生物降解磁性纳米颗粒及其制法和应用
阅读：1029发布：2020-06-21
专利汇可以提供生物降解磁性纳米颗粒及其制法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 生物 降解 磁性 纳米颗粒及其制备方法和应用。该粒子具备 内核 和 外壳 的核壳型结构，内核层为磁性 氧 化 铁 ，外壳层为天然高分子材料如脂质体、血液 白蛋白 、明胶、 淀粉 或壳聚糖；且粒径为1－100nm。该纳米颗粒通过反相微乳液法合成。在细胞生物学、超微化学、生物大分子体外分离检测和医学体内诊断和示踪 治疗 等领域具有重要应用前景。，下面是生物降解磁性纳米颗粒及其制法和应用专利的具体信息内容。
1.一种生物降解磁性纳米颗粒，具备内核和外壳的核壳型结构，其特征在于：内核层为磁性氧化铁，外壳层为天然高分子材料；且粒径为1-100nm。
2.根据权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒，其特征在于，所说的天然高分子材料选自脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或壳聚糖，或者其组合。
3.根据权利要求2所述的生物降解磁性纳米颗粒，其特征在于，所说的天然高分子材料为壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒，其特征在于，所说的纳米颗粒粒径为25-50nm。
5.根据权利要求4所述的生物降解磁性纳米颗粒，其特征在于，所说的磁性氧化铁成分为γ-Fe2O3。
6.一种权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法，其步骤依次如下：(1)将壳聚糖加入到酸性溶液中溶解，加入γ-Fe2O3粒子，分散均匀，作为水相；(2)取石蜡与表面活性剂、助表面活性剂混合，得均匀体系作为油相；(3)将水相加入到油相中，搅拌均匀，得到油包水型反相微乳液；(4)向体系中加入交联剂，25～40℃下搅拌；(5)洗涤粒子，除去粒子表面活性剂和有机物，真空干燥。
7.根据权利要求6所述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所说的壳聚糖的脱乙酰度为80~95％。
8.根据权利要求6所述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所说的交联剂为戊二醛。
9.根据权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所说的表面活性剂为司班，所说的助表面活性剂为吐温。
10.一种权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒在生物材料分离中和作为生物材料载体或药物载体的应用。
生物降解磁性纳米颗粒及其制法和应用
技术领域
背景技术
细胞分离技术的基本原理是根据不同细胞群具有不同的物理学、化学、生物学以及免疫表型特性，选择相应的一种或几种方法将特定的靶细胞群从混合的细胞群或组织中分离出来。最初分离富集细胞的主要方法即是依据细胞具有不同比重，采用包括速度离心沉淀、密度梯度离心等技术进行分离，但是时间长、效果差。七十年代中后期流式细胞分析及分选技术和单克隆抗体技术的出现和发展，使细胞分离技术出现了质的飞跃。应用单克隆抗体荧光染色与流式细胞分选相结合的荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cellsorting，FACS)技术极大地提高了细胞分离纯化的效率，使得高效快速分离纯化一些含量极少的细胞群成为可能。但是经荧光标记后，细胞的活性受到了一定程度的影响，这对后续研究工作产生了阻碍。磁珠分离可以克服以上缺点，它是基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的，可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出高纯度的靶细胞。磁珠是细胞分选的关键。磁珠应是超顺磁性、铁磁性或者亚铁磁性的材料构成，具有良好的磁响应、低矫顽力和低剩磁的特点，目前最广泛使用铁单质、铁氧化物等磁性材料。由于这些材料形成粒子后团聚严重、化学性质活泼，因此，在应用中，常常将它们进行包裹改性，形成“磁核”-“包覆物”的核壳结构的粒子，以解决这些问题。但现在用以包裹的无机物质无法在体内被降解并且对细胞还是有一定影响。因此，需要选择一种能被降解的天然无毒物质进行包裹。
