技术领域

【0003】本申请涉及H-NOX蛋白和应用它们输送一氧化氮(NO)的方法。 H-NOX蛋白提供了一个新的治疗工具，用于将NO输送到人，并且，用于兽医的 目的，将NO输送到动物。

发明背景

【0004】NO在体内许多重要的过程的控制中充当化学信使，所述重要过程 包括血管舒张、神经传递、炎症、血小板凝集、以及胃肠和血管平滑肌紧张的调 节。由于Lauder Brunton和William Murrell在1867年发现了硝酸甘油(GTN)能 够治疗心脏病病症如心绞痛，有机硝酸盐已经被广泛地用于治疗急性血管收缩病 例。在最近几十年内，血管舒张的机理已经被阐明。NO，其在内皮细胞中合成， 扩散到平滑肌细胞并且激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)以产生环GMP，并且因 此诱导血管舒张。然后，有机硝酸盐作用的临床机理被认为是需要它们生物转化 为NO并且随后激活sGC。然而，由于被称为耐受的现象，有机硝酸盐在24-48小 时后在患者中失效。因而，对于慢性高血压病例的治疗，化合物如β-阻断剂和ACE 抑制剂被使用，虽然它们也具有局限性和副作用。因此，硝基血管扩张剂 (nitrovasodilator)在治疗急性情况中最有用，在所述急性情况中需要迅速的血管 舒张以减轻症状如心绞痛和心肌梗塞。有机硝酸盐的延长给药导致降低的效力， 并且脉管系统变得不反应；这种耐受阻止它们在慢性和急性病例中的进一步应用。 因而，对于急性治疗，采用非连续的硝基血管扩张剂应用，具有有限的效果。对 于慢性血管收缩病例，其它的治疗途径被使用，典型地使用有机硝酸盐和NO不 依赖的血压药剂的混合用药法，成败参半。

【0005】关于耐受机理的两个主要竞争性理论平行进行，以探求导致NO释 放的硝酸盐的生物转化的机理。因为NO被认为是有机硝酸盐的血管扩张效应的 介质，所以从有机硝酸盐释放NO的机理可能受到抑制，导致耐受。但是有机硝 酸盐如何在组织中进行新陈代谢地释放NO尚未被理解。而且，基于机理的耐受 理论是有问题的，因为耐受也降低了内源性NO和外源性NO气体在介导血管舒张 中的效力。因此，有机硝酸盐的生物转化机理显得不同于耐受的原因。竞争性理 论在于对于来自有机硝酸盐的NO的反应在靶组织中受到抑制，可能是因为NO的 产生和该反应的副产品最终抑制了对NO的反应，或因为NO通路的急性激活具有 使其对于进一步的刺激脱敏的反馈机制。此理论被称为终末器官耐受(end-organ tolerance)。最近，统一的理论被提出，其包括有机硝酸盐生物转化的方面以及终 末器官对于NO的脱敏。实质上，有机硝酸盐的生物转化表现为导致组织中较高 水平的过氧化物(O2-)。过氧化物以扩散速度与NO反应，产生过硝酸盐(OONO)。 该反应主要俘获并破坏基础NO，阻止其活化sGC。降低的NO水平导致血管收缩， 并且OONO-是损伤组织的强有力的氧化剂。用有机硝酸盐如GTN的延长治疗可能 导致患者高血压和组织损伤，而这可以用共同施用抗氧化剂如抗坏血酸盐来缓和。 因此，用于将NO输送到器官和组织以减轻血管收缩的改善的治疗剂是主要的治 疗目标。

【0006】已经对应用基于血红蛋白的载体输送NO进行了一些研究。然而， 由于在O2的存在下它们与NO的反应性——其导致基于血红蛋白的载体的失活， 因此基于血红蛋白的载体受到限制。NO直接与结合到血红蛋白的O2反应，以形 成高铁血红蛋白和硝酸盐。血红素铁和NO被结合的氧原子氧化，并且该反应发 生地非常迅速，以致没有观测到NO置换O2(参见，如美国专利第6,455,676号)。

【0007】由于NO被持续产生和消耗，在体内存在NO的自然周转。当无细 胞的血红蛋白被施用时，NO产生和消耗之间的平衡被与无细胞的血红蛋白的反应 所改变。NO和结合到血红蛋白的O2之间的氧化反应是不可逆的，这导致了NO、 O2和血红蛋白的破坏。NO结合到没有O2结合的血红蛋白在生理时标上实际上是 不可逆的，因为亚硝酰基血红蛋白的解离的半衰期(half-life)是5-6小时，因而 有效地使作为无细胞的NO载体的血红蛋白失活。一旦NO分子与血红蛋白反应， 其被从信号分子库中除去，因而引起某些不利情形。例如，NO结合到血红蛋白(有 或没有结合的O2)可以防止血管舒张并潜在地导致高血压，其有时在施用某些细 胞外血红蛋白溶液之后被观测到。

【0008】还需要NO以介导某些炎症反应。例如，由内皮产生的NO抑制血 小板凝集。因此，在NO被无细胞的血红蛋白(具有或没有O2结合)结合时，血 小板凝集可能增加。在血小板凝集时，它们释放有效的血管收缩化合物如血栓烷 A2和5-羟色胺。这些化合物可以与由血红蛋白的清除引起的降低的NO水平协同 起作用，以产生显著的血管收缩。除了抑制血小板凝集，NO还抑制中性粒细胞附 着到细胞壁，其反过来能够导致细胞壁损坏。内皮细胞壁损坏在用某些血红蛋白 溶液输注时被观察到。由于从血浆中除去无细胞的血红蛋白的血红蛋白受体的存 在，基于血红蛋白的NO载体也被来自血浆的无细胞的血红蛋白的快速清除所阻 碍。无细胞的血红蛋白还可以引起肾毒性，可能是由于肾小球中NO的耗尽，引 起缢痕(或缩窄)和随后的机能障碍。

【0009】由于目前的硝基血管扩张剂治疗的局限性，对于输送NO的另外的 或可选的治疗仍然具有重大的意义和需要。特别是，需要产生较小耐受的NO载 体。此外，在O2存在下具有低的NO钝化速率的NO载体是期望的，如具有低NO 反应性和/或对O2的低亲和力的NO载体。具有适合用于特定的临床或工业应用的 NO解离常数或NO解离速率的NO载体也是需要的。

发明简述

【0010】本发明部分地基于这样令人惊奇的发现——野生型和突变H-NOX 蛋白具有比血红蛋白低的多的NO反应性，并且因此是令人满意的NO载体。如果 需要，突变可以被引入到H-NOX蛋白中，以改变它们的NO和O2配体的结合， 以进一步使优化作为NO载体的H-NOX蛋白的应用。在一些实施方式中，作为 NO载体的H-NOX蛋白的应用比目前的血管扩张剂——如有机硝酸盐——的应 用，产生更小的耐受。

【0011】在一方面，本发明以突变H-NOX蛋白为特征。因此，在一些实施 方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其包括至少一个突变，与相应的野生型 H-NOX蛋白相比，所述突变改变NO解离常数或NO反应性。在一些实施方式中， 突变H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常数的2个数量级之内， 并且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白NO反应性低至少10倍。在一些 实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白NO反应性低至少100倍， 如比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋 白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，如在37℃大约 1×10-4s-1至大约0.012s-1或大约1×10-4s-1至大约1×10-3s-1。在一些实施方式中，突 变H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，如在37℃至少大约10μM 或至少大约50μM。

【0012】在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其包括至少 一个突变，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对NO的koff、k1或 k2或改变O2解离常数。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对NO的koff、k1 或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且突变H-NOX蛋白的O2解离 常数在37℃为至少大约1μM。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对NO的 koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约0.012s-1之间或大约1×10-4s-1至大约 1×10-3s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至 少大约10μM，如至少大约50μM。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO 反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍，如比血红蛋白的NO反应性低至少 100倍或比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。

【0013】在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其选自腾冲 嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌N-NOX I5L、腾冲嗜 热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、腾冲嗜 热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌 I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌 L144F、L2 F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOX(728-899)、脱 硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOXY139L、β1(1-385)、β1(1-385)I145Y、β1(1-385) I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217) I142Y、肉毒梭菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭菌(C.botulinum) H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭 菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-183)、以及秀丽隐杆线虫(C.elegans)H-NOX GCY-35(1-252)。在一些实施方式中，β1或β2蛋白源自褐鼠(R.norvegicus)或智 人(H.sapiens)β1或β2蛋白。

【0014】在一些实施方式中，本发明提供分离的H-NOX蛋白，其选自腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾 冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺 军团菌(L.pneumophilia)2F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱 硫弧菌H-NOX Y139L、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194) L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌 H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、以 及秀丽隐杆线虫H-NOX GCY-35(1-252)。在一些实施方式中，β1或β2蛋白源自褐 鼠(R.norvegicus)或智人(H.sapiens)β1或β2蛋白。

【0015】在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离 常数在血红蛋白的NO解离常数的0.1至10倍之间，如在血红蛋白的NO解离常 数的0.5至2倍之间。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的 NO解离常数在智人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，如在智人血红 蛋白α的NO解离常数0.1至10倍之间或在0.5至2倍之间的NO解离常数。在分 离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α 的NO反应性低至少10倍，如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1000 倍。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃ 为大约700s-1以下，如在20℃为大约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、 100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、 1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1以下。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方 式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，如37℃为至少大约 10μM或至少大约50μM。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白 的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白 的O2解离常数在37℃为至少大约1μM。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中， H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且 H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如在20℃，为大约600s-1、 500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中， H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，并且H-NOX蛋白的NO反 应性在20℃为大约700s-1以下(如在20℃，为大约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1 或1.8s-1以下)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素 自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中， H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且 H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在分离的H-NOX蛋白 的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，并且 H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下。在分离的H-NOX蛋白 的一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1以下， 并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如在20℃，为600s-1、 500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。

【0016】在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，与从其衍生的H-NOX蛋 白相比，H-NOX蛋白包含一个或多个突变(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 或10个突变)。在不同的实施方式中，与从其衍生的H-NOX蛋白相比，H-NOX 蛋白包含少于20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个突变。在一些实施 方式中，H-NOX蛋白具有至少一个不在远侧袋中的突变。在一些实施方式中， H-NOX蛋白具有至少一个突变，其中对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的酪氨酸140 (Tyr140)或嗜肺军团菌2的苯丙氨酸142(Phe142)的残基被任何其它氨基酸置 换。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少两个突变，其中至少一个突变是相 应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的酪氨酸140(Tyr140)或嗜肺军团菌2的苯丙氨酸 142(Phe142)的残基被任何其它的氨基酸置换。在一些实施方式中，H-NOX蛋 白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的Y140F突变或Y140L突变或嗜肺军团菌2的 F142Y突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，与相应的野生型蛋白质相 比，H-NOX蛋白中的至少一个C末端氨基酸(如至少大约50个连续的C-末端氨 基酸或在大约25至大约200个连续的C-末端氨基酸之间)被除去。在一些实施方 式中，H-NOX蛋白是包含H-NOX蛋白——如褐鼠或智人β1或β2蛋白——的前 194、217或385个氨基酸的缺失。

【0017】在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白来源于哺乳 动物蛋白(如，人蛋白如β1)。在分离的H-NOX蛋白的各种实施方式中，H-NOX 蛋白来源于细菌蛋白(如，腾冲嗜热厌氧菌蛋白)。在分离的H-NOX蛋白的一些 实施方式中，H-NOX蛋白共价结合到另一分子或部分，如聚乙二醇。血红素可以 结合或可以不结合到H-NOX蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，NO 被结合到H-NOX蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白是 融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白蛋白(如人血清白蛋白)的部 分或全部。

【0018】在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或 嗜肺军团菌2H-NOX F142Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX 蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在分离的H-NOX蛋白的一些实施 方式中，H-NOX蛋白不是野生型嗜肺军团菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、 褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35 H-NOX、野生型点形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄杆菌(C. crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇 梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中， H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、 褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在分离的H-NOX 蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠 β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中， H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、 或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX 蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1 I145Y。在分 离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、 智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX (1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐 鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOXI145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野 生型脱硫脱硫弧菌β1 H-NOX、野生型脱硫脱硫弧菌CG14885-PA H-NOX、野生型 秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌(C. crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇 梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中， H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一种，所述下列H-NOX蛋白以它们的基 因名称列出，之后是它们的种缩写和Genebank标识符(如从2006年5月21日； 2006年5月22日；2007年5月21日；或2007年5月22日起可获得的下列蛋白 序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、 SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、 CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、 Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、 CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、 GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、 Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2， gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352， gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904 (gi：71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或 GYCα-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMG Genomics4：5-13)。在这些名称中使用的种缩写包括：Ana-鱼腥藻 某种(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇 梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcus sp.)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌 (Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜 热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)； Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX 蛋白的任何一种，所述下列H-NOX蛋白以它们的生物体名称和Pfam数据库登录 号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5 月21日起可获得的下列蛋白序列)列出：线虫种(Caenorhabditis briggsae) Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种 Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种 Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、 秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫 GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、 弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus) Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、 黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis) Q4S6K5_TETNG、红鳍东方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人(Homo sapiens)GCYB2_HUMAN、智人(Homo sapiens)GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩 (Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、 白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus) Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus) Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus) Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus) Q80WX7_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX8_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q920Q1_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q54A43_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WY0_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WY4_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q8CH85_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WY5_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)GCYB1_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q8CH90_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q91XJ7_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX9_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)GCYB2_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)GCYA2_RAT、狗(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa) Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾 (Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾(Manduca sexta)O76340_MANSE、 蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂(Apis mellifera)Q5FAN0_APIME、 蜜蜂(Apis mellifera)Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9A_NOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、 冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊 (Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)GCYH_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) GCY8E_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)GCYDA_DROME、黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)GCYDB_DROME、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗 果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q296C7_DROPS、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q296C8_DROPS、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura) Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆 (Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻某种(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄 杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium) HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium) HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus) Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、浑 球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、 Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、 Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila) Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺 军团菌(Legionella pneumophila)Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一种嗜冷细菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、 Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulniftcus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔 弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q7MJS8_VIBVY、 发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种(Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、 脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis) Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、 Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌 (Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌(Clostridium beijerincki)NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在分离的H-NOX蛋白的一些实施 方式中，H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX蛋白 的Tyr135、Ser137、和Arg139。

【0019】在一方面，本发明以编码本文描述的突变H-NOX蛋白的任何一个 或多个的重组核酸为特征。在具体的实施方式中，所述核酸包括在图2-4D或 8A-8DD中示出的核酸的任一个的片段或完整核酸序列。在一些实施方式中，所述 核酸编码包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或 全部的融合蛋白。在一些实施方式中，所述核酸包括来自H-NOX核酸的至少大约 下列任何个数的连续核苷酸：50、100、150、200、300、400、500、600、700、 800或更多个，并且与其来源的H-NOX核酸相比，包含一个或多个突变(如，1、 2、3、4、5、6、7、8、9、或10个突变)。在各种实施方式中，与其来源的H-NOX 核酸相比，突变H-NOX核酸包含少于大约下列任一个数的突变：20、15、12、10、 9、8、7、6、5、4、3、或2个。本发明也以编码突变H-NOX蛋白的任一核酸的 简并变体为特征。

【0020】仍在另一方面，本发明提供载体，其包括本文描述的突变H-NOX 核酸的任一个或多个。在另一方面，本发明以包括本文描述的突变H-NOX核酸的 任一个或多个的细胞为特征。在一方面，本发明以包括本文描述的任何载体的细 胞为特征。

【0021】在一方面，本发明以产生H-NOX蛋白的方法为特征。该方法包括 在适合产生突变H-NOX蛋白的条件下培养细胞，所述细胞具有编码本文描述的突 变H-NOX蛋白的任一种或多种的核酸。在一些实施方式中，本发明进一步包括纯 化突变H-NOX蛋白的步骤。

【0022】在一方面，本发明的特征在于包括一种或多种H-NOX蛋白——如 本文描述的野生型或突变H-NOX蛋白的任一种——的药物组合物。在一些实施方 式中，所述药物组合物包括药学上可接受量的本文描述的H-NOX蛋白和药学上可 接受的载体。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO koff、k1或k2在37℃为大 约1x 10-4s-1至大约10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约 1μM。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO解离常 数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低 至少10倍。

【0023】在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在智 人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，如在智人血红蛋白α的NO解 离常数的0.1至10倍之间或在0.5至2倍之间的NO解离常数。在药物组合物的 一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性被智人血红蛋白α的NO反应性低至 少10倍，如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1,000倍。在药物组 合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白质。在药物组合物的一些实施 方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突变蛋白。在药物组合物的各种实施方式中， H-NOX蛋白具有至少一个突变，所述突变与相应的野生型蛋白相比，改变了NO 解离常数、对NO的koff、对NO的k1、对NO的k2、O2解离常数、NO稳定性、 NO反应性、血红素的自氧化速率、或前述的两种或多种的任何组合。在药物组合 物的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis) H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌 氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜嗜热杆菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、 腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、 野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、嗜肺军团菌2 F9W-F142Y、野生型脱硫脱硫弧菌H-NOX、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱 硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I140Y、智人β1 I145Y、 智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智 人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217) I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C78S、 智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385) I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194) L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOX H105G、褐 鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOX C78E、肉 毒梭状芽胞杆菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭状芽胞杆菌H-NOX(1-186)、 野生型丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)H-NOX、丙酮丁醇梭杆菌 H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭杆菌H-NOX(1-183)、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35 H-NOX、秀丽隐杆线虫H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蝇(D.melangaster) β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA、野生型黑腹果蝇CG14886、野生型黑 腹果蝇CG4154、野生型点形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄杆菌 (C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX、野生型小鼠 H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黄牛(B.Taurus)H-NOX、野生型褐鼠； 野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉(O.latipes)H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、 野生型红鳍东方鲀(F.rubripes)H-NOX、野生型冈比亚按蚊H-NOX、野生型烟 草天蛾(M.sexta)H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫gcy-31、秀丽隐杆线虫gcy-32、 野生型秀丽隐杆线虫gcy-33、野生型秀丽隐杆线虫gcy-34、野生型秀丽隐杆线虫 gcy-35、野生型秀丽隐杆线虫gcy-36、野生型秀丽隐杆线虫gcy-37；野生型霍乱弧 菌(V.cholera)H-NOX、野生型费氏弧菌(V.fischerii)H-NOX、和野生型点形 念珠藻H-NOX。在药物组合物的具体实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型褐鼠 sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型腾冲嗜热厌 氧菌H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、 野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、以及嗜肺军团菌2 H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多 种脂质体或纳米粒子，所述脂质体或纳米粒子包括或包封所述H-NOX蛋白。

