[0002] 本
发明要求2010年7月23日提交的美国临时
专利申请No.61/367,006的优先权，其全部内容在此引用作为参考。
技术领域
[0003] 本发明一般涉及利用无细胞体液和血液细胞诊断、
预后或监测疾病或病症的方法。本发明还涉及利用无细胞体液和血液细胞，确认疾病或病症标记物的方法。
背景技术
[0004] 疾病的早期诊断常常会增加成功
治疗或治愈该疾病的可能性。但是，目前的治疗方法主要取决于从人口衍生出的平均值（由健康个人获得）。个性化的诊断方法需要能诊断（尤其是早期诊断）还不知道患有疾病或患有复发性疾病的个人所存在的疾病或病症。
[0005] 白细胞开始是作为骨髓中的多能造血干细胞，然后沿着骨髓系（单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，以及嗜
碱性粒细胞）或淋巴系（T淋巴细胞和B淋巴细胞以及自然杀伤细胞）发展。骨髓系细胞（例如，中性粒细胞和巨噬细胞）的主要功能为吞噬传染性
生物体、受损细胞（生存不需要的）、衰老和死亡细胞（凋亡和
坏死），以及清理细胞碎片。源自健康动物的吞噬细胞不能进行复制且为二倍体，即DNA含量为2n。平均来说，每个细胞包含的DNA小于10纳克，RNA小于20纳克且
蛋白质小于300纳克。非吞噬细胞也为二倍体且不参与死亡细胞或感染性生物体的内化作用，并DNA指数为1。
[0006] 不同白细胞亚群的生命周期为几天（例如，中性粒细胞）至几个月（例如，巨噬细胞）不等。与其他类型细胞一样，白细胞会发生老化并最终死亡。在它们的老化过程中，源自人体血液和组织的吞噬细胞（例如，中性粒细胞）显示出程序性细胞死亡（例如，细胞凋亡）的所有典型标记物，包括半胱天冬酶活化、致密核以及
染色质碎片。这些细胞还在其细胞外的质膜表面上显示出许多“吃我（eat-me）”标记（例如，磷脂酰丝
氨酸，糖类）。因此，通过其他的吞噬细胞，从组织和血液清除出垂死的和死亡的细胞以及其亚细胞碎片。
[0007] 本发明的其中一个目的在于提供诊断方法（通过利用无细胞体液和血液细胞，加强疾病或病症特异性标记物的检测，例如，核酸、蛋白质、
碳水化合物和/或脂质等等）。本发明的另一个目的在于提供确认疾病或病症的特异性标记物的方法以及进一步利用该标记物（单独的或连同任何已知的标记物）诊断疾病或病症的方法。
发明内容
[0008] 我们已发明出新的且有用的检测/诊断疾病或病症的方法，该方法利用无细胞体液结合非吞噬细胞或DNA含量为2n的吞噬细胞（=2n吞噬细胞）。在一些
实施例中，无细胞的体液包含病变细胞（diseased cells）的组分，例如DNA和/或蛋白质，并可用作病变细胞的替代物（同时非吞噬细胞或者）。在其他实施例中，将无细胞体液用作病变细胞的替代物，而将=2n的吞噬细胞用作对照细胞。
[0009] 在一方面，本发明提供了诊断受试者疾病或病症的方法或提供了辅助诊断受试者疾病或病症诊断的方法，包括：a）确定无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱（profile）；b）确定非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；以及c）确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的差异，其中该差异表示受试者存在所述的疾病或病症。
[0010] 在另一方面，本发明提供了评估受试者发展疾病或病症的
风险的方法，包括：a）确定无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；b）确定非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；以及c）确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的差异，其中该差异表示受试者发展所述疾病或病症的风险。
[0011] 仍在另一方面，本发明提供了预后受试者疾病或病症的方法以及提供了辅助预后受试者疾病或病症的方法，包括：a）确定无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；b）确定非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；以及c）确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的差异，其中该确认的差异表示受试者所述疾病或病症的预后。
[0012] 仍在另一方面，本发明提供了评估受试者疾病或病症治疗效果（efficacy of treatment）的方法，包括：a）确定治疗前受试者无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；确定治疗前受试者非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的第一差异；b）确定治疗后受试者无细胞体液样品中的一个或多个标记物的第三谱；确定治疗后受试者非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第四谱；确认至少一个或多个所述标记物的第三和第四谱之间的第二差异；以及c）确认所述第一差异和所述第二差异之间的差异，其中该确认的差异表示受试者的所述疾病或病症的治疗效果。
[0013] 仍在另一方面，本发明提供了监测受试者疾病或病症进展或衰退（regression）的方法，包括：a）在第一时间点，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；在该第一时间点，确定受试者非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；确认至少一个或多个所述标记物的第一谱和第二谱之间的第一差异；b）在第二时间点，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个标记物的第三谱；在该第二时间点，确定受试者非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第四谱；确认至少一个或多个所述标记物的第三谱和第四谱之间的第二差异；以及c）确认所述第一差异和所述第二差异之间的差异，其中该确认的差异表示受试者所述疾病或病症的进展或衰退。
[0014] 仍在另一个方面，本发明提供了确认可改善或治疗受试者疾病或病症的化合物的方法，包括：a）在将化合物给予受试者之前，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；在将化合物给予受试者之前，确定受试者非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；确认至少一个或多个所述标记物的第一谱和第二谱之间的第一差异；b）在将化合物给予受试者后，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个标记物的第三谱；在将化合物给予受试者后，确定受试者非吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第四谱；确认至少一个或多个所述标记物的第三谱和第四谱之间的第二差异；以及c）确认所述第一差异和所述第二差异之间的差异，其中该确认的差异表示该化合物可改善或治疗受试者的所述疾病或病症。
[0015] 仍在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者疾病或病症的方法或提供了辅助诊断受试者疾病或病症的方法，包括：a）确定无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；b）确定无细胞体液样品中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；以及c）确认至少一个或多个所述标记物的第一谱和第二谱之间的差异，其中该差异表示受试者存在所述的疾病或病症。
[0016] 仍在另一方面，本发明提供了评估受试者发展疾病或病症的风险的方法，包括：a）确定无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；b）确定=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；以及c）确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的差异，其中该差异表示受试者发展所述疾病或病症的风险。
[0017] 仍在另一方面，本发明提供了预后受试者疾病或病症的方法以及提供了辅助预后受试者疾病或病症的方法，包括：a）确定无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；b）确定=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；以及c）确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的差异，其中该差异表示受试者所述疾病或病症的预后。
[0018] 仍在另一方面，本发明提供了评估受试者疾病或病症治疗效果的方法，包括：a）确定治疗前受试者无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；确定治疗前受试者=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；确认至少一个或多个所述标记物的第一和第二谱之间的第一差异；b）确定治疗后受试者无细胞体液样品中的一个或多个标记物的第三谱；确定治疗后受试者=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第四谱；确认至少一个或多个所述标记物的第三和第四谱之间的第二差异；以及c）确认所述第一差异和所述第二差异之间的差异，其中该确认的差异表示受试者所述疾病或病症的治疗效果。
[0019] 仍在另一方面，本发明提供了监测受试者疾病或病症进展或衰退的方法，包括：a）在第一时间点，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；在该第一时间点，确定受试者=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；确认至少一个或多个所述标记物的第一谱和第二谱之间的第一差异；b）在第二时间点，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个标记物的第三谱；在该第二时间点，确定受试者=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第四谱；确认至少一个或多个所述标记物的第三谱和第四谱之间的第二差异；以及c）确认所述第一差异和所述第二差异之间的差异，其中该确认的差异表示受试者所述疾病或病症的进展或衰退。
[0020] 仍在另一个方面，本发明提供了确认可改善或治疗受试者疾病或病症的化合物的方法，包括：a）在将化合物给予受试者之前，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个疾病或病症标记物的第一谱；在将化合物给予受试者之前，确定受试者=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第二谱；确认至少一个或多个所述标记物的第一谱和第二谱之间的第一差异；b）在将化合物给予受试者后，确定受试者无细胞体液样品中的一个或多个标记物的第三谱；在将化合物给予受试者后，确定受试者=2n吞噬细胞群中的一个或多个标记物中的至少一个的第四谱；确认至少一个或多个所述标记物的第三谱和第四谱之间的第二差异；以及c）确认所述第一差异和所述第二差异之间的差异，其中该确认的差异表示该化合物可改善或治疗受试者的所述疾病或病症。
[0021] 仍在另一个方面，本发明提供了确认一个或多个疾病或病症标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第二谱；确认第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中该第一组差异特指（specific to）第一谱相对于第二谱（的差异）；b）确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第三谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的非吞噬细胞中的分析物的第四谱；确认第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中该第二组差异特指第三谱相对于第四谱（的差异）；以及c）确认一个或多个分析物（特指第一组差异相对于第二组差异（的差异）），所确认的分析物为所述疾病或病症的标记物。可选地，该方法进一步包括d）获得被患有疾病或病症的受试者所述疾病或病症感染（影响，affect）的细胞或组织中的分析物的第五谱；获得未被受试者（患有疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确认第五谱和第六谱间的第三组差异，其中该第三组差异特指第五谱相对于第六谱的差异；以及e）确认存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个标记物。
[0022] 仍在另一个方面，本发明提供了确认一个或多个疾病或病症标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第二谱；确认第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中该第一组差异特指第一谱相对于第二谱的差异；b）确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第三谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的非吞噬细胞中的分析物的第四谱；确认第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中该第二组差异特指第三谱相对于第四谱的差异；以及c）确认一个或多个分析物（特指第一组差异相对于第二组差异的差异），所确认的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）获得被受试者（患有所述疾病或病症）所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；获得未被受试者（患有疾病或病症）所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确认第五谱和第六谱间的第三组差异，其中该第三组差异特指第五谱相对于第六谱的差异；以及e）确认存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个标记物。
[0023] 仍在另一个方面，本发明提供了确认一个或多个疾病或病症标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；通过
数据挖掘，获得未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第二谱；
确认第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中该第一组差异特指第一谱相对于第二谱的差异；b）确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第三谱；通过数据挖掘，获得未患有所述疾病或病症的对照受试者的非吞噬细胞中的分析物的第四谱；确认第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中该第二组差异特指第三谱相对于第四谱的差异；以及c）确认一个或多个分析物（特指第一组差异相对于第二组差异的差异），所确认的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）通过数据挖掘，获得被所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；通过数据挖掘，获得未被所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确认第五谱和第六谱间的第三组差异，其中该第三组差异特指第五谱相对于第六谱的差异；以及e）确认存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个标记物。
[0024] 仍在另一个方面，本发明提供了确认一个或多个疾病或病症标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第二谱；确认第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中该第一组差异特指第一谱相对于第二谱的差异；b）确定被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第三谱；确定未被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第四谱；确认第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中该第二组差异特指第三谱相对于第四谱的差异；c）确认在第一组差异和第二组差异中同时存在的一个或多个分析物，所确认的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液中的分析物的第五谱；确认第一谱和第五谱间的第三组差异，其中该第三组差异特指第一谱相对于第五谱的差异；以及e）确认存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个标记物。
[0025] 仍在另一个方面，本发明提供了确认一个或多个疾病或病症标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定患有所述疾病或病症的受试者的=2n吞噬细胞中的分析物的第二谱；确认第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中该第一组差异特指第一谱相对于第二谱的差异；b）确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第三谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的=2n吞噬细胞中的分析物的第四谱；确认第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中该第二组差异特指第三谱相对于第四谱的差异；以及c）确认一个或多个分析物（特指第一组差异相对于第二组差异的差异），所确认的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）获得被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；获得未被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确认第五谱和第六谱间的第三组差异，其中该第三组差异特指第五谱相对于第六谱的差异；以及e）确认存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个标记物。
[0026] 在一些实施例中，所述的标记物或分析物为核酸（例如，核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA或NDA-RNA杂合体（hybrid）），蛋白质（例如，氨基酸、肽、酶、
抗原、
抗体、细胞因子、脂蛋白、糖蛋白或
激素），脂类（例如，
脂肪酸、磷脂、胆固醇），碳水化合物（例如，单糖、双糖、多糖），代谢产物（例如，维生素、初级代谢产物、
次级代谢产物），或其组合。
[0027] 在一些实施例中，所述谱为核酸谱（例如，基因型谱，单核苷酸多态性谱，基因突变谱，基因拷贝数谱，DNA甲基化谱，DNA乙酰化谱，染色体剂量谱（chromosome dosage profile），基因表达谱），蛋白质谱（例如，蛋白质表达、蛋白质活化），脂质谱，碳水化合物谱，代谢产物谱，或其组合。在一些实施例中，通过定性测定、定量测定或其组合，确定谱。
