下面结合具体
实施例,进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件。
实施例1:基因组的提取:
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O19型,离心收集细胞。 用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分 钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml 的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase, 65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清再用等体积的酚∶氯仿∶ 异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次,取上清再用等体积的乙醚抽提以 除去残余的酚,上清用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70% 乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼 脂糖凝胶电泳检测。
实施例2:通过PCR扩增大肠杆菌O19型中的O-抗原基因簇:
以大肠杆菌O19型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。 首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523 -ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT),再根据O-抗原基因簇下游 的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C);用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩 增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟;然后94℃变性 10秒,60℃退火15秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环。最后,在68 ℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 的大小及其特异性。合并5管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3:构建O-抗原基因簇文库:
首先是连接产物的获得:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O- 抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1.5kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中。 随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP, 10mMdATP),1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃30分钟, 将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其 相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA 尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚 抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时, 总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后 用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物, 再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备:参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中,180 rpm培养10小时后,取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中,37℃250rpm 剧烈振荡培养到OD600 0.5左右,然后冰浴冷却20分钟,于4℃4000rpm离 心15分钟。倾尽上清,用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体,于4 ℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体, 于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,4℃ 6000rpm离心10分钟,弃上清,最后沉淀用1ml冰预冷的10%的甘油悬浮 细胞,即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管,-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞:取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5α混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏, 时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复 苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上 37℃倒置过夜培养,次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到 含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用 EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到白色克隆群构成了大肠杆菌O19 型的O-抗原基因簇文库。
实施例4:对文库中的克隆测序:
从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型 DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到100%的覆 盖率,从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5:核苷酸序列的拼接及分析:
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而 得到大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序 列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O19型的基因组作5个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上 高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O19型O-抗原基因簇的核苷酸序列后, 用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information,NCBI)的orffinder发现基因,找到9个开放的阅读框,用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O19型的O- 抗原基因簇的结构,如表3所示。
通过检索和比较,发现orf1编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇 中rmlB基因编码的dTDP-glucose 4,6 dehydratase,有94%的氨基酸序列一 致性和95%的相似性,通过对Pfam蛋白基序
数据库的搜索,发现orf1编码 的蛋白与已知的RmlB的共有序列的同源性预期值非常高(E value=5.7×e-210 )。Orf2基因编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlD基因编 码的dTDP-6-deoxy-L-mannose-dehydrogenas有95%的氨基酸序列一致性和 96%的相似性,通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索,发现orf2编码的蛋白 与已知的RmlD的共有序列的同源性预期值非常高(E value=1.5×e-74)。orf3 基因编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlA基因编码的 glucose-1-phosphate thymidylyltransferase有96%的氨基酸序列一致性 和98%的相似性,通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索,发现orf3编码的蛋 白与已知的RmlA的共有序列的同源性预期值非常高(E value=4.1×e-118)。 orf4基因编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlC基因编码的 dTDP-6-deoxy-D-glucose-3,5 epimerase有81%的氨基酸序列一致性和86% 的相似性,通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索,发现orf4编码的蛋白与已 知的RmlC的共有序列的同源性预期值非常高(E value=5.5×e-123)。rmlBDAC 负责合成鼠李糖O-抗原中的一种稀有单糖。因此我们将这四个基因暂命名为 rmlB,D,A,和C。
orf5和orf6是大肠杆菌O19种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基 因。orf5编码的蛋白与Shigella flexneri 2a str.301(AAN43639)的O-抗原转移 酶有40%的序列一致性和62%的相似性,通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的 拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段,这是Wzx蛋白的典型特征。所 以命名orf5为wzx。orf6编码的蛋白与大肠杆菌(BAA15877)的O-抗原聚合酶 有24%的一致性,46%的相似性,通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结 构发现其含有10个跨膜片段,并且有一个大的胞质内亲水环(loop),这是 Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf6为wzy。
orf7,8,9三个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有34-40%的序 列一致性和52-61%的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的 搜索,这两个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族的共有序列的同源性 预期值为3.2×e-14,8.7×e-16和4.4×e-32,因此我们推测这三个基因编码糖 基转移酶,而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种
