一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法
专利汇可以提供一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于 微 流体 技术 的激光单细胞提取方法，特点是：包括在 载玻片 表面 覆盖 一层PEN膜，并使用多聚赖 氨 酸溶液 处理PEN膜表面；将载玻片装入捕获仪的微流体装置内；将经预处理的 血液样本 装载于捕获仪中，采用免疫磁微粒技术对靶细胞进行分离；取出载玻片干燥；用丙 酮 固定靶细胞，并进行免疫 荧光 染色 ； 显微镜 下观察读片，识别靶细胞；采用 激光切割 单个靶细胞，并去除杂质细胞；将切割后的带有单个靶细胞的PEN膜挑取至PCR管，或通过微流体在通道中收集，完成单细胞提取；优点是：操作简便，可实现单细胞捕获过程的自动化，减少 试剂 用量，单细胞捕获效率和提取效率高，能够有效保持被分离提取细胞的完整性，有利于细胞下游分析应用。，下面是一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法专利的具体信息内容。
1.一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在载玻片表面覆盖一层厚度为2～5μm的PEN膜，并使用0.01～0.02%W/V的多聚赖氨酸溶液处理PEN膜表面，得到镀膜载玻片；
（2）将镀膜载玻片装入微流体装置内，并安装至捕获仪内，并安装配套使用的捕获耗材包及配套试剂；
（3）将血液样本进行预处理，将带有特定生物标志物的纳米磁珠结合到血液中的目标细胞上，然后将经过预处理的血液样本装载于捕获仪中，设置捕获仪的运行参数，采用免疫磁微粒技术对血液样本中的目标细胞进行分离，分离完成后得到附着于镀膜载玻片表面的靶细胞；
（4）取出镀膜载玻片，37℃干燥；
（5）用丙酮固定镀膜载玻片表面上的靶细胞，并采用免疫荧光染料对镀膜载玻片表面进行免疫荧光染色；
（6）将染色后的镀膜载玻片放置在显微镜下观察读片，识别靶细胞和其余杂质细胞，其中细胞的免疫荧光显色反应满足判断标准的被判定为靶细胞；
（7）在显微镜观察下，采用激光切割带有单个靶细胞的PEN膜，并去除切割范围内的杂质细胞；
（8）在显微镜观察下，将切割后的带有单个靶细胞的PEN膜通过针手动拾取膜，并将其置于涂抹有粘合剂的PCR管中，使PEN膜的背面放置于粘合剂部分上；或者将切割后的带有单个靶细胞的PEN膜通过微流体在通道中收集单个靶细胞，完成单细胞提取。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的目标细胞为肿瘤细胞，所述的步骤（5）中采用的免疫荧光染料为：anti-CD45和anti-CK；所述的步骤（6）中细胞的免疫荧光显色反应满足判断标准的被判定为靶细胞具体为：细胞的免疫荧光显色反应满足CK为阳性且CD45为阴性的被判定为靶细胞。
3.根据权利要求2所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的步骤（5）中对可分离镀膜载玻片表面进行免疫荧光染色具体为：对干燥后的镀膜载玻片先用anti-CK进行荧光标记，37℃条件下孵育1小时，然后用PBST缓冲液漂洗；再对镀膜载玻片用anti-CD45进行荧光标记，33℃条件下孵育1小时，用PBST缓冲液漂洗后室温下干燥。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的步骤（3）中将血液样本进行预处理具体包括：取适量血液样本加入到离心管中，然后加入血液前处理试剂，混匀后在离心力800g±200g下离心8～12min，去除血浆与红细胞；用移液器吸取离心管中的上清液，并往上清液中加入血液前处理试剂至5ml，混匀并确保底部无沉淀；然后往混匀后的溶液中加入具有上皮细胞功能粘附分子的Fe3O4纳米磁珠悬浮液
100ul，所述的Fe3O4纳米磁珠的粒径大小为100～200nm，混匀后置于垂直混合仪上，在8-
10rpm条件下孵育1.5h。