[0028] 在一些实施例中，相比非吞噬细胞，无细胞体液中的一个或多个标记物中的至少一个标记物被上调或激活。在一些实施例中，相比非吞噬细胞，无细胞体液样品中的一个或多个标记物中的至少一个标记物被下调或抑制。在一些实施例中，相比=2n吞噬细胞，无细胞体液中的一个或多个标记物中的至少一个标记物被上调或激活。在一些实施例中，相比=2n吞噬细胞，无细胞体液中的一个或多个标记物中的至少一个标记物被下调或抑制。
[0029] 在一些实施例中，第一谱、第二谱、第三谱、第四谱、第五谱或第六谱包括缺失（缺少）一个或多个标记物中的至少一个。
[0030] 在一些实施例中，该差异为至少1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍差异。
[0031] 在一些实施例中，本发明的方法还包括溶解=2n吞噬细胞和非吞噬细胞；以及从这些细胞中提取出细胞内容物（cellular content）。在一些实施例中，本发明的方法包括从无细胞体液中提取出细胞内容物。在一些实施例中，无细胞体液包括活的病变细胞、死亡的病变细胞、凋亡的病变细胞、循环
肿瘤细胞、感染因子（infectious agent）、
胎儿细胞、滋养层细胞（trophoblast），或其
片段。
[0032] 在一些实施例中，疾病或病症的一个或多个标记物中的至少一个标记物存在于无细胞体液的细胞内容物中。在一些实施例中，所述疾病或病症的一个或多个标记物不存在于非吞噬细胞或=2n吞噬细胞的细胞内容物中。
[0033] 在一些实施例中，本发明方法还包括将c）中确定的差异与所述疾病或病症的一个或多个已知标记物的库（repository）（即，通过数据挖掘获得的数据）进行比较。
[0034] 在一些实施例中，吞噬细胞为专业吞噬细胞（例如，嗜中性粒细胞，巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞，
泡沫细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞），非专业吞噬细胞（例如，上皮细胞，内皮细胞，
成纤维细胞，间充质细胞），或其组合。在一些实施例中，非吞噬细胞为T细胞、B细胞、裸细胞、嗜碱性粒细胞，或其组合。
[0035] 在一些实施例中，从受试者的体液样品（例如，血液、尿液），组织或细胞（例如，白细胞、胎儿细胞）中分离出吞噬细胞（例如，=2n吞噬细胞）和非吞噬细胞。
[0036] 在一些实施例中，利用标准的/已知的细胞分离/分隔（isolation）/纯化技术，例如，抗体、流式细胞术、
荧光激活细胞分选、过滤、梯度离心（gradient-based centrifugation）、洗脱、微流控（microfluidics）、
磁性分离技术、荧光磁性分离技术、纳米结构、
量子点、高通量
显微镜基平台、或其组合，从体液、组织或细胞中分离出吞噬细胞（例如，=2n吞噬细胞）和非吞噬细胞或从=2n吞噬细胞中分离出＞2n吞噬细胞。
[0037] 本发明还提供了本发明方法所用的且可通过本发明方法进行确认的标记物。
附图说明
[0038] 本专利或申请文件至少包括一个以
颜色绘制的图。可根据要求并支付必要
费用，由专利局（Office）提供含彩色图的本专利或专利申请公布的拷贝件。结合附图，根据以下说明性实施例的详细描述，可更加充分地理解本发明的上述和其他的特征和优势，其中：
[0039] 图1示意性地示出了在比较和去除（扣除）患者特异性固有标记（patient specific intrinsic signature）（由分离自非吞噬淋巴细胞的DNA，RNA，蛋白质和/或脂质获得）后，确认
血浆内的疾病/病症特异性DNA，RNA，蛋白质和/或脂质标记的建议性方法。
[0040] 图2示意性地示出了可用于确认肿瘤特异性标记（表达于癌症患者的血浆中）的分析方法。
[0041] 图3示意性地示出了本发明方法的一个实施例的一般
流程图。
[0042] 图4示意性地示出了本发明方法的另一个实施例的一般流程图。
[0043] 图5示意性地示出了本发明方法的仍另一个实施例的一般流程图。
[0044] 图6示意性地示出了在比较和去除患者特异性固有标记（由分离自DNA含量为2n的WBC的DNA，RNA，蛋白质和/或脂质获得）后，确认血浆内的疾病/病症特异性DNA，RNA，蛋白质和/或脂质标志的建议性方法。
[0045] 图7示意性地示出了可用于确认癌症患者的肿瘤特异性标记的分析方法。
[0046] 图8示意性地示出了本发明方法的另一个实施例的一般流程图。
[0047] 图9示意性地示出了本发明方法的另一个实施例的一般流程图。
[0048] 图10示出了借助Hoechst33342（显示二倍体WBC的分离以及从这些细胞提取的最终高
质量的RNA（RIN=9.2））染色后的人类WBC的FACS谱。
[0049] 图11示出了总RNA（分离自LNCaP和LLC1细胞）的凝胶
电泳分析。
[0050] 图12列出了从小鼠白细胞（WBC）中获得的RNA的产量和质量。
[0051] 图13A-13D示出了显示七个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于LNCaP（人
前列腺癌）荷瘤裸鼠的中性粒细胞）的阵列。（A）LNCaP肿瘤。（B）从荷LNCaP瘤的裸鼠中获得的中性粒细胞（NT）。（C）从荷LNCaP瘤的裸鼠中获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤裸鼠获得的中性粒细胞（NN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的中性粒细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的中性粒细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度地表达。NT中的表达相比于NN和TT中的表达为≥2倍。
[0052] 图14A-14D示出了显示三个上调、癌症相关的基因（检测于LNCaP（人前列腺癌）荷瘤裸鼠的巨噬细胞）的阵列。（A）LNCaP肿瘤。（B）从荷LNCaP瘤的裸鼠中获得的巨噬细胞（MT）。（C）从荷LNCaP瘤的裸鼠中获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤裸鼠获得的巨噬细胞（MN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的巨噬细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的巨噬细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达。MT中的表达相比于MN和TT中的表达为≥2倍。
[0053] 图15A-15D示出了显示四个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于LS174T（人结肠癌）荷瘤裸鼠的中性粒细胞）的阵列。（A）LS174T肿瘤。（B）从荷LS174T瘤的裸鼠中获得的中性粒细胞（NT）。（C）从荷LS174T瘤的裸鼠中获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤裸鼠获得的中性粒细胞（NN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的中性粒细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的中性粒细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达的标记。NT中的表达相比于NN和TT中的表达为≥2倍。
[0054] 图16A-16D示出了显示三个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于LS174T（人结肠癌）荷瘤裸鼠的巨噬细胞）的阵列。（A）LS174T肿瘤。（B）从荷LS174T瘤的裸鼠中获得的巨噬细胞（MT）。（C）从荷LS174T瘤的裸鼠中获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤裸鼠获得的巨噬细胞（MN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的巨噬细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的巨噬细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达。MT中的表达相比于MN和TT中的表达为≥2倍。
[0055] 图17A-17D示出了显示出五个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于荷LLC1（小鼠转移性
肺癌）瘤的C57/B1鼠的中性粒细胞）的阵列。（A）LLC1肿瘤。（B）从荷LLC1瘤的C57/B1鼠获得的中性粒细胞（NT）。（C）从荷LLC1瘤的C57/B1鼠获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤C57/B1鼠获得的中性粒细胞（NN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的中性粒细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的中性粒细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达。NT中的表达相比于NN和TT中的表达为≥2倍。
[0056] 图18A-18D示出了显示两个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于荷LLC1（小鼠转移性肺癌）瘤的C57/B1鼠的巨噬细胞）的阵列。（A）LLC1肿瘤。（B）从荷LLC1瘤的C57/B1鼠获得的巨噬细胞（MT）。（C）从荷LLC1瘤的C57/B1鼠获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤C57/B1鼠获得的巨噬细胞（MN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的中性粒细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的中性粒细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达。MT中的表达相比于MN和TT中的表达为≥2倍。
[0057] 图19A-19D示出了显示出两个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于荷B16F10（小鼠转移性黑色素瘤）瘤的C57/B1鼠的中性粒细胞）的阵列。（A）B16F10肿瘤。（B）从荷B16F10瘤的C57/B1鼠获得的中性粒细胞（NT）。（C）从荷B16F10瘤的C57/B1鼠获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤C57/B1鼠获得的中性粒细胞（NN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的中性粒细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的中性粒细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达。NT中的表达相比于NN和TT中的表达为≥2倍。
[0058] 图20A-20D示出了显示出一个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于荷B16F10（小鼠转移性黑色素瘤）瘤的C57/B1鼠的巨噬细胞）的阵列。（A）B16F10肿瘤。（B）从荷B16F10瘤的C57/B1鼠获得的巨噬细胞（MT）。（C）从荷B16F10瘤的C57/B1鼠获得的T细胞（TT）。（D）从非荷瘤C57/B1鼠获得的巨噬细胞（MN）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（A）和荷瘤小鼠的巨噬细胞（B）中表达以及在非荷瘤小鼠的巨噬细胞（D）和非吞噬T细胞（C）中以最低程度表达。MT中的表达相比于MN和TT中的表达为≥2倍。
[0059] 图21A-21D示出了显示出五个上调（≥2倍）、癌症相关基因（检测于患有头颈癌（鳞状细胞癌）的患者的中性粒细胞）的阵列。（A）正常组织（
皮肤）活检。（B）肿瘤组织活检。（C）从患者血液获得的中性粒细胞（NT）。（D）从患者血液获得的T细胞（TT）。圆圈标识表示在肿瘤细胞（B）和患者血液的中性粒细胞（C）中表达以及在正常皮肤（A）或非吞噬T细胞（D）中以最低程度表达或不表达。NT中的表达相比于TT和皮肤中的表达为≥2倍。
[0060] 图22A-22B示出了显示出23个上调（≥2倍）、癌症相关的基因（检测于患有卵巢癌（腺癌）的患者的巨噬细胞）的阵列。（A）从患者血液获得的巨噬细胞（MT）。（B）从患者血液获得的T细胞（TT）。圆圈标识表示在患者巨噬细胞（A）中表达以及在非吞噬T细胞（B）中以最低程度表达。MT中的表达相比于TT中的表达为≥2倍。
[0061] 图23示出了用于确认吞噬细胞中的肿瘤标记的方法。在该示例中，定量测定荷瘤动物的巨噬细胞（MT）中的癌症相关基因的表达强度，将其与源于相同动物的T细胞中的那些癌症相关基因的表达强度进行比较，并确认>2倍的过度表达的癌症相关基因。然后，定量确定MT中的全部表达基因的强度并将其与从非荷瘤动物中获得的巨噬细胞（MNT）的全部表达基因的强度进行比较，并确认>2倍的过度表达的基因。选择两个列表中的共同基因并将其与相同肿瘤所表达的那些基因进行比较（阴影区域）。
[0062] 图24A-24B示出了（A）从荷LNCaP人前列腺肿瘤的裸鼠获得的巨噬细胞（MLNCaP）与从相同动物获得的T细胞（T细胞LNCaP），（B）MLNCaP与从非荷瘤小鼠（非肿瘤）获得的巨噬细胞，（C）从荷LNCaP人前列腺肿瘤的裸鼠获得的中性粒细胞（NLNCaP）与从相同动物获得的T细胞（T细胞LNCaP），以及（D）NLNCaP与从非荷瘤小鼠（非肿瘤）获得的巨噬细胞，的基因表达强度的比较。红色的基因为>2倍的过度表达；绿色的基因为>2倍的低表达（表达不足，under-express）。
[0063] 图25列出了吞噬的中性粒细胞（N）和巨噬细胞（M）中的癌症相关基因的表达。
[0064] 图26列出了相比非吞噬性T细胞，在患有卵巢癌的患者的吞噬性巨噬细胞中被上调（>2倍）的癌症相关基因。
[0065] 图27示出了从小鼠WBC获得的蛋白质样品（5.9微克）的SDS凝胶（10%）电泳。
[0066] 图28示出了从荷瘤小鼠获得的T细胞和单核细胞/巨噬细胞（M/M）中的TAG-72和SPA表达的蛋白质印迹分析，其表明标记仅存在于吞噬细胞中。
具体实施方式
[0067] 除非另有定义，否则本申请所使用的科学和技术术语与本领域内的那些普通技术人员通常理解的含义相同。通常地，本文所述的有关细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、
微生物学、药理学、遗传学、蛋白质和核
酸化学，及其技术所使用的系统命名为本领域内所熟知的且为本领域内所通常使用的。
[0068] 特别地，以上全部的，以及本文所涉及的任何其他的公布、专利和所公布的专利申请均以参考的方式并入本文。在冲突的情况下，以本
说明书（包括其具体定义）为准。
[0069] 在整个说明书中，单词“包含”应该理解为其意味包含
指定的整体（或组件）或整体（或组件）群，但是不排除任何其他的整体（或组件）或整体（或组件）群。
[0070] 除非本文另有明确规定，否则单数形式“一个”包括复数形式。
[0071] 所使用的术语“包括”指的是“包括但不局限于”。“包括”和“包括但不局限于”可交换使用。
[0072] “患者”、“受试者”或“个体”可交换使用且指的是人类或非人类的动物。这些术语包括
哺乳动物，例如人类，灵长类动物，
家畜动物（例如，
牛、猪），伴侣动物（例如，狗、猫）以及啮齿动物（例如，小鼠和大鼠）。
[0073] 如本文所使用的，对照受试者指的是未被诊断患有所分析的疾病或病症的任何个体。术语“正常对照”，“健康对照”以及“未患病细胞”同样指的是取自未患有所分析的疾病或病症的来源（例如受试者、对照受试者、细胞系）的样品（例如，细胞、血清、组织），因此其可用于确定所分析的疾病或病症的基线。还应该理解的是对照受试者、正常对照以及健康对照包含获得的并可用作标准的数据，即，其可反复使用（针对多个不同受试者）。换句话说，例如，当将受试者样品与对照样品进行比较时，从对照样品获得的数据可在不同组试验中获得，例如，其可为从大量健康受试者获得的且不是当时（获得受试者数据）所实际获得的平均值。
[0074] 本文所使用的术语“诊断”指的是方法，技术人员可借助该方法评估和/或确定患者是否患有指定的疾病或病症。技术人员通常在一个或多个诊断指标的
基础上进行诊断，例如，标记物的存在，不存在，数量或数量变化（表明病症的存在，严重性，或不存在）。
[0075] 本文所使用的术语“预后”用在这里指的是疾病或病症进展的可能性，包括疾病或病症的复发。
[0076] 就所有目的而言，所公开的
国际申请PCT/US2009/031395以参考的方式并入本文。
[0077] 有关本发明方法的描述
[0078] 本发明提供了通过比较无细胞体液和取自相同个体的非吞噬细胞之间的，或无细胞体液和取自相同个体的吞噬细胞（不含已吞噬的细胞或血液细胞组分）（即，DNA含量为2n的吞噬细胞）之间的与疾病或病症相关的标记物（例如，核酸，蛋白质，脂质，碳水化合物，代谢产物）的谱（例如，基因/蛋白质/脂质/碳水化合物表达谱，基因型，基因拷贝数，基因量，DNA甲基化等），诊断或辅助诊断疾病或病症的方法。
[0079] 本发明还提供了评估发展疾病或病症的风险、预测所述疾病、监测所述疾病的进展或衰退、评估治疗效果或确定能改善或治疗所述疾病或病症的化合物的方法。
[0080] 所述的受试者特异性谱之间的比较消除了对从人口衍生出的平均值谱（针对特定疾病或病症）的依赖性（可对受试者特定疾病或病症的检测或诊断产生误差）。本发明方法可针对个体进行个性化的检测、诊断和治疗。
[0081] 本发明方法（i）具有高特异性、敏感性和准确性并可检测存在于体液样品、细胞或组织中的疾病或病症特异性标记物；以及（ii）消除已知发生在个体之间的“基线差异”（由于内在（例如，年龄、性别、种族背景、健康状况等等）和暂时的标记物表达变化）。因此，在某些方面，本发明提供了用于疾病或病症早期检测（即在可通过常规诊断技术诊断出疾病之前，例如成像技术）的非侵入性检测方法，因此提供了与需求和对策（用于干预、
预防和治疗患有该疾病或病症的个体）相关的提高的决策的基础。
[0082] 可将本发明方法与任何熟知的诊断方法联合使用，例如，物理检查（physical inspection）、目视检查（visual inspection）、活检（
组织切片，biopsy）、扫描、组织检查、放射检查、成像、超声、利用市售
试剂盒、基因检测、免疫检测、体液分析或神经活动监测。
[0083] 在一些实施例中，所述的吞噬细胞为专业吞噬细胞，例如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、泡沫细胞、肥大细胞或嗜酸性细胞。在一些实施例中，所述的吞噬细胞为非专业吞噬细胞，例如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞或间质细胞。在其他实施例中，所述的吞噬细胞可为不同类型的吞噬细胞的混合物。可用于本发明的非吞噬细胞包括（但不局限于）T细胞、B细胞、裸细胞（null cells）、嗜碱粒细胞或其混合物。
[0084] 如本文所使用的，“=2n吞噬细胞”指的是DNA含量为2n的吞噬细胞。根据本发明，一些吞噬细胞不具有吞没的活的/垂死的（dying）/死亡的病变细胞或片段和/或存在于体液中的无细胞的疾病特异性的核酸、蛋白质、脂类和/或碳水化合物。该类吞噬细胞的DNA含量保持在2n。
[0085] 如本文所使用的，疾病或病症标记物的“谱”可广泛涉及与标记物相关的任何信息。该信息可以是定性的（例如，存在或不存在）或定量的（例如，水平、拷贝数或剂量）。在一些实施例中，标记物的谱可表明不存在该标记物。该谱可为核酸（例如，DNA或RNA）谱、蛋白质谱、脂质谱、碳水化合物谱、代谢产物谱或其组合。本文所使用的“标记物”一般指的是吞噬细胞中的可进行差异检测的分析物（且可指示疾病或病症的存在）。如果吞噬细胞中的分析物具有定量或定性差异，分析物可进行差异检测。
