技术领域
[0001] 本
发明属于生物电化学传感器领域，具体涉及一种用于血糖
生物传感器的修饰电极及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 糖尿病是由于胰岛素分泌
缺陷或者生物效应降低引起的一种新陈代谢型
疾病，严重危害人类健康。积极的
预防治疗和早期筛查是糖尿病的有效控制手段，因此，血糖快速有效的体外检测具有十分重要的意义。
[0003] 目前血糖的体外检测方法主要有高效液相色谱法、分光光度法、旋光度法、气相色谱法、电化学生物传感器等。这些方法存在着设备昂贵、过程繁
锁、检测时间长等问题，因此在血糖实际的检测中受到限制。相比较而言，生物电化学传感器具有操作简单、易于微型化、响应速度快、灵敏度高、成本低廉等优点，在血糖的体外检测中具有很好的应用前景。
[0004] 血糖生物电化学传感器通常是利用
葡萄糖氧化酶来识别检测血糖，在本发明之前的第一代血糖生物传感器采用葡萄糖氧化酶的天然介体，利用生成的H2O2在电极上的氧化输出
信号指示
血糖浓度，这种传感器存在受环境氧浓度影响大、响应特性差、背景
电流大等问题，因而产生了第二代血糖生物传感器。第二代血糖生物传感器通过外加媒介体来促进血糖氧化与电极间
电子传递问题，通过媒介体介导葡萄糖氧化酶对葡萄糖的催化反应，并不直接依赖O2或H2O2浓度变化，而是利用具有较低氧化电位的媒介体的氧化信号对血糖进行测定。然而，第二代血糖生物传感器仍然存在
稳定性差、检测信号弱、灵
密度低、抗干扰能
力差、难于微型化及大规模生产等问题。
发明内容
[0005] 为解决第二代血糖生物电化学传感器存在检测灵敏度低、重现性与抗干扰能力差以及葡萄糖氧化酶不稳定等的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种用于血糖生物传感器的、由葡萄糖氧化酶、电子媒介体与壳聚糖功能化
碳纳米管组成的修饰电极的制备方法。
[0006] 本发明的又一目的在于提供一种上述制备方法制备而成的修饰电极。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述修饰电极在制备血糖生物传感器中的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术予以实现：
[0009] 一种用于血糖生物传感器的修饰电极的制备方法，包括以下操作步骤：
[0010] (1)在
水溶剂中采用十二烷基苯磺酸钠分散单壁
碳纳米管，得到
单壁碳纳米管悬浮液；将单壁碳纳米管悬浮液滴加到基底电极上，再将该电极在红外灯下干燥制得单壁碳纳米管修饰电极；
[0011] (2)分别配制浓度为10～20g/L的葡萄糖氧化酶的三羟甲基
氨基甲烷溶液、2～8g/L的二茂
铁的乙腈溶液以及8～13mmol/L的四丁基高氯酸铵的乙腈溶液；将二茂铁的乙腈溶液以及四丁基高氯酸铵的乙腈溶液按照体积比为1:1混合，得到二茂铁与四丁基高氯酸铵的
混合液；再将二茂铁与四丁基高氯酸铵的混合液与葡萄糖氧化酶的三羟甲基氨基甲烷溶液按照体积比为1:1混合，得到葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液；接着将葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液滴加到单壁碳纳米管修饰电极上，然后在20～50℃下恒温干燥，制得葡萄糖氧化酶-二茂铁修饰单壁碳纳米管电极；
[0012] (3)用乙酸溶解壳聚糖，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液滴加到葡萄糖氧化酶-二茂铁修饰单壁碳纳米管电极上，在20～50℃下恒温干燥，制得用于血糖生物传感器的修饰电极。
[0013] 步骤(1)所述基底电极为
石墨电极或玻碳电极，有效面积为0.1～1.0cm2。
[0014] 步骤(2)所述葡萄糖氧化酶的三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度优选为16g/L，二茂铁的乙腈溶液的浓度优选为4g/L，四丁基高氯酸铵的乙腈溶液的浓度优选为10.8mmol/L。
