本发明的目的是提供一种可将样品制备、核酸杂交以及结果检测整合、集成化的核酸分析芯片实验室系统。
本发明提供的核酸分析芯片实验室系统,包括一个由具有
生物相容性材料在基质上构建的可控腔体;所述基质上固定有一种或多种与目标核酸互补的核酸探针。
所述目标核酸可以处于或者不处于基质的表面。
该实验室系统还包括一套
试剂,这套试剂适合于从样品中制备所述的目标核酸,适合于所述的目标核酸的扩增,适合于所述的目标核酸与所述的探针之间的杂交;同时还可以包括用于检测所述的目标核酸和所述的核酸探针之间的杂交结果的方法。因此在往本发明所述的可控的封闭腔体中加入带有所述的目标核酸的样品后,可以在合适的条件下进行下述的连续的操作:从样品制备或扩增所述的目标核酸,在所述的目标核酸和所述的核酸探针之间进行核酸杂交,需要的话还可以从所述的可控的封闭腔体中直接检测杂交信号,在这一连续的操作过程中,所述的可控的封闭腔体和外界的环境之间没有任何的物质交换。
任何合适的材料均可被用于本芯片实验室系统的构建。在更合适的情况下,合适的材料是一种气密性材料,例如,MJ Research公司的自封闭腔体(MJ Research selfseal chamber)和自封闭胶(self seal gel),或者是封闭的塑料内腔以及其它类似的材料。同时,在本芯片实验室系统中也可以采用放
水材料。
合适的材料可以采用任何合适的方法而与基质连接从而形成可控的封闭腔体。举例来说,合适的材料可以被胶合到基质上而形成可控的封闭腔体;合适的材料也可以通过微加工的方式而构造在基质的表面而形成可控的封闭腔体。
任何合适的材料均可被用于本芯片实验室系统的构建。举例来说,合适的材料包括
硅,塑料,玻璃,
石英玻璃,陶瓷,
橡胶,金属,多聚物以及它们的任何组合。
本发明的实验室系统可以在基质上固定一个核苷酸探针也可以在基质上固定大量的核酸探针,这些核酸探针可以被用于同时分析大量的目标核酸。
单链或双链探针均可被用于本芯片实验室系统。探针可以是寡核苷酸探针或者是其它类型的核酸,例如长链的PCR产物。应用于本芯片实验室的核酸探针可以具有任何合适的长度。如果使用的是单链探针,则其合适的长度范围是5到100
碱基。如果使用的是双链的探针,则其合适的长度范围是5到100碱基对。用于本芯片实验室系统的探针可以是标记的核酸探针。可以采用任何合适的标记方式。这些标记方式包括,放射标记,荧光标记,化学标记,酶学标记,发光标记,荧光共振
能量转移以及分子信标。
探针可以被修饰而使其有利于与基质相连接。核酸探针可以通过任何合适的方式而与基质相连接。举例来说,核酸探针可以通过功能基团而与基片相连接,例如-CHO,-NH2,-SH or-S-S-;探针与基质的连接也可以通过特定的结合
配对而介导,例如,生物素和亲和素的配对,生物素与链霉亲和素的配对。探针与基质的连接可以通过多种方式而实现,例如,紫外线激活的交联,热激活的交联,NH2和-CHO之间的反应,-SH和-SH之间的反应,生物素和亲和素之间的结合,生物素与链霉亲和素之间的结合。
核酸探针可以是特异性也可以是兼并性探针。核酸探针可以是DNA、RNA、PNA、LNA或者它们的组合。核酸探针可以充分或者完全与目标核酸配对。
在本芯片实验室系统的一个具体的实现方式中,对于一个特定的检测位点,包含两个核酸探针,第一条探针被固定在芯片基片的表面,并且带有第一种FRET标记,第二条探针处于液相环境中并带有第二种FRET标记,当两条探针均与目标核酸杂交后,两条探针由于目标探针的存在而在空间上处于临近的
位置,从而在两条探针之间发生荧光共振能量转移而产生可以检测的信号。可以采用任何合适的FRET标记。一般优选下列FRET标记的组合,Fluroscein和TAMRA,TAMRA和Cy5,ROX和Cy5,IAEDNS和Fluroscein,或者Fluroscein和QSY-7。
