聚乙二醇化的纳米颗粒
阅读：670发布：2020-05-11
专利汇可以提供聚乙二醇化的纳米颗粒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及含有 生物 可降解的 聚合物 和聚乙二醇或其衍生物的纳米颗粒，该生物可降解的聚合物优选乙烯基甲基醚和 马 来酸酐(PVM/MA)共聚物。这些纳米颗粒易于生产并提供优良的生物附着性、尺寸和ζ电位特性，使得它们适合于活性分子的 给药 。对生产所使用的聚乙二醇类型的进行选择可适当调节这些纳米颗粒的特性，这可根据待携带的药物的类型和/或药物制剂的给药方法有利地加以利用。 聚乙二醇化 通过将提到的两种大分子短时间的简单孵育而进行，不需要借助于高毒性的 有机 溶剂 或长时间艰苦的有机合成过程。而且，聚乙二醇化过程可与生物活性分子包裹过程相结合。，下面是聚乙二醇化的纳米颗粒专利的具体信息内容。
1.用于携带生物活性分子的聚乙二醇化的纳米颗粒，其包含生物 可降解的聚合物和聚乙二醇或其衍生物。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于所述生物可降解的 聚合物为乙烯基甲基醚和马来酸酐(PVM/MA)共聚物。
3.如权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述共聚物具有100KDa 至2400KDa的分子量，更优选200KDa至2000KDa的分子量，尤其 优选180KDa至250KDa的分子量。
4.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述聚乙二醇 或其衍生物具有400Da至35,000Da的分子量。
5.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述聚乙二醇 选自聚乙二醇、聚丙二醇、包含所述两类单体的嵌段或随机共聚物、 其混合物或其衍生物。
6.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述聚乙二醇 具有至少一个被修饰的末端羟基，优选以烷氧基、丙烯酸基、甲基丙 烯酸基、烷基、氨基、磷酸基、异硫氰酸基、硫氢基、巯基或硫酸基 修饰。
7.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中聚亚烃基二醇 选自聚乙二醇2000、聚乙二醇甲基醚2000、O，O’-双-(2-氨基乙基)聚 乙二醇2000、O，O’-双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇2000 或其混合物。
8.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中聚乙二醇与所 述生物可降解的聚合物重量比为1∶2-6，优选1∶2-4，更优选约1∶4。
9.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，包含蛋白质或肽作 为活性分子。
10.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，包含选自DNA、 RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸的化合物作为活性分子。
11.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，包含抗肿瘤剂或 肿瘤抗原作为活性分子。
12.如前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，包含中枢神经系 统保护剂或糖皮质激素作为活性分子。
13.如前述权利要求任何一项的纳米颗粒，包含用于疫苗接种的 抗原或用于免疫治疗的变应原作为活性分子。
14.药物组合物，包含权利要求1-13中任一项所述的聚乙二醇化 的纳米颗粒以及赋形剂、载体或佐剂。
15.如权利要求14所述的药物组合物，用于通过提供到达生物体 粘膜的途径给药，优选通过口、直肠、鼻、阴道或眼给药。
16.如权利要求15所述的药物组合物，用于口服给药。
17.如权利要求15所述的药物组合物，用于眼部给药。
18.权利要求1-13中任一项所述的纳米颗粒在制备药物中的用 途。
19.冻干产物，包括权利要求1-13中任一项所述的聚乙二醇化的 纳米颗粒。
20.制备权利要求1-13中任一项所述的聚乙二醇化的纳米颗粒的 方法，包括在以水醇溶液使所述聚合物除溶剂之前，将所述聚合物和 所述聚乙二醇在有机溶剂中同时孵育的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于所述生物可降解的聚 合物浓度为0.001％w/v至10％w/v，聚亚烷基二醇的浓度为0.001％ w/v至5％w/v。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于所述有机相/水 醇溶液比例为1/1-1/10。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其特征在于包括另 外的用于去除有机溶剂和/或纯化的步骤。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其特征在于所述活 性分子在所述聚合物和所述聚乙二醇在有机溶剂中同时孵育的步骤中 加入。
25.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其特征在于所述活 性分子加入至已形成的纳米颗粒的水悬浮液中。
26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其特征在于包括另 外的冻干步骤，任选地在防冷冻剂、优选蔗糖或甘露醇存在下进行。
27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述生物可降 解聚合物为乙烯基甲基醚和马来酸酐(PVM/MA)共聚物，优选包括的 分子量为100KDa至2400KDa。
发明领域
本发明涉及基于生物可降解的聚合物和聚乙二醇的聚乙二醇化的纳米 颗粒、制备该聚乙二醇化的纳米颗粒的方法、含有该聚乙二醇化的纳米颗 粒的制剂以及该聚乙二醇化的纳米颗粒作为给药系统的用途。
发明背景
近年来，生物可降解聚合物纳米颗粒已被推荐作为新的给药系统。它 们提供的最重要的特征之一为控制所纳入的药物的释放。这导致更佳的治 疗效果，为患者提供更舒适的给药并且能够防止服药过量。而且，可包括 进具有不同物理化学特性的药物，使得能够增强它们在生物液体中稳定性。 通常，该事实通常对于抗原、蛋白质和大分子来说非常重要。而且，由于 它们尺寸小，纳米颗粒适于通过不同途径给药，如口服、肠胃外和眼部给 药(Kreuter，Adv.Drug Del.Rev.，7(1991)71-86；Gref et al.，Science，263 (1994)1600-1603；Zimmer and Kreuter，Adv.Drug Del.Rev.，16(1995) 61-73)。
口服给药为最方便和最通用的给药途径。然而，某些活性分子的生物 利用度依赖于(i)药物分子的特征和药物形式，以及(ii)胃肠道中的生理条 件，如蛋白水解酶、蠕动和系统前代谢(presystemic metabolism)的存在。诸 如纳米颗粒的胶体系统已被推荐来克服某些这类障碍。这些载体实质上具 有大的比表面，由此促进了它们与生物支持物(胃肠粘膜)的相互作用。药 物的释放控制也使得能在时间上延长低生物半衰期分子的作用。另一方面， 纳米颗粒也可被派儿结(Peyer’patch)细胞和被淋巴组织滤泡摄取(Hodges et al.，J.Drug Target.，3(1995)57-60；Florence，Pharm.Res.，14(1997) 259-266)。该现象使得药物导向淋巴通路，并且在疫苗接种的情况下，有 助于抗原呈递。然而，对于通过口服给药的应用来说，常规的纳米颗粒具 有一些显著的缺陷：(i)在胃肠液中的某些不稳定性，(ii)低水平的肠内吸 收，以及(iii)在胃肠粘膜中的非特异性定向或附着。
纳米颗粒的肠胃外给药提供可控的全身释放，其适合于具有(i)低口服 生物利用度、(ii)短生物血浆半衰期以及(iii)有限的稳定性的药物。肠胃外 纳米颗粒的另外的显著优势为药物在某个器官聚集的可能性。然而，静脉 给药后，纳米颗粒迅速被单核吞噬细胞系统(MPS)的巨噬细胞识别、摄取 并且从血液循环中清除。这种现象限制了它们在控制释放中的作用以及药 物在除MPS外的其它组织中聚集的可能性。
尽管也可获得全身性作用，控制释放系统的眼部给药对眼睛疾病的治 疗仍具有显著优势。然而，由于向鼻泪管排出和泪水稀释，眼部给药伴随 制剂从角膜前区域的快速清除。这些过程导致极低百分比的所给予的药物 可渗透进入角膜并且到达眼内组织(低于5％)。该排出造成药剂通过该途径 给药时产生全身性作用。大量的研究已证实，与常规的诸如溶液和药膏的 眼药形式相比，纳米颗粒的应用使得在结膜中的药物量增加并且提高了它 们的生物利用度(Gurny et al.，J.Controlled Rel.，6(1987)367-373； Deshpande et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，15(1998)381-420)。胶 体系统可作为简单滴剂给药，由于其低粘度避免了视力问题。由于药物从 纳米颗粒基质中持续释放，所以可以降低使用频率。然而，纳米颗粒也显 示从吸收位点快速清除。
因此，即使纳米颗粒对上述不同给药方法可能是有用的，但仍然存在 使其应用困难的问题。改变聚合物基质及其表面的特性可提供对上述某些 问题的解决方法。
从该观点看，以适合的聚合物结合或包被纳米颗粒，可改变其物理化 学特性，并且可间接地改变其分布和与生物介质的相互作用。可能的策略 为聚乙二醇(PEG)结合纳米颗粒，称为聚乙二醇化的纳米颗粒或获得隐形 (stealthy)的纳米颗粒。
对于它们经口服给药的应用，聚乙二醇与常规纳米颗粒的结合可在消 化液中保护它们不受酶攻击。这是由于聚乙二醇的电位排斥蛋白质(Gref et al.，Science，263(1994)1600-1603)。该方法也使得它们与粘蛋白和存在于 腔内的其它蛋白质的相互作用降至最低。相似的策略已用于眼用纳米颗粒 的开发中。Fresta等人观察到在以聚乙二醇包被的聚(氰基丙烯酸烷基酯) 纳米球中给药后，无环鸟苷(acyclovir)的眼吸收显著增强(Fresta et al.，J.Pharm.Sci.，90(2001)288-297)。该现象被解释为被包被的纳米颗粒与 角膜上皮细胞之间的更大相互作用。
用乙二醇包被的不同的纳米颗粒静脉注射给药已证明循环延长(Gref et al.，Science，263(1994)1600-1603；Stolnik et al.，Pharm.Res.，11(1994) 1800-1808；Bazile et al.，J.Pham.Sci.，84(1995)493-498)。聚乙二醇包被的 聚乳酸(PLA)纳米颗粒(t1/2＝6h)比用白蛋白或泊洛沙姆(poloxamer)包被的 纳米颗粒(t1/2＝2-3分钟)具有更长的血浆半衰期(Verrecchia et al.，J. Controlled Rel.，36(1995)49-61)。存在于纳米颗粒表面的亲水聚乙二醇链 显著地降低了纳米颗粒与血蛋白(称为调理素)的相互作用。这些蛋白质在 颗粒与吞噬细胞之间形成“桥梁”，促进吞噬作用(Frank & Fries，Immunol. Today，12(1991)322-326)。然而，聚乙二醇的亲水性不是提供有效的抗调 理作用的唯一重要因素。其它的亲水聚合物如聚乙烯醇已证明仅具有低的 保护纳米颗粒不受调理作用的能力(Leroux et al.，Life Sci.，57(1995) 695-703)。因此，聚乙二醇化提供的空间稳定性也可能归结于其它物理化 学特性，如PEG链的高度柔性和特定结构形式(Mosquiera et al.， Biomaterials，22(2001)2967-2979)。
这种新策略的主要缺陷为聚乙二醇与纳米颗粒表面结合的稳定性 (Peracchia et al.，Life Sci.，61(1997)749-761)。已知聚乙二醇排斥蛋白质的 能力依赖于链的构象、电荷、长度和柔性(Torchillin，J.Microencaps.，15 (1998)1-19)。纳米颗粒表面修饰的方法主要通过物理吸附(Stolnik et al.， Adv.Drug Del.Rev.，16(1995)195-214)或通过共价结合(De Jaeghere et al.，J. Drug Target.，8(2000)143-153)进行。然而，由于相互作用的不稳定性，简 单吸附的缺陷为包被的快速丢失。假定共价结合为优选，多数的聚乙二醇 化的纳米颗粒使用聚乙二醇与乳酸或乙醇酸共聚物制备。然而，共聚化方 法需要使用一些催化剂和特殊的化学条件(Beletsi et al.，Int.J.Pharm.，182 (1999)187-197)。此外，在有机合成中使用的毒性有机溶剂残留(二氯甲烷、 甲苯等)也是难以解决的。
因此，仍需要获得口服给药稳定的纳米颗粒，在胃肠道中，其保持亲 水包被并且其具有良好的生物附着性和特异性。为了有效性，它们必须无 毒、生物可降解并且容易生产。
发明概述
本发明的目的是提供解决上述缺陷的纳米颗粒，即口服给药时，它们 具有稳定性和特异性，它们具有与粘膜相互作用的良好附着特性，它们能 够携带各种各样的活性分子，它们以可控方式释放活性分子，并且尤其是 当通过胃肠外给药时，阻止其从血液系统中清除。
已经观察到，由生物可降解的聚合物和聚乙二醇形成的纳米颗粒解决 了这些问题。尤其发现，由聚乙烯基甲基醚和马来酸酐以及聚乙二醇共聚 物形成的纳米颗粒易于生产并且提供优异的生物附着性、尺寸以及ζ电位 特征，使它们适合于活性分子的给药。还发现对制备它们所用的聚乙二醇 的类型进行选择使得能适当调整这些纳米颗粒的特性，这可根据待携带的 药物的类型和/或药物制型的给药方法有利地加以利用。
因此，在本发明的第一方面涉及用于携带生物活性分子的聚乙二醇化 的纳米颗粒，该纳米颗粒包含生物可降解的聚合物和聚乙二醇或其衍生物。 在一个变体中，该生物可降解的聚合物为乙烯基甲基醚和马来酸酐 (PVM/MA)共聚物。
所述聚乙二醇优选具有400至35,000Da的分子量。当聚亚烷基二醇 (polyalkylene glycol)选自聚乙二醇、聚丙二醇、包括这两类单体的嵌段或 随机共聚物、其混合物或其衍生物时，其提供良好的结果。聚乙二醇的至 少一个末端羟基基团任选地被取代，优选被烷氧基、丙烯酸基、甲基丙烯 酸基、烷基、氨基、磷酸基、异硫氰酸基、硫氢基、巯基或硫酸基取代。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇与生物可降解的聚合物之间的重量 比为1∶2-6，优选1∶2-4，更优选约1∶4。
本发明的聚乙二醇化的纳米颗粒可纳入活性分子，如蛋白质、肽、 DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。关于它们的活性，可 为抗肿瘤制剂或肿瘤抗原、或中枢神经系统的保护剂或糖皮质激素、或用 于疫苗接种的抗原或用于免疫治疗的变应原，以及其它。
另一方面，本发明涉及包括如上所述聚乙二醇化的纳米颗粒的药物组 合物。在一个变体中，该制剂用于口服给药。在另一变体中，该制剂为胃 肠外给药或通过粘膜(例如眼粘膜)给药。
因此，本发明的聚乙二醇化的纳米颗粒可用于药物的制备中。其可任 选地为冻干形式。
本发明的另一方面涉及制备所述聚乙二醇化的纳米颗粒方法，其包括 在以水醇溶液使所述聚合物除溶剂之前，将所述聚合物和所述聚乙二醇在 有机溶剂中同时孵育的步骤。在一个变体中，所述生物可降解的聚合物的 浓度在0.001至10％w/v之间，聚乙二醇的浓度在0.001至5％w/v之间。 有机相/水醇溶液相的比例任选地为1/1至1/10。
该方法还可包括另外的除去有机溶剂和/或纯化的步骤，以及通过使用 交联剂稳定聚乙二醇化的纳米颗粒的步骤。所述生物活性分子可在聚合物 和聚乙二醇在有机溶剂中同时孵育的步骤中被纳入，或可随后被纳入在已 形成的纳米颗粒的水悬浮液中，以便产生它们的结合。
附图说明
图1显示不同类型纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)照片-(a)NP；(b) PEG NP；(c)mPEG NP；(d)DAE-PEG NP；(e)DAP-PEG NP。比例尺代表 150nm。
