声敏纳米粒子
阅读：80发布：2020-05-12
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1.用于在声波作用下诱导介体中的空化作用的纳米粒子，所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为5至50nm的表面形貌。
2.用于治疗体内肿瘤的纳米粒子，所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为
5至50nm的表面形貌，由此布置所述纳米粒子以在用压力波对身体进行声波作用时增强身体内的空化作用。
3.用于治疗肿瘤组织的系统，所述系统包括压力波源和用于运送至所述组织的纳米粒子，所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为5至50nm的表面形貌，由此布置所述纳米粒子以在用来自所述压力波源的压力波对所述组织进行声波作用时增强所述组织内的空化作用。
4.控制组织内空化作用的方法，所述方法包括将纳米粒子运送至所述组织，和用压力波对所述组织进行声波作用，其中所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为5至
50nm的表面形貌。
5.使目标物成像的方法，所述方法包括将纳米粒子运送至所述目标物，其中所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为5至50nm的表面形貌，和用压力波对所述目标物进行声波作用使得所述纳米粒子诱导所述目标物内的空化作用，借助于检测器检测通过空化作用产生的压力波，和处理来自所述检测器的信号以产生所述目标物的图像。
6.监测将治疗物质运送至组织的方法，所述方法包括将所述治疗物质和纳米粒子运送至所述组织，其中所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为5至50nm的表面形貌，和用压力波对所述组织进行声波作用使得所述纳米粒子诱导所述组织内的空化作用，借助于检测器检测通过空化作用产生的压力波，和处理来自所述检测器的信号以监测所述运送。
7.将治疗物质运送至组织的方法，所述方法包括将所述治疗物质和纳米粒子运送至所述组织，和用压力波对所述组织进行声波作用，其中所述纳米粒子的直径为10至1000nm且具有深度为5至50nm的表面形貌。
8.根据前述权利要求中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述表面形貌由直径为
5-50nm的球体或部分球体形成，或由深度为5-50nm和/或宽度为5-50nm的凹陷形成。
9.根据前述权利要求中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述纳米粒子是疏水的。
10.根据前述权利要求中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述纳米粒子携载药物。
11.根据前述权利要求中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述纳米粒子是形成空心的纳米胶囊。
12.根据前述权利要求中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述纳米粒子是冻干的或喷雾冻干的或喷雾干燥的。
13.根据前述权利要求中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述纳米粒子各自通过提供芯并在所述芯上形成壳而形成。
14.根据权利要求13的纳米粒子、系统或方法，其中所述芯由聚苯乙烯制成。
15.根据权利要求13或权利要求14的纳米粒子、系统或方法，其中所述壳至少部分由二氧化硅或二氧化钛形成。
16.根据权利要求13至15中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中移除所述芯从而留下空心的壳。
17.根据权利要求13至16中任一项的纳米粒子、系统或方法，其中所述壳至少部分由直径为5至50nm的粒子形成由此得到所述表面形貌。
18.根据权利要求4至7中任一项的方法或根据权利要求3的系统，其中所述压力波的频率为至少100kHz。
19.根据权利要求4至7或18中任一项的方法或根据权利要求3的系统，其中所述压力波的频率为至少500kHz。
20.根据权利要求4至7、18或19中任一项的方法或根据权利要求3的系统，其中所述压力波的频率不大于10MHz。
21.根据权利要求4至7或18至20中任一项的方法或根据权利要求3的系统，其中所述压力波的频率不大于5MHz。
