一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体
阅读：1047发布：2020-11-21
专利汇可以提供一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体，其为整合有以下序列的 植物 双元表达载体：终止子-启动子-LoxP位点序列-attP1位点序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位点序列-LoxP位点序列-启动子-终止子。该载体利用T-DNA边界序列间共轭的启动子序列及LoxP和attP位点序列可通过酶切反应或重组反应将植物或病虫cDNA文库整合至该载体。通过RNA干涉在植物中沉默植物基因或通过进食来沉默病虫害基因，从而应用于植物功能基因组研究来发掘新的基因功能，或筛选可用于寄主输出的RNA干涉的靶标基因，进而培育出广谱或专一的抗病虫新品种。，下面是一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体专利的具体信息内容。
1.一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体，其特征在于，其为整合有以下序列的植物双元表达载体：终止子-启动子-LoxP位点序列-attP1位点序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位点序列-LoxP位点序列-启动子-终止子。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述终止子为NOS终止子。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子为CaMV35S启动子。
4.一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体，其特征在于，其为整合有以下序列的植物双元表达载体：NOS终止子序列-CaMV35S启动子-LoxP位点序列-attP1位点序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位点序列-LoxP位点序列-CaMV35S启动子-NOS终止子序列。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述植物双元表达载体的出发载体为pTF101.1。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，其碱基序列如Seq ID No.1所示。
7.权利要求1-6任一项所述的表达载体在发掘新的基因功能或培育抗病虫植物新品种中的应用，其是利用该表达载体T-DNA边界序列间共轭的启动子序列及LoxP和attP位点序列，通过酶切反应或重组反应将植物或病虫cDNA文库整合至该载体，通过RNA干涉在植物中沉默植物基因或通过寄主输出来沉默病虫害基因，从而应用于植物功能基因组研究来发掘新的基因功能，或筛选可用于寄主输出的RNA干涉的靶标基因，进而培育出广谱或专一的抗病虫植物新品种。
一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体
技术领域
[0001] 本发明涉及RNA干涉技术和功能基因组学，具体地说，涉及一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体。
背景技术
[0002] 自从在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中发现基于RNA干涉(RNAi)的基因敲除(knock out)或敲减(knock down)以来，RNA干涉技术已广泛应用于生命科学的各个领域，对揭示新的生命现象和发明新的技术方法都具有革命性意义。RNAi已用于微生物、线虫、果蝇、哺乳动物和植物特定基因功能的分析。在高通量基因克隆和功能验证方面，RNAi最早应用体外合成的dsRNA来大规模敲出或敲减C.elegans基因以便从基因组水平来剖析基因的功能。虽然在果蝇和哺乳动物培养细胞中有时存在脱靶(off target)现象，但是RNAi技术在这些生物中也取得了巨大的成功。在植物中，利用内含子两端的特定基因反向重复序列产生发卡双链小RNA(short hairpin RNA，shRNA)可以通过诱导植物内源基因高效沉默来研究特定基因的功能。