利用Taqman低密度微流体芯片技术检测29种呼吸道病原体的
方法
技术领域
背景技术
[0002]
呼吸系统疾病包括急性呼吸道感染和社区获得性
肺炎两大类，它们对人类的健康造成了严重的威胁和挑战。其中，与两类疾病发生密切相关的呼吸道病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次氏体等，很多病原体引起的临床症状相似，在病原诊断方面容易出现误诊，造成抗生素滥用的现象普遍存在。及时准确对病原体进行
鉴别诊断有助于对呼吸道疾病进行
预防和
治疗，减轻社会医疗卫生负担。
[0003] 一直以来，传统的呼吸道病原体检测技术主要包括细菌和病毒培养、
抗原抗体反应和免疫
荧光、普通PCR等检测技术手段。然而，以上这些技术或多或少都存在一定
缺陷：细菌或细胞培养周期较长，要求较高，而病原体诊断需要一定时效性，细菌或细胞培养不能满足短时间快速检测的要求；抗原抗体反应灵敏度和特异度较低，容易出现
假阳性，不适合多种病原体混合感染检测；普通凝胶
电泳的灵敏度低，有时条带模糊，判断不够准确，极易造成误诊。
[0004] Real-time PCR技术具有较高灵敏度和特异性，检测时间较短且准确的优势，已成为国内外检测病原体的主要技术方法。而国内外商品化的
试剂盒较多，且价格较贵，除此之外，主要是针对单一的呼吸道病原感染检测，针对不同呼吸道病原体同时检测的方法较少，这不利于多种病原体感染的同时筛检。而在多重PCR检测中，由于检测不同病原体的引物探针在一个反应管中，极易造成假阳性。除此之外，在多重PCR检测中，检测其中一种病原体的引物探针的改变，会导致整个实验体系的改变，需要重新进行检测体系的优化，这使实验更加复杂。为了改变上述研究的缺陷且提高快速筛查多种呼吸道病原体的能
力，需要建立快速、灵敏、准确的具备现场和实验室快速筛查多种病原体的技术体系。
[0005] Taqman低密度微流体芯片(TAC)技术是一种新兴的多病原体筛查技术，在384孔微流体芯片中，一份样品可实现多达48种靶标的同时检测，有助于微量样品的多靶标筛查。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种利用Taqman低密度微流体芯片技术检测29种呼吸道病原体的方法。
[0007] 本发明首先提供了成套引物探针，包括29套引物探针组合；
[0008] 引物探针组合1由
序列表的序列1、2所示的引物和序列3所示的探针组成；
[0009] 引物探针组合2由序列表的序列4、5所示的引物和序列6所示的探针组成；
[0010] 引物探针组合3由序列表的序列7、8所示的引物和序列9所示的探针组成；
[0011] 引物探针组合4由序列表的序列10、11所示的引物和序列12所示的探针组成；
[0012] 引物探针组合5由序列表的序列13、14所示的引物和序列15所示的探针组成；
[0013] 引物探针组合6由序列表的序列16、17所示的引物和序列18所示的探针组成；
[0014] 引物探针组合7由序列表的序列19、20所示的引物和序列21所示的探针组成；
[0015] 引物探针组合8由序列表的序列22、23所示的引物和序列24所示的探针组成；
[0016] 引物探针组合9由序列表的序列25、26所示的引物和序列27所示的探针组成；
[0017] 引物探针组合10由序列表的序列28、29所示的引物和序列30所示的探针组成；
[0018] 引物探针组合11由序列表的序列31、32所示的引物和序列33所示的探针组成；
[0019] 引物探针组合12由序列表的序列34、35所示的引物和序列36所示的探针组成；
[0020] 引物探针组合13由序列表的序列37、38所示的引物和序列39所示的探针组成；
[0021] 引物探针组合14由序列表的序列40、41所示的引物和序列42所示的探针组成；
[0022] 引物探针组合15由序列表的序列43、44所示的引物和序列45所示的探针组成；
[0023] 引物探针组合16由序列表的序列46、47所示的引物和序列48所示的探针组成；
[0024] 引物探针组合17由序列表的序列49、50所示的引物和序列51所示的探针组成；
[0025] 引物探针组合18由序列表的序列52、53所示的引物和序列54所示的探针组成；
[0026] 引物探针组合19由序列表的序列55、56所示的引物和序列57所示的探针组成；
[0027] 引物探针组合20由序列表的序列58、59所示的引物和序列60所示的探针组成；
[0028] 引物探针组合21由序列表的序列61、62所示的引物和序列63所示的探针组成；
[0029] 引物探针组合22由序列表的序列64、65所示的引物和序列66所示的探针组成；
[0030] 引物探针组合23由序列表的序列67、68所示的引物和序列69所示的探针组成；
[0031] 引物探针组合24由序列表的序列70、71所示的引物和序列72所示的探针组成；
[0032] 引物探针组合25由序列表的序列73、74所示的引物和序列75所示的探针组成；
[0033] 引物探针组合26由序列表的序列76、77所示的引物和序列78所示的探针组成；
[0034] 引物探针组合27由序列表的序列79、80所示的引物和序列81所示的探针组成；
