TRPML3(MCOLN3)作为咸味受体的鉴定及在用于鉴定调控钠转运、吸收或排泄和/或醛固酮和/或血管加压素的产生或释放的味觉(咸味)调节剂和/或治疗剂的测定中的用途
阅读：503发布：2022-10-03
专利汇可以提供TRPML3(MCOLN3)作为咸味受体的鉴定及在用于鉴定调控钠转运、吸收或排泄和/或醛固酮和/或血管加压素的产生或释放的味觉(咸味)调节剂和/或治疗剂的测定中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于鉴定人TRPML3调节剂(优选地TRPML3增强剂)的基于高通量 哺乳动物 细胞和中等通量卵母细胞的电生理测定。测定中调控TRPML3功能的化合物预期影响人的咸味味觉。本发明的电生理测定(诸如二 电极 电压 钳技术)有助于鉴定特异调控人TRPML3的化合物。本发明的测定提供了用来检测促进(增强)或抑制TRPML3功能的化合物的强有 力 的筛选。因此增强或阻抑TRPML 3通道活性的化合物应调控咸味味觉。另外，这些化合物可用来调节钠排泄、尿输出和与钠 水 平相关的其他 生物 功能。本发明涉及阐明TRPML3参与灵长类动物(包括人和可能其他哺乳动物)的咸味感受(考虑到钠和其他离子对生理功能和条件的重要性，这一表型在不同动物中可能是非常保守的)。TRPML3基因还调控钠代谢、钠排泄、血压、液体潴留、心脏功能和诸如尿液产生和排泄的泌尿功能的一种或多种。本 发明人 基于基因表达测定、相似测定、已有报道和功能(电生理)研究鉴定TRPML3编码灵长类动物和人(以及可能其他哺乳动物)的咸味受体，所述基因表达测定确定了TRPML3特异地在味蕾细胞中表达，而不在舌上皮细胞中表达，所述相似测定确定了TRPML3特异表达或富集于不表达TRPM5或PKD2L1的味觉细胞亚群的味蕾细胞的上半部分，所述已有报道证明TRPML3在诸如 耳 的其他感觉器官中表达(因此进一步证实了TRPML3作为“专业”感觉基因的作用)、TRPML3在调节钠代谢中发挥重要作用的肾上腺(因为其调节钠代谢的关键分子 醛 固 酮 )中强表达及与其相关的事实(即，引发强烈盐渴求的自身免疫病，爱迪生氏病，涉及肾上腺的破坏)，所述功能(电生理)研究表明TRPML3传导钠并且显示与人咸味受体一致的生化特性(通过K+、Li+，并且对阿米洛利不敏感)。本 申请 还公开了用于鉴定灵长类动物味觉特异基因的新原理和方法，所述基因包括参与咸味感受(特别是人咸味感受)的基因，以及参与甜味、苦味、鲜味和酸味味觉和包括脂肪味觉(fat taste)的其他味觉感受的基因，和参与其他味觉细胞或味觉受体相关活性的基因，所述相关活性诸如消化功能和消化相关 疾病 、味觉细胞周转、 口腔 和消化道的免疫调节和诸如在糖尿病和肥胖中的代谢调节。使用这些方法鉴定的基因可用在用于鉴定味觉调节剂(增强剂或阻抑剂)和调控这些基因活性的潜在 治疗 剂的测定中。，下面是TRPML3(MCOLN3)作为咸味受体的鉴定及在用于鉴定调控钠转运、吸收或排泄和/或醛固酮和/或血管加压素的产生或释放的味觉(咸味)调节剂和/或治疗剂的测定中的用途专利的具体信息内容。
1.分离的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、甲状旁腺细胞、黑色素细胞或泌尿器细胞，或富集的味觉细胞样品，其中所述分离或富集的细胞样品包含表达TRPML3离子通道多肽的细胞。
2.如权利要求1所述的分离细胞或富集的味觉细胞样品，其中所述TRPML3选自哺乳动物、禽、两栖动物、鱼和爬行动物TRPML3。
3.如权利要求1所述的分离细胞或富集的味觉细胞样品，其表达哺乳动物TRPML3或
鸡、斑马鱼或爪蟾TRPML3。
4.如权利要求3所述的分离细胞或富集的细胞样品，其中所述哺乳动物TRPML 3选自
由人、鼠、大鼠、犬、猫、豚鼠、猪、马、牛、山羊、绵羊、熊、猴、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴、食蟹猴、长臂猿、瞪羚和斑马TRPML3组成的组。
5.如权利要求1所述的分离细胞或富集的细胞样品，其中所述TRPML3离子通道多肽与选自具有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少90％的序列同一性。
6.如权利要求5所述的分离细胞或富集的细胞样品，其中所述TRPML3离子通道多肽与选自具有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML 3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少95％的序列同一性。
7.如权利要求5所述的分离细胞或富集的细胞样品，其中所述TRPML3离子通道多肽
具有包含于SEQ ID NO：2、4或10中的序列或者由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML 3多肽。
8.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其中所述细胞或富集的细胞样品表达的TRPML3多肽具有使该离子通道对钠的敏感性或可透过性更低的突变。
9.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其中所述细胞或富集的细胞样品表达的TRPML3多肽具有使该离子通道对钠的敏感性或可透过性更高的突变。
10.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其中所述细胞或富集的细胞样品表达
的TRPML3多肽具有保持该离子通道处于“开放”或“关闭”取向的突变。
11.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其中所述细胞或富集的细胞样品表达
的TRPML3多肽具有细胞毒性的突变。
12.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其中所述细胞或富集的细胞样品表达
的TRPML 3多肽具有导致其中钠流入和流出不受控制的细胞的突变。
13.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其包含响应于咸味味觉的味觉细胞。
14.如权利要求13所述的分离细胞或细胞样品，其中所述味觉细胞选自人、非人灵长类动物、啮齿类动物、犬或猫的味觉细胞。
15.如权利要求14所述的分离细胞或细胞样品，其是人或非人灵长类动物的味觉细
胞。
16.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其包含泌尿器细胞。
17.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其包含垂体细胞。
18.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其包含肾上腺细胞。
19.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其包含甲状旁腺细胞。
20.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其包含参与咸味感受、钠代谢、醛固酮产生、和/或血管加压素释放的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、甲状旁腺细胞、黑色素细胞、或泌尿器细胞。
21.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其于溶液中。
22.如权利要求1所述的分离细胞或细胞样品，其在固相支持物上。
23.如权利要求22所述的分离细胞或细胞样品，其中所述支持物在柱子上。
24.如权利要求1所述的分离的味觉细胞或富集的细胞样品，其中所述味觉细胞是人
的咸味味觉细胞。
25.如权利要求1所述的分离的味觉细胞或富集的味觉细胞样品，其包含于人或非人
灵长类动物味蕾的上半部分。
26.如权利要求25所述的分离的味觉细胞或富集的味觉细胞样品，其中所述TRPML3基因是野生型的人或猕猴TRPML3。
27.如权利要求26所述的分离的味觉细胞或富集的味觉细胞样品，其中所述TRPML3基因是人基因，并且具有SEQ ID NO：2中的序列。
28.如权利要求1所述的分离细胞或富集的细胞样品，其进一步表达NALCN、NKAIN3、TRPML1和/或TRPML2。
29.一种调控咸味感受的分离的味觉受体，其包含调控哺乳动物咸味味觉的TRPML3多肽或其变体。
30.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其为同聚体。
31.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其为单体。
32.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其为异聚体。
33.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其包含哺乳动物、禽、两栖动物、鱼或爬行动物TRPML3离子通道。
34.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其为哺乳动物或鸡、斑马鱼或爪蟾的味觉受体。
35.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其包含选自人、鼠、大鼠、犬、猫、豚鼠、猪、马、牛、山羊、绵羊、熊、猴、大猩猩、黑猩猩、猩猩、食蟹猴、长臂猿、瞪羚、猕猴和斑马TRPML3的TRPML3。
36.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中所述TRPML3离子通道多肽与选自具
有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少90％的序列同一性。
37.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中所述TRPML3离子通道多肽与选自具
有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少95％的序列同一性。
38.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中被表达的所述TRPML3多肽具有使该离子通道对钠更敏感或更不敏感的突变。
39.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中被表达的所述TRPML3多肽具有使该离子通道更可透过或更不可透过钠的突变。
40.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中被表达的所述TRPML 3多肽具有保持
该离子通道处于“开放”或“关闭”取向的突变。
41.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中被表达的所述TRPML3多肽具有对含有该离子通道的细胞有毒性的突变。
42.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其中被表达的所述TRPML3多肽具有使该离子通道在细胞中表达时钠或钙的流入和流出不受控制的突变。
43.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其包含另一个离子通道多肽。
44.如权利要求43所述的分离的味觉受体，其中所述其他离子通道是NKAIN3、NALCN、TRPML1或TRPML2。
45.如权利要求29所述的分离的味觉受体，其为人或非人灵长类动物的咸味受体。
46.如权利要求45所述的分离的味觉受体，其包含人的咸味受体。
47.一种转基因非人动物，其被遗传改造为敲除或损害内源TRPML3的表达，条件是所述转基因动物不是Varitint小鼠。
48.一种转基因非人动物，其被遗传改造为表达异源TRPML3多肽，条件是所述转基因动物不是Varitint小鼠。
49.如权利要求48所述的转基因动物，其中所述TRPML3多肽是哺乳动物、禽、鱼、两栖动物或爬行动物TRPML3。
50.如权利要求48所述的转基因动物，其中所述TRPML3是哺乳动物TRPML3。
51.如权利要求50所述的转基因动物，其中所述TRPML3选自人、鼠、大鼠、犬、猫、豚鼠、猪、马、牛、山羊、绵羊、熊、猴、大猩猩、黑猩猩、猩猩、食蟹猴、长臂猿、瞪羚、猕猴和斑马TRPML3。
52.如权利要求48所述的转基因动物，其中所述异源TRPML3离子通道多肽与选自具
有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少90％的序列同一性。
53.如权利要求48所述的转基因动物，其中所述异源TRPML3离子通道多肽与选自具
有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少95％的序列同一性。
54.如权利要求48所述的转基因动物，其中所述异源TRPML 3离子通道多肽，其中被表达的所述异源TRPML3多肽具有使该离子通道对钠更敏感或更不敏感的突变。
55.如权利要求48所述的转基因动物，其中被表达的所述异源TRPML3多肽具有使该离子通道更可透过或更不可透过钠的突变。
56.如权利要求48所述的转基因动物，其中被表达的所述异源TRPML3多肽具有保持该离子通道处于“开放”或“关闭”取向的突变。
57.如权利要求48所述的转基因动物，其中被表达的所述TRPML3多肽具有对表达该离子通道的细胞有毒性的突变。
58.如权利要求48所述的转基因动物，其中被表达的所述异源TRPML3多肽具有使该离子通道在细胞中表达时钠或钙流入和流出不受控制的突变。
59.如权利要求48所述的转基因动物，其中被表达的所述异源TRPML3多肽导致特定细胞类型的切除。
60.如权利要求59所述的转基因动物，其中被表达的所述异源TRPML3多肽导致选自味觉细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、黑色素细胞、甲状旁腺细胞和泌尿器细胞的一种或多种细胞类型的切除。
61.如权利要求60所述的转基因动物，其中被表达的所述异源TRPML 3多肽是突变的
人TRPML3多肽，其具有使该离子通道在细胞中表达时钠或钙流入和流出不受控制的突变。
62.一种在鉴定调控咸味味觉的化合物的筛选中使用权利要求47-61任一项所述的转
基因动物的方法。
63.一种使用varitint-waddler小鼠来测定TRPM13在味觉细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、泌尿器细胞或黑色素细胞中功能的方法。
64.如权利要求63所述的方法，其包括使用基因芯片来比较在正常小鼠与varitint
waddler小鼠的咸味味觉细胞中特异表达的基因，以鉴定在检测咸味味觉的味觉细胞中特异表达的基因。
65.权利要求64中检测到的基因或检测到的对应多肽在检测咸味味觉调节剂的测定
中的应用。
66.如权利要求64所述的测定，其用来检测调控TRPML 3功能、或作为咸味受体起作
用、或调控咸味味觉信号从TRPML3向神经纤维传输和/或控制咸味味觉细胞发育分化或凋亡的基因。
67.如权利要求65所述的方法，其用来鉴定TRPML3的拮抗剂、激动剂或增强剂。
68.如权利要求65所述的方法，其中被鉴定的化合物在人味觉测试中被进一步评估。
69.一种使用根据权利要求47-61任一项的转基因动物来阐明TRPML 3对醛固酮产生、钠代谢、咸味感受或血管加压素释放的影响的方法。
70.一种使用表达编码离子通道的TRPML3基因的转基因动物(非人)来评估涉及异常
醛固酮产生、血管加压素释放、钠代谢和/或黑色素细胞损失的疾病或病况的潜在治疗方案的方法，所述离子通道对表达该离子通道的细胞有毒性。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述疾病或病况选自水肿、血压(高或低血压)、肝硬化、原发性高醛固酮血症、肾功能障碍、糖尿病(I或II型)和与其相关的病理症状，包括循环问题、水肿、与循环差相关的眼病、高可的松血症、动脉粥样硬化或例如腹型肥胖的肥胖，以及肝病、性功能障碍(男性或女性)、脑血管疾病、血管疾病、视网膜病变、神经病、胰岛素病、内皮功能障碍、压力受体功能障碍、偏头痛、潮热和经前期紧张和其他心血管病况，诸如动脉粥样硬化、心力衰竭、充血性心力衰竭、血管疾病、中风、心肌梗死、内皮功能障碍、心室肥厚、肾功能障碍、靶器官损伤、血栓形成、心律不齐、斑块破裂和动脉瘤或可由醛固酮激动剂或拮抗剂治疗的另一种病况。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述疾病或病况选自糖尿病、肥胖、诸如囊性肾病、获得性囊性肾病的肾病、诸如近视的眼循环相关病患；恶心、呕吐、性功能障碍(男性或女性)、水肿、高血压、充血性心力衰竭(范围从纽约心脏学会的II类至红润肺水肿)、周期性自发性水肿、肾病综合征、由肝硬化或其他原因引起的腹水、各种原因的脑水肿、稀释性低钠血症和统称为ADH不适当分泌综合征的代谢改变以及其中治疗上需要血管舒张和/或抗催产活性或施用血管加压素激动剂或拮抗剂的其他疾病或病况。
73.一种表达咸味受体的重组细胞，所述咸味受体包含TRPML3或其变体。
74.如权利要求73所述的重组细胞，其为酵母、两栖动物、昆虫、细菌、爬行动物、禽或哺乳动物细胞。
75.如权利要求74所述的重组细胞，其为两栖动物卵母细胞或哺乳动物细胞。
76.如权利要求75所述的重组细胞，其选自HEK-293、COS、CHO和BHK细胞。
77.如权利要求73所述的重组细胞，其瞬时表达所述TRPML3多肽。
78.如权利要求73所述的重组细胞，其稳定表达所述TRPML3多肽。
79.如权利要求73所述的重组细胞，其包含杆状病毒表达载体。
80.如权利要求79所述的重组细胞，其中所述载体是BacMam载体。
81.如权利要求73所述的重组细胞样品，其中所述TRPML3选自哺乳动物、禽、两栖动物、鱼和爬行动物TRPML3。
82.如权利要求73所述的重组细胞，其表达哺乳动物TRPML3或鸡、斑马鱼或爪蟾
TRPML3。
83.如权利要求73所述的重组细胞，其表达哺乳动物TRPML3，选自由人、鼠、大鼠、犬、猫、豚鼠、猪、马、牛、山羊、绵羊、熊、猴、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴、食蟹猴、长臂猿、瞪羚和斑马TRPML3组成的组。
84.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述TRPML3离子通道多肽与选自具有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少90％的序列同一性。
85.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述TRPML3离子通道多肽与选自具有SEQ ID NO：2、4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽具有至少95％的序列同一性。
86.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述TRPML3离子通道多肽具有包含于SEQ ID NO：2或4的序列或包含由SEQ ID NO：39或40编码的TRPML3多肽。
87.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述细胞表达的TRPML3多肽具有使该离子通道对钠更敏感或更不敏感的突变。
88.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述细胞表达的TRPML3多肽具有使该离子通道更可透过或更不可透过钠的突变。
89.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述细胞表达的TRPML3多肽具有保持该离子通道处于“开放”取向的突变。
90.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述细胞样品表达的TRPML3多肽具有对一些细胞有毒性的突变。
91.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述细胞或富集的细胞样品表达的TRPML3多肽具有导致其中钠流入和流出不受控制的细胞的突变。
92.如权利要求73所述的重组细胞，其中所述TRPML 3离子通道响应于咸味味觉调节
剂。
93.如权利要求73所述的重组细胞，其表达另一个钠离子通道多肽。
94.如权利要求89所述的重组细胞，其中所述其他钠通道是NALCN、NKAIN3、TRPML1或TRPML2。
95.一种用于鉴定激动、拮抗或增强TRPML3活性的化合物的测定，其包括使根据权利要求73-94之一的重组细胞或内源地表达TRPML3离子通道多肽的初生细胞、急性分离的细胞或其他细胞与推测的TRPML3增强剂、激动剂或拮抗剂接触并确定其对TRPML 3活性的影响。
96.如权利要求95所述的测定，其中内源细胞选自肾上腺皮质细胞、甲状旁腺细胞、味蕾细胞、泌尿器细胞、黑色素细胞、肾上腺或甲状旁腺细胞。
97.如权利要求95所述的测定，其中所述细胞是表达TRPML3的初生的、急性分离的或其他内源细胞。
98.如权利要求97所述的测定，其中所述细胞是肾上腺皮质细胞、垂体细胞、甲状旁腺细胞、味觉细胞或黑色素细胞。
99.如权利要求98所述的测定，其中所述细胞表达啮齿类动物或人或非人灵长类动物的TRPML3序列。
100.如权利要求98所述的测定，其中所述TRPML3由具有支持在重组宿主细胞中增强
表达的优化密码子的序列编码。
101.如权利要求98所述的测定，其中所述TRPML3的序列与选自包含于SEQ ID NO：2、
4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的多肽序列或由SEQ ID NO：39或40多肽编码的多肽序列至少90％相同。
102.如权利要求98所述的测定，其中所述TRPML3的序列与选自包含于SEQ ID NO：2、
4、10、12、14、16、22、24、26、28、30、32和34的多肽的多肽序列或由SEQ ID NO：39或40多肽编码的多肽序列至少95％相同。
103.如权利要求98所述的测定，其中所述TRPML3是野生型人序列或包含
Varitint-waddler突变(A419P)的啮齿类动物或人序列。
104.如权利要求98所述的测定，其中所述TRPML3是由SEQ IDNO：1、3、17或18编码
的人序列。
105.如权利要求98-103任一项所述的测定，其为电生理测定。
106.如权利要求105所述的测定，其中所述重组细胞是两栖动物卵母细胞。
107.如权利要求105所述的测定，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
108.如权利要求105所述的测定，其中所述测定是使用离子敏感染料或荧光团的电生理测定。
109.如权利要求105所述的测定，其中所述测定是二电极电压钳测定。
110.如权利要求109所述的测定，其中所述测试细胞是爪蟾卵母细胞。
111.如权利要求107所述的测定，其中所述哺乳动物细胞选自由HEK293、HEK293T、
Swiss3T3、CHO、BHK、NIH3T3和COS细胞组成的组。
112.如权利要求105所述的测定，其中所述细胞是爪蟾卵母细胞。
113.如权利要求105所述的测定，其中所述测定是膜片钳测定。
114.如权利要求105所述的测定，其使用膜电位染料选自由以下组成的组：Molecular Devices膜电位试剂盒(目录号R8034)、Di-4-ANEPPS(4-(2-(6-(二丁氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1-(3-磺丙基)氢氧化吡啶，内盐、DiSBACC4(2)(双-(1，2-二巴比妥酸)-三乙炔氧烯洛尔)、Cc-2-DMPE(太平洋蓝1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三醇-3磷酸乙醇胺，三乙铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4-[1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷-7，13-二基双(5-甲氧基-6，1，2-苯并呋喃二基)}双-四{(乙酰氧)甲基}酯(Molecular Probes)。
115.如权利要求105所述的方法，其使用钠敏感染料。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述钠敏感染料是四乙酸钠绿(Molecular
Probes)或Na-敏感染料试剂盒(MolecularDevices)。
117.如权利要求97所述的测定，其中所述测定通过离子流测定来测量活性。
118.如权利要求117所述的测定，其使用原子吸收光谱来检测离子流。
119.如权利要求105所述的测定，其使用荧光板读数器(FLIPR)。
120.如权利要求105所述的测定，其使用电压成像板读数器(VIPR)。
121.如权利要求105所述的测定，其使用自动电生理仪器。
122.如权利要求121所述的测定，其使用IonWorks测定系统。
123.如权利要求105所述的测定，其使用选自由以下组成的组的膜电位染料：
Molecular Devices膜电位试剂盒(目录号8034)、Di-4-ANEPPS(4-(2-(6-(二丁氨
基)-2-萘-基)乙烯基)-1-(3-磺丙基)-氢氧化吡啶，内盐)；DiSBACC4(2)(双-(1.2-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)；DiSBAC4(3)(双-(1，3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)；CC-2-DPME(太平洋蓝1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4’-[1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷-7，13-二基双(5-甲氧基-6，1，2-苯并呋喃二基)]双-四[(乙酰氧)甲基]酯(Molecular Probes)。
124.如权利要求99-123任一项所述的测定，其中被鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物在味觉测试中评估。
125.如权利要求99-123任一项所述的测定，其中被鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂对醛固酮产生的影响在动物中测试。
126.如权利要求99-123任一项所述的测定，其中被鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂对血管加压素释放的影响在动物中测试。
127.如权利要求99-123任一项所述的测定，其中所述被鉴定的拮抗剂、激动剂或增强剂化合物对爱迪生氏病、毛发脱落、毛发或毛皮褪色、味觉细胞再生、垂体细胞再生、肾上腺细胞再生、黑色素细胞细胞再生、血压、液体潴留、钠代谢和尿液产生的至少一种的影响在动物中测试。
128.如权利要求99-123任一项所述的测定，其中被鉴定的化合物对治疗疾病或病况
的影响在合适的体外或体内动物模型中评估，其中所述疾病或病况选自水肿、血压(高或低血压)、肝硬化、原发性高醛固酮血症、肾功能障碍、糖尿病(I或II型)和与其相关的病理症状，包括循环问题、水肿、与循环差相关的眼病、高可的松血症、动脉粥样硬化或例如腹型肥胖的肥胖，以及肝病、性功能障碍(男性或女性)、脑血管疾病、血管疾病、视网膜病变、神经病、胰岛素病、内皮功能障碍、压力受体功能障碍、偏头痛、潮热和经前期紧张以及其他心血管病况，诸如动脉粥样硬化、心力衰竭、充血性心力衰竭、血管疾病、中风、心肌梗死、内皮功能障碍、心室肥厚、肾功能障碍、靶器官损伤、血栓形成、心律不齐、斑块破裂和动脉瘤或可由醛固酮激动剂或拮抗剂治疗的另一种病况。
129.如权利要求99-123任一项所述的测定，其中被鉴定的化合物对治疗疾病或病况
的影响在合适的体外或体内模型中测试，其中所述疾病或病况选自囊性肾病、获得性囊性肾病、诸如近视的眼循环相关病患；恶心、呕吐、性功能障碍(男性或女性)、水肿、高血压、充血性心力衰竭(范围从纽约心脏学会的II类至红润肺水肿)、周期性自发性水肿、肾病综合征、由肝硬化或其他原因引起的腹水、各种原因的脑水肿、稀释性低钠血症和统称为ADH不适当分泌综合征的代谢改变和其中治疗上需要血管舒张和/或抗催产活性或施用血管加压素激动剂或拮抗剂的其他疾病或病况。
130.一种治疗涉及醛固酮产生或可通过施用醛固酮激动剂或拮抗剂来治疗的疾病或
病况的方法，包括施用治疗有效量的调控TRPML3的化合物。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述疾病或病况选自水肿、血压(高或低血
压)、肝硬化、原发性高醛固酮血症、肾功能障碍、糖尿病(I或II型)和与其相关的病理症状，包括循环问题、水肿、与循环差相关的眼病、高可的松血症、动脉粥样硬化或例如腹型肥胖的肥胖，以及肝病、性功能障碍(男性或女性)、脑血管疾病、血管疾病、视网膜病变、神经病、胰岛素病、内皮功能障碍、压力受体功能障碍、偏头痛、潮热和经前期紧张以及其他心血管病况，诸如动脉粥样硬化、心力衰竭、充血性心力衰竭、血管疾病、中风、心肌梗死、内皮功能障碍、心室肥厚、肾功能障碍、靶器官损伤、血栓形成、心律不齐、斑块破裂和动脉瘤。
132.一种治疗涉及血管加压素释放的疾病或病况的方法，其包括施用有效量的调控
TRPML3的化合物。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述疾病或病况选自囊性肾病、获得性囊性肾病、诸如近视的眼循环相关病患；恶心、呕吐、性功能障碍(男性或女性)、水肿、高血压、充血性心力衰竭(范围从纽约心脏学会的II类至红润肺水肿)、周期性自发性水肿、肾病综合征、由肝硬化或其他原因引起的腹水、各种原因的脑水肿、稀释性低钠血症和统称为ADH不适当分泌综合征的代谢改变以及其中治疗上需要血管舒张和/或抗催产的其他疾病或病况或其中治疗上需要施用血管加压素激动剂或拮抗剂的另一种病况。
134.一种调控有相应需要的受治疗者的血压或液体潴留的方法，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
135.一种调控有相应需要的受治疗者的尿液产生和/或排泄的方法，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
136.一种治疗有相应需要的受治疗者的爱迪生氏病或IV型黏脂沉积的方法，其包括
施用有效量的调控TRPML3的化合物。
137.如权利要求120-126任一项所述的方法，其中所述化合物是多肽、抗体、小分子、siRNA、反义RNA或核酶。
138.一种治疗甲状旁腺疾病或病况的方法，其包括施用TRPML 3调节剂。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述疾病选自钙体内平衡、甲状腺功能亢
进、甲状腺功能减退、高血钙、囊状骨炎、假性甲状腺功能减退、Jansen干骺端软骨生成、Blomstrand软骨生成和不同原因的骨质疏松，所述原因包括例如年龄相关、绝经或药物、化疗或放疗诱导。
140.如权利要求1所述的分离的咸味味觉细胞，其不表达T1R。
141.如权利要求1所述的分离的咸味味觉细胞，其不表达T2R。
142.如权利要求1所述的分离的咸味味觉细胞，其不表达PKD2L1/PKD1L3和/或
TRPM5。
143.一种使用特异于TRPML3基因或基因产物的探针来鉴定和/或分离和/或富集样
品中的咸味味觉特异细胞的方法。
144.如权利要求143所述的方法，其中所述味觉细胞是人或猕猴味觉细胞。
145.如权利要求142所述的方法，其中所述分离的味觉细胞不表达PKD2L1、PKD1L3或TRPM5。
146.如权利要求142所述的方法，其中所述细胞不表达T1R或T2R。
147.如权利要求142所述的方法，其中所述味觉细胞不表达转导蛋白或味转导素。
148.如权利要求142所述的方法，其中所述咸味味觉细胞亚型或味觉细胞谱系通过包括使用荧光激活细胞分选仪(FACS)的方法来分离、纯化、富集或标记。
149.如权利要求142所述的方法，其中所述味觉细胞亚型或味觉细胞谱系通过包括使用标记的磁珠的方法来分离、纯化、富集或标记。
150.如权利要求142所述的方法，其中混合的细胞群体或细胞悬液通过含有味觉细胞的组织的酶消化和/或组织解聚而产生。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述细胞衍生自舌、口腔、胃肠道或相关器官、肾上腺、垂体、黑色素细胞和尿道的至少一个。
152.如权利要求142所述的方法，其中所述咸味味觉细胞亚型或味觉细胞谱系通过包括阴性细胞选择技术的方法来分离、纯化、富集或标记，所述阴性细胞选择技术基于至少一个其他味觉细胞特异基因的表达或不表达来消除至少一个非靶味觉细胞亚型或谱系。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述方法使用细胞毒性抗体来特异地杀死至少一个非靶细胞类型或谱系。
154.一种使用TRPML3和/或TRPML1或TRPML2作为标志来鉴定、分离或富集咸味受体
细胞的方法。
155.一种在结合测定中鉴定推测的咸味味觉调节剂的方法，其包括提供TRPML3多肽
或表达TRPML3的细胞并使所述多肽或细胞与推测的TRPML3调节化合物接触并基于其与TRPML3多肽的特异结合来鉴定潜在的TRPML3调节剂。
156.如权利要求155所述的结合测定，其为直接结合测定。
157.如权利要求155所述的结合测定，其为竞争结合测定。
158.如权利要求155所述的结合测定，其使用哺乳动物TRPML3多肽。
159.如权利要求158所述的结合测定，其使用与选自包含于SEQID NO：2、4、10、12、14、
16、22、24、26、28、30、32和34的那些的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的多肽具有至少90％序列同一性的TRPML3多肽。
160.如权利要求158所述的结合测定，其使用与选自包含于SEQID NO：2、4、10、12、14、
16、22、24、26、28、30、32和34的那些的TRPML3多肽或由SEQ ID NO：39或40编码的多肽具有至少95％序列同一性的TRPML3多肽。
161.如权利要求160所述的结合测定，其使用野生型人、非人灵长类动物或啮齿类动物TRPML3多肽或具有A419P突变的TRPML3多肽。
162.如权利要求158所述的结合测定，其使用放射性核素、荧光团或酶来帮助结合的检测。
163.如权利要求158所述的结合测定，其中所述离子通道由哺乳动物细胞表达。
164.如权利要求158所述的结合测定，其中所述TRPML3多肽是单体或多聚体。
165.如权利要求158所述的结合测定，其中所述TRPML3是异聚体并且包含TRPML1或
TRPML2，或者所述TRPML3与TRPML1或TRPML2一起表达。
166.一种治疗黑色素细胞相关病况的方法，其包括施用治疗或美容有效量的TRPML3
调节化合物。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述病况是黑色素瘤或色素沉着或细胞增殖紊乱。
168.如权利要求166所述的方法，其中所述病况是脱发、秃顶、或毛发泛灰或皮肤颜色(“光泽”)丧失。
169.如权利要求168所述的方法，其为衰老、激素失衡、辐射或化疗的结果。
170.如权利要求166所述的方法，其中所述调节剂是激动剂。
171.如权利要求166所述的方法，其中所述调节剂是拮抗剂。
172.如权利要求166所述的方法，其中所述调节剂选自小分子、碳水化合物、反义RNA、dsRNA、核酶、抗体、多肽和糖肽。
173.一种利用表达功能性TRPML3钠通道的哺乳动物细胞或卵母细胞与推测TRPML3调
节化合物鉴定TRPML3调节剂的方法，其包括：
(i)测定所述化合物对通过TRPML3通道的钠转运的影响；并
(ii)基于其对钠转运的增强或抑制作用来鉴定所述化合物是否是TRPML3调节剂。
174.如权利要求173所述的方法，其还包括(iii)在人或哺乳动物味觉测试中确认被
鉴定的化合物调控咸味味觉。
175.如权利要求173所述的方法，其中被鉴定的化合物对钠排泄或泌尿功能的体内影响在人或哺乳动物中测试。
176.如权利要求173所述的方法，其中所述TRMPL3是哺乳动物TRMPL3。
177.如权利要求164所述的方法，其中所述TRMPL3是人、非人灵长类动物、啮齿类动物、牛、猪、马或绵羊TRMPL3。
178.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由HEK293、HEK293T、
Swiss3T3、CHO、BHK、NIH3T3和COS细胞组成的组。
179.如权利要求173所述的方法，其中所述卵母细胞是哺乳动物、两栖动物、禽或爬行动物卵母细胞。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述两栖动物卵母细胞是爪蟾卵母细胞。
181.如权利要求173所述的方法，其中所述细胞表达在味觉细胞中表达的其他基因或离子通道。
182.一种使用权利要求173中鉴定的化合物来调控或增强咸味感受的方法。
183.一种使用权利要求173中鉴定的化合物来调控人或哺乳动物的钠排泄或泌尿功
能的方法。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述测定是电生理测定。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述测定是二电极电压钳技术。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述卵母细胞是两栖动物卵母细胞。
187.如权利要求186所述的方法，其中所述卵母细胞是青蛙卵母细胞。
188.如权利要求187所述的方法，其中所述测定是电生理测定。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述测定是二电极电压钳技术。
190.如权利要求189所述的方法，其用来鉴定人TRPML3增强剂。
191.如权利要求189所述的方法，其用来鉴定人TRPML3抑制剂。
192.如权利要求188所述的方法，其中所述卵母细胞在与推测的人TRPML3增强剂接触之前与人TRPML3抑制剂接触。
193.如权利要求190所述的方法，其还包括使用未被显微注射人TRPML3 cRNA的卵母
细胞的阴性对照。
194.如权利要求190所述的方法，其中所述推测的调节剂以范围从约1nM至约1mM的
浓度应用。
195.如权利要求190所述的方法，其中所述人TRPML3增强剂表现至少20％的增强系
数。
196.如权利要求190所述的方法，其中所述人TRPML3增强剂表现至少50％的增强系
数。
197.如权利要求190所述的方法，其中所述人TRPML3增强剂表现至少100％的增强系
数。
198.如权利要求191所述的方法，其中所述人TRPML3阻抑剂表现至少20％的抑制系
数。
199.如权利要求191所述的方法，其中所述人TRPML3阻抑剂表现至少50％的抑制系
数。
200.如权利要求191所述的方法，其中所述人TRPML3阻抑剂表现至少100％的抑制系
数。
201.一种基于哺乳动物或青蛙卵母细胞的用于分析和筛选推测的TRPML3调节剂的高
通量测定，其包括：使预加载膜电位荧光染料或钠荧光染料的表达TRPML3或变体、片段或功能等效物的测试细胞与至少一个TRPML3推测调节剂化合物在钠或锂存在下接触；并在推测的调节剂/TRPML3相互作用存在时监测阳离子介导的测试细胞荧光的改变，并与缺少所述调节剂时的改变相比来确定TRPML3的调控程度。
202.如权利要求201所述的测定方法，其中所述阳离子是钠。
203.如权利要求201所述的测定方法，其中所述阳离子是锂。
204.如权利要求201所述的测定，其中所述阳离子是钾。
205.如权利要求201所述的测定方法，其中所述测试细胞选自由MDCK、HEK293、HEK293 T、BHK、COS、NIH3T3、U2OS、Swiss3T3和CHO组成的组。
206.如权利要求205所述的测定方法，其中所述测试细胞是HEK293细胞。
207.如权利要求201所述的测定方法，其中所述方法用来基于可检测的荧光改变将化合物鉴定为特别调控味觉的化合物。
208.如权利要求207所述的测定方法，其中所述味觉是咸味味觉。
209.如权利要求201所述的测定方法，其中所述测试细胞接种在多孔测试板的孔上。
210.如权利要求209所述的测定方法，其中通过将推测的调节剂加到所述多孔测试板的孔中使所述测试细胞与所述推测的调节剂接触。
211.如权利要求210所述的测定方法，其中所述测试细胞加载允许荧光改变被检测的膜电位染料。
212.如权利要求201所述的测定方法，其中TRPML3是由从人味觉细胞cDNA克隆的人
TRPML3DNA序列编码的人TRPML3。
213.如权利要求201所述的测定方法，其中所述TRPML3 DNA是密码子优化的、或野生型的、或突变的TRPML3 DNA。
214.如权利要求213所述的测定方法，其中所述TRPML3 DNA选自包含于SEQ ID NO：
1、3、17、18、39和40中的那些。
215.如权利要求201所述的测定，其中荧光板读数器用来监测荧光的改变。
216.如权利要求201所述的测定，其中电压成像板读数器用来监测荧光的改变。
217.如权利要求201所述的测定，其中所述膜电位染料选自由以下组成的组：
Di-4-ANEPPS(4-(2-(6-(二丁氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1-(3-磺丙基))-氢氧化吡啶，内盐)、DiSBACC4(2)(双-(1，2-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)、DiSBAC4(3)(双-(1，
3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)、CC-2-DMPE(1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4′-[1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷-7，13-二基双(5-甲氧基-6，1-2-苯并呋喃二基)]双-，四[(乙酰氧)甲基]酯。
218.一种用于监测TRPML 3活性的方法，其包括：提供用功能性TRPML3剪接变体及其片段转染的测试细胞；将所述测试细胞接种于多孔板的孔中；用膜电位染料于多孔板的孔中对接种的测试细胞进行染料加载；使染料加载的测试细胞与至少一个推测的调控化合物和钠在所述多孔板的孔中接触；并使用荧光板读数器或电压强度板读数器来监测由调节剂/TRPML3相互作用引起的膜电位染料的任何荧光改变。
219.如权利要求218所述的方法，其中所述测试细胞是HEK293细胞。
220.如权利要求219所述的方法，其中所述测试细胞是HEK293T细胞。
221.如权利要求218所述的方法，其中所述膜电位染料选自由以下组成的组：
Di-4-ANEPPS(4-(2-(6-(二丁氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1-(3-磺丙基)-氢氧化吡啶，
内盐)、DiSBAC4(2)(双-(1，2-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)、DiSBAC4(3)(双-(1，
3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)、CC-2-DMPE(1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4′-[1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷-7，13-二基双(5-甲氧基-6，1-2-苯并呋喃二基)]双-，四[(乙酰氧)甲基]酯。
222.如权利要求218所述的方法，其中所述TRPML3是从人味觉细胞cDNA克隆的人
TRPML3。
223.如权利要求218所述的方法，其中所述TRPML3选自由天然存在的人TRPML3、可变剪接的人TRPML3及其功能变体组成的组。
224.如权利要求218所述的方法，其中所述测试细胞选自由MDCK、HEK293、HEK293T、COS、BHK、NIH3T3、Swiss3T3、U2OS和CHO细胞组成的组。
225.一种用于鉴定调控咸味味觉的化合物的方法，其包括：提供用功能性人TRPML3、其剪接变体、嵌合体或片段转染或转化的测试细胞；将所述测试细胞接种于多孔板的孔中；