作为包覆层材料须满足的条件有：具有良好的生物相容性和抗原性，在体内可生物降解，代谢产物无毒，并在一定时间内排出体外；具有包裹一定量“磁核”的能力，有一定的机械强度。天然高分子材料因其生物学特性和成膜性(或成球性)较好，从而倍受研究人员关注。如脂质体、聚天然氨基酸类的白蛋白、明胶、丝素蛋白等；聚多糖类的淀粉、壳聚糖等。
脂质体(Liposomes)是由磷脂胆固醇等为膜材包合而成。磷脂分散在水中时能形成多层微囊，且每层均为脂质双分子层，各层之间被水相隔开，这种微囊就是脂质体。脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力。为克服脂质体作为载体的靶向分布不理想、稳定性较差的缺点，近年来开发了一些新型脂质体，如温度敏感型、PL敏感型、免疫、聚合膜脂质体。
壳聚糖是一种天然多糖类纤维素，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中，又称为可溶性甲壳素，是自然界中唯一带有阳离子的可食纤维素，壳聚糖具有无毒、生物相容性好、可降解等优点，还具有抗菌、抗肿瘤、抗血凝、抗酸、抗溃疡等活性，可阻止或减弱药物对胃部的刺激性，并具有在酸性环境下形成水凝胶、具有黏膜性的特性，这些生物活性决定了壳聚糖在医药领域有广泛的应用，并且通过对壳聚糖进行改性，扩大了其在医学上的应用范围，现已成为高分子材料研究的热点之一。
丝素蛋白来源于蚕丝，由18种氨基酸组成。它没有免疫反应，具有良好的血液、组织相容性和抗凝血性。在负载与释放药物时，具有一定程度的pH值响应性和酶分解性。以上这些特点为其作为可控(或缓释)骨架材料提供了条件。目前的研究主要集中在缓释膜材方面，而作为微球壁材的报道很少。
磁性壳聚糖微球，是指用壳聚糖包裹“磁核”的核壳型结构颗粒，可以在微球表面通过化学反应引入多种反应性功能基(如羟基、羧基、醛基、氨基等)，也可以通过共价键来固定酶、细胞、抗体等生物活性物质，因此在固定化酶、细胞分离、免疫诊断及肿瘤靶向治疗，蛋白质、DNA的分离和提纯等方面有广泛的应用。
免疫细胞分离是基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的，可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出高纯度的细胞。
免疫磁性细胞分离法(Immunomagnetic cell separation methods)在细胞生物学中越来越成为专家学者关注的焦点。免疫磁性细胞分离依靠两种机制实现靶细胞分离。直接方法就是通过将亲和配基(即抗体)连接到磁性微球上，形成表面结合单克隆抗体的免疫磁性微球(immunomagnetic microspheres，IMMS)，此微球能特异性地与靶细胞结合并使之具有磁响应性，在外磁场作用下，可以使靶细胞与其它杂质分离。间接法就是先将抗体加到细胞悬液中，孵化后没有结合抗体的细胞被洗掉，而抗体-靶细胞复合物则通过标记有另一配基(即二抗)的免疫磁性微球富集。用无机物作为包裹层的免疫磁性微球，无法在体内降解，在细胞分选结束后须将其从被标记细胞上除去。但即使用高分子进行包裹，磁性颗粒的大小也会对细胞有很大的影响。若颗粒大小与细胞接近，则在分离之后必须将粒子除去；如果颗粒直径在100nm以内，粒子可以被生物体直接降解，对细胞活性影响较小，分离后无需除去，得到的细胞可直接用于体内细胞移植的研究。
此外，固定化酶是指利用物理吸附或化学结合法将自由酶固定到载体上，以提高酶的操作稳定性和反复回收利用酶的技术。常用的酶固定方法有：吸附法、包埋法、共价结合法和交联法。还没有用磁性微球作为固定化酶的载体以使固定化酶的分离简单易行的研究。
另外，用化学疗法治疗恶性肿瘤常不尽如人意，这主要是因为传送到肿瘤部位的药物不够。而目前尚无通过用一种磁性引导的、对细胞无害的壳聚糖制备微球作为载体固载抗癌药物，利用其结构中的阳离子结合负电荷的糖肫聚糖(GAG)、肝素、脑血管中的细胞，达到靶向给药、缓释控药的目的，从而提高药物利用率和对肿瘤的治疗效果的报道。
作为包覆层材料须满足的条件有：具有良好的生物相容性和抗原性，在体内可生物降解，代谢产物无毒，并在一定时间内排出体外；具有包裹一定量“磁核”的能力，有一定的机械强度。天然高分子材料因其生物学特性和成膜性(或成球性)较好，从而倍受研究人员关注。如脂质体、聚天然氨基酸类的白蛋白、明胶、丝素蛋白等；聚多糖类的淀粉、壳聚糖等。