二糖键,因此我们 推测大肠杆菌O19的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这三个 基因的确切功能还不能确定,因此我们将这三个基因暂命名为orf7,orf8和 orf9。
实施例6:特异基因的筛选:
针对大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物,在每 个基因内各设计了两对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方,以确 保其特异性;用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模 板进行PCR,除在含大肠杆菌O19的第十三组中得到了预期大小的一条带 外,在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物,所以wzx、wzy基 因对大肠杆菌O19型的O—抗原都是高度特异的;这些基因在核苷酸序列中 的位置见表1。
实施例7:引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅,搅拌均匀,分成20g一份,存在-40℃冰箱中备 用。将10μl大肠杆菌O19的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中, 于37℃,200转/分,培养12小时至饱和,取少量培养好的菌液作106和107 倍的稀释,其余的菌液放于4℃的冰箱中备用,取50μl稀释菌液涂布LB琼 脂平板,37度,培养12h,对所涂平板计数,计算原液中活菌浓度。在5份 生猪肉馅中分别掺入5×103,5×102,5×101,5个和0个活菌,搅拌均匀, 加入200ml LB培养基,经6层纱布过滤,过滤液于37℃,200转/分,培养12h。 从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟,去上清,加100μl MQ 超纯水吹开沉淀并混匀,放入100度沸水中煮15分钟,裂解液于12,000g离 心8分钟,取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对,SEQ ID NO:1中的 4259至4274碱基的核苷酸和4560至4575碱基的核苷酸;SEQ ID NO:1中 的4312至4327碱基的核苷酸和4880至4895碱基的核苷酸。SEQ ID NO:1 中的5834至5849碱基的核苷酸和6410至6425碱基的核苷酸;SEQ ID NO:1 中的5626至5641碱基的核苷酸和5987至6003碱基的核苷酸,进行PCR反 应,PCR反应体系如下:MQ:15.7μl,Mg2+:2.5μl,Buffer:2.5μl,dNTP: 1μl,Taq酶:0.3μl,P1:1μl,P2:1μl,模板DNA:1μl。PCR反应条 件为:95℃:5′,95℃:30″,56℃:45″,72℃:1′,72℃:5′,共30 个循环。反应结束后,取10μl反应产物电泳,若有与预期大小相符的扩增带, 则结果为阳性,若没有,则结果为阴性。参入了5×103,5×102,5×101, 和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0 个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法 时,这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O19的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达,可以组建重组 疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原,可以引起强烈的免疫反 应,是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的 将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达,动 物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993,7:239- 252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王 磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗 STM-1中表达,并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应 (Microbial Pathogenesis 1999,27:55-59)。所以本发明O19的O抗原特异基 因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO:1所示),构造特异核酸探针,将其固定到芯片的载体上制成生物芯片, 将要检测的样品适当处理后,与生物芯片进行杂交反应,然后利用生物芯片
信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定 的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如
食品加工和生产行业, 畜牧兽医行业海关检疫等的
微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量,在完 全相同的条件下就可以产业化。
表1列出了大肠杆菌O19型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖 单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O19型 的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应 的功能和大小。在每个基因内,我们各设计了两对引物,每对引物分布在相 应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO:1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火
温度以表2中 的所有菌的基因组为模板进行PCR,得到了相应的PCR产物,其大小也列 于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来 源,为了检测的方便,我们将它们每12-19个菌分为一组,总共12组,它们 的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O19型的基因组DNA作为阳性对照。以每组 菌做模板,用表1中的每对引物按如下条件做PCR:在95℃预变性5分钟 后,95℃变性30秒,退火时间是30秒,温度见表1,72℃延伸2分钟,这 样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟,反应体系是25ul。模板为1∶20 稀释,取1μl。反应完毕后,取10ulPCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检 测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因,每个基因都有两对引物被检测,每对引物除了在第 13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外,在其他组中都没有扩 增到任何大小正确的带,也就是说,在大多数组中没有得到任何PCR产物带, 所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O19型及其O-抗原是高度特异的。
最后,通过PCR从大肠杆菌O19型中筛选到对大肠杆菌O19型的O-抗 原高度特异的基因:wzx、wzy。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷 酸对大肠杆菌O19型的O-抗原是特异的,尤其是上述每个基因中的引物即 寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O19型是高度特异的。所有的这 些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O19型,并能 鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的结构表,在表中列出了大肠杆菌O19 型的O-抗原基因簇的结构,共由9个基因组成,每个基因用方框表示,并在 方框内写入基因的名称,数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf) 的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因,它们不属于O-抗 原基因簇,我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长 序列。
表4是大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的基因的位置图,在图中列 出了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准 确位置,在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠 杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个:ATG和GTG。
SEQ ID NO:1序列(SEQUENCE LISTING)
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>对大肠杆菌O19型的O抗原特异的核苷酸
<130>对大肠杆菌O19型的O抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>12434
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
atcgaaaaac ccggatcagc cgcagacgct ggactcagac atcatggccg ttggtcgcta 60
tgtgctttct gccgatattt ggccggaact agaacgcact caaccaggtg catggggacg 120
tattcagctg actgatgcca ttgccgaact ggcgaaaaaa cagtccgttg atgccatgct 180
gatgactgga gacagctacg actgcggtaa aaaaatgggc tatatgcagg cgtttgtgaa 240
gtatgggctg cgcaacctaa aagaaggggc gaagttccgt aaagggattg agaagctgtt 300
aagcgaataa tgaaaatctg accgaatgta acggttgata agaaaattat aacggcagtg 360
aagattcgtg gcgaaagtaa tttgttgcga atattcctgc cgttgtttta tataaacaat 420
cagaataaca acgagttagc aataggattt tagtcaaagt tttccaggat tttccttgtt 480