声敏纳米粒子
技术领域
背景技术
[0002] 长期以来超声治疗过程的空化作用的重要性是已知的，因为在体内激活空化作用方面具有困难。迄今为止用于降低空化阈值的最常用方法是使用由脂质或蛋白质外鞘(也称为超声造影剂)稳定的可注射微泡。即使这些试剂将会降低阈值，但是它们的尺寸使得它们不适宜在微血管循环中特别是在肿瘤中积聚。因为它们包裹气体，因此这些微泡在体内历经几小时的过程中也将会改变它们的尺寸和性质。
[0003] 也已知可借助于声学液滴汽化(acoustic droplet vaporisation)形成气泡(参见http://www.ultrasound.med.umich.edu/Projects/ADV.html)。在该方法中，使过热的通常为纳米范围的液滴(如全氟烃)在声激发之后膨胀，得到充满蒸气的气泡。缺点是，它们在体内的稳定性仍未证实；事实是，产生的气泡本质上是蒸气气泡，这意味着难以使其依惯性塌陷。因此不能产生与使用本发明的惯性空化作用有关的治疗生物效果。
发明内容
[0004] 制造表面粗糙的纳米粒子的方法，所述纳米粒子尤其可以在暴露于诊断或治疗超声时促进声空化的开始。
[0005] 主要应用旨在将治疗超声与用于目标药物运送的那些纳米粒子组合。声空化，即在声场作用下气体或蒸气填充的空穴的非线性振动，已经显示出可在几种超声治疗应用中起到关键作用，包括目标药物的释放和运送，和治疗剂从血流外渗进入周围的组织。
[0006] 但是，在体内存在极少可使声空化结种的本身可用的核，因此为了使该过程开始需要极大的压力变化幅度。本发明的一些实施方式旨在制备生物相容的纳米粒子以在超声激发下促进空化作用的开始，所述纳米粒子具有正确尺寸以在肿瘤中进行自然积聚(10-1000nm)，并且具有正确的表面特征(例如疏水性和表面粗糙度)。可以使用这些粒子，来简单地降低已经发现空化作用的重要作用的超声治疗应用中的空化阈值，例如通过高强度聚焦超声的非侵入性消融(non-invasive ablation)，超声增强的溶栓治疗，声孔效应(sonoporation)，超声促渗(sonophoresis)，打开血脑屏障，碎石术(lithotripsy)。但是，那些声敏纳米粒子可以附接于药物、疫苗或其它治疗剂或与药物、疫苗或其它治疗剂组合，从而也使得能够释放和运送空化作用调节的目标药物。
[0007] 所需粒子可以通过任何适宜的方法获得。优选地，它们通过以下技术之一(但不限于)制备：层层组装(layer-by-layer assembly)，喷雾冻干，乳化技术(例如单和双乳液技术)，乳液扩散，聚合物凝聚，纳米沉淀和喷雾干燥。最终粒子的粒径可以为10nm至1000nm(例如通过动态光散射，扫描电子显微镜法，透射电子显微镜法，或其它适宜的粒度测定法测得)。粒子群体可以显示出单分散性或多分散性尺寸分布。粒子可以具有空心或实心的芯。粒子具有粗糙的表面形态(通过扫描电子显微镜法确定)，其表面积大于理想球体的表面积(通过气体吸附，BET确定)。粒子可以由多种物质组成，这些物质包括但不限于(i)天然和合成生物相容的和/或可生物降解的聚合物例如聚(乳酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚(己内酯)，聚(乙二醇)，(ii)无机物质例如金，二氧化硅和二氧化钛等。
[0008] 也已知可使用纳米级载体用于通过超声释放目标药物。这些载体通常采取脂质体或胶束的形式。胶束载体可以是热敏的，即具有在加热后的给定温度变得泄露的外壳。这样的载体必需使用治疗超声的显著的能量输入以便于释放它们的有效载荷。可以使其它脂质体或胶束载体通过在机械力下使脂质体或胶束破裂来释放它们的有效载荷，该机械力可能由空化作用引起(参见Evjen TJ，Nilssen EA， S，Brandl M，Fossheim SL.Distearoylethanolamine-based liposomes for ultrasound-mediated drug delivery.Eur J Pharm Biopharm.2010；75(3):327-33)，但是因为载体本身对局部空化阈值没有影响，已知实现空化所需的压力变化幅度会非常高(高于15MPa，在MHz频率范围内)。
[0009] 在一些实施方式中，本发明可以通过使用稳定的固体纳米粒子实现在微脉管化的组织中局部改变空化阈值。因为空化作用是受压力驱动的而非能量驱动的现象，超过空化阈值的短脉冲超声可能足以释放封装的药物。因此，这可以提供通过超声实现的低能量释放机制。
[0010] 预期本发明在整个超声治疗领域都具有广泛的适用性，如上所述。不限于卫生保健但与声波组合的应用包括声化学，化学工程，或其中促进声空化的开始是重要的任何其它应用。