【0024】在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热 厌氧菌H-NOX Y40L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺 军团菌2H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不 是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在药物组合物的一些实施方式中，所述 H-NOX蛋白不是野生型嗜肺军团菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇β1 H-NOX、野生型 黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点 形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生 型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白 不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在药物组合物的一些实施方式中， 所述H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠 β1(1-385)I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜 热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、或智人β1 H-NOX(1-385) I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1 I145Y。在药物组合物的一些实施方式 中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野 生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2 H-NOX、智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野 生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆 菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在药物 组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一种，所 述下列H-NOX蛋白以它们的基因名称列出，随后是它们的种名缩写和Genbank标 识符(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日或2007年5 月22日起可获得的下列蛋白质序列)：Npun5905_Npu_23129606、 alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、 VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、 Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、 CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、 Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、 gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、 gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904 (gi：71985505)、GCY1β3_Hs_20535603、GCY1β2-Hs_899477、或 GYCα-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMG Genomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种缩写包括Ana-鱼腥藻 某种(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇 梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌 (Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜 热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)； Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX 蛋白的任一种，所述下列H-NOX蛋白被以它们的生物体名称和Pfam数据库登录 号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月 21；或2007年5月22日起可获得的下列蛋白序列)列出：线虫种Q622M5_CAEBR、 线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、 线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、 秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫 GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、 秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、 青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚 (Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis) Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东 方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、 智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人 GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、 红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes) Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠 Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐 鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、 褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、 褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus) GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus) Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾 O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、 蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、 冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊 (Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、 黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇 GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇 Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica) Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻某种(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、 Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌(HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides) Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、 Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军 团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、 嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种 (Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜 肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一种嗜冷细菌) Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、 Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1__VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、 创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种 (Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp) RED65 Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌 (Halothermothrix orenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkdliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以 及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在药物组合物的一些实施方 式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的 Tyr135、Ser137和Arg139。

【0025】除非另外明确指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突变 H-NOX蛋白可以被用于本文描述的药物组合物的任何一种。H-NOX蛋白可以具 有或不具有血红素和/或结合的NO并且可以共价结合或可以不共价结合到另一个 分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括 H-NOX结构域和另一蛋白质——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或 全部。

【0026】在一方面，本发明提供使用H-NOX蛋白将NO输送到个体(例如， 哺乳动物，如灵长类(例如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科 动物或猫科动物)的方法。在一些实施方式中，所述个体遭受心血管病症、高血 压、由高血压加剧的病症、血管收缩性病症、中风、或功能性NO缺乏或处于心 血管病症、高血压、由高血压加剧的病症、血管收缩性病症、中风、或功能性NO 缺乏的风险。在具体的实施方式中，由高血压加剧的病症是心力衰竭、肾功能衰 竭或中风。

【0027】因此，在一些实施方式中，本发明提供向个体(如，人)输送NO 的方法，该方法通过用足以将有效量的NO输送到所述个体的量对需要其的个体 施用H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在 37℃为大约1×10-4s-1至大约10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至 少大约1μM。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的NO 解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反 应性低至少10倍。

【0028】在所述方法的一些实施方式中，在H-NOX蛋白施用到所述个体之 前，NO结合到H-NOX蛋白。在所述方法的一些实施方式中，在将H-NOX蛋白 施用到所述个体之前，NO不结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将NO从个 体中一个位置输送到个体中另一位置。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX 蛋白被经口施用、直肠施用、或被施用到个体的血液中。在所述方法的具体的实 施方式中，所述H-NOX蛋白被施用到个体的血液中。在所述方法的一些实施方式 中，H-NOX蛋白被施用到个体至少两次。

【0029】在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白的NO解离常数 在智人血红蛋白α的NO解离常数的2个数量级之内，如NO解离常数在智人血红 蛋白α的NO解离常数的0.1至10倍之间或在0.5至2倍之间。在所述方法的一 些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少 10倍，如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1,000倍。在所述方法 的一些实施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在所述方法的一些实施方式中， H-NOX蛋白是如本文所述的突变蛋白。在所述方法的各种实施方式中，H-NOX 蛋白具有至少一个突变，与相应的野生型蛋白相比，所述突变改变了NO解离常 数、对NO的koff、对NO的k1、对NO的k2、O2解离常数、NO稳定性、NO反 应性、血红素的自氧化速率、或前述的两种或多种的任何组合。在所述方法的一 些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)H-NOX、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、 腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、 野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、嗜肺军团菌2 F9W-F142Y、野生型脱硫脱硫弧菌H-NOX、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱 硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I140Y、智人β1 I145Y、 智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智 人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217) I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C78S、 智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385) I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194) L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOX H105G、褐 鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOX C78E、肉 毒梭状芽胞杆菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭状芽胞杆菌H-NOX(1-186)、 野生型丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)H-NOX、丙酮丁醇梭杆菌 H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭杆菌H-NOX(1-183)、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35 H-NOX、秀丽隐杆线虫H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蝇(D.melangaster) β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA、野生型黑腹果蝇CG14886、野生型黑 腹果蝇CG4154、野生型点形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄杆菌 (C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX、野生型小鼠 H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黄牛(B.Taurus)H-NOX、野生型褐鼠； 野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉(O.latipes)H-NOX、野生型弓背青鳉H-NOX、 野生型红鳍东方鲀(F.rubripes)H-NOX、野生型冈比亚按蚊H-NOX、野生型烟 草天蛾(M.sexta)H-NOX；野生型秀丽隐杆线虫gcy-31、秀丽隐杆线虫gcy-32、 野生型秀丽隐杆线虫gcy-33、野生型秀丽隐杆线虫gcy-34、野生型秀丽隐杆线虫 gcy-35、野生型秀丽隐杆线虫gcy-36、野生型秀丽隐杆线虫gcy-37；野生型霍乱弧 菌(V.cholera)H-NOX、野生型费氏弧菌H-NOX、和野生型点形念珠藻H-NOX。 在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠 β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺军团 菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、以及嗜肺军团菌2H-NOX F142Y。在 所述方法的一些实施方式中，一种或多种脂质体或纳米粒子包括或包封所述 H-NOX蛋白。

【0030】在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX Y40L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺军团菌 2H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜 热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是 野生型嗜肺军团菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、 野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生 型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌 H-NOX。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐 鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、 或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白 不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在 所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。在所述方法的 一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1 I145Y。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热 厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX (1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑 腹果蝇β1 H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型秀丽隐杆线虫 GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型 沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭杆菌H-NOX。在所述方法的一些实施方 式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一种，所述下列H-NOX蛋白 以它们的基因名称列出，随后是它们的种名缩写和Genbank标识符(如从2006 年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日或2007年5月22日起可获 得的下列蛋白质序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、 SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、 CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi：46192757)、 Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、 CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、 GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、 Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、 gi：62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、 gi：86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904 (gi：71985505)、GCY1β3_Hs_20535603、GCY1β2-Hs_899477、或 GYCα-99B_Dm_729270(gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMG Genomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种缩写包括：Ana-鱼腥藻 某种(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇 梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细菌某种(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌 (Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜 热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)； Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。在所述方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋 白的任一种，所述下列H-NOX蛋白被以它们的生物体名称和Pfam数据库登录号 (如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月 21；或2007年5月22日起可获得的下列蛋白序列)列出：线虫种Q622M5_CAEBR、 线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、 线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、 秀丽隐杆线虫GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫 GCY36_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、 秀丽隐杆线虫GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、 青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚 (Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis) Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东 方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、 智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人 GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、 红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan trogiodytes) Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191H_YLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠 Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐 鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、 褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、 褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus) GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus) Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾 O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、 蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、 冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊 (Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、 黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇 GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇 Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica) Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻(Anabaena sp) Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、 Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides) Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD 1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、 Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军 团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、 嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种 (Legionella pneumophila subsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺 亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一种嗜冷细菌) Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)QgEF49_SHEON、 Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、 创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种 (Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp) RED65 Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌 (Halothermothrix orenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以 及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在所述方法的一些实施方式 中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、 Ser137和Arg139。

【0031】除非另外明确指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突变 的H-NOX蛋白以及所有药物组合物可以被用于本文描述的输送NO的任何方法。 H-NOX蛋白可以具有或可以不具有血红素和/或结合的NO并且可以共价结合或可 以不共价结合到另外一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX 蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质——如白蛋白(例如，人血 清白蛋白)——的部分或全部。

【0032】在一方面，本发明以包括一种或多种H-NOX蛋白的试剂盒为特征。 在一些实施方式中，本发明提供试剂盒，该试剂盒包括H-NOX蛋白和使用该试剂 盒将NO输送到个体的说明。在一些实施方式中，H-NOX蛋白对NO的koff、k1 或k2在37℃为大约1×10-4s-1至大约10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃ 为至少大约1μM。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的 NO解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO 反应性低至少10倍。除非另外明确指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型 和突变H-NOX蛋白以及所有药物组合物可以被用于本文描述的任何试剂盒。 H-NOX蛋白可以具有或不具有血红素和/或结合的NO并且可以共价结合或可以不 共价结合到另外一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白 是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白质——如白蛋白(例如，人血清白 蛋白)——的部分或全部。

【0033】在一方面，本发明的特征在于用作药剂的H-NOX蛋白(如本文描 述的野生型或突变蛋白的任一种)。在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白为 特征，所述H-NOX蛋白用于将NO输送到个体的方法。在一些实施方式中，H-NOX 蛋白被用于治疗输送NO对其有益的任何病症，如心血管病症、高血压、由高血 压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩性病症、中风或功 能性NO缺乏。

【0034】在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白(如本文描述的野生型 或突变蛋白的任一种)在药物——如用于向个体输送NO的药物——制备中的应 用为特征。在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白在向个体输送NO中的应用 为特征。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用于治疗输送NO对其有益的任何病 症，如心血管病症、高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭 或中风)、血管收缩病症、中风或功能性NO缺乏。

附图简述

【0035】图1A是NO-结合的和O2-结合的H-NOX蛋白的远侧袋残基的三维 结构图(在血红素之上)。NO-结合的和O2-结合的H-NOX蛋白的血红素配位残基 也被示出(在血红素之下)。图1A基于由Pellicena，P.等人(2004年8月31日). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)：12854-12859报道的腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX的三维结构。

【0036】图1B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构的立体侧视图，图解说 明了H-NOX结构域的结构特征。蛋白折叠以带状图(ribbon diagram)表示。血红 素、双氧配体以及近端组氨酸以球棒模型显示。根据图5B中示出的命名法，α-螺 旋被标记为A-G。β-折叠被标记1-4。图1B来自Pellicena，P.等人(2004年8月31 日)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.AcadSci USA 101(35)：12854-12859。

【0037】图1C-1H是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构图，其举例说明了 示范性的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的远侧袋残基。在图1C-1H中描述的下列残基 是构成H-NOX远侧袋的主要残基：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、 Phe78、Phe82、Tyr140、和Leu144，其被包含在螺旋A、D、E和G中。应用PYMOL (DeLano Scientific，LLP)制作图1C-1H。

【0038】图2是下列H-NOX蛋白的序列对比，所述H-NOX蛋白结合或被预 测结合O2和NO：多数(Majority)(SEQ ID NO：1)；Ce.gcy-31(SEQ ID NO：2)； Ce.gcy-33(SEQ ID NO：3)；Ce.gcy-35(SEQ ID NO：4)；Dm.CG14885 HNOX(SEQ ID NO：5)；Dm.CG4154 HNOX(SEQ ID NO：6)；Ms.Beta3 HNOX(SEQ ID NO：7)； Tt HNOX(SEQ ID NO：8)；以及Ca HNOX(SEQ ID NO：9)。这些H-NOX蛋白被预 测结合O2以及NO，因为它们在相应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140的位置具 有酪氨酸。在图2中使用的氨基酸编编号是从H-NOX结构域或全长蛋白质中的第 一个氨基酸起始，作为第1个残基。采用程序MegAlign中的默认参数进行对比。 图2中使用的缩写在下文参考图4A-4D进行描述。

【0039】图3A-3D是下列H-NOX蛋白的序列对比，所述H-NOX蛋白结合 或被预测结合NO而不是O2：多数(Majority)(SEQ ID NO：10)；Dm.sGC β1蛋 白(SEQ ID NO：11)；sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：12)；hs.sGC β1蛋白(SEQ ID NO：13)； hs.β2蛋白(SEQ ID NO：14)；Ms.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：15)；Mm.sGCβ1蛋白 (SEQ ID NO：16)；Np.β1HD-样(SEQ ID NO：17)；Tr.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO：18)； 冈比亚按蚊(Anopheles_gambiae)|XP_310919(SEQ ID NO：19)；蜜蜂 (Apis_mellifera)|NP_001011632(SEQ ID NO：20)；Bt.sGC β1蛋白(SEQ ID NO：21)；莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO：22)；弓背青 鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO：23)；青鳉(Oryzias_latipes) |BAA76691(SEQ ID NO：24)；紫球海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO：25)；以及Sus scrofa beta1|NP_001018042+(SEQ ID NO：26)。采用程序MegAlign 中的默认参数进行对比。图3A-3D中使用的缩写在下文参考图4进行描述。

【0040】图4A-4D是来自图2和图3A-3D的H-NOX蛋白的序列对比：多 数(Majority)(SEQ ID NO：27)；Dm.sGC β1蛋白(SEQ ID NO：11)；sGC β1蛋白 (SEQ ID NO：12)；hs.sGC β1蛋白(SEQ ID NO：13)；hs.β2蛋白(SEQ ID NO：14)；Mm. sGC β1蛋白(SEQ ID NO：16)；Np.β1 HD-样(SEQ ID NO：17)；Tr.sGC β1蛋白(SEQ ID NO：18)；莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO：22)；弓 背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO：23)；紫球海胆 (Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO：25)；野猪(Sus scrofa) β1|NP_001018042(SEQ ID NO：26)；gcy-31a(SEQ ID NO：2)；gcy-33(SEQ ID NO：3)； Ca.HNOX(SEQ ID NO：9)；T.β1HD-样(SEQ ID NO：8)，Ms.sGc β3蛋白(SEQ ID NO：7)；CG14885(SEQ ID NO：5)；和Dm.sGC短变体(SEQ ID NO：6)。采用程序 MegAlign中的默认参数产生该对比。对于图2-4D，“Dm.sGC β1蛋白”表示黑腹果 蝇β1 H-NOX，“sGC β1蛋白”表示褐鼠β1 H-NOX；“hs.sGC β1蛋白”表示智人β1 H-NOX；“hs.β2蛋白”表示智人β2 H-NOX；“Mm.sGCβ1蛋白”表示小鼠β1 H-NOX；“Np.β1HD-样”表示点形念珠藻H-NOX；“Tr.sGC β1蛋白”表示红鳍东方 鲀(Takifugu rubripes)β1 H-NOX；“Anopheles_gambiae|XP_310919”表示冈比亚 按蚊β1 H-NOX；“Apis_mellifera|NP_001011632”表示蜜蜂β1 H-NOX；“Bt.sGC β1 蛋白”表示牛β1 H-NOX；“Chlamydomonas_reinhardtii|AAR02”表示莱茵衣藻β1 H-NOX；“Oryzias_curvinotus|BAC98396表示弓背青鳉β1 H-NOX； “Oryzias_latipes|BAA76691”表示青鳉β1H-NOX；“Strongylocentrotus_purpuratus|X” 表示紫球海胆β1 H-NOX；“Sus serofa β1|NP_001018042+”表示野猪β1 H-NOX； “gcy-31a”表示秀丽隐杆线虫Gcy-31a H-NOX；“gcy-33”表示秀丽隐杆线虫Gcy-33 H-NOX，“gcy-35”表示秀丽隐杆线虫Gcy-35 H-NOX；“Ca.HNOX”表示丙酮丁醇 梭杆菌(Clostridium acetobutiylicum)H-NOX；“T.β1HD-样”表示腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX；“Ms.sGc β3蛋白”表示烟草天蛾β3H-NOX；“CG14885”表示黑腹果蝇 CG14885 H-NOX；“Dm.sGC短变体”表示黑腹果蝇Gcy-88-E-S H-NOX，而“Dm. CG4154 HNOX”表示黑腹果蝇CG4154H-NOX。

【0041】图5A是H-NOX家族的成员的序列对比。序列编号是腾冲嗜热厌氧 菌H-NOX的编号。不变残基用“V”表示，非常高度保守的残基以“s”表示。腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX的Y140以“H.”表示。在其它的H-NOX蛋白中可以稳定FeII-O2 复合物的推测的远侧袋酪氨酸残基是：对于秀丽隐杆线虫GCY-35是位置70；在 黑腹果蝇CG14885-PA中是位置140；秀丽隐杆线虫GCY-35的位置138；丙酮丁 醇梭杆菌的位置140；根据腾冲嗜热厌氧菌进行编号。登录号为：智人β1[gi：2746083] (SEQ ID NO：28)、褐鼠β1[gi：27127318](SEQ ID NO：29)、黑腹果蝇β1[gi：861203] (SEQ ID NO：30)、黑腹果蝇CG14885-PA[gi：23171476](SEQ ID NO：31)、秀丽隐杆 线虫GCY-35[gi：52782806](SEQ ID NO：32)、点形念珠藻[gi：23129606](SEQ ID NO：33)、新月柄杆菌[gi：16127222](SEQ ID NO：34)、沙雷氏菌[gi：24373702](SEQ ID NO：35)、嗜肺军团菌(ORF 2)[CUCGC_272624](SEQ ID NO：36)、丙酮丁醇梭杆菌 [gi：15896488](SEQ ID NO：37)、以及腾冲嗜热厌氧菌[gi：20807169](SEQ ID NO：38)。采用程序MegAlign、Lasergene、DNA Star(见万维网 “dnastar.com/products/megalign.php”)，生成对比。Clustal-W默认参数被采用。

【0042】图5B是示例性H-NOX结构域的序列对比。该对比顶部的二级结构 注解和编号对应于来自腾冲嗜热厌氧菌的H-NOX结构域。α-螺旋以螺旋表示，而 β-折叠以箭头表示。远侧袋由α-螺旋αA、αD、αE以及αG限定。 Pubmed/NCBI登录号如下：Ther_tengcongensis gi 20807169.(SEQ ID NO：39)、 Clos_acetobutylicum gi 15896488.(SEQ ID NO：40)、Clos_tetani GI：75543266 (SEQ ID NO：41)、Desu_desulfuricans gi 23475919.(SEQ ID NO：42)、 Vibr_vulnificus gi 27361734.(SEQ ID NO：43)、Caul_crescentus gi 16127222.(SEQ ID NO：44)、Micr_degradans gi 23027521.(SEQ ID NO：45)、 Vibr_cholerae gi 15601476.(SEQ ID NO：46)、Shew_oneidensis gi 24373702(SEQ ID NO：47)、Rat_beta1_sGC gi 27127318.(SEQ ID NO：48)、 Rat_beta2_sGC gi 21956635.(SEQ ID NO：49)、Nost_punctiforme gi 23129606.(SEQ ID NO：50)以及Nost_sp.gi 17229770.(SEQ ID NO：51)。共 有序列被显示在图5B(SEQ ID NO：52)的底部。采用程序MULTALIN(Corpet，F. (1988)Nucleic Acids Res.16：10881-10890)生成对比，并且采用程序ESPRIPT(Gouet， P.et al.(1999)Bioinformatics 15：305-308.)制作图5B。