[0086] 本发明方法可适用于多种疾病或病症。
[0087] 本发明方法可适用于多种疾病或病症。示例性疾病或病症有心
血管疾病或病症，与肾相关的疾病或病症，与产前（prenatal）或妊娠相关的疾病或病症，神经（neurological）或神经精神性疾病（neuropsychiatric disease）或病症，与自身免疫或免疫相关的疾病或病症，癌症，传染性疾病或病症，线粒体疾病，
呼吸道-肠胃道疾病或病症，生殖性疾病或病症、眼科疾病或病症，肌肉-骨骼疾病或病症，或皮肤疾病或病症。
[0088] 如本文所使用的，术语“心血管疾病或病症”指的是可影响心脏或血管（动脉和静脉）系统的任何病症。示例性的心血管疾病包括（但不局限于）心肌梗塞、
冠状动脉疾病、经皮冠状动脉腔内
血管成形术（PTCA）、冠状动脉搭桥手术（CABG）、
再狭窄、动脉末梢疾病、中风、腹主动脉
动脉瘤、颅内动脉瘤、大动脉粥样硬化性中风、心原性中风、早发性心肌梗死、心
力衰竭、肺栓塞、急性冠状动脉综合征（ACS）、心绞痛、心脏肥大、动脉硬化、心内膜炎、心肌炎、全心炎、
高血压、充血性心力衰竭、动脉硬化、脑血管疾病、心脏病（declining cardiac health）、缺血性心脏病、心包炎、心原性休克、酒精性心肌疾病、先天性心脏病、缺血性心肌病、高血压性心肌病、瓣膜心肌病、
炎症性心肌病、继发于系统性代谢疾病的心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、失常性右室心肌病、限制性心肌病、内心肌病、
心脏瓣膜病、高血压心脏病、心肌缺血发作、不稳
定心绞痛、心肌断裂、心原性休克、栓塞、深部静脉血栓形成、
心律失常、致心律失常性右室心肌病、糖尿病性心肌病、二尖瓣返流、二尖瓣脱垂、外周血管疾病、动脉疾病、颈动脉疾病、深部静脉血栓形成、静脉疾病、脑血管疾病、动脉瘤、左心室肥大、高血压肾病、高血压性
视网膜病、血管炎、左主干病变、动脉血管疾病、静脉血管疾病、微循环血栓症、短暂的脑血管意外、肢体缺血、动脉瘤、血栓症、表面静脉血栓症以及深静脉血栓。
[0089] 如本文所使用的，术语“与肾相关的疾病或病症”指的是可影响肾脏或肾脏系统的任何疾病或病症。示例性的与肾相关的疾病包括（但不局限于）慢性肾脏疾病，原发性肾脏疾病，非糖尿病性肾脏疾病，血管球性肾炎，间质性肾炎，糖尿病性肾脏疾病，糖尿病性肾病，肾小球硬化症，急进性肾小球肾炎，肾脏纤维化，奥尔波特综合征，IDDM肾炎，系膜增生系肾小球肾炎，膜性增殖性肾小球肾炎，新月体性肾小球肾炎，肾间质性纤维变性，局灶节段性肾小球硬化，膜性肾病，微小病变型肾病，寡免疫复合物急进性肾炎，IgA肾病，多囊性肾疾病，Dent疾病，球形红细胞症，海曼肾炎，常染色体显性（成人）多囊性肾疾病，常染色体隐性（儿童）多囊性肾疾病，急性肾损伤，肾病综合征，肾缺血，足细胞疾病或障碍，蛋白尿，肾小球疾病，膜性肾小球肾炎，局灶性节段性肾小球肾炎，先兆子痫，子痫惊厥，肾脏损害，胶原血管疾病，良性体位性（体位）蛋白尿，IgM肾病，膜性肾病，结节病，糖尿病，由于药物造成的肾脏损伤，法布瑞氏病，氨基酸尿，Fanconi综合征，高血压肾硬化，间质性肾炎，镰状细胞病，血红蛋白尿，肌红蛋白尿，韦格内肉芽肿病，糖原累积症I型，慢性肾脏疾病，慢性肾功能衰竭，低肾小球滤过率（GFR），肾动脉硬化，狼疮肾炎，ANCA阳性寡免疫新月体肾小球肾炎，慢性移植性肾病，中毒性肾损害，肾毒性，肾脏坏死，肾损伤，肾小球和肾小管损伤，肾脏功能障碍，肾脏综合征，急性肾功能衰竭，慢性肾功能衰竭，近端管功能障碍，急性肾移植排斥，慢性肾移植排斥，非IgA系膜增生性肾炎，感染后肾小球肾炎，任何种类的肾脏血管炎，任何遗传性肾脏疾病，任何间质性肾炎，肾移植失败，肾癌，伴随有其他病症（例如，高血压、糖尿病、
自身免疫性疾病）的肾疾病，Dent氏病，球形红细胞增多症，海曼肾炎，原发性肾脏疾病，塌陷性肾小球病，致密物沉积病，冷球蛋白血症相关性肾炎，Henoch-Schonlein疾病，传染后肾小球肾炎，细菌性心内膜炎，显微镜下多血管炎，Churg-Strauss综合征，抗肾小球基底膜抗体介导的肾小球肾炎，
淀粉样变性，单克隆免疫球蛋白沉积病，纤维性肾小球肾炎，免疫触须样肾小球病，缺血性肾小管损伤，药物引起的肾小管间质性肾炎，毒性肾小管间质性肾炎，感染性肾小管间质性肾炎，细菌性肾盂肾炎，由多瘤
病毒感染或HIV感染导致的病毒感染性肾小管间质性肾炎，代谢诱导的小管间质疾病，混合性结缔组织病，管型肾病，由尿酸盐或
草酸盐或药物引起的结晶沉积导致的晶体肾病，急性细胞间质移植排斥，由淋巴瘤或移植后淋巴组织增生性疾病导致的肿瘤浸润性疾病，肾脏的阻塞性疾病，血管疾病，血栓性微血管病，肾动脉硬化，粥状栓塞性肾疾病，混合结缔组织病，结节性多动脉炎，
钙调
磷酸酶
抑制剂诱导的血管疾病，急性细胞血管移植排斥，急性体液移植排斥，早期肾功能衰竭（ERFD），终末期肾病（ESRD），肾静脉血栓形成，急性肾小管坏死，急性间质性肾炎，慢性肾脏疾病，肾动脉狭窄，缺血性肾病，尿毒症，药物和毒素诱导的慢性肾炎，返流性肾病，肾结石，古德帕斯丘综合征以及肾盂积水。
[0090] 如本文所使用的，术语“与产前或妊娠相关的疾病或病症”指的是影响孕妇、胚胎或胎儿的任何疾病、障碍或病症。与产前或妊娠相关的病症还可指由怀孕引起的相关或所出现（直接地或间接地）的任何疾病、紊乱或病症。这些疾病或病症可包括任何和所有的出生
缺陷，先天性病症，或遗传性疾病或病症。示例性的与产前或妊娠相关的疾病包括（但不局限于）恒河猴疾病，新生儿溶血病，β地中海贫血，性别确定障碍，妊娠确定障碍，遗传性孟德尔遗传紊乱，染色体畸变，胎儿染色体
单体型，8三体型，13三体型（帕陶综合征），16三体型，18三体型（爱德华氏综合征），21三体型（唐氏综合征），X染色体连
锁紊乱，X三体型（XXX综合征），X单体型（特纳综合征），XXY综合征，XYY综合征，XXXY综合征，XXYY综合征，XYYY综合征，XXXXX综合征，XXXXY综合征，XXXYY综合征，XXYYY综合征，脆性X综合征，胎儿生长受限，囊性纤维化，血红蛋白病，胎儿死亡，胎儿酒精综合征，镰状细胞性贫血，血友病，克氏综合症，dup(17)(p11.2p1.2)综合征，子宫内膜异位症，Pelizaeus-Merzbacher疾病，dup(22)(q11.2q11.2)综合征，猫眼综合征，猫叫综合征，沃尔夫-赫塞豪恩综合征，腓骨
肌萎缩症，压力易感性神经病，Smith-Magenis综合征，神经纤维瘤病，Alagille综合征，腭心面综合征，迪格奥尔格综合征，类固醇
硫酸酯酶缺乏症，Prader-Willi综合征，Kallmann综合征，眼球与线性皮肤缺损综合症，肾上腺发育不全，甘油激酶缺乏症，Pelizaeus-Merzbacher疾病，Y上的睾丸决定因子，无精子症（因子a），无精子症（因子b），无精子症（因子c），lp36缺失，苯丙
酮尿症，Tay-Sachs疾病，肾上腺增生，范科尼贫血，脊髓性肌萎缩，Duchenne型肌营养不良，亨廷顿氏病，肌强直营养不良，罗伯逊易位，Angelman综合征，结节性脑硬化，
共济失调毛细血管扩张症，开放性脊柱裂，神经管缺陷，腹壁缺损，小于胎龄儿，先天性巨细胞病毒，软骨发育不全，码方式综合症，先天性甲状腺功能衰退症，先天性弓形体病，生物素缺乏症，半乳糖血症，枫糖浆尿病，高胱氨酸尿，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症，结构性出生缺陷，心脏缺陷，四肢异常，畸形足，无脑畸形，无嗅脑畸形/前脑无裂畸形，脑积水，无眼畸形/小眼畸形，无
耳畸形/小耳畸形，大血管错位，法洛四联症，左心发育不全综合征，对
导管型主动脉缩窄，不含唇裂的腭裂，含或不含唇裂的腭裂，含或不含瘘的食道闭锁/狭窄，小肠闭锁/狭窄，肛管直肠闭锁/狭窄，尿道下裂，性别不清，肾发育不全，囊性肾，上肢内侧多指趾畸形，肢体短缩畸形，膈疝，失明，
白内障，视力问题，听力缺失，耳聋，X连锁肾上腺白质营养不良，Rett综合征，溶酶体障碍，脑瘫，
自闭症，无舌畸形，白化病，眼白化病，眼皮肤白化病，妊娠糖尿病，Arnold-Chiari畸形，CHARGE综合征，先天性膈疝，brachydactlia，无虹膜，裂足和裂手，异色症，Dwarnian耳，埃莱尔-当洛综合征，大疱性表皮松解症，哥尔罕疾病，Hashimoto氏综合征，胎儿水肿，肌
张力衰退，Klippel-Feil综合征，肌肉萎缩症，成骨不全症，早衰，Smith Lemli Opitz综合征，色盲，X连锁淋巴组织疾病，脐突出，腹裂畸形，先兆子痫，子痫惊厥，早产，流产，宫内生长延迟，异位妊娠，妊娠剧吐，孕妇晨吐，或可能性地成功引产。
[0091] 如本文所使用的，术语“神经或神经精神性疾病或病症”指的是影响神经系统的任何疾病或病症。示例性的神经或神经精神性疾病或病症包括（但不局限于）头部外伤，中风，中风、缺血性中风，出血性中风，蛛网膜下腔出血，颅内出血，内部短暂性脑缺血发作，血管性痴呆，皮质基底神经节变性，脑炎，
癫痫，Landau-Kleffner综合征，脑积水，假性脑瘤，丘脑疾病，脑膜炎，骨髓炎，
运动障碍，特发性震颤，脊髓疾病，脊髓空洞症，阿尔茨海默氏症（早发型），阿尔茨海默症（晚发型），多发脑梗塞性痴呆，匹克病，亨廷顿氏病，
帕金森病，帕金森综合征，痴呆，额颞叶痴呆，皮质基底节变性，多系统萎缩，进行性核上性麻痹，路易体病，Creutzfeldt-Jakob疾病，Dandy-Walker综合征，
弗里德赖希共济失调，Machado-Joseph疾病，偏头痛，
精神分裂症，
情绪障碍和抑郁，路易体痴呆（DLB），额颞叶性痴呆（FTD），多种形式的血管性痴呆（VD），皮层下血管痴呆（Binswanger氏病），自闭症，发育障碍，运动神经元疾病，肌萎缩侧索硬化症（ALS），神经元或脑损伤，大脑缺
氧，大脑性麻痹（CP），记忆障碍，运动障碍，皮质基底神经节退化症，多种形式的多系统萎缩，与中风相关的疾病，脑血管意外，照射后癫痫性脑病，血管性帕金森症，丘脑脑血管意外，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，与酒精相关的痴呆，词义性痴呆，共济失调，非典型帕金森症，肌张力障碍，进行性核上性麻痹，特发性震颤，轻度
认知障碍，肌萎缩侧索硬化症，多发性硬化症，神经病变，匹克病，嗜刚果红淀粉样血管病，Creutzfeldt-Jakob疾病，
艾滋病痴呆综合征，
抑郁症，
焦虑症，恐惧症，面部神经麻痹，癫痫，脑炎，神经肌肉疾病，神经肿瘤疾病，脑部肿瘤，神经血管紊乱，神经免疫疾病，神经系统疾病，神经创伤（包括脊髓损伤），
疼痛（包括神经性疼痛），儿科神经和神经障碍，
睡眠障碍，杜尔雷斯综合征，皮质基底神经节变性，与酒精相关的痴呆，语义性痴呆，与多梗死性痴呆结合的阿尔茨海默病，与路易体痴呆结合的阿尔茨海默病，与路易体痴呆结合的帕金森氏病，与路易体痴呆结合的阿尔茨海默病和帕金森氏病，与慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病结合的额颞叶痴呆，注意缺陷多运动障碍，精神分裂症，
强迫症，智力迟钝，
自闭症谱系障碍，视性眼阵挛-肌阵挛综合征（OMS）发作，发音障碍，
学习障碍（即，阅读或运算），口头或表现能力缺失，多动症，淀粉样疾病，阮蛋白病，Tau病变，α-突触核蛋白病，上瘾状态（例如，由可卡因、尼古丁、酒精、事物、迷幻药、阿拉伯茶、咖啡因、鸦片、海洛因、大麻、安非他命、
冰毒或
赌博中的至少一个造成的上瘾状态），以及法布瑞氏病。
[0092] 如本文所使用的，术语“与自身免疫或免疫相关的疾病或病症”指的是可影响免疫系统功能的任何疾病或病症。示例性的与自身免疫或免疫相关的疾病或病症包括（但不局限于）抗磷脂综合征，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，自身免疫性血管炎，
腹腔疾病，自身免疫性甲状腺炎，输血后免疫反应，母胎不兼容，输血反应，免疫缺乏症（例如，IgA缺乏症），常见的变异型免疫缺陷病，药物引起的红斑狼疮，糖尿病，I型糖尿病，II型糖尿病，青少年糖尿病，幼年型类风湿性关节炎，
银屑病关节炎，多发性硬化症，免疫缺陷，过敏，哮喘，过敏性皮炎，牛皮癣，过敏性
接触性皮炎，慢性皮肤疾病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，化疗引起的损伤，移
植物抗宿主病，骨髓移植排斥反应，强直性脊柱炎，过敏性湿疹，天疱疮，Behcet氏病，慢性疲劳综合征纤维肌痛，化疗引起的损伤，重症肌无力，肾小球肾炎，过敏性视网膜炎，系统性硬化症，亚急性皮肤红斑狼疮，皮肤红斑狼疮（包括冻疮红斑狼疮），Sjogren综合征，自身免疫性肾炎，自身免疫性血管炎，自身免疫性
肝炎，自身免疫性心肌炎，自身免疫性脑炎，自身免疫介导的血液系统疾病，lc-SSc（肢端型硬皮病），dc-SSc（弥漫型硬皮病），自身免疫性甲状腺炎（AT），Grave氏病（GD），重症肌无力，多发性硬化症（MS），强直性脊柱炎，移植排斥反应，免疫衰老，风湿病/自身免疫性疾病，混合的结缔组织疾病，脊椎关节病，牛皮癣，牛皮癣关节炎，肌炎，硬皮病，皮肌炎，自身免疫性血管炎，混合结缔组织病，特发性血小板减少性紫癜，Crohn氏病，人类佐剂病，骨关节炎，青少年慢性关节炎，脊椎关节病，特发性炎性肌病，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性血小板减少症，甲状腺炎，免疫介导的肾脏疾病，中枢或周围神经系统的脱髓鞘疾病，特发性脱髓鞘多神经病，Guillain-Barre综合征，慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆疾病，感染性或自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎，硬化性胆管炎，炎症性肠病，谷胶敏感性肠病，Whipple氏病，自身免疫或免疫介导的皮肤疾病，大疱性皮肤疾病，多形性红斑，过敏性鼻炎，过敏性皮炎，食物过敏，荨麻疹，肺部免疫疾病，嗜酸性肺炎，特发性肺纤维化，过敏性肺炎，与移植相关的疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病，银屑病关节炎，牛皮癣，皮炎，多发性肌炎/皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，系统性硬皮症和硬化症，与炎症性肠病相关的反应，Crohn氏病，溃疡性结肠炎，呼吸窘迫综合征，成人呼吸窘迫综合征（ARDS），脑膜炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，过敏性疾病，湿疹，哮喘，涉及T细胞渗透和慢性炎症反应的病症，动脉粥样硬化，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺乏症，变应性脑脊髓炎，与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和延发型超敏反应相关的免疫反应，肺结核，结节病，肉芽肿病（包括Wegener氏肉芽肿），粒细胞缺乏症，血管炎（包括ANCA），再生障碍性贫血，戴-布二氏贫血，免疫溶血性贫血（包括自身免疫性溶血性贫血（AIHA）），恶性贫血，纯红细胞再生障碍性贫血（PRCA），因子VIII缺乏症，血友病A，自身免疫性中性粒细胞减少症，
全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，中枢神经系统（CNS）炎性疾病，多器官损伤综合征，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，过敏神经炎，Bechet疾病，Castleman氏综合征，Goodpasture氏综合征，Lambert-Eaton肌无力综合征，Reynaud氏综合征，Sjorgen氏综合征，Stevens-Johnson综合征，大疱性类天疱疮，天疱疮，自身免疫性聚内分泌，Reiter氏病，僵人综合征，巨细胞性动脉炎，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多发性神经病或IgM介导的神经病变，特发性血小板减少性紫癜（ITP），血栓性血小板减少性紫癜（TTP），自身免疫性血小板减少症，睾丸和卵巢的自身免疫性疾病（包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎），原发性甲状腺功能不足，自身免疫性内分泌疾病（包括自身免疫性甲状腺炎），慢性甲状腺炎（Hashimoto氏甲状腺炎），亚急性甲状腺炎，特发性甲状腺功能衰退，Addison氏病，Grave氏病，自身免疫性多腺体综合征（或多腺体内分泌失调综合征），Sheehan氏综合征，自身免疫性肝炎，淋巴间质性肺炎（HIV），闭塞性细支气管炎（非移植）-NSIP，Guillain-Barre氏综合征，大血管炎（包括风湿性多肌痛和巨细胞（Takayasu氏）动脉炎），中血管炎（包括Kawasaki氏疾病和结节性多动脉炎），强直性脊柱炎，Berger氏疾病（IgA肾病），快速进行性肾小球肾炎，原发性胆汁性肝硬化，乳糜性口炎性腹泻（非热带性口炎性腹泻），冷球蛋白血症，以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）。
[0093] 如本文所使用的，术语“癌症”指的是各种类型的
恶性肿瘤，其中大部分可侵入周围组织，且可转移至不同
位置（例如，见PDR医药字典，第一版（1995），其全部内容以引用的方式并入本文）。术语“瘤”和“肿瘤”指的是异常生长的组织，其细胞内增殖速率快于正常增殖速率且当引起增殖的刺激物移除后，仍继续增长。同上，该异常组织显示出部分的或完全的缺乏结构组织和与正常组织的功能协调，其可为良性（即，良性肿瘤）或恶性（即，恶性肿瘤）。一般类别的癌症示例包括（但不局限于）癌（即，来源于上皮细胞的恶性肿瘤，例如常见的
乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌），肉瘤（即，来源于结缔组织或间质细胞的恶性肿瘤），淋巴瘤（即，来源于造血细胞的恶性肿瘤），白血病（即，来源于造血细胞的恶性肿瘤），生殖细胞肿瘤（即，来源于全能细胞的肿瘤。在成年人中最常见于睾丸或卵巢中；在胎儿、婴儿和幼儿中最常见于身体中线上，尤其是尾椎骨顶端），急性肿瘤（即，类似于不成熟或胚胎组织的典型恶性肿瘤）等等。涵盖于本发明的瘤类型示例包括（但不局限于）那些与神经组织癌症、血液形成组织癌症、乳腺癌、皮肤癌、骨骼癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、子
宫颈癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、免疫系统癌症、头部和颈部癌症、结肠癌、胃癌、支气管癌和/或肾脏癌相关的瘤。
[0094] 如本文所使用的，术语“感染因子（传染剂，infectious agent）”包括（但不局限于）致病生物（例如，病毒、细菌、
真菌、寄生物、传染性蛋白质等等。
[0095] 病毒包括（但不局限于）DNA或RNA动物病毒。如本文所使用的，RNA病毒包括（但不局限于）病毒家族如微小核糖核酸病毒科（例如，脊髓灰质炎病毒），呼肠孤病毒科（例如，轮状病毒），披膜病毒科（例如，脑炎病毒、黄热病病毒、风疹病毒），正粘病毒科（例如，流感病毒），副粘病毒科（例如，呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒），弹状病毒科（例如，狂犬病病毒），冠状病毒，本扬病毒科，黄病毒科，纤丝病毒科，沙粒病毒科，本扬病毒科和逆转录病毒科（例如，人T细胞白血病病毒（HTLV），人免疫缺陷病毒（HIV））。如本文所使用的，DNA病毒包括（但不局限于）病毒家族，如乳多空病毒科（例如，
乳头状瘤病毒），腺病毒科（例如，腺病毒），疱疹病毒科（例如，单纯疱疹病毒）以及痘病毒科（例如，
天花病毒）。
[0096] 细菌包括（但不局限于）革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，抗酸细菌等等。
[0097] 如本文所使用的，革兰氏阳性细菌包括（但不局限于）放线菌，伊氏放线菌，炭疽芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌，肉毒杆菌，肉毒杆菌，艰难梭状芽孢杆菌，产气荚膜梭菌，破伤风梭菌，棒状杆菌属，粪肠球菌，单核细胞增生李斯特氏菌，诺卡氏菌属，痤疮丙酸杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，
变形链球菌，肺炎链球菌等等。
