作为提取剂。
[0070] 具体地，所述提取剂中硫酸铵和MC的质量比为20:1。
[0071] 实施例7
[0072] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用氯化钙和PEG6000作为提取剂。
[0073] 具体地，所述提取剂中氯化钙和PEG6000的质量比为1:1。
[0074] 实施例8
[0075] 本实施例提供一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂，采用柠檬酸钠和PEI作为提取剂。
[0076] 具体地，所述提取剂中柠檬酸钠和PEI的质量比为1:2。
[0077] 实施例9-16
[0078] 一种实施例9-16提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，采用实施例1所提供的提取剂。
[0079] 具体地，将血浆样本分别与所述提取剂充分混合得到待提取体系，在室温下孵育30min后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心5min后即得；
[0080] 其中，所述血浆样本在所述待提取体系中的浓度为80％-95％；所述提取剂在所述待提取体系中的浓度分别如下所示：
[0081]
[0082] 实施例17-24
[0083] 实施例17-24提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，采用实施例2所提供的提取剂。
[0084] 具体地，将血浆样本分别与所述提取剂充分混合得到待提取体系，在室温下孵育30min后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心5min后即得；
[0085] 其中，所述血浆样本在所述待提取体系中的浓度为80％-95％；所述提取剂在所述待提取体系中的浓度分别如下所示：
[0086]
[0087]
[0088] 实施例25-31
[0089] 实施例25-32提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，采用实施例3所提供的提取剂。
[0090] 具体地，将血浆样本分别与所述提取剂充分混合得到待提取体系，在室温下孵育30min后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心5min后即得；
[0091] 其中，所述血浆样本在所述待提取体系中的浓度为80％-95％；所述提取剂在所述待提取体系中的浓度分别如下所示：
[0092]
[0093] 实施例32-39
[0094] 实施例32-4039提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，采用实施例4所提供的提取剂。
[0095] 具体地，将血浆样本分别与所述提取剂充分混合得到待提取体系，在室温下孵育30min后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心5min后即得；
[0096] 其中，所述血浆样本在所述待提取体系中的浓度为80％-95％；所述提取剂在所述待提取体系中的浓度分别如下所示：
[0097]
[0098]
[0099] 实施例40-47
[0100] 实施例40-47提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，采用氯化钠作为提取剂。
[0101] 具体地，将血浆样本分别与所述提取剂充分混合得到待提取体系，在室温下孵育30min后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心5min后即得；
[0102] 其中，所述血浆样本在所述待提取体系中的浓度为80％-95％；所述提取剂在所述待提取体系中的浓度分别如下所示：
[0103]
[0104] 实施例48
[0105] 本实施例提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，具体包括如下步骤：
[0106] 1)向体液样本中加入氯化钙和PEG6000，并充分混合，使体系内所述氯化钙和PEG6000的浓度均为1wt％；
[0107] 2)于0～25℃下静置1-30分钟；
[0108] 3)利用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，即分离得到胞外囊泡。
[0109] 作为本实施例的优选方案1，步骤2)中的温度为4～10℃；
