来自海洋的节杆菌及其产低温右旋糖苷酶的方法
阅读：203发布：2022-05-29
专利汇可以提供来自海洋的节杆菌及其产低温右旋糖苷酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是一种海洋节杆菌YJ34（Arthrobactersp.）CGMCCN0.7385。该菌株生长 温度 范围为4-37℃，最适生长温度为25℃；生长pH范围为5-11，最适生长pH为7.0；生长的NaCl浓度为0%-10%，最适生长的NaCl浓度为2%。本发明还公开了一种利用海洋节杆菌产低温右旋糖苷酶的方法。本发明的节杆菌YJ34菌株所产的右旋糖苷酶的pH为7.0、温度为35℃，适合作为 口腔 护理剂。，下面是来自海洋的节杆菌及其产低温右旋糖苷酶的方法专利的具体信息内容。
来自海洋的节杆菌及其产低温右旋糖苷酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域的节杆菌YJ34（Arthrobacter sp. ）CGMCC N0.7385（已于2013年3月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.7385）；本发明还涉及该菌株产低温右旋糖苷酶的方法。
背景技术
[0002] 口腔中的细菌发酵食物中的蔗糖，生成右旋糖酐（α-D-glucan）。右旋糖酐由α-1,4、α-1,3以及α-1,6糖苷键构成，其中α-1,6糖苷键形成的侧链决定其粘附性，右旋糖苷通过其粘附性相互交联，形成保护性网状结构，微生物特别是具有龋齿形成能力的链球菌在网状结构保护下大量繁殖，在牙齿表面或缝隙中形成软而粘稠的菌斑结构，这种结构称牙菌斑，这些微生物分泌的酸性代谢物破坏牙釉质，从而导致龋齿。因此为了预防和控制龋齿和牙周病，抑制牙菌斑的发生和发展是至关重要的。
[0003] 右旋糖苷（酐）酶(dextranase，EC3.2.1.11)，是专一切割右旋糖苷（Dextean）中α-1,6糖苷键的水解酶。右旋糖苷酶可以水解牙菌斑中的右旋糖苷，从而清除牙菌斑。早在1968年，fitzgerald首次报道了右旋糖苷酶在防龋方面的可能性，引起了人们的极大兴趣。1969年Gibbons和keyes在饮水中加入右旋糖苷酶，成功地抑制了仓鼠龋齿的形成。1982年日本学者同田祯三也报告了用右旋糖苷酶抑制和分解人工菌斑的效果 (孙晋武,
1986)。1990年和1992年我国赵宝荣等对淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilacinus) 菌株
8523右旋糖苷酶的防龋齿作用进行了研究，结果表明此酶具有显普地抑制牙菌斑的作用(赵宝荣等, 1990；李玉晶等，1991)。2002年Marotta利用体外牙菌斑葡聚糖网状基质合成过程模型，发现在牙菌斑形成过程中，右旋糖苷酶可减少葡聚糖形成量，而且形成的葡聚糖没有粘附细菌细胞的能力（Marotta et al.，2002）。 利用右旋糖苷酶抑制牙菌斑，近年来受到各国口腔医学研究的重视，右旋糖苷酶是一种生物制剂，使用和保存简便易行。无毒性，无耐药性，不影响口腔内的生物生态平衡，对不会刷牙的婴幼儿和不具备洗漱条件的情况下，是一种良好的预防牙龋齿斑的制剂。而每个人饭后，尤其是食糖后应用添加有此酶的漱口剂，是一项很好的抑制菌斑形成，预防龋齿和牙周病的有效措施。 目前美国、加拿大等国家已将具有降解牙菌斑能力的右旋糖苷酶应用于以下商品的开发（受专利保护）：牙膏、口香糖、漱口液、软膏、食品、啤酒、喷射液体牙齿清洁仪,而国内关于右旋糖苷酶的研究报道不多，仅见霉菌产右旋糖苷酶的报道，中国科学院微生物研究所报道的淡紫拟青霉、焦曲霉等霉菌（孙晋武等，1988，28(1)；程秀兰等，1992）、合肥工业大学报道绳状青霉菌和棘孢青霉(朱慧霞等，2010；张洪斌等，2011)和安徽大学报道黄绿青霉（岳晓婧等，2011），产酶时间长，多为6-8天。