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ERFE特异性抗体组合物和使用方法

阅读:722发布:2022-10-15

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1.一种分离并纯化的抗体,其与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合。
2.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
3.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与长度为至少3个基酸的ERFE多肽的表位结合。
4.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
5.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
6.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
7.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
8.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG恒定域。
9.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
10.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
11.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是抗原结合片段
12.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
13.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人抗体。
14.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人源化的。
15.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是嵌合的。
16.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制
erythroferrone活性。
17.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制调素mRNA表达的抑制。
18.根据权利要求1所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
19.一种分离并纯化的抗体,其与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:
2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
20.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
21.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与D77结合。
22.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与P78结合。
23.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与R79结合。
24.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与D80结合。
25.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与A81结合。
26.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与W82结合。
27.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与M83结合。
28.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与L84结合。
29.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与F85结合。
30.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与V86结合。
31.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
32.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
33.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
34.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG恒定域。
35.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
36.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
37.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是抗原结合片段。
38.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
39.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人抗体。
40.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人源化的。
41.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是嵌合的。
42.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制
erythroferrone活性。
43.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
44.根据权利要求19所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
45.一种宿主细胞,其产生与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体。
46.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
47.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
48.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
49.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
50.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
51.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
52.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体包含IgG恒定域。
53.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
54.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体是单克隆抗体。
55.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体是抗原结合片段。
56.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
57.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体是人抗体。
58.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体是人源化的。
59.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体是嵌合的。
60.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
61.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
62.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
63.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
64.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
65.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与D77结合。
66.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与P78结合。
67.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与R79结合。
68.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与D80结合。
69.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与A81结合。
70.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与W82结合。
71.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与M83结合。
72.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与L84结合。
73.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与F85结合。
74.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与V86结合。
75.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
76.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
77.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
78.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
79.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞和per.C6细胞。
80.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是CHO 细胞。
81.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是骨髓瘤细胞。
82.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是杂交瘤。
83.根据权利要求45所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、奇异变形杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、短芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、类干酪乳杆菌细胞、浅青紫链霉菌细胞、解脂耶尔森氏菌细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、黑曲霉泡盛变种细胞、米曲霉细胞、蜥蜴利什曼原虫细胞、粉纹夜蛾幼虫细胞、草地贪夜蛾细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-1模拟细胞。
84.一种组合物,其包含与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体以及赋形剂。
85.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
86.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
87.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)的全部或部分的表位结合。
88.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
89.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
90.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
91.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体包含IgG恒定域。
92.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
93.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体是单克隆抗体。
94.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体是抗原结合片段。
95.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
96.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体是人抗体。
97.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体是人源化的。
98.根据权利要求84所述的组合物,其中抗体是嵌合的。
99.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
100.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
101.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体具有小于1.0x10-08M的KD。
102.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
103.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
104.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与D77结合。
105.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与P78结合。
106.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与R79结合。
107.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与D80 结合。
108.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与A81结合。
109.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与W82结合。
110.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与M83结合。
111.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与L84结合。
112.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与F85结合。
113.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体至少与V86结合。
114.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
115.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
116.根据权利要求84所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
117.一种产生与ERFE多肽特异性结合的抗体的方法,其包括从产生所述抗体的宿主细胞中分离并纯化所述抗体。
118.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
119.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
120.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)的全部或部分的表位结合。
121.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
122.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
123.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
124.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体包含IgG恒定域。
125.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
126.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
127.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体是抗原结合片段。
128.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
129.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体是人抗体。
130.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体是人源化的。
131.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体是嵌合的。
132.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
133.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