tccagagcgg attggtaaga caattagcgt ttgaattttt cgggtttagc gcgagtgggt 540
aacgctcgtc acatcgtagg catgcatgca gtgctctggt agctgtaaag ccaggggcgg 600
tagcgtgcat taatacctct attaatcaag ctaagagccg cttatttaca gtatgctctg 660
aagtaatatg gaataaaaaa gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt 720
ctgctgtagt tcgtcacatt ataaataata cgcaggatag tgttgttaat gtcgataaat 780
taacgtacgc cggaaacctc gaatcacttg ctgatgtttc tgattctgaa cgctatgttt 840
ttgaacgtgc ggatgtttgc gatgcagctg caatggcgcg gatttttgct ctgcatcagc 900
cggatgcagt gatgcacttg gctgctgaaa gccatgtgga tcgttccatt acaggccctg 960
cggcatttat tgaaaccaat attgttggta cttatgtcct tttggaagcc gctcgcaatt 1020
actggtctgc tcttgatagc gacaagaaaa atagcttccg ttttcatcat atttctactg 1080
acgaagtcta tggcgatttg cctcatcctg acgaagtaaa taataaagaa gaattacccc 1140
tctttactgg gacgacagct tacgcgccaa gcagcccata ttctgcttct aaagcatcca 1200
gcgatcattt agtccgcgcg tggaaacgta cctatggttt accgaccatt gtgactaact 1260
gttcgaataa ctacggccct tatcactttc cggaaaaatt gattccgctg gtaattctta 1320
atgctctgga aggtaaggca ttacctattt atggcaaagg ggatcaaatt cgtgactggc 1380
tgtatgttga agatcatgcg cgtgcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggtg 1440
aaacttataa cattggtgga cacaacgaaa agaaaaacat cgatgtagtg ctcattattt 1500
gtgatttgtt ggatgagatt gtaccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg 1560
ttgccgatcg tccgggacac gatcgccgtt atgcgattga tgctgacaag attagccgcg 1620
aattgggttg gaaaccacag gaaacgtttg agagcgggat tcgtaaaacg gtggaatggt 1680
acctggctaa tgcaaaatgg gtcggaaatg tgaaaagtgg tgcctatcag tcatggattg 1740
cacagaacta tgagggtcgc cagtaatgaa tatcctcctt ttcggcaaaa cagggcaggt 1800
aggttgggaa ctacagcgtg ctctggcacc tctgggtaat ttgattgctc ttgatgtcca 1860
ctccactgat tattgtggtg attttagtaa ccctgaaggg gtggctgaaa cagtcaaaag 1920
aattcgacct gatgttattg ttaatgctgc ggctcatacc gcagtagata aggctgagtc 1980
agaacccgaa tttgcacaat tactcaatgc aactagcgtt gaatcaattg caaaagcggc 2040
taatgaagtt ggggcttggg taattcatta ctcaactgac tacgtattcc ctggaaatgg 2100
tgacatgcca tggctggaga cggatacaac cgctccgctg aatgtttatg gtgaaactaa 2160
gttagccgga gaaaaagcat tacaagaaca ttgtcctaag caccttattt tccggactag 2220
ctgggtctat gcaggcaaag gaaataactt cgcgaaaacg atgttacgtc tggcaaaaga 2280
gcgcgaagaa ttagcggtta ttaacgatca gtttggtgca ccaacaggtg ctgaactgct 2340
ggctgattgt acggcacatg caattcgtat ggcactgaat aaaccagaag tcgcaggttt 2400
gtaccatctg gtagccagtg gtaccacaac ctggcacgat tatgctgcgc tggtttttga 2460
agaggcacga aaagcaggta ttccccttgc actcaacaag ctcaacgcgg taccaacaac 2520
agcttatcct acaccagctc gtcgtccaca taactctcgt cttaatacag taaaatttca 2580
gcagaacttt gcgcttgtct tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa tgctcaacga 2640
attatttacg actacagcaa tttaatagtt tttgcatctt gttcgtgatg gtggagcaag 2700
atgaattaaa aggaatgatg aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttag cgggtggttc 2760
tggtactcgt ctttatcctg taactatggc tgtcagtaaa cagctgttac cgatttatga 2820
taaaccgatg atctattatc cgttgtctac actgatgtta gcgggtattc gcgatattct 2880
gattatcagt acgccacagg atactcctcg ttttcaacag ttgctgggtg atggcagcca 2940
gtggggcctg aatcttcaat acaaagtgca accgagccca gacggtcttg cgcaagcatt 3000
tatcatcggt gaagagttta ttggtggtga tgactgtgct ttggttcttg gtgataatat 3060
cttctacggt cacgatctgc cgaagttaat ggaagcagct gttaacaaag aaagtggcgc 3120
aacggtattt gcttatcacg taaatgatcc tgaacgctac ggtgtcgttg agtttgataa 3180
aaacggtacg gcaattagcc tggaagaaaa accgctacag ccaaaaagtg attatgcggt 3240
gactgggctt tatttctatg ataacgacgt tgtcgaaatg gcgaaaaacc ttaagccatc 3300
tgcacgtggt gaactggaaa ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac aagggcgttt 3360
gtctgttgct atgatgggtc gtggttatgc atggctggac acggggacac atcaaagtct 3420
tattgaagca agcaacttca ttgcaacaat tgaagagcgt cagggactga aagtttcctg 3480
cccggaagaa attgcttacc gtaaagggtt tattgatgct gagcaggtga aagtattggc 3540
tgaaccgttg aagaaaaatg cttatggtga gtacctgcta aaaatgatta aaggttatta 3600
ataaaatgaa cgtaattaaa acagaaattc cagatgtatt aattttcgag ccgaaagttt 3660
ttggtgatga acgtggtttc ttttttgaga gctttaacca gaaggttttt gaggaagctg 3720
taggccgcaa agttgaattt gttcaggata accattcgaa gtccagtaaa ggtgttttac 3780
gcgggctaca ttatcagtta gacccttatg cacaaggaaa attggtgcgc tgcgtagttg 3840
gtgaagtttt tgatgtagcg gttgatattc gtaaatcgtc acctacattt gggaaatggg 3900
ttggggtaaa tttgtctgct gataataagc gccagttgtg gatcccggaa gggtttgcgc 3960
atggattttt ggtgttgagt gaaacggctg agtttttgta taagacgaca aattattatc 4020
atcctgatgc tgaaggttca ttacgttgga atgatgatga tattaatatt aattggccat 4080
catcatacgg tatcactcta tcaaagaagg atgaaaatgc accgtacttc aacagaataa 4140
tcggtaatgg aattttatga gtttatttaa aaacgctggc tggaatattt taggtctggt 4200
tattccactt attatggcga tccccgttat ggggatcatg gctcgtttat taggtgttga 4260
acgctttggt cttttcacta ttgcttatgc tttaatggga tatgcaagtg tttttgatgg 4320
cggaatatct cgtgcagtta ttcggtttgt atctatttat agaaatgaca atgaaaaagt 4380
taatgttatt ttaggttctt ctatatatac ggtaactgtt ttaagtatcc taatagcatt 4440
attaacttat ttagtatcac caaatttggt tgttttttta aaagtatcac aggatattcg 4500
acatgaagtt gtaatagctc ttcagctact gggggcatgt atccctgcat tactacttac 4560
acaagtatgg cgagcatatc ttgaaggtgt cgaaaatttt tcttctttga acattcaaca 4620
agttctaaca agtcctttca taatattatt accattaacc acaacatggt tttcacaaac 4680
tcttatttca gcagtattag ggttgatttt gggacgctgg attgttgcat ttattagttg 4740
gaaactttgt tcgcgccatc ttaaaaattt caaaagaaca tttagtcgaa aagctttgat 4800
