志贺氏菌是随着人类进化而发展起来的致病菌，能侵袭结肠膜上皮细胞， 导致自限性化脓性感染病灶，引起人类的细菌性痢疾。人类对志贺氏菌有较高 的敏感性，只需要少于十个菌就可以引起人的感染，儿童和成人易感染，特 别是儿童，易引起急性中毒性痢疾，而志贺氏菌的O-抗原是志贺氏菌引起疾 病的主要原因之一。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复 的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷 二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成 寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚 合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子 [Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责 O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇 [Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和 沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001) “Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection and Immunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含 有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因。其中 糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基 因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖 单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转 移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只 存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不 同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单 糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着， 所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又 具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其 O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应 自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一 的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不 足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、 灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检 测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏 菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门 氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”， J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血 清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因 的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年， Paton，A.W et.al用针对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核 苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]， 但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定 E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R. 认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb) cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O- 抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度 特异的。
志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关 系非常近，并且有12种O-抗原是大肠杆菌和志贺氏菌共有的，其中鲍氏志贺 氏菌7型就拥有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983) “Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]，传统的血清型 方法不能将它们区分。

本发明的目的是提供一种鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，它 是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和 转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长核 苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的基 因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy 基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、 orf12基因；糖合成路径基因，包括flmA，flmB，neuA，flmD，flmH，nue，glf。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌7型 的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf10、orf11、orf12 基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于 编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因 内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是特异 的；尤其是表一中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是高度 特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对鲍氏志贺氏 菌7型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反 应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通 过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原及检测和鉴定鲍氏志贺 氏菌7型。
本发明的还一目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全 序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列， 也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是 如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15796个碱基；或者具有一个或 多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1 的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于它是由 11个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述 的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合 酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括 orf8、orf10、orf11、orf12基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO：1中的 6714至7928碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO：1中的7936至8877碱 基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO：1中的8889至10184碱基的核苷酸；orf10 基因是SEQ ID NO：1中的10186至11148碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO：1中的11355至12272碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO：1中的12247 至13176碱基的核苷酸；
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是 源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因的orf8、orf10、orf11、 orf12基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述 的源于wzx的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的6782至6799碱基的核苷酸和7449至7466碱基的核 苷酸，
SEQ ID NO：1中的6971至6989碱基的核苷酸和7481至7498碱基的核 苷酸，
SEQ ID NO：1中的7035至7053碱基的核苷酸和7588至7607碱基的核 苷酸；
源于orf8的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的8065至8082碱基的核苷酸和8789至8806碱基的核 苷酸，
SEQ ID NO：1中的8134至8152碱基的核苷酸和8685至8704碱基的核 苷酸，
SEQ ID NO：1中的8198至8215碱基的核苷酸和8459至8476碱基的核 苷酸；
源于wzy的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的9091至9108碱基的核苷酸和9457至9474碱基的核 苷酸，
SEQ ID NO：1中的9357至9376碱基的核苷酸和9704至9721碱基的核 苷酸，
SEQ ID NO：1中的9120至9137碱基的核苷酸和9945至9962碱基的核 苷酸；
源于orf10的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的10271至10288碱基的核苷酸和11060至11077碱基 的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的10375至10393碱基的核苷酸和10790至10808碱基 的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的10510至10528碱基的核苷酸和11090至11108碱基 的核苷酸；
源于orf11的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的11737至11754碱基的核苷酸和12013至12030碱基 的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的11367至11384碱基的核苷酸和12154至12171碱基 的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的11482至11598碱基的核苷酸和11839至11856碱基 的核苷酸；
