一种纳米探针及其制备方法与应用
阅读：233发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种纳米探针及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种 纳米探针 及其制备方法与应用，所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在花菁类有机物上的两亲性物质构成，所述花菁类有机物的结构通式为其中，R为CH3、CH2CH3、本发明利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系的三联吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针，增强了纳米探针与 白蛋白 结合时产生的 荧光 强度及光 稳定性 ，从而使得纳米探针对白蛋白检测时，具有检测范围宽、灵敏高、 检测限 低的特点。，下面是一种纳米探针及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种纳米探针，其特征在于，所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在花菁类有机物上的两亲性物质构成，所述花菁类有机物的结构通式为
其中，R为CH3、CH2CH3、
2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述两亲性物质为两亲性PEG或卵磷脂；所述两亲性PEG选自PEG-PE、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG2000和PS-b-PEG中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述纳米探针的粒径为50-100nm。
4.一种如权利要求1-3任一所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：将花菁类有机物、两亲性物质与第一有机溶剂混合，超声，加入超纯水，再超声，去除第一有机溶剂，过膜，超滤离心分离，得到纳米探针。
5.根据权利要求4所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃。
6.根据权利要求4所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述花菁类有机物的制备方法包括步骤：七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶在第二有机溶剂中进行反应，反应结束后将反应混合物倒入冰水中，经萃取、浓缩，柱层析分离，得花菁类有机物；
所述七甲川菁染料的结构通式为
其中，R为CH3、CH2CH3、
7.根据权利要求6所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述第二有机溶剂为甲醇、DMF或NMP。
8.根据权利要求6所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述反应的条件为：25-
100℃，15-72h。
9.一种如权利要求1-3任一所述的纳米探针在定量检测样品中的白蛋白中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述定量检测的方法为荧光分光光度法或荧光成像法。
一种纳米探针及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及纳米探针技术领域，尤其涉及一种纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 在临床诊断中，蛋白质及其生物标志物的定量检测对疾病的诊断非常重要。在各种蛋白质中，白蛋白(albumin，ALB)是血液中含量最多的转运蛋白，具有重要的生物学功能，包括促进各种药物，脂肪酸和代谢物的运输、维持血液渗透压等。一般来说，正常血清中白蛋白的浓度为35-55g·L-1。血液中白蛋白的浓度可以反映出个体的健康状况。例如，血浆中的白蛋白浓度较低，称为低蛋白血症，表明可能患有肝脏和肾脏疾病或低蛋白质饮食相-1关的营养不良。相反，正常尿液中白蛋白的浓度为<30mg·L ，如果尿液中存在过量的白蛋白，则有可能是糖尿病、心血管疾病和肾脏疾病的早期征兆。
[0003] 现有的白蛋白的常用检测方法中，液相色谱，电泳分析等方法的灵敏度和便捷性不甚理想。虽然荧光检测法具有灵敏度高，检测限低，检测方法简单等优势，逐渐成为研究的热点，但是目前已有的荧光探针分子激发波长较短，容易产生背景干扰。
[0004] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
[0005] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米探针及其制备方法与应用，旨在解决现有荧光探针分子激发波长较短，容易产生背景干扰，不易准确检测白蛋白含量的问题。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种纳米探针，其中，所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在花菁类有机物上的两亲性物质构成，所述花菁类有机物的结构通式为其中，R为CH3、CH2CH3、