图2显示根据所用的方法，PEG 2000(mg/mg)的结合：PEG和PVM/MA 同时在有机相(OP)中孵育或纳米颗粒与PEG的水溶液(AP)孵育。
图3显示聚乙二醇的类型对PVM/MA转变为纳米颗粒(PVM/MA-e)的 百分数以及对方法产率的影响。
图4显示以PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒(上)和游离PEG 2000(下) 的核磁共振图谱。框图中显示在4.58ppm处(羟基基团的质子)的峰的放大 图。
图5显示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以PEG 2000聚乙二醇 化的纳米颗粒(a)和游离PEG 2000(b)的核磁共振图谱的细节。
图6显示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以DAP-PEG 2000聚乙 二醇化的纳米颗粒(a)和游离DAP-PEG 2000(b)的核磁共振图谱的细节。
图7显示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以DAE-PEG 2000聚乙 二醇化的纳米颗粒(a)和游离DAE-PEG 2000(b)的核磁共振图谱的细节。
图8显示依据核磁共振数据和ζ电位值所主张的不同的聚乙二醇化的 纳米颗粒的结构-a)PEG-NP；b)mPEG-NP；c)DAE-PEG-NP；d) DAP-PEG-NP。
图9显示对大鼠口服给药后，聚乙二醇化的纳米颗粒在胃肠道的分布： (a)PEG-NP，(b)mPEG-NP，(c)DAE-PEG-NP和(d)DAP-PEG-NP。x轴表 示附着的纳米颗粒(NP)的量(mg)；y轴表示胃肠道的不同部分(St：胃；I1， I2，I3，I4：肠部分；Ce：盲肠)；z轴表示给药后的时间(小时)。
图10显示10mg的单一剂量口服给药后，整个胃肠道内不同聚乙二醇 化的纳米颗粒的生物附着曲线(NP，mg)。t：以小时为单位的时间。
图11显示以PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒(PEG-NP)10mg口服给 药2小时后回肠部分的荧光显微镜图像。a)回肠绒毛：箭头指示上皮细胞 的顶部区域；b)上皮细胞：箭头指示肠上皮细胞间的荧光。比例尺代表为 20μm。
图12显示以PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒(PEG-NP)10mg口服给 药2小时后回肠段的光学显微镜图像。a)总图：(放大135倍)以及b)放大 的细节(放大530倍)。L：内腔；E：肠上皮细胞；GC：产生细胞的粘液； 黑箭头：肠上皮细胞核；白箭头：粘膜下的毛细血管。
图13显示纳米颗粒10mg口服给药2小时后，PEG-NP在回肠派尔结 的定位。a)派尔结的总图(放大135倍)；b)放大的细节(放大530倍)；PP- 派尔结；FAE-滤泡相关的上皮细胞；黑箭头：派尔结的圆顶细胞，其中包 括有纳米颗粒。
发明详细说明
令人惊奇的是，发现用不同聚乙二醇修饰和包被生物可降解聚合物的 纳米颗粒，例如乙烯基甲基醚和马来酸酐(PVM/MA)共聚物的纳米颗粒， 可获得在口服给药中具有物理化学特性、生物附着性和特异性的纳米颗粒， 在非常令人感兴趣的系统中将它们转化为特殊药物载体。根据所用的聚乙 二醇的类型和制备方法，这些纳米颗粒的特征可以有利地被调节。本发明 的聚乙二醇化的纳米颗粒在口服或眼部给药后，可延长在粘膜中的保留时 间。这些纳米颗粒可用于具有窄吸收窗的药物的给药，因而提高了其生物 利用度。这些纳米颗粒也是高毒性药物(如抑制细胞生长药物)的适合载体， 由于其使得系统的血浆循环时间延长，在该段时间内药物以可控方式逐渐 释放。另一方面，静脉给药后，聚乙二醇化的纳米颗粒可防止单核吞噬细 胞系统(MPS)细胞的识别和清除，提供延长的药物循环。
术语“纳米颗粒”用于指尺寸小于1.0微米的球体或类似形状，优选为 10至900纳米的范围。
如上所述，本发明的一方面涉及由生物可降解的聚合物形成的聚乙二 醇化的纳米颗粒。可使用现有技术中已知的可形成纳米颗粒的生物可降解 聚合物。这些聚合物包括聚羟基酸，如聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物(如 PLGA)、聚酸酐、聚酯和诸如壳聚糖的聚糖，以及其它。在本说明书中， 术语“生物可降解的”指聚合物一旦暴露于pH6-9以及温度在25至45℃之 间的生理溶液中，其在一段时间内溶解或降解，这段时间对于所需的应用 (例如体内治疗)来说是可接受的。
在本发明的一个变体中，酸酐形式的乙烯基甲醚和马来酸酐共聚物 (PVM/MA或Gantrez AN)用作生物可降解聚合物。其优选具有100至2400 KDa之间的分子量，更优选200至2000KDa之间。在本发明的一个变体 中，优选PVM/MA共聚物分子量为180至250KDa之间。
由于其低毒性(LD50＝8-9g/kg，口服)以及优良的生物相容性而被广泛 应用于制药工艺中，所以该共聚物为有利的。在数量和价格方面，其也属 于容易获得的。由于其酸酐基团，该聚合物可与不同的亲水物质反应，而 不用借助通常具有非常大毒性的有机溶剂(戊二醛和碳化二亚胺衍生 物)(Arbos et al.，J.Controlled Rel.，83(2002)321-330)。该聚合物在含水介质 中不溶，但是Gantrez AN的酸酐基团水解，产生羧基基团。溶解较慢并且 取决于其发生条件。考虑到在PVM/MA中官能团的生物利用度，分子与亲 核基团(如羟基(-OH)或胺基(-NH2))的共价结合可通过在含水介质中简单孵 育产生。
该共聚物的非-聚乙二醇化的纳米颗粒及其制备在属于同一申请人的 WO 02/069938中描述，在此引入该申请的全部内容作为参考。乙烯基甲 基醚和马来酸酐共聚物纳米颗粒可容易地制备，其通过向该聚合物的有机 容液中加入第一极性溶剂(与聚合物溶液混溶的)以及随后加入第二非溶剂 液体，例如水醇溶液，来使聚合物除溶剂而进行。可任选地添加交联剂。 以下将描述获得该聚合物的聚乙二醇化的纳米颗粒，并且发现它们非常容 易获得。
在本说明书中，术语“聚乙二醇”理解为任何溶于水的含有由2或3个 碳原子连接的醚基团的亲水性聚合物，任选地含有分枝的亚烷基基团。因 此该定义包括分枝或无分枝的聚乙二醇、聚丙二醇以及包含这两种类型单 体的嵌段或随机共聚物。该术语也包括末端羟基基团的衍生物，该末端羟 基基团可被修饰(一个末端或两个末端)以引入烷氧基、丙烯酸基、甲基丙 烯酸基、烷基、氨基、磷酸基、异硫氰酸基、氢硫基、巯基和硫酸基。聚 乙二醇或聚丙二醇可在亚烷基基团上被取代。如取代基存在，这些取代基 优选烷基基团。
聚乙二醇为已批准用于口服、肠胃外和局部给药(FDA)的水溶性聚合 物。聚乙二醇为环氧乙烷(EO)或环氧丙烷(PO)在水存在下、以单乙烯醇或 二乙二醇作为反应引发剂在碱性介质中聚合产生(1，2-Epoxide Polymer： Ethylene Oxide Polymers and Copolymers(1，2-环氧聚合物：环氧乙烷聚合物 和共聚物)，in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering；Mark， H.F.(Ed.)，John Widely and Sons Inc.，1986，pp.225-273)。当达到需要的分子 量时(通常利用反应过程的粘度测量来控制)，通过用酸(乳酸、醋酸等)中和 催化剂终止聚合发应。得到具有非常简单结构的线性聚合物：
HO-(CH2-CH2-O)n-H
其中(n)为EO单体或单位的数量。单体也可包含亚丙基基团。
尽管工艺上所有这些产品都应该称为聚(氧化烯)(poly(oxyalkylene))， 平均分子量(或分子质量)在200至35,000之间的产品称为聚乙二醇(PEG)。 该术语聚乙二醇通常用于表明羟基末端基团对这些分子物理化学特性的显 著影响。术语PEG通常和数值联合使用。在制药工业中，数字表示平均分 子量，而在化妆品工业中伴随字母PEG的数字指构成分子的聚合的EO的 单位(Hand book of Pharmaceutical Excipients，Rowev R.c.，Sheskey P.J.， Weller P.J.(Eds)，4th Edition，Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association，London，UK，2003)。PEG收录在不同的药典中， 尽管命名不同(International Harmonisation：Polyethylene glycol(PEG)： Pharmeuropa 1999，11，612-614)。根据2003由R.C.Rowe，P.J.Sheskey和 P.J.Weller编辑，由药物出版社(Pharmaceutical Press)(伦敦，英国)和美国 药物协会(华盛顿，美国)出版的药物赋形剂手册(第4版)，聚氧乙烯二醇 (polyoxyethylene glycol)也称为聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚乙二醇 (macrogols)、聚乙二醇(macrogol)或PEG。英国药典采用聚乙二醇 (polyethylene glycol)和聚乙二醇(macrogols)，欧洲药典采用聚乙二醇 (polyethylene glycol)和聚乙二醇(macrogol)，而美国药典(USP)采用聚乙二 醇(polyethylene glycol(s))。
分子量低于400的PEG为室温下不挥发的液体。PEG 600的熔点在17 至22℃之间，而平均分子量在800至2000之间的PEG为低熔点、浆糊状 物质，分子量超过3000的PEG为固体，一直到PEG 35000都可购得。另 一方面，尽管当分子量的增加时，其熔点也增加，但沸点只增加至最大值 60℃。同样地，当分子量增加，其水溶性降低。在任何情况下，接近50％ m/m量的PEG 35000不溶于水中。
从毒理学观点看，认为PEG无毒无免疫原性(Hermansky S.J et al.，Food Chem.Toxic.，1995，33，139-140；Final Report on the Safety Assessment of PEGs：J.A.C.T.，1993，12，429-457；polyethylene glycol，21 CFR 172.820， FDA)。WHO规定每日允许摄入量为10mg/kg重量(Polyethylene glycols； Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives；World Health Organisation，Geneva；Technical Report Series 1980， 648，17-18(聚乙二醇；FAO/WHO联合专家委员会关于食品添加剂的第23 份报告；日内瓦世界卫生组织；技术报告系列1980，648，17-18))。
聚乙二醇衍生物具有与常规PEG类似的优点，例如其水溶性、生理惰 性、低毒性以及在极为不同条件下的稳定性。这些衍生物包括极其不同的 产品并且以取代羟基的官能团为特征，例如-NH2(最活泼基团之一)、苯酚、 乙醛、异硫氰酸酯、-SH基团等。在能用于本发明的聚乙二醇衍生物中， 可指出以下物质：
-聚氧乙烯酯：PEG单甲醚单琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG单甲醚单羧 基甲基醚、PEG己二酸酯、PEG二硬脂酸酯、PEG单硬脂酸酯、PEG羟基 硬脂酸酯、PEG二月桂酸酯、PEG二油酸酯、PEG单油酸酯、PEG蓖麻醇 酸酯、PEG椰子油酯。
-聚氧乙烯烷基醚：PEG单甲醚或甲氧基PEG(mPEG)、PEG二甲醚。
-其它：聚(乙二醇对苯二酸酯)、聚氧乙烯衍生物和山梨聚糖酯以及脂 肪酸、环氧乙烷和环氧丙烷共聚物、环氧乙烷与丙烯酰胺共聚物。
-PEG衍生物：O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇(DAE-PEG 2000)、O，O’- 双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇无分枝并且羟基基团未被取代。在 该变体中，所用聚乙二醇优选分子量在400至35,000Da之间。当分子量 低于400Da时，发现聚乙二醇化无法有效发生。因此在本发明的一个优选 变体中，用于制备聚乙二醇化的纳米克颗粒的聚乙二醇的分子量等于或大 于400，更优选等于或大于1000，尤其优选值为1500至10,000之间，优 选为2000至5000KDa之间。
因此，在本发明的一个变体中，使用聚乙二醇2000(PEG 2000)。PEG 2000与聚合物量的比值优选1∶2-6，接近1∶4的比值可提供好的结果。例 如约0.25mg PEG 2000/mg聚合物可提供有效的聚乙二醇化。在该情况下， 与纳米颗粒结合的量为约55.0微克每mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征 为球形并且尺寸接近300nm。
在本发明的另一变体中，用于制备聚乙二醇化的纳米颗粒的聚乙二醇 具有封闭的末端羟基基团，例如通过用甲基醚衍生物。这降低了其亲水性， 甚至改变纳米颗粒的结构。在这种情况下，更大百分比的聚乙二醇链包含 在其内部，只有小部分结合于纳米颗粒表面。该特性使得我们能利用封闭 羟基基团或通过引入如下所述的其它官能团调节纳米颗粒的特性。对于处 于纳米颗粒内部的m-PEG来说，其功能为通过修饰多孔的聚合物基质来改 进药物释放。
聚乙二醇基甲基醚2000(m-PEG 2000)用于一个优选的变体中。mPEG 2000与聚合物的量的比例优选1∶2-6，接近1∶4的比值可提供好的结果， 例如约0.25mg mPEG 2000/mg聚合物。在该情况下，与纳米颗粒结合的量 为约35.5微克每mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征为球形并且尺寸接近 300nm。
在本发明的另一个变体中，所用的聚乙二醇具有不同于羟基基团的末 端官能团，如氨基基团。这些氨基基团又可被取代并具有官能团。在优选 变体中，氨基基团为-NH2。观察具有这些基团的纳米颗粒口服给药后，纳 米颗粒在肠道的某些段内积聚，允许特异性给药。
因此，在一个变体中，制备聚乙二醇化的纳米颗粒所用的聚乙二醇为 O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG 2000)。在该情况下，由于 链两末端连接，聚乙二醇化纳米颗粒的结构不是“毛刷”类型结构，而产生 “环”形结构。DAE-PEG与聚合物的量的比例优选低于1∶4。在一个优选变 体中，等于或低于0.25mg DAE-PEG 2000/mg聚合物。在该情况下， DAE-PEG 2000与纳米颗粒连接的量为约90.6微克每mg纳米颗粒。这些 纳米颗粒的特征为球形并且尺寸接近500nm。
在另一个变体中，制备聚乙二醇化的纳米颗粒所用的聚乙二醇具有氨 基基团并且烷基基团中有分枝。已发现，带有这些取代基时倾向于形成毛 刷类型结构，末端之一在纳米颗粒内部，另一末端在外侧。
因此，如果所用的聚乙二醇为O，O’-双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二 醇-聚丙二醇2000(DAP-PEG 2000)，纳米颗粒的特征为球形并且尺寸接近 360nm。在该情况下，DAP-PEG相对于聚合物的量优选等于或低于0.25mg DAP-PEG 2000/mg聚合物，与纳米颗粒结合的量为约67.6微克每mg纳米 颗粒。
对应于上述带有不同类型官能团的基团，一些聚亚烷基二醇的化学结 构举例说明如下：
a)H(OCH2CH2)nOH
b)H3C(OCH2CH2)nOH
c)H2N(CH2CH2O)nCH2CH2NH2
d)H2NCHCH3CH2(OCHCH3CH2)(OCH2CH2)n(OCH2CHCH3)NH2
具体实例为：
a)聚乙二醇400、1000或2000(PEG 400，PEG 1000或PEG 2000)；
b)聚乙二醇甲基醚2000(mPEG 2000)；
c)O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG 2000)；
d)O，O’-双-(2-氨基丙基)-聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇(DAP-PEG 2000)。