一些基于发卡小干涉RNA(hairpin small interfering RNA，hsiRNA)的高效载体如pHANNIBAL/KANNIBAL，pHellsgate等已用于敲减一个或几个特定基因的表达。但是，由于克隆过程的复杂，这些载体在全基因组RNAi的功能基因组学研究中的应用受到限制。为了获得可用于基因组水平RNAi的载体，Brummell等(2003)构建了只需一步克隆操作的SHUTR载体，通过在一个基因的末端连接一个3’-UTR(NOS终止子)的反向重复序列，在植物中产生双链发卡结构RNA来沉默靶基因。这个载体在番茄和拟南芥中的有效性分别用PG基因、T10P11.13和Athb-1基因进行了验证，沉默效率约为90％，并且用于表达叶肉细胞cDNA文库，获得相关突变体。与传统T-DNA和转座子插入不同，RNAi技术有很多优势：1.RNAi引起的功能缺失(loss-of-function)突变体筛选是基于序列的同源性，因而较随机插入方法需要小得多的突变群体而且目的基因鉴定很容易。2.RNAi基因表达敲减产生的突变是显性的，在第一代转基因群体便可以进行表型筛选，节省大量突变体筛选所用时间和劳力。3.RNAi可以敲减多个相近基因的表达进而克服基因的冗余性。4.由于RNAi是一种可以时空特异调控的基因表达敲减体系，因此可以克服必需基因敲除引起的致死性。由此可见，RNAi在植物功能基因组，特别是具有复杂基因组的作物功能基因组研究中，突变筛选和基因克隆最具潜力的工具。高通量RNAi技术在玉米中已得到初步验证，在766个独立转基因系中沉默了99个基因，RNAi转基因结构可以在玉米中稳定遗传，并且可以沉默目的基因及其相近基因，证明了RNAi技术在作物功能基因组中的可行性。无论发卡结构的双链小RNA(shRNA)，还是较长的双链RNA(dsRNA＞200bp)都可以高效沉默植物内源基因的表达。体外合成的或细菌中用共轭启动子产生的dsRNA已成功应用于C.elegans和果蝇的功能基因组研究来鉴定基因功能。虽然基于长双链RNA(ldsRNA)的反义抑制技术已广泛应用于植物基因功能研究，但是ldsRNA基因沉默在植物功能基因组研究中还没有报道。与C.elegans类似，外源ldsRNA浸泡和饲喂也可以沉默寄生线虫体内同源基因的表达。寄主输出性的RNA干涉技术(Host-Delivered RNAi，HD RNAi)利用寄主植物表达害虫的长双链RNA(ldsRNA)，通过进食进入害虫体内引起害虫重要功能基因的沉默，达到杀死或减弱害虫生活力的目的。HD RNAi正成为获得害虫抗性植物极具潜力的新技术，已成功用于获得对昆虫和线虫具有抗性的植物。然而，HD RNAi技术的效果随着靶基因的不同而变化。在寄主中高通量的表达害虫基因的长片段双链RNA(ldsRNA)并结合抗虫筛选，是获得大量理想抗虫基因的有效途径。但是，具有这些功能的高通量RNA干涉载体仍不成熟。
发明内容
[0003] 本发明的目的是利用共轭启动子和LoxP及attP位点序列，提供一种高通量产生ldsRNA的载体。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明的一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体，其为整合有以下序列的植物双元表达载体：终止子-启动子-LoxP位点序列-attP1位点序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位点序列-LoxP位点序列-启动子-终止子，是一种可高通量产生植物或病虫基因长双链RNA的高效植物表达载体。
[0005] 其中，所述终止子为NOS终止子或其他所有可应用该载体产生ldsRNA的终止子。
[0006] 所述启动子为CaMV35S启动子或其他所有可应用该载体产生ldsRNA的启动子。
[0007] 进一步地，本发明的一种用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体，其为整合有以下序列的植物双元表达载体：NOS终止子序列-CaMV35S启动子-LoxP位点序列-attP1位点序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位点序列-LoxP位点序列-CaMV35S启动子-NOS终止子序列，是一种可高通量产生植物或病虫基因长双链RNA的高效植物表达载体。
[0008] 其中，所述植物双元表达载体的出发载体为pTF101.1，由其构建得到的用于全基因组或跨基因组沉默的长双链RNA表达载体的碱基序列如Seq ID No.1所示。
