纳米颗粒免疫抑制化合物的可注射的组合物
专利汇可以提供纳米颗粒免疫抑制化合物的可注射的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于形成皮下或肌内贮点的可注射的纳米颗粒免疫 抑制剂 组合物。本发明还涉及纳米颗粒他克莫司和/或西罗莫司的可注射的组合物，其消除了使用聚 氧 乙烯(60)氢化 蓖麻油 (HCO－60)和/或聚山梨酯80作为增 溶剂 的需要。本发明还公开了制备可注射的纳米颗粒他克莫司和/或西罗莫司组合物的方法，并且还涉及对皮下或肌内贮点使用含他克莫司、西罗莫司或其组合的可注射的纳米颗粒制剂的 治疗 方法以 预防 器官排斥和治疗 牛 皮癣或其他免疫性 疾病 。，下面是纳米颗粒免疫抑制化合物的可注射的组合物专利的具体信息内容。
1.一种可注射的纳米颗粒制剂，其包含：
(a)有效平均粒度小于约2000nm的他克莫司颗粒；和
(b)至少一种表面稳定剂。
2.权利要求1的组合物，还包括有效平均粒度小于约2000nm的 西罗莫司颗粒和表面稳定剂，其中西罗莫司表面稳定剂可以和他克莫司 表面稳定剂相同或不同。
3.权利要求1或2的组合物，其中他克莫司选自晶相、无定形相、 半晶相、半无定形相和其混合物。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中纳米颗粒他克莫司颗粒 的有效平均粒度选自小于约1900nm，小于约1800nm，小于约1700 nm，小于约1600nm，小于约1500nm，小于约1400nm，小于约1300nm， 小于约1200nm，小于约1100nm，小于约1000nm，小于约900nm， 小于约800nm，小于约700nm，小于约650nm，小于约600nm，小于 约550nm，小于约500nm，小于约450nm，小于约400nm，小于约350 nm，小于约300nm，小于约250nm，小于约200nm，小于约150nm， 小于约100nm，小于约75nm和小于约50nm。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中当注射给病人时，形成 皮下或肌内贮点以便长期免疫抑制剂释放。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中该组合物还包含一种或 多种药用可接受的赋形剂、载体或者其组合。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中至少一种表面稳定剂的 含量选自以下：约0.5wt％-约99.999wt％，约5.0wt％-约99.9wt％和约 10wt％-约99.5wt％，基于他克莫司和至少一种表面稳定剂的总干重，不 包括其它赋形剂。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中他克莫司的含量选自以 下：约99.5wt％-约0.001wt％，约95wt％-约0.1wt％，和约90wt％-约 0.5wt％，基于他克莫司和至少一种表面稳定剂的总重量，不包括其它赋 形剂。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其包含至少两种表面稳定 剂。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中表面稳定剂选自阴离子 表面稳定剂、阳离子表面稳定剂、两性离子表面稳定剂、非离子表面稳 定剂和离子表面稳定剂。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，其中至少一种表面稳定剂选 自十六烷基氯化吡啶、明胶、酪蛋白、磷脂、葡聚糖、甘油、阿拉伯 树胶、胆固醇、黄蓍胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油 酯、十六醇十八醇混合物、聚西托醇乳化蜡、失水山梨糖醇酯、聚氧乙 烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、 聚乙二醇、十二烷基三甲基溴化铵、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、 磷酸盐/酯、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羟丙基纤维素、羟丙甲 纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、邻苯二甲酸羟 丙甲纤维素、非晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡 咯烷酮、4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚与环氧乙烷和甲醛的聚合物、泊洛 沙姆；poloxamines、带电的磷脂、磺基琥珀酸二辛酯、磺基琥珀酸钠二 烷基酯、十二烷基硫酸钠、烷基芳基聚醚磺酸酯、蔗糖硬脂酸酯和蔗糖 二硬脂酸酯的混合物、对异壬基苯氧基聚(缩水甘油)、癸酰-N-甲基葡糖 酰胺；正癸基β-D-吡喃葡糖苷；正癸基β-D-吡喃麦芽糖苷；正十二烷基 β-D-吡喃葡糖苷；正十二烷基β-D-麦芽糖苷；庚酰-N-甲基葡糖酰胺；正 庚基-β-D-吡喃葡糖苷；正庚基β-D-硫代葡糖苷；正己基β-D-吡喃葡糖 苷；壬酰-N-甲基葡糖酰胺；正壬基β-D-吡喃葡糖苷；辛酰-N-甲基葡糖 酰胺；正辛基-β-D-吡喃葡糖苷；辛基β-D-硫代吡喃葡糖苷；溶菌酶、PEG- 磷脂、PEG-胆固醇、PEG-胆固醇衍生物、PEG-维生素A、PEG-维生素 E、乙酸乙烯酯与乙烯基吡咯烷酮的无规共聚物、阳离子型聚合物、阳 离子型生物聚合物、阳离子型多糖、阳离子型纤维素质、阳离子型藻酸 盐、阳离子型非聚合化合物、阳离子型磷脂、阳离子型脂质、聚甲基丙 烯酸甲酯三甲基溴化铵、锍化合物、聚乙烯吡咯烷酮-2-二甲氨基乙基异 丁烯酸酯硫酸二甲酯、十六烷基三甲基溴化铵、化合物、季铵化合物、 苄基二(2-氯乙基)乙基溴化铵、椰油三甲基氯化铵、椰油三甲基溴化铵、 椰油甲基二羟乙基氯化铵、椰油甲基二羟乙基溴化铵、癸基三乙基氯化 铵、癸基二甲基羟乙基氯化铵、癸基二甲基羟乙基氯化溴化铵、C12-15 二甲基羟乙基氯化铵、C12-15二甲基羟乙基氯化溴化铵、椰油二甲基羟 乙基氯化铵、椰油二甲基羟乙基溴化铵、十四烷基三甲基甲硫酸铵、月 桂基二甲基苄基氯化铵、月桂基二甲基苄基溴化铵、月桂基二甲基(氧乙 烯基)4氯化铵、月桂基二甲基(氧乙烯基)4溴化铵、N-烷基(C12-18)二甲基 苄基氯化铵、N-烷基(C14-18)二甲基苄基氯化铵、N-十四烷基二甲基苄基 氯化铵一水合物、二甲基二癸基氯化铵、N-烷基和(C12-14)二甲基1-萘基 甲基氯化铵、三甲基卤化铵、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、月 桂基三甲基氯化铵、乙氧基化烷酰氨基烷基二烷基铵盐、乙氧基化三烷 基铵盐、二烷基苯二烷基氯化铵、N-二癸基二甲基氯化铵、N-十四烷基 二甲基苄基氯化铵一水合物、N-烷基(C12-14)二甲基1-萘基甲基氯化铵、 十二烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基苯烷基氯化铵、月桂基三甲基氯化 铵、烷基苄基甲基氯化铵、烷基苄基二甲基溴化铵、C12三甲基溴化铵、 C15三甲基溴化铵、C17三甲基溴化铵、十二烷基苄基三乙基氯化铵、聚 二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)、二甲基氯化铵、烷基二甲基卤化 铵、三(十六烷基)甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三乙基溴 化铵、十四烷基三甲基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、POLYQUAT 10TM、 四丁基溴化铵、苄基三甲基溴化铵、胆碱酯、苯扎氯铵、司拉氯铵化合 物、十六烷基溴化吡啶、十六烷基氯化吡啶、季铵化的聚氧乙基烷 基胺的卤化物盐、MIRAPOLTM、ALKAQUATTM、烷基吡啶盐；胺、 胺盐、氧化胺、酰亚胺吡咯(imide azolinium)盐、质子化的季型丙烯酰 胺、甲基化的季型聚合物和阳离子型瓜尔胶。
12.权利要求1-11中任一项的组合物，其包含作为表面稳定剂的聚 维酮聚合物，该聚合物的分子量为约40000道尔顿或更少。
13.权利要求1-12中任一项的组合物，还包含一种或多种非他克莫 司或者非西罗莫司活性剂。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，其中该组合物重新分散在生 物相关介质中，使得他克莫司颗粒的有效平均粒度选自以下：小于约2 微米，小于约1900nm，小于约1800nm，小于约1700nm，小于约1600 nm，小于约1500nm，小于约1400nm，小于约1300nm，小于约1200nm， 小于约1100nm，小于约1000nm，小于约900nm，小于约800nm，小 于约700nm，小于约650nm，小于约600nm，小于约550nm，小于约 500nm，小于约450nm，小于约400nm，小于约350nm，小于约300nm， 小于约250nm，小于约200nm，小于约150nm，小于约100nm，小于 约75nm和小于约50nm。
15.权利要求14的组合物，其中生物相关介质选自水、电解质水溶 液、盐的水溶液、酸的水溶液、碱的水溶液和其组合。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中以相同剂量施用，当对 施用后的哺乳动物受试者的血浆进行分析时，所述他克莫司的Tmax小于 非纳米颗粒他克莫司的Tmax。
17.权利要求16的组合物，其中：
(a)以相同剂量施用，所述Tmax选自不大于非纳米颗粒他克莫司 制剂所显示的Tmax的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约 30％、约25％、约20％、约15％、约10％和约5％；
(b)在施用于禁食受试者后，该组合物显示出选自以下的Tmax：小 于约6小时，小于约5小时，小于约4小时，小于约3小时，小于约2 小时，小于约1小时和小于约30分钟；或者
(c)(a)和(b)的组合。
18.权利要求1-17中任一项的组合物，其中以相同剂量施用，当对 施用后的哺乳动物受试者的血浆进行分析时，所述他克莫司的Cmax大于 非纳米颗粒他克莫司制剂的Cmax。
19.权利要求18的组合物，其中以相同剂量施用，所述Cmax选自： 大于非纳米颗粒他克莫司制剂所显示的Cmax至少约50％、至少约 100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至 少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％、 至少约1100％、至少约1200％、至少约1300％、至少约1400％、至少约 1500％、至少约1600％、至少约1700％、至少约1800％或者至少约 1900％。
20.权利要求1-19中任一项的组合物，其中以相同剂量施用，当对 施用后的哺乳动物受试者的血浆进行分析时，所述他克莫司的AUC大 于非纳米颗粒他克莫司制剂的AUC。
21.权利要求20的组合物，其中以相同剂量施用，所述AUC选自： 大于所述免疫抑制剂的非纳米颗粒制剂所显示的AUC至少约25％、至 少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、 至少约175％、至少约200％、至少约225％、至少约250％、至少约275％、 至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、 至少约550％、至少约600％、至少约750％、至少约700％、至少约750％、 至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、 至少约1050％、至少约1100％、至少约1150％或者至少约1200％。
22.权利要求1-21中任一项的组合物，在进食条件下施用时，与在 禁食条件下相比，其没有产生显著不同的吸收水平。
23.权利要求22的组合物，其中相对于禁食状态，在进食状态下施 用时，他克莫司组合物的吸收差别选自：小于约100％、小于约90％、 小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小 于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于 约5％和小于约3％。
24.权利要求1-23中任一项的组合物，其中在禁食状态下对人施用 该组合物生物等效于在进食状态下对受试者施用该组合物。
25.权利要求1-24中任一项的组合物用于制造药物的用途。
26.权利要求25的用途，其中所述药物可用于器官排斥的预防性治 疗或者牛皮癣或其他免疫性疾病的治疗。
27.权利要求25的用途，其中该药物是可注射的药物组合物，该可 注射的药物组合物形成皮下或肌内贮点，以便长期释放。
28.一种制造可注射的纳米颗粒他克莫司组合物的方法，该方法包 括使他克莫司颗粒与至少一种表面稳定剂在一定条件下接触一段时 间，所述条件和时间足以提供有效平均粒度小于约2000nm的他克莫司 颗粒。
29.权利要求28的方法，其中所述接触包括研磨、湿磨、均化、沉 淀或超临界流体粒子生成技术。
30.权利要求28的方法，还包括向纳米颗粒他克莫司组合物中添加 纳米颗粒西罗莫司组合物，其中纳米颗粒西罗莫司组合物包含有效平均 粒度小于约2000nm的西罗莫司颗粒和表面稳定剂，其中西罗莫司表面 稳定剂可以和他克莫司表面稳定剂相同或不同。
技术领域
本发明涉及含至少一种免疫抑制化合物的可注射的纳米颗粒组合 物。在示范性实施方案中，本发明描述了纳米颗粒免疫抑制化合物如他 克莫司、西罗莫司或其组合的可注射的组合物。
技术背景
A.有关免疫抑制化合物的背景
免疫抑制化合物的实例包括但不限于他克莫司和西罗莫司。
1.有关他克莫司的背景
他克莫司，或FK-506，是一种大环内酯免疫抑制剂，据称是环孢菌 素效力的100倍。它由链霉菌的一种单型物种苏库巴链霉菌 (Streptomyces tsukubaensis)发酵制得。美国专利4,894,366和EPO出 版物No.0184162描述了他克莫司，在这里全文引用作为参考。
他克莫司以PROGRAF(可由Fujisawa USA，Inc.得到)的商品名称销 售，它抑制某些体液免疫，而且在更大程度上抑制细胞介导的反应，例 如同种异体移植物的排斥、迟发型超敏反应、胶原诱发的关节炎、实验 性变应性脑脊髓炎和移植物抗宿主病。他克莫司延长了肝、肾、心脏、 骨髓、小肠和胰腺、肺和气管、皮肤、角膜和四肢的动物移植模型中宿 主和移植物的存活期。
实验证据表明，他克莫司与胞内蛋白FKBP-12相结合。然后形成他 克莫司-FKBP-12、钙、钙调蛋白和钙依赖磷酸酶的复合物，钙依赖磷酸 酶的磷酸酶活性被抑制。这一作用可以防止活化T细胞核因子(NF-AT) 的去磷酸化和易位，NF-AT被认为是引发形成淋巴因子(例如白介素-2， γ-干扰素)所需的基因转录的一种核组分。其总结果是抑制T-淋巴细胞的 活化(即，免疫抑制作用)。