134.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
135.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
136.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
137.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与D77结合。
138.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与P78结合。
139.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与R79结合。
140.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与D80结合。
141.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与A81结合。
142.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与W82结合。
143.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与M83结合。
144.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与L84结合。
145.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与F85结合。
146.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体至少与V86结合。
147.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
148.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
149.根据权利要求117所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
150.根据权利要求117所述的方法,其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
151.根据权利要求117所述的方法,其中所述宿主细胞选自CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞和per.C6细胞。
152.根据权利要求117所述的方法,其中所述宿主细胞是CHO细胞。
153.根据权利要求117所述的方法,其中所述宿主细胞是骨髓瘤细胞。
154.根据权利要求117所述的方法,其中所述宿主细胞是杂交瘤。
155.根据权利要求117所述的方法,其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、奇异变形杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、短芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、类干酪乳杆菌细胞、浅青紫链霉菌细胞、解脂耶尔森氏菌细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、黑曲霉泡盛变种细胞、米曲霉细胞、蜥蜴利什曼原虫细胞、粉纹夜蛾幼虫细胞、草地贪夜蛾细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-
1模拟细胞。
156.一种调节ERFE多肽活性的方法,其包括使所述ERFE多肽与足量的与所述ERFE多肽特异性结合的抗体或包含该抗体的组合物接触
157.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
158.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
159.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)的全部或部分的表位结合。
160.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
161.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
162.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
163.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体包含IgG恒定域。
164.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
165.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
166.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体是抗原结合片段。
167.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
168.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体是人抗体。
169.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体是人源化的。
170.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体是嵌合的。
171.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
172.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
173.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
174.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
175.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
176.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与D77结合。
177.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与P78结合。
178.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与R79结合。
179.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与D80结合。
180.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与A81结合。
181.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与W82结合。
182.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与M83结合。
183.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与L84结合。
184.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与F85结合。
185.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体至少与V86结合。
186.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
187.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
188.根据权利要求156所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
189.一种检测样品中的ERFE多肽的方法,其包括使所述样品与同所述ERFE多肽特异性结合的抗体和可检测标记物接触。
190.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
191.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
192.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)的全部或部分的表位结合。
193.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
194.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
195.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
196.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体包含IgG恒定域。
197.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
198.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
199.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体是抗原结合片段。
200.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
201.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体是人抗体。
202.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体是人源化的。
203.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体是嵌合的。
204.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
205.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
206.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
207.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
208.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
209.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与D77结合。
210.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与P78结合。
211.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与R79结合。
212.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与D80结合。
213.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与A81结合。
214.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与W82结合。
215.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与M83结合。
216.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与L84结合。
217.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与F85 结合。
218.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体至少与V86结合。
219.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
220.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
221.根据权利要求189所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
222.根据权利要求189所述的方法,其中所述方法包括夹心ELISA。
223.根据权利要求222所述的方法,其中所述夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在所述孔中将包含所述ERFE多肽的样品与所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将标记的检测抗体与所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,然后测量与所述ERFE和捕获抗体结合的检测抗体的量。
224.根据权利要求223所述的方法,其中所述标记的检测抗体是生物素化的、荧光的或酶缀合的。
225.根据权利要求223所述的方法,其中所述捕获抗体与ERFE多肽的C末端的至少一部分结合,并且所述检测抗体与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合,其中所述捕获抗体和所述检测抗体是不同的抗体。
226.根据权利要求223所述的方法,其中所述样品包括血液、血清、尿液、唾液、骨髓、肝、脾、脑脊液、骨骼肌、平滑肌、脂肪组织、细胞或培养基。
227.根据权利要求222所述的方法,其中所述夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在所述孔中将包含所述ERFE多肽的样品与所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将生物素化的检测抗体与所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将链霉亲和素-HRP缀合物与所述生物素化的检测抗体、所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,添加底物并测量吸光度值。
228.根据权利要求227所述的方法,其中所述底物是比色的、发光的或荧光的。
229.根据权利要求227所述的方法,其中所述捕获抗体与ERFE多肽的C末端的至少一部分结合,并且所述检测抗体与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合,其中所述捕获抗体和所述检测抗体是不同的抗体。
230.根据权利要求227所述的方法,其中所述样品包括血液、血清、尿液、唾液、骨髓、肝、脾、脑脊液、骨骼肌、平滑肌、脂肪组织、细胞或培养基。
231.一种试剂盒,其包含与ERFE多肽特异性结合的抗体以及至少一种缓冲液。
232.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
233.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
234.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
235.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
236.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
237.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
238.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体包含IgG 恒定域。
239.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
240.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是单克隆抗体。
241.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是抗原结合片段。
242.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
243.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是人抗体。
244.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是人源化的。
245.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是嵌合的。
246.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
247.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
248.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
249.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
250.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
251.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与D77结合。
252.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与P78结合。
253.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与R79 结合。
254.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与D80结合。
255.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与A81结合。
256.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与W82结合。
257.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与M83结合。
258.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与L84结合。
259.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与F85结合。
260.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体至少与V86结合。
