纳米晶体纳米乳剂
阅读：614发布：2020-05-13
专利汇可以提供纳米晶体纳米乳剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 纳米乳 剂形式的 纳米晶 体制剂，其包含连续 水 相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含助 表面活性剂 。本发明还涉及所述制剂的生产方法和在医学成像、 热疗 法或光疗法领域中的应用。，下面是纳米晶体纳米乳剂专利的具体信息内容。
1.纳米乳剂形式的金属、金属氧化物或半导体纳米晶体制剂，其包含连续的水相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种磷脂和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质包含至少一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯，且其中水相包含助表面活性剂。
2.权利要求1的纳米晶体制剂，其中纳米晶体是发光的。
3.权利要求1或权利要求2的纳米晶体制剂，其中油相还包含至少一种油。
4.权利要求1-3任一项的纳米晶体制剂，其中助表面活性剂包含至少一种环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元形成的链。
5.权利要求4的纳米晶体制剂，其中助表面活性剂选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类和脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
6.权利要求1-5任一项的纳米晶体制剂，其特征在于分散的相被官能化。
7.金属、金属氧化物或半导体纳米晶体制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤：
(i)制备包含适量纳米晶体、磷脂和至少一种增溶脂质的油相，所述增溶脂质包含至少一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯；
(ii)制备包含助表面活性剂的水相；
(iii)在足够剪力的作用下将油相分散在水相中，以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
8.权利要求7的制备方法，其中剪力作用通过超声处理产生。
9.权利要求7或权利要求8的制备方法，其中通过将全部或一些成分放入适合的溶剂中形成溶液且然后蒸发溶剂制备油相。
10.权利要求1-6任一项的纳米晶体制剂，其用于医学成像、热疗法或光疗法。
11.光疗或热疗治疗方法，其包含对有此需要的哺乳动物给予有效治疗量的权利要求
1-6任一项的制剂。
12.诊断方法，其包含给哺乳动物施用权利要求1-6任一项的制剂。
纳米晶体纳米乳剂
[0002] [现有技术]
[0004] 因此，在大量应用中提出了用纳米晶体有利地替代通常使用的有机化合物，例如特别是在如下应用中：
[0005] -使用氧化铁纳米晶体的磁共振成像(MRI)(Wagner，V.等人，The emerging nanomedicine landscape，Nat Biotechnol.，2006，24(10)：p.1211-12171)；
[0006] -使用发光半导体纳米晶体的荧光成像和光疗法(Azzazy，H.M.E.，M.M.H.Mansour，and S.C.Kazmierczak，From diagnostics totherapy：prospects of quantum dots，Clinical Biochemistry，2007，40：p.917-927)；
[0007] -热疗法和/或光学成像(Loo，C.等人，Immunotargetednanoshells for integrated cancer imaging and therapy.NanoLett.，2005，5(4)：p.709-711)或应用金纳米晶体的X-射线(Kim，D.等人，Antibiofouling polymer-coated gold nanoparticles as acontrast agent for in vivo X-ray computed tomography imaging，J.Am.Chem.Soc.，2007，129：p.7661-7665)。
[0008] 这些应用一般涉及对患者给予纳米晶体，例如通过注射。因此，必须提供这些稳定和适合于注射的、特别是生物相容性的纳米晶体制剂。
[0009] 在合成后，一般得到有机配体稳定的形式的纳米晶体，这使得能够控制其生长。可以通过用在一端上对纳米晶体表面具有亲和力、而在另一端上对水介质具有亲和力的双功能配体替代所述配体，从而在生物相容性水介质中增溶纳米晶体。