[0110] 作为本实施例的优选方案2，步骤1)中充分混合后，调节pH值为6；
[0111] 作为本实施例的优选方案3，步骤2)中的静置时间为10分钟。
[0112] 实施例49-53
[0113] 实施例49-53分别提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，与实施例48的区别仅在于提取剂的浓度不同，具体如下：
[0114]
[0115] 实施例54
[0116] 本实施例提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，具体包括如下步骤：
[0117] 1)向体液样本中加入柠檬酸钠和PEI，并充分混合，使体系内所述柠檬酸钠的浓度为0.5wt％，PEI的浓度为1wt％；
[0118] 2)于0～25℃下静置1-30分钟；
[0119] 3)利用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，即分离得到胞外囊泡。
[0120] 作为本实施例的优选方案1，步骤2)中的温度为4～10℃；
[0121] 作为本实施例的优选方案2，步骤1)中充分混合后，调节pH值为8；
[0122] 作为本实施例的优选方案3，步骤2)中的静置时间为10分钟。
[0123] 实施例55-59
[0124] 实施例55-59分别提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，与实施例54的区别仅在于提取剂的浓度不同，具体如下：
[0125]
[0126] 实施例60
[0127] 本实施例提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，具体包括如下步骤：
[0128] 1)向体液样本中加入硫酸铵和MC，并充分混合，使体系内所述硫酸铵的浓度为10wt％，MC的浓度为0.5wt％；
[0129] 2)于0～25℃下静置1-30分钟；
[0130] 3)利用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，即分离得到胞外囊泡。
[0131] 作为本实施例的优选方案1，步骤2)中的温度为4～10℃；
[0132] 作为本实施例的优选方案2，步骤1)中充分混合后，调节pH值为5；
[0133] 作为本实施例的优选方案3，步骤2)中的静置时间为10分钟。
[0134] 实施例61-65
[0135] 实施例61-65分别提供一种基于盐析法提取体液中胞外囊泡的方法，与实施例60的区别仅在于提取剂的浓度不同，具体如下：
[0136]
[0137] 实验例1
[0138] 本实验例验证实施例9-14、17-22、25-30、32-37、40-45所提供的提取方法对于胞外囊泡(EVs)的盐析作用。
[0139] 实验目的：验证五种不同无机盐在浓度不同时对胞外囊泡(EVs)的盐析作用。
[0140] 实验步骤及结果：
[0141] 1、试剂准备
[0142] 采用实施例9-14、17-22、25-30、32-37、40-45所提供的浓度分别为0.5％wt、1％wt、2.5％wt、5％wt、10％wt和20％wt的五种不同的无机盐溶液。
[0143] 2、制备绿色荧光标记的胞外囊泡
[0144] 将商用人血浆解冻后1300g离心15分钟，去除细胞残骸。之后将上清转移到新离心管中，3000g离心15分钟后，取上清与PBS以体积比1:9混合，并于4℃下13000g离心30分钟。将上清加入100kDa的超滤管中，离心浓缩，并加入PBS离心清洗。将超滤管滤膜上剩余的液体吸出，加入终浓度5％的DIO染料标记。过夜透析，去除剩余的DIO染料。使用超速离心机
100,000g离心1小时，加入50μLPBS重悬待用。
100,000g离心1小时，加入50μLPBS重悬待用。
[0145] 3、胞外囊泡(EVs)盐析实验
[0146] 将绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)溶液以1:50的体积比分别与不同浓度的无机盐溶液混合，室温孵育30分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。取In最大值为Imax，计算yield＝lg(In/Imax)，如附图1所示，在同一条曲线上(所用无机盐相同)，该数值越小说明该浓度下胞外囊泡(EVs)的盐析作用越强。
[0147] 实验结果显示，随着溶液中无机盐浓度的提高，氯化钠、硫酸铵和氯化镁对胞外囊泡(EVs)的盐析作用逐渐增强；柠檬酸钠溶液仅在浓度低于2.5％wt或高于20％wt的条件下，对胞外囊泡(EVs)显示出一定的盐析能力；氯化钙溶液对胞外囊泡(EVs)的盐析作用随着氯化钙的浓度升高，首先表现为急剧增强，达到一个最大值后开始逐渐减弱。