[0098] 如本文所使用的，革兰氏阴性菌包括（但不局限于）猫抓阿菲波菌，拟杆菌属，杆菌状巴尔通氏体，百日咳杆菌，伯氏疏螺旋体，回归热包柔氏螺旋体，布氏杆菌属，肉芽肿荚膜杆菌，弯曲杆菌属，大肠埃希杆菌，土拉热弗朗西丝氏菌，
阴道加德纳菌，埃及嗜血杆菌，杜克雷氏嗜血杆菌，流感嗜血杆菌，幽
门螺旋杆菌，嗜肺军团菌，肾脏钩端螺旋体，脑膜炎奈瑟氏菌，
牙龈卟啉单胞菌，斯氏普罗威登斯菌，
铜绿假单胞菌，沙门肠炎杆菌，伤寒沙门氏菌，灵杆菌，波伊德氏志贺氏菌，念珠状链杆菌，酿脓链球菌，梅毒密螺旋体，霍乱弧菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌等等。
[0099] 如本文所使用的，抗酸细菌包括（但不局限于）
鸟分枝杆菌，麻风分枝杆菌，结核分支杆菌等等。
[0100] 如本文所使用的，不涵盖在另外三类中的其他细菌包括（但不局限于）汉氏巴尔通体，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体，贝氏柯克斯体，肺炎支原体，小蛛立克次氏体，普氏立克次体，立克氏立克次氏体，恙虫病立克次体，地方性斑疹伤寒立克次氏体，解脲脲原体，肺炎链球菌，卡氏埃利希体，粪肠球菌，脑膜炎球菌等等。
[0101] 如本文所使用的，真菌包括（但不局限于）曲霉菌，念珠菌，白念珠菌，粗球孢子菌，隐球菌属以及其组合。
[0102] 如本文所使用的，寄生微生物包括（但不局限于）结肠小袋纤毛虫，小隐孢子虫，环孢子球虫，脑胞内原虫属，痢疾变形虫，比氏肠胞虫，肠兰伯式鞭毛虫，利什曼原虫，疟原虫，刚地弓形虫，锥虫，梯形变形虫等等。
[0103] 如本文所使用的，寄生物包括虫（例如，蠕虫），特别是寄生虫，包括但不局限于
线虫类（蛔虫，如鞭虫、钩虫、蛲虫、丝虫等等），绦虫类（例如，绦虫）。
[0104] 如本文所使用的，“治疗”疾病或病症指的是采取措施，以获得有益或所需的疗效，包括临床疗效。有益或所需的临床疗效包括（但不局限于）与疾病或病症相关的一个或多个症状的缓解或改善。
[0105] 如本文所使用的，利用本领域内那些技术人员所熟知的多种方法中的其中一个，将化合物或药剂“给予”至受试者。例如，可通过静脉内、动脉、皮内、肌内、腹膜内、皮下、眼睛、舌下、口服（通过摄入）、鼻内（通过吸入）、椎管内、脑内以及经皮（通过吸收，例如通过皮肤导管），进行化合物或药剂
给药。还可通过可再负载的（rechargeable）或生物可降解的
聚合物装置或其他装置，例如塞片或
泵，或可延长、减缓或受
控释放化合物或药剂的制剂，引入化合物或药剂。还可进行例如一次，多次，和/或通过一个或多个延长时间的给药。在一些方面，给药既包括直接给药，包括自我给药，还包括间接给药，包括开药方。例如，如本文所使用的，指导患者进行自我给药或间接给药和/或为患者提供药物
处方的医生将药物给予患者。在一些实施例中，通过口服进行化合物或药剂给药，例如，通过摄取（ingestion）将药物给予受试者，或通过静脉给药，例如，通过注射将药物引入受试者。在一些实施例中，通过口服给药的化合物或药剂可采用延长释放或缓慢释放的制剂，或者利用可用于该缓慢或延长释放的装置进行给药。
[0106] 在某些实施例中，相比非吞噬细胞，用于本发明方法的标记物在无细胞体液中被上调或激活。在某些实施例中，相比非吞噬细胞，用于本发明方法的标记物在无细胞体液中被下调或抑制。在某些实施例中，相比=2n的吞噬细胞，用于本发明方法的标记物在无细胞体液中被上调或激活。在某些实施例中，相比=2n的吞噬细胞，用于本发明方法的标记物在无细胞体液中被下调或抑制。不同疾病或病症与不同标记物的上调（或激活）或下调（或抑制）相关。如本文所使用的，“上调”可指表达水平（例如，基因表达或蛋白质表达）、基因拷贝数、基因量以及标记物其他的定性或定量可检测状态的增加。相似地，“下调”可指表达水平（例如，基因表达或蛋白质表达）、基因拷贝数、基因量以及标记物其他的定性或定量可检测状态的降低。如本文所使用的，“激活”可指标记物的激活状态，例如，磷酸化状态，DNA甲基化状态或DNA乙酰化状态。同样地，“抑制”可指标记物的抑制或非活化状态，例如，去磷酸化状态，泛素化状态，DNA去甲基化状态。
[0107] 在某些实施例中，本发明方法还可包括从无细胞体液中提取或富集标记物。此处可利用任何已知的提取或富集方法。在某些实施例中，本发明方法还可包括在确定多个谱之前，实施下述步骤中的至少一个步骤：i）裂解非吞噬细胞或=2n的吞噬细胞；ii）从裂解的非吞噬细胞或=2n吞噬细胞中提取出细胞内容物。此处可利用任何熟知的细胞裂解和提取方法。在某些实施例中，所述的无细胞体液包含多种类型的已吞没（engulfed）物质，例如，活的病变细胞，死亡的病变细胞，凋亡的病变细胞，循环肿瘤细胞，感染因子，胎儿细胞，滋养层细胞，或其片段。在某些实施例中，无细胞体液中存在疾病或病症的至少一个或多个标记物。在某些实施例中，非吞噬细胞或=2n吞噬细胞的细胞内容物中不存在标记物。
[0108] 在某些实施例中，本发明方法进一步包括将疾病或病症特异性标记物的已确定差异与本领域内熟知的至少一个标记物的库进行比较。该比较可进一步证实疾病或病症的存在。在某些实施例中，所已知标记物的库可通过数据挖掘获得。本文所使用的术语“数据挖掘（data mining）”指的是从
数据库的已知数据发现新的数据模型、关系或相关性并在以后提取出切实可用的信息的方法。通常地，通过对基于计算机的系统进行数据训练（train），实施数据挖掘，例如，对输入数据进行归类并随后利用新的输入数据，根据
训练数据，做出决策。这些系统包括（但不局限于）
专家系统，
模糊逻辑，非线性回归分析，多元分析（multivariate analysis），
决策树分类器（decision tree classifier）以及贝叶斯信念网络（Bayesian belief network）。
[0109] 在某些实施例中，无细胞体液来自体液样品。示例性的体液样品可为全血、尿液、
粪便、唾液、淋巴液、脑脊髓液、滑液、囊液、腹水、胸腔积液、从妊娠头三个月的孕妇获得的液体、从妊娠中三个月的孕妇获得的液体、从妊娠后三个月的孕妇获得的液体、母体血液、
羊水、绒毛膜绒毛样品、源自着床前胚胎的液体、母体尿液、母体唾液、胎盘样品、胎儿血液、灌洗和子宫颈阴道液（lavage and cervical vaginal fluid）、细胞间液（interstitial fluid），或者眼液。在一些实施例中，通过本领域内的熟知方法，从体液样品中分离出细胞，例如提取、离心以及过滤，获得无细胞体液样品。
[0110] 在某些实施例中，=2n吞噬细胞或非吞噬细胞分离自白细胞。在某些实施例中，=2n吞噬细胞分离自吞噬细胞群。
[0111] 在某些实施例中，在分离液体（通过静脉或动脉穿刺，然后通过提取血液、组织活检、
支气管肺泡灌洗、鼻灌洗、眼睛灌洗、腹膜腔灌洗、阴道灌洗、膀胱灌洗、直肠灌洗、脊髓液细针抽吸、滑液抽吸等等获得）的非细胞部分（例如，通过离心）后，获得包含DNA含量为2n的细胞的组织或液体样品。在分离液体（通过静脉或动脉穿刺，然后通过提取血液、组织活检、支气管肺泡灌洗、鼻灌洗、眼睛灌洗、腹膜腔灌洗、阴道灌洗、膀胱灌洗、直肠灌洗、脊髓液细针抽吸、滑液抽吸等等获得）的细胞部分（例如，通过离心）后，获得无细胞体液。
[0112] 在本发明方法中，利用细胞分离/隔离/纯化方法，从受试者的体液样品、细胞或组织中分离出细胞群。技术人员可利用任何熟知的细胞分离/隔离/纯化技术，从体液中分离出=2n吞噬细胞或非吞噬细胞。示例性的细胞提取/分离/隔离技术包括（但不局限于）使用抗体，流式细胞术，荧光激活细胞分选，过滤，梯度离心，洗脱，微流控，磁分离技术，荧光磁分离技术，纳米结构，量子点，高通量显微镜基平台（high throughput microscope-based plateform），或其组合。
[0113] 在本文所述方法的某些方面，被描述其谱的分析物包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、
代谢物，或其任何组合。在本文所述方法的某些方面，标记物包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物，或其任何组合。如本文所使用的，术语“核酸”意在包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA），RNA分子（例如，mRNA），DNA-RNA杂合体，以及利用核酸类似物形成的DNA或RNA类似物。所述的核酸分子可为核苷酸、寡核苷酸、双链DNA、单链DNA、多链DNA、互补DNA、基因组DNA、非编码DNA、信使RNA（mRNA）、微RNA（miRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、小干扰RNA（siRNA）、不均一核RNA（hnRNA），或小发夹RNA（shRNA）。
[0114] 如本文所使用的，术语“氨基酸”包括含有基本氨基基团和酸性羧基基团的有机化合物。该术语包括天然氨基酸（例如，L氨基酸）、修饰的和不寻常氨基酸（例如，D-氨基酸和β-氨基酸），以及在生物学上已知以游离或组合形式出现（通常不出现于蛋白质中）的氨基酸。天然蛋白质所存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、
色氨酸、脯氨酸以及缬氨酸。天然的非蛋白质氨基酸包括精氨基
琥珀酸、瓜氨酸、半胱氨酸硫酸、3,4-二羟基苯基丙氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、3-单碘酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、3,5,5-三碘甲腺原氨酸、以及3,3',5,5'-四碘甲腺原氨酸。修饰的或不同寻常的氨基酸包括D-氨基酸，羟基赖氨酸，4-羟基脯氨酸，N-苄氧羰基-保护的氨基酸，2,4-二氨基丁酸，高精氨酸，正亮氨酸，N-甲基氨基丁酸，
萘基丙氨酸，苯基甘氨酸，α-苯基脯氨酸，叔亮氨酸，4-氨基环己基丙氨酸，N-甲基-正亮氨酸，3,4-脱氢脯氨酸，N,N-二甲基氨基甘氨酸，N-甲基氨基甘氨酸，4-氨基哌啶-4-
羧酸，6-氨基己酸，反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸，2-、3-和4-(氨基甲基)-苯
甲酸，1-氨基环戊烷羧酸，1-氨基环丙烷羧酸，以及2-苄基-5-氨基戊酸。
[0115] 如本文所使用的，术语“肽”包括由两个或更多个氨基酸（通过肽键相连）组成的化合物。肽具有的分子量可小于10,000道尔顿，小于5,000道尔顿或小于2,500道尔顿。术语“肽”还包括含有肽和非肽（例如假肽或类肽的残基或其他非氨基酸组分）组分的化合物。含有肽和非肽组分的该类化合物还可称为“肽类似物”。
[0116] 如本文所使用的，术语“蛋白质”包括由氨基酸（排列成直链并通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基基团间的肽键相连）组成的化合物。用于本发明方法的蛋白质包括（但不局限于）氨基酸、肽、抗体、抗体片段、细胞因子、脂蛋白或糖蛋白。
[0117] 如本文所使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体，单克隆抗体（包括全长的抗体（具有免疫球蛋白Fc区域）），具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体（例如，双特异性抗体），双抗体，单链分子，以及抗体片段（例如，Fab或F(ab')2以及Fv）。有关不同类别的抗体的结构和性能见Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw编著的Basic and Clinical Immunology，第八版，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第六章，第71页。
[0118] 如本文所使用的，术语“细胞因子”指的是分泌蛋白或活性片段或其突变体（调节免疫系统的细胞活性）。示例性的细胞因子包括（但不局限于）白细胞介素、干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、免疫细胞前体的集落刺激因子等等。
[0119] 如本文所使用的，术语“脂蛋白”包括带负电荷的组合物（包含被两性分子的磷脂（与游离的胆固醇和载脂蛋白结合）表
面层包围的疏水性胆甾醇酯和甘油三酸酯核心）。脂蛋白的特征在于其
密度（例如，极低密度的脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）以及高密度脂蛋白（HDL）），由它们的大小、脂质和蛋白质的相对量决定。脂蛋白的特征还在于存在或不存在特定修饰（例如，氧化、乙酰化或
糖化）。
[0120] 如本文所使用的，术语“糖蛋白”包括具有一个或多个低聚糖或多糖（共价连接至肽或蛋白质）的糖苷。示例性的糖蛋白可包括（但不局限于）免疫球蛋白，主要组织相容性复合物的成员，
胶原蛋白，粘蛋白，糖蛋白IIb/IIIa，糖蛋白-41（gp41）以及糖蛋白-120（gp12），卵泡刺激性激素，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein），红细胞生成素，转
铁蛋白，碱性磷酸酶以及凝集素。
[0121] 如文本所使用的，术语“脂质”包括合成的或天然存在的化合物（一般为两性分子并为生物可相容的）。脂质一般包含亲水组分和疏水组分。示例性的脂质包括（但不局限于）脂肪酸，中性脂肪，磷脂，胆固醇，胆固醇酯类，甘油三酸酯，糖脂类，甘油酯类，甘油磷脂，神经鞘脂类，甾醇脂类，异戊烯醇脂类（prenol lipids），糖脂类，聚酮类，胆碱甘油磷脂，
乙醇胺甘油磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，溶血胆碱甘油磷脂，溶血乙醇胺甘油磷脂，磷脂酸，溶血磷脂酸，神经鞘磷脂，半乳糖基神经酰胺，葡糖苷脂酰鞘氨醇，硫脂类，
游离脂肪酸，前列腺素，三酰甘油，二酰甘油，单酰甘油，酰基辅酶A，酰基肉碱，氧化固醇，神经酰胺，心磷脂，鞘氨基醇碱-1-磷酸酯，鞘氨醇，溶血神经鞘氨酯，神经节苷脂，缩
醛磷脂，硫脂，神经酰胺，低密度脂蛋白（LDL），极低密度脂蛋白（very low density lipoproteins，VLDL），高密度脂蛋白（HDL），鞘氨基醇碱-1-磷酸酯或其衍生物。
[0122] 如本文所使用的，术语“碳水化合物”包括（但不局限于）含有氧、氢和碳
原子的化合物，通常为（CH2O）n，其中n为整数。示例性的碳水化合物包括（但不局限于）单糖、双糖、多糖或低聚糖。
[0123] 如本文所使用的，术语“代谢物”包括用于代谢的任何分子。代谢物可为代谢过程中的产物、底物或中间物（中间体）。该术语包括初级代谢物、次级代谢物、有机代谢物，或无机代谢物。代谢物包括（但不局限于）氨基酸、肽、酰基肉碱、单糖、脂质和磷脂、前列腺素、羟基花生四烯酸、羟基十八碳二烯酸、类固醇、胆汁酸，以及糖脂和磷脂。示例性的代谢物可为神经鞘脂类、糖苷神经鞘脂类、鞘氨醇、神经酰胺、神经鞘磷脂、神经鞘氨醇磷胆碱、二氢神经鞘氨醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸、缩醛磷脂酰胆碱（plasmenylphoshatidylcholine）、缩醛磷脂酰胆碱、蛋白质氨基酸，丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、非对称性二甲基精氨酸、对称性二甲基精氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、硝基酪氨酸、羟基脯氨酸、犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、非蛋白氨基酸、鸟氨酸、瓜氨酸、酰基肉碱类、肉碱、游离的肉碱、碱基肉碱、羟基酰基肉碱、二羧基酰基肉碱、还原性单糖、己糖、戊糖、脱氧己糖、肌酸酐、肌氨酸、亚精胺、精胺、腐胺、多巴胺、血清素、前列腺素、羟基花生四烯酸、羟基十八碳二烯酸、白三烯、血栓素、胆汁酸、甾醇类、胆固醇、维生素和辅助因子、药物，以及药物代谢物。
[0124] 在本发明的一些实施例中，将疾病或病症的至少一个或多个标记物的谱进行比较。该比较可以是定量的或定性的。可利用本文所述的任一测定方法进行定量测定。例如，测序、直接测序、随机鸟枪测序、Sanger双脱氧链终止测序（Sanger dideoxy termination sequencing）、全基因组测序、借助杂交测序、焦磷酸测序（pyrosequencing）、毛细管电泳、凝胶电泳、双重测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行
信号测序（massively parallel signature sequencing）、乳液PCR、借助可逆的染料终止（reversible dye terminator）测序、双末端测序、近期测序（near-term sequencing）、核酸外切酶测序、连接法测序、短读测序（short-read sequencing）、单分子测序、合成法测序、实时测序、反向终止测序（reverse-terminator sequencing）、纳米孔测序、454测序、Solexa基因组分析仪测序、 测序、MS-PET测序、质谱分析、基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱、电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）质谱、表面增强激光
解吸电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱、四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱、
大气压光离子质谱（APPI-MS）、傅里叶变换质谱（FTMS）、基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换
离子回旋共振（MALDI-FT-ICR）质谱、二次离子质谱（SIMS）、
聚合酶链反应（PCR）分析、定量PCR、实时PCR、荧光测定、比色测定、
化学发光测定，或其组合。
[0125] 定量比较可包括统计分析，例如T检验、ANOVA、Krustal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney以及比值比（odds ratio）。定量差异可包括谱之间的标记物水平的差异或者谱之间所存在的标记物的数量的差异，以及其组合。示例性的标记物水平可以是（不具有限制性）基因表达水平、核酸水平、蛋白质水平、脂质水平等等。定性差异可包括（但不局限于）激活和失活，蛋白质降解，核酸降解，以及共价修饰。
[0126] 在本发明的某些实施例中，谱为核酸谱、蛋白质谱、脂质谱、碳水化合物谱、代谢物谱，或其组合。所述谱可被定性或定量测定。
[0127] 核酸谱可以是（不具有限制性）基因型谱、单核苷酸多型性谱、基因突变谱、基因拷贝数谱、DNA甲基化谱、DNA乙酰化谱、染色体剂量谱、基因表达谱，或其组合。
[0128] 核酸谱可由本领域内熟知的检测基因型、单核苷酸多态性、基因突变、基因拷贝数、DNA甲基化状态、DNA乙酰化状态、染色体量的任何方法进行确定。示例性方法包括（但不局限于）聚合酶链反应（PCR）分析、测序分析、电泳分析、限制性片段长度多态性（RFLP）分析、Northern印迹分析、定量PCR、逆转录酶-PCR分析（RT-PCR）、等位基因特异性寡核苷酸杂交分析、比较基因组杂交、异源双链泳动分析（heteroduplex mobility assay，HMA）、单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、RNA酶错配分析、质谱分析、
串联质谱分析、基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱、电喷雾电离（ESI）质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱、四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱、大气压光离子质谱（APPI-MS）、傅里叶变换质谱（FTMS）、基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换离子回旋共振（MALDI-FT-ICR）质谱、二次离子质谱（SIMS）、