[0035] 引物探针组合28由序列表的序列82、83所示的引物和序列84所示的探针组成；
[0036] 引物探针组合29由序列表的序列85、86所示的引物和序列87所示的探针组成。
[0037] 所述成套引物探针还包括引物探针组合30；
[0038] 引物探针组合30由序列表的序列88、89所示的引物和序列90所示的探针组成。
[0039] 所述成套引物探针还可包括检测IPCO的引物探针组合。
[0040] 以上任一所述探针为MGB探针；所述探针一端采用荧光基团标记，另一端采用MGB基团标记。所述探针具体可为5’端采用FAM荧光基团标记，3’端采用MGB基团标记。
[0041] 以上每个引物探针组合中，两条引物和探针的摩尔比为1:1:2。
[0042] 以上所述成套引物探针的用途为如下(a1)至(a6)中的任一种：
[0043] (a1)鉴别29种呼吸道病原体；
[0044] (a2)制备用于鉴别鉴别29种呼吸道病原体的产品；
[0045] (a3)鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种；
[0046] (a4)制备用于鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种的产品；
[0047] (a5)鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种；
[0048] (a6)制备用于鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种的产品。
[0049] 本发明还保护以上所述成套引物探针的应用，如下(a1)至(a6)中的任一种：
[0050] (a1)鉴别29种呼吸道病原体；
[0051] (a2)制备用于鉴别鉴别29种呼吸道病原体的产品；
[0052] (a3)鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种；
[0053] (a4)制备用于鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种的产品；
[0054] (a5)鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种；
[0055] (a6)制备用于鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种的产品。
[0056] 本发明还保护含有以上任一所述成套引物探针的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)：
[0057] (b1)鉴别29种呼吸道病原体；
[0058] (b2)鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种；
[0059] (b3)鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种。
[0060] 所述试剂盒还包括利用定量PCR检测29种呼吸道病原体的其他试剂，具体可为实时定量一步法逆转录试剂盒中的试剂，如2×Quant One Step Probe qRT-PCR master Mix、HotMaster Taq polymerase、QuantRTase。
[0061] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物探针单独
包装的步骤。
[0062] 本发明还保护一种Taqman低密度微流体芯片；所述芯片上固定有以上任一所述的成套引物探针。
[0063] 所述Taqman低密度微流体芯片的用途为如下(a1)至(a6)中的任一种：
[0064] (a1)鉴别29种呼吸道病原体；
[0065] (a2)制备用于鉴别鉴别29种呼吸道病原体的产品；
[0066] (a3)鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种；
[0067] (a4)制备用于鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种的产品；
[0068] (a5)鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种；
[0069] (a6)制备用于鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种的产品。
[0070] 本发明还保护所述Taqman低密度微流体芯片的的应用，为如下(a1)至(a6)中的任一种：
[0071] (a1)鉴别29种呼吸道病原体；
[0072] (a2)制备用于鉴别鉴别29种呼吸道病原体的产品；
[0073] (a3)鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种；
[0074] (a4)制备用于鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种的产品；
