寻求容易的方法，合成大量各种不同的化合物，然后就其各种可能 的生理及其它活性加以筛选，此种途径具有十分重要的意义。一般这样 的合成包括多级连续步骤，而每一步又包括将得到的分子加以化学修 饰。例如，化学修饰可以包括将某种单元如单体或合成聚合物加入到增 长序列中或进行官能团修饰。因为采用涉及化学修饰的合成法，加入可 以是天然存在的、合成的，或二者结合的某些单元物质，例如氨基酸、 核苷酸、糖、类脂、或杂环化合物等，可以创造出大量化合物。因此， 即使仅将合成限制于天然存在的单元物质或结构单元，可供选择的数量 仍然极大，即有4种核苷酸、20种普通氨基酸、以及基本上数量无限的 糖可供选择。
而在生产大量不同化合物，其中每步合成有很多选择余地时，一个 固有的不利因素是每种个体化合物存在量甚少。虽然特定化合物之特性 (如生理活性)可以测定出，但往往不可能鉴定出该存在的具体化合物 的化学结构。
并且，生理活性化合物历史上是使用Edisonian或概率技术，通过检 测未加工的液体培养基发现的，而每次只有相当少的化合物被测出，或 者说只检测到有限量的天然存在的生理活性化合物的类似结构的同系 物。有两个主要问题与使用此种未加工液体培养基相关，即必需将反应 混合物提纯为单一组份化合物，并需要耗费很多努力来确定经纯化之化 合物的结构。
为了寻求解决这些缺点和问题，现已开发出种种新技术，其中之一 是，以加以控制或随机方式加入各种个体单元作为按顺序化学合成的部 份，产生在合成每个顺序阶段可能出现的，由于不同选择所造成的所有 按比例，或基本上按比例的可能化合物。然而，为使该项技术获得成功， 则制备化合物的该技术必需是能让人们测定出具体化合物组成，以便使 其证明有感兴趣之特征的适宜方法。
一个这样的方法包括采用一种片状物，该片状物表面的物理分离位 点能进行分离分析(Fodor等人，Science 251：767[1991])。因为已 知其中反应剂是按顺序加入到该各位点的，人们便可以记录发生顺序， 由此也就可记下反应系列。然后假如人们将该片状物用针对具体所需之 特征的筛选方法处理，并检测该特征，人们便可很容易地测定出表现该 特征的位点所合成的化合物。
另一技术包括与合成感兴趣之低肽类化合物相似的寡核苷酸推理合 成法(Brenner和Lerner，PNAS USA[1992]81：5381-5383)。
其它技术也披露在下述公开文献中：Amoto，Science(1992)257，330 -331，讨论利用共合成DNA标记鉴定多肽；Lam等人，Nature(1991) 354，82-84，介绍制备大型肽库的方法；Houghton等人，Nature(1991) 354，84-86，以及Tung和Beck-Sickinger，Angew.Chem.Int.Ed.Engl. (1992)91，367-383，介绍建立大型肽文库的方法；Kerr等人，J.Amer. Chem.Soc.，(1993)115，2529-31，讲解合成由肽链编码的低聚物文库 的方法；最后，国际专利申请WO91/17823和WO92/09300也涉及组合 文库。
但是，因为前述一般方法需相同部份连续加进，因此，主要感兴趣 的问题在于发明一种不局限于相同部份连续加入而生产化合物的方法。 此种方法例如可以在甾族化合物、抗生素、糖、辅酶、酶抑制剂、配位 体等等的修饰中找到应用，这些修饰反应常常涉及多步合成，其中，人 们希望改变反应试剂和/或条件得到多样性化合物。此类方法中所述试剂 可以是有机试剂或无机试剂，其中可以引入或加以修饰官能团，连接侧 基或除去侧基，开环或闭环，改变立体化学结构等等(例如见Bunin和 Ellman，JACS 114，10997[1992])。然而为使该法可行，需要一个方便的 方法鉴定由不同修饰的极广变化所产生的大量化合物之结构。因此，需 要找到可以记录下来反应历程的方法，并希望所得化合物的结构得到鉴 定。
最后，随着合成的化合物文库规律扩大，解释结构和分离产物的已 知技术已经基本上失效和不确定，阻碍了对有重要鉴定的任何化合物结 构的精确测定。因此，对新方法的基本要求是，能合成复杂组合的化学 文库，其中能很容易对文库中有重要鉴定的个体化合物进行精确结构测 定。
前述方法的许多缺点以及许多未满足之要求，由本发明便可解决， 正如后面将要全面叙述的，本发明提供了超过前述方法的诸多优点。 发明概述
现对编码组合文库提供方法和组成，即，在合成的每一阶段，在化合 物进行合成的载体(例如颗粒)上，被专一地进行标记，以定义随同该 载体上化合物合成时伴随的特定事项(通常指所加化学试剂)。所述标 记使用鉴定剂分子来完成，该分子记录合成期间载体颗粒所经历的按顺 序的事项。由此提供在该载体上生产化合物的反应历程。
各鉴定剂分子特征在于，在所采用的合成条件下是稳定的，在合成 期间保持与载体相结合，在能反映给定合成阶段特定的反应选择的合成 期间，独特地定义特定事项，可区别于检测期间可能存在的其它成份， 以及可以移除由便捷分析技术加以辨别的标记成份。
本发明所用鉴定剂相互结合，形成二进制或更高阶编码体系，能用 相当少量的鉴定剂编码相当大量的反应产物。例如，当用于二进码时， N种鉴定剂可以独特地编码多达2N种不同化合物。
而且，本发明的鉴定剂不需逐次通过前面的鉴定剂结合，而是独立 地结合到基质上，直接结合或通过合成的产物结合。所述鉴定剂是非可 排序的。并且所述鉴定剂含有可裂解成份或部份，它可使容易分析的标 记成份移除。
组合合成采用限定性固体载体很方便，其上可以进行反应且鉴定剂 可与之结合。可将携载最终产品的个体固体载体或基质针对所需特性进 行筛选，并通过分析相应的鉴定剂标记测定出反应历程。
附图简述
图1表示标记4的质谱分析，观察到相应于标记4的两个信号。
图2表示标记11的质谱分析，观察到相应于标记11的二个信号。
图3表示标记13的质谱分析，观察到相应于标记13的二个信号。
图4表示各自以近似相等之易混合在一起时的标记4、11和13的 正化学电离质谱图(PCIMS)，相应于各分离标记的二个信号可很容易 地加以区别。
图5表示仅有未衍生的d-7样品时的质谱和色谱图。
图6表示由于标记的衍生作用，显示出色谱法得到改善后的质谱和 色谱图，d-5和d-7混合物样品被评价。
本发明的详细描述
本申请中所谓“标记”或“T”意指具两种特性的化学物质部份。 第一，它能与所有其它化学物质部份相区别，第二，当以10-18-10-9摩 尔之量存在时能被检测出。这两种性质被包容于单一化学结构中。此外， 这两种性质还可包容在连接在一起的分离化学结构中。就后者而言，化 学结构之一(称之为C，如果有一个以上此种结构，则称为C，C’等 等)提供使该标记与其它标记可区分的特性，而另一化学结构E，则提 供使该标记可检测的特性，并且或许还可任意提供使该标记可与其它标 记分开之特性。
本申请中所谓“接头”或“L”意指具有三种特性的化学物质部份， 第一，它可连接于固体载体上，第二，可连接于标记上，第三，当其与 固体载体和标记相连时，该连接可裂解，以使该标记可从固体载体上释 放出来。该三种特性可包容于单一化学结构中，此外，还可包容于连接 在一起的三种化学结构中。就后者而言，化学结构之一(可称之为F1) 可提供使该接头连接于固体载体上的性质；第二化学结构(可称之为V) 提供使该接头可裂解之性质；而第三化学结构(可称之为A’)则提供使 该接头连接于标记上之特性。化学结构V和A’最好合一及相同，在这种 情况下V-A’可称之为F2。
本申请中所谓“鉴定剂”意指包括标记和接头二者的化学物质本体。 因此，从最广意义上来说，鉴定剂可由式L-T代表，而其特定方案中， 可用式F1-V-A’-T；F1-V-A’-C-E(或 F1-V-A’-E-C)；L-C-E(或L-E-C)和L-C-E-C’来表示。
本申请中所谓“结合的鉴定剂”意指连接于固体载体上的鉴定剂。
本文中所谓“选择”意指组合合成中在一给定阶段可替换的多变因 素，例如反应剂、试剂、反应条件及其组合等等。所谓“阶段”相当于 化合物或配位体按顺序合成的步骤，所述化合物或配位体是组合合成的 最终产物。
所谓“烷基”包括直链、支链、环状的以及其相结合的结构。这样， 该术语包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、环丙 基、环丁基、环戊基、2-甲基环丙基等等。低级烷基是C1-C6烷基。 低级链烯基是直链的、支链的或环状构型及其相结合的C2-C6链烯基。
除非另外说明，一具体分子中任何取代基的定义(如R1，R2，Z 等等)与该分子中其它地方它的定义无关。这样NR4R4可代表NHH、 NHCH3、NHCH2CH3、N(CH3)2等等。
本文所述某些化合物含一个或多个不对称中心，因而可以存在对映 异构体、非对映体、和其它立体异构形式。本发明意味着包括所有此种 可能的立体异构体，以及其外消旋及光学纯形式。使用手性合成聚合物、 手性试剂，或常规拆分技术，可以制备旋光活性(R)和(S)异构体。 若本文所述化合物含烯类双键，则包括E和Z两种几何异构体。
在其上进行本发明组合合成的材料，本文中，可替换使用下述称呼： 珠粒、固体表面、(固体)基质、颗粒、载体等等。这些术语趋于包括：
a)固体载体，例如珠粒、片、园片、毛细管、中空纤维、针状体、 固体纤维、纤维素珠、有孔玻璃珠、硅胶、用二乙烯基苯交联(或未交 联)的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳胶珠、用N，N’-双 -丙烯酰乙二胺交联(或未交联)的二甲基丙烯酰胺珠、涂覆有疏水聚 合物的玻璃颗粒等等，即具有坚固或半坚固表面的材料；和
b)可溶性载体，例如低分子量未交联的聚苯乙烯。
这些材料必需含官能团，或者是能够官能化的，以便鉴定剂或产物 中间体可连接于其上。
此外，下面的简写表示下述意义：
AcOH＝乙酸
BSA  ＝二(三甲基硅甲基)乙酰胺
CAN  ＝硝酸铈(iv)铵
DEAD ＝偶氮二甲酸二乙酯
DCM  ＝二氯甲烷
DIC  ＝二异丙基碳二亚胺
DMF  ＝N，N-二甲基甲酰胺
Fmoc ＝9-芴基甲氧羰基
HOBt＝1-羟基苯并三唑
PhMe＝甲苯
r.t. ＝室温
TFA  ＝三氟乙酸
THF  ＝四氢呋喃
本发明关系到产品(即化合物)文库的生产，其中该文库中存在的 个体产品或化合物可以是相互物理分离开的，并可结合于固体载体上或 从固体载体解离下后就其有意义特性进行筛选。因为进行一系列合成， 其中每一合成阶段，每一个体中间体均以各种方式处理，因此产生大量 产物，每种产物仅以少量存在，常常少于100pmol，更通常少于10nmol。 由于这样产生的最终产物或化合物量很少，通过分离和结构解释未鉴定 这些产物一般是不可能的。而且，除了加入相似物质单元之外，其余所 涉及的按顺序合成中，假使并不是不可能使用一般可获取的产物量，那 么分析也将是很费力的。然而，若配合该系列合成中每项选择或多项选 择之结合(例如“加入试剂A”或“加入试剂A、然后加入试剂B、并 加热至100℃2小时”)加入一组鉴定剂(该鉴定剂限定各变化因素的 选择，例如反应剂、试剂、反应条件或这些因素之结合)，则人们可以 利用这些鉴定剂定义各可定义及可分离基质的反应历程。分析从鉴定剂 中解离的标记，使得反应历程的鉴定十分快捷，其量可限于皮摩尔级或 更低浓度例如毫微微摩尔或更低。人们可以测定合成产物的特征，即通 过各种筛选技术，通常测定化学和生物学特征，然后借助与产品相结合 的标记鉴定反应历程，并由此鉴定出具所需特征之产物的结构。
这种即时多标记体系的采用，避免了必需进行复杂的共合成反应的 缺点(此种复杂共合成减低产量并要求多保护基)，并避免了使用作为 化学标记的可定序标记的必要性。必需多保护基和所有已知可定序标记 分子(即核酸或肽低聚物)的固有不稳定性，二者严重限制了可用于所 述文库单元或配位体合成的化学途径。
并且，使用二进制或较高阶多标记体系，大大降低了合成中每一阶 段编码试剂/反应剂选择所必需的标记数量。例如，假定一个特定合成阶 段，对试剂可以有128种不同的选择，则二进制体系只需要7种标记。 这可造成实用的编码体系和不实用体系之间的差别，因为要获得并使用 其它体系所需的大量可区别标记可能是办不到的。采用本发明的二进制 体系，可利用30种区分标记，足够编码＞109种不同合成。
重要的是，本发明方法采用为解码之目的能从配位体或固体载体上 解离下来的标记。此种可解离性也使得该标记能基于一种以上的根据被 区分，具体来说，它们可以被分离出(例如根据色谱保留时间)，然后 进行分析(例如第二根据是光谱特性，如质谱m/e，或电泳动性)。有 多种根据加以区分，便使得以少量标记可编码大量情报。
解离也使得标记可在很低水平被检测，因为它们可以从载体基质(合 成在其上进行)和从合成的配位体上移出，否则二者中哪一种的存在都 可能提供虚假背景信号，例如荧光猝灭等等。
可解离标记也有助于通过自动取样体系快速分析，并允许借助对官 能团的检测进行选择性衍生作用，消除检测部份和合成中所用反应条件 之间的任何不相容性。
任何标记方案固有原则是，要求标记的化学特征和其掺入的化学阶 段，要与配位体特征及其合成阶段相容，反之亦然。一般化学惰性的标 记的优点(如其后例举的取代的芳氧基多亚甲基部份)是可以采用于配 位体合成中的化学转化和化学官能化的范围较大。
本发明化学稳定性标记的另一优点，是其与多种不同的快速、方便 的分离和分析方法(例如气相色谱和质谱)相容。而且，本发明的有机 标记一般不与生物学受体发生特异性的相互作用。因此，这些标记在生 物检测时一般不给出虚假结果，一般也不被酶或其它生物分子修饰。
最后，本发明标记的化学稳定性，使得它们可用前述促进其分析敏 感性的极为多样之方法解离下来。
因此，本发明提供了编码组合合成的方法和组合物，由此合成的每 一阶段提供一种或多种鉴定剂，所述鉴定剂编码事项与在载体或颗粒上 合成化合物时的颗粒阶段有关。所述事项包括在该反应阶段选择的反应 剂和/或反应条件，其中每个此种阶段，可涉及在相同或不同条件下的一 种或多种，相同或不同的反应剂，例如部分反应、多样加入、加入速度、 反应剂的不同结合等等。此外，颗粒组可和其它颗粒组隔绝，并经历按 顺序合成过程中，某一时间的不同系列事项。