[0011] 本发明涉及的科学是鉴定方法，所述方法可以适当地改变纳米粒子的疏水性和表面粗糙度由此捕获瞬时量的气体以便于在暴露于负压时促进空化作用开始。此外，对组织中声空化的实验和数学研究的新近组合(S.Labouret and C-C.Coussios，J.Acoust.Soc.Am，2011，in press)已经证明，在关于通过组织中空化核可见的表面张力和粘弹性性质的某些假设下，具有特定尺寸的核更可能在特定激发频率下惯性空化。特别地，该研究已经表明，为使在低于负3MPa峰值的压力变化幅度的单循环声激发发生空化行为，在1.6MHz需要小于或等于8nm的核，在1MHz需要小于或等于11nm的核，在0.5MHz需要小于或等于28nm的核。
[0012] 在本发明的实施方式中，本发明利用此点在于，如果具有特定尺寸的核在粗糙纳米粒子表面上形成，则它们将优先在特定激发频率响应。
[0013] 本发明因此进一步涉及调节纳米粒子的疏水性和表面粗糙度由此捕获瞬时量的特定尺寸范围的气体以便于在暴露于处于特定超声频率的负压时促进空化作用开始。
[0014] 本发明因此提供用于在声波作用下诱导介体(medium)中的空化作用的纳米粒子，所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌(surface feature)。
[0015] 本发明还提供用于治疗体内肿瘤的纳米粒子，所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌，由此布置所述纳米粒子以在用压力波对身体进行声波作用时增强身体内的空化作用。
[0016] 本发明还提供用于治疗肿瘤组织的系统，所述系统包括压力波源和用于运送至所述组织的纳米粒子，所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌，由此布置所述纳米粒子以在用来自所述压力波源的压力波对所述组织进行声波作用时增强所述组织内的空化作用。
[0017] 本发明还提供控制组织内空化作用的方法，所述方法包括将纳米粒子运送至组织，和用压力波对所述组织进行声波作用，其中所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌。
[0018] 本发明还提供使目标物成像的方法，所述方法包括将纳米粒子运送至所述目标物，其中所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌，和用压力波对所述目标物进行声波作用使得所述纳米粒子诱导所述目标物内的空化作用，借助于检测器检测通过空化作用产生的压力波，和处理来自所述检测器的信号以产生所述目标物和/或空化区的图像。
[0019] 本发明还提供监测将治疗物质运送至组织的方法，所述方法包括将所述治疗物质和纳米粒子运送至所述组织，其中所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌，和用压力波对所述组织进行声波作用使得所述纳米粒子诱导所述组织内的空化作用，借助于检测器检测通过空化作用产生的压力波，和处理来自所述检测器的信号以监测所述运送。
[0020] 本发明还提供将治疗物质运送至组织的方法，所述方法包括将所述治疗物质和纳米粒子运送至所述组织，其中所述纳米粒子的直径不大于1000nm(任选为10至1000nm)且具有深度不大于50nm(任选为5至50nm)的表面形貌，和用压力波对所述组织进行声波作用。
[0021] 本发明还提供将纳米粒子的位置绘图并将治疗物质运送至组织两者的方法。这可以通过使用具有空化核的两个或更多个特征长度标尺(characteristic lengthscale)的纳米粒子实现：第一成核长度标尺在特定的激发频率下响应以诱导针对使粒子位置成像的目的的空化作用，而第二长度标尺在不同的激发频率下响应从而引起增强治疗物质运送(例如通过纳米粒子破裂进行)的惯性空化，从而实现包封的治疗物质的运送。在一些实施方式中，可以使用两组纳米粒子(各自在长度标尺之一具有表面特征)的混合物，在一些实施方式中可以使用在两种长度标尺都具有表面形貌的纳米粒子。
[0022] 优选的粒径通过生理因素确定。至多1000nm的粒子将容易由普通微脉管系统(例如脑部药物运送给药中所涉及的)吸收。但是，小于约600nm的粒子容易由漏的肿瘤脉管系统(leaky tumour vasculature)(在增强的渗透性和保留效应或EPR下)所保留。直径为100-300nm的粒子优先由肿瘤脉管系统吸收。因此在以上所有情况下，纳米粒子的直径可以不大于800nm，例如直径可以为50-800nm。在一些情况下，直径可以不大于600nm，例如直径可以为50-600nm。在一些情况下，直径可以不大于300nm，例如直径可以为50-300nm。在一些情况下，优选直径可以为至少100nm，例如直径可以为100-300nm。直径可以测量为中值直径，例如粒子的体积瞬时中值直径D(4,3)。