用膜电位染料于所述多孔板的孔中对接种的测试细胞进行染料加载；使染料加载的测试细胞与至少一个推测的调节化合物和钠在所述多孔板的孔中接触；使用荧光板读数器或电压强度板读数器来监测由调节剂/TRPML3相互作用引起的膜电位染料的任何荧光改变；并基于监测的荧光改变将至少一个推测的调节剂鉴定为调控咸味味觉的化合物。
226.如权利要求225所述的方法，其还包括评估鉴定的TRPML3调节化合物对咸味感受的影响。
227.如权利要求212所述的方法，其中所述测试细胞选自由MDCK、HEK293、HEK293T、COS、BHK、NIH3T3、Swiss3T3、U2OS和CHO组成的组。
228.如权利要求227所述的方法，其中所述测试细胞是HEK293细胞。
229.如权利要求228所述的方法，其中所述测试细胞是HEK293T细胞。
230.如权利要求225所述的方法，其中所述方法用来基于可检测的荧光改变将化合物鉴定为特别调控味觉的化合物。
231.如权利要求225所述的方法，其中所述味觉是咸味味觉。
232.如权利要求225所述的方法，其中通过将推测的调节剂加到多孔测试板的孔中使所述测试细胞与所述推测的调节剂接触。
233.如权利要求225所述的方法，其中所述测试细胞被加载允许荧光改变被检测的膜电位染料。
234.如权利要求225所述的方法，其中所述测试细胞表达TRPML3或其片段或变体。
235.如权利要求225所述的方法，其中所述TRPML3选自由天然存在的人TRPML3、可变剪接的人TRPML3或其功能变体组成的组。
236.如权利要求225所述的方法，其中荧光板读数器用来监测荧光的改变。
237.如权利要求225所述的方法，其中电压成像板读数器用来监测荧光的改变。
238.如权利要求233所述的方法，其中所述膜电位染料选自由以下组成的组：
Di-4-ANEPPS(4-(2-(6-(二丁氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1-(3-磺丙基))-氢氧化吡啶，内盐)、DiSBACC4(2)(双-(1，2-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)、DiSBAC4(3)(双-(1，
3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔)、CC-2-DMPE(1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯-二羧酸，4，4′-[1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷-7，13-二基双(5-甲氧基-6，1-2-苯并呋喃二基)]双-，四[(乙酰氧)甲基]酯。
239.一种通过使用高通量膜片钳电生理测定系统来鉴定TRPML3调节剂的方法。
240.如权利要求239所述的方法，其包括IonWorks自动膜片钳系统。
241.如权利要求239所述的方法，其使用表达TRPML3 DNA的哺乳动物细胞。
242.如权利要求241所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO-K1细胞。
243.如权利要求239所述的方法，其用来鉴定开放(激活)TRPML3离子通道的化合物。
244.如权利要求226所述的方法，其用来鉴定关闭(阻抑)TRPML3离子通道的化合物。
245.如权利要求243所述的方法，其中所述化合物被测试为咸味味觉增强剂。
246.如权利要求243所述的方法，其中所述化合物被测试为咸味味觉阻抑剂。
247.如权利要求239所述的方法，其中所述测定在标准模式下运行，其中每个孔对应于单个细胞。
248.如权利要求239所述的方法，其中所述测定在群体膜片钳(PPC)模式下运行，其中每个孔给出64个细胞的平均电流，这潜在地增强了总体成功率(“阳性命中”)并降低了孔与孔的差异性。
249.如权利要求239所述的方法，其使用包含表达TRPML 3的哺乳动物测试细胞的
384-孔格式。
250.如权利要求239所述的方法，其使用瞬时转染的CHO-K1细胞。
251.如权利要求239所述的方法，其使用稳定转染的CHO-K1细胞。
252.如权利要求239所述的方法，其通过使用Ba cMam表达系统将TRPML3基因引入
CHO-K1细胞。
253.如权利要求239所述的方法，其中所述哺乳动物细胞表达野生型人TRPML3 DNA、密码子(人)优化的TRPML3DNA序列或包含导致A419P突变的修饰的TRPML3突变体。
254.如权利要求226所述的方法，其中TRPML3功能是在IonWorksQuattro仪器(MDS
Analytical Technologies)上使用穿孔膜片钳技术测定的被测定的TRPML3功能。
255.一种使用鉴定为TRPML3调节剂的化合物作为供人或动物消耗的组合物的风味添
加剂的方法。
256.如权利要求255所述的方法，其中所述组合物是供人或动物消耗的食物、饮料、化妆品、营养品、药物。
257.如权利要求255所述的方法，其中所述组合物选自马铃薯片、玉米片、薄脆饼干、汤、蘸料、软饮料、包装的肉制品和椒盐卷饼。
258.如权利要求242所述的方法，其中所述组合物选自：饮料，诸如果汁饮料、运动饮料、蔬菜汁、发酵乳酸饮料、碳酸饮料、咖啡、可可饮料、红茶、乌龙茶、绿茶、清酒、酒精和粉末饮料；糖食，包括糖果、口香糖、片糖、橡皮糖、苏打汽水糖和巧克力；烘烤食品，包括曲奇饼干、饼干和面包；甜点，诸如酸奶和冰淇淋；小吃，包括马铃薯片和薄脆饼干；炖菜、咖喱、汤、调料、蘸料、汤面、高汤、味噌、速食肉汤、酱汁、肉汤、果酱、喷洒浇料、日式烤饼、味噌汤、泡菜、饭团浇料、茶饭浇料、诸如小麦、荞麦和中式面条的半熟食或熟食或其冷藏和冷冻食物；速食食物，包括速食面；和作料，包括混合的粉状作料和蛋黄酱。
259.如权利要求255所述的方法，其中所述组合物选自营养补剂或运动饮料和小吃产品。
TRPML3(MCOLN3)作为咸味受体的鉴定及在用于鉴定调控
或释放的味觉(咸味)调节剂和/或治疗剂的测定中的用
途
[0001] 相关的临时和非临时申请
[0002] 本申请涉及由本受让人Senomyx Inc之前提交的涉及用于鉴定灵长类动物味觉特异基因和特别用于鉴定灵长类动物咸味受体基因的新原理的临时申请。这些临时申请：2007年6月8日提交的美国申请序列第60/929,017号；2007年6月8日提交的美国申
请序列第60/929,007号；2007年6月29日提交的美国申请序列第60/947,052号；2007年8月3日提交的美国申请序列第60/935,297号；2007年11月13日提交的美国申请
序列第60/987,611号；2007年11月19日提交的美国申请序列第60/988,938号；2007年11月30日提交的美国申请序列第60/991,274号；2007年11月30日提交的美国申
请序列第60/991,289号；2007年12月5日提交的美国申请序列第60/992,502号；2007年12月5日提交的美国申请序列第60/992,517号；2007年12月28日提交的美国申请序列第61/017,244号；2008年1月16日提交的美国申请序列第61/021,437号；2008年
4月8日提交的美国申请序列第61/043,257号；和2008年5月10日提交的美国申请序列第61/053,310号。另外，本申请涉及并要求保护2007年6月8日提交的美国序列第
11/808,356号和同一天提交的代理人案号67824.703201的优先权。所有前面提到的临时和非临时申请通过引用整体并入本文。
请序列第60/929,007号；2007年6月29日提交的美国申请序列第60/947,052号；2007年8月3日提交的美国申请序列第60/935,297号；2007年11月13日提交的美国申请
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请序列第60/991,289号；2007年12月5日提交的美国申请序列第60/992,502号；2007年12月5日提交的美国申请序列第60/992,517号；2007年12月28日提交的美国申请序列第61/017,244号；2008年1月16日提交的美国申请序列第61/021,437号；2008年
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[0003] 这些申请包括涉及各种味觉特异基因(包括TRPML3或MCOLN3)的公开内容，当该基因可选地为已知时。该基因被强调为由本发明人在电生理测定中功能化的基因。该基因被本发明人理论化为编码咸味受体的候选基因，因为据预测其编码调节灵长类动物(例如人)、啮齿类动物和其他动物的咸味味觉的味觉特异的钠离子通道。如本文所述，使用表达野生型或突变的TRPML3多肽的细胞(哺乳动物和两栖动物细胞)和啮齿类动物细胞的体外和体内(动物)测定确认TRPML3或MCOLN3参与咸味感受，并且影响与味觉不相关的其他生物功能，诸如听觉和平衡(如啮齿类动物TRPML3的突变所证明，该突变杀死了内耳的毛细胞，对听力具有不良作用(耳聋)，造成受损的平衡，以及导致正常色素沉着的破坏，这明显归因于由该相同TRPML3突变引起的黑色素细胞的损失)。
[0004] 本发明人获得的、本文公开和先前未知的结果还表明，由于该基因在钠转运、排泄和吸收中可能的作用、其在钠感受中的作用以及基于其中已知该基因特异表达的组织(包括肾上腺和垂体)，该基因表明其与醛固酮和/或血管加压素一起调控或参与调节钠转运、代谢、排泄和其他钠和可能其他离子相关的涉及醛固酮和/或血管加压素的功能，因为这些激素在包括人和啮齿类动物的不同哺乳动物的钠转运、代谢和排泄中发挥重要作用。发明领域
[0005] 本发明涉及瞬时受体电位阳离子通道(transient receptorpotential cation)超家族的TRPML亚家族成员特定离子通道多肽(TRPML3或MCOLN3)参与味觉(咸味)感受(例如钠味觉感受)的发现。
[0006] 更具体地，考虑到保持钠和钾离子水平在不同浓度阈值内的重要性，并且考虑到这些离子对不同有机体的健康重要的生理过程的重要影响，本发明涉及如下发现：特定离子通道多肽(TRPML3或MCOLN3)参与灵长类动物(人和非人灵长类动物)、啮齿类动物和其他哺乳动物和可能其他脊椎动物(禽类、爬行动物、两栖动物)的味觉(咸味)感受。
[0007] 另外，本发明涉及如下发现：TRPML3或MCOLN3多肽或其功能性变体当单独或与其他味觉特异多肽(例如诸如GPCR的其他辅助分子，或包括例如TRPML1、TRPML2、NKAIN3或NALCN的离子通道)组合表达时作为响应于咸味刺激和潜在地其他味觉引发分子的味觉受体起作用。
[0008] 另外，本发明涉及如下发现：由于该基因在钠感受中的作用和其中已知其特异表达的组织(包括肾上腺和垂体)，该基因编码单独或与其他辅助分子一起在调控醛固酮和血管加压素的水平和释放并且因此调控由醛固酮和/或血管加压素调节的钠相关的生理活性中发挥作用的多肽。
[0009] 另外，本发明涉及如下发现：由于TRPML3参与钠感受并且进一步基于其在甲状旁腺器官表达，TRPML3调节剂可用来治疗涉及甲状旁腺的疾病，这些疾病包括但不限于钙体内平衡、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、高血钙、囊性骨炎、假性甲状旁腺功能减退、Jansen干骺端软骨生成、Blomstrand软骨生成和不同原因的骨质疏松，所述原因包括例如年龄相关、绝经、或药物、化疗或放疗诱导。
[0010] 本发明还涉及含有TRPML3或MCOLN3基因的突变形式的动物模型(Varitint waddler小鼠)的应用，其中TRPML3咸味味觉细胞被特异地从味蕾切除，并且其中咸味味觉被极大地减弱以便研究TRPML3对咸味味觉的影响和该离子通道对钠转运、代谢和排泄的其他影响，因为该基因在包括人的其他动物可能具有相同的影响。
[0011] 本发明还涉及使用突变型TRPML3基因(A419P TRPML3)来特异切除包括味觉细胞或黑色素细胞的细胞类型并产生缺少这些不同细胞群体的小鼠模型系统。
[0012] 本发明还涉及使用突变型TRPML3离子通道多肽(A419P TRPML3)作为毒素来杀死诸如咸味味觉细胞或黑色素细胞的特定细胞类型。
[0013] 本发明还涉及该基因和相应多肽或其包括等位变体、嵌合体、片段和改造的突变体(例如设计来调控(增强或减弱)活性或来保持离子通道处于开放或关闭位置的突变体)的变体在用于鉴定TRPML3调节化合物(TRPML3激动剂、拮抗剂、增强剂、阻抑剂)的测定中的应用。这些化合物潜在地可用作味觉调节剂和调控或治疗涉及异常的血管加压素释放、醛固酮的产生、黑色素细胞的功能或钠转运、吸收和/或排泄的生理功能和病况的治疗剂。例如这些化合物可用作咸味味觉阻抑剂、增强剂或抑制剂，或用于治疗高血压、泌尿功能、心血管疾病，用于治疗黑色素细胞相关的病况，诸如色素沉着紊乱、黑色素瘤和诸如IV型黏脂沉积的粘液相关病况。
[0014] 基于前述，本发明具体地涉及用于鉴定TRPML3调节剂的基于哺乳动物细胞的高通量筛选测定(HTS测定)。在示例性实施方案中，本发明教导在用于鉴定TRPML3功能的增强剂或阻抑剂的基于细胞的测定中使用表达TRPML3的活性变体(A419P-TRPML3)的细胞。在基于细胞的测定中调控TRPML3功能的化合物预期影响人和其他哺乳动物中的咸味味觉。本发明中描述的测定可在标准96或384孔培养板中以高通量模式运行。
[0015] 在更具体的实施方案中，本发明鉴定并提供了功能(电生理)、体内和免疫组织化学数据，这些数据提供证据表明TRPML3(MCOLN3)编码作为灵长类动物(例如人)咸味受体起作用的多肽。
[0016] 在相关的实施方案中，本发明提供了使用TRPML3多肽和核酸序列及其特异探针作为可用来富集、鉴定或分离咸味受体和其他TRPML3表达细胞的标志。
[0017] 在相关的实施方案中，本发明提供了使用TRPML3多肽和核酸序列及其特异探针作为可用来鉴定可与异常TRPML3功能或表达相关的特定疾病和病况相关的TRPML3突变的标志，所述疾病和病况诸如涉及异常钠感受、转运、排泄和吸收，黑色素细胞功能(癌、色素沉着紊乱等)的疾病和涉及异常醛固酮或血管加压素产生或释放的疾病，诸如心血管和泌尿疾病。
[0018] 在另一个具体方面，本发明提供了使用TRPML3(MCOLN3)和表达TRPML3的细胞或TRPML3转基因动物模型来鉴定引发或调控(阻抑或增强)包括人的灵长类动物的咸味味觉的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物的体外和体内测定。这些测定使用表达TRPML3(野生型或其变体)的细胞或动物，或使用表达与诸如其他味觉特异多肽(诸如NALCN或NKAIN3、GPCR)的其他辅助多肽或诸如TRPML1和/或TRPML2的相关离子通道一起的TRPML3离子通道或变体(例如具有增强的活性或遗传改造为固定于“开放”或“关闭”取向的功能性变体)的细胞。
[0019] 在另一个方面，本发明提供了转基因动物(优选地啮齿类动物)和使用其来确认TRPML3在哺乳动物的咸味味觉和在涉及钠和其他离子(诸如钾、钙、锂)和离子(钠)代谢、血压、液体潴留和排泄、泌尿功能和心脏功能的其他生理功能中的作用。
[0020] 在另一个方面，本发明提供了在例如神经生理行为或电生理测定的测定中使用TRPML3和表达TRPML3的细胞或转基因动物的体外和体内测定，以便鉴定减轻涉及或由该离子通道多肽的表达缺陷引起的疾病和病况的治疗性化合物和/或其对包括切除的特定细胞的影响。作为实例这些病况包括涉及TRPML3超表达、低表达和影响其作为哺乳动物(包括例如人和非人灵长类动物)中味觉特异钠通道起作用的能力的TRPML3多肽的突变的病况。作为实例其他病况包括爱迪生氏病和涉及异常醛固酮或血管加压素产生或释放的疾病，诸如高血压、低血压、液体潴留，和受损的泌尿或心脏功能，诸如心律不齐、心脏病发作和中风。
[0021] 在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定调控使用单独的TRPML3或与另一个味觉特异基因(诸如NALCN或NKAIN3或TRPML1或TRPML2)一起表达的TRPML3功能的化合物的测定和使用鉴定的化合物来调控人和其他哺乳动物或脊椎动物中的咸味感受。在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定调控使用单独的TRPML3或与另一个味觉特异基因(诸如NALCN或NKAIN3或TRPML1或TRPML2)一起表达的TRPML3功能的化合物的测定和使用鉴定的化合物来调控人和其他哺乳动物或脊椎动物中的咸味感受。
[0022] 本发明进一步提供了基于使用本文提供的方法鉴定的TRPML3表达或不表达来分离、纯化和标记咸味和其他TRPML3表达细胞类型和味觉细胞谱系的特定方法，所述细胞谱系包括味觉干细胞和其他未成熟和成熟的味觉细胞谱系，包括分化为味蕾细胞、味觉细胞神经元、味觉免疫细胞等的细胞。这些分离和纯化方法包括阳性和阴性细胞分离方法。例如需要的味觉细胞谱系或类型可通过例如通过使用荧光激活细胞分选仪(FACS)的阳性细胞选择方法、例如通过使用抗体包被的珠的电生理视觉鉴定需要的细胞例如单个转染细胞的磁珠细胞选择来分离。可选地，需要的味觉细胞谱系或类型可通过阴性细胞纯化和分离方法来回收或纯化，其中通过去除一个或几个不需要的细胞谱系来将需要的细胞类型从混合的细胞群体中富集或纯化，例如通过使例如来自舌、口腔、或胃肠道和相关器官的含有需要的味觉细胞和不需要的细胞的混合的细胞悬液与特异于靶基因或在待去除的不需要的味觉细胞类型上表达的基因的细胞毒性抗体接触。
[0023] 本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠来检测TRPML3功能对黑色素细胞、垂体、肾上腺、味觉、泌尿或味觉细胞的影响。
[0024] 本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠来检测TRPML3功能对黑色素细胞、垂体、肾上腺、味觉、泌尿或味觉细胞的影响。
[0025] 另外，本发明涉及如下发现：由于TRPML3参与钠感受并且进一步基于其在甲状旁腺器官的表达，TRPML3调节剂可用来治疗涉及甲状旁腺的疾病，所述疾病包括但不限于钙体内平衡、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、高血钙、囊性骨炎、假性甲状腺功能减退、Jansen干骺端软骨生成、Blomstrand软骨生成和不同原因的骨质疏松，所述原因包括例如年龄相关、绝经、或药物、化疗或放疗诱导。
[0026] 本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠在测定中来检测在咸味味觉细胞中特异表达而不在Varitint waddler小鼠中特异表达(因为其中切除了咸味味觉细胞)的基因，该基因可调控TRPML3的功能，或作为咸味受体起作用或调控咸味味觉信号从TRPML3向神经纤维的传输和/或控制咸味味觉细胞的发育分化或凋亡。这些基因检测测定可包含使用基因芯片或微阵列技术来比较在咸味味觉细胞中表达的基因与在Varitint waddler小鼠中表达的基因。
[0027] 本发明进一步提供了基于使用本文提供的方法鉴定的TRPML3表达或不表达来分离、纯化和标记咸味和其他TRPML3表达细胞类型和细胞谱系的特定方法，所述细胞谱系包括味觉干细胞和其他未成熟和成熟的味觉细胞谱系，包括分化为味蕾细胞、味觉细胞神经元、味觉免疫细胞等的细胞。这些分离和纯化方法包括阳性和阴性细胞分离方法。例如需要的味觉细胞谱系或类型可通过例如通过使用荧光激活细胞分选仪(FACS)的阳性细胞选择方法、例如通过使用抗体包被的珠的电生理视觉鉴定需要的细胞(诸如单个转染的细胞)的磁珠细胞选择来分离。可选地，需要的味觉细胞谱系或类型可通过阴性细胞纯化和分离方法来回收或纯化，其中通过去除一个或几个不需要的细胞谱系来将需要的细胞类型从混合的细胞群体中富集或纯化，例如通过使例如来自舌、口腔、或胃肠道和相关器官的含有需要的味觉细胞和不需要的细胞的混合的细胞悬液与特异于靶基因或在待去除的不需要的味觉细胞类型上表达的基因的细胞毒性抗体接触。本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠来检测TRPML3功能对黑色素细胞、垂体、肾上腺、味觉、泌尿或味觉细胞的影响。
[0028] 本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠来检测TRPML3功能对黑色素细胞、垂体、肾上腺、味觉、泌尿或味觉细胞的影响。
[0029] 本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠在测定中来检测在咸味味觉细胞中特异表达而不在Varitint waddler小鼠中特异表达(因为其中切除了咸味味觉细胞)的基因，该基因可调控TRPML3的功能，或作为咸味受体起作用或调控咸味味觉信号从TRPML3向神经纤维的传输和/或控制咸味味觉细胞的发育分化或凋亡。这些基因检测测定可包含使用基因芯片或微阵列技术来比较在咸味味觉细胞中表达的基因与在Varitint waddler小鼠中表达的基因。
[0030] 本发明还涉及使用特异于TRPML3和/或相关辅助多肽的标志例如抗体或寡核苷酸定位舌和口腔中参与特定味觉(咸味)和非味觉特定功能的区域、定位包含在胃肠道和相关器官(诸如肠上皮或尿道)中特定(咸味)味觉感受细胞上的表达特定味觉特异基因并因此参与本文公开的味觉细胞特定功能的一种或多种的细胞，，和/或在味觉细胞分化研究中使用该基因和其特异标志，例如用于鉴定诱导味觉细胞分化或脱分化的化合物，例如成体或胚胎干细胞和其他多能或未成熟细胞类型分化为需要的味觉细胞谱系和味觉细胞类型。
[0031] 发明背景
[0032] 已研究过各种离子通道，以便阐明其潜在参与咸味味觉和调节钠转运、代谢和排泄。特别地，已详细研究过ENaC/退化蛋白家族离子通道成员上皮钠通道(ENaC)，其包括哺乳动物的酸感受离子通道(ASIC)、线虫的机械敏感性退化蛋白通道和软体动物的FMRF-酰胺肽门控通道(Kellenger，S.和Schild，L.(2002)Physiol.Rev.82：735-767)。ENaC介导+包括肾、结肠和肺的多种组织中阿米洛利-敏感的通过高阻抗上皮的顶端膜Na 转运。
[0033] 已知ENaC是包含α、β和γ亚基或δ、β和γ亚基的异三聚通道。假设该异三聚通道参与人的咸味感受。先前本受让人已开发了使用ENaC序列来鉴定调控δβγ和αβγ人ENaC的化合物的测定，以便检查这些化合物是否将潜在地调控人的咸味感受。这些化合物也可潜在地用来治疗涉及异常ENaC功能的人病理。
[0034] 不象其他哺乳动物，当以特异地调控ENaC功能的浓度使用时，阿米洛利只轻微地降低氯化钠味觉的强度，即降低约15-20％(Halpern，B.P.(1998)Neuroscience and Behavioral Reviews.23：5-47)。本发明人进行的实验显示当以300倍(对阿米洛利)和3000倍(对苄阿米洛利(benzamil))高于αβγENaC的IC50值(等同于10倍对阿米洛利和100倍对苄阿米洛利高于δβγENaC的IC50值)的水平测试时，阿米洛利或更有效的阿米洛利衍生物phenamil不引发对感受的人盐强度的显著影响。基于以上，得出其他(ENaC基因)参与人咸味感受的理论。
[0035] 另外，近来报道味觉受体可以在非口腔组织表达，例如在消化系统和潜在地诸如肾的其他器官表达，这表明其具有非味觉相关的活性，诸如在食物感受和调控消化等。特别地，据报道甜味、鲜味和苦味味觉受体在除口腔外的细胞中表达，诸如胃肠细胞(参见例 如 Sternini 等，Amer J Physiol.Gastrointestinal and Liver Physiology，292：G457-G461，2007；Mace，O.J.等，J.Physiology.10.1113/jphysiol.2007.130906。2007年
5月10日在线发表)。还据不同的研究组报道(Margolskee等，Bezencon等，Rozengurt等，和Sternini等(2007)(同上))，苦味和鲜味味觉受体和诸如TRPM5和味转导素的其他味觉信号传导分子在胃肠道的专门细胞中表达(参见例如Margolskee等，Genes Brain Behavior 2007(3月21日网上发表)；Rozengurt等，Amer.J.Physiol.Gastroent.Liver Physiol.291(2)：G171-7(2006)；Bezencon等，Chem Senses32(1)：41-47(2007))。
Margolskee等(同上)进一步报道，啮齿类动物中T1R3或味转导素的丧失导致胰岛素代谢的改变和诸如GLP-1(胰高血糖素样肽1)的饱食肽的释放。
5月10日在线发表)。还据不同的研究组报道(Margolskee等，Bezencon等，Rozengurt等，和Sternini等(2007)(同上))，苦味和鲜味味觉受体和诸如TRPM5和味转导素的其他味觉信号传导分子在胃肠道的专门细胞中表达(参见例如Margolskee等，Genes Brain Behavior 2007(3月21日网上发表)；Rozengurt等，Amer.J.Physiol.Gastroent.Liver Physiol.291(2)：G171-7(2006)；Bezencon等，Chem Senses32(1)：41-47(2007))。
Margolskee等(同上)进一步报道，啮齿类动物中T1R3或味转导素的丧失导致胰岛素代谢的改变和诸如GLP-1(胰高血糖素样肽1)的饱食肽的释放。
[0036] 基于对其他味觉受体的这些观察，咸味受体可能在控制钠离子体内平衡中发挥重要作用的组织诸如肾上腺和垂体中表达。因为味觉受体在诸如消化器官的非味觉细胞中表达，并且可能在泌尿系统的器官中表达，其可能参与不直接与味觉相关的功能诸如消化功能(诸如胃运动、吸收、食物检测、代谢和口腔或消化道的免疫调节)，并且也可影响与钠吸收、排泄和转运相关的功能，诸如血压和液体潴留。因此鉴定味觉细胞特异基因和鉴定这些基因在哪些特定细胞中表达应有助于更好的理解这些味觉受体的其他非味觉功能，并且也有助于使用这些基因、基因产物和表达这些的细胞在用于鉴定例如治疗消化疾病的新治疗剂的测定中，所述消化疾病自身免疫、炎症和癌症、代谢、糖尿病、进食障碍、肥胖、味觉细胞周转、高血压、液体潴留和消化系统的免疫调节。在钠(咸味)味觉受体的特定实例中，阐明对咸味感受重要的基因的特定身份应有助于理解这些基因对其他钠相关功能和对泌尿和心血管功能关键的参与钠转运、代谢和排泄的多肽(诸如血管加压素或醛固酮)的作用。
[0037] 如上文提到，本发明具体涉及TRPML3是参与哺乳动物和潜在地其他脊椎动物的钠(咸味)味觉感受的离子通道多肽的发现，考虑到钠和其他离子(诸如钾、钙、锂)对许多生理功能的重要性，这一发现将暗示该基因在不同脊椎动物中可能是保守的。在本文发明人的特定发现之前，即TRPML3(MCOLN3)编码参与灵长类动物和其他哺乳动物的咸味感受的离子通道(进一步可能在涉及钠转运和排泄的相关生理功能中发挥作用)，先前报道该基因负责称为varitint-waddler的小鼠突变体的表型，该突变体显示早发性听力丧失、前庭缺陷、色素异常和围产期致死(DiPalma等，Mutationsin Mcoln3 associated withdeafness and pigmentation defects in varitint-waddler(Va)mice.( 与varitint-waddler(Va)小鼠中耳聋和色素沉着缺陷相关的Mcoln3的突变)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：14994-14999；2002)。据进一步报道，MCOLN3或TRPML3在毛细胞和静纤毛质膜内表达(耳内)。特别地，已报道该肽中导致第五个跨膜结构域中ala 419取代成pro的突变导致高活性的MCOLN3，这导致表达该分子的细胞(即耳的毛细胞)的死亡(因此Va小鼠的耳聋)(Grimm C等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 104：19583-8；2007)。
[0038] 尽管在小鼠中，A419P-TRPML 3的突变导致严重形式的varitint-waddler表型(Kim等，J.Biol.Chem.，2007年12 月14日；282(50)：36138-42.2007年10月 25日 网上发表；Nagata等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，2008年1月8日；105(1)：353-8.2007年12月27日网上发表；Grimm等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，2007年12月4日，104(49)：
19583-8.2007年11月28日网上发表)，其特征为色素沉着缺陷、听力丧失和胚胎致死，另一个TRPML3突变(TRPML3(I362T/A419P)导致轻微形式的varitint-waddler表型。
19583-8.2007年11月28日网上发表)，其特征为色素沉着缺陷、听力丧失和胚胎致死，另一个TRPML3突变(TRPML3(I362T/A419P)导致轻微形式的varitint-waddler表型。
[0039] 突变是如何造成每个表型的是未知的。据报道TRPML3的第一个通道特性是作为强烈向内的整流阳离子通道，受胞外Na+的新调节(Kim等2007(同上))。他们进一步报道在不含Na+的培养基中预孵育TRPML3的胞外表面是通道活化所需的，但是随后通道缓慢失活。因此A419P突变将通道锁定于开放不受调节的状态。Kim等研究者进一步观察到A419G突变相似的功能获得，其与A419P类似预期去稳定TRPML3的α螺旋第五个跨膜结构域。相反，Kim等观察到I362T突变导致无活性的通道，但TRPML3(I362T/A419P)的通道特性与TRPML3(A419P)类似。然而，他们报道TRPML3(I362T/A419P)的表面表达和电流密度低于TRPML3(A419P)，并且据报道A419P突变影响了通道的糖基化，并引起大量细胞死亡。据报道他们的发现进一步确认了varitint-waddler表型是由于TRPML3(I362T/A419P)突变体减轻的TRPML3(A419P)的功能获得引起的，导致更轻微的表型。
[0040] 另外，据报道TRPML3基因家族的相关成员TRPML1(黏脂1/MCOLN1)的一些突变导致IV型黏脂沉积，严重的遗传性神经退行性疾病(Xu等，2007年11月13日，Proc Acad Sci USA，104(46)：18321-62007年11月7日网上发表)。该疾病是黏脂沉积的特定形式，是特征为严重的神经退行、胃酸缺乏和视觉损伤(诸如角膜混浊和斜视)的常染色体隐性溶酶体存储紊乱。该疾病是由于第2组瞬时受体电位(TRP)相关阳离子通道TRPML1的突变而发生的(Venkatanulum等，J Biol.Chem.2006年6月23日281(25)：17517-27 2006年4月10日网上发表)。
[0041] 据报道，TRPML3基因家族的成员彼此相关联。例如同样的参考文献Venkatanulum等(同上)表明这些(TRPML1、2和3)蛋白倾向于多聚化，并教导其亚细胞分布和调控这些蛋白运输的机制是有限的。他们还宣称TRPML相互作用来形成同和异多聚体。另外，Venkatanulum等还声称TRPML1或TRPML2的存在特异地影响TRPML3的空间分布。他们宣称尽管TRPML1和TRPML2同多聚体是溶酶体蛋白，TRPML3同多聚体位于内质网。另外，他们宣称TRPML3在与TRPML1或TRPML2共表达时定位于溶酶体，当TRPML1和TRPML2的溶酶体靶向被破坏时TRPML3类似地错误定位。相反，他们声明TRPML3不引起TRPML1或TRPML2在内质网的滞留。Venkatanulum等还表明存在控制TRPML的亚细胞分布的等级，以便TRPML1和TRPML2指示TRPML 3的定位而不是反之亦然。
[0042] 文献和公共基因数据库中还报道了MCOLN3或TRPML3在肾上腺强表达，已知肾上腺在调节机体钠代谢中发挥重要作用。进一步，据报道人自身免疫病(爱迪生氏)的特征为肾上腺的破坏，并且该疾病的一个指示症状是强烈的盐渴求。
[0043] 更进一步，据报道TRPML3在垂体强表达，并且在黑色素细胞中表达。如上文指出，varitint突变以及导致听力细胞的死亡，导致黑色素细胞的死亡。
[0044] 然而，据本发明人所知，先前没有人表明在不同哺乳动物或其他脊椎动物中TRPML3或相关基因TRPML1或TRPML2参与咸味味觉或编码感受和响应于咸味刺激的味觉受体多肽。
[0045] 发明简述和目的
[0046] 因此，本发明的目的是提供第一次确定下述的发现和支持数据：TRPML3在不同哺乳动物和潜在地其他脊椎动物的味觉(特别是咸味味觉)中发挥活性作用，并且基于此该离子通道单独或与其他离子通道基因(诸如TRPML1、TRPML2或NALCN、NKAIN3)或其他辅助蛋白一起可进一步在诸如钠吸收、转运和排泄的钠相关的细胞和生理活性和诸如尿液排出、血压调节和类似的相关附属影响和活性中发挥重要作用。
[0047] 同样，本发明的目的是提供表达TRPML3或其变体和任选地适合用在鉴定TRPML3调节剂的测定中或适合用于研究TRPML3对咸味味觉和涉及钠转运、代谢和排泄的其他生理过程的影响的其他离子通道或诸如味觉特异的GPCR的辅助蛋白的转化或转染的细胞或转基因动物。
[0048] 同样，本发明的目的是提供包含测试细胞，优选地重组哺乳动物细胞或两栖动物卵母细胞或表达内源性TRPML3的咸味味觉细胞或表达功能性TRPML3或变体、片段或功能等效物的其他TRPML3表达细胞(例如垂体或肾上腺)的测定系统，以及基于哺乳动物细胞和基于两栖动物卵母细胞的TRPML3推测调节剂的测定(优选地高通量测定)。
[0049] 更具体地，本发明的目的是提供表达可用在筛选TRPML3调节剂的基于细胞的测定中的功能性TRPML3或变体、片段或功能等效物的人细胞系，例如HEK293T细胞、CHO细胞和两栖动物卵母细胞。
[0050] 同样，本发明的目的是提供表达功能性TRPML3或变体、片段或功能等效物的哺乳动物细胞和两栖动物卵母细胞，用于功能地鉴定TRPML3的活性和鉴定增强或阻抑咸味感受的化合物(本文称为咸味味觉调节剂)。这些化合物可用作食物、药物和饮料的成分来增强、调控、抑制或阻抑咸味味觉。
[0051] 如本申请要求保护优先权利益的临时申请和在先发明专利申请所公开，本发明人使用鉴定灵长类动物味觉特异基因的新原理起初鉴定该基因为编码味觉特异基因(详细公开于临时申请，通过引用并入本文)。这些申请显示编码多跨膜蛋白的该基因在传导钠的味蕾顶部、味觉感受细胞中表达。基于此推测TRPML3可能参与咸味感受和其他钠相关的功能。
[0052] 下文提供的本文公开的数据，包括体外和体内的功能(电生理)数据(使用表达突变形式TRPML3基因的varitint-waddler小鼠，其造成耳聋、色素丧失和受损的平衡)、免疫组织化学数据和其他信息，证实了本发明人最初的推测，并提供了有说服力的实验证明该基因编码允许舌的味蕾的感受味觉细胞检测氯化钠(盐)的咸味受体。
[0053] 另外，基于该基因还在肾上腺和垂体表达的事实，其预期与诸如血管加压素和醛固酮的其他多肽一起参与或调节机体不同细胞、组织和器官中钠转运、代谢和排泄的一般调节。
[0054] 共同提供有说服力的证据证明TRPML3基因编码在不同动物中作为咸味受体起作用的离子通道的本文包含的证据包括以下：
[0055] (1)MCOLN3或TRPML3至少在灵长类动物和人味觉细胞中特异表达，而不在舌上皮细胞表达，并且在味蕾顶部、不表达TRPM5(即其不是甜味、苦味或鲜味)、不表达PKD2L1(即其不是酸味)并且发现朝向味孔的味觉感受细胞亚群特异表达。因此，MCOLN3阳性细胞包含不同于参与检测其他(非咸味)味觉形态的已知味觉细胞的不同亚群的味觉细胞。
[0056] (2)MCOLN3或TRPML3也在其他器官(例如耳)的感受细胞中表达。因此其是‘专业’的感受基因。
[0057] (3)MCOLN3或TRPML3在肾上腺强表达。这些腺体在调节机体钠代谢中发挥非常重要的作用。因此MCOLN3可能(基于本发明人获得的这些和其他数据)是调节钠代谢的关键分子，并且可调节或参与肾上腺产生醛固酮。
[0058] (4)人自身免疫病(爱迪生氏)的特征为肾上腺的破坏。该疾病的一个指示症状是盐渴求。后者可能是针对MCOLN3的自身抗体的存在或破坏了味蕾中MCOLN3或TRPML3功能的该基因突变的结果。
[0059] (5)MCOLN3或TRPML3也在参与血管加压素释放的垂体中高表达，这转而影响尿液产生和肾功能。基于此和本发明人获得的与TRPML3相关的其他数据，该多肽可能调节血管加压素的释放，因此调节尿中的钠排泄。
[0060] (6)MCOLN3或TRPML3在电生理研究中传导钠，并且显示预测为灵长类动物咸味受体的正确的生化特征(即检测K+、Li+和阿米洛利不敏感性)。
[0061] (7)在varitint小鼠(具有TRPML3突变)中使用钠的神经生理实验实验(神经记录)表明Varitint小鼠对钠的应答受损(不显示强烈的咸味应答)。这些小鼠切除了味蕾中表达TRPML3的味觉细胞(咸味味觉细胞)，这确认了这些特定细胞是检测咸味的前提。
[0062] (8)使用表达突变的TRPML3多肽(突变导致离子通道固定于“开放”取向)的哺乳动物细胞和两栖动物卵母细胞的基于细胞的测定鉴定了在味觉测试中应增强或阻抑咸味味觉的TRPML3增强剂和阻抑剂。
[0063] 因此，基于前文，本发明的目的是确定MCOLN3或TRPML3作为人咸味受体的身份，并且基于此来使用转染了该基因或变体(例如功能性嵌合体、具有增强活性、固定于开放取向或有助于其用于测定的TRPML3蛋白的其他需要的改变的突变体)的细胞或动物设计筛选测定，目的是鉴定该分子功能的激动剂、拮抗剂或增强剂(调节剂)，其将调控咸味味觉和其他TRPML3功能。
[0064] 同样，本发明的目的是提供分离的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞或泌尿器细胞或包含表达参与咸味感受、钠代谢、醛固酮产生和/或血管加压素释放的TRPML3的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞或泌尿器细胞的富集的细胞样品，其中所述分离的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、或泌尿器细胞或富集的味觉细胞样品表达TRPML3基因或其变体，其编码调控咸味味觉、钠转运、代谢或排泄和/或醛固酮或血管加压素释放或产生的至少一种的钠通道。优选地，该细胞将是人、非人灵长类动物或啮齿类动物来源。
[0065] 同样，本发明的特定目的是鉴定将用于治疗涉及醛固酮释放或产生的疾病的TRPML3调节剂。可使用TRPML3调节剂治疗的疾病和病况包括可由激动或拮抗醛固酮因此激动或拮抗钠转运和排泄的化合物治疗的疾病，所述化合物作为实例包括水肿、血压(高或低血压)、肝硬化、原发性高醛固酮血症、肾功能障碍、糖尿病(I或II型)和与其相关的病理症状，包括循环问题、水肿、与循环差相关的眼病、高可的松血症、动脉粥样硬化或例如腹型肥胖的肥胖，以及肝病、性功能障碍(男性或女性)、脑血管疾病、血管疾病、视网膜病变、神经病、胰岛素病、内皮功能障碍、压力受体功能障碍、偏头痛、潮热和经前期紧张以及其他心血管病况，诸如动脉粥样硬化、心力衰竭、充血性心力衰竭、血管疾病、中风、心肌梗死、内皮功能障碍、心室肥厚、肾功能障碍、靶器官损伤、血栓形成、心律不齐、斑块破裂和动脉瘤。
[0066] 同样，本发明的特定目的是鉴定将用于治疗涉及血管加压素释放或产生的疾病的TRPML3调节剂。可使用TRPML3调节剂治疗的疾病和病况包括可由激动或拮抗血管加压素的化合物治疗的疾病，所述化合物相似地作为实例包括糖尿病、肥胖、肾病，诸如囊性肾病、获得性囊性肾病、诸如近视的眼循环相关疾患；恶心、呕吐、性功能障碍(男性或女性)、水肿、高血压、充血性心力衰竭(范围从纽约心脏学会的II类到红润肺水肿)、周期性自发性水肿、肾病综合征、由于肝硬化或其他原因的腹水、各种原因的脑水肿，以及稀释性低钠血症和统称为ADH不适当分泌综合征的代谢改变和其中治疗上需要血管舒张和/或抗催产活性的其他疾病或病况。
[0067] 同样更具体地，本发明的目的是提供调控咸味感受的分离的味觉受体，其包含TRPML3多肽或其变体(诸如改造为具有增强的离子通道活性或保持固定于开放取向的变体)或调控包括人的哺乳动物的咸味味觉的TRPML3的嵌合体或片段。该味觉受体可以是单体或多聚体(异聚体或同聚体)，并且可包含其他味觉特异多肽，例如诸如TRPML2、TRPML1、NKAIN3或NALCN的其他离子通道多肽。
[0068] 同样更具体地，本发明的目的是提供被遗传改造为敲除了内源TRPML3的表达和/或进一步遗传改造敲入其直向同源物或变体(例如改造为增强离子通道活性或将通道固定于“开放”位置的变体)转基因非人动物。包括表达人或其他灵长类动物TRPML3基因或变体的这些动物可用来鉴定调控(增强或阻抑)人和其他哺乳动物咸味味觉的化合物。
[0069] 更具体地，本发明的目的是提供被遗传改造为表达异源TRPML3多肽(例如人TPML3或变体)的转基因非人动物。
[0070] 同样更具体地，本发明的目的是提供使用表达TRPML3或突变体形式(诸如造成Varitint-waddler表型的突变)的转基因动物在鉴定TRPML3的拮抗剂、激动剂或增强剂和研究TRPML3对包括咸味味觉和钠转运、代谢和排泄的不同生理活性的影响的筛选中的测定方法。
[0071] 同样更具体地，本发明的目的是提供使用相应的转基因动物的方法，其中TRPML3基因被“敲除”以便阐明TRPML3对味觉和对心脏或泌尿功能，特别是对醛固酮产生、钠代谢、咸味感受或血管加压素释放的影响。预期这些动物可包含与钠转运和代谢相关的病况，诸如高血压、低血压、液体潴留、心脏病发作和中风。因此本发明还包括使用这些动物作为疾病模型和用于评估用于治疗或预防此类病况的潜在治疗剂。
[0072] 同样更具体地，本发明的目的是使用突变形式的TRPML3多肽(包括产生Varitint-Waddler表型的突变形式)，以便杀死或切除特定细胞，包括咸味味觉细胞、黑色素细胞、垂体或肾上腺细胞。
[0073] 同样更具体地，本发明的目的是使用编码TRPML3多肽的基因的突变形式(包括产生Varitint-Waddler表型的突变形式)，以便产生其中切除了特定细胞的转基因动物，并使用这些转基因动物来测试潜在治疗剂和作为疾病模型。
[0074] 同样更具体地，本发明的目的是使用突变形式的TRPML3多肽(包括产生Varitint-Waddler表型的突变形式)作为杀死特定细胞的毒素。
[0075] 同样更具体地，本发明的目的是提供使用调控或结合TRPML3的分子(例如激动或拮抗或特异结合该多肽的分子)来治疗黑色素瘤、肾上腺癌、垂体癌等和其他涉及黑色素细胞的病况，诸如色素沉着紊乱或垂体或肾上腺相关的病患。
[0076] 同样更具体地，本发明的目的是提供表达包含编码功能性钠离子通道多肽的TRPML3或其变体的咸味受体的重组细胞。
[0077] 同样更具体地，本发明的目的是提供用于鉴定激动、拮抗或增强TRPML3活性的化合物的测定，其包括表达TRPML3的重组或内源味觉或其他细胞与推测的TRPML3增强剂、激动剂或拮抗剂接触和确定其对TRPML3活性的影响。优选地，这些测定将是电生理测定，例如膜片钳或二电极电压钳测定，其可以是自动化的并且一般将使用哺乳动物或两栖动物细胞。
[0078] 同样更具体地，本发明的目的是提供通过离子流测定来鉴定TRPML3调节剂的方法。
[0079] 同样更具体地，本发明的目的是提供通过自动电生理(膜片钳)测定(即IonWorks测定系统)来鉴定TRPML3调节剂(增强剂、阻抑剂)的方法。
[0080] 同样更具体地，本发明的目的是提供通过使用青蛙卵母细胞的电生理测定来鉴定TRPML3调节剂(增强剂、阻抑剂)的方法。
[0081] 同样更具体地，本发明的目的是提供通过使用哺乳动物细胞的电生理测定来鉴定TRPML3调节剂(增强剂、阻抑剂)的方法。
[0082] 同样更具体地，本发明的目的是提供其中在味觉测试中评估鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物的此类TRPML3测定。
[0083] 同样更具体地，本发明的目的是提供其中在动物中测试鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物对醛固酮产生的影响的此类TRPML3测定。
[0084] 同样更具体地，本发明的目的是提供其中在动物中测试鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物对血管加压素释放的影响的此类TRPML3测定。
[0085] 同样更具体地，本发明的目的是提供其中在动物中测试鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物对心脏或泌尿功能的至少一种和更具体地对血压、液体潴留、钠代谢或尿液产生的影响的此类TRPML3测定。