【0043】图6A和6B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的血红素环境的三维 结构图。图6A和6B来自Pellicena，P等人2004年8月31日)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl. Acad Sci USA 101(35)：12854-12859。

【0044】图7A-7F是对于Tt H-NOX(图7A)、Tt Y140L(图7B)、Tt W9F-Y140L (图7C)、Tt F78Y-Y140L(图7D)、L2 H-NOX和L2 F142Y(图7E)以及β1(1-385)和 β1(1-385)I145Y(图7F)，在暴露于空气(FeII-O2复合物；每个图的底部图线)之 前和之后，在厌氧还原作用(FeII未连接复合物；每个图的顶部图线)后H-NOX 蛋白的UV-可见光光谱图。除了L2 F142Y和β1(1-385)I145Y的FeII和FeII-O2复 合物之外，在还原并且暴露于空气之后的野生型L2 H-NOX和β1-(1-385)H-NOX 的光谱分别在图7E和7F中的中间图线中被示出，表明这些蛋白质在加入远侧袋 酪氨酸之前不结合O2。书写在每一组曲线的左上角的两个或三个数字代表图中的 图线峰的波长。所述数字以其中相应的图线在图中垂直出现的顺序进行垂直书写。 例如，在图7A中的430nm的值表示该图中顶部图线的波长的峰(其代表FeII未连 接的复合物)，而图7A中416nm的值表示该图中底部图线的波长的峰(其代表 FeII-O2复合物)。在空气的存在下，波长的偏位表示该蛋白质结合O2。在空气存 在下，500和600nm之间的双峰的形成也可表示O2结合。图7A-7F来自Boon，E.M 等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，” Nature Chem.Biol.1：53-59。

【0045】图8A-gD包括编码H-NOX蛋白的示例性核酸的多核苷酸序列及相 应的H-NOX蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NOS：53-162)。

发明详述

【0046】本发明部分地基于令人惊讶的发现——H-NOX蛋白具有比血红蛋白 低得多的NO反应性。由于在O2存在下NO使H-NOX蛋白失活的可能性较低， 这种固有的低NO反应性(和高NO稳定性)使野生型和突变H-NOX蛋白成为期 望的NO载体。重要的是，在一些H-NOX蛋白中的远侧袋酪氨酸的存在(Pellicena， P.等人，(August 31，2004)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)：12854-12859)提示了不期望的高NO反应性，表明用作NO载体不可取。 例如，通过类推，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)血红蛋白——其具 有结构类似的远侧袋酪氨酸——与NO极其迅速地反应，且被分枝杆菌 (Mycobacterium)用于有效地清除和避免由受到感染的宿主产生的防御性NO (Ouellet，H.等人(2002年4月30日)，“Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide，”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 99(9)：5902-5907)。然而，我们惊讶地发现H-NOX蛋白实际上具有比血红蛋白低 得多的NO反应性，这使它们用作NO载体成为可能。

【0047】此外，发现可以通过改变H-NOX蛋白对于NO或O2的亲和性以使 结合到H-NOX蛋白的NO的量最大并且减少被NO与结合到H-NOX蛋白的O2 的反应所氧化的H-NOX蛋白的量，来提高H-NOX蛋白作为NO载体的有效性。 特别是，H-NOX蛋白对于NO或O2的亲和性以及H-NOX蛋白区分NO和O2配 体的能力可以通过引入一个或多个氨基酸突变而改变，使得H-NOX蛋白适合以期 望的亲和性结合NO或O2。例如，通过H-NOX蛋白结合NO或O2的解离常数或 解离速率可以通过引入单个氨基酸突变而改变。另外的突变可以被引入，以进一 步改变对NO和/或O2的亲和性。H-NOX蛋白家族因此可以被操作，以显示改善 或最佳的NO输送的动力学和热力学特性。例如，突变H-NOX蛋白被制备，其具 有改变的NO结合的解离常数和/或解离速率，其提高了H-NOX蛋白对于多种临 床和工业应用的有效性。在一些实施方式中，具有低O2亲和力的H-NOX蛋白(如 在37℃至少大约1μM的O2解离常数)被用于使结合H-NOX蛋白的O2的量减到 最少，因而促进NO与H-NOX蛋白的结合，并且减少由于NO与结合到H-NOX 蛋白的血红素的O2反应而被氧化的H-NOX蛋白的量。H-NOX蛋白的氧化的这种 减少导致可以被受治疗个体的器官、组织、以及细胞利用的NO和O2的破坏较少。 调节H-NOX蛋白结合并输送NO的能力是解决和克服当前血管扩张剂的主要缺点 的治疗途径。因此，本发明提供用于NO输送的蛋白质、组合物、试剂盒以及方 法。

【0048】使用用于NO输送的H-NOX蛋白有许多优点。有机硝酸盐对于由 于耐受引起的有限时长是有效的。因为H-NOX蛋白直接将NO输送到个体而不要 求硝酸盐到NO的生物转化，H-NOX蛋白作为NO载体的效应不被这种生物转化 途径的抑制所限制。血红蛋白基的NO载体的主要局限性是它们对于O2的高亲和 力以及它们被NO钝化的倾向。如上面提到的，即使低水平的NO被血红蛋白基的 载体破坏，可以对脉管系统和器官的紧张性静止状态(tonic resting state)具有严 重的影响并且导致高血压和胃肠的不良应激。在被用作氧载体时，分子内和分子 间交联已经被用于使血红蛋白基运载工具的毒性降到最低(“Blood Substitutes，”R. Winslow ed.Academic Press，2006)。虽然这些修饰克服了与血红蛋白外渗有关的一 些严重毒性问题，但仍保持高NO反应性。相反地，H-NOX蛋白具有比血红蛋白 低得多的NO反应性。由于较少的NO与结合到H-NOX蛋白的O2反应，这种较 低的反应性导致NO、O2以及H-NOX蛋白的破坏较少。选择具有期望的NO解离 常数和解离速率的H-NOX蛋白的能力也可以通过防止太多的NO释放(引起低血 压)使副作用降到最低，并且防止NO在不期望的部位(如，没有血管收缩的部 位)被释放。工程改造H-NOX蛋白以在最小的NO反应性下结合并输送NO，提 供了一种新的血液气体NO载体，其中所述H-NOX蛋白输送NO而不被NO钝化。 这些H-NOX蛋白、组合物、试剂盒以及方法在本文被进一步描述。

【0049】对于NO的输送，工程H-NOX蛋白代表了重要的替代选择，其克 服了长期存在的当前硝基血管扩张剂耐受问题。H-NOX蛋白作为NO输送媒介的 应用提供了治疗慢性高血压加重的疾病的新的治疗途径。

H-NOX蛋白

H-NOX蛋白家族综述

【0050】除非另外指出，任何野生型或突变H-NOX蛋白可以在如本文所述 的组合物、试剂盒以及方法中被使用。如本文所用的，“H-NOX蛋白”是指具有 H-NOX结构域(称为血红素-一氧化氮以及氧(Heme-Nitric oxide and OXygen)结 合结构域)的蛋白质。H-NOX蛋白可以包含或不包含一个或多个除了H-NOX结 构域之外的其它结构域。H-NOX蛋白是高度保守的、充分表征的血红素蛋白家族 的成员(Iyer，L.M等人(2003年2月3日)，“Ancient Conserved Domains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins，”BMC Genomics 4(1)：5；Karow，D.S等人(2004年8月10日)，“Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211；Boon，E.M 等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，” Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.等人(2005年10月)，“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr. Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.等人(2005)，“Ligand Specificity of H-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem. 99(4)：892-902)。H-NOX蛋白也被称为Pfam 07700蛋白或HNOB蛋白(Pfam-蛋白 质结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型(Hidden Markov Models)的数据库， Copyright(C)1996-2006 The Pfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation，Inc.，59 Temple Place-Suite 330，Boston，MA 02111-1307，USA)。在一些 实施方式中，H-NOX蛋白具有，或被预测具有包括六个α-螺旋、随后是两个β折 叠、接着是一个α-螺旋、之后是两个β折叠的二级结构。H-NOX蛋白可以是能够 结合血红素的脱辅基蛋白质或具有结合的血红素的全蛋白质。H-NOX蛋白能够共 价地或非共价地结合血红素基团。一些H-NOX蛋白结合NO但不结合O2，而另 外的H-NOX蛋白结合NO和O2。来自已经被分离的兼性好氧菌的H-NOX结构域 结合NO但不结合O2。来自专性好氧原核生物、秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇的H-NOX 蛋白结合NO和O2。哺乳动物具有两种H-NOX蛋白：β1和β2。小鼠、大鼠、母 牛以及人H-NOX序列的对比显示这些物种共有99％的同一性。在一些实施方式中， H-NOX蛋白的H-NOX结构域或整个H-NOX蛋白与天然存在的腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX蛋白或天然存在的sGC蛋白(如，天然存在的sGC β1蛋白)的相应区域 具有至少大约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99 或99.5％的同一性之一。如本文进一步讨论的，与相应的天然存在的H-NOX蛋白 相比，H-NOX蛋白可以任选地包含一个或多个突变。在一些实施方式中，H-NOX 蛋白包括除了H-NOX结构域之外的一个或多个结构域。在具体的实施方式中， H-NOX蛋白包括来自另一个蛋白质的一个或多个结构域或整个序列。例如， H-NOX蛋白可以是融合蛋白，该融合蛋白包括H-NOX结构域和另一蛋白质如白 蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。在一些实施方式中，只有H-NOX结构域 存在。

【0051】来自腾冲嗜热厌氧菌的原核O2-结合H-NOX的晶体结构(Nioche，P. 等人(2004年11月26日)，“Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum，”Science 306(5701)：1550-1553；Pellicena，P.等人(2004年8月31日). “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)：12854-12859)表明，酪氨酸侧链羟基形 成与FeII-O2部分的关键H键。这种远侧袋氢键合网络——其主要涉及Y140—— 使FeII-O2复合物稳定(图6B)。该酪氨酸不存在于排斥O2并只结合NO的H-NOX 蛋白中。例如，这种氢键合网络被预测在来自sGC和好氧原核生物的H-NOX蛋 白中不存在，表明这在由这些血红素蛋白显示出的针对O2的显著配体选择性中是 关键的分子因素。图7A-7G清楚地表明，在结合NO而不结合O2的野生型H-NOX 蛋白的远侧袋中添加酪氨酸可以使突变H-NOX蛋白能够结合O2。因而，在H-NOX 血红素折叠的远侧血红素袋中的酪氨酸发挥开关一样的作用，以开启或关闭O2结 合。

【0052】如在图6A和6B中所示的，卟啉的结构被高度扭曲。如在图6A中 图示的，保守的Y-S-R基序使氢键合与血红素基的丙酸侧链相互作用。图6B，保 守的H102是血红素的近侧配体(图6B)。

【0053】如本文所用的，“蛋白质”包括无论分离自天然来源、由重组技术产 生的、或化学合成的蛋白质和蛋白质片段。蛋白质可以具有一种或多种修饰，如 翻译后修饰(如，糖基化，等)或任何其它修饰(如，PEG化，等)。蛋白质可以包 含一个或多个非天然存在的氨基酸(例如，如具有侧链修饰的氨基酸)。在不同的 实施方式中，H-NOX蛋白具有至少大约50、100、150、181、200、250、300、350、 400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白可以包括大约50至大约 600个氨基酸，如大约100至大约500个氨基酸、大约150至大约400个氨基酸、 大约150至大约300个氨基酸、或大约175至大约200个氨基酸。

H-NOX蛋白的来源

【0054】来自任何属或种的H-NOX蛋白可以被用在本文描述的组合物、试 剂盒和方法中。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白为来自哺乳动物(如灵长类(如 人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科或猫科)、昆虫、酵母、或细 菌的蛋白质，或来源于这类蛋白质。示例性的哺乳动物H-NOX蛋白包括野生型人 和大鼠可溶性鸟苷酸环化酶(如β1亚基)。H-NOX蛋白的例子包括野生型哺乳动 物H-NOX蛋白，所述野生型哺乳动物如智人、小鼠、家犬、牛和褐鼠；以及野生 型非哺乳动物的脊椎动物H-NOX蛋白，所述野生型非哺乳动物的脊椎动物如爪 蟾、弓背青鳉、O.curivatus和红鳍东方鲀。非哺乳动物野生型NO-结合H-NOX 蛋白的例子包括黑腹果蝇、冈比亚按蚊以及烟草天蛾的野生型H-NOX蛋白；非哺 乳动物野生型O2结合H-NOX蛋白的例子包括下列动物的野生型H-NOX蛋白：秀 丽隐杆线虫gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36和gcy-37；黑腹果 蝇CG14885、CG14886和CG4154；以及烟草天蛾β-3；原核野生型H-NOX蛋白 的例子包括腾冲嗜热厌氧菌、霍乱弧菌、费氏弧菌、点形念珠藻、脱硫脱硫弧菌、 嗜肺军团菌1、嗜肺军团菌2、和丙酮丁醇梭菌的野生型H-NOX蛋白。

【0055】示例性H-NOX蛋白的NCBI登录号包括下列：智人(Homo sapiens) β1[gi：2746083]、褐鼠(Rattus norvegicus)β1[gi：27127318]、黑腹果蝇(Drosophila melangaster)β1[gi：861203]、黑腹果蝇(Drosophila melangaster)CG14885-PA [gi：23171476]、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)GCY-35[gi：52782806]、点形 念珠藻(Nostoc punctiforme)[gi：23129606]、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus) [gi：16127222]、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis[gi：24373702]、嗜肺军团菌 (Legionella pneumophila)(ORF 2)[CUCGC_272624]、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)[gi：15896488]以及腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)[gi：20807169]。

【0056】示例性H-NOX蛋白还包括下列H-NOX蛋白，其按照它们的基因名、 接着是它们的种的缩写和Genbank标识符加以列出(如从2006年5月21日；2006 年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可获得的下列蛋白序列， 其各自以其全部通过引用由此被并入)：Npun5905_Npu_23129606， alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、 VCA0720_Vch_15601476，CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi：46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、 Tar4_Tte_20807169，Ddes2822_Dde_23475919，CAC3243_Cac_15896488、 gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455，GUCY1B3_Hs_4504215、 HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、 CG4154_Dm_24646993(gi：NP_650424.2、gi：62484298)、 gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi：32566352、gi：86564713)、 gcy-35_Ce-17507861(gi：71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi：71985505)、 GCY1a3_Hs_20535603、GCY1a2-Hs_899477、或GYCa-99B_Dm_729270 (gi：68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMG Genomics 4：5-13)。在这些名称中使用的种的缩写包括：Ana-鱼腥藻(Anabaena Sp)；Ccr- 新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趋磁细 菌某种(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-点形念珠藻 (Nostoc punctiforme)；Rhsp-浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone- 沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；Hpul-马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。

【0057】其它示范性的H-NOX蛋白包括下列H-NOX蛋白，其按照它们的生 物体名称和Pfam数据库登录号(如从2006年5月21日；2006年5月22日；2007 年5月17日；或2007年5月21日起可获得的下列蛋白序列，其各自以它们的全 部通过引用被并入)列出：线虫种Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、 线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、 线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、秀丽隐杆线虫 GCY37_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY31_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY36_CAEEL、 秀丽隐杆线虫GCY32_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY35_CAEEL、秀丽隐杆线虫 GCY34_CAEEL、秀丽隐杆线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus) Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis) Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、红鳍东 方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、 智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人 GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、 红猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes) Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠 Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐 鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、 褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、 褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus) GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus) Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾 O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、 蜜蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PYK9_ANOGA、冈比亚按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、 冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚按蚊 (Anophelesgambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、 黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇 GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇 Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysis californica) Q7YWK7_APLCA、马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻某种(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、 Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白细菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白细菌HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5 Q2DG60_ACICY、浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides) Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、 Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军 团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、 嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种 (Legionella pneumophila subsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺 亚种Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一种嗜冷细菌) Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、 Saccharophagus_degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、 创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、 Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌属某种(Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋细菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、 脱硫脱硫弧菌Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterter tengcongensis) Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、 Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭状芽胞杆菌 (Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。应用如本文所述的Pfam数据库，基于属于H-NOX蛋白家族 的这些蛋白质的标识，预测这些序列编码H-NOX蛋白。

【0058】可以应用标准方法确定另外的H-NOX蛋白和核酸，其可适合用于 本文描述的药物组合物和方法。例如，基于它们与已知H-NOX蛋白和核酸的一级 和/或预测的蛋白质二级结构的相似性，标准序列对比和/或结构预测程序可以被用 于鉴定另外的H-NOX蛋白和核酸。例如，Pfam数据库采用所定义的对比算法和 隐蔽马尔科夫模型(如Pfam 21.0)来将蛋白质分类成家族，如H-NOX家族(Pfam -蛋白结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型的数据库，Copyright(C)1996-2006 The Pfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation，Inc.，59Temple Place-Suite 330，Boston，MA 02111-1307，USA)。标准数据库如swissprot-trembl数据库(万维 网“expasy.org”，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4，Switzerland)也可以被用于鉴定H-NOX蛋白家族 的成员。采用标准结构预测程序如PredictProtein(630 West，168 Street，BB217，New York，N.Y.10032，USA)的默认设置，H-NOX蛋白的二级和/或三级结构可以被预 测。可选地，采用标准方法，H-NOX蛋白的真实二级和/或三级结构可以被确定。

【0059】在一些实施方式中，H-NOX蛋白在相应位置上具有与腾冲嗜热厌氧 菌H-NOX中的下列远侧袋残基的任何一个相同的氨基酸：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、 Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、Leu144或前述的两个或多个的任 何组合。在一些实施方式中，基于它们的氨基酸序列的序列对比，H-NOX蛋白在 对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115或Arg135的位置分别具有脯氨酸或精氨 酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有对应于褐鼠β1H-NOX的His105的组氨 酸。在一些实施方式中，H-NOX具有或被预测具有包括6个α螺旋、之后为2个 β折叠、接着为1个α螺旋、之后为2个β折叠的二级结构。H-NOX蛋白的这种 二级结构已经被报道。