[0010] 然而，得到的水性制剂仍然不稳定。实际上，配体与存在于介质中的其他分子竞争且pH、温度或乃至存在的氧的任意改变都可能使溶液不稳定并且导致纳米晶体絮凝。就这些纳米晶体而言，还观察到不需要的蛋白质或DNA非特异性吸收。最终，纳米晶体的内在特性可以在这种类型的制剂中变性，例如影响发光半导体纳米晶体的量子收率。
[0011] 为了更好地稳定纳米晶体和保护其特性，建议将它们包囊在不同系统中，例如一层两亲配体、无机壳或乃至较大的纳米系统。
[0012] 因此，Schroeder等人描述了将发光半导体纳米晶体包囊在脂质胶束中：Folate mediated tumor cell uptake of quantum dotsentrapped in lipid nanoparticles，J.Control.Release，2007，124：p.28-34。通过在将成分在氯仿中混合后离心、蒸发溶剂和重新混悬于水中得到纳米粒，称作脂质滴(lipodots)。就此而言，纳米粒的大小分布是极大的，60-200nm。认为发光半导体纳米晶体实际上被包囊在胶束中，然后形成较大的聚集物，这可以解释观察到的荧光明显受到抑制(-98.5％)。
[0013] 此外，S.K.Mandal等人(Langmuir 2005，21，4175-4179)描述了将氧化铁纳米晶体和荧光半导体纳米晶体联合包囊(jointencapsulation)在辛烷纳米乳剂中。然而，这种类型的乳剂因存在辛烷而不是生物相容性的。
[0014] [技术问题]
[0015] 因此，需要提供适合于生物学和医药领域、特别是医学成像领域中特定需求的纳米晶体制剂。
[0016] 更具体地说，需求生物相容性、稳定和保护纳米晶体内在特性的制剂。
[0017] 最终，提供能够在体内成像或治疗区域靶向生物分布的制剂是有益的。
[0018] [发明概述]
[0019] 本发明提出了，将纳米晶体包囊在具有特别稳定配方并且仅使用对人体注射批准的成分制备的纳米乳剂的油分散相中。
[0020] 本发明的第一个方面还涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其包含连续的水相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质(Solubilising lipid)，且其中水相包含助表面活性剂。
[0021] 纳米晶体特别由金属或氧化物形成并且可以是导体或半导体。本发明特别涉及发光纳米晶体。
[0023] 助表面活性剂优选包含至少一种环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元形成的链。助表面活性剂有利地选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类和脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
[0024] 根据一个实施方案，纳米晶体制剂包含官能化的分散的相，例如通过接枝两亲脂质或助表面活性剂于生物配体。
[0025] 本发明第二个方面涉及纳米晶体制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤：
[0026] (i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和适量纳米晶体的油相；
[0027] (ii)制备包含助表面活性剂的水相；
[0028] (iii)在足够剪力的作用下将油相分散在水相中，以形成纳米乳剂；和[0029] (iv)回收由此形成的纳米乳剂。
[0030] 剪力作用优选通过超声处理产生。有利地通过将全部或一些成分放入适合溶剂的溶液中且然后蒸发溶剂制备油相。
[0031] 本发明的最后一个方面涉及本发明纳米晶体制剂在医学成像、热疗法或光疗法中的应用。
[0032] 特别地，纳米乳剂有利地显示贮存过程中(＞3个月)极佳的胶体稳定性和良好的包囊纳米晶体的能力以及在分散相中增加的浓度。在应用过程中，在将纳米粒静脉内注入有机体(隐身特征(stealthycharacter))后还观察到长血浆寿命。
[0033] 一般而言，本发明的纳米乳剂适用于生物学和医学领域内，特别是通过注射，因为可以使用对人体注射批准的成分制备它。
[0034] 在本申请中，纳米乳剂能够通过控制纳米乳剂作为载体的生物分布来管理纳米晶体的生物分布。由此能够避免纳米晶体被免疫系统快速识别与产生的血液循环中的寿命减少。
[0035] 分散相形成的纳米粒在静脉内注射后具有长血浆寿命。这一结果可能因纳米乳剂的低ζ电位(zeta potential)导致。ζ电位是影响纳米乳剂的生物分布的参数，由此在接触细胞时，正ζ电位由此促进胞吞作用。