[0086] 同样更具体地，本发明的目的是提供鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于治疗涉及醛固酮产生的疾病或病况的应用，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0087] 同样更具体地，本发明的目的是提供鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于治疗涉及血管加压素释放的疾病或病况的应用，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0088] 同样更具体地，本发明的目的是提供鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于调控有相应需要的受治疗者的心脏功能(例如血压、心律不齐、或中风或液体潴留)的应用，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0089] 同样更具体地，本发明的目的是提供分离的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、黑色素细胞、或泌尿器细胞或富集的味觉细胞样品，其中所述分离或富集的细胞样品包含表达TRPML3离子通道多肽的细胞。
[0090] 同样更具体地，本发明的目的是提供分离的调控咸味感受的味觉受体，其包含调控哺乳动物咸味味觉的TRPML3多肽或其变体。
[0091] 同样更具体地，本发明的目的是提供被遗传改造为敲除或损害内源TRPML3表达的转基因非人动物，条件是所述转基因动物不是Varitint小鼠。
[0092] 同样更具体地，本发明的目的是提供被遗传改造为表达异源TRPML3多肽的转基因非人动物，条件是所述转基因动物不是Varitint小鼠。
[0093] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种在鉴定调控咸味味觉的化合物的筛选中使用转基因动物的方法。
[0094] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种使用转基因动物来鉴定TRPML3的拮抗剂、激动剂或增强剂的方法，其中所鉴定的化合物进一步任选地在人味觉测试中评估。
[0095] 同样更具体地，本发明的目的是提供使用转基因动物来阐明TRPML3对醛固酮产生、钠代谢、咸味感受或血管加压素释放的影响的方法。
[0096] 同样更具体地，本发明的目的是提供使用表达编码对表达离子通道的细胞有毒的离子通道的TRPML3基因的转基因动物(非人)以评估涉及异常醛固酮产生、血管加压素释放、钠代谢和/或黑色素细胞损失的疾病或病况的治疗方案的方法。
[0097] 本发明还涉及用Varitint waddler小鼠来检测TRPML3功能对黑色素细胞、垂体、肾上腺、味觉、泌尿或味觉细胞的影响的应用。
[0098] 本发明还涉及Varitint waddler小鼠在检测在咸味味觉细胞中特异表达而不在Varitint waddler小鼠中表达(因为其中切除了咸味味觉细胞)的基因的测定中的应用，该基因可调控TRPML3的功能，或者作为咸味受体起作用或调控咸味味觉信号从TRPML3向神经纤维的传输和/或控制咸味味觉细胞的发育分化或凋亡。这些基因检测测定可包含使用基因芯片或微阵列技术来比较在咸味味觉细胞中表达的基因与在Varitint waddler小鼠中表达的基因。
[0099] 本发明还提供了治疗甲状旁腺相关疾病的方法，所述疾病诸如钙体内平衡、高血钙、骨炎、甲状旁腺功能减退、甲状旁腺功能亢进、囊状纤维性骨炎、假性甲状旁腺功能减退、Jansen干骺端软骨生成、Blomstrand软骨生成和不同原因的骨质疏松，所述原因诸如疾病、年龄、绝经、化疗、放疗、药物及类似原因。
[0100] 同样更具体地，本发明的目的是提供表达包含TRPML3或其变体的咸味受体的重组细胞，例如，酵母、两栖动物、昆虫、细菌、爬行动物、禽类、或哺乳动物细胞，优选地哺乳动物细胞或青蛙卵母细胞，诸如可瞬时表达所述TRPML3多肽或稳定表达所述TRPML3多肽的CHO-K1、HEK-293、COS、CHO、BHK细胞。
[0101] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种在结合测定中鉴定推测的咸味味觉调节剂的方法，其包括：提供TRPML3多肽或表达TRPML3的细胞并使所述多肽或细胞与推测的TRPML3调节化合物接触并基于其与TRPML3多肽的特定结合来鉴定潜在的TRPML3调节剂。
[0102] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种调控有相应需要的受治疗者的血压或液体潴留的方法，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0103] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种调控有相应需要的受治疗者的尿液产生和/或排泄的方法，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0104] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种治疗有相应需要的受治疗者的爱迪生氏病或IV型黏脂沉积(mocolipidosis)的方法，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0105] 同样更具体地，本发明的目的是提供特定的密码子优化的和TRPML3突变的序列以及使用这些序列的测定。
[0106] 同样更具体地，本发明的目的是提供如此鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于调控有相应需要的受治疗者的尿液产生和/或排泄或水肿的应用，其包括施用有效量的调控TRPML3的化合物。
[0107] 同样更具体地，本发明的目的是提供可包括多肽、抗体、小分子、siRNA、反义RNA、核酶等的此类鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物。
[0108] 更具体地，本发明的目的是提供基于哺乳动物和卵母细胞的测定(优选地高或中等通量)用于分析和筛选咸味受体(TRPML3)，该测定任选地可包括添加调控TRPML3功能的化合物。此类方法可用来功能地表征TRPML3的活性，并鉴定不同TRPML3离子通道中盐感受所需的特定基序或残基，以及鉴定增强或阻抑咸味感受的化合物(本文称为咸味味觉调节剂)。
[0109] 同样，本发明的目的是提供通过施用TRPML3调节剂来治疗或预防涉及钠转运和代谢的病况(诸如高血压、低血压、液体潴留、心脏病发作和中风)和上文提到的病况的新方法。
[0110] 在特定的方面，本发明提供了一种利用表达功能性TRPML3钠通道的哺乳动物细胞或卵母细胞与推测的TRPML3调节化合物来鉴定TRPML3的调节剂的方法，其包括：(i)测定所述化合物对通过TRPML3通道的钠转运的影响；并(ii)基于其对钠转运的增强或抑制影响来鉴定所述化合物是否是TRPML3调节剂。本发明还包括(iii)在人或哺乳动物味觉测试中确认鉴定的化合物调控咸味味觉。在一个实施方案中，所述TRMPL3是哺乳动物的TRMPL3。在另一个实施方案中，TRMPL3是人、非人灵长类动物、啮齿类动物(小鼠或大鼠)、牛、猪、马或绵羊的TRMPL3。
[0111] 在进一步的实施方案中，在人或哺乳动物中测试鉴定的化合物对钠提取或泌尿功能或心血管或涉及TRPML3的其他功能的体内影响。在一个实施方案中，所述TRMPL3是哺乳动物的TRMPL3。在另一个实施方案中，TRMPL3是人、非人灵长类动物、啮齿类动物、牛、猪、马或绵羊的TRMPL3。
[0112] 在本发明的一个方面，哺乳动物细胞选自由HEK293、HEK293T、Swiss3T3、CHO、BHK、NIH3T3和COS细胞组成的组。在第二个方面，卵母细胞是哺乳动物、两栖动物、禽或爬行动物卵母细胞。在进一步的方面，两栖动物卵母细胞是爪蟾(Xenopus)卵母细胞。在本发明的另一方面，细胞表达其他味觉基因，优选地离子通道。
[0113] 在本发明相关的实施方案中，这些测定用来鉴定人TRPML3增强剂或抑制剂，其中卵母细胞在与推测的人TRPML3增强剂接触之前与人TRPML3的抑制剂或激活剂接触。在另外的实施方案中，该测定还包括使用没有被显微注射人TRPML3 cRNA的卵母细胞的阴性对照。在本发明的另一方面，推测的调节剂以范围从约1nM至约1mM的浓度应用。在本发明的另一方面，人TRPML3增强剂显示至少20％的增强系数。在进一步的方面，人TRPML3增强剂显示至少50％的增强系数。在进一步的方面，人TRPML3增强剂显示至少100％的增强系数。
[0114] 同样更一般地，本发明的目的是提供一种鉴定编码参与灵长类动物(人或非人)咸味感受的多肽的基因的方法或原理，其包括：
[0115] (i)鉴定一套基因，其包括在真菌状和任选地轮廓状、叶状或腭味觉细胞中表达而不在舌细胞中表达的基因和/或在味觉细胞中的表达水平显著高于在舌细胞中的表达水平的基因；
[0116] (ii)在(i)中鉴定的基因中，任选地鉴定一套基因，其不在表达鲜味、甜味、苦味或酸味味觉受体或这些细胞的标志(T1R或T2R、TRPM5和PKD2L1/PKD1L3)的味觉细胞中表达；
[0117] (iii)任选地鉴定包含在步骤(i)或步骤(ii)之后鉴定的基因属中的味觉特异基因的亚群，其在味蕾的上半部分特异表达而不在味蕾的下半部分表达，或者其在味蕾的上半部分比在味蕾的下半部分富集(至少1.2-1.5倍更高地表达)；并
[0118] (iv)功能地表达根据(ii)或(iii)鉴定的一个或多个基因并确定哪些所述基因作为钠响应离子通道或钠响应受体或转运子起作用，因此鉴定该基因作为调控咸味味觉的推测基因。
[0119] (优选地，功能化的鉴定的基因是相对于味蕾的下半部分在味蕾的上半部分富集至少1.2-1.5倍的基因)。
[0120] 在这些方法中，步骤(i)优选地包括使用激光捕获显微解剖(LCD)来从非味觉组织解剖和纯化味觉组织，和/或步骤(i)包括RNA扩增来自味觉细胞和舌细胞的基因，扩增的基因用含有特异于获得味觉和舌状组织的特定哺乳动物基因的样品的基因芯片筛选。
[0121] 进一步，在这些方法中，步骤(i)优选地包括使用针对人或非人灵长类动物基因组的每个离子通道的引物的高通量PCR，并且步骤(ii)优选地通过使用特异于步骤(i)中鉴定的基因的反义RNA探针的原位杂交以便确定在味觉细胞与舌细胞中的表达水平，或通过使用特异于由步骤(i)鉴定的基因编码的蛋白的标记的抗体的免疫细胞化学检测来完成。
[0122] 同样更一般地，本发明的目的是提供一种鉴定编码参与灵长类动物(人或非人)咸味感受的多肽的基因的方法，其包括：
[0123] (i)鉴定一套基因，其包括在真菌状、轮廓状、叶状或腭味觉细胞中表达而不在舌细胞中表达的基因和/或在所述味觉细胞中的表达水平显著高于在舌细胞中的表达水平的基因；
[0124] (ii)在(i)中鉴定的基因中，鉴定一套基因，其不在表达鲜味、甜味、苦味或酸味味觉受体或这些细胞的标志(T1R或T2RTRPM5或PKD2L1/PKD1L3)的味觉细胞中表达；
[0125] (iii)在(i)或(ii)中鉴定的基因中，任选地鉴定该基因是否特异地在味蕾的上半部分表达而不在味蕾的下半部分表达，或者相对于在味蕾下半部分的表达其在味蕾的上半部分富集(至少1.2-1.5倍更高地表达)；并
[0126] (iv)在表达一个或多个根据(ii)鉴定的基因的初级神经元中确定哪些所述基因作为钠响应离子通道或钠响应受体或转运子起作用，因此鉴定该基因作为调控咸味味觉的推测基因。
[0127] (同样，功能化的选择的味觉特定基因将优选地被富集，即在味蕾的上半部分的表达对比味蕾的下半部分高1.2-1.5倍。)
[0128] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种鉴定潜在地体内应用于调控人咸味味觉的化合物的测定，其包括以下：
[0129] (i)使表达编码单独TRPML3离子通道或带有NALCN、NKAIN3、TRPML1或TRPML2或直向同源物的基因或编码与其编码的多肽具有至少90％序列同一性的多肽的基因的细胞与至少一种推测的拮抗剂、激动剂或增强剂化合物接触；
[0130] (ii)在存在和不存在所述推测的激动剂、拮抗剂或增强剂的情况下，测定钠传导、受体活性或钠转运；和
[0131] (iii)基于化合物是否调控钠传导和与人咸味受体一致的其他传导特性而鉴定该化合物为潜在的咸味味觉增强剂。
[0132] 同样更具体地，本发明的目的是提供一种使用特异于TRPML3基因或基因产物的探针来在味觉细胞样品中鉴定和/或分离和/或富集咸味特异细胞(优选地灵长类动物alt受体表达细胞)的方法。
[0133] 同样更具体地，本发明的目的是提供用TRPML3来纯化或富集需要的味觉细胞亚型或味觉细胞谱系的应用，其包括使用荧光激活细胞分选仪(FACS)或使用标记的磁珠。
[0134] 同样更具体地，本发明的目的是提供用TRPML3来纯化或富集需要的味觉细胞亚型或味觉细胞谱系的应用，其中需要的味觉细胞亚型或味觉细胞谱系通过包括阴性细胞选择技术的方法而被分离、纯化、富集或标记，基于至少一个其他味觉细胞特异基因的表达或表达缺乏，所述阴性细胞选择技术例如通过使用特异地杀死至少一个非靶细胞类型或谱系的细胞毒性抗体来消除至少一个非靶味觉细胞亚型或谱系。
[0135] 同样更具体地，本发明的目的是提供使用单独或与其他味觉特异基因(例如TRPML1、TRPML2、NALCN和/或NKAIN3)一起的TRPML3作为标志来鉴定、分离或富集咸味受体细胞的方法。
[0136] 基于前文，可理解本发明部分是鉴定味觉特异基因的新方案的结果。这些基因是使用两种不同的技术(基因芯片和聚合酶链反应(PCR)筛选)鉴定的，以便鉴定新的咸味受体靶基因。首先，使用含有几乎所有已知猕猴基因的Affymetrix基因芯片来确定哪些基因在舌背面的灵长类动物轮廓状味觉细胞和舌前面的真菌状乳头味觉细胞中特异表达，而不在通过激光捕获显微解剖分离的舌上皮细胞表达。第二，使用PCR来确定哪些离子通道(来自我们在人/猕猴基因组中编目的通道)在猕猴真菌状和/或轮廓状(CV)乳头味觉细胞中特异表达，而不在通过激光捕获显微解剖分离的舌上皮细胞表达。另外，在这些基因中，在味蕾上半部分特异表达或富集(以至少1.2-1.5倍更高地表达)的亚群被鉴定为特别优选的功能化候选基因。通过任一种方法鉴定的基因的味觉特异性表达使用独立的组织学方法(诸如原位杂交或免疫组织化学)来确认，以便确定哪些基因在味觉细胞中表达。使用双标记组织学方法，确定哪些新的味觉特异基因在表达味觉特异离子通道TRPM5的甜味、苦味和鲜味细胞中、表达味觉特异离子通道PKD2L1/PKD1L3的酸味细胞中、或不表达TRPM5或PKD2L1/PKD1L3的独特细胞类型中表达。可传导钠或被钠活化并且在TRPM5-和PKD2L1/PKD1L3-阴性细胞群体中表达的味觉特异基因(优选地离子通道)是可能用于筛选努力的候选基因以便鉴定编码哺乳动物咸味受体的基因以及其中这些咸味受体基因诸如在口腔和尿道中表达的特定细胞类型，并且还用于设计用来鉴定人咸味味觉增强剂的高通量测定中。使用这些一般方法，TRPML3被鉴定为潜在的咸味受体。
[0137] 使用这些原理而鉴定以及影响盐感受(和可能由此受影响的诸如钠吸收、转运和排泄的其他生物活性及其诸如液体潴留和血压调节的影响)的新的味觉特异基因一般能可选地影响其他味觉形态和味道感受。尽管本发明人鉴定TRPML3作为咸味受体，以及具有有说服力的功能数据支持，预期TRPML3参与诸如上文讨论的非味觉生物功能。因此，该基因是治疗性筛选测定中有用的靶，例如鉴定用于治疗与TRPML3相关的疾病的治疗剂，所述疾病诸如爱迪生氏病、诸如IV型黏脂沉积的黏液(mocoid)疾患、泌尿疾患和心血管疾患和与钠转运、代谢和排泄和血管加压素或醛固酮释放或产生相关的病理。
[0138] 本发明一般还涉及发明的味觉特异基因和其特异探针在包括阳性和阴性细胞分离方法的分离和纯化方法中的应用。例如，需要的味觉细胞谱系或类型可通过阳性细胞选择方法分离，例如通过使用荧光激活细胞分选(FACS)、磁珠细胞选择，例如通过诸如使用抗体包被的珠的电生理法视觉鉴定需要的细胞，例如单个转染的细胞。可选地，需要的味觉细胞谱系或类型可通过阴性细胞纯化和分离方法来回收或纯化，其中需要的细胞类型从混合的细胞群体中通过去除一种或几种不需要的细胞谱系来富集或纯化，例如通过使含有需要的味觉(咸味)细胞和不需要的细胞的混合的细胞悬液(例如来自舌、口腔或胃肠道和相关器官)与特异于在待去除的不需要的味觉细胞类型上表达的靶基因的细胞毒性抗体接触。
[0139] 本发明一般还涉及发明的味觉特异基因的应用，其参与特定味觉和非味觉特异功能、包含在表达特定味觉特异基因并因此参与本文公开的味觉细胞特定功能的一种或多种的胃肠道和相关器官(诸如肠上皮或尿道)的特定区域的细胞制图，和/或在味觉细胞分化研究中使用该基因和其特异标志，例如用于鉴定诱导味觉细胞分化或脱分化的化合物，例如成体或胚胎干细胞和其他多能或未成熟细胞类型分化为需要的味觉细胞谱系和味觉细胞类型。
[0140] 同样更具体地，如下文详述，本发明更广泛地提供了候选咸味味觉基因(优选地离子通道)的原理和标准，其是：
[0141] a)在灵长类动物(猕猴)味觉细胞特别是真菌状和/或轮廓状乳头衍生的味觉细胞以及叶状和腭味觉细胞中特异表达，而不在舌上皮细胞表达，或者在味觉细胞中的表达水平高于舌细胞。
[0142] b)通过组织学方法的味觉细胞中的表达。具体地，在不表达甜味、苦味和鲜味细胞标志TRPM5或酸味细胞标志PKD2L1/PKD1L3的独特味觉细胞类型中表达。该独特细胞类型将可能对应于独特的味觉细胞谱系，例如专门的盐感受或脂肪感受细胞。
[0143] c)在异源表达系统(诸如爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞)或初级神经元(诸如背根神经节神经元)中作为具有基本组成性功能(即部分通道群体开放并在静止时通过钠)的钠通道或钠活化受体的功能性表达。
[0144] d)任选地，在味蕾细胞的上部特定表达或富集，优选地味蕾上半部分对比下半部分至少1.2-1.5倍更高的表达。
[0145] 满足这些标准的基因进一步进行高通量筛选努力以便鉴定增强人盐感受的化合物。这些方法与表达突变体TRPML3基因产生Varitint-waddler表型的小鼠中的体外功能测定和神经生理数据偶联揭示了TRPML3是灵长类动物(人)和非人灵长类动物、最可能其他动物的咸味受体，所述其他动物包括例如其他哺乳动物，诸如狗、猫、马、牛、猪、绵羊和其他脊椎动物。
[0146] 更具体地，如下文详述，本发明提供了候选咸味味觉基因(优选地离子通道)的原理和标准，其是：
[0147] a)在灵长类动物(猕猴)味觉细胞特别是真菌状和/或轮廓状乳头衍生的味觉细胞以及叶状和腭味觉细胞中特异表达，而不在舌上皮细胞表达，或者在味觉细胞中的表达水平高于舌细胞。
[0148] b)通过组织学方法的味觉细胞中的表达。具体地，在不表达甜味、苦味和鲜味细胞标志TRPM5或酸味细胞标志PKD2L1/PKD1L3的独特味觉细胞类型中表达。该独特细胞类型可能是专门的盐感受细胞。
[0149] c)在异源表达系统(诸如爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞)或初级神经元(诸如背根神经节神经元)中作为具有基本组成性功能(即部分通道群体开放并在静止时通过钠)的钠通道或钠活化受体的功能性表达。
[0150] 发明概述
[0151] 使用通过引用并入本文的早期临时专利申请中公开的鉴定味觉特异基因的新原理(其在与本申请同一天提交的相关申请中被要求保护)，本发明人鉴定了作为灵长类动物(人)咸味受体多肽起作用的味觉特异多肽，其很可能参与涉及钠转运、吸收和排泄的其他生理功能，诸如泌尿和心脏功能。
[0152] 特别地，本发明人鉴定了可选命名为黏脂3(MCOLN3)或TRPML3的基因，其编码在传导钠的味觉感受细胞的味蕾上部表达的多跨膜蛋白。各种证据有说服力地说明该多肽作为灵长类动物咸味受体多肽。
[0153] 具体地，该基因本身和/或与其他味觉特异多肽或离子通道(相关家族成员)诸如TRPML1、TRPML2、NALCN或NKAIN3一起代表咸味受体，其允许舌的味蕾的感受味觉细胞检测氯化钠(盐)。另外，因为该基因在肾上腺和垂体高表达，合理地预期其在调节机体的钠代谢中发挥积极作用。表明该基因为人咸味受体的证据包括至少以下：
[0154] (1)使用鉴定推测的味觉受体基因的新原理，本发明人确定MCOLN3在不表达TRPM5(即其不是甜味、苦味或鲜味)、不表达PKD2L1(即其不是酸味)并且朝向味孔的味觉感受细胞亚群的味蕾顶部特异表达。
[0155] (2)已知MCOLN3还在比如耳的其他器官的感受细胞中表达。因此，其是‘专业’的感受细胞。
[0156] (3)进一步已知MCOLN3在肾上腺强表达。这些腺体在调节机体的钠代谢中发挥非常重要的作用。因此，MCOLN3可能是调节钠代谢的关键分子，并且可调节肾上腺产生醛固酮。
[0157] (4)与前文相关，还已知人自身免疫病(爱迪生氏)的特征是肾上腺的破坏。该疾病的一个指示症状是盐渴求。后者可能产生于存在针对MCOLN3的自身抗体或破坏味蕾中MCOLN3功能的该基因的突变。
[0158] (5)还已知MCOLN3或TRPML3在产生参与尿液产生的血管加压素的垂体中高表达，这进一步证实了该基因在钠排泄和泌尿功能中可能的作用。
[0159] (6)如包含在下文实验实施例中的数据所证实，在电生理研究中MCOLN3传导钠并表现出预测的并与人咸味受体一致的生化特征(检测K+、Li+和阿米洛利不敏感性)。
[0160] (7)在varitint-waddler小鼠(具有TRPML3突变)中使用钠的神经生理实验(神经记录)表明Varitint小鼠对钠的响应受损(不表现强烈的咸味应答)。另外，已确认同样的这些小鼠被切除了表达TRPML3或MCOLN3的味觉细胞(咸味味觉细胞)，这进一步确定表达TRPML3的味蕾细胞的独特的味觉细胞亚群是有功能的，即它们是咸味感受的前提。
[0161] (8)使用表达突变TRPML3多肽(突变导致离子通道固定于“开放”取向)的哺乳动物细胞和两栖动物卵母细胞的基于细胞的测定鉴定了在咸味测试中应增强或阻抑咸味味觉的TRPML3增强剂和阻抑剂。
[0162] 该发现非常重要，因为鉴定MCOLN3或TRPML3为人和其他灵长类动物和啮齿类动物的咸味受体(并推测可能是其他哺乳动物或脊椎动物的咸味受体)允许设计使用该基因转染的细胞的筛选测定，用于鉴定该分子功能的激动剂、拮抗剂或增强剂(调节剂)的目的。这些化合物可用作味觉调节剂，并且也可用作用于治疗和调控心脏和泌尿相关功能和病况诸如高或低血压、中风、心脏病发作、心律不齐、液体潴留、异常钠和其他离子的代谢和排泄的治疗剂。
[0163] 如上文所示，该基因起初是使用旨在鉴定在人味蕾顶部特异表达的基因的全基因组策略发现的(参见临时申请，其通过引用并入本文，其鉴定TRPML3作为啮齿类动物和灵长类动物的味觉特异基因)。本发明人早期还从先前的实验确定味蕾顶部含有过量表达已知味觉受体基因和其他味觉特异基因(包括相似地在味蕾上半部分富集的钠离子通道TRPML3)的细胞。相反，味蕾的底部含有位于味蕾上部的感受味蕾细胞的前体细胞。该数据库允许本发明人鉴定许多味蕾顶部(感受)细胞特异表达的基因，包括TRPML3。
[0164] 在回顾鉴定的味觉特异基因时本发明人进一步指出这些基因之一(MCOLN3或TRPML3)先前报道负责称为varitint-waddler的小鼠突变体的表型，该小鼠表现为早发性听力损失、前庭缺陷、色素异常和围产期致死(Dipalma等，Mutations in Mcoln3 associated withdeafness and pigmentation defects in variant-waddler(Va)mice.(与variant-waddler(Va)小鼠的耳聋和色素沉着缺陷相关的Mcoln3突变)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：14994-14999；2002)。如发明背景中指出，MCOLN3或TRPML3在毛细胞和静纤毛(耳内)的质膜内表达，并且导致第五个跨膜结构域的ala 419变为pro的取代的突变特别报道导致高活性的MCOLN3，其引起表达该分子的细胞死亡，诸如耳的毛细胞(因此导致Va小鼠的耳聋)(Grimm C等，ProcNatl.Acad.Sci.USA 104：19583-8；2007)。
[0165] 基于本发明人阐明TRPML3作为灵长类动物和可能其他哺乳动物的咸味受体，进一步预测该小鼠也将表现出咸味味觉异常(由于异常MCOLN3分子及其在舌味蕾细胞中将可能损害咸味感受的影响)。事实上，本发明人已经证实了这一点。本发明人使用表达该突变TRPML3基因的小鼠(varitint小鼠)进行了神经生理研究(在下文实验实施例中描述)，并确认如希望和预期，这些小鼠表现出受损的对咸味刺激的应答(如以其中正常将观察到阳性神经记录应答的浓度用咸味刺激来刺激这些小鼠的神经记录结果所证明)。使用CT神经记录，显示Varitint waddler小鼠表现出对氯化钠应答的缺陷。具体地，Varitintwaddler小鼠的苄阿米洛利-不敏感CT神经对氯化钠的应答极大减弱了。
[0166] 本发明人还有分子和免疫组织化学数据揭示了同样的这些小鼠的味蕾切除了表达TRPML3的味蕾细胞。这确认了本发明人的推测：该独特的味觉细胞亚群参与检测咸味并且是咸味感受的前提。
[0167] 因此，本发明人有体内证据证实如下结论：功能性TRPML3离子通道在特定味觉细胞(“专业”咸味味觉细胞)中的存在是啮齿类动物和可能其他哺乳动物(包括最特别的人和其他灵长类动物)咸味感受的必要前提。
[0168] 另外，因为本发明人使用公共数据库已确定MCOLN3在肾上腺和垂体中强表达，这进一步支持了本发明人的发现以及表明该基因和特异地检测或靶向该基因和/或调控其功能的化合物的其他应用。该基因在肾上腺和垂体中表达的事实是关键的观察，因为肾上腺代表机体主要的钠代谢调节器之一。这些腺体监测血液的盐水平，并分泌通过帮助肾保留钠和排出钾来调节机体的血压及水盐平衡的醛固酮(盐皮质激素)。当醛固酮的产生下降太低时，肾不能调节盐水平衡，引起血容量和血压下降。
[0169] 垂体还产生血管加压素(AVP)，其是参与尿液中钠水平并在钠通过尿液排泄中发挥作用的激素。特别地，AVP的一个最重要的作用是调节机体滞留水；当机体脱水时，其被释放，并引起肾保留水，因此浓缩尿液并减少尿量。其还通过诱导适度的血管收缩来提高血压。
[0170] 另外，AVP增加了肾的肾单位中远曲小管和收集小管对水的通透性，因此允许水的重吸收和更小体积的浓缩尿液的排泄-抗利尿。这是通过另外的水通道(水通道蛋白-2)插入肾小管/收集管上皮细胞的顶端膜发生的。该水通道蛋白允许水通过肾单位(在远曲小管和传导小管)并进入细胞，这增加了从滤出液重吸收的水量。
[0171] AVP还增加了收集管的髓样部分对尿素的通透性，允许增加的尿素重吸收进髓样间质，降低了由去除皮质收集管中的水而产生的浓度梯度。此外，AVP的另一个肾的作用是其刺激汉勒腺的增厚环中钠的重吸收。因此，基于本发明人发现TRPML3参与咸味检测，不令人惊讶的是TRPML3在产生非常明显参与钠转运和排泄的多肽的两个腺体中表达，并且该基因除了参与咸味感受外还在调控涉及钠转运、吸收和排泄的其他过程，特别是由血管加压素或醛固酮调节的过程中发挥积极作用。
[0172] 因此，基于这些观察和阐明该基因作为咸味受体，本发明人进一步鉴定MCOLN3是关键的盐/钠监测分子，控制肾上腺中醛固酮的产生和/或调节垂体释放血管加压素。
[0173] 在舌中，如预期鉴定为检测咸味刺激的味觉受体的分子，MCOLN3或TRPML3由位于味蕾顶部负责检测咸味味觉的咸味感受细胞亚群表达。因此，本发明提供有力的证据证明MCOLN3或TRPML3在各种组织中检测和调节盐中的重要作用。
[0174] 尽管先前已报道MCOLN3是钠传导通道，存在许多钠离子通道多肽，并且该通道先前未被认为参与咸味感受或调节钠代谢、排泄、转运或涉及血管加压素和醛固酮的钠相关过程。因此本发明构成了新的意外的发现，因为其提供了已知基因(MCOLN3)的新的应用(咸味受体)。在垂体中，本发明人基于其发现和包含于本文证实TRPML3作为咸味受体的作用的数据进一步预期MCOLN3进一步可能参与调节血管加压素的释放。如提到，通过其对肾的影响血管加压素是尿液产生的关键调节子。重要地，已知血管加压素从垂体后叶的释放受NaCl浓度调节。该蛋白在垂体高表达。因此，基于其在垂体的表达，通过其对血管加压素释放可能的影响，TRPML3可能通过其对液体潴留、NaCl感受和浓度和血压的影响来调节机体的NaCl代谢。
[0175] 因此，在一个实施方案中，本发明鉴定了MCOLN3或TRPML3作为人咸味受体，并且基于此提供了使用该基因转染的细胞的筛选测定，用于鉴定该分子功能的激动剂、拮抗剂或增强剂(调节剂)，其将调控咸味味觉和其他味觉相关的TRPML3功能和非味觉相关功能，诸如涉及不同组织中钠排泄、代谢和转运以及诸如本文鉴定的与异常TRPML3表达相关的病理病况的功能。
[0176] 更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了分离和纯化的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞或泌尿器细胞或包含表达参与咸味感受、钠代谢、醛固酮产生、和/或血管加压素释放的TRPML3的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞或泌尿器细胞的富集的味觉细胞样品，其中所述分离的味觉细胞、肾上腺细胞、垂体细胞或泌尿器细胞或富集的味觉细胞样品表达编码调控咸味味觉、钠代谢、醛固酮产生和血管加压素释放的至少一种的钠通道的TRPML3基因或其变体。优选地，所述细胞将是人、非人灵长类动物或啮齿类动物来源。
[0177] 在另一个实施方案中，本发明还提供了调控咸味感受的分离的味觉受体，其包含用在用于鉴定TRPML3调节剂的测定中的TRPML3多肽或其变体和/或所述味觉受体多肽调控包括人的哺乳动物的咸味味觉。该味觉受体可以是单体或多聚体(同聚体或异聚体)，并且可包含其他味觉特异多肽，例如其他离子通道多肽，诸如NKAIN3或NALCN或诸如TRPML1或TRPML2的相关离子通道。该TRPML3多肽或核酸序列可以是哺乳动物或其他物种来源。如提到，考虑到钠代谢和排泄对有机体的体内平衡和健康的重要性，该基因及其各种物种的直向同源物可能在不同哺乳动物和可能其他脊椎动物(诸如爬行动物、两栖动物和禽)的咸味感受以及盐(钠)代谢和排泄中发挥作用。
[0178] 根据本发明TRPML3基因可以是野生型的，或者可以被遗传改造为引入影响(增强或抑制)离子通道功能和/或固定离子通道处于开放或关闭取向的需要的突变。其也可由宿主优选密码子修饰。此类突变示例于本文，本领域技术人员将能使用本领域已知的方法设计其他突变。因此，应理解，本文中TRPML3多肽可以相对于天然TRPML3多肽被修饰，并且可与天然TRPML3多肽或功能片段具有80、85、90、95、96、97、98、99或更高的序列同一性。另外，该TRPML3多肽可包含嵌合的离子通道，即其中内源TRPML3离子通道的一个或多个结构域或区域被相关(例如直向同源物)离子通道、同一TRPML家族的离子通道(TRPML1或TRPML2)或例如另一个钠通道(诸如NALCN或NKAIN3)的另一个离子通道的对应结构域或区域取代。
[0179] 这些嵌合体可基于已知的TRPML3蛋白拓扑结构来构建。该拓扑结构图示于以下。
[0180]
[0181] 该图示中，跨膜结构域列为1至6。氨基(N)和羧基(C)在细胞内。另外，在位于细胞外的TM1和TM2之间存在一个大的胞外环。有功能(仍响应于钠)的嵌合体可例如潜在地通过用另一个TRPML3或另一个离子通道多肽的胞外环区域取代横跨TM1和TM2的胞外环区域、或者通过用另一个离子通道的对应TM取代TM来构建。嵌合体还可在人和小鼠TRPML3之间制备，其中TM1和TM2之间的大胞外环被交换。
[0182] 孔区和TM5周围的残基也可潜在地例如由其他离子通道的对应残基修饰。
[0183] 基于来自人(NM_018298)和小鼠(NM_134160)TRPML3序列的蛋白序列的比较和比对(图35)，其中人表示为Hs，小鼠表示为Mm，可以发现这些蛋白的91％是相同的，96％是相似的。这证实了本发明人的推测(合理的)：考虑到其调控的重要生理功能，TRPML3在不同哺乳动物和潜在地其他脊椎动物中可能非常保守，并且可构建有功能的嵌合体和突变体。事实上，该申请含有权利要求之前的序列表中禽类和鱼类TRPML3基因的序列。使用这些和其他TRPML3基因作为探针可鉴定其他直向同源物。
[0184] 图(图35)中的比对相似地显示了人和小鼠TRPML3的TRPML3多肽的6个跨膜结构域是加下划线的TM1至TM6。TM5和TM6之间的孔区表示为‘孔区’。如上文图示，预测氨基和羧基末端位于细胞内。构建突变体时，需要保持孔区的残基完整或者修饰非常少的残基，如果存在这些修饰对应于存在于其他TRPML3多肽孔区的残基或TRPML1或TRPML2孔区的对应残基。
[0185] 本文讨论的和发现于varitint-waddler小鼠中的A419P突变锁定TRPML3处于开放构象，并且其位于TM5，在图35中突出显示。
[0186] 如下文实施例讨论和显示，该突变用在TRPML3调节剂(阻抑剂)的测定中，特别可用在FLIPR测定中。另一个突变V412P部分激活TRPML3，以红紫色表示。该突变增强了TRPML3的活性，并且可用来在FLIPR测定中筛选增强剂。其他突变潜在地也可在TM5和孔区周围产生以便改变TRPML3离子通道的活性和产生可用于高通量筛选的活性通道。
[0187] 本发明一般使用包括使用野生型或突变的TRPML3多肽或者其中密码子根据其中表达发生的宿主细胞(例如人细胞)进行了优化的TRPML3多肽的测定。然而，在一些实例中，需要通过消除TRPML3多肽的表达来确定体内TRPML3的所有影响。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种转基因非人动物，其被遗传改造为敲除了内源TRPML3的表达或表达无功能的TRPML3多肽。
[0188] 在另一个实施方案中，本发明还提供了一种转基因非人动物，其被遗传改造为表达异源TRPML3多肽或突变或嵌合的TRPML3多肽，以便可筛选该动物来鉴定所述异源TRPML3多肽的调节剂，例如人或其他灵长类动物TRPML3或家养动物(狗、猫等)的TRPML3。
[0189] 在另一个实施方案中，本发明还提供了使用表达突变或异源TRPML3的转基因动物在鉴定TRPML3的拮抗剂、激动剂或增强剂的筛选中的测定方法(以便筛选该动物来鉴定突变或异源TRPML3多肽的调节剂)。
[0190] 在相关的实施方案中，本发明还产生了含有Varitint-小鼠中发现的TRPML3突变或其他功能等效突变的转基因动物，以便产生去除了特定类型表达TRPML3的细胞(诸如咸味味觉细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、黑色素细胞或泌尿器系统细胞)的转基因动物，以及研究这些动物中这些细胞切除的影响，或使用这些动物作为涉及这些切除细胞的病况的疾病模型。
[0191] 在另一个实施方案中，本发明还提供了使用根据其中TRPML3基因被“切除”的转基因动物的方法，以便阐明TRPML3对味觉和对心脏或泌尿功能，特别是对醛固酮产生、钠代谢、咸味感受或血管加压素释放的影响。
[0192] 而且，因为TRPML3敲除应产生涉及异常钠转运、吸收和排泄以及相关泌尿或心血管影响的病况或异常，这些转基因动物潜在地也可用作这些病况的模型，并用于测试潜在的治疗剂和治疗方案。
[0193] 在更具体的实施方案中，本发明还提供了使用Varitint waddler小鼠来研究在缺少TRPML3味觉细胞时的咸味味觉行为。
[0194] 在更具体的实施方案中，本发明还涉及使用Varitint waddler小鼠来检测TRPML3功能对黑色素细胞、垂体、肾上腺、味觉、泌尿或味觉细胞的影响。
[0195] 在更具体的实施方案中，本发明还涉及在检测在咸味味觉细胞中特异表达并且不在Varitint waddler小鼠中表达(因为其中切除了咸味味觉细胞)的基因的测定中使用Varitint waddler小鼠，所述基因可调控TRPML3的功能，或作为咸味受体起作用或调控咸味味觉信号从TRPML3向神经纤维的传输和/或控制咸味味觉细胞的发育分化或凋亡。这些基因检测测定可包含使用基因芯片或微阵列技术来比较在咸味味觉细胞中表达的基因与在Varitint waddler小鼠中表达的基因。
[0196] 在更具体的实施方案中，本发明还提供了治疗甲状旁腺相关疾病的方法，诸如钙体内平衡、高血钙、骨炎、甲状旁腺功能减退、甲状旁腺功能亢进、囊状纤维性骨炎、假性甲状旁腺功能减退、Jansen干骺端软骨生成、Blomstrand软骨生成和不同原因的骨质疏松，所述原因诸如疾病、年龄、绝经、化疗、辐射治疗、药物和类似原因。
[0197] 在另一个实施方案中，本发明还提供了表达咸味受体的重组细胞，其包含编码钠离子通道多肽的TRPML3或其变体。
[0198] 在另一个实施方案中，本发明还提供了使用A419P TRPML3多肽作为毒素来杀死表达TRPML3的特定的细胞类型，例如咸味味觉细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、黑色素细胞和/或泌尿系统细胞。
[0199] 在另一个实施方案中，本发明还提供了特异结合TRPML3的标记分子研究机体的钠转运、代谢或排泄的应用。
[0200] 在另一个实施方案中，本发明还提供了特异结合TRPML3的分子引导治疗剂或诊断剂至特定位点(例如咸味味觉细胞、肾上腺细胞、黑色素细胞、垂体细胞等)的应用。
[0201] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定激动、拮抗或增强TRPML3活性的化合物的测定，其包括表达TRPML3的重组或内源味觉或其他细胞与推测的TRPML3增强剂、激动剂或拮抗剂接触和确定其对TRPML3活性的影响。优选地，这些测定将是电生理测定，例如，膜片钳或二电极电压钳测定。
[0202] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了用于通过离子流测定来鉴定TRPML3调节剂的方法。
[0203] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了其中鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物在味觉测试中被评估的此类TRPML3测定。
[0204] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了其中鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物对醛固酮产生的影响在动物中被测试的此类TRPML3测定。
[0205] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了其中鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物对血管加压素释放的影响在动物中被测试的此类TRPML3测定。
[0206] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了其中鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物对心脏或泌尿功能和更具体地对血压、液体潴留、钠代谢或尿液产生的至少一种的影响在动物中被测试的此类TRPML3测定。
[0207] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于治疗涉及醛固酮产生的疾病或病况的应用，其包括施用有效量调控TRPML3的化合物。
[0208] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于治疗涉及血管加压素释放的疾病或病况的应用，其包括施用有效量调控TRPML3的化合物。如提到，作为实例这些病况包括可使用激动或拮抗血管加压素的TRPML3调节剂治疗的疾病和病况，诸如糖尿病、肥胖、诸如囊性肾病、获得性囊性肾病的肾病、诸如近视的眼循环相关疾患；恶心、呕吐、性功能障碍(男性或女性)、水肿、高血压、充血性心力衰竭(范围从纽约心脏学会的II类至红润肺水肿)、周期性自发性水肿、肾病综合征、由肝硬化或其他原因引起的腹水、各种原因的脑水肿，以及稀释性低钠血症和统称为ADH不适当分泌综合征的代谢改变和其中治疗上需要血管舒张和/或抗催产活性的其他疾病或病况。
[0209] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于治疗涉及醛固酮产生的疾病或病况的应用，其包括施用有效量调控TRPML3因此调控醛固酮的化合物。可使用激动或拮抗醛固酮因此激动或拮抗钠转运和排泄的TRPML3调节剂治疗的疾病和病况包括例如水肿、血压(高或低血压)、肝硬化、原发性高醛固酮血症、肾功能障碍、糖尿病(I或II型)和与其相关的病理症状，包括循环问题、水肿、与循环差相关的眼病、高可的松血症、动脉粥样硬化或例如腹型肥胖的肥胖，以及肝病、性功能障碍(男性或女性)、脑血管疾病、血管疾病、视网膜病变、神经病、胰岛素病、内皮功能障碍、压力受体功能障碍、偏头痛、潮热和经前期紧张以及其他心血管病况，诸如动脉粥样硬化、心力衰竭、充血性心力衰竭、血管疾病、中风、心肌梗死、内皮功能障碍、心室肥厚、肾功能障碍、靶器官损伤、血栓形成、心律不齐、斑块破裂和动脉瘤。
[0210] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于治疗涉及TRPML3的疾病或病况(诸如爱迪生氏病或IV型黏脂沉积)的应用。
[0211] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于调控有相应需要的受治疗者的心脏功能(例如血压、心律不齐或中风或液体潴留)的应用，其包括施用有效量调控TRPML3的化合物。
[0212] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了此类鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于调控有相应需要的受治疗者的尿液产生和/或排泄的应用，其包括施用有效量调控TRPML3的化合物。
[0213] 同样更具体地，另一个实施方案提供了例如增强剂、激动剂或拮抗剂的TRPML3调节剂用于治疗涉及黑色素细胞的病况(诸如黑色素瘤和色素沉着紊乱)和促进例如由于疾病、衰老、UV辐射、化疗或激素失衡而脱色的毛发或皮肤的生长或着色的应用。
[0214] 同样更具体地，另一个实施方案提供了例如增强剂、激动剂或拮抗剂的TRPML3调节剂用于治疗涉及垂体细胞的病况(诸如垂体癌或糖尿病或垂体疾病)的应用。
[0215] 同样更具体地，另一个实施方案提供了例如增强剂、激动剂或拮抗剂的TRPML3调节剂用于治疗涉及肾上腺细胞的病况(诸如肾上腺癌或其他肾上腺病况)的应用。
[0217] 同样更具体地，在另一个实施方案中，本发明提供了此类鉴定的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物用于味觉和治疗性应用，其可包括多肽、抗体、小分子、siRNA、反义RNA、核酶等。
[0218] TRPML3作为咸味受体的发现部分基于人咸味味觉可部分地由在味觉细胞中特异表达的钠或其他离子通道以及转运子和GPCR介导的假说。使用这些基因产物及其衍生物鉴定的调控这些靶基因活性的化合物潜在地可用作用于人消耗的食物、饮料和药物中人咸味味觉的调节剂。此类化合物及其衍生物潜在地还可用来治疗涉及异常离子通道功能的疾病。进一步使用根据本发明鉴定的基因和表达该基因的细胞鉴定的化合物用在用于鉴定调控其他味觉细胞相关功能和表型的潜在治疗剂的如本文讨论的治疗剂筛选测定中。
[0219] 基于其在发现于舌前部的灵长类动物真菌状乳头味觉细胞中和发现于舌后部的轮廓状乳头味觉细胞中的选择性表达，使用味觉受体细胞的基因芯片微阵列与通过激光捕获显微解剖(LCM)分离的非味觉舌上皮细胞相比，本发明人认为该基因是重要的。这一方案还鉴定了两个在味蕾的上半部分富集的其他味觉特异的离子通道NKAIN3和NALCN。由于咸味感受在舌前部最普遍，预测咸味受体基因包含于这套鉴定的基因中。(据整个说明书所述，本发明人鉴定了“一个人或哺乳动物咸味受体”而不是“该人或哺乳动物咸味受体”，因为可以想到人或其他哺乳动物中调节咸味味觉和钠代谢的基因存在一些冗余。
[0220] 该基因起初被鉴定为推测参与哺乳动物咸味味觉的味觉特异离子通道多肽。该方案包括步骤(i)鉴定一套基因，其包括在猕猴味觉细胞(真菌状和轮廓状乳头味觉细胞)中表达，但不在舌上皮细胞中表达的基因和/或在味觉细胞中的表达水平显著高于在舌细胞中的表达水平的基因；(ii)在(i)中鉴定的一套基因中鉴定基因亚群，其是基于表明其可能是咸味受体候选(即推测的离子通道)和/或编码多结构域跨膜蛋白的标准选择的。然后检查这些基因来确定这些基因在表达鲜味、甜味或苦味味觉受体(TIR或T2R)或酸味味觉受体(PKD2L1/PKD1L3)的味觉细胞中表达还是不表达；和(iii)功能地表达根据(ii)鉴定的亚群中的一个或多个基因并确定这些基因中哪些作为钠响应离子通道或钠响应受体或转运子起作用，因此鉴定该基因作为调控咸味味觉的推测基因。用于该方法的味觉组织一般来自人、灵长类动物或啮齿类动物来源。在本方法的一个优选实施方案，步骤(iii)的基因作为钠响应离子通道起作用，更优选地当这些基因表达时，通道群体的部分开放并且在静息时通过钠。