【0060】如果需要，采用标准方法，新鉴定的H-NOX蛋白可以被测试，以 确定其是否结合血红素。可以通过应用标准方法——如本文描述那些方法——确 定H-NOX蛋白是否结合NO，来测试H-NOX蛋白作为NO载体起作用的能力。 如果需要，本文描述的一个或多个突变可以被引入到H-NOX蛋白中，以使其作为 NO载体的特征得到优化。例如，一个或多个突变可以被引入，以改变其NO解离 常数、对NO的koff、对NO的k1、对NO的k2、O2解离常数、NO稳定性、NO 反应性、血红素自氧化速率、和前述的两个或多个的任何组合。标准技术如本文 描述的那些可以被用于测量这些参数。

【0061】如本文所讨论的，突变H-NOX蛋白(如下面讨论的I类和II类突 变)可以从这些或其它天然野生型来源序列(如，在图2-4D或8A-8DD列出的序 列或本文所述的任何其它序列)通过诱变进行衍生。如本文所用的，“从......衍生 (或衍生自)”涉及一个或多个突变被引入到其中的蛋白质的来源。例如，“衍生自 哺乳动物蛋白”的蛋白质是指将一个或多个突变引入野生型(即，天然存在的序列) 哺乳动物蛋白序列产生的目标蛋白质。

突变H-NOX蛋白

【0062】如本文进一步讨论的，H-NOX蛋白可以包括一个或多个突变，如与 相应野生型蛋白的那些相比，改变NO解离常数、对NO的koff、O2解离常数、对 O2的koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性、或前述两个或多个的任 何组合的突变。由于本文提供的教导，使用本文所述且普通技术人员已知的技术， 可通过随机诱变，接着经验筛选需要的或期望的解离常数、解离速率、NO反应性、 稳定性、生理相容性或前述两种或多种的任何组合，来产生工程H-NOX蛋白组。 可选地，诱变可以选择性地靶向特定区域或残基，例如H-NOX蛋白的实验确定或 预测的三维结构中明显的远侧袋残基(本文图1A，并参见，例如，Boon，E.M.等 人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59，其通过引用由此并入其全部内容，特别是涉及野生型和 突变H-NOX蛋白的序列)或从序列对比中鉴定的进化上保守的残基(本文图2-4D， 并且参见例如，Boon E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59，其通过引用由此并入其全部 内容，特别是涉及野生型和突变H-NOX蛋白的序列)。

【0063】如本文所使用，“突变蛋白”意指与天然发生的蛋白质相比，具有一 个或多个突变的蛋白质。在一种实施方式中，突变蛋白具有与所有天然发生的蛋 白质的序列不同的序列。在各种实施方式中，突变蛋白的氨基酸序列与天然发生 的蛋白的相应区域的序列具有至少约下列任一的同一性：10、15、20、25、30、 40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％。在一些实施方式中，突变 蛋白是含有来自全长蛋白的至少约下列任何个数的连续氨基酸的蛋白片段：25、 50、75、100、150、200、300或400个。例如，可以使用带有其中指定的默认参 数的序列分析软件(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)测量序列同一性。该软件程序通过对各种 氨基酸置换、删除和其它修饰赋予同源性程度来匹配相似序列。

【0064】如本文所使用，“突变”意指在天然发生的参考核酸或氨基酸序列中 的改变。示例性的核酸突变包括插入、删除、移码突变、沉默突变、无义突变或 错义突变。在一些实施方式中，核酸突变不是沉默突变。示例性的蛋白突变包括 一个或多个氨基酸的插入(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的插入)、 一个或多个氨基酸的删除(如N-末端、C-末端和/或内部残基的删除，例如至少约 下列任何个数的氨基酸的删除：5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或 更多个，或者大约下列任何个数的氨基酸的删除：5、10、15、25、50、75、100、 150、200、300或400个)、一个或多个氨基酸的置换(如2、3、4、5、6、7、8、 9或10个氨基酸的置换)、或前述两种或多种的组合。H-NOX蛋白的示例性功能 截短包括β1序列的残基1-385。在一些实施方式中，与天然发生的蛋白质相比， 突变蛋白具有至少一个氨基酸改变。在一些实施方式中，突变核酸序列编码与天 然发生的蛋白质相比具有至少一个氨基酸改变的蛋白质。在一些实施方式中，核 酸不是天然发生的核酸的简并版本，所述天然发生的核酸编码与天然发生的蛋白 质具有相同的氨基酸序列的蛋白质。在提到特定氨基酸突变中使用的命名法首先 确定野生型氨基酸，接着是残基编号，而最后是取代氨基酸。例如，Y140L表示 在残基编号140上的酪氨酸被亮氨酸置换。

【0065】“进化上保守的突变”是一种蛋白质中的氨基酸被同一蛋白质家族中 另一种蛋白质相应位置上的氨基酸置换。示例性的进化上保守的突变(也表示为I 类突变)列于表1A。在表1A中，突变根据人β1 H-NOX的序列进行编号/注释， 但对有所有H-NOX序列都是类似的。因此，任何其它H-NOX蛋白中的对应位置 可以被突变为指出的残基。例如，人β1 H-NOX的Phe4可以被突变为酪氨酸，由 于其它H-NOX蛋白在该位置具有酪氨酸。对应的苯丙氨酸残基可以被突变为其它 任何H-NOX蛋白中的酪氨酸。在具体实施方式中，一个或多个突变被限定为进化 上保守的残基。在一些实施方式中，一个或多个突变可包括至少一个进化上保守 的突变和至少一个非进化上保守的突变。如果希望，鉴于本文提供的教导，这些 突变H-NOX蛋白经受对NO/O2解离常数、NO反应性、稳定性和生理相容性的经 验筛选。

表1A.示例性的靶向进化上保守的残基的I类H-NOX突变

F4Y    Q30G    I145Y

F4L    E33P    I145H

H7G    N61G    K151E

A8E    C78H    I157F

L9W    A109F   E183F

【0066】在一些实施方式中，所述突变为远侧袋突变，例如α-螺旋A、D、E 或G中残基的突变(Pellicena，P.et al.(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl. Acad Sci USA 101(35)：12854-12859)。示例性的远侧袋突变(也表示为II类突变)列 于表1B。在表1B中，突变根据人β1 H-NOX的序列进行编号/注释，但对于所有 H-NOX序列都是类似的。因为若干取代在每个所描述的残基处提供了可行的突变， 在每个指出位置的残基可以被改变为任何其它天然或非天然存在的氨基酸(表示 为“X”)。这类突变可以产生具有各种期望亲和力、稳定性和反应性特征的H-NOX 蛋白。

表1B.示例性的靶向远侧袋残疾的II类H-NOX突变

V8X    M73X    I145X

L9X    F77X    I149X

F70X   C78X

【0067】在具体实施方式中，所述突变为血红素远侧袋突变。如本文所述， 在H-NOX家族的NO-结合成员中阻止O2结合的关键分子决定因素是血红素的远 侧袋中氢键供体的缺乏。因此，在一些实施方式中，所述突变改变H-NOX结构域 和远侧袋内配体之间的氢键结合。在一些实施方式中，所述突变破坏远侧袋的氢 键供体和/或赋予相对于对应的野生型H-NOX结构域降低的O2配体结合。示例性 的远侧袋残基包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、 Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140和Leu144以及任何其它H-NOX蛋白中对 应的残基。

【0068】不在远侧袋中的残基也可影响血红素基团的三维结构；该结构再影 响O2和NO与血红素基团中铁的结合。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白在 远侧袋之外具有一个或多个突变。可以被突变但不在远侧袋中的残基的实例包括 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115和Arg135。在一些实施方式中，所述突变在近 侧袋(proximal pocket)中，所述近侧袋包括His105，其作为连接到血红素铁的残 基。

【0069】在一些实施方式中，当存在两个或多个突变时，至少一个突变在远 侧袋之中，并且至少一个突变在远侧袋之外(例如，在近侧袋中的突变)。在一些 实施方式中，所有的突变都在远侧袋中。

【0070】在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与由自然界中生物体 产生的蛋白质的序列不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在 2006年5月21日或2006年5月22日于任何数据库中发现的序列(例如预测为或 已知为H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。在一些实施方式中， H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2007年5月21日或2007年5月22日于任何数据 库中发现的序列(例如预测为或已知为H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序 列)不相同。

【0071】为了降低从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋 白中的氨基酸可以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白 四级结构表面上的一个或多个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基 酸。在一些变异中，一个或多个表面氨基酸的突变可与两个或多个远侧袋残基的 突变、远侧袋外的一个或多个残基的突变(如，近侧袋中的突变)或前述两种或 多种的组合进行组合。

【0072】示例性的突变显示于表2。此外，表2中所列残基的任何一个可以 被突变为任何其它氨基酸。本发明也涉及本文所述突变的任何组合，例如双突变、 三突变或更高的多突变。例如，本文所述突变的任何一种的组合可以在同一H-NOX 蛋白中进行。注意，在其它哺乳动物或非哺乳动物H-NOX蛋白的等价位置上的突 变也被本发明包括。如果希望，除表2中提到的残基以外的残基也可以被突变。 示例性的突变H-NOX蛋白包含一个或多个突变，其相对于对应的野生型H-NOX 结构域赋予改变的NO或O2配体-结合，并可作为生理相容的哺乳动物NO血液气 体载体起作用。

【0073】在表2和所有随后的表格中，突变的残基编号表示在被描述的特定 H-NOX蛋白的序列中的位置。例如，腾冲嗜热厌氧菌I5A指的是腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX第五个位置上的异亮氨酸被丙氨酸置换。相同的异亮氨酸到丙氨酸的突变 可以在任何其它H-NOX蛋白的相应残基中进行(该残基可以是或可以不是其它 H-NOX蛋白序列中的第五个残基)。由于哺乳动物β1 H-NOX结构域的氨基酸序 列最多有两个氨基酸不同，所以，当被引入野生型大鼠β1 H-NOX蛋白时产生期 望突变H-NOX蛋白的突变也被预期，在被引入来自其它哺乳动物如人的野生型β1 H-NOX蛋白中时产生期望的突变H-NOX蛋白。

【0074】在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个突变，其中对应于腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115、Arg135或Tyr140，β1(1-385) 的I145，或嗜肺军团菌2的Phe142的残基被任何其它氨基酸置换。在一些实施方 式中，H-NOX蛋白具有至少两个突变，其中至少一个突变是对应于腾冲嗜热厌氧 菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115、Arg135或Tyr140，β1(1-385)的I145， 或嗜肺军团菌2的Phe142的残基被任何其它氨基酸置换。在一些实施方式中， H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的I5A突变、I5L突变、W9F突变、 Y140F突变、Y140L突变、Y140H突变、W9F Y140H双突变、或F78Y Y140F双 突变，或β1的I145Y突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾 冲嗜热厌氧菌的W9Y突变、W9H突变、W9N突变、N74H突变、N74E突变、 N74A突变、P115A突变、R135Q突变、I5L P115A双突变、N74A Y140H双突变 或W9F N74A双突变。在一些实施方式中，与相应的野生型蛋白(如褐鼠或智人 β1)相比，H-NOX蛋白中的至少一个C-末端氨基酸(如至少大约50个连续的C- 末端氨基酸或在大约25至大约200个之间的连续C-末端氨基酸)已被除去。

表2.来自腾冲嗜热厌氧菌(Tt)、嗜肺军团菌(Lp)、脱硫脱硫弧菌(Dd)、 霍乱弧菌(Vc)、点形念珠藻(Np)、肉毒梭菌(Cb)、丙酮丁醇梭杆菌(Ca)、大 鼠、人、秀丽隐杆线虫(Ce)的示例性H-NOX突变

Tt             Lp         Dd         其它细菌          大鼠         人           蠕虫

Tt H-NOX      L2 H-NOX    DdH-NOX    Vc H-NOX          β1(1-385)   β1(1-385)   Ce GCY-

                         (728-899)                                               35(1-252)

Tt  H-NOX     L2 F142Y    Dd Y139L   Np H-NOX          β1(1-385)   β1(1-385)

His6                                                   I145Y        I145Y

              L2                     Cb                β1(1-385)   β1(1-385)

Tt I5A        F9W-F142Y              H-NOX(1-175)      I145H        I145H

              L1 H-NOX               Cb                β1(1-385)   β1(1-385)

Tt I5L                               H-NOX(1-186)      C78Y          C78Y

              L1 F142Y               Ca                β1(1-194)   β1(1-194)

Tt I5L-P115A                         H-NOX(1-197)

Tt W9F                               Ca                β1 H105F    β1 H105F

                                     H-NOX(1-183)

Tt                                                     β1 H105G    β1 H105G

W9F-Y140L       

Tt                                                     β1(1-194)   β1(1-194)

W9F-Y140H                                              I145Y        I145Y

Tt                                                     β1(1-194)   β1(1-194)

W9F-N74A                                               L9W-I145Y    L9W-I145Y

Tt W9Y                                                β2(1-217)    β2(1-217)

Tt W9N                                                β2(1-217)    β2(1-217)

                                                       I142Y        I142Y

Tt W9H

Tt N74E

Tt N74A

Tt N74H

Tt

N74A-Y140H

Tt I75F His6

Tt

F78Y-Y140L

Tt

F78Y-Y140F

Tt P115A

Tt R135Q

His6

Tt Y140F

Tt Y140L

Tt Y140H

Tt Y140A

Tt L144F

His6

H-NOX蛋白的修饰

【0075】野生型或突变H-NOX蛋白的任何一种都可以使用标准方法进行修 饰和/或配制，以增强治疗或工业应用。例如并且尤其是应用到异源工程H-NOX 蛋白时，本领域内已知各种方法用于将这样的试剂与免疫监视隔离，包括交联、 聚乙二醇化、糖修饰等(例如，Rohlfs，R.J.et al.(1998年5月15日)“Arterial Blood Pressure Responses to Cell-Free Hemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric Oxide，”J.Biol.Chem.273(20)：12128-12134；Migita，R.et al.(1997年6月).“Blood Volume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion With Hemoglobin-Based Oxygen Carriers，”J.Appl.Physiol.82(6)：1995-2002；Vandegriff，K. D.et al.(2004年8月15日)“Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)：183-189， 它们各自通过引用由此并入其全部内容，尤其是关于蛋白质的修饰)，以及普通技术人 员已知的其它技术。将H-NOX蛋白与诸如人血清白蛋白的人蛋白融合可以提高血 清半衰期、粘度和胶体渗透压(colloidal oncotic pressure)。在一些实施方式中， H-NOX蛋白在其合成过程之中或之后被修饰，以降低其免疫原性和/或提高其血浆 保留时间。H-NOX蛋白也可以被包封(例如在脂质体或纳米颗粒中包封)。

野生型或突变H-NOX蛋白的特征

【0076】如本文所述，已经制备了大量不同的提供NO解离常数范围、O2解 离常数范围、NO koff范围、O2 koff范围、NO反应性范围和稳定性范围的H-NOX 突变蛋白。在一些实施方式中，与目前使用的输送NO的化合物——如任何生物 转化为NO的有机硝酸盐——相比，H-NOX蛋白具有类似的或改善的NO解离常 数、O2解离常数、NO koff、O2koff、NO反应性、自氧化速率、血浆保留时间、或 前述的两者或多种的任何组合。

【0077】如上面所讨论的，固有的低NO反应性(和高的NO稳定性)使野 生型和突变H-NOX蛋白成为期望的NO载体，因为在O2存在下由NO钝化H-NOX 蛋白的可能性较低。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有低的O2亲和力(如在 37℃至少大约1μM的O2解离常数)或没有可检测到的O2亲和力。由于很少的— —如果有的话——O2结合到H-NOX蛋白，结合到H-NOX蛋白的血红素的O2的 NO氧化为最少。因而最少的NO、O2和H-NOX蛋白被这种NO氧化所钝化。因 此，更多的NO可以被输送到个体中期望的位点，而较少的能够被个体中组织利 用的O2被破坏。

【0078】如本文所使用，“血红蛋白”表示来自被良好表征的血红蛋白家族的 蛋白或其突变体，它们是红细胞中含铁的O2输送金属蛋白。纯化的、无基质人血 红蛋白具有约200-500nM的对O2动力学KD。该值是亚基依赖性的。

【0079】“6-配位FeII-NO复合物”表示6-配位铁-亚硝酰基，其在大约 416-422nm处产生紫外-可见索雷(UV-Vis Soret)峰，如，例如由Boon，E.M.等人 (2006年8月)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)：21892-21902所描述的，其通过 引用由此以其全部内容并入，尤其是关于含有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋 白样品的百分数和含有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数的确定。

【0080】“5-配位FeII-NO复合物”表示5-配位铁-亚硝酰基，其在大约 397-400nm处产生紫外-可见索雷峰，如，例如由Boon，E.M.等人(2006)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)：21892-21902所描述的，其通过引用由此以其全部 内容并入，尤其是关于含有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数和 含有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白样品的百分数的确定。

【0081】如本文使用的，“koff”表示解离速率，如从蛋白质中释放NO或O2 的速率。较低数值的低koff表示较慢的解离速率。对于具有6-配位FeII-NO复合物 的H-NOX蛋白，如Boon，E.M.等人(August 2006)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol. Chem.281(31)：21892-21902和Boon，E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59所述的计 算对NO的koff，其各自通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于H-NOX蛋 白的NO koff的计算。对于具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，对NO的 koff由对NO的k1和对NO的k2来描述，如由Winger，J.A.等人(January 2007) “Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的， 其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是H-NOX蛋白的NO koff、NO k1和NO k2的计算。对于包含5-配位FeII-NO复合物和6-配位FeII-NO复合物的混合物的 H-NOX蛋白，对NO的koff由对NO的k1和对NO的k2来描述，如由Winger，J.A 等人(January 2007)，“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)： 897-907所描述的，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于H-NOX蛋白 的NO koff、NO k1和NO k2的计算。

【0082】在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃ 为大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，如在37℃在大约1×10-4s-1至大约0.012s-1 之间，在大约1×10-4s-1至大约0.007s-1，大约0.005s-1至大约0.011s-1，或大约1× 10-4s-1至大约1×10-3s-1。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff在37℃ 为大约1至大约1,000s-1，如在37℃大约1至大约50s-1，大约50至大约100s-1， 大约100至大约250s-1，大约250至大约500s-1，大约500至大约750s-1，或大约 750至大约1,000s-1。

【0083】“kon”表示结合速率，如NO或O2结合到蛋白质的速率。较低数值的 低kon表示较慢的结合速率。在不同的实施方式中，H-NOX蛋白的对O2的kon在 20℃为大约0.14至大约60μM-1s-1，如大约6至大约60μM-1s-1，大约6至大约12 μM-1s-1，大约15至大约60μM-1s-1，大约5至大约18μM-1s-1，大约6至大约15μM-1s-1。