脂质体(Liposomes)是由磷脂胆固醇等为膜材包合而成。磷脂分散在水中时能形成多层微囊，且每层均为脂质双分子层，各层之间被水相隔开，这种微囊就是脂质体。脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力。为克服脂质体作为载体的靶向分布不理想、稳定性较差的缺点，近年来开发了一些新型脂质体，如温度敏感型、PL敏感型、免疫、聚合膜脂质体。
壳聚糖是一种天然多糖类纤维素，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中，又称为可溶性甲壳素，是自然界中唯一带有阳离子的可食纤维素，壳聚糖具有无毒、生物相容性好、可降解等优点，还具有抗菌、抗肿瘤、抗血凝、抗酸、抗溃疡等活性，可阻止或减弱药物对胃部的刺激性，并具有在酸性环境下形成水凝胶、具有黏膜性的特性，这些生物活性决定了壳聚糖在医药领域有广泛的应用，并且通过对壳聚糖进行改性，扩大了其在医学上的应用范围，现已成为高分子材料研究的热点之一。
丝素蛋白来源于蚕丝，由18种氨基酸组成。它没有免疫反应，具有良好的血液、组织相容性和抗凝血性。在负载与释放药物时，具有一定程度的pH值响应性和酶分解性。以上这些特点为其作为可控(或缓释)骨架材料提供了条件。目前的研究主要集中在缓释膜材方面，而作为微球壁材的报道很少。
磁性壳聚糖微球，是指用壳聚糖包裹“磁核”的核壳型结构颗粒，可以在微球表面通过化学反应引入多种反应性功能基(如羟基、羧基、醛基、氨基等)，也可以通过共价键来固定酶、细胞、抗体等生物活性物质，因此在固定化酶、细胞分离、免疫诊断及肿瘤靶向治疗，蛋白质、DNA的分离和提纯等方面有广泛的应用。
免疫细胞分离是基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的，可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出高纯度的细胞。
免疫磁性细胞分离法(Immunomagnetic cell separation methods)在细胞生物学中越来越成为专家学者关注的焦点。免疫磁性细胞分离依靠两种机制实现靶细胞分离。直接方法就是通过将亲和配基(即抗体)连接到磁性微球上，形成表面结合单克隆抗体的免疫磁性微球(immunomagnetic microspheres，IMMS)，此微球能特异性地与靶细胞结合并使之具有磁响应性，在外磁场作用下，可以使靶细胞与其它杂质分离。间接法就是先将抗体加到细胞悬液中，孵化后没有结合抗体的细胞被洗掉，而抗体-靶细胞复合物则通过标记有另一配基(即二抗)的免疫磁性微球富集。用无机物作为包裹层的免疫磁性微球，无法在体内降解，在细胞分选结束后须将其从被标记细胞上除去。但即使用高分子进行包裹，磁性颗粒的大小也会对细胞有很大的影响。若颗粒大小与细胞接近，则在分离之后必须将粒子除去；如果颗粒直径在100nm以内，粒子可以被生物体直接降解，对细胞活性影响较小，分离后无需除去，得到的细胞可直接用于体内细胞移植的研究。
此外，固定化酶是指利用物理吸附或化学结合法将自由酶固定到载体上，以提高酶的操作稳定性和反复回收利用酶的技术。常用的酶固定方法有：吸附法、包埋法、共价结合法和交联法。还没有用磁性微球作为固定化酶的载体以使固定化酶的分离简单易行的研究。
另外，用化学疗法治疗恶性肿瘤常不尽如人意，这主要是因为传送到肿瘤部位的药物不够。而目前尚无通过用一种磁性引导的、对细胞无害的壳聚糖制备微球作为载体固载抗癌药物，利用其结构中的阳离子结合负电荷的糖肫聚糖(GAG)、肝素、脑血管中的细胞，达到靶向给药、缓释控药的目的，从而提高药物利用率和对肿瘤的治疗效果的报道。
发明内容
所要解决的技术问题本发明需要解决的技术问题是提供一种生物降解磁性纳米颗粒及其制法和应用，以克服现有技术中磁性纳米颗粒无法进行生物降解、对所接触的细胞有不利影响的缺陷。
技术方案本发明的内容之一是提供一种生物降解磁性纳米颗粒，具备内核和外壳的核壳型结构，其特征在于：内核层为磁性氧化铁，外壳层为天然高分子材料；且粒径为1-100nm。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的优选方案之一为，所说的天然高分子材料选自脂质体、血液白蛋白、明胶、丝素蛋白、淀粉或壳聚糖，或者其组合。优选所说的天然高分子材料为壳聚糖。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的另一优选方案为，所说的纳米颗粒粒径为25-50nm。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的又一优选方案为，所说的磁性氧化铁成分为γ-Fe2O3。
