用于生物分析中的数字测定的微流控设备和方法
阅读：1006发布：2020-06-01
专利汇可以提供用于生物分析中的数字测定的微流控设备和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了介质上 电润湿 (EWOD)设备和在EWOD设备中执行数字 生物 测定的相关方法。所述方法包括以下步骤：将含有生物实体和测定 试剂 的样品池输入EWOD设备；通过用EWOD设备进行电润湿操作，将样品池分割成用于生物测定的分割区；测量每个分割区的体积；改变分割区的条件以启动生物测定，其中改变的条件导致生物实体执行生物过程以产生产物物质；并通过以下步骤进行生物测定：实时测量每个分割区的分割区性质和体积，其中分割区性质表示由各自分割区内的任何生物实体或多个实体的生物过程产生的产物物质；基于测量的分割区性质和体积，确定每个分割区中的产物物质浓度；并基于所确定的产物物质浓度，通过每个分割区中包含的生物实体的数量对分割区进行分类。基于这种分类，可以计算生物实体的数量，所述数量又可以用于计算样品池中的生物实体的总数或浓度。所述方法可进一步包括增强的分割过程，其使得分割区的体积变化最小化。，下面是用于生物分析中的数字测定的微流控设备和方法专利的具体信息内容。
1.在介质上电润湿(EWOD)设备中执行数字生物测定的方法，包括以下步骤：
将含有生物实体和测定试剂的样品池输入到EWOD设备中；
通过用EWOD设备执行电润湿操作，将所述样品池分割成用于数字生物测定的分割区；
测量每个分割区的体积；
改变所述分割区的条件以启动所述数字生物测定，其中所述改变的条件导致生物实体执行生物过程以产生产物物质；和
通过以下步骤执行所述数字生物测定：
实时测量每个分割区的分割区性质和体积，其中所述分割区性质表示由各自分割区内的任何生物实体或多个实体的生物过程产生的产物物质；
基于所测量的分割区性质和体积，确定每个分割区中的所述产物物质的浓度；和基于所确定的所述产物物质的浓度，通过包含在每个分割区中的生物实体的数量对所述分割区进行分类。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述EWOD设备包括集成的阻抗感测电路，并且基于由所述阻抗感测电路所感测的阻抗来确定每个分割区的体积。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其中，所述分割区性质包括由所述EWOD设备的光学传感器测量的光学性质。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述光学性质是来自光源的光的分割区的荧光或吸收，其中所述光源将光发射到所述EWOD设备上。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，改变所述分割区的条件以启动所述生物测定，包括温度的变化、额外化学组分的添加、光活化或电化学活化中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，进一步包含绘制所述分割区性质的时间依赖性变化，以确定每个分割区中所述产物物质的相对浓度，并计数每个分割区中的生物实体的数量。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，对所述分割区进行分类包括：将所述分割区性质没有显示变化的分割区视为具有零个生物实体；将具有最慢分割区性质增长率的那些分割区视为具有一个生物实体；将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有两个生物实体；将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有三个生物实体；并且将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有四个或更多个生物实体。
8.根据权利要求6-7任一项所述的方法，进一步包含估计所述样品池中的所述生物实体的初始浓度。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，进一步包含确定何时达到分割区性质阈值的分割区的速率下降到零，并且在达到所述分割区性质阈值的分割区的速率下降到零之后对所述分割区进行分类。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，进一步包含记录每个分割区的分割区历史，包括从其生成所述分割区的所述样本池的体积，从所述样本池生成所述分割区的次序，以及每个分割区随时间的体积。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中，分割所述样本池包含：执行分割过程的至少一次迭代，直到所述样本池的足够部分被分割，其中每次迭代包含：
执行电润湿操作以从样品池中取出多个样品液滴；
用所述EWOD设备上的感测系统测量每个样品液滴的体积；
计算平均液滴体积，并没定液滴体积相对于平均液滴体积的可接受变动范围；
执行电润湿操作，以便在EWOD设备的测定区域内将在所述可接受范围内的分割区进行隔离；和
执行电润湿操作，以便将在所述可接受范围之外的分割区合并回到所述样品池中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述感测系统包括在所述EWOD设备中集成的阻抗感测电路，并且基于由所述阻抗感测电路所感测的阻抗来确定每个样品液滴的体积。
13.根据权利要求11-12任一项所述的方法，其中，所述可接受的范围是相对于所述平均液滴体积的±0.5标准偏差。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述可接受的范围是相对于所述平均液滴体积的±百分比。
15.根据权利要求11-14任一项所述的方法，包含执行所述分割过程的多次迭代。
16.根据权利要求11-15任一项所述的方法，进一步包含：
将含有测定试剂和零个生物实体的试剂池输入到所述EWOD设备中；
通过进行至少一次迭代来分割所述试剂池，直到所述试剂池的足够部分被分割；和将来自所述样品池的分割区与试剂池的相应分割区混合，以启动生物测定。
17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中所述生物测定是通过聚合酶链反应(PCR)的核酸扩增。
18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括表征所述样品池中核酸分子长度的分布。
19.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中，所述生物测定包含用于蛋白质生物标记定量的酶联免疫吸附测定(ELISA)、用于酶转换量定量的酶促测定或用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定之一。
20.一种微流控系统，其包含：
介质上电润湿(EWOD)设备，所述设备包含被配置为接收一个或多个液滴的元件阵列，所述元件阵列包含多个单独的阵列元件；和
控制系统，所述控制系统被配置为控制施加到所述元件阵列的致动电压，以便执行关于液滴的操纵操作，以执行根据权利要求1-19任一项所述的执行数字生物测定的方法。
21.根据权利要求20所述的微流控系统，进一步包含：
沿着所述EWOD设备的位于不同空间位置的多个热控制元件，至少一个所述热控制元件的温度随时间变化；
其中所述控制系统包括热控制单元，该热控制单元被配置为控制多个热控制元件的温度以产生沿着EWOD设备的位于不同空间位置的多个热区。
22.根据权利要求20-21任一项所述的微流控系统，进一步包含：将光发射到所述阵列元件上的光源，和光学传感器，其中所述光学传感器被配置为感测分配到所述阵列元件上的液滴的光学性质。
23.根据权利要求20-22任一项所述的微流控系统，进一步包含集成在EWOD设备的阵列元件中的集成阻抗感测电路，并且基于由所述阻抗感测电路所感测到的阻抗来确定分配到阵列元件上的液滴的体积。
24.存储程序代码的非暂时性计算机可读介质，所述程序代码由处理设备执行，用于控制施加到介质上电润湿(EWOD)设备的元件阵列的阵列元件上的致动电压，用于对元件阵列上的液滴执行液滴操纵，所述程序代码能够通过所述处理设备执行，以执行以下步骤：
将含有生物实体和测定试剂的样品池输入到EWOD设备中；
通过用EWOD设备执行电润湿操作，将所述样品池分割成用于数字生物测定的分割区；
测量每个分割区的体积；
改变所述分割区的条件以启动所述数字生物测定，其中所述改变的条件导致生物实体执行生物过程以产生产物物质；和
通过以下步骤执行所述数字生物测定：
实时测量每个分割区的分割区性质和体积，其中所述分割区性质表示由各自分割区内的任何生物实体或多个实体的生物过程产生的产物物质；
基于所测量的分割区性质和体积，确定每个分割区中的所述产物物质的浓度；和基于所确定的所述产物物质的浓度，通过包含在每个分割区中的生物实体的数量对所述分割区进行分类。
25.根据权利要求24所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述程序代码还能够通过所述处理设备执行，以通过执行分割过程的至少一次迭代来执行对所述样品池的分割，直到所述样品池的足够部分被分割，其中每次迭代包括：
执行电润湿操作以从样品池中取出多个样品液滴；
用所述EWOD设备上的感测系统测量每个样品液滴的体积；
计算平均液滴体积，并设定液滴体积相对于平均液滴体积的可接受变动范围；
执行电润湿操作，以在EWOD设备的测定区域内将在所述可接受范围内的分割区进行隔离；和
执行电润湿操作，以将在所述可接受范围之外的分割区介并回到所述样品池中。
用于生物分析中的数字测定的微流控设备和方法
技术领域
[0001] 本发明一般涉及有源矩阵介质上电润湿(Active Matrix Electro-wetting-On-Dielectric，AM-EWOD)设备和生物分析中的数字测定，例如诸如用于核酸定量的数字聚介酶链式反应(PCR)、用于蛋白质生物标记定量的酶联免疫吸附测定(ELISA)、用于酶转换量定量的酶促测定，以及用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定。更具体地，本发明涉及在AM-EWOD设备上执行生物分析中的数字测定的系统和方法。
背景技术