表面等离子体共振、Southern印迹分析、原位杂交、荧光原位杂交（FISH）、发色原位杂交（chromogenic in situ hybridization，CISH）、免疫组织化学（IHC）、微阵列、比较基因组杂交、染色体组型分析、多重连接探针扩增法（MLPA）、短荧光片段的定量多重PCR（QMPSF）、显微镜分析、甲基化特异性PCR（MSP）测定、由连接介导PCR的HpaII小片断富集（HELP）分析、
放射性醋酸标记分析、比色DNA乙酰化分析、与微阵列结合的染色质免疫沉淀（ChIP-on-chip）分析、限制性标记基因组扫描、甲基化DNA免疫沉淀法（MeDIP）、针对DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的分子击穿光检测、色谱分离、甲基化敏感的限制酶分析、将非甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶的重亚
硫酸盐驱动转换法、甲基结合PCR分析，或其组合。
[0129] 如本文所使用的，术语“测序”用于广泛含义且该术语指的是本领域内所熟知的可确定至少部分核酸中的至少一些连续核苷酸的顺序（包括但不局限于延伸产物或载体插入中的至少一部分）的任何技术。示例性测序技术包括直接测序、随机鸟枪测序、Sanger双脱氧链终止测序、全基因组测序、借助杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双重测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行信号测序、乳液PCR、借助可逆的染料终止测序、双末端测序、近期测序、核酸外切酶测序、连接法测序、短读测序、单分子测序、合成法测序、实时测序、反向终止测序、纳米孔测序、454测序、Solexa基因组分析仪测序、 测序、MS-PET测序、质谱分析，以及其组合。在一些实施例中，测序包括利用仪器，检测测序产物，例如但不局限于ABI 377DNA测序仪，ABI 310,3100,3100-Avant,3730,或3730xI基因分析仪，ABI
TM
3700DNA分析仪，或Applied Biosystems SOLiD 系统（所有均来自Applied Biosystems），Genome Sequencer20System（Roche Applied Science），或质谱仪。在某些实施例中，测序包括高通量测序技术，例如但不局限于大规模平行信号测序（MPSS）。
[0130] 在本发明的进一步实施例中，蛋白谱可为蛋白质表达谱，蛋白质激活谱，或其组合。在一些实施例中，蛋白质激活谱可包括确定磷酸化状态，泛素化状态，豆蔻酰化状态，或蛋白质构象状态。
[0131] 可利用本领域内熟知的任何方法（用于检测蛋白质表达水平、蛋白质磷酸化状态、蛋白质泛素化状态、蛋白质豆蔻酰化状态，或蛋白质构象状态），检测蛋白质谱。在一些实施例中，利用免疫组织化学测定、酶联
免疫吸附测定（ELISA）、原位杂交法、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、质谱法、串联质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱、电喷雾电离（ESI）质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱、四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱、大气压光离子质谱（APPI-MS）、傅里叶变换质谱（FTMS）、基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换离子回旋共振（MALDI-FT-ICR）质谱、二次离子质谱（SIMS）、放射
免疫测定、显微镜测定、基于微流控芯片的测定、
表面等离子共振技术、测序、蛋白印迹检测或其组合，确定蛋白质谱。
[0132] 在本发明的一些实施例中，可通过色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、质谱法、串联质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱、电喷雾电离（ESI）质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱、四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱、大气压光离子质谱（APPI-MS）、傅里叶变换质谱（FTMS）、基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换离子回旋共振（MALDI-FT-ICR）质谱、二次离子质谱（SIMS）、放射免疫测定、基于微流控芯片的测定、荧光检测、化学发光检测或其组合，确定脂质谱。用于分析生物样品中的脂质含量的进一步方法为本领域内所熟知的（例如，见Kang等人,(1992)Biochim.Biophys.Acta.1128:267；Weylandt等人,(1996)Lipids31:977；J.Schiller等人,(1999)Anal.Biochem.267:46；Kang等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:4050；Schiller等人,(2004)Prog.Lipid Res.43:499）。其中一个示例性脂质分析方法是从生物样品中提取出脂质（例如，利用氯仿-甲醇（2:1，体积/体积），包含0.005%丁基化羟基
甲苯（BHT，作为抗
氧化剂）），制备脂肪酸甲基酯（例如，利用14%的三氟化
硼-甲醇试剂），然后对脂肪酸甲基酯进行定量测定（例如，通过HPLC、TLC，通过气相色谱-质谱（利用市售的气相色谱、质谱和/或气相色谱/质谱组合））。通过将多个分析的脂肪酸的区域与固定浓度的内部标准的区域进行比较，确定脂肪酸的质量。
[0133] 在本发明一些实施例中，通过色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、质谱法、串联质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱、电喷雾电离（ESI）质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱、四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱、大气压光离子质谱（APPI-MS）、傅里叶变换质谱（FTMS）、基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换离子回旋共振（MALDI-FT-ICR）质谱、二次离子质谱（SIMS）、放射免疫测定、基于微流控芯片的测定、荧光检测、化学发光检测或其组合，确定碳水化合物谱。
[0134] 在本发明一些实施例中，通过色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、质谱法、串联质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱、电喷雾电离（ESI）质谱、表面增强激光解吸电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱、四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱、大气压光离子质谱（APPI-MS）、傅里叶变换质谱（FTMS）、基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换离子回旋共振（MALDI-FT-ICR）质谱、二次离子质谱（SIMS）、放射免疫测定、基于微流控芯片的测定、荧光检测、化学发光检测或其组合，确定代谢物谱。
[0135] 如本文所使用的，不同谱（由本发明方法检测的）之间的“差异”可指不同的基因拷贝数，不同DNA、RNA、蛋白质、脂质或碳水化合物的表达水平，不同的DNA甲基化状态，不同的DNA乙酰化状态以及不同的蛋白质修饰状态。所述差异可大于1倍。在一些实施例中，所述差异为1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或者10倍差异。在一些实施例中，差异为1-10、2-10、5-10、10-20或10-100倍之间的任何倍数差异。
[0136] 检测标记物的一般测定原则包括在合适条件下制备样品或包含标记物（例如，DNA、RNA、蛋白质、多肽、碳水化合物、脂质、代谢物等中的一个或多个）的反应混合物以及探针，然后保持足够长时间，使标记物和探针发生相互作用并结合，从而在反应混合物中形成可移除和/或检测的复合物。这些测定可以多种方式进行。
[0137] 例如，其中一个实施该测定的方法包括将标记物或探针锚定至固相
支撑物（也称为底物）上，然后在反应末期，检测锚定在固相上的目标标记物/探针复合物。在该方法的一个实施例中，可将从受试者获得的样品（将被检测标记物的存在和/或浓度）锚定至载体或固相支撑物上。在另一个实施例中，可能存在相反情况，其中可将探针锚定在固相上并将受试者样品作为测定的未锚定组分进行反应。
[0138] 已确定一些将测定组分锚定至固相的方法。这些包括（不具有限制性）标记物或探针分子（借助生物素和链酶亲和素的结合进行固定）。这些生物素化的测定组分可通过生物素-NHS（N-羟基-琥珀酰亚胺）进行制备（利用本领域内的熟知技术（例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemical，Rockford，IL）），然后固定在链霉亲和素涂覆（包被）的96孔板（Pierce Chemical）的小孔中。在某些实施例中，可预先制备并储存具有固定的测定组分的表面。
[0139] 用于该测定的其他合适载体或固相支撑物包括可结合该类分子（标记物或探针属于该类分子）的任何材料。熟知的支撑物或载体包括（但不局限于）玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性
纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩以及
磁铁矿。
[0140] 为了借助上述方法实施测定，将未固定的组分添加至其上锚定了所述第二组分的固相。反应完成后，可在适当的条件下，去除未复合的组分（例如，通过冲洗），以保持所形成的任何复合物固定在固相上。可采用本文所述的许多方法，完成锚定在固相上的标记物/探针复合物的检测。
[0141] 在某些示例性实施例中，可借助本文所述的可检测标记（其为本领域内每个技术人员所熟知的），对探针（当其为未锚定的测定组分时）进行标记（以便检测和测定的读取（直接地或间接地））。
[0142] 还可直接地检测出标记物/探针复合物的形成（不需要进一步处理或标记任一组分（标记物或探针）），例如通过利用荧光
能量转移技术（例如见美国专利No.5,631,169和4,868,103）。根据激发（借助具有合适
波长的入射光），选择第一个“供体”分子上的荧
光标记，其发射的荧光能量被第二个“受体”分子上的荧光标记吸收，转而使“受体”分子能发出荧光（由于吸收的能量）。交替地，“供体”蛋白分子可简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同光波长的标记，使得“受体”分子的标记区别于“供体”分子的标记。由于标记之间的能量转移的效率与分子分开的距离有关，所以可对分子之间的空间关系进行评估。在一种情况（其中结合发生在分子之间）中，在测定中，“受体”分子的标记的荧光发射应该最大。FET结合事件可通过标准的荧光检测装置（本领域内所熟知的，例如利用荧光剂）方便地测得。
[0143] 在另一个实施例中，可以不标记测定的组分（探针或标记物）（利用技术，例如实时生物分子相互作用分析（BIA）），测定探针识别标记物的能力（例如，见Sjolander,S.和Urbaniczky,C,1991,Anal.Chem.63:23382345以及Szabo等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699705）。如本文所使用的，“BIA”或“
表面等离子体共振”是研究生物特异性相互作用（实时）的技术，其不需要标记任一相互作用物（例如，BIAcore）。结合表面（指示结合事件）上的质量变化导致表面附近的光的折射率发生改变（表面等离子体共振（SPR）的光学现象），从而产生可检测信号（其可指示生物分子之间的实时反应）。
[0144] 可选地，在另一个实施例中，可借助标记物和探针（作为液体相中的溶质）进行类似的诊断和预后分析。在该测定中，利用许多标准技术中的任一技术，包括但不局限于：差速离心法（differential centrifugation）、色谱法、电泳以及免疫沉淀，从未复合的组分中分离出复合的标记物和探针。在差异离心法中，由于复合物的沉降平衡（根据其不同大小和密度）不同，可通过一系列的离心步骤，将标记物/探针复合物从未复合的测定组分中分离出（例如，见Rivas和Minton(1993)Trends Biochem.Sci.18:284）。还可利用标准色谱技术，从未复合的分子中分离出复合分子。例如，凝胶过滤色谱法（根据大小分离分子），以及通过利用合适的凝胶过滤
树脂（采用柱形式），例如从相对较小的未复合组分中分离出相对较大的复合物。同样地，可利用标记物/探针复合物的相对不同的电荷性质（相对于未复合的组分），从未复合的组分中区分出复合物，例如，通过利用离子交换色谱树脂。所述的树脂和色谱技术是本领域内的每个技术人员所熟知的（例如，见Heegaard(1998)J.Mol.Recognit.11:141；Hage 和 Tweed(1997)J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.12:499）。还可利用凝胶电泳，从未结合的组分中分离出复合的测定组分（例如，见Ausubel等人,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,19871999）。在该技术中，例如根据大小或电荷，分离出蛋白质或核酸复合物。为了保持电泳过程中的结合相互作用，一般优选非变性的凝胶基质材料以及缺乏还原剂的环境。用于特定测定的合适环境以及其组分是本领域内的每个技术人员所熟知的。
[0145] 在某些示例性实施例中，通过原位和/或体外形式确定存在于生物样品中的与标记物相对应的mRNA的水平（利用本领域熟知的方法）。许多表达检测方法使用了分离的RNA。对于体外方法而言，可利用不与mRNA分离相冲突的任何RNA分离技术，纯化出血细胞中的RNA（例如，见Ausubel等人,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York19871999）。另外，可利用本领域内那些技术人员所熟知的技术轻易地对大量的细胞和/或样品进行加工处理，例如Chomczynski的单步RNA分离方法（1989，美国专利No.4,843,155）。
[0146] 可将分离的mRNA用于杂交或扩增试验（包括但不局限于Southern或Northern分析，聚合酶链反应分析以及探针阵列）。在某些示例性实施例中，用于检测mRNA水平的诊断方法包括将分离的mRNA与可杂交至所检测基因编码的mRNA的核酸分子（探针）进行接触。核酸探针可为（例如）全长的cDNA或其一部分，例如在长度上至少具有7、15、30、50、100、
250或500个核苷酸的寡核苷酸，并且其可在严格的条件下，足以特异性地杂交至mRNA或基因组DNA（编码本发明标记物）。用于本发明诊断测定的其他合适探针如本文所述。mRNA与探针的杂交表明正在表达所述的标记物。
[0147] 在一种形式中，将mRNA固定在固体表面上并将其与探针接触（例如，通过在琼脂糖凝胶上操作分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移至膜，例如消化纤维）。在可选择的形式中，将所述探针固定在固体表面上并使mRNA与探针接触，例如采用
基因芯片阵列。技术人员可轻易地对检测本发明标记物所编码的mRNA的水平的熟知mRNA检测方法做出改变。
[0148] 确定样品中与本发明标记物相对应的mRNA水平的可选择方法包括核酸扩增步骤，例如通过RT-PCR（其实验性实施例如在美国专利No.4,683,195和4,683,202中描述），COLD-PCR（Li等人,(2008)Nat.Med.14:579），连接酶连锁反应（Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189），自持续的序列复制（Guatelli等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874），转录扩增系统（Kwoh等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173），Q-β复制酶（Lizardi等人,(1988)Bio/Technology6:1197），滚环复制（美国专 利No.5,854,033）或任何其他的核酸扩增方法，然后利用本领域内的那些技术人员所熟知的技术，检测扩增的分子。这些检测方法尤其适用于检测以极低数量存在的核酸分子。如本文所使用的，扩增引物定义为一对核酸分子，其可
退火至基因的5'或3'区域（分别为正链和负链，或者相反）并且其之间还包含短的区域。通常地，扩增引物的长度为约10至30个核苷酸并且其侧接长度为约50至200个核苷酸的区域。当在合适条件并借助合适试剂时，该引物可扩增包含核苷酸序列（由引物所侧接）的核酸分子。
[0149] 对于原位方法而言，在检测前，不需要将mRNA从样品（例如，体液（如血细胞））分离出。在该方法中，利用熟知的
组织学方法制备/加工细胞或组织样品。然后，将所述样品固定在支撑物（通常为
载玻片）上，再将其与可杂交至编码标记物的mRNA的探针接触。
[0150] 在可根据标记物的绝对表达水平做出确定的选择性方法中，可根据标记物的标准化表达水平进行确定。通过校正标记物的绝对表达水平（通过将它的表达与不为标记物的基因（例如，可组成型表达的持家基因）的表达进行比较），使表达水平标准化。用于标准化的合适基因包括持家基因，例如肌动蛋白基因，或者上皮细胞特异性基因。该标准化可将源自一个来源的患者样品的表达水平与源自另一个来源的患者样品的表达水平进行比较，例如，将源自个体的噬血细胞与源自个体的非噬血细胞进行比较。
[0151] 在本发明的一个实施例中，检测了与标记物相对应的蛋白质或多肽。在某些实施例中，用于检测蛋白质或多肽的试剂可为能结合至多肽的抗体，例如具有可检测标记的抗体。如本文所使用的，与探针或抗体相关的术语“标记的”意包括通过将可检测的物质偶联（即，物理连接）至探针或抗体，对探针或抗体进行直接标记，以及通过与直接标记的另一个药剂反应，对探针或抗体进行间接标记。示例性的间接标记包括利用荧光标记的二抗检测一抗并借助生物素对DNA探针进行末端标记，使得可借助荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可利用完整抗体或其片段（例如，Fab或F(ab')2）。在一种形式中，在方法中使用了抗体或抗体片段，例如，检测所表达的蛋白质的Western印迹或免疫荧光技术。在该使用中，一般优选将抗体或蛋白质固定在固体支撑物上。合适的固相支撑物或载体包括能结合抗原或抗体的任何支撑物。熟知的支撑物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩、磁铁矿等等。
[0152] 可利用多种形式，确定样品是否包含结合至指定抗体的蛋白质。示例性的形式包括（但不局限于）竞争性和非竞争性免疫分析、酶免疫测定（EIA）、放射免疫测定（RIA）、抗原捕捉测定、双抗体夹心测定、Western印迹分析、酶联免疫吸收测定（ELISA）、平面阵列（planar array）、比色测定、化学发光测定、荧光测定等等。本发明方法使用了包含放射免疫测定和酶联免疫测定的免疫测定法。技术人员可轻易地对用于确定细胞（例如，体液细胞如血细胞）是否表达本发明标记物的蛋白质/抗体的熟知检测方法做出改变。
[0153] 本领域内的每个技术人员熟知用于结合抗体或抗原的许多其他的合适载体，并可对本发明所使用的这些载体做出变化。例如，可将从细胞（例如，体液细胞如血细胞）中分离出的蛋白质用于聚丙烯酰胺凝胶电泳并可将其固定在固相支撑物上，例如硝化纤维。利用合适的缓冲液对该支撑物进行冲洗，然后利用可检测标记的抗体对其进行处理。再利用所述缓冲液对固相支撑物进行第二次冲洗，去除未结合的抗体。然后，通过传统方法检测固体支撑物上所结合的标记数量。