[0075] (a5)鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种；
[0076] (a6)制备用于鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种的产品。
[0077] 本发明还保护含有以上所述的Taqman低密度微流体芯片的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)：
[0078] (b1)鉴别29种呼吸道病原体；
[0079] (b2)鉴定待测病原体是否为鉴别29种呼吸道病原体中的一种；
[0080] (b3)鉴定待测样本是否感染了29种呼吸道病原体中的一种或多种。
[0081] 所述试剂盒还包括利用TAC检测29种呼吸道病原体的其他试剂，具体可为实时定量一步法逆转录试剂盒中的试剂，如2×Quant One Step Probe qRT-PCR master Mix、HotMaster Taq polymerase、QuantRTase。
[0082] 以上任一所述29种呼吸道病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、人偏肺病毒A型、人偏肺病毒B型、鼻病毒、肠道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、结核杆菌、人博卡病毒、麻疹病毒、
风疹病毒、腮腺炎病毒、立克次氏体、人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、人冠状病毒OC43、人冠状病毒KU1、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、百日咳博代氏杆菌Ⅰ和百日咳博代氏杆菌Ⅱ。
[0083] 以上任一所述待测样本具体可为鼻咽拭子样本。
[0084] 本发明提供了针对29种呼吸道病原体检测的Taqman低密度微流体芯片(TAC)，评价并优化研制的29种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片(TAC)技术体系，使其检测
水平达到：最低检出限10-100copy/反应；与其它相关病原体以及人的基因组无交叉反应；重复性变异系数不大于3％，
稳定性变异系数不大于10％。与临床上常用检测方法即金标准比较，29种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片(TAC)检测技术灵敏度为95.2％，特异度为96.6％，一致性系数为0.7～1.0。本发明建立的针对29种呼吸道病原体的Taqman低密度微流体芯片(TAC)检测技术，充分利用MGB探针检测的优势，克服了以往呼吸道病原体
多重检测的缺陷，能够在两小时内对一份样品实现呼吸道病原体的29种呼吸道病原体多靶标检测，且具有良好的灵敏度和特异度。本发明为中国地区呼吸道疾病的监测和爆发调查提供快速、准确、高通量的技术手段。
附图说明
[0085] 图1为TAC排版。
[0086] 图2为TAC加样模式图。
具体实施方式
[0087] 以下的
实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0088] 本发明检测的29种呼吸道病原体包括：INF-A(甲型流感病毒，Influenza A)、INF-B(乙型流感病毒，Influenza B)、PIV-1(副流感病毒1型，Parainfluenza virus1)、PIV-2(副流感病毒2型，Parainfluenza virus2)、PIV-3(副流感病毒3型，Parainfluenza virus3)、HMPV-A(人偏肺病毒A型，Human metapneumovirus A)、HMPV-B(人偏肺病毒B型，Human metapneumovirus B)、HRV(鼻病毒，Human Rhinovirus)、HEV(肠道病毒，Human Enterovirus)、HADV(腺病毒，Human Pan-adenovirus)、RSV-A(呼吸道合胞病毒A型，Respiratory virus A)、RSV-B(呼吸道合胞病毒B型，Respiratory virus B)、M.pneumo(肺炎支原体，Mycoplasma pneumonie)、C.pneumo(肺炎衣原体，Chlamydia pneumoniae)、S.pneumo(肺炎链球菌，Streptococcus pneumoniae)、MT(结核杆菌，Mycobacterium tuberculosis)、HBOV(人博卡病毒，Human bocavirus)、MV(麻疹病毒，Measles Virus)、RV(风疹病毒，RubellaVirus)、MPV(腮腺炎病毒，Mumps virus)、CB(立克次氏体，Coxiella burneti)、HCoV-229E(人冠状病毒229E，Humancoronavirus 229E)、HCoV-NL63(人冠状病毒NL63，Humancoronavirus NL63)、HCoV-OC43(人冠状病毒OC43，Humancoronavirus OC43)、HCoV-HKU1(人冠状病毒KU1，Humancoronavirus HKU1)、L.pneu(嗜肺军团菌，Pan-Legionella)、H.influ(流感嗜血杆菌，Haemophilus influenza)、B.pert I(百日咳博代氏杆菌Ⅰ，Bordetella pertussis targetⅠ)和B.pert II(百日咳博代氏杆菌Ⅱ，Bordetella pertussis targetⅡ)。