在本芯片实验室系统的另外一种实施方式中,在一个特定的检测位点上,其中第一条探针固定于芯片基质的表面,而第二条探针则处于液相环境中,两条探针之间互补,并且第一条探针与目标核酸互补,第一条探针与第二条探针之间形成的杂交体的Tm值比第一条探针和目标核酸之间的杂交体的Tm低5℃到30℃,第一条探针上带有荧光标记,第二条探针上则带有与第一条探针上的荧光分子所对应的淬灭分子。在不存在目标核酸的情况下,上述的两条探针之间可以杂交,荧光分子的荧光被淬灭分子所淬灭;在检测体系中存在目标核酸的情况下,目标核酸更容易与固定的探针杂交,从而使得固定的探针上的荧光标记不再被淬灭,在合适的激发光下产生可以检测的信号。可以采用任何合适的荧光标记,例如,6-FAM,TET,HEX,Cy3,Cy5,Texas Red,ROX,Fluroscein or TAMRA,同时也可以采用任何合适的荧光淬灭标记,例如,Dacyl,Black Hole-1,Black Hole-2或者直径从0.1nm到10nm的胶体金颗粒。
需要的话,可以采用任何合适的方法来扩增目标核酸,例如,多聚酶链反应(PCR),连接酶链反应(LCR),基于核酸序列的扩增(NASBA),链置换扩增(SDA),转录调节的扩增(TMA)以及滚环复制(RCA)。为了适合于扩增,本芯片实验室系统可以包括至少一套适合于一种扩增方法的反应缓冲液和其它试剂。
在一种特殊的实现方式中,本芯片实验室系统包括一套同时进行核酸扩增和核酸探针与目标核酸之间杂交的试剂。本芯片实验室系统包括一套能够从样品中制备目标核酸,扩增目标核酸并且进行核酸探针和目标核酸之间杂交的试剂。
本芯片实验室系统可以进一步包括一套
温度控制设备,例如商用的PCR仪以及水浴。本芯片实验室系统可以进一步包括一套信号检测设备,例如荧光成像设备。
本芯片实验室系统可以被用于任何适合的目的。举例来说,在封闭的腔体中实现连续的以获得目标核酸为目的的样品制备以及核酸探针和目标核酸之间的杂交。另一个例子是本芯片实验室系统可以被用于在在封闭的腔体中连续地实现核酸探针与目标核酸之间的杂交以及杂交信号的检测和分析。
本芯片实验室系统可以进一步包括采用本系统进行样品制备,核酸扩增或杂交的说明。
本发明的另一个目的是提供一种核酸分析方法。
本发明提供的核酸分析方法包括:1)往上述芯片实验室系统的可控封闭腔体中加入可能带有目标核酸的样品;2)在封闭腔体中连续的从所述的样品中制备所述的目标核酸,或者扩增所述的目标核酸,在所述的目标核酸和所述的核酸探针之间进行杂交;3)进行杂交信号的检测分析。
可采用本芯片实验室系统和核酸分析方法来进行分析或定量的核苷酸序列包括DNA,RNA或者其它的自然状态下存在的或者合成的核酸样品。用于检测的样品包括体液例如尿液,血液,精液,
脑脊液,脓液,
羊水,眼泪;半固体或液体的渗出液例如痰液,唾液,
肺抽出液,
阴道或尿道渗出液;以及粪便或固体组织样品例如活
组织切片和活茸毛膜样品。用于检测的样品还包括从
皮肤,生殖器或喉咙收集来的拭子样品。可以采用任何常用的方式来从待测样品中分离核酸。
本芯片实验室系统和核酸分析方法可以在一次试验中用一种探针来分析一种样品,也可以是一种高通量的形式如用一种探针来同步分析大量的样品,或者用大量的探针来同步分析一种样品。更佳的方式是用大量的探针来同步分析大量的样品。
可以采用本芯片实验室系统和核酸分析方法来分析任何合适的目标核酸。目标核酸包括DNA,例如A-,B-或者Z-形DNA,或者RNA例如mRNA,tRNA和rRNA。核酸可以是单链,双链或者三链的形式。进一步,可以分析编码
蛋白质或者多肽的核酸。其中,蛋白质和多肽包括酶,转运蛋白(例如离子通道或离子
泵),营养或存储蛋白,收缩或运动蛋白(例如肌动蛋白和肌球蛋白),结构蛋白,防御蛋白或调节蛋白(例如
抗体,
激素或者生长因子)。
可以采用本芯片实验室系统和核酸分析方法来分析任何合适的样品。通常来分析生物样品如来源于
植物,动物,人类,
真菌,细菌或病毒的生物样品。如果分析的样品来源于