他克莫司的经验式C44H69NO12·H2O，分子量为822.05。他克莫司为 白色晶体或晶状粉末，几乎不溶于水，在乙醇中易溶解，在甲醇和氯仿 中极易溶解。他克莫司的化学结构如下：
(参见The Merck Index，第12版，9200，Merck&Co.，Inc.，Rahway， NJ，1996)。
他克莫司在口服后于胃肠道内的吸收是不完全和变化不定的。他克 莫司在成年肾移植患者(N＝26)中的绝对生物利用度为17±10％，在成年 肝移植患者(N＝17)中为22±6％，在健康的志愿者中为18±5％(N＝16)。
在32名健康的志愿者中进行的单剂量研究确定了1mg和5mg胶囊 的生物等效性。另一项在32名健康志愿者中进行的单剂量研究确定了 0.5mg和1mg胶囊的生物等效性。他克莫司最大血液浓度(Cmax)和曲线 下面积(AUC)在接受3mg、7mg和10mg单次口服剂量的18名禁食的健 康志愿者中像是以正比于剂量的方式增加。
在18名肾移植患者中，在服药10-12小时后测得的他克莫司谷浓度 3-30mg/mL(Cmin)与AUC的相关性很好(相关系数0.93)。在浓度范围 为10-60mg/mL的24名肝移植患者中，相关系数为0.94。
关于食物的影响，他克莫司的吸收速度和程度在禁食条件下最大。 当对15名健康志愿者施用时，食物的存在和组成降低了他克莫司的吸 收速度和程度。高脂膳食(848千卡，46％脂肪)的这一影响最显著：平均 AUC和Cmax分别降低37％和77％，Tmax延长了5倍。高碳水化合物膳 食(668千卡，85％碳水化合物)将平均AUC和平均Cmax分别降低28％和 65％。
在健康的志愿者中(N＝16)，用餐时间也影响他克莫司的生物利用 度。当用餐后立即施用时，与禁食条件相比，平均Cmax下降71％，平均 AUC下降39％。当进餐1.5小时后施用时，与禁食条件相比，平均Cmax 下降63％，平均AUC下降39％。
在11名肝移植患者中，在高脂(400千卡，34％脂肪)早餐15分钟后 施用他克莫司，与禁食条件相比，造成AUC(27±18％)和Cmax(50±19％) 降低。
他克莫司的血浆蛋白结合约为99％，并且在5-50ng/ml的范围内与 浓度无关。他克莫司主要与白蛋白和α-1-酸性糖蛋白结合，并与红细胞 高度缔合。他克莫司在全血和血浆之间的分布取决于几个因素，例如血 细胞比容、血浆分离时的温度、药物浓度和血浆蛋白浓度。在美国的一 项研究中，全血浓度与血浆浓度之比平均为35(范围为12-67)。
他克莫司通过混合功能氧化酶系统、主要是细胞色素P-450系统 (CYP3A)来广泛地进行新陈代谢。已经提出了导致形成8种可能的代谢 产物的代谢途径。脱甲基作用和羟基化作用被称为体外生物转化的主要 机制。在人肝微粒体培养中所识别的主要的代谢产物是13-脱甲基他克 莫司。在体外试验中，已经报导了31-脱甲基代谢产物具有与他克莫司 相同的活性。
在健康志愿者、成年肾移植患者和成年肝移植患者中，在他克莫司 的静脉内施用后的平均清除率分别为0.040、0.083和0.053L/hr/kg。在 人体中，所施用的小于1％的剂量无变化地在尿中排泄。
在向6名健康志愿者的静脉内施用的放射性标记的他克莫司的质量 平衡研究中，放射性标记的平均回收率为77.8±12.7％。粪便排出占 92.4±1.0％，基于放射性的排出半衰期为48.1±15.9小时，而基于他克莫 司浓度，其为43.5±11.6小时。放射性标记的平均清除率是 0.029±0.015L/hr/kg，他克莫司的清除率是0.029±0.009L/hr/kg。当口服施 用时，放射性标记的平均回收率为94.9±30.7％。粪便排出占 92.6±30.7％，尿排出占2.3±1.1％，基于放射性的排出半衰期为31.9±10.5 小时，而基于他克莫司浓度，其为48.4±12.3小时。放射性标记的平均 清除率为0.226±0.116L/hr/kg，他克莫司的清除率为0.172±0.088L/hr/kg。
对不能口服PROGRAF胶囊的患者，可以用PROGRAF注射剂开 始治疗。当考虑使用PROGRAF注射剂时，应当注意用含蓖麻油衍生物 如CREMAPHOR的他克莫司注射物曾发生过敏反应。因此，对HCO- 60(聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油)过敏的患者禁用PROGRAF注射剂。 PROGRAF的首次剂量应当在移植后6小时马上施用。建议的 PROGRAF注射剂的初始剂量为0.03-0.05mg/kg/天，连续静脉内输注。 成年患者应以剂量范围的下限接受剂量。在移植后早期建议同时进行肾 上腺皮质类固醇治疗。PROGRAF注射剂的连续静脉内(IV)输注应当只 持续到患者可以耐受口服PROGRAF胶囊为止。
使用前，PROGRAF注射剂必须用0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖 注射液稀释，直至浓度为0.004-0.02mg/mL。稀释的输注液应当储存在 玻璃或聚乙烯容器中，并应在24小时后丢弃。稀释的输注液不应储存 在PVC容器中，因为稳定性会降低，而且有邻苯二甲酸盐(酯)萃出的可 能性。在使用更稀的溶液的情形(例如儿科配药等)中，同样应当使用无 PVC的管子，以最小化大量药物吸附在管子上的可能性。每当溶液和容 器允许，肠外药物产品在施用前应当目测检查颗粒物和变色情况。由于 PROGRAF在碱性介质中的化学不稳定性，PROGRAF注射剂不应当与 pH为9或更高的溶液(例如更昔洛韦或阿昔洛韦)混合或者共输注。
如果静脉内治疗是必需的，建议在能够耐受口服治疗时立即从静脉 内转换成口服他克莫司。在接受静脉内输注的患者中，首次口服治疗剂 量应当在停止静脉内输注8-12小时后进行。建议的他克莫司胶囊起始口 服剂量为0.10-0.15mg/kg/天，以每12小时按两分日剂量施用。已报道共 服葡萄柚汁来提高肝移植患者的他克莫司血液谷浓度。配药应当根据排 斥和耐受性的临床评估来确定。
2.关于西罗莫司的背景
西罗莫司是由吸湿链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)生成的免 疫抑制性大环内酯。西罗莫司(亦称雷帕霉素)的化学名称是 (3S，6R，7E，9R，10R，12R，14S，15E，17E，19E，21S，23S，26R，27R，34aS)-9，10，12， 13，14，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十六氢-9，27-二羟基-3-[(1R)-2- [(1S，3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10，21-二甲氧基- 6，8，12，14，20，26-六甲基-23，27-环氧-3H-吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂 hentriacontine-1，5，11，28，29(4H，6H，31H)-五酮。它的分子式是 C51H79NO13，分子量为914.2。西罗莫司的结构式如下所示。
西罗莫司是白色至灰白色粉末，不溶于水，但易溶于苄醇、氯仿、 丙酮和乙腈。西罗莫司目前是以口服剂型的形式以商品名称Rapamune 由Wyeth-Ayerst Inc.(Madison，N.J.)销售。Rapamune以含1mg/mL西罗 莫司的口服液的形式施用。Rapamune此外以含1-mg西罗莫司的白色、 三角形药片和含2-mg西罗莫司的黄色至米色三角形药片的形式获得。
Rapamune口服液中的非活性成分是Phosal50 PG(磷脂酰胆碱、丙 二醇、单和二-甘油酯、乙醇、大豆脂肪酸、和抗坏血酸棕榈酸酯)和聚 山梨酯80。Rapamune口服液包含1.5％-2.5％乙醇。Rapamune片剂中的 非活性成分包括蔗糖、乳糖、聚乙二醇8000、硫酸钙、微晶纤维素、药 物釉(pharmaceutical glaze)、滑石、二氧化钛、硬脂酸镁、聚维酮、 泊洛沙姆188、聚乙二醇20,000、甘油单油酸酯、巴西棕榈蜡及其他成 分。2毫克剂型还包含氧化铁黄10和氧化铁棕70。
西罗莫司抑制T-淋巴细胞活化和增殖(其是响应由不同于其它免疫 抑制剂的机制所造成的抗原和细胞因子(白介素[IL]-2、IL-4、和IL-15) 刺激而发生的)。西罗莫司还抑制抗体产生。在细胞中，西罗莫司结合 到抑免蛋白，FK结合蛋白-12(FKBP-12)，以产生免疫抑制复合物。西罗 莫司：FKBP-12复合物对钙依赖磷酸酶活性没有影响。该复合物结合并 抑制西罗莫司的哺乳动物靶(mTOR)——一种关键的调节激酶的活化。 这种抑制压制了细胞因子驱动的T细胞的增殖，抑制了细胞周期从G1 至S期的进程。
在实验模型中的研究表明，在小鼠、大鼠、猪和/或灵长类动物中， 西罗莫司使同种异体移植物(肾、心脏、皮、胰岛、小肠、胰十二指肠和 骨髓)的存活得到了延长。在大鼠中，西罗莫司逆转了心脏和肾的同种异 体移植物的急性排斥反应，并且在预敏化的大鼠中使移植物的存活得到 了延长。在一些研究中，在中止治疗后，西罗莫司的免疫抑制作用持续 了长达6个月。这种耐受性作用是同种异体抗原特异性的。
在自身免疫性疾病的啮齿动物模型中，西罗莫司抑制了与系统性红 斑狼疮、胶原诱发的关节炎、自身免疫I型糖尿病、自身免疫心肌炎、 实验性变应性脑脊髓炎、移植物抗宿主病和自身免疫葡萄膜视网膜炎有 关的由免疫介导的事件。
在健康受试者、儿科透渗析患者、肝损伤患者和肾移植患者中在口 服后已经确定了西罗莫司药物动力学活性。在施用Rapamune口服液 后，西罗莫司被快速吸收，在健康受试者中在单一剂量后，至最大浓度 的平均时间(Tmax)大约为1小时，而在肾移植者中，在给予多口服剂量 后，至最大浓度的平均时间大约为2小时。在施用Rapamune口服液后， 估计西罗莫司的系统利用率为大约14％。在施用片剂后，西罗莫司的平 均生物利用率为大约为27％高于口服液。西罗莫司口服片剂与口服液不 是生物等效的；然而，在2mg剂量水平下，已经证实了临床等效性。在 将Rapamune口服液施用于稳定的肾移植患者后，西罗莫司浓度与剂量 成比例，在3-12mg/m2。
B.关于纳米颗粒活性剂组合物的背景
纳米颗粒活性剂组合物最早见于美国专利5,145,684(′684专利)，包 括溶解性差的治疗或诊断剂的颗粒，在其表面上有吸附的或缔合的非交 联的表面稳定剂。′684专利还描述了制备这种纳米颗粒活性剂组合物的 方法，但是没有提到含有纳米颗粒形式的他克莫司的组合物。在题为 “Method of Grinding Pharmaceutical Substances”的美国专利5,518,187和 5,862,999，题为“Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances”的美国专利5,718,388，和题为“Process of Preparing Therapeutic Compositions Containing Nanoparticles”的美国专利5,510,118 中，描述了制造纳米颗粒组合物的方法。
例如，纳米颗粒组合物还在下述专利中描述：美国专利5,298,262： Use of Ionic Cloud Point Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization；美国专利5,302,401：Method to Reduce Particle Size Growth During Lyophilization；美国专利5,318,767：X-Ray Contrast Compositions Useful in Medical Imaging；美国专利5,326,552：Novel Formulation For Nanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular Weight Non-ionic Surfactants；美国专利5,328,404：Method of X-Ray Imaging Using Iodinated Aromatic Propanedioates；美国专利5,336,507： Use of Charged Phospholipids to Reduce Nanoparticle Aggregation；美国 专利5,340,564：Formulations Comprising Olin 10-G to Prevent Particle Aggregation and Increase Stability；美国专利5,346,702：Use of Non-Ionic Cloud Point Modifiers to Minimize Nanoparticulate Aggregation During Sterilization；美国专利5,349,957：Preparation and Magnetic Properties of Very Small Magnetic-Dextran Particles；美国专利5,352,459：Use of Purified Surface Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization；美国专利5,399,363和5,494,683：Surface Modified Anticancer Nanoparticles；美国专利5,401,492：Water Insoluble Non- Magnetic Manganese Particles as Magnetic Resonance Enhancement Agents； 美国专利5,429,824：Use of Tyloxapol as a Nanoparticulate Stabilizer；美 国专利5,447,710：Method for Making Nanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular Weight Non-ionic Surfactants；美国 专利5,451,393：X-Ray Contrast Compositions Useful in Medical Imaging； 美国专利5,466,440：Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X- Ray Contrast Agents in Combination with Pharmaceutically Acceptable Clays；美国专利5,470,583：Method of Preparing Nanoparticle Compositions Containing Charged Phospholipids to Reduce Aggregation； 美国专利5,472,683：Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbamic Anhydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging；美国专利5,500,204：Nanoparticulate