[0008] 所述的纳米探针，其中，所述两亲性物质为两亲性PEG或卵磷脂；所述两亲性PEG选自PEG-PE、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG2000和PS-b-PEG中的一种或多种。
[0009] 所述的纳米探针，其中，所述纳米探针的粒径为50-100nm。
[0011] 所述的纳米探针的制备方法，其中，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃。
[0012] 所述的纳米探针的制备方法，其中，所述花菁类有机物的制备方法包括步骤：七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶在第二有机溶剂中进行反应，反应结束后将反应混合物倒入冰水中，经萃取、浓缩，柱层析分离，得花菁类有机物；所述七甲川菁染料的结构通式为其中，R为CH3、CH2CH3、
[0013] 所述的纳米探针的制备方法，其中，所述第二有机溶剂为甲醇、DMF或NMP。
[0014] 所述的纳米探针的制备方法，其中，所述反应的条件为：25-100℃，15-72h。
[0015] 一种如上所述的纳米探针在定量检测样品中的白蛋白中的应用。
[0016] 所述的应用，其中，所述定量检测的方法为荧光分光光度法或荧光成像法。
[0017] 有益效果：本发明利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系的三联吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针，增强了纳米探针与白蛋白结合时产生的荧光强度及光稳定性，从而使得纳米探针对白蛋白检测时，具有检测范围宽、灵敏高、检测限低的特点。附图说明
[0018] 图1为本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)的TEM图。
[0019] 图2为在胎牛血清(FBS)存在时，本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)的TEM图。
[0020] 图3为本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)的水合粒径分布图。
[0021] 图4为在FBS存在时，本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)水合粒径分布图。
[0022] 图5为本发明实施例2中PNC溶液随牛血清白蛋白(BSA)的浓度变化的荧光光谱图。
[0023] 图6为本发明实施例2中PNC溶液的荧光波长为610nm处的荧光强度与BSA的浓度的变化关系图。
[0024] 图7为本发明实施例3中加入相同浓度的不同生物样品时，PNC溶液的荧光强度对比图。
[0025] 图8为本发明实施例4中加入不同浓度的牛血清白蛋白、胎牛血清、老鼠血液时，PNC溶液的荧光成像图。
[0026] 图9为本发明实施例5中加入不同浓度牛血清白蛋白、奶粉时，PNC溶液的荧光成像图。
[0027] 图10为本发明实施例6中加入不同待测物(不同肾毒性老鼠的尿液)时，PNC溶液的荧光强度随待测物浓度的变化对比图。
具体实施方式
[0028] 本发明提供一种纳米探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029] 本发明实施例提供一种纳米探针，其中，所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在花菁类有机物上的两亲性物质构成，所述花菁类有机物的结构式为其中，R为CH3、CH2CH3、
[0030] 本实施例利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系的三联吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针，增强了纳米探针与白蛋白结合时产生的荧光强度及光稳定性，从而使得纳米探针对白蛋白检测时，具有检测范围宽、灵敏高、检测限低的特点。
[0031] 在一种实施方式中，所述两亲性物质可为但不限于两亲性PEG(polyethylene，聚乙二醇)或卵磷脂；所述两亲性PEG选自但不限于PEG-PE(polyethylene-phosphatidyl ethanolamine，聚乙二醇磷脂酰乙醇胺)、DSPE-PEG5000(Distearoyl phosphoethanolamine-PEG5000，甲氧基聚乙二醇磷脂，Mw为5000)、DSPE-PEG2000(Distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，甲氧基聚乙二醇磷脂，Mw为2000)和PS-b-PEG(poly(styrene)-block-poly(ethylene glycol)，聚苯乙烯-b-聚乙二醇)中的一种或多种；优选地，所述两亲性物质为DSPE-PEG2000。所述纳米探针为纳米颗粒，所述纳米探针的粒径为50-100nm。
[0032] 本实施例的纳米探针中的花菁类有机物疏水性较强，包裹两亲性物质自组装后引起荧光猝灭，但其吲哚结构可通过非共价作用力与白蛋白特异性结合，同时可恢复荧光。