[0002] 介质上电润湿(Electrowetting on dielectric，EWOD)是用于通过施加电场来操纵液滴的公知技术。有源矩阵EWOD(AM-EWOD)是指在包含晶体管的有源矩阵阵列中例如通过使用薄膜晶体管(TFT)实现EWOD。因此，它是用于芯片实验窒技术的数字微流控的候选技术。对该技术的基本原理的介绍可以在以下文献中找到：“Digital microfluidics：is a true lab-on-a-chip poss ble？”，R.B.Fair，Microfluid Nanofluid(2007)3：245-281)。
[0003] 图1以横截面形式示出了常规EWOD设备的一部分。该设备包括下基板10，其最上层由导电材料形成，该导电材料被图案化以便实现多个阵列元件电极12(例如图1中的12A和12B)。给定阵列元件的电极可以被称为元件电极12。包括极性材料(其通常也是含水的和/或离子的)的液滴14被约束在下基板10和顶基板16之间的平面中。可以通过隔离物18实现这两个基板之间的合适的间隙，并且非极性环绕流体20(例如油)可用于占据未被液滴14占据的体积。设置在下基板10上的绝缘体层22将导电元件电极12A、12B与第一疏水涂层24分离，其中，液滴14以用θ表示的接触角26位于第一疏水涂层24上。疏水涂层由疏水材料(通常是但不一定是含氟聚合物)形成。
[0004] 第二疏水涂层28在顶基板16上，液滴14可以与第二疏水涂层28接触。在顶基板16和第二疏水涂层28之间插入参考电极30。
[0005] 接触角θ如图1所示限定，并由固体与液体(γsL)、液体与非极性环绕流体(γLG)和固体与非极性环绕流体(γSG)界面之间的表面张力分量的平衡来确定，并且在没有施加电压的情况下满足杨氏定律，该等式由下式给出：
[0006]
[0007] 在操作中，可以将称为EW驱动电压(例如，图1中的VT、V0和V00)的电压从外部施加到不同的电极(例如，分别施加到参考电极30、元件电极12、12A和12B)。建立得到的电力有效地控制疏水涂层24的疏水性。通过布置不同的EW驱动电压(例如V0和V00)施加到不同的元件电极(例如12A和12B)，液滴14可以在两个基板10和16之间的横向平面中移动。
[0008] 以下描述EWOD设备的实例配置和操作。US 6911132(Pamula等人，2005年6月28口授权)公开了一种用于控制液滴在两个维度中的位置和移动的二维EWOD阵列。US 6565727(Shenderov，2003年5月20日授权)进一步公开了用于其他液滴操作的方法，包括液滴的分裂和合并以及将不同材料的液滴混合在一起。US 7163612(Sterling等人，2007年1月16日授权)描述了基于TFT的薄膜电子器如何用于通过使用与AM显示技术中采用的电路布置非常相似的电路布置来控制对EWOD阵列的电压脉冲的寻址。
[0009] US 7163612的方法可以被称为“有源矩阵介质上电润湿”(AM-EWOD)。使用基于TFT的薄膜电子器件来控制EWOD阵列有若干优点，即：
[0010] -电子驱动电路可以集成到下基板10上。
[0011] -基于TFT的薄膜电子器件非常适合于AM-EWOD应用。它们生产便宜，从而可以以相对低的成本生产相对大的基板面积。
[0012] -以标准工艺制造的TFT可以被设计为在比标准CMOS工艺中制造的晶体管高得多的电压下操作。这是重要的，因为许多EWOD技术需要施加超过20V的电润湿电压。
[0013] EWOD液滴操纵设备是用于化学和生化反应自动化的非常理想的平台。这种设备可以在液滴中实行化学/生化反应或反应次序，其需要复杂的液滴操作，可能包括复杂的温度特征。可能需要在不同温度下执行不同的反应步骤。EWOD设备的许多应用需要改变样品和试剂液滴(以及通过将它们组合在一起而产生的产物)的温度，以促进所需的化学或生化反应。许多这些反应方案要求在反应次序中的不同时间将液滴带到多个不同的温度。许多反应方案要求液滴在时间上进行热循环，在一些情况下经历许多这样的热循环。
[0014] 生物测定通常定义为量化样品容器中生物实体的浓度或活性的测定。可以例如使用吸收光谱法、荧光光谱法或基于非光学化学的生物实体检测方法来进行测定读出。在数字生物测定中，生物实体被分割成许多小容器或分割区，并且这些分割区可以是乳液中的液滴或物理隔离的隔室。每个容器中的生物实体的数量是离散数量(例如，0、1、2、3、4…..)。此外，所有分割区都含有由生物实体引发的生化/化学反应所必需的试剂。这些试剂以比生物实体高得多的浓度存在，并因此以基本上相同的浓度存在于所有的分割区中。
[0015] 在分割之后，改变分割区的环境，并且生物实体响应于环境变化引发在分割区中存在的试剂向新产物物质的转化。分割区中新物质的存在引起分割区性质的变化，例如诸如荧光、吸收、电化学行为、pH或一些其它可与转化相关的物理性质的变化。例如，分割区性质可以指示新产物物质的浓度，其由响应于环境变化而发生的生物活性引起。依次测量分割区性质可以用于分别确定每个分割区中的生物实体的数量(可以是零)。
[0016] 以下是数字生物测定的常见实例。进行数字核酸测定，以定量核酸序列的浓度。例如，可以将含有靶标DNA、聚合酶链反应(PCR)试剂和荧光探针的样品(或者通过液滴的一些其他性质如吸收、电化学特性、pH等进行读出)进行分割。商业数字PCR系统通常将产生1000个和1000万个之间的分割区。然后将分割区热循环至少30次，如本领域已知的用于PCR测定的。扩增含有DNA的分割区中的DNA，并且含有DNA的分割区将变为荧光的。在无DNA的分割区中不发生DNA扩增，并且这些液滴不会变为荧光的。在热循环之后，分别评估所述分割区，以确定分割区性质是否已经发生变化。用泊松统计分析非荧光分割区的比例，以计算靶标DNA分子的原始数目。在分割之前知道原始样品体积允许计算原始DNA靶标的浓度。
[0017] 数字蛋白质测定可用于使用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量样品中的蛋白质，特别是血清样品中的低丰度生物标志物蛋白质。ELISA是一种广泛使用的技术，用于检测任何可与抗体结合的蛋白质，或定量具有酶活性的酶。酶样品可以分成含有酶的分割区和不含酶的分割区。酶作用于底物，修饰的底物产生分割区性质的变化。其中已经发生这种变化的分割区被计为含有酶，并且其中未发生变化的那些分割区被计为无酶。无酶分割区的数量允许估计酶的原始数量。或者，可以通过比较酶修饰的底物的相对形成速率来评估群体中各酶的活性水平的扩散。
[0018] 数字的基于细胞的测定涉及在分割区中封装离散数量的细胞，并使用例如细胞分泌物、细胞表面生物标志物、细胞代谢物等测量细胞表型和基因型的特征。这种测定通常通过将细胞分割到含有用于酶促扩增检测的荧光底物的分割区中进行。
[0019] 已经使用EWOD系统来执行用于产生液滴以形成分割区的方法，以及用于数字PCR的操纵的方法，例如如在US 8,137,917(Pollack等人，2012年3月20日授权)中所描述的。此外，US 2016/0310949(Kwang，2016年10月27日公布)描述了EWOD作为产生和操纵用于数字PCR的液滴的方法，由此通过包括来自液滴熔化实验的数据来改进标准终点分析。这些专利文献描述了PCR反应的终点分析，并末评估实时数据。Fluidigm产品qdPCR 37K IFC是用于分隔亚纳升体积(0.85nl)的芯片，并用于实时数字PCR。所述系统结合了数字PCR的终点分析和能够为每个隔室计算阈值的同步实时荧光测量。Thermofisher QuantStudio 3D是另一种用于分隔生物样品以进行数字核酸分析的系统。
[0020] 还已知分割区尺寸的变化能够对数字生物测定的准确性具有影响，特别是数字PCR(Scientific Reports DOI：10.1038/srep13174)。因此，已经开发了数据分析方法以试图考虑该变化(Scientific Reports DOI：10.1038/s41598-017-09183-4)。
[0021] 如上所述，常规数字生物测定可用于计数样品中生物实体的数量，例如诸如DNA、RNA和蛋白质，或用于评价酶样品中各酶的酶活性，或用于测量细胞群体中细胞的特征。然而，传统的系统和方法困扰于来自数字生物测定的输出的不准确性，因为它们没有方便的方式来影响分割区尺寸的分布和表征分割区尺寸的变化(二者均作为分割的结果，并归因于在数字生物测定期间分割区尺寸的意外变化)，并将这些变化掺入到分析中。当前的方法典型地假设分割区都具有相同的体积，但情况并非如此。
[0022] 出于多种原因，可能发生分割区体积与预期体积的偏差。例如，在油包水乳液系统中，在分割期间，分割参数的微小变化可能导致分割区尺寸的不可预测的差异。在测定期间，可能发生意外的分割区(液滴)合并，或者水性分割区可能发生水分流失。作为另一个例子，在分隔系统中，隔室尺寸可以在芯片内和芯片之间以不可预测和难以测量的方式变化，或者隔室可以仅部分填充。
[0023] 当分隔区尺寸变化没有很好地表征时，使用泊松统计精确估计样品中生物实体的原始数量或评价生物实体活性的相对特征更具挑战性。这是许多类型的数字生物测定的问题，包括例如用于核酸分析的数字PCR系统、评价蛋白质浓度的系统、用于分析酶活性的系统，以及用于描绘细胞群体特征的系统。
[0024] 发明概述
[0025] 本发明提供了用于提高数字生物测定的准确性和可以进行数字生物测定容易度的系统和方法。在示例性实施方案中，微流控系统包括具有元件阵列的AM-EWOD设备，所述元件被配置为接收一个或更多个液滴，所述液滴构成用于进行数字生物测定的分割区。微流控系统进一步包括：AM-EWOD控制器，其被配置为控制施加到元件阵列的致动电压；集成在AM-EWOD设备中的集成阻抗传感器，其被配置为测量液滴分割区的尺寸；以及被配置为检测分割区性质(例如，光学液滴性质、电化学液滴性质、pH)的性质检测系统。基于被所述检测系统检测到的所述分割区性质，所述控制器进一步被配置为确定液滴分割区的生物实体引发的分割区性质的变化。所述微流控系统进一步可包括被配置成控制液滴分割区中的温度的至少一个热控制元件和热控制器，以及基于计算机的控制系统以便存储每个分割区的历史。
[0026] 所述AM-EWOD控制器用于密切控制分割区的环境，以使所述分割区物理性质的变异最小化。以下是可以控制的示例性分割区性质：分割区的温度、分割区的高度(即，所述设备的顶部和底部之间的距离)以及所述分割区与之接触的表面。这种增强的控制意味着，在具有最小变化的分割区的基本上固定体积中进行所测量的分割区性质，例如光学荧光测量或其他性质测量。通过使分割区之间的体积变化忽略不计，分割区的确定结果是准确的，并且易于进行分割区到分割区之间的比较。