由前述可看出(经实施例证实)，聚乙二醇类型的选择使得能随意调节 所产生的系统的特性。不同类型聚乙二醇混合物的使用增添了另外的可变 因素。从实践的观点来看，这对于调整和选择每一活性分子以及每一给药 方法的最适系统是很重要的。
制备生物可降解聚合物聚乙二醇(优选乙烯基甲基醚和马来酸酐 (PVM/MA)共聚物和聚乙二醇)纳米颗粒的方法以例如WO 02/069938中描 述的溶剂置换方法为基础。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇化的纳米颗粒通过两种不同的方法 制备：(i)两种聚合物同时在有机相中孵育(例如PVM/MA和PEG)以及(ii)生 物可降解聚合物纳米颗粒与聚乙二醇的水溶液孵育。这些方法对制备PEG 结合在其表面的PVM/MA纳米颗粒是有效的。由于第一变体(聚合物同时 孵育)提供良好的PEG结合程度，所以其为优选。
第一种方法包括生物可降解聚合物和聚乙二醇在诸如丙酮的有机溶剂 中同时溶解。混合物的孵育在室温下搅拌一定时间进行。生物可降解聚合 物的浓度优选在0.001至10％w/v之间，聚乙二醇或其衍生物的浓度在 0.001至5％w/v之间。
一定体积的与聚合物溶液混溶的极性溶剂，例如乙醇，可任选地添加 至该溶液中。
也可任选使用交联剂，以增强纳米颗粒的稳定性，如WO 02/069 938 中所描述。在交联剂中，可以使用二氨化的分子(如1，3-二氨丙醇)、聚糖或 单糖、蛋白质以及通常的任何具有能与Gantrez酸酐基团反应的官能团的 分子。在本发明的方法中，当加入PEG时，交联不是必需的，因为这同时 发生。如果需要其交联，必须加入非常少量的上述产品。
最后，加入类似体积的第二非溶剂液体，优选水醇溶液。在一个变体 中，使用制药级用水(WFI纯化水，根据应用)。有机相/水醇溶液比例优选 为1/1-1/10。具有乳白色悬浮液外观时纳米颗粒立即在介质中形成。
利用任何适合的方法如减压蒸馏除去有机溶剂，纳米颗粒仍保留在稳 定的水悬浮液中。
用常规方法纯化纳米颗粒，如离心、超离心、切向过滤或蒸发，包括 真空的使用。
最后，如需要长期存储和保存，可将它们冻干。通常的防冷冻剂如蔗 糖或甘露醇可用于促进冻干，其优选浓度在0.1至10％重量比之间。
第二种方法包括在诸如丙酮的有机溶剂中溶解生物可降解聚合物。随 后一定体积的水醇溶液如乙醇和最终类似体积的水加至该溶液中。当具有 乳白色悬浮液外观时纳米颗粒立即在介质中形成。有机溶剂通过如前面所 述的方法(例如减压蒸发)除去，纳米颗粒保留在稳定的水悬浮液中。然后， 纳米颗粒在聚乙二醇的水溶液中孵育。孵育在搅拌下进行一段时间。纳米 颗粒随后经离心纯化并最终使用上述相同方法冻干。
本发明也针对包含所述聚乙二醇化的纳米颗粒和任选的活性分子的药 物组合物。适合的药物制剂为那些本领域技术人员熟知的肠内制剂，优选 口服，肠胃外制剂，如注射剂，以及局部制剂，如眼用制剂。这些制剂应 包含每一种剂型的适合的赋形剂。例如，对片剂或胶囊剂形式的口服剂型 的情况，如需要可包括结合剂、分裂剂、润滑剂、填充剂、肠衣等。口服 制剂是通过常规的混合、干法或湿法造粒以及加入本发明的聚乙二醇化的 纳米颗粒而制备的。
在本发明的一方面，聚乙二醇化的纳米颗粒通过提供到达组织粘膜的 途径给药(包括口服给药、直肠给药、鼻给药、阴道给药和眼部给药)。
当聚乙二醇化的纳米颗粒经肠胃外给药时，它们用于改善所结合的生 物活性分子和/或常规纳米颗粒的分布情况。对于肠胃外制剂的情况，使用 纳米颗粒的无菌悬浮液或冻干产物和重建载体(如生理盐水)。如需要，可 加入赋形剂，如低温储藏试剂、pH调节液和表面活性剂。
所述聚乙二醇化的纳米颗粒及其制剂可用作生物活性分子给药的基本 成分。活性分子可理解为以预防和治疗为目的，对个体给药的任何化合物， 该个体优选人类。当然，该术语也包括大分子化合物，如蛋白质、肽、核 酸等。聚乙二醇化的纳米颗粒用于改善结合的生物活性分子的分布。
在一个变体中，活性分子选自DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸 或多核苷酸。在另一个变体中，活性分子选自蛋白质或肽。
可加入选自抗肿瘤剂或肿瘤的抗原剂、选自中枢神经系统保护剂或糖 皮质激素等的活性分子。或者，活性分子为疫苗接种的抗原或免疫治疗的 变应原。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇化的纳米颗粒还用作疫苗接种佐剂。
将药物加入本发明的纳米颗粒中，可如WO 02/069938中所述进行， 即在纳米颗粒形成之前加入至聚合物溶液中，或随后将其加入至已形成的 纳米颗粒的水悬浮液中。例如，根据药物的天然属性，可使用以下方法：
a)疏水性药物：加入至有机相(丙酮)并在搅拌(机械、磁力或超声搅拌) 下与PVMMA和PEG联合孵育/溶解不定的时间段(多至1小时)。
b)亲水性药物：加入至有机相(丙酮)并在搅拌(机械、磁力或超声搅拌) 下与PVMMA和PEG联合孵育一段可变的时间(多至1小时)，直至获得稀 丙酮悬浮液。该方法成功地用于包裹蛋白质模型(卵清蛋白、约44kDa的 蛋白质)。该加入方法为有效的，可以增强蛋白质模型的包裹。
c)亲水性药物：加入至水相中，与预先形成的纳米颗粒孵育(该情况用 于包裹用在实施例中的两种荧光标记物：FITC和RBITC)
下面通过本发明的非限制性和说明性实施例来描述本发明。
实施例
已采用了一些技术用于新纳米颗粒的物理化学表征。纳米颗粒的尺寸 和ζ电位在Zetamaster仪器中测定(Malvern，英国)。纳米颗粒的形状可在 其用磷钨酸处理后，通过电子透射显微镜(Zeiss，德国)观察。
实施例1：
以聚乙二醇2000(PEG-NP)制备聚乙二醇化的纳米颗粒
对两种方法进行测试：
-两种聚合物在有机相中混合
-用PEG包被预先形成的纳米颗粒
制备聚乙二醇化的纳米颗粒的方法的产率通过在方法结束后和在其冻 干后通过测定其重量得到。制备产率以百分数表示，相对于最初的 PVM/MA-共聚物和聚乙二醇的质量计算得到。与纳米颗粒结合的聚乙二醇 的量通过比色法(Labsystems iEMS Reader MF)测定，并且以起始使用量和 在纳米颗粒制备过程中上清液中存在的量之间的差值计算得到。
1.1.有机相中聚乙二醇与乙烯基甲级醚和马来酸酐共聚物的结合
该方法通过PVM/MA和PEG 2000同时在有机相中孵育进行。
为此，将100mg PVM/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然后，PEG 2000加入至该溶液中(10-50mg)。混合物在磁力搅拌下反应1小时。然后， 10ml乙醇和10ml蒸馏水加至该相中。使得到的混合物均匀化5分钟。通 过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去有机溶剂，浓缩形成的纳米颗粒。悬 浮液经过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。收集 上清液用于分析评价，而剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后， 纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
所获得的纳米颗粒具有类似于常规纳米颗粒的球形形状(图1b)。表1 为这些聚乙二醇化的纳米颗粒的特性。PEG 2000与纳米颗粒的结合引起群 体的多分散性增加。观察到随着聚乙二醇(1∶2比例)量的增加，纳米颗粒尺 寸尤其是多分散性变得非常高。对纳米颗粒表面电位的观察显示了聚乙二 醇化的纳米颗粒较低的负值。这些结果表明，纳米颗粒表面上存在聚乙二 醇链。最后必须指出，PEG 2000：PVM/MA的比例低于1∶4w/w时，与纳 米颗粒结合的PEG的量保持恒定并接近50μg/mg。
表1.PEG 2000的量对纳米颗粒物理化学特性的影响。数据表示平均 值±S.D.(n＝3)。 PEG2000 (mg) 尺寸(nm) 多分散性 ζ电位(mV) PEG 2000的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 10 317±5 0.218 -7.8±0.5 44.9±15.8 25 299±22 0.210 -14.6±0.3 55.0±12.0 50 400±35 0.570 -16.3±10.0 128.2±86.6
*结合到纳米颗粒的PEG 2000的量(以μg PEG/mg纳米颗粒表示)，根 据比色法测定。
1.2.聚乙二醇与预先制备的纳米颗粒的结合
将100mg PVM/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然后，在搅拌下 向该溶液中加入10ml乙醇和10ml蒸馏水。使得到的混合物均匀化5分 钟。然后，纳米颗粒悬浮液在减压下蒸发，直至两种溶剂被除去。含水的 纳米悬浮液体积用水调至5ml，并且加入含有10-25mg PEG 2000的5ml 水溶液。纳米颗粒在聚乙二醇相中的孵育在磁力搅拌下进行1小时。悬浮 液通过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上 清液并且将剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最终将纳米颗粒悬浮 液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
与纳米颗粒结合的聚乙二醇的量通过先前指出的比色法测定。通过该 方法测定的结果显示，与纳米颗粒结合的PEG的量比实施例1.1所述的方 法(在有机溶剂中孵育)低很多(图2)。该结果的原因是聚乙二醇对水的高亲 合性，因此聚乙二醇未能与在预先形成的颗粒中来自共聚物水解得到的羧 基基团有效地结合。可得出结论，通过共聚物和聚乙二醇在有机相中同时 孵育来获得聚乙二醇化的纳米颗粒的方法比以PEG简单包被预先形成的 纳米颗粒更有效。
1.3.PEG分子量对聚乙二醇化的纳米颗粒的物理化学特性的影响
如实施例1.1.所述，该方法为PVM/MA与所需的聚乙二醇(PEG 400、 PEG 1000或PEG 2000)同时孵育进行。
为此，将100mg的PMA/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然后， 加入25mg PEG(400、1000或2000)。使混合物在磁力搅拌下反应1小时。 然后将10ml乙醇和10ml蒸馏水加入至该相中。将所得到的混合物均匀 化5分钟。通过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去有机溶剂，浓缩纳米颗 粒悬浮液。悬浮液经离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国) 纯化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将 纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
PEG(400、1000或2000)和mPEG(实施例2)的量通过比色法测定。为 此，将15μl碘溶液(10mg/ml的碘；20mg/ml的碘化钾)加入至纳米颗粒纯 化步骤中获得的1ml上清液中。PEG(或mPEG)和碘之间形成的复合物的 吸收值通过比色法在λ540nm处观察(Sims & Snape，Anal.Biochem.，107 (1980)60-63)。
表2显示PEG分子量对获得的纳米颗粒的物理化学特性的影响。依 据该结果，可得出结论低分子量聚乙二醇不适合这些纳米颗粒的聚乙二醇 化。对于为液体的PEG 400来说，不能获得结合，而对于PEG 1000来说， 结合非常低。这些结果也为颗粒表面电荷的研究所证实。以PEG 400或PEG 1000修饰的纳米颗粒的ζ电位一直比以PEG 2000聚乙二醇化的颗粒的电 位值更负，与未包被的颗粒的电位值相似。可得出结论用PEG 2000进行 聚乙二醇化更有效。
表2.PEG分子量对聚乙二醇化的纳米颗粒的物理化学特性的影响 (PEG/PVM-MA比例＝0.25)。数据表示平均值±S.D.(n＝3)。 纳米颗粒类型 PEG的量μg/纳米颗粒mg 尺寸(nm) ζ电位(mV) 比色法 1H-NMR NP* - - 289±11 -33.5±6.6 PEG 400-NP ND** ND** 241±6 -40.1±1.5 PEG 1000-NP ND** 19.8 271±10 -45.3±5.0 PEG 2000-NP 55.0±12.0 30.2 299±22 -14.6±0.3
*NP-未用PEG处理的纳米颗粒
**ND-未检测到
1通过核磁共振测定与纳米颗粒结合的PEG的量(方法在实施例5中描 述)。
实施例2：
以聚乙二醇基甲基醚2000(mPEG-NP)制备聚乙二醇化的纳米颗粒 该方法通过PVM/MA和mPEG同时在有机相中孵育进行。
为此，将100mg共聚物PVM/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然 后，一定量mPEG 2000加入至该溶液中(10-50mg)。混合物在磁力搅拌下 反应1小时。然后，将10ml乙醇和10ml蒸馏水加至该相中。使所得到 的混合物均匀化5分钟。有机溶剂通过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去， 浓缩纳米颗粒悬浮液。悬浮液经过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。 最后，将纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
图1(c)显示被mPEG 2000包被的纳米颗粒具有球形形状并且表面看似 光滑。表3显示mPEG 2000与纳米颗粒的结合水平以及其对纳米颗粒的尺 寸、多分散性和表面电荷的影响。结果显示随mPEG 2000起始量的增加， 与纳米颗粒结合的mPEG的百分数略有增加。
mPEG的存在增加了纳米颗粒群体的多分散性，尤其是在高浓度时 (mPEG/PVM-MA比例高于0.25)。另一方面，当所用mPEG增加时，纳 米颗粒的负电荷降低。然而，当使用大量mPEG时观察到相当大的偏差， 这表明mPEG 2000链的表面分布不均一。
表3.mPEG 2000的量对纳米颗粒的物理化学特性的影响。数据表示平 均值±SD (n＝3) mPEG 2000 (mg) 尺寸 (nm) 多分散性 ζ电位 (mV) mPEG 2000的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 10 254±9 0.128 -19.7±7.4 36.1±14.3 25 272±17 0.151 -11.8±2.2 35.5±7.5 50 329±20 0.350 -21.0±10.0 116.8±68.4
*与纳米颗粒结合的mPEG 2000的量(以μg mPEG/mg纳米颗粒表示)， 根据比色法测定。
实施例3：
以O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG-NP)制备聚乙二醇化的 纳米颗粒
该方法通过PVM/MA和DAE-PEG 2000同时在有机相中孵育进行。
为此，一定量的DAE-PEG(5、10、25或35mg)溶解在5ml有机溶剂 (丙酮)中。然后，在磁力搅拌下将100mg PVM/MA加入该溶液中。所得到 的混合物在磁力搅拌下反应1小时。然后，在搅拌下将10ml乙醇和10ml 蒸馏水加至该有机相中。使得到的混合物均匀化5分钟。通过减压蒸发 (Buchi R-144，瑞士)除去有机溶剂，浓缩纳米颗粒悬浮液。悬浮液经离心 (20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上清液并且剩余 物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
向纳米颗粒纯化步骤中获得的上清液中加入Micro BCATM蛋白质检测 试剂盒(Pierce，U.S.A.)的试剂，以测定DAE-PEG的量和DAP-PEG的量(实 施例4)。该试剂能与这些聚乙二醇的氨基基团相互作用得到有色复合物。 为此，将150μl试剂加至相同体积的上清液中。37℃孵育2小时后，通过 比色法测定λ570nm处的吸收值。