源于orf12的寡核苷酸对是：
SEQ ID NO：1中的12274至12291碱基的核苷酸和13016至13033碱基 的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的12489至12506碱基的核苷酸和13101至13120碱基 的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的12384至12401碱基的核苷酸和12959至12976碱基 的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的 细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通 过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于， 其作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因 芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征 在于，其包括下述步骤：
(1)提取基因组。在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞， 用Tris-HCl(pH8.0)和EDTA重悬细胞，37℃温育20分后加入溶菌酶裂解细菌， 加入蛋白酶K和SDS降解蛋白质，再加入RNase去除RNA；然后用等体积酚及 等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去除其中的酶和蛋白，再用等 体积的乙醚抽提除去残余的酚；用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA 后用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中，基因组DNA通过0.4％的 琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过Long PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。首先根据 经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523 -ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd 基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用 Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基 因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒；60℃退 火30秒，68℃延伸15分，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分， 得到长度为15796个碱基的PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega 公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库。用被修改的Novagen DNaseI shot gun法 构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul0.1M MnCl2， 1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；选择合适的反应 时间使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul0.1M EDTA 终止反应，合并4管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊 醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的 无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此 混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75 ℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩 大为80ul，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提 和乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24 小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶， 最后用无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30ul水中得到连接产物， 用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α 细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad 公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒， 电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄 青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌 落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培 养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小， 得到的白色克隆构成了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序。从文库中挑选插入片段在700bp以上的120 个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入 片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到 的序列设计引物，两对引物，如下所示：5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和 3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及 5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’，再从鲍氏志贺氏 菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇 的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析。用英国剑桥MRC(Medical Research Council) 分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼 接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸 全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对鲍氏志 贺氏菌7型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。 2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O- 抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找 到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这 些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的 Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精 确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，
(6)特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、 wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物。在每个基因内各设计了三 对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些 引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在各组中 都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带， 虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、 orf8、orf10、orf11、orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原都是高度特 异的。
也就是，在本发明的第一个方面，提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基 因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15796个碱 基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核 苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了鲍氏志贺氏菌7 型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由11个基因组成，都位于 galF基因和gnd基因之间。
在本发明的第二个方面，提供了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的 基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy 基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、 orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括 flmA，flmB，neuA，flmD，flmH，nue，glf基因，它们在O-抗原基因簇中的起始位 置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到糖基转移酶基 因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖 的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不 是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因 对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是高度特异的。