[0027] 本公开内容描述了基于AM-EWOD的微流控系统和方法，其使以下自动化：在迭代过程中将样品分割成多个分割区，使得系统的分割准确性的缺陷最小化，并且所述结果是定义的平均分割区体积和标准偏差之内的分割区群体；触发生物实体所引发的过程启动，所述过程导致所述分割区的性质被修改；在测定期间实时测量与时间有关的分割区体积；测量生物实体引发的与时间有关的新产物物质；计算每个分割区中所述新产物物质的相对浓度；通过分割之后分割区所包含的生物实体的数量，对所述分割区进行分类；并且计算所述生物实体的原始样品的浓度，或比较所述生物实体的相对活性，这取决于所进行的数字生物测定的类型。
[0028] 每个分割区的实时分析会产生显示所述分割区性质随时间变化的时间进程。新产物物质的相对形成速率可用于比较酶样品中各酶的相对活性，或评价细胞样品中的细胞异质性。在其他数字生物测定中，其中来自测定的主要输出是原始样品的浓度，将分割区分类为负分割区，即其中未发生分割区性质变化的分割区，或正分割区，即其中发生了分割区性质变化的分割区。然后可以使用泊松统计来分析正分割区与负分割区的比率，以估计每个分割区的生物实体的平均数量。然后通过除以所述样品的总体积将所述平均数量转化为原始样品中的浓度。
[0029] 因此，本发明的一个方面是增强的介质上电润湿(EWOD)设备和在EWOD设备中执行数字生物测定的相关方法。在示例性实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：将含有生物实体和测定试剂的样品池输入EWOD设备中；通过用EWOD设备进行电润湿操作，将样品池分割成用于数字生物测定的分割区；测量每个分割区的体积；改变所述分割区的条件以启动所述生物测定，其中所述改变的条件导致所述生物实体执行生物过程以产生产物物质；并通过以下步骤进行所述生物测定：实时测量每个分割区的分割区性质和体积，其中所述分割区性质表示由在相应分割区内的任何生物实体或多个实体的生物过程产生的产物物质；基于所述测量的分割区性质和体积，确定每个分割区中的产物物质浓度；并基于所确定的所述产物物质浓度，通过每个分割区中包含的生物实体的数量对所述分割区进行分类。基于这种分类，可以计算生物实体的数量，所述数量又可以用于计算样品池中的生物实体的总数或浓度。
[0030] 所述方法的示例性实施方案进一步包括增强的分割过程，其使得所述分割区的体积变化最小化。所述增强的分割过程包括：执行分割过程的至少一次迭代，直到所述样本池的足够部分被分割，其中每次达代包括：执行电润湿操作以从所述样品池中取出多个样品液滴；用EWOD设备上的传感系统测量每个样品液滴的体积；计算平均液滴体积，并设置液滴体积相对于平均液滴体积的可接受变化范围；执行电润湿操作以便在EWOD设备的测定区域内在可接受范围内使分割区隔离；并且执行电润湿操作，以便将可接受范围之外的分割区合并回到样品池中。在示例性实施方案中，执行分割过程的多次迭代。
[0031] 根据本发明的另一方面，微流控系统包括介质上电润湿(EWOD)设备，所述设备包括配置成接收一个或更多个液滴的元件阵列，所述元件阵列包括多个单独的阵列元件；和控制系统，其被配置为控制施加到元件阵列的致动电压，以对所述液滴执行操纵操作，以执行根据任何实施方案的执行数字生物测定的方法。多个热控制元件可以沿着EWOD设备位于不同的空间位置，并且其中所述控制系统包括热控制单元，该热控制单元被配置为控制多个热控制元件的温度以产生沿着EWOD设备的位于不同空间位置的多个热区。微流控系统进一步可包括：光源，其将光发射到所述阵列元件上；以及光学传感器，其被配置为感测分配到所述阵列元件上的液滴的光学性质。微流控系统进一步可以包括集成在EWOD设备的阵列元件中的集成阻抗感测电路，并且基于由所述阻抗感测电路所感测到的阻抗来确定分配到阵列元件上的液滴的体积。
[0032] 本发明的另一方面是存储程序代码的非暂时性计算机可读介质，所述程序代码由处理设备执行，用于控制施加到介质上电润湿(EWOD)设备的元件阵列的阵列元件上的致动电压，用于对元件阵列上的液滴执行液滴操纵，所述程序代码能够由所述处理设备执行以在根据任何实施方案的EWOD设备中执行数字生物测定的方法的步骤。
[0033] 参考以下描述和附图，本发明的这些和进一步的特征将是显而易见的。在说明书和附图中，已经详细公开了本发明的特定实施方案，其表示可以使用本发明的原理的一些方式，但是应该理解，本发明的范围不受相应的限制。相反，本发明包括落入所附权利要求的宗旨和术语内的所有改变、修改和等同物。关于一个实施方案描述和/或示出的特征可以在一个或多个其他实施方案中以相同方式或以类似方式使用和/或与其他实施方案的特征组合或代替其他实施方案的特征。
[0034] 附图简述
[0035] 图1是以截面形式描绘常规EWOD设备的图。
[0036] 图2是描绘根据本发明实施方案的示例性基于EWOD的微流控系统的图。
[0037] 图3是根据本发明实施方案的以示意性透视图描绘示例性AM-EWOD设备的图。
[0038] 图4是描绘图3的示例性AM-EWOD设备的一些阵列元件横截面的图。
[0039] 图5A是描绘当存在液滴时在元件电极处呈现的电负载的电路表示的图。
[0040] 图5B是描绘当不存在液滴时在元件电极处呈现的电负载的电路表示的图。
[0041] 图6是描绘根据本发明的实施方案的图3的示例性AM-EWOD设备中的薄膜电子器件的示例性布置的图。
[0042] 图7是描绘根据本发明实施方案的阵列元件电路的示例性布置的图。
[0043] 图8是描绘根据本发明实施方案的示例性微流控系统的图，所述微流控系统包括热控制元件。
[0044] 图9是描绘图8的微流控系统的图，其示出了EWOD通道内的液滴的示例性位置。
[0045] 图10是描绘根据本发明实施方案的示例性微流控系统的图，所述微流控系统包括热控制元件和内部和外部传感器模块。
[0046] 图11是描绘示例性EWOD设备的一部分的图，其示出了对于生物实体引发的新产物物质的评估的液滴/分割区的体积。
[0047] 图12A、12B、12C、12D、12E、12F和12G是描绘根据本发明实施方案的步骤进程的图，所述步骤进程构成执行分割过程以产生用于生物测定反应方案的分割区的示例性方法。
[0048] 图13是描绘由常规分割过程产生的分割区尺寸的典型分布的图表。
[0049] 图14A、14B和14C是描绘分割区性质程度的图表，绘制为(分割区体积变化不同范围的)生物测定的时间的函数。
[0050] 图15A和15B是描绘分割区性质程度的图表，绘制为(分割区体积变化不同范围的分割区性质随时间呈指数变化的)生物测定的时间的函数。
[0051] 图16是描绘根据泊松统计，相对于每个分割区的生物实体的体积浓度，估计包含0、1、2、3、4个初始生物实体拷贝的分割区数量的图。
[0052] 图17是描绘随时间进行已经达到分割区性质阈值的分割区累积数量的图。
[0053] 图18A、18B和18C是描绘根据本发明的另一个实施方案的步骤进程的图，所述步骤进程构成执行分割过程以产生用于生物测定反应方案的分割区的另一示例性方法。具体实施方案
[0054] 图2是描绘根据本发明实施方案的示例性基于EWOD的微流控系统的图。在图2的示例中，测量系统包括读取器32和盒34。盒34可以包含微流控设备，例EWOD或AM-EWOD设备36，以及(未示出)进入所述设备的流体输入端口和常规的电连接。流体输入端口可以执行将流体输入AM-EWOD设备36中并在所述设备内产生液滴的功能，例如通过从电润湿控制的输入池分配。如下面进一步详述的，微流控设备包括电极阵列，所述点电极阵列被配置为接收输入的液滴。
[0055] 微流控系统进一步可以包括控制系统，所述控制系统被配置为控制施加到微流控设备的电极阵列的致动电压，以对液滴执行操纵操作。例如，读取器32可以包含被配置作为控制电子器件38的这种控制系统，以及存储设备40，所述存储设备40可以存储与系统相关联的任何数据和任何应用软件。控制电子器件38可以包括合适的电路和/或处理设备，所述处理设备被配置为执行与AM-EWOD设备36(例如CPU、微控制器或微处理器)的控制有关的各种控制操作。
[0056] 在它们的功能中，为了实现本发明的特征，控制电子器件可以包含整个控制系统的一部分，其可以执行体现为存储设备40内的控制应用程序的程序代码。如何对控制系统进行编程以操作和执行与存储的控制应用程序相关的逻辑功能，这对于计算机编程领域特别是电子控制设备的应用编程的普通技术人员来说将是显而易见的。因此，为了简洁起见，省略了关于具体编程代码的细节。存储设备40可以被配置作为非暂时性计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)或任何其他合适的介质。而且，虽然代码可以由控制电子器件38根据示例性实施方案执行，但是这种控制系统功能也可以通过专用硬件、固件、软件或其组介来执行，而不脱离本发明的范围。
[0057] 控制系统可以配置为执行以下一些或全部功能：
[0059] -解译表示由与AM-EWOD设备36相关联的传感器或传感器电路测量的传感器信息的输入数据，包括计算AM-EWOD设备36上的液滴的位置、尺寸、质心和周长。
[0062] -根据本发明的实施方案，并且如下面进一步详细描述的，控制系统可以包括热控制单元，所述热控制单元被配置为控制EWOD通道内的EWOD设备的温度，如适合于所给定反应方案的。
[0063] 在图2的示例中，可以提供外部传感器模块35用于感测液滴性质。例如，可以采用本领域已知的光学传感器作为用于感测液滴性质的外部传感器。合适的光学传感器包括相机设备、光传感器、电荷耦合器件(CCD)和图像类似图像传感器等。备选地，传感器可以配置为内部传感器电路，所述内部传感器电路作为驱动电路的一部分掺入每个阵列元件中。这种传感器电路可以通过检测阵列元件处的电性质(例如阻抗或电容)来感测液滴性质。
[0064] 控制系统，例如通过控制电子器件38，可以提供和控制施加到微流控设备36的电极阵列的致动电压，例如所需的电压和定时信号，以执行液滴操纵操作并感测AM-EWOD设备36上的液滴。控制电子器件进一步地可以执行应用软件以生成和输出用于液滴感测和执行感测操作的控制电压。读取器32和盒34可以在使用时电连接在一起，例如通过连接线42的电缆，尽管可以使用提供电通信的各种其他方法(例如，无线连接)，如本领域普通技术人员所已知的。
[0065] 图3是根据本发明实施方案的以示意性透视图描绘示例性AM-EWOD设备36的附加细节的图。AM-EWOD设备36具有下基板44，薄膜电子器件46设置在下基板44上。薄膜电子器件46被布置为驱动阵列元件电极48。多个阵列元件电极48布置在电极或元件阵列50中，具有X乘以Y个阵列元件，其中X和Y可以是任何整数。可以包括任何极性液体并且通常典型地是含水的液滴52被封闭在下基板44和由间隔物56隔开的顶基板54之间，但是将理解的是，可以存在多个液滴52。