[0036] 纳米乳剂的分散相可易于在表面上被生物配体官能化，以便使纳米晶体输送逐步靶向于被成像或治疗的组织。
[0037] 由于连续水相中助表面活性剂的浓度增加，所以纳米乳剂还显示具有极小直径的分散相。包囊具有3-12nm平均直径的纳米晶体的纳米乳剂由此典型地具有小于50nm且优选30-40nm的平均直径。
[0038] 所述纳米乳剂有利地具有增加浓度的分散相，例如相对于纳米乳剂重量的大于10％，且特别是20-40％重量。
[0039] 最终，可以通简单生产方法得到提出的纳米乳剂，这种生产方法是低廉的、可以快速进行并且是稳定的，因为它对所用制剂的变化不敏感。
[0040] [本发明的公开内容]
[0041] [定义]
[0042] 在本文件的含义中，术语“纳米乳剂”意指具有至少两相的组合物，所述两相一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是20-100nm，且最优选20-70nm(参见文章C.Solans，P.Izquierdo，J.Nolla，N.Azemar and M.J.Garcia-Celma，Curr Opin Colloid In，2005，10，102-110)。
[0043] 在本文件的含义中，术语“脂质”表示全部脂肪和油或包含存在于动物脂肪和植物油中的脂肪酸的物质。它们是主要由碳、氢和氧形成并且具有低于水的密度的疏水或两亲分子。所述脂质在室温(25℃)可以是固态、为蜡或作为油的液体形式。
[0044] 术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。最常见的是，磷脂类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。具体的磷脂类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。
[0045] 术语“卵磷脂”意指磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸酯、甘油和两种脂肪酸形成的脂质。更广泛地说，它包括从生命来源、植物或动物来源提取的磷脂类，条件是它们主要由磷脂酰胆碱组成。这些卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物组成。
[0046] 术语“脂肪酸”意指具有至少4个碳原子的碳链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有4-28个碳原子(一般是偶数)的碳链。长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且极长链脂肪酸是具有22个以上碳原子的那些。
[0047] 术语“表面活性剂”意指具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型和水/油-型界面具有特异性亲和力，使得它们降低这些界面的自由能并且稳定分散的系统。
[0048] 术语“助表面活性剂”意指与另一种表面活性剂一起起作用以进一步降低界面能量的表面活性剂。
[0049] 术语“生物配体”意指以特异性方式识别一般细排列在胞表面上的受体的任意分子。
[0050] 术语“纳米晶体”意指至少一种尺寸小于100nm的单晶。目前可得到的纳米晶体通常是无机物；然而，也可能涉及有机纳米晶体。纳米晶体可以由纯物质或化合物形成。特别地，它们还可以是金属或金属氧化物。纳米晶体可以是导体或半导体。就半导体材料而言，通常也涉及量子颗粒(或量子点或乃至qdots)。纳米晶体因其小尺寸而具有如电位阱这样的性能，它限制电子的三维空间，在该区域中大小相当于电子的德布罗意(de Broglie)波长，即在半导体中几个纳米。由于这种限制，所以纳米晶体的电子具有不连续的定量能量水平，其可以通过改变纳米晶体的大小和形状来控制。
[0051] [乳剂]
[0052] 本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的具体纳米晶体制剂。
[0053] 该乳剂是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相的或多相的，特别是通过在分散相中包含第二个水相。
[0054] 纳米晶体因其一般的亲脂性亲和力而被纳米乳剂的油分散相包囊。
[0055] 如上所述，目前有益于生物学和医学领域中应用的纳米晶体主要是无机纳米晶体。
[0057] 本发明特别涉及半导体纳米晶体，甚至更具体地说是发光纳米晶体，特别是荧光纳米晶体。实际上，荧光纳米晶体在成像领域中是极为有用的标记物。