Diagnostic Dimers as X- Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging；美国 专利5,518,738：Nanoparticulate NSAID Formulations；美国专利5,521,218： Nanoparticulate Iododipamide Derivatives for Use as X-Ray Contrast Agents；美国专利5,525,328：Nanoparticulate Diagnostic Diatrizoxy Ester X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging；美 国专利5,543,133：Process of Preparing X-Ray Contrast Compositions Containing Nanoparticles；美国专利5,552,160：Surface Modified NS AID Nanoparticles；美国专利5,560,931：Formulations of Compounds as Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or Fatty Acids；美国专利 5,565,188：Polyalkylene Block Copolymers as Surface Modifiers for Nanoparticles；美国专利5,569,448：Sulfated Non-ionic Block Copolymer Surfactant as Stabilizer Coatings for Nanoparticle Compositions；美国专利 5,571,536：Formulations of Compounds as Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or Fatty Acids；美国专利5,573,749：Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carboxylic Anydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging；美国专利5,573,750： Diagnostic Imaging X-Ray Contrast Agents；美国专利5,573,783： Redispersible Nanoparticulate Film Matrices With Protective Overcoats；美 国专利5,580,579：Site-specific Adhesion Within the GI Tract Using Nanoparticles Stabilized by High Molecular Weight，Linear Poly(ethylene Oxide)Polymers；美国专利5,585,108：Formulations of Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents in Combination with Pharmaceutically Acceptable Clays；美国专利5,587,143：Butylene Oxide-Ethylene Oxide Block Copolymers Surfactants as Stabilizer Coatings for Nanoparticulate Compositions；美国专利5,591,456：Milled Naproxen with Hydroxypropyl Cellulose as Dispersion Stabilizer；美国专利5,593,657：Novel Barium Salt Formulations Stabilized by Non-ionic and Anionic Stabilizers；美国专利 5,622,938：Sugar Based Surfactant for Nanocrystals；美国专利5,628,981： Improved Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X-Ray Contrast Agents and Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents；美国专利5,643,552： Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbonic Anhydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging；美国专利5,718,388： Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances；美国专利 5,718,919：Nanoparticles Containing the R(-)Enantiomer of Ibuprofen；美 国专利5,747,001：Aerosols Containing Beclomethasone Nanoparticie Dispersions；美国专利5,834,025：Reduction of Intravenously Administered Nanoparticulate Formulation Induced Adverse Physiological Reactions；美 国专利6,045,829：″Nanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)Protease Inhibitors Using Celluosic Surface Stabilizers；美国专利6,068,858：Methods of Making Nanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)Protease Inhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers；美国专利6,153,225：Injectable Formulations of Nanoparticulate Naproxen；美国专利6,165,506：New Solid Dose Form of Nanoparticulate Naproxen；美国专利6,221,400： Methods of Treating Mammals Using Nanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)Protease Inhibitors；美国专利 6,264,922：Nebulized Aerosols Containing Nanoparticle Dispersions；美国 专利6,267,989：Methods for Preventing Crystal Growth and Particle Aggregation in Nanoparticle Compositions；美国专利6,270,806：Use of PEG-Derivatized Lipids as Surface Stabilizers for Nanoparticulate Compositions；美国专利6,316,029：Rapidly Disintegrating Solid Oral Dosage Form；美国专利6,375,986：Solid Dose Nanoparticulate Compositions Comprising a Synergistic Combination of a Polymeric Surface Stabilizer and Dioctyl Sodium Sulfosuccinate；美国专利6,428,814： Bioadhesive Nanoparticulate Compositions Having Cationic Surface Stabilizers；美国专利6,431,478：Small Scale Mill；美国专利6,432,381： Methods for Targeting Drug Delivery to the Upper and/or Lower Gastrointestinal Tract；美国专利6,582,285：Apparatus for Sanitary Wet Milling；美国专利6,592,903：Nanoparticulate Dispersions Comprising a Synergistic Combination of a Polymeric Surface Stabilizer and Dioctyl Sodium Sulfosuccinate；美国专利6,656,504：Nanoparticulate Compositions Comprising Amorphous Cyclosporine；美国专利6,742,734： System and Method for Milling Materials；美国专利6,745,962：Small Scale Mill and Method Thereof；美国专利6,811,767：Liquid droplet aerosols of Nanoparticulate drugs；美国专利6,908,626：Compositions having a combination of immediate release and controlled release characteristics；美国专利6,969,529：Nanoparticulate compositions comprising copolymers of vinyl pyrrolidone and vinyl acetate as surface stabilizers；美国专利6,976,647：System and Method for Milling Materials； 和美国专利6,991,191：Method of Using a Smail Scale Mill；其全部结合 入本文作为参考。另外,美国专利申请20020012675A1(2002年1月31 日公布：ontrolled Release Nanoparticulate Compositions)描述了纳米颗 粒组合物,并特别结合入本文作为参考。这些参考文件都没有描述纳米 颗粒他克莫司或纳米颗粒西罗莫司的组合物。
US 20030054042(Stabilization of chemical compounds using nanoparticulate formulations)描述了纳米颗粒雷帕霉素制剂,其包括可注 射的制剂。美国专利5,989,591(Rapamycin formulations for oral administration)描述了片剂剂型的用于口服的纳米颗粒雷帕霉素组合 物。
例如在下述专利中描述了无定形小颗粒组合物：美国专利4,783,484： Particulate Composition and Use Thereof as Antimicrobial Agent；美国专 利4,826,689：Method for Making Uniformly Sized Particles from Water- Insoluble Organic Compounds；美国专利4,997,454：Method for Making Uniformly-Sized Particles From Insoluble Compounds；美国专利5,741,522： Ultrasmall，Non-aggregated Porous Particles of Uniform Size for Entrapping Gas Bubbles Within and Methods；和美国专利5,776,496：Ultrasmall Porous Particles for Enhancing Ultrasound Back Scatter；其全部特别结合 入本文作为参考。
需要免疫抑制剂如他克莫司和西罗莫司的组合物，其具有增强的溶 解特性，其又在施用于患者时，提供了增强的生物利用率，以及降低的 进食/禁食吸收变化性。通过提供包括他克莫司、西罗莫司或其组合的可 注射的纳米颗粒制剂的方法和组合物，本发明满足了这些需要。这种可 注射的纳米颗粒制剂消除了对使用增溶剂如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油 (HCO-60)或聚山梨酯如聚山梨酯80的需要。
发明内容
本发明还提供了一种可注射的免疫抑制的制剂，其包含纳米颗粒他 克莫司、纳米颗粒西罗莫司或其组合，其中他克莫司和/或西罗莫司的有 效平均粒度小于约2000nm。另外，所述组合物包括至少一种表面稳定 剂，其吸附或缔合于他克莫司和/或西罗莫司颗粒的表面。在本发明的其 他实施方案中，纳米颗粒他克莫司或西罗莫司颗粒的有效平均粒度小于 约1900nm、小于约1800nm、小于约1700nm、小于约1600nm、小于 约1500nm、小于约1400nm、小于约1300nm、小于约1200nm、小于 约1250nm、小于约1000nm、小于约900nm、小于约800nm、小于约 700nm、小于约600nm、小于约550nm、小于约500nm、小于约450nm、 小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于 约200nm、小于约150nm、小于约100nm、小于约7nm、或小于约 50nm。
本发明的另一方面提供了可注射的纳米颗粒他克莫司、纳米颗粒西 罗莫司或他克莫司/西罗莫司组合的制剂，其消除了使用聚氧乙烯(60)氢 化蓖麻油(HCO-60)和/或聚山梨酯80作为增溶剂的需要。这是有益的， 因为常规的非纳米颗粒可注射的他克莫司或西罗莫司制剂包括聚氧乙 烯(60)氢化蓖麻油或聚山梨酯80作为增溶剂。这种增溶剂的存在可能导 致患者的过敏性休克(即严重的变态反应)和死亡。
本发明还提供了在注射体积中含高浓度的他克莫司、西罗莫司或其 组合的制剂，在施用时形成了具有慢的、长期药物溶解的贮点。
在本发明的另一方面中，提供了一种制备含他克莫司、西罗莫司或 其组合的可注射的纳米颗粒免疫抑制制剂的方法。所述方法包括：(1) 在液体分散介质中将所选的免疫抑制化合物分散；和(2)用机械方法将免 疫抑制化合物的粒度减小到期望的有效平均粒度，例如小于约2000 nm。在免疫抑制化合物的粒度减小之前、之中或之后，可以将一种或多 种表面稳定剂添加到组合物中。在一种实施方案中，所述表面稳定剂是 分子量小于约40,000道尔顿的聚维酮聚合物。优选地，在粒度减小过程 中，将液体分散介质维持在生理pH水平，例如约3-约8。