在本发明的第三个方面，提供了源于鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中 的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因 和糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它们 是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表一中的寡核苷 酸对，在表一中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡 核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火 温度进行。这些引物只在以鲍氏志贺氏菌7型为模板进行的PCR扩增中得到 预期大小的产物，而在以表二所列的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌为模板 进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对 为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有些菌中得 到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到基因组的别 的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以，可以 确定这些引物即表一所列的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型及它们的O-抗原是 高度特异的。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是 显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移 酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它 们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些 寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的6714至7928碱基)， orf8基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的7936至8877碱基)，wzy基因(核 苷酸位置是从SEQ ID NO：1的8889至10184碱基)，orf10基因(核苷酸位置 是从SEQ ID NO：1的10186至11148碱基)，orf11基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的11355至12272碱基)，orf12基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1 的12247至13176碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型(SEQ ID NO：1)都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突 变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中， 需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发 明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转 运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与 wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特 殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗 原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、 wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy或与wzy有相似功能的基因中的寡 核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗 原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些 抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是： (i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因 或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许 可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个 以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用PCR 方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如 southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及 细菌。
本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核 苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡 核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基 转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx 有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡 核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是 由鲍氏志贺氏菌7型或表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗 原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂 交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基 因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能 的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O- 抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是鲍氏志贺氏菌7 型或。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本 发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧 光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但 它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一 个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡 核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基 因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使 当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基 因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发 明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、 编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基 因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是 特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细 菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下 至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码 糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx 有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况 下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个 以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌7型或。可用本发 明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷 酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的 抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中 的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或 与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此 外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到 不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检 测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗 原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于 O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，发明者 相信本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的全长序列，而且 可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产 生表达鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。 实施例1：基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分，然后 加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白 酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65 ℃30分。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊 醇(25∶24∶1)抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的 酚。上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA， 最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。 实施例2：通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌7型中的O-抗原基因簇。
鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇通过Long PCR扩增。首先根据经常发 现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设 计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR 反应程序如下：在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒， 68℃延伸15分，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分，得到PCR 产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管 long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR 产物。 实施例3：构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建 O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽 提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA， 并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单 位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加 入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应 20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇抽提和等体 积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24 小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。 最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物， 再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180 rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm 剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分，于4℃4000rpm离心 15分。倾尽上清液液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4 ℃4000rpm离心15分。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体， 于4℃4000rpm离心15分。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm 离心10分，弃上清液液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即 为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏， 时间为5.0毫秒-6.0ms毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌 复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上 37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到 含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用 EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌 7型的O-抗原基因簇文库。 实施例4：对文库中的克隆测序