【0084】“解离常数”表示“动力学解离常数”或“计算的解离常数”。“动力学解 离常数”或“KD”表示动力学解离速率(off-rate)(koff)与动力学结合速率(on-rate) (kon)的比率，如采用标准方法(如，标准光谱法、停流法、或闪光光解法)—— 包括技术人员已知的和/或本文描述的方法——被测定为绝对值的KD值。“计算的 解离常数”或“计算的KD”指基于测量的koff的动力学解离常数的近似值。对于计算 的对NO的KD，H-NOX蛋白的对NO的kon的值被假定为710μM-1s-1，其是报道 的β1(1-385)的kon，该kon在4℃被测量并且在37℃没有显著增加(Zhao，等人(1999)， “A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase，”PNAS. 96：14753-14758，其通过引用由此以其全部内容并入，尤其是关于H-NOX蛋白质 的NO kon的计算)。对于计算的对O2的KD，kon的值通过如本文所述的动力学KD 和koff之间的相关性得到。

【0085】在不同的实施方式中，H-NOX蛋白结合NO的动力学或计算的KD 在相同的条件下(如在20℃)在血红蛋白的大约0.01至大约100倍之内，如在相 同的条件下(如在20℃)，在血红蛋白的大约0.1至大约10倍之间或在大约0.5至 大约2倍之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在37℃在大约0.1 至大约20pM之间，如在37℃，为大约0.5至大约15，大约0.5至大约12，大约 0.7至大约4，或大约0.7至大约3。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离 常数在37℃为至少大约0.1pM，如在37℃为至少大约0.5、1、3、5、10、12、50、 100、400、500、1000、2000、3000或4000pM的任一个。在一些实施方式中， H-NOX蛋白的NO解离常数在37℃为5000pM以下，如在37℃为大约4000pM、 3000pM、2000pM、1000pM、500pM、400pM、100pM、50pM、12pM、10pM、 5pM、3pM或1pM的任一个以下。

【0086】在不同的实施方式中，H-NOX蛋白结合O2的动力学或计算的KD 在相同的条件下(如在20℃)在血红蛋白的大约0.01至大约100倍之内，如在相 同的条件下(如在20℃)，在血红蛋白的大约0.1至大约10倍之间或在大约0.5至 大约2倍之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大 约1μM，如在37℃为至少大约5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、 70μM、80μM、90μM、或100μM的任一个。在一些实施方式中，在37℃没有可 检测到的与O2的结合，如采用如本文所述的紫外-可见光谱法，没有可检测到的 O2结合(如，在O2存在下，在～418nm没有可观察到的峰，例如，当如在O2不 存在的情况下所观察到的Soret峰保持在～431nm时或当由于蛋白质氧化Soret峰 移动到～410nm时)。

【0087】如本文使用的，“NO亲和性”是定性的术语，其指NO结合到蛋白质 的强度(如结合到血红素基或结合到氧，所述氧结合到与蛋白质结合的血红素基 上)。这种亲和性受对NO的koff和kon两者的影响。数值较小的NO KD值意味着 较高的亲和性。“氧亲和性”是定性术语，其指氧结合到蛋白质的血红素部分的强度。 这种亲和性受对氧的koff和kon两者的影响。数值较小的氧KD值意味着较高的亲和 性。

【0088】如本文所用的，“NO稳定性”指在氧存在下蛋白质对NO氧化的稳定 性或抵抗力。例如，蛋白质在氧存在下结合到NO时不被氧化的能力可表示该蛋 白质的NO稳定性。在一些实施方式中，在20℃温育大约1、2、4、6、8、10、 15或20小时的任一段时间之后，大约50、40、30、10或5％的任一个以下的H-NOX 蛋白被氧化。

【0089】如本文所使用，“NO反应性”指的是在2μM蛋白质的浓度下，在氧 存在的情况下，在血红素结合蛋白的血红素中的铁被NO氧化的速率。单位为s-1 的较低数值的NO反应性表示较低的NO反应性。在多种实施方式中，H-NOX蛋 白的NO反应性在20℃小于约700s-1，例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、400s-1、 300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、 1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在多种实施方式中，H-NOX 蛋白的NO反应性在20℃在约0.1到约600s-1之间，例如，在20℃在约0.5到约 400s-1、约0.5到约100s-1、约0.5到约50s-1、约0.5到约10s-1、约1到约5s-1或约 0.5到约2.1s-1之间。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的反应性在相同条件下，如 在20℃，比血红蛋白的反应性至少低约10、100、1,000或10,000倍。

【0090】如本文所使用，“自氧化速率”指的是在血红素结合蛋白的血红素中 铁被自氧化的速率。单位为s-1的较低数值的自氧化速率表示较低的自氧化速率。 在多种实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1.0h-1，例如 在37℃小于约下列值的任何一个：0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、 0.3h-1、0.2h-1、0.1h-1或0.05h-1。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧 化速率在37℃，在约0.006到约5.0h-1之间，例如在37℃，约0.006到约1.0h-1、 约0.006到约0.9h-1或约0.06到约0.5h-1。

【0091】在多种实施方式中，突变H-NOX蛋白具有(a)在血红蛋白的2个数 量级之内的NO或O2解离常数、结合速率(对NO或O2的kon)或解离速率(对 O2或NO的koff)，(b)分别具有比sGC β1弱(例如，至少弱约10倍、100倍或1000 倍)的NO亲和力，(c)比血红蛋白低至少1000倍的与结合O2的NO反应性，(d) 比血红蛋白高至少2、10、100或1000倍的体内血浆保留时间，或(e)前述两种或 多种的任何组合。

【0092】示例性的适当NO载体提供了在血红蛋白的两个数量级之内的解离 常数，即在约0.01到100倍之间，例如在血红蛋白的解离常数的约0.1到10倍之 间，或约0.5到2倍之间。各种已建立的技术可被用于量化解离常数，例如本文所 述的技术(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月). “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.et al.(2005). “Ligand Specificity of H-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg. Biochem.99(4)：892-902)，Vandegriff，K.D.et al.(August 15，2004)“Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)：183-189，它们的每个都在此被完整引入作为参考， 尤其是涉及解离常数的测量)，以及普通技术人员已知的那些技术。示例性的NO载 体为带有结合O2的H-NOX蛋白提供了低的或最小的NO反应性，例如比血红蛋 白低的NO反应性。在一些实施方式中，NO反应性比血红蛋白的NO反应性低得 多，例如低至少约10、100、1,000或10,000倍。多种已建立的技术可被用于量化 NO反应性(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月). “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.et al.(2005). “Ligand Specificity of H-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg. Biochem.99(4)：892-902)，Vandegriff，K.D.et al.(2004年8月15日)“Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)：183-189，它们的每个都在此被完整引入作为参考， 尤其是涉及NO反应性的测量)，以及普通技术人员已知的那些技术。因为野生型腾 冲嗜热厌氧菌H-NOX具有这样的低NO反应性，所以其它野生型H-NOX蛋白和 突变H-NOX蛋白可具有相似的低NO反应性。例如，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H具有与野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX相似的NO反应性。

【0093】用于NO输送的示范性突变体具有比sGC β1弱的的NO亲和性，优 选地弱至少10倍、100倍、或1000倍。对于治疗性NO输送(如，在心脏病发作、 心脏直视手术或中风期间/之后)，一系列具有不同亲和性的工程H-NOX蛋白在特 定的疾病状况下被经验测试功效，在一些实施方式中NO亲和性的范围为0.1至 1000nM。

【0094】此外，适当的NO载体提供了高的或最大的稳定性，特别是体内稳 定性。多种稳定性量度可以被使用，例如氧化稳定性(如，对自氧化或NO氧化 的稳定性)、温度稳定性和体内稳定性。多种已建立的技术可被用于量化稳定性， 例如本文所述的技术(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.1：53-59；Boon，E.M.et al.(2005年 10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)：441-446；Boon，E.M.et al. (2005).“Ligand Specificity of H-NOX Domains：From sGC to Bacterial NO Sensors，” J.Inorg.Biochem.99(4)：892-902)，以及普通技术人员已知的那些技术。对于血浆、 血液或组织中的体内稳定性，示例性的稳定性量度包括保留时间、清除速率和半 衰期。来自嗜热生物体的H-NOX蛋白被预期在高温下稳定。在多种实施方式中， 血浆保留时间比血红蛋白的血浆保留时间高至少约2、10、100或1000倍(例如， Bobofchak，K.M.et al.(2003年8月).“A Recombinant Polymeric Hemoglobin With Conformational，Functional，And Physiological characteristics of an in vivo O2 transporter，”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285(2)：H549-H561)。普通技术人员将 认识到，血红蛋白基载体受到来自血浆的无细胞血红蛋白的快速清除的限制，该 快速清除的原因在于存在将无细胞血红蛋白从血浆中除去的血红蛋白受体。由于 血浆中没有H-NOX蛋白的受体，野生型和突变H-NOX蛋白被预期具有比血红蛋 白更长的保留时间。如果希望，血浆保留时间可以通过聚乙二醇化或交联H-NOX 蛋白，或使用标准方法(如本文所述的那些和普通技术人员已知的那些)将H-NOX 蛋白与另一蛋白融合而提高。

【0095】在不同的实施方式中，H-NOX蛋白的NO解离常数在血红蛋白的 NO解离常数的2个数量级之内，而H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO 反应性低至少10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2 在37℃在大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在 37℃为至少大约1μm。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2 在37℃为大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃ 为至少大约1μm。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或k2在37℃ 为大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为大 约700s-1以下(如，在20℃为大约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。 在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在37℃为至少大约1μM，而H-NOX 蛋白的NO反应性在20℃为大约700s-1以下(如，在20℃为600s-1、500s-1、100 s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对NO的koff、k1或 k2在37℃为大约1×10-4s-1至大约10s-1之间，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化 速率在37℃为大约1h-1以下。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在 37℃为至少大约1μM，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1 以下。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃为大约1h-1 以下，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃为约700s-1以下(如，在20℃为约 600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白 溶液的粘度在1和4厘泊(centipoise(cP))之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋 白溶液的胶体渗透压在20和50mm Hg之间。

【0096】表3列出了野生型和突变H-NOX蛋白的示例性大小、氧亲和性、 自氧化稳定性、NO反应速率以及修饰。在表3中，载体大小是指修饰的(如PEG 化的)或未修饰的H-NOX蛋白的分子量。

表3：H-NOX蛋白的示例性实施方式

  载体大小  氧亲和性   稳定性   (自氧化)   NO   亲和性   NO反应性   (s-1)   颗粒修饰   ＞1MD  至少1μM   1小时   1pM   0.01至0.1   交联   0.5kD至1MD  至少10μM   1小时至12小时   500pM   0.1至1   PEG化   0.1kD至0.5kD  至少50μM   12小时至48小时   1nM   1至10   包封   0.01kD至0.1kD  至少75μM   48小时至2周   1μM   10至100

【0097】在表4-14中报道了具体突变体的示例性数据。在表4-14中，β1和 β2指来自大鼠H-NOX蛋白的蛋白质。由于哺乳动物β1 H-NOX结构域的氨基酸 序列至多两个氨基酸不同，所以对于其它哺乳动物H-NOX蛋白，如人β1中的相 应突变，相似的结果被预期。

【0098】表4表明，NO结合的解离常数可以通过使H-NOX蛋白中的一个 或多个残基突变而显著地改变。另外，变构调节剂显著地影响sGC的NO解离常 数和解离速率的能力支持了这样的突变能力，所述突变改变sGC或其它H-NOX蛋 白的结构以改变NO的解离常数和解离速率。如果需要，通过结合表4中列出的 任何突变或通过将一个或多个另外的突变引入到H-NOX蛋白中，NO结合的解离 常数可以被进一步改变，如本文所述。

表4.NO结合到H-NOX和其它血红素蛋白的KD值

【0099】表5表明，通过突变H-NOX蛋白中的一个或多个残基，NO结合 的解离速率(koff)可以被显著地突变。这些示例性突变H-NOX蛋白的koff在37℃在 0.00013到0.011s-1的范围内。对于表5，应用如在每一引用的文献中指明的化学 阱，得到血红素蛋白的NO解离速率。为了比较，采用NO电极对来自有机硝酸盐 和NONOate的NO解离速率进行了测量并且使用氧基血红素阱进行确认。必要时， 利用大约每10℃速率加倍这一事实将数值调节到37℃。如果需要，通过将表5中 列出的单或双突变的任何组合或通过将一个或多个另外的突变引入到H-NOX蛋 白中，NO结合的koff可以被进一步改变，如本文所述。

表5.血红素蛋白和硝基血管扩张剂在37℃下的NO解离速率的比较。

【0100】如表6中所示，将一个或多个突变引入到野生型H-NOX蛋白中使 自氧化速率和O2解离速率发生改变。如果需要，通过将表6中列出的单或双突变 的任何组合或通过将一个或多个另外的突变引入到H-NOX蛋白中，自氧化速率或 O2解离速率可以被进一步改变，如本文所述。

表6.野生型和II类突变H-NOX蛋白对自氧化的稳定性、O2结合特性(如O2解 离的速率)以及远侧袋H-键合残基被列出。

【0101】表7说明了通过引入一个或多个突变，H-NOX蛋白的O2结合速率 (kon)、O2解离速率(koff)、O2解离常数(KD)以及自氧化速率(kox)的改变。在一些实 施方式中，表7中列出的单或双突变的任一个与另一个突变(如表7中的另一个 突变或本文所述的任何其它突变)结合，以进一步改变O2结合速率(kon)、O2解离 速率(koff)、O2解离常数、自氧化速率或前述两个或多个的组合。

表7.组氨酰基连接的FeII血红素蛋白的O2结合动力学常数

【0102】表8说明，H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧 化速率、NO反应性以及FeII-O2复合物的稳定性可以通过引入一个或多个突变被改 变。在一些实施方式中，表8中列出的任一单突变或双突变与另一个突变(如表8 中的另一个突变或本文所述的任何其它突变)结合，以进一步改变H-NOX蛋白 中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性或FeII-O2复合物的 稳定性。如技术人员将会理解的，一个或多个额外的突变的引入，如本文描述的 那些突变，可以被用于进一步改变这些数值。

表8.H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性 和FeII-O2复合物的稳定性。

【0103】表9表明通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基发生突变，O2结 合的解离常数可以被显著改变。这些示例性的H-NOX蛋白的动力学KD值在20℃ 在21.20nM至1000000.00nM的范围内。如果需要，通过将表9中列出的任一单 或双突变组合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，O2结合的 解离常数可以被进一步改变，如本文所述。

表9.根据O2结合的解离常数的数值排列的野生型和突变的H-NOX蛋白以及参 照蛋白。

 蛋白质   动力学KD(nM)   ±   计算的KD(nM)  Tt P115A   21.2   2.1  Tt N74H   27  Tt I5L-P115A   30  Tt N74A   32  Tt I5A   80  Tt F78Y-Y140L   80  Tt H-NOXHis6   89  Tt H-NOX   89.7   6.2  Tt wt   90  t F78Y-Y140F   150  t W9Y   218

 Tt R135Q His6   252  Hs Hb beta   267  Tt W9F   305   31  Tt W9H   456  Tt Y140H   500  Hs Hb α   560  Tt W9N   573  Tt I75F-His6   713-773  HemAT-B   720  Sw Mb   880  Tt I5L   1000  Tt L144F-His6   1092-1185  Tt Y140L   2000  Tt W9F-Y140H   2500  L2 F142Y   9200   3000  Bj FixL   140000  Tt W9F-N74A   1000000  Dd H-NOX   1000000  β1(1-385)I145Y   1000000

【0104】表10表明，通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基发生突变，O2 结合的解离速率可以被显著改变。这些示例性的H-NOX蛋白的解离速率在20℃ 在0.21s-1到23.4s-1的范围内。如果需要，通过将表10中列出的任一单或双突变 结合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，O2结合的解离速率 以被进一步改变，如本文所述。

表10.根据O2结合的解离速率的数值排列的野生型和突变的H-NOX蛋白以及参 照蛋白。

 蛋白质   koff(s-1)   ±  Tt N74A   0.21   0.004  Tt P115A   0.22   0.01  Tt I5L-P115A   0.28   0.03  Tt N74E   0.38   0.01  Tt N74H   0.44   0.01  Tt I5A   0.82   0.03  Tt F78Y-Y140L   0.83   0.17  Tt H-NOX His6   1.2   0.02  Tt H-NOX   1.22   0.09  Tt F78Y-Y140F   1.48   0.33  L1 F142Y   1.73  Tt W9F   1.84   0.17  β1(1-385)I145Y   2.69   0.61

 Tt W9Y   3.07   0.1  Tt R135Q His6   3.56   0.08  L2 F142Y   3.68   0.71  Tt Y140H   5.03   0.69  Tt W9H   6.42   0.11  Dd H-NOX   7.13   0.45  Tt W9N   8.09   0.14  Tt I5L   9.5   0.64  Tt I75F-His6   10.48   0.12  Sw Mb   15  Tt Y140F   15.7   9.8  Hs Hb β   16  Tt L144F-His6   16.06   0.21  Bj FixL   20  Tt Y140L   20.1   2  HemAT-B   23  Tt W9F-Y140H   23.4   3.7  Hs Hb α   28

【0105】表11表明，通过使H-NOX蛋白中的一个或多个残基发生突变，O2 结合的结合速率可以被显著改变。这些示例性的H-NOX蛋白的结合速率在20℃ 在60μM-1s-1至0.14μM-1s-1的范围内。如果需要，通过将表11中列出的任一单或 双突变结合或通过将一个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，O2结合的结 合速率可以被进一步改变，如本文所述。

表11.根据O2结合的结合速率的数值排列的野生型和突变的H-NOX蛋白以及参 照蛋白。

【0106】表12说明示了例性H-NOX突变对NO和O2结合的影响。表12中 列出的Fe-未连接形式的每一个数字是用于单峰(其被列在β列和α列之间)。当 NO或O2结合时，该单峰分成两个峰，β和α(其被分别列于β列和α列下方)。 如果需要，通过将表12中列出的任一单或双突变结合或通过将一个或多个额外的 突变引入到H-NOX蛋白中，NO或O2结合可以被进一步改变，如本文所述。

表12：一些组氨酰基-连接的FeII血红素蛋白复合物的紫外-可见光峰的位置a。

FeII-NO复合物

FeII-O2复合物

【0107】表13包含一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-O2复合物的UV- 可见光峰的位置。当血红蛋白或H-NOX蛋白厌氧时，其在～431nm处具有一个Soret (索雷)峰，并且其处于未连接态。如果H-NOX蛋白未结合O2，那么当O2被加 入时，该Soret峰不改变。如果H-NOX蛋白结合NO并且形成6-配位的铁-亚硝 酰基复合物，那么当NO被加入时，其Soret峰将移动到420nm和424nm之间。 如果H-NOX蛋白结合NO并且形成5-配位的铁-亚硝酰基复合物，那么其Soret 峰将移动到～399nm。如果H-NOX蛋白没有结合O2，那么当O2被加入时，Soret 峰将不会发生变化。如果H-NOX蛋白结合O2，那么当O2被加入时，其Soret峰 将移动414nm和418nm之间，这与发生在血红蛋白中的移动相同，表示O2结合 到血红素。氧化的H-NOX(Fe(III))的Soret峰可能与储存或使用之后的H-NOX蛋 白的状态有关。如果需要，通过将表13中列出的任一单或双突变结合或通过将一 个或多个额外的突变引入到H-NOX蛋白中，NO或O2结合可以被进一步改变，如 本文所述。

表13.一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO以及Fe(II)-O2复合物的紫外-可见峰光 的位置。

  复合物  蛋白质   Soret   β   α   Fe(II)  Tt wt   430   563  Tt W9Y   430   569  Tt N74A   433   558  Tt N74H   431   561  Tt N74A-Y140H   430   567  Tt W9H   431   563  Tt N74E   433   559  Tt W9N   431   569  Tt wt His6   430   565   复合物  蛋白质   Soret   βa   α   Fe(III)  Tt wt   413   550   585  Tt W9Y   409   N.A.  Tt N74A   416   554   586  Tt N74H   408   N.A.  Tt N74A-Y140H   407   N.A.  Tt W9H   407   N.A.  Tt N74E   408   N.A.