[0009] 本发明进一步提供上述表达载体在发掘新的基因功能或培育抗病虫植物新品种中的应用，其是利用该表达载体T-DNA边界序列间共轭的CaMV35S启动子及LoxP和attP位点序列，通过简单的一步酶切反应或重组反应将植物或病虫cDNA文库整合至该载体，通过RNA干涉在植物中沉默植物基因或通过寄主输出来沉默病虫害基因，从而应用于植物功能基因组研究来发掘新的基因功能，或筛选可用于寄主输出的RNA干涉的靶标基因，进而培育出抗病虫植物新品种。
[0010] 本发明构建的用于全基因组或跨基因组基因沉默的新型表达载体GCGS-2(含GUS基因)，可以在植物中高通量、高效表达外源作物或病虫害ldsRNA来沉默相应的基因。通过农杆菌介导的拟南芥稳定转化系统，用该载体可以高效沉默报告基因GUS，沉默效率高达99％。通过Gateway系统，可以将玉米根系低氮诱导的cDNA文库转移至GCGS-2载体，获得
6
具有代表性的高质量的ldsRNA表达文库(1.6×10 个85％不冗余的克隆)。通过沉默拟南芥中与该文库的同源基因，在103棵转基因植株中，随机挑选37株进行PCR和测序，其中30株植物可以获得测序结果且17株为单基因插入。在103棵植物中发现两株具有生长缓慢、叶片卷曲和不育表型的植株，基于这些研究结果，GCGS-2载体可以用来发掘新基因的功能，或筛选可用于寄主输出的RNA干涉的靶标基因，进而培育出广谱或专一的抗病虫作物新品种。
附图说明
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具有代表性的高质量的ldsRNA表达文库(1.6×10 个85％不冗余的克隆)。通过沉默拟南芥中与该文库的同源基因，在103棵转基因植株中，随机挑选37株进行PCR和测序，其中30株植物可以获得测序结果且17株为单基因插入。在103棵植物中发现两株具有生长缓慢、叶片卷曲和不育表型的植株，基于这些研究结果，GCGS-2载体可以用来发掘新基因的功能，或筛选可用于寄主输出的RNA干涉的靶标基因，进而培育出广谱或专一的抗病虫作物新品种。
附图说明
[0011] 图1为实施例1中构建的表达载体GCGS-1的部分结构示意图。
[0012] 图2为实施例1中构建的表达载体GCGS-2的部分结构示意图。
[0013] 图3为表达GUS基因的拟南芥(CK)和转化GCGS-1的表达GUS基因的拟南芥的GUS染色分析结果。
[0014] 图4为玉米根系cDNA文库平均插入片段大小检测结果。
[0015] 图5为转入玉米基因的拟南芥突变体表型对比。
具体实施方式
[0016] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0017] 实施例1含Lox和attP位点的共轭启动子植物RNAi双元表达载体构建[0018] 1、pTF101.1载体Xho I酶切位点突变
[0019] (1)设计扩增引物如下：
[0020] pTF 101.1FP：5’-CTGGTCGACGTCCTCTCCAAATGAAATG-3’
[0021] pTF 101.1RP：5’-GTCAATTGGAGCTCGGTACCCGGGGATC-3’
[0022] (2)用上述引物以质粒pTF101.1为模板进行扩增
[0023] 扩增体系如下：
[0025] 回收PCR扩增目的条带后，用Sal I和Hind III双酶切，回收767bp片段，连接至酶切后的pTF101.1载体的Xho I和Hind III位点间，得到重组载体。热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆测序，挑选序列正确的克隆进行下一步试验。
[0026] 2、含有CaMV35S共轭启动子和Lox P位点的dsRNA产生匣的构建
[0027] (1)设计扩增引物如下：
[0028] Tnos1 FP：5’-CCGCAATTGTAACATAGATGACACCGCG-
[0029] Tnos1 RP：5’-CGCGAGCTCACCAGCTCGAATTTCCCCGA-3’
[0030] 35S1 FP：5’-CGCGAGCTCGGAGTCAAAGATTCAAATAG-3’
[0031] 35S1 RP：5’-CGCGGATCCGAATTCATAACTTCGTATAATGT
[0032] ATGCTATACGAAGTTATAAGCTTCCCCCGTGTTCTC-3’