261.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
262.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
263.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
264.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述抗体是生物素化的。
265.根据权利要求231所述的试剂盒,其进一步包含底物。
266.根据权利要求231所述的试剂盒,其中所述底物是比色的、发光的或荧光的。
267.一种分离并纯化的抗体,其与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合。
268.根据权利要求267所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
269.根据权利要求267或权利要求268所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
270.根据权利要求267至269中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
271.根据权利要求267至270中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
272.根据权利要求267至271中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
273.根据权利要求267至272中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
274.根据权利要求267至273中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG恒定域。
275.根据权利要求267至274中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
276.根据权利要求267至275中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
277.根据权利要求267至276中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是抗原结合片段。
278.根据权利要求267至277中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
279.根据权利要求267至278中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人抗体。
280.根据权利要求267至279中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人源化的。
281.根据权利要求267至280中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是嵌合的。
282.根据权利要求267至281中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
283.根据权利要求267至282中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
284.根据权利要求267至283中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体具有小-8
于1.0x10 M的KD。
285.一种分离并纯化的抗体,其与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
286.根据权利要求285所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
287.根据权利要求285或权利要求286所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与D77结合。
288.根据权利要求285至287中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与P78结合。
289.根据权利要求285至288中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与R79结合。
290.根据权利要求285至289中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与D80结合。
291.根据权利要求285至290中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与A81结合。
292.根据权利要求285至291中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与W82结合。
293.根据权利要求285至292中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与M83结合。
294.根据权利要求285至293中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与L84结合。
295.根据权利要求285至294中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与F85结合。
296.根据权利要求285至295中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体至少与V86结合。
297.根据权利要求285至296中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
298.根据权利要求285至297中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
299.根据权利要求285至298中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
300.根据权利要求285至299中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG恒定域。
301.根据权利要求285至300中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
302.根据权利要求285至301中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
303.根据权利要求285至302中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是抗原结合片段。
304.根据权利要求285至303中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
305.根据权利要求285至304中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人抗体。
306.根据权利要求285至305中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是人源化的。
307.根据权利要求285至306中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体是嵌合的。
308.根据权利要求285至307中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
309.根据权利要求285至308中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
310.根据权利要求285至309中任一项所述的分离并纯化的抗体,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
311.一种宿主细胞,其产生与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体。
312.根据权利要求311所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
313.根据权利要求311或权利要求312所述的宿主细胞,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
314.根据权利要求311至313中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
315.根据权利要求311至314中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
316.根据权利要求311至315中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
317.根据权利要求311至316中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
318.根据权利要求311至317中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体包含IgG恒定域。
319.根据权利要求311至318中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
320.根据权利要求311至319中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体是单克隆抗体。
321.根据权利要求311至320中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体是抗原结合片段。
322.根据权利要求311至321中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
323.根据权利要求311至322中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体是人抗体。
324.根据权利要求311至323中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体是人源化的。
325.根据权利要求311至324中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体是嵌合的。
326.根据权利要求311至325中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
327.根据权利要求311至326中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
328.根据权利要求311至327中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
329.根据权利要求311至328中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
330.根据权利要求311至329中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
331.根据权利要求311至330中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与D77结合。
332.根据权利要求311至331中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与P78结合。
333.根据权利要求311至332中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与R79结合。
334.根据权利要求311至333中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与D80结合。
335.根据权利要求311至334中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与A81结合。
336.根据权利要求311至335中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与W82结合。
337.根据权利要求311至336中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与M83结合。
338.根据权利要求311至337中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与L84结合。
339.根据权利要求311至338中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与F85结合。
340.根据权利要求311至339中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体至少与V86结合。
341.根据权利要求311至340中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
342.根据权利要求311至341中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
343.根据权利要求311至342中任一项所述的宿主细胞,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
344.根据权利要求311至343中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
345.根据权利要求311至344中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞和per.C6细胞。
346.根据权利要求311至345中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是CHO细胞。
347.根据权利要求311至346中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是骨髓瘤细胞。
348.根据权利要求311至347中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是杂交瘤。
349.根据权利要求311至348中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、奇异变形杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、短芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、类干酪乳杆菌细胞、浅青紫链霉菌细胞、解脂耶尔森氏菌细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、黑曲霉泡盛变种细胞、米曲霉细胞、蜥蜴利什曼原虫细胞、粉纹夜蛾幼虫细胞、草地贪夜蛾细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-1模拟细胞。
350.一种组合物,其包含与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体以及赋形剂。
351.根据权利要求350所述的组合物,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
352.根据权利要求350或权利要求351所述的组合物,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
353.根据权利要求350至352中任一项所述的组合物,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
354.根据权利要求350至353中任一项所述的组合物,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
355.根据权利要求350至354中任一项所述的组合物,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
356.根据权利要求350至355中任一项所述的组合物,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
357.根据权利要求350至356中任一项所述的组合物,其中所述抗体包含IgG恒定域。
358.根据权利要求350至357中任一项所述的组合物,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
359.根据权利要求350至358中任一项所述的组合物,其中所述抗体是单克隆抗体。
360.根据权利要求350至359中任一项所述的组合物,其中所述抗体是抗原结合片段。
361.根据权利要求350至360中任一项所述的组合物,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)
2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
362.根据权利要求350至361中任一项所述的组合物,其中所述抗体是人抗体。
363.根据权利要求350至362中任一项所述的组合物,其中所述抗体是人源化的。
364.根据权利要求350至363中任一项所述的组合物,其中所述抗体是嵌合的。
365.根据权利要求350至364中任一项所述的组合物,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
366.根据权利要求350至365中任一项所述的组合物,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
367.根据权利要求350至366中任一项所述的组合物,其中所述抗体具有小于1.0x10-
08M的KD。
368.根据权利要求350至367中任一项所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
369.根据权利要求350至368中任一项所述的组合物,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
370.根据权利要求350至369中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与D77结合。
371.根据权利要求350至370中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与P78结合。
372.根据权利要求350至371中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与R79结合。
373.根据权利要求350至372中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与D80结合。
374.根据权利要求350至373中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与A81结合。