用霉菌来生产预防口腔牙菌斑的右旋糖苷酶存在安全性的问题，且产酶时间长，如果用在牙膏中，还存在碱性条件下不稳定的问题（孙晋武，1986）。海洋细菌右旋糖苷酶的开发将克服这些问题。 海洋具有高盐、低温、碱性等极端环境，使得海洋微生物酶具有陆地微生物酶不具有的独特催化性质和应用潜力。目前已从海洋微生物中筛选到产右旋糖苷酶的菌株主要为交替假单胞菌属和弧菌属（发明专利，ZL200910029584.4 ，发明专利ZL 201010534675.6），这些菌产生的右旋糖苷酶作用温度低，产酶时间短（12-30h），碱性条件下稳定，对牙菌斑生物膜有很好的抑制作用，将这种海洋细菌来源的右旋糖甘酶用于口腔护理剂（如漱口液、牙膏、口香糖）中，替代化学成分为主的口腔护理剂，将具有较好的经济和社会效益。
1986)。1990年和1992年我国赵宝荣等对淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilacinus) 菌株
8523右旋糖苷酶的防龋齿作用进行了研究，结果表明此酶具有显普地抑制牙菌斑的作用(赵宝荣等, 1990；李玉晶等，1991)。2002年Marotta利用体外牙菌斑葡聚糖网状基质合成过程模型，发现在牙菌斑形成过程中，右旋糖苷酶可减少葡聚糖形成量，而且形成的葡聚糖没有粘附细菌细胞的能力（Marotta et al.，2002）。 利用右旋糖苷酶抑制牙菌斑，近年来受到各国口腔医学研究的重视，右旋糖苷酶是一种生物制剂，使用和保存简便易行。无毒性，无耐药性，不影响口腔内的生物生态平衡，对不会刷牙的婴幼儿和不具备洗漱条件的情况下，是一种良好的预防牙龋齿斑的制剂。而每个人饭后，尤其是食糖后应用添加有此酶的漱口剂，是一项很好的抑制菌斑形成，预防龋齿和牙周病的有效措施。 目前美国、加拿大等国家已将具有降解牙菌斑能力的右旋糖苷酶应用于以下商品的开发（受专利保护）：牙膏、口香糖、漱口液、软膏、食品、啤酒、喷射液体牙齿清洁仪,而国内关于右旋糖苷酶的研究报道不多，仅见霉菌产右旋糖苷酶的报道，中国科学院微生物研究所报道的淡紫拟青霉、焦曲霉等霉菌（孙晋武等，1988，28(1)；程秀兰等，1992）、合肥工业大学报道绳状青霉菌和棘孢青霉(朱慧霞等，2010；张洪斌等，2011)和安徽大学报道黄绿青霉（岳晓婧等，2011），产酶时间长，多为6-8天。用霉菌来生产预防口腔牙菌斑的右旋糖苷酶存在安全性的问题，且产酶时间长，如果用在牙膏中，还存在碱性条件下不稳定的问题（孙晋武，1986）。海洋细菌右旋糖苷酶的开发将克服这些问题。 海洋具有高盐、低温、碱性等极端环境，使得海洋微生物酶具有陆地微生物酶不具有的独特催化性质和应用潜力。目前已从海洋微生物中筛选到产右旋糖苷酶的菌株主要为交替假单胞菌属和弧菌属（发明专利，ZL200910029584.4 ，发明专利ZL 201010534675.6），这些菌产生的右旋糖苷酶作用温度低，产酶时间短（12-30h），碱性条件下稳定，对牙菌斑生物膜有很好的抑制作用，将这种海洋细菌来源的右旋糖甘酶用于口腔护理剂（如漱口液、牙膏、口香糖）中，替代化学成分为主的口腔护理剂，将具有较好的经济和社会效益。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产右旋糖苷酶的来自海洋的节杆菌YJ34。
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述节杆菌YJ34发酵生产右旋糖苷酶的方法。
[0006] 本发明的特征包括节杆菌YJ34（Arthrobacter sp.）CGMCC N0.7385菌株本身（以下称菌株YJ34），以及利用该菌株发酵生产右旋糖苷酶的方法。节杆菌YJ34产低温右旋糖苷酶的方法步骤如下：将节杆菌YJ34菌株斜面种子接种到2216E培养基中，25℃，180 r/min，装液量20%，培养16 h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基中，180r/min，25℃培养21h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶；所述的产酶培养基为：蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，NaCl 2%、右旋糖酐T20 1%， pH7.0。