[0066] 图4是描绘图3的示例性AM-EWOD设备36的一些阵列元件横截面的图。在图4中描绘的AM-EWOD设备的部分中，所述设备包括可以在图3的AM-EWOD设备36的电极或元件阵列50中使用的以横截面示出的一对阵列元件电极48A和48B。设备配置类似于图1中所示的常规配置。AM-EWOD设备36进一步包括设置在下基板44上的薄膜电子器件46，所述下基板通过间隔物56与上基板54分离。下基板44的最上层(可以被认为是薄膜电子器件层46的一部分)被图案化，从而实现多个阵列元件电极48(例如，阵列元件电极的具体示例是图4中的48A和48B)。术语元件电极48可以在以下内容中被理解为指代与特定阵列元件相关联的物理电极结构48，并且还指代直接连接到该物理结构的电路的节点。图4中示出了参考电极58，其设置在顶基板54上，但备选地参考电极可设置在下基板44上以实现面内参考电极的几何形状。术语参考电极58也可以在以下内容中被理解为指代物理电极结构中的任一个或二者以及指代直接连接到该物理结构的电路的节点。
[0067] 同样类似于图1的常规结构，在AM-EWOD设备36中，非极性流体60(例如油)可用于占据末被液滴52占据的体积。绝缘体层62可设置在下基板44上，并将导电元件电极48A和48B与第一疏水涂层64分离，其中，液滴52以用θ表示的接触角66位于第一疏水涂层64上。疏水涂层由疏水材料(通常是但不一定是含氟聚合物)形成。第二疏水涂层68在顶基板54上，液滴52可以与第二疏水涂层68接触。将参考电极58插入顶基板54和第二疏水涂层68之间。
[0068] 图5A示出了在存在液滴52的情况下元件电极48和参考电极58之间的电负载70A的电路表示。液滴52通常可以被建模为并联的电阻器和电容器。典型地，液滴的电阻将相对较低(例如，如果液滴包含离子)，并且液滴的电容将相对较高(例如，因为极性液体的相对介电常数相对较高，例如，如果液滴是含水的，则为～80)。在许多情况下，液滴电阻相对较小，使得在用于电润湿的目的频率下，液滴52可以有效地起电短路作用。疏水涂层64和68具有可以被建模为电容器的电特性，并且绝缘体62也可以被建模为电容器。元件电极48和参考电极58之间的总阻抗可以通过如下电容器来近似，所述电容器的值通常由绝缘体62和疏水涂层64和68的贡献来支配，并且对于典型的层厚度和材料，其值可以是皮可法拉(pico-Farad)量级的。
[0069] 图5B示出了在不存在液滴的情况下元件电极48和参考电极58之间的电负载70B的电路表示。在这种情况下，液滴组件由表示占据顶基板和下基板之间的空间的非极性流体60的电容的电容器代替。在这种情况下，元件电极48和参考电极58之间的总阻抗可以由如下电容器近似，所述电容器的值由非极性流体的电容支配，并且通常是小的，为毫微微法拉(femto-Farad)的量级。
[0070] 为了驱动和感测阵列元件，电负载70A/70B总体上在效果方面起电容器的作用，其值取决于在给定元件电极48处是否存在液滴52。在存在液滴的情况下，电容相对较高(通常为皮可法拉量级)，而如果不存在液滴，则电容是低的(通常为毫微微法拉的量级)。如果液滴部分地覆盖给定电极48，则电容可以近似表示液滴52对元件电极48的覆盖程度。
[0071] 图6是描绘根据本发明的实施方案的图3的示例性AM-EWOD设备36中的薄膜电子器件46的示例性布置的图。薄膜电子器件46位于下基板44上。元件阵列50的每个阵列元件51包含用于控制相应元件电极48的电极电位的阵列元件电路72。还可在薄膜电子器件46中实现集成的行驱动器74和列驱动器76电路，以便向阵列元件电路72提供控制信号。阵列元件电路72还可以包含用于检测阵列元件位置中液滴存在或不存在的感测能力。进一步地可以在薄膜电子器件中实施集成的传感器行寻址78和列检测电路80，用于在每个阵列元件中寻址和传感器电路的读数。
[0072] 还可以提供串行界面82以处理串行输入数据流并且便于将所需电压编程至阵列50中的元件电极48。电压供应界面84提供相应的电源电压、顶基板驱动电压和如本文进一步所描述的其他必要的电压输入。即使对于大阵列尺寸，下基板44与外部控制电子器件、电源和任何其他组件之间的多个连接线86也可以相对较少地制造。可选地，串行数据输入可以部分并行化。例如，如果使用两条数据输入线，则在对列驱动器电路76进行微小修改的情况下，第一条可以为列1至X/2提供数据，第二条可以为列(1+X/2)至M提供数据。以这种方式，可以将数据编程到阵列的速率增加，将数据编程到阵列是液晶显示驱动电路中使用的标准技术。
[0073] 通常，包括薄膜电子器件46的示例性AM-EWOD器件36可以如下配置。AM-EWOD设备36包括上述参考电极58(其可选地可以是平面内参考电极)和元件阵列50上的多个单独阵列元件51，每个阵列元件51包括阵列元件电极48和阵列元件电路72。相关地，AM-EWOD设备
36可以被配置为执行使阵列元件致动的方法，以通过控制要施加到多个阵列元件的电润湿电压来操纵阵列上的液滴。施加的电压可以通过如图2所述的控制系统的操作来提供，包括控制电子器件38和存储在存储装置40上的应用和数据。每个阵列元件51处的电润湿电压由阵列元件电极48和参考电极58之间的电势差限定。控制给定阵列元件处的电润湿电压的方法通常包括以下步骤：通过控制系统的操作，向阵列元件电极48提供电压和向参考电极58提供电压。
36可以被配置为执行使阵列元件致动的方法，以通过控制要施加到多个阵列元件的电润湿电压来操纵阵列上的液滴。施加的电压可以通过如图2所述的控制系统的操作来提供，包括控制电子器件38和存储在存储装置40上的应用和数据。每个阵列元件51处的电润湿电压由阵列元件电极48和参考电极58之间的电势差限定。控制给定阵列元件处的电润湿电压的方法通常包括以下步骤：通过控制系统的操作，向阵列元件电极48提供电压和向参考电极58提供电压。
[0074] 图7是描绘根据本发明实施方案的存在于每个阵列元件51中的阵列元件电路72的示例性布置的图。阵列元件电路72可以包含致动电路88，所述致动电路88具有输入ENABLE(启动)、DATA(数据)和ACTUATE(致动)，以及连接到元件电极48的输出。阵列元件电路72还可以包含液滴感测电路90，其可以与元件电极48电通信。典型地，液滴感测电路90的读出可以由一个或多个寻址线(例如RW)控制，这些寻址线可以是阵列的同一行中的元件共用的，并且还可以具有一个或多个输出，例如OUT，所述输出对于阵列的同一列中的所有元素可能是共用的。
[0075] 阵列元件电路72通常可以执行以下功能：
[0076] (i)通过向阵列元件电极提供电压来选择性地使元件电极48致动。因此，存在于阵列元件51处的任何液滴可以通过电润湿效应致动或解除致动。
[0077] (ii)在阵列元件51的位置处感测液滴的存在或不存在。感测的方式可以是电容或阻抗、光学、热或一些其他方式。使用集成的阻抗传感器电路作为阵列元件电路的一部分，可以方便有效地采用电容或阻抗感测。
[0078] 包括集成的阻抗传感器电路的阵列元件电路72的示例性配置在本领域中是已知的，并且例如在背景技术部分中引用的US8653832和共同转让的英国申请GB1500261.1中详细描述，两者都通过引用并入本文。这些专利文献包括如何致动液滴(通过电润湿)以及如何通过集成电容或阻抗感测电路来感测液滴的描述。通常，电容和阻抗感测可以是模拟的，并且可以在阵列中的每个元件处同时地或几乎同时地执行。通过处理来自这种传感器的返回的信息(例如，在读取器32的存储设备40中的应用软件中)，上述控制系统能够实时地或几乎实时地确定存在于元件阵列50中的每个液滴的位置、尺寸或体积、质心和周长。如结合图2所述，传感器电路的备选方案是提供外部传感器(例如，传感器35)，例如可用于感测液滴性质的光学传感器。
[0079] 常见的数字生物测定方法包括在不同温度下执行反应方案的步骤。因此，本发明使用EWOD设备中的温度的增强控制来优化其中发生液滴操纵和反应的EWOD通道中的温度。于2017年5月30日提交的申请号为15/607,940的中请人的中请中提供了包含增强的温度控制的示例性EWOD设备的完整描述，其内容通过引用并入本文。出于说明目的，本文提供了这种描述的一部分。应当理解，以下是示例，并且可以采用EWOD设备内的任何合适的温度控制。
[0080] 图8是描绘根据本发明实施方案的示例性微流控系统100的图，所述系统包括控制系统102和定义EWOD通道106的EWOD设备104(其尤其可以是AM-EWOD设备)。图9是描绘图8的微流控系统100的图，其示出了EWOD通道106内的液滴108的示例性位置。非极性流体110(例如油)可用于占据未被液滴108占据的体积。EWOD设备可以包括由间隔物116分开的第一(顶)基板部件112和第二(底)基板部件114，所述间隔物限定EWOD通道106。为了简化相关特征的说明，省略了EWOD设备组件的各个层。因此，第一和第二基板部件可以包括形成EWOD设备的相关基板、绝缘层、电极层和相关的结构，例如诸如关于图3-7描述的各种组件。图8和9还示出了用于将流体输入EWOD通道内的代表性流体输入结构118。输入结构的各种配置在本领域中是已知的，并且因此可以采用任何合适的输入结构。
[0081] 如上所述，微流控系统100进一步包括控制系统102。控制系统102可相当地被配置为结合图2描述的控制系统，包括可执行程序代码的控制电子器件，所述程序代码体现为包含在非暂时性计算机可读介质或存储设备中的控制应用程序。控制系统102可以包括EWOD控制单元122，所述EWOD控制单元具有控制电子器件和CPU处理设备，用于通过控制施加到EWOD设备的阵列元件的致动电压来控制EWOD设备上的液滴的移动。控制系统102进一步包括热区控制单元124和多个热控制元件。在所描绘的示例中，示出了两个热控制元件126和128，其沿着EWOD设备定位在不同的空间位置。应当理解，可以在给定设备中采用任何合适数量的多个热控制元件，如可适用于特定的微流控操作的。类似于EWOD控制单元122，热区控制单元124包含控制电子器件和CPU或处理设备，用于控制热控制元件的温度以便在EWOD设备内产生不同的温度控制区。热区控制单元的控制电子器件同样可以类似地执行程序代码，该程序代码体现为包含在热区控制单元内的非暂时性计算机可读介质或存储设备内的热控制应用。