375.根据权利要求350至374中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与W82结合。
376.根据权利要求350至375中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与M83结合。
377.根据权利要求350至376中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与L84结合。
378.根据权利要求350至377中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与F85结合。
379.根据权利要求350至378中任一项所述的组合物,其中所述抗体至少与V86结合。
380.根据权利要求350至379中任一项所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
381.根据权利要求350至380中任一项所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
382.根据权利要求350至381中任一项所述的组合物,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
383.一种产生与ERFE多肽特异性结合的抗体的方法,其包括从产生所述抗体的宿主细胞中分离并纯化所述抗体。
384.根据权利要求383所述的方法,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
385.根据权利要求383或权利要求384所述的方法,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
386.根据权利要求383至385中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
387.根据权利要求383至386中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
388.根据权利要求383至387中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
389.根据权利要求383至388中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
390.根据权利要求383至389中任一项所述的方法,其中所述抗体包含IgG恒定域。
391.根据权利要求383至390中任一项所述的方法,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
392.根据权利要求383至391中任一项所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
393.根据权利要求383至392中任一项所述的方法,其中所述抗体是抗原结合片段。
394.根据权利要求383至393中任一项所述的方法,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
395.根据权利要求383至394中任一项所述的方法,其中所述抗体是人抗体。
396.根据权利要求383至395中任一项所述的方法,其中所述抗体是人源化的。
397.根据权利要求383至396中任一项所述的方法,其中所述抗体是嵌合的。
398.根据权利要求383至397中任一项所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
399.根据权利要求383至398中任一项所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
400.根据权利要求383至399中任一项所述的方法,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
401.根据权利要求383至400中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
402.根据权利要求383至401中任一项所述的方法,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
403.根据权利要求383至402中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与D77结合。
404.根据权利要求383至403中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与P78结合。
405.根据权利要求383至404中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与R79结合。
406.根据权利要求383至405中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与D80结合。
407.根据权利要求383至406中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与A81结合。
408.根据权利要求383至407中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与W82结合。
409.根据权利要求383至408中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与M83结合。
410.根据权利要求383至409中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与L84结合。
411.根据权利要求383至410中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与F85结合。
412.根据权利要求383至411中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与V86结合。
413.根据权利要求383至412中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
414.根据权利要求383至413中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
415.根据权利要求383至414中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
416.根据权利要求383至415中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
417.根据权利要求383至416中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞选自CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1 细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞和per.C6细胞。
418.根据权利要求383至417中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是CHO细胞。
419.根据权利要求383至418中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是骨髓瘤细胞。
420.根据权利要求383至419中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是杂交瘤。
421.根据权利要求383至420中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、奇异变形杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、短芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、类干酪乳杆菌细胞、浅青紫链霉菌细胞、解脂耶尔森氏菌细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、黑曲霉泡盛变种细胞、米曲霉细胞、蜥蜴利什曼原虫细胞、粉纹夜蛾幼虫细胞、草地贪夜蛾细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-1模拟细胞。
422.一种调节ERFE多肽活性的方法,其包括使所述ERFE多肽与足量的与所述ERFE多肽特异性结合的抗体或包含该抗体的组合物接触。
423.根据权利要求422所述的方法,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
424.根据权利要求422或权利要求423所述的方法,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
425.根据权利要求422至424中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
426.根据权利要求422至425中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
427.根据权利要求422至426中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
428.根据权利要求422至427中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
429.根据权利要求422至428中任一项所述的方法,其中所述抗体包含IgG恒定域。
430.根据权利要求422至429中任一项所述的方法,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
431.根据权利要求422至430中任一项所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
432.根据权利要求422至431中任一项所述的方法,其中所述抗体是抗原结合片段。
433.根据权利要求422至432中任一项所述的方法,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
434.根据权利要求422至433中任一项所述的方法,其中所述抗体是人抗体。
435.根据权利要求422至434中任一项所述的方法,其中所述抗体是人源化的。
436.根据权利要求422至435中任一项所述的方法,其中所述抗体是嵌合的。
437.根据权利要求422至436中任一项所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
438.根据权利要求422至437中任一项所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
439.根据权利要求422至438中任一项所述的方法,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
440.根据权利要求422至439中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
441.根据权利要求422至440中任一项所述的方法,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
442.根据权利要求422至441中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与D77结合。
443.根据权利要求422至442中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与P78结合。
444.根据权利要求422至443中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与R79结合。
445.根据权利要求422至444中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与D80结合。
446.根据权利要求422至445中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与A81结合。
447.根据权利要求422至446中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与W82结合。
448.根据权利要求422至447中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与M83结合。
449.根据权利要求422至448中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与L84结合。
450.根据权利要求422至449中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与F85结合。
451.根据权利要求422至450中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与V86结合。
452.根据权利要求422至451中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
453.根据权利要求422至452中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
454.根据权利要求422至453中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
455.一种检测样品中的ERFE多肽的方法,其包括使所述样品与同所述ERFE多肽特异性结合的抗体和可检测标记物接触。
456.根据权利要求455所述的方法,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
457.根据权利要求455或权利要求456所述的方法,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
458.根据权利要求455至457中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
459.根据权利要求455至458中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
460.根据权利要求455至459中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
461.根据权利要求455至460中任一项所述的方法,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
462.根据权利要求455至461中任一项所述的方法,其中所述抗体包含IgG恒定域。
463.根据权利要求455至462中任一项所述的方法,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
464.根据权利要求455至463中任一项所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
465.根据权利要求455至464中任一项所述的方法,其中所述抗体是抗原结合片段。
466.根据权利要求455至465中任一项所述的方法,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
467.根据权利要求455至466中任一项所述的方法,其中所述抗体是人抗体。
468.根据权利要求455至467中任一项所述的方法,其中所述抗体是人源化的。
469.根据权利要求455至468中任一项所述的方法,其中所述抗体是嵌合的。
470.根据权利要求455至469中任一项所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
471.根据权利要求455至470中任一项所述的方法,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
472.根据权利要求455至471中任一项所述的方法,其中所述抗体具有小于1.0x10-8M的KD。
473.根据权利要求455至472中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
474.根据权利要求455至473中任一项所述的方法,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
475.根据权利要求455至474中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与D77结合。
476.根据权利要求455至475中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与P78结合。
477.根据权利要求455至476中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与R79结合。
478.根据权利要求455至477中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与D80结合。
479.根据权利要求455至478中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与A81结合。
480.根据权利要求455至479中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与W82结合。
481.根据权利要求455至480中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与M83结合。
482.根据权利要求455至481中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与L84结合。
483.根据权利要求455至482中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与F85结合。
484.根据权利要求455至483中任一项所述的方法,其中所述抗体至少与V86结合。
485.根据权利要求455至484中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
486.根据权利要求455至485中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
487.根据权利要求455至486中任一项所述的方法,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
488.根据权利要求455至487中任一项所述的方法,其中所述方法包括夹心ELISA。
489.根据权利要求488所述的方法,其中所述夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在所述孔中将包含所述ERFE多肽的样品与所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将标记的检测抗体与所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,然后测量与所述ERFE和捕获抗体结合的检测抗体的量。