[0221] 在优选实施方案中，步骤(i)包括使用激光捕获显微解剖(LCM)来从非味觉组织解剖和纯化味觉组织。在本实施方案的一个模式中，步骤(i)包括从味觉细胞和舌细胞对基因进行RNA扩增，扩增的基因用含有特异于获得味觉和舌状组织的特定哺乳动物的基因样品的基因芯片进行筛选，并且优选地基因芯片包括一套注释的人基因。在本实施方案的一个可选模式中，步骤(i)包括使用针对哺乳动物基因组每个离子通道的引物的高通量PCR。
[0222] 在另一个优选实施方案中，通过使用特异于步骤(i)中鉴定的一套基因的反义RNA探针的原位杂交来进行步骤(ii)以便确定在味觉细胞与舌细胞中的表达水平。在可选的优选实施方案中，通过使用特异于步骤(i)中鉴定的基因编码的蛋白的标记抗体的免疫化学检测来进行步骤(ii)。
[0223] 在用于鉴定编码涉及哺乳动物咸味感受的多肽的基因的方法的另一个实施方案中，本发明的方法包括步骤(i)鉴定一套猕猴基因，其包括在味觉细胞中表达，但不在舌细胞中表达的基因和/或在味觉细胞中的表达水平显著高于在猕猴舌细胞中的表达水平的基因；(ii)在(i)中鉴定的一套基因中鉴定基因亚群，其不在表达鲜味、甜味或苦味味觉受体(TIR或T2R)或酸味味觉受体(PKD2L1/PKD1L3)的味觉细胞中表达；和(iii)在表达根据(ii)鉴定的亚群中一个或多个基因的初级神经元中确定所述基因中哪些作为钠响应离子通道或钠响应受体或转运子，因此鉴定该基因作为推测的调控咸味味觉的基因。在本实施方案的一个模式中，步骤(iii)包括神经元与特异结合该基因并抑制其活性的抗体接触。
[0224] 在另一个通用模式中，本发明提供了用于鉴定具有调控人咸味味觉的潜在体内应用的化合物的测定。该方法包括步骤(i)表达编码离子通道、受体或转运子、根据上文任一种方法鉴定为推测的影响咸味味觉的基因的基因或者编码与其编码的多肽具有至少90％序列同一性的多肽的基因的细胞与至少一个推测的增强剂化合物接触；(ii)在所述推测的增强剂存在和不存在时测定钠传导、受体活性或钠转运；和(iii)基于其是否增强钠传导、所述受体的活性或钠转运来鉴定该化合物作为潜在的咸味味觉增强剂。在各种实施方案中，该基因编码离子通道，或者该基因编码GPCR。优选地，该基因是人基因。更优选地，该方法还包括测试该化合物或其衍生物在人或动物味觉测试中的作用。优选地，选择的化合物促进钠离子转运到味蕾细胞中。推测的影响咸味味觉的基因可在两栖动物卵母细胞或哺乳动物细胞，优选地爪蟾卵母细胞或选自由HEK293、HEK293T、Swiss3T3、CHO、BHK、NIH3T3、猴L细胞、非洲绿猴肾细胞、Ltk-细胞和COS细胞组成的组的哺乳动物细胞中表达。优选地，推测的影响咸味味觉的基因的表达是在可调节启动子的控制下。推测的影响咸味味觉的基因可稳定地或瞬时地表达。在优选模式中，影响咸味味觉的基因是TRPML3。
[0225] 在优选模式中，步骤(ii)的测定是使用钠敏感染料的电生理测定，优选的染料包括选自由以下组成的组的膜电位染料：MolecularDevices膜电位试剂盒(目录号R8034)、Di-4-ANEPPS(4-(2-(6-(二丁氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1-(3-磺丙基)氢氧化吡啶，内盐、DiSBACC4(2)(双-(1，2-二巴比妥酸)-三乙炔氧烯洛尔)、Cc-2-DMPE(太平洋蓝1，2-二肉豆蔻酰-sn-丙三醇-3磷酸乙醇胺，三乙铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸(benzenedicrboxylicacid)，4，4-[1，4，10-三氧杂-7，13-二氮杂环十五烷(cylopentadecane)-7，13-二基双(5-甲氧基-6，1，2-苯并呋喃二基)}双-四{(乙酰氧)甲基}酯(MolecularProbes)，更优选地，该钠敏感染料是四乙酸钠绿(Molecular Probes)或Na-敏感染料试剂盒(Molecular Devices)。在另一个优选模式中，步骤(ii)的测定是爪蟾卵母细胞中的二电极电压钳测定，或者该测定是哺乳动物细胞中的膜片钳测定。优选地，该测定通过离子流测定来测量活性，包括使用原子吸收光谱来检测离子流。
[0226] 可选地，该测定可使用荧光板读数器(FLIPR)、或电压成像平板读数器(VIPR)，其用来增强依赖于离子通道的钠或液体吸收。在本方法的优选实施方案中，推测的影响咸味味觉的基因的活性在青蛙卵母细胞中通过二电极电压钳电生理地测定，或者在哺乳动物细胞中优选地使用可以是荧光板读数器(FLIPR)或电压成像平板读数器(VIPR)或膜片钳的自动成像仪器测定。
[0227] 在另一个模式中，本发明提供了用于鉴定具有调控人甜味、苦味、鲜味或酸味味觉的潜在体内应用的化合物的测定。该方法包括步骤(i)表达根据本发明鉴定的基因的细胞与至少一个推测的增强剂或阻抑剂化合物接触；(ii)在所述推测的增强剂或阻抑剂存在和不存在时测定钠传导、受体活性或味觉基因产物功能；和(iii)基于其是否调控钠传导、所述受体的活性或味觉基因产物的功能来鉴定该化合物作为潜在的甜味、苦味或鲜味味觉增强剂或阻抑剂。
[0228] 在另一个模式中，本发明提供了用于鉴定具有作为潜在治疗剂的潜在体内应用的化合物的测定。该方法包括步骤(i)表达根据本发明鉴定的基因的细胞与至少一个推测的增强剂或阻抑剂化合物接触；(ii)在所述推测的增强剂或阻抑剂存在和不存在时测定钠传导、受体活性或味觉基因产物功能；和(iii)基于其是否调控钠传导、所述受体的活性或味觉基因产物的功能来鉴定该化合物作为可用来调控不直接涉及味觉的味觉细胞相关功能或表型诸如消化疾患或疾病、味觉细胞或味蕾周转或再生、口腔或消化系统的免疫调节或治疗代谢紊乱(诸如糖尿病、肥胖、进食障碍等)的潜在治疗剂。
[0230] 图1含有揭示TRPML3是味觉特异基因的RT-PCR数据。该实验中，使用通过激光捕获显微解剖收集的人(左侧)和猴(右侧)味蕾(味觉)和舌上皮细胞(舌)样品进行RT-PCR。可以发现TRPML 3只在味觉细胞中表达，与已知味觉特异基因T1R2和TRPM5相似。
管家基因β-肌动蛋白在味觉和舌细胞中都表达，表明两个样品的RNA都是高质量的。‘+’表明进行了反转录，‘-’表明没有进行反转录(阴性对照)。只有进行了反转录才能观察到条带。所有条带被克隆并测序以便确认基因的身份。
管家基因β-肌动蛋白在味觉和舌细胞中都表达，表明两个样品的RNA都是高质量的。‘+’表明进行了反转录，‘-’表明没有进行反转录(阴性对照)。只有进行了反转录才能观察到条带。所有条带被克隆并测序以便确认基因的身份。
[0231] 图2含有显示TRPML3形成钠通道的电生理实验。对表达人TRPML3的细胞进行全细胞膜片钳电生理。这些实验的结果揭示TRPML3产生钠泄漏电流，其在去除钠并用大的不透过阳离子NMDG替换时被阻抑。图2中顶部的迹线显示-60mV保持电位下的电流。图中中间的迹线显示在存在钠(NaCl)和不存在钠(NMDG-Cl)时从-100mV至+60mV的电流-电压迹线。图2中底部的图显示在钠存在(深蓝色线；菱形)和不存在(红紫色线；方形)时的电流电压曲线。可以看出TRPML3表现出向内的整流(与正电压相比负电压下更高的电流)。
[0232] 图3含有表明人TRPML3通道特性与人咸味味觉的心理物理学一致的其他电生理实验结果。图3的上图含有显示TRPML3的钠传导(深蓝色线；菱形)不受30uM阿米洛利(红紫色线；方形)阻抑的电流-电压曲线。人咸味味觉和TRPML3都不受阿米洛利的阻抑。同一图的下图含有显示TRPML3均等地可透过盐阳离子钠(深蓝色线；菱形)和锂(红紫色线；方形)的电流-电压曲线。考虑到已知钠和锂对人是均等地咸的事实(因为两种阳离子均等地渗透人TRPML3通道)，这一结果与TRPL3是人咸味受体一致。
[0233] 图4含有显示TRPML3蛋白在味孔附近的顶端膜区域表达的实验。可以看出TRPML3抗体标记延伸至味孔的味觉细胞过程(左图)。面向唾液的顶端味蕾结构域的放大清楚地说明了TRPML3蛋白在味孔区域表达(3个右图；味孔用蓝色箭头表示)。这一观察也与TRPML3是人咸味受体一致，因为这一位置理想地适合TRPML3感受唾液中的钠。与TRPML3相似，其他已知的味觉受体(甜味、苦味、鲜味和酸味)也向在其中其品尝唾液中其需要的味元的味孔极化。
[0234] 图5含有表明TRPML3蛋白不在TRPM5细胞中表达的免疫化学双标记实验的数据。该图显示猴CV乳头中用TRPM5(绿色；左图)和TRPML3(红色；中图)双标记的免疫组织化学结果。可以看出该图中表达TRPM5和TRPML3的细胞是不同的(右侧是合并的图)。这些数据表明TRPML3不在TRPM5细胞(包含甜味、苦味和鲜味细胞)中表达，而是专门在专业咸味味觉细胞中表达。
[0235] 图6含有另一个免疫化学双标记实验的数据。包含于图6中的数据揭示TRPML3蛋白不在PKD2L1细胞中表达。该图含有在猴CV乳头中用PKD2L1(绿色；左图)和TRPML3(红色；中图)双标记的免疫组织化学结果。从图中可以看出表达PKD2L1和TRPML3的细胞是不同的(右侧是合并的图)。这些数据表明TRPML3不在PKD2L1细胞(包含酸味细胞)中表达，而是在专业的咸味味觉细胞中表达。
[0236] 图7说明了用人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞的I/V曲线的实例。
[0237] 图8说明了筛选含人TRPML3 cRNA卵母细胞中可调控TRPML3活性的化合物的实例。
[0238] 图9说明了使用TRPML3阻抑剂钆的I/V曲线的实例。
[0239] 图10是在卵母细胞表达系统中使用二电极电压钳来检查化合物对人TRPML3活性的影响的实验流程图。
[0240] 图11说明了组成性活性钠通道的表达增强了加载有特定膜电位染料的细胞中的基底荧光。
[0241] 图12说明应用钆降低了表达A419P-TRPML3的细胞中基底荧光的增强。
[0242] 图13说明应用钆以依赖于剂量的方式降低了表达A419P-TRPML3的细胞中基底荧光的增强。
[0243] 图14说明TRPML3质粒的滴定。
[0244] 图15说明钆的影响特异于TRPML3。
[0245] 图16说明用编码A419P-TRPML3的杆状病毒转导HEK293细胞加倍了测定窗口。
[0246] 图17是使用表达A419P-TRPML3的细胞获得的筛选数据的实例。
[0247] 图18是使用表达A419P-TRPML3的细胞进行的10,000个化合物小规模筛选的概述。
[0248] 图19显示人TRPML3的野生型(非密码子优化)和密码子优化的DNA序列的比对，这些DNA序列是76.4％相同的。野生型(非密码子优化)、密码子优化和A419P TRPML3在卵母细胞中表达，并测量钠电流。
[0249] 图20：人野生型(非密码子优化；用蓝色菱形标记WT)、密码子优化(用粉色方形标记WT-CO)和A419P(用黄色三角标记突变体)TRPML3 cRNA的功能性表达。由超极化电位(更负电位)下更强的电流和去极化电位(更正电位)下更弱的电流表示的向内整流的I/V曲线表明TRPML3离子通道的功能性表达。应注意与无密码子优化的野生型TRPML3相比，密码子优化TRPML3和A419P TRPML3观察到增加的电流。
[0250] 图21：筛选用密码子优化的人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞以便鉴定活化TRPML3的化合物(TRPML3增强剂)的实例。在多个卵母细胞中，TRPML3增强剂将TRPML3活性增强了169+/-26％(顶部的代表迹线)，而对没有TRPML3表达的未注射卵母细胞没有影响(底部的代表迹线)。仅加入缓冲液对TRPML3电流没有影响，并且一旦第二次应用，TRPML3增强剂的影响是可再现的。
[0251] 图22：TRPML3增强剂对TRPML3 I/V曲线影响的实例。用密码子优化的人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞未经处理(蓝三角标记对照)或用TRPML3增强剂刺激(红紫色方形标记增强剂)，在从-90mV至+30mV的电压下测量电流。应注意TRPML 3增强剂在负电压下激活TRPML3电流(增强剂与对照相比向内电流更大)，导致I/V曲线斜率的增加。还应注意零电流向右漂移，暗示在增强剂存在时增强的钠传导。
[0252] 图23：在胞外钠存在和不存在时TRPML3增强剂影响的实例。表达密码子优化的人TRPML3 cRNA的卵母细胞用NMDG(没有钠)、TRPML3增强剂外加钠、仅缓冲液或TRPML3增强剂外加NMDG(没有钠)刺激。应注意在钠存在时TRPML3增强剂增强了TRPML3的活性，但在钠不存在时没有影响。这些数据说明TRPML3增强剂开放了TRPML3通道，并增加了钠离子流入卵母细胞。
[0253] 图24：WT TRPML3的表达水平取决于哺乳动物的细胞类型。A.表达WT和HEK293细胞中A419P突变体TRPML3通道的细胞的电流电压分析(I/V图)。A419P突变体TRPML3通道表达大的向内整流电流(粉色)，然而只观察到小的WT TRPML3电流(蓝色)。B.WT和A419P突变体TRPML3通道在CHO细胞中具有相似的功能特征。
[0254] 图25：TRPML3用于CHO细胞中增强剂和阻抑剂筛选的应用。A.CHO细胞中瞬时表达的WT人TRPML3通道用来鉴定通道增强剂。I/V图显示与单独的缓冲液相比(蓝色；对照)，使用增强剂导致负电位下向内电流的增强(粉色)。B.CHO细胞中稳定表达的突变体A419P TRPML3通道用来鉴定通道阻抑剂。与单独的缓冲液相比(蓝色；对照)，加入1mM GdCl3(氯化钆)导致向内电流的减弱(粉色)。
[0255] 图26：密码子优化的WT TRPML3用于筛选增强TRPML3功能的化合物的应用。A.非密码子优化的WT TRPML3的瞬时表达(浅蓝色)导致HEK293细胞中很小的电流。相反，使用密码子优化的WT TRPML3(深蓝色；Cod Opt WT)导致与A419P突变体通道具有相似平均强度的电流(粉色)。B.使用杆状病毒转导递送的密码子优化的WT TRPML3(蓝色)导致与A419P TRPML3相似的平均电流(粉色)。C.用密码子优化的WT TRPML3杆状病毒转导的细胞用来鉴定TRPML3功能的增强剂。与单独的缓冲液相比(蓝色；对照)，加入增强剂化合物导致向内电流的增加(粉色)。
[0256] 图27：WT和A419P TRPML3共同表达增加了HEK293细胞中的功能性表面表达。A.A419P TRPML3 cDNA(0.5ug)引发的电流转染到HEK293细胞中，产生具有特征性向内整流的电流。B.WT非密码子优化的TRPML3(1.5ug)在HEK293细胞中表达，并且不产生电流。
C.A419P(0.5ug)与WT(1.5ug)TRPML3 cDNA在HEK293细胞中共同表达导致是当仅表达A419P cDNA时两倍大的向内电流。D.在HEK293细胞中WT(蓝色)、A419P(粉色)和WT和A419P共表达(黄色)TRPML3cDNA引发的平均电流的I/V图。
C.A419P(0.5ug)与WT(1.5ug)TRPML3 cDNA在HEK293细胞中共同表达导致是当仅表达A419P cDNA时两倍大的向内电流。D.在HEK293细胞中WT(蓝色)、A419P(粉色)和WT和A419P共表达(黄色)TRPML3cDNA引发的平均电流的I/V图。
[0257] 图28含有IonWorks PPC膜片板中TRPML3功能的实例。A，具有A419 TRPML3可诱导克隆的PPC膜片板的所有384孔的视图，其显示化合物前扫描的结果。黄色表明其中-120mV下的电流≤0nA的孔(在具有亲本CHO-K1细胞的对照实验中没有孔被标记为黄色)。蓝色表明其中平均密封太低(＜10mOhm)以致不能可靠地测量电流的孔。可在94％的孔中测到A419P TRPML3电流。B，来自A中显示的膜片板的加入4mM GdCl3或胞外缓冲液(模拟添加)之前和之后的平均电流±SEM。GdCl3被加到柱1-38上，而胞外缓冲液被加到柱39-48上。为了比较，包含了来自使用亲本CHO-K1细胞的单独实验。模拟添加之后TRPML3电流的稳定性表明该测定应检测增强或阻抑TRPML3电流的化合物。
[0258] 图29含有使用表达A419P TRPML3的可诱导CHO-K1细胞系的IonWorks扫描的实例(上图)。超极化电位(更多负电位)下更多电流和去极化电位(更多正电位)下更少电流指示TRPML3向内整流。加入GdCl3阻抑了TRPML3电流。红线表示在钠(NaCl)溶液中的扫描。蓝线表示在4mM GdCl3溶液中的扫描。中图是来自亲本CHO-K1细胞，用作阴性对照。负电位下的正电流是由于负电位下过度纠正电流的泄漏差减。下图显示用来记录电流的电压指令方案。从0mV至10mV的等级用来计算泄漏电流(通过密封泄漏流经的电流)，从总电流中减去泄漏电流得到流出膜的电流。结果来自PPC膜片板中的单个孔，并且代表达64个细胞的平均电流。
[0259] 图30含有用来在IonWorks测定中检查化合物对TRPML3(hTRPML3)活性影响的实验流程图。
[0260] 图31显示在Varitint waddler小鼠中TRPML3细胞被特异地从味蕾切除。对通过激光捕获显微解剖分离的Varitint waddler(Va)或野生型(WT)小鼠的味蕾(TB)和舌上皮细胞(LE)进行终点RT-PCR实验。TRPML3只在WT小鼠的味蕾中表达而在Va小鼠的味蕾中缺乏，而所有其他味觉基因(T1R2、GPR113、TRPM5)以及管家基因(β-肌动蛋白、GAPDH)均等地在TB和LE中表达。‘+’表明进行了反转录，‘-’表明没有进行反转录。只有使用反转录酶才能观察到PCR条带，暗示PCR产物来自mRNA而不是基因组DNA。
[0261] 图32还通过使用实时PCR显示在Varitint waddler小鼠中TRPML3细胞被特异地从味蕾切除。对通过激光捕获显微解剖分离的Varitint waddler(Va)或野生型(WT)小鼠的味蕾(TB)进行实时定量RT-PCR实验。TRPML3只在WT小鼠的味蕾中表达而在Va小鼠的味蕾中缺乏(使用两个不同的引物对标记的Mcoln3_1和Mcoln3_2获得相似的结果)，而所有其他味觉基因(Tas1r2、Tas1r3、PKD211、TRPM5、Plcb2、Tas2r108和Tas2r116)以及管家基因(对照)在Va和WT小鼠的味蕾中表达。
[0262] 图33含有显示甜味、鲜味、苦味和酸味细胞在Varitint-waddler小鼠的味蕾中是完整的实验。来自野生型(图的上排)和Varitintwaddler(Va；图的下排)小鼠舌后部的轮廓状乳头的原位杂交。PKD1L3(左侧；酸味)、PKD2L1(中间；酸味)和TRPM5(右侧；甜味、苦味、鲜味和GPR113)味觉细胞以相似的水平存在于野生型和Va小鼠中。
[0263] 图34含有证明Varitint waddler小鼠缺乏咸味味觉的CT神经记录实验。来自野生型(左侧)或Varitint waddler(Va；右侧)小鼠的CT神经记录。用0.1M NaCl或0.1M NaCl外加5uM苄阿米洛利刺激前部的舌以便抑制CT神经响应的阿米洛利敏感组分。
在NaCl刺激中间，用含有10mM KCl的低盐溶液冲洗舌。应注意CT神经响应的苄阿米洛利不敏感组分在Va小鼠中被大量消除了(红色箭头)，暗示切除TRPML3味觉细胞显著损害了咸味感受。另外，在Va小鼠中(红色圆圈)对NaCl的即时相位应答被极大地减弱了。比例尺表明盐应用的时间框(x-轴)和CT应答强度(y-轴；任意单位)。
在NaCl刺激中间，用含有10mM KCl的低盐溶液冲洗舌。应注意CT神经响应的苄阿米洛利不敏感组分在Va小鼠中被大量消除了(红色箭头)，暗示切除TRPML3味觉细胞显著损害了咸味感受。另外，在Va小鼠中(红色圆圈)对NaCl的即时相位应答被极大地减弱了。比例尺表明盐应用的时间框(x-轴)和CT应答强度(y-轴；任意单位)。
[0264] 图35含有人和小鼠TRPML3基因和多肽的序列比对。鉴定了跨膜结构域、胞外环和孔区，以及导致Varitint waddler小鼠的残基(419)。
[0265] 发明详述
[0266] 本发明涉及鉴定调节哺乳动物和潜在地其他脊椎动物(例如禽、爬行动物和两栖动物)咸味感受的基因。该基因TRPML3或MCOLN3在响应于咸味刺激的味觉细胞中特异表达，并且还在垂体、肾上腺和黑色素细胞中表达。该基因编码离子通道多肽，其单独或潜在地与其他辅助分子或离子通道(诸如TRPML1、TRPML2、NALCN或NKAIN3)一起检测咸味刺激，并且可能调节钠转运、代谢和排泄和/或基于如下事实而进一步可影响涉及醛固酮和/或血管加压素的钠相关过程：该离子通道主要在产生醛固酮(一种显著参与影响泌尿和心血管系统以及其他器官的钠相关过程的激素)的肾上腺中表达以及基本上由分泌血管加压素(在钠转运、代谢和排泄中发挥非常重要作用并且影响血压、尿液排出和液体潴留等)的另一种激素)的垂体表达。因此，该离子通道多肽可能在不同细胞和器官的钠转运、代谢和排泄中发挥重要作用，以及参与咸味感受。
[0267] 该基因黏脂3(MCOLN3)或TRPML3(使用本文和在通过引用并入本文的其他临时申请中公开的新原理鉴定)编码在传导钠的味觉感受细胞的味蕾顶部表达的多跨膜蛋白。据信该基因编码允许舌的味蕾的感受味觉细胞检测氯化钠(盐)的咸味受体。另外，因为该基因在肾上腺和垂体中表达，其可能参与调节机体的钠代谢。本发明人获得证据和表明该基因是人咸味受体的与该基因相关的早期报道如下：
[0268] (1)MCOLN3在不表达TRPM5(即其不是甜味、苦味或鲜味)并且朝向味孔的味觉感受细胞亚群的味蕾顶部表达。
[0269] (2)MCOLN3还在比如耳的其他器官的感受细胞中表达。因此其是‘专业’的感受基因。
[0270] (3)MCOLN3在肾上腺强表达。这些腺体在调节机体的钠代谢中发挥非常重要的作用。因此MCOLN3可能是调节钠代谢的关键分子，并且可能调节肾上腺产生醛固酮。
[0271] (4)一种人自身免疫病(爱迪生氏)的特征是肾上腺的破坏。该疾病的一个指示症状是盐渴求。后者可能产生于针对MCOLN3的自身抗体的存在，或破坏味蕾中MCOLN3功能的该基因的突变。
[0272] (5)MCOLN3在参与调节尿液产生的血管加压素释放的垂体中高表达。这进一步支持了该离子通道在机体的钠代谢和排泄中的重要性。
[0273] (6)在电生理研究中MCOLN3传导钠，并表现出预测为咸味受体的正确的生化特征(检测K+、Li+和阿米洛利敏感性)。
[0274] (7)在varitint小鼠(具有TRPML3突变)中使用钠的神经生理实验(神经记录)表明Varitint小鼠对钠的响应缺陷(不表现出强烈的咸味应答)。
[0275] (8)使用表达突变的TRPML3多肽(突变导致离子通道固定于“开放”取向)的哺乳动物细胞和两栖动物卵母细胞的基于细胞的测定鉴定了应在咸味测试中增强或阻抑咸味味觉的TRPML3增强剂和阻抑剂。
[0276] MCOLN3是人咸味受体的发现实现了使用该基因转染的细胞、用于鉴定该分子功能的激动剂、拮抗剂或增强剂(调节剂)目的的筛选测定的设计。
[0277] 该基因最初是由本发明人使用旨在鉴定在味觉细胞中特异表达的基因和筛选在人味蕾顶部富集的其亚群的全基因组筛选策略鉴定的。从他们先前的实验，本发明人推断味蕾顶部含有过量表达已知味觉受体基因的细胞。相反，味蕾底部含有位于味蕾顶部部分的感受味蕾细胞的前体细胞。这一数据库允许本发明人鉴定许多味蕾顶部(感受)细胞特异表达的基因。这些基因之一MCOLN3先前描述为负责称为varitint-waddler的小鼠突变体的表型，其表现为早发性听力丧失、前庭缺陷、色素异常和围产期致死(Dipalma等，Mutations in MCOLN3associated with deafness and pigmentation defects invaritint-waddler(Va)mice.(与varitint-waddler(Va)小鼠的耳聋和色素缺陷相关的MCOLN3突变)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：14994-14999；2002)。MCOLN3在毛细胞和静纤毛(耳内)的质膜中表达。该突变导致导致第五个跨膜结构域的ala 419变为pro的取代。结果是高活性的MCOLN3，其引起表达该分子的细胞死亡，诸如耳的毛细胞(因此导致Va小鼠的耳聋)(Grimm C等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 104：19583-8；2007)。因此，本发明人预期该小鼠也将表现出咸味味觉异常(由于异常的MCOLN3分子及其在舌的咸味味蕾细胞中的可能影响)。实际上，如包含于本文的神经生理实验和数据所示，当以正常应引发咸味感受的浓度的咸味刺激刺激时，这些小鼠不强烈地对咸味刺激作出响应(下文讨论的Varitint小鼠的神经记录结果证实，破坏TRPML3活性并且由于内耳中毛细胞的丧失而引起耳聋和平衡问题的TRPML3突变也破坏了咸味味觉，这进一步证实正常功能的TRPML3或MCOLN3离子通道是咸味感受的前提)。
[0278] 同样，因为公共数据库表明MCOLN3在肾上腺和垂体中强表达，并且因为肾上腺代表机体主要的钠代谢调节器之一，TRPML3可能显著参与钠代谢。(肾上腺监测血液的盐水平并分泌通过帮助肾保留钠和排出钾而调节机体血压和水盐平衡的醛固酮(盐皮质激素)。此外，当醛固酮的产生下降的太低时，肾不能调节盐水平衡，引起血容量和血压下降。)[0279] 因此，还据预测MCOLN3是控制醛固酮产生的肾上腺中关键的盐/钠监测分子。相反，舌中的MCOLN3是由位于味蕾顶部的味觉感受细胞亚群表达的，并且负责检测咸味。通过任一种方式，MCOLN3在检测各种组织的盐中具有关键的作用。因此本发明构成具有重要应用的重要发现。
[0280] 另外，由于TRPML3或MCOLN3还在垂体中大量表达，本发明人还预测MCOLN3参与调节血管加压素释放。通过其对肾的影响血管加压素是尿液产生的关键调节子。重要地，已知血管加压素从垂体后叶的释放受NaCl浓度的调节。以其他方式，通过其对液体潴留、NaCl感受和浓度和血压的影响，MCOLN3似乎是机体NaCl代谢的关键调节子。
[0281] 因此本发明鉴定并提供了功能(电生理)和免疫组织化学数据和动物数据(神经生理研究)，其表明TRPML3(MCOLN3)编码作为灵长类动物(例如人)咸味受体起作用的多肽，并且在系统的钠感受和代谢中发挥重要作用。
[0282] 基于此，本发明主要集中在开发用于鉴定调控TRPML3多肽(阻抑、增强、激活)的化合物的可靠和有效的测定，这些化合物应调控咸味味觉以及调控与TRPML3相关的生物功能，诸如细胞、组织和器官的钠转运、吸收和排泄，以及影响(激动或拮抗)醛固酮或血管加压素相关的活性和病况，其中调控醛固酮或血管加压素的释放或产生是治疗的根据。如本领域所公知，激动或拮抗血管加压素和醛固酮的化合物可很好地应用于治疗中，特别是泌尿和心血管病况，以及涉及水肿或异常循环的病况。例如，这些化合物用于治疗高血压、水肿、充血性心力衰竭、糖尿病及其症状，以及许多其他病况。
[0283] 另外，因为TRPML3影响黑色素细胞和毛细胞，调控TRPML3的化合物可用于促进黑色素细胞的增殖和分化，可用于治疗色素沉着紊乱，可防止或恢复灰白毛发或皮肤至其正常着色(例如由于疾病、年龄、激素功能障碍、UV辐射或化疗而丧失的着色)，并且可促进毛囊生长和增殖。TRPML3调节剂还可用于治疗黑色素瘤，因为其潜在地可选择性地杀死表达TRPML3的黑色素瘤细胞。
[0284] 基于前文，本发明提供了包含表达功能性TRPML3的测试细胞(优选地基于哺乳动物细胞和卵母细胞)的测定系统，其可包含任何需要的物种的野生型TRPML3、其中突变天然产生或通过设计引入的突变的TRPML3，例如以便修饰TRPML3的功能(增强或抑制)或保持其处于固定的开孔取向以便有助于其用于调节剂的筛选测定中，或者其可包含其中TRPML3的结构域或胞外部分与另一个TRPML3离子通道或另一个离子通道(诸如TRPML1、TRPML2、NALCN或NKAIN3)或另一个TRP离子通道的结构域或胞外部分交换的嵌合的TRPML3离子通道或功能片段。TRPML3的示例性突变公开于本文，并且可由熟练的技术人员使用本文公开的信息和本领域技术人员公知的方法来设计。同样，如本文所述，提供编码TRPML3、含有宿主优选密码子(即密码子在其中要进行测定的细胞中是优选的)的核酸序列是有优势的。例如，本发明人在下文提供了由人优选密码子组成的TRPML3基因，以便增强人(例如HEK-293细胞)TRPML3离子通道的活性，用于根据本发明的优选测定中。
[0285] 优选地，本发明提供了基于哺乳动物细胞和基于卵母细胞的用于分析和筛选咸味受体(TRPML3)的优选地高或中等通量的测定。更具体地，本发明提供了表达可用在用于筛选TRPML3调节剂的基于细胞的测定中的TRPML3的两栖动物卵母细胞。本发明还提供了表达功能性TRPML3的两栖动物卵母细胞，用于功能地鉴定TRPML3活性，并且可用来鉴定增强或阻抑咸味感受的化合物(本文称为咸味味觉调节剂)。这些化合物可用作食物、药物和饮料的成分来增强、调控、抑制或阻抑咸味味觉。这些化合物还具有潜在的治疗性应用，例如调节血压、心脏功能、肾功能特别是尿液产生和排泄，治疗爱迪生氏病、IV型黏脂沉积和醛固酮和/或血管加压素的生理影响以及其中治疗上需要施用醛固酮或血管加压素激动剂或拮抗剂的疾病。
[0286] 因此本发明鉴定和提供了功能(电生理)、分子和免疫组织化学数据，其表明TRPML3(MCOLN3)编码作为灵长类动物(例如人)咸味受体起作用的多肽。
[0287] 进一步本发明提供了这些味觉特异基因作为可用来富集、鉴定或分离表达咸味受体的细胞的标志的应用。
[0288] 本发明还提供了使用TRPML3(MCOLN3)和表达TRPML3的细胞或TRPML3转基因动物模型来鉴定引发或调控(阻抑或增强)包括人的灵长类动物的咸味味觉的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物的体外和体内测定。这些测定使用单独表达TRPML3的细胞或表达TRPML3离子通道以及诸如NALCN或NKAIN3的其他味觉特异多肽的细胞。
[0289] 另外，本发明提供了转基因动物(优选地啮齿类动物)及其用来确认TRPML3在哺乳动物的咸味味觉和在涉及钠和其他离子的其他生理功能(诸如钠代谢、血压、液体潴留和排泄、泌尿功能和心脏功能)中的作用。
[0290] 本发明还提供了使用TRPML3和表达TRPML3的细胞或转基因动物在测定中(优选地电生理测定)以便鉴定减轻涉及该多肽表达缺陷(包括超表达、低表达和影响其作为包括例如人和非人灵长类动物的哺乳动物中味觉特异的钠通道起作用的能力的TRPML3多肽的突变)的疾病和病况的治疗性化合物的体外和体内测定。作为实例这些病况包括爱迪生氏病和涉及或受异常醛固酮产生或血管加压素释放影响的其他疾病，诸如高血压、低血压、液体潴留和受损的泌尿或心脏功能(诸如心律不齐、心脏病发作和中风)。
[0291] 该基因最初是通过使用以下鉴定新的味觉特异基因的方法鉴定的：
[0292] 1)激光捕获显微解剖(LCM)和RNA扩增：在激光捕获显微解剖中，纤细的激光束用来解剖和纯化来自组织切片的味觉细胞。该方法分离了缺少污染的舌上皮细胞和结缔组织的味觉细胞，并允许技术人员对高度富集的味觉细胞群体进行分子生物学实验。平行地，通过LCM分离舌上皮细胞，并用作缺少味觉细胞的阴性对照。LCM对味觉乳头的人工或酶促解剖是有利的，因为这些原始技术产生味觉和舌细胞的异质混合物，其中味觉细胞包含1-20％的收集材料。RNA扩增从通过LCM分离的味觉细胞和舌细胞中以无偏差的方式扩增总RNA达1,000,000倍，以便产生足够的遗传材料来进行分子生物学研究(基因芯片或PCR)。我们已发现5,000个味觉细胞足够用于使用猕猴味觉组织的基因芯片实验，多于10,000个味觉细胞足够用于使用猕猴味觉组织的PCR实验。
[0293] 2)基因芯片：基因芯片含有小芯片上几乎所有注释的基因。从味觉和舌细胞中分离和扩增的RNA与基因芯片杂交可用来确定哪些特定的基因在味觉细胞中而不在舌细胞中表达，以及哪些特定的基因在味觉细胞中的表达水平高于舌细胞。使用Affymetrix猕猴基因组阵列使用成对的猕猴真菌状(FG)和轮廓状(CV)味觉和舌样品进行基因芯片实验，使用GeneSpring GX v7.3软件(Agilent Technologies)进行分析。5000个真菌状和CV味觉和舌细胞通过LCM单独分离，并纯化每个样品的总RNA。然后扩增RNA并与基因芯片杂交。使用两个不同的算法进行数据分析：考虑了基因芯片上完全匹配和错配探针的Affymetrix Microarray Suite 5(MAS5)，和仅考虑基因芯片上完全匹配探针的可靠的多芯片算法(RMA)。该分析中鉴定了编码跨膜蛋白的味觉特异基因。
[0294] 3)PCR：使用特异于人/猕猴基因组中离子通道的引物在96孔板中进行高通量PCR，扩增通过LCM分离的人/猕猴味觉和舌细胞的RNA。检测味觉细胞而不是舌细胞中适当大小的产物并对PCR产物进行DNA测序(以便确认基因身份)表明感兴趣的离子通道是味觉特异基因。在使用针对猕猴基因组中鉴定的离子通道的引物的高通量PCR之前，首先对可达4个已知味觉特异基因和2个管家基因进行质量控制PCR反应，以便确保味觉和舌RNA是高质量的。可被检测的4个味觉特异基因是Gα蛋白味转导素(GNAT3)、甜味受体组分T1R2、离子通道TRPM5和酶磷脂酶C亚型β2(PLCβ2)；检测的两个管家基因是β-肌动蛋白和GAPDH。味觉基因由味觉细胞而不是舌细胞特异表达外加味觉细胞和舌细胞都表达遍在的管家基因，表明高质量的RNA材料。
[0295] 在琼脂糖凝胶上分析PCR产物来确定适当大小的条带是否存在于味觉细胞而不是舌细胞中。具有这种表达模式的基因是推测的味觉特异基因。克隆所有味觉特异基因并测序来确认基因的身份。
[0296] 4)原位杂交：特异于单个基因(通过基因芯片或PCR鉴定)的反义RNA探针与含有味觉细胞的组织切片杂交，以便确定感兴趣基因的mRNA转录物是否在味觉细胞中表达，特别是在酸味、甜味、苦味和/或鲜味细胞中表达，或在可能参与咸味检测的独特的细胞类型中表达。在双标记原位杂交中，产生两个不同的RNA探针来标记两个不同的基因，特别是通过基因芯片和/或PCR方法鉴定的两个不同的味觉特异基因。可选地，可产生一个探针来标记单个基因以便确定该基因是否在味觉细胞中表达。对双标记研究，第一个基因用在荧光显微镜下产生一种颜色的FITC探针标记，而第二个基因用在荧光显微镜下产生不同颜色的洋地黄毒苷(DIG)探针标记。探针1和探针2的叠加揭示了基因是在相同还是不同的细胞类型中表达。例如，如果通过基因芯片或PCR方法鉴定的独特的离子通道与表达TRPM5的细胞共定位，该独特的离子通道在负责甜味、苦味和/或鲜味味觉的细胞中表达。相反，如果通过基因芯片或PCR方法鉴定的独特的离子通道不与表达TRPM5的细胞共定位，该独特的离子通道在可能负责咸味味觉(或另一种味觉形式)的不同细胞类型中表达，并且该独特的离子通道可能直接参与钠检测。
[0297] 5)免疫组织化学：特异于单个蛋白(其基因是通过基因芯片或PCR鉴定的)的抗体应用于含有味觉细胞的组织切片以便确定感兴趣的蛋白是否在味觉细胞中表达，特别是在酸味、甜味、苦味和/或鲜味细胞中表达或在可能参与咸味检测的独特细胞类型中表达。在双标记免疫组织化学中，使用两个不同的抗体来标记两个不同蛋白，特别是其基因是通过基因芯片和/或PCR方法鉴定的两个不同的味觉特异蛋白。可选地，可使用一个抗体探针来标记单个蛋白以便确定该蛋白是否在味觉细胞中表达。对双标记研究，第一个蛋白用只能用称为酪胺信号扩增(TSA)的灵敏检测方法检测的非常稀浓度的抗体标记。然后第二个蛋白用另一个抗体标记并使用非TSA方法来检测。稀释的第一个抗体不能由标准的非TSA方法检测；因此来自同一物种(例如兔多克隆抗体)的两个不同抗体将不会交叉反应，因此可用于双标记实验中。蛋白探针1和蛋白探针2的叠加揭示了蛋白是在相同还是不同的细胞类型中表达。例如，如果通过基因芯片或PCR方法鉴定的独特的离子通道与表达TRPM5的细胞共定位，该独特的离子通道在负责甜味、苦味和/或鲜味味觉的细胞中表达。相反，如果通过基因芯片或PCR方法鉴定的独特的离子通道不与表达TRPM5的细胞共定位，该独特的离子通道在可能负责咸味味觉(或另一种味觉形式)的不同细胞类型中表达，并且该独特的离子通道可能直接参与钠检测。
[0298] 进一步，鉴定该离子通道基因作为潜在地参与咸味感受的离子通道还包括以下原理来选择潜在的咸味受体或离子通道候选。
[0299] 首先，使用如上文所述的LCM从猕猴(食蟹猴)中分离味蕾。猕猴基因与人基因平均90-95％相同，并且猕猴是研究包括味觉的人生物学的极好的实验模型。因此猕猴中鉴定的味觉基因将与其人直向同源物高度相似，并执行人中观察到的相似的功能。使用LCM，纤细的激光束用来从组织切片解剖和纯化味觉细胞。该方法分离了缺少污染的舌上皮细胞和结缔组织的味觉细胞，并且允许对高度富集的味觉细胞群体进行分子生物学实验。平行地，通过LCM分离舌上皮细胞，并用作缺少味觉细胞的阴性对照。LCM对味觉乳头的人工和酶促解剖是有利的，因为这些原始的技术倾向于产生味觉细胞和舌细胞的异质混合物，其中味觉细胞只包含约1-20％的收集材料。
[0300] 第二，使用基因芯片/微阵列分析从味觉和非味觉细胞分离的RNA。基因芯片含有小芯片上几乎所有注释的基因。从味觉细胞和舌细胞分离的RNA与基因芯片杂交可用来确定哪些特定的基因在味觉细胞而不在舌细胞中表达，以及哪些特定的基因在味觉细胞中的表达水平高于舌细胞。为了鉴定其探针套在基因芯片上没有功能的基因，基因芯片在21个猕猴非味觉组织上进行。不产生高于背景水平数据的基因的探针套包括不与基因靶有效杂交的探针套以及不被21个猕猴组织图所代表的探针套。代表不被基因芯片方法包括的基因的这些基因单独通过PCR和/或组织学分析以便鉴定在味觉细胞而不是舌细胞中表达的基因(特别是编码跨膜蛋白的基因)以及在味觉细胞中的表达水平高于通过LCM分离的舌细胞的基因。
[0301] 第三，通过基因芯片和/或PCR鉴定的味觉特异基因使用双标记方法通过组织学来检查。使用原位杂交，特异于单个基因的反义探针与含有味觉细胞的组织切片杂交，以便确定感兴趣基因的mRNA转录物是否在味觉细胞中表达，特别在甜味、苦味、酸味和/或鲜味味觉细胞中表达，或在可能参与咸味或其他味觉形式(例如脂肪味觉检测)的独特细胞类型中表达。使用特异于单个蛋白(其基因是通过基因芯片鉴定的)的免疫组织化学抗体，这些抗体应用于含有味觉细胞的组织切片以便确定感兴趣的蛋白是否在味觉细胞中表达，特别是在甜味、苦味、酸味和/或鲜味细胞中表达，或在可能参与咸味或脂肪味觉检测的特定细胞类型中表达。在表达TRPM5(甜味、苦味和鲜味细胞的标志)的味觉细胞中表达的基因将编码可能调控甜味、苦味和/或鲜味味觉的蛋白。在表达PKD2L1或PKD1L3(酸味细胞的标志)的味觉细胞中表达的基因将编码可能调控酸味味觉的蛋白。在既不表达TRPM5也不表达PKD2L1或PKD1L3的味觉细胞中表达的基因将编码在可响应于咸味或脂肪细胞的特定细胞类型中表达的蛋白。因此，在特定味觉细胞类型中表达的基因可响应于咸味受体或脂肪味觉受体，并且可调控咸味或脂肪味觉检测。
[0302] 第四，使用相似的LCM程序和基因芯片或PCR表达方法，进行实验来鉴定哪套基因特异地在味蕾的上半部分而不是下半部分表达，或者哪套基因在上半部分富集，即相对于下半部分的细胞在包含味蕾上半部分的细胞中至少1.2-1.5倍更高地表达。(考虑到其在味蕾上的取向，这些基因是人味觉受体的优选候选)。
[0303] 第五，在独特细胞类型中表达的味觉特异基因通过使用包括电生理的功能测定来分析，以便确定在诸如HEK293细胞、CHO细胞或爪蟾卵母细胞的异源系统中表达的基因产物产生钠响应受体或钠-传导离子通道。咸味受体靶应响应于与人味觉相关的浓度的钠离子(20-140mM钠)。
[0304] 第六，为了最后证实基因作为咸味受体的作用，满足上文提出的标准的基因进一步进行高通量筛选来鉴定增强剂和阻抑剂，在咸味测试中测试这些化合物以便确定其是否增强或抑制咸味感受。平行地，产生缺少感兴趣基因(或表达如本文Varitint小鼠使用的变体形式)的敲除小鼠，并进行生理(神经记录)和行为(2-瓶优选测试和味觉测定测试)实验来确定该动物是否缺陷或缺少咸味感受。
[0305] 因此，该TRPML3基因被鉴定为编码参与钠味觉感受和可能参与钠感受和代谢的多肽离子通道，其更广泛地基于以下标准：1)在基因芯片和/或PCR实验中特异地在味觉细胞中表达或者在味觉细胞中的表达水平高于舌细胞中的基因(这些被定义为味觉特异基因)；2)在组织学上不对应于甜味、苦味、酸味和/或鲜味细胞的独特细胞类型中表达的基因；3)在电生理或功能实验中产生钠响应受体或钠通道的基因产物；和4)调控咸味感受的基因产物的增强剂或阻抑剂和/或敲除小鼠或表达感兴趣的离子通道基因的无活性或变体形式缺陷或缺少咸味应答。
[0306] 使用这些原理、方法和方案，许多灵长类动物基因最初被鉴定为味觉细胞特异的。包括TRPML3的这些基因包含于早期的临时申请中，其通过引用并入本文。考虑到用来鉴定这些基因的全面而正确的方法，本发明人预测这大套基因包含在灵长类动物味觉细胞中特异表达的基因。
[0307] 从这大组基因中鉴定了味觉特异的、在味蕾的上半部分特异表达或富集、并且编码钠离子通道的味觉特异基因的小亚群。特别鉴定了三个离子通道特异性基因，即TRPML3、NKAIN3和NALCN。在这3个基因中，确认了TRPML3编码参与咸味感受并且是咸味感受所需的离子通道。
[0308] 具体地，包含于下文实施例的功能(电生理)和免疫组织化学数据和Varitint小鼠中获得的数据表明MCOLN3(TRPML3)作为啮齿类动物、人和其他灵长类动物以及可能其他哺乳动物中的咸味受体起作用，并且还可能在涉及钠代谢、吸收和排泄的其他生理功能(诸如涉及醛固酮产生和血管加压素释放的生理功能)中发挥作用。支持选择的离子通道基因的测试的该标准进一步概述与下文表1中。
[0309] 表1
[0310]基因名 TB对LE的 顶部对底物TB 报道该基因编码钠通道的参考文献
比率 的比率
NALCN(aka 11.2 7.2 Cell.2007年4月20日；129(2)：371-83
VGCNL1) The neuronal channel NALCN
contributes resting sodium
permeability and is required for
normal respiratory rhythm.(神经元通
道有助于静息钠的通透性，并且是正常呼
吸节律所需的)
Lu B，Su Y，Das S，Liu J，Xia J，Ren
D.
描述NALCN作为钠泄漏通道，与预测的咸
味受体一致。
TRPML3 10.2 1.6 J Biol Chem.2007年10月25日；[网上
(aka 发表于印刷版之前]
MCOLN3) Gain-of-function mutation in TRPML3
causes the mouse varitint-waddler
phenotype.(TRPML3的获得功能突变引起
varitint-waddler小鼠的表型).
Kim HJ，Li Q，Tjon-Kon-Sang S，So I，
Kiselyov K，Muallem S.
首次描述TRPML3作为可透过钠的通道，
与咸味受体一致。
NKAIN3 3.3 1.5 Hum Mol Genet.2007年10月15
(aka 日；16(20)：3394-410.网上发表于2007
FAM77D) 年7月2日
A novel family of transmembrane
proteins interacting with(beta)
subunits of the Na，K-ATPase.(与
Na，K-ATP酶的β亚基相互作用的跨膜蛋
白新家族)
Gorokhova S，Bibert S，Geering K，
Heintz N.
描述了NKAIN3的果蝇同系物作为阿米洛
利-不敏感的钠通道，与咸味受体一致。
比率 的比率
NALCN(aka 11.2 7.2 Cell.2007年4月20日；129(2)：371-83
VGCNL1) The neuronal channel NALCN
contributes resting sodium
permeability and is required for
normal respiratory rhythm.(神经元通
道有助于静息钠的通透性，并且是正常呼
吸节律所需的)
Lu B，Su Y，Das S，Liu J，Xia J，Ren
D.
描述NALCN作为钠泄漏通道，与预测的咸
味受体一致。
TRPML3 10.2 1.6 J Biol Chem.2007年10月25日；[网上
(aka 发表于印刷版之前]
MCOLN3) Gain-of-function mutation in TRPML3
causes the mouse varitint-waddler
phenotype.(TRPML3的获得功能突变引起
varitint-waddler小鼠的表型).
Kim HJ，Li Q，Tjon-Kon-Sang S，So I，
Kiselyov K，Muallem S.
首次描述TRPML3作为可透过钠的通道，
与咸味受体一致。
NKAIN3 3.3 1.5 Hum Mol Genet.2007年10月15
(aka 日；16(20)：3394-410.网上发表于2007
FAM77D) 年7月2日
A novel family of transmembrane
proteins interacting with(beta)
subunits of the Na，K-ATPase.(与
Na，K-ATP酶的β亚基相互作用的跨膜蛋
白新家族)
Gorokhova S，Bibert S，Geering K，
Heintz N.