哺乳动物或者人类,则样品可以是来源于特定的组织或器官。组织包括结缔组织,上皮组织,肌肉组织或者神经组织。器官则包括眼睛,环节螺旋器官,听觉器官,切维茨器官,环绕心室器官,科尔蒂器官,关键器官,指甲,末梢,女性外生殖器官,男性外生殖器官,移动器官,鲁菲尼器官,生殖器官,高尔基肌
腱器官,味觉器官,听觉器官,女性内生殖器,男性内生殖器,输送器官,雅各布森器官,神经体液器官,神经腱器官,嗅觉器官,
耳石器,下垂器官,罗森米勒器,感觉器官,螺旋器官,皮下连合器官,皮下穹隆器官,额外器官,触觉器官,靶器官,触摸器官,泌尿器官,动脉薄板末端器官,前庭器官,耳蜗前庭器官,退化器官,视觉器官,梨鼻器,游动器官,韦伯器官以及祖克坎德耳体。样品可以来源于哺乳动物的内部器官,例如脑,肺,肝,胰腺,骨髓,胸腺,心脏,淋巴,血液,骨头,软骨,胰腺,肾脏,胆囊,胃,肠,睾丸,卵巢,子宫,神经系统,腺体,血管等。
本芯片实验室系统和核酸分析方法可以用于与不同疾病,失调或者感染相关的病理样品的分析。其中,疾病或者失调包括
肿瘤、癌症、免疫系统疾病、代谢疾病、肌肉或者骨组织疾病、神经系统疾病、信号传导疾病或运输疾病;感染包括真菌,细菌以及
病毒感染。
附图说明
图1为核酸分析芯片实验室系统的结构示意图图2为核酸探针与目标分子的杂交结构示意图图3为组合核酸探针与目标分子的杂交位置关系示意图图4为组合核酸探针与目标分子的杂交位置关系示意图具体实施方式
实施例1、核酸分析芯片实验室系统如图1所示,本发明的核酸分析芯片实验室系统由核酸扩增及杂交反应腔1、核酸扩增及杂交反应体系2、固定在基片上的探针3、固相基片4、温度
控制器5及荧光
扫描仪6组成。
核酸扩增及杂交反应腔1的腔体具有很好的气密性,能够长时间耐95摄氏度以上的高温。构成腔体的材料具有良好的导热性以及很好的生物相容性,对扩增及杂交反应没有抑止作用。可以选用MJ Research(MJ Research,Inc.MA,USA)的该类产品。
核酸扩增及杂交反应体系2包括引物和待检测的模板以及优化过的缓冲液体系,在该体系下可以顺利地进行核酸扩增和杂交。
固定在基片上的探针3通过特定的共价方式固定在经过特定化学修饰的芯片表面,通过与目标序列的互补结合而实现特异性检测。
固相基片4具有很好的导热性、强度以及生物相容性,对核酸扩增及杂交没有抑止作用。基片材料容易获得并且廉价。可用的固相材料包括普通玻璃片,石英玻璃片,
硅片,陶瓷以及塑料等。
用于PCR及杂交
温度控制的温度控制器具有很好的控温性能如升降温速度快,控温
精度高。温度控制器可以采用商用的PCR仪以及原位PCR仪以及微型的控温设备,从而实现整套系统的小型化。
用于结果检测的荧光扫描仪6。可以采用商用的荧光扫描仪和小型的荧光扫描仪。
实施例2、核酸探针与目标分子的杂交结构一种可实现杂交和检测整合的探针未与目标分子杂交时的结构如图2a所示,它包括基片4;具有茎环结构的探针分子3。分子G1和分子G2为一对荧光分子和荧光淬灭分子的组合,两者的位置可以互换;化学基团G4为经过特定化学处理后的后芯片基片上所暴露的基团,化学基团G3为探针分子末端在合成时修饰上的基团。化学基团G3和化学基团G4之间在特定的条件下可以发生牢固的共价或非共价的结合,从而将探针固定在芯片的表面。
探针分子3具有茎环结构。此时由于茎两端的荧光分子和荧光淬灭分子距离很近,荧光分子在特定的激发
光激发下所发射的荧光被荧光淬灭分子所淬灭,此时检测不到信号。
一种可实现杂交和检测整合的探针与目标分子杂交后的结构如图2b所示,它包括基片4;具有茎环结构的探针分子3;目标分子7。分子G1和分子G2为一对荧光分子和荧光淬灭分子的组合,两者的位置可以互换;化学基团G4为经过特定化学处理后的后芯片基片上所暴露的基团,化学基团G3为探针分子末端在合成时修饰上的基团。化学基团G3和化学基团G4之间在特定的条件下可以发生牢固的共价或非共价的结合,从而将探针固定在芯片的表面。
此时由于杂交体的刚性而将图2a中的茎环结构打开,茎两端的荧光分子和淬灭分子的距离拉大,荧光分子在特定的激发光下发射的荧光不被荧光淬灭分子淬灭,此时可以检测到杂交信号。