本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，制备所说的外壳层成分可以是不同种类的可生物降解的天然高分子材料，比如：脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或者壳聚糖；也可以是这些成分的组合，比如：组成明胶在外壳聚糖在内的双层外壳、或者血液白蛋白在内淀粉在外的双层外壳；还可以是淀粉和脂质体的均匀混合外壳、或者壳聚糖和明胶的均匀混合外壳。较佳地，其外壳成分采用明胶、血液白蛋白、壳聚糖或者其组合；最佳地，所述的外壳成分是壳聚糖。之所以说这些外壳成分都可采用，是由于其在生物降解性能上均比较好，且与细胞的相容性良好，没有细胞毒性。在原料提供和制备上也比较简单，只需在本发明的壳聚糖磁性纳米颗粒制备方法的基础上稍加改动，即可获得脂质体磁性纳米颗粒、血液白蛋白磁性纳米颗粒、明胶磁性纳米颗粒、或者淀粉磁性纳米颗粒。
本发明的内容之二是提供一种制备所说的生物降解磁性纳米颗粒的方法，其步骤依次如下：(1)将壳聚糖加入到酸性溶液中溶解，加入γ-Fe2O3粒子，分散均匀，作为水相；(2)取石蜡与表面活性剂、助表面活性剂混合，得均匀体系，作为油相；(3)将水相加入到油相中，搅拌均匀，得到油包水型反相微乳液；(4)向体系中加入交联剂，25～40℃下搅拌；(5)洗涤粒子，除去粒子表面活性剂和有机物，真空干燥。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法的优选方案之一为，所说的壳聚糖的脱乙酰度为80～95％。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法的优选方案之二为，所说的交联剂为戊二醛。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法的优选方案之三为，表面活性剂为司班，所说的助表面活性剂为吐温。
本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，对于选定的外壳成分，如脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或者壳聚糖等等，一般技术人员可根据现有技术选用合适的外壳——内核交联剂。例如以可溶性淀粉为原料，环氧氯丙烷为交联剂，Span 60为乳化剂，甲苯和蓖麻油的混合物为油相，采用逆相悬浮交联聚合法合成淀粉微球。
本发明的内容之三是提供一种权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒在生物材料分离中和作为生物材料载体或药物载体的应用。
所说应用的一种方式为，利用生物降解磁性纳米颗粒与免疫抗体或者抗原一起制备免疫磁性微球，利用特异性免疫反应分离富集相应的细胞。
所说应用的另一种方式为，利用生物降解磁性纳米颗粒以物理吸附或化学结合法将自由酶固定到颗粒上，制成固定化酶，利用磁性分离固定化酶，使其反复使用。
所说应用的再一种方式为，利用生物降解磁性纳米颗粒作为载体固载抗癌药物，进行靶向给药、缓释控药。
本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，由于所说的生物降解磁性纳米颗粒并不限于磁性壳聚糖，还有脂质体磁性纳米颗粒、血液白蛋白磁性纳米颗粒、明胶磁性纳米颗粒、或者淀粉磁性纳米颗粒，以及几种天然高分子组合而成的磁性纳米颗粒，故利用不同外壳材料的性质不同，比如：脂质体本身携带药物的特性、容易进入细胞的特性，可以制成良好的抗癌药物磁性纳米载体；利用血液白蛋白与外周血的相容性和逐步代谢的特性制备肝脏疾病药物，以维持肝脏的营养代偿和缓慢持续作用于疾病组织，形成药物和营养的双重支持等等。
有益效果1.本发明的生物降解磁性纳米颗粒其外壳层采用脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或者壳聚糖等无毒、具有生物相容性的材料，使其应用于生物化学领域成为可能。
2.由于其生物降解特性，本发明的生物降解磁性纳米颗粒与现有技术中生物惰性的磁性纳米粒子相比，可以使纳米颗粒不但具备一般磁性纳米粒子在体外对核酸、蛋白质、动植物细胞的分离能力，还具有体内应用的生物功能。
3.本发明制备生物降解磁性纳米颗粒如磁性壳聚糖纳米复合材料的方法，所得的粒子直径为1-100nm可控，比如优选的目标粒径为40nm左右，即可通过调节反应条件，获得大小均匀，分散性良好，磁响应优良，且粒径分布窄的纳米颗粒，工艺简单，重现性好。