[0007] 本发明所涉及的菌株YJ34是在中国江苏省连云港海域的海泥中分离到的节杆菌YJ34（Arthrobacter sp.），该节杆菌YJ34于2013年3月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.7385。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0008] 以下对本发明进行详细的阐述。
[0009] 一、本发明菌株YJ34的形态特征与生理生化特征。
[0010] 1.1形态特征：菌株YJ34为革兰氏阴性杆菌（见图1），无荚膜，在固体培养基中培养48h后，菌落呈浅黄色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，在初筛平板上形成的透明圈（见图2）。
[0011] 1.2生理生化特征:菌株YJ34的生理生化反应结果见表1，菌株VP实验为阳性、能利用葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、蜜二糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、山梨醇和苦杏仁苷，能液化明胶，能产生硫化氢，不产生吲哚，不产生β半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和色氨酸脱氨酶。
[0012] 表1 菌株YJ34生理生化特征实验项目 结果 实验项目 结果
菌落颜色 黄色 阿拉伯糖利用 +
4℃生长 + 甘露醇利用 +
37℃生长 + 肌醇利用 +
无氯化钠生长 + 山梨醇利用 +
最适氯化钠生长浓度 2% 苦杏仁苷利用 -
VP + 明胶酶 +
吲哚产生 - β半乳糖苷酶 -
NO2产生 - 精氨酸双水解酶 -
H2S + 赖氨酸脱羧酶 -
葡萄糖利用 + 鸟氨酸脱羧酶 -
蔗糖利用 + 柠檬酸利用 -
鼠李糖利用 + 脲酶 +
蜜二糖利用 + 色氨酸脱氨酶 -
注: +: 阳性; �: 阴性.
1.3菌株YJ34的分子生物学鉴定：
利用Takara试剂盒提取菌株基因组进行PCR, 引物选用原核微生物16S
rDNA通 用引 物, 上 游 引物: 5 ′-agagtttgatcctggctag-3 ′, 下 游 引物 :
5′-ggttaccttgttacgactt-3′, 胶回收PCR产物, 与pMD 19-T载体连接, 转化至DH5α感受态细胞, 蓝白斑筛选出阳性克隆, 菌落PCR验证, 送至上海生工生物公司测序。扩增菌株YJ34的16S rDNA，其长度为1429 bp，在GenBank中的登录号为JN426846。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比较，发现YJ34与Arthrobacter sp。(GU220063.1)在同一分支，同源性达到99.9%(图3)。结合菌株的生理生化特征, 将该菌株命名节杆菌属（Arthrobactersp. YJ34）。
菌落颜色 黄色 阿拉伯糖利用 +
4℃生长 + 甘露醇利用 +
37℃生长 + 肌醇利用 +
无氯化钠生长 + 山梨醇利用 +
最适氯化钠生长浓度 2% 苦杏仁苷利用 -
VP + 明胶酶 +
吲哚产生 - β半乳糖苷酶 -
NO2产生 - 精氨酸双水解酶 -
H2S + 赖氨酸脱羧酶 -
葡萄糖利用 + 鸟氨酸脱羧酶 -
蔗糖利用 + 柠檬酸利用 -
鼠李糖利用 + 脲酶 +
蜜二糖利用 + 色氨酸脱氨酶 -
注: +: 阳性; �: 阴性.