[0033] 以pCAMBIA 1301质粒为模板，分别用PCR扩增出NOS终止子和CaMV35S启动子片段并利用引入的相应酶切位点连接至上述改造后的pTF101.1载体。热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆测序，挑选序列正确的克隆进行下一步试验。
[0034] (2)设计扩增引物如下：
[0035] GUS FP：5’-CCGCTCGAGCTGTAATTCACACGTG-3’
[0036] GUS RP：5’-CGCGGATCCTTGACCATGGTAGATC-3’
[0037] 35S2FP：5’-CCGCTCGAGATAACTTCGTATAGCATGCATTATA CGAAGTTATCCCCCGTGTTCTCTCCAAATG-3’
[0038] 35S2RP：5’-TCCCCCCGGGGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGG AC-3’
[0039] Tnos2FP：5’-AACTGCAGGAATTGTAACATAGATG ACACC-3’
[0040] Tnos2RP：5’-TCCCCCCGGGACCAGCTCGAATTTCCCCGATC-3’
[0041] 以pCAMBIA1301为模板分别扩增2107bp GUS基因、532bpCaMV35S启动子片段和270bp NOS终止子序列，利用相应酶切位点连接至上述改造后的pTF101.1载体，得到重组载体GCGS-1(图1)。热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆测序，挑选序列正确的克隆用20％甘油保菌于-80℃保存。
[0042] (3)设计扩增引物如下：
[0043] Gateway FP：5’-CCGCTCGAGGTAAAACGACGGCCAG-3’
[0044] Gateway FP：5’-CCGCTCGAGCAGGAAACAGCTATGAC-3’
[0045] 以质粒pDONER 221为模板扩增得到含有attP1和attP2重组位点间ccdB和Cm(R)基因的2517bp片段，通过Xho I位点连接至GCGS-1载体，得到重组载体GCGS-2(图2)。电击法转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，挑取单克隆测序，挑选序列正确的克隆用20％甘油保菌于-80℃保存。
[0046] 实施例2利用GCGS-1载体沉默转基因拟南芥中GUS基因的表达
[0047] 1、转基因拟南芥的获得
[0048] (1)将构建好的GCGS-1载体0.1μg加入到100μL农杆菌GV3301中，利用电击法转化，加入900μL LB液体培养基，28℃摇床培养2h后离心，去除上清400μL，重悬菌体涂布于含有100mg/L Spe(壮观霉素)、30mg/L Gen(硫酸庆大霉素)和100mg/L Rif(利福平)的LB固体培养基上，28℃培养3天，筛选阳性克隆。
[0049] (2)挑取单克隆于5mL液体LB培养基中，含100mg/L Spe、30mg/LGen和100mg/L Rif，28℃摇床培养2天后，按1∶100接种到LB液体培养基(含100mg/L Spe、30mg/L Gen和100mg/L Rif)，28℃摇床振荡培养至OD600＝0.5-0.8时离心收集菌体，重悬于转化培养基中(1/2MS，含5％蔗糖和0.025％Silwet L-77)。
[0050] (3)将表达GUS基因拟南芥花序浸入转化培养基中3min，取出后用保鲜膜包裹，水平避光放置24h，揭去保鲜膜，用水淋洗植物。
[0052] (5)7-10天后待子叶完全展开，0.01％Basta含0.1％Tween 20喷洒3次，间隔1-2天。
[0053] (6)将没有黄化的植物移入新的培养土中，提取DNA用PCR鉴定转基因植物。
[0054] 上游引物：Bar15’-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3’
[0055] 下游引物：Bar25’-CCAGAAACCCACGTCATGC-3’
[0056] (7)利用PCR鉴定阳性植物进行下一步实验。
[0057] 2、GUS染色分析
[0059] (2)倒掉丙酮后，加入预冷的超纯水，冰上放置5min。
[0060] (3)取出叶片，浸于GUS染液中，37℃避光放置24h。
[0061] (4)取出叶片，加入0.24M HCl和20％甲醇，57℃水浴15min。
[0062] (5)倒掉溶液，加入7％NaOH和60％乙醇，室温放置15min。
[0063] (6)40％、20％和10％乙醇逐级脱色，每次5min。