图1(d)显示被DAE-PEG 2000包被的纳米颗粒具有球形形状。表4显 示DAE-PEG 2000的结合水平及其对纳米颗粒尺寸、多分散性和表面电荷 的影响。结果显示，随着DAE-PEG 2000的量(从5至35mg)增加，与纳米 颗粒连接的赋形剂的量也增加。然而，当所用DAE-PEG 2000的量大于25 mg时，不形成纳米颗粒。
分析尺寸时，观察到增加结合程度如何产生具有更大尺寸和更大多分 散性的纳米颗粒。因此，当以25mg DAE-PEG 2000生产DAE-PEG纳米 颗粒时，得到的颗粒尺寸大于500nm并且具有极高的多分散性。另一方面， 观察到，与未被包被的纳米颗粒相比，被包被的纳米颗粒表面负电荷减少。 这些数据表明DAE-PEG 2000链存在于纳米颗粒表面。
表4.DAE-PEG的量对纳米颗粒物理化学特性的影响。数据表示平均 值±S.D.(n＝3)。 DAE-PEG (mg) 尺寸 (nm) 多分散性 ζ电位 (mV) DAE-PEG的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 5 324±14 0.207 -14.0±9.0 27.0±7.0 10 387±23 0.296 -11.9±3.5 71.1±24.0 25 505±88 0.946 -5.5±1.5 90.6±6.0
*与纳米颗粒结合的DAE-PEG 2000的量(以μg DAE-PEG/mg纳米颗粒 表示)，根据比色法测定。
实施例4：
以O，O’-双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇2000制备聚乙二醇 化的纳米颗粒(DAP-PEG-NP)
该方法通过PVM/MA和DAP-PEG 2000同时在有机相中孵育进行。
为此，一定量的DAP-PEG 2000(10-50mg)溶解在5ml有机溶剂(丙酮) 中。然后，在磁力搅拌下将100mg乙烯基甲基醚和马来酸酐共聚物加入至 该溶液中。使得到的混合物在磁力搅拌下反应1小时。然后，在搅拌下将 10ml乙醇和10ml蒸馏水加至该相中。使得到的混合物均匀化5分钟。有 机溶剂通过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去，浓缩纳米颗粒悬浮液。悬 浮液经过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上 清液，剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将纳米颗粒悬浮液 在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
图1(e)显示被DAP-PEG 2000包被的纳米颗粒具有球形形状并且表面 光滑。表5显示这些纳米颗粒的一般特性。结果表明随DAP-PEG 2000量 的增加，其与纳米颗粒结合的量也增加。然而，当所用DAP-PEG 2000的 量大于35mg时，不形成纳米颗粒。
观察到，增加结合程度产生具有更大尺寸以及更高分散性的纳米颗粒。 ζ电位观测显示，被包被的纳米颗粒所测到的负值显著降低(值接近零)。这 些结果表明DAP-PEG 2000链优选位于纳米颗粒表面。
表5.DAP-PEG的量对纳米颗粒的物理化学特性的影响。数据表示平 均值±S.D.(n＝3)。 DAP-PEG (mg) 尺寸 (nm) 多分散性 ζ电位 (mV) DAP-PEG的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 10 347±7 0.089 -4.1±1.7 ND** 25 361±15 0.169 -2.7±0.8 67.6±17.6 50 512±12 0.372 -6.9±0.7 101.1±11.9
*与纳米颗粒结合的DAP-PEG 2000的量(以μg DAP-PEG/mg纳米颗粒 表示)，根据比色法测定。
**ND-未检测到。
实施例5：
对方法产率以及聚乙二醇化的纳米颗粒结构的研究
图3显示聚乙二醇的类型对PVM/MA转化成纳米颗粒的百分比以及对 本方法的总产率的影响。通常，共聚物转变为纳米颗粒的百分比接近73％。 据观察，当以PEG或mPEG修饰纳米颗粒时，PVM/MA转化成纳米颗粒 的百分比没有显著改变。然而，以DAE-PEG或DAP-PEG使纳米颗粒聚乙 二醇化时使方法的产率降低。
聚乙二醇与纳米颗粒的结合通过元素分析法(Leco CHN-900，U.S.A.) 已证实。根据该技术，当与其它组分(如PEG)结合时，它们可显示氧、氢 或氮组成的改变。
表6包括不同类型的聚乙二醇化的纳米颗粒的C、H、O和N元素组 成。与常规纳米颗粒(NP)相比，所有聚乙二醇化的纳米颗粒显示氢(H)的百 分含量增加和氧含量相对降低。另一方面，DAE-PEG NP和DAP-PEG NP 显示有氮存在，而在未修饰的纳米颗粒中未发现。
表6.聚乙二醇化的纳米颗粒和未修饰的颗粒(NP)之间元素百分含量的 对比。 样品 百分比(％) C H O N NP 51.72 5.24 43.04 - PEG-NP 51.39 5.44 43.17 - mPEG-NP 52.00 5.47 42.53 - DAE-PEG-NP 51.24 5.92 42.69 0.14 DAP-PEG-NP 52.78 5.79 41.10 0.33
聚乙二醇的位置(纳米颗粒的内部或表面)通过核磁共振 (H-NMR)(Bruker 400 UltrashieldTM，德国)分析，该方法为将5mg聚乙二醇 化纳米颗粒溶解在0.5ml的氘化的二甲亚砜后进行分析。以PEG和mPEG 聚乙二醇化的纳米颗粒的图谱在应用6400扫描后获得，而DAE-PEG-NP 和DAP-PEG-NP的图谱在12800扫描后获得。图谱显示聚亚乙基 (polyethylene)单体的典型氢峰(在3.51ppm，-OCH2CH2-)以及羟基基团中的 氢峰(对PEG和mPEG的情况)，或DAE-PEG和DAP-PEG的氨基的氢峰(在 4.58ppm)(图4)。计算在聚乙二醇化的颗粒图谱中和游离聚乙二醇的图谱 中的这两峰面积的比值。该比值可提供聚乙二醇链在聚乙二醇化的纳米颗 粒中的定位信息。
据观察，羟基基团的氢峰(4.58ppm)出现在以PEG 2000聚乙二醇化的 纳米颗粒的图谱中(图5a)。表7显示之前提到PEG-NP和游离PEG的两峰 的面积(在3.51ppm和在4.58ppm)以及它们之间的比值。计算两峰的比值， 纳米颗粒的约是游离PEG 2000的两倍。对于这些纳米颗粒来说，这些数 据意味着羟基基团的比例低两倍，因此可得出结论，大量的这些官能团(其 未出现在图谱中)与共聚物的酸酐基团连接。根据这些观察，一小部分PEG 2000链包含在纳米颗粒的内部，而大部分PEG链排列在其表面。该事实 与表1所示的ζ电位数据相符。
表7显示了涉及m-PEG-NP和游离mPEG的两峰面积的数据。可以看 出，聚乙二醇化的纳米颗粒的两峰之间比例与mPEG 2000的两峰之间比例 类似(177对217)。该结果说明，两种情况(纳米颗粒和游离mPEG)下mPEG 羟基基团比例相似，仅小比例的羟基与共聚物的酸酐基团反应。可得出结 论，这些颗粒的结构不同于PEG-NP的结构。该情况下，更大比例的mPEG 链包含在内部，其仅有一小部分位于纳米颗粒表面。因此，mPEG链的表 面分布为不均一的，这与在这些颗粒的ζ电位分析中看到的较大偏差相一 致(表3)。
表7.利用核磁共振(H-NMR)方法分析PEG 2000以及用PEG 2000聚 乙二醇化的纳米颗粒的图谱 显示 峰面积 峰A 3.51ppm (聚亚乙基单体中的氢) 峰B 4.58ppm (羟基氢) 比例 A/B PEG 2000 PEG-NP 75.35×109 2.03×109 73.65×107 1.11×107 102.3 183.3 mPEG mPEG-NP 46.00×109 2.30×109 26.01×107 1.06×107 176.8 217.0
表8显示涉及DAP-PEG-NP和游离DAP-PEG 2000的峰面积的数据。 在DAP-PEG 2000的图谱中，有两个对应于位于链末端的两种不同氨基基 团的氢的信号：一双重峰在δ＝4.55ppm，另一个在δ＝4.45ppm(图6b)。 在以DAP-PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒的图谱中看到，没有这些氨基 基团的氢(图6a)，这表明该类型聚乙二醇的所有氨基基团与聚合物酸酐基 团反应形成纳米颗粒。而且，DAP-PEG链以两末端氨基基团与纳米颗粒表 面连接并且表面完全包被。该结果得到这些颗粒的ζ电位值(接近0)的支持 (表5)。
表8.利用核磁共振(H-NMR)方法分析DAP-PEG 2000和聚乙二醇化 的纳米颗粒(DAP-PEG-NP)的图谱。 显示 峰面积 峰A 3.51ppm (聚亚乙基单体的氢) 峰B 4.55ppm (氨基的氢) 峰C 4.45ppm (氨基的氢) DAP-PEG 115.14×109 9.83×106 21.46×106 DAP-PEG-NP 9.81×109 - -
对于DAE-PEG 2000，由于在4.58ppm峰的低强度以及低分辨率(与浓 度和扫描数无关)(图7b)，所以不可能同样计算两峰之间的比例。任何情况 下，可看到该峰出现在纳米颗粒图谱上，也出现在DAE-PEG 2000的图谱 上。因此，可得出结论，一部分DAE-PEG链包含在颗粒内部。然而，其 大多数位于表面，仅在该聚乙二醇链的末端连接。
根据这些数据，可得出聚乙二醇化的纳米颗粒具有不同的结构的结论。 对不同剂型所主张的结构显示于图8。某些聚乙二醇，如PEG 2000、 DAE-PEG和DAP-PEG，修饰成形的纳米颗粒表面。对于PEG-NP和 DAE-PEG-NP的情况，包被产生“毛刷”形结构(图8a和c)，而对于DAP-PEG 的情况，在其链的两末端连接，产生“环”形结构(图8d)。只有当使用mPEG 2000时，未观察到纳米颗粒表面的修饰情况。发现大部分mPEG在纳米颗 粒内部(图8b)。
实施例6：
聚乙二醇化的纳米颗粒在大鼠胃肠道的生物附着性研究
根据符合欧洲动物实验法(86/609/EU)的Navarra大学伦理委员会规章 进行该项研究。
该测定中所用的聚乙二醇化的纳米颗粒被若丹明B异硫氰酸酯荧光标 记。为此，利用PVM/MA和不同类型的聚乙二醇同时孵育形成纳米颗粒(根 据实施例1.1、2、3和4中的方法)。然后，在搅拌下将10ml乙醇和10ml 蒸馏水加入至该相中。使得到的混合物均匀化5分钟。有机溶剂提供减压 蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去，浓缩纳米颗粒悬浮液。纳米水悬浮液体积 用蒸馏水调至9ml并加入1ml若丹明B异硫氰酸酯水溶液(1.25mg/ml)。 纳米颗粒与荧光标记物的孵育在搅拌下进行5分钟。然后，荧光修饰的纳 米颗粒悬浮液通过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。 除去上清液，剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将纳米颗粒 悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
表9包括用在该测定中的以若丹明B异硫氰酸酯荧光标记的制剂的特 性。
表9.在生物附着性研究中考虑的纳米颗粒的物理化学特性。平均值± SD(n＝3)。 样品 尺寸(nm) ζ电位 (mV) 聚乙二醇 (μg/mg)* 若丹明 (μg/mg)** NP 289±11 -33.5±6.6 - 10.33±0.87 PEG-NP 299±22 -14.6±0.3 55.0±12.0 10.37±0.09 mPEG-NP 272±17 -11.8±2.2 35.5±7.5 10.46±0.11 DAE-PEG-NP 505±88 -5.5±1.5 90.6±6.0 10.04±0.62 DAP-PEG-NP 361±15 -2.7±0.8 67.6±17.6 8.74±0.75
*与纳米颗粒结合的聚乙二醇的量(μg PEG/mg纳米颗粒)。
**通过比色法在540nm测定的与纳米颗粒连接的若丹明B异硫氰酸 酯的量(以μg/mg纳米颗粒表示)。
获得的纳米颗粒(10mg)分散在1ml水中后，对雄性大鼠(Wistar型， 重220.0g)口服给药。口服给药后，动物在不同时间通过颈脱位法处死：0.5、 1、3和8小时。打开腹腔并取出胃肠道。各区段划分为以下解剖部分：胃、 小肠和盲肠。各段沿肠系膜纵向切开并用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4；0.15M) 清洗，除去未附着的纳米颗粒部分。此外，各段切成2cm长的部分并用1 ml 3M氢氧化钠消化24小时(Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002) 129-136)。然后以2ml甲醇取出若丹明，并且样品4000rpm离心10分钟。 上清液(1ml)用3ml水稀释，并利用λex＝540nm和λem＝580nm的荧光光 谱(GENios，澳大利亚)测定。根据该方法可评估附着在粘膜上的纳米颗粒 部分。
聚乙二醇化的纳米颗粒在胃肠道不同部分的特异性分布见图9。所有 制剂显示在胃粘膜上最初附着显著。给药30分钟后，附着在该器官的剂量 的百分比在PEG-NP的13％和DAP-PEG-NP的9％之间。所有聚乙二醇化 的纳米颗粒剂型也显示对小肠I3部分的某种亲合性；然而，在给药后3小 时，PEG-NP和DAE-PEG-NP显示为最有效的制剂，维持附着在小肠的量， 接近剂量的20％。最后，给药后8小时，发现附着的纳米颗粒的峰值在小 肠的最后部分(对于PEG-NP)或在盲肠(对于mPEG和DAP-PEG-NP)。对于 PEG-NP和DAP-PEG-NP来说，仍可定量相对大部分(接近10％)的附着在 粘膜上的纳米颗粒。结论是，可断言以PEG 2000和mPEG 2000包被的纳 米颗粒显示非常均一的分布，并且8小时内遍布在消化道的所有部分(图9 a和b)。以DAE-PEG聚乙二醇化的纳米颗粒优选附着在小肠中间部分(图 9c)，而以DAP-PEG 2000修饰的纳米颗粒主要积聚在小肠消化道末端区域 (图9d)。这些结果意味着本发明开发的纳米颗粒可提供特异性药物释放。
生物附着性参数(Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002)129-136)：各制 剂的附着曲线是通过表示在大鼠胃肠粘膜中附着的聚乙二醇化的纳米颗粒 部分随时间的变化而获得。以下生物附着参数由该曲线计算：AUCadh、kadh 和MRTadh。kadh表示附着部分的清除率，并用WinNonlin程序1.5版 (Scientific Consulting，Inc.)辅助计算。表示随时间变化的附着部分的AUCadh 或曲线下面积(以相对于时间的附着标记物的量的形式表示)可通过至 tz(最后的取样点)的梯形法(trapezoid method)计算，并能够定量生物附着现 象的强度。最后，MRTadh指纳米颗粒的附着部分的平均保留时间，并且使 用最后样品点作为界线，其能够评估附着作用的相对持续时间。
图10显示聚乙二醇化的纳米颗粒在整个胃肠道8小时的生物附着曲 线。所有聚乙二醇化的纳米颗粒显示的生物附着曲线与未修饰的颗粒(NP) 的曲线不同。NP的最大生物附着发生在其口服给药30分钟后，并且随后 迅速降低。相反，聚乙二醇化的纳米颗粒通常具有较低的产生生物附着作 用的初始能力。然而，该附着能力保持至少3小时。因此给药3小时后， 附着于胃肠粘膜的纳米颗粒的量的范围在PEG-NP给药剂量的25％和 DAP-PEG-NP给药剂量的16％之间，所有情况均高于对照(NP)。另一方面， 获得的PEG-NP的曲线尤其令人感兴趣。这些纳米颗粒在其给药后1小时 显示最大附着(约剂量的32％)，并且给药3小时后，颗粒附着于粘膜的水 平与最初水平类似。对于其它聚乙二醇化的纳米颗粒，其初始附着保持至 少3小时。
生物附着参数可提供关于纳米颗粒附着特性的更多细节(表10)。如前 所述，聚乙二醇化的纳米颗粒与粘膜作用的初始能力(Qmax)比未包被的颗粒 (NP)低。然而，聚乙二醇化的纳米颗粒的曲线下生物附着面积(AUCadh)更 高；这意味着附着强度更大。该现象尤其在PEG-NP的情况中观察到，其 中AUCadh是NP的1.6倍。而且，与未包被的颗粒相比，所有聚乙二醇化 的纳米颗粒制剂具有更低的附着部分清除程度(kadh)以及更长保留时间 (MRTadh)。因此，DAP-PEG-NP显示比常规颗粒更慢的附着部分清除，表 明这些纳米颗粒维持长时间的生物附着的可能性。据观察，所有聚乙二醇 化的纳米颗粒在胃肠道中显示长保留时间(MRTadh)。关于附着部分的平均 保留时间(MRTadh)，尤其令人关注的是所有聚乙二醇化的纳米颗粒显示保 留时间比NP显著延长。因此，这些纳米颗粒显示保留时间比常规颗粒保 留时间延长17至48分钟。