本发明还涉及使用含他克莫司、西罗莫司或其组合的本发明的可注 射的纳米颗粒制剂治疗包括人在内的哺乳动物以预防器官排斥的方 法。例如，所述组合物对于接受同种异体肝或肾移植的患者以及治疗牛 皮癣或其它免疫性疾病来说是有用的。所述方法包括以下步骤：将治疗 有效量的他克莫司、西罗莫司或其组合的可注射的纳米颗粒制剂经皮下 或肌内注射而施用于受试者，使得在其中形成贮点以便药物的长期施 用。
本发明的可注射的纳米颗粒他克莫司或西罗莫司制剂可任选地包 括一种或多种药理学可接受的赋形剂，如无毒性的生理学可接受的液体 载体、pH调节剂或防腐剂。
以上概述和以下详述都是示范性的和说明性的，都意图提供对如所 要求保护的本发明的进一步的解释。通过以下发明的详细说明，其它目 的、优点和新颖特征对本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1.未研磨的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微 照片。
图2.具有2％(w/w)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K29/32和0.05％(w/w)磺 基琥珀酸二辛酯(DOSS)的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水 分散体的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
图3.具有2％(w/w)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K29/32和0.05％(w/w)磺 基琥珀酸二辛酯(DOSS)的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水 分散体在冷藏贮存一周后的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照 片。
图4.具有2％(w/w)PVP K12和0.15％(w/w)脱氧胆酸钠的10％(w/w) 纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学技术拍摄的 100X光学显微照片。
图5.具有3％(w/w)PlasdoneS630(乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯 的比例为60∶40的无规共聚物)的20％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
图6.具有3％(w/w)PlasdoneS630(乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯 的比例为60∶40的无规共聚物)的20％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体在冷藏贮存一周后的采用相位光学技术拍摄的100X光学 显微照片。
图7.具有2％(w/w)羟丙基纤维素(HPC-SL)和0.1％(w/w)DOSS的 10％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学技 术拍摄的100X光学显微照片。
图8.具有1％(w/w)HPC-SL和0.15％(w/w)DOSS的5％(w/w)纳米颗 粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学技术拍摄的100X光 学显微照片。
图9.具有1％(w/w)HPC-SL和0.15％(w/w)DOSS的5％(w/w)纳米颗 粒他克莫司(Camida LLC)水分散体在冷藏贮存12天后的采用相位光学 技术拍摄的100X光学显微照片。
图10.具有1％(w/w)HPC-SL和0.1％(w/w)脱氧胆酸钠的5％(w/w) 纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学技术拍摄的 100X光学显微照片。
图11.具有1％(w/w)HPC-SL和0.1％(w/w)脱氧胆酸钠的5％(w/w) 纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体在冷藏贮存12天后的采用相 位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
图12.具有2％(w/w)羟丙基甲基纤维素(HPMC)和0.05％(w/w)DOSS 的10％(w/w)内米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学 技术拍摄的100X光学显微照片。
图13.具有2％(w/w)羟丙基甲基纤维素(HPMC)和0.05％(w/w)DOSS 的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体在冷藏贮存一周 后的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
图14.具有2％PluronicF108的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司 (Camida LLC)水分散体的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照 片。
图15.具有2％PluronicF108的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司 (Camida LLC)水分散体在冷藏贮存一周后的采用相位光学技术拍摄的 100X光学显微照片。
图16.具有2％Tween80的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
图17.具有2％Tween80的10％(w/w)纳米颗粒他克莫司(Camida LLC)水分散体在冷藏贮存一周后的采用相位光学技术拍摄的100X光学 显微照片。
发明的详细说明
A.引言
本发明涉及包含可注射的纳米颗粒免疫抑制制剂如纳米颗粒他克 莫司、纳米颗粒西罗莫司或其组合的可注射制剂的组合物。本发明中所 用的免疫抑制剂可以是任何水溶性差的免疫抑制剂。在本发明的一种实 施方案中，免疫抑制剂是他克莫司、西罗莫司或其组合。纳米颗粒免疫 抑制剂的有效平均粒度为小于约2000nm。
与常规的、非纳米颗粒或溶解形式的他克莫司或西罗莫司相比，含 纳米颗粒他克莫司、纳米颗粒西罗莫司或其组合的本发明的制剂的优点 包括但不局限于：(1)增加的水溶性；(2)增加的生物利用率；(3)由于增 强的生物利用率造成的较小的剂型大小；(4)由于增强的生物利用率造成 的较低的治疗剂量；(5)由于较低的剂量造成的不希望的副作用的降低的 风险；(6)增强的患者便利性和顺应性；和(7)在器官替换手术后更有效预 防器官排斥或者更有效治疗牛皮癣或其他的免疫性疾病。相比于可注射 的他克莫司或西罗莫司的常规形式，本发明的含他克莫司、西罗莫司或 其组合的可注射的纳米颗粒制剂的进一步的优点是消除了使用聚氧乙 烯(60)氢化蓖麻油(HCO-60)或聚山梨酯如聚山梨酯80作为增溶剂的需 要。
本发明还包括含他克莫司、西罗莫司或其组合以及一种或多种无毒 生理学可接受的载体、助剂或媒介体(总称为载体)的纳米颗粒组合物。 这些组合物可以配制成用于肠道外注射(例如，静脉内、肌肉或皮下)， 以固体、液体或气溶胶形式口服，阴道、鼻、直肠、眼、局部(粉末、软 膏或滴剂)、含服、脑池内、腹膜内或表面施用等。
B.定义
如同下面和整篇申请中所述，本文中使用若干定义来描述本发明。
本文使用的术语“小于约2000nm的有效平均粒度”意味着当用例如 沉降场流动分级、光子相关谱、光散射、盘式离心和本领域技术人员已 知的其它技术测定时，按重量计至少50％的他克莫司、西罗莫司或他克 莫司和西罗莫司颗粒的尺寸小于约2000nm。
如本文中使用的，“约”应该被本领域普通技术人员理解，并将随其 所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文， 对于本领域技术人员而言，其使用不是清楚的，那么“约”意思是不超过 所述特定术语的正负10％。
如本文使用的，关于稳定的他克莫司或西罗莫司颗粒，术语“稳定 的”包含但不限于一种或多种下述参数：(1)随着时间的过去，他克莫司 或西罗莫司颗粒没有因为颗粒相互间的引力而显著絮凝或凝聚或者粒 度明显增加；(2)随着时间的过去，他克莫司或西罗莫司颗粒的物理结构 不会改变，例如从无定形相转变为晶相；(3)他克莫司或西罗莫司颗粒是 化学稳定的；和/或(4)在制备本发明的纳米颗粒过程中，在他克莫司或 西罗莫司的熔点或熔点以上，他克莫司和/或西罗莫司没有经历加热步 骤。
术语“常规的”或“非纳米颗粒”他克莫司、西罗莫司或其组合应指溶 解的或有效平均粒度大于约2000nm的活性剂。如本文中所定义的纳米 颗粒活性剂的有效平均粒度小于约2000nm。
如本文中使用的短语“水溶性差的药物”，是指水中溶解度小于约30 mg/mL，小于约20mg/mL，小于约10mg/mL，或小于约1mg/mL的药 物。
如本文中所使用的，短语“治疗有效量”，应指对于在需要所述治疗 的众多受试者中所施用的药物提供了特定的药理学响应的药物剂量。应 该强调，在特定情形下，对特定受试者所施用的治疗有效量的药物，即 使所述剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量的，在治疗本文中所述 症状/疾病方面将不总是有效。
如本文中使用的，术语“颗粒”是指以离散颗粒、丸粒、珠粒或团粒 存在为特征的物质状态，而不管其大小、形状或形态如何。如本文中使 用的，术语“多颗粒”是指多个离散或聚集的颗粒、丸粒、珠粒、团粒或 其混合物，而不管其大小、形状或形态如何。
C.纳米颗粒免疫抑制组合物的特征
本发明的纳米颗粒免疫抑制组合物有很多增强的药理学特性。
1.增加的生物利用率
与现有的常规他克莫司或西罗莫司制剂相比，本发明的含他克莫 司、西罗莫司或其组合的制剂在相同的他克莫司、西罗莫司或其组合的 同样剂量下表现出增加的生物利用率。
非生物等效性是重要的，因为这意味着他克莫司、西罗莫司或其组 合的纳米颗粒剂型显示出明显更大的药物吸收。对于与常规微晶剂型生 物等效的纳米颗粒剂型，该纳米颗粒剂型将一定包含明显更少的药物。 因而，纳米颗粒剂型显著地增加了药物的生物利用率。
而且，含他克莫司、西罗莫司或其组合的纳米颗粒剂型要求更少的 药物以获得与常规微晶剂型(例如PROGRAF)所观察到的相同的药理学 作用。因此，相比于常规的微晶剂型，纳米颗粒剂型具有增加的生物利 用率。
2.本发明的他克莫司和/或西罗莫司组合物的药物动力学特征不受 摄入该组合物的受试者的进食或禁食状态的影响
本发明组合物包含他克莫司、西罗莫司或其组合，其中他克莫司、 西罗莫司或其组合的药物动力学特征基本上不受摄入该组合物的受试 者的进食或禁食状态的影响。这意味着，相对于禁食，当在进食状态下 施用含他克莫司、西罗莫司或其组合的纳米颗粒组合物时，药物吸收量 或药物吸收速率几乎没有或者没有明显的差别。
基本上消除食物影响的剂型的益处包括：增加了受试者的便利性， 从而提高了受试者的顺应性，因为所述受试者不需要确保他们在有食或 无食的条件下服药。这是重要的，因为在受试者对他克莫司或西罗莫司 较差的顺应性条件下，可能会观察到该药物用来治疗的医学症状的增 强，例如患者可能遭受器官排斥，或者未对牛皮癣或其他免疫性疾病进 行治疗。
本发明还优选地提供含他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物，其 当施用于哺乳动物受试者时，具有所希望的药物动力学特征。含他克莫 司、西罗莫司或其组合的组合物的所希望的药物动力学特征优选地包括 但不局限于：(1)当对施用后的哺乳动物受试者的血浆进行分析时，以相 同剂量施用，他克莫司、西罗莫司或其组合的Cmax优选地大于非纳米颗 粒他克莫司或西罗莫司制剂的Cmax；和/或(2)当对施用后的哺乳动物受 试者的血浆进行分析时，以相同剂量施用，他克莫司、西罗莫司或其组 合的AUC优选地大于非纳米颗粒他克莫司或西罗莫司制剂的AUC；和/ 或(3)当对施用后的哺乳动物受试者的血浆进行分析时，以相同剂量施 用，他克莫司、西罗莫司或其组合的Tmax优选地小于非纳米颗粒他克莫 司或西罗莫司制剂的Tmax。如本文中使用的，所希望的药物动力学特征 是在他克莫司、西罗莫司或其组合的首次剂量后所测量的药物动力学特 征。
在一种实施方案中，以相同剂量施用，在与非纳米颗粒他克莫司或 西罗莫司制剂的比较药物动力学试验中，含他克莫司、西罗莫司或其组 合的组合物显示出Tmax不大于非纳米颗粒他克莫司或西罗莫司制剂所 显示的Tmax的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约30％、 约25％、约20％、约15％、约10％或约5％。
在另一实施方案中，在与非纳米颗粒他克莫司或西罗莫司制剂的比 较药物动力学试验中，以相同剂量施用，本发明的含他克莫司、西罗莫 司或其组合的组合物显示出Cmax大于非纳米颗粒他克莫司或西罗莫司 制剂所显示出的Cmax至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少 约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、 至少约800％、至少约900％、至少约1000％、至少约1100％、至少约 1200％、至少约1300％、至少约1400％、至少约1500％、至少约1600％、 至少约1700％、至少约1800％或至少约1900％。
在又一个实施方案中，在与非纳米颗粒他克莫司或西罗莫司制剂的 比较药物动力学试验中，以相同剂量施用，本发明的含他克莫司、西罗 莫司或其组合的组合物显示出AUC大于非纳米颗粒他克莫司或西罗莫 司制剂所显示出的AUC至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少 约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、 至少约225％、至少约250％、至少约275％、至少约300％、至少约350％、 至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、 至少约750％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、 至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约 1100％、至少约1150％或者至少约1200％。
3.相对于禁食状态，在进食状态下施用时本发明的含免疫抑制化合 物的组合物的生物等效性
本发明还包括含纳米颗粒他克莫司、纳米颗粒西罗莫司或其组合的 组合物，其中在禁食状态下对受试者施用该组合物生物等效于在进食状 态下对受试者施用该组合物。相对于禁食状态，在进食状态下施用时， 含纳米颗粒他克莫司、纳米颗粒西罗莫司或其组合的组合物的吸收差异 优选地小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约 15％、小于约10％、小于约5％、或小于约3％。