[0089] 实施例1、针对29种呼吸道病原体检测的引物探针设计
[0090] 针对29种呼吸道病原体检测的引物探针如表1所示。
[0091] 表1
[0092]
[0093]
[0094]
[0095] 注：兼并
碱基Y代表C或T；兼并碱基R代表A或G；兼并碱基S代表G或C；兼并碱基K代表G或T。注：F代表上游引物；R代表下游引物；P代表MGB探针。探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB基团。每一组引物探针组合中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为1:1:0.5。
[0096] 本发明中的单重实时定量PCR采用RNP作为内参基因，TAC检测采用RNP和IPCO作为内参基因。用于检测IPCO的引物和探针由ABI公司设计并合成。用于检测RNP的引物和探针如下：
[0097] F：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’(序列88)；
[0098] R：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’(序列89)；
[0099] P：5’-CTGAAGGCTCTGCGC-3’(序列90)。
[0100] 实施例2、阳性质粒标准品的制备
[0101] 针对29种病原体制备每种病原体对应的阳性质粒标准品。
[0102] 将目的
片段插入克隆载体pEASY-Blunt zero(PEASY-Blunt zero Cloning Kit,全式金，批号CB501)中，得到阳性质粒标准品(已经测序验证)。
[0103] 每种病原体对应的目的片段如表2所示。
[0104] 表2
[0105]病原 GenBank 位数
INF-A(甲型流感病毒) MK995729.1 171-276
INF-B(乙型流感病毒) MK999133.1 657-747
PIV-1(副流感病毒1型) MH684390.1 778-859
PIV-2(副流感病毒2型) MH892406.1 7463-7619
PIV-3(副流感病毒3型) KT765995.1 291-549
RSV-A(呼吸道合胞病毒A型) MH760599.1 1083-1166
RSV-B(呼吸道合胞病毒B型) MK749916.1 1275-1377
HMPV-A(人偏肺病毒A型) MH428626.1 96-246
HMPV-B(人偏肺病毒B型) KY474534.1 442-522
HRV(鼻病毒) MH899592.1 138-345
HADV(腺病毒) MF962521.1 3-132
HBOV(人博卡病毒) MK034749.1 2548-2628
HEV(肠道病毒) MH933857.1 325-470
MV(麻疹病毒) MK161348.1 2005-2190
RV(风疹病毒) LC466970.1 86-171
HCoV-229E(人冠状病毒229E) MF542265.1 25706-25782
HCoV-NL63(人冠状病毒NL63) MG428707.1 26809-26927
HCoV-OC43(人冠状病毒OC43) MK787437.1 438-513
HCoV-HKU1(人冠状病毒KU1) LC315650.1 6053-6203
MPV(腮腺炎病毒) MK161348.1 2005-2190
CB(立克次氏体) CP040059.1 1117266-1117162
C.pneumo(肺炎衣原体) LN849043.1 132665-132830
M.pneumo(肺炎支原体) LR214945.1 634494-634409
L.pneu(嗜肺军团菌) LR134332.1 650170-650435
S.pneumo(肺炎链球菌) LR536845.1 1841628-1841554
H.influ(流感嗜血杆菌) CP031254.1 161576-161691
MT(结核杆菌) CP039850.1 3054551-3054389
B.pertI(百日咳博代氏杆菌Ⅰ) LR590467.1 4099514-4099579
B.pertII(百日咳博代氏杆菌Ⅱ) LR590480.1 108293-108236
[0106] 实施例3、引物探针的单重实时定量PCR初步评价
[0107] 一、临床分离菌株检测
[0108] 待测菌株：临床分离的29种病原体菌株。
[0109] CB(立克次氏体，Coxiella burneti)记载于文献：何泽民孙志会于永慧et al.贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体的克隆与鉴定[J].