ggagcttatt agctttggtg gatgggtaac tctgagtaat attataggcc ctttaatggg 4860
gtttattgat cgttttgctg tctcacattt cgctggcgct aatgttgttg cttactattc 4920
agggccgtct gatatggtat ctcgacttac tttatttcct ggggctgttg ccagggctct 4980
atttccaaaa ctaagttttg aaactagaga agagagcaaa gttacatatt ttcgatctct 5040
aattctcgtt ttttgtttat cttttctttt agcattgcca tttttcttat tttcaagcga 5100
tatattaggt atatggttag gaaatgagta tagaggagat gcagcggtcg tatttcgcat 5160
attgttaatt ggatttgttt ttaattcaat agcacaaata tgttttgcta gaattcagtc 5220
tgctggattt gcgaaatgga ctggtattgt gcatattatg gaattcatac catacttggt 5280
tcttttgtat ttactgaccg tcaaatattc tttttttgga gctgcgttcg ccttttcatt 5340
aaggtcatta ttggatttta taattctatt cctggttgaa aggatcggta tctataacat 5400
ggataggata taatatgaat gtcgttcaag caatggttat aatatacctt tgttacctaa 5460
ttatatgttt cttctttagg cttgaaataa cacatccagc agttgtacat acgataattt 5520
ggcttataag cgcgagctta gctcttgttt ttgctgaaga aaaatatttg ccaaataact 5580
attatatagt tatagcaaac tcaatgtttt ttattttttc tttcattggt ggaattggtg 5640
tttttaataa aaataaagct tttcagttaa atattgataa aaattcttat gtaaatgctt 5700
taccattttg tttaataata tcattttatt tgattatact aataacctat aatgtgaatg 5760
ttttatcaaa catatcagcg ttccgagatt atctggttgc tgacgatggt gctaattatg 5820
gtttattagg gcgtatcgca atgttatcgc tcttctcttc ttgtttttta cttttgagaa 5880
gtcgaaggct ttttttactt agcgccgtgt tgtgcatccc tataattatt atactaagtg 5940
caaaaacctt agttctattg tatttaataa cgatactaat tttaactcca aacaggctga 6000
aaatatcaaa actactaatc ttctttagca tatttattct tttctttatt gggataatga 6060
ggcttcgata tccagaagca tcttttaatt taattttata ttatttatat aattatattt 6120
caggtggatt tttggctttt tcacaattgc cgaattcatt taatcaagtt tttggttttt 6180
attctttcag aaacttttac ctttggttaa atgtgctcta tccagtcgag atcgcaaaca 6240
ttcttcaaga gtgggtaaat gtcccatttc ctgtcaatgt atatacgtat cttcgccctt 6300
attatatgga ttttgattat ttatcattat ttttcccaat tatctttggc tttttttcgg 6360
gaagaatata tatggaaaag tataaaaata gacgcattta ttatattgta tacccgataa 6420
ccttttacgc aatagcaatg cagctatttg atgatcaata tcttacatgg ttatcaaact 6480
ggatattgct tataattaca ggctatataa tgacttggga gggggtatgt cgaaaatagc 6540
agttttgata gtaacgtata atccagtttt aagtgtgttg gatgatctaa ttggaaagat 6600
aaaaaaagct aaatataatt tagaaatatt tctcgttgat aatgctagtg aaaatgctaa 6660
tatattaaaa gctaaattta aggacgagcc caatatatta ttccttgatg aaaatttggg 6720
attggctggg gcacaaaatg taggtctgaa aaaaatatta cgaacagact gtgaagcagt 6780
cctttttttt gatcaagata cttcccctac agatgtattt tttactaatt tgatagagtc 6840
tatgtcaaag ttagctctac agggagaaaa aattggtgct attggacctg ttttttacga 6900
ctcaaggaca ggaaccaaat atccatttat tctcttaaaa agaatccgag ctaagaaggt 6960
ttttccaaca ggtaatgtcc cgcttaaagt ttcattttta ataaactcag gtatgctagt 7020
accagtaagc acattaaaag atgttgggtt aatgaaagag gaattattta tagactatgt 7080
cgatattgaa tggtgcctcc gagctgcaag taaaaagttt aacttttacg ctattcccga 7140
tgcaacgatg agtcatgcat taggagatga gcgtaaatca attttgggaa gagaaattag 7200
catacacagc cctttgagac gttattattt agcaagaaat tctatttata tgctgcgttt 7260
accatacgtt cctttggggt ataaaataag agaaattttg ttttcattgt tgagaacagc 7320
gatatttata tcaactgtta ataataagaa ggtttatgtt gattttattc taaaaggttg 7380
gtcggatggc attaaaaaaa attatgggaa gtatgttgga ataaagtaga tatttttttt 7440
gaaacgaata aacttggaca aatttaatcc ctttcaatgg agaaaaaagt gattagttcg 7500
gttacagtta catataaccc agatattgaa tgcctcagac agcaactttt atcagtacgt 7560
aagcaggttg atttatgtgt aattgttgat aatggctcaa acaatattat tgagattaaa 7620
aaattaaatt atgagtttga tttttatctt attcaatttg atgataatta tggtctcgca 7680
tatgcacaaa atagtggtat agaatatgcc atatcttctg gtacagaata tttattattg 7740
ttggatcaag atagtatctt gaaagatgaa ttttctaaga acatgaagca tatatatata 7800
aaatataatg ttgggatttt aggaccttca ttttatgatc ctcaaaacaa taaaatttat 7860
tttgggactt gttataaagg accttttatt agccgtaagt ctatcggtga ggttaccgat 7920
gttacttttg tcattgcatc gggctccttt ttttcatcag atgtttataa aaaaattgga 7980
ggaatgaaat ctgaactttt tgtggattat attgatgttg aatggtctct tagagcaaaa 8040
aatatgggat acagagtgtg tatgactaac agggctttaa tggctcatac aattggtgat 8100
tccagaatta caatttttgg gcggacaata tcggtgcata gccccataag acgttattat 8160
ttagttagaa atagtttcta tatgctaagg ttgcactatg tgcctattgg atataaagtt 8220
cgcgaaattt tctttaattg tttacgatca ataatttctc taataataag tgacaaaaag 8280
ggtaatgtaa taactaaact aggtcaagga atatatgacg gtattcgtgg gaaatatggt 8340
gattataaag atagataata ttaattcatc cgttgcgtca caattaaatt agaattcatg 8400
tacaaattaa tacaaaggaa aagtaatact taaagtatat tcaacactaa ataattcact 8460
tttcctatca tggaaagatc atcggtgtgc tgtaggcaca aagatgcaaa acgggacgtt 8520
ttgcatgtaa taagcataag cttgtaaaga gatggtggca ggcagggaaa gatcatcaga 8580
agttcacttt ttgtactaaa taattcgcat tttatgttta aaaattgaga tattccttat 8640
tacctaaagc tgttttttat tgcttataca tgatcaaata ctccttacat aattaaggag 8700
aacaaaatgg aacttaaaaa gttgatggaa catatttcta ttatccccga ttacagacaa 8760
gcctggaaag tagaacataa attgacagat attctactgt tgactatttg cgccgtcatt 8820
tctggtgcag aaggctggga agatatagag gattttggtg aaacacatct cgattttttg 8880
aagcaatatg gtgattttga aaatggtatt cctgtccacg ataccattgc cagagttgta 8940
tcctgtatca gtcctgcaaa gtttcacgag tgctttatta actggatgcg tgactgccat 9000
tcctcaaatg ataaagacgt tattgcaatt gatggaaaaa cgctccggca ctcttatgac 9060
aagaatcgcc gcaagggagc gattcatgtc attagtgcgt tctcaacaat gcacagtctg 9120
gttctcgggc agattaagac ggatgagaaa tccaatgaga ttacagccat tcctgaactt 9180
cttaacatgc tggatattaa aggaaaaatc atcacaactg atgcgatggg gtgccagaaa 9240
