一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用
专利汇可以提供一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于 微 流体 技术 制备单分散冻干微气泡的方法及其应用。该方法通过微流体快速乳化技术获得尺寸可控的单分散乳液；所得单分散乳液进行 冷冻干燥 后，所得到中空微球即为微气泡的前驱体；将空心微球与缓冲溶液混合后，即得到单分散微气泡溶液。本方法利用微流体乳化技术制备中空微球作为微气泡的前驱体，所得微气泡冻干粉方便运输和保存，在使用时，不受仪器、场地和使用人员技术背景等要求的限制，所得到的微气泡尺寸均一，且可通过微流体技术调节微气泡的尺寸和 内核 的气体种类。在动物临床实验中，本发明的单分散冻干微气泡体现出比传统的多分散微气泡 造影剂 更强的造影效果。本发明的实验可控性强，所得微气泡的应用领域广。，下面是一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备微流体芯片
组装微流体芯片或玻璃毛细管组装成的液滴生成装置；
步骤2，制备单分散乳液
利用机械泵或者气压泵作为驱动，将含有表面活性剂的水溶液和溶有脂质体的三氯甲烷溶液分别从水相入口和油相入口注入微流体芯片，其中水溶液中含有体积分数2.5％的Pluronic-F68表面活性剂，三氯甲烷溶液中含有0.1％-1％质量分数的脂质体，水相流量为
1-50ml/hr，油相流量为0.1-10ml/hr，水相流量与油相流量的比例为1/5-1/20，通过调节水相流量与油相流量的流量比，可制得直径为5微米至50微米且均一分布的油/水乳液；其中，脂质体由于自身的两亲性会分布在油/水乳液的界面；
步骤3，冷冻干燥
对步骤2所得的油/水乳液进行收集和静置分离，撇去上层的大部分水溶液，将剩余的乳液移入冻干机，在-80℃下超低温干燥，得到由脂质体包裹的中空微球，即单分散冻干微气泡。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，所述微流体芯片为PDMS微流体芯片，所述PDMS微流体芯片的制备方法，包括以下步骤：
第一步，利用工程制图软件AutoCAD设计深度为50微米，宽度为50微米的微流体管道，并在透明塑料薄片上印刷为光刻模板，所述微流体管道有一个水相入口、一个油相入口和一个产物收集出口，所述水相入口和油相入口的口径为1mm；
第二步，使用软光刻技术将光刻模板打印在硅片基板上，光刻模板上的图案在硅片基板的投影尺寸比为1:1；
第三步，揭模
将PDMS硅胶均匀涂抹于硅片基板上，层厚度为5mm,使用真空泵充分消除硅胶中残留的气泡之后，将硅胶移入70℃的烘箱中加热1小时，揭模后即得管道，且硅片基板可以重复使用来进行揭模；
第四步，键合
将微流体管道和玻璃基板放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟后，使得A材料和玻璃基板表面充分羟基化，反应结束后迅速取出微流体管道和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成粘合，得到微流体芯片。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，步骤2和步骤3中脂质体的具体成分：每100mg脂质体中含有60mg,的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)；
10mg的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate，sodium salt(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸，钠盐态)；20mg的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)；以及10mg的1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)-2000](1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)-2000]。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，作为改进的是，脂质体在三氯甲烷溶液中的质量分数为0.5％。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法，其特征在于，所述微流体芯片由玻璃毛细管组装成的液滴生成装置，所述液滴生成装置的制备方法，包括以下步骤：