[0023] 表面形貌可以由粒子形成，所述粒子可以是球体或部分球体(part-sphere)。粒子的直径可以为不大于50nm，例如为5-50nm。表面形貌可以由深度不大于50nm(例如为5-50nm)、或宽度不大于50nm(例如为5-50nm)的凹陷形成，以便于匹配优选的核尺寸用于在特定的超声激发频率进行声空化。
[0024] 在所有的以上方法和系统中，超声的频率可以为至少100kHz。确实在每种情况下，超声的频率可以为100kHz至10MHz的范围内。在每种情况下，超声频率可以为至少500kHz。在每种情况下，频率可以为500kHz至5MHz。
[0025] 纳米粒子可以是疏水的，它们的疏水性主要通过选择形成纳米粒子外层的材料确定。这样的材料因此应该表现出高接触角，理想地大于60度，这通过以下方法之一测得：静态固着液滴法；动态固着液滴法，动态Wilhelmy方法，单纤维Wilhelmy方法或粉末接触角方法。因此优选接触角等于或大于二氧化硅接触角的材料。
[0026] 纳米粒子可以携载药物。例如，纳米粒子可以是包含药物的形成空心的纳米胶囊，或者可以将药物结合到纳米粒子的结构中。
[0027] 纳米粒子可以是冻干的或喷雾冻干的或喷雾干燥的。这可以在将药物包封进粒子中之后进行。这可以提供所需等级的表面形貌。在其它情况下，其它表面改性法可以用于确保存在所需等级的表面形貌。
[0028] 纳米粒子各自可以通过提供芯并在芯上形成壳而形成。芯可以由例如聚苯乙烯制成。壳可以至少部分由二氧化硅或二氧化钛形成。可以移除芯，留下空心的壳。
[0029] 壳可以至少部分由直径为5至50nm的粒子形成由此提供表面形貌。
附图说明
[0031] 图1是制备根据本发明实施方式的纳米粒子的方法中的步骤的示意图；
[0032] 图2是根据本发明实施方式形成的芯-壳纳米粒子的一组图像；
[0033] 图3是根据本发明实施方式形成的芯-壳纳米粒子的另一组图像；
[0034] 图4是根据本发明实施方式形成的壳纳米粒子的另一组图像；
[0035] 图5是显示各种物质的空化概率与峰值压力之间关系的曲线图；
[0036] 图6是显示各种物质的空化噪声发射与峰值压力之间关系的曲线图；
[0037] 图7是显示各种物质的空化概率与峰值压力之间关系的曲线图；
[0038] 图8是显示各种物质的空化噪声发射与峰值压力之间关系的曲线图；
[0039] 图9是通过单乳液形成的粒子的一组图像；
[0040] 图10是通过具有樟脑的单乳液形成的粒子的一组图像；
[0041] 图11是通过双乳液形成的粒子的一组图像；
[0042] 图12是根据本发明实施方式操作的系统的图形表示；
[0043] 图13是显示水、和包含根据本发明实施方式的纳米粒子的血液、和不含纳米粒子的血液的空化阈值的图表；
[0044] 图14a，14b和14c是显示针对各涂层粒子尺寸，在不同超声频率，空化概率与峰值压力的关系图；和
[0045] 图15a，15b和15c是显示针对各纳米粒子尺寸，在不同超声频率，空化概率与峰值压力的关系图。
[0046] 优选实施方式
[0047] 适用于本发明的纳米粒子可以按多种不同方式制备，以下将描述其中一些实例。
[0048] 层层组装
[0049] 参照图1，根据本发明一种实施方式的纳米粒子在层层组装方法中制备。尺寸为20nm至600nm的适宜的纳米粒子(如聚苯乙烯，金等)用作层层聚合电解质沉积作用的模板。用超声作用使阴离子模板粒子悬浮在溶液中，接着用阳离子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)在0.5M NaCl中的溶液培养，使得PDADMAC沉积于模板表面，如图1(a)中所示。将粒子以13,500xg离心以形成纳米丸粒并用超声使其重新悬浮在去离子水中。在这些条件下再清洗粒子两次以除去过量的PDADMAC。最后使粒子重新悬浮于阴离子聚合物聚苯乙烯磺酸盐(PSS)在0.5M NaCl中的溶液并对其进行培养以确保PSS沉积于阳离子涂布的表面，如图1(b)所示。然后再次以13,500xg将溶液离心以形成纳米丸粒，如图1(c)所示。再次清洗粒子两次以除去过量的PSS。最后使粒子重新悬浮于阳离子聚合物PDADMAC在0.5M NaCl中的溶液，并用去离子水再次清洗三次以确保从粒子除去过量的电解质。最后重新悬浮于硅胶( )的溶液，即在0.1M NaCl中的40%溶液。在培养以确保SiO2沉积于阳离子涂布的表面之后，如图1(d)所示，通过重复离心-重新悬浮步骤再次清洁粒子以从粒子除去过量的二氧化硅。然后将粒子清洁并冻干以便于除去任何水并确保空气被捕获在粒子表面上。