在本发明的一个实施方案中，本发明包括含纳米颗粒他克莫司、纳 米颗粒西罗莫司或其组合的组合物，其中在禁食状态下对受试者施用该 组合物生物等效于在进食状态下对受试者施用该组合物，特别是正如由 美国食品与药物管理局和相应的欧洲管理机构(EMEA)所给出的Cmax和 AUC指南所定义的。根据美国FDA指南，如果AUC和Cmax的90％置 信区间(CI)处在0.80至1.25之间(就调节目的而言，Tmax测量与生物等 效性不相关)，则两种产品或方法是生物等效的。根据欧洲EMEA指南， 为了显示出两种化合物或施用状况之间的生物等效性，AUC的90％的 CI必须在0.80至1.25之间，而Cmax的90％的CI必须在0.70至1.43之 间。
4.本发明的免疫抑制组合物的溶解曲线
本发明的含他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物出乎意料地具有 令人惊奇的溶解曲线。所施用的活性剂的快速溶解是优选的，因为较快 的溶解一般会导致更快地发生作用和更大的生物利用率。为了改进含他 克莫司、西罗莫司或其组合的溶解曲线和生物利用率，提高药物的溶解 使其能达到接近100％的水平是有用的。
本发明的含他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物优选具有这样的 溶解曲线，其中在约5分钟内至少约20％的组合物被溶解。在本发明的 其他实施方案中，至少约30％或至少约40％的含他克莫司、西罗莫司或 其组合的组合物在约5分钟内溶解。在本发明的其它实施方案中，优选 至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的含 他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物在约10分钟内溶解。最后，在 本发明的另一实施方案中，优选至少约70％、至少约80％、至少约90％ 或至少约100％的含他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物在约20分钟 内溶解。
溶解优选在判别性介质中测量。这样一种溶解介质将对两种在胃液 中具有很不同的溶解曲线的产品产生两种很不相同的溶解曲线，即，该 溶解介质预测组合物的体内溶解情况。示例性的溶解介质是含0.025M 表面活性剂十二烷基硫酸钠的水介质。可以通过分光光度法测定所溶解 的量。旋动叶片法(欧洲药典)可用来测量溶解情况。
5.在生物相关介质中免疫抑制组合物的稳定性
本发明的含他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物的另外的特点是 当分散在生物相关介质中，所述组合物基本上保持纳米颗粒粒度。生物 相关介质模仿体内所存在的情况。由于本发明的纳米颗粒活性剂组合物 受益于活性剂的小粒度；如果在施用时，活性剂不基本上保持纳米颗粒 粒度的话，那么会形成“团块”或团聚的活性剂颗粒。随着这种团聚颗粒 的形成，剂型的生物利用率可能降低。
优选地，在生物相关介质中分散后，本发明的组合物保持小于约 2000nm的有效平均粒度。在本发明的其它实施方案中，本发明的再分 散的他克莫司和/或西罗莫司颗粒的有效平均粒度小于约1900nm，小于 约1800nm，小于约1700nm，小于约1600nm，小于约1500nm，小于 约1400nm，小于约1300nm，小于约1200nm，小于约1100nm，小于 约1000nm，小于约900nm，小于约800nm，小于约700nm，小于约 650nm，小于约600nm，小于约550nm，小于约500nm，小于约450nm， 小于约400nm，小于约350nm，小于约300nm，小于约250nm，小于 约200nm，小于约150nm，小于约100nm，小于约75nm或小于约50 nm，如通过光散射方法、显微技术或其他合适方法测量的。适于测量有 效平均粒度的所述方法为本领域普通技术人员所知。
这种生物相关的水介质可以是显示出所要求的离子强度和pH的任 何水介质，所述的离子强度和pH构成了介质生物相关性的基础。所要 求的pH和离子强度是在人体中存在的生理情况的代表。这种生物相关 的水介质可以是例如显示出所要求的pH值和离子强度的电解质水溶液 或任何盐、酸或碱的水溶液或其组合。
生物相关的pH是本领域众所周知的。例如，在胃中，pH范围是从 略小于2(但一般大于1)直至4或5。在小肠中，pH可以为4-6。在结肠 中，它可以是6-8。生物相关的离子强度也是本领域众所周知的。禁食 状态胃液的离子强度为约0.1M，而禁食状态肠液的离子强度为约0.14。 例如见Lindahl等的″Characterization of Fluids from the Stomach and Proximal Jejunum in Men and Women，″Pharm.Res.，14(4)：497- 502(1997)。
据信试验溶液的pH和离子强度比特定的化学内容物更为关键。因 此，合适的pH和离子强度值可以通过强酸、强碱、盐、单偶合或多偶 合的酸-碱对(即，弱酸和该酸的相应盐)、单质子和多质子电解质等的许 多种组合得到。代表性的电解质溶液可以是但不限于：浓度约0.001-约 0.1M的HCl溶液，和浓度约0.001-约0.1M的NaCl溶液，以及其混合 物。例如，电解质溶液可以是但不限于：约0.1M或更稀的HCl，约0.01M 或更稀的HCl，约0.001M或更稀的HCl，约0.1M或更稀的NaCl，约 0.01M或更稀的NaCl，约0.001M或更稀的NaCl，以及其混合物。在这 些电解质溶液中，0.01M HCl和/或0.1M NaCl最代表禁食人体生理条 件，归于近侧胃肠道的pH和离子强度条件。
0.001M HCl、0.01M HCl和0.1M HCl的电解质浓度分别相应于 pH＝3、pH＝2和pH＝1。例如，0.01M HCl溶液模拟了胃中存在的典型的 酸性条件。0.1M的NaCl溶液提供了在包括胃肠液在内的整个人体中存 在的离子强度条件的合理近似，不过高于0.1M的浓度可以用来模拟人 的胃肠道内的进食条件。显示出所要求的pH值和离子强度的盐、酸、 碱或其组合的示范性溶液包括但不限于，磷酸/磷酸盐+氯化钠、氯化钾 和氯化钙，乙酸/乙酸盐+氯化钠、氯化钾和氯化钙，碳酸/碳酸氢盐+氯 化钠、氯化钾和氯化钙，和柠檬酸/柠檬酸盐+氯化钠、氯化钾和氯化钙。
再分散性可以用本领域已知的任何合适的方法检测。参见例如美国 专利6,375,986(Solid Dose Nanoparticulate Compositions Comprising a Synergistic Composition of a Polymeric Surface Stabilizer and Dioctyl Sodium Sulfosuccinate)的实施例部分。
6.与其它活性剂联合使用的免疫抑制组合物
本发明的含他克莫司、西罗莫司或其组合的组合物可以另外含有一 种或多种可用于预防器官排斥或者治疗牛皮癣或其他免疫性疾病的化 合物。本发明的组合物可以与这些其它活性剂共同配制，或是本发明组 合物可以与所述活性剂一起共同施用或顺序施用。可以与他克莫司和/ 或西罗莫司共同施用或者共同配制的药物的实例，包括但不限于环孢菌 素、麦可酚酸、阿仑单抗、麦考酚酸吗乙酯、皮质类固醇、糖皮质类固 醇、多西环素、干扰素β-1b、丙二腈酰胺FK778、硫唑嘌呤、Campath-1H、 巴利昔单抗和甲氨蝶呤。
D.组合物
本发明提供了包含纳米颗粒他克莫司、西罗莫司或其组合和至少一 种表面稳定剂的组合物。表面稳定剂优选吸附或缔合于他克莫司或西罗 莫司颗粒的表面。本文中有用的表面稳定剂不与他克莫司或西罗莫司颗 粒或者自身发生化学反应。优选地，表面稳定剂的各个分子基本上没有 分子间交联键。在另一实施方案中，本发明的组合物可以包含两种或多 种表面稳定剂。
本发明还包括含他克莫司、西罗莫司或其组合以及一种或多种无毒 生理学可接受的载体、助剂或媒介体(总称为载体)的纳米颗粒组合物。 所述组合物可被配制成用于肠道外注射(例如静脉内、肌内或皮下注 射)、腹膜内注射等。
1.免疫抑制活性剂
用于本发明可注射的剂型的示范性的免疫抑制活性剂是他克莫司 和西罗莫司。
他克莫司，也称作FK-506或藤霉素，是一种23元的大环内酯。如 本文中使用的，术语“他克莫司”包括其类似物和盐，并且可以是结晶 相、无定形相、半结晶相、半无定形相或其混合物。他克莫司可能以一 种基本上旋光纯的对映体形式，或以对映体的混合物、外消旋物或其它 形式存在。他克莫司的常规形式包含增溶剂，如Cremophor，这是不希 望的。
西罗莫司可作为免疫抑制剂和抗真菌抗生素，它的用途描述在以下 文献中：美国专利3,929,992、3,993,749和4,316,885以及比利时专利 877,700。该化合物，仅微溶于水中，即20微克/mL，当受潮时迅速水解。 因为当遇到水介质时西罗莫司非常不稳定，所以已经开发出特别的可注 射制剂以便施用于患者，如欧洲专利EP041,795中所描述的那些。这种 制剂往往是不希望的，因为通常非水增溶剂表现出有毒性的副作用。如 本文中使用的，术语“西罗莫司”包括其类似物和盐，并且可以为晶相、 无定形相、半晶相、半无定形相或其混合物。西罗莫司可能以一种基本 上旋光纯的对映体的形式存在，或者以对映体的混合物、外消旋或其它 形式存在。
2.表面稳定剂
在本发明的含他克莫司、西罗莫司或其组合的可注射制剂中可以使 用一种以上表面稳定剂的组合。合适的表面稳定剂包括但不限于已知的 有机或无机药物赋形剂。这些赋形剂包括各种聚合物、低分子量低聚 物、天然产物和表面活性剂。表面稳定剂包括非离子型、阴离子型、阳 离子型、离子型和两性离子型表面活性剂。一种示范性的用于可注射的 纳米颗粒他克莫司和/或纳米颗粒西罗莫司制剂的表面稳定剂是聚维酮 聚合物。
表面稳定剂的代表性实例包括但是不局限于羟丙基甲基纤维素(现 称为″羟丙甲纤维素″)、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸 钠、磺基琥珀酸二辛酯、明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、葡聚糖、阿拉 伯树胶、胆固醇、黄蓍胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘 油酯、十六醇十八醇混合物、聚西托醇乳化蜡、失水山梨糖醇酯、聚氧 乙烯烷基醚(例如，聚乙二醇醚如聚西托醇1000)、聚氧乙烯蓖麻油衍生 物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，市售可得的Tween，例如， Tween 20和Tween 80(ICI Speciality Chemicals))；聚乙二醇(例如， Carbowaxes 3550和934(Union Carbide))、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二 氧化硅、磷酸盐/酯、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、 羟乙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙甲纤维素、非晶纤维素、硅酸铝镁、三 乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚与环氧乙烷和甲醛 的聚合物(亦称泰洛沙泊、四丁酚醛和triton)、泊洛沙姆(例如，Pluronics F68和F108，其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；poloxamines(例 如，Tetronic 908，亦称Poloxamine 908，它是由环氧丙烷和环氧乙烷 顺序加成到乙二胺而衍生形成的四官能嵌段共聚物(BASF Wyandotte Corporation，Parsippany，N.J.))；Tetronic 1508(T-1508)(BASF Wyandotte Corporation)，Triton X-200(一种烷基芳基聚醚磺酸酯，Rohn and Haas)；Crodestas F-110(蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的混合 物，Croda Inc.)；对异壬基苯氧基聚(缩水甘油)，也称作Olin-1OG或 Surfactant 10-G(Olin Chemicals，Stamford，CT)；Crodestas SL-40(Croda， Inc.)；和SA9OHCO(C18H37CH2(CON(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2， Eastman Kodak Co.)；癸酰-N-甲基葡糖酰胺(glucamide)；正癸基(-D- 吡喃葡糖苷；正癸基(-D-吡喃麦芽糖苷；正十二烷基(-D-吡喃葡糖苷； 正十二烷基(-D-麦芽糖苷；庚酰-N-甲基葡糖酰胺；正庚基-(-D-吡喃葡糖 苷；正庚基(-D-硫代葡糖苷；正己基(-D-吡喃葡糖苷；壬酰-N-甲基葡糖 酰胺；正壬酰(-D-吡喃葡糖苷；辛酰-N-甲基葡糖酰胺；正辛基-(-D-吡喃 葡糖苷；辛基(-D-硫代吡喃葡糖苷；PEG-磷脂，PEG-胆固醇，PEG-胆固 醇衍生物；PEG-维生素A，PEG-维生素E，溶菌酶，乙烯基吡咯烷酮和 乙酸乙烯酯的无规共聚物等。