从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限 公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列 达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从鲍氏 志贺氏菌7型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原 基因簇的所有序列。在鲍氏志贺氏菌7型中我们设计了两对引物，如下所示： 5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’ 5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’ 实施例5：核苷酸序列的拼接及分析
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从 而得到鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。 序列的质量主要由两个方面来保证：1)对鲍氏志贺氏菌7型的基因组作6个 Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以 上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后， 用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用 Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌7 型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Aeromonas punctata的合成酶flmA基 因在197个氨基酸的序列中都有53％的相同性，表明它们之间有高度的同源 性。所以可以确定orf1是flmA基因。orf2与Aeromonas punctata的合成 酶flmB基因在378个氨基酸的序列中都有61％的相同性，表明它们之间有高 度的同源性。所以可以确定orf2是flmB基因。orf3与Aeromonas punctata 的nueA基因在227个氨基酸的序列中有56％的相同性，表明它们之间有高度 的同源性。所以，可以确定orf3是neuA基因。orf4与Aeromonas punctata 的flmD基因在361氨基酸的序列中有33％的相同性，53％的相似性，表明它们 之间也有高度的同源性。所以，可以确定orf4是flmD基因。orf5与Aeromonas punctata的flmH基因在227个氨基酸的序列中有35％的相同性，59％的相似 性，表明它们之间有高度的同源性。所以，可以确定orf5是flmH基因。Orf 6与Aeromonas punctata的neuB基因在361氨基酸的序列中有73％的相同性， 84％的相似性，表明它们之间也有高度的同源性。所以，可以确定orf6是neuB 基因。Orf7与大肠杆菌的wzx基因在307个氨基酸序列中有23％的相同性，并 且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf7有12个潜在的穿膜区，它与许多 wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序， 所以可以确定orf7是wzx基因，命名为wzx。Orf8与Salmonella enterica 的glycosyltansferase基因在286个氨基酸中有29％的相同性，是一个糖基 转移酶基因，命名为orf8。 Orf9与大肠杆菌的wzy基因在306个氨基酸序列 中有20％的相同性，另外通过Eisenberg算法得知orf9有10个潜在的穿膜区， 与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，所以确定orf9就是wzy基因，命 名为wzy。Orf11与S.boydii的糖基转移酶基因在239个氨基酸序列中有32％ 的相同性，51％的相似性，所以确定orf11是一个乙酰基转移酶基因，命名为 orf11。Orf12与Methanothermobacter thermautotrophicas的糖基转移酶基 因在286个氨基酸序列中有36％的相同性，51％的相似性，所以确定orf12是 一个糖基转移酶基因，命名为orf12。 Orf12与Pseudomonas aeruginosa的 合成酶wbpS基因在628个氨基酸序列中有56％的相同性，72％的相似性，所以 确定orf12是一个合成酶酶基因，命名为orf12，Orf13与Pseudomonas typhimurium LT2的glf基因在381个氨基酸序列中有58％的相同性，73％的 相似性，所以可以确定orf13是glf基因，命名为glf。根据鲍氏志贺氏菌7 型的O-抗原结构可知还需要有1个糖基转移酶基因，orf10与已知序列无明 显同源性，但具有糖基转移酶的特征，是1个糖基转移酶，命名为orf10。 实施例6：特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、 wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的 位置见表1所示。
表1列出了鲍氏志贺氏菌7型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖 单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了鲍氏志贺氏菌7型 的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应 的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表二中的 所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且 高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTA AAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株 大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基 因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来 源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们 的来源都列于表中。
在第23组中含有鲍氏志贺氏菌7型的基因组DNA作为阳性对照。以每组 菌做模板，用表一中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分后， 94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表一)，退火时间是50 秒，72℃延伸2分，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分，反应体 系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增 出的片段。
对于wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、orf12基因，每个基因都有1至3 对引物被检测，每对引物除了在第23组中做PCR后得到了预期大小的正确的 一条带外，在第18组中也都得到同样大小的特异性带。以第18组中的每个 菌的基因组DNA做模板PCR后，发现只在中得到了阳性结果。更详细地说， 以上每个基因的每一对引物都在中得到预期大小的正确的PCR产物带。据报 道，鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原结构是一样的，我们的结果从另一个侧面证 实了这一点。此外，所有的引物在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带， 也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR 产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf10、orf11、 orf12基因对鲍氏志贺氏菌7型及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从鲍氏志贺氏菌7型中筛选到对鲍氏志贺氏菌7型的O- 抗原高度特异的基因：wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任 何一段10-20nt的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原是特异的，尤其是 上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌7型 是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中 的鲍氏志贺氏菌7型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了鲍氏 志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框 表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅 读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，这两 个基因不负责O-抗原的合成，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O- 抗原基因簇的全长序列。
表4是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列 出了鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准 确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。
序列列表
                         SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸
<130>对鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15796
<212>DNA
<213>Shigella boydii
<400>1
ctcctggtga ctcatgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcatatgaa     60
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gcaaaacggt attccggttc caaccttctc tgcggcggtt gcttattacg acagctatcg    15780
tgccgctgtcctgcct                                                     15796 表一鲍氏志贺氏菌7型O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因