 Tt W9N   408   N.A.  Tt wt His6   413   550   586

a“N.A.”表示由于在较长的波长处的低信号，不可指定的α和β谱带。

  复合物   蛋白质   Soret   β   α   Fe(II)-NO   Tt wt   420   550   578   Tt W9Y   420   552   576   Tt N74A   421   572   Tt N74H   424   562   Tt N74A-Y140H   421   549   576   Tt W9H   420   548   575   Tt N74E   422   544   571   Tt W9N   421   541   576   Tt wt His6   420   547   576   复合物   蛋白质   Soret   β   α   Fe(II)-O2   Tt wt   416   556   591   Tt W9Y   416   555   590   Tt N74A   418   553   589   Tt N74H   418   553   589   Tt N74A-Y140H   414   555   584   Tt W9H   418   556   589   Tt N74E   417   555   587   Tt W9N   416   588   553   Tt wt His6   416   556   591

【0108】表14包含示例性腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白的自氧化速率。如果 需要，通过组合表14中列出的任何突变或通过将一个或多个额外的突变引入到 H-NOX蛋白中，自氧化速率可以被进一步改变，如本文所述。2nm和3nm的值 在表14中是指UV-可见光Soret峰在观察的时间段内偏移2到3nm；这样极小的 改变可能是由于自氧化。

表14.腾冲嗜热厌氧菌(Tt)H-NOX蛋白的自氧化速率

  蛋白质   自氧化速率(25℃，hr-1)a   Tt wt   稳定   Tt W9Y   稳定   Tt N74A   稳定   Tt N74H   在4℃稳定，在RT非常慢(2nm)

  Tt W9H   稳定   Tt N74E   在4℃非常慢(2nm)，在RT缓慢   Tt W9N   在4℃稳定，在RT非常慢(3nm)   Tt wt His6   稳定   Tt I75F-His6   稳定   Tt L144F-His6   稳定

a“稳定”表示在至少24小时之后血红素没有发生氧化。

“RT”表示室温

H-NOX核酸

【0109】本发明也以编码本文所述的任何突变H-NOX蛋白的核酸为特征。 如本文所使用，“核酸”指的是单链或双链形式的两个或多个脱氧核糖核苷酸和/或 核糖核苷酸，并且除非另有限制，包含天然发生核苷酸的类似物，其以与天然发 生的核苷酸相似的方式与核酸杂交。在一些实施方式中，所述核酸为重组核酸。“重 组核酸”表示一种目标核酸，其不含一个或多个在所述目标核酸从中衍生的生物体 的天然发生的基因组中位于所述目标核酸侧翼的核酸(如基因)。在一些实施方式 中，H-NOX核酸被可操作地连接到另一核酸，所述另一核酸编码另一蛋白的全部 或部分，以便该重组核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包括H-NOX蛋白(如，具 有或不具有来自H-NOX蛋白另一结构域的H-NOX结构域)，以及诸如人血清白 蛋白的另一蛋白的全部或部分。该术语因此包括，例如被参入载体、参入自主复 制质粒或病毒、或参入原核生物或真核生物基因组DNA的重组DNA，或者作为 独立于其它序列的单独分子(如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性 核酸内切酶消化产生的cDNA片段)存在的重组DNA。

【0110】本发明也以含有一个或多个编码本文所述的任何突变H-NOX蛋白 的核酸的载体为特征。如本文所使用，“载体”表示能够输送，并任选地在宿主细胞 中表达一个或多个目标核酸的构建体(construct)。载体的实例包括，但不限于， 质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式 中，载体包含在表达调控序列调控下的核酸。“表达调控序列”表示指导目标核酸转 录的核酸序列。表达调控序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者 增强子。该表达控制序列被可操作地连接到待转录的核酸片段。

【0111】在具体实施方式中，所述核酸包括图2-4D或8A-8DD中所示的任何 核酸的片段或完整核酸序列。在一些实施方式中，所述核酸包括至少约50、100、 150、200、300、400、500、600、700、800或更多个连续的来自H-NOX核酸的 核苷酸，并且与其所衍生的H-NOX核酸相比包含一个或多个突变(例如，1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在多种实施方式中，与其从中衍生的H-NOX 核酸相比，突变H-NOX核酸包含少于约任何20、15、12、10、9、8、7、6、5、 4、3或2个突变。本发明也以编码突变H-NOX蛋白的任何核酸的简并变体 (degenerate variant)为特征。

【0112】本发明也包括含有至少一种编码本文所述突变H-NOX蛋白的核酸 的细胞或细胞群。示例性的细胞包括昆虫、植物、酵母、细菌和哺乳动物细胞。 这些细胞可用于使用标准方法——如本文所述的那些方法——生产突变H-NOX 蛋白。

H-NOX蛋白的制剂

【0113】本文所述的任何野生型或突变H-NOX蛋白可被用于药物组合物或 非药物组合物的配制。如下文进一步讨论，这些制剂在多种治疗应用和工业应用 中有用。

【0114】在一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种野生型或突变 H-NOX蛋白(例如本文所述的任何H-NOX野生型或突变蛋白)和药学上可接受 的载体。在多种实施方式中，H-NOX蛋白是分离的或纯化的蛋白质。“药学上可接 受的载体”是表示任何这样的物质——当与活性成分结合时，基于普通技术人员的 知识，其允许所述成分保持生物活性并且不引起不可接受的免疫反应(如严重的 过敏或过敏性休克)。实例包括，但不限于，任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐 溶液、水、乳液如油/水乳液、和各种类型的润湿剂。用于气雾剂或肠胃外给药的 示例性的稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含这类载体的组合物通 过已知的传统方法(参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A. Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000，它们在此被完整引入作为参 考，尤其是涉及制剂的部分)进行配制。

【0115】尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体可被用于本发明的药 物组合物，载体的类型将根据给药方式而改变。组合物可以被配制，用于任何合 适方式的给药，包括，例如静脉内、动脉内、囊内(intravesicular)、吸入、腹膜 内、肺内、肌肉内、皮下、气管内、经粘膜、眼内、鞘内或经皮给药。对于肠胃 外给药，例如皮下注射，载体可包括，例如水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。 对于经口给药，可利用上述载体的任何一种，或者固体载体，例如甘露醇、乳糖、 淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖或碳酸镁。生物可降解 微球(例如，聚乳酸、聚甘醇酸(polylactate polyglycolate))也可被用作载体。

【0116】在一些实施方式中，所述药物组合物或非药物组合物包括缓冲液(如 中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水等)、糖(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精等)、抗 氧化剂、螯合剂(如EDTA、谷胱甘肽等)、防腐剂、用于结合和/或运输氧的另一 种化合物、非活性成分(如稳定剂、填料等)或前述两种或多种的组合。在一些 实施方式中，所述组合物被配制为冻干物。H-NOX蛋白也可能使用公知的技术包 封入脂质体或纳米颗粒中。可以被用于H-NOX蛋白的其它示例性制剂由例如美国 专利号6,974,795和6,432,918进行了描述，其在此被完整引入作为参考，尤其是 关于蛋白质制剂的部分。

【0117】本文所述的组合物可作为持续释放制剂(例如，诸如胶囊或海绵的 制剂，其在给药后产生缓慢释放的化合物)的一部分进行给药。这样的制剂通常 可使用公知的技术加以制备，并通过例如经口、直肠、皮下植入进行给药，或通 过在期望的目标部位植入进行给药。持续释放制剂可含有分散于载体基质中和/或 包含于被速率控制膜包围的储库(reservoir)中的H-NOX蛋白。这类制剂中使用 的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些实施方式中，所述制 剂提供了相对恒定水平的H-NOX蛋白释放。包含在持续释放制剂中的H-NOX蛋 白的量取决于植入部位、释放速率和期望持续时间、以及待治疗或预防的病症的 本质。

【0118】在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的野生型或突变H-NOX 蛋白。术语“有效量”意思是本文所述一种或多种蛋白的这样的量——基于执业专门 医师的知识，与其功效和毒性的参数结合，其在给定的治疗形式中应该有效。如 本领域所知，有效量可以是一个或多个剂量。如临床中所理解，与另一种药物、 化合物或药物组合物一起，药物组合物的有效剂量可能达到或可能不会达到。因 此，有效量可以在给予一种或多种治疗试剂的背景下加以考虑，并且如果与一种 或多种其它试剂结合，期望或有益的结果可以或已经达到，则单一药剂可以被认 为以有效量给药。

【0119】血红蛋白作为血液替代物的示例性剂量为每千克患者体重约10mg 到约5克或更高的胞外血红蛋白。H-NOX蛋白的相似剂量可被用于NO的输送。 因此，在一些实施方式中，给予人的有效量的H-NOX蛋白在数克到超过约350克 之间。H-NOX蛋白的其它示例性剂量包括在适当的输注速率——例如约0.5ml/min (参见，例如Winslow，R.Chapter 12 In Blood Substitutes)下大约4.4、5、10或 13G/DL(其中G/DL是H-NOX蛋白溶液在输注进入循环系统之前的浓度)的任何 一个。在一些实施方式中，10毫克以下剂量的H-NOX蛋白被用于临时性血管舒 张。可以理解，每种剂型的各个剂量中包含的活性成分的单位含量本身不需要构 成有效量，因为必要的有效量可通过多次给药的组合效果达到。包含在药物组合 物中H-NOX蛋白量的选择取决于使用的剂型、治疗的病症、以及根据本领域普通 技术人员确定的要达到的具体目的。

【0120】示例性的组合物包括遗传工程改造的重组H-NOX蛋白，其可被分 离或纯化，所述重组H-NOX蛋白质包含一个或多个突变，所述突变相对于对应野 生型H-NOX蛋白整体上赋予改变的NO或O2配体结合，并作为生理上相容的哺 乳动物血液气体NO载体起作用。例如，本文所述的突变H-NOX蛋白。

【0121】本发明也提供NO载体，其包含一种或多种野生型或突变H-NOX 蛋白或主要由其组成。适合用于配制蛋白质(如被输送到血液或胃肠系统的蛋白 质)的缓冲液和其它成分在本领域内是已知的。

【0122】为了减轻或防止被给予药物组合物的人类对象的免疫反应，人 H-NOX蛋白(野生型人蛋白质或一个或多个突变已经被引入其中的人蛋白质)或 其它非抗原性H-NOX蛋白(如，哺乳动物H-NOX蛋白)可以被使用。为了降低 或消除从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可 以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四级结构表面上 的一个或多个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。

H-NOX蛋白的治疗应用

【0123】本文描述的任何野生型或突变H-NOX蛋白(如分离的或纯化的 H-NOX蛋白)或药物组合物可以在治疗应用中使用。对于所治疗的具体适应征， 基于期望的NO解离常数、O2解离常数、NO koff、O2 koff、NO反应性、NO稳定 性、自氧化速率、血浆停留时间、半衰期或前述两种或多种的任何组合，可以选 择具体的H-NOX蛋白，用于这类应用。H-NOX蛋白可以被用于治疗任何输送NO 对其有益的病症。典型的靶指征包括功能性NO缺乏的疾病，如其中需要血管扩 张剂或NO载体的病症，包括由慢性高血压加剧的病症，如心力衰竭、肾功能衰 竭和中风。在不同的实施方式中，治疗的病症是心血管病症(如，心肌梗塞或心 脏手术)、高血压、血管收缩性病症(如，中风)、勃起功能障碍、便秘、或肠梗 阻。对于便秘或肠梗阻的治疗，H-NOX蛋白可以被用于输送NO，以治疗括约肌 控制缺陷，因而使平滑肌松弛。例如，当在消化系统中起作用的H-NOX蛋白通 过消化系统时，所述H-NOX蛋白可以使回肠的平滑肌松弛。所述方法和组合物 可应用于急性的情况(向组织或特定部位快速提供NO，如急性心肌梗塞或中风) 和慢性的情况(如，慢性高血压或从心肌梗塞或中风的急性后恢复(post-acute recovery from cardiac infarction or stroke))。

【0125】在多种实施方式中，本发明以向个体(例如，哺乳动物，如灵长类 (如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科或猫科)输送NO的方法 为特征，该方法通过给予需要它的个体足以向该个体输送NO的量的野生型或突 变H-NOX蛋白进行。在一些实施方式中，本发明提供了携带或向诸如哺乳动物的 个体输送血液气体的方法，其包括向该个体(如，哺乳动物)的血液输送一种或 多种H-NOX组合物的步骤。用于向血液、消化系统或组织(如，哺乳动物血液或 组织)输送蛋白质的方法在本领域内是已知的。在多种实施方式中，所述H-NOX 蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白或是具有血红素结合的全蛋白质。在向个体 施用H-NOX蛋白之前，H-NOX蛋白可具有或可不具有结合的血红素。在一些实 施方式中，NO在其被输送到个体之前结合到H-NOX蛋白。在其它实施方式中， 在给予所述个体所述蛋白之前，NO未被结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白 将NO从该个体中的一个位置运输到该个体中的另一个位置。例如，在具体的实 施方式中，H-NOX蛋白结合血流中的NO并且只在NO浓度非常低的地方(如血 管收缩部位)释放NO。该NO的靶向输送可以比传统血管扩张剂产生更小的副作 用，所述传统血管扩张剂独立于局部NO浓度而释放NO并且因此全身性起作用， 具有副作用如头痛和周围刺痛。

【0126】本发明的方法可以被用于治疗任何个体。对于本文的应用，除非另 外清楚指出，如本文所使用，“个体”意思是哺乳动物，包括但不限于，灵长类(如， 人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科和猫科。因此，本发明可用于 人类药物和兽医环境，包括在农业牲畜和家养宠物中的用途。所述个体可已经被 诊断患有、被怀疑患有或处于发展某种指征的风险，例如心血管疾病(例如，心 肌梗塞或心脏手术)、高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭 或中风)、血管收缩性病症(如中风)、功能性NO缺乏、勃起功能障碍、便秘、 或肠梗阻。该个体可以是遗传上易于发展这类病症或以其它方式易于发展这类病 症。

【0127】如本文所用的，“需要它的(in need thereof)”包括患有病症或疾病 (如，心血管病症如心肌梗塞或心脏手术，高血压，由高血压加剧的病症如心力 衰竭、肾功能衰竭或中风，血管收缩性病症如中风，功能性NO缺乏，勃起功能 障碍，便秘或肠梗阻)或处于所述病症或疾病的风险中的个体。如本文所使用的， “处于风险中”的个体是处于发展病症如心血管病症(如，心肌梗塞或心脏手术)、 高血压、由高血压加剧的病症(如，心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩性 病症(如中风)、功能性NO缺乏、勃起功能障碍、便秘、或肠梗阻的风险中的个 体。“处于风险中”的个体可以具有或可以不具有可检测的疾病或病症，并且在本 文描述的治疗方法之前可以显示出或不显示出可检测的疾病。“处于风险中”表示个 体具有一个或多个所谓的风险因素，其是与疾病和病症的发展相关的可测量的参 数并且在本领域内是已知的。具有一种或多种这些风险因素的个体比没有这些风 险因素(一种或多种)的个体具有更高的可能性发展所述疾病或病症。这些风险 因素包括但不限于，年龄、性别、种族、饮食、以前的疾病史、前兆疾病的存在、 基因(即，遗传的)考虑因素以及环境暴露。

【0128】这些方法可以被用于治疗或延迟NO输送对其有益的任何病症。“治 疗(treatment)”或“治疗(treating)”表示用于获得有益或期望结果——包括临床 结果——的方法。出于本发明的目的，有益或期望的结果包括，但不限于与病症 (如，但不限于，心血管病症如心肌梗塞或心脏手术，高血压，由高血压加剧的 病症如心力衰竭、肾功能衰竭或中风，血管收缩性病症如中风，功能性NO缺乏， 勃起功能障碍，便秘或肠梗阻)相关的症状的缓解、与病症相关的症状程度的减 弱、或与病症相关的症状恶化的预防。在一些实施方式中，比起与当前可用的疗 法相关的副作用，使用一种或多种本文公开的蛋白质进行的治疗未伴随有副作用 或伴随有更少的副作用。

【0129】如本文所使用，“延迟”疾病或病症的发展表示延迟、阻碍、减缓、 阻止、稳定和/或推迟诸如如心血管病症(如心肌梗塞或心脏手术)、高血压、由高 血压加剧的病症(如心力衰竭、肾功能衰竭或中风)、血管收缩病症(如中风)、 功能性NO缺乏、勃起功能障碍、便秘或肠梗阻的疾病或病症的发展。延迟可以 具有各种时间长度，取决于所述疾病的历史和/或正治疗的个体。如本领域普通技 术人员所知，实际上，足够或明显的延迟可以包括预防，因为个体不发展所述疾 病或病症。例如，当与不使用所述方法比较时，所述方法可降低在给定时帧中疾 病发展的概率和/或减轻所述疾病在给定时帧中的程度。在一些实施方式中，这样 的比较基于使用统计上显著个数的对象进行的临床研究。疾病发展可以是使用标 准临床技术可检测的。发展也可指初始不可检测的疾病的发展，并包括发生、复 发和发病。