实施例3、组合核酸探针与目标分子的杂交位置关系一种可实现杂交和检测整合的组合探针在与目标分子杂交前的位置关系如图3a所示,它包括:基片4;固定在基片上的探针分子3;游离的探针分子8。分子G1和分子G2为一对可以发生荧光共振能量转移的荧光分子。化学基团G4为经过特定化学处理后的芯片基片上所暴露的基团,化学基团G3为探针分子末端在合成时修饰上的基团,化学基团G3和化学基团G4之间在特定的条件下可以发生牢固的共价或非共价的结合,从而将探针固定在芯片的表面。
在这种组合中有两条探针。其中一条探针的一端可以通过特定的方式与经过特定化学修饰的芯片表面共价结合,游离的另一末端修饰上了一种特定的荧光素。另一条探针则在反应体系中游离,与第一条探针标记荧光素的一端相对应的一端标记了另一种荧光素,在两种荧光素之间可以实现荧光共振能量转移。两条探针均与目标分子互补。
一种可实现杂交和检测整合的组合探针在与目标分子杂交后的位置关系如图3b所示,它包括:基片4;固定在基片上的探针分子3;游离的探针分子8;目标分子7。分子G1和分子G2为一对可以发生荧光共振能量转移的荧光分子。化学基团G4为经过特定化学处理后的芯片基片上所暴露的基团,化学基团G3为探针分子末端在合成时修饰上的基团,化学基团G3和化学基团G4之间在特定的条件下可以发生牢固的共价或非共价的结合,从而将探针固定在芯片的表面。
两条探针在与目标分子杂交后,位置上处于一种接近的关系,两个荧光素的距离在产生荧光共振能量转移所要求的有效距离即Frster半径之内。此时用前一个荧光素的激发
波长来激发,而用后一个荧光素的发射波长来接受,即可检测到杂交信号。
实施例4、组合核酸探针与目标分子的杂交位置关系一种可实现杂交和检测整合的组合探针在与目标分子杂交前的位置关系如图4a所示,它包括:基片4;固定在基片上的探针分子3;可与固定的探针分子结合的探针分子8。分子G1和分子G2为一对可以发生荧光共振能量转移的荧光分子或者分子G1为荧光分子,分子G2为淬灭分子。化学基团G4为经过特定化学处理后的后芯片基片上所暴露的基团,化学基团G3为探针分子末端在合成时修饰上的基团,化学基团G3和化学基团G4之间在特定的条件下可以发生牢固的共价或非共价的结合,从而将探针固定在芯片的表面。
这种组合有两条探针。其中一条探针的一端可以通过特定的方式与经过特定化学修饰的芯片表面共价结合,游离的另一末端修饰上了一种特定的荧光素。另一条探针则在反应体系中游离,与第一条探针标记荧光素的一端相对应的一端标记了一种荧光分子或者荧光淬灭分子。第二条探针与第一条探针互补,如果体系中无待检测的目标核酸分子,则荧光素分子所发射的荧光被荧光淬灭物质所淬灭,或者的一条探针上的荧光素处于激发态时的能量通过荧光共振能量转移而转移给互补探针上的荧光素分子,此时检测不到杂交信号。
一种可实现杂交和检测整合的组合探针在与目标分子杂交后的位置关系如图4b所示,它包括基片4;固定在基片上的探针分子3;可与固定的探针分子结合的探针分子8;目标分子7。分子G1和分子G2为一对可以发生荧光共振能量转移的荧光分子或者分子G1为荧光分子,分子G2为淬灭分子。化学基团G4为经过特定化学处理后的后芯片基片上所暴露的基团,化学基团G3为探针分子末端在合成时修饰上的基团,化学基团G3和化学基团G4之间在特定的条件下可以发生牢固的共价或非共价的结合,从而将探针固定在芯片的表面。
这种组合有两条探针。其中一条探针的一端可以通过特定的方式与经过特定化学修饰的芯片表面共价结合,游离的另一末端修饰上了一种特定的荧光素。另一条探针则在反应体系中游离,与第一条探针标记荧光素的一端相对应的一端标记了一种荧光淬灭物质。如果体系中有待检测的目标核酸分子,则第二条探针与第一条探针的结合被目标分子与第一条探针的结合所取代,淬灭作用被消除,即可检测到杂交信号。
实施例5、基于荧光共振能量转移的整合系统用于乙型
肝炎病毒的检测A.
醛基化芯片的制备将玻片浸泡于洗液中,室温过夜。洗净玻片上的酸液。离心甩干玻片。110℃,15分钟,彻底干燥玻片。将玻片浸入1%APTES(异丙胺基-三乙