图10.根据聚乙二醇化的纳米颗粒在整个胃肠道随时间的分布计算的 生物附着参数。 纳米颗粒 AUCadh(mg h) MRT(h) kadh(h-1) Qmax.(mg) NP 11.83±2.0 2.77 0.21±0.01 3.64±0.34 PEG-NP 16.19±2.29 3.11 0.17±0.01 3.16±0.57 mPEG-NP 12.91±6.84 3.10 0.16±0.05 2.55±1.17 DAE-PEG-NP 13.49±1.76 3.05 0.17±0.02 2.51±0.50 DAP-PEG-NP 10.90±5.04 3.57 0.14±0.10 2.05±0.47
实施例7：
观察在胃肠粘膜中的聚乙二醇化的纳米颗粒
利用荧光和光学显微镜观察在胃肠粘膜中的聚乙二醇化的纳米颗粒。 为此，聚乙二醇化的纳米颗粒用诸如若丹明B异硫氰酸酯(RBITC)和荧光 素异硫氰酸酯(FITC)的荧光分子标记。大鼠口服给药后，收集肠的不同部 分并用磷酸盐缓冲液洗涤(pH＝7.4；0.15M)，如上所述。
第一种情况，肠段(包含RBITC标记的纳米颗粒)固定在Tissue-Tek O.C.T.介质(Sakura，荷兰)中，并通过干冰和2-甲基丁烷冷冻。然后，在 低温下(-22℃)在低温恒温器(Leica，德国)中将肠段切成5μm的切片。获得 的切片放置在包被有聚-L-赖氨酸(Sigma，西班牙)的载波片上，并在荧光显 微镜(Olympus CH-40，日本)下观察。
另一方面，将肠段(含有FITC标记的纳米颗粒)在福尔马林溶液(4％) 中固定24小时。固定后，组织包埋在石蜡中并切成3μm的切片。将这些 切片放在包被有Vectabond(Vector Labs，U.S.A.)的载波片上。然后，使获 得的切片去石蜡、再水合并通过加入过氧化氢溶液(3％)10分钟阻断内源性 过氧化物酶。然后，用蒸馏水洗涤支持物(5分钟)，放入柠檬酸盐缓冲液(pH ＝6.0；0.01M)中，微波炉加热(最大火力15分钟和最小火力15分钟)，用 水洗，最后用Tris缓冲盐水(TBS)(pH＝7.36；NaCl 0.5M；0.05M)洗涤。为 了防止非特异性标记，切片用正常的山羊血清(1∶20，DAKO，U.S.A.)室温 孵育30分钟，然后与特异性抗-血清(1∶100单克隆抗-FITC，M0878，DAKO， U.S.A.)4℃孵育24小时。用Tris缓冲盐水(TBS)洗涤后，将样品与山羊抗- 小鼠Ig二抗孵育(室温，30分钟)，该二抗偶联到标记有过氧化物酶的右旋 糖苷。样品用TBS缓冲液洗涤，通过二氨基联苯胺显示过氧化物酶活性。 该切片以苏木精形成弱反差、脱水并置于DPX。最后，样品在光学显微镜 (Nicon Eclipse E 800M，日本)下观察。
图11显示小肠上皮细胞中存在PEG-NP。颗粒通常位于细胞的顶部区 域(图11a)，但也可观察到某些部分渗透进肠上皮细胞间(图11b)。
纳米颗粒在肠上皮细胞中的强烈渗透可用光学显微镜观察(图12)。用 荧光显微镜，观察在细胞顶部区域的分布。另一方面，图12b也显示在基 底侧区域的分布。观察到某些细胞核含有标记物或标记的纳米颗粒，这使 得可推测使用该纳米颗粒可促进不同生物活性分子向细胞核的递送。
最后，图13显示这些系统在派尔结细胞中的分布。尤其令人感兴趣的 是，观察到这些纳米颗粒似乎集中在被认为是派尔结的“圆顶(dome)”的区 域。该圆顶的特征在于其为单核巨噬细胞细胞聚集的区域。可以推断这些 聚乙二醇化的纳米颗粒在开发口服疫苗和在免疫治疗中的意义。
口服给药为最方便和最通用的给药途径。然而，某些活性分子的生物 利用度依赖于(i)药物分子的特征和药物形式，以及(ii)胃肠道中的生理条 件，如蛋白水解酶、蠕动和系统前代谢(presystemic metabolism)的存在。诸 如纳米颗粒的胶体系统已被推荐来克服某些这类障碍。这些载体实质上具 有大的比表面，由此促进了它们与生物支持物(胃肠粘膜)的相互作用。药 物的释放控制也使得能在时间上延长低生物半衰期分子的作用。另一方面， 纳米颗粒也可被派儿结(Peyer’patch)细胞和被淋巴组织滤泡摄取(Hodges et al.，J.Drug Target.，3(1995)57-60；Florence，Pharm.Res.，14(1997) 259-266)。该现象使得药物导向淋巴通路，并且在疫苗接种的情况下，有 助于抗原呈递。然而，对于通过口服给药的应用来说，常规的纳米颗粒具 有一些显著的缺陷：(i)在胃肠液中的某些不稳定性，(ii)低水平的肠内吸 收，以及(iii)在胃肠粘膜中的非特异性定向或附着。
纳米颗粒的肠胃外给药提供可控的全身释放，其适合于具有(i)低口服 生物利用度、(ii)短生物血浆半衰期以及(iii)有限的稳定性的药物。肠胃外 纳米颗粒的另外的显著优势为药物在某个器官聚集的可能性。然而，静脉 给药后，纳米颗粒迅速被单核吞噬细胞系统(MPS)的巨噬细胞识别、摄取 并且从血液循环中清除。这种现象限制了它们在控制释放中的作用以及药 物在除MPS外的其它组织中聚集的可能性。
尽管也可获得全身性作用，控制释放系统的眼部给药对眼睛疾病的治 疗仍具有显著优势。然而，由于向鼻泪管排出和泪水稀释，眼部给药伴随 制剂从角膜前区域的快速清除。这些过程导致极低百分比的所给予的药物 可渗透进入角膜并且到达眼内组织(低于5％)。该排出造成药剂通过该途径 给药时产生全身性作用。大量的研究已证实，与常规的诸如溶液和药膏的 眼药形式相比，纳米颗粒的应用使得在结膜中的药物量增加并且提高了它 们的生物利用度(Gurny et al.，J.Controlled Rel.，6(1987)367-373； Deshpande et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，15(1998)381-420)。胶 体系统可作为简单滴剂给药，由于其低粘度避免了视力问题。由于药物从 纳米颗粒基质中持续释放，所以可以降低使用频率。然而，纳米颗粒也显 示从吸收位点快速清除。
因此，即使纳米颗粒对上述不同给药方法可能是有用的，但仍然存在 使其应用困难的问题。改变聚合物基质及其表面的特性可提供对上述某些 问题的解决方法。
从该观点看，以适合的聚合物结合或包被纳米颗粒，可改变其物理化 学特性，并且可间接地改变其分布和与生物介质的相互作用。可能的策略 为聚乙二醇(PEG)结合纳米颗粒，称为聚乙二醇化的纳米颗粒或获得隐形 (stealthy)的纳米颗粒。
对于它们经口服给药的应用，聚乙二醇与常规纳米颗粒的结合可在消 化液中保护它们不受酶攻击。这是由于聚乙二醇的电位排斥蛋白质(Gref et al.，Science，263(1994)1600-1603)。该方法也使得它们与粘蛋白和存在于 腔内的其它蛋白质的相互作用降至最低。相似的策略已用于眼用纳米颗粒 的开发中。Fresta等人观察到在以聚乙二醇包被的聚(氰基丙烯酸烷基酯) 纳米球中给药后，无环鸟苷(acyclovir)的眼吸收显著增强(Fresta et al.，J.Pharm.Sci.，90(2001)288-297)。该现象被解释为被包被的纳米颗粒与 角膜上皮细胞之间的更大相互作用。
用乙二醇包被的不同的纳米颗粒静脉注射给药已证明循环延长(Gref et al.，Science，263(1994)1600-1603；Stolnik et al.，Pharm.Res.，11(1994) 1800-1808；Bazile et al.，J.Pham.Sci.，84(1995)493-498)。聚乙二醇包被的 聚乳酸(PLA)纳米颗粒(t1/2＝6h)比用白蛋白或泊洛沙姆(poloxamer)包被的 纳米颗粒(t1/2＝2-3分钟)具有更长的血浆半衰期(Verrecchia et al.，J. Controlled Rel.，36(1995)49-61)。存在于纳米颗粒表面的亲水聚乙二醇链 显著地降低了纳米颗粒与血蛋白(称为调理素)的相互作用。这些蛋白质在 颗粒与吞噬细胞之间形成“桥梁”，促进吞噬作用(Frank & Fries，Immunol. Today，12(1991)322-326)。然而，聚乙二醇的亲水性不是提供有效的抗调 理作用的唯一重要因素。其它的亲水聚合物如聚乙烯醇已证明仅具有低的 保护纳米颗粒不受调理作用的能力(Leroux et al.，Life Sci.，57(1995) 695-703)。因此，聚乙二醇化提供的空间稳定性也可能归结于其它物理化 学特性，如PEG链的高度柔性和特定结构形式(Mosquiera et al.， Biomaterials，22(2001)2967-2979)。
这种新策略的主要缺陷为聚乙二醇与纳米颗粒表面结合的稳定性 (Peracchia et al.，Life Sci.，61(1997)749-761)。已知聚乙二醇排斥蛋白质的 能力依赖于链的构象、电荷、长度和柔性(Torchillin，J.Microencaps.，15 (1998)1-19)。纳米颗粒表面修饰的方法主要通过物理吸附(Stolnik et al.， Adv.Drug Del.Rev.，16(1995)195-214)或通过共价结合(De Jaeghere et al.，J. Drug Target.，8(2000)143-153)进行。然而，由于相互作用的不稳定性，简 单吸附的缺陷为包被的快速丢失。假定共价结合为优选，多数的聚乙二醇 化的纳米颗粒使用聚乙二醇与乳酸或乙醇酸共聚物制备。然而，共聚化方 法需要使用一些催化剂和特殊的化学条件(Beletsi et al.，Int.J.Pharm.，182 (1999)187-197)。此外，在有机合成中使用的毒性有机溶剂残留(二氯甲烷、 甲苯等)也是难以解决的。
因此，仍需要获得口服给药稳定的纳米颗粒，在胃肠道中，其保持亲 水包被并且其具有良好的生物附着性和特异性。为了有效性，它们必须无 毒、生物可降解并且容易生产。
发明概述
本发明的目的是提供解决上述缺陷的纳米颗粒，即口服给药时，它们 具有稳定性和特异性，它们具有与粘膜相互作用的良好附着特性，它们能 够携带各种各样的活性分子，它们以可控方式释放活性分子，并且尤其是 当通过胃肠外给药时，阻止其从血液系统中清除。
已经观察到，由生物可降解的聚合物和聚乙二醇形成的纳米颗粒解决 了这些问题。尤其发现，由聚乙烯基甲基醚和马来酸酐以及聚乙二醇共聚 物形成的纳米颗粒易于生产并且提供优异的生物附着性、尺寸以及ζ电位 特征，使它们适合于活性分子的给药。还发现对制备它们所用的聚乙二醇 的类型进行选择使得能适当调整这些纳米颗粒的特性，这可根据待携带的 药物的类型和/或药物制型的给药方法有利地加以利用。
因此，在本发明的第一方面涉及用于携带生物活性分子的聚乙二醇化 的纳米颗粒，该纳米颗粒包含生物可降解的聚合物和聚乙二醇或其衍生物。 在一个变体中，该生物可降解的聚合物为乙烯基甲基醚和马来酸酐 (PVM/MA)共聚物。
所述聚乙二醇优选具有400至35,000Da的分子量。当聚亚烷基二醇 (polyalkylene glycol)选自聚乙二醇、聚丙二醇、包括这两类单体的嵌段或 随机共聚物、其混合物或其衍生物时，其提供良好的结果。聚乙二醇的至 少一个末端羟基基团任选地被取代，优选被烷氧基、丙烯酸基、甲基丙烯 酸基、烷基、氨基、磷酸基、异硫氰酸基、硫氢基、巯基或硫酸基取代。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇与生物可降解的聚合物之间的重量 比为1∶2-6，优选1∶2-4，更优选约1∶4。
本发明的聚乙二醇化的纳米颗粒可纳入活性分子，如蛋白质、肽、 DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。关于它们的活性，可 为抗肿瘤制剂或肿瘤抗原、或中枢神经系统的保护剂或糖皮质激素、或用 于疫苗接种的抗原或用于免疫治疗的变应原，以及其它。
另一方面，本发明涉及包括如上所述聚乙二醇化的纳米颗粒的药物组 合物。在一个变体中，该制剂用于口服给药。在另一变体中，该制剂为胃 肠外给药或通过粘膜(例如眼粘膜)给药。
因此，本发明的聚乙二醇化的纳米颗粒可用于药物的制备中。其可任 选地为冻干形式。
本发明的另一方面涉及制备所述聚乙二醇化的纳米颗粒方法，其包括 在以水醇溶液使所述聚合物除溶剂之前，将所述聚合物和所述聚乙二醇在 有机溶剂中同时孵育的步骤。在一个变体中，所述生物可降解的聚合物的 浓度在0.001至10％w/v之间，聚乙二醇的浓度在0.001至5％w/v之间。 有机相/水醇溶液相的比例任选地为1/1至1/10。
该方法还可包括另外的除去有机溶剂和/或纯化的步骤，以及通过使用 交联剂稳定聚乙二醇化的纳米颗粒的步骤。所述生物活性分子可在聚合物 和聚乙二醇在有机溶剂中同时孵育的步骤中被纳入，或可随后被纳入在已 形成的纳米颗粒的水悬浮液中，以便产生它们的结合。
附图说明
图1显示不同类型纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)照片-(a)NP；(b) PEG NP；(c)mPEG NP；(d)DAE-PEG NP；(e)DAP-PEG NP。比例尺代表 150nm。
图2显示根据所用的方法，PEG 2000(mg/mg)的结合：PEG和PVM/MA 同时在有机相(OP)中孵育或纳米颗粒与PEG的水溶液(AP)孵育。
图3显示聚乙二醇的类型对PVM/MA转变为纳米颗粒(PVM/MA-e)的 百分数以及对方法产率的影响。
图4显示以PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒(上)和游离PEG 2000(下) 的核磁共振图谱。框图中显示在4.58ppm处(羟基基团的质子)的峰的放大 图。
图5显示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以PEG 2000聚乙二醇 化的纳米颗粒(a)和游离PEG 2000(b)的核磁共振图谱的细节。
图6显示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以DAP-PEG 2000聚乙 二醇化的纳米颗粒(a)和游离DAP-PEG 2000(b)的核磁共振图谱的细节。
图7显示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以DAE-PEG 2000聚乙 二醇化的纳米颗粒(a)和游离DAE-PEG 2000(b)的核磁共振图谱的细节。
图8显示依据核磁共振数据和ζ电位值所主张的不同的聚乙二醇化的 纳米颗粒的结构-a)PEG-NP；b)mPEG-NP；c)DAE-PEG-NP；d) DAP-PEG-NP。
图9显示对大鼠口服给药后，聚乙二醇化的纳米颗粒在胃肠道的分布： (a)PEG-NP，(b)mPEG-NP，(c)DAE-PEG-NP和(d)DAP-PEG-NP。x轴表 示附着的纳米颗粒(NP)的量(mg)；y轴表示胃肠道的不同部分(St：胃；I1， I2，I3，I4：肠部分；Ce：盲肠)；z轴表示给药后的时间(小时)。
图10显示10mg的单一剂量口服给药后，整个胃肠道内不同聚乙二醇 化的纳米颗粒的生物附着曲线(NP，mg)。t：以小时为单位的时间。
图11显示以PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒(PEG-NP)10mg口服给 药2小时后回肠部分的荧光显微镜图像。a)回肠绒毛：箭头指示上皮细胞 的顶部区域；b)上皮细胞：箭头指示肠上皮细胞间的荧光。比例尺代表为 20μm。
图12显示以PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒(PEG-NP)10mg口服给 药2小时后回肠段的光学显微镜图像。a)总图：(放大135倍)以及b)放大 的细节(放大530倍)。L：内腔；E：肠上皮细胞；GC：产生细胞的粘液； 黑箭头：肠上皮细胞核；白箭头：粘膜下的毛细血管。
图13显示纳米颗粒10mg口服给药2小时后，PEG-NP在回肠派尔结 的定位。a)派尔结的总图(放大135倍)；b)放大的细节(放大530倍)；PP- 派尔结；FAE-滤泡相关的上皮细胞；黑箭头：派尔结的圆顶细胞，其中包 括有纳米颗粒。
发明详细说明