gatattgcag agaagataca aaaacagggc ggtgattatt tattcgctgt aaaaggaaac 9300
caggggcggc ttaataaagc ctttgaggaa aaatttccgc tgaaagaatt aaataatcca 9360
gagcatgaca gttacgctat tagtgaaaag agtcacggca gagaagaaat ccgtcttcat 9420
attgtttgcg atgtccctga tgaacttatt gatttcacgt ttgaatggaa agggctgaag 9480
aaattatgcg tggcagtctc ctttcggtcc ataatagcag aacaaaagaa agagccagaa 9540
atgacggtca gatattatat cagttctgct gatttaaccg cagagaagtt cgccacagca 9600
atccgaaacc actggcacgt ggagaataag ctgcactggc gtctggacgt ggtaataaat 9660
gaagacgact gcaaaataag aagaggaaat gcagcagaat tattttcagg gatacggcac 9720
atcgctatta atattttgac gaatgataag gtattcaagg cagggttaag acgtaagatg 9780
cgaaaagcag ccatggacag aaactatctg gcgtcagtcc ttgcggggag cgggctttcg 9840
taatctcgcc ctgacatgga cctctaaggc gatattaatt gtttgaaaat tatatctcaa 9900
atttaaaaat gagctgtatg ctgttagagt ataaaatatg tgtttttata ttggaaggtt 9960
tttagtgagc atgattttaa ccaaaaatat aaatacttta ctttcataca ctataacatc 10020
aattaaggat ggaataaatg gtgaaacggg ggaatataaa ggataacaac tcattatgaa 10080
aaaaataata catatccaag tgttgccaaa aatgtctggg gttcagcaag tctcttttga 10140
tattttgtca gggattaatg acgaaaatgt acaaaaattt atattatgtg gttcaccaga 10200
tggcagttca gatgatgatt ttaaacagaa atttactgat ataggtgtta gggttattac 10260
gatgccttca ttaaaacgaa atatcgggtg gcatgatttt cgatgtttca ttgatttata 10320
caatttcttt aaaaaggaaa agtttgatat agttcataca aactcaacta agccaggaat 10380
aatagctaga atagccgcta gattagctgg gacaaaactc attattcaca cagtacatgg 10440
aatcgcattt catagaaaag aaaatactgt aaggaaaatt ttttactatt gccttgaaaa 10500
ttttgcaaca ctttttggta gcattaatgt gacagtgaac gagaattatt taaaatatta 10560
tccattcgtt aaaagtcaca ttgtatataa tggagttgat ttcaacgttc tttgctgcaa 10620
taaaaaggat catgattttt tacatattgc atttatggct agacttgata aacaaaaaaa 10680
ccctttggag tttataagag ccgttaatat tattaagaaa aaattaccaa atgagcgttt 10740
gaaatttaca ttggctggct gtggtgagtt agaaaatgaa tgtaaaaaat taatagaaca 10800
ttttcatctt acagatgtta ttgatatgcc tggatggata gtagataaaa acacatttta 10860
taactctgtc gatattattt gccagccatc caattgggag gcttttggct tagtatttgt 10920
tgaggccgca ttttttgaaa ttccatctgt ttcaaggaat attgaaggga ttcctgaggt 10980
tattttagat aatgaaactg ggcttttgta tgagggtgga gaagccgagt tgagtgaaaa 11040
gctgatatca ttaattcatg ataaaaagaa aatttcttgg ttaggtttga atgctaaaga 11100
atatgtctta aagcatttca ccaaagatat catggttgaa aaatattcaa aactgtatga 11160
tttataagta tctaattaaa tttcactatg atttttgcat tatgatatta tagacccgtg 11220
tattttttca agccgcacgc cctcgcggtg accaccccct gacaggagta aacaatgtca 11280
aagcaacaga tcggcgtagt cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaacatc 11340
gaaagccgtg gttataccgt ctctattttc aaccgttccc gtgaaaagac ggaagaagtg 11400
attgccgaaa atccaggcaa gaaactggtt ccttactata cggtgaaaga gtttgttgaa 11460
tctctggaaa cgcctcgtcg catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct 11520
gctattgatt ccctcaagcc atacctcgat aaaggtgaca tcattattga tggtggtaat 11580
accttcttcc aggacaccat tcgtcgtaac cgtgagcttt ctgccgaagg ttttaacttc 11640
atcggtaccg gtgtttccgg cggtgaagag ggggcgctga aagggccttc catcatgcct 11700
ggtgggcaga aagaagccta tgaactggtt gcgccgatcc tgaccaaaat cgccgccgtt 11760
gctgaagatg gcgaaccgtg cgttacctat attggtgccg atggcgcagg tcactatgtg 11820
aagatggttc acaacggtat tgaatatggc gatatgcagc tgattgctga agcctattct 11880
ctgcttaaag gtggcctgaa cctcaccaac gaagaactgg cgcagacctt taccgagtgg 11940
aataacggtg aactgagtag ctacctgatc gacatcacca aagacatctt cactaaaaaa 12000
gatgaagacg gtaactacct ggttgatgtg atcctggatg aagcggctaa caaaggtacc 12060
ggtaaatgga ccagccagag cgcgctggat ctcggagaac cgctgtcgct gattaccgag 12120
tctgtgtttg cacgttatat ctcttctctg aaagagcagc gtgttgccgc atctaaagtt 12180
ctctctggcc cacaagcgca gccagctggc gacaaaggtg agttcatcga aaaagttcgt 12240
cgtgctctgt atctgggtag tcgcgctgcg cctggattaa gttcgcaggc agaacagcgg 12300
cacggtagct atcgtaatag gcaaccgcag cggcgaaggt cggaaccggg ataccgttct 12360
gtactgcata agcaacaaca cacgcagcgc ctgctggtag tcatcggcaa tttgcttgaa 12420
gtacggagcc agca 12434
表1大肠杆菌O19型的O抗原基因簇中的寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据 基因 功能 基因的碱基 位置 正向引物 反向引物 PCR产物 的长度 产生正确 大小电泳 带的组数 PCR的退 火温度 (℃) Wzx O-抗原转运酶 4157-5413 4259-4274 4560-4575 317bp 0* 56 4312-4327 4880-4895 584bp 0* 56 Wzy O-抗原聚合酶 5415-6539 5834-5849 6410-6425 592bp 0* 56 5626-5641 5987-6003 378bp 0* 56
* 只在大肠杆菌O19型中得到正确的一条带
表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号 该组中含有的菌株 来源
1、野生型大肠杆菌 O1,O2,O5,O7,O8,O9,O12,O13,O14,O15,O16,O17,O18, IMVSa
O20,O21,O22,O23,O24
2、野生型大肠杆菌 O4,O10,O25,O26,O27,O28,O29,O30,O32,O33,O34,O35, IMVSa
O36,O37,O38,O40,O41,O42,O43
3、野生型大肠杆菌 O6,O44,O45,O46,O48,O49,O50,O51,O52,O54,O55,O56, IMVSa
O57,O58,O60,O61,O62,O53
4、野生型大肠杆菌 O63,O65,O66,O69,O70,O71,O74,O75,O76,O77,O78, IMVSa
O79,O80,O81,O82,O83,O68
5、野生型大肠杆菌 O84,O85,O86,O87,O88,O89,O90,O91,O92,O98,O99, IMVSa
O101,O102,O103,O104,O105,O106,O97
6、野生型大肠杆菌 O107,O108,O109,O110,O111,O112ab,O112ac,O113, IMVSa
O115,O116,O118,O120,O123,O125,O126,O128,O117
7、野生型大肠杆菌 O129,O130,O131,O132,O133,O134,O135,O136,O137, IMVSa
O138,O139,O141,O142,O143,O144,O145,O140
8、野生型大肠杆菌 O146,O147,O148,O150,O152,O154,O156,O157,O158, IMVSa
O159,O160,O161,O163,O164,O165,O166,O153 b
9、野生型大肠杆菌 O168,O169,O170,O171,O172,O173, c
痢疾志贺氏菌 D1,D2,D3,D4,D5,D6,D7,D8,D9,D10,D11,D12,D13 d
10、鲍氏志贺氏菌 B1,B2,B3,B4,B6,B7,B8,B9,B10,B11,B12,B13,B14,B15, d
B16,B17,B18