生物技术通讯,v.30(2):170-174.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0110] HEV(肠道病毒，Human Enterovirus)记载于文献：沃颖.2012-2014年重庆儿童呼吸道
病毒感染流行特征分析[D].中国人民解放军军事医学科学院,2015.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0111] MV(麻疹病毒，Measles Virus)记载于文献：朱晓光,刘
冰,李斌,et al.麻疹病毒属病毒种特异性探针的设计[J].中国生物制品学杂志,v.23(10):1132-1134.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0112] RV(风疹病毒，RubellaVirus)记载于文献：汪晓辉,杨瑞馥,张朝隆,et al.RT-Se minested-PCR检测风疹病毒[J].中华
微生物学和免疫学杂志,1995(3).公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0113] B.pert I(百日咳博代氏杆菌ⅠBordetella pertussis targetⅠ)/B.pert II(百日咳博代氏杆菌Ⅱ，Bordetella pertussis targetⅡ)记载于文献：徐颖华.百日咳鲍特氏菌分子鉴定、基因组多态性与微进化的研究[D].2011.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0114] M.pneumo(肺炎支原体，Mycoplasma pneumonie)、C.pneumo(肺炎衣原体，Chlamydia pneumoniae)记载于文献：王菲,李岩伟,黄小兰,et al.肺炎衣原体及肺炎支原体临床血清学检测试剂的研发及应用[J].标记免疫分析与临床,2018(5).公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0115] C.pneumo(肺炎衣原体，Chlamydia pneumoniae)S.pneumo(肺炎链球菌，Streptococcus pneumoniae)、H.influ(流感嗜血杆菌，Haemophilus influenza)记载于文献：Zhao C,Wang X,Zhang C,et al.Development of a TaqMan Array card to target 21purulent meningitis-related pathogens[J].BMC Infectious Diseases,2019,19(1).公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0116] MT(结核杆菌，Mycobacterium tuberculosis)记载于文献：李卓林,王璐璐,刘日辉,et al.吉林省110株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型[J].吉林大学学报(医学版),2013,39(2):308-312.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0117] L.pneu(嗜肺军团菌，Pan-Legionella)记载于文献：汪黎,朱虹,端青.检测嗜肺军团菌胶体金
免疫层析法的建立[J].军事医学,2008,32(1):55-57.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0118] 其余菌株均记载于：张驰.呼吸道病毒在感染性疾病中的分布及变异规律的研究[D].公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
[0119] MPV(腮腺炎病毒，Mumps virus)：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院。
[0120] 对于每一种病原体菌株来说，以菌株cDNA为模板，采用该种病原体菌株在表1中对应的引物和探针进行单重实时定量PCR检测。
[0121] 反应体系：模板2μL，2×Quant One Step Probe qRT-PCR master Mix 12.5μL，HotMaster Taq polymerase 1μL，QuantRTase 0.5μL，探针0.5μL，上下游引物各0.5μL，去离子水7.5μL。探针在反应体系中的浓度为200nmol，上下游引物在反应体系中的浓度均为400nmol。
[0122] 上述反应体系中的试剂均是来自中国天根生化科技有限公司(TIANGEN)：实时定量一步法逆转录试剂盒(Quant One Step qRT-PCR Kit(Probe)。
[0123] 配置反应体系后，1500r/s离心1min。
[0124] 反应程序：50℃逆转录30min，92℃预变性3min；40个循环为92℃变性10seconds，62℃
退火20seconds；68℃延伸20seconds(此处收集荧光
信号)。
[0125] CT值小于等于38为阳性，反之为阴性。检测结果如表3所示。
[0126] 表3
[0127]
[0128] 结果显示实验结果均为阳性，且无交叉反应。
[0129] 二、阳性标准质粒检测
[0130] 待测样本：29种实施例2中制备的阳性标准质粒。
[0131] 1、对于每一种阳性标准质粒来说，配置107copy/μL、106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL共5个浓度梯度的待测溶液，每个浓度设置2个重复。采用该种阳性标准质粒在表1中对应的引物和探针进行单重实时定量PCR检测，获得标准曲线，得到线性度和扩增效率。PCR反应体系和反应程序同步骤一。试验重复3次，评价其重复性。