[0148] 4、胞外囊泡(EVs)在不同盐溶液中的粒径分布
[0149] 将健康人血浆中提取的胞外囊泡(EVs)分别用1x PBS，10％wt的硫酸铵、10％wt柠檬酸钠、10％wt氯化钙、10％wt氯化钠、10％wt氯化镁重悬，然后用动态光散射仪测量其粒径变化。结果如附图2显示，硫酸铵、氯化钠、柠檬酸钠以及氯化镁对胞外囊泡(EVs)粒径影响较小，而氯化钙能够引起胞外囊泡(EVs)团聚从而显著影响其粒径分布。这一现象与在脂质体中观察到的类似，也说明不同无机盐体系影响胞外囊泡(EVs)聚集状态的机制有所差异。
[0150] 实验例2
[0151] 本实验例验证实施例9-47所提供的提取方法对于蛋白质的盐析作用。
[0152] 实验目的：
[0153] 验证五种不同无机盐在浓度不同时对蛋白质的盐析作用。为验证无机盐对于体液蛋白质的盐析作用是否会对胞外囊泡(EVs)的纯度造成影响，以无血浆蛋白质为模型，研究了无机盐对血浆蛋白质的盐析作用。
[0154] 实验步骤及结果：
[0155] 1、无胞外囊泡(EVs)人血浆的制备
[0156] 将商用人血浆解冻后，在160,000g下离心18小时，取上清分装待用。
[0157] 2、无机盐对血浆蛋白质的盐析作用
[0158] 取等体积的无胞外囊泡(EVs)人血浆，向其中分别加入实施例1-40所提供的硫酸铵、柠檬酸钠、氯化钙、氯化钠以及氯化镁使其终浓度范围介于0.5％wt和30％wt之间，其中氯化钠最高浓度为26％wt。室温孵育30分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液，用BCA法检测蛋白质总量。
[0159] Pn(n代表该反应中的无机盐浓度)。取Pn最大值为Pmax，计算yield＝lg(Pn/Pmax)，如附图3所示，在同一条曲线上(所用无机盐相同)，该数值越小说明该浓度下血浆蛋白质的盐析作用越强。实验结果显示，在给出的实验条件下，随着浓度增加氯化钠、柠檬酸钠和氯化镁对血浆蛋白质的盐析作用未见明显增强。随着浓度增加，硫酸铵对血浆蛋白的盐析作用逐步增强，而氯化钙在浓度低于10％wt的时候，出现了小幅波动，在浓度介于10％wt和20％wt的范围时对血浆蛋白的盐析作用显著增强。
[0160] 实验例3
[0161] 本实验例验证实施例48-65所提供的提取方法的对于胞外囊泡(EVs)的盐析作用。
[0162] 实施例48-65与实施例1-47的区别在于，还进一步加入了水溶性聚合物，分别为非离子型聚合物聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、正电聚合物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)以及容易盐析的水溶性聚合物甲基纤维素(Methyl cellulose)。
[0163] 实验步骤及结果：
[0164] 1、试剂准备
[0165] PEG6000，PEI，MC，以及无机盐采购自sigma。绿色荧光标记的胞外囊泡的制备方法同实验例1。
[0166] 2、水溶性聚合物对胞外囊泡(EVs)盐析的影响
[0167] 将聚合物PEG6000，PEI，MC分别与三种无机盐，硫酸铵、氯化钙和柠檬酸钠以不同比例混合，并加入等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)。室温孵育30分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。如图4所示，在同一条曲线上(所用无机盐相同)，In数值越小说明该条件下胞外囊泡(EVs)的盐析作用越强。
[0168] 其中，数据如下表所示：
[0169] 表1、硫酸铵浓度与水溶性聚合物的浓度不同时对EVs的盐析作用[0170]
[0171] 表2、氯化钙浓度与水溶性聚合物的浓度不同时对EVs的盐析作用[0172]
[0173] 表3、柠檬酸钠浓度与水溶性聚合物的浓度不同时对EVs的盐析作用[0174]
[0175]
[0176] 实验结果显示，加入PEG后，囊泡在不同浓度的无机盐下盐析作用的变化趋势并未改变。加入PEI后，低无机盐浓度下的盐析作用得到增强，增加PEI浓度能够进一步促进外泌体的析出。而加入MC后，无机盐对胞外囊泡(EVs)的盐析作用出现了不同程度的上下浮动。
[0177] 其中，以0.5％MC+10％硫酸铵、1％PEG+1％氯化钙以及1％PEI+0.5％柠檬酸钠应用时效果最优。
[0178] 实验例4