4.本发明的实验表明，将生物降解磁性纳米颗粒用于富集的CD34+细胞，纯度达80％左右，是一种良好的检测用纳米材料。
5.采用纳米颗粒联结生物相容材料，可以有效的发挥纳米材料的表面积优势，提高生物反应的效率、加快反应时间，同时减小反应体系的总量，使得进行微量检测和微量反应简便易行。
6.本发明提供的生物降解磁性纳米颗粒特别是磁性壳聚糖是蛋白质的良好生物吸附剂。通过磁性壳聚糖微球对蛋白质的分离和提纯，可达到对资源回收利用的目的，并且经过吸附的蛋白质很容易被洗脱分离，蛋白质的活性也能大大提高。
7.本发明的磁性壳聚糖微球作为固定化酶的载体可以使固定化酶的分离简单易行。
8.利用本发明磁性壳聚糖微球作为载体固载抗癌药物，利用其结构中的阳离子结合负电荷的糖肫聚糖(GAG)、肝素、脑血管中的细胞，可以达到靶向给药、缓释控药的目的，提高药物利用率和对肿瘤的治疗效果。
9.本发明的制备方法采用成本低廉的天然有机高分子、外壳交联剂等，使得实际大规模生产具有可行性。
10.生物降解的磁性纳米颗粒对于纳米水平上的生物材料的理化性质的研究提供了基础，同时进一步提供了扩大应用的可能性。
11.在本发明的纳米粒子上连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等，可以广泛应用于各类分子的体外检测和疾病的体内示踪治疗。
附图说明
图1是壳聚糖(a)、磁性壳聚糖材料(b)、Fe2O3(c)的红外谱图。在图中a的2882cm-1的吸收峰是壳聚糖残糖基上的甲基或次甲基的C-H的伸缩振动峰，图中b在2920cm-1和2845cm-1处吸收峰，这是戊二醛中的-CH2伸缩振动峰；在1729cm-1处出现新的吸收峰，这是制备纳米粒子时生成的悬挂醛基的吸收峰；在1665cm-1处出现了席夫碱反应产物C＝N的伸缩振动吸收峰；在图中c同时还出现了572cm-1和632cm-1的吸收峰是γ-Fe2O3的两个特征峰。
图2是磁性壳聚糖纳米复合材料的原子力显微镜图(a)以及对应的磁扫描图(b)。从图1中可以看到制备的磁性纳米材料粒径在40nm左右，大小均匀，有很好的分散性，并且粒子的磁响应性能非常好。
技术方案本发明的内容之一是提供一种生物降解磁性纳米颗粒，具备内核和外壳的核壳型结构，其特征在于：内核层为磁性氧化铁，外壳层为天然高分子材料；且粒径为1-100nm。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的优选方案之一为，所说的天然高分子材料选自脂质体、血液白蛋白、明胶、丝素蛋白、淀粉或壳聚糖，或者其组合。优选所说的天然高分子材料为壳聚糖。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的另一优选方案为，所说的纳米颗粒粒径为25-50nm。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的又一优选方案为，所说的磁性氧化铁成分为γ-Fe2O3。
本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，制备所说的外壳层成分可以是不同种类的可生物降解的天然高分子材料，比如：脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或者壳聚糖；也可以是这些成分的组合，比如：组成明胶在外壳聚糖在内的双层外壳、或者血液白蛋白在内淀粉在外的双层外壳；还可以是淀粉和脂质体的均匀混合外壳、或者壳聚糖和明胶的均匀混合外壳。较佳地，其外壳成分采用明胶、血液白蛋白、壳聚糖或者其组合；最佳地，所述的外壳成分是壳聚糖。之所以说这些外壳成分都可采用，是由于其在生物降解性能上均比较好，且与细胞的相容性良好，没有细胞毒性。在原料提供和制备上也比较简单，只需在本发明的壳聚糖磁性纳米颗粒制备方法的基础上稍加改动，即可获得脂质体磁性纳米颗粒、血液白蛋白磁性纳米颗粒、明胶磁性纳米颗粒、或者淀粉磁性纳米颗粒。
本发明的内容之二是提供一种制备所说的生物降解磁性纳米颗粒的方法，其步骤依次如下：(1)将壳聚糖加入到酸性溶液中溶解，加入γ-Fe2O3粒子，分散均匀，作为水相；(2)取石蜡与表面活性剂、助表面活性剂混合，得均匀体系，作为油相；(3)将水相加入到油相中，搅拌均匀，得到油包水型反相微乳液；(4)向体系中加入交联剂，25～40℃下搅拌；(5)洗涤粒子，除去粒子表面活性剂和有机物，真空干燥。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法的优选方案之一为，所说的壳聚糖的脱乙酰度为80～95％。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法的优选方案之二为，所说的交联剂为戊二醛。