490.根据权利要求489所述的方法,其中所述标记的检测抗体是生物素化的、荧光的或酶缀合的。
491.根据权利要求489或权利要求490所述的方法,其中所述捕获抗体与ERFE多肽的C末端的至少一部分结合,并且所述检测抗体与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合,其中所述捕获抗体和所述检测抗体是不同的抗体。
492.根据权利要求489至491中任一项所述的方法,其中所述样品包括血液、血清、尿液、唾液、骨髓、肝、脾、脑脊液、骨骼肌、平滑肌、脂肪组织、细胞或培养基。
493.根据权利要求488至492中任一项所述的方法,其中所述夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在所述孔中将包含所述ERFE多肽的样品与所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将生物素化的检测抗体与所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将链霉亲和素-HRP缀合物与所述生物素化的检测抗体、所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,添加底物并测量吸光度值。
494.根据权利要求493所述的方法,其中所述底物是比色的、发光的或荧光的。
495.根据权利要求493或权利要求494所述的方法,其中所述捕获抗体与ERFE多肽的C末端的至少一部分结合,并且所述检测抗体与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合,其中所述捕获抗体和所述检测抗体是不同的抗体。
496.根据权利要求493至495中任一项所述的方法,其中所述样品包括血液、血清、尿液、唾液、骨髓、肝、脾、脑脊液、骨骼肌、平滑肌、脂肪组织、细胞或培养基。
497.一种试剂盒,其包含与ERFE多肽特异性结合的抗体以及至少一种缓冲液。
498.根据权利要求497所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE的N末端上的ERFE多肽的表位结合。
499.根据权利要求497或权利要求498所述的试剂盒,其中所述抗体与长度为至少3个氨基酸的ERFE多肽的表位结合。
500.根据权利要求497至499中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分的表位结合。
501.根据权利要求497至500中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸的表位结合。
502.根据权利要求497至501中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸的表位结合。
503.根据权利要求497至502中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与包含序列
DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸的表位结合。
504.根据权利要求497至503中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体包含IgG恒定域。
505.根据权利要求497至504中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。
506.根据权利要求497至505中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是单克隆抗体。
507.根据权利要求497至506中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是抗原结合片段。
508.根据权利要求497至507中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是Fab片段、F(ab’)
2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。
509.根据权利要求497至508中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是人抗体。
510.根据权利要求497至509中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是人源化的。
511.根据权利要求497至510中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是嵌合的。
512.根据权利要求497至511中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。
513.根据权利要求497至512中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体部分或完全抑制铁调素mRNA表达的抑制。
-8
514.根据权利要求497至513中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体具有小于1.0x10 M的KD。
515.根据权利要求497至514中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
516.根据权利要求497至515中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体阻断ERFE多肽对铁调素mRNA表达的抑制。
517.根据权利要求497至516中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与D77结合。
518.根据权利要求497至517中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与P78结合。
519.根据权利要求497至518中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与R79结合。
520.根据权利要求497至519中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与D80结合。
521.根据权利要求497至520中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与A81结合。
522.根据权利要求497至521中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与W82结合。
523.根据权利要求497至522中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与M83结合。
524.根据权利要求497至523中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与L84结合。
525.根据权利要求497至524中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与F85结合。
526.根据权利要求497至525中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体至少与V86结合。
527.根据权利要求497至526中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
528.根据权利要求497至527中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
529.根据权利要求497至528中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体与ERFE多肽的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
530.根据权利要求497至529中任一项所述的试剂盒,其中所述抗体是生物素化的。
531.根据权利要求497至530中任一项所述的试剂盒,其进一步包含底物。
532.根据权利要求497至531中任一项所述的试剂盒,其中所述底物是比色的、发光的或荧光的。

说明书全文

ERFE特异性抗体组合物和使用方法

相关申请

[0001] 本申请要求于2016年8月5日提交的美国临时申请号62/371,478的权益,该申请的内容通过引用以其全文并入本文。序列表
[0002] 本申请附有以ASCII格式以电子方式提交并且通过引用以其全文并入本文的序列表。所述ASCII拷贝创建于2017年7月19日,被命名为45543-702_601_SL.txt,并且大小为8,263字节。
发明内容
[0003] 在某些实施方案中,本文提供了分离并纯化的抗体,其与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。
[0004] 在某些实施方案中,本文还提供了分离并纯化的抗体,其与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体阻断ERFE对调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
[0005] 在某些实施方案中,本文还提供了与ERFE结合的分离并纯化的抗体。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)或微抗体(minibody)。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。
[0006] 在某些实施方案中,本文另外提供了宿主细胞,其产生本文公开的与ERFE结合的分离并纯化的抗体。在一些实施方案中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞选自CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞和per.C6细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是CHO细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是杂交瘤。在一些实施方案中,所述宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)细胞、奇异变形杆菌(P.mirabilis)细胞、恶臭假单胞菌(P.putidas)细胞、短芽孢杆菌(B.brevis)细胞、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞、类干酪乳杆菌(L.paracasei)细胞、浅青紫链霉菌(S.lividans)细胞、解脂耶尔森氏菌(Y.lipolytica)细胞、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)细胞、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)细胞、酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞、黑曲霉泡盛变种(A.niger var.awamori)细胞、米曲霉(A.oryzae)细胞、蜥蜴利什曼原虫(L.tarentolae)细胞、粉纹夜蛾(T.ni)幼虫细胞、草地贪夜蛾(S.frugiperda)细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-1模拟细胞。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:
1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。
[0007] 在某些实施方案中,本文还提供了组合物,其包含与本文公开的ERFE结合的分离并纯化的抗体以及赋形剂。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体是中和抗体。
[0008] 在某些实施方案中,本文还提供了产生与ERFE多肽特异性结合的抗体的方法,其包括从本文公开的宿主细胞中分离并纯化抗体。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体是中和抗体。
[0009] 在某些实施方案中,本文还提供了调节ERFE多肽活性的方法,其包括使所述ERFE多肽与足量的与本文提供的ERFE结合的分离并纯化的抗体或其组合物接触。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ  ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ IDNO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体是中和抗体。
[0010] 在某些实施方案中,本文另外提供了检测样品中的ERFE多肽的方法,其包括使所述样品与本文提供的同ERFE结合的分离并纯化的抗体和可检测标记物接触。在一些实施方案中,所述方法包括夹心ELISA。在一些实施方案中,所述夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在所述孔中将包含所述ERFE多肽的样品与所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将标记的检测抗体与所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,然后测量与所述ERFE和捕获抗体结合的检测抗体的量。在一些实施方案中,所述标记的检测抗体是生物素化的、荧光的或酶缀合的。在一些实施方案中,所述夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在所述孔中将包含所述ERFE多肽的样品与所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将生物素化的检测抗体与所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,在所述孔中将链霉亲和素-HRP缀合物与所述生物素化的检测抗体、所述ERFE多肽和所述捕获抗体一起温育,添加底物并测量吸光度值。在一些实施方案中,所述底物是比色的、发光的或荧光的。在一些实施方案中,所述捕获抗体与ERFE多肽的C末端的至少一部分结合,并且所述检测抗体与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合,其中所述捕获抗体和所述检测抗体是不同的抗体。在一些实施方案中,所述样品包括血液、血清、尿液、唾液、骨髓、肝、脾、脑脊液、骨骼肌、平滑肌、脂肪组织、细胞或培养基。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体是中和抗体。
[0011] 在某些实施方案中,本文还提供了试剂盒,其包含本文公开的与ERFE结合的分离并纯化的抗体以及至少一种缓冲液。在一些实施方案中,至少一种抗体是生物素化的。在一些实施方案中,所述试剂盒包含底物。在一些实施方案中,所述底物是比色的、发光的或荧光的。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,所述分离并纯化的抗体与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体至少与D77结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与P78结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与R79结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与D80结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与A81结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与W82结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与M83结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与L84结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与F85结合。在一些实施方案中,所述抗体至少与V86结合。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
在一些实施方案中,所述抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,所述抗体包含IgG恒定域。
在一些实施方案中,所述抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域,或其变体。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体或微抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人抗体。在一些实施方案中,所述抗体是人源化的。在一些实施方案中,所述抗体是嵌合的。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制erythroferrone活性。在一些实施方案中,所述抗体部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,所述抗体是中和抗体。
附图说明
[0012] 新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本文原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图,将会获得对本文的特征和优点的更好的理解,在这些附图中:
[0013] 图1示出了使用重组ERFE的erythroferrone(ERFE)夹心ELISA标准曲线的结果。
[0014] 图2示出了在静脉切开术后的时间过程中的血清ERFE平。
[0015] 图3示出了在β-地中海贫血的小鼠模型中,th3/+与ERFE KO/th3、ERFE KO和野生型(WT)相比的血清ERFE水平。
[0016] 图4示出了α-ERFE-1抗体的表位作图。
[0017] 图5示出了α-ERFE-2抗体的表位作图。
[0018] 图6示出了α-ERFE-3抗体的表位作图。
[0019] 图7示出了α-ERFE-1抗体针对Fc-mERFE、FlagHis-mERFE和FlagHis-hERFE的拮抗活性。
[0020] 图8示出了α-ERFE-2抗体针对Fc-mERFE、FlagHis-mERFE和FlagHis-hERFE的拮抗活性。
[0021] 图9示出了α-ERFE-1抗体与生物素化的ERFE肽(SEQ ID NO:13)结合的结合动学。
[0022] 图10示出了α-ERFE-2抗体与生物素化的ERFE肽(SEQ ID NO:13)结合的结合动力学。
[0023] 图11示出了各种分离并纯化的抗ERFE抗体的抗ERFE抗体结合数据的概述。
[0024] 图12示出了通过对分离并纯化的抗ERFE抗体的抑制测定进行的功能性抗ERFE抗体筛选。