[0179] 本实验例验证实施例6-8所提供的提取剂(不同聚合物/无机盐配方)、本发明所提供的提取方法受pH值、温度以及孵育时间的影响。
[0180] 实验目的：研究当提取剂的配方确定时，其他因素包括孵育温度、pH值、和孵育时间对胞外囊泡(EVs)得率的影响。
[0181] 实验步骤及结果：
[0182] 1、试剂准备
[0183] PEG 6000、PEI、MC、HCl、NaOH以及无机盐采购自sigma。
[0184] 绿色荧光标记的胞外囊泡的制备方法同实验例1。
[0185] 2、孵育温度对胞外囊泡(EVs)得率的影响
[0186] 向等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)溶液中加入所述提取剂，分别配置成含有0.5％MC+10％硫酸铵、1％PEG+1％氯化钙以及1％PEI+0.5％柠檬酸钠的溶液。分别在4℃、
10℃和25℃下孵育30分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。取等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)用PBS稀释到与各反应体系相同的体积，测量荧光强度I0。计算胞外囊泡(EVs)得率，yield＝(1-In/I0)·100％。如附图5，结果显示，在4～25℃之间，温度对胞外囊泡(EVs)得率影响较小。
10℃和25℃下孵育30分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。取等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)用PBS稀释到与各反应体系相同的体积，测量荧光强度I0。计算胞外囊泡(EVs)得率，yield＝(1-In/I0)·100％。如附图5，结果显示，在4～25℃之间，温度对胞外囊泡(EVs)得率影响较小。
[0187] 3、pH对胞外囊泡(EVs)得率的影响
[0188] 向溶液中加入聚合物和无机盐，分别配置成含有0.5％MC+10％硫酸铵、1％PEG+1％氯化钙以及1％PEI+0.5％柠檬酸钠的溶液。并用1M的HCl和NaOH溶液滴定至pH为5、6、7、
8。向溶液中加入等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)后，室温下孵育30分钟，然后滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。用1M的HCl和NaOH溶液滴定PBS缓冲液至pH为5、6、7、8。向溶液中加入等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)，测量荧光强度I0。计算胞外囊泡(EVs)得率，yield＝(1-In/I0)·
100％。
8。向溶液中加入等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)后，室温下孵育30分钟，然后滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。用1M的HCl和NaOH溶液滴定PBS缓冲液至pH为5、6、7、8。向溶液中加入等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)，测量荧光强度I0。计算胞外囊泡(EVs)得率，yield＝(1-In/I0)·
100％。
[0189] 如附图6，结果显示，MC+硫酸铵的配方随pH变化的改变最为显著，且最优pH值为5；PEG+氯化钙的配方最优pH值为6；而PEI+柠檬酸钠的配方随pH值变化改变并不明显，pH值为
8时效果略优于其他条件。
8时效果略优于其他条件。
[0190] 4、孵育时间对胞外囊泡(EVs)得率的影响
[0191] 向等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)溶液中加入聚合物和无机盐，分别配置成含有0.5％MC+10％硫酸铵、1％PEG+1％氯化钙以及1％PEI+0.5％柠檬酸钠的溶液。分别在室温下孵育10、30、60、120分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后取流出液检测荧光强度In(n代表该反应中的无机盐浓度)。取等量绿色荧光标记的胞外囊泡(EVs)用PBS稀释到与各反应体系相同的体积，测量荧光强度I0。计算胞外囊泡(EVs)得率，yield＝(1-In/I0)·100％。
[0192] 如附图7，结果显示，只需孵育10分钟，三种方法已经能够取得较高的胞外囊泡(EVs)得率。
[0193] 实验例5