【0130】在一些直接输送带有结合NO的H-NOX蛋白到身体中特定部位(如 组织或器官)的实施方式中，对NO koff比KD值重要，因为NO已经结合到所述 蛋白质(使得kon较不重要)并且NO需要在身体中特定部位处或附近处被释放(以 受koff影响的速率释放)。在急性病症治疗的一些实施方式中，H-NOX蛋白具有相 对高的对NO的koff、k1或k2(如至少大约0.05s-1、0.1s-1或1.0s-1的任一个)，以 便血管舒张迅速发生。在一些全身给药的实施方式中，H-NOX蛋白具有相对低的 对NO的koff、k1或k2(如至少大约0.05s-1、0.01s-1或0.001s-1的任一个)，以使 NO直到H-NOX蛋白到达低NO浓度的部位(如血管收缩的部位)才被释放。

【0131】H-NOX蛋白也可以被用于成像(imaging)。具体而言，光成像(例 如，光学相干断层扫描(optical coherence tomography)；参见，例如Villard，J.W. (2002)“Use of a Blood Substitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickening with Optical Coherence Tomography，”Circulation 105：1843-1849，其在此 被完整引入作为参考，尤其是关于光学相干断层扫描)被红细胞变模糊。用H-NOX 溶液灌注允许循环系统和血管壁的图像更清晰，因为H-NOX蛋白比红细胞小的 多。

【0132】本发明的H-NOX蛋白和药物组合物可以通过任何常规手段给予个 体，例如通过经口、局部、眼内、鞘内、肺内、气管内或气溶胶给药；通过经皮 或粘膜吸收；或通过注射(如，皮下、静脉内、动脉内、囊泡内或肌内注射)。H-NOX 蛋白也可以被包含在大体积肠胃外溶液中，用于施用到血液。在示例性的实施方 式中，H-NOX蛋白被施用至个体的血液(例如，施用至血管，如静脉、动脉或毛 细血管)。

【0133】在一些实施方式中，所述组合物的持续连续释放制剂被使用。H-NOX 蛋白的给药可以进行例如数秒到数小时的时间期间，这取决于给药目的。对于急 性病症，示例性的给药时程是尽可能迅速。其它示例性的时程包括大约10、20、 30、40、60、90或120分钟的任何一个。示例性输注速率为从约30mL/小时到约 13,260mL/小时，例如约100mL/小时到约3,000mL/小时。H-NOX蛋白的示例性总 剂量为约900mg/kg，在20分钟内以13,260mL/小时加以施用。对于猪，H-NOX 蛋白的示例性总剂量约为18.9克。

【0134】示例性的给药频率包括，但不限于，每周至少1、2、3、4、5、6 或7次(即每天一次)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白每天至少给药2、3、4 或6次。H-NOX蛋白可以在例如数天或数周的时间段内给药。在一些实施方式中， H-NOX蛋白被给药更长的时间段，例如数月或数年。基于给药医师的判断，所述 组合物的给药频率可以在疗程内加以调整。

【0135】如上文所述，H-NOX蛋白剂量的选择取决于使用的剂型、给药的频 率和次数、治疗的病症和根据本领域普通技术人员确定的所要达到的具体目的。 在一些实施方式中，给予人的H-NOX蛋白的有效量在数克到超过约350克之间。

【0136】在一些实施方式中，两种或多种不同的H-NOX蛋白被同时、顺序 或共同给药。在一些实施方式中，用于O2输送的另一种化合物或疗法与一种或多 种H-NOX蛋白的给药同时、顺序、或共同给予。

H-NOX蛋白的工业应用

【0137】本文所述的H-NOX蛋白和组合物也可以被用于多种体外或工业应 用(参见，例如美国专利号6,455,676，其在此被完整引入作为参考，特别是关于 体外或工业应用)。对于特定的应用，基于期望的NO解离常数、O2解离常数、NO koff、O2 koff、NO反应性、NO稳定性、自氧化速率、半衰期或前述两种或多种的 任何组合，可以选择特定的H-NOX蛋白用于这类应用。在工业应用的多种实施方 式中，H-NOX蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白或带有血红素结合的全蛋白质。

【0138】H-NOX蛋白可以被用于将NO加入到需要NO的溶液中。在使用 需要厌氧发酵的生物反应器的实施方式中，H-NOX蛋白被用于输送NO到细胞。 例如，向线粒体的NO输送可限制氧化磷酸化并且增强通过乳酸盐通路的代谢。 丙酮丁醇梭杆菌中的H-NOX蛋白——其作为生物燃料发生器(biofuel generator) 在厌氧发酵的条件下进行培养——可以天然地发挥此功能。而且，H-NOX蛋白可 以被用于从需要除去NO的溶液中除去NO。例如，H-NOX蛋白可以被用于吸收 或除去生物反应器中的NO，在所述生物反应器中NO是细胞增殖和/或线粒体功能 的抑制剂。除去NO可以改善线粒体功能、限制凋亡、增加每细胞的生产率、或 前述的两种或多种的任何组合。

含有H-NOX蛋白的试剂盒

【0139】也提供了包含本文所述任何H-NOX蛋白及适当包装的制品和试剂 盒。在一些实施方式中，本发明包括试剂盒，其具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文 所述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文所述的它们的制剂)和(ii)使用该试剂盒 向个体输送NO的说明。在多种实施方式中，本发明以试剂盒为特征，所述试剂 盒具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文所述 的它们的制剂)和(ii)将该试剂盒用于本文所述的任何工业应用(如，将NO加入 到溶液或从溶液除去NO)的说明。

【0140】用于本文所述组合物的适当包装在本领域内是已知的，并且包括， 例如，小瓶(如，密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、软包装(如，密封的聚酯 薄膜(Mylar)或塑料袋)等。这些制品可进一步被灭菌和/或密封。也提供了包含 本文所述组合物的单位剂型。这些单位剂型能够以单或多单位剂量被储存在适当 的包装中，并也可被进一步灭菌和密封。本发明的试剂盒中提供的说明通常是在 标签或包装内页(例如，该试剂盒中包含的纸张)上的书面说明，但是机器可读 的说明书(例如，磁盘或光盘上携带的说明书)也是可接受的。涉及H-NOX蛋白 应用的说明通常包括关于目的治疗或工业应用的剂量、给药方案和给药途径。试 剂盒可进一步包括选择适于治疗的个体的描述。

【0141】容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂 量。例如，含有足够剂量本文所公开的H-NOX蛋白的试剂盒也可被提供，以向个 体提供延长时间段的有效治疗，例如，约下列值的任何一个：一周、2周、3周、 4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更 长时间。试剂盒也可包括多单位剂量的H-NOX蛋白和使用说明，并以足以用于药 房——例如医院药房和配药药房(compounding pharmacies)——存储和使用的量 进行包装。在一些实施方式，试剂盒包括干燥(例如，冻干)组合物，其能够被 重构、重悬浮或再水化，通常形成稳定的H-NOX蛋白水混悬液。

H-NOX蛋白的示例性生产方法

【0142】本发明也提供了产生本文所述任何突变H-NOX蛋白的方法。在一 些实施方式中，所述方法包括在适合突变H-NOX蛋白产生的条件下培养具有编码 突变H-NOX蛋白的核酸的细胞。在多种实施方式中，突变H-NOX也被纯化(例 如，从细胞或培养基中纯化H-NOX蛋白)。

【0143】如上文所述，数个野生型H-NOX蛋白和核酸的序列是已知的并且 可以被用于产生本发明所述的突变H-NOX蛋白和核酸。用于重组H-NOX蛋白的 突变、表达和纯化的技术由例如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59和Karow， D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211中描述，其在 此被完整引入作为参考，特别是关于重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化。这些 技术或其它标准技术可以被用于产生任何突变H-NOX蛋白。

【0144】具体而言，本文所述的突变H-NOX蛋白可以通过本领域已知的多 种方法产生。突变可以通过氨基酸的化学修饰发生在氨基酸水平，或通过编码给 定氨基酸的核苷酸序列的改变发生在密码子水平。在蛋白质的任何给定位置处的 氨基酸取代可以通过改变编码该氨基酸的密码子而实现。这可以通过定点诱变， 使用下列进行，例如：(i)Amersham技术(Amersham mutagenesis kit，Amersham，Inc.， Cleveland，Ohio)，其基于Taylor，J.W.et al.(1985年12月20日)“The Use of Phosphorothioate-Modified DNA in Restriction Enzyme Reactions to Prepare Nicked DNA，”Nucleic Acids Res.13(24)：8749-8764；Taylor，J.W.et al.(1985年12月20日) “The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High Frequency Using Phosphorothioate-Modified DNA，”Nucleic Acids Res.13(24)：8765-8785； Nakamaye，K.L.et al.(1986年12月22日)“Inhibition of Restriction Endonuclease Nci I Cleavage by Phosphorothioate Groups and its Application to Oligonucleotide-Directed Mutagenesis，”Nucleic Acids Res.14(24)：9679-9698；和 Dente et al.(1985).在DNA Cloning，Glover，Ed.，IRL Press，pages 791-802中的方 法；(ii)Promega试剂盒(Promega Inc.，Madison，Wis.)；或(iii)Biorad试剂盒(Biorad Inc.，Richmond，Calif.)，其基于Kunkel，T.A.(1985年1月)“Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(2)：488-492；Kunkel，T.A.(1987).“Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection，”Methods Enzymol.154：367-382；Kunkel，美国专利 4,873,192，它们的每一个都在此被引入作为参考，特别是关于蛋白质诱变。诱变 也可以通过其它商业可得的或非商业手段进行，例如使用带有突变核苷酸的定点 诱变的那些手段。

【0145】定点诱变也可以使用基于PCR的诱变进行，例如在Zhengbin et al. (1992).PCR Methods and Applications，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中205-207页；Jones，D.H.et al.(1990年2月).“A Rapid Method For Site-Specific Mutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase Chain Reaction to Generate Recombinant Circles，”Biotechniques 8(2)：178-183；Jones，D.H. et al.(1991年1月).“A Rapid Method For Recombination And Site-Specific Mutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction，”Biotechniques 10(1)：62-66中描述的那些，它们中的每一个都在此被引入 作为参考，特别是关于蛋白质诱变。定点诱变也可以使用盒式诱变，利用本领域 普通技术人员已知的技术进行。

【0146】突变H-NOX核酸可以使用标准技术被参入载体，例如表达载体。 例如，限制性酶可以被用于切割突变H-NOX核酸和载体。接着，被切割的突变 H-NOX核酸和被切割的载体的匹配末端可以被连接。产生的载体可以使用标准技 术(例如，电穿孔)被插入细胞(例如，昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或细菌 细胞)，用于编码的H-NOX蛋白的表达。

【0147】具体而言，异源蛋白质已经被表达在许多生物表达系统中，例如昆 虫细胞、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。因此，合适的生物蛋白表达系统可以 被用于产生大量重组H-NOX蛋白。在一些实施方式中，所述H-NOX蛋白(如， 突变或野生型H-NOX蛋白)是分离的蛋白质。如本文所使用，“分离的蛋白质”表 示从一种或多种组分分离的蛋白，所述蛋白质与所述组分天然相关，所述组分包 括，例如核酸、脂质和其它蛋白质。分离的蛋白质也不存在于蛋白质文库中，例 如具有2、5、10、20、50或更多种不同蛋白质的文库。分离的蛋白质也可以通过， 例如编码该蛋白质的核酸的表达或通过该蛋白质的化学合成而获得。

【0148】如果希望，H-NOX蛋白可以使用标准技术进行纯化。如本文所使用， “纯化的蛋白质”表示，已经从在产生蛋白质时存在的一种或多种组分中分离的蛋白 质(例如，突变或野生型H-NOX蛋白)。在一些实施方式中，所述蛋白质至少不 含按重量计约60％的当产生所述蛋白质时存在的其它组分。在多种实施方式中， 所述蛋白质按重量计至少约75％、90％或99％纯。纯化的蛋白质可以通过，例如 从天然来源、重组表达系统或化学合成的反应混合物进行纯化(如，提取)而获 得。示例性的纯化方法包括免疫沉淀、柱层析例如免疫亲和层析、磁珠免疫亲和 纯化、和使用板结合抗体淘选、以及普通技术人员已知的其它技术。纯度可以通 过任何适当的方法进行测定，例如，通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC 分析。在一些实施方式中，纯化的蛋白质被掺入本发明所述的药物组合物或被用 于本发明所述的方法。本发明所述的药物组合物可具有添加剂、载体或除纯化的 蛋白质以外的其它组分。

实施例

【0149】实施例——其旨在纯粹是本发明的示例并因此不应该被认为以任何 方式限制本发明——还描述并详述了上面讨论的本发明的方面和实施方式。这些 实施例并不旨在表示以下实验是所进行的全部的或唯一的实验。除非另外说明， 温度以摄氏度表示并且压力等于或接近大气压。

实施例1：野生型和突变H-NOX蛋白的产生

【0150】使用标准方法产生、表达和纯化野生型和突变H-NOX蛋白，基本 上如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59和Karow，D.S.et al.(August 10， 2004)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，” Biochemistry 43(31)：10203-10211中所描述，它们在此都被完整引入作为参考，特 别是关于重组H-NOX蛋白的诱变、表达和纯化。使用来自Strategene(La Jolla，CA) 的QuickChange方案进行诱变。蛋白质在细胞培养中的表达及后续的蛋白质纯化 根据Karow，D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)：10203-10211所述进行。

实施例2：突变H-NOX蛋白的表征

计算的对NO的KD：koff与kon的比率

【0151】为了确定计算的对NO的KD，H-NOX蛋白的对NO的kon的值被 假定为710μM-1s-1，并且NO的解离速率(具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋 白的koff或具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的k1或k2)如下所述进行测 定。

koff、k1和k2(NO解离速率)

具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的koff值

【0152】对于具有6-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，NO的koff被计算 出，如由Boon，E.M.等人(August 2006)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem. 281(31)：21892-21902和Boon，E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 1：53-59所描述的，其各自以 其全部内容通过引用并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff的计算。简而言之， 稀释在无氧的50mM三乙醇胺、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中的H-NOX蛋白 的FeII-NO复合物(5μM血红素，终浓度)与饱和一氧化碳和相同缓冲液(无氧的) 中的30mM(终浓度)连二亚硫酸盐阱(trap)(Na2S2O4)迅速混合(Kharitonov，V. G.等人(1997)，Biochemistry 36：6814-6818和Moore，E.G.等人(1976)，J.Biol.Chem. 251：2788-2794，其各自全部内容通过引用并入，尤其是关于NO解离速率的计算)。 以前已经确定，CO结合在这些实验中并非速率限制性的(Kharitonov，V.G等人 (1997)Biochemistry 36：6814-6818)；这在没有CO下仅应用30mM Na2S2O4作为 阱的实验中得到证实。采用具有100微升到1毫升大小和1厘米径长的石英小池 (quartz cuvette)(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)，通过在Cary 3E分光光度 计上定时地扫描而获得数据，所述分光光度计装备有被设定到不同温度(0-70℃) 的Neslab RTE-100恒温浴。当FeII-CO复合物形成时，在423nm处监测来自血红 素的NO的解离。通过从每一后续扫描减去第一次扫描来计算差示光谱(difference spectra)。通过423nm处的吸光度相对于时间的增加确定NO解离速率并且采用 Kaleidagraph 3.X(Synergy Software，Reading，PA)将其以具有f(x)＝A x(1-e-kx)型的 单指数进行拟合。具体而言，血红素-CO浓度的单指数增加(由于来自NO阱的 CO结合)可以由方程1描述：

${\mathrm{\Delta A}}_t={\mathrm{\Delta A}}_T(1-e^{-k_{1}t})$ (方程1)

【0153】其中，ΔAt是在时间t下信号幅度的变化；ΔAT是信号幅度的总变化， 并且k1是观测反应速率常数。每一次实验最少进行六次，并且对获得的速率取平 均。所测量的解离速率独立于CO和连二亚硫酸盐浓度(3、30和300mM连二亚 硫酸盐被检测)。

具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白的k1和k2值

【0154】对于具有5-配位FeII-NO复合物的H-NOX蛋白，对NO的koff通过 对NO的k1和对NO的k2进行描述，如由Winger，J.A.等人(January 2007)， “Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的， 其由此通过引用以其全部并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1以及 NO k2的计算。简而言之，采用以前描述的CO/连二亚硫酸盐捕集法(Cary，S.P.L. 等人(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：13064-13069和Kharitonov，V.G.等 人(1997)，Biochemistry 36：6814-6818，其各自由此通过引用以其全部内容并入，尤 其是关于NO解离速率的计算)，在37℃和10℃测量NO与具有5-配位FeII-NO复 合物的H-NOX蛋白的血红素的解离。如下制备捕集液：使用无氧室(Coy Laboratory Products)，在特氟隆-密封的反应小瓶(Teflon-sealed Reacti-Vial)(Pierce) 中制备连二亚硫酸钠(Na2S2O4)在50mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl中的溶液。 从无氧室移出该溶液并通过使气体通过溶液起泡10分钟用CO饱和该溶液。通过 与过量DEA/NO(在10mM NaOH中)在25℃下在50mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl中温育10分钟，形成H-NOX蛋白-NO复合物。通过追踪Soret最大值从431 至399nm的偏移，确认向亚硝酰基类的全部转化。H-NOX蛋白被放置在隔膜密 封的无氧小池(具有100微升到1毫升的大小和1厘米径长的石英小池)中，并 且使用清除氧的气体组(oxygen-scavenged gas train)进行脱氧。正好在脱氧之前 加入小量的DEA/NO(～3当量)，以维持亚硝酰基类(任何残留物随后被捕集溶液 中大量过量的Na2S2O4破坏)。无氧小池的顶部空间用CO替换，并且所述小池和 捕集溶液在测定温度下平衡1分钟。通过用Hamilton气密式注射器将CO/连二亚 硫酸盐溶液加入到无氧小池中并混合，起始反应。反应混合物中的Na2S2O4的终浓 度为30mM。最终的蛋白质浓度：对于β1(1-194)、β1(1-385)和β2(1-217) 为1.9至2.5μM，而对于sGC为0.88至2.5μM。在捕集液加入之后10秒钟，开 始数据收集。应用装备有Neslab RTE-100温度控制器的Cary 3E分光光度计(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)，通过电子吸收光谱监测反应。在909纳米/分钟下， 以1.5nm的数据点间隔，在380-450nm的范围内收集数据。每18秒钟记录光谱， 进行5分钟；每分钟记录，进行10分钟；以及之后每2分钟记录，共记录3小时 或直到反应完成。从每一光谱中减去缓冲液基线，并且通过标准化至410纳米处 的等吸光点，校正光谱的基线漂移。通过从所有后续光谱中减去时间0时的光谱， 获得差示光谱。从差示光谱中提取出在423纳米处(ΔA423；β1(1-194))和β1(1-385)) 或424纳米处(ΔA424；sGC和β2(1-217))的吸光度的变化值并且将其相对于时间 作图，以获得每一实验的解离时程。重复两次或三次获得解离时程，并且每一实 验在几天内重复2-5次。一般地，由于获得大量的纯化sGC相对困难，全长sGC 的ΔA424值——其与实验蛋白质浓度成比例——比血红素结构域构建物的ΔA424值 小。