1.3菌株YJ34的分子生物学鉴定：
利用Takara试剂盒提取菌株基因组进行PCR, 引物选用原核微生物16S
rDNA通 用引 物, 上 游 引物: 5 ′-agagtttgatcctggctag-3 ′, 下 游 引物 :
5′-ggttaccttgttacgactt-3′, 胶回收PCR产物, 与pMD 19-T载体连接, 转化至DH5α感受态细胞, 蓝白斑筛选出阳性克隆, 菌落PCR验证, 送至上海生工生物公司测序。扩增菌株YJ34的16S rDNA，其长度为1429 bp，在GenBank中的登录号为JN426846。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比较，发现YJ34与Arthrobacter sp。(GU220063.1)在同一分支，同源性达到99.9%(图3)。结合菌株的生理生化特征, 将该菌株命名节杆菌属（Arthrobactersp. YJ34）。
[0013] 二、本发明菌株YJ34的生长特性本发明提供的菌株YJ34对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。
[0015] 初筛培养基: 蛋白胨0.5% 酵母粉0.1%, 蓝色葡聚糖2000 0.2%, 右旋糖酐T200.8%, 琼脂2%, 陈海水配制，pH 8.0;
复筛培养基: 蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，葡聚糖1.0%，琼脂2%，陈海水配制，pH8。 [0016] 产酶培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，NaCl 2%、右旋糖酐T20 1%， pH7.0。
复筛培养基: 蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，葡聚糖1.0%，琼脂2%，陈海水配制，pH8。 [0016] 产酶培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，NaCl 2%、右旋糖酐T20 1%， pH7.0。
[0017] 种子液的制备：将菌株YJ34斜面种子接种到2216E培养基中, 25℃, 180 r/min, 装液量20%, 培养16 h。
[0018] 2.3温度对菌株YJ34生长的影响：将种子液以2%接种量于2216E培养基，pH 7.5，转速180r/min，装液量20%，分别在不同温度下培养24 h，选择在600nm波长下测定OD值，其生长温度范围为4-37℃，最适生长温度为25℃，见图4。
[0019] 2.4 pH对菌株YJ34生长的影响 ：pH范围4.0�11.0, 最适温度培养, 其余条件同2.3, 生长pH范围为5-11，最适生长pH为7.0，见图5。
[0020] 2.5 NaCl对菌株KQ11生长的影响：培养基用自来水配制，NaCl范围0% - 12%, 在最适温度和pH下培养, 其余条件同
2.3，生长的NaCl浓度为0%-10%，最适生长的NaCl浓度为2 %，见图6。
2.3，生长的NaCl浓度为0%-10%，最适生长的NaCl浓度为2 %，见图6。
[0021] 三、菌株YJ34发酵生产右旋糖苷酶的方法发明人对菌株YJ34（Arthrobactersp. YJ34）发酵生产右旋糖苷酶的方法进行了研究。
[0022] 3.1发酵时间对菌株YJ34产酶的影响：发酵12h后，产酶量上升速度较快，到发酵21h时产酶量最高，随时间增加，24h后酶活力逐渐下降，见图7。
[0023] 3.2发酵温度对菌株YJ34产酶影响：在不同温度下进行发酵培养，该菌株在15℃-30℃ 下产酶良好，25℃时菌株YJ34发酵产酶达到最高，见图8。
[0024] 3.3培养基pH对菌株YJ34产酶的影响：培养基初始pH6.0-8.5条件下生长产酶良好，pH7.0时，菌株YJ34发酵产酶最好，见图9。
[0025] 3.4 NaCl浓度对菌株YJ34产酶的影响：该菌在NaCl 0–5%时能生长并产酶，当培养基NaCl浓度升至2%时，菌株发酵产酶最高，见图10。
[0026] 3.5装液量对菌株YJ34发酵产酶的影响：20%装液量条件下达到最高酶活力，见图11。
[0027] 3.6诱导剂浓度对菌株YJ34产酶的影响：右旋糖苷酶为一种诱导酶，右旋糖酐T20为诱导剂，通过配置成不同终浓度研究诱导产酶状况，结果表明当培养基无诱导物存在时，菌株YJ34不产酶，1%浓度的右旋糖苷酐T20条件下即可达到最高酶活力，增大诱导物浓度产酶活力无明显增加，见图12。
[0028] 3.7右旋糖苷酶活测定：将10 μL酶液与190 μL 3%的右旋糖酐T70 (50 mmol/L, pH 5.5乙酸钠缓冲液配制) 35 °C水浴15 min后, DNS法测定还原糖含量。酶活力单位定义(U/mL): 上述反应条件下, 每分钟催化释放1 μmoL麦芽糖所需的酶量为一个活力单位。
[0029] 四、菌株YJ34 右旋糖苷酶的性质4.1 粗酶液的制备：将节杆菌YJ34（Arthrobacter sp. YJ34）菌株斜面种子接种到
2216E培养基中, 25℃, 180 r/min, 装液量20%, 培养16 h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，NaCl 2%、右旋糖酐T20 1%， pH7.0）中，180r/min，25℃培养21h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶。
2216E培养基中, 25℃, 180 r/min, 装液量20%, 培养16 h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，NaCl 2%、右旋糖酐T20 1%， pH7.0）中，180r/min，25℃培养21h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶。