步骤i，制管
取一根圆型毛细管作为内管，并使用毛细管拉伸机对其一端进行拉伸形成流线型收缩端口，端口尺寸为0.1毫米；再取另外一根的正方形玻璃毛细管作为外管；内管的外径须不大于外管的内径，且差值不大于0.5毫米，内管与外管在使用之前均充分清洗、烘干；
步骤ii,组装
将步骤i所得的内管小心插入外管5毫米左右，在内管远端、内外管相接处以及外管远端分别连接到工程塑料转接口，并使用速干胶小心封装在透明塑料或玻璃薄板上；微流体平台整体长度为8厘米，宽度为1厘米；内管远端、内外管相接处以及外管远端的三个转接口分别为水相入口，油相入口以及产物出口。
6.基于权利要求1制备的单分散冻干微气泡在医学超声显影上的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述单分散冻干微气泡在应用时，需要进行换气充气处理，即对单分散冻干微气泡进行真空处理，再通入目标气体作为气泡内核，在目标气体的保护下进行密封包装，即得可用于实际使用的单分散冻干微气泡。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述换气充气的步骤，包括以下步骤：
步骤i，制管
将冻干微气泡放入5mL-100mL的真空瓶中，瓶口用医用橡胶塞封口，利用真空泵连接的注射器针头将瓶中气体抽干，抽气过程持续1分钟；
步骤ii，换气
将需要填充的内核气体，利用注射器针头注入真空瓶中；
步骤iii,重复抽真空和换气
重复步骤i和ii三次，确保换气过程充分，微气泡内部充分充满目标气体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述内核气体为氮气、氧气，碳氟化合物，二氧化碳等气体中一种或多种混合而成。
一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的方法及其应用
技术领域
背景技术
2023-2029)，则制备1mL含有109个微气泡的溶液需要15～20分钟，难以响应临床应用的即时需求；(3)利用传统的微流体方法生产微气泡难以做到独立调节微气泡的大小和浓度，这是因为微气泡的尺寸与流体的流量成负相关关系，要制备较小的微气泡必须要较高的液体流量，从而带来较低的气泡浓度，而在实际的超声造影应用中，较低的气泡浓度通常难以提供有效的声学反射；(4)鉴于微流体实际生产微气泡的低速率，在漫长的制备、收集、转移和运输过程中，微气泡的稳定性通常也会收到影响，进一步地降低了微气泡的产率和使用效果。
发明内容
步骤1，制备微流体芯片
组装微流体芯片或玻璃毛细管组装成的液滴生成装置；
步骤2，制备单分散乳液
利用机械泵或者气压泵作为驱动，将含有表面活性剂的水溶液和溶有脂质体的三氯甲烷溶液分别从水相入口和油相入口注入微流体芯片，其中水溶液中含有体积分数2.5％的Pluronic-F68表面活性剂，三氯甲烷溶液中含有质量分数0.1％-1％的脂质体，水相流量为
1-50ml/hr，油相流量为0.1-10ml/hr，水相流量与油相流量的比例为1/5-1/20，调节水相流量与油相流量的流量比，可制得直径为5-50μm且均一分布的油/水乳液；其中，脂质体由于自身的两亲性会分布在油/水乳液的界面；
步骤3，冷冻干燥
对步骤2所得的油/水乳液进行收集和静置分离，撇去上层的水溶液，将剩余的乳液移入冻干机，在-80℃下超低温干燥，得到由脂质体包裹的中空微球，即单分散冻干微气泡。
第二步，使用软光刻技术将光刻模板打印在硅片基板上，光刻模板上的图案在硅片基板的投影尺寸比为1:1；
第三步，揭模
将PDMS硅胶均匀涂抹于硅片基板上，层厚度为5mm,使用真空泵充分消除硅胶中残留的气泡之后，将硅胶移入70℃的烘箱中加热1小时，揭模后即得管道，且硅片基板可以重复使用来进行揭模；
第四步，键合
将微流体管道和玻璃基板放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟后，使得A材料和玻璃基板表面充分羟基化，反应结束后迅速取出微流体管道和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成粘合，得到微流体芯片。