【0155】采用Kaleidagraph 3.X(Synergy Software Reading，PA)，进行曲线拟 合、数据分析以及图形产生。来自每一解离实验的数据被拟合到如下面方程2示 出的双指数中，以获得观测速率常数。具体而言，方程2描述了血红素-CO浓度 的双指数增加(由于来自NO阱的CO结合)：

${\mathrm{\Delta A}}_t={\mathrm{\Delta A}}_1(1-e^{-k_{1}t})+{\mathrm{\Delta A}}_2(1-e^{-k_{2}t})$ (方程2)

其中，ΔAt是在时间t时信号幅度的变化；ΔA1和ΔA2是每一指数过程对于信号幅 度总变化的贡献，并且k1和k2是每一过程的观测反应速率常数。

【0156】观测到的数据与其中解离发生于两种5-配位血红素-NO复合物的初 始平衡混合物的模型一致，如方案1中显示。因此，k1对应于NO从血红素-NO5C 构象的解离，而k2代表观测的反应速率，对应于kO-kC，其受到较慢的从血红素 -NO NO*5C到血红素-NO5C的转化的限制。

方案1

具有5-配位和6-配位FeII-NO复合物混合物的H-NOX蛋白的k1和k2值

【0157】对于包含5-配位和6-配位FeII-NO复合物的混合物的H-NOX蛋白， 对NO的koff由对NO的k1和对NO的k2来描述。如同上述对于具有5-配位FeII-NO 复合物的H-NOX蛋白一样，测量对NO的k1和k2，如由Winger，J.A.等人(January 2007)，“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)：897-907所描述的， 其由此通过引用以其全部并入，尤其是关于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1以及 NO k2的计算。

NO的计算的KD

【0158】对于NO的计算的KD，H-NOX蛋白的对NO的kon值被假定为710 μM-1s-1，其是报道的β1(1-385)的kon——其在4℃下测量并且在37℃下没有显著增 加(Zhao等人(1999)，“A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase，”PNAS.96：14753-14758，其尤其通过引用以其全部并入，尤其是 关于H-NOX蛋白的NO kon计算)。因此，通过计算koff、k1或k2(如上述进行测量) 与kon(被假定为710μM-1s-1)之比来确定NO的计算的KD。

O2的动力学KD：koff与kon之比

【0159】测定野生型和突变H-NOX蛋白的动力学KD值，基本上如Boon，E.M. et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，” Nature ChemicalBiology 1：53-59所述进行，其在此被完整引入作为参考，特别是涉 及O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、自氧化速率和NO解离速率。

kon(O2结合速率)

【0160】使用闪光光解法在20℃下测量O2对血红素的结合。由于非常快的 成对重组动力学(geminate recombination kinetics)，不可能闪蒸出(flash off)FeII-O2 复合体；因此，FeII-CO复合体用560nm的激光(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA) 进行闪光光解，产生5-配位的FeII中间体，在不同波长下追踪分子O2与该FeII中 间体的结合。通过用10mM连二亚硫酸盐进行厌氧还原，接着在PD-10柱(Millipore， Inc.，Billerica，MA)上进行脱盐而制备蛋白质样品。该样品随后在受控气氛的石英小 池(quartz cuvette)中在50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中被稀释到 20μM的血红素，石英小池的尺寸为100μL到1mL并且径长为1cm。CO气体在该 小池的顶部空间流动10分钟，以形成FeII-CO复合物，该复合物的形成通过UV- 可见光谱(Soret最大值为423nm)加以确认。该样品随后被用于测量闪光光解后 但仍在1大气压的CO气体下的CO-再结合动力学，或在闪光光解之前，它被打开 并在空气中搅拌30分钟，充分对缓冲液充氧，以观察O2-再结合事件。在多个波 长对时间下，观察O2与血红素的结合。这些迹线使用Igor Pro软件(Wavemetrics， Inc.，Oswego，OR；最新2005版)以单指数拟合。该速率独立于观测波长，但依赖 于O2浓度。UV-可见光光谱自始至终被使用，以确认所有的复合物和中间体(Cary 3K，Varian，Inc.Palo Alto，CA)。瞬时吸收数据使用Dmochowski，I.J.et al.(2000年 8月31日)“Enantiomeric Discrimination of Ru-Substrates by Cytochrome P450cam，”J Inorg Biochem.81(3)：221-228所述的仪器进行采集，其在此被完整引入作为参考， 特别是关于仪器操作。该仪器具有20ns的反应时间，并且数据以200兆样每秒 (megasample s-1)的速率被数字化。

koff(O2解离速率)

【0161】为了测量koff，蛋白质(5μM血红素)的FeII-O2复合物，在无氧的 50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中稀释，与等体积含有各种浓度连二亚 硫酸盐和/或饱和CO气体的相同缓冲液(无氧)迅速混合。在装备有设置为20℃ 的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度计(TGK Scientific LTD.，Bradford On Avon，United Kingdom)上获取数据。O2从血红素的解离 被监控为在437nm——FeII-FeII-O2差示光谱中的最大值——或425nm——FeII- FeII-CO差示光谱中的最大值——处吸光度的增加。最终的迹线使用软件拟合成单 指数，该软件是所述仪器的一部分。每个实验进行最少6次，并且对得到的速率 进行平均。测量的解离速率独立于连二亚硫酸盐浓度(测试了100、50、25、10、 5和2.5mM连二亚硫酸盐)且独立于作为被还原物质的阱(trap)的饱和CO，两 者都在10mM连二亚硫酸盐存在和不存在的情况下。

O2的动力学KD

【0162】通过使用上述koff与kon的测量结果计算koff与kon的比率，确定O2 的动力学KD。

计算的KD

【0163】为测量计算的KD，对如上所述获得的koff值和动力学KD值进行绘 图。koff与动力学KD之间的线性关系通过方程(y＝mx+b)加以定义。然后，koff 值沿图线插入，以使用Excel：MAC 2004(Microsoft，Redmond，WA)得到计算的KD。 在没有测量的kon的情况下，该插值提供了使koff与KD相关的方法。

自氧化速率

【0164】为测量自氧化速率，蛋白质样品被无氧还原，随后在有氧的50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中被稀释到5μM血红素。然后，这些样品在 装备有设置到37℃的Neslab RTE-100恒温浴的Cary 3E分光光度计中温育，并定 期扫描(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)。通过在对时间绘制的并使用Excel： MAC 2004(Microsoft，Redmond，WA)以单指数拟合的FeIII-FeII差示光谱中的最大 值与最小值之间的差确定自氧化速率。

与NO反应的速率

【0165】使用在缓冲液A中以2μM浓度制备的纯化蛋白(Tt WT HNOX、Tt Y140H HNOX和智人血红蛋白(Hs Hb))和在缓冲液A中以200μM制备的NO测 量NO反应性(缓冲液A：50mM Hepes，pH 7.5、50mM NaCl)。在装备有设置为 20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度计(TGK Scientific LTD.，Bradford On Avon，英国)上获取数据。所述蛋白质与NO以1∶1 的比例迅速混合，混合时间0.00125秒。使用软件将最大变化的波长拟合成单指数， 该软件是光度计的一部分，主要测量NO氧化的限速步骤。该反应的终产物对于 H-NOX蛋白是三价铁-NO，而对于Hs Hb为三价铁-水合物。

p50测量

【0166】如果希望，突变或野生型H-NOX蛋白的p50值可以如Guarnone，R. et al.(1995年9月/10月).“Performance Characteristics of Hemox-Analyzer For Assessment of The Hemoglobin Dissociation Curve，”Haematologica 80(5)：426-430所 述加以测量，其在此被完整引入作为参考，特别是关于p50值的测量。使用血氧 分析仪(HemOx-Analyzer)测定p50值。测量室起始于0％氧并缓慢上升，递增至 100％氧。该室中的氧探针测量氧饱和百分比。第二探针(UV-可见光)测量两个 吸收波长，调谐至血红素蛋白(如，诸如与血红素复合的H-NOX的蛋白质)的 UV-可见光光谱的α和β峰。这些吸收峰随着血红素蛋白结合氧而线性升高。然后， 绘制从未结合至100％结合的百分数变化对氧百分数值的图，以产生曲线。p50是 该曲线上的点，在该点50％血红素蛋白结合氧。

【0167】具体而言，血氧-分析仪(Hemox-Analyzer)(TCS Scientific Corporation， New Hope，PA)通过将50μL血液或血红素蛋白暴露于提高的氧气分压并用氮气使 其去氧，来确定氧血红素蛋白(oxyhemoprotein)解离曲线(oxyhemoprotein dissociation curve，ODC)。Clark氧电极检测氧张力的变化，该变化被记录在x-y坐 标记录仪的x轴上。所产生的氧血红素蛋白分数的增长通过双波长分光光度法在 560nm和576nm同时监测，并显示在y轴上。从前中静脉(antemedial vein)取血 样，用肝素抗凝，并在湿冰上保持在4℃，直到测定。50μL全血在5μL的Hemox 溶液中稀释，该溶液是制造商提供的缓冲液，其保持溶液的pH值在7.4±0.01。该 样品-缓冲液被吸入作为血氧-分析仪的一部分的小池，并且混合物的温度被平衡并 带到37℃；该样品随后用空气充氧到100％。调整pO2值之后，该样品用氮气去氧； 在去氧的过程中，曲线被记录在图纸上。p50值使用作为血氧-分析仪一部分的软 件在x轴上外推为这样的点，在该点上O2饱和度为50％。完成记录所需的时间约 为30分钟。

【0168】任何H-NOX蛋白的p50值可以与血红蛋白的p50值比较，作为 H-NOX蛋白相比于血红蛋白对O2的相对亲和性的指示。表13列出了先前报告的 血红蛋白的p50值。

表13.血红蛋白突变体及其报告的氧亲和性

  名称   修饰   KD(nM)   p50   (mmHg)   参考文献/制造   商   血红蛋白   (无基质)   ～400   14   血红蛋白   (RBC的)   27

  Hemopure   (HBOC-201)   牛聚合的(Bovine   polymerized)   36   Biopure   Oxyglobin   (HBOC-301)   牛聚合的(Bovine   polymerized)   54   Biopure   Hemospan   (MP4)   马来酰亚胺-PEG   5   Sangart   Polyheme   吡哆醛   28-30   Northfield Labs   Hemolink   0-蜜三糖   (0-raffinose)   40   Hemosol   Hemassist   琥珀酰水杨酸   (Diaspirin)   32   Baxter

粘度测量

【0169】如果希望，H-NOX溶液的粘度可以使用带有的CPE-40圆锥轴(cone spindle)的锥板式流变计(型号DV-III，Brookfield；Middleboro，MA)以200/s的剪 切速率进行测量。在血液稀释氧输送实验中给予的粘度在1到4厘泊(cP)之间 的溶液被报告为安全(Winslow，R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat，”J Appl Physiol.97(4)：1527-1534，美国专利号6,974,795和6,432,918，它们中的每一个都 在此被完整引入作为参考，特别是关于粘度测量)。因此，在一些实施方式中， H-NOX蛋白溶液的粘度在1和4cP之间。

胶体渗透压测量

【0170】如果希望，胶体渗透压可以使用胶体渗透压计(型号4420，Wescor； Logan，UT)，根据制造商的说明进行测量。测量胶体渗透压的示例性方法在 Vandegriff，K.D.et al.(1997年11月).“Colloid Osmotic Properties of Modified Hemoglobins：Chemically Cross-Linked Versus Polyethylene Glycol Surface-Conjugated，”Biophys.Chem.69(1)：23-30，万维网地址为 “anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php”；美国专利号6,974,795和6,432,918中进 行描述，它们中的每个都在此被完整引入作为参考，特别是关于测量胶体渗透压。 在血液稀释氧输送实验中给予的、胶体渗透压在20到50mmHg之间的溶液被报告 为安全(Winslow，R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat，”J.Appl.Physiol. 97(4)：1527-1534)。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的胶体渗透压在20 和50mm Hg之间。

实施例3：用于NO载体H-NOX突变体的心脏病模型

【0171】两个动物模型可以被用于比较作为NO载体的H-NOX蛋白和标准 硝酸盐疗法的功效。为了在慢性心血管疾病的大鼠模型中比较H-NOX蛋白的效应 与用二硝酸异山梨醇(ISDN)进行的真实NO输送，可以使用雄性Wistar大鼠对 已经建立的方案(Shimamura，S.等人(2006)，J Vet Med Sci Vol.68(3)：213-7，其由此 通过引用以其全部并入，尤其是关于心血管疾病的模型)进行改进。为了模拟心 血管肥大，通过腹侧腹部剖腹手术和在插入的21号针上应用收缩线——其随后被 除去以使血管狭窄一致，腹主动脉被收缩(腹主动脉狭窄或“AC”模型)。假手术组 的大鼠经历相似的手术，但是不产生AC。手术之后，大鼠被随机地分成每组14 只动物的治疗组(7只服药而7只服安慰剂)，并且被允许恢复7天。每组的治疗 (对照组在每一测试情形下以安慰剂进行配对)是：(1)AC大鼠被经口施用 sr-ISDN或安慰剂；(2)AC大鼠被IV施用本文描述的一种或多种野生型或突变 H-NOX蛋白或安慰剂(如失活的H-NOX蛋白)；(3)和(4)假手术组大鼠，分 别如(1)或(2)进行处理。一天一次治疗，共12周，之后在动物被处死，心脏被切离， 进行标准组织病理学分析，用于确定心肌细胞形态、纤维化、胶原沉积、心室直 径、主动脉形态、以及其它标准分析，从而评价疾病进程或预防。

【0172】为了比较H-NOX蛋白与ISDN在介导急性心肌梗塞之后的长期左 心室重塑中的效力，采用标准方案(Bodh I.Jugdutt，MBChB，MSc；Mohammad I. Khan，MBBS(1994).Circulation 89(S))，制作了犬模型，其中ISDN通过长期施用 已经显示出一些功效。对于每一实验，40只健康的任一性别的杂种狗(体重，16 至29千克)在全身麻醉(戊巴比妥钠，30毫克/千克，IV)下进行左外侧切口开 胸手术。聚乙烯导管被插入到颈外静脉、颈内动脉、以及左心房中，所述聚乙烯 导管中充满肝素化盐水，并且它们的末端在颈后外露。丝绸绷带被放置在中左管 状动脉前降支的周围，在第一和第二对角分支之间，并被系上。金属珠被缝合在 左中心室水平处的短轴平面中的心内膜前表面、心内膜侧表面和心内膜后表面， 以使系列局部图像的回波心脏描记的方向一致。心包和胸腔随后被关闭。青霉素 (1百万单位)和链霉素(1克)被肌肉内给药，并且所述狗返回到它们的笼内。

【0173】冠状动脉结扎后两天，70只健康的生还者被随机进行硝酸盐治疗 (n＝10)、H-NOX蛋白治疗(如，一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白，其已 经任选地使用本文描述的任一测定方法进行了体外表征并且任选地进行了毒性和/ 或药物代谢动力学的优化)(10只)、以及匹配的对照亚组(没有治疗，n＝20)：亚 组1(10只对照，10只硝酸盐)和亚组2(10只对照，10只H-NOX蛋白)。所 述狗被允许自由进食流体，并且没有试图通过流体限制或药物治疗来治疗心力衰 竭。在第六周，存活的狗被麻醉，并且用过剂量的静脉内氯化钾将心脏固定在舒 张期，切离心脏，在生理盐水溶液中洗涤并称重。取出血液样品，用于监测血液 气体、血像、和电解质。应用标准程序，进行康复期间的测量(如ECG’s、血液动 力学，等)，并且验尸分析包括上述对于慢性心力衰竭的那些测量(如，胶原堆积、 肌细胞形态学，等等)。在心肌梗塞和/或慢性AC模型实验中与ISDN(用于急性 和慢性心力衰竭的基于硝酸盐的治疗的护理标准)一样有效或更有效的H-NOX蛋 白对于心力衰竭和/或慢性AC的治疗特别有用。预期这样的H-NOX蛋白对于治疗 NO输送对其有益的其它指征也是有用的。

【0174】前述实施例和详细描述通过阐述的方式而非通过限制的方式给出。 本说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利通过引用并入本文，如同每个单 独的出版物、专利申请或专利被具体地并各自地被指出通过引用而并入。尽管出 于清楚理解的目的，前述发明已经通过举例说明和实施例的方式以一些细节进行 了描述，但考虑根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言非常明显的是， 可以对本发明进行某些变化和修改而不背离所附权利要求书的精神或范围。

【0175】除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所 属领域普通技术人员通常理解的那些。本领域普通技术人员也将理解，与本文所 描述的那些相似或等价的任何方法及材料也可以用于实施或测试本发明。

【0176】对于本文中的使用，除非另外明确指出，术语“一种/一个(a)”、“一 种/一个(an)”及类似表达的使用指的是一个(种)或多个(种)。

【0177】提到“大约”，本文的值或参数包括(并描述了)涉及该值或参数本 身的实施方式。例如，提到“大约X”的描述包括“X”的描述。

【0178】应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包含 (comprising)”、“由……组成(consisting)”和“主要由……组成(consisting essentially of)”的方面和实施方式。

相关申请的交叉引用

【0001】本申请要求由Michael A.Marletta、Stephen P.L.Cary、Elizabeth M. Boon和JonathanA.Winger于2006年5月22日提交的、标题为“Engineering H-NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery(用于治疗性一氧化氮和氧 输送的工程H-NOX蛋白)”(UC案号为B06-084)的美国临时申请系列号60/921,505 的权益。该美国临时申请于2007年5月1日从2006年5月22日提交的美国实用 申请系列号11/440,588转变为临时申请，其公开内容通过引用各自以其全部并入 本文。

关于联邦赞助的研究或开发的声明

【0002】本工作由编号为DE-AC03-76SF的基金支持。美国政府对授予本申 请的任何专利可能拥有权利。