[0015] 步骤(2)所述葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液中葡萄糖氧化酶浓度为8g/L，二茂铁浓度为1g/L，四丁基高氯酸铵浓度为2.7mmol/L；步骤(3)所述壳聚糖溶液的浓度为5g/L。
[0016] 在基底电极上依次修饰了单壁碳纳米管悬浮液、葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液及2
壳聚糖溶液；步骤(1)所述滴加到基底电极上的单壁碳纳米管悬浮液的量为平均每1cm基底电极滴加65μL；步骤(2)所述滴加到单壁碳纳米管修饰电极上的葡萄糖氧化酶-二茂
2
铁混合液的量为平均每1cm基底电极滴加65μL；步骤(3)所述滴加到葡萄糖氧化酶-二
2
茂铁修饰单壁碳纳米管电极上的壳聚糖溶液的量为平均每1cm基底电极滴加100μL。
[0017] 一种由上述制备方法制备得到的修饰电极。
[0018] 上述修饰电极在制备血糖传感器中的应用，所述应用按照以下操作步骤：
[0019] (1)将修饰电极作为
工作电极，与
对电极、参比电极一起构建成三电极体系，并与电化学工作站相对应的电极连接；然后在
电解池里加入0.1mol/L的
磷酸缓冲溶液(pH＝7)；
[0020] (2)采用电位阶跃法恒定电位在0.15～0.30V，在电流趋于稳定时向
电解池中滴加已知浓度的葡萄糖溶液，得到滴加葡萄糖的响应电流，将所得到的响应电流与滴加的葡萄糖浓度进行拟合，制定葡萄糖浓度-响应电流标准曲线，用于血糖浓度的检测；
[0021] (3)在(1)装置中，采用电位阶跃法恒定电位在0.15～0.30V，在电流趋于稳定时往电解池中滴加待测血液样品，得到血液中葡萄糖的响应电流，将该响应电流与葡萄糖浓度-响应电流标准曲线进行对比，计算得出血液样品中葡萄糖浓度。
[0022] 步骤(2)滴加已知浓度的葡萄糖溶液的量为10μL；步骤(3)中所述电位为0.2V，滴加血液样品的量为20μL。
[0023] 本发明所得修饰电极中单壁碳纳米管具有很好的
导电性能，具有较大的
比表面积，因此单壁碳纳米管的引入有利于葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液与电极之间的电子传递；该修饰电极中葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液是由水相和油相按照体积比1:1混合，并在
表面活性剂四丁基高氯酸铵作用下得到稳定的微乳体系，能够保证葡萄糖氧化酶和二茂铁稳定存在，并更好地发挥酶的生物活性，同时中采用了适宜浓度的二茂铁作为电子传递体，能很好地介导葡萄糖氧化酶的活性中心与电极间的电子传递，提高了葡萄糖的检测灵敏度；此外，由于本发明修饰电极的最外层是多孔的具有
生物相容性的壳聚糖，可以很好地防止了内层葡萄糖氧化酶-二茂铁的流失，使得所制备的修饰电极高效稳定。
[0024] 与现有的血糖传感器相比较，本发明具有如下优势：
[0025] (1)本发明所述的新型修饰电极中，含二茂铁的油相与含葡萄糖氧化酶的水相在表面活性剂四丁基高氯酸铵的作用下形成了微乳结构，对二茂铁介导葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖具有很好的增强，同时单壁碳纳米管的优良电化学性质，对新型修饰电极检测血糖时的灵敏度和抗干扰能力有极大的提高；
[0026] (2)本发明所述的新型修饰电极中，由于葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液以微乳形式存在，同时在具有优良生物相容性的壳聚糖保护下，修饰电极具有极强的稳定性，保证了构建的血糖传感器的重现性、稳定性及准确性；
[0027] (3)本发明提供的血糖传感器，构建简单，稳定性强，可重复多次使用，同时具有检测线性区间宽、操作简单、灵敏度高、重现性高、抗干扰能力强等优点。
附图说明
[0028] 图1是
实施例1中新型修饰电极在磷酸缓冲液中扫描速度为0.2V/s下的循环
伏安图；
[0029] 图2是实施例2中新型修饰电极在葡萄糖溶液中连续循环扫描50圈的微分脉冲伏安图；
[0030] 图3是实施例2中新型修饰电极对葡萄糖溶液计时电流响应及干扰物的影响；