[0050] 如上制备的粒子可以原样使用，所述粒子包含芯和壳，并且由于沉积在表面上的SiO2粒子而具有表面粗糙度。但是，无机(SiO2/TiO2)壳纳米粒子可以通过使上述芯壳表面粗糙化的纳米粒子煅烧或化学分解以除去芯而制备。
[0051] 在一种实施方式中，如下将上面制备的表面粗糙化的粒子制成空心：在所述冻干步骤之前，对芯粒子进行煅烧或化学分解。或在炉内干燥(煅烧，例如聚苯乙烯芯纳米粒子)之后使用粒子，或者使粒子重新悬浮于去离子水或聚合物/表面活性剂稳定剂溶液，接着进行冻干(芯粒子的化学分解)。
[0052] 在上述方法的一个实例中，在制备300nm粒子中，在旋转下将150μl的0.3μm聚苯乙烯胶乳与30ml PDADMAC(1mg/ml，0.5M NaCl)培养30分钟以确保聚合物沉积于聚苯乙烯芯表面。使样品以13,500xg离心20分钟，然后使其在去离子水中的超声浴内再分散，之后以13,500xg再次进一步离心20分钟。该离心-重新悬浮清洗循环总共重复三次，最后重新悬浮于30mlPSS溶液(1mg/ml，在0.5M NaCl中)。在旋转下将样品培养20分钟，之后通过三次重复的上述离心-重新悬浮清洗循环进行清洗。在清洗之后重新悬浮于第二个30ml PDADAMAC溶液(1mg/ml，0.5M NaCl)另外20分钟并通过离心-重新悬浮循环再清洁粒子另外三次。最后重新悬浮于30ml 溶液(40%v/v溶液，在0.1M NaCl中)并培养20分钟，接着进行三次最终的离心-重新悬浮清洗步骤。然后用超声作用将粒子重新悬浮于10ml去离子水，接着进行冻干，以便于除去任何水并确保空气被捕获在粒子表面上。
[0053] 所得粒子显示于图2和3，从这些图可以看出，粒子的直径为所预期的约300nm，SiO2的粒子存在于纳米粒子的表面上并且直径为约15-20nm。这使得纳米粒子的表面具有深度为5至20nm的表面形貌。例如，当SiO2在下面纳米球体的相对光滑表面上形成部分球体形貌时，光滑表面之上的形貌中至少一些的高度为2至20nm。当SiO2粒子靠近在一起并形成基本上整个纳米球体的表面时，每个SiO2粒子仍形成表面形貌并且具有的深度为5-20nm。可知，SiO2粒子的表面本身将具有表面粗糙度，在较小尺度上具有表面形貌。同样，例如由于层层工艺中芯形状不规则或不均匀性，纳米粒子可以在较大尺度上具有不规则性。但是，这些不会显著改变5-20nm范围内的表面粗糙度对空化作用的影响。清楚的是可使用不同尺寸的SiO2粒子，纳米粒子可以接纳稍不同尺度的表面粗糙度，例如至多50nm。
[0054] 在通过煅烧来自上述芯-壳表面粗糙化的纳米粒子的聚苯乙烯模板制备空心无机(SiO2/TiO2)壳纳米粒子的实例中，将5ml以上制备的清洁过的重新悬浮的表面粗糙化的芯-壳纳米粒子在大气环境中以受控方式加热至600°C并在最终温度保持4小时以确保聚苯乙烯芯完全煅烧。所得粒子如图4所示，从中可以看出纳米粒子是空心的，其中壳主要由紧密接触的SiO2粒子形成，其中壳为两个或三个粒子厚。因此，在该情况下，表面粗糙度再次具有表面形貌，它们各自由SiO2粒子之一的一部分形成并且深度为至多约SiO2粒子的直径，即约20nm。
[0055] 参照图5，用1MHz治疗超声对各种物质进行声波作用，使用布置以检测通过空化作用产生的超声的超声检测器阵列测量空化的概率。测试物质是普通的水，包含通过层层TM法形成的300nm粒子且不含Ludox 的水，包含通过层层法形成的300nm粒子且含有用于增TM
加表面粗糙度的Ludox 的水，和普通的Ludox。正如所见，纳米粒子的存在增强了空化作用，但是较粗的纳米粒子会进一步增强空化作用。
加表面粗糙度的Ludox 的水，和普通的Ludox。正如所见，纳米粒子的存在增强了空化作用，但是较粗的纳米粒子会进一步增强空化作用。
[0056] 图6是显示来自相同实验的空化噪声发射与峰值压力之间关系的曲线图。
[0057] 图7是类似于图5的曲线图，但是对于直径为300nm和600nm的纳米粒子，各自用TMLudox 形成。图8显示来自相同实验表示为类似于图6的空化概率的结果。正如所见，与较小的粒子相比，较大的粒子增加的空化作用较多。
[0058] 乳化方法