11、福氏志贺氏菌 F1a,F1b,F2a,F2b,F3,F4a,F4b,F5(v:4),F5(v:7),F6, d
DS,DR
12、野生型大肠杆菌 O3,O11,O39,O59,O64,O73,O96,O95,O100,O114,O151,O155, IMVSa
O124,O167,O162,O121,O127,O149,O119
13、第1组菌株加上大肠杆菌标准菌株O19 IMVSa
为了检测的方便,每12-19个菌分为一组,总共12组,第13组作为阳性对照
a. Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS),Anelaide,Australia
b. Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark
c. O172和O173来自于Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark,其余来自于IMVS
d. 中国
预防医学科学院流行病学研究所
表3大肠杆菌O19型O抗原基因结构图
Escherichia coli type 19 O-antigen gene cluster
galF rmlB rmlD rmlA rmlC wzx wzy orf7 orf8 H-repeat orf* orf9 gnd
G+C% 44.4 45.7 43.1 38.7 34.7 29.5 32.6 30.8 40.4 27.2 31.1
表4大肠杆菌O19型O抗原基因簇基因位置
ATCGAAAAAC CCGGATCAGC CGCAGACGCT GGACTCAGAC ATCATGGCCG TTGGTCGCTA 60
TGTGCTTTCT GCCGATATTT GGCCGGAACT AGAACGCACT CAACCAGGTG CATGGGGACG 120
TATTCAGCTG ACTGATGCCA TTGCCGAACT GGCGAAAAAA CAGTCCGTTG ATGCCATGCT 180
GATGACTGGA GACAGCTACG ACTGCGGTAA AAAAATGGGC TATATGCAGG CGTTTGTGAA 240
GTATGGGCTG CGCAACCTAA AAGAAGGGGC GAAGTTCCGT AAAGGGATTG AGAAGCTGTT 300
AAGCGAATAA TGAAAATCTG ACCGAATGTA ACGGTTGATA AGAAAATTAT AACGGCAGTG 360
AAGATTCGTG GCGAAAGTAA TTTGTTGCGA ATATTCCTGC CGTTGTTTTA TATAAACAAT 420
CAGAATAACA ACGAGTTAGC AATAGGATTT TAGTCAAAGT TTTCCAGGAT TTTCCTTGTT 480
TCCAGAGCGG ATTGGTAAGA CAATTAGCGT TTGAATTTTT CGGGTTTAGC GCGAGTGGGT 540
AACGCTCGTC ACATCGTAGG CATGCATGCA GTGCTCTGGT AGCTGTAAAG CCAGGGGCGG 600
TAGCGTGCAT TAATACCTCT ATTAATCAAG CTAAGAGCCG CTTATTTACA GTATGCTCTG 660
orf1的起始
AAGTAATATG GAATAAAAAA GTGAAGATAC TTGTTACTGG TGGCGCAGGA TTTATTGGTT 720
CTGCTGTAGT TCGTCACATT ATAAATAATA CGCAGGATAG TGTTGTTAAT GTCGATAAAT 780
TAACGTACGC CGGAAACCTC GAATCACTTG CTGATGTTTC TGATTCTGAA CGCTATGTTT 840
TTGAACGTGC GGATGTTTGC GATGCAGCTG CAATGGCGCG GATTTTTGCT CTGCATCAGC 900
CGGATGCAGT GATGCACTTG GCTGCTGAAA GCCATGTGGA TCGTTCCATT ACAGGCCCTG 960
CGGCATTTAT TGAAACCAAT ATTGTTGGTA CTTATGTCCT TTTGGAAGCC GCTCGCAATT 1020
ACTGGTCTGC TCTTGATAGC GACAAGAAAA ATAGCTTCCG TTTTCATCAT ATTTCTACTG 1080
ACGAAGTCTA TGGCGATTTG CCTCATCCTG ACGAAGTAAA TAATAAAGAA GAATTACCCC 1140
TCTTTACTGG GACGACAGCT TACGCGCCAA GCAGCCCATA TTCTGCTTCT AAAGCATCCA 1200
GCGATCATTT AGTCCGCGCG TGGAAACGTA CCTATGGTTT ACCGACCATT GTGACTAACT 1260
GTTCGAATAA CTACGGcCCT TATCACTTTC CGGAAAAATT GATTCCGCTG GTAATTCTTA 1320
ATGCTCTGGA AGGTAAGGCA TTACCTATTT ATGGCAAAGG GGATCAAATT CGTGACTGGC 1380
TGTATGTTGA AGATCATGCG CGTGCGTTAT ATACCGTCGT AACCGAAGGT AAAGCGGGTG 1440
AAACTTATAA CATTGGTGGA CACAACGAAA AGAAAAACAT CGATGTAGTG CTCATTATTT 1500
GTGATTTGTT GGATGAGATT GTACCGAAAG AGAAATCTTA CCGCGAGCAA ATTACTTATG 1560
TTGCCGATCG TCCGGGACAC GATCGCCGTT ATGCGATTGA TGCTGACAAG ATTAGCCGCG 1620
AATTGGGTTG GAAACCACAG GAAACGTTTG AGAGCGGGAT TCGTAAAACG GTGGAATGGT 1680
ACCTGGCTAA TGCAAAATGG GTCGGAAATG TGAAAAGTGG TGCCTATCAG TCATGGATTG 1740
orf1的终止 orf2的起始
CACAGAACTA TGAGGGTCGC CAG TAATGAA TATCCTCCTT TTCGGCAAAA CAGGGCAGGT 1800
AGGTTGGGAA CTACAGCGTG CTCTGGCACC TCTGGGTAAT TTGATTGCTC TTGATGTCCA 1860
CTCCACTGAT TATTGTGGTG ATTTTAGTAA CCCTGAAGGG GTGGCTGAAA CAGTCAAAAG 1920
AATTCGACCT GATGTTATTG TTAATGCTGC GGCTCATACC GCAGTAGATA AGGCTGAGTC 1980
AGAACCCGAA TTTGCACAAT TACTCAATGC AACTAGCGTT GAATCAATTG CAAAAGCGGC 2040
TAATGAAGTT GGGGCTTGGG TAATTCATTA CTCAACTGAC TACGTATTCC CTGGAAATGG 2100
TGACATGCCA TGGCTGGAGA CGGATACAAC CGCTCCGCTG AATGTTTATG GTGAAACTAA 2160
GTTAGCCGGA GAAAAAGCAT TACAAGAACA TTGTCCTAAG CACCTTATTT TCCGGACTAG 2220
CTGGGTCTAT GCAGGCAAAG GAAATAACTT CGCGAAAACG ATGTTACGTC TGGCAAAAGA 2280
GCGCGAAGAA TTAGCGGTTA TTAACGATCA GTTTGGTGCA CCAACAGGTG CTGAACTGCT 2340
GGCTGATTGT ACGGCACATG CAATTCGTAT GGCACTGAAT AAACCAGAAG TCGCAGGTTT 2400
GTACCATCTG GTAGCCAGTG GTACCACAAC CTGGCACGAT TATGCTGCGC TGGTTTTTGA 2460
AGAGGCACGA AAAGCAGGTA TTCCCCTTGC ACTCAACAAG CTCAACGCGG TACCAACAAC 2520
AGCTTATCCT ACACCAGCTC GTCGTCCACA TAACTCTCGT CTTAATACAG TAAAATTTCA 2580
GCAGAACTTT GCGCTTGTCT TGCCTGACTG GCAGGTTGGC GTGAAACGAA TGCTCAACGA 2640
orf2的终止
ATTATTTACG ACTACAGCAA TT TAATAGTT TTTGCATCTT GTTCGTGATG GTGGAGCAAG 2700
orf3的起始
ATGAATTAAA AGGAATGATG AA ATGAAAAC GCGTAAAGGT ATTATTTTAG CGGGTGGTTC 2760
TGGTACTCGT CTTTATCCTG TAACTATGGC TGTCAGTAAA CAGCTGTTAC CGATTTATGA 2820
TAAACCGATG ATCTATTATC CGTTGTCTAC ACTGATGTTA GCGGGTATTC GCGATATTCT 2880
GATTATCAGT ACGCCACAGG ATACTCCTCG TTTTCAACAG TTGCTGGGTG ATGGCAGCCA 2940
GTGGGGCCTG AATCTTCAAT ACAAAGTGCA ACCGAGCCCA GACGGTCTTG CGCAAGCATT 3000
TATCATCGGT GAAGAGTTTA TTGGTGGTGA TGACTGTGCT TTGGTTCTTG GTGATAATAT 3060
CTTCTACGGT CACGATCTGC CGAAGTTAAT GGAAGCAGCT GTTAACAAAG AAAGTGGCGC 3120
AACGGTATTT GCTTATCACG TAAATGATCC TGAACGCTAC GGTGTCGTTG AGTTTGATAA 3180
AAACGGTACG GCAATTAGCC TGGAAGAAAA ACCGCTACAG CCAAAAAGTG ATTATGCGGT 3240
GACTGGGCTT TATTTCTATG ATAACGACGT TGTCGAAATG GCGAAAAACC TTAAGCCATC 3300
TGCACGTGGT GAACTGGAAA TTACCGATAT TAACCGTATT TATATGGAAC AAGGGCGTTT 3360
GTCTGTTGCT ATGATGGGTC GTGGTTATGC ATGGCTGGAC ACGGGGACAC ATCAAAGTCT 3420
TATTGAAGCA AGCAACTTCA TTGCAACAAT TGAAGAGCGT CAGGGACTGA AAGTTTCCTG 3480
CCCGGAAGAA ATTGCTTACC GTAAAGGGTT TATTGATGCT GAGCAGGTGA AAGTATTGGC 3540
orf3的终止
TGAACCGTTG AAGAAAAATG CTTATGGTGA GTACCTGCTA AAAATGATTA AAGGTTAT TA 3600
orf4的起始
ATAAA ATGAA CGTAATTAAA ACAGAAATTC CAGATGTATT AATTTTCGAG CCGAAAGTTT 3660
TTGGTGATGA ACGTGGTTTC TTTTTTGAGA GCTTTAACCA GAAGGTTTTT GAGGAAGCTG 3720
TAGGCCGCAA AGTTGAATTT GTTCAGGATA ACCATTCGAA GTCCAGTAAA GGTGTTTTAC 3780
GCGGGCTACA TTATCAGTTA GACCCTTATG CACAAGGAAA ATTGGTGCGC TGCGTAGTTG 3840