[0030] 4.2 酶作用温度对酶活性的影响：将右旋糖苷酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图13，酶的最适作用温度为35℃。
[0031] 4.3酶的作用pH对酶活性的影响 ：将酶液与在不同pH的右旋糖酐溶液中在35℃下进行酶活力测定，结果见图14，pH7.0该酶的活性最高。
[0033] 图1为菌株YJ34的电镜照片形态(×13000)图；图2为菌株YJ34在初筛平板上形成的透明圈图；
图3为菌株YJ34系统进化树；
图4为温度对菌株YJ34生长的影响图；图中：◆ 15°C, ■20°C, ▲ 25°C,
×30°C,●35°C；
图5为pH对菌株YJ34生长的影响图；
图6为NaCl浓度对菌株YJ34生长的影响图；
图7为发酵时间对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图8为温度对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图9为pH对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图10为NaCl浓度对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图11为装液量对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图12为诱导剂浓度对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图13为温度对YJ34右旋糖苷酶的影响图；
图14为pH对YJ34右旋糖苷酶的影响图；
本发明节杆菌YJ34（Arthrobactersp.）己于2013年3月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.7385。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
图3为菌株YJ34系统进化树；
图4为温度对菌株YJ34生长的影响图；图中：◆ 15°C, ■20°C, ▲ 25°C,
×30°C,●35°C；
图5为pH对菌株YJ34生长的影响图；
图6为NaCl浓度对菌株YJ34生长的影响图；
图7为发酵时间对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图8为温度对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图9为pH对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图10为NaCl浓度对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图11为装液量对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图12为诱导剂浓度对菌株YJ34发酵产酶的影响图；
图13为温度对YJ34右旋糖苷酶的影响图；
图14为pH对YJ34右旋糖苷酶的影响图；
本发明节杆菌YJ34（Arthrobactersp.）己于2013年3月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.7385。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
[0034] 以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
[0035] 实施例1，一种来自海泮的节杆菌YJ34（Arthrobactersp.）CGMCC N0.7385。该菌株具有以下特征：菌株YJ34为革兰氏阴性杆菌、无荚膜。VP实验为阳性、能利用葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、蜜二糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、山梨醇和苦杏仁苷，能液化明胶，能产生硫化氢，不产生吲哚，不产生β半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和色氨酸脱氨酶。菌株YJ34生长温度范围为4-37℃，最适生长温度为25℃；生长pH范围为5-11，最适生长pH为7.0；生长的NaCl浓度为0%-10%，最适生长的NaCl浓度为2%。
[0036] 实施例2，一种如实施例1所述的节杆菌YJ34 CGMCC N0.7385发酵产生右旋糖苷酶的方法，其步骤如下：将节杆菌YJ34产低温右旋糖苷酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将节杆菌YJ34菌株斜面种子接种到2216E培养基中, 25℃, 180 r/min, 装液量20%, 培养16 h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，NaCl 2%、右旋糖酐T20 1%， pH7.0）中，180r/min，25℃培养21h，10000r/min离心
5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶。
5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶。
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