若提供N种鉴定剂，每种有M种不同状态，那么可以独特地定义 MN种不同的合成。若M＝2，则可以包括鉴定剂“存在”或“不存在” 这样两种状态，这样该合成由基数2，或二进码限定。若M＝3，那么 所述三种状态便是“以两种不同浓度存在的鉴定剂”或“鉴定剂不存在”， 该合成将由基数3码限定。本文中，此种M＞2的基数M码称之为高阶 码。高阶码超过二进码的优点在于，编码同样量的有关合成情报只需较 少种的鉴定剂。生产的产物将作为系列合成之结果被定义。在合成的每 一阶段，有很多种反应剂和/或试剂和/或条件可利用，结果产生之产物特 性与可鉴定的并通常可分离的实体(例如标记)有关。有关“反应剂” 和“试剂”的意义，大部份情况下，倾向于所谓反应剂是要结合入产物 中的物质，例如氨基酸、核苷酸、亲核试剂、亲电试剂、双烯、烷基化 或环化试剂、二胺、或任何其它合成聚合物等等。而试剂则可以变成， 也可以不变成结合入产物中的部份，例如碱、酸、热、氧化剂或还原剂， 但二者均纳入所谓“化学剂”这一术语中。该合成可以包括结合入产物 中的个体反应剂。此外，在某一个阶段还可包括结果修饰反应中间体的 一种或多种反应。许多情况下，将包括这些可能性之结合。
若使用基数2或二进码(M＝2)和三种鉴定剂(N＝3)，则可 以编码合成中某一给定阶段多达8(23)种因素。如果三种鉴定剂分别 由T1、T2和T3代表，而每种鉴定剂“存在”或“不存在”分别用0 或1表示，这样所述8种不同因素可按如下方式以二进码表示：     因素1     因素2     因素3     因素4   T1，T2，T3     0，0，0     1，0，0     0，1，0     1，1，0     因素5     因素6     因素7     因素8   T1，T2，T3     0，0，1     1，0，1     0，1，1     1，1，1
同样，甚至可以用更多鉴定剂编码更多有关合成情报。例如9种鉴 定剂(N＝3)和基数2码(M＝2)，将达到29(或512)种不同因 素选择被编码。使用基数3码(M＝3)和3种鉴定剂(N＝3)，则 使得多至27(33)种因素选择被编码。如果三种鉴定剂由T1、T2、 T3代表，不存在鉴定剂由‘0’代表，每珠以约0.5pmol之量存在的情 况由‘1’代表，而每珠以约1.0pmol之量存在由‘2’代表，那么27 种不同因素可由三种鉴定剂以基数3码表示如下：     因素1     因素2     因素3     因素4   T1，T2，T3     0，0，0     1，0，0     2，0，0     0，1，0     因素5     因素6     .  .  .     因素27   T1，T2，T3     1，1，0     2，1，0     .  .  .     2，2，2
为使所述高阶编码方案实用，将一种附加鉴定剂，以给定量(如约 1.0pmol/珠)加入到文库中所有成员中，提供测定所有鉴定剂量的参照 标准。鉴定剂量可以采用配有各种检测方法的气相色谱及高压液相色谱 测定。若用高压液相色谱，如果该鉴定剂是由不同量放射性核素(例如 氚3H)以放射性标记过的，那么可以采用闪烁计数法便捷地测定其量。 测定3H对14C之比(这样使用14C作为标准)进行定量分析特别方便。 该方法中，可以区分多达10种不同量的3H，则应基数10或10阶码(M ＝10)，只使用很少种类鉴定剂，该码便可编码大量情报。 产物及合成策略
大部份情况下，本发明方法所得产物将是有机化合物，其中系列合 成将包括加入或除去化学物质单元，涉及修饰的反应或引入一个或多个 官能团、开环、关环等等。化学物质单元可取之多种形式，既可是天然 存在的，也可是合成的，例如亲核试剂、亲电试剂、双烯、烷基化剂或 酰化剂、二胺、核苷酸、氨基酸、糖类脂、或其衍生物、有机单体、合 成聚合物、以及其组合。另外，反应可以包括引起烷基化作用、酰化作 用、硝化作用、卤化作用、氧化作用、还原作用、水解作用、取代作用、 消除作用、加成作用等等的反应。该方法可以以极少之量生产非低聚体、 低聚体或其组合物，其中反应历程和特定情况下的组合可由存在的标记 限定。非低聚体包括极为广泛的有机分子，例如杂环类、芳族类、脂环 类、脂肪族类及其组合，包括甾类抗生素、酶抑制剂、配位体、激素、 药物、生物碱、阿片、萜烃、紫菜碱、毒素、催化剂以及其结合。低聚 体包括寡肽、寡核苷酸、低聚糖、多脂、聚酯、聚酰胺、聚尿烷、聚脲、 聚醚、聚磷衍生物，(所述磷衍生物为磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰 胺、亚磷酸酯或亚磷酰胺)、聚硫衍生物，(所述硫衍生物为砜、磺酸 酯、亚硫酸酯、磺酰胺或亚磺酰胺)，其中对于磷和硫衍生物来说，绝 大部份所示杂原子将键合于C、H、N、O或S及其结合上。
反应可以包括在核心分子结构的各种随意位点修饰，或在特定位点 修饰。例如溴化一种多环化合物时，溴化作用可在多种位置发生，或者 可以使用例如N-溴代琥珀酰亚胺之类溴化剂，针对一特定位点进行。 大多数情况下，反应将涉及单一位点或等同位点，例如乙二醇的两个羟 基之一。
大多数情况下，除了双官能团化合物用同一连接官能团连接外，例 如氨基酸和酰氨键、核苷酸和磷酸酯键、或其类似化合物(如氨基异氰 酸酯和脲键)，本发明合成将有至少两个步骤。
本发明方法允许各阶段反应之多样性，这取决于有关试剂和条件的 选择。这样，就氨基酸而言，若使用普通天然编码氨基酸，则有多达20 种氨基酸包括在内，而如果希望使用其它氨基酸，例如，D-氨基酸、 除α-位之外具其它氨基的氨基酸、侧链上有不同取代基或氨基上有取 代基的氨基酸等等，那么就有宽得多的选择。就不同的核酸而言，通常 将有DNA或RNA所用的至多4种天然核酸，如果不选择这些特定核酸， 则有大得多的数量可采用。就糖和类脂而言，存在非常之多的化合物， 若使用各种取代基，那么这些化合物还可进一步增加，所有这些化合物 均可用于该合成。对于个别有机化合物而言，此选择可达天文数字。此 外，一种物质还可有许多类似物，其中脲、尿烷、羰基亚甲基等可以代 替肽键；各种有机和无机基团可以代替磷酸酯键，而氮或硫可以取代醚 键中的氧，反之亦然。
合成策略将随人们希望生产的产物族之性质而异。因此，所述策略 必须考虑按阶段改变产物性质的能力，同时允许保留前面各阶段结果， 并需参与下一阶段反应。若各物质单元是同一族，例如核苷酸、氨基酸 和糖，则该合成策略是利用相对早已确定的，频繁使用的常规化学法。 因此，对于核苷酸而言，可采用磷酰胺化或亚磷酸化化学法，而对于寡 肽而言，则可用借助常规保护基的Fmoc或Boc化学法；对于糖而言， 所述策略较少常规使用，但大量保护基、活性官能团和条件对合成多糖 已是确定的。对于其它化学类型而言，人们将找到个体单元的性质，并 且将得知合成的机会，或者设计出相适应的合成机会。
在某些例子中，人们可以希望在相同或不同的阶段引入相同或不同 的部件。例如，人们希望将普通肽功能单元(例如纤维连结素结合单元， RGDS)、多糖(如Lex)、有机基团(例如内酰胺、内酯、苯环、烯烃、 乙二醇、硫醚等等)在合成期间引入。以该方式，可以按可变性引入分 子的前后。这些情况可以仅仅包括有多种选择的很少几个步骤，而产生 与特定功能实体相关的大量产物。这对于有兴趣得到与具有有益特征之 核心分子或单元相关的大量衍生物，有特殊的应用价值。
在开发合成策略中，人们可以实现在组合合成过程中制备的几种化 合物的批量合成。举一个极端的例子，例如，可以包括空间障碍，电荷 和/或偶极相互作用，交替反应途径等情况的合成，人们可以使条件最佳 化，增加在其它情况下不能形成或仅以低产量形成的化合物的产量。以 这种方式，则可以使组合合成期间反应条件多样性，包括不同溶剂，温 度，时间，浓度等等。而且，还可以使用批量合成，其提供的特定化合 物浓度比组合合成高得多，以此促进化合物活性鉴定。 载体：连接和解离
该合成方法要求提供包括不同反应剂的多种不同反应，结果在合成 各阶段产生多种不同的中间体。当可利用其它技术时，采用小型固定固 体基质，如市售珠粒，可最为便捷地实现，所述珠粒可以很容易混合， 分离，及用作按顺序合成的固体基质。所述固体基质可以是固态的，有 孔的，可形变的或坚硬的，并有任何合宜的结构和形状。某些例子中， 磁性的或具荧光的珠粒很有用。所述珠粒直径一般至少为10- 2000μm，通常至少为20-500μm，更为普遍的是至少为50-250μm。
对于颗粒或珠粒而言，可以采用任何合适的组合，所述珠粒组合在 各处理阶段将保持其机械整体性，可以是功能化的，有官能团或允许同 活性物种反应，允许进行系列合成，以及连接鉴定剂，可以容易地混合 和分离，并且允许标记和产物便捷地解离。可以采用的珠粒包括纤维珠、 控制孔玻璃珠、硅胶、聚苯乙烯珠、尤其是用二乙烯基苯交联的聚苯乙 烯珠、聚亚乙基二醇/聚苯乙烯之类的接枝共聚物珠、聚丙烯酰胺珠、乳 胶珠、二甲基丙烯酰胺珠(特别是以N，N’-二丙烯酰亚乙基二胺交联的 和包含N-叔丁氧羰基-β-丙氨酰-N’-丙烯酰六亚甲基二胺的)、 组合珠，例如用疏水聚合物(如交联聚苯乙烯、氟代乙烯聚合物接枝的 线性聚苯乙烯之类)涂覆的玻璃颗粒等等。包括共价连接活性官能团的 有用固体载体(颗粒)的综述，可参见Atherton等人，肽化学前景 (Prospective in Peptide Chemistry)，Karger，101-117(1981)； Amamath等人，化学综述(Chem.Rev.)，77：183-217(1977)； 和Fridkin，肽(The Peptides)，Vol.2，Chapter 3，Academic Press， Inc.，(1979)，pp.333-363。
根据合成程序的性质及最终产物的检测，对这种或那种珠粒可以有 不同程度地需求。虽然珠粒特别合宜，但其它固体载体也可使用，例如 毛细管、中空纤维、针状物、固体纤维等，其中固体载体的大小在反应 历程中允许按所希望的改变。
根据合成性质，所述珠粒可按不同方式进行功能化处理，使之能连 接于初始反应剂中。这可以通过非活泼键，例如酯键、酰氨键、胺键、 醚键连接，或通过硫、硅、碳等原子连接，视人们是否希望能从珠粒上 移出产物而定。通常与珠粒键合的键是永久性的，但珠粒和产物之间的 连接可以可裂解性的，例如表1所例举的。可采用两种或多种不同键使 得标记和/或产物有差别的释放出。
根据结合于颗粒上的连接基团的性质，珠粒上的活性官能团不一定 是必需的，还允许是插进单键或双键之中的连接方式，例如可利用带有 碳双键、氮双键或其它高活性类双键。这种情况下，可裂解键由将产物 或标记结合于珠粒上的连接基团提供。
当产物恒定连接时，则希望连于珠粒的键拉长，以免该珠粒不会对 筛选期间产物的结合造成空间障碍。可采用各种键，特别是亲水键例如 聚亚乙基氧、糖类、多羟基化合物、酯、酰胺及其结合等等。
存在于珠粒上的官能团可以包括羟基、羧基、偕卤代亚氨基、氨基、 硫基、活性卤素(Cl或Br)或拟卤素(如-CF3、-CN等)、羰基、 硅甲基、甲苯磺酰基、甲磺酸酯基、对溴苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基 等等。选择官能团时，对某些实际情况应加以考虑，即鉴定剂也通常要 结合于珠粒上。应考虑的问题包括应用相同或不同的官能团与产物和鉴 定剂是否有关，以及该两官能团与产物或鉴定剂连接和标记解离专用阶 段是否相容。对产物可以采用不同连接基团，以便使产物可以以特定的 量有选择地释放出来。某此情况下，颗粒可以有加以保护的官能团，在 每一步骤之前，可以部份的或全部去保护基，若全部去保护基，则需再 保护。例如在多肽合成中可以用苄酯基保护氨基，用苄基醚保护羟基等 等。
若希望产物解离下来，则有很多官能团和反应剂可供利用。较合宜 的是醚，其中取代的苄基醚或其衍生物，如二苯甲基醚、2，3-二氢化 茚醚等，可以由酸或温和的还原条件裂解。此外，也可采用β-消除反 应，其中可用弱碱释放产物。也可以采用乙缩醛、包括其硫代类似物， 其中可以借助于弱酸，尤其是在有俘获羰基的化合物存在下。将甲醛、 HCl和乙醇部份结合，形成α-氯代乙醚，然后再将其与珠粒上的羟基功 能团偶合形成乙缩醛。还可以采用各种光活性键、例如O-硝基苄基、 7-硝基-2，3-二氢化茚基、2-硝基二苯甲基醚或酯等等。酯和酰胺 可以作为接头，其中形成半酸酯或酰胺，特别是用环酐，然后使用碳化 二亚胺之类的偶合剂再与珠粒上的羟基或氨基官能团反应。可用肽作为 接头，其中将所述序列进行酶水解，特别是酶能识别特定序列。使用碳 酸衍生物，例如光气、羰基二咪唑等和弱碱可以制备碳酸酯或氨基甲酸 酯，该键可以用酸、碱或强还原剂(如LiAIH4)使之裂解，特别是裂解 碳酸酯。为全面了解可裂解基团，例如参见Green和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2nd ed.  Wiley(1991)一书。已被开 发的各种体系的多样性，使得产物和鉴定剂的连接，及产物和标记的有 差别解离，正如所希望的，其条件可在很广范围内变化。
下表表示各种所述连接单元(即式I中的F2)及其裂解方式： 表1.各所述连接单元及其裂解方式     连接基团           裂解试剂 硅甲基 氟化物或酸  A  hv  B  Ce(NH4)2(NO3)6 -NCO(L)* OH-，H+，或LiAlH4  C  O3，OsO4/IO4-，或KMnO4  D  1)O2或Br2，MeOH  2)H3O+ -Si-(L) 氧化剂，H+，Br2，Cl2，等 E  H3O+ F  H3O+ G  F-或H+ H X＝酮、酯、酰氨、NO2、硫醚 亚砜、砜、及相关吸电子基团 碱，OH- I  H3O+或还原剂(如Li/NH3) J (3P)3RhCl(H) K  Li，Mg，或BuLi M  Hg+2 N X＝素素或拟卤素 Zn或Mg O 氧化剂(如Pb(OAc)4或 H5IO6) P X＝吸电子基团   碱 *(L)表示标记或产物的连接点
(L)是直接键合于所示原子，或通过连接基团(如C(O)O)间接 键合的标记或产物，所述连接基团可以提供适宜的功能团。
R是H或低级烷基。 接头