[0025] 图13A示出了α-ERFE-1在抑制ERFE介导的HAMP抑制中的体外功能性剂量响应。
[0026] 图13B示出了α-ERFE-2在抑制ERFE介导的HAMP抑制中的体外功能性剂量响应。
[0027] 图13C示出了α-ERFE-1和α-ERFE-3在抑制ERFE介导的HAMP抑制中的体外功能性剂量响应。
[0028] 图14A示出了α-ERFE-1抗体与单价人ERFE结合的动力学测量。
[0029] 图14B示出了α-ERFE-2抗体与单价人ERFE结合的动力学测量。
[0030] 图14C示出了α-ERFE-3抗体与单价人ERFE结合的动力学测量。
[0031] 图15A示出了人和食蟹猴ERFE与α-ERFE-1抗体的结合的比较。
[0032] 图15B示出了人和食蟹猴ERFE与α-ERFE-2抗体的结合的比较。
[0033] 图16A示出了与人ERFE特异性结合的α-ERFE-1和α-ERFE-2的western印迹。
[0034] 图16B示出了用于与ERFE结合以将ERFE掺入Hep3B细胞裂解物中的α-ERFE-1的western印迹。
[0035] 图16C示出了ELISA,其说明α-ERFE-1和α-ERFE-2与人ERFE特异性结合,但不与其他家族成员CTRP蛋白结合。
[0036] 图17A示出了α-ERFE-1和α-ERFE-2在抑制用EPO刺激ERFE后的HAMP mRNA水平变化方面的体内活性。
[0037] 图17B示出了α-ERFE-1和α-ERFE-2在抑制用EPO刺激ERFE后的血清铁调素水平变化方面的体内活性。
[0038] 图17C示出了α-ERFE-1和α-ERFE-2在抑制用EPO刺激ERFE后的血清铁水平变化方面的体内活性。
[0039] 图18A示出了α-ERFE-3在抑制用EPO刺激ERFE后的HAMP mRNA水平变化方面的体内活性。
[0040] 图18B示出了α-ERFE-3在抑制用EPO刺激ERFE后的血清铁调素水平变化方面的体内活性。
[0041] 图18C示出了α-ERFE-3在抑制用EPO刺激ERFE后的血清铁水平变化方面的体内活性。

具体实施方式

[0042] 在某些实施方案中,本文公开了分离并纯化的抗体,其与erythroferrone(ERFE)多肽的表位特异性结合。在某些实施方案中,本文进一步公开了分离并纯化的抗体,其与ERFE的以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且其中该抗体阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在某些实施方案中,本文另外公开了宿主细胞,其产生与erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体,例如与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在某些实施方案中,本文还公开了组合物,其包含与erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体以及赋形剂,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在某些实施方案中,本文进一步公开了产生与erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体,例如与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体的方法:
SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,该方法包括从宿主细胞中分离并纯化抗体。在某些实施方案中,本文另外公开了调节ERFE多肽活性的方法,其包括使该ERFE多肽与足量的与erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体或其组合物接触,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在某些实施方案中,本文还公开了检测样品中的ERFE多肽的方法,其包括使该样品与同erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体和可检测标记物接触,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在某些实施方案中,本文进一步公开了试剂盒,其包含与erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体或其组合物,以及至少一种缓冲液,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
定义
[0043] 如本文所用,erythroferrone(包括ERFE和Erfe)及其类似物和片段在本文中统称为“ERFE多肽”。
[0044] 如本文所用,“erythroferrone活性”是指与对照相比,该物质降低肝铁调素mRNA或血清铁调素水平或者提高血清铁水平的能力。
[0045] 如本文所用,术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用,以指连接在一起的两个或更多个氨基酸。
[0046] 如本文所用,“基本上纯化的”化合物或“分离的”化合物在本文可互换使用,是指化合物从其天然环境中移取,并且/或者至少约60%、约75%、约90%或约95-100%不含天然与该化合物关联或由其合成的其他大分子组分或化合物。
[0047] 如本文所用,“接触”当用于诸如蛋白质(例如,ERFE抗体)、材料、样品等组成物或者处理时,意指该组成物(例如,ERFE抗体)与另一个提及的实体之间的直接或间接相互作用。直接相互作用的具体实例是结合。间接相互作用的具体实例是组成物作用于中间分子,该中间分子又作用于所提及的实体。因此,例如,使细胞(例如,肝细胞)与ERFE抗体接触包括允许抗体与细胞结合(例如,通过与ERFE结合),或允许抗体作用于中间体,该中间体又作用于该细胞。
[0048] 术语“测定”和“测量”及其语法变化在本文中可互换使用,并且是指定性或定量的测定,或者定性和定量测定二者。当该术语用于结合时,涉及评估结合的相对量、亲和力或特异性的任何手段,包括本文阐述和本领域已知的各种方法。例如,在一些实施方案中,通过ELISA测定来测定或测量ERFE抗体与ERFE的结合。
[0049] 如本文所用,“中和抗体”是能够抑制靶蛋白的抗体。在一些实施方案中,抗ERFE中和抗体降低循环ERFE水平。在一些实施方案中,抗ERFE中和抗体降低ERFE活性。在一些实施方案中,抗ERFE中和抗体抑制或阻止ERFE与受体结合。
[0050] 如本文所用,除非上下文另有明确说明,否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。因此,例如,提及“一种抗体”包括多种抗体,并且在一些实施方案中提及“一个抗体”包括多个抗体,等等。
[0051] 如本文所用,除非上下文另有明确说明,否则所有数值或数值范围包括在这些范围内或包含这些范围的全部整数以及在范围内或包含范围的数值或整数的分数。因此,例如,提及90-100%的范围包括91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%等,以及91.1%、91.2%、91.3%、91.4%、91.5%等,92.1%、92.2%、92.3%、92.4%、92.5%等,诸如此类。
在另一个实例中,提及1-5,000倍的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20倍等,以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍等,2.1、2.2、2.3、2.4、2.5倍等,诸如此类。
Erythroferrone
[0052] Erythroferrone(ERFE)是在红细胞产生与个体中铁的吸收和分布之间进行介导的激素。ERFE在个体的骨髓中产生,并且当红细胞的产生受到刺激时,例如出血后或贫血恢复期间,其产生大大增加。ERFE调节铁的供应以满足骨髓中红细胞生成的需要。具体而言,发现ERFE作用于肝以抑制主要铁调节蛋白—铁调素—的产生。因此,在某些情况下,ERFE的过量产生导致疾病如β-地中海贫血中的铁过载。
[0053] 铁调素是一种由肝合成的25个氨基酸的肽激素,是铁稳态的主要调节物。铁调素通过与唯一的铁输出蛋白铁转运蛋白结合从而导致其在溶酶体中的泛素化、内化和降解而起作用。当铁转运蛋白从细胞膜上消失时,膳食铁的吸收受到抑制,并且再循环铁被隔离在巨噬细胞中,从而减少可用于红细胞生成的铁。相反,低铁调素允许铁转运蛋白在将铁输出到血浆的细胞上保持活性,从而使更多的铁可用于血红蛋白合成。铁、炎症或ER应激刺激铁调素产生,而低、铁缺乏和增加的红细胞生成活性抑制铁调素产生。
[0054] 铁调素在出血或施用红细胞生成素(EPO)后得到抑制。铁调素在因出血、溶血或铁缺乏引起的贫血或者无效性红细胞生成中减少。红细胞生成对铁调素的抑制作用在具有无效性红细胞生成的疾病中尤为突出,其中红细胞前体大量扩充但大多数在成红细胞阶段经历凋亡而不是成熟为红细胞。
[0055] ERFE也称为补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白15、肌联素(Myonectin)、FAM132B、C1QTNF15和CTRP15。全长人ERFE的一个非限制性实例是如下所示的序列:MAPARRPAGARLLLVYAGLLAAAAAGLGSPEPGAPSRSRARREPPPGNELPRGPGESRAGPAARPPEPTAERAHSVDPRDAWMLFVRQSDKGVNGKKRSRGKAKKLKFGLPGPPGPPGPQGPPGPIIPPEALLKEFQLLLKGAVRQRERAEPEPCTCGPAGPVAASLAPVSATAGEDDDDVVGDVLALLAAPLAPGPRAPRVEAAFLCRLRRDALVERRALHELGVYYLPDAEGAFRRGPGLNLTSGQYRAPVAGFYALAATLHVALGEPPRRGPPRPRDHLRLLICIQSRCQRNASLEAIMGLESSSELFTISVNGVLYLQMGQWTSVFLDNASGCSLTVRSGSHFSAVLLGV(SEQ ID NO:2)。ERFE抗体
[0056] 在某些实施方案中,本文公开了与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体。在某些实施方案中,本文进一步公开了与ERFE的以下残基中的至少一个结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,该抗体与ERFE多肽的结合阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,针对ERFE多肽的抗体是中和抗体。
[0057] 在一些实施方案中,本文公开的与ERFE多肽特异性结合的抗体是分离的。在一些实施方案中,与ERFE多肽特异性结合的抗体是基本上纯化的。在一些实施方案中,与ERFE多肽特异性结合的抗体是分离并基本上纯化的。
[0058] 在一些实施方案中,本文公开的与ERFE多肽特异性结合的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,本文公开的与ERFE多肽特异性结合的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中,本文公开的与ERFE多肽特异性结合的抗体是IgM抗体、IgG抗体、IgA抗体、IgE抗体、IgD抗体或其任何亚类。在一些实施方案中,本文公开的与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgM抗体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgG抗体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgA抗体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgE抗体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽序列特异性结合的抗体是IgD抗体。
[0059] 在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体包含IgG恒定域或其变体。在一些实施方案中,本文的IgG恒定域变体包含具有降低的与补体蛋白如C1q的结合的恒定域。具有降低的与C1q的结合的一些此类变体包括但不限于IgG1的残基L235、G237、D270、N297、K322、P329和P331处的突变;以及IgG2的N297、E318、K320和K322处的突变。在一些实施方案中,本文的IgG变体包含具有增加的与FcRn的结合的恒定域。具有增加的与FcRn的结合的一些此类变体包括但不限于T250、M252、S254、T256、M428、H433和N434。在另外的实施方案中,本文的IgG变体包括用来自IgG4Fc结构域的氨基酸修饰IgG2Fc结构域以消除效应子功能。在另外的实施方案中,本文的IgG变体包括用来自IgG1、IgG2或IgG4Fc结构域的氨基酸修饰IgG3Fc结构域。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域或其变体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgG2抗体。在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgG3抗体。在一些实施方案中,与
erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是IgG4抗体。
[0060] 在一些实施方案中,本文的抗体具有κ或λ轻链序列,如天然存在的抗体中的全长、其混合物(即,κ和λ链序列的融合物)及其子序列/片段。天然存在的抗体分子含有两个κ或两个λ轻链。
[0061] 在一些实施方案中,结合亲和力通过缔合(Ka)和解离(Kd)速率来确定。平衡亲和常数KD是Ka/Kd的比率。在一些实施方案中,使用表面等离子体共振(SPR)来测量缔合(Ka)和解离(Kd)速率。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的并且是可商购的(BiaCore 2000、Biacore AB、ForteBio Octet)。在一些实施方案中,KD值被定义为使ERFE上的结合位点的一半(50%)饱和所需的ERFE抗体浓度。
[0062] 在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是抗体子序列或抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Cov-X-抗体、双抗体、三抗体、dsDb、DART、scDb、tandAb、三主体抗体(triple body)、三头抗体(triple head)、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、dAb-CH1/CL、scFv4-Ig、IgG-scFv、scFv-IgG、DVD-Ig、IgG-sVD、sVD-IgG、二合一IgG(2in 1-IgG)、mAb2、Tandemab共同LC、taFv-Fc、双抗体、双-双抗体、scDbFc、scDb-CH3、scFv-Fc-scFV、HCAb-VHH、kih IgG、kih IgG通用LC、scFv-kih-Fc、kih scFab-IgG、scFv-kih-CH3、CrossMab、mAb-Fv、kih-IgG-scFab、kih scFab-IgG-scFv、kih scFab-IgG-scFv、κ/λ-抗体共同HC、SEED-抗体、CH3电荷对、铰链电荷对、不对称IgG、Duobody、纳米抗体、微抗体、VL和VH结构域片段。
[0063] 在一些实施方案中,抗体子序列和抗体片段具有全长抗体的结合亲和力、全长抗体的结合特异性或者全长抗体的一种或多种活性或功能,例如ERFE拮抗剂或激动剂抗体的功能或活性。
[0064] 在一些实施方案中,与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体是人抗体。在一些实施方案中,该抗体是人源化的。在一些实施方案中,该抗体是嵌合的。
ERFE表位
[0065] 在一些实施方案中,本文公开的抗体与ERFE多肽N末端序列的氨基酸序列中的表位特异性结合。在一些实施方案中,该ERFE多肽的表位在ERFE的N末端上。在一些实施方案中,该ERFE多肽的表位在ERFE的C末端上。在一些实施方案中,该ERFE多肽的表位的长度为至少3个氨基酸。
[0066] 在一些实施方案中,本文公开的抗体与之结合的ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分。在一些实施方案中,该ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的3至6个氨基酸。在一些实施方案中,该ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的4至6个氨基酸。在一些实施方案中,该ERFE多肽的表位包含序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的5至6个氨基酸。在一些实施方案中,该抗体与SEQ ID NO:2的至少D77结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的P78结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的R79结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的D80结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的A81结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的W82结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的M83结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的L84结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:2的F85结合。在一些实施方案中,该抗体至少与SEQ ID NO:
2的V86结合。在一些实施方案中,该抗体与ERFE的以下残基中的至少两个结合:SEQ ID NO:
2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,该抗体与ERFE的以下残基中的至少三个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
在一些实施方案中,该抗体与ERFE的以下残基中的至少四个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
ERFE抗体的制备
[0067] 在某些方面,本文进一步公开了这样的方法,其产生与erythroferrone(ERFE)多肽序列的表位特异性结合的抗体,例如,与以下残基中的至少一种特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,该方法包括从宿主细胞中分离并纯化抗体。