有用的阳离子型表面稳定剂的实例包括但不局限于聚合物、生物聚 合物、多糖、纤维素质(cellulosics)、藻酸盐、磷脂和非聚合的化合物， 诸如两性离子型稳定剂、聚-n-甲基吡啶、氯化anthryul吡啶、阳离 子型磷脂、壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯基咪唑、polybrene、溴化聚甲基 丙烯酸甲酯三甲基溴化铵(PMMTMABr)、己基二苯乙酮基三甲基溴化铵 (HDMAB)和聚乙烯吡咯烷酮-2-二甲氨基乙基异丁烯酸酯硫酸二甲酯。 其他有用的阳离子型稳定剂包括但不局限于，阳离子型脂质、锍、辚和 季铵化合物，诸如硬脂基三甲基氯化铵、苄基二(2-氯乙基)乙基溴化铵、 椰油三甲基氯化铵或溴化铵、椰油甲基二羟乙基氯化铵或溴化铵、癸基 三乙基氯化铵、癸基二甲基羟乙基氯化铵或溴化铵、C12-15二甲基羟乙 基氯化铵或溴化铵、椰油二甲基羟乙基氯化铵或溴化铵、十四烷基三甲 基甲硫酸铵、月桂基二甲基苄基氯化铵或溴化铵、月桂基二甲基(氧乙烯 基)4氯化铵或溴化铵、N-烷基(C12-18)二甲基苄基氯化铵、N-烷基(C14-18) 二甲基苄基氯化铵、N-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物、二甲基二 癸基氯化铵、N-烷基和(C12-14)二甲基1-萘基甲基氯化铵、三甲基卤化 铵、烷基三甲基铵盐和二烷基二甲基铵盐、月桂基三甲基氯化铵、乙氧 基化烷酰氨基烷基二烷基铵盐和/或乙氧基化三烷基铵盐、二烷基苯二烷 基氯化铵、N-二癸基二甲基氯化铵、N-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水 合物、N-烷基(C12-14)二甲基1-萘基甲基氯化铵和十二烷基二甲基苄基氯 化铵、二烷基苯烷基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、烷基苄基甲基氯化 铵、烷基苄基二甲基溴化铵、C12，C15，C17三甲基溴化铵、十二烷基苄基 三乙基氯化铵、聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)、二甲基氯化铵、 烷基二甲基卤化铵、三(十六烷基)甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十 二烷基三乙基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、甲基三辛基氯化铵 (ALIQUAT336)、POLYQUAT、四丁基溴化铵、苄基三甲基溴化铵、胆 碱酯(诸如脂肪酸的胆碱酯)、苯扎氯铵、司拉氯铵(stearalkonium chloride)类化合物(诸如硬脂基三甲基氯化铵和二硬脂基二甲基氯化 铵)、十六烷基溴化吡啶或氯化吡啶、季铵化的聚氧乙基烷基胺的 卤化物盐、MIRAPOL和ALKAQUAT(Alkaril Chemical Company)、烷基 吡啶盐；胺，诸如烷基胺、二烷基胺、链烷醇胺、聚乙烯多胺、N，N- 二烷基氨基烷基丙烯酸酯和乙烯基吡啶，胺盐，诸如十二烷基胺乙酸 盐、十八烷基胺乙酸盐、烷基吡啶盐和烷基咪唑盐，和氧化胺；酰 亚胺吡咯(imide azolinium)盐；质子化的季型丙烯酰胺；甲基化的季型 聚合物如聚[二烯丙基二甲基氯化铵]和聚[N-甲基乙烯基氯化吡啶]； 和阳离子型瓜尔胶。
这种示例性的阳离子型表面稳定剂和其它有用的阳离子型表面稳 定剂描述于以下文献中：J.Cross和E.Singer，Cationic Surfactants： Analytical and Biological Evaluation(Marcel Dekker，1994)；P.和D. Rubingh(编者)，Cationic Surfactants：Physical Chemistry(Marcel Dekker， 1991)；和J.Richmond，Cationic Surfactants：Organic Chemistry，(Marcel Dekker，1990)。
非聚合的表面稳定剂是任何非聚合的化合物，如苯扎氯铵、碳化 合物、辚化合物、氧锚化合物、卤化合物、阳离子型有机金属化合物、 季磷化合物、吡啶化合物、苯胺化合物、铵化合物、羟基铵化合物、 伯铵化合物、仲铵化合物、叔铵化合物和通式NR1R2R3R4(+)的季铵化 合物。对于通式NR1R2R3R4(+)的化合物来说：
(i)R1-R4都不是CH3；
(ii)R1-R4中的一个是CH3；
(iii)R1-R4中的三个是CH3；
(iv)R1-R4全部都是CH3；
(v)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是C6H5CH2，且R1-R4 中的一个是7个或更少个碳原子的烷基链；
(vi)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是C6H5CH2，且R1-R4 中的一个是19个或更多个碳原子的烷基链；
(vii)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是基团C6H5(CH2)n， 其中n＞1；
(viii)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是C6H5CH2，且R1- R4中的一个含至少一个杂原子；
(ix)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是C6H5CH2，且R1-R4 中的一个含至少一个卤素；
(x)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是C6H5CH2，且R1-R4 中的一个含至少一个环状片段；
(xi)R1-R4中的两个是CH3，R1-R4中的一个是苯环；或
(xii)R1-R4中的两个是CH3并且R1-R4中的两个是纯粹的脂族片 段。
这些化合物包括但不限于：二十二烷基苄基二甲基氯化铵、氯化 benzethonium、十六烷基氯化吡啶、二十二烷基三甲基氯化铵、十二 烷基苄基二甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、十六烷基三甲基 溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基氢氟胺、氯化氯烯丙基六亚 甲基四胺(Quaternium-15)、二硬脂基二甲基氯化铵(Quaternium-5)、十二 烷基二甲基乙基苄基氯化铵(Quaternium-14)、Quaternium-22、 Quaternium-26、Quaternium-18锂蒙脱石、二甲氨乙基氯盐酸盐、半胱 氨酸盐酸盐、二乙醇铵POE(10)油基醚磷酸盐、二乙醇铵POE(3)油基醚 磷酸盐、牛脂基苄基二甲基氯化铵、二甲基二(十八烷基)铵膨润土、司 拉氯铵、溴化杜灭芬、地那铵苯甲酸盐、十四烷基苄基二甲基氯化铵、 十二烷基三甲基氯化铵、乙二胺二盐酸盐、盐酸胍、盐酸吡哆醇、盐酸 碘非他胺、盐酸葡甲胺、甲苄索氯铵、十四烷基三甲基溴化铵、油基三 甲基氯化铵、Polyquaternium-1、盐酸普鲁卡因、椰油基甜菜碱、硬脂基 苄基二甲基铵膨润土、硬脂基苄基二甲基铵锂蒙脱石、十八烷基三羟基 乙基丙二胺二氢氟酸盐、牛脂基三甲基氯化铵和十六烷基三甲基溴化 铵。
这些表面稳定剂的大多数是已知的药物赋形剂，在The American Pharmaceutical Association和The Pharmaceutical Society of Great Britain 联合出版的Handbook of Pharmaceutical Excipients(The Pharmaceutical Press，2000)中有详细说明，特别引入本文作为参考。
聚维酮聚合物
聚维酮聚合物是用于配制可注射的纳米颗粒他克莫司和/或纳米颗 粒西罗莫司制剂的示范性的表面稳定剂。聚维酮聚合物，亦称 ″polyvidon(e)″、″povidonum″、″PVP″和″聚乙烯吡咯烷酮″，以 Kollidon(BASF Corp.)和Plasdone(ISP Technologies，Inc.)的商品名销 售。它们是多分散的大分子，化学名称为1-乙烯基(ethenyl)-2-吡咯烷酮 聚合物和1-乙烯基(vinyl)-2-吡咯烷酮聚合物。聚维酮聚合物作为商业产 品被制备成平均分子量从约10,000到约700,000道尔顿的一系列产品。 要用作施用给哺乳动物的药物化合物的表面改性剂，聚维酮聚合物的分 子量必须小于约40,000道尔顿，因为大于40,000的分子量将难以从体 内清除。
聚维酮聚合物用例如Reppe方法制备，包括：(1)利用Reppe丁二烯 合成法，由乙炔和甲醛得到1，4-丁二醇；(2)在200℃将1，4-丁二醇于铜 上脱氢，形成γ-丁内酯；(3)使γ-丁内酯与氨反应，生成吡咯烷酮。随后 用乙炔处理，得到乙烯基吡咯烷酮单体。在H2O和NH3存在下，通过加 热进行聚合。参见The Merck Index，10th Edition，pp.7581(Merck&Co.， Rahway，NJ；1983)。
聚维酮聚合物的制造方法产生的聚合物包含链长不等的分子，因而 分子量不同。对于每种特定的市售可得的品级，所述分子的分子量大约 围绕一平均值变化。因为难以直接确定聚合物的分子量，所以最常用的 将不同分子量等级分类的方法是利用基于粘度测量值的K值。各种不同 等级的聚维酮聚合物的K值代表平均分子量的函数，其得自粘度测量 值，并且根据Fikentscher公式计算。
分子量的重均值Mw是通过测量各个分子的重量的方法如光散射法 而确定的。表1提供了几种市售可得的聚维酮聚合物的分子量数据，所 述聚维酮聚合物都是可溶的。
表1
聚维酮 K-值 Mv(道尔顿)** Mw(道尔顿)** Mn(道尔顿)** Plasdone C-15 17±1 7,000 10,500 3,000 Plasdone C-30 30.5±1.5 38,000 62,500* 16,500 Kollidon 12 PF 11-14 3,900 2,000-3,000 1,300 Kollidon 17 PF 16-18 9,300 7,000-11,000 2,500 Kollidon 25 24-32 25,700 28,000-34,000 6,000
*因为分子量大于40,000道尔顿，此种聚维酮聚合物不宜用作肠道外施用(即， 注射)的药物化合物的表面稳定剂。
**Mv是粘均分子量，Mn是数均分子量，Mw是重均分子量。Mw和Mn通过光 散射和超离心方法测定，Mv通过粘度测量来确定。
根据表1中提供的数据，示范性的有用的市售可得的聚维酮聚合物 包括但不限于：Plasdone C-15、Kollidon 12 PF、Kollidon 17 PF和 Kollidon 25。
3.纳米颗粒他克莫司和西罗莫司的粒度
如本文中使用的，根据如本领域技术人员熟知的常规粒度测量技术 所测量的重均粒度来确定粒度。所述技术包括例如沉降场流动分级、光 子相关谱法、光散射和盘式离心法。
本发明的免疫抑制组合物包括他克莫司和/或西罗莫司纳米颗粒，其 有效平均粒度小于约2000nm(即2微米)。在本发明的其它实施方案中， 他克莫司和西罗莫司纳米颗粒的有效平均粒度小于约1900nm，小于约 1800nm，小于约1700nm，小于约1600nm，小于约1500nm，小于约 1400nm，小于约1300nm，小于约1200nm，小于约1100nm，小于约 1000nm，小于约900nm，小于约800nm，小于约700nm，小于约650 nm，小于约600nm，小于约550nm，小于约500nm，小于约450nm， 小于约400nm，小于约350nm，小于约300nm，小于约250nm，小于 约200nm，小于约150nm，小于约100nm，小于约75nm或小于约50 nm，如通过光散射方法、显微技术或其他合适方法测量的。
“小于约2000nm的有效平均粒度”是指按重量计算，至少50％的所 述他克莫司、西罗莫司或他克莫司和西罗莫司颗粒的粒度小于有效平均 值，即小于约2000nm。如果“有效平均粒度”小于约1900nm，那么， 当通过如上所述的技术进行测量时，至少约50％的他克莫司、西罗莫司 或他克莫司和西罗莫司颗粒的大小为小于约1900nm。对于上述其它粒 度，同样如此。在其他的实施方案中，至少约60％、至少约70％、至少 约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的他克莫司、西罗莫司 或他克莫司和西罗莫司颗粒的粒度小于有效平均值，即小于约2000 nm、小于约1900nm、小于约1800nm等。
在本发明中，纳米颗粒他克莫司、西罗莫司或他克莫司和西罗莫司 组合物的D50值是按重量计算，50％的他克莫司、西罗莫司或他克莫司 和西罗莫司颗粒所低于的粒度。同样地，D90是按重量计算，90％的他 克莫司、西罗莫司或他克莫司和西罗莫司颗粒所低于的粒度。
4.纳米颗粒免疫抑制化合物和表面稳定剂的浓度
他克莫司、西罗莫司和其组合以及一种或多种表面稳定剂的相对数 量可以在很大范围内变化。单独组分的最优数量例如取决于所选的表面 稳定剂的物理和化学性质，如亲水亲油平衡(HLB)、熔点和稳定剂的水 溶液的表面张力等等。
优选地，他克莫司、西罗莫司或其组合的浓度可以如下变化：约 99.5wt％-约0.001wt％，约95wt％-约0.1wt％，或约90wt％-约0.5wt％， 基于他克莫司、西罗莫司或其组合和至少一种表面稳定剂的总重量，不 包括其它赋形剂。从剂量和成本效率观点来看，活性成分的较高的浓度 通常是优选的。
优选地，表面稳定剂的浓度可以如下变化：约0.5wt％-约 99.999wt％，约5.0wt％-约99.9wt％，或约10wt％-约99.5wt％，基于活性 剂和至少一种表面稳定剂的总干重，不包括其它赋形剂。
5.其他的药物赋形剂
本发明的药物组合物，根据给药途径和所希望的剂型，还可以含有 一种或多种粘合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、防腐 剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。这些赋形剂是本 领域众所周知的。
填充剂的实例是乳糖一水合物、无水乳糖和各种淀粉；粘合剂的实 例是各种纤维素和交联的聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素如AvicelPH101 和AvicelPH102、微晶纤维素、和硅酸化微晶纤维素(ProSolv SMCCTM)。
合适的润滑剂，其包括对要被压缩的粉末的流动性起作用的试剂， 是胶体二氧化硅，例如Aerosil200、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂 酸钙和硅胶。
甜味剂的实例是任何天然或人工甜味剂，例如蔗糖、木糖醇、糖精 钠、环己氨磺酸盐、天冬甜素和乙酰舒泛(acsulfame)。矫味剂的实例是 Magnasweet(MAFCO商标)、泡泡糖香料和水果香料等。
防腐剂的实例是山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙 酯、苯甲酸及其盐、对羟基苯甲酸的其它酯如对羟基苯甲酸丁酯、醇如 乙醇或苯甲醇、酚类化合物如苯酚、和季铵化合物如苯扎氯铵。
合适的稀释剂包括药用可接受的惰性填料，例如微晶纤维素、乳 糖、磷酸氢钙、糖类和/或上述任何物质的混合物。稀释剂的实例包括微 晶纤维素，例如AvicelPH101和AvicelPH102；乳糖，例如乳糖一水 合物、无水乳糖和PharmatoseDCL21；磷酸氢钙，例如Emcompress； 甘露糖醇；淀粉；山梨糖醇；蔗糖和葡萄糖。
合适的崩解剂包括轻度交联的聚乙烯吡咯烷酮、玉蜀黍(corn)淀 粉、马铃薯淀粉、玉米(maize)淀粉及改性淀粉，交联的羧甲基纤维素钠， 交聚维酮(cross-povidone)，淀粉羟乙酸钠及其混合物。
泡腾剂的实例是泡腾配对物，例如有机酸与碳酸盐或碳酸氢盐。合 适的有机酸包括例如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、己二酸、丁二 酸和藻酸以及酸酐和酸式盐。合适的碳酸盐和碳酸氢盐包括例如碳酸 钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、甘氨酸碳酸钠、L-赖氨酸 碳酸盐和精氨酸碳酸盐。或者，可以只存在泡腾配对物中的碳酸氢钠组 分。
6.可注射的纳米颗粒他克莫司制剂
本发明提供了含他克莫司、西罗莫司或其组合的可注射的纳米颗粒 制剂，其在低的注射体积中包括高药物浓度。示范性的制剂包括，基于 w/w％计：
免疫抑制活性剂：1.0-50％
表面稳定剂：0.1-50％
防腐剂：0.05-0.25％
pH调节剂：pH为约6-约7
水：q.s.