[0031] 图4是由图3结果得到的葡萄糖浓度-响应电流标准曲线。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。根据本发明设计目的，同类物质的简单替代以及用量的变化，例如改变本发明血糖传感器的新型修饰电极所采用的基底电极，简单改变单壁碳纳米管或葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液用量等均应属于本发明的范围；下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法；所使用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0033] 实施例1
[0034] 本发明的葡萄糖氧化酶、电子媒介体与壳聚糖功能化碳纳米管修饰电极，通过以下制备方法制备得到：
[0035] (1)用15mg的十二烷基苯磺酸钠和5mL水，在超声处理下分散3mg单壁碳纳米管，得到单壁碳纳米管的悬浮液；并将13μL单壁碳纳米管悬浮液滴加到石墨电极上，在红外灯下干燥，制得单壁碳纳米管修饰电极；
[0036] (2)分别配制浓度为4g/L的二茂铁的乙腈溶液、浓度为10.8mmol/L的四丁基高氯酸铵的乙腈溶液、浓度为16g/L的葡萄糖氧化酶的三羟甲基氨基甲烷溶液；再将浓度为4g/L的二茂铁的乙腈溶液和浓度为10.8mmol/L的四丁基高氯酸铵的乙腈溶液按照1:1的体积比混合，得到油相；最后将含二茂铁和四丁基高氯酸铵的油相与葡萄糖氧化酶的三羟甲基氨基甲烷溶液按照1:1的体积比混合，最终得到
颜色为黄色、稳定而均匀的葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液(该混合液中葡萄糖氧化酶浓度为8g/L，二茂铁浓度为1g/L，四丁基高氯酸铵浓度为2.7mmol/L)；并将13μL葡萄糖氧化酶-二茂铁混合液滴加到单壁碳纳米管修饰电极上，然后放在干燥箱中于20～50℃下恒温干燥，制得葡萄糖氧化酶-二茂铁修饰单壁碳纳米管电极；
[0037] (3)采用1mL体积分数为1％的乙酸水溶液溶解5mg的壳聚糖，得到浓度为5g/L的壳聚糖溶液；最后将20μL壳聚糖溶液滴加到葡萄糖氧化酶-二茂铁修饰单壁碳纳米管电极上，然后放在干燥箱中于20～50℃下恒温干燥，制得由壳聚糖保护的葡萄糖氧化酶-二茂铁修饰单壁碳纳米管电极，即本发明用于血糖生物传感器的修饰电极。
[0038] 本实施例的修饰电极的电化学表征，具体操作步骤如下：
[0039] 将本实施例中制备的修饰电极作为工作电极，与对电极、参比电极一起构建成三电极体系，并与电化学工作站相对应的电极连接；然后在电解池的槽内加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液；采用循环
伏安法进行扫描，控制扫描速度为0.2V/s，得到相应的电流对电位的变化关系，如图1所示；根据图1分析可知，实施例1中制备的新型修饰电极具有优良的电化学性能，修饰电极中葡萄糖氧化酶在电子传递体二茂铁的介导下表现出准可逆的电化学性质，同时电子媒介体二茂铁也表现出准可逆的电化学性质。
[0040] 实施例2
[0041] 本发明修饰电极用于检测葡萄糖溶液过程中稳定性的探究，具体步骤如下：
[0042] (1)将实施例1所得修饰电极作为工作电极，与对电极、参比电极一起构建成三电极体系，并与电化学工作站相对应的电极连接；
[0043] (2)然后在电解池的槽内加入1mmol/L的葡萄糖溶液；
[0044] (3)采用微分脉冲伏安法在电位区间为-0.2～0.6V中测量电流随电位变化而变化的情况，循环扫描50圈；
[0045] 采用的微分脉冲伏安法中，脉冲宽度为0.05s，阶跃电位为4mV，振幅为25mV，在电位区间-0.2～0.6V连续扫描50圈，得到的电流随电位变化关系图如图2所示。通过图2可以分析出，实施例1中的修饰电极催化氧化葡萄糖对应的氧化峰电位为0.2V附近，因此本发明的修饰电极检测血糖的恒定电位为0.15～0.30V，最佳恒定电位选择为0.2V。同时，分析连续50圈的微分脉冲伏安图可以分析得出，本发明的修饰电极在电催化氧化葡萄糖的过程中电化学信号没有明显的减弱，表现出对葡萄糖电催化氧化的高稳定性，并且检测葡萄糖的信号明显。