[0068] 在一些实施方案中,本文公开的抗体包含抗体子序列或片段。在一些实施方案中,抗体子序列和片段通过蛋白水解抗体,例如通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来制备。通过用胃蛋白酶进行酶促切割产生的抗体子序列和片段提供被表示为F(ab′)2的5S片段。在一些实施方案中,使用硫醇还原剂进一步裂解该片段以产生3.5S Fab′单价片段。或者,使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab′片段和Fe片段。在一些实施方案中,还使用切割抗体的其他方法,如分离重链以形成单价轻-重链片段、进一步切割片段或者其他酶促或化学方法。
[0069] 在一些实施方案中,本文公开的抗体包含抗体子序列和片段。例如,在一些实施方案中,VL或VH子序列通过连接体序列连接,从而形成VL-VH嵌合体。在一些实施方案中,单链Fv(scFv)子序列的组合通过连接体序列连接,从而形成scFv-scFv嵌合体。ERFE抗体子序列和片段包括单链抗体或者单独或与全部或部分其他ERFE抗体子序列组合的可变区。
[0070] 通过遗传方法产生抗体及其子序列和片段。技术包括将编码蛋白质或抗体的基因的全部或部分表达到宿主细胞中,如Cos细胞、CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞、per.C6细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、大肠杆菌细胞、奇异变形杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、短芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、类干酪乳杆菌细胞、浅青紫链霉菌细胞、解脂耶尔森氏菌细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、黑曲霉泡盛变种细胞、米曲霉细胞、蜥蜴利什曼原虫细胞、粉纹夜蛾幼虫细胞、草地贪夜蛾细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-1模拟细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是真菌细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是昆虫细胞。重组宿主细胞合成全长或子序列,例如scFv。
[0071] 与ERFE多肽特异性结合的抗体的修饰形式包括衍生化序列,例如,其中游离氨基基团形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、苄氧羰基;游离羧基基团形成盐、甲酯和乙酯;游离羟基基团形成O-酰基或O-烷基衍生物的氨基酸,以及天然存在的氨基酸衍生物,例如针对脯氨酸的4-羟基脯氨酸、针对赖氨酸的5-羟基赖氨酸、针对丝氨酸的高丝氨酸、针对赖氨酸的氨酸等。在一些实施方案中,使用本领域已知的方法产生修饰。
[0072] 与ERFE多肽特异性结合的抗体的修饰形式包括添加和插入。例如,在一些实施方案中,添加是任何类型的分子与ERFE抗体的共价或非共价连接。通常,添加和插入赋予不同的功能或活性。
[0073] 添加和插入包括融合(嵌合)抗体,该融合(嵌合)抗体具有一个或多个通常不与抗体共价连接的分子。具体实例是另一种抗体的氨基酸序列,以产生多特异性抗体。
[0074] 在一些实施方案中,本文公开的抗体是嵌合体或融合抗体,其具有与之共价连接的一个或多个另外的结构域,以赋予不同或互补的功能或活性。
[0075] 在一些实施方案中,本文公开的抗体包含异源结构域。在一些实施方案中,异源结构域是氨基酸添加或插入,但不限于氨基酸残基。因此,在一些实施方案中,异源结构域由多种不同类型的小或大功能部分中的任一种组成。这样的部分包括核酸、肽、水化合物、脂质或小有机化合物,如药物、金属(金、)等。异源结构域的特定非限制性实例包括例如,标签、可检测标记物和细胞毒性剂。标签和可检测标记物的具体实例包括T7-标签、His-标签、myc-标签、HA-标签和FLAG-标签;酶(辣根过氧化物酶、脲酶、过氧化氢酶、磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素转移酶);酶底物;配体(例如,生物素);受体(抗生物素蛋白);放射性核素(例如,C14、S35、P32、P33、H3、I125和I131);电子致密试剂;顺磁标记物;荧光团(荧光素、罗丹明、藻红蛋白);发色团;化学发光(咪唑、萤光素酶);以及生物发光剂。细胞毒性剂的具体实例包括白喉毒素、霍乱毒素和蓖麻毒素。
[0076] 在一些实施方案中,本文公开的抗体包含与抗体的第一部分和第二部分连接的连接体序列。在一些实施方案中,该连接体使得抗体的第一部分和抗体的第二部分能够至少部分地维持不同的功能或活性。在一些实施方案中,该连接体序列具有柔性结构、是可切割的(例如被蛋白酶切割)、不能形成有序的二级结构、或者具有疏水或带电荷特性。通常见于柔性蛋白质区域的氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。在一些实施方案中,其他近中性氨基酸如苏氨酸和丙氨酸也用于连接体序列。连接体进一步包括化学交联和缀合剂,如磺基-琥珀酰亚胺基衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)和二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)。
[0077] 在一些实施方案中,本文公开的抗体通过保护或阻断基团以及多种化学修饰中的任一种而被糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、甲酰化、遍在蛋白化或衍生化。在一些实施方案中,本文公开的抗体包含脂质或脂肪酸。其他排列和可能性对于本领域普通技术人员而言将会是显而易见的,并且被认为在本文的范围内。
[0078] 在一些实施方案中,本文公开的抗体使用重组DNA技术通过细胞表达或体外翻译来制备。本文公开的抗体还使用本领域已知的方法(例如,自动化肽合成装置(参见,例如,Applied Biosystems,Foster City,Calif.))通过化学合成来产生。
[0079] 考虑到在本文使用产生多克隆和单克隆抗体的任何合适的方法。例如,ERFE或其免疫原性片段任选地与载体如匙孔 血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(例如,BSA)缀合,或与佐剂如弗氏完全或不完全佐剂混合,并用于使动物免疫。在一些实施方案中,使用杂交瘤技术,分离来自响应于ERFE免疫的动物的脾细胞并将其与骨髓瘤细胞融合。在一些实施方案中,针对与ERFE或其免疫原性片段的反应性筛选由杂交瘤产生的单克隆抗体。
[0080] 在一些实施方案中,免疫的动物包括灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或豚鼠。在一些实施方案中,初始免疫和任何可选的后续免疫是通过静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下途径进行的。另外,为了增加免疫应答,在一些实施方案中,抗原与另一种蛋白质如卵清蛋白、匙孔 血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白或破伤类毒素偶联,或与佐剂如弗氏完全或不完全佐剂混合。在一些实施方案中,初始免疫和任何可选的后续免疫是通过腹膜内、肌肉内、眼内或皮下途径进行的。在一些实施方案中,后续免疫以相同或不同浓度的ERFE制剂,并且以规则或不规则的间隔进行。
[0081] 动物包括经遗传修饰以包括人类基因座的那些动物,该人类基因座在一些实施方案中用于产生人抗体。在一些实施方案中,使用常规杂交瘤技术分离来自对抗原具有高响应的免疫小鼠的脾细胞并将其与骨髓瘤细胞融合。在一些实施方案中,获得与ERFE结合的单克隆抗体。
[0082] 当用于抗体时,术语“人的”意指抗体的氨基酸序列是完全人的,即人重链和人轻链可变区以及人恒定区。因此,所有氨基酸都是人的或存在于人抗体中。在一些实施方案中,通过用人抗体中存在的氨基酸残基置换非人氨基酸残基来使非人的抗体成为完全人的抗体。存在于人抗体中的氨基酸残基、CDR区图和人抗体共有残基是本领域已知的。因此,人抗体包括其中一个或多个氨基酸残基已被任何其他人抗体中存在的一个或多个氨基酸置换的抗体。
[0083] ERFE抗体包括人源化抗体,在一些实施方案中,该人源化抗体使用任何合适的技术产生,包括例如,CDR移植;镶饰(veneering)或表面再塑(resurfacing);以及链改组。人共有序列先前已用于产生人源化抗体。
[0084] 当用于抗体时,术语“人源化”意指抗体的氨基酸序列具有与受体人免疫球蛋白分子中的所需抗原特异性结合的一个或多个互补决定区(CDR)的非人氨基酸残基(例如,小鼠的、大鼠的、山羊的、兔的等),以及Fv框架区(FR)中的一个或多个人氨基酸残基(它们是在CDR侧翼的氨基酸残基)。在一些实施方案中,被称为“灵长类化”的抗体在“人源化”的含义内,但受体人免疫球蛋白分子和框架区氨基酸残基是除任何人残基之外的任何灵长类动物氨基酸残基(例如,猿的、长臂猿的、大猩猩的、黑猩猩的、猩猩的、猕猴的)。在一些实施方案中,免疫球蛋白的人FR残基被相应的非人残基置换。因此,在一些实施方案中,CDR或人框架区中的残基被来自非人CDR或框架区供体抗体的相应残基置换,例如,以改变抗原亲和力或特异性。在一些实施方案中,人源化抗体包括残基既不在人抗体中也不在供体CDR或框架序列中发现的残基。例如,在一些实施方案中,预测在人抗体或供体非人抗体中未发现的特定位置处的FR置换会改变人抗体在该位置处的结合亲和力或特异性。基于分子建模的抗体框架和CDR置换是本领域公知的,例如,通过对CDR和框架残基的相互作用进行建模来鉴别对抗原结合重要的框架残基,并进行序列比较以鉴别特定位置处的异常框架残基。
[0085] 与ERFE多肽特异性结合的抗体包括嵌合抗体。如本文所用,当用于抗体时,术语“嵌合”及其语法变化意指抗体的氨基酸序列含有衍生自、获自或分离自或者基于两个或更多个不同物种的一个或多个部分。例如,在一些实施方案中,抗体的一部分是人的(例如,恒定区),而抗体的另一部分是非人的(例如,鼠重链或鼠轻链可变区)。因此,嵌合抗体的实例是其中抗体的不同部分具有不同物种来源的抗体。在一些实施方案中,与人源化或灵长类化的抗体不同,嵌合抗体在抗体的任何区域中都具有不同物种的序列。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。
[0086] 在一些实施方案中,还使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合生成与ERFE多肽特异性结合的抗体。
[0087] 在一些实施方案中,另外在抗体方法中使用的合适技术包括基于ERFE的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、大小排阻、蛋白A柱上的纯化,或这些技术的任何组合。在一些实施方案中,使用ELISA测定来确定ERFE抗体同种型,例如在一些实施方案中,使用小鼠Ig吸收的抗人Ig来鉴别人Ig。
[0088] 在某些实施方案中,本文公开了表达与ERFE多肽特异性结合的抗体、子序列及其片段的宿主细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞表达与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体。在一些实施方案中,本文公开的宿主细胞表达与ERFE的N末端上的表位结合的抗体。在一些实施方案中,本文公开的宿主细胞表达与序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分结合的抗体。在一些实施方案中,本文公开的宿主细胞表达与以下残基中的至少一个结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,本文公开的宿主细胞表达抗体,该抗体(a)与ERFE的N末端上的表位结合,并且(b)阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,本文公开的宿主细胞表达抗体,该抗体(a)与序列DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)的全部或部分结合,并且(b)阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,本文公开的宿主细胞表达抗体,该抗体(a)与以下残基中的至少一个结合:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,并且(b)阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,该抗体是中和抗体。
[0089] 在一些实施方案中,所述宿主细胞是脾细胞、杂交瘤细胞或CHO细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是来自原代细胞分离物(例如,脾细胞)、次生或传代细胞分离物或者已建立或永生化的细胞培养物(杂交瘤或CHO细胞)的多个细胞或细胞群体。本文考虑的宿主细胞包括但不限于Cos细胞、CHO细胞、ExpiCHO-S细胞、CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞、GS-NSO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293E细胞、HEK293-6E细胞、HEK293F细胞、per.C6细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、大肠杆菌细胞、奇异变形杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、短芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、类干酪乳杆菌细胞、浅青紫链霉菌细胞、解脂耶尔森氏菌细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、黑曲霉泡盛变种细胞、米曲霉细胞、蜥蜴利什曼原虫细胞、粉纹夜蛾幼虫细胞、草地贪夜蛾细胞、果蝇S2细胞、草地贪夜蛾SF9细胞、粉纹夜蛾细胞和SfSWT-1模拟细胞。
[0090] 在某些实施方案中,本文进一步提供了产生与ERFE多肽特异性结合的抗体的方法。在一些实施方案中,用于产生与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体的方法包括向动物(例如,小鼠)施用任选地与人Fc重组蛋白缀合的人ERFE、子序列或片段(例如,ERFE N末端序列),筛选表达与人ERFE结合的抗体的动物,并选择产生与人ERFE结合的抗体的动物,从所选择的动物中分离并培养表达该抗体的细胞群体,以及从所培养的细胞纯化该抗体。在一些实施方案中,该方法包括确定该抗体是否具有ERFE拮抗活性。在一些实施方案中,该方法包括确定该抗体是否是中和抗体。在一些实施方案中,所述动物是能够产生人抗体的转基因动物。
[0091] 本文另外提供了产生抑制或阻止ERFE与受体结合的人抗体的方法。在一些实施方案中,用于产生与erythroferrone(ERFE)多肽结合的抗体的方法包括向动物(例如,小鼠)施用任选地与人Fc重组蛋白缀合的人ERFE、子序列或片段(例如,ERFE N末端序列),筛选表达与人ERFE结合的抗体的动物,并选择产生与人ERFE结合的抗体的动物,从所选择的动物中分离并培养表达该抗体的细胞群体,以及从所培养的细胞纯化该抗体。在一些实施方案中,该方法包括确定该抗体是否抑制或阻止ERFE与受体结合。在一些实施方案中,该方法包括确定该抗体是否是中和抗体。
[0092] 本文另外提供了表达具有一种或多种以下特征的抗体的非人转基因动物:a)与杂交瘤细胞系产生的抗体相同;b)与杂交瘤细胞系产生的抗体的ERFE N末端结构域的氨基酸序列中的表位结合;c)具有在杂交瘤细胞系产生的抗体的约1-5000倍以内的ERFE结合亲和力;d)具有在杂交瘤细胞系产生的抗体的约KD 10-6M至约KD 10-12M以内的ERFE结合亲和力;e)具有杂交瘤细胞系产生的抗体的结合特异性;或f)与杂交瘤细胞系产生的抗体竞争与ERFE的结合。
[0093] 本文还提供了制备与ERFE多肽特异性结合的抗体的方法。在一些实施方案中,制备方法包括在生物反应器或大型培养容器中培养表达该抗体的宿主细胞,并通过本领域已知的方法纯化该抗体。在一些实施方案中,将该抗体分泌到培养基中。在一些实施方案中,不将该抗体分泌到培养基中。在一些实施方案中,通过亲和色谱法纯化该抗体。在一些实施方案中,通过阴离子交换色谱法纯化该抗体。在一些实施方案中,通过阳离子交换色谱法纯化该抗体。在一些实施方案中,通过大小排阻色谱法纯化该抗体。ERFE抗体方法和使用
[0094] 在某些实施方案中,本文另外公开了调节ERFE多肽的活性的方法,其包括使ERFE多肽与足量的与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体或其组合物接触,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,该抗体是中和抗体。
[0095] 抗体包括与ERFE多肽特异性结合并在体内或体外(例如,在个体中)调节ERFE功能或活性的抗体。如本文所用,当用于ERFE活性或功能时,术语“调节”及其语法变化意指ERFE活性或功能可检测地受影响、改变或变化。因此,调节ERFE活性或功能的ERFE抗体是可检测地影响、改变或变化一种或多种ERFE活性或功能的抗体,该一种或多种ERFE活性或功能在一些实施方案中包括例如ERFE与ERFE受体的结合、ERFE介导的信号传导或者ERFE介导的或ERFE可调节的细胞应答,或者本文所述或另外已知或可知的另外的ERFE活性或功能。在一些实施方案中,该ERFE抗体中和ERFE活性。在一些实施方案中,该ERFE抗体是中和抗体。受影响、改变或变化的ERFE活性的检测使用体外、基于细胞或体内的ERFE测定来完成。此类测定包括但不限于铁调素细胞表达测定、铁调素体内测定和血液铁水平体内测定。
[0096] 在一些实施方案中,与包含SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸的ERFE多肽表位结合的抗体具有期望的性质,例如抑制ERFE功能或活性。在一些实施方案中,与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合的抗体抑制ERFE功能或活性。在一些实施方案中,不与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合的抗体不抑制ERFE功能或活性。
[0097] 在一些实施方案中,所述抗体阻断部分或完全抑制ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。ERFE组合物
[0098] 在某些实施方案中,本文还公开了组合物,其包含与erythroferrone(ERFE)多肽序列特异性结合的抗体以及赋形剂,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
[0099] 在某些实施方案中,本文公开了组合物,其包含(a)与erythroferrone(ERFE)多肽序列特异性结合的抗体,和(b)缓冲液或赋形剂。在一些实施方案中,本文进一步公开了组合物,其包含(a)与以下残基中的至少一个结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86,和(b)赋形剂。在一些实施方案中,该抗体阻断ERFE对铁调素mRNA表达的抑制。在一些实施方案中,该抗体是中和抗体。