示范性的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯(约0.18％，基于w/w％)、对 羟基苯甲酸丙酯(约0.02％，基于w/w％)、苯酚(约0.5％，基于w/w％)、 和苄醇(高至2％v/v)。示范性的pH调节剂是氢氧化钠，示范性的液体载 体是无菌注射水。其它有用的防腐剂、pH调节剂和液体载体是本领域 众所周知的。
本发明中的活性他克莫司或西罗莫司可能以一种基本上旋光纯的 对映体的形式存在，或者以对映体的混合物、外消旋或其它形式存在。 所述免疫抑制剂优选存在于本发明的可注射的纳米颗粒制剂中，其数量 为约0.01mg-约50mg，或者其数量为约0.05mg-约20mg。
E.制备纳米颗粒他克莫司和/或西罗莫司制剂的方法
使用本领域中任何合适的已知方法如研磨、均化、沉淀或超临界流 体粒子生成技术，可以制备纳米颗粒他克莫司和/或西罗莫司组合物。制 备纳米颗粒活性剂组合物的示范性的方法描述于美国专利5,145,684 中。此外在以下文献中描述了制备纳米颗粒活性剂组合物的方法：美国 专利5,518,187(Method of Grinding Pharmaceutical Substances)、美国专利 5,718,388(Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances)、美 国专利5,862,999(Method of Grinding Pharmaceutical Substances)、美国专 利5,665,331(Co-Microprecipitation of Nano particulate Pharmaceutical Agents with Crystal Growth Modifiers)、美国专利5,662,883(Co- Microprecipitation of Nano particulate Pharmaceutical Agents with Crystal Growth Modifiers)、美国专利5,560,932(Microprecipitation of Nano particulate Pharmaceutical Agents)、美国专利5,543,133(Process of Preparing X-Ray Contrast Compositions Containing Nanoparticles)、美国专 利5,534,270(Method of Preparing Stable Drug Nanoparticles)、美国专利 5,510,118(Process of Preparing Therapeutic Compositions Containing Nanoparticles)和美国专利5,470,583(Method of Preparing Nanoparticle Compositions Containing Charged Phospholipids to Reduce Aggregation)， 其全部特别引入本文作为参考。
所形成的纳米颗粒他克莫司和/或西罗莫司组合物或分散体可能以 固体、半固体或液体剂型制剂的形式使用，例如液体分散体、凝胶、气 溶胶、油膏、乳膏、控释制剂、速熔制剂、冷冻干燥制剂、片剂、胶囊、 延迟释放制剂、延长释放制剂、脉动释放制剂、混合型立即释放剂和控 释制剂等。在本发明中，可注射的剂型是优选的。
在本发明的另一方面中，提供了一种制备本发明的可注射的纳米颗 粒免疫抑制制剂的方法。所述方法包括以下步骤：(1)在液体分散介质中 将期望剂量的他克莫司、西罗莫司或其组合的分散；和(2)用机械方法将 他克莫司、西罗莫司或其组合的粒度减小到小于约2000nm的有效平均 粒度。在活性剂的粒度减小之前、之中或之后，可以将表面稳定剂添加 到分散介质中。在一种实施方案中，所述表面稳定剂是分子量小于约 40,000道尔顿的聚维酮聚合物。在粒度减小过程期间，可以将液体分散 介质维持在生理pH水平，例如约3.0-约8.0；在粒度减小过程期间，更 优选为约5.0-约7.5。在另一实施方案中，用于粒度减小过程的分散介质 是水性的。
使用粒度减小方法，将免疫抑制剂的粒度减小到小于约2000nm的 有效平均粒度。为他克莫司或西罗莫司免疫抑制剂的粒度减小而提供机 械力的有效方法包括球磨研磨、介质研磨和均化，例如利用 Microfluidizer(Microfluidics Corp.)。球磨研磨是一种使用研磨介质、药 物、稳定剂和液体的低能量研磨方法。材料被置于以最佳速度旋转的研 磨容器中，使得研磨介质阶式落下并且通过撞击使得药物粒度减小。所 用的介质必须具有高密度，因为用于粒度减小的能量是由重力和研磨介 质的质量提供的。
介质研磨是高能量研磨方法。将药物、稳定剂和液体置于储存器 内，在含有介质和转轴/叶轮的小室内再循环。转轴搅动介质，其使药物 受到冲击和剪切力作用，从而减小了药物的粒度。
均化是一种未使用研磨介质的技术。药物、稳定剂和液体(或者药物 和液体，稳定剂在粒度减小后加入)组成工艺物流，其被推进到工艺段 中，所述工艺段在Microfluidizer中被叫为互作用腔(Interaction Chamber)。待处理的产物被引入泵中，然后推出。Microfluidizer的起 动阀将泵中的空气排出。一旦泵中充满产物，起动阀被关闭并且产物被 推压穿过互作用腔。互作用腔的几何结构产生强有力的剪切、冲击和空 化作用力，这是粒度减小的原因。具体地说，在互作用腔内，受压的产 物被分成两股物流并被加速到极高的速度。所形成的射流随后在相互作 用区域中彼此互射和碰撞。所形成的产物具有很细和均匀的粒度或液滴 大小。Microfluidizer还提供了热交换器以使产物冷却。美国专利 5,510,118提及了使用Microfluidizer的方法，该专利特意引入本文作为 参考。
可以将免疫抑制剂添加到在其中免疫抑制剂基本上不溶解的液体 介质，从而形成预混物。表面稳定剂可以存在于预混物中，或者其可以 在粒度减小后添加到药物分散体中。通过使预混物经历机械设备而使分 散体中的平均他克莫司或西罗莫司粒度减小到小于约2000nm，从而能 够直接使用该预混物。优选的是当使用球磨机来研磨时，直接使用预混 物。或者，使用合适的搅动，例如Cowles型混合器，可以将免疫抑制 剂和至少一种表面稳定剂分散在液体介质中，直至观察到均质的分散 体，其中没有肉眼可见的大凝聚体。优选的是当使用再循环介质磨机进 行研磨时，预混物经受这样一种预研磨分散步骤。
用于使他克莫司或西罗莫司粒度减小的机械设备可以采取分散研 磨机的形式。合适的分散研磨机包括球磨机、立式磨机(attritor mill)、 振动磨机、介质磨机诸如砂磨机和珠磨机。介质磨机是优选的，因为需 要相对较短的研磨时间来提供期望的粒度的减小。对于介质磨机，预混 物的表观粘度优选为约100-约1000厘泊，对于球磨研磨，预混物的表 观粘度优选为约1直至约100厘泊。这样的范围往往提供了有效的粒度 减小和介质侵蚀之间的最佳平衡。
研磨时间可以在很大范围内改变，并且这主要取决于特定的机械设 备和所选的加工条件。对于球磨机，可能要求最多5天或更长一些的加 工时间。或者，借助于高剪切介质磨机，短于1天的加工时间是可能的 (停留时间为1分钟直至数小时)。
在不明显使免疫抑制剂分子降解的温度下，可以使他克莫司或西罗 莫司颗粒的粒度减小。通常优选加工温度为小于约30-小于约40℃。如 果期望的话，可以借助传统冷却设备来冷却加工设备。例如，考虑通过 夹套或者将磨机腔室浸入冰水中来控制温度。通常，本发明的方法是在 环境温度和对于研磨方法来说安全和有效的加工压力的条件下方便地 进行的。环境加工压力是球磨机、立式磨机和振动磨机所典型使用的。
研磨介质
粒度减小步骤的研磨介质可选自刚性介质，优选球形或颗粒状的， 平均尺寸小于约3mm，更优选小于约1mm。这种介质令人想望地可以 提供具有较短加工时间的本发明的颗粒并且使研磨设备有较小的磨 损。不认为研磨介质的材料选择是关键的。氧化锆如用氧化镁稳定的 95％ZrO、硅酸锆、陶瓷、不锈钢、二氧化钛、氧化铝、用钇稳定的 95％ZrO、玻璃研磨介质和聚合物研磨介质是示范性的研磨材料。
研磨介质可以包括颗粒，其优选基本上是球状的，例如珠粒，基本 上由聚合树脂或其它合适的材料组成。或者，研磨介质可以包括具有粘 附于其上的聚合树脂涂层的芯。聚合树脂的密度可以为约0.8-约 3.0g/cm3。
通常，合适的聚合树脂在化学和物理上是惰性的，基本上不含金 属、溶剂和单体，并具有足够的硬度和脆性，使其能避免在研磨期间碎 裂或粉碎。合适的聚合树脂包括交联聚苯乙烯，如用二乙烯基苯交联的 聚苯乙烯；苯乙烯共聚物；聚碳酸酯；聚缩醛，例如Delrin(E.I.du Pont de Nemours and Co.)；氯乙烯聚合物和共聚物；聚氨酯；聚酰胺；聚(四 氟乙烯)，例如Teflon(E.I.du Pont de Nemours and Co.)和其它含氟聚合 物；高密度聚乙烯；聚丙烯；纤维素醚和酯，例如乙酸纤维素；聚羟基 异丁烯酸酯；聚羟乙基丙烯酸酯；和含硅氧烷聚合物，例如聚硅氧烷等。 聚合物可以是生物可降解的。示范性的可生物降解的聚合物包括聚(丙交 酯)、聚(乙交酯)、丙交酯和乙交酯的共聚物、聚酐、聚(甲基丙烯酸羟乙 酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(N-酰基羟脯氨酸)酯、聚(N-棕榈酰羟脯氨酸) 酯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚(原酸酯)、聚(己内酯)和聚(磷腈)。对于 可生物降解的聚合物，介质本身的污染可以有利地进行体内新陈代谢而 变为生物可接受的产物，其可以从身体中排出。
研磨介质优选尺寸为约0.01-约3mm。对于精细研磨来说，研磨介 质的尺寸优选地为约0.02-约2mm，更优选地为约0.03-约1mm。
在优选的研磨方法中，连续地制造颗粒。这种方法包括将活性的他 克莫司或西罗莫司连续加入到研磨室中，使所述化合物与研磨介质接 触，同时在研磨室内使粒度减小，并从研磨室中连续取出活性纳米颗 粒。
在二次加工中利用常规的分离技术，例如利用简单过滤，经过筛网 过滤器或滤网筛分等，将研磨介质与研磨过的纳米颗粒他克莫司或西罗 莫司分离。也可以使用其它的分离技术例如离心。
无菌产品制造
可注射的组合物的发展要求制造无菌产品。本发明的制造方法与用 于无菌混悬液的典型的已知制造方法类似。典型的无菌混悬液的制造工 艺流程图如下：
(介质调节)
↓
混配
↓
粒度减小
↓
装瓶
(冷冻干燥)和/或(末端杀菌)
如括号内任选步骤所示，一些加工取决于粒度减小的方法和/或杀菌 的方法。例如，对于不使用介质的研磨方法，不需要介质调节。如果末 端杀菌不是可行的，由于化学和/或物理不稳定性造成的，则可以使用无 菌加工。
F.治疗方法
本发明的又一个方面提供了一种使用本发明的可注射的纳米颗粒 他克莫司或西罗莫司制剂对包括人在内的哺乳动物进行治疗以预防器 官排斥或治疗牛皮癣或其他免疫性疾病。所述方法包括以下步骤：将本 发明的治疗有效量的可注射的纳米颗粒他克莫司或西罗莫司制剂施用 于受试者以便在患者内形成皮下或肌内贮点。随着时间，所述贮点缓慢 地释放活性物质而向同种异体器官接受者提供长期治疗或者治疗牛皮 癣或其他免疫性疾病。他克莫司或西罗莫司的贮点制剂可以提供免疫抑 制治疗长达1年，如果要求这样的话。
在本发明的其它实施方案中，可注射的贮点纳米颗粒他克莫司、西 罗莫司或其组合组合物提供了药物的治疗水平达高达约1星期、高达约 2星期、高达约3星期、高达约4星期、高达约5星期、高达约6星期、 高达约7星期、高达约8星期、高达约9星期、高达约10星期、高达 约11星期、高达约12星期、高达约1月、高达约2月、高达约3月、 高达约4月、高达约5月、高达约6月、高达约7月、高达约8月、高 达约9月、高达约10月、高达约11月或高达约1年。
本发明特别有益的特点是本发明的可注射的纳米颗粒他克莫司、西 罗莫司或他克莫司和西罗莫司制剂可以被注射到患者体内成为贮点并 且消除了使用聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油(HCO-60)和/或聚山梨酯诸如聚 山梨酯80作为增溶剂的需要。另外，本发明的可注射制剂可以在贮点 输送系统中提供高浓度的他克莫司、西罗莫司或其组合以便实现长期治 疗效果。
本领域普通技术将会理解的是他克莫司、西罗莫司或其组合的有效 量可以凭经验确定并且能够以纯的形式使用，其中，所述形式以药用可 接受的盐、酯或前体药物形式存在。因此，所选的剂量水平取决于期望 的治疗效果、施用途径、所施用的他克莫司、西罗莫司或其组合的效力、 期望的治疗持续时间以及其它因素。
剂量单元组合物可以含有其约量(submultiples)的这些数量，所述 约量可用来构成日剂量。然而应该理解，对于任何特定的患者，具体的 剂量水平将取决于多种因素：要实现的细胞或生理响应的类型和程度； 使用的具体作用剂或组合物的活性；使用的具体作用剂或组合物；患者 的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和药 物的排泄速度；治疗的持续时间；与具体作用剂联合或同时使用的药 物；以及医学领域中熟知的类似因素。
* * * * *
给出以下实施例用以说明本发明。然而应该理解，本发明的精神和 范围不限于这些实施例中描述的具体条件或细节，而只应受权利要求的 范围的限制。本文中给出的所有参考文献，包括美国专利，都特别引入 作为参考。
实施例
实施例1
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。图1显示了未研磨的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X 光学显微照片。
结合有2％(w/w)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K29/32和0.05％(w/w)磺基琥 珀酸二辛酯(DOSS)的10％(w/w)他克莫司(Camida LLC)水分散体在 NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国专 利6,431,478)的10ml研磨室中与500微米的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将混合物在2500rpm的速度下研 磨60分钟。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 192nm，D50为177nm，D90为278nm，如表1所示。图2显示了研 磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。在 ＜15℃下冷藏1周后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度 是245nm，D50是219nm，D90是374nm。图3显示了冷藏1周后的 研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