[0059] 根据本发明实施方式的纳米粒子可以通过单乳液法或双乳液法制备。在单乳液法的一种情况中，将适宜的不溶于水的聚合物(如PLGA，PLA等)溶解于不与水溶混的有机溶剂(如水饱和的二氯甲烷或氯仿)中。可以添加成孔物质(如樟脑)和/或活性药剂。然后使所得溶液在较大体积的稳定剂水溶液中乳化以形成水包油(o/w)乳液。使用的稳定剂通常是表面活性聚合物例如泊洛沙姆或聚乙烯醇或o/w-表面活性剂例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。乳液的均化可以使用超声均化器、高压均化器、高剪切均化器或其它进行以便于获得纳米乳液，该纳米乳液包含分散在稳定剂水溶液中的有机聚合物溶液的纳米液滴。有机溶液与液体稳定剂溶液的体积比通常为(但不限于)1:5至1:10。然后在恒定的搅拌下将所得乳液倒入过量的水中或与水溶混的溶剂在水中的低浓度溶液(如2%异丙醇溶液)中以实现有机溶剂从内部油相扩散进入外部水相并由此使粒子变硬。然后清洁并冻干粒子以除去任何水并使成孔物质升华。
[0060] 在双乳液法的一种情况中，使少量水在不溶于水的聚合物(如PLA，PLGA)在有机溶剂(不与水溶混)的有机溶液中乳化以便于获得油包水(w/o)-乳液。有机相可以另外包括(w/o)-表面活性剂(如聚山梨醇酯20或80)和成孔物质(如樟脑)。水相与有机相的体积比通常为(但不限于)1:5至1:10。乳化使用超声均化器、高压均化器、高剪切均化器或其它进行以便于获得纳米乳液，该纳米乳液包含分散在有机溶液中的含水纳米液滴。然后使所得w/o-乳液乳化进入稳定剂水溶液以形成(w/o/w)双乳液。使用的稳定剂通常是表面活性聚合物例如泊洛沙姆或聚乙烯醇或o/w-表面活性剂例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。双乳液的均化可以使用超声均化器、高压均化器、高剪切均化器、或其它进行以便于获得纳米乳液。第一乳液和液体稳定剂溶液的体积比通常为(但不限于)1:5至1:10。然后在恒定的搅拌下将所得双乳液倒入过量的水中或与水溶混的溶剂在水中的低浓度溶液(如2%异丙醇溶液)中以实现有机溶剂从内部油相扩散进入外部水相并由此使粒子变硬。然后清洁并冻干粒子以除去任何水并使成孔物质升华。
[0061] 单乳液实施例：
[0062] 首先，将250mg樟脑溶于100ml二氯甲烷。第二，将2500mg PLGA溶于100ml樟脑溶液，得到最终油相。在4°C将20ml所得PLGA溶液添加到100ml的50mg/ml PV溶液并使用超声均化器(Sonicator类型7533A)以20W将溶液均化4分钟。将所得乳液倒入500ml的2%异丙醇溶液中并以300rpm在冰浴上搅拌另外4小时从而蒸发掉二氯甲烷并由此使粒子变硬。然后通过以7500rpm在15°C离心20min收集纳米粒子。在用去离子水清洗三次之后，使粒子重新悬浮于去离子水并将其装入20ml血清管状玻璃小瓶用于冻干。冻干在-15°C的主干燥温度和+25°C的辅干燥温度进行。在干燥过程中，使真空保持恒定在100mTorr。
[0063] 图9和10显示通过单乳液法形成的粒子的实例。可以看出，上述声波作用可得到正确尺寸的粒子，而没有声波作用的方法得到大得多的粒子。制得粒子的表面粗糙度可以通过上述的SiO2粒子的层层沉积增加。
[0064] 双乳液实施例：
[0065] 首先，将250mg樟脑溶于100ml二氯甲烷。第二，将2500mg PLGA溶于100ml樟脑溶液，得到最终油相。为产生第一w/o乳液，将1ml去离子水添加到20ml聚合物溶液中并使用超声均化器在20W进行超声作用30秒。然后将所得(w/o)-乳液倒入100ml的5%PVA溶液(在4°C)并使用超声均化器在20W均化，得到(w/o/w)-双乳液。将所得双乳液倒入500ml的2%异丙醇溶液中并以300rpm在冰浴上搅拌另外4小时从而蒸发掉二氯甲烷并由此使粒子变硬。然后通过以7500rpm在15°C离心20min收集纳米粒子。在用去离子水清洗三次之后，使粒子重新悬浮于去离子水并将其装入20ml血清管状玻璃小瓶用于冻干。冻干在-15°C的主干燥温度和+25°C的辅干燥温度进行。在干燥过程中，使真空保持恒定在100mTorr。
[0066] 图11显示通过双乳液法形成的粒子的实例。再次可见，声波作用可得到具有所需尺寸的粒子，而没有声波作用的方法往往会制得大得多的粒子。制得粒子的表面粗糙度可以通过上述的SiO2粒子的层层沉积增加。
[0067] 纳米沉淀(溶剂置换)：
[0068] 在该方法中，将不溶于水的聚合物材料(如PLA，PLGA)溶解于与水溶混的有机溶剂中。聚合物在有机溶剂中的所得溶液可以另外包含少量的其它有机溶剂(如苯甲酸苄基酯、苄基醇等)，液体油，或成孔物质(如樟脑)，它们可以与水溶混或可以不与水溶混。制剂可以进一步包含在溶液中的疏水活性治疗成分。可以如下制备粒子：在恒定的搅拌下，将有机溶液添加到过量的稳定剂水溶液中，两者的体积比通常为(但不限于)1:10。通过纳米沉淀(溶剂置换)机理自发形成纳米粒子。适宜的稳定剂是浓度为0.5%至5%的表面活性聚合物，例如聚乙烯醇、泊洛沙姆等。为实现粒子具有粗糙表面并在表面上或在纳米粒子内具有气穴，可将粒子冻干以除去任何水并使成孔物质升华。