[0082] 热控制元件126和128能够根据需要并且如由热区控制单元124根据任何所需的反应方案所确定的，主动加热、冷却或加热和冷却EWOD设备。可以通过任何公知的机制实施加热和/或冷却。例如，加热可以通过焦耳加热或电阻加热，并且冷却可以通过本领域已知的用于加热和冷却的珀耳帖效应进行。其温度由热控制元件之一控制的EWOD设备内的EWOD通道106的区域在本文中称为热区。例如，在图8和9中，第一热控制元件126是可操作的，以便控制EWOD通道内的第一热区127的温度，并且第二热控制元件128是可操作的，以便控制EWOD通道内的第二热区129的温度。因此，第一和第二热区127和129基于热控制元件的相应位置沿着EWOD设备位于不同的空间位置。此外，可以采用任何合适数量的多个热控制元件，所述热控制元件将控制位于沿着EWOD设备的不同空间位置的相应数量的热区中的温度。
[0083] 液滴采取液滴所位于的任何热区的温度。由于液滴的微小尺寸，在液滴和热区之间发生快速温度均衡。在图9的示例中，液滴108位于第一热区127中，并且因此将采取由第一热控制元件126所控制的第一热区127的温度。通过施加适当的致动电压，液滴108可以移动到第二热区129，并且因此将采取由第二热控制元件128所控制的第二热区129的温度。
[0084] EWOD控制单元122将致动电压施加到EWOD设备的阵列元件，以将液滴从一个热区移动到另一个热区。组织热区控制单元124和EWOD控制单元122共同工作，以配置动态控制的热区，该热区可以根据EWOD设备的通道内的液滴的位置改变通道中的温度。可以利用液滴位置传感器(例如，使用图3的外部传感器35或基于感测液滴阻抗的图7的液滴感测电路90)读出EWOD通道中的液滴的位置，所述液滴位置传感器可以被集成到EWOD液滴操纵设备。
通过结介对EWOD设备的通道中的温度的空间和时间控制，优化执行给定的生化/化学反应或反应次序所需的温度特征，并且进而优化热区的数量和尺寸。包含液滴位置传感器(一个或多个)进一步增强了系统，因为液滴位置的反馈控制可用于确定实施热区温度变化的时间。
通过结介对EWOD设备的通道中的温度的空间和时间控制，优化执行给定的生化/化学反应或反应次序所需的温度特征，并且进而优化热区的数量和尺寸。包含液滴位置传感器(一个或多个)进一步增强了系统，因为液滴位置的反馈控制可用于确定实施热区温度变化的时间。
[0085] 热控制元件126和128可以布置成与EWOD设备的基板层之一热接触，例如布置在外表面上或内部作为EWOD设备的基板层的一部分。在图8和图9的示例中，热控制元件都位于第二(底)基板114的外表面上，但是可以采用定位热控制元件的各种其他配置，如申请号15/607,940所教导的。
[0086] EWOD设备的各个部分的热控制可以与EWOD设备的不同部分的液滴操纵控制相结合，以执行本发明的方法。在示例性实施方案中，控制系统运行，以便根据指定的或预设的占空比，和/或基于液滴的实际的实时感测的性质，以预定的时间、速率和持续时间，以适当的次序将适当的致动电压施加到相关的阵列元件，。以这种方式，通过使用施加到EWOD元件阵列的不同部分的间歇致动模式，可以在EWOD设备阵列的不同部分处执行不同的液滴操纵操作。例如，在于2017年3月31日提交的申请号为15/475,410的申请人的申请中描述了将间歇致动模式施加到EWOD设备阵列的不同部分的细节，其内容也通过引用并入本文。
[0087] 图10是描绘根据本发明实施方案的示例性微流控系统150的图，所述微流控系统包括热控制元件和内部和外部传感器模块。为了进行荧光测量，系统150可以包括用于发射如上所述的测量光的光源152，以及用作光学传感器的成像器153，所述成像器作为用于检测来自反应液滴的接收光的光学传感器，用于执行荧光测量，如本领域所已知的。可以通过成像控制器154来控制和分析光源和成像器的操作。
[0088] 光源、成像器和成像控制器可以与微流控系统组介以执行数字生物测定。根据关于以上图2-9所描述的设备，微流控系统可以被配置为基于EWOD或AM-EWOD的系统。对于如图10所示的一般参考，微流控系统可以包括EWOD控制器156，所述EWOD控制器可以相当地配置为上述的控制系统，所述控制系统控制并入到EWOD设备157中的电润湿元件阵列的致动。作为并入到这种控制器中的控制应用程序的一部分，可以提供用于执行控制和感测操作的计算机和算法158，并将其存储在非暂时性计算机可读介质或存储设备中。微流控系统进一步包括温度控制器160和多个热控制元件(T-元件)。在所描绘的示例中，示出了两个热控制元件162和164，但是再次应当理解，可以在给定设备中采用任何合适数量的多个热控制元件，如可适用于特定的微流控操作的。温度控制器160包含控制电子器件和CPU或处理设备，用于控制热控制元件的温度以在EWOD设备内产生不同的温度控制区域，如上所引用的和在申请号15/607,940中所述的。另外，尽管成像控制器154、EWOD控制器156、计算机和算法158以及温度控制器160在图12中被示为单独的元件，但是应当理解，可以将多个控制组件组合成单个控制系统组件。
[0089] 在以下描述的用于数字生物测定的示例性反应方案中，以下是与EWOD设备配置和操作相关联的一组示例参数。应当理解，以下是说明性的，并且可以如对任何特定生物测定的特定情况所合适的进行调整。典型的EWOD设备可以具有316×130个TFT像素，其中每个TFT像素为210um×210um，并且单元间隙为130um。这相当于41，080个像素，并且因此这种EWOD设备能够容纳液滴～235μL的最大体积。例如，可用的液滴尺寸可以是1x1、2x1、2x2或3x3像素或相当的，并且可以在2至3个像素的液滴之间分配间隙。由这些液滴布置和EWOD阵列的大小，能够计算液滴数量和与数字生物测定反应方案相关的每个分割区的体积。
[0090] 所述AM-EWOD控制器用于密切控制分割区的环境，以使所述分割区物理性质的变化最小化。以下是可以控制的示例性分割区性质：分割区的温度、分割区的高度(即，所述设备的顶部和底部之间的距离)以及所述分割区与之接触的表面。通过使分割区之间的体积变化忽略不计，分割区的确定结果是准确的，并且易于进行分割区到分割区之间的比较。
[0091] 这种增强的控制意味着，在具有最小变化的分割区的基本上固定体积中进行所测量的分割区性质，例如光学荧光测量或其他分割区性质测量。图11是描绘示例性EWOD设备180的一部分的图，其示出了对于生物实体引发的新产物物质的评估的液滴/分割区的体积。类似于上述EWOD设备的先前示例，EWOD设备180包括顶基板182和底基板184，它们由间隔物186分开以限定EWOD通道。侧壁188进一步可限定端口190，用于将流体输入EWOD通道中。图11进一步描绘了包含在非极性流体(油)194中的液滴192，所述液滴可构成用于生物测定的分割区。随着本发明的分割区性质的增强控制，在许多分割区之间的具有最小变化的分割区192内基本上固定体积196中，进行光学荧光测量或其他分割区性质测量。
[0092] 精确的分割区体积具有用于获得数字生物测定的准确结果的增强的效果。当所有分割区基本相同时，可以使用标准泊松统计来高精度地对分割区中的生物实体的分布进行建模。相反，当分割区体积以不可预测的方式变化时，则泊松模型将提供样本池中生物实体原始数量的差的估计。另外，每个分割区包含离散数量的生物实体，并且这些生物实体中的每一个将分割区中也存在的试剂转化为新产物物质，该新产物物质可由系统通过分区性质的变化实时监测。由生物实体产生的新产物物质的浓度以及因此分割区性质的变化程度将取决于分割区体积。评估分割区的特定体积的测量(例如点测量)将取决于分割区的实际体积，而在分割之前添加到总试样的参考物质将显得恒定。作为分割区体积变化的结果，具有相同数量的生物实体的分割区将显得以不同的速率产生新的产物物质，并因此导致生物测定的不准确结果。
[0093] 图12A-12G是描绘根据本发明的实施方案的步骤进程的图，所述步骤进程构成执行分割过程以产生用于生物测定反应方案的分割区的示例性方法。用于说明的目的，图12A以简化的方式示出了EWOD盒200的初始准备。应当理解，EWOD盒200将具有与上述EWOD设备的实施方案相当的结构。如图12A所示，将样品流体加载到EWOD盒200的EWOD阵列201上以产生样品流体的样品池202，所述样品池含有生物实体和用于化学或生物化学反应的试剂。样品池202具有流体的测量的或已知的体积，并且构成含有作为生物测定对象的生物实体的样品流体。样品池的体积由设备控制系统存储。
[0094] 在如图12B所示的反应方案的第一步骤中，EWOD盒200的电润湿操作用于将多个样品液滴204从样品池202拉到EWOD阵列201上。样品液滴204对应于用于生物测定的各个分割区，并且一些分割区包含生物实体而其他分割区不包含生物实体。在该初始分割中，约5％的生物样品池被分成多个分割区，如图12B所示。如上所述，为了生物测定的准确性，期望分割区都具有基本相同的体积，尽管如由样品池所绘制的，分割区实际上可以是相同的或是不同的尺寸。在这方面，图13是描绘由常规分割过程产生的分割区尺寸的典型分布的图表。中心线表示平均分割区体积，所述平均分割区体积可以是由设备设置和电润湿操作规定的目标分割区体积。尽管中心线体积是平均值，但是所得到的分割区体积通常将如图13所示类似地分布。短划线和点线可表示相对于平均值的分割区体积范围。例如，短划线可以表示从目标体积加/减一个标准偏差变化，并且点线例如可以表示从平均体积加/减两个标准偏差变化。
[0095] 为了解释这种变化，在如图12C所示的反应方案的第二步骤中，AM-EWOD感测组件测量各个分割区的体积。例如，可以使用集成在阵列元件内的集成阻抗传感器电路来确定体积，如以上关于图7所述。在测量体积之后，体积值由微流控系统的控制系统确定，并且，与样品池(从该样品池分割液滴)的体积一起存储在控制系统内。控制系统进一步可以计算液滴群体的平均液滴尺寸和标准偏差，以产生如以上关于图13所述的类似的分布。对于给定的生物测定，自平均值的可接受的液滴尺寸变动可以是可接受的，例如诸如在平均值的例如±5％或±10％的百分比内，或通过一些其他介适的统计测量，例如自平均值的标准偏差的给定的百分率或数目内。例如，尽管可以采用任何介适的变动参数，但可以采用自平均值±0.5标准偏差作为可接受的变动范围。然后，控制系统识别具有可接受范围内的体积的分割区与具有超出可接受范围的体积的分割区。在图12C的示例中，为了说明，白色分割区204a构成被确定为在可接受的体积范围内的分割区，并且变黑的分割区204b构成被确定为在可接受的体积范围之外的分割区。
[0096] 图12D-12F示出了分离可接受的分割区204a用于进一步操作以执行生物测定的步骤。如图12D所示，可接受的分割区204a，即在设置的可接受的体积变动范围内的分割区，首先通过电润湿操作移动到EWOD阵列201的测定区域206中。分割区的开放阵列被设计成能够使在所需的体积范围内的分割区快速自动分离，从它们被分割的阵列到用于生物测定的新的阵列和位置。如图12E所示，接下来通过电润湿操作将不可接受的分割区204b合并成单个返回液滴208。如图12F所示，接下来通过电润湿操作将返回液滴208合并回到原始样品池202中。