描述了NKAIN3的果蝇同系物作为阿米洛
利-不敏感的钠通道，与咸味受体一致。
[0311]
[0312] 因此，基于前文，本发明一般涉及用于鉴定味觉基因(包括参与咸味感受或诸如脂肪味觉感受的其它味觉感受的基因)的方法和其在用于鉴定人咸味味觉增强剂和其他味觉调节剂化合物和用于鉴定调控其他味觉细胞相关功能和表型(包括不直接与味觉转导相关的疾病和病况，即涉及不同组织中异常钠转运、代谢和排泄以及感受的疾病和病况)的潜在治疗剂的筛选测定中的应用。
[0313] 调控TRPML3的化合物在调控人咸味感受中具有潜在的应用。例如在电生理测定中鉴定的化合物及其生物上可接受的衍生物在使用人志愿者的人味觉测试中测试，以便确认其对人咸味感受的影响。另外，鉴定为潜在治疗剂的化合物将在适当的体外和体内模型中被评估，取决于预期应用的本质。例如鉴定为糖尿病的潜在治疗剂的化合物可在公知的糖尿病动物模型中(诸如NOD小鼠模型或BB大鼠模型)评估。相似地，鉴定为IBD或克罗恩病的潜在治疗剂的化合物可在IBD或克罗恩病的啮齿类动物模型中测试。
[0314] 用来鉴定味觉(例如咸味味觉)调节或治疗化合物的基于细胞的测定将优选地包含使用表达本文公开的基因的细胞或其组合来鉴定调控(增强)参与咸味感受的基因活性的化合物的高通量筛选平台。另外，这些序列可被修饰以便引入沉默突变或具有功能影响的突变(诸如影响离子(钠)流入的确定突变)。如上文提到，该测定将优选地包含在两栖动物卵母细胞中进行的电生理测定或使用荧光离子敏感染料或膜电位染料(例如钠敏感染料)使用表达根据本发明的离子通道的哺乳动物细胞的测定。优选地，调控此类离子通道的化合物是通过使用表达本文鉴定的离子通道的卵母细胞进行的电生理测定(例如膜片钳或二电极电压钳)的筛选鉴定的。
[0315] 可选地，调控推测参与咸味味觉的离子通道的化合物可通过离子流测定来检测，例如放射标记离子流测定或原子吸收光谱偶联的离子流测定。如上文公开，这些化合物在调控人咸味感受或用于调控涉及异常或正常离子通道功能的其他生物过程中具有潜在的应用。
[0316] 基于细胞的测定使用在通常用在用于鉴定离子通道或GPCR调节化合物的筛选中的需要的细胞中(优选地卵母细胞或诸如HEK-293细胞的人细胞、或其他人或哺乳动物细胞)表达的突变的核酸序列。这些细胞可进一步被改造以便表达其他序列，例如其他味觉GPCR，即诸如本受让人Senomyx其他专利申请中描述的T1R或T2R以及适当的G蛋白。卵母细胞系统是有优势的，因为其允许多种mRNA物种的直接注射、提供高蛋白表达，并且能容纳内在于离子通道过量表达的有害影响。然而缺点是使用两栖动物卵母细胞的电生理筛选不适合高通量筛选大量的化合物，并且不是哺乳动物系统。如指出，本发明包含使用哺乳动物细胞的测定，优选地高通量测定。这些高通量筛选测定一般将使用转染或接种到孔或培养板中的哺乳动物细胞，其中在测试化合物存在时允许进行功能表达，并且使用膜电位荧光或离子(钠)荧光染料来检测活性。
[0317] 这些筛选方法用来使用本文提供的核酸和蛋白质序列来鉴定TRPML3调节剂，例如人咸味味觉或其他味觉形态的激活剂、抑制剂、刺激子、增强剂等和靶向其他味觉细胞功能或表型的潜在治疗剂。此类调节剂可影响咸味味觉或其他味觉形态或味觉细胞相关功能和表型，例如通过调控转录、翻译、mRNA或蛋白质稳定性；通过改变离子通道与质膜或其他分子的相互作用；或通过影响离子通道蛋白的活性。
[0318] 使用高通量筛选(HTS)来筛选化合物，以便鉴定能结合和/或调控味觉受体或味觉离子通道多肽或转运子或其片段活性的那些化合物。本发明中，蛋白在例如人细胞或青蛙卵母细胞的细胞中重组地表达，通过使用离子通道、受体或转运子功能的任何测量方法测定活性的调控，诸如测量膜电位、或测量胞内钠或锂水平的改变。测定离子(例如阳离子)通道功能的方法包括例如，膜片钳技术、二电极电压钳、测量全细胞电流和使用离子敏感荧光染料的荧光成像技术和离子流测定，例如放射标记的离子流测定或离子流测定。
[0319] 根据本发明鉴定的基因增强剂可用于许多不同的目的。例如，其可包括作为调味剂来调控食物、饮料、汤、药和其他人消耗产品的咸味味觉。另外，本发明提供了用于进行本文公开的测定的试剂盒。
[0320] 事实上，如实施例中所述，此类基于TRPML3细胞的测定已经鉴定了TRPML3阻抑剂和增强剂，其将在味觉测试中被测试来确定其对咸味感受的影响。
[0321] 本发明还提供了TRPML3作为可用来富集、鉴定或分离表达咸味受体的细胞的标志的应用。
[0322] 本发明还提供了使用TRPML3(MCOLN3)和表达TRPML3的细胞或TRPML3转基因动物模型来鉴定引发或调控(阻抑或增强)包括人的灵长类动物的咸味味觉的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物的体外和体内测定。这些测定使用单独表达TRPML3的细胞或表达TRPML3离子通道以及其他味觉特异多肽(诸如NALCN或NKAIN3)或相关TRPML成员(诸如TRPML1或TRPML2)的细胞。
[0323] 进一步，本发明提供了转基因动物(优选地啮齿类动物)及其用来确认TRPML3在哺乳动物的咸味味觉和在涉及钠和其他离子的其他生理功能(诸如钠代谢、血压、液体潴留和排泄、泌尿功能和心脏功能)中的作用的应用。
[0324] 另外，本发明提供了使用TRPML3和表达TRPML3的细胞或转基因动物在测定中(优选地电生理测定)以便鉴定减轻涉及该多肽表达缺陷(超表达、低表达和影响其在包括例如人和非人灵长类动物的哺乳动物中作为味觉特异钠通道起作用的能力的TRPML3多肽的突变)的疾病和病况的治疗性化合物的体外和体内测定。作为实例这些病况包括爱迪生氏病和涉及异常醛固酮产生或血管加压素释放的疾病，诸如高血压、低血压、液体潴留和受损的泌尿或心脏功能，诸如心律不齐、心脏病发作和中风。
[0325] 定义
[0326] “推测的咸味受体或咸味味觉离子通道基因”指在味觉细胞中表达而不在舌细胞中表达或者在舌细胞中的表达明显更弱的基因，此外优选地不在表达T1R、T2R、TRPM5或PKD2L1/PKD1L3基因的味觉细胞中表达。优选地，这些基因在包含味蕾的细胞上半部分对比下半部分特异表达或富集(至少1.2-1.5倍更高地表达)。这包括化学感受或味觉细胞，特别是猕猴和可能其他哺乳动物的味觉细胞。如指出以及在本发明的优选方面中，TRPML3已被鉴定为一个此类咸味受体(钠离子通道)多肽。
[0327] “TRPML3”或“MCOLN3”指参与啮齿类动物、人和非人灵长类动物以及可能其他哺乳动物和脊椎动物(包括鸟、爬行动物和两栖动物)的咸味感受的基因或其变体。本申请包含就在权利要求之前的人、小鼠、牛、鼠、斑马鱼、鸡和其他哺乳动物物种的TRPML3基因和多肽的示例性序列。这些序列的比较揭示了TRPML3多肽的多肽序列在不同物种中是非常相似的，即小鼠和人TRPML3有96％序列同一性和91％序列相似性。因此对熟悉本领域的技术人员，在其他哺乳动物基因或基因组和多肽文库中鉴定TRPML3基因应该是相对简单的。而且，考虑到钠代谢对细胞活力和有机体一般健康的关键作用，其他脊椎动物可能表达TRPML3。根据此，本发明意图广泛地包括含有不同物种(但最优选地人和其他哺乳动物)的TRPML3基因和功能变体(诸如嵌合体)的咸味受体。本文的TRPML3基因和多肽还具体地包括在一个或多个位点突变的TRPML3突变基因和片段，所述突变例如以便修饰(增强或降低TRPML3活性)、使离子通道更适合用于诸如通过修饰多肽以便该离子通道固定于“开放”或“关闭”位置或者通过产生其中一个TRPML3多肽的结构域或胞外环或其部分与另一个离子通道(例如不同物种的TRPML3或非TRPML3离子通道，诸如例如TRPML1、TRPML2、NKAIN3或NALCN)交换的片段或嵌合体的测定中。术语TRPML3多肽和核酸序列还具体包含与本文公开的多肽具有至少80％序列同一性，更优选地与天然TRPML3多肽(例如天然人、非人灵长类动物、啮齿类动物(大鼠、小鼠等)、狗、猫、马、牛、绵羊等的TRPML3多肽)具有至少90％序列同一性或更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的TRPML3离子通道多肽。TRPML3核酸序列还包括所有核酸编码序列，诸如cDNA、基因组序列、cRNA、mRNA以及单链、双链和三链核酸序列及其互补链。人中，在味蕾、垂体和肾上腺存在TRPML3 mRNA的3个主要形式，其序列包含于权利要求之前的序列表中。
[0328] TRPML3序列还包括特异地与编码参与咸味感受和/或钠转运、代谢或排泄的钠离子通道的编码TRPML3的核酸序列或其互补链杂交的序列。适合用于鉴定其他TRPML3直向同源物和相关基因的示例性杂交病况是本领域已知的，并且定义于本申请下文中。
[0329] “味觉细胞”指当成熟时表达直接或间接调节或调控特定味觉形态诸如甜味、酸味、鲜味、咸味、苦味、脂肪、金属或其他味觉感受或一般味觉感受诸如味觉强度或味觉响应的持续时间的至少一个受体、转运子或离子通道的细胞。这特别包括在化学感觉或味觉细胞(特别是猕猴和可能其他哺乳动物味觉细胞)中表达的基因。味觉细胞表达mRNA和/或基因C6orf15的蛋白(染色体阅读框架15)-也称为STG。该基因描述为味觉特异基因(M.Neira等，Mammalian Genome 12：60-66，2001)，并且在本文报道的猕猴味觉特异基因中。另外，成熟的味觉受体细胞一般将表达αENaC的mRNA和/或蛋白。我们有数据(本文未显示)揭示αENaC在至少甜味、苦味、鲜味、酸味和最可能咸味味觉细胞中表达。进一步，成熟的味觉受体细胞将一般表达细胞角蛋白19的mRNA和/或蛋白。该蛋白只在成熟的味觉细胞中表达，没有发现于基底或干细胞(L.Wong等，Chemical Senses 19(3)：251-264，1994)。此外，基于其特征形态熟悉本领域的技术人员可鉴定味觉细胞。特别地，成熟味觉受体的味觉细胞是伸长的纺锤体形。成熟味觉受体细胞还具有穿入味孔的细胞尖端(顶端膜)，因此接近或暴露于唾液。相反，未成熟的味觉细胞(例如基底细胞或干细胞)是圆形的，并且不暴露于味孔和唾液。不同于成熟味觉细胞，基底细胞和干细胞还倾向于朝向味蕾的基部定位。
[0330] “化学感受细胞”是参与诸如味元的化学刺激剂和诸如添味剂的其他化学感受刺激的感受的细胞。本文的化学感受细胞特别包括味觉受体细胞和包含于消化道或尿道或其他器官中当成熟时表达一个或多个味觉受体的细胞。例如，已知胃肠化学感受细胞表达T1R或T2R，并且这些细胞可能参与食物感受、代谢、消化、糖尿病、食物吸收、胃运动等。另外，尿道中发现的细胞可能表达咸味受体，并参与钠转运、排泄和与其相关的功能，诸如血压和液体潴留。进一步，消化系统中表达味觉受体的化学感受细胞还可表达嗜铬粒蛋白A，该蛋白是分泌颗粒的标志(C.Sternini，“Taste Receptors in thegastrointestinal tract.IV.Functional Implications of BitterTaste Receptors in Gastrointestinal Chemosensing”.(胃肠道中的味觉受体.IV.胃肠化学感受中苦味味觉受体的功能暗示)American Journal of Physiology，Gastrointestinal and LiverPhysiology.”，292：G457-G461，2007)。
[0331] 本文的“味觉细胞相关基因”指味觉细胞表达而不是舌细胞表达的参与味觉或非味觉相关味觉细胞功能或表型的基因。这特别包括本文和本文引用的早期临时申请中报道的在特别是来自猕猴的化学感受或味觉细胞中特异表达的基因。味觉细胞包括表达味觉受体的口腔(诸如舌)中的细胞和在表达味觉受体的机体其他区域(诸如消化系统和尿道)的味觉细胞。此类基因包括包含于通过引用并入本文的申请的表中的基因。这些基因包括参与味觉和非味觉相关功能的基因，诸如味觉细胞周转、影响消化系统或口腔的疾病、口腔和/或消化系统的免疫调、涉及味觉细胞的消化和代谢功能，诸如糖尿病、肥胖、血压、液体潴留等。在指本文鉴定的特定味觉特异基因时，这些基因包括对应于包含于本文的基因及其直向同源物和包括其等位变体的嵌合体和变体的核酸序列。特别地，此类变体包括编码与由对应于引用基因或其直向同源物(特别是人和非人灵长类动物直向同源物)的基因编码的多肽至少80％相同(更优选地至少90％或95％相同的多肽的序列。另外，该基因包括在严格杂交条件下与对应于对应于早期临时专利申请中的基因的一种基因序列的核酸序列杂交的核酸序列。
[0332] “阳离子通道”是调节阳离子流过细胞膜的多种蛋白。特定阳离子通道转运特定阳离子的能力一般随阳离子的化合价以及特定阳离子的特定通道的特异性而变化。
[0333] “同聚的通道”指由相同α亚基组成的阳离子通道，而“异聚的通道”指由两种或多种不同类型α亚基组成的阳离子通道。同聚的和异聚的通道可包括辅助的β亚基。
[0334] “β亚基”是由α亚基组成的阳离子通道的辅助亚基的多肽单体；而单独的β亚基不能形成通道(参见例如，美国专利第5,776,734号)。已知β亚基例如通过帮助α亚基到达细胞表面增加通道的数目、改变激活动力学和改变天然配体结合通道的敏感性。β亚基可以在孔区外面，并与包含孔区的α亚基缔合。它们还可促成孔区的外口。
[0335] 术语“真实的”或“野生型”或“天然”核酸序列指包含于本文序列表的野生型核酸序列以及剪接变体、等位变体和其他变体和本领域一般熟悉的其他核酸序列。
[0336] 术语“真实的”或“野生型”或“天然”多肽指由本申请和通过引用并入本文的早期临时专利申请中公开的基因和核酸序列编码的多肽。
[0337] 术语“修饰的增强受体核酸序列”或“优化的核酸序列”指含有一个或多个突变、特别是影响(抑制或增强)重组宿主细胞(最特别地卵母细胞或人细胞，诸如HEK-293细胞)中基因活性的突变的核酸序列。特别地，这些突变包括通过得到的含有突变亚基序列的离子通道来影响门控的突变。该离子通道可在构成特定离子通道的三个亚基的一个或几个中包含此类突变。修饰的核酸序列例如可在影响(损害)门控功能或缺少表面表达的一个亚基中含有取代突变。本发明包含其他突变基因序列，即剪接变体、含有缺失或增加的变体，该序列的嵌合体及类似序列的应用。进一步，本发明可使用可被修饰以便引入宿主细胞优选密码子(特别是两栖动物或人宿主细胞优选密码子)的序列。
[0338] 根据本发明术语受体或离子通道蛋白或其片段或编码特定味觉受体或离子通道或转运子或其片段的核酸指核酸和多肽多态变体、等位基因、突变体和物种间同系物，其：(1)具有与野生型核酸编码的氨基酸序列或味觉蛋白的氨基酸序列例如由包含于本文表1的基因核酸序列编码的蛋白及其片段和其保守修饰的变体高于约60％氨基酸序列同一性、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域；(3)由在严格杂交条件下特异地与对应于编码由所述基因之一编码的基因的核酸序列的反义链杂交的核酸序列及其保守修饰的变体编码的多肽；(4)具有与例如本文公开的核酸具有高于约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列同一性的核酸序列，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的区域。
65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域；(3)由在严格杂交条件下特异地与对应于编码由所述基因之一编码的基因的核酸序列的反义链杂交的核酸序列及其保守修饰的变体编码的多肽；(4)具有与例如本文公开的核酸具有高于约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列同一性的核酸序列，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的区域。
[0339] 推测的咸味或其他味觉特异基因或多核苷酸或多肽序列一般来自哺乳动物，其包括但不限于灵长类动物(例如人)；啮齿类动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠)；牛、猪、马、绵羊或任何其他哺乳动物。然而，如提到TRPML3离子通道在其中其可能具有相似功能的其他(非哺乳动物)脊椎动物中表达。本发明的核酸和蛋白包括天然存在的或重组分子。这些基因一般将编码具有离子通道活性的蛋白，即其可透过钠或锂。特别地这包括灵长类动物TRPML3基因及其人和其他哺乳动物的直向同源物以及保持TRPML3功能性的片段和变体，即在监测钠、锂传导和对阿米洛利的应答(缺少)的电生理测定中以及在其他适合的功能测定中表现类似。
[0340] 通过“确定功能性影响”或“确定对细胞的影响”意指测定增加或减少间接或直接处于味觉基因(优选地本文鉴定的咸味基因)影响下的参数的化合物的影响，例如功能、物理、表型和化学影响。此类功能影响包括但不限于离子流、膜电位、电流强度和电压门控的改变，以及其他生物学影响，诸如任何标志基因的基因表达的改变和类似影响。离子流可包括通过通道的任何离子，例如钠或锂及其类似物，诸如放射性同位素。此类功能影响可通过本领域技术人员已知的任何方法来测量，例如使用电压敏感染料的膜片钳、或通过测定诸如光谱特征(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力(例如形状)、色谱或溶解度特性的参数的改变。使用表达TRPML3的细胞的适合的电生理测定示例于下文的实验实施例中。
[0341] 该味觉细胞表达的多核苷酸和多肽序列的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”用来指使用这些多核苷酸和多肽序列的体外和体内测定鉴定的激活、抑制或调控分子。抑制剂是例如结合、部分或完全抑制活性、降低、阻止、延缓激活、失活、脱敏或下调这些味觉特异蛋白的活性或表达的化合物，例如拮抗剂。“激活剂”是增强、开放、激活、促进、增强激活、敏化、拮抗或上调蛋白活性的化合物。抑制剂、激活剂或调节剂一般还包括该味觉细胞特异蛋白的遗传修饰形式，例如具有改变活性的形式，以及天然存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环状肽、核酸、抗体、反义分子、siRNA、核酶、小有机分子和类似分子。抑制剂和激活剂的此类测定包括例如在体外、细胞、细胞提取物或细胞膜中表达该味觉细胞特异蛋白，应用推测的调节剂化合物和然后确定对活性的功能影响，如上文所述。
[0342] 包含由用潜在激活剂、抑制剂或调节剂处理的本文鉴定的基因编码的蛋白的样品或测定与没有抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品比较来检查激活或迁移调控的程度。对照样品(没有用抑制剂处理)被指定100％的相对蛋白活性值。当相对于对照的活性值为约80％、优选地50％、更优选地25-0％时，实现离子通道的抑制。当相对于对照(没有用激活剂处理)的活性值为110％、更优选地150％、更优选地200-500％(即相对于对照2至5倍更高)、更优选地1000-3000％或更高时，实现离子通道的激活。
[0343] 如本文所用，术语“测试化合物”或“药物候选”或“调节剂”或语法上的等效物描述待测试其调控冷感的能力的天然存在或合成化合物的任何分子，优选地小分子、或蛋白质、寡肽(例如长度从约5到约25个氨基酸，优选地长度从约10至20个或12至18个氨基酸，优选地长度为12、15或18个氨基酸)、小有机分子、多糖、脂类、脂肪酸、多核苷酸、siRNA、寡核苷酸、核酶等。测试化合物可以是以测试化合物文库的形式，诸如提供足够范围多样性的组合或随机文库。测试化合物任选地与融合伴侣相连，例如靶向化合物、拯救化合物、二聚化合物、稳定化合物、可寻址化合物和其他功能部分。按照惯例，通过鉴定具有一些所需特性或活性(例如抑制活性)的测试化合物(称为“候选化合物”)产生具有有用特性的新的化学实体，产生先导化合物的变体，和评估那些变体化合物的特性和活性。此类分析通常采用高通量筛选(HTS)方法。
[0344] “小有机分子”指分子量大于约50道尔顿并且小于约2500道尔顿的天然存在或合成的有机分子，优选地小于约2000道尔顿，优选地介于约100至约1000道尔顿之间，更优选地介于约200至约500道尔顿。
[0345] “生物样品”包括诸如活检和尸检样品的组织切片以及为了组织学目的而取的冷冻切片。此类样品包括血液、痰液、组织、例如原代培养物的培养细胞、外植体和转化细胞、粪便、尿液等。生物样品一般获自真核有机体，最优选地哺乳动物，诸如灵长类动物(例如黑猩猩或人)；牛；狗；猫；啮齿类动物，例如豚鼠、小鼠、大鼠；兔；或鸟；爬行动物；或鱼。
[0346] 术语“相同的”或“同一性”百分比在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中指两个或多个序列或亚序列相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(即当用最大对应性对比较窗口或指定区域进行比较和比对时，在特定区域(例如包含于本文表1的基因或序列)约60％同一性，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法所测量，或通过人工比对和视觉检查(参见例如NCBI网站或类似网站)。然后可以说此类序列是“大体上相同的”。该定义还指或可应用于测试序列的互补序列(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下文所述，优选算法可考虑缺口和类似参数。优选地，同一性存在于长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域，更优选地存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域。
[0347] 对序列比较，一般一个序列作为测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，测试和参考序列被输入计算机，指定亚序列坐标，如果必要，指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，或者可指定可选参数。然后基于程序参数序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0348] 如本文所用，“比较窗口”包括选自由以下组成的组的许多邻接位置的任一个的片段的参考：从20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在两个序列被最佳比对后，序列可与相同数目邻接位置的参考序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可进行用于比较的序列的最佳比对，例如通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman& Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson & Lipman，Proc.Na t’l.Acad.Sci.USA 85：
2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(WisconsinGenetics软件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过人工比对和视觉检查(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方法)(Ausubel等，编辑，1995年增刊))。
2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(WisconsinGenetics软件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过人工比对和视觉检查(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方法)(Ausubel等，编辑，1995年增刊))。
[0349] 适合用来确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，Nucl.AcidsRes.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。使用本文所述参数使用BLAST和BLAST 2.0来确定本发明的核酸和蛋白质的序列同一性百分比。用于执行BLAST分析的软件是可公开通过国家生物技术信息中心获得的。该算法涉及首先通过鉴定询问序列中长度为W的短字符来鉴定高得分序列对(HSP)，这些字符当与数据库序列中同样长度的字符比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T指邻接字符得分阈值(Altschul等，上文)。这些最初的邻接字符命中作为起始搜索的种子来发现含有这些字符的更长的HSP。字符命中在沿每个序列的两个方向延伸直到累积比对的得分增加。对核苷酸序列使用参数M(一对匹配残基的奖励分，总是＞0)和N(不匹配残基的惩罚分，总是＜0)来计算累积得分。对氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当：累积比对得分从其最大获得值减少了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分变为零或以下；或者达到任一序列的末端时，每个方向字符命中的延伸暂停。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)的默认参数是：字符长度(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和比较两条链。对氨基酸序列，BLASTP程序的默认参数是：字符长度为3，期望值(E)为10，而BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 89：10915(1989))中，比对(B)为50、期望值(E)为10、M-5、N＝-4和比较两条链。
[0350] “核酸”指以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其多聚体或其互补链。该术语包含含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键合的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
[0351] 除非另外指明，特定的核酸序列还暗含地包含其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选择(或所有)密码子的第三个位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可交换使用。
[0352] 特定核酸序列还暗含地包含“剪接变体”。相似地，由核酸编码的特定蛋白暗含地包含由该核酸的剪接变体编码的任何蛋白。如其名称表明，“剪接变体”是基因可变剪接的产物。转录后，最初的核酸转录物可被剪接以便不同(交替)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制不同，但包括外显子的交替剪接。来自相同核酸的通过通读转录的交替多肽也包含于本定义中。剪接反应的任何产物(包括剪接产物的重组形式)包括于本定义中。钾通道剪接变体的实例在Leicher等，J.Biol.Chem.273(52)：35095-35101(1998)中讨论。
[0353] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可交换使用指氨基酸残基的多聚体。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的多聚体，以及天然存在氨基酸的多聚体和非天然存在氨基酸的多聚体。
[0354] 术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同基本化学结构的化合物，即与氢结合的碳、羧基基团、氨基基团和R基团，例如同型丝氨酸、正亮氨酸、甲硫亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸一般化学结构的结构、但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。
[0355] 本文中，其公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号都可指氨基酸。同样，其通常接受的单字母代码可指核苷酸。
[0356] “保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或其中该核酸不编码基本相同序列的氨基酸序列的核酸。由于遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任何特定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此在其中密码子指定为丙氨酸的每个位置，该密码子可改变为所述不改变编码多肽的任何对应密码子。此类核酸改变为“沉默改变”，其为一种保守修饰的改变。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每个可能的沉默改变。技术人员将理解，核酸的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG)可被修饰以便产生功能上相同的分子。相应地，编码多肽的核酸的每个沉默改变暗含于每个关于表达产物而不关于实际探针序列的所述序列中。
[0357] 关于氨基酸序列，本领域技术人员将理解，编码序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个取代、缺失或添加是其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸的“保守修饰的变体”。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。此类保守修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。
[0358] 以下8组每组含有互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
[0359] 诸如多肽结构的大分子结构可从各种组织水平来描述。该组织的一般讨论参见例如Alberts等，Molecular Biology of the Cell(细胞的分子生物学)(第三版，1994)和Cantor和Schimmel，生物物理化学部分I：The conformation of Biological Macromolecules(生物大分子的构象)(1980)。“一级结构”指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指多肽局部有序的三维结构。这些结构通常称为结构域，例如跨膜结构域、孔结构域和胞质尾结构域。结构域是形成多肽致密单位的多肽部分，一般为15至350个氨基酸长。
示例性结构域包括胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。典型的结构域由更低组织的部分构成，诸如.β.-折叠和.α.-螺旋的拉伸。“三级结构”指多肽单体的完整三维结构。
“四级结构”指由独立的三级单位的非共价缔合形成的三维结构。各向异性术语也称为能量术语。
示例性结构域包括胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。典型的结构域由更低组织的部分构成，诸如.β.-折叠和.α.-螺旋的拉伸。“三级结构”指多肽单体的完整三维结构。
“四级结构”指由独立的三级单位的非共价缔合形成的三维结构。各向异性术语也称为能量术语。
[0360] “标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方法检测的组合物。例如有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密剂、酶(例如，通常用在ELISA中)、生物素、地高辛、或半抗原和可例如通过将放射性标记掺入肽而变得可检测的蛋白质或用来检测特异地与肽反应的抗体的蛋白质。
[0361] 当指例如细胞、或核酸、蛋白或载体使用时，术语“重组”表明该细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的改变而被修饰，或者该细胞来自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在细胞的天然(非重组)形式中发现的基因或者表达以其他方式异常表达(降低表达或根本不表达)的天然基因。
[0362] 当指核酸部分使用时，术语“异源”表明该核酸包含两个或多个未在自然以彼此相同关系发现的亚序列。例如，该核酸一般重组地产生，具有两个或多个来自不相关基因并排列为产生新的功能核酸的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。相似地，异源蛋白表明该蛋白包含两个或多个未在自然以彼此相同关系发现的亚序列(例如融合蛋白)。
[0363] 短语“严格杂交条件”指该条件下探针将与一般处于核酸复杂混合物中的其靶亚序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。更长的序列在更高温度下特异杂交。核酸杂交的广泛指导发现于 Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes(生物化学和分子生物学技术-核酸探针的杂交)，“Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(“杂交原理和核酸测定策略的概述”)(1993)。严格条件一般选为在特定离子强度pH下比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。Tm是与靶互补的探针的50％在平衡点与靶序列杂交的温度(在特定离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序列是过量存在的，Tm下，在平衡点探针的50％被占据)。严格条件也可用添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选地背景杂交的10倍。示例性严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5X SSC和1％SDS、在42℃下孵育，或者5X SSC、1％SDS、在65℃下孵育，用0.2X SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。
[0364] 如果其编码的多肽是大体上相同的，那么严格条件下不彼此杂交的核酸仍旧是大体上相同的。例如当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，发生这种情况。在这种情况下，该核酸一般在适度严格的杂交条件下杂交。示例性“适度严格的杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液在37℃下杂交，在1X SSC中在45℃下洗涤。阳性杂交是背景的至少两倍。本领域普通技术人员将容易理解可使用可选杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件。用于确定杂交参数的其他准则提供于许多参考文献中，例如CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学最新方法)，Ausubel等编辑。
[0365] 对PCR，约36℃的温度一般用于低严格性扩增，尽管取决于引物长度退火温度可在介于约32℃和48℃之间改变。对高严格性PCR扩增，一般是约62℃的温度，尽管取决于引物长度和特异性，高严格性退火温度可在从约50℃至约65℃的范围。高和低严格性扩增的一般循环条件包括90℃-95℃30秒-2分钟的变性期、持续30秒-2分钟的退火期和约72℃1-2分钟的延伸期。低和高严格性扩增反应的方案和准则提供于例如Innis等(1990)PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications(PCR方案，方法和应用的指导)，Academic Press，Inc.N.Y.)。
[0366] “抗体”指包含来自特异结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的构架区的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ζ和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ζ，其然后定义了免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般抗体的抗原结合区对结合的特异性和亲和力是最关键的。
[0367] 如本文所用，术语抗体还包括通过完整抗体的修饰产生或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段(例如单链Fv)、嵌合体、人源化抗体或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。对例如重组、单克隆或多克隆抗体的抗体的制备，可使用本领域已知的许多技术(参见例如Kohler &Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today4：72(1983)；Cole等，第77-96页，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(免疫学最新方法)(1991)；Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体实验手册)(1988)和Harlow & Lane，Using Antibodies，ALaboratory Manual(使用抗体实验手册)(1999)；和Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和时间)(第二版
1986))。
1986))。
[0368] 当指蛋白或肽时，短语“特异(或选择性)结合”抗体或“特异(或选择性)与...免疫反应”指通常在蛋白和其他生物制品的异质群体中确定蛋白存在的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，特定抗体以背景的至少两倍和更一般地背景的超过10至
100倍与特定蛋白结合。在这种条件下与抗体的特异结合需要针对其对特定蛋白的特异性而选择的抗体。例如，蛋白、多态变体、等位基因、直向同源物和保守修饰的变体、或剪接变体、或其部分制备的多克隆抗体可被选择以便只获得与该蛋白而不与其他蛋白特异免疫反应的那些多克隆抗体。这种选择可通过扣除与其他分子交叉反应的抗体来实现。可使用多种免疫测定形式来选择特异地与特定蛋白免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定一般用来选择特异地与蛋白免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体实验手册)(1988)，描述了可用来确定特定免疫反应性的免疫测定形式和条件)。
100倍与特定蛋白结合。在这种条件下与抗体的特异结合需要针对其对特定蛋白的特异性而选择的抗体。例如，蛋白、多态变体、等位基因、直向同源物和保守修饰的变体、或剪接变体、或其部分制备的多克隆抗体可被选择以便只获得与该蛋白而不与其他蛋白特异免疫反应的那些多克隆抗体。这种选择可通过扣除与其他分子交叉反应的抗体来实现。可使用多种免疫测定形式来选择特异地与特定蛋白免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定一般用来选择特异地与蛋白免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体实验手册)(1988)，描述了可用来确定特定免疫反应性的免疫测定形式和条件)。
[0369] 本文中“治疗有效量”意指产生其施用影响的剂。精确的剂量将取决于治疗目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(药 物 剂 量 形 式)( 第 1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technologyof Pharmaceutical compounding(药物化合物的艺术、科学和技术)(1999)；和Pickar，Dosage Calculations(剂量计算)(1999))。
[0370] 本文鉴定的味觉(咸味)基因的重组表达
[0371] 为获得克隆基因(诸如编码该基因的cDNA)的高水平表达，技术人员一般将该基因亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，以及如果对编码蛋白的核酸，用于翻译起始的核糖体结合位点。适合的真核和原核启动子是本领域公知的，并描述于例如Sambrook等和Ausubel等，上文。例如，用于表达味觉特异蛋白的细菌表达系统可获自例如大肠杆菌(E.coli)，芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙 门 氏 菌(Salmonella)(Palva等，Gene22：229-235(1983)；Mosbach 等，Nature 302：543-545(1983)。用于此类表达系统的试剂盒可商业获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫学报的真核表达系统是本领域公知的，并且也可商业获得。例如，反转录病毒表达系统可用在发明中。如下文所述，该推测的影响咸味味觉的基因优选地在诸如HEK-293细胞的人细胞中表达，其广泛用于高通量筛选。
[0372] 用来指导异源核酸表达的启动子的选择取决于特定的应用。启动子优选地位于在其天然设定下与转录起始位点的距离相同的与异源转录起始位点的距离。然而，如本领域所已知，可容纳该距离的一些改变而不丧失启动子的功能。
[0373] 除了启动子，表达载体一般含有包含核酸在宿主细胞中表达所需的所有其他元件的转录单位或表达盒。因此一般的表达盒包含可操作地与编码鉴定的基因的核酸序列相连的启动子和转录物有效多聚腺苷化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒的其他元件可包括增强子，如果使用基因组DNA作为结构基因，包括具有功能剪接供体和受体位点的内含子。
[0374] 除了启动子序列，表达盒还应包含结构基因下游的转录终止区来提供有效的终止。终止区可获自与启动子序列相同的基因，或者可获自不同的基因。
[0375] 用来将遗传信息转移到细胞中的特定表达载体不是特别关键的。可使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常见载体。标准的细菌表达载体包括质粒(诸如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D)和融合表达系统(诸如MBP、GST和LacZ)。表位标签也可加到重组蛋白中来提供方便的分离方法，例如c-myc。序列标签可包括于用于核酸拯救的表达盒中。诸如荧光蛋白、绿色或红色荧光蛋白、β-gal、CAT和类似物的标志可包括于载体中作为载体转导的标志。
[0376] 含有来自真核病毒调节元件的表达载体一般用在真核表达载体中，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体、反转录病毒载体和来自埃巴病毒的载体。其他示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和允许蛋白在CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对在真核细胞中表达有效的其他启动子指导下表达的其他载体。特别优选的表达系统是BacMam表达系统，其使用基于杆状病毒的载体来在哺乳动物细胞中表达多肽，本文为在HEK-293细胞中表达的TRPML3多肽。
[0377] 从真核载体表达蛋白也可使用可诱导启动子来调节。使用可诱导启动子，通过将这些物质的应答元件加入该启动子，表达水平取决于诸如四环素或蜕皮激素的诱导剂的浓度。只有在诱导剂存在时，高水平表达一般获自可诱导启动子；基底表达水平最低。
[0378] 本发明中使用的载体可包括可调节启动子，例如，tet-调节系统和RU-486系统(参见例如Gossen & Bujard，Proc.Nat’l Acad.SciUSA 89：5547(1992)；Oligino等，Gene Ther.5：491-496(1998)；Wang 等，Gene Ther.4：432-441(1997)；Neering 等，Blood88：1147-1155(1996)；和Rendahl等，Nat.Biotechnol.16：757-761(1998))。这些给予小分子控制候选靶核酸的表达。这一有益特点可用来确定所需表型是由转染的cDNA而不是体细胞突变引起的。
[0379] 一些表达系统具有提供基因扩增的标志，诸如胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。可选地，不涉及基因扩增的高产量表达系统也是适合的，诸如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，使用在多角体蛋白启动子指导下的基因序列或其他强杆状病毒启动子。
[0380] 一般包括于表达载体中的元件还包括在特定宿主细胞中起作用的复制子。在大肠杆菌中，该载体可包含编码抗生素抗性的基因以便允许含有重组质粒的细菌的选择，和在质粒非必需区的独特的限制位点以便允许真核序列的插入。选择的特定抗生素抗性基因不是关键的，本领域已知的许多抗性基因的任一种是合适的。优选地选择原核序列以便其不干扰DNA在真核细胞中的复制，如果需要。
[0381] 标准的转染方法可用来产生表达大量需要的味觉特异蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准技术进行纯化(参见例如Colley等，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guideto Protein Purification(蛋白纯化指导)，于Methods in Enzymology第182卷(Deutscher编辑，1990))。真核和原核细胞的转化根据标准技术进行(参见例如Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等，编辑，1983)。可使用将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何已知程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、凝聚胺、原生质体融合、电穿孔、生物射弹、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传材料引入宿主细胞的其他公知方法的任一种(参见例如Sambrook等，上文)。唯一必要的是：使用的特定遗传改造程序能成功地将至少一个基因引入能表达该基因的宿主细胞中。
[0382] 在将表达载体引入细胞之后，转染细胞在支持基因表达的条件下培养。在一些实例中，可使用下文鉴定的标准技术从培养物中回收此类多肽。
[0383] 用于推测的味觉细胞特异基因产物调节剂的测定
[0384] 推测的味觉细胞特异蛋白的调控可使用多种体外和体内测定来评定，包括如上文所述的基于细胞的模型。此类测定可用来测试该蛋白或其片段的抑制剂和激活剂，以及因此测试其抑制剂和激活剂。此类调节剂潜在地用于药物治疗，或作为调味剂来调控咸味味觉或其他味觉形态或整体味觉，或用作潜在治疗剂用于调控涉及本文报道的鉴定的味觉细胞特异基因的一个或几个的味觉细胞相关的功能或表型。
[0385] 使用表达重组或天然存在的该味觉特异蛋白的细胞的测定可使用如本文所述的体外、体内和离体的各种测定来进行。为了鉴定能调控其活性的分子，进行测定来检测各种候选调节剂对优选地在细胞中表达的活性的影响。
[0386] 特别地，离子通道蛋白的通道活性可使用各种测定来测定以便测量离子流的改变，包括膜片钳技术、测量全细胞电流、放射性标记的离子流测定或与原子吸收光谱偶联的流量测定和使用电压敏感染料或锂或钠敏感染料的荧光测定(参见例如Vestergarrd-Bogind 等，J.Membrane Biol.88：67-75(1988)；Daniel 等，J.Pharmacol.Meth.25：185-193(1991)；Hoevinsky等，J.Membrane Biol.137：59-70(1994))。例如，编码蛋白或其同系物的核酸可被注射入爪蟾卵母细胞或转染到哺乳动物细胞中，优选地诸如HEK-293细胞或CHO细胞的人细胞。然后可通过测量膜极化的改变(即膜电位的改变)来评定通道活性。
[0387] 获得电生理测量的优选方法是通过使用膜片钳技术来测量电流，例如“细胞附着”模式、“内-外”模式和“全细胞”模式(参见，例如，Ackerman等，New Engl.J.Med.336：1575-1595，1997)。全细胞电流可使用标准方法来确定，诸如由Hamil等，Pflugers.Archiv.391：185(1981)描述的方法。
[0388] 也方便地通过测量胞内离子水平(即钠或锂)的改变来评定通道活性。此类方法示例于本文。例如，可通过评定放射性钠的摄取、或者通过使用适合的荧光染料来测量钠流量。在一般的显微荧光测定试验中，一旦结合了单个钠离子就经历荧光改变的染料被加载到表达味觉细胞特异离子通道的细胞的胞质内。一旦暴露于激动剂，通过当钠结合时发生的荧光改变反映了胞质钠的增加。
[0389] 除了这些优选方法，该味觉细胞特异多肽的活性也可使用多种其他体外和体内测定来评定以便确定功能、化学和物理影响，例如测量其与包括肽、小有机分子和脂类的其他分子的结合；测量蛋白质和/或RNA水平，或者测量该多肽的其他方面，例如转录水平或影响味觉细胞特异蛋白活性的生理改变。当使用完整细胞或动物确定功能结果时，技术人员还可测量多种影响，诸如细胞生长的改变或pH改变或胞内第二信使(诸如IP3、cGMP或cAMP)或磷脂酶C信号传导途径组分或调节子的改变。此类测定可用来测试KCNB蛋白的激活剂和抑制剂。这样鉴定的调节剂用于例如许多诊断和治疗应用。
[0390] 体外测定
[0391] 鉴定对该基因具有调控活性的化合物的测定优选地在体外进行。本文的测定优选地使用根据本发明的全长蛋白或其变体。该蛋白可任选地与异源蛋白融合以形成嵌合体。在本文示例的测定中，优选地用在高通量测定中的表达全长多肽的细胞用来鉴定调控基因功能的化合物。可选地，纯化的重组或天然存在的蛋白可用在本发明的体外方法中。除了纯化蛋白或其片段，重组或天然存在的味觉细胞蛋白可以是细胞裂解物或细胞膜的一部分。如下文所述，结合测定可以是固态或可溶的。优选地，该蛋白、其片段或膜与固相支持物共价或非共价结合。通常，本发明的体外测定是非竞争或竞争配体结合或配体亲和力测定(具有已知的胞外配体，诸如薄荷醇)。这些体外测定包括测量蛋白的光谱(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力(例如形状)、色谱或溶解度特性的改变。
[0392] 优选地，进行高通量结合测定，其中蛋白与潜在调节剂接触，并孵育适当量的时间。如下文所述，可使用多种调节剂，包括小有机分子、肽、抗体和配体类似物。多种测定可用来鉴定调节剂的结合，包括标记的蛋白-蛋白结合测定、凝胶电泳迁移率变动、免疫测定、诸如磷酸化测定的酶测定和类似测定。在一些实例中，候选调节剂的结合通过使用竞争结合测定来确定，其中在潜在调节剂存在时测量使用已知配体结合的干扰。在此类测定中，已知配体首先结合，然后加入需要的化合物(即推测的增强剂)。在特定蛋白被洗涤后，确定潜在调节剂或已知配体结合的干扰。通常潜在调节剂或已知配体被标记。
[0393] 另外，高通量功能基因组测定也可用来通过鉴定破坏味觉特异多肽和与其结合的其他蛋白的蛋白质相互作用的化合物来鉴定冷感调节剂。此类测定可例如使用细胞系或初生细胞检测细胞表面标志表达的改变、胞内钙的改变、或膜电流的改变。细胞一般与cDNA或随机肽文库(核酸编码)接触。该cDNA文库可包含正义、反义、全长和截短的cDNA。该肽文库由核酸编码。然后使用如上文所述的测定监测cDNA或肽文库对细胞表型的影响。cDNA或肽的影响可使用例如核酸的可调节表达(诸如从四环素启动子的表达)被证实并与体细胞突变区分。编码肽的cDNA和核酸可使用本领域技术人员已知的技术(例如使用序列标签)而被拯救。
[0394] 根据本发明与由cDNA编码的蛋白相互作用的蛋白可使用酵母双杂交系统、哺乳动物双杂交系统或噬菌体展示筛选等来分离。这样鉴定的靶可进一步用作这些测定的诱饵来鉴定可与特定离子通道、受体或转运蛋白相互作用的其他组分，其成员也是药物开发的靶(参见例如Fields等，Nature 340：245(1989)；Vasavada等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA88：10686(1991)；Fearon等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89：7958(1992)；Dang等，Mol.Cell.Biol.11：954(1991)；Chien等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9578(1991)；和美国专利第5,283,173、5,667,973、5,468,614、5,525,490和5,637,463号)。
[0395] 基于细胞的体内测定
[0396] 在优选实施方案中，野生型和突变体味觉细胞特异蛋白在细胞中表达，并且测定其功能(例如物理和化学)或表型改变以便鉴定调控其功能或恢复突变体基因(例如具有受损的门控功能的基因)功能的调节剂。表达蛋白的细胞也可用在结合测定中。如本文所述可测量任何适合的功能影响。例如，膜电位的改变、胞内锂或钠水平的改变和配体的结合都是适合使用基于细胞的系统来鉴定潜在调节剂的测定。用于此类基于细胞的测定的适合的细胞包括初生细胞和改造为表达蛋白的重组细胞系。因此该味觉细胞特异蛋白可以是天然存在的或重组的。如上文所述，具有离子通道活性的这些蛋白的片段或嵌合体也可用在基于细胞的测定中。例如，根据本发明的离子通道的跨膜结构域可与异源蛋白(优选地异源离子通道蛋白)的胞质结构域融合。该嵌合蛋白将具有离子通道活性，并且可用于本发明的基于细胞的测定中。在另一个实施方案中，味觉细胞特异蛋白的结构域(诸如胞外或胞质结构域)用在本发明的基于细胞的测定中。
[0397] 在另一个实施方案中，特定靶味觉多肽的细胞多肽水平可通过测量蛋白或mRNA的水平来确定。使用选择性结合多肽或其片段的抗体的免疫测定(诸如蛋白质印迹、ELISA和类似测定)来测量与离子通道激活相关的蛋白水平。对测量mRNA，例如使用PCR、LCR的扩增、或例如northern杂交、RNA酶保护、点杂交的杂交测定是优选的。如本文所述，使用直接或间接标记的检测剂(例如荧光或放射活性标记的核酸、放射活性或酶标记的抗体和类似物)来检测蛋白或mRNA的水平。
[0398] 可选地，可使用报告基因系统来测量蛋白的表达。该系统可使用与报告基因(诸如氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶、细菌萤光素酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶)可操作地相连的靶基因启动子来设计。此外，感兴趣的蛋白可通过与第二个报告基因(诸如红色或绿色荧光蛋白)相连而用作间接报告基因(参见，例如，Mistili & Spector，Nature Biotechnology 15：961-964(1997))。报告基因构建体一般转染进细胞。用潜在调节剂处理后，根据本领域技术人员已知的标准技术测量报告基因转录、翻译、或活性的量。
[0399] 在另一个实施方案中，可测量与信号转导相关的功能影响。激活或抑制的离子通道将潜在地改变靶酶、第二信使、通道和其他效应蛋白的特性。该实例包括磷脂酶C和其他信号系统的激活。还可检查下游结果，诸如磷脂酶C产生二酰基甘油和IP3。
[0400] 离子通道活性的测定包括用离子或电压敏感的染料加载细胞来报告活性，例如通过观察钠流入或胞内钠的释放。用于确定此类受体活性的测定也可使用已知的这些受体的激动剂和拮抗剂作为阴性或阳性对照来评定测试化合物的活性。在用于鉴定调节化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定中，将分别使用离子敏感或膜电压荧光指示剂来监测胞质中离子水平或膜电压的改变。可采用的离子敏感指示剂和电压探针包括公开于Molecular Probes 1997产品目录的那些。也可使用放射性标记的离子流测定或与原子吸收光谱偶联的流量测定。