上述的生物降解磁性纳米颗粒的制备方法的优选方案之三为，表面活性剂为司班，所说的助表面活性剂为吐温。
本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，对于选定的外壳成分，如脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或者壳聚糖等等，一般技术人员可根据现有技术选用合适的外壳——内核交联剂。例如以可溶性淀粉为原料，环氧氯丙烷为交联剂，Span 60为乳化剂，甲苯和蓖麻油的混合物为油相，采用逆相悬浮交联聚合法合成淀粉微球。
本发明的内容之三是提供一种权利要求1所述的生物降解磁性纳米颗粒在生物材料分离中和作为生物材料载体或药物载体的应用。
所说应用的一种方式为，利用生物降解磁性纳米颗粒与免疫抗体或者抗原一起制备免疫磁性微球，利用特异性免疫反应分离富集相应的细胞。
所说应用的另一种方式为，利用生物降解磁性纳米颗粒以物理吸附或化学结合法将自由酶固定到颗粒上，制成固定化酶，利用磁性分离固定化酶，使其反复使用。
所说应用的再一种方式为，利用生物降解磁性纳米颗粒作为载体固载抗癌药物，进行靶向给药、缓释控药。
本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，由于所说的生物降解磁性纳米颗粒并不限于磁性壳聚糖，还有脂质体磁性纳米颗粒、血液白蛋白磁性纳米颗粒、明胶磁性纳米颗粒、或者淀粉磁性纳米颗粒，以及几种天然高分子组合而成的磁性纳米颗粒，故利用不同外壳材料的性质不同，比如：脂质体本身携带药物的特性、容易进入细胞的特性，可以制成良好的抗癌药物磁性纳米载体；利用血液白蛋白与外周血的相容性和逐步代谢的特性制备肝脏疾病药物，以维持肝脏的营养代偿和缓慢持续作用于疾病组织，形成药物和营养的双重支持等等。
有益效果1.本发明的生物降解磁性纳米颗粒其外壳层采用脂质体、血液白蛋白、明胶、淀粉或者壳聚糖等无毒、具有生物相容性的材料，使其应用于生物化学领域成为可能。
2.由于其生物降解特性，本发明的生物降解磁性纳米颗粒与现有技术中生物惰性的磁性纳米粒子相比，可以使纳米颗粒不但具备一般磁性纳米粒子在体外对核酸、蛋白质、动植物细胞的分离能力，还具有体内应用的生物功能。
3.本发明制备生物降解磁性纳米颗粒如磁性壳聚糖纳米复合材料的方法，所得的粒子直径为1-100nm可控，比如优选的目标粒径为40nm左右，即可通过调节反应条件，获得大小均匀，分散性良好，磁响应优良，且粒径分布窄的纳米颗粒，工艺简单，重现性好。
4.本发明的实验表明，将生物降解磁性纳米颗粒用于富集的CD34+细胞，纯度达80％左右，是一种良好的检测用纳米材料。
5.采用纳米颗粒联结生物相容材料，可以有效的发挥纳米材料的表面积优势，提高生物反应的效率、加快反应时间，同时减小反应体系的总量，使得进行微量检测和微量反应简便易行。
6.本发明提供的生物降解磁性纳米颗粒特别是磁性壳聚糖是蛋白质的良好生物吸附剂。通过磁性壳聚糖微球对蛋白质的分离和提纯，可达到对资源回收利用的目的，并且经过吸附的蛋白质很容易被洗脱分离，蛋白质的活性也能大大提高。
7.本发明的磁性壳聚糖微球作为固定化酶的载体可以使固定化酶的分离简单易行。
8.利用本发明磁性壳聚糖微球作为载体固载抗癌药物，利用其结构中的阳离子结合负电荷的糖肫聚糖(GAG)、肝素、脑血管中的细胞，可以达到靶向给药、缓释控药的目的，提高药物利用率和对肿瘤的治疗效果。
9.本发明的制备方法采用成本低廉的天然有机高分子、外壳交联剂等，使得实际大规模生产具有可行性。
10.生物降解的磁性纳米颗粒对于纳米水平上的生物材料的理化性质的研究提供了基础，同时进一步提供了扩大应用的可能性。
11.在本发明的纳米粒子上连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等，可以广泛应用于各类分子的体外检测和疾病的体内示踪治疗。
附图说明
图1是壳聚糖(a)、磁性壳聚糖材料(b)、Fe2O3(c)的红外谱图。在图中a的2882cm-1的吸收峰是壳聚糖残糖基上的甲基或次甲基的C-H的伸缩振动峰，图中b在2920cm-1和2845cm-1处吸收峰，这是戊二醛中的-CH2伸缩振动峰；在1729cm-1处出现新的吸收峰，这是制备纳米粒子时生成的悬挂醛基的吸收峰；在1665cm-1处出现了席夫碱反应产物C＝N的伸缩振动吸收峰；在图中c同时还出现了572cm-1和632cm-1的吸收峰是γ-Fe2O3的两个特征峰。