[0064] (7)倒掉溶液，加入25％甘油和5％乙醇，室温放置15min。
[0065] (8)倒掉溶液，加入50％甘油过夜。
[0066] 3、实验结果
[0067] 与对照相比，99株转基因拟南芥的叶片只有一株有着色，而对照有明显的蓝色着色(图3)。这样的结果说明，转GCGS-1植物体内原有的GUS基因的表达受到了由载体表达的dsRNA的抑制，从而经染色后不能显示蓝色。99株转基因植物只有一株着色，基因沉默效率约为99％。
[0068] 实施例3基于长双链RNA干扰文库的拟南芥功能基因组研究
[0069] 1、用于功能基因组研究的cDNA文库的获得
[0070] (1)低氮诱导下玉米根系cDNA文库线性化
[0071] 玉米根系cDNA文库的构建：取7天正常培养后缺氮处理2天的玉米根系用Trizol法提取总RNA，利用Poly(A)mRNA分离纯化试剂盒纯化mRNA，利用全长cDNA文库构建试剂盒(Invitrogen，USA)构建入门克隆文库，再利用LR重组获得低氮诱导下玉米根系cDNA文库。
[0072] 取1μL低氮诱导下玉米根系cDNA文库(1μg/μL)，加入1μL10×EcoRV缓冲液，1μL EcoRV内切酶，6μL H2O，37℃温育2h。再加入40μL H2O，25μL NaAc(3M)，187.5μL无水乙醇，-20℃放置过夜。16,000×g 4℃离心15min，去掉上清，用70％乙醇冲洗一次，相同条件下离心，去掉上清，室温干燥10min，加入7μL H2O用移液器吸打30-40次。
[0073] (2)利用BP重组获得用于功能基因组研究的cDNA文库
[0074] 向7μL线性化后的玉米cDNA文库中加入2μL GCGS-2载体(150ng/μL)，3μL BP重组酶，25℃温育24h，加入1μL蛋白酶K，37℃反应10min。利用电击转化法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，加入1mL液体LB培养基，37℃振荡培养1h，取100μL菌液逐级稀释到100倍，涂布于含100mg/L Spe的固体LB平板上，计算库容量。随机挑选阳性克隆提取质粒测序，利用Xho I内切酶计算平均插入片段大小。
[0075] 2、基于长双链RNA干扰文库的功能基因组研究
[0076] 取1mL转化后的大肠杆菌DH10B菌液，加入5mL含100mg/L Spe的液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600约为1，提取质粒，利用电击法转化农杆菌GV3301感受态细胞，加入1mL液体LB培养基，28℃震荡培养2h，加入5mL含100mg/L Spe、30mg/L Gen和100mg/L Rif的液体LB培养基，28℃摇床培养2天后，按1∶100接种到新的LB液体培养基(含100mg/L Spe、30mg/L Gen和100mg/L Rif)，28℃震荡培养至OD600＝0.5-0.8时离心收集菌体，重悬于转化培养基中(1/2MS，含5％蔗糖和0.025％Silwet L-77)，利用浸花法转化拟南芥Col生态型植物。
[0077] 种子成熟后干燥1-2周，70％乙醇灭菌1min，然后用2％次氯酸钠(含Tween-20)处理两分钟，无菌水洗三次，然后将种子洒在土中。7-10天后待子叶完全展开，用含0.1％Tween 20的0.01％Basta喷洒3次，间隔1-2天。将没有黄化的植物移入新的培养土中，提取DNA用PCR鉴定转基因植株，再利用如下特异引物扩增插入片段，测序结果通过比对鉴定转基因插入片段。
[0078] FP：5’-CAGGGAGGCAAACAAGCTAG-3’
[0079] RP：5’-TGTAATACGACTCACTATAGG-3’
[0080] 3、实验结果
[0081] 转化后的cDNA文库经计算共有1.6×106个克隆，酶切结果显示插入片段平均大小＞1kb(图4)，23个随机测序结果中有20个为独立的玉米基因，表明转移后的文库质量是符合实验要求的。已获得转基因拟南芥103株，随机挑选37棵进行PCR和测序，其中30棵植株可以获得测序结果且17株为单基因插入，17株中2株具有生长缓慢、叶片卷曲和不育的表型(图5)，经PCR扩增插入片段后，测序结果证明其中1株转入玉米硫氧还蛋白H5基因，表明转基因拟南芥中表达了转入的玉米硫氧还蛋白H5基因的dsRNA，造成了拟南芥中同源基因的沉默。
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