[0401] 分离编码TRPML3蛋白的核酸
[0402] 本发明部分依赖于重组遗传学领域的常规技术。公开本发明中使用的一般方法的基本课本包括Sambrook和Russell，MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)(第三版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(基因转移和表达实验手册)(1990)；和Current Protocols inMolecularBiology(分子生物学最新方法)(Ausubel等，编辑，1994))。
[0403] 编码TRPML3蛋白、多态变体、直向同源物和等位基因的核酸可使用TRPML3核酸探针和寡核苷酸在严格杂交条件下通过筛选文库来分离。可选地，通过检测免疫上与针对TRPML3或其部分制备的抗血清或纯化抗体同源表达，表达文库可用来克隆TRPML3蛋白、多态变体、直向同源物和等位基因。
[0404] 为了制备cDNA文库，技术人员应选择富含TRPML3 RNA的来源。然后使用反转录酶将mRNA变为cDNA，连接到重组载体中，并转染到重组宿主中用于繁殖、筛选和克隆。用于制备和筛选cDNA文库的方法是公知的(参见，例如，Gubler & Hoffman，Gene 25：
263-269(1983)；Sambrook等，上文；Ausubel等，上文)。
263-269(1983)；Sambrook等，上文；Ausubel等，上文)。
[0405] 对基因组文库，从组织提取DNA，机械剪切或酶消化来产生约12-20kb的片段。该片段然后通过梯度离心与不需要大小的片段分开，并构建到细菌噬菌体λ载体中。这些载体和噬菌体在体外包装。通过如Benton & Davis，Science 196：180-182(1977)所述的斑块杂交分析重组噬菌体。如Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，72：3961-3965(1975)的一般描述进行菌落杂交。
[0406] 可选地，使用T7 RNA多聚体从用适当的限制性酶线性化的DNA体外转录cRNA，可从TRPML3 DNA质粒产生编码TRPML3的TRPML3 cRNA，得到的cRNA显微注射进适合的细胞中，例如卵母细胞，优选地青蛙卵母细胞。
[0407] 分离TRPML3核酸及其直向同源物、等位基因、突变体、多态变体和保守修饰的变体的可选方法结合使用合成的寡核苷酸引物和扩增RNA或DNA模板(参见美国专利第4,683,195和4,683,202号；PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)(Innis等，编辑，1990))。诸如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)的方法可用来直接从mRNA、从cDNA、从基因组文库或cDNA文库扩增TRPML3的核酸序列。简并寡核苷酸可设计为使用本文提供的序列来扩增TRPML3同系物。限制性内切核酸酶位点可加入引物中。聚合酶链反应或其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达蛋白的核酸序列、制备核酸以便使用其作为探针用于检测生理样品中编码TRPML3的mRNA的存在、用于核酸测序或用于其他目的。通过PCR反应扩增的基因可从琼脂糖凝胶纯化并克隆到适当的载体中。
[0408] TRPML3的基因表达也可通过本领域已知的技术分析，例如反转录和扩增mRNA、分离总RNA或poly A+RNA、northern杂交、点杂交、原位杂交、RNA酶保护、高密度多核苷酸阵列技术，例如类似技术。
[0409] 编码TRPML3蛋白的核酸可与高密度寡核苷酸阵列技术一起使用(例如GeneChip)来鉴定本发明中的TRPML3蛋白、直向同源物、等位基因、保守修饰的变体和多态变体。在其中鉴定的同系物与T细胞激活和迁移的调控相关的实例中，其可与GeneChip一起使用作为诊断工具来检测生物样品中的疾病，参见，例如，Gunthand等，AIDSRes.Hum.Retroviruses14：869-876(1998)；Kozal等，Nat.Med.2：753-759(1996)；Matson等，Anal.Biochem.224：
110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.14：1675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.8：435-448(1998)；和Hacia等，Nucleic Acids Res.26：3865-3866(1998)。
110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.14：1675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.8：435-448(1998)；和Hacia等，Nucleic Acids Res.26：3865-3866(1998)。
[0410] 如指出，鉴定调控(即增强、抑制或阻抑)TRPML3的化合物的优选测定包含监测表达与至少一个推测的TRPML3调节剂(增强剂或抑制剂)接触的TRPML3的细胞中电流改变的电生理测定。这些测定可使用表达功能性TRPML3的任何细胞。在优选实施方案中，该细胞将包含卵母细胞，优选地青蛙卵母细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞，或者适合用于表达功能性TRPML3离子通道的另一个表达系统。优选地，该表达系统将表现出强烈并且迅速的TRPML3钠通道的表达，并且理想地将不表达任何或非常少的内源离子通道，因此有助于鉴定特异调控TRPML3钠通道功能的化合物。因此，不需要的背景应答被最小化或消除。此外，诸如卵母细胞的强烈细胞是需要的，因为这使细胞能重新用在根据本发明的测定中。先前已报道卵母细胞迅速并强烈地表达其他功能性离子通道(Pascal，CRC Crit.Rev.Biotech.22(4)：317-87(1987)；Wagner 等，Cell Physiol.Biochem.10：1-12(2000)；Canessa等，Nature 367：463-467(1994))。
[0411] 特别优选的电生理测定是在青蛙卵母细胞中通过二电极电压钳技术来测量TRPML3通道功能的适度通量的测定。这种强烈、快速的表达系统提供了在仅约18-24小时之后可达数百万的离子通道在卵母细胞膜中表达。此外，因为卵母细胞相对大(直径1mm，与大多数哺乳动物相比相对较大)，其容易处理和操作。
[0412] 基于这些优势，单个卵母细胞可用来获得多个和重复的电生理记录。卵母细胞一般还表达很少的内源通道。因此卵母细胞允许重复的直接测量靶化合物对TRPML3钠通道功能的影响。
[0413] 在根据本发明的优选二电极电压钳测定中，将已显微注射了TRPML3 cRNA的青蛙卵母细胞转移到玻璃闪烁瓶，并在适当条件下孵育以便有助于TRPML3蛋白的表达。
[0414] 在获得了TRPML3钠离子通道表达之后(一般在cRNA显微注射后约24小时)，根据二电极电压钳技术使用适当的二电极电压测量装置(例如OpusXpress 6000A平行卵母细胞电压钳系统(MDS AnalyticalTechnologies))来测量TRPML3功能。二电极电压钳技术测量通过TRPML3钠离子通道穿过完整的卵母细胞膜的宏观电流。用电压感受电极和电流感受电极穿刺卵母细胞；使用电压感受电极将跨卵母细胞膜的电压或电位差异固定于特定值，并使用电流感受电极测量保持该电压所需的跨卵母细胞膜的电流或离子流量。OpusXpress系统是可商业获得的二电极电压测量装置的一个实例，其是半自动的，并且包含允许同时记录从8个卵母细胞产生的电生理记录的工作站。该系统还提供了自动卵母细胞刺穿和通过计算机控制的递送化合物到96-孔化合物板的流体操纵杆来递送靶化合物。
该系统能最好地描述为中等或适度通量系统，因为其允许每周评估可达100种化合物。当然，可通过添加如所述的其他电压测量装置来筛选更多的化合物。
该系统能最好地描述为中等或适度通量系统，因为其允许每周评估可达100种化合物。当然，可通过添加如所述的其他电压测量装置来筛选更多的化合物。
[0415] 该测定系统中，TRPML3增强剂将导致卵母细胞膜中穿过TRPML3通道的电流的增强。该值通过标准公式计算。此类测定还可包括适当的阴性对照，例如已知的TRPML3抑制剂。因此，该化合物作为内对照起作用来证实卵母细胞表达功能性TRPML3，并允许在应用化合物之后筛选推测的TRPML3增强剂(如果靶化合物是TRPML3增强剂，其将导致卵母细胞膜中穿过TRPML3通道的电流的增强)。
[0416] 理想地，计算每个增强剂的增强系数％。例如，100％增强剂相对于基底对照值(没有化合物)增加了TRPML3活性100％。
[0417] 还理想地使用阴性对照来确认没有用TRPML3 cRNA注射的卵母细胞不表现出相同的影响。
[0418] 理想地，还对表现出强％增强阀的化合物进行更复杂的分析(例如，电流/电压(I/V)曲线、竞争实验和剂量应答曲线)来确定化合物表现出一半最大活性的浓度(EC50值)。这些实验将进一步确认该化合物的影响是TRPML3-特异的。
[0419] 这些测定将提供对TRPML3调节剂(优选地TRPML3增强剂)的鉴定，其可用作食物、饮料、药物和类似物质的添加剂以便调控与其相关的咸味味觉。理想地，TRPML3增强剂将表现出至少20％的增强系数，更优选地至少50％和甚至更优选地至少100％的增强系数。
[0420] 测试作为TRPML3蛋白调节剂的化合物可以是任何小有机分子或生物实体，诸如蛋白质(例如抗体或肽)、糖、核酸(例如反义寡核苷酸或核酶)、或脂类。可选地，调节剂可以是TRPML3蛋白的遗传改变形式。测试化合物一般将是小有机分子、肽、脂类和脂类类似物。优选地，测试化合物对人消耗是安全的。
[0421] 本质上，任何化合物可用作本发明的测定中潜在的调节剂或配体，尽管通常使用的大多数化合物可溶解于水或有机(特别是基于DMSO)溶液中。该测定设计为通过自动化测定步骤和为测定提供来自任何方便来源的化合物来筛选大的化学文库，两者一般是平行地运行(例如，在机器人测定中在微量滴定板上以微量滴定的形式)。应理解，有许多化合物供应商，包括ChemDiv(San Diego，Calif.)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、Fluka Chemika-Biochemica-Analytika(BuchsSwitzerland)和类似供应商。
[0422] 在优选实施方案中，适度或高通量筛选方法涉及提供含有大量潜在TRPML3调节剂(潜在激活剂或抑制剂化合物)的小有机分子或肽文库。然后如本文所述在测定中筛选此类“化学文库”来鉴定那些显示出需要的特征活性的文库成员(特定的化学物种或亚类)。这样鉴定的化合物可作为常规的“先导化合物”，或者其本身可用作潜在的或实际的产物。如指出，优选的卵母细胞二电压钳电极系统(单个装置)允许每周检测约60个化合物。
[0423] 组合化学文库是通过化学合成或生物合成、通过组合多种化学“结构单元”(诸如试剂)产生的多种化合物的集合。例如，线性组合化学文库(诸如多肽文库)是通过组合以特定化合物长度的每种可能的方式(即多肽化合物中氨基酸的数目)的一组化学结构单元(氨基酸)形成的。通过化学结构单元的这种组合混合可合成无数化合物。
[0424] 组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。此类组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利第5,010,175号，Furka，Int J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature 354：84-88(1991))。也可使用产生化学多样性文库的其他化学物质。此类化学物质包括但不限于：类肽(例如，PCT公布第WO 91/19735号)、编码肽(例如，PCT公布第WO 93/20242号)、随机生物寡聚体(例如，PCT公布第WO
92/00091号)、苯二氮杂卓(例如，美国专利第5,288,514号)、诸如海因、苯二氮杂卓和二肽的多样体(diversomer)(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6909-6913(1993))、乙烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽模拟肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science
261：1303(1993))、和/或肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))、核酸文库(参见Ausubel，Berger and Sambrook，都见上文)、肽核酸文库(参见，例如，美国专利第5,539,083号)、抗体文库(参见，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：
309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如，Liang等，Science，
274：1520-1522(1996)和美国专利第5,593,853号)、小有机分子文库(参见，例如，苯二氮杂卓，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利第5,569,588号；
噻唑烷酮和间噻嗪酮(metathiazanone)，美国专利第5,549,974号；吡咯烷，美国专利第
5,525,735和5,519,134号；吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；苯二氮杂卓，美国专利第5,288,514号，和类似物质)。
92/00091号)、苯二氮杂卓(例如，美国专利第5,288,514号)、诸如海因、苯二氮杂卓和二肽的多样体(diversomer)(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6909-6913(1993))、乙烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽模拟肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science
261：1303(1993))、和/或肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))、核酸文库(参见Ausubel，Berger and Sambrook，都见上文)、肽核酸文库(参见，例如，美国专利第5,539,083号)、抗体文库(参见，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：
309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如，Liang等，Science，
274：1520-1522(1996)和美国专利第5,593,853号)、小有机分子文库(参见，例如，苯二氮杂卓，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利第5,569,588号；
噻唑烷酮和间噻嗪酮(metathiazanone)，美国专利第5,549,974号；吡咯烷，美国专利第
5,525,735和5,519,134号；吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；苯二氮杂卓，美国专利第5,288,514号，和类似物质)。
[0425] 用于制备组合文库的装置可商业获得(参见，例如357MPS、390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville Ky.，Symphony，Rainin，Woburn，Mass.，433A Applied Biosystems，Foster City，Calif.，9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。另外，多种组合文库本身可商业获得(参见，例如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.，Martek Biosciences，Columbia，Md.，等)。
[0426] 例如使用高通量筛选(HTS)筛选化合物来鉴定能结合和/或调控味觉受体或味觉离子通道多肽或转运子或其片段活性的那些化合物。本发明中，蛋白在细胞(例如哺乳动物细胞或青蛙卵母细胞)中重组表达，并且通过使用离子通道、受体或转运子功能的任何测量(诸如测量膜电位、或测量胞内钠或锂水平的改变)来测定活性的调控。测定例如阳离子的离子通道功能的方法包括例如，膜片钳技术、二电极电压钳、测量全细胞电流和使用离子敏感荧光染料的荧光成像技术和离子流测定(例如放射性标记的离子流测定或离子流测定)。
[0427] 含有使用公开的测定鉴定的TRPML3调节化合物的食物和饮料组合物
[0428] 使用鉴定TRPML3调节化合物的测定鉴定的化合物潜在地用作可消化组合物(即食物和饮料)以及口服施用的药物的成分或香料。调控或增强咸味感受的化合物可单独或组合用作食物或饮料的香料。在优选的应用中，该调节剂将被掺入具有降低水平的钠的食物或饮料，得到的产品的咸味将与高钠产品相似。此类食物和饮料的实例包括小吃产品诸如马铃薯片、薄脆饼干、汤、蘸料、软饮料、包装的肉制品、椒盐卷饼及其他。
[0429] 根据本发明鉴定的咸味香味增强剂或阻抑剂可混合于各种食物和饮料中。食物和饮料的其他实例包括多种食物和饮料，例如，诸如果汁饮料、运动饮料、蔬菜汁、发酵乳酸饮料、碳酸饮料、咖啡、可可饮料、红茶、乌龙茶、绿茶、清酒、酒精和粉末饮料的饮料；诸如糖果、口香糖、片糖、橡皮糖，苏打汽水糖和巧克力的糖食；诸如曲奇饼干、饼干和面包的焙烤食物；诸如酸奶和冰淇淋的甜点；诸如马铃薯片和薄脆饼干的小吃；炖菜、咖喱食物、汤、调料、蘸料、汤面、高汤、味噌、速食肉汤、酱汁、肉汤、果酱、喷洒浇料、日式烤饼、味噌汤、泡菜、饭团浇料、茶饭浇料、诸如小麦、荞麦和中式面条的半熟食或熟食或其冷藏和冷冻食物；诸如速食面的速食食物；和诸如混合的粉状作料和蛋黄酱的作料。
[0430] 在咸味香味增强剂与之混合的食物和饮料中，特别有利于改善机体的是营养和滋养饮料、包括营养补剂饮料的功能饮料、诸如马铃薯片和风味薄脆饼干的小吃产品、诸如咖喱的味香加工食物、炖菜和汤和类似食物。上文的味香加工食物形式包括熟食和半熟食和软罐头、其冷藏或冷冻食物。
[0431] 混合的本发明的咸味香味增强剂或阻抑剂的量可根据咸味香味增强剂或阻抑剂的形式和与之混合的食物或饮料而变化，但优选范围在相对于食物或饮料的0.000001％至1.0wt％，更优选地0.0001％至0.1wt％，更优选地0.00001％至0.01wt％。本发明的咸味香味增强剂或阻抑剂可通过已知方法的任一种来混合。
[0432] 可选地，阻抑或抑制咸味感受的化合物可用作天然含有高盐浓度的食物的成分或香料，以便阻抑或掩盖其咸味。这些材料包括运动饮料和其中存在大量包括钠的电解质的其他组合物，例如在损耗电解质平衡的生病或剧烈运动之后用于药物或置换目的。
[0433] 可包括根据本发明的TRPML3调节化合物的用于摄食的组合物将包括用于人、动物(家养、动物园动物、宠物)摄食的组合物，并且将包括食物、饮料、药剂、营养品(neuticeutical)和化妆品。
[0434] 此类TRPML3调节化合物的量将是产生需要程度咸味感受的量。当然，用在此类应用中的化合物将确定为对人消耗是安全的，并且在人味觉测试中可接受。
[0435] 优选测定实施方案-使用二电极电压钳电生理记录测量卵母细胞中的TRPML3电流
[0436] 使用表达功能性人TRPML3的两栖动物卵母细胞的用于鉴定TRPML3调节剂的电生理测定
[0437] 卵母细胞表达系统具有固有的优势(表达水平，强烈、低的内源离子通道表达)，这使其用于检查化合物对通过TRPML3通道的钠转运的影响。这些化合物是用于增强咸味感受的候选。早期卵母细胞表达系统用于在功能研究中迅速而强烈的表达离子通道(Dascal，CRC Crit.Rev.Biochem.(1987)22(4)：317-387；Wagner等，CellularPhysiology and Biochemistry(2000)10：1-12；Canessa等，Nature(1994)367：463-467)。因此，选择该系统用于使用如下文描述的方法和材料的二电极电压钳测定。
[0438] 卵母细胞表达系统包含以下步骤和方法，其共包含筛选TRPML3增强剂：青蛙外科手术和卵母细胞分离、cRNA的制备、卵母细胞的显微注射和使用二电极电压钳电生理记录在卵母细胞中测量TRPML3电流。以下参考文献描述了用于青蛙外科手术和卵 母 细胞 分 离(Marcus-Sekura等，Methods in Enzymology(1987)152：284-288；Goldin，Methods in Enzymology(1992)207：266-279)、cRNA制备(Swanson等，Methods in Enzymology(1992)207：310-319；Goldin 等，Methods in Enzymology(1992)207：
279-297)、卵母细胞显微注射(Matten等，Methods in Enzymology(1995)254：458-466；
Hitchcock等，Methods in Enzymology(1987)152：276-284)和二电极电压钳电生理记录(Stuhmer，Methods in Enzymology(1992)207：319-339；Wagner等，Cellular Physiology and Biochemistry(2000)10：1-12)的一般实践。这些方法的每种(因为其涉及筛选TRPML3增强剂)进一步详述于下文。
279-297)、卵母细胞显微注射(Matten等，Methods in Enzymology(1995)254：458-466；
Hitchcock等，Methods in Enzymology(1987)152：276-284)和二电极电压钳电生理记录(Stuhmer，Methods in Enzymology(1992)207：319-339；Wagner等，Cellular Physiology and Biochemistry(2000)10：1-12)的一般实践。这些方法的每种(因为其涉及筛选TRPML3增强剂)进一步详述于下文。
[0439] 青蛙外科手术和卵母细胞分离
[0440] 长度大于或等于9cm的雌性非洲爪蟾南非爪蛙获自NASCO(FortAtkinson，Wis.)。青蛙在于蒸馏水中的0.15％MS-222(三卡因或乙基-3-氨基苯甲酸甲烷磺酸酯；Sigma)中麻醉并置于冰上。使用无菌的外科工具，在腹部穿过外层皮肤和内部腹膜层产生连续的1-2cm切口。切去的卵巢叶(含有1000-2000个卵母细胞)置于OR-2不含钙的介质中(82.5mM NaCl、2mM KCl、1mM MgCl2、5mM HEPES用NaOH使pH 7.5)，并依次用2mg/ml IA型胶原酶(Sigma)(使用前制备)消化45分钟，然后用1mg/ml IA型胶原酶消化15分钟在摇摆平台上于室温消化。酶消化之后，在大多数卵母细胞从卵巢叶释放的时间点，卵母细胞在没有胶原酶的OR-2中冲洗，并转移到含有补充有2.5mM丙酮酸钠的Barth′s盐水(88mM NaCl、2mM KCl、0.82mM MgSO4、0.33mM Ca(NO3)2、0.41mM CaCl2、2.4mM NaHCO3和5mM HEPES pH 7.5；Specialty Media)的培养皿中。选择含有对应于含有黑色素色素颗粒的卵暗侧的清晰动物极和对应于含有卵黄蛋白的卵亮侧的植物极的成熟期V或VI卵母细胞(-1mm直径)用于显微注射。使用C6针用3-0黑色编制缝合线(Harvard Apparatus)来缝合青蛙，并且在2-3个月恢复期之后重新用于卵母细胞的分离。
[0441] cRNA制备
[0442] 根据制造商的说明书(Ambion)从描述于WO 02/087306A2的人TRPML3 DNA质粒使用mMESSAGE mMACHINE试剂盒来产生TRPML3 cRNA，在体外使用T7 RNA聚合酶从用限制性酶线性化的DNA转录cRNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳和在260nm和280nm处的分光光度吸光度读数检查cRNA的质量以确保产生全长未降解的cRNA。
[0443] 显微注射
[0444] 显微注射针套在使用硼硅酸盐玻璃毛细管(World PrecisionInstruments Inc.)的Model P-97 Flaming/Brown微量移液器(Sutter Instrument Co.)上，后端填充矿物油(Sigma)，然后使用具有Micro4 MicroSyringe泵控制器的Nanoliter 2000注入器(WorldPrecision Instruments)前端填充TRPML3 cRNA。用含有10-25ng人TRPML3 cRNA的10-25nl卵母细胞显微注射到动物极中。显微注射之后，卵母细胞被转移到含有补充有2.5mM丙酮酸钠的Barth′s溶液的玻璃闪烁瓶中，并在正常大气条件下于18-19℃孵育过夜。在此期间，该卵母细胞将注射的TRPML3 cRNA翻译为蛋白质。
[0445] 使用二电极电压钳测量卵母细胞中的TRPML3电流
[0446] 显微注射10-25ng人TRPML3 cRNA之后24至48小时，使用二电极电压钳技术在OpusXpress 6000A平行卵母细胞电压钳系统(MDSAnalytical Technologies)上测量卵母细胞中的TRPML3功能。二电极电压钳技术是测量通过蛋白通道流过整个卵母细胞膜的宏观电流的电生理方法(Stuhmer，Methods in Enzymology(1992)207：319-339)。用电压感受电极和电流感受电极刺穿卵母细胞；使用电压感受电极使跨卵母细胞膜的电压或电位差固定于特定值，并使用电流感受电极来测量保持该电压所需的跨卵母细胞膜的电流或离子流量。OpusXpress系统是允许同时记录8个卵母细胞的半自动二电极电压钳工作站。卵母细胞的刺穿是自动的，并且化合物的递送是通过计算机控制的来自96孔化合物板的流体操纵杆进行的。
[0447] 卵母细胞置于OpusXpress系统，并浸浴于ND-96溶液中(96mMNaCl、2.5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2和5mM HEPES用NaOH使pH 7.5)。用电压感受和电流感受电极刺穿卵母细胞，套在使用硼硅酸盐玻璃毛细管(World Precision Instruments Inc.)的ModelP-97 Flaming/Brown微量移液器(Sutter Instrument Co.)上，后端填充含有氯化银导线的3M KCl。对于电压感受电极，电极表现出2-10Mohm的阻抗；对于电流感受电极，电极表现出0.5-2Mohm2-10Mohm的阻抗。刺穿之后，卵母细胞的电压固定于-60mV，并且起始实验记录。在50Hz处获得数据，并在5Hz处使用4孔Bessel过滤器进行低通过过滤。
[0448] 说明进行的检查化合物对TRPML3功能的影响的实验顺序的流程图示于图10，包括60mV的保持电位筛选、I/V曲线、NDMG竞争测试、剂量应答曲线和测试未注射的卵母细胞。
[0449] 优选测定实施方案-使用二电极电压钳电生理记录和密码子优化的TRPML3序列测量卵母细胞中的TRPML3电流
[0450] 密码子包含编码蛋白序列中特定氨基酸的3个核苷酸。因为存在61个不同的编码20个氨基酸的密码子核苷酸三联体，大多数氨基酸可由不止一个密码子编码。使用特定物种中每个氨基酸偏爱的密码子的密码子优化可通过增加翻译的速度和准确性而不改变蛋白序列来改进蛋白的功能性表达。
[0451] 产生在DNA水平与非密码子优化的TRPML3具有76.4％同源的人TRPML3基因的密码子优化形式(图19)。密码子被优化为达到人序列的最佳翻译。通过将第5个跨膜结构域中的丙氨酸419突变为脯氨酸，我们还产生了TRPML3的活性形式(A419P TRPML3)。该突变导致TRPML3通道处于开放构象(confirmation)(Xu等，PNAS 104(46)：18321-18326，2007；Grimm等，PNAS 104(49)：19583-19588，2007；Nagata等，PNAS 105(1)：353-358，2008；Kim等，J.Biol.Chem.282(50)：36138-36142，2007)；因此，A419P TRPML3特别用于鉴定TRPML3阻抑剂。
[0452] 野生型(非密码子优化)、密码子优化和A419P TRPML3在卵母细胞中表达，并测量钠电流。图20说明野生型TRPML3产生低水平的钠电流，密码子优化的野生型TRPML3产生中等水平的钠电流，而A419PTRPML3产生高水平的钠电流。因此，密码子优化的野生型TRPML3和A419P TRPML3有助于筛选调控TRPML3功能的化合物。
[0453] 密码子优化的野生型TRPML3可用来筛选开放(增强)如前文所述的TRPML3功能的化合物。下文实施例中的数据说明使用这些序列电生理卵母细胞测定如何能用来鉴定是候选人咸味味觉增强剂的TRPML3增强剂和野生型密码子优化的TRPML3如何有助于在卵母细胞电生理测定中鉴定TRPML3增强剂。
[0454] 优选测定实施方案--TRPML3哺乳动物细胞电生理测定
[0455] 可使用不同的哺乳动物细胞来进行该测定。在优选的示例性实施方案中，永生化的哺乳动物细胞或组织培养细胞(诸如人胚胎肾细胞(HEK293细胞)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))用来检查化合物对通过外源表达的人TRPML3阳离子通道的钠转运的影响。这些化合物是调控咸味感受的候选。离子通道在哺乳动物组织培养细胞系中的表达广泛用于用于功能研究的离子通道迅速和强烈的表达。使用培养的哺乳动物细胞作为表达系统的优势包括：用于将感兴趣的cDNA引入细胞的多种完备方法，包括产生稳定细胞系的能力、相对容易进行膜片钳实验、与来自内源表达的离子通道的电流相比高水平的电流；直接测量离子通道功能的能力。
[0456] 从哺乳动物组织培养细胞系进行电生理记录包含电生理、组织培养和分子生物学领域的技术人员所熟悉的以下步骤和方法：培养物中的细胞维持、cDNA的制备和纯化、通过转染和/或病毒转导将cDNA引入细胞、稳定克隆选择和膜片钳电生理。以下参考文献描述了哺乳动物细胞的膜片钳电生理的一般实践(Sackman B.和E.Neher(编辑).1995.Single-channel recording (单通道记录)，第二版；Hille B.2001.Ion channels of excitable membranes(易兴奋膜的离子通道)，第三版)。
[0457] 使用全细胞电压钳电生理记录测量哺乳动物细胞中的TRPML3电流
[0458] 全细胞电压钳技术是测量通过蛋白通道流过整个质膜的宏观电流的电生理方法。活体哺乳动物细胞置于特殊的含有胞外溶液的显微镜室中。由微型机械手指导并处于视觉控制下，用电传导盐溶液充满的小直径玻璃吸管首先使用导致高抗gigaOhm密封的轻柔负压附着于细胞膜。使用导致全细胞膜片钳构型的进一步吸力破坏吸管内的膜片钳。全细胞膜片钳构型允许组合测量膜内的所有离子通道蛋白或宏观电流。使用膜片钳放大器与全细胞膜片钳构型组合允许操作人员控制跨完整细胞膜的电压或电位差异，以及细胞内部和外部的离子组合物。因此该技术提供了高度敏感和灵活的平台用于生物物理地研究离子通道的特性，包括(但不限于)电压依赖性、激活和失活动力学和对不同离子的通透性以及离子通道阻抑剂、增强剂和调节剂的筛选平台。利用计算机控制的膜片钳放大器配合阀控制器允许电压方案自动执行，并允许胞外溶液迅速交换。因此单个细胞可经受多种电压方案和化合物添加。
[0459] 在任何电生理测定之前，必须获得TRPML3 cDNA有效递送到哺乳动物组织培养细胞。这可以至少3种方式实现：1)使用基于脂质的方法瞬时转染TRPML3 cDNA，2)使用诸如杆状病毒、腺病毒和慢病毒的病毒感染的转导，3)通过将TRPML3稳定加入染色体稳定表达cDNA和选择表达TRPML3的克隆。用来筛选TRPML3电流的增强剂和阻抑剂的哺乳动物的电生理方案与先前描述用于爪蟾卵母细胞的方案类似。简单地说，这些方案包括电流电压分析、候选TRPML3阻抑剂和增强剂的NMDG竞争和剂量应答。另外，全细胞膜片钳电生理技术能克服卵母细胞的二电极电压钳产生的一些局限性。例如，更小尺寸的哺乳动物细胞允许快速过程的更详细的生物物理分析(诸如化合物对激活和失活动力学的影响)。控制细胞胞内溶液的能力还允许测量由化合物的添加引起的通道通透性的任何改变。最后，细胞附着、内-外和外-外膜片构型的能力允许测量单个通道电流的能力，这允许详细鉴定任何增强剂或阻抑剂的作用机制。
[0460] CHO细胞用于野生型TRPML3的功能性表达和筛选咸味味觉调节剂的应用。先前的报道使用膜片钳测定显示HEK293细胞中野生型(WT)TRPML3很少或没有功能(Xu等，PNAS104(46)：18321-18326，2007；Grimm 等，PNAS 104(49)：19583-19588，2007；Nagata等，PNAS 105(1)：353-358，2008；Kim等，J.Biol.Chem.282(50)：36138-36142，2007)。相反，据信A419P突变体TRPML3在HEK293细胞中不受调节，导致当瞬时表达时强烈的电流。图24A中，HEK293细胞用WT和A419P突变体TRPML 3瞬时转染，其电流通过一系列从-100至+60mV的电压步骤测定，以便产生电流-电压相关性图(I/V图)。与WT相比，A419P突变体TRPML3通道的表达导致大、向内的整流电流。在下文实施例中我们描述了允许增加功能的WT TRPML3的诸如CHO细胞的可选细胞系的应用(图24B)。另外，我们显示平均宏观电流和向内整流对WT和A419P TRPML3通道是相同的。因此，诸如CHO细胞的特定细胞系的应用允许提供咸味味觉调节剂筛选平台的哺乳动物系统中WT TRPML3更有效的功能性表达。图25中，我们说明了使用在CHO细胞中表达的WT和A419P突变体TRPML3通道来测试和研究潜在咸味味觉增强剂和阻抑剂的实践。在全细胞电生理测定中，TRPML3增强剂将被观察为当细胞固定于负电位时向内电流的增强。图25A的I/V分析显示WTTRPML3被化合物增强。在同一测定中，TRPML3的阻抑剂导致处于负电位时向内电流的降低。图25B中，在CHO细胞中组成性表达的A419P突变体TRPML3通道被化合物氯化钆(许多离子通道的抑制剂)阻抑。
[0461] 密码子优化的cDNA用于哺乳动物细胞中有效表达TRPML3和筛选咸味味觉调节剂的应用
[0462] 密码子包含编码蛋白序列中特定氨基酸的3个核苷酸。因为存在61个不同的编码20个氨基酸的密码子核苷酸三联体，大多数氨基酸可由不止一个密码子编码。使用特定物种中每个氨基酸偏爱的密码子的密码子优化可通过增加翻译的速度和准确性而不改变蛋白序列来改进蛋白的功能性表达。如先前指出，产生在DNA水平与非密码子优化的TRPML3具有76.4％同源的人TRPML3基因的密码子优化形式(图19)。密码子被优化为达到人序列的最佳翻译。先前我们显示WT TRPML3通道不有效地在HEK293细胞中表达功能性通道(图24A)。在图26中我们说明使用密码子优化的TRPML3极大地克服了HEK293细胞中观察到的表达问题。当通过瞬时转染或使用杆状病毒转导在HEK293细胞中表达密码子优化的WT TRPML3时(图26B)，观察到与A419P TRPML3突变体通道具有相似特性的强烈的电流。因此使用密码子优化的TRPML3允许提供了咸味味觉调节剂筛选平台的HEK293细胞中WTTRPML3离子通道改进的功能性表达。图26C中，我们说明了使用密码子优化的WT TRPML3通道来测试和研究潜在咸味味觉调节剂的实践。该实验中，密码子优化的WT TRPML3 cDNA经由杆状病毒转导递送至哺乳动物细胞。密码子优化的WT TRPML3介导的向内电流被激活TRPML3的化合物增强(图26C)。
[0463] TRPML3异源多聚体用于表达和筛选咸味味觉调节剂的应用
[0464] TRPML3离子通道亚基是离子通道亚基的更大的6TMD离子通道家族的成员。与其他6TMD离子通道相似，据信需要达4个TRPML亚基来产生单个离子通道(Hille B.2001.Ion Channels of excitablemembranes(易兴奋膜的离子通道)，第三版；Venkatachalam等，J BiolChem.2006年6月23日；281(25)：17517-27)。功能性通道可完全由相同亚基组成(同聚的)或者与密切相关的亚基缔合(异聚的)。异聚的通道的一般特征是其通常具有与其同聚的对应物相比中间的生物物理功能，因此增强了通道潜在的功能多样性。也可通过质膜运输的改变和翻译后修饰(诸如磷酸化、泛素化和糖基化)由亚基的不同组合物来调控活性。哺乳动物细胞中异聚的通道的研究可通过经由哺乳动物细胞中的共转染或爪蟾卵母细胞中共注入cRNA而递送多个通道亚基cDNA来实现。另外，多聚化也可通过将通道亚基cDNA共价连接到一起产生表达多个cDNA的稳定细胞系、或用递送多个通道亚基cDNA的多个病毒的病毒转导来实现。
[0465] 实践中，WT和A419P TRPML3通道亚基的多聚化可用来增强表面活性的水平(图27)。如已显示，专有地由A419P TRPML3亚基组成的通道在HEK293细胞中表达功能性通道(图27A)。在同样的细胞中，当非密码子优化WT TRPML3亚基表达时，甚至当使用3倍量的cDNA时没有观察到电流(图27B)。相反，A419P TRPML3 cDNA与WT TRPML3cDNA在HEK293细胞中共同表达导致协同效应，导致比两个单独的通道群体简单相加预测的更大的电流(图27C-D)。这一数据表明由WT和A419P突变体亚基组成的通道存在于膜上，并且可用于TRPML3增强剂和阻抑剂测定。如本实施例所示，使用有限量的A419P cDNA对比WT应增加通道四聚体内WT TRPML3亚基的比例，可能赋予通道中间的生物物理功能。因此由于已表明同聚的A419P TRPML3通道可能已非常可能开放(Po)(Xu等，PNAS 104(46)：18321-18326，
2007)，使用异聚的A419P/WT TRPML3通道可能更适合用于筛选TRPML3增强剂。
2007)，使用异聚的A419P/WT TRPML3通道可能更适合用于筛选TRPML3增强剂。
[0466] 优选测定实施方案-使用膜电位染料监测变体TRPML3的功能
[0467] 开发了用于发现TRPML3调节剂的特定的基于细胞的测定，其可最终用在食物和饮料中来调控咸味感受。在用编码A419P-TRPML3的基因瞬时转染或转导的HEK293细胞中使用特定的膜电位染料(FMPs；Molecular Devices)监测A419P-TRPML3的功能。
[0468] 在本发明的一个实施方案中，表达TRPML3或变体、片段或功能等效物的哺乳动物或青蛙卵母细胞用膜电位荧光染料或钠荧光染料预加载。然后该细胞在存在钠或锂时与TRPML3推测的调节化合物接触。在推测的调节剂存在时阳离子介导的细胞荧光的改变与缺少调节剂时的改变比较来确定TRPML3的调控程度。
[0469] 可选地，哺乳动物细胞可用功能性TRPML3剪接变体和片段转染。然后细胞接种于多孔板的孔中，并孵育足以达到至少约70％会合的时间。然后用膜电位染料染料加载细胞，并与至少一个推测的调控化合物和钠接触。由调节剂/TRPML3相互作用引起的膜电位染料荧光的任何改变使用荧光板读数器或电压强度板读数器来监测。然后推测的咸味味觉调节剂可通过荧光的改变来鉴定。
[0470] 优选测定实施方案-IonWorks TRPML3膜片钳测定
[0471] IonWorks自动膜片钳系统用来检查化合物对通过人TRPML3阳离子通道的钠转运的影响。这些化合物是调控咸味感受的候选。IonWorks系统广泛用于高通量电生理。使用其384-孔形式，IonWorks系统能每天检查上千种化合物，是任何自动电生理系统中最高通量的。IonWorks仪器的优势是其能以其中每个孔对应于单个细胞的标准模式运行，或者以其中每个孔给出64个细胞的平均电流的群体膜片钳(PPC)模式运行，因此增加了总体成功率和降低了孔与孔的差异性。IonWorks系统的其他优势是其使用哺乳动物细胞，并且其通过记录离子电流提供了离子通道功能的直接测量。
[0472] 使用IonWorks膜片钳测定测量CHO-K1细胞中的TRPML3电流
[0473] 可测定人TRPML3的不同形式，包括但不限于野生型形式和编码A419P取代的功能获得突变体形式。可通过3种方法的任一种在CHO-K1细胞中表达TRPML3：(i)瞬时转染，(ii)BacMam转导或(iii)稳定转染，并使用穿孔膜片钳技术在IonWorks Quattro仪器(MDSAnalytical Technologies)上测量TRPML3的功能。使用Detachin细胞分离溶液(Genlantis)解离细胞，离心，并在外部记录缓冲液(150mMNaCl、2mM KCl、1.5mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES用NaOH使pH 7.4)中重悬。将解离的细胞加到384-孔PPC板中，其中每个孔基底有64个洞，每个洞的直径为1-2μm。一个细胞落在一个洞上，并且使用负压在细胞和洞之间形成高mega-Ohm密封。密封形成后，使用穿孔膜片钳技术来获得电进入细胞内部。该技术中，两性霉素(形成孔的抗生素)应用于洞的下面，并在分离、暴露的质膜切片上形成小孔，导致从PPC板下面电进入细胞。一旦进入细胞，起始实验记录。两类电极，平板下的共同接地电极和浸入每个孔的单独记录电极，允许控制电压(跨细胞膜的电位)和允许记录跨完整细胞膜的离子电流的流量。IonWorks Quattro系统是允许记录384孔的半自动膜片钳工作站。细胞分散于膜片板、密封形成和电进入是自动的，而化合物的递送是通过计算机控制的流体操纵杆从384孔化合物平板进行的。
[0474] 以下描述说明了用来鉴定调控(激活或阻抑)TRPML3功能的化合物的IonWorks筛选测定。为了使平板的孔提供数据，必须满足两个标准：(i)首先，孔必须有大多数洞开放(64个洞的平均阻抗必须＞1mOhm并＜10mOhm)和(ii)在细胞添加之后，大多数洞必须具有与膜片板形成高mOhm密封的细胞(64个洞的平均阻抗必须＞10mOhm)。如果满足了这两个标准，仪器收集化合物前扫描和化合物后扫描的数据。所示实施例中(图28)，94％的孔的阻抗大于10mOhm。每次扫描中，在电压改变时测量电流(参见图29的实施例电压指令迹线)。
[0475] 由于TRPML3通道表现出向内整流，记录将显示超极化电位下大的向内电流和去极化电位下小的向外电流(图29)。化合物将以介于-1uM和-100uM之间的浓度应用。如果化合物作为TRPML3增强剂起作用，那么细胞膜中穿过TRPML3通道的电流增强。如果化合物作为TRPML3阻抑剂起作用，那么细胞膜中穿过TRPML3通道的电流减弱。TRPML3电流可在两个不同的电压下检查：例如，-120mV和-40mV。通过影响电压依赖的整流而增强TRPML3的化合物将优先地在其中整流强的-40mV下被检测，而阻抑TRPML3的化合物将优先地在其中TRPML3电流更大的-120mV下被检测。为了定量化合物对TRPML3功能的影响，我们使用以下公式：[(A-Ao)/(B-Bo)]x100。B和Bo是在添加化合物之前测量的电流，而A和Ao是在添加化合物之后测量的电流。A和B是测试电压(-120mV或-40mV)下的电流，而Ao或Bo是0mV下的电流。该值导致用来计量我们的测定中化合物的活性的调控系数％。例如，如果调控系数％等于200％，那么与缺少化合物的对照值相比，该化合物加倍了TRPML3的活性。如果调控系数％等于50％，那么该化合物降低了TRPML3活性至1/2的基底对照值(缺少化合物)。
[0476] 在亲本细胞中进行阴性对照实验以便说明在表达TRPML3的细胞中使用化合物观察到的影响是由于流过TRPML3通道的电流，而不是由于流过细胞膜中内源表达的通道的电流。特异调控TRPML3的化合物不应影响对照CHO-K1细胞中的电流，并且应表现出接近100％的调控系数％。
[0477] 对显示大调控系数％并且不影响对照CHO-K1细胞的化合物进行更复杂的分析。测定包括电流/电压(I/V)曲线、GdCl3竞争实验(GdCl3是TRPML3的阻抑剂)和剂量应答曲线。对I/V曲线，在存在或缺少化合物时，从120mV至+60mV以10mV的增加的电压级数测量电流，以便研究化合物的调控幅度。I/V曲线的斜率指示感兴趣的化合物的电流调控幅度。强增强剂增加I/V曲线的斜率，指示增加的TRPML3离子通道的开放。强阻抑剂降低I/V曲线的斜率，指示增加的TRPML3离子通道的关闭。存在化合物时进行的对照I/V曲线应与缺少化合物时进行的I/V曲线相同和重叠。
[0478] 进行GdCl3竞争实验来说明化合物的影响依赖于TRPML3。首先，应用化合物以便确定调控系数％，然后应用饱和剂量的GdCl3(或一些其他的TRPML3阻抑剂)。为使增强剂直接作用于TRPML3通道，来自用增强剂外加GdCl3处理的细胞的电流应类似于仅用GdCl3处理的细胞观察到的电流。该实验显示当通道被阻抑时，化合物没有增强作用，因此该化合物必须直接调控TRPML3通道的功能。
[0479] 进行剂量应答曲线来确定化合物表现出一半最大活性的浓度(增强剂为EC50，而阻抑剂为IC50)。EC50或IC50值越小，化合物作为TRPML3调节剂的活性越强。通过连续应用增加浓度的化合物(从低剂量(-1nM)开始，发展到高剂量(-1mM))进行剂量应答曲线。如上文所述计算调控系数％，并作为化合物浓度的函数以对数比例作图来确定化合物的EC50或IC50值。
[0480] 说明进行来检查化合物对TRPML3功能的影响的实验顺序的流程图描述于图30，包括在120mV和-40mV的保持电位下筛选、I/V曲线、GdCl3竞争测试、剂量应答曲线和阴性对照实验。
[0481] 动物模型
[0482] 动物模型还潜在用于筛选基因活性的调节剂。转基因动物技术导致基因过量表达，而siRNA和基因敲除技术导致与适当的基因靶向载体同源重组后缺少或降低的基因表达。相同的技术还可应用于制备敲除细胞。当需要时，靶基因的组织特异性表达或敲除可能是必要的。通过此类方法产生的转基因动物用作与基因靶相关应答的动物模型。例如表达根据本发明的基因的此类动物可用来产生超级尝味员(supertaster)表型，诸如用于筛选化学和生物毒素、腐臭/变质/污染的食物和饮料，或者用于筛选调控味觉干细胞分化的治疗性化合物。
[0483] 可通过将标志基因或其他异源基因经由同源重组插入小鼠基因组的内源基因位点来产生敲除细胞和转基因小鼠。此类小鼠也可通过用靶基因的突变形式取代内源基因、或者通过例如通过暴露于已知诱变剂突变内源基因来产生。
[0484] DNA构建体被引入胚胎干细胞的核内。含有新改造的遗传损害的细胞被注入被重新植入受体雌性小鼠的宿主小鼠的胚胎。这些胚胎中的一些发展为具有部分来自突变体细胞系的生殖细胞的嵌合小鼠。因此，通过繁殖嵌合小鼠，可能获得含有引入的遗传损害的新的小鼠系(参见，例如，Capecchi等，Science 244：1288(1989))。根据Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(小鼠胚胎操作实验手册)(1988)和Teratocarcinomas and Embryonic StemCells：A Practical Approach(畸胎瘤和胚胎干细胞实践方法)(Robertson，编辑，1987)，可衍生出嵌合靶向小鼠。
[0485] 优选动物模型测定实施方案-Varitint-Waddler小鼠研究
[0486] 本发明还涵盖称为Varitint waddler小鼠的小鼠模型或相似转基因动物的应用，其中TRPML3咸味味觉细胞被特异地从味蕾切除，并且其中咸味被极大地减弱以便研究体内TRPML3对咸味味觉和涉及钠代谢的其他功能的影响，以及该基因的突变在产生特定细胞类型(诸如咸味味觉细胞、黑色素细胞、垂体细胞和肾上腺细胞)减少的动物中的应用。
[0487] Varitint waddler小鼠的TRPML3离子通道具有功能获得的A419P突变(Di Palma等，PNAS 99(23)：14994-14999，2002)，其来自1942的自发突变(Cloudman等，J.Heredity36：258-263，1945)。这些小鼠被称为Varitint waddler是由于其两个最明显的表型：花斑状的毛色(毛皮的可变色调)和前庭系统缺陷(转圈行为和像鸭子一样摇摆)。增强活性的A419P TRPML3改变了表达TRPML3的细胞(包括皮肤的黑色素细胞以及内耳和前庭系统的毛细胞)的离子平衡，并导致这些细胞群体的死亡(Xu等，PNAS 104(46)：18321-18326，
2007；Grimm 等，PNAS 104(49)：19583-19588，2007；Nagata 等，PNAS 105(1)：353-358，
2008；Kim等，J.Biol.Chem.282(50)：36138-36142，2007)。细胞死亡可能可归因于钠和/或钙离子不受控制地进入细胞质。因此，Varitint waddler小鼠是其中表达A419P TRPML3的细胞相继死亡的细胞切除的模型。
2007；Grimm 等，PNAS 104(49)：19583-19588，2007；Nagata 等，PNAS 105(1)：353-358，
2008；Kim等，J.Biol.Chem.282(50)：36138-36142，2007)。细胞死亡可能可归因于钠和/或钙离子不受控制地进入细胞质。因此，Varitint waddler小鼠是其中表达A419P TRPML3的细胞相继死亡的细胞切除的模型。
[0488] 因为TRPML3在舌上的味觉细胞中特异表达，进行实验来确定表达TRPML3的味觉细胞是否在Varitint waddler小鼠中被切除。使用终点PCR(图31)或实时定量PCR(图32)在来自Varitint waddler小鼠的纯化的味觉细胞中检测不到TRPML3。相反，参与甜味、苦味、鲜味和酸味味觉的基因的表达在Varitint waddler和野生型对照小鼠中是相似的(图31-32)。图33使用组织原位杂交技术说明TRPM5(甜味、苦味、鲜味、GPR113)和PKD2L1/PKD1L3(酸味)味觉细胞在Varitintwaddler小鼠中是完整的。因此，不表达TRPML3(包括甜味、苦味、鲜味、GPR113和酸味)的味觉细胞群体在Varitint waddler小鼠模型不受影响。因此，Varitint waddler小鼠含有缺少TRPML3味觉细胞的味蕾，Varitint waddler小鼠可用来研究在缺少该细胞群体时的咸味味觉。
[0489] 另外，电生理CT神经记录是研究啮齿类动物系统的味觉生物学的完善方法，并且已被用来阐明遗传突变对多种味觉刺激的生理应答的影响(Damak等，
Science.2003301(5634)：850-3；Lyall等，J Physiol.2004558(Pt 1)：147-59；Zhao等，Cell.2003 115(3)：255-66；Mueller等，Nature.2005434(7030)：225-9)。CT神经在真菌状和某些叶状味觉乳头中刺激包含味蕾的前部舌；因此CT神经的活性代表了响应于味元应用于舌前部的味觉受体细胞功能的量度。如前文所述使用本领域技术人员熟悉的程序进行CT神经记录方法(Lyall等，J Physiol.2004558(Pt 1)：147-59；Treesukosol等，Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol.2007 年 5 月，292(5)：R1799-809；Dahl 等，BrainResearch.1997 756：22-34)。
Science.2003301(5634)：850-3；Lyall等，J Physiol.2004558(Pt 1)：147-59；Zhao等，Cell.2003 115(3)：255-66；Mueller等，Nature.2005434(7030)：225-9)。CT神经在真菌状和某些叶状味觉乳头中刺激包含味蕾的前部舌；因此CT神经的活性代表了响应于味元应用于舌前部的味觉受体细胞功能的量度。如前文所述使用本领域技术人员熟悉的程序进行CT神经记录方法(Lyall等，J Physiol.2004558(Pt 1)：147-59；Treesukosol等，Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol.2007 年 5 月，292(5)：R1799-809；Dahl 等，BrainResearch.1997 756：22-34)。
[0490] 使用CT神经记录，显示Varitint waddler小鼠表现出对氯化钠响应的缺陷。具体地，Varitint waddler小鼠具有极度减弱的benzamil-不敏感CT神经对氯化钠的应答(图34)。因为TRPML3不受阿米洛利或阿米洛利类似物benzamil阻抑，benzamil-不敏感的CT应答主要归因于TRPML3。CT神经应答的起始(相位型)和持续(紧张型)组分在Varitint waddler小鼠中被减弱。这些数据表明消除TRPML3味觉细胞显著降低了小鼠感受咸味的能力，并指出TRPML3味觉细胞作为专业咸味味觉细胞的中心作用。
[0491] 这些结果进一步显示Varitint waddler小鼠具有其中TRPML3味觉细胞被特异切除的味蕾，并且这些小鼠可用在其中特异影响咸味味觉的味觉研究中。
[0492] 这些结果还显示Varitint waddler小鼠表现出benzamil-不敏感CT神经对氯化钠应答的缺陷，并且Varitint waddler小鼠表现出CT神经对氯化钠应答的起始(相位型)和持续(紧张型)组分的缺陷。
[0493] 重要地，这些结果显示可使用A419P TRPML3的表达以便特异地切除细胞类型并产生缺少不同细胞群体的小鼠模型系统。
[0494] 这些动物还可用来研究A419P TRPML3作为毒素杀死特定细胞类型的影响。
[0495] 候选调节剂
[0496] 测试作为推测的味觉相关蛋白或涉及味觉细胞的其他非味觉相关功能和表型的调节剂的化合物可以是任何小有机分子或生物实体，诸如例如抗体或肽的蛋白质、糖、例如反义寡核苷酸或核酶的核酸或脂类。可选地，调节剂可以是蛋白的遗传改变形式。测试化合物一般将是小有机分子、肽、脂类和脂类类似物。在一个实施方案中，该化合物是天然存在或合成的薄荷醇类似物。
[0497] 本质上任何化合物可用作本发明测定中的潜在调节剂或配体，尽管通常使用的大多数化合物可溶解于水或有机(特别是基于DMSO)溶液。该测定被设计为通过自动化测定步骤和为测定提供来自任何方便来源的化合物来筛选大的化学文库，其一般平行地进行(例如在机器人测定中在微量滴定板上以微量滴定形式进行)。应理解，化合物有许多供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)、Aldrich(St.Louis，Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、Fluka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs Switzerland)和类似供应商。
[0498] 在一个优选实施方案中，高通量筛选方法涉及提供组合的小有机分子或含有大量潜在治疗性化合物(潜在调节剂或配体化合物)的肽文库。然后在如本文所述的一个或多个测定中筛选此类“组合化学文库”或“配体文库”来鉴定显示需要的特征活性的那些文库成员(特定的化学物类或亚类)。这样鉴定的化合物可作为常规的“先导化合物”，或者它们本身可用作潜在或实际的治疗剂。
[0499] 组合化学文库是通过化学合成或生物合成、通过组合许多化学“结构单元”(诸如试剂)产生的多种化合物的集合。例如，诸如多肽文库的线性组合化学文库是通过以特定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)的每种可能的方式来组合一组化学结构单元(氨基酸)形成的。通过化学结构单元的此类组合的混合可合成无数化合物。