令人惊奇的是，发现用不同聚乙二醇修饰和包被生物可降解聚合物的 纳米颗粒，例如乙烯基甲基醚和马来酸酐(PVM/MA)共聚物的纳米颗粒， 可获得在口服给药中具有物理化学特性、生物附着性和特异性的纳米颗粒， 在非常令人感兴趣的系统中将它们转化为特殊药物载体。根据所用的聚乙 二醇的类型和制备方法，这些纳米颗粒的特征可以有利地被调节。本发明 的聚乙二醇化的纳米颗粒在口服或眼部给药后，可延长在粘膜中的保留时 间。这些纳米颗粒可用于具有窄吸收窗的药物的给药，因而提高了其生物 利用度。这些纳米颗粒也是高毒性药物(如抑制细胞生长药物)的适合载体， 由于其使得系统的血浆循环时间延长，在该段时间内药物以可控方式逐渐 释放。另一方面，静脉给药后，聚乙二醇化的纳米颗粒可防止单核吞噬细 胞系统(MPS)细胞的识别和清除，提供延长的药物循环。
术语“纳米颗粒”用于指尺寸小于1.0微米的球体或类似形状，优选为 10至900纳米的范围。
如上所述，本发明的一方面涉及由生物可降解的聚合物形成的聚乙二 醇化的纳米颗粒。可使用现有技术中已知的可形成纳米颗粒的生物可降解 聚合物。这些聚合物包括聚羟基酸，如聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物(如 PLGA)、聚酸酐、聚酯和诸如壳聚糖的聚糖，以及其它。在本说明书中， 术语“生物可降解的”指聚合物一旦暴露于pH6-9以及温度在25至45℃之 间的生理溶液中，其在一段时间内溶解或降解，这段时间对于所需的应用 (例如体内治疗)来说是可接受的。
在本发明的一个变体中，酸酐形式的乙烯基甲醚和马来酸酐共聚物 (PVM/MA或Gantrez AN)用作生物可降解聚合物。其优选具有100至2400 KDa之间的分子量，更优选200至2000KDa之间。在本发明的一个变体 中，优选PVM/MA共聚物分子量为180至250KDa之间。
由于其低毒性(LD50＝8-9g/kg，口服)以及优良的生物相容性而被广泛 应用于制药工艺中，所以该共聚物为有利的。在数量和价格方面，其也属 于容易获得的。由于其酸酐基团，该聚合物可与不同的亲水物质反应，而 不用借助通常具有非常大毒性的有机溶剂(戊二醛和碳化二亚胺衍生 物)(Arbos et al.，J.Controlled Rel.，83(2002)321-330)。该聚合物在含水介质 中不溶，但是Gantrez AN的酸酐基团水解，产生羧基基团。溶解较慢并且 取决于其发生条件。考虑到在PVM/MA中官能团的生物利用度，分子与亲 核基团(如羟基(-OH)或胺基(-NH2))的共价结合可通过在含水介质中简单孵 育产生。
该共聚物的非-聚乙二醇化的纳米颗粒及其制备在属于同一申请人的 WO 02/069938中描述，在此引入该申请的全部内容作为参考。乙烯基甲 基醚和马来酸酐共聚物纳米颗粒可容易地制备，其通过向该聚合物的有机 容液中加入第一极性溶剂(与聚合物溶液混溶的)以及随后加入第二非溶剂 液体，例如水醇溶液，来使聚合物除溶剂而进行。可任选地添加交联剂。 以下将描述获得该聚合物的聚乙二醇化的纳米颗粒，并且发现它们非常容 易获得。
在本说明书中，术语“聚乙二醇”理解为任何溶于水的含有由2或3个 碳原子连接的醚基团的亲水性聚合物，任选地含有分枝的亚烷基基团。因 此该定义包括分枝或无分枝的聚乙二醇、聚丙二醇以及包含这两种类型单 体的嵌段或随机共聚物。该术语也包括末端羟基基团的衍生物，该末端羟 基基团可被修饰(一个末端或两个末端)以引入烷氧基、丙烯酸基、甲基丙 烯酸基、烷基、氨基、磷酸基、异硫氰酸基、氢硫基、巯基和硫酸基。聚 乙二醇或聚丙二醇可在亚烷基基团上被取代。如取代基存在，这些取代基 优选烷基基团。
聚乙二醇为已批准用于口服、肠胃外和局部给药(FDA)的水溶性聚合 物。聚乙二醇为环氧乙烷(EO)或环氧丙烷(PO)在水存在下、以单乙烯醇或 二乙二醇作为反应引发剂在碱性介质中聚合产生(1，2-Epoxide Polymer： Ethylene Oxide Polymers and Copolymers(1，2-环氧聚合物：环氧乙烷聚合物 和共聚物)，in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering；Mark， H.F.(Ed.)，John Widely and Sons Inc.，1986，pp.225-273)。当达到需要的分子 量时(通常利用反应过程的粘度测量来控制)，通过用酸(乳酸、醋酸等)中和 催化剂终止聚合发应。得到具有非常简单结构的线性聚合物：
HO-(CH2-CH2-O)n-H
其中(n)为EO单体或单位的数量。单体也可包含亚丙基基团。
尽管工艺上所有这些产品都应该称为聚(氧化烯)(poly(oxyalkylene))， 平均分子量(或分子质量)在200至35,000之间的产品称为聚乙二醇(PEG)。 该术语聚乙二醇通常用于表明羟基末端基团对这些分子物理化学特性的显 著影响。术语PEG通常和数值联合使用。在制药工业中，数字表示平均分 子量，而在化妆品工业中伴随字母PEG的数字指构成分子的聚合的EO的 单位(Hand book of Pharmaceutical Excipients，Rowev R.c.，Sheskey P.J.， Weller P.J.(Eds)，4th Edition，Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association，London，UK，2003)。PEG收录在不同的药典中， 尽管命名不同(International Harmonisation：Polyethylene glycol(PEG)： Pharmeuropa 1999，11，612-614)。根据2003由R.C.Rowe，P.J.Sheskey和 P.J.Weller编辑，由药物出版社(Pharmaceutical Press)(伦敦，英国)和美国 药物协会(华盛顿，美国)出版的药物赋形剂手册(第4版)，聚氧乙烯二醇 (polyoxyethylene glycol)也称为聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚乙二醇 (macrogols)、聚乙二醇(macrogol)或PEG。英国药典采用聚乙二醇 (polyethylene glycol)和聚乙二醇(macrogols)，欧洲药典采用聚乙二醇 (polyethylene glycol)和聚乙二醇(macrogol)，而美国药典(USP)采用聚乙二 醇(polyethylene glycol(s))。
分子量低于400的PEG为室温下不挥发的液体。PEG 600的熔点在17 至22℃之间，而平均分子量在800至2000之间的PEG为低熔点、浆糊状 物质，分子量超过3000的PEG为固体，一直到PEG 35000都可购得。另 一方面，尽管当分子量的增加时，其熔点也增加，但沸点只增加至最大值 60℃。同样地，当分子量增加，其水溶性降低。在任何情况下，接近50％ m/m量的PEG 35000不溶于水中。
从毒理学观点看，认为PEG无毒无免疫原性(Hermansky S.J et al.，Food Chem.Toxic.，1995，33，139-140；Final Report on the Safety Assessment of PEGs：J.A.C.T.，1993，12，429-457；polyethylene glycol，21 CFR 172.820， FDA)。WHO规定每日允许摄入量为10mg/kg重量(Polyethylene glycols； Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives；World Health Organisation，Geneva；Technical Report Series 1980， 648，17-18(聚乙二醇；FAO/WHO联合专家委员会关于食品添加剂的第23 份报告；日内瓦世界卫生组织；技术报告系列1980，648，17-18))。
聚乙二醇衍生物具有与常规PEG类似的优点，例如其水溶性、生理惰 性、低毒性以及在极为不同条件下的稳定性。这些衍生物包括极其不同的 产品并且以取代羟基的官能团为特征，例如-NH2(最活泼基团之一)、苯酚、 乙醛、异硫氰酸酯、-SH基团等。在能用于本发明的聚乙二醇衍生物中， 可指出以下物质：
-聚氧乙烯酯：PEG单甲醚单琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG单甲醚单羧 基甲基醚、PEG己二酸酯、PEG二硬脂酸酯、PEG单硬脂酸酯、PEG羟基 硬脂酸酯、PEG二月桂酸酯、PEG二油酸酯、PEG单油酸酯、PEG蓖麻醇 酸酯、PEG椰子油酯。
-聚氧乙烯烷基醚：PEG单甲醚或甲氧基PEG(mPEG)、PEG二甲醚。
-其它：聚(乙二醇对苯二酸酯)、聚氧乙烯衍生物和山梨聚糖酯以及脂 肪酸、环氧乙烷和环氧丙烷共聚物、环氧乙烷与丙烯酰胺共聚物。
-PEG衍生物：O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇(DAE-PEG 2000)、O，O’- 双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇无分枝并且羟基基团未被取代。在 该变体中，所用聚乙二醇优选分子量在400至35,000Da之间。当分子量 低于400Da时，发现聚乙二醇化无法有效发生。因此在本发明的一个优选 变体中，用于制备聚乙二醇化的纳米克颗粒的聚乙二醇的分子量等于或大 于400，更优选等于或大于1000，尤其优选值为1500至10,000之间，优 选为2000至5000KDa之间。
因此，在本发明的一个变体中，使用聚乙二醇2000(PEG 2000)。PEG 2000与聚合物量的比值优选1∶2-6，接近1∶4的比值可提供好的结果。例 如约0.25mg PEG 2000/mg聚合物可提供有效的聚乙二醇化。在该情况下， 与纳米颗粒结合的量为约55.0微克每mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征 为球形并且尺寸接近300nm。
在本发明的另一变体中，用于制备聚乙二醇化的纳米颗粒的聚乙二醇 具有封闭的末端羟基基团，例如通过用甲基醚衍生物。这降低了其亲水性， 甚至改变纳米颗粒的结构。在这种情况下，更大百分比的聚乙二醇链包含 在其内部，只有小部分结合于纳米颗粒表面。该特性使得我们能利用封闭 羟基基团或通过引入如下所述的其它官能团调节纳米颗粒的特性。对于处 于纳米颗粒内部的m-PEG来说，其功能为通过修饰多孔的聚合物基质来改 进药物释放。
聚乙二醇基甲基醚2000(m-PEG 2000)用于一个优选的变体中。mPEG 2000与聚合物的量的比例优选1∶2-6，接近1∶4的比值可提供好的结果， 例如约0.25mg mPEG 2000/mg聚合物。在该情况下，与纳米颗粒结合的量 为约35.5微克每mg纳米颗粒。这些纳米颗粒的特征为球形并且尺寸接近 300nm。
在本发明的另一个变体中，所用的聚乙二醇具有不同于羟基基团的末 端官能团，如氨基基团。这些氨基基团又可被取代并具有官能团。在优选 变体中，氨基基团为-NH2。观察具有这些基团的纳米颗粒口服给药后，纳 米颗粒在肠道的某些段内积聚，允许特异性给药。
因此，在一个变体中，制备聚乙二醇化的纳米颗粒所用的聚乙二醇为 O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG 2000)。在该情况下，由于 链两末端连接，聚乙二醇化纳米颗粒的结构不是“毛刷”类型结构，而产生 “环”形结构。DAE-PEG与聚合物的量的比例优选低于1∶4。在一个优选变 体中，等于或低于0.25mg DAE-PEG 2000/mg聚合物。在该情况下， DAE-PEG 2000与纳米颗粒连接的量为约90.6微克每mg纳米颗粒。这些 纳米颗粒的特征为球形并且尺寸接近500nm。
在另一个变体中，制备聚乙二醇化的纳米颗粒所用的聚乙二醇具有氨 基基团并且烷基基团中有分枝。已发现，带有这些取代基时倾向于形成毛 刷类型结构，末端之一在纳米颗粒内部，另一末端在外侧。
因此，如果所用的聚乙二醇为O，O’-双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二 醇-聚丙二醇2000(DAP-PEG 2000)，纳米颗粒的特征为球形并且尺寸接近 360nm。在该情况下，DAP-PEG相对于聚合物的量优选等于或低于0.25mg DAP-PEG 2000/mg聚合物，与纳米颗粒结合的量为约67.6微克每mg纳米 颗粒。
对应于上述带有不同类型官能团的基团，一些聚亚烷基二醇的化学结 构举例说明如下：
a)H(OCH2CH2)nOH
b)H3C(OCH2CH2)nOH
c)H2N(CH2CH2O)nCH2CH2NH2
d)H2NCHCH3CH2(OCHCH3CH2)(OCH2CH2)n(OCH2CHCH3)NH2
具体实例为：
a)聚乙二醇400、1000或2000(PEG 400，PEG 1000或PEG 2000)；
b)聚乙二醇甲基醚2000(mPEG 2000)；
c)O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG 2000)；
d)O，O’-双-(2-氨基丙基)-聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇(DAP-PEG 2000)。
由前述可看出(经实施例证实)，聚乙二醇类型的选择使得能随意调节 所产生的系统的特性。不同类型聚乙二醇混合物的使用增添了另外的可变 因素。从实践的观点来看，这对于调整和选择每一活性分子以及每一给药 方法的最适系统是很重要的。
制备生物可降解聚合物聚乙二醇(优选乙烯基甲基醚和马来酸酐 (PVM/MA)共聚物和聚乙二醇)纳米颗粒的方法以例如WO 02/069938中描 述的溶剂置换方法为基础。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇化的纳米颗粒通过两种不同的方法 制备：(i)两种聚合物同时在有机相中孵育(例如PVM/MA和PEG)以及(ii)生 物可降解聚合物纳米颗粒与聚乙二醇的水溶液孵育。这些方法对制备PEG 结合在其表面的PVM/MA纳米颗粒是有效的。由于第一变体(聚合物同时 孵育)提供良好的PEG结合程度，所以其为优选。
第一种方法包括生物可降解聚合物和聚乙二醇在诸如丙酮的有机溶剂 中同时溶解。混合物的孵育在室温下搅拌一定时间进行。生物可降解聚合 物的浓度优选在0.001至10％w/v之间，聚乙二醇或其衍生物的浓度在 0.001至5％w/v之间。
一定体积的与聚合物溶液混溶的极性溶剂，例如乙醇，可任选地添加 至该溶液中。
也可任选使用交联剂，以增强纳米颗粒的稳定性，如WO 02/069 938 中所描述。在交联剂中，可以使用二氨化的分子(如1，3-二氨丙醇)、聚糖或 单糖、蛋白质以及通常的任何具有能与Gantrez酸酐基团反应的官能团的 分子。在本发明的方法中，当加入PEG时，交联不是必需的，因为这同时 发生。如果需要其交联，必须加入非常少量的上述产品。
最后，加入类似体积的第二非溶剂液体，优选水醇溶液。在一个变体 中，使用制药级用水(WFI纯化水，根据应用)。有机相/水醇溶液比例优选 为1/1-1/10。具有乳白色悬浮液外观时纳米颗粒立即在介质中形成。
利用任何适合的方法如减压蒸馏除去有机溶剂，纳米颗粒仍保留在稳 定的水悬浮液中。
用常规方法纯化纳米颗粒，如离心、超离心、切向过滤或蒸发，包括 真空的使用。
最后，如需要长期存储和保存，可将它们冻干。通常的防冷冻剂如蔗 糖或甘露醇可用于促进冻干，其优选浓度在0.1至10％重量比之间。
第二种方法包括在诸如丙酮的有机溶剂中溶解生物可降解聚合物。随 后一定体积的水醇溶液如乙醇和最终类似体积的水加至该溶液中。当具有 乳白色悬浮液外观时纳米颗粒立即在介质中形成。有机溶剂通过如前面所 述的方法(例如减压蒸发)除去，纳米颗粒保留在稳定的水悬浮液中。然后， 纳米颗粒在聚乙二醇的水溶液中孵育。孵育在搅拌下进行一段时间。纳米 颗粒随后经离心纯化并最终使用上述相同方法冻干。
本发明也针对包含所述聚乙二醇化的纳米颗粒和任选的活性分子的药 物组合物。适合的药物制剂为那些本领域技术人员熟知的肠内制剂，优选 口服，肠胃外制剂，如注射剂，以及局部制剂，如眼用制剂。这些制剂应 包含每一种剂型的适合的赋形剂。例如，对片剂或胶囊剂形式的口服剂型 的情况，如需要可包括结合剂、分裂剂、润滑剂、填充剂、肠衣等。口服 制剂是通过常规的混合、干法或湿法造粒以及加入本发明的聚乙二醇化的 纳米颗粒而制备的。
在本发明的一方面，聚乙二醇化的纳米颗粒通过提供到达组织粘膜的 途径给药(包括口服给药、直肠给药、鼻给药、阴道给药和眼部给药)。
当聚乙二醇化的纳米颗粒经肠胃外给药时，它们用于改善所结合的生 物活性分子和/或常规纳米颗粒的分布情况。对于肠胃外制剂的情况，使用 纳米颗粒的无菌悬浮液或冻干产物和重建载体(如生理盐水)。如需要，可 加入赋形剂，如低温储藏试剂、pH调节液和表面活性剂。