[0059] 用于纳米晶体的有益半导体实例特别是CdS、CdSe、CdTe、InP、PbS、Si、CuInS和InGa半导体。这些材料可以以纯的形式或混合物形式、掺杂形式或芯/壳类形式的纳米晶体存在，其中纳米晶体芯被壳包衣，例如由ZnS制成。
[0061] 一般通过携带至少一种疏水链(优选C8(或以上)烃链)的配体层稳定商购纳米晶体。这些疏水链配体可以是，例如脂肪酸、硫醇类、膦类、氧化膦、磷酸酯类、膦酸酯类或具有脂肪链的胺类。它们可以包含一种或多种能够使它们结合纳米晶体的官能团(例如硫辛酸、低聚膦类等)。所用配体的实例特别是具有3个C8烃链的氧化三辛基膦(TOPO)。或者，还可以使用具有一般较长单一疏水脂肪链、例如C14-C22链、特别是C16或C18链的配体。
[0062] 能够包囊在本发明纳米乳剂中的纳米晶体的大小没有特别限定，并且根据商购功能和其他应用限制进行选择。典型地，纳米晶体具有约1nm-100nm、优选2nm-20nm的平均直径。
[0063] 由于增溶脂质在分散相中的应用，从而能够增加两亲脂质的浓度，所以提出的纳米乳剂能够包囊增加浓度的纳米晶体。
[0064] 因此，能够得到在同一纳米液滴中包囊多个不同或相同纳米晶体的纳米乳剂。不同纳米晶体的包囊能够提供多功能纳米乳剂。因此，发射不同量和不同波长的光的发光半导体纳米晶体的包囊能够提供具有光学“条形码”的纳米粒。
[0065] 纳米晶体的期望的浓度一般依赖于指定应用。典型地，就在乳剂中的终浓度而言，油相包含0.1-20nmol/g的纳米晶体，例如0.001-2nmol/g。
[0066] 可以将由疏水配体层稳定的且分散在有机溶剂中的纳米晶体掺入乳剂的油相，然后蒸发有机溶剂。所用的有机溶剂可以是，例如甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、DMSO或DMF。为了避免任何痕量的毒性溶剂，可以首先将纳米晶体转入更好耐受的溶剂，例如己烷。
[0067] 纳米乳剂的油相还可以包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。
[0068] 为了形成稳定纳米乳剂，一般在组合物中必需包括至少一种两亲脂质作为表面活性剂。表面活性剂的两亲性使油滴在连续水相中稳定。
[0069] 两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自亲脂部分包含具有8-30个碳原子的直链或支链饱和或不饱和的化合物。它们可以选自磷脂类、胆固醇、溶脂质(lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂类，并且可以具有天然或合成来源；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类，例如在 商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；与聚氧化乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在 商品名下由ICI Americas，Inc.销售的和在下由UnionCarbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯；能够使用单独或混合物形式的所述表面活性剂。
[0070] 卵磷脂是优选的两亲脂质。
[0071] 在一个具体的实施方案中，全部或部分两亲脂质可以具有反应官能团，例如马来酰亚胺、硫醇、胺、酯、羟基胺或醛基团。反应官能团的存在使得官能化合物在界面上接枝。将反应性两亲脂质掺入界面上形成的层，稳定分散相，其中它易于偶合存在于例如水相中的反应性化合物。
[0072] 一般而言，油相包含0.01-99％重量、优选5-75％重量、特别是20-60％重量且最具体的是33-45％重量的两亲脂质。
[0073] 两亲脂质的量有利地有助于控制得到的纳米乳剂的分散相的大小。
[0074] 本发明的乳剂还包含增溶脂质。该化合物的主要任务在于增溶在纳米乳剂油相中难溶的两亲脂质。
[0075] 增溶脂质是对两亲脂质具有足够亲和力以使其增溶的脂质。增溶脂质优选在室温下是固体。
[0076] 就两亲脂质是磷脂的情况而言，可能的增溶脂质特别是甘油衍生物，尤其是通过用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。
[0077] 所用的增溶脂质有利地依赖于所用两亲脂质而被选择。它一般具有类似的化学结构以便带来期望的增溶。它可以是油或蜡。增溶脂质优选在室温(20℃)下是固体，而在体温(37℃)下是液体。
[0078] 优选的增溶脂质，特别是磷脂类，是脂肪酸甘油酯类，特别是饱和脂肪酸甘油酯类，且特别是包含8-18个碳原子、甚至更优选12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。有利的是包括不同甘油酯的混合物。