及其中的引物及PCR数据   基因   功能  基因的碱基     位置     正向引物     反向引物   PCR产   物长度  产生正    确  大小电  泳带的   组数   PCR的   退火温   度(℃)   Wzx   转运   酶  6714至7928 #103(6782至6799)   #104(7449至     7466)   685bp     0     52 #147(6971至6989)   #148(7481至     7498)   528bp     0     59 #173(7035至7053)   #174(7588至     7607)   573bp     0     45  Orf8   糖基   转移   酶  7936至8877 #105(8065至8082)   #106(8789至     8806)   742bp     0     58 #149(8134至8152)   #150(8685至     8704)   571bp     0     59 #175(8198至8215)   #176(8459至     8476)   279bp     0     50   Wzy   聚合   酶  8889至  10184 #107(9091至9108)   #108(9457至     9474)   384bp     0     55   #155(9357至9376)   #156(9704至     9721) 365bp     0     59   #177(9120至9137)   #178(9945至     9962) 843bp     0*     50  Orf10 糖基 转移 酶   10186至   11148   #109(10271至     10288)   #110(11060至     11077) 807bp     0**     50   #125(10375至     10393)   #126(10790至     10808) 444bp     0***     48   #411(10510至     10528)   #412(11090至     11108) 599bp     0***     45  Orf11 糖基 转移 酶   11355至   12272   #111(11737至     11754)   #112(12013至     12030) 294bp     0     58   #151(11367至     11384)   #152(12154至     12171) 805bp     0     59   #179(11482至     11598)   #180(11839至     11856) 375bp     0***     50  Or f12 糖基 转移 酶   12247至   13176   #113(12274至     12291)   #114(13016至     13033) 767bp     0     50   #153(12489至     12506)   #154(13101至     13120) 632bp     0     59   #181(12384至     12401)   #182(12959至     12976) 593bp     0     50 *在所有组中得到2条错误大小的带，**在6组中都得到1条错误大小 的带，***在所有组中得到1条错误大小的带 表二  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源 组号                       该组中含有的菌株                                 来源 1      野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O10，O16，O18，O39                         IMVSa 2      野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100                IMVS 3      野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137         IMVS 4      野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12                IMVS 5      野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22              IMVS 6      野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30                IMVS 7      野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42                IMVS 8      野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53                IMVS 9      野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61                IMVS 10     野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70                IMVS 11     野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81                IMVS 12     野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90                IMVS 13     野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101               IMVS 14     野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118        IMVS 15     野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171        See b 16     野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132，      See c 17     野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143        IMVS 18     野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152        IMVS 19     野生型大肠杆菌O153，O154，O155，O156，O157，O158，O159，O164        IMVS 20     野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111                  IMVS 21     野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110              IMVS 22     鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14                 Seed 23     鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18      Seed 24     痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8                    Seed 25     痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13                              Seed 26     弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：7)F5(v：4) Seed 27     宋内氏志贺氏D5，DR                                                  Seed  a.   Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia  b.   O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark  c.   172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVS  d.   中国预防医学科学院流行病学研究所 表3是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇的结构表
     1kb 表4是鲍氏志贺氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表 ctcctggtga ctcatgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcatatgaa      60 ttagaatcgc tccttgaaca gcgtgtaaaa cgccagttgc tggcggaagt tcagtccatc     120 tgcccaccgg gcgtcaccat tatgaatgtg cgtcagagcg aacctttagg tttgggccac     180 tccattttgt gcgccagacc cgccattggc gacaatccat tcgttgtggt gctgcctgat     240 gtcgttattg atgatgccag cgccgatccg ctgcgttaca accttgccgc tatgattgcg     300 cgattcaacg aaacgggtcg cagtcaggtt ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct     360 gaatactctg tcatccagac taaagaaccg ctggatcgtg aaggcaaagt cagtcgcatt     420 gttgaattta tcgaaaaacc cgatcagccg cagacactgg attcagacat tatggcggtt     480 ggtcgctatg tgctttctgc agacatttgg cctgaactgg agcggactca acccggtgca     540 tggggacgta ttcagctaac tgacgcaatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtccgttgat     600 gcaatgttaa tgacgggtga cagctacgac tgcggtaaaa aaatgggcta catgcaggca     660 tttgtgaagt acggactacg caacctgaaa gaaggagtga agttccgcaa agggattgag     720 cagctgttaa gcgaataaaa atcttaccgg atgtaacggt taataagaaa atcataacgg     780 cagtgaagat tcgtggtgaa agtaaattgc aacgaatgtt cctgccgtta ttgctttata     840 aaacactata ataacaatga gttagcaata agattttagt caaatttttc caggattttc     900 cttgtttcca gagcggattg gtaagacaat tagcgtttga atttttcggg tttagcgcga     960 gtgggtaatg ctcgtcacat cgtaggtatg catgcagtgc tctggtagct gttaagccag    1020 gggcggtagc gtgtgttaaa cttaaggggg ttgttgcgag taatcaagat cgcggcaatt    1080 tcggattgtg tcttattttg ataataaaac tatcctgata actggtggta ctggctcatt    1140