[0069] 纳米沉淀法实施例：
[0070] 首先将125mg聚-(D,L-丙交酯)聚合物(PLA)溶解于丙酮(25ml)。然后将0.5ml苯甲酸苄基酯或苄基醇和12.5mg樟脑添加到丙酮溶液中。在适当的磁力搅拌下，将所得有机溶液倒入50ml包含250mg泊洛沙姆的水中。然后通过在环境压力在4°C在冰浴中搅拌除去扩散进水相的丙酮。空间稳定剂如下除去：在15°C将粒子离心，丢弃浮在表面的物质，使粒子重新悬浮于去离子水。将此重复3次。然后将最终的粒子悬浮液冻干以便于获得干燥纳米胶囊并使存在于粒子制剂中的樟脑升华。樟脑的升华导致形成孔并增加在冻干之后表面粗糙度增加。
[0071] 喷雾冻干
[0072] 在该方法中，纳米粒子可以通过任何形式的喷雾冻干由初始液体进料制备，所述初始液体进料包含从低至约0.01%(和更低)至约10%浓度的在溶液、乳液或悬浮液中的粒子组分。特别地，进料液体可以是水溶液或含水悬浮液或在溶液或悬浮液中含有粒子组分的有机溶剂，所述粒子组分包括药物活性成分和任何必要的赋形剂或稳定剂。进料液体可以是乳液类型的，例如单乳液，双乳液或微乳液。一种或多种适宜的溶剂或分散体介质可以用于制备乳液。溶剂或分散体介质可以包含适宜的溶解的物质以调节进料液体的性质，例如pH，渗透压，粘度，表面张力等。来自初始进料液体的喷雾冻干可以与之后的加工步骤合并，所述之后的加工步骤例如超声均化(声波作用)，压制，碾磨，筛分，喷涂，或纳米封装。粒子也可以通过上述技术的任何组合制备。
[0073] 喷雾干燥的实施例1：
[0074] 将可生物降解的聚合物(如PLGA)以低浓度(如<1%)溶解于有机溶剂(如乙腈)，然后使用适当的喷嘴系统(如超声喷雾器，双流体喷嘴，单分散性液滴发生器等)用适当的低温液体(如液氮)将液体溶液雾化进入容器。在与低温液体碰撞之后液滴立即冷冻凝固，然后将其转移到冻干系统的预冷却的架子上。冻干在低温和低压进行，即低于溶剂的熔融温度和制剂的破坏温度。在冻干之后，可以无需进一步加工直接使用干燥的纳米粒子，或者如下进一步降低粒度：在SFD之后使可生物降解的粉末悬浮于适当的分散体介质，使悬浮液经受超声均化几分钟。后一过程之后是适当的干燥步骤，例如另外的冻干循环，以除去分散体介质并获得干燥产品。
[0075] 喷雾冻干的实施例2：
[0076] 使用磁力搅拌器在恒定搅拌下将20mg PLA溶解于20g对-二甲苯。喷雾冷冻如下进行：使用60kHz超声喷嘴(Sono Tek，USA)将液体溶液以1ml/min的流速雾化进充有液氮的不锈钢滚筒。将喷嘴的功率设定为4瓦。在喷雾干燥过程结束时，将含有喷雾冷冻液滴的不锈钢滚筒加满液氮并转移到实验室冻干系统(FTS Lyostar1，USA)的预冷器的架子(-40°C)上。冻干在-15°C的主干燥温度和+25°C的辅干燥温度进行。在冻干循环结束时，将最终干燥的粉末从不锈钢滚筒转移进在手套箱的湿度受控环境(0.5%相对湿度，在20°C)中的20ml血清管状玻璃小瓶。
[0077] 参照图12，根据上述任何方法制备的并且具有所需尺寸和表面粗糙度的粒子可以用于在超声声波作用下诱导组织内的空化作用。空化作用可以用于成像目的或者用于增强治疗物质到组织的运送。图8显示同时进行这两种功能的超声系统。超声系统包括形式为超声传感器的超声源10，该超声传感器通过计算机形式的控制器12控制。超声检测器阵列14位于超声传感器10的中心并布置以在从组织中空化作用发射的较高频率被动检测超声。显示屏16连接于计算机12。计算机12包括存储器和处理器并且布置以控制超声传感器10的操作，从而处理来自检测器阵列14的信号并产生屏幕16上显示的图像。布置传感器
10以对声波作用区域18进行声波作用，并布置检测器阵列14以检测来自声波作用区域18的超声。提供纳米粒子的来源20从而能够在位于声波作用区域18的位置将纳米粒子注入患者22，在该实施例中为注入患者的肝脏。布置计算机以控制传感器从而在100kHz-10MHz范围内的任何频率产生超声。
10以对声波作用区域18进行声波作用，并布置检测器阵列14以检测来自声波作用区域18的超声。提供纳米粒子的来源20从而能够在位于声波作用区域18的位置将纳米粒子注入患者22，在该实施例中为注入患者的肝脏。布置计算机以控制传感器从而在100kHz-10MHz范围内的任何频率产生超声。
[0078] 在一种操作模式中，将纳米粒子注入患者的肝脏内。由于粒子的尺寸，它们可进入并积累在肝脏中任何癌症肿瘤的脉管系统中。然后布置计算机12以控制传感器10从而对声波作用区域18进行声波作用，并处理来自检测器阵列14的信号。纳米粒子的表面粗糙度诱导空化作用，该空化作用由此集中在粒子积累的区域，检测空化作用并通过计算机12使其成像。纳米粒子可以通过任何上述方法制备。