5.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的步骤（8）中通过微流体在通道中收集单个靶细胞具体包括：首先用水相层流传输激光切割后附着在PEN膜上的靶细胞，然后用双相油-水混合形成油滴包裹的微液滴，完成对单个靶细胞的收集。
6.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的捕获仪为免疫磁微粒捕获仪，设置捕获仪的运行参数为：磁微粒捕获速度2.2～3ml/hr，镀膜载玻片的清洗速度4～6ml/hr。
7.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的步骤（2）中的配套试剂包括：血液前处理试剂、免疫磁微粒、细胞捕获增强剂、清洗液和质控品。
8.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法，其特征在于所述的显微镜和所述的激光采用蔡司激光显微切割系统，切割PEN膜的切割区域尺寸为500μm×500μm。
一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）将镀膜载玻片装入微流体装置内，并安装至捕获仪内，并安装配套使用的捕获耗材包及配套试剂；
（3）将血液样本进行预处理，将带有特定生物标志物的纳米磁珠结合到血液中的目标细胞上，然后将经过预处理的血液样本装载于捕获仪中，设置捕获仪的运行参数，采用免疫磁微粒技术对血液样本中的目标细胞进行分离，分离完成后得到附着于镀膜载玻片表面的靶细胞；
（4）取出镀膜载玻片，37℃干燥；
（5）用丙酮固定镀膜载玻片表面上的靶细胞，并采用免疫荧光染料对镀膜载玻片表面进行免疫荧光染色；
（6）将染色后的镀膜载玻片放置在显微镜下观察读片，识别靶细胞和其余杂质细胞，其中细胞的免疫荧光显色反应满足判断标准的被判定为靶细胞；
（7）在显微镜观察下，采用激光切割带有单个靶细胞的PEN膜，并去除切割范围内的杂质细胞；
（8）在显微镜观察下，将切割后的带有单个靶细胞的PEN膜通过针手动拾取膜，并将其置于涂抹有粘合剂的PCR管中，使PEN膜的背面放置于粘合剂部分上；或者将切割后的带有单个靶细胞的PEN膜通过微流体在通道中收集单个靶细胞，完成单细胞提取。
图3为本发明中激光提取靶细胞的过程示意图；
图4为本发明中通过微流体在通道中收集单个靶细胞的示意图；
图5为本发明实施例二中分离得到SKBR3（a）和MCF7（b）肿瘤细胞的荧光成像图；
图6为本发明实施例三中患者1外周血样本中分离得到的肿瘤细胞荧光成像图；
图7为本发明实施例三中患者2外周血样本中分离得到的肿瘤细胞荧光成像图。
具体实施方式
（1）在载玻片1表面覆盖一层厚度为3μm的PEN（polyethylene naphthalat，聚萘二甲酸乙二醇酯）膜，并使用0.01%（W/V）的多聚赖氨酸溶液处理PEN膜2表面，得到镀膜载玻片3；
（2）将镀膜载玻片3装入微流体装置内，并安装至捕获仪内，并安装配套使用的捕获耗材包及配套试剂；
（3）将血液样本进行预处理，将带有特定生物标志物的纳米磁珠5结合到血液中的目标细胞4上，然后将经过预处理的血液样本装载于捕获仪中，设置捕获仪的运行参数，采用免疫磁微粒技术对血液样本中的目标细胞4进行分离，分离完成后得到附着于镀膜载玻片3表面的靶细胞6；
（4）取出镀膜载玻片3，37℃干燥；
（5）用丙酮固定镀膜载玻片3表面上的靶细胞6，并采用免疫荧光染料对镀膜载玻片3表面进行免疫荧光染色；
（6）将染色后的镀膜载玻片3放置在显微镜下观察读片，识别靶细胞6和其余杂质细胞，其中细胞的免疫荧光显色反应满足判断标准的被判定为靶细胞6；
（7）在显微镜观察下，采用激光切割带有单个靶细胞6的PEN膜2，并去除切割范围内的杂质细胞；
（8）在显微镜观察下，将切割后的带有单个靶细胞6的PEN膜2通过针手动拾取膜，并将其置于涂抹有粘合剂的PCR管7中，使PEN膜2的背面放置于粘合剂部分上；或者将切割后的带有单个靶细胞6的PEN膜2通过微流体在通道中收集单个靶细胞6，完成单细胞提取。其中涂抹有粘合剂的PCR管7可以采用市售的Zeiss Adhesive Cap管。