[0079] 优选包括包含至少10％重量的C12脂肪酸、至少5％重量的C14脂肪酸、至少5％重量的C16脂肪酸和至少5％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。
[0080] 优选包括包含0％-20％重量的C8脂肪酸、0％-20％重量的C10脂肪酸、10％-70％重量的C12脂肪酸、5％-30％重量的C14脂肪酸、5％-30％重量的C16脂肪酸和
5％-30％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。
5％-30％重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。
[0081] 特别优选由Gattefossé在商品名 NC下销售的半合成甘油酯混合物，其在室温下是固体并且批准应用于人体注射。N 型甘油酯类通过直接酯化脂肪酸和甘油得到。它们是C8-C18饱和脂肪酸的半合成甘油酯类，其中定性-定量组成如下表所示。
[0082] 上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应受限于具体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得到的芯具有增加的内在黏度，未显示结晶性。结晶对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为它一般导致液滴聚集和/或导致被包囊的分子从液滴中排出。这些特性由此提高了随时间推移的纳米乳剂物理稳定性和纳米晶体的包囊稳定性。
[0083] 增溶脂质的量随存在于油相中的两亲脂质的类型和量而广泛改变。一般而言，油相包含1-99％重量、优选5-80％重量且特别是40-75％重量的增溶脂质。
[0084] 表1：来自Gattefossé的Suppocire 的脂肪酸组成
[0085]链长 [％重量]
C8 0.1-0.9
C10 0.1-0.9
C12 25-50
C14 10-24.9
C16 10-24.9
C18 10-24.9
C8 0.1-0.9
C10 0.1-0.9
C12 25-50
C14 10-24.9
C16 10-24.9
C18 10-24.9
[0086] 油相还可以包含一种或多种其他油。
[0087] 所用的油优选具有小于8且甚至更优选3-6的亲水亲油平衡值(HLB)。有利的是，使用在乳剂形成前无任何化学或物理改变的油。
[0088] 在提出的应用中，油选自生物相容性油，特别是天然(植物或动物)或合成来源的油。这种类型的油特别包括天然植物来源的油，特别包括大豆、亚麻籽、棕榈、花生、橄榄、葡萄籽和向日葵油；和合成油，特别包括甘油三酯类、甘油二酯类和单酸甘油酯类。这些油可以是其天然形式，可以被精制或酯交换。
[0090] 一般而言，如果存在，则油包含在油相中，其量为1-80％重量，优选5-50％重量且特别是10-30％重量。
[0092] 可以通过单纯混合成分，如果必要将它们加热至全部成分熔化来制备用于乳剂分散相的油相。
[0094] 它还包含其他成分，其包括助表面活性剂。助表面活性剂稳定纳米乳剂。
[0095] 助表面活性剂还可以对纳米乳剂的指定应用具有其他影响。特别地，它可以被接枝以便携带靶向配体。
[0096] 可以用于本发明乳剂的助表面活性剂优选是水溶性表面活性剂。水溶性表面活性剂优选被烷氧基化并且优选包含至少一种由环氧乙烷单元(PEO或PEG)或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。优选链中的单元数在2-500之间改变。
[0097] 助表面活性剂的实例特别包括：共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；脂肪酸和聚乙二醇醚类，例如ICI Americas Inc.在 商品名下销售的产品(例如
35，58，78或98)；脂肪酸和聚乙二醇酯类，例如ICI Americas Inc.在 商品名下销售的产品(例如 45，52，53或59)；和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物，例如BASF AG在 商品名下销售的产品(例如 F68，F127，L64，L61，
10R4，17R2，17R4，25R2或25R4)或Unichema ChemieBV在 商品名下销售的产品(例如 PE/F68，PE/L61或PE/L64)。