[0097] 可以在多次迭代中重复图12B-12F中所描绘的操作。例如，可以在每次迭代时对另外5％的样品池进行分割。随着每次迭代，将确定一定比例的分割区在可接受的体积范围内，并将其移动到测定区域206中。在可接受的体积范围之外的任何不可接受的分割区将返回到样品池。进行另外的迭代，直到样品池已被分成所需数量的分割区，所有割分区已被确定在可接受的体积范围内。所需数量的可接受分割区可以构成原始样品池的任何必要部分，并且可以使用多次迭代以这种方式分割直至整个样品池。
[0098] 图12G是描绘在必要数量的分割迭代之后的分割过程的结果的图。例如，20μl的原始体积样品池可导致产尘800至900个分割区，所述分割区如如图12G中所示的类似的以阵列形式定位。在该示例中，EWOD盒200被描绘为包括阵列区域210，所述阵列区域210包含EWOD设备的阵列元件。阵列区域210上已经分配了关于图12B-12F所述产生的分割区204a。阵列区域210进一步安装在多个热控制元件212附近。在该示例中，存在十二个热控制元件，其适于执行各种生物测定，包括通过PCR的核酸扩增。取决于所执行的生物测定，可以使用任何合适数量的热控制元件。利用这样的配置，对应于各自热控制元件的阵列区域的不同区可以经受不同的热状态，用于执行生物测定的不同方面。
[0099] 一旦样品体积被有效分割，可以操作微流控系统以执行生物测定。可以通过执行操作以改变分割区环境来启动生物测定，其引发由生物实体执行的生物过程。环境变化可以构成例如温度的变化、额外化学组分的添加、光活化、电化学活化或能够引发由生物实体执行的生物过程的其他方法。换言之，环境变化通过分割区内存在的任何生物实体引发生物过程，这改变了随后能够测量的该分割区的性质。例如，分割区性质可以是光学性质，例如分割区的荧光或吸收，或基于化学的性质，例如诸如电化学行为的变化、pH或一些其他物理性质。通常，分割区性质的变化是由于新产物物质的创建而引起的，所述新产物物质是通过生物过程响应于环境变化而产生的。因此，对分割区性质的影响程度与新产物物质的浓度有关，而新产物物质的浓度又与存在于被测量的分割区内的生物实体的数量有关。
[0100] 作为生物测定的一部分，系统相对于时间并实时地测量所有分割区的体积，并且相对于时间并实时地测量适用的分割区性质。根据这些测量，系统计算由生物实体过程所创建的分割区中新产物物质的相对浓度，并根据所测量的分割区体积对其进行调整。通过考虑在增强分割过程期间分割区体积的变动，并通过在生物测定期间实时地继续测量分割区体积，可以校正用于分割区体积任何变化的输出，所述分割区体积变化在分割本身期间或在生物测定期间发生。
[0101] 使用本发明的方法，微流控系统记录完整的分割区历史，并且对于每个分割区，已知以下内容：
[0102] 1.产生分割区的储池的体积。
[0103] 2.从储池生成分割区的次序。
[0104] 3.生物测定期间，每个分割区的体积随时间的变化。
[0105] 如上所述，每个分割区包含离散数量的生物实体(可以是零)。此外，所有分割区都含有由生物实体引发的生化或化学反应所必需的试剂。这些试剂以比生物实体高得多的浓度存在，并因此以基本相同的浓度存在于所有的分割区中。在分割之后，如上所述改变分割区的环境，并且生物实体或多个生物实体引发将割分区中存在的试剂转化为新产物物质的生物过程。分割区中新产物物质的存在引起适用的分割区性质的变化，例如诸如荧光、吸收、电化学行为、pH或其他物理性质。在生物测定期间，关于时间实时地监测分割区性质和分割区体积的变化。
[0106] 图14A-14C说明了本发明的优点。在这些图中，绘制了分割区性质的程度作为测定的时间对于分割区体积变动的不同范围的函数。这是针对分割区220、222、224、226和228绘制的，在该示例中其分别包括0、1、2、3和4个靶标生物实体230。由于每个分割区只能存在离散数量的生物实体，因此仅观察到某些线梯度值。
[0107] 参考图14A，由于分割区220具有零个生物实体，所测量的依赖生物实体的分割区性质的程度保持为零。对于非零个的分割区，分割区性质的程度取决于两个特征：(1)生物实体的数量，以及(2)分割区的体积。在这方面，对于分割区中给定数量的生物实体，并且在给定的时间内，当分割区体积相对较小时，分割区性质的程度将更大，因为较大的分割区体积稀释了依赖生物实体的分割区性质的影响。如上所述，分割区性质的行为倾向于与由生物实体的生物过程产生的新产物物质的浓度相关。因此，由于较小的分割区尺寸，观察到的分割区性质(例如，荧光、化学变化)的程度更快地建立，原因在于新产物物质的浓度在给定的时间量内将更大。因此，在图14A中，关系的陡峭斜度表示分割区性质的更快速的影响。因此，对于具有更多生物实体的分割区，以及对于在给定时间内具有更高浓度的新产物物质的较小体积的分割区，斜度更陡峭。
[0108] 图14A中的阴影区域表示分割区性质程度的范围相对于分割区的体积变动。在图14A的示例中，变动范围相对于平均分割区体积是±10％。因此，在该图中，对于给定的分割区222、224、226或228，阴影区域的左侧是用于体积范围的低端的分割区性质的梯度值图，并且阴影区域的右侧是体积范围的高端的分割区设置的梯度值图，阴影区域包含相对于平均分割区体积的整个体积变化范围±10％的分割区性质的梯度值。
[0109] 如图14A所示，在短时间内难以确定包含一个或多个生物实体的分割区之间的差异，并且特别难以确定具有相对较大数量例如三个与四个生物实体的分割区。换言之，在较短时间段期间，两个或更多个阴影区域可以重叠，这意味着给定浓度的新产物物质影响分割区性质，直至不能与分割区内特定数量的生物实体最终相关联的程度。这使得难以提供生物实体总数的准确计数，原因在于关于生物实体的数量，某些分割区可能被错误分类。一种选择是延长生物测定的时间以使得图表变得彼此更易区分的，但延长测定时间通常是不合需要的解决方案。此外，当分割区中的所有试剂都已被消耗时，生物实体引发的反应将停止。此时，所有的分割区将采取不依赖于分割区中生物实体数量的相同输出。
[0110] 相反，上述分割过程减少并且几乎能够消除分割区之间的体积变化。在这方面，图14B与图14A相当，不同之处在于分割区性质的曲线图是基于相对于平均分割区体积±5％的体积变化范围。图14C也与图14A相当，除了分割区性质的曲线图基于其中体积变化范围基本上为零的最佳分割。如图14B和14C所示，分各区体积变化的基本减少到接近完全减少增强了在非常短的时间段内确定具有不同数量的生物实体的分割区的能力，特别是对于相对较大数量的生物实体(对于其的分割区通常更加难以确定)。结果是，通过根据本发明的实施方案通过分割减少或消除体积变化影响，可以在更短的时间内实现更准确的生物测定结果。
[0111] 因此，上述增强的分割过程可以与生物测定期间的分割区体积的实时测量相组合。在AM-EWOD系统中将分割区体积的实时测量进行集成用于自动的分割区操纵具有优于常规配置的若干优点。所描述的分割过程产生用于特定的生物数字测定的适当的分割区尺寸分布。系统在分割后评估分割区群体的分割区尺寸分布，并使用此信息使以下操作自动化：选择特定尺寸范围内的分割区，并对具有所需尺寸范围之外的尺寸的分割区进行重新分割。
[0112] 在用于评估单个酶(生物实体)活性的数字生物测定中，在评估单个酶性质时准确地知道分割区体积使得能够校正任何分割区尺寸诱导的酶引发的物质浓度的变动。然后，酶引发的物质的形成速率将反映单个酶活性的差异，并因此评估酶样品的异质性。类似地，在评估单个细胞的性质时准确地知道分割区体积能够更好地分析细胞群体中的异质性程度。
[0113] 另一个优点是增强了对生物实体的计数以及使用数字生物测定对样品浓度的评价。根据每个分割区的生物实体引发的物质的浓度变化的体积校正的实时分析，可以区分最初包含0、1、2、3或4或甚至5个生物实体的分割区。对于平均生物实体分割区浓度＜1，计算所有分割区中的生物实体的总数并除以总样品体积，以上给出了原始样品浓度的良好估计。对于更高浓度的样品，将这种计数方法与修改的泊松分析相组合以确定原始样品浓度可能更合适，所述修改的泊松分析用于每个分割区含有大于4个生物实体的分割区。例如，对于诸如qPCR的数字生物测定，比较含有1、2、3或4个拷贝的靶标DNA的分割区的时间过程允许评估PCR过程的效率。
[0114] 更一般地，对于生物测定，在生物测定的执行期间，由于各种原因可发生分割区体积变化，并且实时测量允许校正任何这样的体积变动。例如，分割区尺寸的实时测量使得在评估数字生物测定的输出中能够更好地解释合并的分割区。分割区尺寸的实时测量进一步使得能够解释分割区尺寸的变化，所述变化例如由在数字生物测定过程中从分割区蒸发水而引起，并且可以评估这种变动并将其并入到测定分析中。分割区尺寸的实时测量进一步能够使得以下的分割区不包括在来自数字生物测定的输出的评估中，在所述分割区中发生其他非生物实体引发的分割区性质的变化，且所述分割区显示不同的时间进程。因此，所描述的系统自动地：使测量样品体积集成并自动化；生成并测量样品分割区的体积；引发生物实体驱动的过程；监测分割区体积和生物实体引发的分割区性质；并且使用关于每个分割区的该信息以便更准确地确定分割区性质的相对的时间依赖性变化，从而增加进行数字生物分析的容易性和准确性。
[0115] 因此，本发明的一个方面是执行生物测定的方法，该方法采用限制分割区体积变动的分割过程，并实时监测分割区体积和分割区性质，从而增强测定结果。在示例性实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：
[0116] 1.将含有生物实体的样品池加载到AM-EWOD设备上。
[0117] 2.测量样品池的体积。
[0118] 3.将一些样品池分成多个分割区，其中一些分割区将包含生物实体，而另一些分割区则不包含生物实体。
[0119] 4.测量每个分割区在被制备后的体积，以及从其中产生分割区的样品池中剩余的样品的体积。
[0120] 5.计算分割区的平均体积和标准偏差或标准误差，并为分割区设置可接受的体积范围。
[0121] 6.将具有可接受范围内的体积的分割区移动到AM-EWOD元件阵列上的指定位置，以形成可接受范围内的分割区的阵列。
[0122] 7.将具有可接受范围之外的尺寸的分割区合并，并将这些分割区返回至样品池用于重新分割。
[0123] 8.重复步骤3到7，直至已经分割样品池的所有或足够部分。