氧基硅烷)的95%
乙醇中。在室温下用脱色摇床轻摇1小时。用95%乙醇清洗处理过的玻片。将洗净的玻片放入
真空干燥箱,抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa),关闭通气
阀,开始升温,110℃,20分钟。将凉至室温的玻片浸泡于12.5%的戊二醛溶液(400ml 12.5%戊二醛溶液:100ml 50%的戊二醛,300ml
磷酸盐缓冲液(1M NaH2PO4 30ml,2.628gNaCl),调PH值到7.0))。室温放置4小时,轻轻摇动。将玻片从戊二醛溶液中取出,3×SSC漂洗一次,去离子水冲洗两次,离心甩干,室温干燥。
B.引物和探针的合成探针一:amino-5’-polyT(15nt)GCATGGACATCGACCCTTATAAAG-3’-TAMRA探针二:Cy5-5’-GGAGCTACTGTGGAGTTACTC CTGG-3’上游引物:gTTCAAgCCTCCAAgCTgTg下游引物:TCAgAAggCAAAAAAgAgAgTAACT引物和探针均在上海博亚生物技术公司合成。
C.阵列的制作探针一溶于50%的DMSO中,终浓度为10μM。采用Cartesian的点样仪(Cartesian Technologies,Inc.CA,USA)按照预先设定好的样式点样。将点好的玻片置于玻片盒中室温放置过夜以干燥玻片。室温下将玻片在0.2%的SDS中浸泡两次,每次2分钟,振动。去离子水冲洗两次,去离子水漂洗一次,离心甩干。把玻片转移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中,再加入100无水乙醇),室温摇床轻摇5分钟。去离子水冲洗一次,去离子水漂洗两次,每次1分钟。离心甩干。
D.反应腔的制作采用MJ Research(MJ Research,Inc.MA,USA)的自封闭腔(self seal chamber)来构建反应腔,具体的构建过程按照产品的使用说明,反应腔
覆盖的芯片区域含有探针的点阵。
E.核酸扩增和杂交PCR反应体系的组成如下:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3 at 24℃),50mmol/LKCl,1.5mmol/L MgCl2;0.5μmol/L的上游引物以及下游引物;1单位的Taq DNA聚合酶;200μmol/L的dNTPs(dATP,dTTP,dCTP和dGTP),0.1%的BSA,0.1%的吐温20以及终浓度为2μmol/L的探针二;反应的总体积为25μl.将配置好的体系加入D中所构建的反应腔中,用所料盖片密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行。采用如下的热循环程序。预变性:94℃,1minutes;主循环:94℃,30秒钟,55℃,30秒钟,72℃,1分钟,30个循环;72℃,10分钟。PCR结束后,在同一PCR仪上,52℃,4小时进行杂交反应。
F.结果检测最终的结果采用ScanArray 4000荧光扫描仪(GSI Lumonics,MA,USA)来检测,激发波长为543nm,选用
激光器3,信号的检测选用滤光片7,激光器和
光电倍增管的功能的均
选定80%,扫描的焦距根据不同玻片做适当调整。检测的程序遵照仪器的使用说明。结果显示芯片点阵上有较强的荧
光信号,同一点阵上的阴性对照探针所在的位置则只有较弱的荧光信号,同时未加入待测样品的芯片亦只有较弱的荧光信号,说明待测样品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
实施例6、基于分子信标的整合系统用于乙型肝炎病毒的检测A.醛基化的芯片的制备将玻片浸泡于洗液中,室温过夜。用