35，58，78或98)；脂肪酸和聚乙二醇酯类，例如ICI Americas Inc.在 商品名下销售的产品(例如 45，52，53或59)；和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物，例如BASF AG在 商品名下销售的产品(例如 F68，F127，L64，L61，
10R4，17R2，17R4，25R2或25R4)或Unichema ChemieBV在 商品名下销售的产品(例如 PE/F68，PE/L61或PE/L64)。
[0098] 水相优选包含2-50％重量、优选5-30％重量且特别是10-20％重量的助表面活性剂。
[0099] 在一个优选的实施方案中，连续相还包含增稠剂，例如甘油、糖、寡糖或多糖、树胶或乃至蛋白质，优选甘油。实际上，较高黏度连续相的应用促进乳化且由此能够减少超声处理时间。
[0100] 水相有利地包含0-50％重量、优选1-30％重量且特别是5-20％重量的增稠剂。
[0101] 一般而言，水相还可以包含其他添加剂，例如适量的着色剂、稳定剂和防腐剂。
[0102] 可以通过单纯混合不同成分与选择的水性介质制备用于乳剂连续相的水相。
[0103] 分散相ζ电位的绝对值优选低于20mV，即-20至20mV。实际上，纳米粒ζ电位的绝对值增加导致其在体内蓄积，特别是在肝、脾、肺且还在肾中蓄积。然而，就成像领域中的应用而言，寻找相反的情况-在静脉内注射后具有长血浆寿命的隐身制剂(Stealthyformulation)。
[0104] [制备方法]
[0105] 易于通过在剪力的作用下分散适量的油相和水相制备上述纳米乳剂。
[0106] 在本发明方法中，最初混合不同的油成分和无机纳米晶体，以制备用于乳剂分散相的油预混合物。可以任选通过将成分之一或全部混合物放入适合有机溶剂溶液促进混合。然后蒸发有机溶剂，以便得到用于分散相的均匀油预混合物。
[0107] 此外，还优选在全部成分是液体的温度下生产预混合物。
[0108] 根据优选的实施方案，在表面上使纳米乳剂分散相与有益分子例如生物配体接枝。这种类型的接枝过程能够识别特定细胞(例如，例如S.Achilefu文章Technology in Cancer Research & Treatment，2004，3，393-408中所述的肿瘤细胞)或特定身体器官。
[0109] 表面接枝过程优选通过使分子或其前体与两亲化合物、特别是助表面活性剂偶合进行。就此而言，两亲化合物作为能够使靶向分子排列在表面上的间隔物起作用。这种偶合可以在乳化之前或之后进行。后一种情况在所用化学反应与乳剂胶体稳定性相容时，特别是在pH方面是优选的。偶合反应过程中的pH优选是5-11。
[0110] 有益分子可以是，例如：
[0111] -生物靶向配体，例如抗体、肽类、糖类、适体、寡核苷酸类或化合物例如叶酸；
[0112] -隐身剂：添加以使纳米乳剂对免疫系统而言不可见、增加其在生物体中的循环并且减缓其消除的物质。
[0113] 还能够通过共价键或不通过共价键引入纳米粒内部、在其表面或被吸收在其上：
[0114] -成像剂，特别是用于MRI(磁共振成像)、PET(正电子发射断层摄影术)、SPECT(单光子发射计算机断层摄影术)、超声扫描术、射线照相术、X-断层摄影术和光学成像(荧光、生物发光、扩散等)；和/或
[0115] -治疗剂。
[0116] 油相和水相的比例高度可变。然而，通常使用1-50％、优选5-40％且特别是10-30％重量的油相和50-99％、优选60-95％且特别是70-90％重量的水相制备纳米乳剂。
[0117] 有利的是，将油相以液态分散在水相中。如果各相之一在室温固化，则优选制备具有一相或优选两相的混合物，将其加热至高于或等于熔化温度的温度。
[0118] 优选使用超声处理器或微量流化装置(microfluidiser)产生在剪力影响下的乳化。优选将水相、然后将油相以期望的比例导入适合的圆柱形容器并且将超声处理器浸入介质并且开启足以得到纳米乳剂的时间期限，通常是几分钟。
[0119] 这就产生了均匀的纳米乳剂，其中油滴的平均直径大于10nm且小于200nm，优选20-50nm。
[0120] 在调配前，例如通过过滤或透析稀释和/或灭菌乳剂。该步骤能够消除任何可能在乳剂制备过程中形成的聚集物。
[0121] 如果必要，由此得到的乳剂易于在稀释后备用。
[0122] [使用方法]
[0123] 可以使用本发明的制剂，因为它能够或适合于指定应用，例如通过稀释，其用于对人或动物给予纳米晶体。
[0124] 由于如下事实：仅由批准用于人的成分制备，所以该制剂特别适合于胃肠外给药。然而，还能够通过其他途径、特别是口服或局部进行给药。
[0125] 所公开的制剂能够使得到的制剂用于在生物学和医学领域、特别是医学成像领域中施用纳米晶体。
[0128] 图1：显示用PBS稀释10倍的纳米乳剂P1、P2和P3的荧光光谱；
[0129] 图2：显示一定时间范围内接受如实施例2所述纳米晶体纳米乳剂(P3)注射的健康裸小鼠的荧光反射图像；