针对配位体选择接头是合成策略的一部分，因为所述连接基团在产 物上有可能形成残留功能团，对于从珠粒上解离之后进一步修饰产物是 很实用的。设计合成策略时，人们可以使用在产物中保留的官能团，作 为供连接基团连接的点。此外，若由产物的性质所决定，则可使用裂解 或解离法除去连接官能团，例如用金属氢化物或酸裂解芳硫醚或硅甲 基。因为在许多情况下，合成策略将能够纳入供连接的功能位，该功能 可利用来挑选连接基团。在某些情况下，渴望在将产物连接到载体的位 点上，有不同的官能团，这样可有必要使用不同的连接方式，所述不同 方式必定提供相同解离方法或不同解离方法，解离可以同时完成或陆续 完成，例如用光照射，和酸水解。
为将鉴定剂结合于颗粒，特别有用的是碳双键或氮双键，它们可以 插入碳原子和氢原子之间形成共价键，或插入烯键形成环丙烷(就碳双 键而言)，或形成氮丙啶(就氮双键而言)。
对于带有碳双键或氮双键连接基，各种取代苯可以使用，其中苯被 能提供碳双键的基团：CHN2、COCHN2、SO2CHN2取代；或被能提供 氮双键的基团：N3、NO2、NO、SO2N3取代。碳双键可以通过光解、 热解、或用低价过渡金属化合物(如Rh(OAc)2)处理由重氮烷烃衍生物 而产生。氮双键可通过光解或热解由叠氮化合物而产生，并可使用三价 磷化合物或低价过渡金属从硝基、亚硝基和叠氮化合物产生。
特别有用的一类接头部分(F1-F2-)包括2-硝基-4-羧基苄 氧基、2-硝基-4-重氮乙酰基苄氧基、4-或5-叠氮甲基羰基-2 -甲氧基苯氧基和2-甲氧基-4-或5-羧基苯氧基部份。
T代表标记，Z代表碳双键或氮双键前体或羧基，而R是H或低级 烷基的所述化合物现列举如下，对于光化学标记解离(如用约350nm的 紫外光)的：T3-Z-2-硝基苄基醚、T4-Z-2-硝基苄基醚、 T5-Z-2-硝基苄基醚、T6-Z-2-硝基苄基醚、T2-Z-4 -硝基苄基醚、T3-Z-4-硝基苄基醚、T3-Z-2-硝基苄基 碳酸酯、T4-Z-2-硝基苄基碳酸酯、T5-Z-2-硝基苄基碳 酸酯、T6-Z-2-硝基苄基碳酸酯、T2-Z-4-硝基苄基碳酸 酯和T3-Z-4-硝基苄基碳酸酯。对于氧化解离(如用硝酸铈铵) 的：1-OT-2-OR-3-Z-苯、1-OT-2-OR-4-Z- 苯、1-OT-2-OR-5-Z-苯、1-OT-2-OR-6-Z- 苯、1-OT-4-OR-2-Z-苯和1-OT-4-OR-3-Z- 苯。对于还原或烷基化解离(如用锂/氨或碘甲烷)的：T(2-Z-苯 基)硫醚、T(3-Z-苯基)硫醚和T(4-Z-苯基)硫醚。对于 脱硅甲基解离(如使用氟化叔丁基铵或酸)的：T二烷基-(2-Z- 苯基)甲硅醚、T二烷基-(3-Z-苯基)甲硅醚、T二烷基-(4 -Z-苯基)甲硅醚、T-二烷基-(2-Z-苯基)硅烷、T-二烷 基-(3-Z-苯基)硅烷和T-二烷基-(4-Z-苯基)硅烷。 组合合成
所述合成通常包括涉及至少两种选择，往往至少4种选择，甚至可 包括10种以上选择的各阶段。一般来说，每阶段的选择数不超过约100， 更通常不超过约50。而阶段数至少约3，更常用至少约4，往往至少5， 但不超过30左右，更通常不超过25左右，优选不超过20，更优选不超 过10左右，往往不超过8左右。
所述选择数和阶段数通常将产生至少足够多样性的大量化合物，提 供至少有一种化合物将具有感兴趣之特征的适当可能性。本发明方法可 以产生25000种以上的化合物，通常50000种以上、优选2000000种以 上的化合物，甚至百万以上皆可生产。这就是说通常至少20种化合物， 但可以达106或更多。
某些合成中，一个阶段只可包括一种或二种选择，但这种情况通常 只限于人们希望生产的化合物数量有限和特定的合成策略。许多这些策 略中，限制选择数，即少于5种选择，更通常2种或更少选择，将限于 阶段总数40％以上，或者在顺序合成的2个阶段，更通常限于阶段总数 的20％。 反应程序
进行该合成可以用许多珠粒开始，通常至少103，更通常104，希望 至少105，而一般不超过1015，更通常不超过至少1010。根据第一阶段 的选择数，将该颗粒分装进与之数量相同的容器中。所述容器可以用微 孔平板、个体容器、柱子、凝胶、Terasaki板、烧瓶、Merrifield瓶等等。 该颗粒通常将分成至少每组一个颗粒的各组，通常是许多颗粒一组，一 般1000或更多，甚至可达105或更多，这取决于颗粒总数及该阶段所包 括的选择数。
在各独立容器中然后加入专用试剂，在该阶段中将其处理，并加入 鉴定剂编码试剂及该阶段。每一阶段应提供所希望之反应。一旦反应完 成，可洗涤该珠粒除去试剂，接着将所有珠粒混合在一起，然后再根据 下一阶段的选择数将其分开。将这种分开珠粒，接着标记和合成(反之 亦然)，然后再组合珠粒的程序反复进行，直至该组合合成完成为止。
某些例子中，同一反应可以在2个或更多容器中进行，与其它选择 相比可增加某特定阶段的某特定反应产物的比例。在其它例子中，一个 或多个阶段可将珠粒的一部份置于一旁不进行反应，以便增加伴随最终 产物的多样性。在另外的情况下，可按不同合成途径批量生产。
为了记录或编码珠粒上的反应历程，每一阶段，都应标记以其各自 独特的鉴定剂组合相伴随的与每一选择和步骤有关的珠粒。此外，也可 使用单一标记记录或编码该反应历程。根据所涉及的化学特性，该标记 可在包含每种选择的反应以前，以后，或同时进行。而且为对照起见， 在任何阶段均可取出珠粒样品，将其标记的一部份裂解出和解码，以证 实正确的标记已结合到珠粒样品上。
如前所述，某些例子中，各份颗粒将分成子集，其中每一子集然后 进行不同的反应系列。任何时候，各部份可再结合成单一混合物再进行 随后的反应。例如，若在一个阶段，引入了不饱和化合物，将其分成两 个子集，其中一个子集中将不饱和物还原，而另一子集中则将其环氧化。 然后该两子集可以进行不同的反应系列。
产物合成完成之后，配位体从珠粒上解离下来之后，或仍连于其上 时，针对其所需性质进行筛选。后一情况下，珠粒可以在有鼠单克隆抗 体Y的水缓中液中培养。培养和洗涤之后，该珠粒再与针对鼠抗体的碱 性磷酸酶共轭的兔(或山羊)多克隆抗体一起培养。用荧光沉淀显影剂 鉴定出与单克隆抗体连接的荧光珠粒，并从大部份清洁的未污染的珠粒 中人工分离出来。此外，也可使用荧光激活细胞分析器将荧光珠粒分离 出，只要在分析条件下标记仍保留在珠粒上即可，将各挑选出的荧光珠 粒进行处理，使所有标记的至少某些部份从珠粒上释放出来。
在合成不涉及分步加入同样物质单元，或形成反应付产物的情况 下，很多种化合物将出现在单一珠粒上，或活性化合物的结构不可能从 其反应历程知晓。根据本发明，因为知道反应历程，可以较大规模反复 合成，以便获得足量产物，并分离该产物及将活性化合物进行结构鉴定。
本发明方法可使用各种反应序列来说明。例如，可将醛或酮与乙酸 酯结合，在Claisen反应条件下制备丁烯酸酯，得到未取代的至四取代的 丁烯酸酯，由此制备巴比妥酸盐。所述丁烯酸酯然后在Michael反应条 件下第二次与乙酸酯结合，由此可获得至多达6个取代基的戊二酸酯， 然后使该戊二酸酯与氨或单取代胺结合得到巴比妥酸盐。若改变醛和 酮，改变乙酸酯及胺，那么可以获得大量各种各样的巴比妥酸盐。如果 在一个或多个取代基上还存在官能团，例如氨基、羧基、羟基、硫羟基 等等，这些基团则可按所希望的加以保护或修饰。
在由Bunin和Ellman(J.Am.Chem.Soc.，114，10997(1992))所述 另一例子中，生产苯并二氮杂、合成从通过如4’-氧基基团将不同氨 基加以保护的取代的2-氨基二苯甲酮结合于个体颗粒上开始。
不同反应器中的各不同组颗粒，在脱保护之后，在形成肽键的条件 下加入不同种Fmoc保护的α-氨基酸，所述氨基酸是天然存在的或合成 的。脱保护后，引起内部环化反应，接着用烷基化试剂在氮上进行烷基 化反应，仅需三个步骤，便可制备出大量种类的苯并二氮杂化合物， 并将该文库针对其安神活性或其它活性进行筛选。
可以生产出广泛多样性的药品类似物，例如enalapril之类的降血压 剂；丙醇之类的β-阻断剂；甲腈咪胍和雷尼替丁之类的抗溃疡剂(H2-受体拮抗剂)；异康唑之类的抗真菌剂(胆固醇脱甲基酶抑制剂)； 苯甲二氮之类的抗焦虑剂；阿斯匹林、苯乙酰胺和芬太尼之类的镇痛 药；万古霉素、青霉素和头孢菌素之类的抗生素；可的松之类的消炎剂； 孕激素之类的避孕药；RU-456之类的堕胎药；扑尔敏之类的抗组胺 剂；可待因之类的镇咳药；巴比妥之类的安眠药等等。
作为例证的甲腈咪胍类似物的合成包括羟甲基取代的组氨酸和相关 杂环，其中保留的碳原子或氮原子可以进一步取代或不取代，还包括α、 ω-氨基烷硫醇和取代的硫代脒酯，其中氮上的基团还可变化，例如硝 基，氰基，羟基，烷基及其结合等等。 鉴定剂
本发明的鉴定剂可以由式I代表：
            F1-F2-C-E-C’    I    
其中F1-F2是接头，能使之连接于载体上并使标记从载体上解离下 来；和
C-E-C’是能检测且具可区分性的标记；
E是标记成份，其中(a)它可被检测，例如能通过气相色谱或质 谱分析的电泳基团，或(b)允许被检测和分离出；
C和C’是标记成份，它能使一种标记与其它所有标记分别地区别 开，通常由不同长度和取代作用造成的结果分开来，例如，色谱保留时 间的变化，或质谱荷质比的改变；
F2是连接成份，能被有选择性地裂解释放出标记成份；和
F1是官能团，提供载体连接作用；或者
F2是一条键，而F1是OH或羧基之类的可裂解基团。
虽然式I鉴定剂一般在组合合成期间的每一专门阶段和专门选择时 加入，但E部份可在合成结束时，从基质上裂解以前或以后(优选以光 化学或氧化方式裂解)再加入。特别是，若C含OH、NHR4或SH时， E可在裂解前与C连接。此外，如果E在裂解后连接，则C上的连接点 可以连上F2。这可由下面的反应路线图说明： 其中S＝基质，而
n＝1-40
鉴定剂在基质上的连接可由下式表示：
F1-F2-C-E-C’+S→S-F1’-F2-C-E-C’ 其中F1’-F2-C-E-C’代表连接于基质上的鉴定剂残基。例如当珠 粒以氨甲基功能化，而F1是CO2H时，则F1’是-C(O)-；若珠粒含不饱和 键，而F1是N2CH-C(O)-时，则F1’是＝CH-C(O)-，或-CH2-C(O)-。
作为鉴定剂具体有用的化合物是式I中由式Ia代表的化合物：
            F1-F2-(C(E-C’)a)b    Ia 其中： F1是CO2H，CH2X，NR1R1，C(O)R1，OH，CHN2，SH，C(O)CHN2，
S(O)2Cl，S(O)2CHN2，N3，NO2，NO，S(O)2N3，OC(O)X，C(O)X，
NCO，or NCS； F2是   -Si(R1)2A-，-Si(R1)2-， -OSi(R1)2-，   -N(R1)C(O)O-，-CR1＝CR1-(CR21)2-，-CR1＝CR1C(R1)2-， -C(R1)2-CR1＝CR1-， -C(R1)2A-，-O-C(R1)2A-，  -Si(CH3)2-(CR21)2-A-，-R3-(CR21)2A- -CR1＝CR1-C(R1)2A-， -S-C(R1)A- -S-C(R1)2A-，-C(X)R1-C(R1)2A-， -C(OH)R1-C(R1)2A-，-C(OH)R1-C(CH2X)R1-， -C(OH)R1-C(R1)2-C(X)R1-，-C(OH)(CH2CH2X)-，
A是-O-、-OC(O)O-、-OC(O)-，或-NHC(O)-；
C是一条键；由1-40个F、Cl、Br、C1-C6烷氧基、NR4R4、 OR4、或NHR4任意取代的C1-C20亚烷基；或 -[(C(R4)2)m-Y-Z-Y-(C(R4)2)nY-Z-Y]p-；其前提条件是C+C’中碳原子数最多优选为20；
C’是H；F；Cl；由1-40个F，Cl，Br，C1-C6烷氧基、 NR4R4、OR4或NHR4任意取代的C1-C20烷基；或 -[(C(R4)2)m-Y-Z-Y-(C(R4)2)nY-Z-Y]p-；
E是由1-20个F，Cl或Br取代的C1-C20烷基；或Q-芳基， 其中芳基是由1-7个F、Cl、NO2、SO2R5、或取代苯基取代的，而 取代苯基上的取代基是1-5个F、Cl、NO2或SO2R5；
E-C’可以是-H、-OH、或氨基；
R1是H或C1-C6烷基；
R3是C＝O、C(O)O、C(O)NR1、S、SO、或SO2；
R4是H或C1-C6烷基；
R5是C1-C6烷基；
a是1-5；
b是1-3；
m和n各自独立地是0-20；
p是1-7；
Q是一条键、O、S、NHR4、C＝O、-C(O)NR5、-NR5C(O)-、 -C(O)O-，或-OC(O)-；
X是离去基团，例如Br、Cl、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺 酸酯、或OC(O)OR5；
Y是一条键、O、S、或NHR4；
Z是一条键；由1-4个F、Cl、Br、C1-C6烷基、C1-C6烷 氧基、由1-13个F、Cl取代的C1-C6烷基，或由1-13个F、Cl、 Br取代的C1-C6烷氧基任意取代的亚苯基；(C(R4)2)1-20；或(CF2)1-20； 其先决条件是若Z是一条键，其相邻的Y之一也是一条键；而
芳基是含有至多10个碳原子和至多2个选自O、S和N的杂原子 的单或双芳香环。
式Ia中有关F2的定义中，左手边的键表示连于F1上的键。
下式Ia’的化合物作为鉴定剂也是有用的：
                F1-(C(E-C’)a    Ia’ 其中：
F1是OH或COOH；而其余定义与式Ia中相同。
优选的式Ia化合物如下：其中
F1是CO2H、OH、CHN2、C(O)CHN2、C(O)X、NCS或CH2X； F2是
C和C’各自分别是由1-40个F或Cl取代或未取代的C1-C20 亚烷基或C1-C20烷基，或是[O-(CH2)2-3]p；
E是由1-20个F或Cl取代的C1-C10烷基；Q-芳基，其中芳 基是由1-7个F或Cl取代的双芳环；或由1-5个F、Cl、NO2或 SO2R5取代的Q-苯基；而
Q是一条键、O、-NR5C(O)-或-OC(O)-。