10rpm条件下孵育1.5h。
（1）在载玻片表面覆盖一层厚度为3μm的PEN膜2，并使用0.01%（W/V）的多聚赖氨酸溶液处理PEN膜2表面，得到镀膜载玻片；
（2）将两个镀膜载玻片分别装入微流体装置内，并安装至捕获仪内，并安装配套使用的捕获耗材包及配套试剂；
（3）用PBS缓冲液分别制备MCF-7和SKBR3细胞悬浮液，并取两份各2.5ml的健康人血液样本，往血液样本中分别加入10个肿瘤细胞MCF-7和10个肿瘤细胞SKBR3；
（4）通过密度梯度离心法离心去除血浆与红细胞，然后加入具有上皮细胞功能粘附分子（anti-EpCAM）的Fe3O4磁性纳米粒子悬浮液（粒径大小：100～200nm）；
（5）将经过上述预处理的两份血液样本装载于捕获仪中，设置捕获仪的运行参数，采用免疫磁微粒技术对血液样本中的目标细胞进行分离，设置捕获仪的运行参数：磁微粒捕获速度：2.5ml/hr，清洗速度为5ml/hr，运行仪器，分离完成后得到附着于镀膜载玻片表面的MCF-7细胞和SKBR3细胞；
（6）取出镀膜载玻片，37℃干燥；
（7）用丙酮固定镀膜载玻片表面上的MCF-7细胞和SKBR3细胞，并采用免疫荧光染料anti-CD45和anti-CK对镀膜载玻片进行免疫荧光染色；
（8）将染色后的镀膜载玻片分别放置在蔡司激光显微切割系统的显微镜下观察读片，分别识别MCF-7肿瘤细胞和SKBR3肿瘤细胞，其中CK阳性并且CD45阴性的细胞判定为肿瘤细胞，并记录结果；实验结果如图5所示，位于荧光成像图中部的为SKBR3肿瘤细胞（a）和MCF-7肿瘤细胞（b）被从血液中分离出来并附着于镀膜载玻片的PEN膜2上，CK-FITC染色为绿色，同时镀膜载玻片上还非特异性捕获了血液中的白细胞，AlexaFluor染色为红色；
（9）采用激光分别切割单个SKBR3细胞和MCF-7细胞，切割面积为500μm×500μm，并去除切割范围内的杂质细胞；
（10）将切割后的带有单个SKBR3细胞的PEN膜以及带有单个MCF-7细胞的PEN膜直接分别挑取至PCR管，或者通过油滴包裹的形式分别收集，完成对MCF-7细胞和SKBR3细胞的精准单细胞提取。
（1）在载玻片表面覆盖一层厚度为3μm的PEN膜，并使用0.01%（W/V）的多聚赖氨酸溶液处理PEN膜表面，得到镀膜载玻片；
（2）将两个镀膜载玻片分别装入微流体装置内，并安装至捕获仪内，并安装配套使用的捕获耗材包及配套试剂；
（3）分别采集两名患者外周血5ml作为样本，并置于抗凝管中，即时对每例样本进行检测；其中抗凝管选用CellSave™抗凝管；
（4）通过密度梯度离心法离心去除血浆与红细胞，然后加入具有上皮细胞功能粘附分子（anti-EpCAM）的Fe3O4磁性纳米粒子悬浮液（粒径大小：100～200nm）；
（5）将经过上述预处理的两份血液样本装载于捕获仪中，设置捕获仪的运行参数，采用免疫磁微粒技术对血液样本中的目标细胞进行分离，设置捕获仪的运行参数：磁微粒捕获速度：2.5ml/hr，清洗速度为5ml/hr，运行仪器，分离完成后得到附着于镀膜载玻片表面的患者肿瘤细胞；
（6）取出镀膜载玻片，37℃干燥；
（7）用丙酮固定镀膜载玻片表面上的细胞，并采用免疫荧光染料anti-CD45和anti-CK对镀膜载玻片进行免疫荧光染色；
（8）将染色后的镀膜载玻片分别放置在蔡司激光显微切割系统的显微镜下观察读片，识别肿瘤细胞，其中CK阳性并且CD45阴性的细胞判定为肿瘤细胞，并记录结果；实验结果如图6、图7所示，两名患者外周血中的肿瘤细胞被从血液中分离出来并附着于镀膜载玻片的PEN膜上；
（9）采用激光分别切割单个肿瘤细胞，切割面积根据实况调整，并去除切割范围内的杂质细胞；
（10）将切割后的两组带有单个肿瘤细胞的PEN膜直接分别挑取至PCR管，或者通过油滴包裹的形式分别收集，完成对不同患者肿瘤细胞的精准单细胞提取，备用于肿瘤细胞下游分析。
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