自来水冲洗以洗净玻片上的酸液,蒸馏水冲洗三次,去离子水漂洗一次,再用去离子水冲洗一次。离心甩干玻片。110℃,15分钟,彻底干燥玻片。将玻片浸入1%APTES(异丙胺基-三乙氧基硅烷)的95%乙醇中。在室温下用脱色摇床轻摇1小时。用95%乙醇清洗处理过的玻片。先冲洗一次,再漂洗一次。将洗净的玻片放入真空干燥箱,抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa),关闭通气阀,开始升温,110℃,20分钟。将凉至室温的玻片浸泡于12.5%的戊二醛溶液(400ml 12.5%戊二醛溶液:100ml 50%的戊二醛,300ml磷酸盐缓冲液(1MNaH2PO4 30ml,2.628g NaCl),调PH值到7.0))。室温放置4小时,轻轻摇动。将玻片从戊二醛溶液中取出,3×SSC漂洗一次,去离子水冲洗两次,离心甩干,室温干燥。
B.引物和探针的合成分子信标探针:5’-amino-TTTTT TTTTT TTTT CGTGC-GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-GCACG A-3’-TAMRA, 处标记有荧光淬灭分子Dabcyl。
上游引物:5’-GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-3’
下游引物:5’-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3’引物和探针均在上海博亚生物技术公司合成。
C.阵列的制作分子信标探针溶于50%的DMSO中,终浓度为10μM。采用Cartesin的点样仪(Cartesian Technologies,Inc.CA,USA)按照预先设定好的样式点样。将点好的玻片置于玻片盒中室温放置过夜以干燥玻片。室温下将玻片在0.2%的SDS中浸泡两次,每次2分钟,振动。去离子水冲洗两次,去离子水漂洗一次,离心甩干。把玻片转移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中,再加入100无水乙醇),室温摇床轻摇5分钟。去离子水冲洗一次,去离子水漂洗两次,每次1分钟。离心甩干。
D.反应腔的制作采用MJ Research(MJ Research,Inc.MA,USA)来构建反应腔,具体的构建过程按照产品的使用说明,反应腔覆盖的芯片区域含有探针的点阵。
E.核酸扩增和杂交PCR反应体系的组成如下:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3 at 24℃),50mmol/LKCl,1.5mmol/L MgCl2;0.5μmol/L的上游引物以及下游引物;1单位的Taq DNA聚合酶;200μmol/L的dNTPs(dATP,dTTP,dCTP和dGTP),0.1%的BSA,0.1%的吐温20;反应的总体积为25μl。将配置好的体系加入D中所构建的反应腔中,用所料盖片密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行。采用如下的热循环程序。预变性:94℃,1minutes;主循环:94℃,30秒钟,55℃,30秒钟,72℃,1分钟,30个循环;72℃,10分钟。PCR结束后,在同一PCR仪上,52℃,4小时进行杂交反应。
F.结果检测最终的结果采用ScanArray 4000(GSI Lumonics,MA,USA)来检测,激发波长为543nm,选用激光器3,信号的检测选用滤光片7,激光器和光电倍增管的功能的均选定80%,扫描的焦距根据不同玻片做适当调整。检测的程序遵照仪器的使用说明。结果显示芯片点阵上有较强的荧光信号,同一点阵上的阴性对照探针所在的位置则只有较弱的荧光信号,同时未加入待测样品的芯片亦只有较弱的荧光信号,说明待测样品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