GTGAAGTTTT TGATGTAGCG GTTGATATTC GTAAATCGTC ACCTACATTT GGGAAATGGG 3900
TTGGGGTAAA TTTGTCTGCT GATAATAAGC GCCAGTTGTG GATCCCGGAA GGGTTTGCGC 3960
ATGGATTTTT GGTGTTGAGT GAAACGGCTG AGTTTTTGTA TAAGACGACA AATTATTATC 4020
ATCCTGATGC TGAAGGTTCA TTACGTTGGA ATGATGATGA TATTAATATT AATTGGCCAT 4080
CATCATACGG TATCACTCTA TCAAAGAAGG ATGAAAATGC ACCGTACTTC AACAGAATAA 4140
orf5的起始 orf4的终止
TCGGTAATGG AATTTT ATGA GTTTATTTAA AAACGCTGGC TGGAATATTT TAGGTCTGGT 4200
TATTCCACTT ATTATGGCGA TCCCCGTTAT GGGGATCATG GCTCGTTTAT TAGGTGTTGA 4260
ACGCTTTGGT CTTTTCACTA TTGCTTATGC TTTAATGGGA TATGCAAGTG TTTTTGATGG 4320
CGGAATATCT CGTGCAGTTA TTCGGTTTGT ATCTATTTAT AGAAATGACA ATGAAAAAGT 4380
TAATGTTATT TTAGGTTCTT CTATATATAC GGTAACTGTT TTAAGTATCC TAATAGCATT 4440
ATTAACTTAT TTAGTATCAC CAAATTTGGT TGTTTTTTTA AAAGTATCAC AGGATATTCG 4500
ACATGAAGTT GTAATAGCTC TTCAGCTACT GGGGGCATGT ATCCCTGCAT TACTACTTAC 4560
ACAAGTATGG CGAGCATATC TTGAAGGTGT CGAAAATTTT TCTTCTTTGA ACATTCAACA 4620
AGTTCTAACA AGTCCTTTCA TAATATTATT ACCATTAACC ACAACATGGT TTTCACAAAC 4680
TCTTATTTCA GCAGTATTAG GGTTGATTTT GGGACGCTGG ATTGTTGCAT TTATTAGTTG 4740
GAAACTTTGT TCGCGCCATC TTAAAAATTT CAAAAGAACA TTTAGTCGAA AAGCTTTGAT 4800
GGAGCTTATT AGCTTTGGTG GATGGGTAAC TCTGAGTAAT ATTATAGGCC CTTTAATGGG 4860
GTTTATTGAT CGTTTTGCTG TCTCACATTT CGCTGGCGCT AATGTTGTTG CTTACTATTC 4920
AGGGCCGTCT GATATGGTAT CTCGACTTAC TTTATTTCCT GGGGCTGTTG CCAGGGCTCT 4980
ATTTCCAAAA CTAAGTTTTG AAACTAGAGA AGAGAGCAAA GTTACATATT TTCGATCTCT 5040
AATTCTCGTT TTTTGTTTAT CTTTTCTTTT AGCATTGCCA TTTTTCTTAT TTTCAAGCGA 5100
TATATTAGGT ATATGGTTAG GAAATGAGTA TAGAGGAGAT GCAGCGGTCG TATTTCGCAT 5160
ATTGTTAATT GGATTTGTTT TTAATTCAAT AGCACAAATA TGTTTTGCTA GAATTCAGTC 5220
TGCTGGATTT GCGAAATGGA CTGGTATTGT GCATATTATG GAATTCATAC CATACTTGGT 5280
TCTTTTGTAT TTACTGACCG TCAAATATTC TTTTTTTGGA GCTGCGTTCG CCTTTTCATT 5340
AAGGTCATTA TTGGATTTTA TAATTCTATT CCTGGTTGAA AGGATCGGTA TCTATAACAT 5400
orf5的终止 orf6的起始
GGATAGGATA TAAT ATGAAT GTCGTTCAAG CAATGGTTAT AATATACCTT TGTTACCTAA5460
TTATATGTTT CTTCTTTAGG CTTGAAATAA CACATCCAGC AGTTGTACAT ACGATAATTT 5520
GGCTTATAAG CGCGAGCTTA GCTCTTGTTT TTGCTGAAGA AAAATATTTG CCAAATAACT 5580
ATTATATAGT TATAGCAAAC TCAATGTTTT TTATTTTTTC TTTCATTGGT GGAATTGGTG 5640
TTTTTAATAA AAATAAAGCT TTTCAGTTAA ATATTGATAA AAATTCTTAT GTAAATGCTT 5700
TACCATTTTG TTTAATAATA TCATTTTATT TGATTATACT AATAACCTAT AATGTGAATG 5760
TTTTATCAAA CATATCAGCG TTCCGAGATT ATCTGGTTGC TGACGATGGT GCTAATTATG 5820
GTTTATTAGG GCGTATCGCA ATGTTATCGC TCTTCTCTTC TTGTTTTTTA CTTTTGAGAA 5880
GTCGAAGGCT TTTTTTACTT AGCGCCGTGT TGTGCATCCC TATAATTATT ATACTAAGTG 5940
CAAAAACCTT AGTTCTATTG TATTTAATAA CGATACTAAT TTTAACTCCA AACAGGCTGA 6000
AAATATCAAA ACTACTAATC TTCTTTAGCA TATTTATTCT TTTCTTTATT GGGATAATGA 6060
GGCTTCGATA TCCAGAAGCA TCTTTTAATT TAATTTTATA TTATTTATAT AATTATATTT 6120
CAGGTGGATT TTTGGCTTTT TCACAATTGC CGAATTCATT TAATCAAGTT TTTGGTTTTT 6180
ATTCTTTCAG AAACTTTTAC CTTTGGTTAA ATGTGCTCTA TCCAGTCGAG ATCGCAAACA 6240
TTCTTCAAGA GTGGGTAAAT GTCCCATTTC CTGTCAATGT ATATACGTAT CTTCGCCCTT 6300
ATTATATGGA TTTTGATTAT TTATCATTAT TTTTCCCAAT TATCTTTGGC TTTTTTTCGG 6360
GAAGAATATA TATGGAAAAG TATAAAAATA GACGCATTTA TTATATTGTA TACCCGATAA 6420
CCTTTTACGC AATAGCAATG CAGCTATTTG ATGATCAATA TCTTACATGG TTATCAAACT 6480
orf7的起始 orf6的终止
GGATATTGCT TATAATTACA GGCTATATAA TGACTTGGGA GGGGGT ATGT CGAAAA TAGC6540
AGTTTTGATA GTAACGTATA ATCCAGTTTT AAGTGTGTTG GATGATCTAA TTGGAAAGAT 6600
AAAAAAAGCT AAATATAATT TAGAAATATT TCTCGTTGAT AATGCTAGTG AAAATGCTAA 6660
TATATTAAAA GCTAAATTTA AGGACGAGCC CAATATATTA TTCCTTGATG AAAATTTGGG 6720
ATTGGCTGGG GCACAAAATG TAGGTCTGAA AAAAATATTA CGAACAGACT GTGAAGCAGT 6780
CCTTTTTTTT GATCAAGATA CTTCCCCTAC AGATGTATTT TTTACTAATT TGATAGAGTC 6840
TATGTCAAAG TTAGCTCTAC AGGGAGAAAA AATTGGTGCT ATTGGACCTG TTTTTTACGA 6900
CTCAAGGACA GGAACCAAAT ATCCATTTAT TCTCTTAAAA AGAATCCGAG CTAAGAAGGT 6960
TTTTCCAACA GGTAATGTCC CGCTTAAAGT TTCATTTTTA ATAAACTCAG GTATGCTAGT 7020
ACCAGTAAGC ACATTAAAAG ATGTTGGGTT AATGAAAGAG GAATTATTTA TAGACTATGT 7080
CGATATTGAA TGGTGCCTCC GAGCTGCAAG TAAAAAGTTT AACTTTTACG CTATTCCCGA 7140
TGCAACGATG AGTCATGCAT TAGGAGATGA GCGTAAATCA ATTTTGGGAA GAGAAATTAG 7200
CATACACAGC CCTTTGAGAC GTTATTATTT AGCAAGAAAT TCTATTTATA TGCTGCGTTT 7260
ACCATACGTT CCTTTGGGGT ATAAAATAAG AGAAATTTTG TTTTCATTGT TGAGAACAGC 7320
GATATTTATA TCAACTGTTA ATAATAAGAA GGTTTATGTT GATTTTATTC TAAAAGGTTG 7380
orf7的终止
GTCGGATGGC ATTAAAAAAA ATTATGGGAA GTATGTTGGA ATAAAG TAGA TATTTTTTTT 7440
orf8的起始
GAAACGAATA AACTTGGACA AATTTAATCC CTTTCAATGG AGAAAAAA GT GATTAGTTCG 7500
GTTACAGTTA CATATAACCC AGATATTGAA TGCCTCAGAC AGCAACTTTT ATCAGTACGT 7560
AAGCAGGTTG ATTTATGTGT AATTGTTGAT AATGGCTCAA ACAATATTAT TGAGATTAAA 7620
AAATTAAATT ATGAGTTTGA TTTTTATCTT ATTCAATTTG ATGATAATTA TGGTCTCGCA 7680
TATGCACAAA ATAGTGGTAT AGAATATGCC ATATCTTCTG GTACAGAATA TTTATTATTG 7740
TTGGATCAAG ATAGTATCTT GAAAGATGAA TTTTCTAAGA ACATGAAGCA TATATATATA 7800
AAATATAATG TTGGGATTTT AGGACCTTCA TTTTATGATC CTCAAAACAA TAAAATTTAT 7860
TTTGGGACTT GTTATAAAGG ACCTTTTATT AGCCGTAAGT CTATCGGTGA GGTTACCGAT 7920
GTTACTTTTG TCATTGCATC GGGCTCCTTT TTTTCATCAG ATGTTTATAA AAAAATTGGA 7980
GGAATGAAAT CTGAACTTTT TGTGGATTAT ATTGATGTTG AATGGTCTCT TAGAGCAAAA 8040
AATATGGGAT ACAGAGTGTG TATGACTAAC AGGGCTTTAA TGGCTCATAC AATTGGTGAT 8100
TCCAGAATTA CAATTTTTGG GCGGACAATA TCGGTGCATA GCCCCATAAG ACGTTATTAT 8160