[0124] 9.通过改变与AM-EWOD设备相关的环境来启动生物过程，例如诸如通过温度的改变、额外化学组分的添加、光活化、电化学活化或其他方法。
[0125] 10.在测定期间，关于时间并实时地测量所有分割区的体积。
[0126] 11.关于时间并实时地测量所选的一种或多种生物实体依赖性分割区性质，所述分割区性质表示从生物过程产生的新产物物质的浓度。
[0127] 12.计算分割区中新产物物质的相对浓度，并根据所测量的分割区体积对其进行调整。
[0128] 13.对于分割区，绘制新产物物质的相对浓度的时间依赖性变化。
[0129] 14.对于每个分割区，计算新产物物质形成的相对速率。
[0130] 15.根据新产物物质的形成速率对分割区进行分组。
[0131] 16.按如下方式对分割区进行分类：将分割区性质中没有显示变化的分割区视为具有零生物实体；将具有最慢分割区性质增长率的那些分割区视为具有一个生物实体；将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有两个生物实体；将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有三个生物实体；并且将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有四个或更多个生物实体。
[0132] 以这种方式，校正分割区体积极大地简化了包含多达1、2、3或4个生物实体的分割区的识别，如以上图14A-14C的对比所示。
[0133] 在之前的实例中，分割区性质的产生随时间线性变化。在备选实施方案中，分割区性质可以经历随时间的指数增加。显示分割区性质呈指数增加的生物测定的实例包括DNA聚合酶链反应和等温核酸扩增。在这些测定中，生物实体在生物过程中被复制，并且探针或嵌入荧光染料用于读出生物实体的浓度。
[0134] 图15A和15B是描绘对于分割区体积变化的不同范围，对于随时间呈指数变化的分割区性质，作为生物测定的时间的函数绘制的分配性质的程度的图。首先参考图15A，实线示出了分割区性质相对于时间的平均变化，并且虚线示出了具有比平均值小10％(更陡的梯度)和大10％(次陡的梯度)的体积的分割区的结果。与线性分割区性质类似，在较短的时间内难以区分不同数量的生物实体的分割区，特别是对于较大的数量，例如3个与4个生物实体。图15B是与图15A类似的图，但是根据本发明的实施方案考虑了分割区体积。利用包括实时体积监测的增强的分割和相关处理，即使对于更大数量的生物实体，也可以容易地区分不同数量的生物实体的分割区。
[0135] 这些曲线的形状取决于扩增过程的效率，并且当效率相似时，曲线越过阈值(特别参见图15A)用于测量依赖于样品中生物实体的初始数量的分割区性质。然后可以通过考虑来自于分割区的输出达到该阈值水平所花费的时间来比较指数曲线。该方法通常用于PCR以评估样品的相对浓度。阈值通常被认为是与负分割区相关的噪声的3到10倍之间，并且在图15A中示出。在校正分割区大小之后，相对于最长时间达到阈值的分割区，对分割区进行分类。如图15B的增强结果所示，然后将分割区指定为最初包含生物实体的0、1、2、3、4和更多个拷贝。
[0136] 如上所述，本发明的实施方案不限于零阶(线性)反应和指数反应的反应。相反，基于所测量的分割区性质，本发明可用于比较的新产物物质的相对形成速率，即使特定化学反应的动力学未被完全理解。对于任何类型的反应关系，时间过程可用于估计原始生物样品的浓度。
[0137] 例如，对于平均每个分割区大约一个生物实体的初始样品浓度，泊松统计预测含有>/＝5个生物实体的分割区的百分比为约0.2％。本发明描述了根据分割区包含的生物实体的初始数量对分割区进行分类的系统和方法。在本发明的一个方面，该方法区分含有0、1、2、3、4和＞4个生物实体的分割区。在这些情况下，简单地通过将包含特定数量的生物实体的分割区的数量相加，并乘以每个分割区的生物实体的数量来估计样品中的原始生物实体数是有用的。通过将计数的生物实体的总数除以初始样品体积来获得原始样品浓度。当初始样品浓度导致一个生物实体是每个分割区中的概率数(probabilistic number)时，则极少数分区将包含>5个生物实体。
[0138] 图16是描绘根据泊松统计，相对于每个分割区的生物实体的体积浓度，估计包含0、1、2、3、4个初始生物实体拷贝的分割区数量的图。对于每个分割区的更高平均数量的生物实体，即每个分割区>1，其中包含＞/＝5个生物实体的分割区数量>0.2％(图16空心三角形和虚线)，更合适的是，花费比初始分割更长的时间并且将分割区尺寸的分布缩小到所需的值+/-5％或更小，然后如先前分析中所述进行数字生物分析。一种改进的泊松分析，它考虑了分割区体积，并包括对最初包含0、1、＞/＝2个或0、1、2、＞/＝3个或0、1、2、3、>/＝4个，或1、2、3、4、＞/＝5个的分割区的分析，然后可用于计数原始样本中生物实体的数量，并通过将其除以储池的体积来计算原始样品的浓度。
[0139] 在本发明的另一个方面，数字生物测定的输出可以是对样品中生物实体的个体活性的评估。对于每个分割区小于约0.6个生物实体的平均浓度，泊松统计估计<10％的分割区将包含>1个生物实体每分割区(参见图16)。本发明提供了一种通过测量分割区性质来校正新产物物质浓度的方法，该方法考虑到分割区体积的任何差异。然后可以比较对于包含一个生物实体的分割区观察到的分割区性质的时间依赖性变化，以评估生物实体群体的异质性。例如，这可用于酶样品或细胞群体。
[0140] 在本发明的另一个方面，初始分割可导致分割区体积在所需的体积范围内而不需要重新分割。换言之，分割过程的迭代次数是一次，并且不需要分割过程的后续迭代。没有多次迭代的重新分割步骤，将减少准备用于数字生物测定的样品所花费的时间。然后可以如先前实施方案中所述进行生物数字测定。类似地，在某些情况下，初始分割中分割区体积的变化可能是可接受的，例如当进行以下数字生物测定时：其中来自测定的主要输出是评估酶样品中各个酶的相对活性。在这种情况下，所需的迭代数量也是一次。然后，在分割区中的生物实体的平均浓度＜0.6时，大多数分割区是空的或包含单个生物实体。分割区尺寸和分割区性质的实时测量将使用于分割区性质所记录的信号能够对于分割区尺寸的任何变化进行校正。
[0141] 在生物数字测定期间，两个或更多个分割区可以介并，产生具有更大体积的结果分割区。在生物测定期间没有实时分割区体积评估的情况下，由两个或更多个分割区合并形成的较大分割区似乎在分析中具有与未合并的液滴相同的分割区性质，并且仍然占据了更多的原始样品体积。换言之，通过分割区的合并，由于通过合并的分割区的体积变化，原始分割区中的多个生物实体可能无法区分。可能的选择包括：
[0142]
[0143]
[0144] 使用分割区体积和分割区性质的实时分析获得对分割区数量和分割区内容的最准确描述(上表的最右侧列)。在测定的开始和结束时测量分割区体积允许准确地确定分割区的数量。然而，只有使用分割区性质的实时分析，合并液滴中生物实体的数量才能够容易地估计，并因此用于样品中原始生物实体数量的分析。
[0145] 在数字生物测定中，分割区在分割区性质上可能几乎不显示变化。因此，在传统的数字测定中，几乎不显示变化的分割区很有可能被作为负分割区。根据本发明的实施方案实时检查分割区性质和分割区体积数据将检测发生的分割区性质的明显变化，其对应于含有1、2、3或4(或更多)个生物实体的分割区。然后可以将这些分割区放置在正确的类别中，从而能够更好地分析样品组成。
[0146] 或者，在数字生物测定中，一些分割区对于分割区性质可能具有异常高的值，其在整个生物实体引发的化学反应中保持恒定。在传统的数字测定中，这些分割区将被错误归类为正分割区。根据本发明的实施方案，通过生物实体诱导的性质和分割区尺寸的实时测量，可以校正该错误并且正确地将分割区归类为负。
[0147] 在本发明的另一个方面，实时评估达到数字生物测定的分割区性质阈值的分割区的数量。当达到分割区性质阈值的分割区的比率下降到零时，可以停止数字生物分析，之后通过计数生物实体的数量将分割区进行分类，并且对样品池中生物实体的初始浓度进行估计。以这种方式，一旦收集到足够的信息以定量样品中生物实体的数量，就通过停止数字生物测定来减少测定时间。图17是描绘已经达到分割区性质阈值的分割区的累积数量随时间的图。曲线的形状取决于分割区中生物实体的分布。点线对应于最初每个分割区平均含有3个生物实体的样品，实线对应于最初每个分割区平均含有1个生物实体的样品，并且点划线对应于最初每个分割区平均含有0.6个生物实体的样品。当曲线达到甲台时，可以停止生物测定，因为分割区中的所有生物实体都将达到适当的阈值。换言之，当包含生物实体的所有分割区都已达到分割区性质的阈值时，分割区达到阈值的速率变为零(水平的)。
[0148] 在本发明的另一方面，生物实体样品可以是用于下一代测序的DNA分子文库，并且所述方法可用于表征这种样品中DNA长度的分布。该文库可含有一系列适合下一代测序的DNA分子长度。对部分样品进行分割，并且如关于先前实施方案所描述的，缩小分割区的尺寸分布。
[0149] 在稀释和分割时，每个分割区含有一个DNA分子或零个DNA分子，以及通过PCR用于DNA扩增所需的过量试剂。选择浓度方案使得分割区平均含有零个或一个DNA分子。通过温度的升高和DNA聚合酶的活化来启动DNA扩增。通过具有嵌入染料的荧光分析进行实时DNA浓度监测。染料与双链DNA紧密结合，结合的染料数量取决于原始DNA分子的长度。在校正用于分割区体积差异的荧光输出后，然后可假设输出与模板DNA长度的差异有关。含有较长DNA片段的分割区将比较短长度的DNA更快地达到阈值。绘制分割区达到阈值所花费的时间(考虑到分割区尺寸的变动之后)将给出下一代DNA测序文库中DNA长度分布的估计。这为分析NGS文库中DNA长度的分布提供了便利的方法。
[0150] 在本发明的另一个方面，样品池的一部分被分割，并且如结合先前实施方案所述，缩小分割区的尺寸分布。然后对这些分割区启动数字生物测定，并且将样品池的剩余部分保持在这样的条件下，使得对于该部分不启动生物过程。分割区的尺寸和分割区性质是实时测量的，并且对于生成的每个分割区的性质的变化，进行了体积校正的时间过程。根据生物实体的数量对分割区进行分类，并使用改进的泊松分析对生物实体的总数进行估计，所述改进的泊松分析包含关于含有至少0、1和>1个生物实体的分割区数量的信息，但更优选地包含关于含有0、1、2、3、4和>4个生物实体的分割区数量的信息。对于估计每个分割区平均包含约3个生物实体的样品，可以对AM-EWOD系统进行编程以将剩余样品分割成较小的分割区，使得每个分割区的生物实体的平均数量＜3，这改善了计数，原因在于每个分割区中的生物实体的数量更容易区分(例如，如图15和16所示)。或者，在自动分割并进行如前面实施方案所述的数字生物测定之前，可以用稀释剂稀释样品池，所述稀释剂含有用于进行数字生物反应的所有试剂，以获得每个分割区生物实体的平均数量＜3。