[0154] 在某些示例性实施例中，提供了用于诊断、预后、评估发展疾病的风险，评估治疗效果，监测疾病的进展和衰退以及确定可改善或治疗疾病的化合物的方法。有关这些方法的示例性方法包括从测试的受试者获得体液样品并将该体液样品与可检测疾病或病症的一个或多个标记物（例如，核酸标记物如mRNA、基因组DNA，肽标记物如多肽或蛋白质，脂质标记物如胆固醇或者代谢物标记物如肌酸酐）的化合物或试剂接触，从而在生物样品中检测标记物的存在。在一个实施例中，用于检测mRNA或基因组DNA标记物的试剂为标记的核酸探针，其可杂交至mRNA或基因组DNA标记物。核酸探针可为（例如）全长的核酸标记物或其一部分。用于本发明诊断测定的其他合适探针如本文所述。
[0155] 如本文所述的，可改善或治疗疾病或病症的化合物可包括（但不局限于）能改善症状或预后，阻止疾病或病症发展，促进疾病或病症衰退，或者消除疾病或病症的任何物质。
[0156] 还可利用本发明方法检测基团标记物中的基因变化，从而确定具有改变的基因的受试者是否具有发展癌症和/或感染因子相关的疾病和/或病症，和/或一个或多个本文所述的其他病症（其特征在于在蛋白质标记物的活性或核酸表达中的错误调节（misregulation），例如癌症）的风险。在某些实施例中，所述方法包括检测源自受试者的无细胞体液样品中是否存在基因变化（其特征在于变化会影响编码肽标记物和/或基团标记物的基因的完整性）。例如，可通过确定下述中的至少一个的存在检测出所述的基因变化：1）一个或多个基因标记物缺失一个或多个核苷酸；2）一个或多个基因标记物附加一个或多个核苷酸；3）一个或多个基因标记物具有取代的一个或多个核苷酸；4）一个或多个基因标记物发生染色体重新排列；5）一个或多个基因标记物的信使RNA的转录产物的水平发生变化；6）一个或多个基因标记物发生异常修饰，例如基因组DNA的甲基化形式；7）一个或多个基因标记物的信使RNA的转录产物存在非野生型剪接形式；8）一个或多个蛋白质标记物具有非野生型水平；9）一个或多个基因标记物发生等位基团缺失；以及10）一个或多个蛋白质标记物发生不恰当的翻译后修饰。如本文所述的，在本领域内，具有许多可用于检测一个或多个基因标记物变化的熟知测定方法。
[0157] 在某些实施例中，检测所述变化包括将探针/引物用于聚合酶链反应（PCR）（例如，见美国专利No.4,683,195，4,683,202和5,854,033），例如实时PCR，COLD-PCR（Li等人,(2008)Nat.Med.14:579)，锚定PCR，递归PCR（recursive PCR）或RACE PCR，或可替换地，将探针/引物用于连接酶链式反应（LCR）（例如，见Landegran等人,(1988)Science241:1077；Prodromou 和 Pearl(1992)Protein Eng.5:827；以 及 Nakazawa 等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:360），后者特别适用于检测基因标记物中的点突变（见Abravaya等人,(1995)Nucleic Acids Res.23:675）。该方法可包括收集源自受试者的无细胞体液样品，从样品中分离出核酸（例如，基因组、mRNA或两者），将核酸样品与在合适条件下可特异性杂交至基因标记物的一个或多个引物接触（从而进行基因标记物（如果存在）的杂交和扩增），以及检测扩增产物是否存在，或者检测扩增产物的大小并将其长度与对照样品的长度进行比较。据预期，将PCR和/或LCR用作初步扩增步骤是可取的（结合任一用于检测本文所述突变的技术）。
[0158] 可选择的扩增方法包括：自持续序列复制（Guatelli等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874），转录扩增系统（Kwoh等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173），Q-β复制酶（Lizardi等人,(1988)Bio-Technology6:1197），或者任何其他的核酸扩增方法，然后再利用本领域内那些技术人员所熟知的技术，检测扩增的分子。这些检测方法尤其适用于检测核酸分子（如果这类核酸分子以极低数量存在）。
[0159] 在可替换的实施例中，可通过限制性酶切类型的变化确定一个或多个基因标记物（源自样品）的突变。例如，分离出样品DNA和对照DNA，可选地，对其进行扩增，利用一个或多个限制性内切酶对其进行切割，然后通过凝胶电泳确定片段的长度大小，并进行比较。样品DNA和对照DNA的片段的长度大小差异表明样品DNA发生了突变。另外，还可利用序列特异性核酶（例如，见美国专利No.5,498,531）对存在的特定突变进行计算（通过开发或删除核酶裂解位点）。
[0160] 在其他实施例中，可通过将样品核酸和对照核酸（例如，DNA或RNA）杂交至包含成千上万寡核苷酸探针的高密度阵列，确定本文所述的一个或多个标记物的基 因 突 变（Cronin 等 人,(1996)Human Mutation7:244;Kozal et al.(1996)Nature Medicine2:753）。例如，通过含有光生成的DNA探针（如上Cronin,M.T.等人中所述）的二维阵列，确定核酸标记物的基因突变。简单而言，可利用探针的第一杂交阵列扫描通过样品和对照中的DNA长链段，通过产生连续重叠探针的线性阵列，确定序列之间的碱基变化。该步骤可鉴定点突变。在该步骤之后，利用可表征特定突变的第二杂交阵列（利用与所检测的全部变异或突变互补的较小的专业探针序列）。每个突变阵列由平行的探针集组成，其中一个与野生型基因互补且其他的与突变基因互补。
[0161] 仍在另一个实施例中，可利用本领域内熟知的多个测序反应中的任一测序反应直接对基因标记物进行测序，并通过将样品基因标记物的序列与对应的野生型（对照）序列进行比较，检测突变。示例性的测序反应包括根据Maxam和Gilbert（(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:560)或Sanger（(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463）所开发技术的那些测序反应。还应该考虑到，当实施诊断测定（(1995)Biotechniques19:448）时，可使用多种自动化测序方法中的任一方法，包括质谱测序（例如，见PCT International Publication No.WO94/16101；Cohen 等 人 ,(1996)Adv.Chromatogr.36:127-162；以 及 Griffin 等人,(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38:147）。
[0162] 其他的用于检测基因标记物中的突变的方法包括利用酶切保护试剂检测RNA/RNA或RNA/DNA杂交双链中的错配碱基（Myers等人,(1985)Science230:1242）。通常地，通过提供杂交双链（通过杂交包含野生型标记物序列（具有潜在的突变RNA或DNA）（来源于组织样品）的（标记的）RNA或DNA形成）引发“错配裂解”技术。利用能裂解双链中的单链区域的试剂（例如，当对照链和样品链之间存在碱基对错配时）对该双链进行处理。例如，利用核糖核酸酶对RNA/DNA双链进行处理并利用S1核酸酶对DNA/DNA杂合体进行处理，利用酶裂解错配区域。在其他实施例中，可利用羟胺或四氧化锇以及利用哌啶对DNA/DNA或RNA/DNA双链进行处理，以裂解错配区域。在裂解错配区域后，在变性的聚丙烯酰胺凝胶上，根据大小，分隔最终材料，以确定突变位置。例如，见Cotton等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4397；Saleeba等人,(1992)Methods Enzymol.217:286。在一个实施例中，可对对照的DNA或RNA进行标记，以便检测。
[0163] 仍在另一个实施例中，在错配裂解反应中，利用了可识别双链DNA中的错配碱基对的一个或多个蛋白质（所谓的“DNA错配修复”酶）（在用于检测和比对cDNA标记物（源于细胞样品）中的点突变所定义的系统中）。例如，大肠杆菌的mutY酶在G/A错配时裂解A且HeLa细胞的胸腺嘧啶DNA糖苷酶在G/T错配时裂解T（Hsu等人,(1994)Carcinogenesis15:1657）。根据示例性实施例，将依据于标记物序列（例如，野生型标记物序列）的探针杂交至cDNA或其他的DNA产物（源自测试细胞）。利用DNA错配修复酶对双链进行处理，并通过电泳等，检测裂解的产物（如果存在）。例如见美国专利No.5,459,039。
[0164] 在其他实施例中，利用电泳迁移率的变化确定基因标记物中的突变。例如，可利用单链构象多态性（SSCP）检测突变型核酸和野生型核酸之间的电泳迁移率差异（Orita等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2766，还可见Cotton(1993)Mutat.Res.285:125；以及Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9:73）。样品核酸标记物和对照核酸标记物的单链DNA片段发生变性并可进行复性。根据序列，单链核酸的二级结构发生变化，最终的电泳迁移率的变化可检测单个碱基的变化。可利用标记的探针对DNA片段进行标记或检测。
可通过利用RNA（而不是DNA），提高测定的敏感性，其中二级结构对发生序列变化更敏感。
在一个实施例中，根据电泳迁移率的变化，所述方法利用异源双链分析法，分离双链的异源双链分子（Keen等人,(1991)Trends Genet.7:5）。
[0165] 仍在另一个实施例中，利用变性梯度凝胶电泳（DGGE），测定含有梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的突变片段或野生型片段的运动（Myers等人,(1985)Nature313:495）。当利用DGGE进行分析时，需对DNA进行修饰，以确保其不会完全变性，例如通过添加富含高熔GC的DNA的GC钳（GC clamp）（大约40bp）（通过PCR）。在进一步实施例中，利用
温度梯度替代变性梯度，从而确定对照DNA和样品DNA的迁移率的差异（Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys.Chem.265:12753）。
[0166] 其他的用于检测点突变的技术的示例包括（但不局限于）选择性寡核苷酸杂交，选择性扩增或选择性引物延伸。例如，制备寡核苷酸引物，其中主要发生已知的突变，然后在仅允许杂交的条件下，将其杂交至靶DNA（如果发现完美匹配）（Saiki等人,(1986)Nature324:163；Saiki等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6230）。当将寡核苷酸连至杂交
薄膜并借助标记的靶DNA进行杂交时，该等位基因特异性寡核苷酸被杂交至PCR扩增的靶DNA或许多不同突变。
[0167] 可替换地，结合本发明，利用等位基因特异性扩增技术（取决于选择性PCR扩增）。在分子中心（使得扩增取决于差异杂交）（Gibbs等人,(1989)Nucl.Acids Res.17:2437）或一个引物的3’末端（其中在适当条件下，错配可阻止或减少聚合酶的延伸（Prossner(1993)Tibtech11:238）），用作特异性扩增的引物的寡核苷酸可携带所研究的突变。另外，理想地，在突变区域引入新的限制性位点，以创建以裂解为基础的检测（Gasparini等人,(1992)Mol.Cell Probes6:1）。据预期，在某些实施例中，还可利用用于扩增的Taq连接酶，进行扩增（Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189）。在这种情况下，仅在5’序列的3’末端发生连接（如果存在完美匹配），从而可检测特
定位点上的已知突变的存在（通过查找扩增的存在或不存在）。
[0168] 在一方面，本发明提供了确定疾病或病症的一个或多个标记物的方法，包括：a）确定源自患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定源自患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第二谱；确定所述第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中所述的第一组差异特指所述的第一谱相对于所述的第二谱的差异；b）确定源于不患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第三谱；确定源于不患有所述疾病或病症的对照受试者的非吞噬细胞中的分析物的第四谱；确定所述第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中所述的第二组差异特指所述的第三谱相对于所述的第四谱的差异；c）确定一个或多个分析物（特指所述的第一组差异相对于所述的第二组的差异），所确定的分析物为所述疾病或病症的标记物。可选地，该方法进一步包括d）获得被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；获得未被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确定所述第五谱和第六谱之间的第三组差异，其中所述的第三组差异特指所述的第五谱相对于所述的第六谱的差异；以及e）确定存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个标记物。
[0169] 仍在另一个方面，本发明提供了确定疾病或病症的一个或多个标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第二谱；确定所述第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中所述的第一组差异特指所述的第一谱相对于所述的第二谱的差异；b）确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第三谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的非吞噬细胞中的分析物的第四谱；确定所述第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中所述的第二组差异特指所述的第三谱相对于所述的第四谱的差异；c）确定一个或多个分析物（特指所述的第一组差异相对于所述的第二组差异的差异），所确定的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）获得被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；获得未被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确定所述第五谱和第六谱之间的第三组差异，其中所述的第三组差异特指所述的第五谱相对于所述的第六谱的差异；以及e）确定存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个。
[0170] 仍在另一方面，本发明提供了确定疾病或病症的一个或多个标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；通过数据挖掘，获得未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第二谱；确定所述第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中所述的第一组差异特指所述的第一谱相对于所述的第二谱的差异；b）确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第三谱；通过数据挖掘，获得未患有所述疾病或病症的对照受试者的非吞噬细胞中的分析物的第四谱；确定所述第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中所述的第二组差异特指所述的第三谱相对于所述的第四谱的差异；c）确定一个或多个分析物（特指所述的第一组差异相对于所述的第二组差异的差异），所确定的分析物为所述疾病或病症的标记物。可选地，该方法进一步包括d）通过数据挖掘，获得被所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；通过数据挖掘，获得未被所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确定所述第五谱和第六谱之间的第三组差异，其中所述的第三组差异特指所述的第五谱相对于所述的第六谱的差异；以及e）确定存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个。
[0171] 仍在另一个方面，本发明提供了确定疾病或病症的一个或多个标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定患有所述疾病或病症的受试者的非吞噬细胞中的分析物的第二谱；确定所述第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中所述的第一组差异特指所述的第一谱相对于所述的第二谱的差异；b）确定被患有所述疾病或病症的受试者的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第三谱；确定未被患有所述疾病或病症的受试者的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第四谱；确定所述第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中所述的第二组差异特指所述的第三谱相对于所述的第四谱的差异；c）确定存在于所述第一组差异和所述第二组差异二者中的一个或多个分析物，所确定的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第五谱；确定所述第一谱和第五谱之间的第三组差异，其中所述的第三组差异特指所述的第一谱相对于所述的第五谱的差异；以及e）确定存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个。
[0172] 仍在另一个方面，本发明提供了确定疾病或病症的一个或多个标记物的方法，包括：a）确定患有所述疾病或病症的受试者的无细胞体液样品中的分析物的第一谱；确定患有所述疾病或病症的受试者的=2n吞噬细胞中的分析物的第二谱；确定所述第一谱和第二谱之间的第一组差异，其中所述的第一组差异特指所述的第一谱相对于所述的第二谱的差异；b）确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的无细胞体液样品中的分析物的第三谱；确定未患有所述疾病或病症的对照受试者的=2n吞噬细胞中的分析物的第四谱；确定所述第三谱和第四谱之间的第二组差异，其中所述的第二组差异特指所述的第三谱相对于所述的第四谱的差异；c）确定一个或多个分析物（特指所述的第一组差异相对于所述的第二组差异的差异），所确定的分析物为所述疾病或病症的标记物。且可选地，该方法进一步包括d）获得被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第五谱；获得未被受试者（患有所述疾病或病症）的所述疾病或病症感染的细胞或组织中的分析物的第六谱；确定所述第五谱和第六谱之间的第三组差异，其中所述的第三组差异特指所述的第五谱相对于所述的第六谱的差异；以及e）确定存在于第三组差异中的c）的一个或多个标记物中的至少一个。
[0173] 检测分析物（例如，DNA，RNA，蛋白质，多肽，碳水化合物，脂质等等）（对应于生物样品中的本发明标记物）存在或不存在的示例性方法包括获得所测试的受试者的体液样品（例如，血液）并将该体液样品与能检测一个或多个标记物的化合物或药剂接触。在体外以及体内，利用本文所述的检测方法检测生物样品中的一个或多个标记物。例如用于检测mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测多肽（对应于本发明标记物）的体内技术包括酶联免疫吸附法（ELISA），Western印迹，免疫沉淀以及免疫荧光。用于检测基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。此外，用于检测多肽（对应于本发明标记物）的体内技术包括针对多肽，将标记的抗体直接引至受试者。例如，可利用放射性标记物（其在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术进行检测）对该抗体进行标记。因为每个标记物也是分析物，所以可利用检测标记物存在或不存在的本文所述的任何方法检测分析物的存在或不存在。