所述聚乙二醇化的纳米颗粒及其制剂可用作生物活性分子给药的基本 成分。活性分子可理解为以预防和治疗为目的，对个体给药的任何化合物， 该个体优选人类。当然，该术语也包括大分子化合物，如蛋白质、肽、核 酸等。聚乙二醇化的纳米颗粒用于改善结合的生物活性分子的分布。
在一个变体中，活性分子选自DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸 或多核苷酸。在另一个变体中，活性分子选自蛋白质或肽。
可加入选自抗肿瘤剂或肿瘤的抗原剂、选自中枢神经系统保护剂或糖 皮质激素等的活性分子。或者，活性分子为疫苗接种的抗原或免疫治疗的 变应原。
在本发明的一个变体中，聚乙二醇化的纳米颗粒还用作疫苗接种佐剂。
将药物加入本发明的纳米颗粒中，可如WO 02/069938中所述进行， 即在纳米颗粒形成之前加入至聚合物溶液中，或随后将其加入至已形成的 纳米颗粒的水悬浮液中。例如，根据药物的天然属性，可使用以下方法：
a)疏水性药物：加入至有机相(丙酮)并在搅拌(机械、磁力或超声搅拌) 下与PVMMA和PEG联合孵育/溶解不定的时间段(多至1小时)。
b)亲水性药物：加入至有机相(丙酮)并在搅拌(机械、磁力或超声搅拌) 下与PVMMA和PEG联合孵育一段可变的时间(多至1小时)，直至获得稀 丙酮悬浮液。该方法成功地用于包裹蛋白质模型(卵清蛋白、约44kDa的 蛋白质)。该加入方法为有效的，可以增强蛋白质模型的包裹。
c)亲水性药物：加入至水相中，与预先形成的纳米颗粒孵育(该情况用 于包裹用在实施例中的两种荧光标记物：FITC和RBITC)
下面通过本发明的非限制性和说明性实施例来描述本发明。
实施例
已采用了一些技术用于新纳米颗粒的物理化学表征。纳米颗粒的尺寸 和ζ电位在Zetamaster仪器中测定(Malvern，英国)。纳米颗粒的形状可在 其用磷钨酸处理后，通过电子透射显微镜(Zeiss，德国)观察。
实施例1：
以聚乙二醇2000(PEG-NP)制备聚乙二醇化的纳米颗粒
对两种方法进行测试：
-两种聚合物在有机相中混合
-用PEG包被预先形成的纳米颗粒
制备聚乙二醇化的纳米颗粒的方法的产率通过在方法结束后和在其冻 干后通过测定其重量得到。制备产率以百分数表示，相对于最初的 PVM/MA-共聚物和聚乙二醇的质量计算得到。与纳米颗粒结合的聚乙二醇 的量通过比色法(Labsystems iEMS Reader MF)测定，并且以起始使用量和 在纳米颗粒制备过程中上清液中存在的量之间的差值计算得到。
1.1.有机相中聚乙二醇与乙烯基甲级醚和马来酸酐共聚物的结合
该方法通过PVM/MA和PEG 2000同时在有机相中孵育进行。
为此，将100mg PVM/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然后，PEG 2000加入至该溶液中(10-50mg)。混合物在磁力搅拌下反应1小时。然后， 10ml乙醇和10ml蒸馏水加至该相中。使得到的混合物均匀化5分钟。通 过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去有机溶剂，浓缩形成的纳米颗粒。悬 浮液经过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。收集 上清液用于分析评价，而剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后， 纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
所获得的纳米颗粒具有类似于常规纳米颗粒的球形形状(图1b)。表1 为这些聚乙二醇化的纳米颗粒的特性。PEG 2000与纳米颗粒的结合引起群 体的多分散性增加。观察到随着聚乙二醇(1∶2比例)量的增加，纳米颗粒尺 寸尤其是多分散性变得非常高。对纳米颗粒表面电位的观察显示了聚乙二 醇化的纳米颗粒较低的负值。这些结果表明，纳米颗粒表面上存在聚乙二 醇链。最后必须指出，PEG 2000：PVM/MA的比例低于1∶4w/w时，与纳 米颗粒结合的PEG的量保持恒定并接近50μg/mg。
表1.PEG 2000的量对纳米颗粒物理化学特性的影响。数据表示平均 值±S.D.(n＝3)。 PEG2000 (mg) 尺寸(nm) 多分散性 ζ电位(mV) PEG 2000的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 10 317±5 0.218 -7.8±0.5 44.9±15.8 25 299±22 0.210 -14.6±0.3 55.0±12.0 50 400±35 0.570 -16.3±10.0 128.2±86.6
*结合到纳米颗粒的PEG 2000的量(以μg PEG/mg纳米颗粒表示)，根 据比色法测定。
1.2.聚乙二醇与预先制备的纳米颗粒的结合
将100mg PVM/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然后，在搅拌下 向该溶液中加入10ml乙醇和10ml蒸馏水。使得到的混合物均匀化5分 钟。然后，纳米颗粒悬浮液在减压下蒸发，直至两种溶剂被除去。含水的 纳米悬浮液体积用水调至5ml，并且加入含有10-25mg PEG 2000的5ml 水溶液。纳米颗粒在聚乙二醇相中的孵育在磁力搅拌下进行1小时。悬浮 液通过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上 清液并且将剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最终将纳米颗粒悬浮 液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
与纳米颗粒结合的聚乙二醇的量通过先前指出的比色法测定。通过该 方法测定的结果显示，与纳米颗粒结合的PEG的量比实施例1.1所述的方 法(在有机溶剂中孵育)低很多(图2)。该结果的原因是聚乙二醇对水的高亲 合性，因此聚乙二醇未能与在预先形成的颗粒中来自共聚物水解得到的羧 基基团有效地结合。可得出结论，通过共聚物和聚乙二醇在有机相中同时 孵育来获得聚乙二醇化的纳米颗粒的方法比以PEG简单包被预先形成的 纳米颗粒更有效。
1.3.PEG分子量对聚乙二醇化的纳米颗粒的物理化学特性的影响
如实施例1.1.所述，该方法为PVM/MA与所需的聚乙二醇(PEG 400、 PEG 1000或PEG 2000)同时孵育进行。
为此，将100mg的PMA/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然后， 加入25mg PEG(400、1000或2000)。使混合物在磁力搅拌下反应1小时。 然后将10ml乙醇和10ml蒸馏水加入至该相中。将所得到的混合物均匀 化5分钟。通过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去有机溶剂，浓缩纳米颗 粒悬浮液。悬浮液经离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国) 纯化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将 纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
PEG(400、1000或2000)和mPEG(实施例2)的量通过比色法测定。为 此，将15μl碘溶液(10mg/ml的碘；20mg/ml的碘化钾)加入至纳米颗粒纯 化步骤中获得的1ml上清液中。PEG(或mPEG)和碘之间形成的复合物的 吸收值通过比色法在λ540nm处观察(Sims & Snape，Anal.Biochem.，107 (1980)60-63)。
表2显示PEG分子量对获得的纳米颗粒的物理化学特性的影响。依 据该结果，可得出结论低分子量聚乙二醇不适合这些纳米颗粒的聚乙二醇 化。对于为液体的PEG 400来说，不能获得结合，而对于PEG 1000来说， 结合非常低。这些结果也为颗粒表面电荷的研究所证实。以PEG 400或PEG 1000修饰的纳米颗粒的ζ电位一直比以PEG 2000聚乙二醇化的颗粒的电 位值更负，与未包被的颗粒的电位值相似。可得出结论用PEG 2000进行 聚乙二醇化更有效。
表2.PEG分子量对聚乙二醇化的纳米颗粒的物理化学特性的影响 (PEG/PVM-MA比例＝0.25)。数据表示平均值±S.D.(n＝3)。 纳米颗粒类型 PEG的量μg/纳米颗粒mg 尺寸(nm) ζ电位(mV) 比色法 1H-NMR NP* - - 289±11 -33.5±6.6 PEG 400-NP ND** ND** 241±6 -40.1±1.5 PEG 1000-NP ND** 19.8 271±10 -45.3±5.0 PEG 2000-NP 55.0±12.0 30.2 299±22 -14.6±0.3
*NP-未用PEG处理的纳米颗粒
**ND-未检测到
1通过核磁共振测定与纳米颗粒结合的PEG的量(方法在实施例5中描 述)。
实施例2：
以聚乙二醇基甲基醚2000(mPEG-NP)制备聚乙二醇化的纳米颗粒 该方法通过PVM/MA和mPEG同时在有机相中孵育进行。
为此，将100mg共聚物PVM/MA溶解在5ml有机溶剂(丙酮)中。然 后，一定量mPEG 2000加入至该溶液中(10-50mg)。混合物在磁力搅拌下 反应1小时。然后，将10ml乙醇和10ml蒸馏水加至该相中。使所得到 的混合物均匀化5分钟。有机溶剂通过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去， 浓缩纳米颗粒悬浮液。悬浮液经过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。 最后，将纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
图1(c)显示被mPEG 2000包被的纳米颗粒具有球形形状并且表面看似 光滑。表3显示mPEG 2000与纳米颗粒的结合水平以及其对纳米颗粒的尺 寸、多分散性和表面电荷的影响。结果显示随mPEG 2000起始量的增加， 与纳米颗粒结合的mPEG的百分数略有增加。
mPEG的存在增加了纳米颗粒群体的多分散性，尤其是在高浓度时 (mPEG/PVM-MA比例高于0.25)。另一方面，当所用mPEG增加时，纳 米颗粒的负电荷降低。然而，当使用大量mPEG时观察到相当大的偏差， 这表明mPEG 2000链的表面分布不均一。
表3.mPEG 2000的量对纳米颗粒的物理化学特性的影响。数据表示平 均值±SD (n＝3) mPEG 2000 (mg) 尺寸 (nm) 多分散性 ζ电位 (mV) mPEG 2000的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 10 254±9 0.128 -19.7±7.4 36.1±14.3 25 272±17 0.151 -11.8±2.2 35.5±7.5 50 329±20 0.350 -21.0±10.0 116.8±68.4
*与纳米颗粒结合的mPEG 2000的量(以μg mPEG/mg纳米颗粒表示)， 根据比色法测定。
实施例3：
以O，O’-双-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG-NP)制备聚乙二醇化的 纳米颗粒
该方法通过PVM/MA和DAE-PEG 2000同时在有机相中孵育进行。
为此，一定量的DAE-PEG(5、10、25或35mg)溶解在5ml有机溶剂 (丙酮)中。然后，在磁力搅拌下将100mg PVM/MA加入该溶液中。所得到 的混合物在磁力搅拌下反应1小时。然后，在搅拌下将10ml乙醇和10ml 蒸馏水加至该有机相中。使得到的混合物均匀化5分钟。通过减压蒸发 (Buchi R-144，瑞士)除去有机溶剂，浓缩纳米颗粒悬浮液。悬浮液经离心 (20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上清液并且剩余 物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将纳米颗粒悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
向纳米颗粒纯化步骤中获得的上清液中加入Micro BCATM蛋白质检测 试剂盒(Pierce，U.S.A.)的试剂，以测定DAE-PEG的量和DAP-PEG的量(实 施例4)。该试剂能与这些聚乙二醇的氨基基团相互作用得到有色复合物。 为此，将150μl试剂加至相同体积的上清液中。37℃孵育2小时后，通过 比色法测定λ570nm处的吸收值。
图1(d)显示被DAE-PEG 2000包被的纳米颗粒具有球形形状。表4显 示DAE-PEG 2000的结合水平及其对纳米颗粒尺寸、多分散性和表面电荷 的影响。结果显示，随着DAE-PEG 2000的量(从5至35mg)增加，与纳米 颗粒连接的赋形剂的量也增加。然而，当所用DAE-PEG 2000的量大于25 mg时，不形成纳米颗粒。
分析尺寸时，观察到增加结合程度如何产生具有更大尺寸和更大多分 散性的纳米颗粒。因此，当以25mg DAE-PEG 2000生产DAE-PEG纳米 颗粒时，得到的颗粒尺寸大于500nm并且具有极高的多分散性。另一方面， 观察到，与未被包被的纳米颗粒相比，被包被的纳米颗粒表面负电荷减少。 这些数据表明DAE-PEG 2000链存在于纳米颗粒表面。
表4.DAE-PEG的量对纳米颗粒物理化学特性的影响。数据表示平均 值±S.D.(n＝3)。 DAE-PEG (mg) 尺寸 (nm) 多分散性 ζ电位 (mV) DAE-PEG的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 5 324±14 0.207 -14.0±9.0 27.0±7.0 10 387±23 0.296 -11.9±3.5 71.1±24.0 25 505±88 0.946 -5.5±1.5 90.6±6.0
*与纳米颗粒结合的DAE-PEG 2000的量(以μg DAE-PEG/mg纳米颗粒 表示)，根据比色法测定。
实施例4：
以O，O’-双-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇2000制备聚乙二醇 化的纳米颗粒(DAP-PEG-NP)
该方法通过PVM/MA和DAP-PEG 2000同时在有机相中孵育进行。
为此，一定量的DAP-PEG 2000(10-50mg)溶解在5ml有机溶剂(丙酮) 中。然后，在磁力搅拌下将100mg乙烯基甲基醚和马来酸酐共聚物加入至 该溶液中。使得到的混合物在磁力搅拌下反应1小时。然后，在搅拌下将 10ml乙醇和10ml蒸馏水加至该相中。使得到的混合物均匀化5分钟。有 机溶剂通过减压蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去，浓缩纳米颗粒悬浮液。悬 浮液经过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。除去上 清液，剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将纳米颗粒悬浮液 在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
图1(e)显示被DAP-PEG 2000包被的纳米颗粒具有球形形状并且表面 光滑。表5显示这些纳米颗粒的一般特性。结果表明随DAP-PEG 2000量 的增加，其与纳米颗粒结合的量也增加。然而，当所用DAP-PEG 2000的 量大于35mg时，不形成纳米颗粒。
观察到，增加结合程度产生具有更大尺寸以及更高分散性的纳米颗粒。 ζ电位观测显示，被包被的纳米颗粒所测到的负值显著降低(值接近零)。这 些结果表明DAP-PEG 2000链优选位于纳米颗粒表面。
表5.DAP-PEG的量对纳米颗粒的物理化学特性的影响。数据表示平 均值±S.D.(n＝3)。 DAP-PEG (mg) 尺寸 (nm) 多分散性 ζ电位 (mV) DAP-PEG的量 (μg/mg)* 0 289±11 0.101 -33.5±6.6 - 10 347±7 0.089 -4.1±1.7 ND** 25 361±15 0.169 -2.7±0.8 67.6±17.6 50 512±12 0.372 -6.9±0.7 101.1±11.9