[0130] 图3：显示接受实施例2治疗和24小时后处死的小鼠器官的荧光反射图像(心脏(A)、肺(B)、脑(C)、皮肤(D)、肌肉(E)、肾(F)、肾上腺(G)、膀胱(H)、肠(I)、脾(J)、胰腺(K)、脂肪(L)、胃(M)和子宫-卵巢(N)；和
[0131] 图4：显示接受实施例2治疗和24小时后处死的所述小鼠器官的荧光直方图；
[0132] 图5：显示温度T＝10℃和T＝60℃生产后纳米乳剂的两个1H NMR光谱(实施例3)；
[0133] 图6：显示使用Universal V3.8B TA仪器、通过(a)生产后和在室温贮存4个月后(b)纳米乳剂的示差扫描量热法(DSC)得到的热分析图(热流(W/g)为以℃计的温度的函数)(实施例3)；
[0134] 图7：显示在40℃三种纳米乳剂作为时间(以天数计)函数的纳米乳剂液滴大小(以nm计)的生长。菱形表示不含增溶脂质并且包含油的纳米乳剂，三角形表示包含50∶50增溶脂质和油混合物的纳米乳剂，且圆形表示不含油且包含增溶脂质的纳米乳剂(实施例3)。
实施例
实施例
[0135] 实施例1
[0136] 包囊荧光半导体纳米晶体的纳米乳剂的制备
[0137] 1)分散相的预混合物的制备
[0138] 按照下列方式制备一批1g的预混合物。将50mg大豆油(Sigma-Aldrich)、450mg半合成甘油酯类(在Gattefossé的商品名 NC下销售)和400mg大豆卵磷脂(富含75％磷脂酰胆碱，由 在商品名 S75下销售)放入适合的容器。
将这些化合物溶于氯仿，然后低压蒸发。在50℃干燥剩余的混合物，得到粘性油形式的预混合物，其在冷却时固化。
将这些化合物溶于氯仿，然后低压蒸发。在50℃干燥剩余的混合物，得到粘性油形式的预混合物，其在冷却时固化。
[0139] 2)荧光半导体纳米晶体的制备
[0140] 如下将在近红外范围(705nm)发光并且具有10±2nm平均直径的基于CdTe-ZnS的在1μM的癸烷溶液中销售的芯/壳纳米晶体(Invitrogen销售的Qdots 705 ITK Organic，以Q21761MP为参照)转入己烷溶液。将4个体积(4X)的甲醇/异丙醇溶液(体积比75∶25)加入到1个体积(1X)的半导体纳米晶体中。通过涡旋混合得到的混合物，然后以3000rpm离心5分钟。然后除去上清液，将半导体纳米晶体再分散于1个体积(1X)的己烷中。
[0141] 3)分散相的制备
[0142] 在约70℃的温度下，回收上述步骤中制备的0.334g预混合物，向其中加入如 上 所 述 得 到 的0μL(P0)、125μL(0.125nmols)(P1)、250μL(0.250nmols)(P2) 和500μL(0.500nmols)(P3)的半导体纳米晶体分散液。然后低压蒸发溶剂，在50℃干燥得到的混合物，以便得到粘性油，其冷却时固化。通过涡旋匀化该溶液，保持在70℃下，然后是乳化阶段。
[0143] 4)连续相的制备
[0144] 如下制备一批1.666g的连续相。连续相由0.050g甘油、0.228g聚氧乙烯硬脂酸酯与50mols环氧乙烷(由ICI Americas Inc.在商品名 53下销售)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)形成，以制成达1.666g的混合物。将该溶液加热至50℃，然后乳化。
[0145] 表2：实施例1制剂的组成
[0146]
[0147] 5)乳化
[0148] 将上述得到的批量连续相加入到3)中得到的0.334g批量的分散相中，得到如上述表2中所示组成的混合物。使用安装测量3mm直径的圆锥形探头的AV505 超声处理器(Sonics Newtown)乳化该混合物5分钟，采用的总能量是6000焦耳。得到纳米乳剂(P0)、(P1)、(P2)和(P3)，它们极为稳定和澄清，其着色随纳米晶体的浓度而增加。
[0149] 6)特征
[0150] 使用Zetasizer(Malvern Instruments)从按照1∶1000比例在0.1M PBS中稀释的样品测定的得到的纳米乳剂的分散相的平均直径为30±10nm。
[0151] 使用相同仪器测定的制备的纳米乳剂的ζ电位为-8.6±7.7mV。制备的纳米乳剂显示极佳的胶体稳定性(＞3个月)。
[0152] 使用荧光分光光度计(PERKIN ELMER型号LS 50)记录的制备的纳米乳剂的荧光光谱揭示出甚至在包囊后也具有有益的光学特性。
[0153] 实施例2
[0154] 包囊荧光半导体纳米晶体的纳米乳剂在荧光成像中的应用
[0155] 通过添加100μL磷酸盐缓冲溶液将根据实施例1制备的100μL批量纳米乳剂(P3)稀释两倍。然后将得到的200μL批量(0.025nM纳米晶体)通过静脉内(尾静脉)注入6-8周龄的雌性裸小鼠尾部，并将其保持在无病原体条件下(IFFA-Credo，Marcy l′Etoile，France)。