[0174] 用于本发明方法的标记物可包含以上确定的标记物中的任何一个标记物的任一突变。可对突变位点和序列进行确定，例如，通过该信息的数据库或库（repositories），例如人类基因突变数据库（www.hgmd.cf.ac.uk），单核苷酸多态性数据库（dbSNP，www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP），以及在线人类孟德尔遗传（OMIM），
网站（www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）。
[0175] 用于本发明方法的标记物可包括与疾病或病症相关的任何熟知的标记物。
[0176] 根据某些实施例，利用白细胞（WBC）亚群（分离自（例如）血液、尿液以及唾液）例如非吞噬白细胞、吞噬白细胞（不具有被吞噬/内在化的活的、垂死的或死亡的原核和真核细胞以及其片段）以及DNA含量为2n的白细胞（即，DNA指数=1），报告并排除所评估个体的内在基因组谱、蛋白质组谱、代谢物组谱、糖组谱、糖蛋白组谱、脂质组和/或脂蛋白组谱。确认患者的特异性标志（与所诊断的疾病、病理和/或病症无关）可确认和检测怀疑患有癌症或其他疾病或病症的个体的无细胞体液（例如，全血、血浆、血清、尿液、唾液、脑脊髓液、羊水、眼内液、鼻液、肺灌洗液、腹膜液、粪便、淋巴液等等）中的肿瘤/其他疾病/病症的特异性标志。因此，通过将无细胞体液（例如，全血、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊髓液、羊水、眼内液、鼻液、肺灌洗液、腹膜液、粪便、淋巴液）中存在的疾病或病症特异性标记物的谱与任何非吞噬白细胞或细胞（可通过非侵入性方法获得，例如从颊囊获得）或任何吞噬和/或非吞噬的白细胞或细胞（DNA指数为1）（可通过非侵入性方法获得，例如从颊囊获得）中存在的那些疾病或病症特异性标记物的谱进行比较，确认和检测患者特异性标记和肿瘤特异性标记、疾病特异性标记或病症特异性标记（在非吞噬细胞或任何白细胞和/或其他的体液细胞（DNA含量等于2，即DNA指数=1）中未表达、低表达的标记或在细胞（不与所诊断或检测的疾病或病症相关的细胞，即与个体的内在基因组、蛋白质组和表型遗传学谱相关的细胞）中表达的标记）。而且，可通过无细胞体液和非吞噬白细胞（DNA含量为2n）、任何白细胞（其DNA含量等于2，即DNA指数=1），或任何其他的哺乳动物细胞（可通过非侵入性方法获得，DNA含量为2n）的蛋白质表达谱，确定和检测液体中的肿瘤特异性、疾病特异性或病症特异性的蛋白质标记（在非吞噬细胞或任何白细胞和/或其他体液细胞（DNA含量等于2，即DNA指数=1）中未表达、低表达的标记，或者在细胞（不与所诊断或检测的疾病或病症相关的细胞，即与个体的内在基因组、蛋白质组和表型遗传学谱相关的细胞）中表达的标记）。此外，可通过无细胞体液和非吞噬白细胞（DNA含量为2n）、任何白细胞（其DNA含量等于2，即DNA指数=1）或任何其他的哺乳动物细胞（可通过非侵入性方法获得，DNA含量为2n）的脂质谱，确定和检测液体中的肿瘤特异性、疾病特异性或病症特异性的脂质标记（在非吞噬细胞或任何白细胞和/或其他体液细胞（DNA含量等于2，即DNA指数=1）中未表达、低表达的标记，或者在细胞（不与所诊断或检测的疾病或病症相关的细胞，即与个体的内在基因组、蛋白质组和表型遗传学谱相关的细胞）中表达的标记）。
[0177] 用于本发明方法的标记物可包括与疾病或病症相关的任何已知标记物。可用于本发明的标记物为明确表征为与特定疾病或病症相关的任何标记物，或通过本发明方法确定的任何标记物。
[0178] 在一些实施例中，所述标记物包括至少一个选自由AKT2，BAK1，EGFR，ERBB2，ETS2，FOS，JUN，MAP2K1，MMP2，PDGFB，RBI，SERPLNB2，SNCG以及SPP1组成的组的基因。在一些实施例中，一个或多个标记物包括至少一个选自由AKT1，AKT2，BAK2，CDC25A，E2F1，EGFR，ERBB2，FOS，JUN，MAP2K1，MMP2，NFKB1，PDGFB，PIK3R1，PNN，RBI，SERPINB2，SERPINB5，SNCG，SPP1，TERT，TIMP3以及TP53组成的组的基因。在一些实施例中，一个或多个标记物包括至少一个选自由CASP8，CASP9，COL18A1，ETS2，HTATIP2，MMP9，SRC以及TWIST1组成的组的基因。在一些实施例中，一个或多个标记物包括至少一个选自由AKT1，APAF1，ATM，CDC25A，CDKN1A，ETS2，FOS，IL8，ITGA4，ITGA6，ITGAV，JUN，MAP2K1，NFKBIA，PLAU，PLAUR，RAF1，SERPLNB2，SYK，TIMP1，TNF，TNFRSF10B以及TNFRSF1A组成的组的基因。在一些实施例中，所述标记物包括至少一个选自由ACP2，AK2，AKT3，ARL5B，ATP2B3，BGN，BRAF，BTG2，CAMKK2，CAPG，CAPN12，CPLX2，DENND5A，DNA2，FAM104A，FNIP1，GFRA4，GLUD1，GNAQ，GP1BB，HNRPLL，HOXA2，HPS3，LNPP4A，ITGAV，KLHL23，LANCL2，LYPD6，MAPKAPK3，MEF2A（包括EG:4205），MEF2C，NVL，PCYT1A，PGLYRP4，PLOD1，PPP1CB，PRKAB2，PROS1，PTPRE，RASA4（包括EG:10156），RBMS2，RBPJ，STAT5B，THBS1，TRIB1，TRIM2，TSPAN6以及ZDHHC21组成的组的基因。在一些实施例中，所述标记物包括至少一个选自由B4GALT5，BOP1，CCL2，CCL3，CCL3L1，CCRL2，CD83，CLEC4G，CLIC4，CTSC，CTSO，CXCL10，FCGR3A，FPR3，HBA1，HBB，LRMP，MAP1LC3B2，MS4A4A，MSR1，MYADML，NIDI，PF4，PION，RNF217，SAMD9L，SERPING1以及SPARC组成的组的基因。在一些实施例中，所述标记物包括至少一个选自由ACOT9，AMPD2，ARHGAP15，BATF2，C3AR1，C5orf41，CCL3，CCL3L1，CD63，CHST11，CHSY1，CLEC4G，CTSZ，CXorf21，CYTH4，CYTIP，DLEU2，DNAJA1，DOCK8，DTX3L，DUSP6，EPSTI1，ERF，F2RL1，FYB，GABRB2，GBP5，GLRX，GNB4，ICAM1，IFI35，IFIH1，IFNAR2，IL1R1，IRF1，ITGA5，LAP3，LAPTM5，LCP2，MAP1LC3B，MAP1LC3B2，MICAL2，MT1DP，MT1JP，MT1M，MT2A，MYADML，NEK6，NINJ2，NNMT，NT5C3L，NUB1，PDE4B，PLOD1，PML，PRKCB，PSMB9，RCN3，RGS4，RNASE6，RTP4，SAMD9L，SEL1L，SERPING1，SETX，SIGLEC10，SKIL，SLC7A7，SNORA21，SP100，SP110，SP140，SSFA2，STAT2，STK17B，STK3，TDRD7，TMCC1，TMPRSS11E2，TNFRSF1B，TPM1，TRIM21，TXNDC4，UBE2L6，UBE2W，USP18，VAV1，WARS，WIPF1以及WIPI1组成的组的基因。在一些实施例中，所述标记物包括至少一个选自由ADAR，ADM，ALAS1，ANKRD22，ARHGAP27，B3GNT5，BCL10，C12orf35，C15orf29，C2orf59，CD177，CEACAM1，CPEB2，DDX58，F2RL1，GDPD3，GNAI3，HIST2H3A，HIST2H3D，HIST2H4A，HMGCR，HSPA6，HSPC159，IL4R，IMPA2，KPNB1，KREMEN1，KRT23，LDLR，LOC100130904，LTB4R，MAEA，MARK2，MBOAT2，MPZL3，N4BP1，NBEAL2，NMI，NPEPPS，PARP14，PGM2，PPIF，PXN，RALBP1，ROD1，RPS6KA1，S100P，SERTAD2，SLC9A1，SLPI，SP110，SPINT1，ST14，TBC1D3，TNFRSF9，TRIM21，UPP1，VPS24，ZBTB34以及ZNF256组成的组的基因。
[0179] 在一些实施例中，可用于本发明方法的标记物（针对产前或妊娠相关的疾病或病症）包括例如美国专利7,655,399，7,651,838，6,660,477，6,172,198，5,594,637，5,514,598，6,258,540，6,664,056，7,235,359 和7,645,576，美 国 专 利 申 请 公 布
20090162842，20090155776，20070207466，20060019278，20040086864，20020045176，
20010051341，20020192642，20040009518，20040203037，20050282185，20060252071，
20070275402，20080153090，20090170102，20090061425，20020045176，20040137452，
20050164241，20060019278，20060252068，20060252071，20060257901，20070141625，
20070218469，20070275402，20090155776，20090162842，20090170102，20090317797，
20100120056，20100120076和20100137263以及国际专利申请公布WO/2006/026020，WO/2002/068685，WO/2005/111626，WO/2009/055487，WO/2009/001392和WO/2008/014516所公开的那些标记物。
[0180] 在一些实施例中，用于本发明方法的标记物（针对神经或神经精神疾病或病症）包括例如美国专利7,723,117，6,867,236，美国专利申请公布20060115854，20060115855，20060166283，20060234301，20060259990，20060259991，20070162983，20070264197，
20080026405，20080038730，20080051334，20080152589，20080220013，20080261226，
20080269103，20080286263，20090041862，20090239241，20090275046，20090318354，
20090324611，20100009352，20100021929，20100028356，20100055722，20100062463，
20100075891，20100105623，20100124756，20100159486，20100167937，20100169988，
20100167320，20100112587，20100098705，20100068705，20100009356，20090305265，
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20090274709，国际专利申请公布WO/2004/040016，WO/2004/071269，WO/2005/033341，WO/2005/052592，WO/2005/103712，WO/2005/114222，WO/2006/020269，WO/2006/048778，WO/2006/050475，WO/2006/061609，WO/2006/105907，WO/2006/133423，WO/2006/134390，WO/2007/098585，WO/2007/119179，WO/2008/010660，WO/2008/014314，WO/2008/028257，WO/2008/046509，WO/2008/046510，WO/2008/046511，WO/2008/046512，WO/2008/063369，WO/2008/085035，WO/2008/095261，WO/2008/100596，WO/2008/120684，WO/2008/125651，WO/2008/127317，WO/2008/132464，WO/2009/000520，WO/2009/001392，WO/2009/068591，WO/2009/074331，WO/2009/100131，WO/2010/005750，WO/2010/011506，WO/2010/019553，WO/2010/059242，WO/2010/061283，WO/2010/063009，WO/2010/066000，WO/2009/121152，WO/2009/121951，WO/2009/097450，WO/2009/092382，WO/2009/075579，WO/2009/058168，WO/2009/053523，WO/2009/034470，WO/2009/032722，WO/2009/014639，WO/2009/003142，WO/2010/041046，WO/2007/131345，WO/2008/003826以及WO/2009/07556所公开的那些标记物。
[0181] 在一些实施例中，用于本发明方法的标记物（针对心血管疾病或病症）包括例如美国专利7,670,769，7,445,886，7,432,107，7,157,235和7,009,038，美国专利申请公布 20100167320，20100112587，20100098705，20100068705，20100009356，20090305265，20100124746，20100092983，20070148661，20070141625，20100120050，20090155230 和
20090274709，以及国际专利申请公布WO/2009/121152，WO/2009/121951，WO/2009/097450，WO/2009/092382，WO/2009/075579，WO/2009/058168，WO/2009/053523，WO/2009/034470，WO/2009/032722，WO/2009/014639，WO/2009/003142，WO/2010/041046，WO/2007/131345，WO/2008/003826和WO/2009/075566所公开的那些标记物。
[0182] 在一些实施例中，用于本发明方法的标记物（针对肾相关的疾病或病症）包括例如美国专利7,488,584，7,459,280，7,294,465和7,662,578，美国专利申请公布20100143951，20100124746，20100120056，20100120041，20100081142，20090155230 和
20090239242，国际专利申请公布WO/2010/059996，WO/2010/054389，WO/2010/048347，WO/2010/048497，WO/2010/054167，WO/2010/048346，WO/2010/046137，WO/2010/025434，WO/2010/018185，WO/2010/012306，WO/2009/122387，WO/2009/083950，WO/2009/080780，WO/2009/060035，WO/2009/059259，WO/2008/154238，WO/2008/089936，WO/2008/084331，WO/2008/042012，WO/2007/131345，WO/2005/012907，WO/2004/024098，WO/2003/019193，WO/2007/112999，WO/2007/082733，WO/2006/073941，WO/2010/068686，WO/2010/022210和WO/2009/127644所公开的那些标记物。
[0183] 在一些实施例中，用于本发明方法的标记物（针对与自身免疫或免疫相关的疾病或病症）包括例如7,604,948，7,670,764，6,986,995和6,631,330，美国专利申请公布 20070141625，20090263474，20100075891，20100104579，20100105086，20100131286，20090176217，20090202469，20020119118，20090258025，20100137393，20100120629，
20090318392，20090196927，20090023166，20080227709，20080039402，20080026378，
20070224638，20070218519，20060210562，20050266432，20050164233，20050130245，
20090130683，20090110667，20090054321，20090023166和 20080274118，以 及 国 际 专利 申 请 公 布WO/2009/043848，WO/2010/053587，WO/2010/046503，WO/2010/039714，WO/2009/100342，WO/2009/053537，WO/2009/017444，WO/2008/156867，WO/2008/147938，WO/2008/129296，WO/2008/137835，WO/2008/082519，WO/2008/064336，WO/2008/043782，WO/2008/043725，WO/2007/047907，WO/2006/125117，WO/2006/114661，WO/2006/020899，WO/2005/114222，WO/2005/007836，WO/2004/076639，WO/2004/050704和WO/2001/014881所公开的那些标记物。
[0184] 本发明还提供了含有标记物检测试剂（检测由本发明方法所确定的标记物中的至少一个或多个）的试剂盒。本发明还提供了治疗或预防受试者疾病或病症的方法，包括将药剂（用于调节由本发明方法所确定的至少一个或多个标记物的活性或表达）给予所述受试者。
[0185] 应该理解所描述的本发明实施例仅仅是说明一些本发明原则的应用。根据本文的教导，在不偏离本发明真实精神和保护范围的情况下，本领域内的那些技术人员可对其做出许多
修改。
[0186] 下述实例为本发明的代表性示例。这些实例不应解释为限制本发明的保护范围，基于本公开、图示以及所附的
权利要求，这些和其他的等效实施例将是显而易见的。
[0187] 实例1
[0188] 从非吞噬细胞分离出DNA含量为2n的吞噬细胞的代表性方法I以及表达谱的分析
[0189] 1.将血液样品分离成血浆和包含白细胞样品的白细胞层（血沉棕黄层，buffy coat）。白细胞层接收含抗生物素蛋白的白细胞样品。
[0190] 2.将生物素化的抗体添加至非吞噬血细胞（例如，T细胞），然后将其加至小孔中，在室温下，孵育30分钟，冲洗小孔。
[0192] 4.加入白细胞血液样品。
[0193] 5.在37℃下孵育（30分钟-1小时）。
[0194] 6.吞噬细胞吞噬磁珠并将抗生物素蛋白-生物素-抗体结合至非吞噬细胞，将平板放在磁体顶端并进行冲洗（保留内在化磁珠的吞噬细胞以及与抗体结合的非吞噬细胞；冲去所有的其他细胞）。
[0195] 7.移去磁体并收集吞噬细胞，且将其分离成DNA等于2n的吞噬细胞以及DNA大于2n的吞噬细胞。DNA等于2n的非吞噬细胞和吞噬细胞指的是DNA含量等于2n的细胞。
[0196] 8.从血浆中分离出RNA，从DNA含量等于2n的吞噬细胞和非吞噬细胞中分离出RNA，制备cDNA、cRNA并利用其区分血浆基因谱（例如，全部的基因阵列和/或癌症基因阵列）与吞噬细胞和/或非吞噬细胞的基因谱。
[0197] 9.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出DNA，并确定选择性存在于血浆中（即，不存在于DNA为2n的细胞中，例如非吞噬细胞）的肿瘤-DNA标记；比较谱（例如，全基因阵列，DNA突变和/或从吞噬细胞和非吞噬细胞中获得的SNP）。
[0198] 10.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出蛋白质，进行Western印迹分析（将抗体用至人类肿瘤过度表达的熟知蛋白质（例如，前列腺癌中的PSA和PSMA；结肠癌中的CEA；以及卵巢癌中的CA125），并比较从血浆和DNA等于2n的细胞中获得的谱。可替换地，利用质谱确定蛋白质。