[0079] 在另一种操作模式中，将纳米粒子与治疗物质混合，所述治疗物质作为类似尺寸的纳米粒子形成或携载在类似尺寸的纳米粒子上，即针对最佳吸收，该尺寸在50-800nm的范围内，优选为100-600nm。治疗物质可以是任何适当类型的药物，例如抗癌试剂，siRNA，腺病毒携带者，或任何小分子药物。在该情况下，携载治疗物质的纳米粒子无需诱导空化作用，因此它们的表面粗糙度不重要。将混合物注入患者，声敏纳米粒子和携载治疗物质的纳米粒子由于具有类似的尺寸倾向于彼此在患者的相同部分积累。通过传感器10的超声声波作用因此引起可以使用检测器阵列14成像的空化作用，并且这将可指示来自混合物的声敏纳米粒子的位置，因此也可指示携载治疗物质的纳米粒子的位置。由于成像可以实时进行，这使得能够实时监测携载治疗物质的纳米粒子在待治疗的癌变组织中的积累，并因此能够将治疗物质运送至靶向区域的情况实时成像。在该操作模式下，可知通过声敏纳米粒子诱导的空化作用也将增强治疗物质到目标区域的运送。
[0080] 在其它操作模式中，治疗物质被包封在待运送至靶向位置的声敏纳米粒子内或以其它形式携载在待运送至靶向位置的声敏纳米粒子上。在该情况下，当用超声进行声波作用时，由于它们的表面粗糙度，携载药物的纳米粒子本身用于诱导空化作用。这再次允许使用由纳米粒子诱导的空化作用的成像运送待监测的药物。同时，空化作用也将增强治疗物质在目标位点的运送。
[0081] 在进一步的实施方式中，方法包括将纳米粒子的位置绘图和增强和/或绘图治疗物质到组织的运送两者。在该情况中，使用携载药物并且各自具有两种不同深度的表面形貌的纳米粒子。将纳米粒子注入患者，在注入过程中使用匹配于形貌尺寸的第一个(深度或其它标尺)的超声对纳米粒子进行声波作用以引起空化作用。该空化作用如上述成像，由此可以监测注入过程。然后当纳米粒子在所需位置积累时，使用匹配于第二深度或标尺的表面形貌的第二不同频率的超声对它们进行声波作用。这导致空化气泡的特征不同于第一次声波作用(例如具有不同尺寸，布置以捕获纳米粒子)所产生的那些。
[0082] 参照图13，纳米粒子使用上述层层法制备，其粒度为300nm和涂层粒子为28nm。用超声在1MHz对包含这些粒子的水样品、包含这些粒子的血液样品、和不包含粒子的血液样品进行声波作用。结果表明，与不含粒子的血液相比，对于血液中的粒子、以及水中的粒子，空化阈值显著降低。这暗示出，当纳米粒子变为涂布有血浆蛋白质时，粒子的疏水性和表面粗糙度不受影响。
[0083] 参照图14a，将具有300nm芯尺寸和15nm涂层粒子的类似粒子放在水中，并在508kHz、1.067MHz、1.682MHz和3.46MHz用超声对水进行声波作用。可以看出，当峰值压力增加时，在以下峰值压力诱导空化作用：在最低峰值压力时是在508kHz，在稍高峰值压力时是在1.067MHz，在较高压力时是在1.682MHz，在又较高压力时是在3.46MHz。
[0084] 参照图14b，对相同粒子进行相同的测量，对于粒子所不同的是涂层粒度为28nm。正如所见，阈值压力的降低较不显著，特别是在1.682MHz。
[0085] 参照图14c，对相同粒子进行相同的测量，对于粒子所不同的是涂层粒度为7nm。正如所见，对于所有频率，阈值压力的降低都远远更为显著。
[0086] 比较对于3.46MHz在300nm芯7nm涂层和300nm芯28nm涂层之间的结果，对于较低压力对于7nm涂层空化的概率大的多。这暗示，对于相同曲率的模板(即芯粒度)，使用较小涂层的粒子可导致捕获较小的核，这可更好地适用于在较高频率引发惯性空化作用。
[0087] 参照图15a，将类似的粒子(但是这次是具有500nm芯尺寸和15nm涂层的粒子)放在水中，并在508kHz、1.067MHz、1.682MHz和3.46MHz用超声对水进行声波作用。从图14a的结果可以看出，随着频率降低，阈值压力降低幅度更大。
[0088] 参照图15b，将芯尺寸改变为600nm，而其它参数保持不变。可以看出，在较高频率，阈值压力进一步降低。参照图15c，对于800nm的芯尺寸，可以看出在3.46MHz阈值压力进一步降低。
[0089] 对于所有具有15nm涂层的芯尺寸，注意在3.46MHz的结果，当模板(芯)尺寸由300nm增加至500nm、增加至600nm、增加至800nm时，空化的概率在较低压力变得越来越高(即惯性较大的空化作用可能更容易产生)。这强烈地暗示，源自较大模板的减小的曲率导致捕获较小的核，这较好地适于在较高频率引发惯性空化作用。
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