[0156] 使用荧光反射显像装置(FRI)给在整个操作过程中用气体(异氟烷)保持在全身麻醉状态下的小鼠成像，所述荧光反射显像装置(FRI)包含冕状LEDs作为安装干扰滤光片-2的激发源、在633nm发射光(照明功率50μW.cm )。该装置更详细地描述在Texier，I.等人的文章“Luminescent probes for optical in vivo imaging”，Proceedingsof the SPIE，
2005，5704，16-22中。在通过在激发波长光密度＞5的RG665滤色镜过滤后由具有500ms曝光时间的CCD照相机(Orca BTL，Hamamatsu)采集图像。使用图象处理软件对信号定量。
2005，5704，16-22中。在通过在激发波长光密度＞5的RG665滤色镜过滤后由具有500ms曝光时间的CCD照相机(Orca BTL，Hamamatsu)采集图像。使用图象处理软件对信号定量。
[0157] 图2显示得到的图像并且揭示出注射纳米乳剂后24小时过程中纳米乳剂(P3)在小鼠中的生物分布。可以观察到在注射后前15分钟使用在体内均匀分布的纳米晶体照亮小鼠。1小时后，信号明显集中于胃中并且随时间减少。在肝中存在小的蓄积，表明注射后乳剂良好的隐身水平。
[0158] 图3显示注射后24小时处死的小鼠器官的图像，使用荧光反射成像装置得到所述图像。可以观察到，肝、脾、肺和肾中观察到的信号与胃、皮肤和肾上腺中观察到的信号相比极弱。
[0159] 这些结果突出显示了本发明纳米乳剂静脉内注射至少1小时后的血浆寿命和由此的隐身特性。当选择可以在生物学和医学领域且特别是在医学成像、热疗法和光疗法领域中使用的制剂时，血浆寿命是一个有意义的参数。
[0160] 实施例3
[0161] 纳米乳剂的显著稳定性
[0162] 进行如下实验以显示增溶脂质赋予纳米乳剂的稳定性。
[0163] 实施例3a：通过NMR突出显示液滴的高内在黏度
[0164] 根据实施例1的方案制备包含255mg NC(Gattefossé)(增溶脂质)、85mg大豆油(Sigma Aldrich)(油)、345mg Myr (ICI Americas Inc)(助表面活性剂)、65mg s75(卵磷脂，两亲脂质)和磷酸盐缓冲液(PBS)的纳米乳剂。
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[0165] 在10℃和60℃通过质子核磁共振分析纳米乳剂。与在 H NMR光谱内观察到的纳米乳剂(油/增溶脂质和两亲脂质)的液滴核心成分相关的峰(0.9；1.5；1.6；2.0；2.2；4.1；4.2ppm)比参比物(0ppm 4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸(DSS))扩大，尤其是当温度低时，由此突出显示了液滴的高内在黏度。与助表面活性剂 相关的峰(3.7ppm)未显示任何扩大，表明该助表面活性剂仍然保留在液滴表面上，聚氧乙烯链在水性缓冲液中被增溶(图5)。
[0166] 实施例3b：通过示差扫描量热法突出显示不存在液滴结晶
[0167] 根据实施例1的方案制备包含150mg NC(Gattefossé)(增溶脂质)、50mg大豆油(Sigma Aldrich)(油)、228mg (ICI Americas Inc)(助表面活性剂)、100mg s75(卵磷脂、两亲脂质)和磷酸盐缓冲液(PBS)的纳米乳剂。
[0168] 通过制备后和室温贮存4个月后示差扫描量热法分析纳米乳剂得到的热分析图显示在生产后未观察到融合峰，在室温4个月内贮存后也没有观察到融合峰(fusion peak)，这表明液滴未结晶(图6)。
[0169] 实施例3c：揭示纳米乳剂组成对其物理稳定性的影响
[0170] 根据实施例1的方案制备包含228mg Myr (ICI Americas Inc)(助表面活性剂)、100mg s75(卵磷脂，两亲脂质)、1600μL磷酸盐缓冲液(PBS)、表3中所示量的 NC(Gattefossé)(增溶脂质)和大豆油(Sigma Aldrich)(油)的三种纳米乳剂。
[0171] 表3：纳米乳剂中 NC和大豆油的量
[0172]
[0173] 对三种得到的纳米乳剂在40℃进行加速稳定性试验。监测一定时间期限内纳米乳剂大小/多分散性能够突出显示增溶脂质的稳定效果。而不舍增溶脂质的纳米乳剂的大小在40℃几乎170天后显著增加，包含增溶脂质的纳米乳剂未显示液滴大小改变(图7)。结果显示将增溶脂质添加到纳米乳剂组成中赋予液滴和纳米乳剂更好的物理稳定性。
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