[0033] 本发明实施例还提供一种如上所述的基于纳米探针的制备方法，其中，包括步骤：将花菁类有机物、两亲性物质与第一有机溶剂混合，超声，加入超纯水，再超声，去除第一有机溶剂，过膜，超滤离心分离，得到纳米探针。
[0034] 在一种实施方式中，所述第一有机溶剂可为但不限于二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃。
[0035] 在一种实施方式中，所述花菁类有机物与两亲性物质的质量比为1:5-10；优选地，所述所述花菁类有机物与两亲性物质的质量比为1:10。
[0036] 在一种实施方式中，所述超声的时间为20-35秒，所述再超声的时间为3分钟。
[0037] 在一种实施方式中，所述过膜是指通过孔径为220μm的PES(Polyethersulfone resin，聚醚砜树脂)滤膜；所述超滤离心分离采用的是30KD的超滤管。
[0038] 在一种实施方式中，所述的纳米探针的制备方法，其中，所述花菁类有机物的制备方法包括步骤：七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶在第二有机溶剂中进行反应，反应结束后将反应混合物倒入冰水中，经萃取、浓缩，柱层析分离，得花菁类有机物；所述七甲川菁染料的结构通式为
其中，R
为CH3、CH2CH3、
其中，R
为CH3、CH2CH3、
[0039] 七甲川菁染料为大共轭结构，具有较高的荧光量子产率，采用三联吡啶修饰制备成花菁类有机物，增加其共轭长度的同时引入刚性平面结构，增强了其荧光强度及光稳定性。
[0040] 在一种实施方式中，所述七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶的摩尔比为1：1-7；优选摩尔比为1:4。
[0041] 在一种实施方式中，所述第二有机溶剂可为但不限于甲醇、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)；优选地，所述第二有机溶剂为DMF。
[0042] 在一种实施方式中，所述反应的条件为：25-100℃，15-72h。
[0043] 本实施例所述纳米探针的制备过程简单，利于进行大量生产。
[0044] 本发明实施例还提供一种如上所述的纳米探针在定量检测样品中的白蛋白中的应用。
[0045] 本实施例的纳米探针中的七甲川菁染料为大共轭结构，具有较高的荧光量子产率，经三联吡啶修饰形成花菁类有机物，增加其共轭长度的同时引入刚性平面结构，增强了的荧光强度及光稳定性。花菁类有机物疏水性较强，包裹PEG自组装后引起荧光猝灭，但其吲哚结构可通过非共价作用力与白蛋白特异性结合，同时可恢复荧光。本实施例的纳米探针检测范围宽，检测限低，信号灵敏，可以大量生产，能够特异性检测白蛋白，可以应用于如刑侦案件血迹的检测，肾毒性患者的尿液微量白蛋白的检测，奶粉中蛋白质的含量检测等领域。
[0046] 在一种实施方式中，所述定量检测的方法为荧光分光光度法或荧光成像法。
[0047] 下面通过实施例对本发明进行详细说明。
[0048] 实施例1
[0049] (1)七甲川菁染料为 时，按照反应式
[0050] 制备花菁类有机物；具体制备步骤为：将七甲川菁染料(100mg，0.14mmol)和4-(氨基)苯基2,2,6,2-三联吡啶(100mg，0.31mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4mL)中于90℃搅拌24小时,冷却至室温，旋干去除溶剂，以二氯甲烷/甲醇(体积比为25:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析分离，得到花菁类有机物。该花菁类有机物的结构表征数据为：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝14.1Hz,2H),8.09(d,J＝8.5Hz,2H),7.85(dd,J＝19.1,8.2Hz,4H),7.56(t,J＝7.6Hz,2H),7.43(s,2H),7.34(d,J＝8.8Hz,2H),7.28(m,9H),7.08(d,J＝
7.5Hz,1H),6.77(s,1H),6.24(d,J＝14.1Hz,1H),5.58(s,2H),5.24(s,1H),2.52(s,4H),
2.00(s,9H),1.65(s,2H),1.19(s,2H)；飞行质谱测得的分子量为1023.5080，理论值为
1024.35。
7.5Hz,1H),6.77(s,1H),6.24(d,J＝14.1Hz,1H),5.58(s,2H),5.24(s,1H),2.52(s,4H),
2.00(s,9H),1.65(s,2H),1.19(s,2H)；飞行质谱测得的分子量为1023.5080，理论值为
1024.35。
[0051] (2)基于步骤(1)制得的花菁类有机物，制备纳米探针；具体制备步骤为：将花菁类有机物(1mg，0.98μmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入10mg的DSPE-PEG2000，超声30s，快速加入5mL超纯水，再超声3min，用氮气鼓出二氯甲烷，过220μm的PES滤膜，转移至30kD的超滤管中，在4℃条件下离心(转速为3500转/分钟)15分钟，得到纳米探针(PNC)，为蓝绿色的纳米颗粒，将纳米探针避光保存备用。该纳米探针(PNC)的透射电镜(TEM)测试结果如图1所示，可知该纳米探针的形貌为球形，尺寸均匀，粒径约为50nm；将该纳米探针(PNC)加入胎牛血清(FBS)，并用透射电镜(TEM)对其进行测试，测试结果如图2所示，可知纳米探针出现明显的解体现象，表明FBS可与纳米探针作用从而导致纳米探针的结构被破坏。