表1 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /PVP/DOSS样品 192 177 278 他克莫司 /PVP/DOSS样 品，冷藏1周后 245 219 374
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为192nm，并且储存后观察到极小的粒度增加。
实施例2
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
结合有2％PVP K12和0.15％脱氧胆酸钠的10％(w/w)他克莫司 (Camida LLC)水分散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国专利6,431,478)的10ml研磨室中与500微米 的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将混 合物在2500rpm的速度下研磨150分钟。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。平均的研磨后的他克莫司的粒度为329 nm，D50为303nm，D90为466nm。图4显示了研磨后的他克莫司的 采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为329nm。
实施例3
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
结合有3％(w/w)PluronicS630和0.05％(w/w)DOSS的20％(w/w)他 克莫司(Camida LLC)水分散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国专利6,431,478)的10ml研磨室中与500微 米的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将 混合物在2500rpm的速度下研磨60分钟。图5中显示了研磨后的他克 莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 171nm，D50为163nm，D90为230nm，如以下表2所示。在＜15℃ 下冷藏1周后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度是194 nm，D50是180nm，D90是279nm。图6中显示了在冷藏贮存一周后 的研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
表2 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /Pluronic S630/DOSS样品 171 163 230 他克莫司 /Pluronic S630/DOSS样 品，冷藏1周后 194 180 279
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为171nm，并且储存后观察到极小的粒度增加。
实施例4
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
结合有2％羟丙基纤维素(HPC-SL)和0.1％(w/w)DOSS的10％(w/w) 他克莫司(Camida LLC)水分散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems， King of Prussia，PA；参见例如美国专利6,431,478)的10ml研磨室中与500 微米的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。 将混合物在2500rpm的速度下研磨150分钟。图7中显示了研磨后的他 克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。平均的研磨后的他克莫司的粒度为389 nm，D50为328nm，D90为614nm。
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为389nm。
实施例5
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
结合有1％(w/w)HPC-SL和0.15％(w/w)DOSS的5％(w/w)他克莫司 (Camida LLC)水分散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国专利6,431,478)的10ml研磨室中与500微米 的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将混 合物在5500rpm的速度下研磨90分钟。图8中显示了研磨后的他克莫 司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 169nm，D50为160nm，D90为225nm，如以下表3所示。在＜15℃ 下冷藏12天后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度是155 nm，D50是138nm，D90是216nm。图9中显示了研磨后的他克莫司 在冷藏贮存12天后的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
表3 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /HPC-SL/DOSS 样品 169 160 225 他克莫司/HPC- SL/DOSS样品， 冷藏12天后 155 138 216
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为169nm，并且储存后观察到极小的粒度变化。
实施例6
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
结合有1％(w/w)HPC-SL和0.1％(w/w)脱氧胆酸钠的5％(w/w)他克莫 司(Camida LLC)水分散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国专利6,431,478)的10ml研磨室中与500微米 的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将混 合物在5500rpm的速度下研磨75分钟。图10中显示了研磨后的他克莫 司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA 910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 1780nm，D50为220nm，D90为6665nm，如以下表4所示。在＜15℃ 下冷藏12天后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度是 65100nm，D50是31252nm，D90是175813nm。图11中显示了研磨 后的他克莫司在冷藏贮存12天后的采用相位光学技术拍摄的100X光学 显微照片。
表4 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /HPC-SL/脱氧胆 酸钠 1780 220 6665 他克莫司/HPC- SL/脱氧胆酸钠 样品，冷藏12天 后 65100 31252 175813
结果表明未成功制备稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为在存储12 天后，观察到明显的粒度增加和结块现象。此外，在研磨后的采用相位 光学技术拍摄的100X光学显微照片还显示了大的、可能的“未研磨”晶 体的存在。
实施例7
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
结合有2％(w/w)羟丙基甲基纤维素(HPMC)和0.05％(w/w)DOSS的 10％(w/w)他克莫司(Camida LLC)水分散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国专利6,431,478)的10ml研磨 室中与500微米的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量) 一起研磨。将混合物在2500rpm的速度下研磨60分钟。图12中显示了 研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA 910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 215nm，D50为196nm，D90为311nm，如以下表5所示。在＜15℃ 下冷藏1周后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度是227 nm，D50是206nm，D90是337nm。图13中显示了在冷藏贮存一周后 的研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
表5 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /HPMC/DOSS 215 196 311 他克莫司 /HPMC/DOSS样 品，冷藏1周后 227 206 337
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为215nm，并且储存后观察到极小的粒度增加。
实施例8
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
10％(w/w)他克莫司(Camida LLC)和2％(w/w)PluronicF108的水分 散体在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如 美国专利6,431,478)的10ml研磨室中与500微米的PolyMill研磨介质 (Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将混合物在2500rpm的速 度下研磨60分钟。图14中显示了研磨后的他克莫司的采用相位光学技 术拍摄的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA 910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 237nm，D50为212nm，D90为355nm，如以下表6所示。在＜15℃ 下冷藏1周后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度是332 nm，D50是306nm，D90是467nm。图15中显示了在冷藏贮存一周后 的研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
表6 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /PluronicF108 237 212 355 他克莫司 /PluronicF108 样品，冷藏1周 后 332 306 467
结果表明成功地制备了稳定的纳米颗粒他克莫司制剂，因为得到的 平均粒度为237nm，并且储存后观察到极小的粒度增加。
实施例9
该实施例的目的是制备适于作为可注射的剂型的纳米颗粒他克莫 司制剂。
10％(w/w)他克莫司(Camida LLC)和2％(w/w)Tween80的水分散体 在NanoMill0.01(NanoMill Systems，King of Prussia，PA；参见例如美国 专利6,431,478)的10ml研磨室中与500微米的PolyMill研磨介质(Dow Chemical，89％介质装载量)一起研磨。将混合物在2500rpm的速度下研 磨60分钟。图16中显示了研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄 的100X光学显微照片。
研磨后，在去离子的蒸馏水中使用Horiba LA 910粒度分析器测量 研磨后的他克莫司颗粒的粒度。初始平均的研磨后的他克莫司的粒度为 208nm，D50为191nm，D90为298nm，如以下表7所示。在＜15℃ 下冷藏1周后，在蒸馏水中的第二次测量中，平均他克莫司粒度是406 nm，D50是348nm，D90是658nm。图17中显示了在冷藏贮存一周后 的研磨后的他克莫司的采用相位光学技术拍摄的100X光学显微照片。
表7 样品 平均粒度(nm) D50粒度(nm) D90粒度(nm) 初始他克莫司 /Tween80 208 191 298 他克莫司 /Tween80样 品，冷藏1周后 406 348 658
结果表明这种制剂可能不是优选的，因为存储1周后，他克莫司粒 度几乎加倍。然而，粒度仍在小于2微米的优选尺寸内。
实施例10
该实施例的目的是描述含纳米颗粒他克莫司和西罗莫司的可注射 的剂型。
通过将实施例1-5或7-9中所述的任何纳米颗粒他克莫司制剂与纳 米颗粒西罗莫司组合物结合可以制备含纳米颗粒他克莫司和纳米颗粒 西罗莫司的可注射的组合物。如US 20030054042(Stabilization of chemical compounds using nanoparticulate formulations)所述，可以制备纳 米颗粒西罗莫司组合物。
* * * *
对于本领域技术人员来说，显而易见的是在不背离本发明的精神和 范围的条件下，可以在本发明的方法和组合物中进行许多改变和变化。 因而，本发明意在涵盖本发明的改变和变化，前提是它们落入所附权利 要求以及其等同物的范围内。
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