优选式Ia化合物是其中-C(E-C’)a由-(CH2)0-15-(CF2)1-15F、 -(CH2)0-15-(CCl2)1-15Cl、-(CH2CH2-O)1-5-Ar、-(CH2CH2CH2O)1-5-Ar、或 -(CH2)1-12-O-Ar代表的化合物，其中Ar是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5， 6-四氟-4(2，3，4，5，6-五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4， 5-三氯苯基、2，6-二氯-4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。
式Ia的一个优选方案是其中F1是COOH、CHN2、C(O)CHN2、 S(O2)CHN2、COCl、OH、SH、CH2X或NHR1； 其中F2是 其中A是-O-、或-OC(O)O-； C(E-C′)a是-(CR42)1-15-(O)0-1-Ar，-(CR42)0-15-(CF2)1-15-F，
       -(CR42)0-15-(CF2)1-15-(CR42)0-15-H，or  
       -(CH2)1-20((O)0-1-(CH2)1-19)0-24-(CH2)0-24-(O)0-1-Ar， 其中Ar是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6- 五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯 -4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。 其它式Ia优选化合物由下述分子式代表： 其中Ar是五氟、五氯或五溴苯基，2，3，5，6-四氟-4(2，3，4，5，6- 五氟苯基)苯基、2，4，6-三氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，6-二氯 -4-氟苯基、或2，3，5，6-四氟苯基。
其它式Ia优选化合物是其中E-C’是H、OH、或NH2的化合物。 此类化合物对于在组合合成结束时与E反应的情况特别有用，尤其是E 可由荧光或电子俘获检测的情况，例如1-二甲胺基萘-5-磺酰氯或 多卤代苯甲酰卤。
本发明的另一方案由下式化合物代表：
根据下面例举的反应路线，或本技术领域熟知的其它方法可以制备 式I化合物。
                              反应路线1
                            鉴定标记物的制备
                        反应路线2                    带有光裂解接头的鉴定剂
                       反应路线3                  带有氧化裂解接头的鉴定剂
                    反应路线4             带有另外的氧化释放接头的鉴定剂
                        反应路线5                               E-C’标记物
                      反应路线7                   带有氧化裂解接头的鉴定剂
所述鉴定剂可以包括一个或多个相同标记。鉴定剂是可将一种物质 与其它区分开的个体化学化合物并能独特地鉴定不同的选择和阶段。以 该方式，可用相对少的鉴定剂品种(通常不到50种标记)制备非常大的 组合文库。每一阶段中，加入定义该阶段和选择的一组鉴定剂，各鉴定 剂以共价键或非共价键与珠粒或产物(通常是珠粒)相结合。鉴定剂组 用于提供各阶段的二进码或其它码，由此可定义选择和阶段。所述鉴定 剂组可以包括零种或仅仅一种鉴定剂。 标记
现在开始讨论标记(C-E-C’)，被采用的标记具下述特征：可 用由F1和F2所决定的方法从珠粒上除去，优选用水解、光解、或氧化法； 可按个体区分，通常是可分离的，在合成条件下是稳定的；既能编码阶 段又能编码选择，以便专一地定义该合成中各阶段所选择使用的试剂； 希望用无需精良技术操作的易获得装备、以容易之方法即可鉴定各种标 记；它们应相当经济并在相当少的分子基础上可提供很强的信号；所述 标记应有足够的灵敏度，在标记测定期间，能使该标记与可能存在的其 它成份区分开。
标记之间可以是结构上相关或不相关的，如处于同源系列，有重复 的官能团，元素周期表的相关元素，不同同位素，及其组合等等。所述 标记可作为二进码的元件，以便一种标记可定义二种选择，二种标记可 定义4种选择，三种标记可定义8种选择，五种标记则可以定义32种选 择等等。因此，合成的每一阶段，相当少的标记种类，可以标明数量大 得多的选择。包含于每一阶段之鉴定剂的标记，可以(或可以不)与其 它阶段相关。对任何组合合成的各标记来说，必需使其能与所有其它标 记区分。按此方式，用相当少的标记种类，通常不到60种，更通常不到 50种，便可制备极大的组合文库。
就每个珠粒来说，各标记通常至少要0.01 femtomol(毫微微摩尔)， 更通常0.001-50pmol，但特定情况下也可用较少或较多量。产物量也 通常在至少相同之范围，多至至少104或更多，通常是至少0.01pmol， 更通常至少1.0pmol并一般不超过10nmol左右。根据珠粒数，阶段数和 每步的选择数，所产生的产物种类数通常超过102，更通常103，甚至可 超过1010，但往往不超过108左右，优选在约104-108范围，更通常105 -108。
大多数情况下，标记是有机分子。各标记往往含有不到约100个原 子，更通常不到约80个原子，一般不到60个原子(除了氢原子，并排 除该标记从珠粒上释放时不保留的连接部份)。该连接部份可以是任何 大小，通常不到约30个原子，更通常不到20个原子(除了氢)。所述 连接部份的大小并不至关重要，而视方便而定。所述标记可形成化合物 家族，其中所有化合物具相似性质，或者可以是不同家族的组合，其中 化合物可以是脂肪族、脂环族、芳香族、杂环、或其组合。区别特征可 能是重复单元数，例如，烷基部份的亚甲基数，多亚烷氧基部份的亚烷 氧基数，多卤代化合物的卤素基团数，α和/或β取代的亚乙基，其中的 取代基可以包括烷基，氧基，羧基，氨基，卤素等，或同位素等等。 标记分析
根据F2基团的性质，可采用还原、氧化、热解、水解、或光解等条 件，将标记物从珠粒上除去，例如用硝酸铈铵氧化儿茶酚醚，或光解硝 基苄醚或酯或酰氨，或者用如示于表1中的其它方法。
标记的分辨可由物理差别达到，例如标记分子重量、气相或液相色 谱的色谱保留时间等。位置异构体可能有不同的保留时间。如果位置异 构体或立体异构体不足以达到物理分离，那么可以使用不同数量的取代 基，例如卤素(如氟)、甲基、氧基等，或与带不同单元数量的其它侧 链结合，例如亚甲基或亚乙氧基，提供所需之分离条件。也可以采用放 射性同位素比，所述放射性同位素提供有区别的发射，例如14C和3H。 物理差别，特别是质量数，可提供有关选择和阶段的情报。
若不用14C/3H比例，可用非放射性同位素组合，例如-CHmDn， 其中m是0，至多为3，而n是3减m。例如，使用质谱检测此类多至 4种不同甲基的不同量，便可以定义大量的选择。
若E-C’是氢，从载体上释放获得的标记，便有一能与引入可检测 标记成份E的标定试剂反应的活性官能团。该官能团可以是双键(尤其 是活化双键)、羟基、硫基、氨基、羧基等较宜。然后该标记与过量标 定试剂反应，提供供分析的产物(E-CH)。该方法中，范围极广的 各种标定试剂可用作该鉴定体系之部份，可以是与为得到所需产物的合 成策略并不相容者。可用于该检测的标定试剂包括卤代芳香化合物(如 全氟苄基溴)、荧光物质(如1-二甲胺基萘-磺酰氯)、放射性同位 素、化学发光物质等等。
当典型标记和反应已详细介绍过后，那么很清楚，许多其它组合便 可照此办理。
根据标记的化学和物理性质，选择适宜的分离方法，最好是各种色 谱法之一，包括气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、特别是高效液相 色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、电泳等等。代替色谱法，可用质 谱通过质量数来使之分离。对于GC，针对的标记包括：有相同或不同 分子量的化学惰性有机分子，包括烷烃、烯烃、芳烃、卤代烃、醚、醇、 硅烷、硫醚等，特别是带有或不带有其它官能团的卤代化合物，宜以毛 细管GC分离配合电子俘获检测或质谱检测(MS)，而对于带有一般有 机化学中不常见元素(如Sn，Ge)的化合物，则用GC毛细管分离配合 原子发射检测。对于LC，MPLC或TLC，针对的标记：见上面有关GC 所列举的，适宜的是被分离之后适于放射性检测的放射性同位素或放射 性同位素组，或适于荧光检测的其它适宜基团取代的直链醚或烃。对于 电泳，针对的标记：同上，特别是带电荷功能性分子，例如阳离子或阴 离子，特别是有机或无机酸基团，其中分子还可进一步由供电泳检测的 可检测放射性同位素或荧光物加以修饰。对于质谱，针对的标记：同上， 尤其是由于不同同位素，相同或不同官能团的不同数量，同源系列的不 同数量及其组合，所造成的不同质量数之分子。
标记的相互分离可包括单一技术或结合技术，例如色谱和电泳；气 相色谱和质谱等。
本发明的标记具极低水平即可检测之性质，通常不到nanomole、优 选picomole或更低，更优选femtomole或更低(且是在有明显较高水平 其它化合物存在下)，为此原因，可采用特异性原子取代使得标定更易 检测，此种取代包括：
(a)对电子俘获检测配合毛细管GC，或负离子质谱检测而言， 由电负性元素，如氟或氯取代；
(b)对于原子发射光谱检测配合毛细管GC而言，由非普通元素 (即除C、H和O之外)取代；
(c)对于原子发射光谱检测测定元素之间比例而言，由几种非普 通元素取代；
(d)对于放射自显影或闪烁计数检测配合LC，TLC或电泳而言， 由放射性元素，例如3H取代；
(e)对于放射自显影或闪烁计数检测测定不同放射性元素之比例 而言，由多种有不同发射光谱的放射性元素，如3H和14C取代。
对于单元素取代(上述a、b、d)来说，只检测单纯“存在”或 “不存在”之情况的A种可分离标记混合物，能编码多达2A种不同合成。 而就多元素取代(上面c和e)而言，每种又有B种可区别状态(例如 不同的3H/14C比例，不同的Si/Sn比例)的A种可分离标记混合物，能 编码多达BA种不同合成。
存在广泛多样性同位素，其中同位素的存在或其存在比例，可提供 有关阶段和选择的情报。所述同位素可以是放射性的，或非放射性的。 特别有意义的同位素包括氘、氚、14C、32P、131I等等。
若采用同位素修饰化合物之混合物，可极大地拓宽只由同位素存在 加以区分的单一标记化合物所获得的情报。例如，可以制备氢和氘的不 同比例之混合物，其中各种比例只相差10％之微。
若用其它元素例如氟取代氢，那么将获得氢、氘和氟的各式混合物， 提供大量的各种可区分性标记。
可以包括的其它基团是芳环，在其不同的位置，用不同官能团，可 将其进行不同的取代。这样，若带有取代苯环，其中取代的位置和取代 的性质可以测定，那么可以提供能区分的多种分子，并可提供有关阶段 和选择的情报。例如，假定C是不变的，而E是多卤代芳环，则可以通 过E上的取代情况来检测和区分。
也可以使用荧光标记。若是荧光标记可能单独不足以定义诸多阶段 及诸多选择时，如上所述，赋予根据C或C’的多样性来分离荧光标记分 子的方法，便可以借助其荧光来独立地检测该标记。
与特定珠粒相结合的标记混合物可以解离下来，并进行初步分离， 希望分开地检测各种标记。一旦各类标记被分开，可以根据其特定官能 团和不同性质分析其每一种。各种技术可用于检测特定的标记，包括放 射自显影或闪烁计数、电子俘获检测、正负离子质谱、红外光谱、紫外 光谱、电子自旋共振光谱、荧光光谱等等。
另一种组合物含在一个试剂盒，或者说在一种共同介质中共存的至 少6种不同标志，每种标志具基本上化学惰性的，相互分子重量不同的 可区分部份，所述标志分子式如下： (1)       Λ-{Δ-(T)α或(T)α-Δ或Δ1-(T)α-Δ2} 其中
Λ是一个带有键合于固体载体上的官能团，并从固体载体上解离之 官能团的连接基团，其中后一官能团可包括于前者(即键合于固体载体 之官能团)之中；
Δ是可区别基团，该基团可使各标志通过物理特征与所有其它标志 区别开(除荧光之外)以提供可编码多步骤合成程序的一整套标志，并 且Δ还包括原与连接基团结合在一起、解离之后仍然保留的任何官能团；
Δ1和Δ2是可区别基团部份，二者结合在一起定义一个可区别基团， 当其结合在一起时则有Δ的定义；
T是可检测基团，当其与可区别基团连接时，可使标志于低水平检 测，所述可检测基团可以是在试剂盒中即存在于标志上的，或者也可以 其后再加入可区别基团中，假如与连接基团连接，则该T也包括原与连 接基团结合，解离之后仍然保留的任何官能团；而
α是0或1，表示所述可检测基团可以存在，亦可不存在；
(2)SS-(Λ’-{Δ-(T)α或(T)α-Δ或Δ1-(T)α-Δ2})β 除了ss是固体载体；Δ’是共价键合于ss的连接基团；而β是与各固体载 体有关的整数(至少为6，但通常不超过约30)外，其余符号定义同上；
(3)Λ″-{Δ″-(T)α或(T″)α-Δ或Δ’1-(T)α-Δ2} 除了Δ″是氢，或是使其从固体载体上解离的光裂解反应，消除反应，或 其它化学反应之后，所剩连接基团的残基；Δ″或Δ’1分别是作为标志从固 体载体上解离下的Δ或Δ1，或经修饰的Δ或Δ；T″是作为标志从固体载 体上解离下来的T或修饰的T以外；其余所有符号定义均同上；
(4)Tα-Λ’″-{Δ″-(T)α或(T″)α-Δ或Δ’1-(T)α-Δ2} 除了Λ’″是一条键，或连接到T后连接基团的保留部份，及附加限制是仅 一个α是1外，其余所有符号定义同上。 测试
为测定有用产物的特性，可采用广泛多样的测试法和技术。
通常，筛选珠粒时，使用单一珠粒或混合珠粒，测定是否这种珠粒 或混合珠粒表现出有活性。这样，混合珠粒可包括10、100、1000或 更多珠粒，以这种方式，可以很快筛选化合物大类，并再分成较小的化 合物类。