[0132] 2、对于每一种阳性标准质粒来说，从102cop/μL进行5倍稀释，连续稀释两个浓度梯度，每个浓度设置2个重复。采用该种阳性标准质粒在表1中对应的引物和探针进行单重实时定量PCR检测，计算最低检出限(LOD)。
[0133] 结果如表4所示。结果显示，应用构建的阳性标准品对29种呼吸道病原体引物探针评价：扩增效率﹥90％，最低检出限﹤10copy/μL。
[0134] 表4
[0135]
[0136] 实施例4、引物探针的TAC检测评价
[0137] 挑选了12种常见呼吸道病原体(具体如表6所示)，委托美国Applied Biosystem公司将表1中所示的12种病原体的检测引物和探针固定于Taqman Array Card专用反应板。
[0138] 1、评价扩增效率和线性度
[0139] 对于每一种呼吸道病原体来说，每3种同样浓度的阳性标准品进行混合，即同数量级浓度分别进行混合，每张TAC反应板中从107copy/μl-104copy/μl共4个浓度梯度，每个浓度梯度设置2个重复，构建标准曲线,应用Applied Biosystems公司的Universal Master MixⅡ进行体系构建及PCR反应(表5)，评价TAC扩增效率和最低检出限评价。
[0140] 2、评价体系的重复性和稳定性
[0141] 对于每一种呼吸道病原体来说，取低浓度102copy/μL阳性标准品，在相同板内和不同板间各重复试验三次，计算其变异系数评价体系的重复性和稳定性，即CV值。
[0142] 3、评价体系的最低检出限(LOD)
[0143] 对于每一种呼吸道病原体来说，取低浓度102copy/μL阳性标准品，从102cop/μL进行5倍稀释，连续稀释两个浓度梯度，每个浓度设置4个重复，其中至少有3个重复孔出现扩增浓度，定义为最低检出限(LOD)。
[0144] 表5
[0145]
[0146] 结果如表6所示。
[0147] 表6
[0148]
[0149] 实施例5、临床样本检测
[0150] 待测样本：包含表1中29种病原体的临床样本：一部分来源于军事医学科学院附属307医院呼吸内科和检验科；另一部分来源于北京市顺义区疾病预防控制中心检验科。2013年6月-2015年5月从就诊疑似呼吸道症状病人中共收集到鼻咽拭子样本736份，其中352份阳性样本，384份阴性样本(病人知情同意)。样本被保存在1ml的
采样液中，﹣80℃保存备用。
[0151] 阳性样本为临床经过现有的传统金标准检测方法(包括：病毒的细胞培养、细菌培养或单重实时定量PCR)检测为阳性的临床样本(只要感染29种病原体中的一种即为阳性)。阴性样本为临床经过传统方法检测未检出病原体的临床样本。传统的实验室检测由提供样本的军事医学科学院附属307医院和北京市顺义区疾病预防控制中心分别进行。
[0152] 委托美国Applied Biosystem公司将表1中所示的29种病原体的检测引物和探针固定于Taqman Array Card专用反应板。
[0153] TAC排版如表7和图1所示。TAC加样模式图如图2所示。
[0154] 表7
[0155]1 INF-A INF-A
2 INF-B INF-B
3 PIV-1 PIV-1
4 PIV-2 PIV-2
5 PIV-3 PIV-3
6 HMPV-A HMPV-A
7 HMPV-B HMPV-B
8 HRV HRV
9 HEV HEV
10 HADV HADV
11 IPCO RNP
12 RSV-A RSV-A
13 RSV-B RSV-B
14 M.pneumoniae M.pneumoniae
15 C.pneumoniae C.pneumoniae
16 S.pneumoniae S.pneumoniae
17 M.tuberculosis M.tuberculosis
18 HBOV HBOV
19 MV RV
20 MPV C.burnetii
21 HCoV-OC43 HCoV-229E
22 HCoV-NL63 HCoV-HKU1
23 L.pneumophila H.influenzae
24 B.pertussis targetI B.pertussis targetII
[0156] 应用一步法试剂，构建TAC反应体系，检测收集的352份临床阳性样本和384份阴性样本。阴性对照：RNase-Free ddH2O；阳性对照：102cop/μL的阳性标准品。
[0157] 一步法试剂反应体系及反应条件见表8。
[0158] 表8
[0159]
[0160] 判断标准：每次扩增阳性和阴性对照正常，无污染；每次内参对照正常；cutoff值设为36。CT值小于36，为阳性样本；CT值36-38为疑似病例；CT值大于38为阴性样本。
[0161] 应用临床传统检测方法作为金标准，评价TAC方法的灵敏度和特异度。应用统计
软件spss17.0计算其一致性检测结果，即Kappa值。Kappa值的判断标准：<0,poor；0-0.20,slight；0.21-0.40,fair；0.41-0.60,moderate；0.61-0.80,substantial；and 0.81-1.00,almost perfect agreemen,P<0.05有统计学意义。
[0162] 与金标准方法比较TAC检测效果见表9。与金标准检测结果相比，TAC的总体灵敏度为95.2％，总体特异度为96.6％。
[0163] TAC检测技术与金标准方法的一致性比较见过如表10所示。结果显示检测一致性较好。
[0164] 表9
[0165]
[0166] 表10
[0167]
[0168] 实验中还检测出同一临床样本的两种及以上病原体共感染，其中24份样本中有两种及以上病原体存在的共感染的病原体(表11)。
[0169] 为了进一步评价TAC检测技术的准确性，随机从检测样本中
抽取了16份金标准认为阳性样本，进行了一代测序，测序的16份样本中有15份与TAC检测结果一致，仅有1份冠状病毒样本检测结果不一致(表12)。
[0170] 表11
[0171]
[0172] 表12
[0173]