实施例7、基于荧光淬灭的整合系统用于乙型肝炎病毒的检测A.醛基化的芯片的制备将玻片浸泡于洗液中,室温过夜。用自来水冲洗以洗净玻片上的酸液,蒸馏水冲洗三次,去离子水漂洗一次,再用去离子水冲洗一次。离心甩干玻片。110℃,15分钟,彻底干燥玻片。将玻片浸入1%APTES(异丙胺基-三乙氧基硅烷)的95%乙醇中。在室温下用脱色摇床轻摇1小时。用95%乙醇清洗处理过的玻片。先冲洗一次,再漂洗一次。将洗净的玻片放入真空干燥箱,抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa),关闭通气阀,开始升温,110℃,20分钟。将凉至室温的玻片浸泡于12.5%的戊二醛溶液(400ml 12.5%戊二醛溶液:100ml 50%的戊二醛,300ml磷酸盐缓冲液(1MNaH2PO4 30ml,2.628g NaCl),调PH值到7.0))。室温放置4小时,轻轻摇动。将玻片从戊二醛溶液中取出,3×SSC漂洗一次,去离子水冲洗两次,离心甩干,室温干燥。
B.引物和探针的合成探针一:amino-5’-polyT(15nt)GCATGGACATCGACCCTTATAAAG-3’-TAMRA探针三:5’- CTTTATAAGGGTCG cct-3’, 处标记有荧光淬灭分子Dabcyl。
上游引物:GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG下游引物:TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT引物和探针均在上海博亚生物技术公司合成。
C.阵列的制作探针一溶于50%的DMSO中,终浓度为10μM。采用Cartesin的点样仪(CartesianTechnologies,Inc.CA,USA)按照预先设定好的样式点样。将点好的玻片置于玻片盒中室温放置过夜以干燥玻片。室温下将玻片在0.2%的SDS中浸泡两次,每次2分钟,振动。去离子水冲洗两次,去离子水漂洗一次,离心甩干。把玻片转移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中,再加入100无水乙醇),室温摇床轻摇5分钟。去离子水冲洗一次,去离子水漂洗两次,每次1分钟。离心甩干。
D.反应腔的制作采用MJ Research(MJ Research,Inc.MA,USA)的self sealchamber来构建反应腔,具体的构建过程按照产品的使用说明,反应腔覆盖的芯片区域含有探针的点阵。
E.核酸扩增和杂交PCR反应体系的组成如下:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3 at 24℃),50mmol/LKCl,1.5mmol/L MgCl2;0.5μmol/L的上游引物以及下游引物;1单位的Taq DNA聚合酶;200μmol/L的dNTPs(dATP,dTTP,dCTP和dGTP),0.1%的BSA,0.1%的吐温20以及终浓度为2μmol/L的探针三;反应的总体积为25μl。将配置好的体系加入D中所构建的反应腔中,用所料盖片密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行。采用如下的热循环程序。预变性:94℃,1minutes;主循环:94℃,30秒钟,55℃,30秒钟,72℃,1分钟,30个循环;72℃,10分钟。PCR结束后,在同一PCR仪上,52℃,4小时进行杂交反应,然后再30℃,5分钟以使探针三与为杂交的探针一结合。
F.结果检测最终的结果采用ScanArray 4000(GSI Lumonics,MA,USA)来检测,激发波长为543nm,选用激光器3,信号的检测选用滤光片7,激光器和光电倍增管的功能的均选定80%,扫描的焦距根据不同玻片做适当调整。检测的程序遵照仪器的使用说明。结果显示芯片点阵上有较强的荧光信号,同一点阵上的阴性对照探针所在的位置则只有较弱的荧光信号,同时未加入待测样品的芯片亦只有较弱的荧光信号,说明待测样品中含有乙型肝炎病毒的核酸。