*与纳米颗粒结合的DAP-PEG 2000的量(以μg DAP-PEG/mg纳米颗粒 表示)，根据比色法测定。
**ND-未检测到。
实施例5：
对方法产率以及聚乙二醇化的纳米颗粒结构的研究
图3显示聚乙二醇的类型对PVM/MA转化成纳米颗粒的百分比以及对 本方法的总产率的影响。通常，共聚物转变为纳米颗粒的百分比接近73％。 据观察，当以PEG或mPEG修饰纳米颗粒时，PVM/MA转化成纳米颗粒 的百分比没有显著改变。然而，以DAE-PEG或DAP-PEG使纳米颗粒聚乙 二醇化时使方法的产率降低。
聚乙二醇与纳米颗粒的结合通过元素分析法(Leco CHN-900，U.S.A.) 已证实。根据该技术，当与其它组分(如PEG)结合时，它们可显示氧、氢 或氮组成的改变。
表6包括不同类型的聚乙二醇化的纳米颗粒的C、H、O和N元素组 成。与常规纳米颗粒(NP)相比，所有聚乙二醇化的纳米颗粒显示氢(H)的百 分含量增加和氧含量相对降低。另一方面，DAE-PEG NP和DAP-PEG NP 显示有氮存在，而在未修饰的纳米颗粒中未发现。
表6.聚乙二醇化的纳米颗粒和未修饰的颗粒(NP)之间元素百分含量的 对比。 样品 百分比(％) C H O N NP 51.72 5.24 43.04 - PEG-NP 51.39 5.44 43.17 - mPEG-NP 52.00 5.47 42.53 - DAE-PEG-NP 51.24 5.92 42.69 0.14 DAP-PEG-NP 52.78 5.79 41.10 0.33
聚乙二醇的位置(纳米颗粒的内部或表面)通过核磁共振 (H-NMR)(Bruker 400 UltrashieldTM，德国)分析，该方法为将5mg聚乙二醇 化纳米颗粒溶解在0.5ml的氘化的二甲亚砜后进行分析。以PEG和mPEG 聚乙二醇化的纳米颗粒的图谱在应用6400扫描后获得，而DAE-PEG-NP 和DAP-PEG-NP的图谱在12800扫描后获得。图谱显示聚亚乙基 (polyethylene)单体的典型氢峰(在3.51ppm，-OCH2CH2-)以及羟基基团中的 氢峰(对PEG和mPEG的情况)，或DAE-PEG和DAP-PEG的氨基的氢峰(在 4.58ppm)(图4)。计算在聚乙二醇化的颗粒图谱中和游离聚乙二醇的图谱 中的这两峰面积的比值。该比值可提供聚乙二醇链在聚乙二醇化的纳米颗 粒中的定位信息。
据观察，羟基基团的氢峰(4.58ppm)出现在以PEG 2000聚乙二醇化的 纳米颗粒的图谱中(图5a)。表7显示之前提到PEG-NP和游离PEG的两峰 的面积(在3.51ppm和在4.58ppm)以及它们之间的比值。计算两峰的比值， 纳米颗粒的约是游离PEG 2000的两倍。对于这些纳米颗粒来说，这些数 据意味着羟基基团的比例低两倍，因此可得出结论，大量的这些官能团(其 未出现在图谱中)与共聚物的酸酐基团连接。根据这些观察，一小部分PEG 2000链包含在纳米颗粒的内部，而大部分PEG链排列在其表面。该事实 与表1所示的ζ电位数据相符。
表7显示了涉及m-PEG-NP和游离mPEG的两峰面积的数据。可以看 出，聚乙二醇化的纳米颗粒的两峰之间比例与mPEG 2000的两峰之间比例 类似(177对217)。该结果说明，两种情况(纳米颗粒和游离mPEG)下mPEG 羟基基团比例相似，仅小比例的羟基与共聚物的酸酐基团反应。可得出结 论，这些颗粒的结构不同于PEG-NP的结构。该情况下，更大比例的mPEG 链包含在内部，其仅有一小部分位于纳米颗粒表面。因此，mPEG链的表 面分布为不均一的，这与在这些颗粒的ζ电位分析中看到的较大偏差相一 致(表3)。
表7.利用核磁共振(H-NMR)方法分析PEG 2000以及用PEG 2000聚 乙二醇化的纳米颗粒的图谱 显示 峰面积 峰A 3.51ppm (聚亚乙基单体中的氢) 峰B 4.58ppm (羟基氢) 比例 A/B PEG 2000 PEG-NP 75.35×109 2.03×109 73.65×107 1.11×107 102.3 183.3 mPEG mPEG-NP 46.00×109 2.30×109 26.01×107 1.06×107 176.8 217.0
表8显示涉及DAP-PEG-NP和游离DAP-PEG 2000的峰面积的数据。 在DAP-PEG 2000的图谱中，有两个对应于位于链末端的两种不同氨基基 团的氢的信号：一双重峰在δ＝4.55ppm，另一个在δ＝4.45ppm(图6b)。 在以DAP-PEG 2000聚乙二醇化的纳米颗粒的图谱中看到，没有这些氨基 基团的氢(图6a)，这表明该类型聚乙二醇的所有氨基基团与聚合物酸酐基 团反应形成纳米颗粒。而且，DAP-PEG链以两末端氨基基团与纳米颗粒表 面连接并且表面完全包被。该结果得到这些颗粒的ζ电位值(接近0)的支持 (表5)。
表8.利用核磁共振(H-NMR)方法分析DAP-PEG 2000和聚乙二醇化 的纳米颗粒(DAP-PEG-NP)的图谱。 显示 峰面积 峰A 3.51ppm (聚亚乙基单体的氢) 峰B 4.55ppm (氨基的氢) 峰C 4.45ppm (氨基的氢) DAP-PEG 115.14×109 9.83×106 21.46×106 DAP-PEG-NP 9.81×109 - -
对于DAE-PEG 2000，由于在4.58ppm峰的低强度以及低分辨率(与浓 度和扫描数无关)(图7b)，所以不可能同样计算两峰之间的比例。任何情况 下，可看到该峰出现在纳米颗粒图谱上，也出现在DAE-PEG 2000的图谱 上。因此，可得出结论，一部分DAE-PEG链包含在颗粒内部。然而，其 大多数位于表面，仅在该聚乙二醇链的末端连接。
根据这些数据，可得出聚乙二醇化的纳米颗粒具有不同的结构的结论。 对不同剂型所主张的结构显示于图8。某些聚乙二醇，如PEG 2000、 DAE-PEG和DAP-PEG，修饰成形的纳米颗粒表面。对于PEG-NP和 DAE-PEG-NP的情况，包被产生“毛刷”形结构(图8a和c)，而对于DAP-PEG 的情况，在其链的两末端连接，产生“环”形结构(图8d)。只有当使用mPEG 2000时，未观察到纳米颗粒表面的修饰情况。发现大部分mPEG在纳米颗 粒内部(图8b)。
实施例6：
聚乙二醇化的纳米颗粒在大鼠胃肠道的生物附着性研究
根据符合欧洲动物实验法(86/609/EU)的Navarra大学伦理委员会规章 进行该项研究。
该测定中所用的聚乙二醇化的纳米颗粒被若丹明B异硫氰酸酯荧光标 记。为此，利用PVM/MA和不同类型的聚乙二醇同时孵育形成纳米颗粒(根 据实施例1.1、2、3和4中的方法)。然后，在搅拌下将10ml乙醇和10ml 蒸馏水加入至该相中。使得到的混合物均匀化5分钟。有机溶剂提供减压 蒸发(Buchi R-144，瑞士)除去，浓缩纳米颗粒悬浮液。纳米水悬浮液体积 用蒸馏水调至9ml并加入1ml若丹明B异硫氰酸酯水溶液(1.25mg/ml)。 纳米颗粒与荧光标记物的孵育在搅拌下进行5分钟。然后，荧光修饰的纳 米颗粒悬浮液通过离心(20分钟，17000rpm，两次)(Sigma 3K30，德国)纯化。 除去上清液，剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重悬浮。最后，将纳米颗粒 悬浮液在Genesis 12EL设备(Virtis，USA)中冷冻并冻干。
表9包括用在该测定中的以若丹明B异硫氰酸酯荧光标记的制剂的特 性。
表9.在生物附着性研究中考虑的纳米颗粒的物理化学特性。平均值± SD(n＝3)。 样品 尺寸(nm) ζ电位 (mV) 聚乙二醇 (μg/mg)* 若丹明 (μg/mg)** NP 289±11 -33.5±6.6 - 10.33±0.87 PEG-NP 299±22 -14.6±0.3 55.0±12.0 10.37±0.09 mPEG-NP 272±17 -11.8±2.2 35.5±7.5 10.46±0.11 DAE-PEG-NP 505±88 -5.5±1.5 90.6±6.0 10.04±0.62 DAP-PEG-NP 361±15 -2.7±0.8 67.6±17.6 8.74±0.75
*与纳米颗粒结合的聚乙二醇的量(μg PEG/mg纳米颗粒)。
**通过比色法在540nm测定的与纳米颗粒连接的若丹明B异硫氰酸 酯的量(以μg/mg纳米颗粒表示)。
获得的纳米颗粒(10mg)分散在1ml水中后，对雄性大鼠(Wistar型， 重220.0g)口服给药。口服给药后，动物在不同时间通过颈脱位法处死：0.5、 1、3和8小时。打开腹腔并取出胃肠道。各区段划分为以下解剖部分：胃、 小肠和盲肠。各段沿肠系膜纵向切开并用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4；0.15M) 清洗，除去未附着的纳米颗粒部分。此外，各段切成2cm长的部分并用1 ml 3M氢氧化钠消化24小时(Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002) 129-136)。然后以2ml甲醇取出若丹明，并且样品4000rpm离心10分钟。 上清液(1ml)用3ml水稀释，并利用λex＝540nm和λem＝580nm的荧光光 谱(GENios，澳大利亚)测定。根据该方法可评估附着在粘膜上的纳米颗粒 部分。
聚乙二醇化的纳米颗粒在胃肠道不同部分的特异性分布见图9。所有 制剂显示在胃粘膜上最初附着显著。给药30分钟后，附着在该器官的剂量 的百分比在PEG-NP的13％和DAP-PEG-NP的9％之间。所有聚乙二醇化 的纳米颗粒剂型也显示对小肠I3部分的某种亲合性；然而，在给药后3小 时，PEG-NP和DAE-PEG-NP显示为最有效的制剂，维持附着在小肠的量， 接近剂量的20％。最后，给药后8小时，发现附着的纳米颗粒的峰值在小 肠的最后部分(对于PEG-NP)或在盲肠(对于mPEG和DAP-PEG-NP)。对于 PEG-NP和DAP-PEG-NP来说，仍可定量相对大部分(接近10％)的附着在 粘膜上的纳米颗粒。结论是，可断言以PEG 2000和mPEG 2000包被的纳 米颗粒显示非常均一的分布，并且8小时内遍布在消化道的所有部分(图9 a和b)。以DAE-PEG聚乙二醇化的纳米颗粒优选附着在小肠中间部分(图 9c)，而以DAP-PEG 2000修饰的纳米颗粒主要积聚在小肠消化道末端区域 (图9d)。这些结果意味着本发明开发的纳米颗粒可提供特异性药物释放。
生物附着性参数(Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002)129-136)：各制 剂的附着曲线是通过表示在大鼠胃肠粘膜中附着的聚乙二醇化的纳米颗粒 部分随时间的变化而获得。以下生物附着参数由该曲线计算：AUCadh、kadh 和MRTadh。kadh表示附着部分的清除率，并用WinNonlin程序1.5版 (Scientific Consulting，Inc.)辅助计算。表示随时间变化的附着部分的AUCadh 或曲线下面积(以相对于时间的附着标记物的量的形式表示)可通过至 tz(最后的取样点)的梯形法(trapezoid method)计算，并能够定量生物附着现 象的强度。最后，MRTadh指纳米颗粒的附着部分的平均保留时间，并且使 用最后样品点作为界线，其能够评估附着作用的相对持续时间。
图10显示聚乙二醇化的纳米颗粒在整个胃肠道8小时的生物附着曲 线。所有聚乙二醇化的纳米颗粒显示的生物附着曲线与未修饰的颗粒(NP) 的曲线不同。NP的最大生物附着发生在其口服给药30分钟后，并且随后 迅速降低。相反，聚乙二醇化的纳米颗粒通常具有较低的产生生物附着作 用的初始能力。然而，该附着能力保持至少3小时。因此给药3小时后， 附着于胃肠粘膜的纳米颗粒的量的范围在PEG-NP给药剂量的25％和 DAP-PEG-NP给药剂量的16％之间，所有情况均高于对照(NP)。另一方面， 获得的PEG-NP的曲线尤其令人感兴趣。这些纳米颗粒在其给药后1小时 显示最大附着(约剂量的32％)，并且给药3小时后，颗粒附着于粘膜的水 平与最初水平类似。对于其它聚乙二醇化的纳米颗粒，其初始附着保持至 少3小时。
生物附着参数可提供关于纳米颗粒附着特性的更多细节(表10)。如前 所述，聚乙二醇化的纳米颗粒与粘膜作用的初始能力(Qmax)比未包被的颗粒 (NP)低。然而，聚乙二醇化的纳米颗粒的曲线下生物附着面积(AUCadh)更 高；这意味着附着强度更大。该现象尤其在PEG-NP的情况中观察到，其 中AUCadh是NP的1.6倍。而且，与未包被的颗粒相比，所有聚乙二醇化 的纳米颗粒制剂具有更低的附着部分清除程度(kadh)以及更长保留时间 (MRTadh)。因此，DAP-PEG-NP显示比常规颗粒更慢的附着部分清除，表 明这些纳米颗粒维持长时间的生物附着的可能性。据观察，所有聚乙二醇 化的纳米颗粒在胃肠道中显示长保留时间(MRTadh)。关于附着部分的平均 保留时间(MRTadh)，尤其令人关注的是所有聚乙二醇化的纳米颗粒显示保 留时间比NP显著延长。因此，这些纳米颗粒显示保留时间比常规颗粒保 留时间延长17至48分钟。
图10.根据聚乙二醇化的纳米颗粒在整个胃肠道随时间的分布计算的 生物附着参数。 纳米颗粒 AUCadh(mg h) MRT(h) kadh(h-1) Qmax.(mg) NP 11.83±2.0 2.77 0.21±0.01 3.64±0.34 PEG-NP 16.19±2.29 3.11 0.17±0.01 3.16±0.57 mPEG-NP 12.91±6.84 3.10 0.16±0.05 2.55±1.17 DAE-PEG-NP 13.49±1.76 3.05 0.17±0.02 2.51±0.50 DAP-PEG-NP 10.90±5.04 3.57 0.14±0.10 2.05±0.47
实施例7：
观察在胃肠粘膜中的聚乙二醇化的纳米颗粒
利用荧光和光学显微镜观察在胃肠粘膜中的聚乙二醇化的纳米颗粒。 为此，聚乙二醇化的纳米颗粒用诸如若丹明B异硫氰酸酯(RBITC)和荧光 素异硫氰酸酯(FITC)的荧光分子标记。大鼠口服给药后，收集肠的不同部 分并用磷酸盐缓冲液洗涤(pH＝7.4；0.15M)，如上所述。
第一种情况，肠段(包含RBITC标记的纳米颗粒)固定在Tissue-Tek O.C.T.介质(Sakura，荷兰)中，并通过干冰和2-甲基丁烷冷冻。然后，在 低温下(-22℃)在低温恒温器(Leica，德国)中将肠段切成5μm的切片。获得 的切片放置在包被有聚-L-赖氨酸(Sigma，西班牙)的载波片上，并在荧光显 微镜(Olympus CH-40，日本)下观察。
另一方面，将肠段(含有FITC标记的纳米颗粒)在福尔马林溶液(4％) 中固定24小时。固定后，组织包埋在石蜡中并切成3μm的切片。将这些 切片放在包被有Vectabond(Vector Labs，U.S.A.)的载波片上。然后，使获 得的切片去石蜡、再水合并通过加入过氧化氢溶液(3％)10分钟阻断内源性 过氧化物酶。然后，用蒸馏水洗涤支持物(5分钟)，放入柠檬酸盐缓冲液(pH ＝6.0；0.01M)中，微波炉加热(最大火力15分钟和最小火力15分钟)，用 水洗，最后用Tris缓冲盐水(TBS)(pH＝7.36；NaCl 0.5M；0.05M)洗涤。为 了防止非特异性标记，切片用正常的山羊血清(1∶20，DAKO，U.S.A.)室温 孵育30分钟，然后与特异性抗-血清(1∶100单克隆抗-FITC，M0878，DAKO， U.S.A.)4℃孵育24小时。用Tris缓冲盐水(TBS)洗涤后，将样品与山羊抗- 小鼠Ig二抗孵育(室温，30分钟)，该二抗偶联到标记有过氧化物酶的右旋 糖苷。样品用TBS缓冲液洗涤，通过二氨基联苯胺显示过氧化物酶活性。 该切片以苏木精形成弱反差、脱水并置于DPX。最后，样品在光学显微镜 (Nicon Eclipse E 800M，日本)下观察。
图11显示小肠上皮细胞中存在PEG-NP。颗粒通常位于细胞的顶部区 域(图11a)，但也可观察到某些部分渗透进肠上皮细胞间(图11b)。
纳米颗粒在肠上皮细胞中的强烈渗透可用光学显微镜观察(图12)。用 荧光显微镜，观察在细胞顶部区域的分布。另一方面，图12b也显示在基 底侧区域的分布。观察到某些细胞核含有标记物或标记的纳米颗粒，这使 得可推测使用该纳米颗粒可促进不同生物活性分子向细胞核的递送。
最后，图13显示这些系统在派尔结细胞中的分布。尤其令人感兴趣的 是，观察到这些纳米颗粒似乎集中在被认为是派尔结的“圆顶(dome)”的区 域。该圆顶的特征在于其为单核巨噬细胞细胞聚集的区域。可以推断这些 聚乙二醇化的纳米颗粒在开发口服疫苗和在免疫治疗中的意义。
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