一种令人感兴趣的技术是与特定生物分子(例如受体)结合。所述 受体可以是单一分子，与微粒体或细胞缔合的分子等。如果兴奋剂活性 是还要研究的，可以使用完整的生物体或细胞，可以测定本发明产物与 之结合后的应答。某些例子中，需将产物由珠粒上解离下来，特别是通 过信号传导的生理活性是要研究的情况下更如此。可采用检测细胞应答 的各种装置，例如生理测微器(购自Malecular Devices，Redwood City， CA.)。如果结合情况是要研究的，则可使用标记受体，其中标记物是荧 光物质、酶、放射性同位素等等，由此可检测受体与珠粒上化合物的结 合情况。此外，可以提供针对该受体的抗体，其中抗体被标记，它可使 信号放大，并避免改变所研究的受体，所述受体能影响其与所研究产物 的结合情况。通过配位体与受体结合的偏移，也可测定该结合，其中配 位体是用可检测标记物标记的。
某些例子中，可以进行二阶段筛选，由此首先使用结合作用作为初 步筛选，接着用活细胞第二次筛选生物活性。采用重组技术，可以极大 地改变细胞的遗传能力。然后可以产生外源基因或外源转录调节序列， 以便结合于表面膜蛋白上，结果将产生可观测信号，例如胞内信号。例 如，可将白染料引入细胞，其中将该白色染料转化成有色产物，特别是 荧光产物的酶，在结合于表面膜时变得易表达，例如β-半乳糖苷酶和 二半乳糖苷荧光素。以这种方式，通过将特定的细胞(或多个细胞)与 特定颗粒结合，使用EACS可测定细胞的荧光性质，这样携带活性化合 物的颗粒便可以鉴定出。可以采用各种技术确保颗粒与细胞保持结合， 即使产物从颗粒中释放出。例如使用针对表面膜蛋白的抗体于颗粒上， 可以将抗生物素蛋白连于细胞表面，并使生物素存在于颗粒上等等。
测试可以使用个体颗粒，或颗粒组，或者其组合来分阶段进行。例 如，进行组合合成之后，将约50-10000个颗粒的组分装入分开的各容 器中，每个容器中，就每一颗粒来说，结合于该颗粒的部份产物被释放 出来，这种部份释放可能是产物与颗粒的不同连接所致，或者因使用的 试剂量有限，条件限制等等，以致于每个颗粒释放的产物分子平均数， 要小于每个颗粒上产物分子的总数。然后取一小体积产物混合物，用于 结合测试中，其中所述结合事项可能是对结合于受体的已知结合配位体 的抑制作用，细胞代谢过程的激活作用或抑制作用等等。正如随后要介 绍的，有各种测试条件可用于检测结合活性。一旦某组被证明是有活性 的，然后通过相同或不同的测试法，可以筛选出个体颗粒。当然也可用 三步或四步程序，其中大组被分成较小组等，最后筛选出单个颗粒。每 种情况下，颗粒上的产物按份释放，新的混合物用于适当测试中，测试 法可以相同或不同，更为精细及耗时的测试法用于较后阶段，或最后阶 段。
也可以采用一种立体测试法，即可将颗粒分配于整个蜂窝状板上， 每个蜂窝孔里有0个或1个颗粒。
本发明的方法可用于找到具催化性质的化学物质，例如具水解活 性，像酯酶活性之类。为此目的，可将珠粒嵌进由可扩散试验底物包围 的半固体基体中。采用不搅动该基体的检测方法，如测光吸收改变，或 测显示裂解底物产生的荧光，若在该处检测出催化活性物，则可将催化 活性物区的珠粒分离出来，并使其标记解码。
代替催化活性物，还可以开发出抑制性或激发活性的化合物。可以 寻求抑制或激活酶，或阻断结合反应的化合物。为检测抑制某种酶的珠 粒，该珠粒连接有具该所需性质的产物，最好是能从该珠粒上将产物释 放出，将其扩散入半固态基体中或置于滤器上，在这里可以观察抑制作 用，激活作用或阻断作用。然后捡出显现(或者说具可检测)抑制作用、 激活作用或阻断作用区域的珠粒，并将标记解码。这种情况下，合成产 物的一部份必需通过可裂解键连接于珠粒上，优选光敏感键，而标记的 一部份还保留与珠粒连接，检出之后采用与前面不同的方法再释放出。
可以使用一种渗析膜，在其中，珠粒层与放射性标记的配位体/受体 对层分开。用紫外光照射珠粒层，从珠粒上释放出的产物可扩散进所述 配位体/受体对层，其中，放射性标记配位体将按与化合物对受体之亲合 性成比例的方式释放，该放射性标记配位体将再扩散回珠粒层。因为放 射性标记与珠粒接近，便可分析带有放射性发射的珠粒。
特别感兴趣的是要找到具生物活性的产物，某些应用领域希望找到 对活细胞有影响的产物，例如抑制微生物生长，抑制病毒生长，抑制基 因表达或激活基因表达等。要筛选出珠粒上的化合物可以很容易实现， 例如，将珠粒嵌入半固态介质中，而产物分子文库从该珠粒上释放(同 时珠粒被固定住)，使化合物扩散进入周围介质。可以观察到细菌坪中 的菌斑之类的现象。随后可显现出生长抑制区，或生长激活区，或者影 响基因表达的区域，检出各区中心处的珠粒并分析。
测试方案将包括凝胶，其中准备处理的分子或体系(如细胞)可以 基本上均匀地嵌进该凝胶中。可利用各种胶化剂，例如聚丙烯酰胺、琼 脂糖、明胶等等。然后将颗粒在凝胶上散开，使颗粒之间充分隔开，以 便进行个体检测。假如希望产物是具水解活性的，则凝胶中加入一种底 物，提供荧光产物。然后就荧光对凝胶进行筛选，并机械挑选出带荧光 信号的颗粒。
可将细胞嵌入凝胶中，结果制造一种细胞坪。如上面所述将颗粒散 开。当然还可放栅格在凝胶上，限定一个颗粒或无颗粒的区域。假如要 判别细胞毒性，可将产物释放出，培养足够时间，接着将活体染料分布 于该凝胶上，随后可以区分吸收染料的细胞，或不吸收染料的细胞。
如上所示，细胞可以是遗传工程细胞，以便当信号被转导时能显示。 有许多受体对其来说表达被激活的基因是已知的。将一外源基因插入基 因的某个位点，于该位点基因处于对此种受体有反应的启动子的转录控 制下，可产生提供可检测信号的酶，例如荧光信号。然后可针对其反应 历程分析带有荧光细胞的颗粒。 文库和试剂盒
为方便起见，可以文库和/或试剂盒的形式提供。所述文库应包括已 带有产物文库和标记的颗粒，以便能筛选结合于珠粒上的产物，或该文 库包括可供筛选的从珠粒上移出并单独分组，或分成10-100，甚至1000 个为一组的产物。所述试剂盒提供进行文库合成的各种用作标记的试 剂。该试剂盒通常至少有4种，往往有5种分装于各容器的不同类化合 物，更通常至少10类，甚至可以含至少102类不同分开的有机化合物， 但往往不超过约102，更通常不超过约36类不同化合物。对于二进制测 定来说，检测的模式通常为该分析所涉及之化合物共同的，以便可以有 共同的发色团、共同的原子等供检测。如果各鉴定剂是预先制备的，则 每类将以有可区分的组合物为特征，该组合物可编码能通过物理计量测 定的选择和阶段，并包括分享至少一个共同官能团的化合物各种类型或 所有类型。
此外，试剂盒还可提供可被结合得到各种鉴定剂的反应剂。这种情 况下，试剂盒将包括许多分隔开的含第一种功能性，并常常有双功能的 有机化合物，通常是4种或更多，通常一种针对合成的一个阶段，其中 该功能性有机化合物分享同一种官能团，并可根据其至少一个决定性特 征加以区别。另外，还可有至少一种(通常至少二种)第二有机化合物， 该化合物能同功能性有机化合物的官能团反应并能形成根据所述第二有 机化合物各不同量加以区分的混合物。例如可以含甘醇，氨基醇，甘醇 酸，其中各种双官能团化合物由所存在的氟或氯原子相区别，来定义各 阶段，并还可以有碘甲烷，其中一种磺甲烷不含放射性同位素，另一种 有14C，再有一种有一个或多个3H。使用二种或多种碘甲烷可以提供能 由其放射性发射进行测定的各种混合物。此外，还可以加多种第二有机 化合物用于二进码中。
正如前面所述，可在释放之后将标记与能够进行检测的分子反应。 此种情况下标记可以十分简单，带有可连于颗粒的，与可检测部份相同 的官能团。例如，若连接于羟羧基上，羟基会释放出来，然后该羟基可 以用能够检测的分子酯化或醚化。又例如，使用氟-或氯-烷基相结合， 于二进码中，氟和/或氯基团数可以决定选择，而碳原子数可以表示阶段。
特别有用的化合物类，包括可区分基团(如C)结合于取代的邻硝 基苄氧基，2，3-二氢化茚氧基或芴基氧基，或者其它可光解或其它可 选择性裂解的基团上的化合物。所述可区分基团可以是2-20个碳的亚 烷基、多亚烷氧基、特别是2-3个碳原子的亚烷氧基、4-8个碳原 子的环烷基、卤代烷基、特别是2-20个碳原子的氟烷基、一个或多个 芳环等，其中借助拥有不同的单元数和/或取代基，由此可区分基团提供 各类之间的差别。
个体颗粒或许多颗粒可以商品提供，特别是那些证明具有所需特性 的颗粒。将其与标记结合，可编码反应历程。然后该产物可以用大规模 合成来生产。如果反应历程专一地限定了结构，那么可以使用相同的或 类似的反应系列，大批量生产该产物。如果反应历程并不专一地限定结 构，那么可大批量重复该反应历程，并将所得产物进行结构分析。在某 些例子中，可以发现组合化学的反应系列可能并不是大量生产产物的优 选方法。
本发明的一个方案是一种试剂盒，该试剂盒含有多类型分隔开的有 机化合物，每类化合物的特征在于有可区分的组合物，该组合物至少编 码一个二进制的，可由物理计量测定的不同情报，并分享至少一种共同 官能团。优选方案是一种含至少4类不同功能性有机化合物的试剂盒。
更优选的是其中所述功能性有机化合物是有如下分子式的试剂盒：
            F1-F2-C-E-C’                     I 和              F1-F2-(C (E-C’)a)b    (Ia) 其中
F1-F2是接头，能同固体载体连接或解离；而
C-E-C’是可由物理计量测定的标记数，具体地说，所述功能性 有机化合物由亚甲基数和/或卤素、氮或硫的存在数相区别。
还优选的是其中C-E-C’部份可经光化学除去的试剂盒，或其 中C-E-C’部份可经氧化、水解、热解、或还原除去的试剂盒。
在一个方案中，本发明是含至少6种不同成份、每种成份均有可区 分部份的组合物。这些成份特征在于各可区分部份基本上是化学稳定的 或惰性的，并有不同于其它各个可区分部份的可鉴定特性。各可区分部 份连接于有活性功能团的连接基团，通过连接基团能与个体可分离固体 表面形成共价键，或者该可区分部份与一种不到1毫微摩尔量便能检测 出来的基团结合，其先决条件是若该部份与连接基团结合，则所述各成 份是物理分离开的。优选固体载体是珠粒。一实施方案中，各成份包括 结合于个体分离固体表面的不同化合物分子，所述分子在固体表面上。 优选本发明该部份定义一种同源系列和/或在核心分子上取代的系列。
本发明也涉及包含至少100个专用固体载体的化合物文库。该化合 物文库中对各固体载体而言(1)当大部份化合物与载体结合时，便有 个体的化合物与所述固体载体结合；(2)有很多种标记，例如不能定 序的标记，其中所述各标记是个体的标记分子，它们处于物理可分离状 态时是可物理区分的，并且可被取代，以便其量小于毫微摩尔级也能检 测出，或者有结合于小于毫微摩尔级也能检测出的取代基的官能团。优 选该化合物文库中各固体载体有至少6个标记。另一方案中，于化合物 文库中，标记定义编码固体上合成化合物所用合成方案的二进码。
本发明也提供了测定由一系列定义二进码的物理分离差别标记所编 码的合成方案之方法。该方法中，至少有两个标记被用于定义合成方案 中的各阶段，共有至少6个标记。该方法之步骤包括借助其物理差别来 分离标记，并检测之。该合成方案被不同标记的二进码定义。
本发明化合物可用作止痛药，和/或治疗炎症，尤其是氮杂三环化合 物用作神经激肽I/牛血清激肽I型受体的拮抗剂。苯并二氮文库各化 合物可用作肌肉松弛剂和/或安定药和/或安眠药。2.35千万数的混合酰 胺文库(实施例6)各化合物，借助其内皮素拮抗剂活性，用于治疗高 血压或Raynaud氏综合症。
                    实施例1 肽文库
为编码多达109种不同合成，要准备30种携带独立标记，能通过毛 细管GC相互分离的不同鉴定剂。若编码较少合成数，则使用种类较少 的鉴定剂。标记一般可购自化学试剂商店，如下面的说明所示。ω-羟 基烯烃-1，其中亚甲基数在1-5范围内改变，将与碘代全氟烷烃反 应，其中CF2基团数是3，4，6，8，10和12。采用自由基催化剂，该碘代 全氟碳将与双键加成，其中碘基团然后可用氢和催化剂或氢化锡还原。 以此法，可以制备出30种不同的标记。该化学程序由Haszeldine和Steele， J.Chem.Soc.(London)，1199(1953)；Brace，J.Fluor.Chem.，20，313 (1982)等文介绍过。高氟标记很容易由电子俘获法检测，有不同的GC 保留时间，因此很容易用毛细管GC分离，并由于其氟化及烃结构，而 呈化学惰性，而各自又有一羟基官能团可直接或间接地与颗粒连接。
与化合物前体连接之前，所述标记(称之为T1-T30)应以对该组 合合成所用的化学中间体适当的方式使之活化。所述适当方式，即试图 将能使之容易通过化学键连接于化合物前体或珠粒基体本身的官能团引 入。活化过程将施用于30种不同标记的每种，使这些标记直接或间接地 化学结合于组合化合物合成中的中间体上。例如，可用羧基衍生物与之 偶合，并使之活化，所得羧基将键合于颗粒上。
如果组合合成肽化合物，或者由酰氨连接有机片段形成的其它结 构，则编码过程可由羧酸装配接头的加成作用组成。例如可以在氢化钠 存在下，将标记与邻硝基对羧基苄基溴的叔丁酯偶合，然后可在稀三氟 乙酸中使该酯水解。
经活化的鉴定剂在组合化合物合成的每个阶段与中间体偶合。活化 鉴定剂的邻硝基苄醚部份，供组合合成完成后光化学解离该标记用，并 挑选出最所需之化合物。使用毛细管GC配合电子俘获检测法，将解离 下来的标记解码，得到合成步骤的历程，供制备所挑选的化合物使用。
虽然几乎有无限套化学步骤和方法可供制备化合物组合文库之用， 但我们将以α-氨基酸偶合制造肽组合文库，作为该编码法应用之典型 例。该例中，我们将介绍一种五肽化合物文库的制备，其中包括该五肽 的五个残基位的每一个上所有16种不同氨基酸的组合。此种文库将包含 165种化合物。为了专一地编码该文库的所有各化合物，将需要上面所述 的20种可解离标记(T1-T20)。