                    orf1的起始 cggcaataag tttgtgcgca  tgacattaga taaatataac cctaaaaaga ttattattta    1200 ttctcgtgat gaaatgaaac agtgggaaat ggcaaaacat ttcaaggacg aaagccgaat    1260 tcgattcttt attggggatg ttcgtgataa agatcgtttg tatcgtgcgt tggatggtgt    1320 tgactttgtt gttcacgccg cagcaacaaa aatcgtacct acagcagagt ataatccctt    1380 cgaatgtgta aaaacaaata tcaatggtgc gatgaatgtg attgatgctt gtatcgataa    1440 aggtatcgaa cgtgttgttg cactttctac tgataaagca agcagccctg cgaatctgta    1500 tggtgcaaca aaattagcat ccgataaact tttcgttgct ggtaactctt attctggtgc    1560 gacaaaaact cgttttgctg ttgttcgcta cggaaatgta atgggatcac gtggttcggt    1620 aataccgttc ttcttatcta tcaaagaaaa aggagaattg cctattactg atgatcgtat    1680 gactcgcttt atgattactc tggagcaggg ggttgagtta gtttggcatg cgtttgaaga    1740 tatggtcggt ggtgaaattt atgtaaaaaa aataccttcg atgaaagtaa ctgatatagc    1800 aacagctgtt gcgcctaatg ctacacaaaa aatggtcggt attcgaccgg gcgagaaact    1860 acacgagcag atgatcagtg ctgaagatgc ttattacact tatgaatatc cagagcattt    1920 taagattctt ccagccattc acaactggtg taactcacct gaaaggatta aagatggtaa    1980
               orf2的起始  orf1的中止 aaaagtgcca gaaggcttcg tct atgaaag tgatagtaac gcagaatgga tgagtattga    2040 agaacttcgt caatggatcg aggataatag agaaaaagta ggtaacattt gatgaaattt    2100 attccctatg gacggcagga tgtttctgat gaagatatcc atgctgtggt ggatgtactg    2160 aagtccgatt ttttgacgca aggaccatgt gttccccaat ttgagaaggc aattgctgat    2220 tatgtgaatg ctaagtatgc agttgcagta aatagtgcta cttcagcact tcacattgct    2280 tgtctcgcgt tggggatgaa gaaaggcgat tggctttgga catcgccaaa tacatttgtt    2340 gcttctgcga actgtgctct ttattgcggt gctaatgtca gttttgtcga tattgatgcg    2400 cggacttata atatgagtgt tagcgcgtta gaagcgaaac ttatgtctgc aaggaacaat    2460 ggaacattgc ctaaggttgt tgttcctgtc gcatttgcag gacagtcatg tgaaatggag    2520 gaaatatata aactctcaaa agagtatgga ttttcaatta tcgaagatgc ttcgcatgct    2580 attggaggaa attaccaggg aaagaaaata ggtaattcgc gctttgcaga tattactata    2640 ttgagcttcc atcctgttaa aattattaca actgcagaag gtggtatggc tctaaccaat    2700 aatgatgatt tggcagaaaa aatgcagtta ttccgtagtc atgggatcac tcgtgatagt    2760 aatcatatga cgaaggtaag tgaaggagga tggtattatc aacaagttga tcttggtctg    2820 aattaccgaa tgactgaact gcaggctgca ttaggcgtga gtcagctgaa gagtattgat    2880 gattttgtaa cacgccgcca tgaactggtt gaacgttaca aaaaagctct cgaagatatt    2940 cctatttccc taccatacca ggcggaaagt ggtcacagtg cctttcacct ttatcctgta    3000 accgttaaaa attctgcaca gcggaaaact ttgtttgatt atctgcggaa taaaaatatc    3060 ggggttaatg tccattatat tccagttcat actcaaccgt attatgaaaa gttagggcat    3120 aaaatcggag attatcctgt cgctgaggat tattactctc gaaccatcag cataccgatg    3180 tattctgctt tgacaaatga agaccaggat tatgtaatcc aatgcattcg ggagtttttt    3240 orf2的中止 orf3的起始 taaatgaatg tggcaatcat tccagctcgt ggtggtagta aacgtatccc tcgaaaaaat    3300 attaaaatgt tttgcgggaa accaatgatt gcctggtcga ttaatgccgc tcgaaagagc    3360 ggcgtgtttg acagaatcat tgtttcgacg gatgatatgg agattgcagc tgtagcaaga    3420 aaattcggcg ccgaagttcc gtttatgcgg ccagaagaac tttcgaatga ttttactgga    3480 acaatccctg ttatacggca tgcggctgaa tggcttattt ctcagggaaa taaaataaaa    3540 tatatttgct gcatttatgc aacggccccc tttattagag atgaagattt aaaactaggt    3600 ttgaacctta tcaaagcaaa ggggggggat tattgttttt ctgttactac ttattcgtac    3660 cctattcaaa gagcattaaa aattaatgag aataacgaaa taaccatgtt tgatccgact    3720 cagtttgaaa tgcgatctca agatcttgtg gacgcttggc atgatgccgg gcaattttat    3780 tgggggaata ttgatgcatg gataaaagaa aaaccggtat ttaagtcaca ggctatacca    3840 ttacctttgc ctagagaacg agtgcaagat attgatacgc cggaagattg gcatttcgct    3900
                                  orf4的起始         orf3的中止 gaggtgttat ataggataaa tacaataaaa a atgaagatt gtatt taggg ttgatgcttc    3960 gctttcaatt ggttcaggac atgtttttcg ttgtctaaat cttgctggtg cattgagaaa    4020 gaatggtttt gaatgcattt ttcttacaaa ggaacatgca ggaaacttaa ttcaatatat    4080 aaagacatat ttgttccaag tatatgttat ttcaaaggaa gataatgttg atgataaata    4140 tattgaaaat gaaaaagagt ggttaggagg gagtcaaaaa gaagacgctg aaaaaacttg    4200 tgaaattatt tacagaaata attttgcacc aggcatattt attattgatc attattcatt    4260 agattctgaa tgggaaagtt taattaaatg gaaatttcca agtacaaaaa ttgttgttat    4320 tgacgacttg tgtaatagaa aacattattg tgatatcctg attgattcaa catttgagcg    4380 tacttctgag gaatatagga gattagttcc tgaatattgt actattttgg ccggtactga    4440 ctatgcttta ctgaaagatg aatttttgca attgcgcaaa gaagccatat taaaacgtac    4500 atctatatta agccctcaga aaattttaat tactatggga ggggttgata tacataacgt    4560 gactgggaaa gttttaaaag aattaaataa tagagctgat cttcattata aaaagatcac    4620 tgttgtatta ggggtgaatt gccctcataa aaaaaacatt gaaaatattg cacaatcgat    4680 aaaatatgat gtggatataa aagtgaatac caacaatatg ccacaactta tgttagaaca    4740 tgatttatct attggagctt taggaagtac tacttgggag agagctgtgc ttggattacc    4800 cacagtaaat attgctattg ctgacaatca actggttatt gtagagaaac taaggcgaaa    4860 tggttttatt gtctttgata gcattaattt tactggggtg gaattagctc gttctttaat    4920 aaaggtaact gatttctatg atgaaatggt gtctcgctcg ctctctatat gtgatggcag    4980
                                        orf4的中止 orf5的起始 gggattacaa aggacactaa aatttataat atctttagct acaaataaa t aatgagac at    5040 gcttatgact ggcaaaaata taaaaaaatt aaatttgctt aacattgttc attcttcgga    5100 ggatattcaa gaaaaagttc gatgtataag aaatgaacct caaattagga agtggatgta    5160 tacagatcat cttatatcaa aagatgagca taaaaattgg attgaaagat taagaaatga    5220 atcaagaaat tttgtgtatg tcgtaatgaa tgactacgat gagcctattg gtgtcgttag    5280 tgtaaattcg attgatttga aaaacaaaaa aggagactgg gcatattatt tgacagcaaa    5340 tacacgtact ggtattggtg ctgtattaga attttttgtg attgattatg tttttaacta    5400 tttgcatctt gaaaaattaa attgtgaggt aattgaacat aatgataccg tcgttcgatt    5460 acatgagaaa tttgggttta agcaggaagg atttagagag tctaatatta taaaggatga    5520 taagcgtttt ggagtttatt attttggttt aacgaaagaa aaatggatgc taacacgaga    5580
                                                   orf5的中止 atgtttaaag aataaatatt ataagctttt ttctcaatac gcggttgatt ttcat taata    5640