[0500] 组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。此类组合化学文库包括但不限于肽文库(参见，例如，美国专利第5,010,175号，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature 354：84-88(1991))。也可使用产生化学多样性文库的其他化学。此类化学包括但不限于：类肽(例如，PCT公布第WO 91/19735号)、编码的肽(例如，PCT公布第WO 93/20242)、随机生物寡聚体(例如，PCT公布第WO 92/00091号)、苯二氮杂卓(例如，美国专利第5,288,514号)、诸如海因、苯二氮杂卓和二肽的多样体(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))、乙烯类多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、具有葡萄糖支架非肽模拟肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science261：1303(1993))、和/或肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))、核酸文库(参见Ausubel，Berger和Sambrook，都见上文)、肽核酸文库(参见，例如，美国专利第5,539,083号)、抗体文库(参见，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：
309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如，Liang等，Science，274：
1520-1522(1996)和美国专利第5,593,853号)、小有机分子文库(参见，例如，苯二氮杂卓，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利第5,569,588号；噻唑烷酮和间噻嗪酮，美国专利第5,549,974号；吡咯烷，美国专利第5,525,735和5,519,134号；
吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；苯二氮杂卓，美国专利第5,288,514号，和类似物质)。
309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如，Liang等，Science，274：
1520-1522(1996)和美国专利第5,593,853号)、小有机分子文库(参见，例如，苯二氮杂卓，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利第5,569,588号；噻唑烷酮和间噻嗪酮，美国专利第5,549,974号；吡咯烷，美国专利第5,525,735和5,519,134号；
吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；苯二氮杂卓，美国专利第5,288,514号，和类似物质)。
[0501] 用于制备组合文库的装置可商业获得(参见，例如357MPS、390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville Ky.，Symphony，Rainin，Woburn，Mass.，433A Applied Biosystems，Foster City，Calif.，9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。另外，多种组合文库本身可商业获得(参见，例如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.，Martek Biosciences，Columbia，Md.，等)。C.固态和可溶高通量测定
[0502] 可使用靶味觉特异蛋白或表达本文公开的天然存在或重组的靶味觉蛋白的细胞或组织进行其他可溶性测定。可选地，可以高通量形式进行基于固相的体外测定，其中蛋白或其片段(诸如胞质结构域)附着于固相底物。本文描述的测定的任一种可适合用于高通量筛选，例如配体结合、钙流量、膜电位改变等。
[0503] 在本发明的可溶或固态的高通量测定中，可能在一天内筛选几千种不同的调节剂或配体。该方法可用于在体外测定蛋白，或用于包含蛋白的基于细胞或基于膜的测定。特别地，微量滴定板的每孔可用来运行针对选择的潜在调节剂的单个测定，或者如果要观察浓度或孵育时间的影响，每5-10个孔能测试单个调节剂。因此，单个标准微量滴定板可测定大约100种(例如96种)调节剂。如果使用1536孔平板，那么单个平板可容易地测定约100-约1500种不同的化合物。每天可能测定许多平板；可能使用本发明的整合系统来测定筛选达约6,000、20,000、50,000或超过100,000种不同化合物。
[0504] 对固态反应，感兴趣的蛋白或其片段(例如胞外结构域)、或包含感兴趣的蛋白或其片段作为融合蛋白一部分的细胞或膜可通过共价或非共价键合(例如通过标签)直接或间接与固态组分结合。该标签可以是多种组分的任一种。一般地，结合标签的分子(标签结合剂)被固定于固相支持物，并且感兴趣的标签分子通过标签和标签结合剂的相互作用附着于固相支持物上。
[0505] 基于文献中清楚描述的已知的分子相互作用，可使用许多标签和标签结合剂。例如，当标签具有天然结合剂(例如，生物素、蛋白A、或蛋白G)时，其可与适当的标签结合剂(亲和素、链霉亲和素、中性链亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)一起使用。具有诸如生物素的天然结合剂的分子的抗体也是普遍可用的适当的标签结合剂；参见SIGMA Immunochemicals 1998目录SIGMA，St.Louis Mo.)。
[0506] 相似地，任何半抗原或抗原化合物可与适当的抗体组合使用以便形成标签/标签结合剂对。数千种特异抗体是可商业获得的，并且许多其他抗体描述于文献中。例如，在一种常见构型中，标签是一抗，而标签结合剂是识别一抗的二抗。除了抗体-抗原相互作用，受体-配体相互作用也是合适的标签和标签结合剂对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体相互作用，诸如转移、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙黏着蛋白家族、整联蛋白家族、选凝素家族和类似受体；参见，例如，Pigott & Power，The Adhesion Molecule FactsBook I(黏着分子事实手册I)(1993)。相似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如，阿片剂、类固醇等)、胞内受体(例如其介导各种小配体的影响，包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D；肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状多聚体构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都能与各种细胞受体相互作用。
[0507] 诸如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯的合成的多聚体也可形成适当的标签或标签结合剂。一旦回顾了本公开内容对本领域技术人员明显的是，许多其他的标签/标签结合剂对也用在本文描述的测定系统中。
[0508] 诸如肽、聚醚和类似物的常用的接头也可用作标签，并且包括诸如介于约5至200个氨基酸之间的多聚甘氨酸序列的多肽序列。此类柔韧的接头是熟悉本领域的技术人员已知的。例如，聚(乙二醇)接头可获自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Ala。这些结构任选地具有酰胺键合、巯基键合、或异功能键合。
[0509] 使用目前可用的多种方法的任一种将标签结合剂固定于固相底物。固相底物一般通过将底物的所有或一部分暴露于将化学基团固定于与标签结合剂的一部分反应的表面的化学试剂而被衍生化或功能化。例如，适合用于附着于更长链部分的基团将包括胺、羟基、硫醇基和羧基基团。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可用来功能化多种表面，诸如玻璃表面。此类固相生物多聚体阵列的构建清楚描述于文献中。参见，例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immunol.Meth.102：259-274(1987)(描述了针上固相组分的合成)；Frank & Doring，Tetrahedron44：6031-6040(1988)(描述了纤维素盘上各种肽序列的合成)；Fodor等，Science，251：
767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，NatureMedicine 2(7)：753-759(1996)(都描述了固定于固相底物的生物多聚体阵列)。用于将标签结合剂固定于底物的非化学方法包括其他常用的方法，诸如热、通过UV辐射交联和类似方法。
767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，NatureMedicine 2(7)：753-759(1996)(都描述了固定于固相底物的生物多聚体阵列)。用于将标签结合剂固定于底物的非化学方法包括其他常用的方法，诸如热、通过UV辐射交联和类似方法。
[0510] 上文已描述了本发明，下文提供的实施例进一步说明了本发明的一些优选实施方案。这些实施例仅为说明的目的提供，并且不应解释为限制本发明。
[0511] 发明的实践应用
[0512] 调控(优选地增强)根据本发明鉴定的味觉特异基因活性的化合物在调控人咸味味觉和潜在地其他味觉形态或总体味觉中具有重要应用。另外，这些化合物潜在地用于涉及其他味觉细胞相关功能和表型的治疗性应用，诸如味觉细胞周转、消化疾病、消化功能、代谢的调节、口腔和/或消化系统中免疫性的调节和类似功能和表型。
[0513] 激活舌上味觉乳头的味觉离子通道的化合物可用来通过促进Na+转运进味蕾细胞来增强咸味感受。这在改进低盐食物和饮料的味觉和适口性中具有明显的消费应用。
[0514] 另外，本文的基因和基因产物可用作鉴定、分离或富集特定味觉细胞类型或谱系的标志。
[0515] 进一步，特异于本文鉴定的味觉细胞的基因和基因产物可用来鉴定调控味觉细胞凋亡、调控控制味觉受体表达的转录因子、调控自分泌/旁分泌调控的味觉细胞的发育、延长味蕾寿命、产生超级尝味员动物表型的化合物用在诸如用于生物恐怖的筛选中或用在筛选诱导干细胞在体内激活和分化为味觉细胞的化合物的动物。
[0516] 该基因、基因产物和表达该基因的细胞可用来筛选影响味觉受体往返顶端膜/味孔区的运输，以便增强或抑制总体或特异味觉、调节味觉细胞动作电位放电频率/膜电位来控制总体或特异味觉的强度、调节神经递质释放到传入神经来控制总体或特异味觉的强度和自分泌/旁分泌调控的味觉受体功能。
[0517] 进一步，该基因、基因产物和表达该基因的细胞可用来鉴定诸如在患有癌症、化疗辐射、影响味觉的损伤或外科手术、药物诱导的味觉障碍、味觉缺失的老年个体或患者中再生味觉细胞和用于减轻味蕾丧失的化合物。
[0518] 更进一步，该基因和基因产物和表达该基因的细胞可用来筛选影响口腔卫生、口臭、口腔中有毒物质的解毒和唾液/口或消化道中细菌、病毒和其他免疫原的中和/消除的化合物。
[0519] 优选地，TRPML3调节剂可用作香味添加剂以便引发或调控(增强或抑制)咸味感受和治疗涉及钠代谢、吸收和排泄的病况和生理功能。特别地，可将TRPML3调节剂加到食物、饮料和药剂以及其他消费产品中，以便调控或掩盖其咸味。另外，TRPML3调节剂和增强剂可用来治疗和调控TRPML3相关的心脏和泌尿功能，诸如血压、液体潴留、尿液产生、中风、心脏病发作、心律不齐、醛固酮产生和血管加压素释放。
[0520] 另外，转基因TRPML3动物(例如敲除和敲入动物)在研究钠代谢和其他活性对生理过程和诸如爱迪生氏病的疾病的影响中具有实践应用，以及用于鉴定调控TRPML3的化合物。
[0521] 涉及TRPML3的以下实施例提供了确认的证据表明TRPML3编码咸味受体多肽并且使用上文描述的材料和方法进行。提出这些实施例以便为本领域普通技术人员提供完整的公开内容和描述如何产生和使用本发明，并且不意图限制被认为是本发明的范围。实施例
[0522] 实施例1：
[0523] 本实施例涉及包含于图1的实验和分子生物学数据，其显示TRPML3是味觉特异基因。通过激光捕获显微解剖收集的人(左侧)和猴(右侧)味蕾(味觉)和舌上皮细胞(舌)进行RT-PCR。图1显示TRPML3仅在味觉细胞中表达，与已知味觉特异基因T1R2和TRPM5类似。该图还显示了管家基因β-肌动蛋白在味觉和舌细胞中表达，表明来自两个样品的RNA是高质量的。‘+’表明进行了反转录，而‘-‘表明没有进行反转录(阴性对照)。
只有具有反转录观察到条带。所有条带被克隆并测序来确认基因的身份。
只有具有反转录观察到条带。所有条带被克隆并测序来确认基因的身份。
[0524] 实施例2：
[0525] 本实施例含有包含于图2的电生理测定，其揭示了TRPML 3形成钠通道。如其中所述进行表达人TRPML3的细胞的全细胞膜片钳电生理。可以看出TRPML3产生在去除钠和用大的不通透阳离子NMDG置换时被阻抑的钠泄漏电流。同一图中的上部迹线显示了处于-60mV保持电位下的电流。图2的中部迹线显示在钠存在(NaCl)和不存在(NMDG-Cl)时从-100mV至+60mV的电流-电压迹线。图中下图显示在钠存在(深蓝色线；菱形)和不存在(红紫色线；方形)时的电流电压曲线。可以看出TRPML3表现出向内整流(与正电压相比负电压下更强的电流)。
[0526] 实施例3：
[0527] 本实施例涉及结果包含于图3的电生理测定。使用人TRPML3通道特性获得的这些结果与人咸味味觉心理物理学一致。图中的上图含有显示TRPML3钠传导(深蓝色线；菱形)不被30uM阿米洛利(红紫色线；方形)阻抑的电流-电压曲线。人咸味味觉和TRPML3都不被阿米洛利阻抑。同一图的下图含有显示TRPML3可均等地透过咸味阳离子钠(深蓝色线；菱形)和锂(红紫色线；方形)。这与TRPML3编码人咸味受体一致，因为钠和锂对人是均等咸味的，并且两个阳离子都透过人TRPML3通道。
[0528] 实施例4：
[0529] 本实施例涉及包含于图4中的免疫组织化学标记实验。其中可以看出TRPML3蛋白在接近味孔的顶端膜区表达。特别地，可以看出TRPML3抗体标记延伸至味孔的味觉细胞过程(左图)。另外，面向唾液的顶端味蕾结构域的放大清楚说明了TRPML3蛋白在味孔区表达(3个右图；味孔用蓝色箭头表示)。该位置理想地适合TRPML3感受唾液中的钠。与TRPML3类似，其他味觉受体(甜味、苦味、鲜味和酸味)也向味孔极化，其中其采样唾液用于其所需的味元。
[0530] 实施例5：
[0531] 本实施例涉及包含于图5的免疫化学标记实验。这些结果显示TRPML3蛋白不在TRPM5细胞中表达。具体地，使用TRPM5(绿色；左图)和TRPML3(红色；中图)在猴CV乳头中进行双标记免疫组织化学。从该图可以看出表达TRPM5和TRPML3的细胞是不同的(右边为合并的图)。这些数据表明TRPML3不在TRPM5细胞(包含甜味、苦味和鲜味细胞)中表达，而仅在专业的咸味味觉细胞中表达。
[0532] 实施例6：
[0533] 本实施例涉及包含于图6的免疫组织化学标记实验。这些结果显示TRPML3蛋白不在PKD2L1细胞中表达。使用PKD2L1(绿色；左图)和TRPML3(红色；中图)在猴CV乳头中进行双标记免疫组织化学。从图中可以看出表达PKD2L1和TRPML3的细胞是不同的(右边为合并的图)。这些数据表明TRPML3不在PKD2L1细胞(包含酸味细胞)中表达，而在专业的咸味味觉细胞中表达。
[0534] 实施例7：
[0535] 用人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞中的I/V曲线
[0536] 以下实施例说明了鉴定调控(激活或阻抑)TRPML3功能的化合物的卵母细胞筛选测定。表达TRPML3的卵母细胞通过I/V曲线分析和使用NMDG的钠置换来鉴定。参见图7。以从100mV至+60mV的电压等级以10mV的增量测量电流。由于TRPML3通道表现出向内整流，超极化电位下具有大的向内电流和去极化电位下小的向外电流的卵母细胞表达TRPML3通道。NMDG是不能透过TRPML3的大的阳离子。因此，由NMDG抑制的电流代表依赖于TRPML3的钠电流。使用NMDG抑制电流被用作另一个内对照来证实该卵母细胞表达功能性TRPML3蛋白。
[0537] 由超极化电位(更负的电位)下更强的电流和去极化电位(更正的电位)下更弱的电流表示的向内整流I/V曲线表明卵母细胞表达TRPML3离子通道。使用NMDG置换钠阻抑了TRPML3电流。钠和NMDG的I/V曲线相减产生了TRPML3特异的钠电流。菱形(□)表示钠(NaCl)溶液中的I/V曲线；方形(■)表示不含钠的NMDG溶液中的I/V曲线；三角(▲)代表NaCl和NMDG I/V曲线的相减，并且代表TRPML3-特异的钠电流。
[0538] 实施例8
[0539] 筛选用人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞中可调控TRPML3活性的化合物
[0540] 浓度介于-1uM和-100uM之间的化合物应用于表现出TRPML3功能的卵母细胞。参见图2。如果该化合物作为TRPML3增强剂起作用，则卵母细胞膜中通过TRPML3通道的电流增强(变得更负)。如果该化合物作为TRPML3阻抑剂起作用，则卵母细胞膜中通过TRPML3通道的电流减弱(变得较不负)。为了定量化合物对TRPML3功能的影响，使用以下等式：
[0541] [(A-Ao)/(B-Bo)]x-100
[0542] A是化合物处理之后的电流，Ao是化合物处理之前的电流，B是NMDG处理之后的电流，Bo是NMDG处理之前的电流。该值导致用来用来计量测定中化合物的活性的调控系数％。例如，如果调控系数％等于100％，那么该化合物增加了TRPML3活性100％的基底对照值(缺少化合物)。如果调控系数％等于-100％，那么该化合物降低了TRPML3活性100％的基底对照值(缺少化合物)。在OpusXpress系统中单独计算每个卵母细胞的调控系数％，然后确定每个化合物的平均和标准偏差。
[0543] 在没有注射TRPML3 cRNA的卵母细胞中进行阴性对照实验，以说明在表达TRPML3的卵母细胞中观察到的化合物的影响是由于流过TRPML3通道的电流，而不是由于流过卵母细胞膜中内源表达的通道的电流。特异调控TRPML3的化合物不应影响未注射的卵母细胞中的电流，而是应表现出接近零的调控系数％。
[0544] 如图8所示，计算每个筛选的化合物的调控系数％。该值对应于由化合物引起的电流改变的幅度除以由NMDG引起的电流改变的幅度，乘以-100％。本实施例中，在OpusXpress系统中电压被固定于60mV的4个(可能最多8个)卵母细胞中连续筛选3种化合物(100uM)。所有4个卵母细胞表达TRPML3，如NMDG对测量的卵母细胞电流的抑制效应所证明。所有3个化合物不显著调控TRPML3的功能，因为添加化合物之前和之后的电流是相似的。
[0545] 实施例9：
[0546] 使用TRPML3阻抑剂钆的I/V曲线
[0547] 对显示大调控系数％并且不影响未注射TRPML3 cRNA的卵母细胞的化合物进行更复杂的分析。测定包括电流/电压(I/V)曲线、NMDG竞争实验和剂量应答曲线。对I/V曲线，在存在和缺少化合物时，以从100mV至+60mV的电压等级以10mV的增量测量电流，以便研究化合物的调控幅度。I/V曲线的斜率指示感兴趣的化合物的电流调控幅度。强增强剂增加I/V曲线的斜率，指示增加的TRPML3离子通道的开放。强阻抑剂降低I/V曲线的斜率，指示增加的TRPML3离子通道的关闭。图9说明钆如何阻抑TRPML3并降低I/V曲线的斜率。在未注射TRPML3cRNA的卵母细胞中，在化合物存在时进行的I/V曲线应与在缺少化合物时的I/V曲线相同和重叠。小方形说明钠溶液中的I/V曲线，而大方形说明300uM钆(GdCl3)溶液中的I/V曲线。应注意钆阻抑TRPML3电流并降低I/V曲线的斜率。
[0548] 实施例10：
[0549] NMDG竞争实验
[0550] 进行NMDG竞争实验以便说明化合物的影响依赖于TRPML3。首先，应用NMDG以便说明TRPML3在卵母细胞中表达。然后，应用化合物以便确定调控系数％。最后共同应用NMDG和化合物。为使增强剂直接作用于TRPML3通道，共同应用NMDG外加化合物应表现出NMDG-型应答，意味着电流被抑制，并且没有增强。该实验显示当缺少钠时，以及用不通透的阳离子NMDG置换时，该化合物不能具有增强效应；因此该化合物必须直接调控TRPML3钠通道功能。
[0551] 实施例11：
[0552] 剂量应答曲线
[0553] 进行剂量应答曲线以便确定化合物表现出一半最大活性的浓度(对增强剂为EC50，而对阻抑剂为IC50)。EC50或IC50值越小，该化合物作为TRPML3调节剂的活性越强。通过依次应用增加浓度的化合物(从低剂量(-1nM)开始发展至高剂量(-1mM))进行剂量应答曲线。如上文所述计算调控系数％，并在对数比例上以化合物浓度的函数作图以便确定化合物的EC50或IC50值。
[0554] 实施例12：
[0555] 组成性有活性的钠通道的表达增强了用特定膜电位染料加载的细胞的基底荧光[0556] HEK293细胞用RFP、αENaC或A419P-TRPML3瞬时转染，并用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟。在FLIPR系统(Molecular Devices)上监测膜电位(荧光信号)。参见图11。结果显示当与RFP转染细胞(RFP是对照载体)相比时，表达A419P-TRPML和αENaC的细胞显示增强的基底荧光。这些结果意味着A419P-TRPML3和αENaC的组成性活性引起细胞膜更去极化，并且我们可在该FLIPR测定中测量A419P-TRPML3的活性。
[0557] 实施例13：
[0558] 应用钆降低了表达A419P-TRPML3的细胞中基底荧光的增强
[0559] HEK293细胞用RFP或A419P-TRPML3瞬时转染，并用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular DeviceS)于室温下加载30分钟。参见图12。在FLIPR系统(Molecular Devices)上监测膜电位(荧光信号)。结果显示添加钆(大、短箭头)显著降低了与RFP转染细胞中(长箭头和迹线2)获得的值接近的基底荧光。这些结果表明A419P-TRPML3的组成性活性和TRPML3调节剂的活性都能在该测定中检测。
[0560] 实施例14：
[0561] 应用钆以依赖于剂量的方式降低了表达A419P-TRPML3的细胞中基底荧光的增强[0562] HEK293细胞用RFP或A419P-TRPML3瞬时转染，并用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟。将HBSS、NMDG和增加浓度的钆加到细胞中，并在FLIPR系统(MolecularDevices)上监测导致的膜电位(荧光信号)的改变。参见图13。结果显示与RFP转染细胞中观察到的影响相比，增加浓度的钆更大程度地显著降低了基底荧光。
[0563] 实施例15：
[0564] TRPML3质粒的滴定
[0565] HEK293细胞用RFP(0ug)或增加量的A419P-TRPML3质粒(从0.02ug至2ug)瞬时转染，并用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟。参见图4。将HBSS(对照)和4mM钆加到细胞中，并在FLIPR系统(Molecular Devices)上监测导致的膜电位(荧光信号)的改变。结果显示增加TRPML3质粒的量至0.5g增强了钆影响的大小。
[0566] 实施例16：
[0567] 钆的影响特异于TRPML3
[0568] HEK293细胞用RFP、A419P-TRPML3或αENaC质粒瞬时转染，并用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟。将HBSS(对照)、3mM钆和30uM阿米洛利加到细胞中，并在FLIPR系统(Molecular Devices)上监测导致的膜电位(荧光信号)的改变。参见图15。结果显示钆优先降低A419P-TRPML3转染细胞中的基底荧光计数，而阿米洛利优先降低αENaC-转染细胞中的基底荧光计数。
[0569] 实施例17：
[0570] 用编码A419P-TRPML3的杆状病毒转导HEK293细胞加倍了测定窗口
[0571] HEK293细胞用允许A419P-TRPML3在哺乳动物细胞(BacMaM)中表达的修饰的杆状病毒转导。24小时后感染的细胞用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟。将HBSS(对照)、2mM和3mM钆加到细胞中，并在FLIPR系统(MolecularDevices)上监测导致的膜电位(荧光信号)的改变。参见图16。
[0572] 实施例17：
[0573] 筛选用表达A419P-TRPML3的细胞获得的数据的实施例
[0574] HEK293细胞用允许A419P-TRPML3在哺乳动物细胞(BacMaM)中表达的修饰的杆状病毒转导。24小时后感染的细胞用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟。参见图17。将320种不同化合物(红点)、HBSS(黑点)和钆(蓝点)加到384孔化合物平板的细胞中，并在FLIPR系统(Molecular Devices)上监测导致的膜电位(荧光信号)的改变。该实验中，鉴定了明显阻抑A419P-TRMPL3的两个主要命中。
[0575] 实施例18：
[0576] 用表达A419P-TRPML3的细胞的10,000个化合物的小筛选的概述
[0577] HEK293细胞用允许A419P-TRPML3在哺乳动物细胞(BacMaM)中表达的修饰的杆状病毒转导。24小时后感染的细胞用于HBSS中的膜电位染料(R-8034；Molecular Devices)于室温下加载30分钟，并如图17所示处理。参见图18。筛选10,000种化合物，鉴定了几个主要命中，包括52个阻抑剂命中和113个增强剂命中。
[0578] 实施例11-18显示在这些实验条件下，相对于用对照载体(RFP)转染的细胞，表达A419P-TRPML3的细胞显示了基底荧光的显著增强。TRP通道阻抑剂钆以依赖于剂量和特定方式逆转了荧光的增强。αENaC阻抑剂阿米洛利对由表达A419P-TRPML3引发的增强的基底荧光没有影响。该测定中现已筛选了数千种化合物，并鉴定了几个命中。这些命中将通过电生理和味觉测试来进一步评估。
[0579] 实施例19：
[0580] 密码子优化的TRPML3基因和突变体的构建
[0581] 如图19所示，构建密码子优化的TRPML3基因。密码子包含蛋白序列中编码特定氨基酸的3个核苷酸。因为存在61个不同的编码20个氨基酸的密码子核苷酸三联体，大多数氨基酸可由不止一个密码子编码。使用特定物种中每个氨基酸偏爱的密码子的密码子优化可通过增加翻译的速度和准确性而不改变蛋白序列来改进蛋白的功能性表达。
[0582] 本发明人使用在DNA水平与非密码子优化的TRPML3具有76.4％同源的人TRPML3基因的密码子优化形式(图19)。密码子被优化为达到人序列的最佳翻译。通过将第5个跨膜结构域中的丙氨酸419突变为脯氨酸，还产生了TRPML3的活性形式(A419P TRPML3)。该突变导致TRPML3通道处于开放构象(confirmation)(Xu等，PNAS 104(46)：18321-18326，2007；Grimm 等，PNAS 104(49)：19583-19588，2007；Nagata 等，PNAS 105(1)：353-358，
2008；Kim等，J.Biol.Chem.282(50)：36138-36142，2007)；因此，A419P TRPML3特别用于鉴定TRPML3阻抑剂。
2008；Kim等，J.Biol.Chem.282(50)：36138-36142，2007)；因此，A419P TRPML3特别用于鉴定TRPML3阻抑剂。
[0583] 实施例20：
[0584] 如包含于图20的实验所示，野生型TRPML3的表达产生低钠电流水平，密码子优化的野生型TRPML3产生中等钠电流水平，而A419PTRPML3产生高钠电流水平。因此，密码子优化的野生型TRPML3和A419PTRPML3有助于筛选调控TRPML3功能的化合物。
[0585] 实施例21：
[0586] 筛选用密码子优化的人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞
[0587] 图21含有涉及筛选用密码子优化的人TRPML3 cRNA注射的卵母细胞的实验，以便鉴定激活TRPML3的化合物(TRPML3增强剂)。其中包含的结果说明当卵母细胞被固定于-60mV时，鉴定了激活TRPML3的增强剂。
[0588] 在多种卵母细胞中，TRPML3增强剂增强了TRPML3的活性169+/-26％(顶部代表性迹线)，并且对用没有TRPML3表达的未注射卵母细胞没有影响(底部代表性迹线)。仅添加缓冲液对TRPML3电流没有影响，并且一旦第二次应用，TRPML3增强剂的影响是可再现的。
[0589] 实施例22：
[0590] TRPML3增强剂对TRPML3 I/V曲线的影响
[0591] 图22含有说明TRPML3增强剂对TRPML3 I/V曲线影响的实施例的实验。该图显示在I/V曲线分析中负电压下与前面实施例相同的增强剂激活TRPML3。用密码子优化的人TRPML3cRNA注射的卵母细胞未经处理(蓝色三角标记的对照)或用TRPML3增强剂刺激(红紫色方形标记的增强剂)，并在从-90mV至+30mV的电压下测量电流。应注意TRPML3增强剂在负电压下激活TRPML3电流(与对照相比使用增强剂的向内电流更大)，导致I/V曲线斜率的增加。还应注意零电流向右漂移，暗示在增强剂存在时增强的钠传导。
[0592] 实施例23：
[0593] 图23含有示例了在胞外钠存在和不存在时TRPML3增强剂影响的实验。表达密码子优化的人TRPML3cRNA的卵母细胞用NMDG(没有钠)、TRPML3增强剂外加钠、仅缓冲液、或TRPML3增强剂外加NMDG(没有钠)刺激。应注意在钠存在时TRPML3增强剂增强了TRPML3的活性，但在缺少钠时没有影响。这些数据说明TRPML3增强剂开放TRPML3通道，并增加钠离子流进卵母细胞的流量。图23说明该相同的增强剂在缺少胞外钠时不激活TRPML3。由于该化合物开放TRPML3并增加流入细胞的钠流量，其是候选的咸味味觉增强剂。共同地，这些数据说明电生理卵母细胞测定可如何用来鉴定是候选人咸味味觉增强剂的TRPML3增强剂，以及野生型密码子优化的TRPML3如何有助于在卵母细胞电生理测定中鉴定TRPML3增强剂。
[0594] 实施例24：
[0595] 不同哺乳动物细胞类型中WT TRPML3的表达水平
[0596] 如包含于图24中的实验所示，WT TRPML3的表达水平取决于哺乳动物细胞的类型。该图的图A是表达WT和A419P突变体TRPML3通道的HEK293细胞的电流电压分析(I/V图)。其显示A419P突变体TRPML3通道表达大的向内整流电流(粉色)，而仅观察到小的WT TRPML3电流(蓝色)。B.WT和A419P突变体TRPML3通道在CHO细胞中具有相似的功能特征。
[0597] 实施例25：
[0598] TRPML3用于CHO细胞中增强剂和阻抑剂筛选的应用
[0599] 图25中的实验涉及TRPML3用于CHO细胞中增强剂和阻抑剂筛选的应用。图A显示WT人TRPML3通道在CHO细胞中瞬时表达，其用来鉴定通道增强剂。I/V图显示与单独的缓冲液(蓝色；对照)相比，使用增强剂导致负电位下向内电流的增加(粉色)。图B显示在CHO细胞中稳定表达的突变体A419P TRPML3通道用来鉴定通道阻抑剂。与单独的缓冲液(蓝色；对照)相比，添加1mM GdCl3导致向内电流的减弱(粉色)。
[0600] 实施例26：
[0601] 在哺乳动物细胞中使用密码子优化的TRPML3的筛选测定
[0602] 图26的实验含有在哺乳动物细胞中使用包含于图19的相同的密码子优化的WT TRPML3用于筛选增强TRPML3功能的化合物的实验。图A显示非密码子优化WT TRPML3(浅蓝色)的瞬时表达导致HEK293细胞中很少的电流。相反，使用密码子优化的WT TRPML3(深蓝色；CodOpt WT)导致与A419P突变体通道相似平均幅度的电流(粉色)。图B显示使用杆状病毒转导递送的密码子优化的WT TRPML3(蓝色)导致与A419P TRPML3相似的平均电流(粉色)。图C显示用密码子优化的WT TRPML3杆状病毒转导的细胞用来鉴定TRPML3功能的增强剂。与单独的缓冲液(蓝色；对照)相比，添加增强剂化合物导致向内电流的增加(粉色)。
[0603] 实施例27：
[0604] WT和A419P TRPML3的共同表达
[0605] 图27的实验涉及WT和A419P TRPML3共同表达的实验。该图的结果表明共同表达增加了HEK293细胞中的功能性表面表达。图A显示转染进HEK293细胞的A419P TRPML3 cDNA(0.5ug)引发的电流，产生具有特征性向内整流的电流。图B显示WT非密码子优化的TRPML3(1.5ug)在HEK293细胞中表达，并且不产生电流。图C显示A419P(0.5ug)与WT(1.5ug)TRPML3 cDNA在HEK293细胞中共同表达导致大的向内电流，其为当单独表达A419P cDNA时的电流的两倍大。图D含有WT(蓝色)、A419P(粉色)和WT和A419P共同表达(黄色)的TRPML3 cDNA在HEK293细胞中引发的平均电流的I/V图。
[0606] 实施例28
[0607] 图28的实验是在IonWorks PPC膜片板实验中测量TRPML3功能的实施例。图A含有具有A419 TRPML3可诱导克隆的来自PPC膜片板的所有384个孔的视图，其显示了化合物前扫描的结果。黄色表明其中-120mV下电流≤0nA的孔(在使用亲本CHO-K1细胞的对照实验中，没有孔被标记为黄色)。蓝色表明其中平均密封阻抗太低(＜10mOhm)以致不能可靠地测量电流的孔。可在94％的孔中测量到A419P TRPML3电流。
[0608] 图B含有添加如A所示的来自膜片板的4mM GdCl3或胞外缓冲液(模拟添加)之前和之后的平均电流±SEM。将GdCl3加到柱1-38，而将胞外缓冲液加到柱39-48。为了比较，包括来自使用亲本CHO-K1细胞的单独实验的数据。模拟添加之后TRPML3电流的稳定性表明该测定应检测增强或阻抑TRPML3电流的化合物。
[0609] 实施例29
[0610] 图29含有使用表达A419P TRPML3的可诱导CHO-K1细胞系的IonWorks扫描的实施例(上图)。TRPML3向内整流，由超极化电位(更负的电位)下更强的电流和去极化电位(更正的电位)下更弱的电流表示。添加GdCl3阻抑了TRPML3电流。红线表示在钠(NaCl)溶液中的扫描。蓝线表示在4mM GdCl3溶液中的扫描。中图来自用作阴性对照的亲本CHO-K1细胞。负电位下的正电流是由于负电位下过度纠正电流的泄漏差减。下图显示用来记录电流的电压指令方案。从0mV至10mV的等级用来计算泄漏电流(通过密封泄漏流进的电流)，从总电流减去泄漏电流得到流过膜的电流。
[0611] 结果来自PPC膜片板中的单个孔，并且代表可达64个细胞的平均电流。图30含有用来在IonWorks测定中检查化合物对人TRPML3(hTRPML3)活性的影响的实验流程图。
[0612] 实施例30
[0613] 如包含于图31的实时PCR实验结果所示，Varitint waddler小鼠中TRPML3味觉细胞被特异地从味蕾切除。显示了通过激光捕获显微解剖分离的Varitint waddler(Va)或野生型(WT)小鼠味蕾(TB)和舌上皮细胞(LE)上的终点RT-PCR实验。
[0614] 结果表明TRPML3仅在WT小鼠的味蕾中表达，而在Va小鼠的味蕾中缺乏，而所有其他味觉基因(T1R2、Gpr113、TRPM5)以及管家基因(β-肌动蛋白，GAPDH)在TB和LE中均等地表达。‘+’表明进行了反转录，而‘-‘表明没有进行反转录。只有使用反转录酶才能观察到PCR条带，表明PCR产物衍生自mRNA，而不是基因组DNA。
[0615] 实施例31
[0616] 本实施例涉及概述于图32的实验，其含有显示TRPML3细胞被特异地从Varitint waddler小鼠的味蕾切除的实时PCR实验。通过激光捕获显微解剖分离的Varitint waddler(Va)或野生型(WT)小鼠味蕾的实时定量RT-PCR实验。TRPML3仅在WT小鼠的味蕾中表达，而在Va小鼠的味蕾中缺乏(使用两个不同引物套标记的Mcoln3_1和Mcoln3_2获得相似的结果)，而所有其他味觉基因(Tas1r2、Tas1r3、PKD211、TRPM5、Plcb2、Tas2r108和Tas2r116)以及管家基因(对照)在Va和WT小鼠的味蕾中表达。
[0617] 实施例32
[0618] 本实施例涉及图33中的实验，其显示甜味、苦味、鲜味和酸味味觉细胞在Varitint waddler小鼠中保持完整。来自野生型(图的上排)和Varitint waddler(Va；图的下排)小鼠舌后部轮廓状乳头的原位杂交。PKD1L3(左侧；酸味)、PKD2L1(中间；酸味)和TRPM5(右侧；甜味、苦味和鲜味)味觉细胞以相似水平存在于野生型和Va小鼠中。
[0619] 实施例33
[0620] 本实施例涉及在用包含于图34的咸味刺激刺激的野生型和Varitint waddler小鼠中使用CT神经记录的实验，其显示Varitintwaddler小鼠的咸味感受缺陷，而野生型小鼠在相同条件下检测咸味。野生型(左侧)或Varitint waddler(Va；右侧)小鼠的CT神经记录。前部舌用0.1M NaCl或0.1M NaCl外加5uM benzamil刺激来抑制CT神经应答的阿米洛利敏感组分。在NaCl刺激中间，舌用含有10mM KCl的低盐溶液冲洗。应注意，CT神经应答的benzamil-不敏感组分在Va小鼠中被极大地消除(红色箭头)，暗示切除TRPML3味觉细胞显著损害了咸味感受。另外，对NaCl的即时相位应答在Va小鼠被极大地减弱(红色圆圈)。比例尺表明盐应用的时间框(x-轴)和CT应答强度(y-轴；任意单位)。
[0621] 图35含有来自人(NM_018298)和小鼠(NM_134160)TRPML3序列的蛋白序列的比对，其中人表示为Hs，而小鼠表示为Mm。人和小鼠蛋白序列是91％相同和96％相似。人和小鼠TRPML3的TRPML3多肽的6个跨膜结构域是加下划线的TM1至TM6。TM5和TM6之间的孔区表示为‘孔区’。预测氨基和羧基末端位于细胞内部。本文讨论和发现于varitint-waddler小鼠中的A419P突变锁定TRPML3处于开放构象，其位于TM5，并且用红色突出显示。另一个突变V412P部分激活TRPML3，并用红紫色表示。
[0622] 尽管本发明通过实施例和优选实施方案描述，应理解本文使用的词语是描述性词语，而不是限制性词语。可在所附权利要求范围内进行改变，而不背离以其更广方面的本发明的范围和精神。尽管本发明在本文参考特定的方法、材料和实施方案描述，应理解本发明不限于公开的细节。本发明扩展至在所附权利要求范围内的所有同等结构、方法和应用。
[0623] 如前文提到，根据本发明鉴定的味觉细胞特异基因和对应的基因产物和表达该基因的细胞例如内源味觉细胞或化学感受细胞和包括这些味觉特异基因及其直向同源物、等位变体、具有与其至少90％序列同一性的变体和/或上文否定的杂交条件下与其特异杂交的基因的重组细胞可用在鉴定味觉调节化合物的测定中，以及用在治疗性筛选测定中。
[0624] 例如这些味觉特异基因、多肽和表达这些的细胞可用来筛选用于治疗消化系统紊乱的化合物。作为实例这些紊乱包括诸如消化不良的影响消化的病况、影响消化系统的自身免疫和炎性疾病，诸如溃疡性结肠炎、炎性肠病综合征、克罗恩综合征、乳糜泻病，和影响消化系统的前期癌和癌症，诸如影响唾液腺、味蕾、胃、胰腺、胆囊、食管、小或大肠、肛门或结肠的癌症。
[0625] 这些味觉特异基因还可用在鉴定影响味觉细胞周转的化合物的筛选测定中。已知味觉细胞周转迅速(约每几周一次)。此外，包括化疗或辐射治疗的许多病况以及老龄可负面地影响味觉细胞发育的能力。结果是减弱的味觉感受，其可导致癌症患者或老年人生活质量的降低。这在患有头颈癌、食管癌、胃癌、肺癌或胰腺癌的患者中特别明显。另外地，这可与另一个病况(恶病质或消耗综合征)一起进化，其组合来降低进食欲望。缺少合适的营养是癌症患者发病和死亡的严重原因。该味觉特异基因含有在干细胞中表达的基因，表明这些基因是为味觉细胞前体和进化为味觉细胞的干细胞的标志。这些基因或表达这些基因的细胞可用来鉴定加速味觉细胞发育的信号。可能包含存在于味觉细胞上的细胞因子样受体的这些信号介导味觉细胞的发育，并且可用在鉴定诱导味觉细胞分化或增殖的化合物的筛选中。因此配体潜在地可从唾液中分离，并且可解释唾液影响味觉功能的能力。例如，患有舍格伦综合征(攻击唾液腺的自身免疫病)的患者表现出改变的味觉功能。该基因和通过使用基因阵列来研究该基因在唾液腺中的表达将有助于理解这些分化机制。
[0626] 还可使用该味觉细胞特异基因和对应的基因产物以及表达这些基因的细胞，以便鉴定用于调控口腔免疫系统的潜在的治疗剂。口腔由与消化道一样的正常菌群群体化的。正常菌群的改变可产生诸如牙龈炎、口臭、胃病和可导致蛀牙或牙齿脱落的其他感染的病况。本文鉴定的味觉细胞特异基因包括许多免疫系统基因。这些基因和对应的多肽或表达该基因的细胞可用来鉴定用于保持口腔的免疫体内平衡、防止致病菌过度生长和用于鉴定口腔中在保持适当的口腔免疫中发挥关键作用的细胞类型的治疗剂。
[0627] 另外，该味觉细胞特异基因和对应的基因产物或表达该基因的细胞用在用于鉴定治疗糖尿病、诸如肥胖的进食紊乱的化合物的筛选测定中。
[0628] 本发明人鉴定的基因产物和增强或抑制基因产物的化合物可影响：口腔卫生、口臭、厌食中有毒物质的解毒、贪食和其他代谢紊乱。消化系统中味觉受体的表达可能代表消化过程中在不同地方检测食物和不同类型的复杂系统。因此，“感受”食物或特定类型(诸如碳水化合物、脂肪、鲜味食物、盐)的存在，应触发可调节参与消化调节的分子产生的各种信号，诸如肠中进入内分泌细胞产生的GIP(依赖于葡萄糖的促胰岛素多肽)和GLP-1(胰高血糖素样肽1)。可能这些细胞上的味觉受体调节当触发时消化系统其他细胞中其他分子信号的产生。这些现象可通过确定哪些细胞表达不同的受体、然后使用基因阵列来研究当激活时这些细胞产生的分子来研究。
[0629] 更具体地，本发明鉴定并提供了功能性(电生理)和免疫组织化学数据，其表明TRPML3(MCOLN3)编码作为灵长类动物(例如人)咸味受体起作用的多肽。
[0630] 更具体地，本发明还提供了这些味觉特异基因作为可用来富集、鉴定或分离表达咸味受体的细胞的标志的应用。
[0631] 更具体地，本发明还提供了使用TRPML3(MCOLN3)和表达TRPML3的细胞或TRPML3转基因动物模型来鉴定引发或调控(阻抑或增强)包括人的灵长类动物中咸味味觉的激动剂、拮抗剂或增强剂化合物的体外和体内测定。这些测定使用单独表达TRPML3的细胞或表达TRPML3离子通道以及其他味觉特异多肽(诸如NALCN或NKAIN3)的细胞。
[0632] 更具体地，本发明还提供了转基因动物(优选地啮齿类动物)和使用该转基因动物来确认TRPML3在哺乳动物咸味味觉和在涉及钠和其他离子的其他生理功能(诸如钠代谢、血压、液体潴留和排泄、泌尿功能和心脏功能)中的作用。
[0633] 更具体地，本发明还提供了使用TRPML3和表达TRPML3的细胞或转基因动物在测定(优选地电生理测定)中以便鉴定减轻涉及影响其在包括例如人和非人灵长类动物的哺乳动物和啮齿类动物中作为味觉特异的钠通道起作用的该多肽的表达缺陷(包括超表达、低表达和TRPML3多肽的突变)的疾病和病况的体外和体内测定。作为实例这些病况包括爱迪生氏病和涉及异常醛固酮产生或血管加压素释放的疾病，诸如高血压、低血压、液体潴留和受损的泌尿或心脏功能，诸如心律不齐、心脏病发作和中风。另外，可使用TRPML3调节化合物治疗的病况包括黑色素瘤和涉及黑色素细胞(melanocyes)的其他病况，诸如色素沉着紊乱。
[0634] 因此，综上所述，本发明涉及鉴定MCOLN3为编码人咸味受体，其允许设计使用该基因转染的细胞用于鉴定影响该分子功能的激动剂、拮抗剂或增强剂(调节化合物)的筛选测定。这些化合物可用作味觉调节剂和用作调控钠代谢、吸收和排泄的治疗剂。为了进一步描述本发明和示例性实施方案，下文提供了来自不同哺乳动物(包括人)的以下TRPML3核酸和多肽序列。然而，如前文所述，根据本发明鉴定的味觉细胞特异基因和对应的基因产物和表达该基因的细胞例如内源味觉细胞或化学感受细胞和包括这些味觉特异基因及其直向同源物、等位变体、嵌合体和与其具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的遗传改造的片段和变体和/或在上文否定的杂交条件下特异与其杂交的基因的重组细胞可用在鉴定味觉调节化合物的测定中，以及用在治疗性筛选测定中。
[0635] 参考文献
[0636] 本申请中引用的所有参考文献整体通过引用并入本文。
[0637] 序列表
[0638] (示例性TRPML3、TRPML2、TRPML1多肽和核酸序列和NKAIN3和NALCN的序列)[0639] 智人(homo sapiens)TRPML3(NM_018298)(SEQ ID NO：1)
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[0649] 智人TRPML1(NM_020533)(SEQ ID NO：6)
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[0657] 小家鼠(mus musculus)TRPML3(NM_134160)(SEQ ID NO：10)
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[0659] 原鸡(gallus gallus)TRPML3(XM_426647)(SEQ ID NO：11)
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[0661] 原鸡TRPLM3(XM_426647)(SEQ ID NO：12)
[0662] MITRGFRSGFYGCSNRYSGAKCQLVAQTFVISAMETPEVAVSSCSARDDEGLCSYGQHLLLPQELVAEDQLRRKLKFFFMNPCEKFWARGRKPWKLGIQLLKIAMVTIQLVLFGLSNQMVVAFKEENTIAFKHLFLKGYMDRMDDTYAVYTQTDVYDQIFFAINQYLQLPNISVGNHAYEKKGAEETALAVCQQFYKQGTICPGNDTFDIDPEIVTDCLYIEPMMSLDNRTVGKHNLNFTLDFHRLVAVQLMFNLKAINLQTVRHHELPDCYDFTLTIVFDNKAHSGRIKISLDNDIEIRECKDWHVSGSIQKNTHYMMIFDAFVILICLSSLILCTRSVVKGIRLQREFVSFFLYYYKKEVSYNDQMEFVNGWYILIMVSDVLTIVGSTLKMEIQAKSLTSYDVCSILLGTSTMLVWLGVIRYLGFFQKYNLLILTLRAALPNVMRFCCCAAMIYLGYCFCGWIVLGPYHVKFRSLNVVSECLFSLINGDDMFATFAKMQQKSYLVWLFSRIYLYSFISLFIYMVLSLFIALITDTYETIKHYQQDGFPETELQRFISQCKDLPNSGRYRLEEEGSVSLFCCCSGPSEHI(SEQ ID NO：12)[0663] 家犬(canis familiaris)TRPML3(XM_547306)(SEQ ID NO：13)
[0664] ATGACCCCTTTTGGCAGCTTGGCTTCTGCAAAGGCTTCAAACTCAAGAGCTGCCTGGAAGATTGTGGTGGATTCATTCAGCTCGCAGCACACGCCCCAGGTGGGCACTGGTGGTCCCCAGGAATCAGACAAGGCCCTTACCTTCGGAGAGTTAACGTTCTCCCACTCATCTCCATTCTTCATCTGCGCCAGCCCTTCTCTCCCACCGTTGCACAGCAGTGGGCTAGACGATGAGCCATACTGCTGGACAGGTTTTCACTGCATCAAGTACCTCGCGGGCCCAGCGAGTGTCCCAAACTCCCTTGAAAGAGGGAGTAAGATATTGGTTTCCCAAGCCTCCTTTCCCATCCGGACCTCCCCTTACCTGACACTGCTAAGCCGAGGGGAAAAGAAGCCTCTCTGCAGTTCCGTGGAGAAAAGGCCTTTGGGGGTTTTGGAGATGGGAAGTCTGACTCTCCTCTCGGAAGAGCTCAAACGGCAGCTCCCCGGCACGCTGTTGCTAGGACAACCTCCGTTGCTAAGGGAAAGAGGCGGCTCCTCTGCTGAGATTGACAAGACGCCGCTACCAATAGGGCGTCTACTCTCCGGCCGCCTCTTCAAGGCCGCACTTGTGATTGGCTGCTGTCGTGCTGACGTCACGCAACTCGAACCGCCGAGAGATCCTGGGTTTTCGCCCGCTCGGCAGGAGGTGTGCGGTTTGGGTTCCCGCGTGGAGGGTGCTGCTGGCTCGAATGTAAACAATCTTTTTTTTTTTCTCCCCCTAGAGATGGCAAATCCTACGGTTGTTATAAGTAGCTGCAGCTCTCATGAAGAGGAAAATCGTTGCACTTTTAGCCAGCACACATCGCCCTCTGAGGAGCTTCTGTTAGAAGACCAGATAAGGCGAAAACTCAAATTTTTTTTCATGAATCCTTGTGAAAAGTTCTGGGCTCGAGGTAGAAAACCATGGAAGCTTGCCATACAAATTCTAAAAATTGCAATGGTGACTATCCAGCTGGTCTTTTTTGGGCTAAGTAACCAGATGGTTGTAGCTTTCAAGGAAGAAAACACTATAGCATTCAAACACCTCTTCTTAAAAGGATATATGGACCGAATGGATGACACATATGCAGTGTACACACAACGTGATGTATATGATCAGATCATCTTTGCAGTGAACCAGTACTTGCTTCTACGCAATACCTCGGTTGGGAATCATGCTTATGAGAACAAGGGGACGGAACAGTCTGCTATGGCAATCTGTCAGCACTTCTACAAGCAGGGAAACATCTGTCCTGGAAATGATACCTTCGACATTGATCCAGAGATTGAAACTGAGTGTTTCTCTGTAGAGCCAGCTGAGCCTTTCCACGTCGGAACACTGGAAGAAAATAAACTCAACTTAACGCTGGACTTTCACAGACTCCTCACGGTGGACCTGCAGTTTAAGCTGAAGGCCATTAATCTGCAGACCATTCGGCATCACGAGCTCCCTGACTGTTATGACTTTACTCTCACTATAACATTTGACAATAAGGCCCATAGTGGAAGAATTAAGATAAGTTTAGATAATGATATTTCCATCAGAGAATGTAAAGACTGGCATGTATCGGGATCAATTCAGAAGAACACTCACTACATGATGATCTTTGATGCCTTTGTTATTCTGACATGCTTGGCTTCACTAACCCTGTGCCTTCGATCTGTAATTAGAGGACTTCAGCTTCAACAGGAATTTGTCAATTTTTTCCTCCTCCATTATAAGAAGGAAGTTTCTGTTTCTGATCGAATGGAATTTGTCAATGGATGGTACATTATGATTATTATTAGTGACATGTTGACAATTATTGGATCAATTCTGAAAATGGAAATTCAAGCTAAGAGTCTAACAAGTTATGATGTTTGTAGCATACTTCTTGGGACTTCCACCATGCTTGTGTGGCTTGGAGTTATTCGATACCTCGGCTTCTTTCAGAAGTACAATCTCCTTATTCTGACCCTGCAGGCAGCACTGCCCAGTGTCATCAGGTTCTGTTGCTGTGCCGCTATGATTTATTTAGGCTATTGCTTCTGTGGATGGATTGTGCTGGGGCCGTACCATGATAAGTTCCGTTCTCTGAACATGGTCTCTGAGTGCCTTTTCTCTCTGATAAATGGAGATGATATGTTTGCCACATTTGCAAAAATGCAACAAAAAAGTTACTTGGTCTGGCTGTTTAGCAGAATTTATCTCTACTCATTCATCAGCCTCTTTATATATATGATTTTAAGTCTTTTCATCGCACTGATCACTGATACGTATGAAACAATTAAGCATTACCAACAAGATGGCTTTCCAGAGACTGAACTTCGTACATTTATATCAGAGTGCAAAGATCTACCCAATTCTGGAAAATACAGATTAGAAGATGACACTCCAATATCTATATTCTGCTGTTGTAAAAAG(SEQ IDNO：13)
[0665] 家犬TRPML3(XM_547306)(SEQ ID NO：14)
[0666] MTPFGSLASAKASNSRAAWKIVVDSFSSQHTPQVGTGGPQESDKALTFGELTFSHSSPFFICASPSLPPLHSSGLDDEPYCWTGFHCIKYLAGPASVPNSLERGSKILVSQASFPIRTSPYLTLLSRGEKKPLCSSVEKRPLGVLEMGSLTLLSEELKRQLPGTLLLGQPPLLRERGGSSAEIDKTPLPIGRLLSGRLFKAALVIGCCRADVTQLEPPRDPGFSPARQEVCGLGSRVEGAAGSNVNNLFFFLPLEMANPTVVISSCSSHEEENRCTFSQHTSPSEELLLEDQIRRKLKFFFMNPCEKFWARGRKPWKLAIQILKIAMVTIQLVFFGLSNQMVVAFKEENTIAFKHLFLKGYMDRMDDTYAVYTQRDVYDQIIFAVNQYLLLRNTSVGNHAYENKGTEQSAMAICQHFYKQGNICPGNDTFDIDPEIETECFSVEPAEPFHVGTLEENKLNLTLDFHRLLTVDLQFKLKAINLQTIRHHELPDCYDFTLTITFDNKAHSGRIKISLDNDISIRECKDWHVSGSIQKNTHYMMIFDAFVILTCLASLTLCLRSVIRGLQLQQEFVNFFLLHYKKEVSVSDRMEFVNGWYIMIIISDMLTIIGSILKMEIQAKSLTSYDVCSILLGTSTMLVWLGVIRYLGFFQKYNLLILTLQAALPSVIRFCCCAAMIYLGYCFCGWIVLGPYHDKFRSLNMVSECLFSLINGDDMFATFAKMQQKSYLVWLFSRIYLYSFISLFIYMILSLFIALITDTYETIKHYQQDGFPETELRTFISECKDLPNSGKYRLEDDTPISIFCCCKK(SEQ ID NO：14)
[0667] 斑马鱼(danio rerio)TRPML3(XM_688418)(SEQ ID NO：15)
[0668] ATGTCTGACCGAGCGTCACACACTCATGAAAGCGCAACACTTCTGGACCCGGAGTGTGTGGAAAGCTTAAGGAGAAAACTCAAGTATTTCTTCATGAGTCCGTGTCAGAAATACAGCACTAGAGGACGGATACCATGGAAGATGATGCTTCAGATACTCAAGATTTGTTTAGTATTCATCTACCTGGTCTCTTTTGGATTGAGCAACGAGATGATGGTGACGTTCAAAGAGGAAAATCTCATCGCCTTCAAGCACTTCTTTCTGAAAAACTACAAGGACAGCAATAAACATTACGCCTTGTACACAAAACATGAAGTTCACGACCACATCCTCTACACCATCAGACGGTATCTACAGCTACAAAACCTGACGATTGGCAATCAAGCGCTGGAGATGATCGATGGTCTGGCGACTCCTCTGTCTCTCTGTCAGCAGTTGTATCGACATGCGCGCGTCGTGCCGTCTAATGAGACGTTTGAAATCGATCCACATGTAGAGACAGAGTGTGTTTCTGTGTATCCCCTTTCTCCCATCACGACTGACAGTCTGGAAAACTCCCTGAACTTGACTTTAGATTTTCAAAGGTTGTTAGCGGTAAACATTTATCTGAAGATCAAGGCTATCAACATTCAGACGGTTCGCCATCAAGAGTTACCAGACTGCTACGACTTCAGCATTAATATCATGTTTGACAATCGTGCACACAGCGGACAGATCAAGATCTCTCTCAGCAGCGGCGTGCAGATAAACGTCTGTAAGGACTGGAACATTTCTGGCTCAAGTAAGTTGAACAGCCACTTTGCGCTGATTGTGGTGTTTGACTGTTTGATCATCTGCTTCTGTCTGCTGTCACTCATCCTCTGCACGCGCTCAGTCCACACAGGATTTCTCCTACAGACTGAATACAGAAGATTCATGTCCAGTCAGCACAGTAAAAGCGTCTCATGGTCTGAGAGGCTGGAGTTCATCAACGGCTGGTACATCCTCATCATCATCAGCGATGCGCTGACTATTGCAGGCTCAATCCTCAAAATCTGCATACAGAGCAAAGAACTGACGAGCTATGACGTGTGCAGTATTCTGCTGGGCACTGCAACAATGCTGGTGTGGATTGGAGTAATGCGCTACCTCAGTTTCTTCCAGAAATATTATATCCTCATCCTCACCCTGAAGGCTGCACTTCCCAATGTGATTCGATTCTCCATCTGCGCTGTTATGATCTACCTGAGTTACTGCTTCTGCGGATGGATCGTTTTGGGGCCACACCATGAAAATTTTCGCACATTCAGTAGGGTTGCTGGCTGTCTTTTCTCCATGATTAATGGGGATGAAATCTACTCCACGTTCACCAAGCTCCGGGAATACAGCACTCTGGTGTGGCTGTTCAGCAGACTCTACGTCTACAGCTTCATCCCGGTCTTCACATACATGGTTCTGAGTGTCTTCATCGCCCTCATCACAGACACGTATGAAACCATCAGGGTGAGTTATTTCAGCTTCAGTGAGAGTAGCTGCAAA(SEQ ID NO：15)[0669] 斑马鱼TRPML3(XM_688418)(SEQ ID NO：16)