为制备该编码文库，我们将以大量(＞106)Merrifield固相合成所用 的聚合物珠粒开始，并用游离氨基使之功能化。将这些珠粒分成16等份， 16个不同反应器(每一反应器准备加入每一种不同α-氨基酸)的每一 个中放入一份。然后对每种氨基酸衍生物(例如Fmoc氨基酸)加入一小份 (如1mol％)鉴定剂，在组合合成的第一步与之偶合。结合于所加鉴定 剂中的特异性标记组合，将代表一种简单的二进码，它鉴定该合成第一 步所用的氨基酸。加入的16种氨基酸由号码1-16表示，而任何一个 号码又可以由前4种标记(T1-T4)的组合以化学方式代表。在表2 和表3中，列举了一种典型的编码方案，其中标记的“存在”或“不存 在”分别由“1”或“0”表示。字母T可以代表该标记或者代表结合 该标记的鉴定剂。
             表2：一种典型的编码方案 第一步中加入的氨基酸     T4     T3     T2     T1  1号(例如甘氨酸)     0     0     0     0  2号(例如丙氨酸)     0     0     0     1  3号(例如缬氨酸)     0     0     1     0  4号(例如丝氨酸)     0     0     1     1  5号(例如苏氨酸)     0     1     0     0       .       .  16号(例如色氨酸)     1     1     1     1
然后使用Fmoc氨基酸与少量如上所述的编码活性鉴定剂混合，在 16个反应器每一个中进行标准的二环己基碳二亚胺(DCC)肽偶合反 应。偶合期间，氨基酸以及少量(如1％)鉴定剂，将与连接于珠粒上 的中间体化学结合。
下一步，将珠粒充分混合并再次分成16份，每份再放入不同之反应 容器中。第二种氨基酸与专用的新的活化鉴定剂(T5-T8)混合后加 入各反应器中，并如前所示进行DCC偶合反应。结合有标记(T5-T8) 的特定混合物，再次代表该组合合成第二步所加氨基酸的简单二进码。
                   表3：一种典型的编码方案   第二步中所加氨基酸     T8     T7     T6     T5  1号(如甘氨酸)     0     0     0     0  2号(如丙氨酸)     0     0     0     1  3号(如缬氨酸)     0     0     1     0  4号(如丝氨酸)     0     0     1     1  5号(如苏氨酸)     0     1     0     0       .       .  16号(如色氨酸)     1     1     1     1
步骤2的16个偶合反应完成之后，将珠粒再次混合，然后分成16 个新的份，进行第三步的合成。至于第三步，使用第一和第二步相同的 方案，将T9-T12用来编码结合于珠粒上的第三氨基酸。第三次偶合反 应完成之后，使用配合T13-T16的第四氨基酸和配合T17-T20的第 五氨基酸，再将该程序重复两次，得到连于珠粒上的1048576种不同肽 的完整文库。
虽然上述珠粒是肉眼不能区分的，但任何珠粒仍可挑选(例如根据 其与肽或其它目标分子结合的有用化学或生物学性质来挑选)，并且其 合成历程可以从解离及解码所结合的标记而得知。
用于解离标记的正确方法，取决于用于将其化学结合于目标化合物 组合合成之中间体的具体接头。在上述例子中，已知碳酸邻硝基苄酯连 接对～300nm光不稳定(Ohtsuka等人，J.Am.Chem.Soc.，100，8210 [1978])，则以光化学照射珠粒来裂解。所述标记从珠粒扩散入自由溶液 中，然后将其注射入装配有灵敏电子俘获检测器的毛细管气相色谱仪 (GC)。因为标记(T1-T20)从GC中出现的次序，及标准条件下 它们的保留时间是预先测定好的，T1-T20任意之一“存在”或“不存 在”将直接由该GC图谱上有没有它们相应的峰来决定。假如1和0分 别代表相应于Tl-T20的峰“存在”和“不存在”，那么该色谱图可以 看作20个二进制码，它可以专一地代表得到该肽文库各化合物的每种可 能的合成。使用安全、经济并由电子俘获检测法于Picomole级以下水平 均能检测的卤化碳标记，使该毛细管GC法成为该目的的特别便捷的编 码方案。
以上述五肽文库所使用编码方案作为例子，特定的珠粒用光照射解 离标记，将溶解的标记注射入毛细管GC，获得下面的色谱图(“峰” 行)： 标记  20  19 18 17 16 15 14  13  12 11 10 9   8  7  6  5   4 3   2  1  GC注射 峰     |   |  |  |     |               |  |            |         |       | 二进码 1   1  1  1  0  1  0  0   0  0  1  1   0  0  0  1   0 0   1  0 步骤   ----5------ -----4-----  ----3------  -----2-----  -----1----- M          色氨酸     苏氨酸      丝氨酸         丙氨酸      缬氨酸
上图中“标记”行以图表示发现的T20-T1峰(|)的GC色谱图 (注意“注射”列于右边，该色谱图从右至左读出)。“峰”行表示标 记(T20-T1)的出现，以在色谱图中的峰表示。“二进码”行给出作 为二进制数的峰存在(1)或不存在(0)。“步骤”行将二进数码分 成五个不同部份，编码合成中的五个不同阶段。最后“AA”行给出每 步中加入的，并由上述“二进码”行的二进码给出的氨基酸的鉴定。
                    实施例2 放射性标记TAGS
下面的描述中，所用标记是直链烷基-α，ω-二醇的单甲醚，该 二醇有N+2个碳原子，其中N代表阶段。甲基是放射性标记试剂，该 试剂带有从1/1-m/l(其中m是选择数)的任何各种比例的3H/14C。 该双放射性标记供精确定量存在于标记中的氚。由于有10个不同的亚烷 基及10个不同的放射性标记比例，便产生1010专用10组份一套的标记。 首先将该标记与活性剂(如与光氯形成氯代甲酸酯)反应，接着与F1- F2成份反应而连接。该情况下F1-F2是邻硝基对羧基苄醇(形成叔丁酯 而被保护)。每进行一个合成步骤，则将脱酯化的鉴定剂直接加入到珠 粒中(所述珠粒有共价键合的胺或羟基)，以与用标准化学法，例如碳 二亚胺偶合法活化的酸形成酰胺或酯。按顺序合成结束后，用各种受体 或酶测定某具体特征而筛选珠粒，然后可分离显示该特征的珠粒，解离 标记并用HPLC分离，得到一系列甘醇单甲醚，然后采用标准放射性同 位素鉴定法分析其放射活性。例如，假定从HPLC柱洗脱出的第一和第 二标记的3H/14C比例分别是5∶1和7∶1，那么显示活性的产物已由第 5号试剂在第一阶段和第7号试剂在第二阶段合成。
                    实施例3 2401肽文库
所用鉴定剂是2-硝基-4-羧基苄基、O-芳基取代的ω-羟基 烷基碳酸酯，其中烷基是3-12个碳原子的烷基，而芳基是(A)五氯 苯基、(B)2，4，6-三氯苯基、或(C)2，6-二氯-4-氟苯基。 该标记称为NAr，其中N是亚甲基数减2，而Ar是芳基。这样，标记 2A有通过氧结合于五氯苯基的亚丁基。本例标记可以很容易地使用电子 俘获气相色谱在约100fmol之量检测。
本例分析中，标记分子按其GC洗脱次序排列。从而，在GC柱上保 留时间最长的标记称为T1，并与二进制合成码号中意义最小的二进制数 字相联系，下一个最长保留标记被称为T2代表下一个最小意义二进制码 数字，如此等等。使用0.2mM×20M甲基硅氧烷毛细管GC柱，获得18 个完好拆分的标记，其中T1-T18分别相应于10A、9A、8A、7A、 6A、5A、4A、3A、6B、2A、5B、1A、4B、3B、2B、1B、 2C和IC。
制备一个2401肽的编码组合文库。该文库有氨基酸顺序N- XXXXEEDLGGGG-珠粒，其中可变的X残基是D、E、I、K、L、 Q或S(单字母码)。4个甘氨酸用作该编码氨基酸顺序和珠粒间的间 隔。该组合文库包括顺序H2N-KLISEEDL，即已知由9E10(一种针 对人C-myc基因产物的单克隆抗体)结合的10氨基酸表位之部份。 为编码该文库，三个二进制码数字足以代表每阶段的七种不同试剂，该 码如下：001＝S、010＝I、011＝K、100＝L、101＝Q、110 ＝E、111＝D。
首先在1.5g 50-90μ聚苯乙烯合成珠粒上制备文库H2NEEDLGGGG -珠粒恒定片段而合成该文库，所述珠粒用1.1meq/g氨甲基，采用基于 叔丁基侧链保护和Fmoc主链保护的标准固相法进行过功能化处理 (Stewart和Young，“Solid Phase Peptide  Synthesis”，2nd edition， Pierce Chemical Co.，1984)。用二乙胺脱去保护基Fmoc基团后，该 珠粒被分成7份，每份200mg，每份放入安装于单活动轴振荡器上的不 同Merrifield合成反应器中。7个反应器中的珠粒按下述方式(见表3- 1)各自独立地加以处理。本例中字母T代表标记或配合标记的鉴定剂。
                                    表3-1 反应器号     步骤1   步骤2     步骤3   步骤4     1  1％T1  DIC，洗 Fmoc(tBu)S，Anh.     洗     2  1％T2     ″ FmocI，Anh.     ″     3  1％T1，T2     ″ Fmoc(Boc)K，Anh.     ″     4  1％T3     ″ FmocL，Anh.     ″     5  1％T1，T3     ″ Fmoc(三苯甲基)Q， Anh.     ″     6  1％T2，T3     ″ Fmoc(叔丁基)E， Anh.     ″     7  1％T1，T2，T3     ″ Fmoc(tBu)D，Anh.     ″
根据上面的方法，列于步骤1中的足量鉴定剂，通过其羧酸，使用 二异丙基碳二亚胺连接，标记相应反应器中每珠粒上约1％的游离氨基 酸，然后各珠粒上其余的游离氨基在第三步与N-保护的氨基酸酐偶 合。用二氯甲烷、异丙醇和N，N-二甲基甲酰胺洗涤之后，将7个反应 器中的珠粒结合并彻底混合。此处，该文库有7个成员。
去Fmoc保护(用二乙胺)之后，珠粒再次分装入7个反应器中，除 了用代表第二阶段的鉴定剂(T4-6)代表前面所用的鉴定剂外，其余 处理同前。再使用鉴定剂T7-9，然后用T10-12以相同之方法重复 该程序另外二次，这样只使用12种鉴定剂，便能制备74＝2401种不同 肽的完整独特的编码文库。
为从单一选择珠上读出合成码，将该珠粒于小离心试管中用每份 100μl DMF先洗四次，然后在Pyrex毛细管中再悬浮于1μl DMF中。 用Rayonet 350nm光源光解2小时之后，用约0.1μl双-三甲基甲硅烷 基乙酰胺，将从结合鉴定剂上释放出的标记进行硅烷基化处理，并将溶 液注射入装配有0.2mM×20M甲基硅氧烷融合二氧化硅毛细管柱，及电 子俘获检测器的Hewlett Packard毛细管气相色谱仪中。从所得标记的 色谱图上直接测定所挑选珠粒的二进制合成码。
                实施例4 苯并二氮杂文库
一种苯并二氮杂组合文库含30种式VIII化合物， 其中：R是CH3、CH(CH3)2、CH2CO2H、(CH2)4NH2、CH2C6H4OH或 CH2C6H5，而
R1是H、CH3、C2H5、CH2CH＝CH2或CH2C6H5
该文库由下面的各反应路线构成：
苯并二氮杂VIII在聚苯乙烯珠上以类似于Bunin和Ellman的方法 (JACS，114，10997-10998[1992])合成，不同之处是珠粒和苯并二氮 杂之间以可光分解接头结合(见步骤A，B和C)。这样，使得苯并 二氮杂在步骤G可通过曝露紫外光下(于DMF中用350nm光照10 分钟至12小时)而以非水解方式释放出。另外，二进码在步骤D和E 引入，供精确测定用于引入6种R基和5种R1基中每一种的反应顺序。 按步骤H移出标记，并用电子俘获检测配合GC分离之后，测定独立的 R和R1基的性质。
步骤D、E、和F基本上遵从Bunin和Ellman的程序，但还包括在 步骤D结合入鉴定剂IXa-c和在步骤E结合入IXd-f。鉴定剂均由式IX代 表： 其中：
IXa表示n＝6；
IXb表示n＝5；
IXc表示n＝4；
IXd表示n＝3；
IXe表示n＝2；和
IXf表示n＝1。
各R和R1的编码如下：
                 表4-1     IX     R     a     CH3     b     CH(CH3)2     a，b     CH2CO2H     c     (CH2)4NH2     a，c     CH2-C6H4-4-OH     b，c     CH2C6H5     IX     R1     d     H     e     CH3     d，e     C2H5     f     CH2CH＝CH2     d，f     CH2C6H5 步骤A
将Fmoc保护的2-氨基-5-氯-4’-羟基-二苯酮(1.3当量) 和二乙基氮杂二甲酸酯(1.3当量)及三苯基膦(1.3当量)加入到化合 物I(1等量)在甲苯(浓度＝0.5M)里的溶液中，该混合物于室温下 搅拌24小时。真空除去溶剂，用乙醚研制残留物并过滤，再次真空除去 溶剂。所得产物II由硅胶色谱提纯。 步骤B
将TFA(3当量)加入到室温搅拌下的化合物II在DCM(0.2M) 里的溶液中，并将该溶液搅拌12小时。将该溶液真空蒸发至干，残留物 溶于DCM中，用盐水洗一次并干燥(Na2SO4)。过滤并蒸发溶剂，得 到III。 步骤C
将1％DVB(二乙烯基苯)交联聚苯乙烯珠(50μ，用氨甲基以 1.1meq/g之量进行过功能化处理)，在肽反应器(Merrifield容器)中 悬浮于DMF中。加入DMF中的III(2当量)和HOBt(3当量)，并 将该反应器振荡10分钟。加入DIC(3当量)，振荡反应器直至水合茚 三酮试验阴性，表示反应完全(12小时之后)为止。
除去DMF，再用DMF(×5)和DCM(×5)洗涤树脂，随后 真空干燥。 步骤D