[0194] 本实验例验证实施例6-8所提供的提取剂(不同聚合物/无机盐配方)于应用时对EVs的RNA提取及RT-PCR实验的影响。
[0195] 实验目的：研究当提取剂的配方确定时，对EVs的RNA提取及RT-PCR实验的影响。
[0196] 实验步骤及结果：
[0197] 1、试剂准备
[0198] PEG6000，PEI，MC，以及无机盐采购自sigma。
[0199] 取健康人血浆2mL，解冻后1300g离心15分钟，去除细胞残骸。之后将上清转移到新离心管中，3000g离心15分钟后，取上清并用0.45μm滤膜过滤待用。所用尿液为日常中段尿，取新鲜采集的中段尿液不少于30mL，3000g离心15分钟后，取上清并用0.45μm滤膜过滤待用。
[0200] 2、EVs RNA提取
[0201] 向血浆及尿液中分别加入聚合物和无机盐，使其终浓度分别为0.5％MC+10％硫酸铵、1％PEG+1％氯化钙以及1％PEI+0.5％柠檬酸钠。室温孵育30分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后向滤膜上加入Qiazol裂解液，室温孵育5分钟。更换外管，10000g离心收集EVs裂解液，并根据miRNeasy Mini kit(Qiagen)的标准流程提取RNA。
[0202] 3、RT-PCR
[0203] 分别取2mL血浆以及30mL尿液提取的EVs RNA，对其中的两个看家基因表达量进行分析，结果如附图8所示。
[0204] 结果发现，无论是血浆还是尿液，使用PEG+氯化钙的方法得到的EVs RNA中目的基因的表达量均较高；使用PEI+柠檬酸钠的方法虽然EVs得率最高，但是带正电的PEI聚合物对RNA提取构成了影响，从而导致RT-PCR检测失败；MC+硫酸铵法提取的EVs RNA中目的基因的表达量不及PEG+氯化钙。
[0205] 实验例6
[0206] 本实验例验证PEG分子量对RT-PCR的影响。
[0207] 实验目的：验证提取剂为氯化钙和PEG的组合物时，PEG的分子量对于RT-PCR的影响。
[0208] 实验步骤及结果：
[0209] 1、试剂准备
[0210] PEG400，PEG6000，PEG35000，以及氯化钙采购自sigma。
[0211] 所用尿液为日常中段尿，取新鲜采集的中段尿液不少于30mL，3000g离心15分钟后，取上清并用0.45μm滤膜过滤待用。
[0212] 2、EVs RNA提取
[0213] 向尿液中加入聚合物和无机盐，使其终浓度分别为1％PEG+1％氯化钙。室温孵育10分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后向滤膜上加入Qiazol裂解液，室温孵育5分钟。更换外管，10000g离心收集EVs裂解液，并根据miRNeasy Mini kit(Qiagen)的标准流程提取RNA。
[0214] 3、RT-PCR
[0215] 取30mL尿液提取的EVs RNA，对其中的两个看家基因表达量进行分析，结果如附图9所示。PEG6000所得EVs RNA的RT-PCR结果较PEG400和PEG35000更好。
[0216] 实验例6
[0217] 本实验例提供本发明所提供的技术方案与与商用试剂盒用于提取EVs的比较。
[0218] 实验步骤及结果：
[0219] 1、试剂准备
[0220] PEG6000以及氯化钙采购自sigma。ExoQuick-TC采购自SBI。
[0221] 所用尿液为健康人(H1、H2、H3)的日常中段尿，取新鲜采集的中段尿液不少于30mL，3000g离心15分钟后，取上清并用0.45μm滤膜过滤待用。
[0222] 2、EVs RNA提取和PCR
[0223] 根据SBI推荐的操作流程提取尿液的EVs，加入Qiazol裂解后待用。另取等体积尿液，向中加入聚合物和无机盐，使其终浓度分别为1％PEG+1％氯化钙。室温孵育10分钟后，滴加到内含0.22μm滤膜的离心管中，10000g离心后向滤膜上加入Qiazol裂解液，室温孵育5分钟。更换外管，10000g离心收集EVs裂解液。
[0224] 根据miRNeasy Mini kit(Qiagen)的标准流程提取RNA，并使用RT-PCR的方法对看家基因GAPDH的表达量进行研究，结果如附图10所示，使用1％氯化钙+1％PEG在室温下孵育10分钟所得的EVs总量与ExoQuick-TC过夜孵育所得的EVs总量基本可比。
[0225] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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