图2是磁性壳聚糖纳米复合材料的原子力显微镜图(a)以及对应的磁扫描图(b)。从图1中可以看到制备的磁性纳米材料粒径在40nm左右，大小均匀，有很好的分散性，并且粒子的磁响应性能非常好。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，γ-Fe2O3购自Sigma公司。
实施例1本发明采取反相微乳液的方法，制备磁性壳聚糖纳米复合材料，得到粒径大小为40nm左右的球形纳米粒子，具体实施方法如下：1.称取1～100mg脱乙酰度分别为80~95％的壳聚糖粉末加入到1～10mL 1％醋酸溶液中，超声溶解，加入5～25mg γ-Fe2O3粒子，分散均匀，作为水相；2.取5～50g石蜡，加入5～10g司班，5～10g吐温，搅拌，得均匀体系，作为油相；3.将水相加入到油相中，搅拌均匀，得到透明褐色油包水型(W/O型)反相微乳液；4.向体系中加入1～3mL戊二醛作为交联剂，恒温水浴25～40℃恒温水浴，机械搅拌，反应后用异丙醇洗涤粒子，除去粒子表面活性剂、有机物，在60℃真空干燥箱中烘干；5.用红外光谱仪、原子力显微镜，透射电镜等仪器对所制备的样品进行表征。
图1、2的结果表明微球为壳聚糖和γ-Fe2O3的复合材料。
实施例2采用经典的反相蒸发法制备磁性脂质体。将适量的大豆磷脂、胆固醇(摩尔比为2∶1)溶解在甲醇一氯仿(1∶1)混合溶剂中，旋转蒸发形成均一透明脂膜，以适量乙醚溶解脂膜后，加适量γ-Fe2O3粒子悬浊液，超声乳化后进行第二次旋转蒸发，而后进行超声匀化，最后将脂质体悬液挤压通过450nm的微孔滤膜即得磁性脂质体，操作过程中通氮气保护。
脂质体具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布。脂质体在淋巴中稳定，靠巨噬细胞的吞噬进入淋巴结，而后被溶酶体破坏。
实施例3采取与实施例1相同的反相微乳液的方法，制备磁性血液白蛋白纳米复合材料，得到粒径大小为50nm左右的球形纳米粒子。白蛋白带负电荷时在受体介导下可被淋巴吸收，且吸收速度与所带的负电荷相关。负电荷白蛋白可到达淋巴结的胚胎中心和卵泡周围，不仅本身对艾滋病病毒的复制有抑制作用，而且还可作为抗艾滋病药的载体。
实施例4采取与实施例1相同的反相微乳液的方法，制备磁性明胶纳米复合材料，得到粒径大小为100nm左右的球形纳米粒子。明胶易与甲醛或戊二醛进行交联反应，形成具有三维网络结掏的坚膜层是其缓释作用的基础，控制形成网络的稠密度、厚度及牢度。
实施例5采取与实施例1相同的反相微乳液的方法，制备磁性淀粉纳米复合材料，得到粒径大小为50～370nm的球形纳米粒子。淀粉微球成本低、贮存稳定、无毒、不会引起免疫反应，其本身具有微孔结构，易吸附药物；在生物体内具有一定的可变形性，能够根据血管丛的微环境来改变自己的形状；经酶降解时，微球的骨架崩解前其载药能力可保持相当长时间，因而可有效延长所载药物的释放时间，提高药物的疗效。
实施例6CD34+细胞富集1.CD34免疫磁性微球的制备将制得的磁性壳聚糖颗粒分散在2mLPBS溶液中，超声分散后，加入5mL 5％的戊二醛溶液，室温振荡12小时，用PBS缓冲溶液洗涤，加入人CD34单抗，抗体为标记了藻红蛋白的抗CD34单抗。4℃反应12小时。将CD34免疫磁性微球磁性分离，4℃保存在PBS缓冲溶液中，备用。
2.CD34+细胞富集将细胞悬液经PBS缓冲溶液稀释，淋巴细胞分离液梯度密度离心，分出单个核细胞(MNC)，洗涤备用。加入制备的CD34免疫磁性微球进行磁性分离。
3.细胞纯度测定经流式细胞仪检测，富集的CD34+细胞纯度为达80％～87％，分离后脐血中得到的CD34+细胞占脐血样品中MNC总数的1.29％±0.31％。
实施例7纤维素酶的固定化称取一定量磁性明胶微粒，加入适量纤维素酶，室温振荡8h，重蒸水充分洗涤，直至无酶蛋白洗出，即得磁性固定化纤维素酶(MIE)。采用Folin2酚法测定，以牛血清蛋白作标准。并对酶活性进行测定。纤维素酶的最大载量达138mg/g，活性回收率可达77％。
实施例8靶向抗癌药物采用乳液-化学交联法制备磁性-氟尿嘧啶-壳聚糖微球，磁性氟尿嘧啶壳聚糖微球具有强顺磁性，粒径分布100nm，γ-Fe2O3质量分数为4.5％~11.5％，药物包封率为40％~85％。体外药物释放实验表明，对氟尿嘧啶的缓释作用明显，释放周期比较长，γ-Fe2O3粒子和含量对微球的释药速率影响不明显；药物释放主要受扩散机制控制，药物含量越大，药物从微球中释放出来的速率越快，可作为理想的磁靶向药物控释体系。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，γ-Fe2O3购自Sigma公司。