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                                        orf7的起始 orf6的中止 agtgatgtta tggccaatac ccgaacatca ttggaattaa ttgcagattt aaa atgaaag    6720 ttattaaaga tagtgttctg tatgtaatag gtgagttgat atctaaaagt gttccatttc    6780 tattgcttcc ctatcttaca aggcggttgg gaattgatgg ttttggagaa atgtcatttt    6840 atcagacaat acttgcttta ttggttatcg ttataagctt agggcaagat ggggctgttg    6900 ctagatattt ttatttctac ggagcccgtt ctataaattt gattgtgact gtaggtgctt    6960 tatattcact tgtgacgaca tccctattgt ttttatcgtt ttcatttttt aaatccacga    7020 tattatcaat tattgtgttg actgctggat ttcaatcact tttcaatacg cagctaagtc    7080 ttaggcagtg ccaaaaagag tcagttcagt atattgtcat gcaaatatta gttgcgttga    7140 cttctggtgg tataaccttt tgtttactgg aaatatatag tcatgattta gttgaaaaga    7200 gatttattgc attgcttttg agtaatatag tttgtgtttt tattgcttat cttatttata    7260 tgaggagacg gaaatataat cacgcatttt tatttcgacg atattatagt gcattgctat    7320 acttgattgg ttttggaggc ccattgattt tgcatcaaat aagtggcttt cttaaaggac    7380 aattagatcg agttttgata tatagccgtt tttctgcttc agatttaggg ggctattctg    7440 ctgcatttca aatagcctca gttctcttga tactgataat ggcgttgaat aaagcactag    7500 ttccatatta ttatagtgag ctcaaaaaaa agcatatagt ctttgatgat ataaaaaaaa    7560 cttgcgtttt tttatttcta ttgattccac ttccatcaat catatcgttg attattcctg    7620 ctgatttttg gtgttttatt ttaggaaatg aatttgttga tgttaaatat tacatcgcta    7680 tattcctatt aggtataggt tttacaatac cttatctttt actagtgaat tatctttttt    7740 attatggtaa aaataaaagt ataactatct gttcagtcat ttcaacatct atttattgca    7800 ttgttcttta ttttttatca tgtttaggta tttcttatgt tccatattct atgttgatag    7860 caaatatgct aatcgttcct ttactttata tggctgccaa aaaaacatca atgcttgaac    7920    orf7的中止   orf8的起始 gccag tgaga ttaat atgcc ctcgttattt atatgtgtta cgccactgca aatgttgatt    7980 gctgaaaaaa taattgataa aaccaggcca gtaaacatag aaattatagt gcttgcatat    8040 cagaaaaatg ataaatatat gcattacata aagcggttgg agaaaaaatg tactaatttt    8100 acagttttgg ctgtaacgcc aaaaaataaa tttgtaaccg tgatcgcctt tgcaaaatta    8160 cataccatct taaataaaaa tatgagtaaa acttactctg aggtttatct gtctagtatt    8220 gataacaagt atgtacaatt aattgtttct aagctcaatt atgcaaggtt atatacattt    8280 gacgatggaa cagcgaatat aattaaatct agtgcatatt atcaagagga aaaaaaaact    8340 ctcaagacta acattttgag atggattttt ggaattaata aaggattgca agaaattaag    8400 agtgaaatat gcaagcacta tacaatttat ccaagtgtta gtaatattgt ctctaataca    8460 gaattgatag agatgtttac acaatgcaaa aaaaggaagc aagataaaaa agttgtgaga    8520 gtctttatag gacaaccttt tgatgaatta ggaataccat tatcactaat agaagagttt    8580 ttctttaaat acaaaatgga ctattattat ccacacccaa gagagaaaat aattaataat    8640 aagttcactt atatacactc acatttgatt tttgaagaat atataattga aggcttacaa    8700 catcaagata tcgtatacaa aatatatggt gctgtgtgta caagtatatt aaatttagcg    8760 tcctcgaaaa atgatatcga gatatgttcc atttatacgg atgagctgag aactaaatat    8820
                                        orf8的中止 orf9的起始 agtgattatt atgcactggc tgaaaaaatg aatattacct tgttaaaact tact tgat at    8880 gataaaatat gactaatata acgttcagaa ctctgagaat tccaggatat ttactctcat    8940 tatttgttct tttaatcgga tttataacat atttcatctt taatgaaact cttgcagcga    9000 atttattagc agtgggggct attggcatta tcattcttga tagtttacat gataagcgga    9060 ttttttattt aacacttttt cccgtgtatg tcctcgtagg tcaactcatt tcattattat    9120 tagttgagca cggatggatt ctaatcgaac ttggaggtat taaaagctat cccattggtt    9180 caattctttt tatggcgtta acaatagttt tattccattt tatcatattt ttaactgtaa    9240 aaatttcaat attcaaattt gatcgaacat gtattgataa gttaagtggt aattctttta    9300 tttattactt gccgattttt tatctatgct tagtatatat tcctgttttt atttatggct    9360 ctgcattatc tgtaacaaat ggtaatcgag ttgtatacaa tcaaataata tcacctgttt    9420 ttttatattt atttcaaatt aaacaattta tacttcctgt tgcaggattg tatttgctta    9480 aaaataaaaa aatatttact atatatctgt ttgcaatttt actatggaat atattgattg    9540 gagagaaggc aacgggcatt tggcagtcat tgtatccaat gctgttacct tatgttttga    9600 taaattatga taaaataaaa acaaaaaata tattaatagt attaggtttt tgtattgtat    9660 ttataaccag tagcatagta attaattata tatttattga aaagtcaggt gctacgttta    9720 tatttgatag aatatcaatg caaggacaat tgtggtggta ttattttaat gagcacgttt    9780 tgttagctaa gacccctcat gaattatctg aagagttctc gtcagaatat agtgggcttc    9840 ttaatctgat gtatcattca atgcctgccc atcttttcaa tagctatatc gagcgcggtg    9900 tagtcttgac gagtggtttc cccgcaatat ttctttttta ctttggacaa tactggctcc    9960 ttcctacgtt attatcacct tttctttttg gtttagttgt ctattttttt tcaagaagtt   10020 tatatagcgg tagtatattg agtttgctta tatcaagtaa actatttttt gcttttactg   10080 ttttttttgc ccgtggagat atcgcaactt ttttagatta taaattgctt atttatctat   10140
                                        orf9的中止  orf10的起始 tgattataat aattttacaa tatttgccaa gggttaaggt t taat atggc gtatacttct   10200 cactttatat ataaagtagc taataagatt agcattttta taagaaaaat catcaactta   10260 tttagattat ttctttacgg tgatgttgtt tcatatgatt ttgaaatgga ggagaataga   10320 agaattatag tgtcaggaag tctaacaaag agagataaca tacctaaaat aatttggatt   10380 tattggcatg atgagcaaat tccattatta atagaggctt gtataaaacg ccttaaagat   10440 ttaaatccta attatcaatt aaatgtgcta aataaattta caattcatga atacttacct   10500 gagagtctaa tgtggagaca ggatctttct gtccaaataa gatctgatct gattcgcttg   10560 ggattattat ataaatttgg tggagtatgg atagatgcta gtgtaatgtt ttttgaggat   10620 ctttcatggt tagaaagact ttcagcagag aataaatatg atttaatcgg tttttatcga   10680 ggcagactat ctatcgactg ctataatcca atagtagaaa gttggatgct gggggcacca   10740 aaatacaata agtttataaa gcgatggtat gacaactttt atccagtatc ttatttaggg   10800 ttagatgaat atttcaacac aattaagaaa agaagtgatt ataaaattat caaacagaat   10860 ataaatattc ccaaatattt atctgtttat ctggcacaac aaatttcgtc gcgagaaatg   10920 agagattatt gcgcttattt aagaaaggta gaggatagtg catatttata tcaagagtca   10980 tatccacagc gtgattgtgt tctctcggag gtttggtgta aaagaagaaa accacagaaa   11040 attcctccac taatcaaatt aacaagccag aacagaaata caattttagc ctgtagtaaa   11100
                                                   orf10的中止 ataaatccac gtagtatcgt aggtgagttt ttagataata agaat tagga atagagaaag   11160 tgcgagataa aattgtattt gtagtcgctg atatcacggc tactggcggg attgaacgag   11220 ttattactta tcttgccagt tatttatgta ataatgggta tagtgtagag atattatcta   11280 ttcatagaag taatcgtaat ttaccttatc ctgttcatgc agacgttcat atctcttttg   11340