干燥后的树脂分装入6个反应器中并用DCM配成悬浮液。将鉴定剂 IXa-c专用组(见表4-1)加入到该烧瓶中，并振荡1小时。加入Rh(TFA)2催化剂(1mol％)到每个烧瓶并再振荡2小时。将烧瓶溶剂排干，用 DCM(×5)洗涤树脂。然后再用TFA的DCM溶液(0.01M)处理该 树脂并振荡30分钟。然后再用DCM(×3)，接着用DMF(×2) 洗涤。用20％哌啶的DMF溶液处理树脂并振荡30分钟。然后用DMF (×3)和DCM(×3)洗涤。
每个烧瓶中加入适当的Fmoc保护的氨基酰氟(3当量)(当需要对 侧链功能团加以保护时，便以叔丁酯(ASP)、叔丁醚(Tyr)或叔丁 氧羰基(Lys)的形式保护)及2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶(10当 量)，并将烧瓶振荡过夜，或直至水合茚三酮试验呈阴性为止。将树脂 用DCM洗涤一次，然后将六批结合在一起，并再次洗涤(DCM×5)、 然后真空干燥。 步骤E
将干燥的树脂分装进5个反应瓶中，并悬浮于DCM中，将专用的鉴 定剂IXd-f组(见表4-1)加入烧瓶并振荡1小时。将Rh(TFA)2催化剂 (1mol％)加入各烧瓶并再振荡2小时。排干烧瓶，用DCM(×5) 洗涤树脂。然后用TFA的DCM溶液(0.01M)处理树脂，并振荡30 分钟，然后用DMF(×3)和DCM(×3)洗涤。
每个烧瓶中加入5％乙酸的DMF溶液后，将混合物加热至60℃， 并振荡过夜。排干溶剂，然后用DMF(×5)洗涤树脂。 步骤F
各批树脂悬浮于THF中，各烧瓶冷却至-78℃。各烧瓶中加入锂 化的(lithiated)5-(苯基甲基)-2-噁唑啉二酮(2当量)的THF 溶液，该混合物于-78℃振荡1小时。然后将适当的烷基化试剂(表4 -2)(4当量)加入各反应烧瓶，接着加入催化量的DMF。反应容器 升至室温，并在该温度下振荡5小时。过滤除去溶剂，用THF(×1) 洗涤树脂，然后真空干燥。然后将各批树脂合并在一起用THF(×2) 和DCM(×2)洗涤，随之用95∶5∶10的TFA∶水∶二甲基硫醚混合 物处理该合并的树脂2小时，除去侧链保护基。
                  表  4-2     鉴定剂     烷基化试剂     e     H3CI     d，e     C2H5Br     f     BrCH2-CH＝CH2     d，f     BrCH2C6H5 步骤G
将该珠粒悬浮于DMF中，用U.V.(350nm)照射12小时，可将所 得苯并二氮杂从聚苯乙烯珠上裂解下来。 步骤H
将所研究的珠粒放入玻璃毛细管中，该管中注射入1μl 1M硝酸铈 (IV)铵(CAN)水溶液、1μl乙腈和2μl己烷。将该管于火焰上密 封，然后离心处理，保证该珠粒浸入试剂中。将该管放入超声浴中，超 声处理1-10小时，优选2-6小时。
将该管碎断打开，将约1μl上层己烷层与约0.2μl双(三甲基甲硅烷 基)-乙酰胺(BSA)混合，然后注射入GC仪，各标记成份用电子俘 获检测法测定，如下述反应路线举例说明的一样。
                        实施例5 117649肽文库
制备117649肽编码文库。该文库有顺序H2N-XXXXXXEEDLGGGG -珠，其中可变残基X是D、E、I、K、L、Q或S。该文库使用实 施例3所定义的18个标记编码；三个二进制数足以表示各步骤使用的7 个氨基酸，所述码为：001＝S、010＝I、011＝K、100＝L、101 ＝Q、110＝E、和111＝D，其中1表示标记存在，而0表示标记不 存在。
在1.5g 50-80μ使用1.1mEq/g氨基甲基功能化处理过的Merrifield 聚苯乙烯合成珠上，使用基于叔丁基侧链保护和Fmoc主链保护的标准固 相合成该文库的恒定片段(H2NEEDLGGGG-珠)。用二乙胺除去N- 末端Fmoc保护基之后，珠粒被分成每份200mg共7份，每份被放入安 装于单活动轴振荡器上的不同Merrifield合成器中。
7个反应器中的珠粒按表3-1处理，连接于一组鉴定剂(T1- T3)上，并加入相应的氨基酸到各份中，不同之处在于用异丁基氯代甲 酸酯代替DIC进行活化处理。
该程序是首先将少量专用鉴定剂，借助其羧酸化学连接到合成珠 上。要实现该连接，用异丁基氯代甲酸酯活化接头的羧基成为混合碳酸 酐，然后加入与1％连接于珠粒上的游离氨基之量相当的该活化鉴定剂。 这样，有约1％的游离氨基由加入的各鉴定剂终止。其余的游离氨基按 常规方式与活化成其对称酐的相应保护氨基酸偶合。
洗涤之后，将7份合并，用二乙胺处理去除氨基的Fmoc保护基。珠 粒再次分成7份，如前所述处理之，不同之处是将携带标记T4、T5和 T6的专用鉴定剂加入各反应器中。
使用携带标记T1-T18的鉴定剂，将分份、标记、偶合组合氨基酸 和主链去保护之程序进行总共6次。得到117649种不同成员的编码肽文 库。 典型的鉴定剂制备法
将碳酸铈(1.70g，5.22mmol)加入到8-溴-1-辛醇(0.91g，4.35 mmol)和2，4，6-三氯苯酚(1.03g，5.22mmol)的DMF(5ml)溶 液中，结果放出气体及产生白色固体沉淀。该反应于80℃搅拌2小时。 用甲苯(50ml)稀释该混合物，倒入分离漏斗中，用0.5N NaOH(2 ×50ml)、1N HCl(2×50ml)和水(50ml)洗涤，干燥有机相 (MgSO4)。蒸发除去溶剂，得到1.24g(87％产率)标记，为清澈油 状物。
将上述标记(0.81g，2.5mmol)加入到2M光气的甲苯(15ml)溶 液中，室温下搅拌1小时，蒸发除去过剩的光气和甲苯，所得粗氯代甲 酸酯被溶于DCM(5ml)和吡啶(0.61ml，7.5mmol)中。加入4-羟 基-甲基-3-硝基苯甲酸叔丁酯(Barany和Albericio，J.Am.Chem. Soc.，(1985)，107，4936-4942)(0.5g，1.98mmol)，室温下搅拌反应 混合物3小时。用乙酸乙酯(75ml)稀释该溶液，并倾进分离漏斗中。 用1N  HCl(3×35ml)、饱和NaHCO3(2×35ml)和盐水(35ml) 洗涤之后，有机相被干燥(MgSO4)。蒸发除去溶剂，用硅胶色谱(5％ -7.5％乙酸乙酯的石油醚液洗脱)提纯残留物，得到0.95g(产率79％) 鉴定剂叔丁基酯，为清澈油状物。
将三氟乙酸(3ml)加入鉴定剂叔丁基酯(0.95g，1.57mmol)的 DCM(30ml)溶液中，将接头的酸(即式I的F1-F2)去保护基，该 溶液于室温下搅拌7小时。将混合物蒸发至干并将残留物再溶解于DCM (30ml)中。用盐水(20ml)洗涤溶液并干燥有机相(MgSO4)。蒸 发除去溶剂，得到0.75g(87％产率)鉴定剂(6B)，为浅黄色固体。 (标记命名法与实施例3同)。 典型的编码文库合成步骤
将Nα-Fmoc-E(tBu)-E(tBu)-D(tBu)-L-G4-NH-树脂 悬浮于DMF(20ml)、并振荡2分钟。过滤之后，加入1∶1的二乙胺∶ DMF(40ml)除去Fmoc保护基，树脂再振荡1小时。过滤分离树脂、 并用DMF(2×20ml每次2分钟)、2∶1二噁烷∶水(2×20ml， 5分钟每次)、DMF(3×20ml，每次2分钟)、DCM(3×20ml， 每次2分钟)洗涤，然后于25℃真空干燥(这一阶段用苦味酸滴定，测 出该树脂有0.4mmol/g氨基)。
将每份150mg树脂分别放入7个merrifield容器中并悬浮于DCM (5ml)中。如下述方法将专用鉴定剂活化为其碳酰酯形式(供第一次 偶合用)：将T1(6.6mg，0.0098mmol)溶解于无水乙醚(2ml)中， 并加入吡啶(10μl)。氯代甲酸异丁酯(1.3μl，0.0096mmol)以其无水 乙醚(0.1ml)的溶液形式加入。所得混合物于25℃搅拌1小时，此时 形成白色细小沉淀。停止搅拌，使沉淀沉积30分钟。T2和T3的碳酰酯 溶液以同样方法制得。各经活化的鉴定剂上清液按等分量(0.25ml)混 合得到专用的3位数二进制标记码，并将鉴定剂的专用编码混合物加入 到七个合成反应器的每一个中。该反应器在黑暗中振荡12小时，然后各 自用DCM(4×10ml，每次2分钟)洗涤。将Nα-Fmoc氨基酸对 称酐的DCM溶液(3当量于10ml中)加入相应的各批编码树脂中，并 振荡20分钟。加入5％N，N-二异丙基乙胺的DCM(1ml)溶液，该 混合物振荡直至该树脂的Kaiser试验为阴性止。
将各批树脂过滤并合并，然后用DCM(4×20ml，每次2分钟)、 异丙醇(2×20ml，每次2分钟)、DCM(4×20ml，每次2分钟) 洗涤。下一个标记/偶合循环如上所述从脱Fmoc保护基开始。
肽的最后位置处的残基脱Fmoc保护基之后，将树脂悬浮于DCM (10ml)，加入苯硫基甲烷(2ml)、乙二硫醇(0.5ml)和三氟乙酸 (10ml)，然后于25℃振荡1小时，从而除去侧链官能团保护基。用 DCM(6×20ml，每次2分钟)洗涤树脂，并干燥之。 电子俘获气相色谱读码
将单个挑选出的珠粒放于Pyrex毛细管，并用DMF(5×10μl)洗 涤，然后将珠粒悬浮于DMF(1μl)中，并将毛细管密封。用366nm光 照射该悬浮珠粒3小时，释放出标记醇，随后将该毛细管放入90℃砂浴 中2小时。打开毛细管加入双-三甲基甲硅烷基乙酰胺(0.1ml)，使 该标记醇进行三甲基甲硅烷基化。离心2分钟后，该珠粒上面的标记溶 液(1μl)直接注射入电子俘获检测的毛细管气相色谱仪中分析。该气 相色谱分析使用装配0.2mm×20m甲基硅氧烷融合二氧化硅毛细管柱， 及电子俘获检测器的Hewlett Packard Series II Model 5890气相色 谱仪进行。光分解反应用UVP“Black Ray”model UVL 56手持式 366nm灯进行。 抗体亲和性法
按Evans等人(Mol.Cell  Biol.，5，3610-3616(1985)及Munro 和Pelham(Cell，48，899-907(1987))所述，从腹水液制备抗-C -myc肽单克隆抗体9E10。为试验珠粒与9E10的结合情况，将珠粒在 含1％牛血清白蛋白(BSA)的TBST〔20mM Tris-HCl(pH7.5)， 500mM NaCl和0.05％Tween-20〕中培养，阻隔非特异性蛋白结 合位点。然后将珠粒离心处理后，悬浮于1∶200 TBST+1％BSA稀释 的9E10脱水液中并培养过夜(4℃)。然后在TBST中将珠粒洗3次， 并于室温下，在碱性磷酸酶偶合的山羊抗鼠IgG抗体(Bio-Rad Laboratories)中，培养90分钟，按1∶3000之比用TBST+1％BSA 稀释。在TBST中洗珠粒两次后，再在磷酸酶缓冲液(100mM  Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl和5mM MgCl2)中洗1次，在含各百分 之一份的AP“彩色试剂”A&B(Bio-Rad  Laboratories)的磷酸 酶缓冲液中，室温下将该珠粒培养1小时。为中止反应，用20mM钠 EDTA、pH7.4洗珠粒两次。采用修改的Harlow等人(Antibodies：a Laboratory Manual，507-573，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)所述竞争ELISA测试法，测定9E10和各种肽之 间的溶液相亲和性。
从30mg肽组合文库样品中，鉴定暴露于抗-C-myc单克隆抗体 染色的40个独立的珠粒。将呈阳性反应的珠粒解码，确定作为myc表位 (EQKLISEEDL)的配位体的反应顺序，或三个N-末端残基中有一个 或二个取代基之差的顺序。
                    实施例6 23540625混合酰胺文库
该编码技术进一步通过制备由肽和其它酰胺化合物组成的23540625 个成员的组合文库而加以试验。
该合成在5个步骤中使用15种不同试剂，并在第6步中用31种不 同试剂而完成。带15种试剂的5个步骤每步各用4种鉴定剂编码，而于 带31种试剂的最后一步中用5种鉴定剂。预先制备25种鉴定剂的标记 组。采用2-硝基-4-羧酸苄基，O-芳基取代的碳酸ω-羟基烷基 酯鉴定剂，其中标记成份由3-12个碳原子的烷基部份组成，而芳基部 份是(A)五氯苯基，(B)2，4，5-三氯苯基，(C)2，4，6-三氯 苯基，或(D)2，6-二氯-4-氟苯基。25个标记的一组，分别用带 上述A、B、C、D的专用链长烷基来制备，可采用0.2mM×25M甲 基硅氧烷GC柱来分离。标记T1-T25(其中T1代表保留时间最长的 标记，而T25则代表保留时间最短之标记)的化学组合归纳如下：   T1    10A   T6    10C   T11    7B   T16    5C   T21    2B   T2    9A   T7    9B   T12    7C   T17    4B   T22    2C   T3    8A   T8    9C   T13    6B   T18    4C   T23    1B   T4    7A   T9    8B   T14    6C   T19    3B   T24    1C   T5    10B   T10   8C   T15    5B   T20    3C   T25    2D 所谓10A，9A等的意义如实施例3所述。