[0052] 用马尔文粒径仪对该纳米探针(PNC)测得的水合粒径分布情况如图3所示，可知该纳米探针(PNC)的粒径分布集中，尺寸均匀，其水合粒径约为180nm；将该纳米探针(PNC)加入胎牛血清(FBS)，并用马尔文粒径仪对其进行测试，测得的水合粒径分布情况如图4所示，可知加入FBS之后纳米探针粒径分布比较分散，进一步表明FBS可与纳米探针作用从而导致纳米探针的结构被破坏。
[0053] 实施例2
[0054] 对实施例1制得的纳米探针(PNC)的灵敏度进行表征：制备3mL实施例1制得的纳米探针(PNC)(15μM)的水溶液；将牛血清白蛋白(BSA)溶于去离子水制备待测样品溶液(55mg/mL)，然后向纳米探针水溶液中按0.1％的体积浓度间隔依次加入0-1.0％的牛血清白蛋白，通过荧光分光光度计测量荧光强度，纳米探针随BSA的浓度变化的荧光光谱变化情况如图5所示，表明纳米探针溶液的荧光强度与BSA的浓度增大而增强。实施例1制得的纳米探针(PNC)在荧光波长为610nm时的荧光强度与随BSA的浓度的变化关系如图6所示，可知两者呈线性变化关系，计算得出实施例1制得的纳米探针对BSA的检测限为4.8μg/mL。
[0055] 实施例3
[0056] 对实施例1制得的纳米探针(PNC)的特异性进行表征：制备3mL纳米探针(15μM)的水溶液，分别将淀粉、酯酶、胰酶、铁转蛋白、谷胱甘肽、球蛋白、胆固醇、牛血清白蛋白、人血清白蛋白生物样品分别溶于去离子水制备待测样品溶液(1.0mM)，随后将上述5％的各待测液加入纳米探针溶液中，以未加待测液的纳米探针(15μM)的水溶液为空白对照实验，采用荧光分光光度计测量荧光，含有不同生物样品的PNC溶液的荧光强度对比情况如图7所示，可知只有牛血清白蛋白与人血清白蛋白两组溶液与纳米探针作用产生显著的荧光，表明白蛋白可以特异性结合纳米探针产生荧光。
[0057] 实施例4
[0058] 荧光成像检测血液的白蛋白，在96孔板的板孔中分别加入200μL 15μM的实施例1制得的纳米探针(PNC)，分别然后按照0.4％的体积浓度间隔依次加入不同浓度的待测物：牛血清白蛋白、胎牛血清及老鼠血液，用小动物荧光成像系统检测其荧光强度,加入不同浓度的牛血清白蛋白、胎牛血清及老鼠血液的PNC溶液的荧光成像结果如图8所示，可知，荧光强度均随待测物浓度增强而增强，表明纳米探针(PNC)可以检测血液中的白蛋白。
[0059] 实施例5
[0060] 荧光成像检测奶粉中的白蛋白：在96孔板的板孔中分别加入200μL15μM的实施例1制得的纳米探针(PNC)，分别然后按照0.2％的质量浓度间隔分别依次加入不同浓度的牛血清白蛋白、奶粉，用小动物荧光成像系统检测其荧光强度；加入不同浓度牛血清白蛋白、奶粉的PNC的荧光成像结果如图9所示，可知，荧光强度随待测物浓度增强而增强，表明纳米探针可以检测奶粉中的白蛋白。
[0061] 实施例6
[0062] 肾毒性老鼠的尿液中白蛋白的检测：所有的实验操作均按照临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。取两只雌性裸鼠(六周,16-20g)，一只不做处理，48小时后收集其尿液作为对照组待测液；另外一只在裸鼠后腿皮下注射100μL体积浓度为
50％的甘油，每隔24小时注射一次，连续注射2次建立急性肾炎性老鼠模型，第二次注射24小时后取收集其尿液作为肾毒性组待测液。向两组15μM的实施例1制得的纳米探针(PNC)水溶液中，按照体积浓度为0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％的顺序分别加入对照组待测液、实验组待测液，采用荧光分光光度计检测其荧光强度；含有不同待测液的PNC溶液的荧光强度随浓度的变化情况如图10所示，可知肾毒性组小鼠尿液中含有一定量的白蛋白，对照组小鼠尿液几乎不含白蛋白，表明纳米探针可用于检测尿液中的白蛋白。
50％的甘油，每隔24小时注射一次，连续注射2次建立急性肾炎性老鼠模型，第二次注射24小时后取收集其尿液作为肾毒性组待测液。向两组15μM的实施例1制得的纳米探针(PNC)水溶液中，按照体积浓度为0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％的顺序分别加入对照组待测液、实验组待测液，采用荧光分光光度计检测其荧光强度；含有不同待测液的PNC溶液的荧光强度随浓度的变化情况如图10所示，可知肾毒性组小鼠尿液中含有一定量的白蛋白，对照组小鼠尿液几乎不含白蛋白，表明纳米探针可用于检测尿液中的白蛋白。
[0063] 综上所述，本发明利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系的三联吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针，增强了纳米探针与白蛋白结合时产生的荧光强度及光稳定性，从而使得纳米探针对白蛋白检测时，具有检测范围宽、灵敏高、检测限低的特点。本发明的纳米探针制备过程简单，可大量生产，能够特异性检测白蛋白，可应用于如刑侦案件血迹的检测，肾毒性患者的尿液微量白蛋白的检测，奶粉中蛋白质的含量检测等领域。
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