实施例1本发明采取反相微乳液的方法，制备磁性壳聚糖纳米复合材料，得到粒径大小为40nm左右的球形纳米粒子，具体实施方法如下：1.称取1～100mg脱乙酰度分别为80~95％的壳聚糖粉末加入到1～10mL 1％醋酸溶液中，超声溶解，加入5～25mg γ-Fe2O3粒子，分散均匀，作为水相；2.取5～50g石蜡，加入5～10g司班，5～10g吐温，搅拌，得均匀体系，作为油相；3.将水相加入到油相中，搅拌均匀，得到透明褐色油包水型(W/O型)反相微乳液；4.向体系中加入1～3mL戊二醛作为交联剂，恒温水浴25～40℃恒温水浴，机械搅拌，反应后用异丙醇洗涤粒子，除去粒子表面活性剂、有机物，在60℃真空干燥箱中烘干；5.用红外光谱仪、原子力显微镜，透射电镜等仪器对所制备的样品进行表征。
图1、2的结果表明微球为壳聚糖和γ-Fe2O3的复合材料。
实施例2采用经典的反相蒸发法制备磁性脂质体。将适量的大豆磷脂、胆固醇(摩尔比为2∶1)溶解在甲醇一氯仿(1∶1)混合溶剂中，旋转蒸发形成均一透明脂膜，以适量乙醚溶解脂膜后，加适量γ-Fe2O3粒子悬浊液，超声乳化后进行第二次旋转蒸发，而后进行超声匀化，最后将脂质体悬液挤压通过450nm的微孔滤膜即得磁性脂质体，操作过程中通氮气保护。
脂质体具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布。脂质体在淋巴中稳定，靠巨噬细胞的吞噬进入淋巴结，而后被溶酶体破坏。
实施例3采取与实施例1相同的反相微乳液的方法，制备磁性血液白蛋白纳米复合材料，得到粒径大小为50nm左右的球形纳米粒子。白蛋白带负电荷时在受体介导下可被淋巴吸收，且吸收速度与所带的负电荷相关。负电荷白蛋白可到达淋巴结的胚胎中心和卵泡周围，不仅本身对艾滋病病毒的复制有抑制作用，而且还可作为抗艾滋病药的载体。
实施例4采取与实施例1相同的反相微乳液的方法，制备磁性明胶纳米复合材料，得到粒径大小为100nm左右的球形纳米粒子。明胶易与甲醛或戊二醛进行交联反应，形成具有三维网络结掏的坚膜层是其缓释作用的基础，控制形成网络的稠密度、厚度及牢度。
实施例5采取与实施例1相同的反相微乳液的方法，制备磁性淀粉纳米复合材料，得到粒径大小为50～370nm的球形纳米粒子。淀粉微球成本低、贮存稳定、无毒、不会引起免疫反应，其本身具有微孔结构，易吸附药物；在生物体内具有一定的可变形性，能够根据血管丛的微环境来改变自己的形状；经酶降解时，微球的骨架崩解前其载药能力可保持相当长时间，因而可有效延长所载药物的释放时间，提高药物的疗效。
实施例6CD34+细胞富集1.CD34免疫磁性微球的制备将制得的磁性壳聚糖颗粒分散在2mLPBS溶液中，超声分散后，加入5mL 5％的戊二醛溶液，室温振荡12小时，用PBS缓冲溶液洗涤，加入人CD34单抗，抗体为标记了藻红蛋白的抗CD34单抗。4℃反应12小时。将CD34免疫磁性微球磁性分离，4℃保存在PBS缓冲溶液中，备用。
2.CD34+细胞富集将细胞悬液经PBS缓冲溶液稀释，淋巴细胞分离液梯度密度离心，分出单个核细胞(MNC)，洗涤备用。加入制备的CD34免疫磁性微球进行磁性分离。
3.细胞纯度测定经流式细胞仪检测，富集的CD34+细胞纯度为达80％～87％，分离后脐血中得到的CD34+细胞占脐血样品中MNC总数的1.29％±0.31％。
实施例7纤维素酶的固定化称取一定量磁性明胶微粒，加入适量纤维素酶，室温振荡8h，重蒸水充分洗涤，直至无酶蛋白洗出，即得磁性固定化纤维素酶(MIE)。采用Folin2酚法测定，以牛血清蛋白作标准。并对酶活性进行测定。纤维素酶的最大载量达138mg/g，活性回收率可达77％。
实施例8靶向抗癌药物采用乳液-化学交联法制备磁性-氟尿嘧啶-壳聚糖微球，磁性氟尿嘧啶壳聚糖微球具有强顺磁性，粒径分布100nm，γ-Fe2O3质量分数为4.5％~11.5％，药物包封率为40％~85％。体外药物释放实验表明，对氟尿嘧啶的缓释作用明显，释放周期比较长，γ-Fe2O3粒子和含量对微球的释药速率影响不明显；药物释放主要受扩散机制控制，药物含量越大，药物从微球中释放出来的速率越快，可作为理想的磁靶向药物控释体系。
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