         orf11的起始 ttgataaaac tata atgaag gcaagaaagc caggatctgt cagcaaatta ctttcacatt   11400 ttaaatcctc atttcattta aatataaaat tatttaagag aagaaaatgt attattgtag   11460 caaatagttt tcctgttgct ttattttcct gcttctcggc cttattttca tcaaaaatgc   11520 tcgttgtcga gcatgttcat tatcactatt acagtaagtg cttagttaat gtaaggcgtt   11580 tcatttataa gtttttttat ggggtagttg cgttaactga gcgtgacagt gagctttata   11640 ttaatgataa actaaattct ctaacaatac ctaacgctct tagttctttt cctgaaaaaa   11700 tagcgaatcc atctgtggaa aagaaaaaaa taattgccgc tggaagatta gaacatcaaa   11760 aagggtttga tattctaata aaatcctttg ctgaaataga ctattctgtg aggaaagaat   11820 ggatcatgga tatttatggg gatggaaatg aaagagctgc cttacagaaa ttaattcatg   11880 atttaaatat tgaggattgt gttaatttat tgggtaacag tcgagacctt atgaacactt   11940 atgctgaata tgattttttt gtattatctt caagatttga aggtttcggg atggttttac   12000 ttgaagccat gagttgcggt cttccttgta ttgccatcga ttgtcctaca gggcctagag   12060 aaatacttga tggaggcaag tatgggatac tttgtgacaa ccaatcaaat ctgggggaga   12120 gtattgcatc tctaattgtt aataaggatc taagaactat gctatccggc aaaagcattt   12180 tacgtagtca tgattataat attcagatta taagtgaaaa atggcagggt ttatttgaaa   12240   orf12的起始                   orf11的中止 gcttaa atga aaaaaatata tatgaaaaa t  aatatcgcac ttgttcttgt tacgtataat   12300 agagagtctc ttttaaaaga agtcctttca tcgataaagc atttaaaaga taaaccgaaa   12360 catgtttata taatcgataa taatagctca gatggaacct gtaatataat tatagatttt   12420 attcaacaga attcatctat tctaagtatg agttatcata atacaggaga taatctcggt   12480 ggggctggcg gatttgctta cggtagccgg cttgcttatg ccgatggatt ccaatggatt   12540 tggttagctg atgatgatgt tgtttttgag caaacatgtc tgactcaatt gatgctttat   12600 tcttcagatg ccgatatatt acagccaatg agaatcaata ctgacggtag ctgtgcagaa   12660 atttcaggaa tagattacga aataaacaat atcttcaggt taaaccctaa aaaacttaaa   12720 attactgata tatatgaaga aaagtgggat attcaagaaa tcaaaacgat accttttgaa   12780 ggaccattaa tacatcgacg tgtatttgag cagattggtt ttcccaaccc cgattttttt   12840 attttttatg atgatctaga ttttgcattg agggctcaaa gagcaggctt caagattaaa   12900 tgtgtaaaat ctgctcatct gattcgtaag attagatttg ttcaaagcgt cgctttgacg   12960 tcttggaaag gttattttat gtatcgtaac ttttttaagg ttcaacttac gtatgcgaga   13020 ataccgatag gattatttag agttattgct atatttttta ttgtaataat ttattctcta   13080 ctatttggag gtgcaaaaaa catttcgact ttgataagtg cattgcgtga tgcattaagg   13140
                                    orf12的中止        orf13的起始 aaaaattttc cacttgatca acgttataaa ccc taattta aaagttaaaa tc atgaaaaa   13200 taaaatagct attgtcggtg caggcttaag tggggcagta atagctcgtg aacttgctga   13260 tgctggatat ttagttgatg tttttgataa acgtcaacat attggaggta actgctatac   13320 cgctagggat cctcaaacaa atattatggt tcatacatat ggcccacata tatttcatac   13380 taacagtaaa tttgtttggg cttatattaa taagctgggg gtatttaaac cgtttactaa   13440 ccgcgttaaa gctgttacta gaggacaggt tttttctttg cctattaacc tattaactat   13500 aaatcaattc ttcaataaat tatttacacc agcagaagca aaaaaatata ttgaatctat   13560 atctgataaa tatattaaag atcctaatac gtttgaagaa caagctttat cctttattgg   13620 acgtgaatta tatgaggctt ttttcaagtc ttatacaatt aaacagtggg ggattttacc   13680 taccgatata ccagccagta ttctcaaacg actgcctgtc cgttttaatt atgatgataa   13740 ttatttttcg catcaatatc agggaatgcc ggaggacggc tatacacctc tattcgaaaa   13800 tcttctgaat cactccaata tcaatgttat tctttctacg gaattctcgg caattgattg   13860 tgataaatat attcatactt tttatagtgg cacaatcgat gggttctttg attatgattt   13920 aggtcgtttg ctatatagaa ctctagactt taaaacggaa gtgttttggg gagattatca   13980 gggatgtgca gtaatgaatt attgtgataa ttctaaacca tatacacgta ttactgaaca   14040 taaatatttt tctccttggg aacaacatga caaaacaata atttacaaag aatatagtag   14100 agaatgtaat gatagtgata ttccctatta ccccgtacga ctggtcagtg ataaagaaat   14160 attaaaaaaa tatgtggaac gtgccagtaa acttgaaaat gttacttttg ttggccgatt   14220 gggtacgtat cgatatttag atatggatgt aactatcact gaggccttaa acaccgccga   14280 acagttttta gaacttcacc aaaataatca aagaatacca gctttttttg ttgatgtttt   14340 orf13的中止 a tagcgagtc aacatgatta tattgtagta cataatatta cgttcatcct gataaattta   14400 atctatattt tgctcatggc tttaaattta aagctattct tcatataata gcactaattg   14460 cggtaacccc tgacaggagt aaacaatgtc aaagcaacag atcggcgtcg tcggtatggc   14520 ggtgatgggg cgcaaccttg cgctcaatat cgaaagccgt ggttataccg tctctatttt   14580 caaccgttcc cgtgaaaaga cggaagaagt gattgccgaa aattctggca aaaaactggt   14640 tccttactat acggtgaaag agttcgttga atctcttgaa acgcctcgtc gcatcctgtt   14700 aatggttaaa gcaggtgcag gcacagatgc tgctattgat tcccttaagc cataccttga   14760 aaaaggcgac atcatcattg atggcggtaa caccttcttc ctggacacca ttcgtcgtaa   14820 ccgtgagctt tctgcggaag gttttaactt cattggtacg ggggtttccg gtggtgaaga   14880 aggtgcgctg aaaggtcctt ctatcatgcc tggcggtcag aaagaagcct atgaattggt   14940 tgcgccgatc ctgaccaaaa tcgctgccgt agctgaagat ggcgaaccgt gcgttaccta   15000 tattggtgca gacggcgcag gtcattatgt gaagatggtt cacaacggta ttgaatacgg   15060 tgatatgcag ttgattgccg aagcttattc actgcttaaa ggtggcctga atctctccaa   15120 cgaagaacta gcgcagacct ttaccgagtg gaataacggt gaactgagca gttacctgat   15180 cgacataacc aaagacatct tcaccaaaaa agatgaagac ggtaactacc tggttgatgt   15240 gattctggat gaagcggcta acaaaggtac cggtaaatgg accagccaga gtgcgctgga   15300 tctcggcgaa ccgctgtcgc tgattaccga gtctgtgttt gcacgttata tctcgtctct   15360 gaaagatcag cgtgttgccg cgtctaaagt tctctctggt ccgcaggcac agccagcagg   15420 cgacaaagcg gagttcatcg agaaagttcg ccgtgcgctg tatcttggca aaatcgtttc   15480 ttatgctcag ggcttctctc aattgcgtgc cgcgtctgaa gagtatcact gggatctgaa   15540 ctacggtgaa atcgcgaaga ttttccgtgc tggctgcatc atccgtgcgc agttcctgca   15600 gaaaatcacc gatgcctatg ccgaaaacct aaaaatcgct aacctgctgt tggctccgta   15660 ttttaagaaa atcgctgacg actaccaaca agcactgcgt gatgtcgtcg cttatgcagt   15720 gcaaaacggt attccggttc caaccttctc tgcggcggtt gcttattacg acagctatcg   15780 tgccgctgtcctgcct                                                    15796
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上 的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。