取一根圆型毛细管作为内管，并使用毛细管拉伸机对其一端进行拉伸形成流线型收缩端口，端口尺寸为0.1毫米；再取另外一根的正方形玻璃毛细管作为外管；内管的外径须不大于外管的内径，且差值不大于0.5毫米，内管与外管在使用之前均充分清洗、烘干；
步骤ii,组装
将步骤i所得的内管小心插入外管5毫米左右，在内管远端、内外管相接处以及外管远端分别连接到工程塑料转接口，并使用速干胶小心封装在透明塑料或玻璃薄板上；微流体平台整体长度为8厘米，宽度为1厘米；内管远端、内外管相接处以及外管远端的三个转接口分别为水相入口，油相入口以及产物出口。
将冻干微气泡放入5mL-100mL的真空瓶中，瓶口用医用橡胶塞封口，利用真空泵连接的注射器针头将瓶中气体抽干，抽气过程持续1分钟；
步骤ii，换气
将需要填充的内核气体利用注射器针头注入真空瓶中；
步骤iii,重复抽真空和换气
重复步骤i和ii三次，确保换气过程充分，微气泡内部充分充满目标气体。
(1)脂质体乳液大小均一，形成的微气泡单分散性好。我们用微流体制备的脂质体乳液尺寸分布较窄，分散度值(Polydispersity)小于0.05，在冻干之后形成的空心脂质体微球仍能有效保持尺寸的单分散性。在溶于生理盐水之后，形成的微气泡依然具备高度的尺寸均一性。而市面上常见的微气泡造影剂的尺寸分散度值(Polydispersity)一般大于0.5，呈现明显的大小差异。
图3为实际生产中的微流体芯片的图片；
图4为本发明实施例1制备一种基于微流体技术制备单分散冻干微气泡的相关实物图，其中，(A)为实施例1进行乳液生产时在显微镜下的微流体管道的实物图,黑色参照标尺为
100微米；(B)为白色脂质体乳液；(C)为单分散气泡超声显影剂冻干粉；(D)为单分散气泡超声显影剂冻干粉浸水之后获得的微气泡溶液；
图5为不同微气泡造影剂的气泡尺寸分布情况，(A)为实施例1制备的单分散冻干微气泡，(B)为已有商品化(声诺维Sonovue)的微气泡超声显影剂；
图6为小鼠肾脏临床超声显影对比，(A)为传统商业化(声诺维Sonovue公司)微气泡造影剂，(B)为本发明生产的微流体微气泡冻干粉造影剂；
图7为实施例2的玻璃毛细管微流控芯片。
具体实施方式
(1)制图：使用工程制图软件AutoCAD设计微流体管道，其中有一个水相进口，一个油相进口，一个产物收集出口，进出口的直径为1毫米，管道深度为50微米，宽度为100微米；微流体管道的结构如图2所示；
(2)制模：将步骤(1)所得的光刻模板使用软光刻技术(soft lithography)等比例投影打印在硅片基板上，尺寸比为1：1。管道由SU-8 2100光刻胶构成，管道深度为50微米，宽度控制为100微米；
(3)揭模：将二甲基硅氧烷单体和固化剂按10：1的比例混合均匀后，倾涂于步骤(2)所得硅片模板上，PDMS硅胶厚度为5毫米。使用真空泵消除硅胶中残留的气泡1小时之后，将硅胶移入70℃的烘箱中加热1小时，揭模后即得PDMS管道；
(4)键合：将PDMS管道和一片普通的显微镜载玻片放入等离子体反应箱中，使用紫外光照射表面1分钟。反应结束后迅速取出PDMS和玻璃基板，使二者表面轻轻接触即可完成键合，得到微流体芯片。芯片总尺寸为5cm×2cm；
(5)乳化：将20mL含有表面活性剂的水溶液和含有脂质体(1mg/mL)的5mL三氯甲烷溶液分别从水相入口和油相入口注入步骤(4)所得的微流体芯片。其中水：三氯甲烷的体积流速比为5mL/hr:1.25mL/hr，所产生的脂质体乳液为大小均一，约为10微米的单分散乳液；
(6)冻干：对步骤(5)所得脂质体乳液和水的混合物进行收集，静置分离10分钟后，撇去上层的水溶液，将剩余的脂质体乳液移入冻干机，在-80度下超低温干燥24小时，得到脂质体作为外壳的中空微球，即单分散冻干微气泡。
在应用过程中，只需要取单分散气泡超声显影剂加入生理盐水，轻轻振荡后，即可获得微气泡溶液。微乳液，脂质体微球和微气泡的尺寸测定使用显微镜拍照对比标尺的方法，测试结果表明本发明提供的微气泡尺寸约为7微米，单分散性相比传统商品化产品有较大的提高，真空干燥包装下脂质体空心微球的稳定性超过3个月。
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