TTAGTTAGAA ATAGTTTCTA TATGCTAAGG TTGCACTATG TGCCTATTGG ATATAAAGTT 8220
CGCGAAATTT TCTTTAATTG TTTACGATCA ATAATTTCTC TAATAATAAG TGACAAAAAG 8280
GGTAATGTAA TAACTAAACT AGGTCAAGGA ATATATGACG GTATTCGTGG GAAATATGGT 8340
orf8的终止
GATTATAAAG ATAGA TAATA TTAATTCATC CGTTGCGTCA CAATTAAATT AGAATTCATG 8400
TACAAATTAA TACAAAGGAA AAGTAATACT TAAAGTATAT TCAACACTAA ATAATTCACT 8460
TTTCCTATCA TGGAAAGATC ATCGGTGTGC TGTAGGCACA AAGATGCAAA ACGGGACGTT 8520
TTGCATGTAA TAAGCATAAG CTTGTAAAGA GATGGTGGCA GGCAGGGAAA GATCATCAGA 8580
AGTTCACTTT TTGTACTAAA TAATTCGCAT TTTATGTTTA AAAATTGAGA TATTCCTTAT 8640
TACCTAAAGC TGTTTTTTAT TGCTTATACA TGATCAAATA CTCCTTACAT AATTAAGGAG 8700
AACAAAATGG AACTTAAAAA GTTGATGGAA CATATTTCTA TTATCCCCGA TTACAGACAA 8760
GCCTGGAAAG TAGAACATAA ATTGACAGAT ATTCTACTGT TGACTATTTG CGCCGTCATT 8820
TCTGGTGCAG AAGGCTGGGA AGATATAGAG GATTTTGGTG AAACACATCT CGATTTTTTG 8880
AAGCAATATG GTGATTTTGA AAATGGTATT CCTGTCCACG ATACCATTGC CAGAGTTGTA 8940
TCCTGTATCA GTCCTGCAAA GTTTCACGAG TGCTTTATTA ACTGGATGCG TGACTGCCAT 9000
TCCTCAAATG ATAAAGACGT TATTGCAATT GATGGAAAAA CGCTCCGGCA CTCTTATGAC 9060
AAGAATCGCC GCAAGGGAGC GATTCATGTC ATTAGTGCGT TCTCAACAAT GCACAGTCTG 9120
GTTCTCGGGC AGATTAAGAC GGATGAGAAA TCCAATGAGA TTACAGCCAT TCCTGAACTT 9180
CTTAACATGC TGGATATTAA AGGAAAAATC ATCACAACTG ATGCGATGGG GTGCCAGAAA 9240
GATATTGCAG AGAAGATACA AAAACAGGGC GGTGATTATT TATTCGCTGT AAAAGGAAAC 9300
CAGGGGCGGC TTAATAAAGC CTTTGAGGAA AAATTTCCGC TGAAAGAATT AAATAATCCA 9360
GAGCATGACA GTTACGCTAT TAGTGAAAAG AGTCACGGCA GAGAAGAAAT CCGTCTTCAT 9420
ATTGTTTGCG ATGTCCCTGA TGAACTTATT GATTTCACGT TTGAATGGAA AGGGCTGAAG 9480
AAATTATGCG TGGCAGTCTC CTTTCGGTCC ATAATAGCAG AACAAAAGAA AGAGCCAGAA 9540
ATGACGGTCA GATATTATAT CAGTTCTGCT GATTTAACCG CAGAGAAGTT CGCCACAGCA 9600
ATCCGAAACC ACTGGCACGT GGAGAATAAG CTGCACTGGC GTCTGGACGT GGTAATAAAT 9660
GAAGACGACT GCAAAATAAG AAGAGGAAAT GCAGCAGAAT TATTTTCAGG GATACGGCAC 9720
ATCGCTATTA ATATTTTGAC GAATGATAAG GTATTCAAGG CAGGGTTAAG ACGTAAGATG 9780
CGAAAAGCAG CCATGGACAG AAACTATCTG GCGTCAGTCC TTGCGGGGAG CGGGCTTTCG 9840
TAATCTCGCC CTGACATGGA CCTCTAAGGC GATATTAATT GTTTGAAAAT TATATCTCAA 9900
ATTTAAAAAT GAGCTGTATG CTGTTAGAGT ATAAAATATG TGTTTTTATA TTGGAAGGTT 9960
TTTAGTGAGC ATGATTTTAA CCAAAAATAT AAATACTTTA CTTTCATACA CTATAACATC 10020
orf9的起始
AATTAAGGAT GGAATAAATG GTGAAACGGG GGAATATAAA GGATAACAAC TCATT ATGAA 10080
AAAAATAATA CATATCCAAG TGTTGCCAAA AATGTCTGGG GTTCAGCAAG TCTCTTTTGA 10140
TATTTTGTCA GGGATTAATG ACGAAAATGT ACAAAAATTT ATATTATGTG GTTCACCAGA 10200
TGGCAGTTCA GATGATGATT TTAAACAGAA ATTTACTGAT ATAGGTGTTA GGGTTATTAC 10260
GATGCCTTCA TTAAAACGAA ATATCGGGTG GCATGATTTT CGATGTTTCA TTGATTTATA 10320
CAATTTCTTT AAAAAGGAAA AGTTTGATAT AGTTCATACA AACTCAACTA AGCCAGGAAT 10380
AATAGCTAGA ATAGCCGCTA GATTAGCTGG GACAAAACTC ATTATTCACA CAGTACATGG 10440
AATCGCATTT CATAGAAAAG AAAATACTGT AAGGAAAATT TTTTACTATT GCCTTGAAAA 10500
TTTTGCAACA CTTTTTGGTA GCATTAATGT GACAGTGAAC GAGAATTATT TAAAATATTA 10560
TCCATTCGTT AAAAGTCACA TTGTATATAA TGGAGTTGAT TTCAACGTTC TTTGCTGCAA 10620
TAAAAAGGAT CATGATTTTT TACATATTGC ATTTATGGCT AGACTTGATA AACAAAAAAA 10680
CCCTTTGGAG TTTATAAGAG CCGTTAATAT TATTAAGAAA AAATTACCAA ATGAGCGTTT 10740
GAAATTTACA TTGGCTGGCT GTGGTGAGTT AGAAAATGAA TGTAAAAAAT TAATAGAACA 10800
TTTTCATCTT ACAGATGTTA TTGATATGCC TGGATGGATA GTAGATAAAA ACACATTTTA 10860
TAACTCTGTC GATATTATTT GCCAGCCATC CAATTGGGAG GCTTTTGGCT TAGTATTTGT 10920
TGAGGCCGCA TTTTTTGAAA TTCCATCTGT TTCAAGGAAT ATTGAAGGGA TTCCTGAGGT 10980
TATTTTAGAT AATGAAACTG GGCTTTTGTA TGAGGGTGGA GAAGCCGAGT TGAGTGAAAA 11040
GCTGATATCA TTAATTCATG ATAAAAAGAA AATTTCTTGG TTAGGTTTGA ATGCTAAAGA 11100
ATATGTCTTA AAGCATTTCA CCAAAGATAT CATGGTTGAA AAATATTCAA AACTGTATGA 11160
orf9的终止
TTTA TAAGTA TCTAATTAAA TTTCACTATG ATTTTTGCAT TATGATATTA TAGACCCGTG 11220
TATTTTTTCA AGCCGCACGC CCTCGCGGTG ACCACCCCCT GACAGGAGTA AACAATGTCA 11280
AAGCAACAGA TCGGCGTAGT CGGTATGGCA GTGATGGGGC GCAACCTTGC GCTCAACATC 11340
GAAAGCCGTG GTTATACCGT CTCTATTTTC AACCGTTCCC GTGAAAAGAC GGAAGAAGTG 11400
ATTGCCGAAA ATCCAGGCAA GAAACTGGTT CCTTACTATA CGGTGAAAGA GTTTGTTGAA 11460
TCTCTGGAAA CGCCTCGTCG CATCCTGTTA ATGGTGAAAG CAGGTGCAGG CACGGATGCT 11520
GCTATTGATT CCCTCAAGCC ATACCTCGAT AAAGGTGACA TCATTATTGA TGGTGGTAAT 11580
ACCTTCTTCC AGGACACCAT TCGTCGTAAC CGTGAGCTTT CTGCCGAAGG TTTTAACTTC 11640
ATCGGTACCG GTGTTTCCGG CGGTGAAGAG GGGGCGCTGA AAGGGCCTTC CATCATGCCT 11700
GGTGGGCAGA AAGAAGCCTA TGAACTGGTT GCGCCGATCC TGACCAAAAT CGCCGCCGTT 11760
GCTGAAGATG GCGAACCGTG CGTTACCTAT ATTGGTGCCG ATGGcGCAGG TCACTATGTG 11820
AAGATGGTTC ACAACGGTAT TGAATATGGC GATATGCAGC TGATTGCTGA AGCCTATTCT 11880
CTGCTTAAAG GTGGCCTGAA CCTCACCAAC GAAGAACTGG CGCAGACCTT TACCGAGTGG 11940
AATAACGGTG AACTGAGTAG CTACCTGATC GACATCACCA AAGACATCTT CACTAAAAAA 12000
GATGAAGACG GTAACTACCT GGTTGATGTG ATCCTGGATG AAGCGGCTAA CAAAGGTACC 12060
GGTAAATGGA CCAGCCAGAG CGCGCTGGAT CTCGGAGAAC CGCTGTCGCT GATTACCGAG 12120
TCTGTGTTTG CACGTTATAT CTCTTCTCTG AAAGAGCAGC GTGTTGCCGC ATCTAAAGTT 12180
CTCTCTGGCC CACAAGCGCA GCCAGCTGGC GACAAAGGTG AGTTCATCGA AAAAGTTCGT 12240
CGTGCTCTGT ATCTGGGTAG TCGCGCTGCG CCTGGATTAA GTTCGCAGGC AGAACAGCGG 12300
CACGGTAGCT ATCGTAATAG GCAACCGCAG CGGCGAAGGT CGGAACCGGG ATACCGTTCT 12360
GTACTGCATA AGCAACAACA CACGCAGCGC CTGCTGGTAG TCATCGGCAA TTTGCTTGAA 12420
GTACGGAGCC AGCA 12434
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上 的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。