[0151] 在本发明的另一个方面，可通过合并和混合两个分割区来启动数字生物测定，以形成具有用于发生生物反应的所有试剂的分割区。图18A-18C是描绘根据本发明的这一实施方案的步骤进程的图，所述步骤进程构成执行分割过程以产生用于生物测定反应方案的分割区的另一示例性方法。类似于图12G，图18A描绘了包括阵列区域210的EWOD盒200，所述阵列区域210包含EWOD设备的阵列元件，所述阵列元件安装在多个热控制元件212的附近。图18A示出了两个流体池，其包括：包括生物实体的生物样品池220，和含有启动生物过程所需的试剂但不含有生物实体的试剂池222，其中所述生物过程启动测定。
[0152] 图18B显示了两个储池的初始分割。特别地，使用与关于图12B-12F描述的方法类似的方法制备两个组件的分割区，导致了从生物样品池220分配的分割区224和从试剂池222分配的分割区226的分离。根据关于图12B-12F所述的分割过程，分割区224和226将具有有限的体积变动。如图18C所示，然后采用电润湿操作将每个分割区224与相应的分割区226混合以形成测定分割区228。在混合时，所得的测定分割区228包含目标生物数字分析所需的所有组分，所述混合通过将来自储池222的试剂引入到来自样品池220的分割区中来启动生物过程。然后如关于先前实施方案所述进行数字生物测定。
[0153] 因此，本发明的一个方面是增强的介质上电润湿(EWOD)设备和在EWOD设备中执行数字生物测定的相关方法。在示例性实施方案中，执行数字生物测定的所述方法可以包括以下步骤：将含有生物实体和测定试剂的样品池输入EWOD设备；通过用EWOD设备进行电润湿操作，将样品池分割成用于数字生物测定的分割区；测量每个分割区的体积；改变所述分割区的条件以启动所述数字生物分析，其中所述改变的条件导致所述生物实体执行生物过程以产生产物物质；并通过以下步骤进行所述数字生物测定：实时测量每个分割区的分割区性质和体积，其中所述分割区性质表示由在各自分割区内的任何生物实体或多个实体的生物过程产生的产物物质；基于所述测量的分割区性质和体积，确定每个分割区中的产物物质浓度；并基于所确定的所述产物物质浓度，通过每个分割区中包含的生物实体的数量对所述分割区进行分类。该方法可以单独地或组合地包括以下特征中的一个或多个。
[0154] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，EWOD设备包括集成的阻抗感测电路，并且每个分割区的体积基于由阻抗感测电路所感测的阻抗来确定。
[0155] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，分割区性质包括由EWOD设备的光学传感器测量的光学性质。
[0156] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，光学性质是来自光源的光的分割区的荧光或吸收，所述光源将光发射到EWOD设备上。
[0157] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，改变分割区的条件以启动生物测定包括温度的变化、额外化学组分的添加、光活化或电化学活化中的至少一种。
[0158] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法进一步包括绘制分割区性质的时间依赖性变化以确定每个分割区中产物物质的相对浓度，并计数每个分割区中的生物实体的数量。
[0159] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，对分割区进行分类包括：将分割区性质没有显示变化的分割区视为具有零生物实体；将具有最慢分割区性质增长率的那些分割区视为具有一个生物实体；将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有两个生物实体；将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有三个生物实体；并且将具有下一个最慢的分割区性质增长率的那些分割区视为具有四个或更多个生物实体。
[0160] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法进一步包括估计样品池中生物实体的初始浓度。
[0161] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法进一步包括确定何时达到分割区性质阈值的分割区的速率下降到零，并且在达到分割区性质阈值的分割区的速率下降到零之后对分割区进行分类。
[0162] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法进一步包括记录每个分割区的分割区历史，包括从其生成分割区的样本池的体积，从样本池生成分割区的次序，以及每个分割区随时间的体积。
[0163] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，分割样品池包含：执行分割过程的至少一次迭代，直到所述样本池的足够部分被分割，其中每次迭代包括：执行电润湿操作以从所述样品池中取出多个样品液滴；用EWOD设备上的传感系统测量每个样品液滴的体积；计算平均液滴体积，并设置液滴体积相对于平均液滴体积的可接受变化范围；执行电润湿操作以便在EWOD设备的测定区域内在可接受范围内使分割区隔离；并且执行电润湿操作，以便将可接受范围之外的分割区合并回到样品池中。
[0164] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，感测系统包括EWOD设备中集成的阻抗感测电路，并且每个样品液滴的体积基于由阻抗感测电路所感测的阻抗来确定。
[0165] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，可接受的范围是相对于平均液滴体积的±0.5标准偏差。
[0166] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，可接受的范围是相对于平均液滴体积的±百分比。
[0167] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法包括执行分割过程的多次迭代。
[0168] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法进一步包括将含有测定试剂和零个生物实体的试剂池输入到EWOD设备中；通过执行至少一次迭代来分割试剂池，直到试剂池的足够部分被分割；将来自样品池的分割区与试剂池的相应分割区混合以启动生物测定。
[0169] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，生物测定是通过聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增。
[0170] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，该方法进一步包括表征样品池中核酸分子长度的分布。
[0171] 在执行数字生物测定的方法的示例性实施方案中，生物测定包括用于蛋白质生物标记定量的酶联免疫吸附测定(ELISA)、用于酶转换量定量的酶促测定或用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定之一。
[0172] 根据本发明的另一方面，微流控系统包括介质上电润湿(EWOD)设备，所述设备包括配置成接收一个或更多个液滴的元件阵列，所述元件阵列包括多个单独的阵列元件；和控制系统，所述控制系统被配置为控制施加到元件阵列的致动电压，以对所述液滴执行操纵操作，以执行根据任何实施方案的执行数字生物测定的方法。微流控系统进一步可单独地或组合地包括以下特征中的一个或多个。
[0173] 在微流控系统的示例性实施方案中，所述系统进一步包括位于沿着EWOD设备的不同空间位置的多个热控制元件，至少一个所述热控制元件的温度相对于时间是可变的；其中，控制系统包括热控制单元，该热控制单元被配置为控制多个热控制元件的温度，以产生位于沿着EWOD设备的不同空间位置的多个热区。
[0174] 在微流控系统的示例性实施方案中，所述系统进一步包括：光源，其将光发射到所述阵列元件上；以及光学传感器，其被配置为感测分配到所述阵列元件上的液滴的光学性质。
[0175] 在微流控系统的示例性实施方案中，所述系统进一步包括集成在EWOD设备的阵列元件中的集成阻抗感测电路，并且基于由所述阻抗感测电路所感测到的阻抗来确定分配到阵列元件上的液滴的体积。
[0176] 本发明的另一方面是存储程序代码的非暂时性计算机可读介质，所述程序代码由处理设备执行，用于控制施加到介质上电润湿(EWOD)设备的元件阵列的阵列元件上的致动电压，用于对元件阵列上的液滴执行液滴操纵，所述程序代码能够由所述处理设备执行以在根据任何实施方案的EWOD设备中执行数字生物测定的方法的步骤。
[0177] 尽管已经关于某个实施方案和多个实施方案示出和描述了本发明，但是本领域技术人员在阅读和理解本说明书和附图时可以想到等同的改变和修改。特别是关于由上述元件(组件、部件、设备、组分等)执行的各种功能，除非另有说明，用于描述这些元件的术语(包括对“装置”的引用)旨在对应于以下元件：尽管在结构上不等同于在本发明的示例性实施方案或多个实施例中执行功能的所公开的结构，但执行所述元件的指定功能的任何元件(即，功能上等同的)。另外，尽管以上仅关于若干实施方案中的一个或多个描述了本发明的特定特征，但是这样的特征可以与其他实施方案的一个或多个其他特征组合，这对于任何给定或特定的应用可能是期望的和有利的。
[0178] 工业适用性
[0179] 所描述的实施例可用于提供增强的AM-EWOD设备操作。AM-EWOD设备可用于提供增强的数字生物测定，例如诸如用于核酸定量的数字聚合酶链式反应(PCR)、用于蛋白质生物标记定量的酶联免疫吸附测定(ELISA)、用于酶转换量定量的酶促测定，以及用于表型分型和基因分型的基于细胞的测定。AM-EWOD设备可以形成芯片实验室系统的一部分。这些设备可用于操纵、反应和感测化学、生物化学或生理学材料。
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