[0046] 本发明的修饰电极用于葡萄糖浓度-响应电流标准曲线的绘制，具体操作步骤如下：
[0047] (1)将实施例1所得修饰电极作为工作电极，与对电极、参比电极一起构建成三电极体系，并与电化学工作站相对应的电极连接；
[0048] (2)再在电解池槽内加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液；
[0049] (3)用电位阶跃法恒定电位为0.2V，在电流趋于稳定时每隔10s向电解池内滴加20μL 20mmol/L或30mmol/L的葡萄糖溶液，得到葡萄糖溶液的响应电流与时间关系；
[0050] (4)分析响应电流的变化值和滴加的葡萄糖浓度的变化关系，绘制葡萄糖浓度-响应电流标准曲线。
[0051] 将本发明的修饰电极作为工作电极，与对电极、参比电极一起构成三电极体系，并与电化学工作站连接好，往电解池中加入0.1mol/L磷酸缓冲液，恒定电位为0.2V，电流趋于稳定后，往电解池中隔10s加入20μL 20mmol/L或30mmol/L的葡萄糖溶液，得到的结果如图3所示；由图3可以看出随着葡萄糖的加入，本发明修饰电极具有比较明显的电流响应信号，并且加入的葡萄糖浓度为20mmol/L或30mmol/L时，电流响应信号随着加入葡萄糖的浓度的不同而有明显的变化。根据图3利用origin绘图
软件拟合得到响应电流和葡萄糖浓度的关系，结果如图4所示，由图4得到葡萄糖浓度-响应电流标准曲线公式为：I(μA)＝2.94+1.59C(mmol/L)，相关度R＝0.999。
[0052] 本发明的修饰电极检测葡萄糖溶液过程中抗干扰能力的探究，具体操作步骤如下：
[0053] 实施例1所得修饰电极作为工作电极，与对电极、参比电极一起构建成三电极体系，并与电化学工作站相对应的电极连接；然后在电解池的槽内加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液；用电位阶跃法恒定电位为0.2V，在电流趋于稳定时向电解池内分别滴加20μL多巴胺、尿酸、维生素C，得到干扰物的响应电流，结果如图3所示；并将该响应电流与葡萄糖浓度-响应电流标准曲线进行比对，计算得出干扰物中葡萄糖的浓度，结果如表1所示；根据图3和表1可以得出，本发明的新型修饰电极对多巴胺、尿酸以及维生素C等干扰物没有响应电流，表现出对葡萄糖检测的高灵敏性和高选择性。
[0054] 本实施例的方法抗干扰能力的验证：
[0055] 向本实施例的多巴胺、尿酸及维生素C干扰物样品中加入标准浓度的5.0mmol/L葡萄糖溶液，得到加标后的干扰物样品；按照本实施例的方法再次检测加标后的多巴胺、尿酸及维生素C干扰物样品中葡萄糖浓度，通过加标前后浓度的差值分别计算加入的葡萄糖浓度的回收率，结果如表1所示。
[0056] 实施例3：
[0057] 本发明的修饰电极用于检测人体血糖的方法，具体操作步骤如下：
[0058] (1)将实施例1所得修饰电极作为工作电极，与对电极、参比电极一起构建成三电极体系，并与电化学工作站相对应的电极连接；
[0059] (2)然后在电解池的槽内加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液；
[0060] (3)用电位阶跃法恒定电位为0.2V，在电流趋于稳定时向电解池内滴加20μL待测血液样品，得到血液中葡萄糖的响应电流，将该响应电流与实施例2中葡萄糖浓度-响应电流标准曲线进行比对，计算得出血液样品中葡萄糖的浓度为5.14±0.06mmol/L；
[0061] 本实施例的方法检测能力的验证：
[0062] 向本实施例的人体血液样品中加入标准浓度的5.0mmol/L的葡萄糖，得到加标后的血液样品，按本实施例的方法再次检测加标后的血液样品中葡萄糖的浓度，通过加标前后浓度的差值分别计算加入的葡萄糖的回收率，结果如表1所示。
[0063] 表1 各样品中葡萄糖浓度及加标回收率
[0064]
[0065] 由表1结果可看出：本发明发展血糖传感器不仅能精确检测人体血液中葡萄糖浓度，且具有灵敏度高、抗干扰能力强、重现性强、可操作性极佳等优点。
[0066] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