[0100] 在一些实施方案中,所述组合物是溶液、乳液、分散介质、包衣和/或等渗的。在一些实施方案中,这样的制剂包含在液体、乳液、悬浮液、糖浆或酏剂中,或者固体形式、粉末、颗粒、晶体或微珠中。在一些实施方案中,补充化合物(例如,防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也掺入该组合物中。
[0101] 在一些实施方案中,使用可生物降解生物相容性聚合物,如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中,脂质体悬浮液(包括使用抗体或病毒外壳蛋白靶向细胞或组织的脂质体)也用作载体。ERFE分析
[0102] 在某些方面,本文还公开了检测样品中的ERFE多肽的方法,其包括使样品与同erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体以及可检测标记物接触,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。
[0103] 在某些方面,本文进一步提供了筛选、检测和鉴别ERFE的无细胞(例如,在溶液中、在固相中)和基于细胞(例如,体外或体内)的方法。在一些实施方案中,该方法在溶液中进行、使用生物材料或样品在体外进行以及在体内(例如,来自动物的细胞或血清的样品)进行。在一些实施方案中,该方法包括在允许抗体与ERFE结合的条件下使生物材料或样品与同ERFE结合的抗体接触;以及测定抗体与ERFE的结合。抗体与ERFE的结合检测ERFE的存在。在一些实施方案中,ERFE存在于细胞或组织上。在一些实施方案中,ERFE存在于来自个体的血清样品中。在一些实施方案中,该生物材料或样品从哺乳动物个体获得。
[0104] 在一些实施方案中,本文还提供了用于检测ERFE多肽的方法,其包括使样品与本文所述的抗体和可检测标记物接触。在一些实施方案中,该方法包括夹心ELISA。在一些实施方案中,该夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在孔中将包含ERFE多肽的样品与捕获抗体一起温育,在孔中将标记的检测抗体与ERFE多肽和捕获抗体一起温育,然后测量与ERFE和捕获抗体结合的检测抗体的量。在一些实施方案中,该夹心ELISA包括将孔与捕获抗体一起温育,在孔中将包含ERFE多肽的样品与捕获抗体一起温育,在孔中将生物素化的检测抗体与ERFE多肽和捕获抗体一起温育,在孔中将链霉亲和素-HRP缀合物与生物素化的检测抗体、ERFE多肽和捕获抗体一起温育,添加底物并测量吸光度值。
[0105] 在本文所述的方法的一些实施方案中,所述方法包括含有血液、血清、尿液、唾液、骨髓、肝、脾、脑脊液、骨骼肌、平滑肌、脂肪组织、细胞或培养基中的一种或多种的样品。在一些实施方案中,该方法是荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫斑点(ELISPOT)、免疫沉淀、Western印迹法、显微术、竞争测定、表面等离子体共振(SPR)或放射免疫测定(RIA)。在一些实施方案中,所述可检测标记物包括酶标记物,如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或葡萄糖氧化酶;荧光标记物,如Alexa 350、Alexa405、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa
555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 680、Alexa
750、 FL、香豆素、 荧光素(FITC)、
TM TM TM TM
(Oregon )、太平洋蓝 (Pacific Blue )、太平洋绿 (Pacific Green )、太平洋
TM TM
橙 (Pacific Orange )、四甲基罗丹明(TRITC)、 (Texas )或其他
荧光标记物;或者放射性同位素,如32P、33P、3H、14C、125I或其他放射性同位素。
[0106] 在本文公开的另外的实施方案中,提供了用于检测样品中的ERFE的ELISA测定。在一些实施方案中,该ELISA测定包括夹心ELISA测定。在特定方面,该夹心ELISA测定包括与ERFE多肽的C末端的至少一部分结合的捕获抗体和与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合的检测抗体。在另一方面,该夹心ELISA测定包括与ERFE多肽的N末端的至少一部分结合的捕获抗体和与SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸结合的检测抗体。在一些实施方案中,该捕获抗体和检测抗体不是相同的抗体。在一些实施方案中,标记的检测抗体是生物素化的、荧光的或酶缀合的。在一些实施方案中,该检测抗体被选自以下的标记物标记:辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或葡萄糖氧化酶、Alexa 350、Alexa 405、Alexa488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa
568、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 680、Alexa 750、
FL、香豆素、 荧光素(FITC)、 太平洋蓝TM、太
平洋绿TM、太平洋橙TM、四甲基罗丹明(TRITC)、 32P、33P、3H、14C和125I。
在一些实施方案中,该夹心ELISA包含酶底物。在一些实施方案中,该酶底物包括PNPP、ABTS、OPD、TMB、ONPG、CDP-Star、CSPD、DynaLight、SuperSignal ELISAPico、SuperSignal ELISA Femto、QuantaBlu、Quanta Red、Amplex Red或Amplex UltraRed中的一种或多种。在一些实施方案中,该底物是比色的、发光的、放射性的或荧光的。在一些实施方案中,通过吸光度、发光、荧光、放射照相术或闪烁计数来检测信号。
ERFE抗体试剂盒
[0107] 在某些方面,本文进一步公开了试剂盒,其包含与erythroferrone(ERFE)多肽特异性结合的抗体或其组合物,以及至少一种缓冲液,该抗体例如是与以下残基中的至少一个特异性结合的抗体:SEQ ID NO:2的D77、P78、R79、D80、A81、W82、M83、L84、F85或V86。在一些实施方案中,该试剂盒包含至少一种生物素化抗体。在一些实施方案中,该试剂盒包含底物。在一些实施方案中,该底物是比色的、发光的或荧光的。
[0108] 在某些实施方案中,本文公开了试剂盒,其包含本文公开的分离并纯化的抗体以及至少一种缓冲液,任选地与关于使用试剂盒组分的说明(例如,用于执行本文方法的说明)组合。在一些实施方案中,该试剂盒包含ERFE抗体、子序列或片段,以及关于检测ERFE的说明。例如,在一些实施方案中,该试剂盒包含用于进行测定的试剂、用于获得待测定样品的装置、用于混合试剂并进行测定的装置等。
[0109] 在一些实施方案中,术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。在一些实施方案中,该包装材料无菌地保持组分,并且由通常用于此类目的的材料(例如,纸、瓦楞纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。在一些实施方案中,标签或包装插页包括适当的书面说明。因此,在一些实施方案中,说明包括用于实施本文的任何方法的说明。因此,在各种实施方案中,试剂盒包含标签或包装插页,该标签或包装插页包括用于在溶液中、体外、体内或离体实施本文方法的说明。
[0110] 在一些实施方案中,所述说明在“印刷品”上,例如在试剂盒内的纸或纸板上、在贴在试剂盒或包装材料上的标签上、或者附着在含有试剂盒组分的小瓶或管上。在一些实施方案中,说明包括音频或视频介质,并且另外包含在计算机可读介质如磁盘(软盘硬盘)、闪存驱动器、光学CD如CD-或DVD-ROM/RAM、磁带,电存储介质如RAM和ROM,以及这些介质的混合体如磁/光存储介质上。
[0111] 在一些实施方案中,本文的试剂盒另外包含缓冲剂、防腐剂或稳定剂。在一些实施方案中,该试剂盒包含用于测定活性的对照组分,例如,对照样品或标准品。在一些实施方案中,该试剂盒的每个组分被封装在单个容器内或混合物中,并且在某些实施方案中,所有各种容器都在单个或多个包装内。
[0112] 本文已经描述了多个实施方案。然而,应当理解,在一些实施方案中,在不脱离本文的精神和范围的情况下进行各种修改。因此,以下实施例旨在说明而非限制权利要求中描述的范围。实施例
实施例1:ERFE夹心ELISA方案
[0113] 将96孔高结合板(Costar#9018)用100μl体积的碳酸钠缓冲液(50mM pH 9.6)中的100ng/孔抗-ERFE捕获抗体在4℃下包被过夜。第二天早上,将孔用TBS-T洗涤三次,每孔350μl。然后将板在室温下用SuperBlock T20(Pierce#37536)封闭30分钟,每孔200μl,并用TBS-T洗涤一次,每孔350μl。接下来,将样品或重组ERFE标准品在Superblock T20中稀释,并在室温下温育2小时,每孔100μl。温育2小时后,将板用TBS-T洗涤三次,每孔350μl。接下来,将板与在SuperBlock T20中稀释至1μg/ml的生物素化的αERFE-1检测抗体一起温育1小时,每孔100μl。温育1小时后,将板用TBS-T洗涤三次,每孔350μl。接下来,将板与链霉亲和素-HRP缀合物(Invitrogen#SNN2004)在Superblock T20中的1/5000稀释液一起温育45分钟,每孔100μl。温育45分钟后,将板用TBS-T洗涤三次,每孔350μl。接下来,添加用于ELISA的超敏液体底物(Supersensitive Liquid Substrate)TMB(Sigma T4444),每孔100μl,并使之显色。通过添加每孔100μl的1N H2SO4来终止反应。通过在450nm下测定的O.D.来测量输出量。
实施例2:ERFE抗体表位作图
[0114] 通过ELISA测定来确定ERFE抗体的表位。简言之,使用标准固相化学和生物素化来合成长度为13个氨基酸且4个氨基酸重叠跨越N末端ERFE序列的多肽。将这些肽纯化至>75%纯度,并溶于重蒸馏水或二甲基亚砜(DMSO)中。
[0115] 然后利用ELISA测定来鉴别每种抗体的相应表位。使用50mM pH 9.6碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中的5μg/mL NeutrAvidin(Pierce,USA)来包被96孔Corning高结合EIA/RIA板。将板用TBST缓冲液洗涤三次并用Superblock T20(Pierce,USA)封闭。将一百微升生物素化的肽用PBS稀释至2μg/mL并添加至每个孔中,并在室温下温育一小时。然后用TBST再次洗涤板,并将在Superblock T20中稀释的纯化抗体(2μg/mL)添加至板中。在室温温育一小时和洗涤步骤之后,在室温下施加在Superblock T20中稀释的山羊抗小鼠IgG HRP-缀合的第二抗体达1小时。TMB用作用于检测的HRP底物。
[0116] 图4、图5和图6示出,肽11和12(SEQ ID NO:13和14)被所有三种抗体识别。包含在肽DPRDAWMLFV(SEQ ID NO:1)内的表位在小鼠与人之间具有100%的同源性。
[0117] 表1:ERFE肽实施例3:ERFE抗体功能活性
[0118] 使用Hep3B细胞测定在体外显示ERFE抗体的功能活性,以表征对hERFE和mERFE驱动的铁调素抑制的中和。对于这些测定,将ERFE或ERFE加抗体在室温下预温育一小时,然后添加至24孔板中,在板中以大约70%的汇合度接种8x 104个Hep3B细胞。将细胞温育六小时,然后裂解以进行总RNA提取。使用一步qRT-PCR来测定相对于HPRT1基因的HAMP转录物水平。测试α-ERFE-1和α-ERFE-2抗体的这些测定的结果分别示于图7和图8中。实施例4:ERFE抗体结合动力学测量
[0119] 在ForteBio Octet Red96分析仪上测定亲和动力学。简言之,在室温下,在PBS+0.1%BSA+0.02%吐温-20的pH 7.2测定缓冲液中,在链霉亲和素包被的Dip and Read Biosensors for Kinetics(ForteBio)上捕获生物素化的13-聚体ERFE肽。将传感器在测定缓冲液中洗涤,然后分别与纯化的α-ERFE-1和α-ERFE-2单克隆抗体在测定缓冲液中以3倍连续稀释温育5分钟,以确定抗体与肽的缔合动力学。然后将传感器在测定缓冲液中温育10分钟,以确定解离动力学。使用1:1模型用ForteBio分析套件8.0计算所得的动力学参数。这些测定的结果示于图9和图10中。
实施例5:ERFE抗体生成—融合/筛选
[0120] 按照本领域技术人员已知的步骤,使用多位点修饰快速免疫(RIMMS)方案用Fc-mERFE 24-340对小鼠进行免疫。在建立对免疫原的高效价应答后,将淋巴结B细胞与小鼠骨髓瘤细胞电融合。将所得杂交瘤接种在软琼脂中,挑选单个集落并在96孔板中生长。针对mERFE反应性对来自大约2400个孔的上清液进行筛选。使用无关Fc融合蛋白来消除免疫原的人Fc部分的结合物。为了支持所得杂交瘤的筛选和表征,在HEK293-Freestyle系统中产生含有蛋白质的不同推定功能结构域的多个小鼠和人ERFE重组蛋白。在最初筛选的2400个杂交瘤克隆中,65个通过ELISA被鉴别为对于与Fc-mERFE 24-340(免疫原)的结合呈阳性,并且对于与用于反向筛选的无关Fc-融合蛋白的结合呈阴性。在对这65个克隆进行跟踪后,通过ELISA以相对于背景>10倍的信号证实29个克隆与Fc-mERFE 24-340(免疫原)和HIS-Flag mERFE 24-340(确认与mERFE蛋白特异性结合)二者结合。在这29个克隆中,通过ELISA以相对于背景>10倍的信号还发现19个克隆与HIS-Flag hERFE结合。选择这19个小鼠/人交叉反应性结合物进行功能表征(图11)。实施例6:功能性抗体筛选
[0121] 在Hep3B铁调素mRNA(HAMP)细胞测定中分析在杂交瘤筛选中鉴别的19个小鼠/人ERFE反应性抗体克隆(图12)。测试含有ERFE特异性抗体的杂交瘤上清液通过中和Fc-mERFE 24-340蛋白的作用而抑制ERFE介导的铁调素水平抑制的能力。为了确定中和作用,将
500ng/ml Fc-mERFE 24-340与杂交瘤上清液(1:5稀释)一起预温育30分钟。将混合物添加至Hep3B细胞,持续15小时,然后测定相对HAMP表达水平。两个杂交瘤克隆被鉴别为完全阻断Fc-mERFE24-340对HAMP表达的抑制作用。由于该测定是用尚未针对抗体浓度进行归一化的杂交瘤上清液进行的,因此还选择了相对于对照杂交瘤培养基显示出低/中等水平的抑制活性的两个其他克隆进行跟踪,以说明其较低活性可能是由于样品中抗体浓度较低的可能性。
实施例7:先导单克隆抗体克隆的鉴别
[0122] 为了跟踪来自杂交瘤上清液的初步细胞功能数据,从杂交瘤纯化抗体,通过ELISA确认结合,并且在细胞Hep3B铁调素mRNA(HAMP)抑制测定中确定功能活性(图13A和图13B)。将α-ERFE-1、α-ERFE-2和α-ERFE-3抗体与500ng/ml HIS-Flag mERFE 24-340或HIS-Flag hERFE 28-354一起预温育,添加至Hep3B细胞,并在温育15小时后确定相对HAMP表达。α-ERFE-1、α-ERFE-2和α-ERFE-3纯化的抗体克隆显示出对ERFE介导的HAMP抑制的剂量依赖性抑制。α-ERFE-1和α-ERFE-2抗体在大约等摩尔的基础上针对小鼠和人ERFE均中和活性(但针对hERFE 28-354的有效作用略低)。类似地,当使用1μg/ml HIS-Flag hERFE 28-354测试时,α-ERFE-3抗体相对于α-ERFE-1抗体显示出对ERFE介导的HAMP抑制的相当的抑制(图
13C)。还测试了另外两种纯化的抗体克隆,但这些克隆显示出较差的中和活性。HIS-Flag ERFE因其在生理上相关而进行测试。
实施例8:抗体结合亲和力
[0123] 通过使用单价人ERFE的ForteBio Octet生物层干涉量度法(BLI;图14A、图14B和图14C)分析来确定纯化的杂交瘤抗体的结合亲和力,并总结于表3中。表3.纯化的杂交瘤抗体α-ERFE-1、α-ERFE-2和α-ERFE-3的结合动力学以及亲和力。
αERFE Ab KD(M) Kon(1/Ms) Kdis(1/s) Full X^2 Full R^2
1 1.84E-09 2.81E+05 5.12E-04 2.34E-02 9.96E-01
2 4.01E-09 5.01E+05 1.98E-03 3.14E-02 9.97E-01
3 6.67E-09 9.23E+04 6.21E-04 6.64E-03 9.98E-01
实施例9:食蟹猴反应性
[0124] 为了支持ERFE抗体治疗剂的临床前开发,检查了食蟹猴ERFE的同源性以及αERFE-1和αERFE-2抗体的物种交叉反应性。在蛋白质水平上,ERFE高度保守,人和食蟹猴ERFE共享大于92%的氨基酸同一性。然而,ERFE抗体结合区内存在单个氨基酸差异(食蟹猴ERFE在抗体结合域(PRDA/TWMLFV(SEQ ID NO:20))中含有单个氨基酸变化(A至T))。对编码食蟹猴ERFE的基因进行克隆,对所得蛋白质(HIS-Flag cERFE 28-354)进行表达、纯化,并通过ELISA测定ERFE抗体结合活性(图15A和图15B)。发现这两种EFRE抗体对人和食蟹猴ERFE具有相同的表观亲和力。
实施例10:抗体特异性
[0125] 为了检查ERFE杂交瘤抗体的特异性,进行BLAST搜索以鉴别与ERFE具有最接近的氨基酸相似性的蛋白质。这包括针对抗体结合表位内包含的肽序列特异性地搜索蛋白质序列数据库。CTRP 12被鉴别为与ERFE具有最高同源性的蛋白质(CTRP 12共享37%的总体同源性)。CTRP 3和CTRP 5来自相同的蛋白质家族,并且与ERFE具有相似的表达模式但共享的同源性较低。通过western印迹法和ELISA二者针对一组相关蛋白质(CTRP)对抗体进行测试,以确定它们是否是特异性结合物。所述抗体识别变性的ERFE蛋白(western印迹法)和天然ERFE蛋白(ELISA),但未能识别非ERFE蛋白。另外,向Hep3B裂解物中掺加Fc-hERFE以显示其他细胞蛋白质不与抗体反应(图16A、图16B和图16C)。实施例11:ERFE抗体的体内活性
[0126] 为了建立先导ERFE抗体的药代动力学和药效学(PK/PD)关系谱,进行了体内研究。在接受用于刺激红细胞生成的200单位/小鼠的红细胞生成素(EPO)的腹膜内(IP)注射之前
24小时,通过IP注射用10mg/kg的α-ERFE-1、α-ERFE-2或α-ERFE-3处理C57BL/6J小鼠。EPO注射后16小时,收获肝组织和血清以供分析。与ERFE的EPO刺激一致,小鼠表现出肝HAMP mRNA表达和血清铁调素浓度降低,以及血清铁水平升高。用α-ERFE-1或α-ERFE-2预先处理有效地缓冲了肝HAMP mRNA表达和血清铁调素浓度的任何变化,以及血清铁水平的任何变化(图
17A、图17B和图17C)。类似地,用α-ERFE-3预先处理也有助于缓冲肝HAMP mRNA表达和血清铁调素浓度的任何变化,以及血清铁水平的任何变化(图18A、图18B和图18C)。
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