[0670] MSDRASHTHESATLLDPECVESLRRKLKYFFMSPCQKYSTRGRIPWKMMLQILKICLVFIYLVSFGLSNEMMVTFKEENLIAFKHFFLKNYKDSNKHYALYTKHEVHDHILYTIRRYLQLQNLTIGNQALEMIDGLATPLSLCQQLYRHARVVPSNETFEIDPHVETECVSVYPLSPITTDSLENSLNLTLDFQRLLAVNIYLKIKAINIQTVRHQELPDCYDFSINIMFDNRAHSGQIKISLSSGVQINVCKDWNISGSSKLNSHFALIVVFDCLIICFCLLSLILCTRSVHTGFLLQTEYRRFMSSQHSKSVSWSERLEFINGWYILIIISDALTIAGSILKICIQSKELTSYDVCSILLGTATMLVWIGVMRYLSFFQKYYILILTLKAALPNVIRFSICAVMIYLSYCFCGWIVLGPHHENFRTFSRVAGCLFSMINGDEIYSTFTKLREYSTLVWLFSRLYVYSFIPVFTYMVLSVFIALITDTYETIRVSYFSFSESSCK(SEQ ID NO：16)
[0671] 智人TRPML3密码子优化(SEQ ID NO：17)
[0672] ATGGCCGACCCTGAGGTGGTGGTGTCCTCCTGCTCTAGCCACGAGGAAGAGAACCGGTGCAACTTCAACCAGCAGACCAGCCCCAGCGAGGAACTGCTGCTGGAAGATCAGATGCGGCGGAAGCTGAAGTTCTTCTTCATGAACCCCTGCGAGAAGTTCTGGGCCAGAGGCCGGAAGCCTTGGAAGCTGGCCATCCAGATCCTGAAGATCGCCATGGTGACCATCCAGCTGGTGCTGTTCGGCCTGAGCAACCAGATGGTGGTGGCCTTCAAAGAGGAAAACACAATCGCCTTCAAGCACCTGTTTCTGAAGGGCTACATGGACCGGATGGACGACACCTACGCCGTGTACACCCAGAGCGACGTGTACGACCAGCTGATCTTCGCCGTGAACCAGTACCTGCAGCTGTACAACGTGAGCGTGGGCAACCACGCCTACGAGAACAAGGGCACCAAGCAGAGCGCCATGGCCATCTGCCAGCACTTCTACAAGCGGGGCAACATCTACCCCGGCAACGACACCTTCGACATCGACCCCGAGATCGAGACAGAGTGCTTCTTCGTGGAGCCCGACGAGCCTTTCCACATCGGCACCCCTGCCGAGAACAAGCTGAACCTGACCCTGGACTTCCACCGGCTGCTGACCGTGGAGCTGCAGTTCAAGCTGAAGGCCATCAACCTGCAGACCGTGCGGCACCAGGAACTGCCCGACTGCTACGACTTCACCCTGACCATCACCTTCGATAACAAGGCCCACAGCGGCCGGATCAAGATCAGCCTGGACAACGACATCAGCATCCGGGAGTGCAAGGACTGGCACGTGAGCGGCAGCATCCAGAAAAACACCCACTACATGATGATCTTCGACGCCTTCGTGATCCTGACCTGCCTGGTGTCCCTGATCCTGTGCATCAGAAGCGTCATCAGGGGCCTGCAGCTCCAGCAGGAATTCGTCAACTTCTTCCTGCTGCACTACAAGAAAGAAGTGTCCGTCAGCGACCAGATGGAATTTGTGAACGGCTGGTACATCATGATCATCATCAGCGACATCCTGACAATCATCGGCAGCATTCTGAAGATGGAAATCCAGGCCAAGAGCCTGACCAGCTACGACGTGTGCAGCATTCTGCTGGGAACCTCCACCATGCTGGTCTGGCTCGGCGTGATCAGATACCTGGGCTTCTTCGCCAAGTACAACCTGCTGATTCTGACACTGCAGGCCGCCCTGCCCAACGTGATCCGGTTCTGCTGCTGCGCCGCCATGATCTACCTGGGCTACTGCTTCTGCGGCTGGATCGTGCTGGGCCCCTACCACGACAAGTTCCGGTCCCTGAACATGGTGTCCGAGTGCCTGTTCAGCCTGATCAACGGCGACGACATGTTCGCCACCTTCGCCAAGATGCAGCAGAAAAGCTACCTGGTCTGGCTGTTCAGCCGGATCTACCTGTACAGCTTCATCAGCCTGTTCATCTACATGATCCTGAGCCTGTTTATCGCCCTGATCACCGATACCTACGAGACAATCAAGCAGTACCAGCAGGACGGCTTCCCCGAGACAGAGCTGCGGACCTTCATCAGCGAGTGTAAGGACCTGCCCAACAGCGGCAAGTACCGGCTGGAAGATGACCCCCCCGTGTCCCTGTTCTGCTGTTGCAAGAAG(SEQ ID NO：17)
[0673] 智人TRPML3 CDS变体C1149T沉默突变(SEQ ID NO：18)
[0674] ATGGCAGATCCTGAGGTAGTTGTGAGTAGCTGCAGCTCTCATGAAGAGGAAAATCGCTGCAATTTTAACCAGCAAACATCTCCATCTGAGGAGCTTCTATTAGAAGACCAGATGAGGCGAAAACTCAAATTTTTTTTCATGAATCCCTGTGAGAAGTTCTGGGCTCGAGGTAGAAAACCATGGAAACTTGCCATACAAATTCTAAAAATTGCAATGGTGACTATCCAGCTGGTCTTATTTGGGCTAAGTAACCAGATGGTGGTAGCTTTCAAGGAAGAGAATACTATAGCATTCAAACACCTTTTCCTAAAAGGATATATGGACCGAATGGATGACACATATGCAGTGTACACACAAAGTGACGTGTATGATCAGTTAATCTTCGCAGTAAACCAGTACTTGCAGCTATACAATGTCTCCGTTGGGAATCATGCTTATGAGAACAAAGGTACCAAGCAATCTGCTATGGCAATCTGTCAGCACTTCTACAAGCGAGGAAACATCTACCCTGGAAATGATACCTTTGACATCGATCCAGAAATTGAAACTGAGTGTTTCTTTGTGGAGCCAGATGAACCTTTTCACATTGGGACACCAGCAGAAAATAAACTGAACTTAACACTGGACTTCCACAGACTCCTAACAGTGGAGCTTCAGTTTAAACTGAAAGCCATTAATCTGCAGACAGTTCGTCATCAAGAACTCCCTGACTGTTATGACTTTACTCTGACTATAACATTTGACAACAAGGCCCATAGTGGAAGAATTAAAATAAGTTTAGATAATGACATTTCCATCAGAGAATGTAAAGACTGGCATGTATCTGGATCAATTCAGAAGAACACTCATTACATGATGATCTTTGATGCCTTTGTCATTCTGACTTGCTTGGTTTCATTAATCCTCTGCATTAGATCTGTGATTAGAGGACTTCAGCTTCAGCAGGAGTTTGTCAATTTTTTCCTCCTCCATTATAAGAAGGAAGTTTCTGTTTCTGATCAAATGGAATTTGTCAATGGATGGTACATTATGATTATTATTAGTGACATATTGACAATCATTGGATCAATTCTAAAAATGGAAATCCAAGCTAAGAGTCTAACTAGTTATGATGTCTGTAGCATACTTCTTGGGACTTCTACCATGCTTGTGTGGCTTGGAGTCATCCGATACCTCGGTTTCTTTGCAAAGTACAACCTCCTCATTTTGACCCTTCAGGCAGCGCTGCCCAATGTCATCAGGTTCTGCTGCTGTGCAGCTATGATTTACTTAGGTTACTGCTTCTGTGGATGGATCGTGCTGGGGCCTTACCATGACAAGTTTCGTTCTCTGAACATGGTCTCTGAGTGCCTTTTCTCTCTGATAAATGGAGATGATATGTTTGCCACGTTTGCAAAAATGCAGCAAAAAAGTTACTTAGTCTGGCTGTTTAGTAGAATTTACCTCTACTCATTCATCAGCCTCTTTATATATATGATTTTAAGTCTTTTCATTGCACTGATCACTGATACATACGAAACAATTAAGCAATACCAACAAGATGGCTTCCCAGAGACTGAACTTCGTACATTTATATCAGAATGCAAAGATCTACCCAACTCTGGAAAATACAGATTAGAAGATGACCCTCCAGTATCTTTATTCTGCTGTTGTAAAAAG(SEQ ID NO：18)
[0675] 褐鼠(rattus norevigus)(NM_00102059.1)(GI：58865683)(SEQ ID NO：19)[0676] gttcgacaga agcttgtgat ttatggtcca aggaatccag tgtcagatca atagacaaaa[0677] 61 tgccccaggg aagttgtgtg tgcattctac tggacagatc agagactggt cagaacaggt[0678] 121 gcttggctgg cggtgcgtcc aaacctcaga gatggcaaat cctgaggtgg tggtaagcag[0679] 181 ctgcagttct caccaggatg aaagtccctg cactttctac ccgagctcat cccagtccga[0680] 241 gcagcttctc ttagaagatc agatgaggcg gaaactcaaa ttctttttta tgaatccttg[0681] 301 cgagaagttc tgggctcggg gtaggaagcc atggaaactt gccatacaga ttctgaaaat[0682] 361 cgctatggtg actatccagc tggttctgtt tggactaagt aaccagatgg tagtagcttt[0683] 421 caaggaagag aacacgatag ccttcaaaca cctcttcctg aaaggctaca tggaccgaat[0684] 481 ggacgacacc tacgcggtgt acactcagaa tgatgtgtac gaccagatca tctttgcagt[0685] 541 gacccggtac ttgcaacttc gaaacatctc cgtcggcaac catgcttatg agaacaaggg[0686] 601 gactaagcag tcagcaatgg cagtctgtca gcacttctac aggcaaggca ccatctgccc[0687] 661 cgggaacgat accttcgaca tcgatccaga agtcgaaaca gactgtttcc ttatagagcc[0688] 721 agaggaagct ttccacatgg gaacacctgg agaaaacaaa ctcaacctga ccctggactt[0689] 781 ccacagactt ctgacagtgg agctccaatt taagctcaaa gccatcaacc tgcagacagt[0690] 841 tcgccaccag gagcttcctg actgttacga ctttaccctg actataacat tcgacaacaa[0691] 901 ggcacacagt ggaagaatca aaataagttt agacaacgac atttctatca gagaatgcaa[0692] 961 agattggcac gtgtctggat caattcagaa gaacacccac tacatgatga tcttcgatgc[0693] 1021 ctttgttatc ctgacctgct tgtcctcgct ggtgctctgc gccaggtctg tgattcgggg[0694] 1081 tcttcagctt cagcaggagt ttgtcaactt tttccttctt cactacaaga aggaagtttc[0695] 1141 ggcctctgat cagatggagt tcatcaacgg gtggtacatt atgatcatcg ttagtgacat[0696] 1201 actgacgatc gttggatcga ttctgaaaat ggaaatccaa gccaagagtc ttacaagcta[0697] 1261 cgatgtctgt agcatacttc ttgggacttc caccatgctc gtgtggcttg gcgttatccg[0698] 1321 atacctgggt ttctttgcga agtacaatct ccttatcctg accctccagg cagcgctgcc[0699] 1381 caatgtcatc aggttctgtt gctgtgcggc tatgatctat cttgggtatt gcttttgcgg[0700] 1441 atggattgtg ctgggccctt accatgagaa gttccgctct ctgaacaagg tctctgagtg[0701] 1501 cctattctca ctgataaatg gagacgacat gttttccacg ttcgcgaaaa tgcagcagaa[0702] 1561 aagttacctg gtgtggctgt tcagccgcgt ctacctgtac tcgttcatca gcctcttcat[0703] 1621 ctacatgatc ttgagccttt tcatcgcgct catcacagac acgtacgaaa ccattaagca[0704] 1681 ctaccagcaa gatggcttcc cagagacgga acttcgaaag tttatcgctg aatgcaaaga[0705] 1741 cctccccaac tctggaaaat acagattgga agatgaccct ccaggttctt tattctgctg[0706] 1801 ctgcaaaaag taactgtcgg gtttctctgt gcctgggagg aaaatacagt gtgtggatga[0707] 1861 gtcagagaca atatggatta ttggtaatca cgcaacagtg tgttcagata ctagtgttct[0708] 1921 gagttaactc acagctatga ctttgcgggg cctgttaaat atatttttaa atattaaaaa[0709] 1981 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
[0710] 褐鼠(NP_00102059.1)(GI：58865684)(SEQ ID NO：20)
[0711] MANPEVVVSSCSSHQDESPCTFYPSSSQSEQLLLEDQMRRKLKFFFMNPCEKFWARGRKPWKLAIQILKIAMVTIQLVLFGLSNQMVVAFKEENTIAFKHLFLKGYMDRMDDTYAVYTQNDVYDQIIFAVTRYLQLRNISVGNHAYENKGTKQSAMAVCQHFYRQGTICPGNDTFDIDPEVETDCFLIEPEEAFHMGTPGENKLNLTLDFHRLLTVELQFKLKAINLQTVRHQELPDCYDFTLTITFDNKAHSGRIKISLDNDISIRECKDWHVSGSIQKNTHYMMIFDAFVILTCLSSLVLCARSVIRGLQLQQEFVNFFLLHYKKEVSASDQMEFINGWYIMIIVSDILTIVGSILKMEIQAKSLTSYDVCSILLGTSTMLVWLGVIRYLGFFAKYNLLILTLQAALPNVIRFCCCAAMIYLGYCFCGWIVLGPYHEKFRSLNKVSECLFSLINGDDMFSTFAKMQQKSYLVWLFSRVYLYSFISLFIYMILSLFIALITDTYETIKHYQQDGFPETELRKFIAECKDLPNSGKYRLEDDPPGSLFCCCKK
[0712] 野猪(sus scrofa)(AB271930)(GI：146741299)(SEQ ID NO：21)(部分)
[0713] 1 gtgaaatggc agatcctgag cctgtcataa gtagctgcag ctctcgtgaa gaggaaaatc[0714] 61 gctgcacttt taaccagcac acatgtccct ctgaggagcg tctattagaa gaccagatga[0715] 121 ggcgaaaact caaatttttt ttcatgactc cttgtgagaa gttctggact cgaggtcgaa[0716] 181 aaccatggaa acttgccatg caagttctaa aaattgcgat ggtgactatc cagctgatct[0717] 241 ttttcgggct aagtaaccag atggtggtag ctttcaagga agagaacacg atagcattta[0718] 301 aacacctctt tctaaagggc tatgtggacc agatggatga cacatatgcc gtgtacaccc[0719] 361 aaagcgacgt atacgatcgg atcgtcttcg cagtgaacca gtacttgcag ctacgcagca[0720] 421 tctcggttgg gaaccacgct tacgagaaca agggcgcgga gcagtcggcc atggcgatct[0721] 481 gttggcactt ctacaagcaa ggaaacatct gtcctggaaa tgacaccttt gacgttgatc[0722] 541 cagaagtaaa aactgaatgt ttctttgttg agccggatga agctgttgac actggaacac[0723] 601 tggaggagaa taagctcaac ttaacccttg actttcacag actcctaacg gtggagctgc[0724] 661 agtttaaact caaggccatt aatctgcaga cgattcgcca tcacgaactc cctgactgtt[0725] 721 atgacttcac cctgaccata acatttgaca a
[0726] 野猪(BAF62305.1)(GI：14671300)(SEQ ID NO：22)(部分)
[0727] MADPEPVISSCSSREEENRCTFNQHTCPSEERLLEDQMRRKLKFFFMTPCEKFWTRGRKPWKLAMQVLKIAMVTIQLIFFGLSNQMVVAFKEENTIAFKHLFLKGYVDQMDDTYAVYTQSDVYDRIVFAVNQYLQLRSISVGNHAYENKGAEQSAMAICWHFYKQGNICPGNDTFDVDPEVKTECFFVEPDEAVDTGTLEENKLNLTLDFHRLLTVELQFKLKAINLQTIRHHELPDCYDFTLTITFD
[0728] 黑猩猩(pan troglytes)TRPML3(XM_001140555.1)(GI：114557485)(SEQ ID NO：23)
[0729] 1 cttactccaa tcaagcctct gcccgccagg aataggtaac ctgtgtgtgt ccgtttgctc[0730] 61 cttctaagag catgcctgat agatacttcg gtagcctctc cggatggccc cttcgtcggg[0731] 121 tagcctctcc tgatggggtc cttcgcccac cctgcctccc gcgccggcgc tccgggtgaa[0732] 181 tgtcaagggt ggctggctgc gaatacctcc ttcagctgct ggggttcccg acagtttgca[0733] 241 gtttttaaaa gtgcaccctc ggaagggctt ttcagactgg gtaaagctga cttttccaag[0734] 301 agatggcaga tcctgaggta gttgtgagta gctgcagctc tcatgaagag gaaaatcgct[0735] 361 gcaattttaa ccagcaaaca tctccatctg aggagcttct attagaagac cagatgaggc[0736] 421 gaaaactcaa attttttttc atgaatccct gtgagaagtt ctgggctcga ggtagaaaac[0737] 481 catggaaact tgccatacaa attctaaaaa ttgcaatggt gactatccag ctggtcttat[0738] 541 ttgggctaag taaccagatg gtggtagctt tcaaggaaga gaatactata gcattcaaac[0739] 601 accttttcct aaaaggatat atggaccgaa tggatgacac atatgcagtg tacacacaaa[0740] 661 gtgacgtgta tgatcagtta atcttcgcag taaaccagta cttgcagcta tacaatgtct[0741] 721 ccgttgggaa tcatgcttat gagaacaaag gtaccaagca atctgctatg gcaatctgtc[0742] 781 agcacttcta caagcgagga aacatctacc ctggaaatga tacctttgac atcgatccag[0743] 841 aaattgaaac tgagtgtttc tttgtggagc cagatgaacc ttttcacatt gggacaccag[0744] 901 cagaaaataa actgaactta acactggact tccacagact cctaacagtg gagcttcagt[0745] 961 ttaaactgaa agccattaat ctgcagacag ttcgtcatca agaactccct gactgttatg[0746] 1021 actttactct gactataaca tttgacaaca aggcccatag tggaagaatt aaaataagtt[0747] 1081 tagataatga catttccatc agagaatgta aagactggca tgtatctgga tcaattcaga[0748] 1141 agaacactca ttacatgatg atctttgatg cctttgtcat tctgacttgc ttggtttcat[0749] 1201 taatcctctg cattagatct gtgattagag gacttcagct tcagcaggta gggaacgttg[0750] 1261 ctttctagga atgctactga cattttgatt gacagagaca ttcactgtgc ctcccctctt[0751] 1321 ttccctaaag gagtttgtca attttttcct cctccattat aagaagggag tttctgtttc[0752] 1381 tgatcaaatg gaatttgtca atggatggta cattatgatt attattagtg acatattgac[0753] 1441 aatcattgga tcaattctaa aaatggaaat ccaagctaag gtaatttttt tcctaatcat[0754] 1501 gctattgtta gtgtcagatt tgcactaatg gtaatgtatt tttccagaat gtaagaattt[0755] 1561 tcagaatgaa ttgtttcttc caaactgtat atcaagtaga cttgaaattg gtaatggtaa[0756] 1621 ttttcttaaa tctagtcagg aggtctctta ggcagagttt ttcaaagtgt gatccacaaa[0757] 1681 ccattgcatc agaatcattg ggtgcctggt aaagtgtacc atgttagacc tactgaattc[0758] 1741 agactcttcg gcggggcctg tgaattctta cacacaccaa aattcataca caaccaaggt[0759] 1801 aactaaggta agagtttttt ttttttttaa atcttacaag aaatgctcaa atctttaaca[0760] 1861 aaaatgagtg ggtctatagg ggaaagtgag gtcaaggcac tatggtgtgc atgcttgcat[0761] 1921 ttgtttcctc cgtccattca aagtgagaat gctcccattt tcttacttta ccattgatgt[0762] 1981 gctacaagct tatttatttt aagactaacc tagcctaaaa atcaactgtc cccacaaaat[0763] 2041 aaaaatcaca ttaaaaaaac taatagtgtt cagactaatc ttgctcaaac ttatgtttcc[0764] 2101 ctagtcttga tgcgactgat tgagtcacct ggggagttgg ttataaacct gggcagagac[0765] 2161 cccaaatgca atggctcaga gaagatagga gcttatttct gtcttatgca atagtcagaa[0766] 2221 tgggttttac agactggtga gtagctcaac atctcacagt cattcaggca cccatgttcc[0767] 2281 tcccattttg tttctctgcc atcccttaag gacttgccct gactgcatga ttattgctgt[0768] 2341 gttgcctcaa acaggttgca gcttatggga agcaaaaaca cggtatggtg gaagctctcc[0769] 2401 catagactga tggcttggct caagagtggc cgactttatt tctgtacata tcccactgga[0770] 2461 tagaatttag tcaatcctaa ctgcagaggg agccagggaa cacagcccag gcatgtgcct[0771] 2521 aggaagggga gaatgggttt aggttgacac ttagcagctg ccactatatg tggctatagt[0772] 2581 atgtatcatt ggaatagatg tttaacttta gggacaaata aacaaaaaac caaaacaaaa[0773] 2641 aaaggagtaa ggggagagat ttgcagcaaa tctttatttt taccaacctc aactatcatt[0774] 2701 aatttcagtg aaccctaaat ggtgtccaac aaaatatctt tctagaccat tcaccgtctc[0775] 2761 tgcctcatag atgatcatat catgttttct tctcttctga aacctctaat acccttgtcc[0776] 2821 tatcctcatt ctaagctgat gaccttactt cctatttcac aaaaataata gaaaaaaaaa[0777] 黑猩猩TRPML3(XP_001140555.1)(GI：469371)(SEQ ID NO：24)
[0778] MADPEVVVSSCSSHEEENRCNFNQQTSPSEELLLEDQMRRKLKFFFMNPCEKFWARGRKPWKLAIQILKIAMVTIQLVLFGLSNQMVVAFKEENTIAFKHLFLKGYMDRMDDTYAVYTQSDVYDQLIFAVNQYLQLYNVSVGNHAYENKGTKQSAMAICQHFYKRGNIYPGNDTFDIDPEIETECFFVEPDEPFHIGTPAENKLNLTLDFHRLLTVELQFKLKAINLQTVRHQELPDCYDFTLTITFDNKAHSGRIKISLDNDISIRECKDWHVSGSIQKNTHYMMIFDAFVILTCLVSLILCIRSVIRGLQLQQVGNVAF
[0779] 黑猩猩TRPML3(XM_001140401.1)(GI：114557483)(SEQ ID NO：25)
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[0860] 黑猩猩TRPML3(XM_00114082.1)(GI：114557479)(SEQ ID NO：29)
[0861] 1 tcctctagag atggcagatc ctgaggtagt tgtgagtagc tgcagctctc atgaagagga[0862] 61 aaatcgctgc aattttaacc agcaaacatc tccatctgag gagcttctat tagaagacca[0863] 121 gatgaggcga aaactcaaat tttttttcat gaatccctgt gagaagttct gggctcgagg[0864] 181 tagaaaacca tggaaacttg ccatacaaat tctaaaaatt gcaatggtga ctatccagct[0865] 241 ggtcttattt gggctaagta accagatggt ggtagctttc aaggaagaga atactatagc[0866] 301 attcaaacac cttttcctaa aaggatatat ggaccgaatg gatgacacat atgcagtgta[0867] 361 cacacaaagt gacgtgtatg atcagttaat cttcgcagta aaccagtact tgcagctata[0868] 421 caatgtctcc gttgggaatc atgcttatga gaacaaaggt accaagcaat ctgctatggc[0869] 481 aatctgtcag cacttctaca agcgaggaaa catctaccct ggaaatgata cctttgacat[0870] 541 cgatccagaa attgaaactg agtgtttctt tgtggagcca gatgaacctt ttcacattgg[0871] 601 gacaccagca gaaaataaac tgaacttaac actggacttc cacagactcc taacagtgga[0872] 661 gcttcagttt aaactgaaag ccattaatct gcagacagtt cgtcatcaag aactccctga[0873] 721 ctgttatgac tttactctga ctataacatt tgacaacaag gcccatagtg gaagaattaa[0874] 781 aataagttta gataatgaca tttccatcag agaatgtaaa gactggcatg tatctggatc[0875] 841 aattcagaag aacactcatt acatgatgat ctttgatgcc tttgtcattc tgacttgctt[0876] 901 ggtttcatta atcctctgca ttagatctgt gattagagga cttcagcttc agcaggagtt[0877] 961 tgtcaatttt ttcctcctcc attataagaa gggagtttct gtttctgatc aaatggaatt[0878] 1021 tgtcaatgga tggtacatta tgattattat tagtgacata ttgacaatca ttggatcaat[0879] 1081 tctaaaaatg gaaatccaag ctaagagtct aactagttat gatgtctgta gcatacttct[0880] 1141 tgggacttct accatgcttg tgtggcttgg agtcatccga tacctcggtt tctttgcaaa[0881] 1201 gtacaatctc ctcattttga cccttcaggc agcactgccc aatgtcatca ggttctgctg[0882] 1261 ctgtgcagct atgatttact taggttactg cttctgtgga tggatcgtgc tggggcctta[0883] 1321 ccatgacaag tttcgttctc tgaacatggt ctctgagtgc cttttctctc tgataaatgg[0884] 1381 agatgatatg tttgccacgt ttgcaaaaat gcagcaaaaa agttacttag tctggctgtt[0885] 1441 tagtagaatt tacctctact cattcatcag cctctttata tatatgattt taagtctttt[0886] 1501 cattgcactg atcactgata catacgaaac aattaagcaa taccaacaag atggcttccc[0887] 1561 agagactgaa cttcgtacat ttatatcaga atgcaaagat ctacccaact ctggaaaata[0888] 1621 cagattagaa gatgaccctc cagtatcttt attctgctgt tgtaaaaagt agctatcagg[0889] 1681 tttatctgta ctttagagga aaatataatg tgtagctgag ttagaacact gtggatattc[0890] 1741 tgagatcaga tgtagtatgt ttgaagactg ttattttgag ctaattgaga cctataattc[0891] 1801 accaataact gtttatattt ttaaaagcaa tatttaatgt ctttgcagct ttatgctggg[0892] 1861 cttgttttta aaacaacttt aatgaggaaa gctattggat tattattatt tcttgtttat[0893] 1921 tttgccatgg ctttagaatg tattctgtat gcctctcttt tgctctgata ctcttgcttc[0894] 1981 ctgctattct gattgtgcag actgtgtaat tagtggaaaa caatccttgg tctgactgtg[0895] 2041 actttggaca actcagtaac cctggcttgg accactctca ggagtccatc cttgagagag[0896] 2101 tgggtgtagt taccatttat acagtaatca ttgcatttta aaatctgctc ttgaaaggaa[0897] 2161 gaataagagt gcaccagaat aagagcgcac cagaataaga gcgcaccagc taacaatgtg[0898] 2221 atacggccat atgtcactta aggatagaga tatgttctga gaaatgtgtc attaggcgat[0899] 2281 tttgtcatta aacatcatag catgtacttc cacaaaccta gatggtatag cctactacac[0900] 2341 acctaggcta tttggtatag cctgttgatc ctggggtaca aatctgtaca acatgttact[0901] 2401 gtattgaata cagtaggcaa ttgtaacaca atggtaagta tctaaacata gaaaagggac[0902] 2461 agtaaaaata tggttttata atcttctggg accaccattg tatatgcggt acatcgttga[0903] 2521 ccaaaacatc gttatccagc atatgactgt atttggttat gaaagccaac tgttacttga[0904] 2581 ttctgctttt agttcttaag aggatcaggt ttttaaatac tcatttacaa gttttctatc[0905] 2641 ctccttcagt gttaaagtag aaagtaaaaa gagtatctta tacatgcatg aaattaaagc[0906] 2701 atataccaaa tgca
[0907] 黑猩猩TRPML3(XP_00114082.1)(GI：114557480)(SEQ ID NO：30)
[0908] MADPEVVVSSCSSHEEENRCNFNQQTSPSEELLLEDQMRRKLKFFFMNPCEKFWARGRKPWKLAIQILKIAMVTIQLVLFGLSNQMVVAFKEENTIAFKHLFLKGYMDRMDDTYAVYTQSDVYDQLIFAVNQYLQLYNVSVGNHAYENKGTKQSAMAICQHFYKRGNIYPGNDTFDIDPEIETECFFVEPDEPFHIGTPAENKLNLTLDFHRLLTVELQFKLKAINLQTVRHQELPDCYDFTLTITFDNKAHSGRIKISLDNDISIRECKDWHVSGSIQKNTHYMMIFDAFVILTCLVSLILCIRSVIRGLQLQQEFVNFFLLHYKKGVSVSDQMEFVNGWYIMIIISDILTIIGSILKMEIQAKSLTSYDVCSILLGTSTMLVWLGVIRYLGFFAKYNLLILTLQAALPNVIRFCCCAAMIYLGYCFCGWIVLGPYHDKFRSLNMVSECLFSLINGDDMFATFAKMQQKSYLVWLFSRIYLYSFISLFIYMILSLFIALITDTYETIKQYQQDGFPETELRTFISECKDLPNSGKYRLEDDPPVSLFCCCKK
[0909] 热 带 爪 蟾 (Xenopus tropicalis)( 热 带 爪 蟾 Silurana tropicalis)(NM_001016804.2)(GI：77682897)(SEQ ID NO：31)
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[0942] 热 带 爪 蟾 (Xenopus tropicalis)( 热 带 爪 蟾 Silurana tropicalis)(NP_001016804.2)(GI：62857333)(SEQ ID NO：32)
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[0944] 热带爪蟾(Xenopus tropicalis)(热带爪蟾Silurana tropicalis)(CR855599.2)(GI：77623768)(SEQ ID NO：33)
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[0978] 热带爪蟾(Xenopus tropicalis)(热带爪蟾Silurana tropicalis)(CAJ83717.1)(GI：89273945)(SEQ ID NO：34)
[0979] MENPELIKTCNSLDEHDGPYCCKQCPMTDELLMEDQLRRKLKFFFMNPCEKFRARGRKPWKLCIQILKIAMVTIQLVLFGLSNEMVVTFKEENTVAFKHLFLKGYKDGHDDTYAIYSQEDVHAHINFTIKRYLELQNISVGNHAYESNGKGQTGMSLCQHYYKQGSIFPGNETFEIDPQIDTECFHIDPSTLCSNDTPAEYYWSNMTLDFYRLVSVEIMFKLKAINLQTIRHHELPDCYDFMVIITFDNKAHSGRIKISLDNDVGIQECKDWHVSGSIQKNTHYMMIFDAAVILVCLSSITLCIRSVVKGIHLQKEYVNFFQHRFARTVSSADRMEFVNGWYIMIIISDVLSIIGSILKMEIQAKSLTSYDVCSILLGTSTLLVWLGVIRYLGFFKKYNLLILTLRAALPNVIRFCCCAAMIYLGYCFCGWIVLGPYHVKFRSLNMVSECLFSLINGDDMFTTFSIMQEKSYLVWLFSRIYLYSFISLFIYMVLSLFIALITDTYDTIKNYQIDGFPESELHTFVSECKDLPTSGRYREQDETSCLSMLCCNR
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[0983] 智人钠泄漏通道，非选择性(NALCN)，多肽
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[1015] 智人钠/钾转运ATP酶相互作用3(NKAIN3)多肽(NP_775959.1)GI：27735000(SEQ IDNO：38)
[1016] MGCCTGRCSLICLCALQLVSALERQIFDFLGFQWAPILGNFLHIIVVILGLFGTIQYRPRYIMVYTVWTALWVTWNVFIICFYLEVGGLSKDTDLMTFNISVHRSWWREHGPGCVRRVLPPSAHGMMDDYTYVSVTGCIVDFQYLEVIHSAVQILLSLVGFVYACYVISISMEEEDTYSCDLQVCKHLFIQMLQIIE
[1017] >智人黏脂3，mRNA gi|38174237|gb|BC060765.1|(SEQ ID NO：39)TGGAGTCGCTCGCTGACTCGCCCTGCGCCCTCGCCGCGGACACCGGAGCTGCGGCCGCTCCCCGCTGTCCCCCAGCTTACTCCAATCAAGCCTCTGCCCGCCAGGAACAGGTAACCTGTGTGTGTCCGTTTGCTCCTTCTAAGAGCATGCCTGATAGATACTTCGGTAGCCTCTCCGGATGGCCCCTTCGTCGGGTAGCCTCTCCTGATGGGGTCCTTCGCCCACCCTGCCTCCCGCGCCGGCGCTCCGGGTGAATGTCAAGGGTGGCTGGCTGCGAATACCTCCTTCAGCTGCTGGGGTTCCCGACAGTTTGCAGTTTTTAAAAGTGCACCCTCGGAAGGGCTTTTCAGACTGGGTAAACCTGACTTTTCCAAGAGATGGCAGATCCTGAGGTAGTTGTGAGTAGCTGCAGCTCTCATGAAGAGGAAAATCGCTGCAATTTTAACCAGCAAACATCTCCATCTGAGGAGCTTCTATTAGAAGACCAGATGAGGCGAAAACTCAAATTTTTTTTCATGAATCCCTGTGAGAAGTTCTGGGCTCGAGGTAGAAAACCATGGAAACTTGCCATACAAATTCTAAAAATTGCAATGGTGACTATCCAGCTGGTCTTATTTGGGCTAAGTAACCAGATGGTGGTAGCTTTCAAGGAAGAGAATACTATAGCATTCAAACACCTTTTCCTAAAAGGATATATGGACCGAATGGATGACACATATGCAGTGTACACACAAAGTGACGTGTATGATCAGTTAATCTTCGCAGTAAACCAGTACTTGCAGCTATACAATGTCTCCGTTGGGAATCATGCTTATGAGAACAAAGGTACCAAGCAATCTGCTATGGCAATCTGTCAGCACTTATACAAGCGAGGAAACATCTACCCTGGAAATGATACCTTTGACATCGATCCAGAAATTGAAACTGAGTGTTTCTTTGTGGAGCCAGATGAACCTTTTCACATTGGGACACCAGCAGAAAATAAACTGAACTTAACACTGGACTTCCACAGACTCCTAACAGTGGAGCTTCAGTTTAAACTGAAAGCCATTAATCTGCAGACAGTTCGTCATCAAGAACTCCCTGACTGTTATGACTTTACTCTGACTATAACATTTGACAACAAGGCCCATAGTGGAAGAATTAAAATAAGTTTAGATAATGACATTTCCATCAGAGAATGTAAAGACTGGCATGTATCTGGATCAATTCAGAAGAACACTCATTACATGATGATCTTTGATGCCTTTGTCATTCTGACTTGCTTGGTTTCATTAATCCTCTGCATTAGATCTGTGATTAGAGGACTTCAGCTTCAGCAGGTAGGGAACGTTGCTTTCTAGGAATGCTACTGACATTTTGATTGACAGAGACATTCACTGTGCCTCCCCTCTTTTCCCTAAAGGAGTTTGTCAATTTTTTCCTCCTCCATTATAAGAAGGAAGTTTCTGTTTCTGATCAAATGGAATTTGTCAATGGATGGTACATTATGATTATTATTAGTGACATATTGACAATCATTGGATCAATTCTAAAAATGGAAATCCAAGCTAAGGTAATTTTTTTCCTAATCATGCTATTGTTAGTGTCAGATTTGCACTAATGGTAATGTATTTTTCCAGAATGTAAGAATTTTCAGAATGAATTGTTTCTTCCAAACTGTATATCAAGTAGACTTGAAATTGGTAATGGTAATTTTCTTAAATCTAGTCAGGAGGTCTCTTAGGCAGAGTTTTTCAAAGTGTGATCCACAAACCATTGCATCAGAATCATTGGGTGCCTGGTAAAGTGTACCATGTTAGACCTACTGAATTCAGACTCTTCGGCGGGGCCTGTGAATTCTTACACACACCAAAATTCATACACAACCAAGGTAACTAAGGTAAGAGTTTTTTTTTTTTTTTAATCTTACAAGAAATGCTCGAATCTTTAACAAAAATGAGTGGGGCTATAGGGGAAAGTGAGGTCAAGGCACTATGGTGTGCATGCTTGCATTTGTTTCCTCCGTCCATTCAAAGTGAGAATGCTCCCATTTTCTTACTTTACCATTGATGTGCTACAAGCTTATTTATTTTAAGACTAACCTAGCCTAAAAATCAACTGTCCCCACAAAATAAAAATCACATTAAAAAAACTAATAGTGTTCAGACTAATCTTGCTCAAACTTATGTTTCCCTAGTCTTGATGCAACTGATTGAGTCACCTGGGGAGTTGGTTATAAACCTGGGCAGAGACCCCAAATGCAATGGCTCAGAGAAGATAGGAGCTTATTTCTGTCTTATGCAATAGTCAGAATGGGTTTTACAGACTGGTGAGTAGCTCAACATCTCACAGTCATTCAGGCACCCATGTTCCTCCCATTTTGTTTCTCTGCCACCCCTTAAGGACTTGCCCTGACTGCATGATTATTGCCGTGTTGCCTCAAACAGGTTGCAGCTTATGGGAAGCAAAAACACGGTATGGTAGAAGCTCTCCCATAGACTGATGGCTTGGCTCAAGAGTGGCCGACTTTATTTCTGTACATATCCCACTGGATAGAATTTAGTCAATCCTAACTGCAGAGGGAGCCAGGGAACACAGCCCAGGCATGTGCCTAGGAAGGGGAGAATGGGTTTAGGTTGACACTTAGCAGCTGCCACTATATGTGGCTATAGTATGTATCATTGGAATAGATGTTTAACTTTAGGGACAAATAAAAAACCAAAACAAAAAAAGGAGTAAGGGGAGAGATTTGCAGCAAATCTTTATTTTTACCAACCTCAACTATCATTAATTTCAGTGAACCCTAAATGGTATCCAACAAAATATCTTTCTAGACCATTCACCGTCTCTGCCTCATAGATGATCATATCATGTTTTCTTCTCTTCTGAAACCTCTAATACCCTTGTCCTATCCTCATTCTAAGCTGATGACCTTACTTCCTATTTCACAAAAATAATAGAAAAAAAAAAAAAAAA
[1018] >>智人黏脂3，cDNA gi|21752911|dbj|AK093948.1|智人cDNA FLJ36629(SEQ ID N0：40)
[1019] ATAGCCTTTCAAATTTCGGTTAATGGTAACTCTCATCAGTTACTCAAGCCAAAAATCTTGGATTCATCACAGACTCCTCTCTTTCACTAATCTCTTCTTCCCCACATCTAATCCAAGAGGAAATCCTATTGTTCTACCTTCATTGGCCAGGCACTGTGACTCATATAATCCCAGCACATTGGGAGGCTGAGGCGGGAGGATGGCTTGAGCCCAGGAGTTCCAGACCAGCCTGGGAAACATAGTGAGGCCCCATCTCTACAAAAAATTAAAAAAATTAGCAGTCAAGGTGGCATGTGTCTGTAATCCAAGCTACTTGGGGGGCTGAGGTGGGAGGATTTCTTGAGCCCGGGAAGTCGAGGCTGCATTGAGCCACGGTTGTGCCACGGCACTCCAGCCTGGGTGACAGAGTGAGACCCCTGTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATAAAAATCACCTGGTCAACTCCACTATTACCAGCCTGGTCCAAGCTACTATCTCTCATTTATATTATTGCAATAGCCTCCTCACTCCTCCAACAACCTGCTGTCAACCACAGCAGCCAACATCTGATCATATCACTTCTGTTTGTGGTTCTCAAATCTCCCCAATTGAGTTACAGTAAAAGACAAACTTGGTGAGTGCCACCTTATCTCTATAACTGTATACCCTTTCTATTGCTCACTCCAGCCAGATGCAATATCCTTGCCAAGCACCCTCCTGTCTCAGGGCCTTTGCACTTGCCAGTCCCTGTGCCTGGAAGGCTTCTCCCCTAGATTTTTGCATGACTTCTCCCTCCCTCCCTTCAGATCTTTGCTCAAATGCCTTCTTTTTAGTGTATGTAAAATGACAAACCCATACCCATTCCTTATCCCCTCCTCTGAATTTTCTCTTCAGCAATTATCAGCAGCAAGTGTCCCAAAGTTTCTATTAACTTATTTCTGTTGTCTCTTTCTTCCCTCCACTAGAATGTAAGCTTTATGAGAGCAGAGACTTTTGTTTGTTCACTGCTTTATCCTTAGCACCTAAAACAGTGCCTTACTCATAGTTACCTCAATATTTATTGCCAAATGAATTTCTGCTTTATAATCTGATTATATTTTTCCACTCTCTCTTAGAGTCTAACTAGTTATGATGTCTGTAGCATACTTCTTGGGACTTCTACCATGCTTGTGTGGCTTGGAGTCATCCGATACCTCGGTTTCTTTGCAAAGTACAACCTCCTCATTTTGACCCTTCAGGCAGCGCTGCCCAATGTCATCAGGTTCTGCTGCTGTGCAGCTATGATTTACTTAGGTTACTGCTTCTGTGGATGGATCGTGCTGGGGCCTTACCATGACAAGTTTCGTTCTCTGAACATGGTCTCTGAGTGCCTTTTCTCTCTGATAAATGGAGATGATATGTTTGCCACGTTTGCAAAAATGCAGCAAAAAAGTTACTTAGTCTGGCTGTTTAGTAGAATTTACCTCTACTCATTCATCAGCCTCTTTATATATATGATTTTAAGTCTTTTCATTGCACTGATCACTGATACATACGAAACAATTAAGCAATACCAACAAGATGGCTTCCCAGAGACTGAACTTCGTACATTTATATCAGAATGCAAAGATCTACCCAACTCTGGAAAATACAGATTAGAAGATGACCCTCCAGTAACTTTATTCTGCTGTTGTAAAAAGTAGCTATCAGGTTTATCTGTACTTTAGAGGAAAATATAATGTGTAGCTGAGTTGGAACACTGTGGATATTCTGAGATCAGATGTAGTATGTTTGAAGACTGTTATTTTGAGCTAATTGAGACCTATAATTCACCAATAACTGTTTATATTTTTAAAAGCAATATTTAATGTCTTTGCAACTTTATGCTGGGATTGTTTTTAAAAAAAACTTTAATGAGGAAAGCTATTGGATTATTATTATTTCTTGTTTATTTTGCCATGGCTTTAGAATGTATTCTGTATGCCTCTCTTTTGCTCTGATACTGTTGCTCCTGCTATTCTGATTGTGCAGACTGTATAATTAGTGGAAAACAATCCTTGGTCTGACTGTGACTTTGGACAACTCAGTAACCCTGGCTTGGACCACTCTCAGGAGTCCATCCTTGAGAGAGTGGGTGTAGTTACCATTTATACAGTAATCATTGCATTTTAAAATCTTCTCTTGAAAGGAAGAATAAGAGTGCACCAGAATAAGAGCGCACCAGAATAAGAGCACACCAGCTAACAATGTGATACGGCCATATGTCACTTAAGGATGGAGATATGTTCTGAGAAATGTGTCATTAGGCGATTTTGTCATTAAACATCATAGCATGTACTTCCACAAACCTAGATGGTATAGCCTACTACACACCTAGGCTATTTGGTATAGCCTGTTGGTCCTGGGGTACAAATCTGTACAACATGTTACTGTATTGAATACAGTAGGCAATTGTAACTCAATGGTAAGTATCTAAACATAGAAAAGGGACAGTAAAAATATGGTTTTATAATCTTCTGGGACCACCATTGTATATGCGGTACATCATTGACCAAAACATCGTTATCCAGCATATGACTGTATTTGGTTATGAAAGCCAACTGTTACTTGATTCTGCTTTTAGTTCTTAAGAGGATCAGGCTTTTAAATACTCATTTACAAGCTTTCTATCCTCCTTCAGTGTTAAAGTAGAAAGTAAAAAGAGTATCTTATACATGCATGAAATTAAAGCATATACCAAATGC
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