[0199] 11.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出脂质并比较其数量和质量，例如，利用HPLC。
[0200] 实例2
[0201] 从非吞噬细胞分离出吞噬细胞的代表性方法II以及表达谱的分析
[0202] 1.将血液样品分离成血浆和包含白细胞样品的白细胞层。
[0203] 2.通过细胞离心涂片（Cytospin），在载玻片上涂上WBC
[0204] 3.在丙酮/甲醇中固定细胞（-20℃，时间5分钟）
[0205] 4.利用苏木精和曙红染色剂以及抗T细胞抗体进行染色
[0206] 5.利用激光捕获显微术（LCM），分离T细胞（非吞噬）和巨噬细胞（吞噬）。分离成DNA等于2n的吞噬细胞以及DNA大于2n的吞噬细胞。DNA等于2n的非吞噬细胞和吞噬细胞指的是DNA含量等于2n的细胞。
[0207] 6.从血浆中分离出RNA，从DNA含量等于2n的吞噬细胞和非吞噬细胞中分离出RNA，制备cDNA、cRNA并利用其区分血浆基因谱（例如，全基因阵列和/或癌症基因阵列）与吞噬细胞和/或非吞噬细胞的基因谱。
[0208] 7.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出DNA，并确定选择性存在于血浆中（即，不存在于DNA为2n的细胞中，例如非吞噬细胞）的肿瘤-DNA标记；比较谱（例如，全基因阵列，DNA突变和/或从吞噬细胞和非吞噬细胞中获得的SNP）。
[0209] 8.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出蛋白质，进行Western印迹分析（将抗体用至人类肿瘤过度表达的熟知蛋白质（例如，前列腺癌中的PSA和PSMA；结肠癌中的CEA；以及卵巢癌中的CA125），并比较在血浆和DNA等于2n的细胞中获得的谱。可替换地，利用质谱确定蛋白质。
[0210] 9.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出脂质并比较其数量和质量，例如，利用HPLC。
[0211] 实例3
[0212] 从非吞噬细胞分离出吞噬细胞的代表性方法III以及表达谱的分析
[0213] 1.从全血中分离出血浆
[0214] 2.利用磁性抗体共轭的磁珠，从全血中分离出非吞噬细胞（例如，T细胞）和吞噬细胞（例如，嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞和/或单核细胞）。分离成DNA等于2n的吞噬细胞和DNA大于2n的吞噬细胞。DNA等于2n的非吞噬细胞和吞噬细胞指的是DNA含量等于2n的细胞。
[0215] 3.从血浆中分离出RNA，从DNA含量等于2n的吞噬细胞和非吞噬细胞中分离出RNA，制备cDNA、cRNA并利用其区分血浆的基因谱（例如，全部的基因阵列和/或癌症基因阵列）与吞噬细胞和/或非吞噬细胞的基因谱。
[0216] 4.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出DNA，并确定选择性存在于血浆中（即，不存在于DNA为2n的细胞中，例如非吞噬细胞）的肿瘤-DNA标记；比较谱（例如，全基因阵列，DNA突变和/或从吞噬细胞和非吞噬细胞中获得的SNP）。
[0217] 5.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出蛋白质，进行Western印迹分析（将抗体用至人类肿瘤过表达的熟知蛋白质（例如，前列腺癌中的PSA和PSMA；结肠癌中的CEA；以及卵巢癌中的CA125），并比较在血浆和DNA等于2n的细胞中获得的谱。可选地，利用质谱确定蛋白质。
[0218] 6.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出脂质并比较其数量和质量，例如，利用HPLC。
[0219] 实例4
[0220] 从非吞噬细胞分离出吞噬细胞的代表性方法IV以及表达谱的分析
[0221] 1．将血液样品分离成血浆和包含白细胞样品的白细胞层。利用特异于具
体细胞亚群（例如，嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、T细胞等等）的荧光抗体对白细胞进行染色并对DNA进行染色（例如，Hoechst33342、碘化丙啶）。
[0222] 2.对细胞进行分选（例如，通过FACS）。
[0223] 3.从血浆中分离出RNA，从DNA含量等于2n的吞噬细胞和非吞噬细胞中分离出RNA，制备cDNA、cRNA并用于利用其区分血浆的基因谱（例如，全基因阵列和/或癌症基因阵列）与吞噬细胞和/或非吞噬细胞的基因谱。
[0224] 4．从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出DNA，并确定选择性存在于血浆中（即，不存在于DNA为2n的细胞中，例如非吞噬细胞）的肿瘤-DNA标记；比较谱（例如，全基因阵列，DNA突变和/或在吞噬细胞和非吞噬细胞中获得的SNP）。
[0225] 5.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出蛋白质，进行Western印迹分析（将抗体用至人类肿瘤过表达的熟知蛋白质（例如，前列腺癌中的PSA和PSMA；结肠癌中的CEA；以及卵巢癌中的CA125），并比较在血浆和DNA等于2n的细胞中获得的谱。可选地，利用质谱确定蛋白质。
[0226] 6.从血浆和DNA等于2n的细胞中分离出脂质并比较其数量和质量，例如，利用HPLC。
[0227] 实例5
[0228] 检测从荷瘤小鼠获得的无细胞体液中的肿瘤特异性基因标记物
[0229] 根据本发明实施例，提供了区分无细胞体液中“正常的非特异性噪声”与“肿瘤特异性”和/或“疾病特异性”和/或“病症特异性”的标记物的方法。将来自荷瘤小鼠的无细胞体液的基因表达谱与源自相同的供体小鼠的非吞噬T细胞的基因表达谱进行比较，确定无细胞体液中的肿瘤特异性标记（未表达或显著地差异表达（在源自相同荷瘤小鼠和非荷瘤动物的非吞噬细胞中））。
[0230] 人类前列腺LNCaP癌细胞
[0231] 将人类前列腺LNCaP癌细胞皮下（s.c.）注射至无胸腺裸鼠（n=5）。二十七天后（肿瘤大小=～0.4cm），通过心脏穿刺（～1mL/小鼠）至包含EDTA的管（然后进行离心），对小鼠进行
放血。分离出血浆。然后分离出白细胞层并进行冲洗，然后分别利用抗小鼠嗜中性粒细胞免疫磁珠法、抗小鼠巨噬细胞免疫磁珠法以及抗小鼠T细胞免疫磁珠法，分离出嗜中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞。从T细胞 中分离出RNA。测定RNA的质量。制备cDNA和生物素化的cRNA（cRNA-B）。从血浆制备出生物素化cRNA（cRNA-B）。分别利用癌基因人类微阵列（Oligo Human Cancer PathwayFinder Microarray-OHS-033-uperArray Bioscience）孵育源自血浆和源自T细胞的cRNA-B样品。
杂交后，对膜进行冲洗并利用抗生物素蛋白-碱性磷酸酶进行染色，然后利用化学发光（
X射线薄膜）检测基因。将从T细胞和血浆获得的基因标记进行比较。从源自血浆的基因标记中去除源自T细胞的基因标记，获得患者特异性标记（与前列腺癌相关的一个或多个标记物）。
[0232] 人类LS174T结肠腺癌肿瘤
[0233] LLC1癌细胞，B16F10小鼠黑色素瘤细胞
[0234] 借助分离自无胸腺裸鼠（n=5）（皮下注射人类LS174T结肠腺癌肿瘤细胞（肿瘤大小=～0.3cm）），C57B1小鼠（n=5）（皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞LLC1（肿瘤大小=～6
0.6cm））以及C57B1小鼠（n=5）（静脉注射10 的B16F10小鼠黑素瘤细胞（当为小鼠肿瘤细胞时，将源自血浆和源自T细胞的cRNA-B样品与Oligo Mouse Cancer
PathwayFinder Microarray-OMM-033-SuperArray Bioscience进行杂交））的血浆和细胞，进行类似试验。RNA还可分离自在培养中以指数方式生长的LS174T，LLC1，B16F10和LNCaP细胞以及分离自血浆和T细胞（从非荷瘤的C57B1裸鼠分离的），并确定它们与癌症相关的基因谱。
[0235] 根据本发明的一些方面，源自注射有人类前列腺或结肠肿瘤细胞的小鼠和源自荷有小鼠肺癌或黑素瘤的小鼠的血浆具有多种与癌症相关的基因的标记（在其各自的肿瘤细胞中也可发现）。根据进一步方面，（i）分离自荷瘤小鼠的非吞噬T细胞；和（ii）从非荷瘤小鼠获得的吞噬性嗜中性粒细胞和巨噬细胞不表达或以最低限度表达与癌症相关的基因。
[0236] 实例8
[0237] 检测源自癌症患者的无细胞体液中的肿瘤特异性基因标记
[0238] 根据本发明的某些实施例，将源自癌症患者的无细胞体液的基因表达谱与源自相同供体的非吞噬T细胞的基团表达谱进行比较，确定无细胞体液中的肿瘤特异性标记（未表达或或显著地差异表达（在非吞噬细胞中））。
[0239] 患有头部和颈部肿瘤的患者
[0240] 从所已知的患有颈部鳞状细胞癌的患者获得10mL静脉血（插入含EDTA的管）。在室温下，在2,000rpm下离心5分钟后，保留血浆并将白细胞层转至管中并利用PBS对其进行冲洗。
[0241] 利用T细胞-、中性粒细胞-和巨噬细胞/单核细胞-大鼠抗人类免疫磁珠TM
（源自INVITROGEN ，Carlsbad，CAT），分离细胞。大体上，将磁珠连续添加至
白细胞样品然后各自在4℃下，孵育30分钟后，利用磁体分离出T细胞-、中性粒细胞-和巨噬细胞/单核细胞-结合的磁珠并利用PBS对其冲洗三次。
[0242] 然后从T细胞中分离出RNA（利用 INVITROGENTM，Carlsbad，CA）。测定RNA的数量和质量并制备cDNA和生物素化cRNA（cRNA-B）。从血浆中制备出
cRNA-B样品并利用癌基因人类微阵列（Oligo Human Cancer PathwayFinder
Microarray-OHS-033–SuperArray Bioscience，Frederick，MD）对每个T细胞进行孵育（60℃，过夜）。杂交后，对膜进行冲洗并利用抗生物素蛋白-碱性磷酸酶对其进行染色，然后利用化学发光（X射线薄膜）对基因进行检测。将从T细胞和从血浆获得的基因标记进行比较。从源自血浆的基因标记中去除源自T细胞的基因标记，获得患者特异性标记（与头部和颈部癌症相关的一个或多个标记物）。
[0243] 根据本发明的一些方面，头部和颈部癌症患者的血浆具有多种与癌症相关的基因标记（在其各自的肿瘤细胞中也可发现）。可鉴定出下述基因：E26病毒癌基因同源物（ETS2），HIV-1Tat交互蛋白（HTAT1P2），IL8（中性粒细胞活化或趋化），Jun癌基因（JUN）以及基质金属蛋白酶9（MMP9）。
[0244] 根据本发明的另外方面，非吞噬T细胞不表达或以最低限度表达这些与癌症相关的基因。
[0245] 卵巢癌患者
[0246] 借助分离自卵巢癌患者的血浆和细胞，进行类似试验。血浆可包括许多与癌症相关的基因（非吞噬T细胞未表达或以最低限度表达的基因）。这些癌基因可包括AKT1，APAF1，ATM，CDC25A，CDKN1A，ETS2，FOS，IL8，ITGA4，ITGA6，ITGAV，JUN，MAP2K1，NFKBIA，PLAU，PLAUR，RAF1，SERPINB2，SYK，TIMP1，TNF，TNFRSF10B或TNFRSF1A中的一个或多个。
[0247] 实例9
[0248] 检测荷有人类前列腺LNCaP肿瘤的小鼠的无细胞体液中的肿瘤特异性蛋白质标记
[0249] 人类结肠LS174T肿瘤
[0250] 利用蛋白纯化试剂盒（Norgen，Incorporated，Product#23500）从小鼠白细胞、T细胞和巨噬细胞中，分离和纯化出蛋白质。该检测方法非常简单且快速（大约30分钟）且可将分离出的蛋白质用于许多下游应用，例如SDS-PAGE分析和Western印迹分析。
[0251] 从荷LNCaP和LS174T肿瘤的小鼠的血浆和非吞噬（T-淋巴细胞）细胞中分离出蛋白质样品（由于前者细胞系表达PSA（Denmeade等人,(2001)Prostate48:1；Lin等人,(2001),J.Urol.166:1943）且后者具有肿瘤特异性糖蛋白（TAG-72）、高分子量粘蛋白（Colcher等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:3199；Colcher等人,(1984)Cancer Res.44:5744；Kassis等人,(1996)J.Nucl.Med.37:343）。利用源自每个血浆和T细胞的16微克纯化的蛋白质样品，进行Western印迹分析。大体上，将每个样品与两体积的SDS上样缓冲液进行混合并利用10%的SDS-PAGE以及在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液（pH8.4）中的未染色的精确加（precision plus）蛋白标准品（Biorad）进行运行（在200伏下）。利用Mini Trans-Blot（Biorad）装置和含有25mMTris、pH8.4、192mM甘氨酸以及20%甲醇的转移缓冲液，将蛋白质转移至硝化纤维薄膜（在4℃下过夜）。利用5%的
脱脂牛奶封闭膜（在室温（RT）下，时间60分钟）并利用B72.3（针对人TAG-72的小鼠单克隆抗体）或ER-PR8（针对人PSA的小鼠单克隆抗体）对其进行孵育（室温下，时间1小时）。对印迹进行冲洗，然后利用Immun-Star山羊抗小鼠-HRP共轭物（Biorad）、特异于小鼠IgG的二抗进行孵育，利用鲁米诺溶液（luminol solution）和过氧化氢缓冲液的1:1
混合液（Biorad），进行孵育（在室温下，时间5分钟），然后再利用自动射线照相术而显影。
[0252] 根据本发明的一个方面，荷LNCaP瘤的小鼠的血浆为PSA阳性，而该蛋白在相同动物的非吞噬T细胞中未检测出。类似地，从荷LS174T瘤的小鼠获得的单核细胞/巨噬细胞可表达TAG-72且其在相同的动物T细胞中未检测出。
[0253] 实例10
[0254] 谱实验
[0255] 分离血液吞噬细胞
[0256] 获得患者的血液样品。将该血液（～5毫升）转移至含有50微升0.5MEDTA（最终的EDTA浓度=～4.8mM）的50毫升的管中。轻轻地涡旋振荡该管并加入25毫升RBC裂解缓冲液（Norgen，Incorporated）。再次轻轻涡旋振荡该管，在室温下进行孵育，直至溶液颜色变成明亮的红色（3-5分钟），然后在2,000rpm下离心3分钟。小心地抽吸上清液后，利用40毫升无Ca/Mg的0.1M PBS（含有2%FBS，2mM EDTA以及20mM
葡萄糖）对WBC进行冲洗，然后利用含有（i）DNA，活的细胞渗透性染色Hoechst33342（4微克/毫升；Em=483nm），（ii）抗人单核细胞/巨噬细胞的单克隆抗体（Alexa 647-共轭物；Em=668nm）（识别由循环单核细胞/巨噬细胞表达的人F4/80抗原），以及（iii）抗人中性粒细胞的单克隆6
抗体（RPE-共轭物；Em=578nm）（识别人循环中性粒细胞）的细胞染色液，对细胞（10/mL）进行孵育（黑暗中，时间30分钟，4℃下）。然后，对该细胞进行冲洗并将其分选（BD FACSAria）为中性粒细胞（Nn=2）、中性粒细胞（Nn>2）、单核细胞/巨噬细胞（M/Mn=2）以及单核细胞/巨噬细胞（M/Mn>2）。根据本发明的一些方面，将DNA含量为2n的细胞的含量与从相同个体获得的血浆的含量进行比较。
[0257] 基因谱
[0258] 实施人类全基因组的基因谱分析。对于源自血浆或人类肿瘤细胞或中性粒细胞（Nn=2，Nn>2）以及单核细胞/巨噬细胞（M/Mn=2，M/Mn>2）的RNA样品而言，利用Affymetrix股份有限公司的 Human Genome U133Plus2.0Array。该阵列可分析超过47,000个转录本和变体的表达水平（包括38,500个被很好表征的人类基因）。通常地，利用提取的RNA确定人类基因的表达谱（利用上述阵列）。为了确保阵列的可重复性，每个样品重复三次且实验重复一次。针对与癌症诱导相关的基因（如下所述），对微阵列数据进行过滤并利用实时定量、逆转录酶、聚合酶链反应（RT-PCR）进行确证。
[0259] 与癌症诱导相关的基因的上调/下调
[0260] 利用Triazol（Invitrogen股份有限公司）分离RNA并利用试剂盒中的药筒（cartridge）进行纯化。利用Bioanalyzer2100（Agilent Technologies股份有限公司，Palo Alto，CA）和Degradometer
软件版本1.41（Worldwide Web：dnaarrays.org），对RNA的质量和数量进行评估。这些实验结果可有助于区分扰动的分子途径（肿瘤的存在所引起）。
[0261] 微阵列实验的分析
[0262] 所形成的大规模/高通量的分子表达数据的分析在很大程度上依赖于（i）确定血浆中差异表达的基因，（ii）注释所确定的基因，以及（iii）将所注释的基因指派至由特定肿瘤特异性表达的基因的能力。可对微阵列数据进行统计学分析，例如，利用dChip包（在其“分析/比较样品”菜单中可轻易容纳该类型基因的列表结构）。当利用Affymetrix基因芯片时，利用一个或多个基因芯片以及相关方法，确定原微阵列数据的质量（Gautier等人,(2004)Bioinformatics20:307）。此外，利用多种背景校正和标准化方法，获得合适的标准化方法和汇总的探针集（以获得表达值）（Huber等 人 ,(2002)Bioinformatics18(Suppl.1):S96；Wu 等 人 ,(2004)Journal of the American Statistical Association99:909；Seo 和 Hoffman(2006)BioMedCentral Bioinformatics7:395）。在两步过滤方法中，将Pn=2的基因谱与Pn>2的基因谱进行比较，并创建所表达基因的列表，然后将这些基因与肿瘤特异性基因（针对每个肿瘤细胞系所确定的）进行比较-Pn=2基因谱过滤后。例如，（i）获得乳腺癌患者的血液并将血液分离成血浆和白细胞层（T细胞从此分离）；（ii）确定基因谱，针对每个血浆和T细胞，重复三次；（iii）针对每组（Nn>2和Nn=2），计算出每个所确定基因的平均数（来自3个样品）以及其各自的标准误差（SE）；（iv）然后比较两组的基团表达谱，根据Welch改良的两样本t检查，以绝对≥2倍log变化（Nn>2/Nn=2）为基础，确定所表达基因的列表（L-l）；（v）比较Nn=2的基因表达谱以及乳腺癌（取自肿瘤和正常乳腺的组织活检）的基因表达谱并确定所表达基因的列表（L-2）；以及（vi）通过比较L-l和L-2中的基因，确定乳腺癌特异性基因标记物（由Nn>2获得/表达）（"Analysis/Compare Samples/Combine Comparisons,"dChip）并滤去相同基因。
[0263] 蛋白质谱
[0264] 利用tris-(2-羧基乙基)膦胰蛋白酶（1mM）和0.02%十二烷基硫酸钠变性并减少50至100微克的总蛋白（源自每个血浆和T细胞）（在60℃下，时间1小时）。然后，阻断半胱氨酸并在37℃下，利用胰蛋白酶裂解总蛋白质，时间12-16小时。最终的肽被iTRAQ标记（利用标记113-119和121），时间1小时（4重（4-plex）或8重（8-plex），取决于所比较的细胞类型的数目）。标记后，将单独标记的样品进行结合，然后将其注入配备有强阳离子交换柱的Agilent1200Series HPLC系统（Applied Biosystems4.6x100Porous）。然后，将96个收集的流分合并成14个流分，再将每个流分注入LC Packings Ultimate HPLC系统，在反相条件下，进行第二轮分流（
分馏）（LC Packings15cm x75μm分析柱）。利用LC Packings Probot将反相流分直接点至目标平板并利用质谱进行分析（Applied Biosystems4800Plus Proteomics Analyzer）。获得数据后，利用ProteinPilot
软件包（Applied Biosystems MDS TM
Sciex）对
光谱进行处理，利用ProteinPilot 软件，借助其相对表达水平，确定每个血浆和T细胞样品中的单个蛋白质，然后分析和确定与癌症相关的蛋白质组标记。