前面五步所用15种试剂及其鉴定码列于下表，其中“1”代表标记 “存在”，而“0”表示该标记不存在。     试剂     码号     L-丝氨酸     (0001)     D-丝氨酸     (0010)     L-谷氨酸     (0011)     D-谷氨酸     (0100)     L-谷氨酰胺     (0101)     D-谷氨酰胺     (0110)     L-赖氨酸     (0111)     D-赖氨酸     (1000)     L-脯氨酸     (1001)     D-脯氨酸     (1010)     L-苯基丙氨酸     (1011)     D-苯基丙氨酸     (1100)     3-氨基-苯甲酸     (1101)     4-氨基苯乙酸     (1110)     3，5-二氨基苯甲酸     (1111) 第6步所用31种试剂及其各自代表的码号列于下面：     试剂     码号     L-丝氨酸   (00001)     D-丝氨酸   (00010)     L-谷氨酸   (00011)     D-谷氨酸   (00100)     L-谷氨酰胺   (00101)     D-谷氨酰胺   (00110)     L-赖氨酸   (00111)     D-赖氨酸   (01000)     L-脯氨酸   (01001)     D-脯氨酸   (01010)     L-苯基丙氨酸   (01011)     D-苯基丙氨酸   (01100)     3-氨基苯甲酸   (01101)     4-氨基苯乙酸   (01110)     3，5-二氨基苯甲酸   (01111)     琥珀酸酐   (10000)     惕各酸   (10001)     2-吡嗪甲酸   (10010)     (±)硫辛酸   (10011)     1-哌啶丙酸   (10100)     胡椒基酸   (10101)     6-甲基烟酸   (10110)     3-(2-噻吩基)丙烯酸   (10111)     碘甲烷   (11000)     甲苯磺酰氯   (11001)   对甲苯磺酰基异氰酸酯   (11010)     3-氰基苯甲酸   (11011)     邻苯二甲酸酐   (11100)     乙酸酐   (11101)     氯代甲酸乙酯   (11110)     甲磺酰氯   (11111)
使用标准方法在珠粒上制备6个甘氨酸单元的间隔基。使用丁基侧 链保护构建可变区，而氨基作为Fmoc衍生物而受保护。以DIC和HOBt 活化羧酸而形成酰氨键。
                    实施例7 杂-Diels-Alder文库
包含下式42种化合物的组合杂-Diels-Alder文库： 其中； R1是H，CH3O，F3C，F3CO，H5C6O，或C6H11； R2是H，CH3，或CH3O； R3是H(当n＝2)，或CH3(当n＝1)；和  R＝H或Cl或  由下述每种反应路线而构建： 氮杂三环产物(VI)在聚苯乙烯珠上构成，由通过紫外光(350nm， DMF中)曝光即能使该氮杂三环(VII)从珠粒上移出的可光裂解接头， 将其连于珠粒中。步骤C、D和E引入的二进制码供专一的测定使ArR、 R1、R2和R3引入的反应顺序。按步骤G移出编码标记，并由配合GC 分离的电子俘获检测法进行分析。
用于本例反应路线中的鉴定剂由式X代表， 其中：
Xa表示n＝10
Xb表示n＝9
Xc表示n＝8
Xd表示n＝7
Xe表示n＝6
Xf表示n＝5
Xg表示n＝4
各R、R1、R2、R3的码如下：
                    表7-1 a，b      c          R1＝H       R2＝H d          R1＝H       R2＝CH3 d，c       R1＝OCH3   R2＝OCH3 e          R1＝CF3    R2＝H e，c       R1＝C6H5O R2＝H e，d       R1＝F3CO   R2＝H e，d，c    R1＝C6H11 R2＝H f          R3＝CH3    n＝1 g          R3＝H       n＝2 步骤A
以30分钟时间，于0℃，搅拌下，在化合物I(2.03g，8mmol)、 4-羟基苯甲醛(1.17g，9.6mmol)和三苯基膦(2.73g，10.4mmol)的 甲苯(20ml)溶液中加入二乙基氮杂二甲酸酯。使该溶液升温，达到室 温后即搅拌1小时。真空除去约一半溶剂而使该溶液浓缩，并随后用乙 醚研制。过滤该混合物，用乙醚彻底洗涤该残留物。真空除去溶剂，用 硅胶色谱(15％的乙酸乙酯己烷洗脱)提纯该残留物，得到1.3g醚化合 物IIa(47％产率)。
以相似的方式使2-氯-4-羟基苯甲醛和2-羟基-1-萘甲醛 与式I化合物偶合，得到醚IIb和IIc，产率分别为91％和67％。 步骤B
醚IIa(0.407g，1.14mmol)的DCM(20ml)溶液于搅拌、室温下 加入TFA(8ml)中。将该溶液搅拌6小时，将其真空蒸发至干，得到 0.343g酸化合物IIIa(产率100％)。用相似方法将醚IIb和IIc去保护， 也得到酸IIIb和IIIc，产率分别为92％和100％。 步骤C
将以氨甲基(1.1meq/g)功能化的1％DVB(二乙烯基苯)交联 的聚苯乙烯珠(50-80μ，200mg树脂)计量加入肽反应器(Merrifield 反应器)中。该树脂悬浮于DMF(2ml)中并振荡20分钟。加入酸IIIa (38mg，2当量)、1-羟基苯并三唑(40mg，2当量)和二异丙基 碳二亚胺(38mg，2当量)，振荡该混合物直至水合茚三酮试验呈阴性 为止(22小时)。过滤除去溶液，用DCM(8×10ml)洗涤树脂。
该树脂悬浮于DCM(5ml)中，加入鉴定剂Xa(15mg)并将烧 瓶振荡1小时。加入Rh(TFA)2催化剂(1mol％)，并再将该烧瓶振荡2 小时。过滤除去溶剂，树脂再悬浮于DCM(5ml)中。加入三氟乙酸 (1滴)，反应器振荡20分钟。过滤除去溶剂，用DCM(8×10ml) 洗涤树脂。
以相似方式，将酸IIIb和IIIc连接于树脂上，并用专用的鉴定剂(即 Xb用于酸IIIb，而Xa和Xb用于酸IIIc)编码。将三批树脂合并、混合、 洗涤及干燥。 步骤D
将干燥树脂分成7等份(87mg)，放进7个用加热带包裹的肽反应 器(Merrifield反应器)中。各反应器树脂均悬浮于甲苯(10ml)中并 振荡20分钟。然后各烧瓶中加入适量的一种苯胺(见表7-2)。
                  表7-2     烧瓶     苯胺   加入量     1     苯胺     3ml     2     3，5-二甲基苯胺     3ml     3     3，4，5-三甲氧基苯胺     2g     4     4-三氟甲基苯胺     3ml     5     4-苯氧基苯胺     2g     6     4-三氟甲氧基苯胺     3ml     7     4-环己基苯胺     2g
接上加热带，使反应混合物于70℃振荡18小时。解下加热带并过 滤除去溶剂，各批树脂用无水DCM(4×10ml)、乙醚(10ml)、 甲苯(10ml)和DCM(2×10ml)洗涤。再将每份悬浮于DCM(5ml) 中，各烧瓶中分别加入专用的鉴定剂或鉴定剂(Xc-e)(15mg)组(见 表7-1)。将烧瓶振荡1小时，然后各瓶中加入Rh(TFA)2(1mol％)， 再连续振荡2小时。
然后除去溶剂，各批树脂再悬浮于加有TFA(1滴)的DCM(5ml) 中。该混合物振荡20分钟，然后过滤除去溶剂。洗涤各批树脂(DCM， 1×10ml)并合并，再用DCM(3×10ml)洗涤，随后真空彻底干燥。 步骤E
将干燥树脂分成2等份(0.3g)，分别放入肽反应器中。用DCM (2×10ml)洗涤各批树脂，然后再悬浮于DCM(5ml)中。一个瓶 中加入鉴定剂Xf(15mg)，而另一个中加入Xg(15mg)。两烧瓶振 荡1小时，然后加入Rh(TFA)2催化剂(1mol％)。振荡烧瓶2小时， 然后过滤除去溶剂。用DCM(3×10ml)洗涤各批树脂，然后再将各 批悬浮于DCM(5ml)中。
将适当的烯醇醚(1ml)(见表7-1)加入到各烧瓶中，并将其 振荡30分钟。各烧瓶中加入BF3·OEt2溶液(0.5ml的5％DCM溶液)， 再振荡24小时。过滤除去溶剂，接着用DCM(10ml)洗涤树脂，然 后将树脂合并。然后再用DCM(5×10ml)、DMF(2×10ml)、 甲醇(2×10ml)和DCM(2×10ml)洗涤珠粒。然后真空彻底干 燥树脂。 步骤F
为确切鉴定杂-Diels-Alder文库生产的产物，以大规模完成一个 典型例供以光谱手段证实其结构。所遵循程序基本上与结合文库所述方 法相同。在步骤A，将4-羟基苯甲醛偶合到可光解基团上。在步骤D， 苯胺与醛缩合，在步骤E，与4，5-二氢-2-甲基呋喃形成烯醇醚。
化合物(步骤F)的光解，通过将珠粒100mg悬浮于DMF(0.3ml) 中并用UVP“Black Ray”model UVL56手持366nm灯照射该珠粒 16小时而完成。用吸液管将DMF移出，用新的DMF(2×3ml)漂洗 该珠粒。将原始溶液和漂洗液合并，真空除去溶剂。NMR分析反应混合 物，与可信样品比较，表明其含有所需氮杂三环化合物。 步骤G
将要研究的珠粒放入-端密封的Pyrex玻璃毛细管中。将1M硝酸铈 (IV)铵水溶液和乙腈(1∶1)的溶液注射进管中，然后离心处理该 管，以使珠粒沉入毛细管底部，并完全被试剂溶液浸没。注射加入己烷 (2μl)，并再次离心处理该管。该毛细管的开口端用火焰密封，放入 超声浴4小时。然后该毛细管插入离心器旋转，以使水层强制通过己烷 层到管的底部。将该提取过程重复3或4次，然后打开该管。用注射器 移出己烷层(1.5μl)并放入含BSA(0.2ml)的不同毛细管中，将该 管密封，离心处理直至试剂彻底混合为止。取出一份溶液(约1μl)， 注射入配有25M×0.2mM甲基硅氧烷融合二氧化硅柱和电子俘获检测 器的气相色谱化，分离及解释标记分子。
于200℃和25psi载气(He2)的条件下将样品注射入GC柱。1分 钟之后，按每分钟升20℃的速度将温度升至320℃，而压力则按每分钟 升2psi的速度升至40psi。这些条件由下图表示： 随意挑选四个珠粒获得下面之结果：
                     珠粒1               被检测的TAG     Xf   Xe  Xd  Xc     Xb  Xa   Ar     2-羟基萘基   R1     C6H11   R2     H   R3  CH3(n＝1)
                            珠粒2                    被检测的TAG     Xg   Xe  Xd  Xc     Xb   Ar   2-氯-4-羟基苯基   R1     C6H11   R2     H   R3   H(n＝2)
                    珠粒3             被检测的TAG     Xg     Xe  Xd     Xb  Xa   Ar     2-羟基萘基   R1     F3CO   R2     H   R3   H(n＝2)
                            珠粒4                  被检测的TAG     Xf     Xe  Xd     Xb   Ar   2-氯-4-羟基苯基   R1     F3CO   R2     H   R3  CH3(n＝1)
                    实施例8 苯并二氮杂文库
遵循实施例4的程序，构建式X的组合文库。 其中
R是天然存在的D或L氨基酸基团；
R1是H、C1-C6烷基、低级链烯基、C1-C6烷胺、羧基C1-C6 烷基、或苯基C1-C6烷基，其中苯基由低级烷基、F、Cl、Br、OH、 NH2、CO2H或O-低级烷基任意取代(或未取代)；
R2是H或CO2H；
R3是H或OH；
R4是H或Cl；
其前提条件是若R3是OH，则R2是H，而若R2是羧基，则R3是H。
该文库由如下通式的许多编码珠粒上释放： 其中
IXn是式Ia的多种鉴定剂，其中所述“多种”代表一种编码方案；
S是基质；
F1’-F2是式Ia接头元件的残基；而
R、R1、R2和R4与式X中定义相同。
                  实施例9 典型的鉴定剂制备法
现举例说明通过形成碳双键连接于树脂上的重氮化合物鉴定剂的制 备。通式如下的化合物： 其中
n是0-10；而
Ar是五氯苯酚、2，4，6-三氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、或2，6- 二氯-4-氟苯酚，其制备方法如下：
在1-羟基-4-(2，6-二氯-4-氟苯氧基)丁烷(0.38g，1.5 mmol)、异香草醛(0.228g，1.5mmol)和三苯基膦(0.393g，1.5mmol) 的THF(8ml)溶液中加入二乙基氮杂二甲酸酯(0.287g，1.7mmol)。 该溶液于室温下搅拌36小时。真空除去溶剂，用硅胶色谱(20％乙酸 乙酯和80％石油醚的混合物为洗脱剂)将残留物提纯，得到0.45g醛化 合物(产率77％)。
该醛(100mg，0.26mmol)溶于丙酮中(8ml)，用KMnO4(61mg， 0.39mmol)的丙酮(4ml)和水(4ml)溶液处理。反应物于室温搅拌 13小时。用乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)稀释该混合物并分层。 再加乙酸乙酯(2×100ml)提取水层，合并的有机层用水(50ml)洗 涤并干燥(MgSO4)。除去溶剂，得到109mg苯甲酸化合物(产率93％)。
该酸(76mg，0.188mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液用草酰氯(36mg， 0.28mmol)和催化量DMF处理。室温下搅拌10分钟后，观察到缓慢但 稳定的释放出气体来。继续搅拌2小时，同时用DCM(15ml)稀释溶 液，并用饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)洗涤。分层，干燥有机层(Na2SO4) 并蒸发溶剂，得到苯甲酰氯化合物，为浅黄色晶体。
将苯甲酰氯溶于二氯甲烷(5ml)中，并加入到搅拌着的过剩重氮 甲烷的乙醚溶液(-78℃)中。使冷却浴温度升高，使该混合物于室温 下搅拌5小时。真空除去溶剂和过剩的重氮甲烷，采用硅胶色谱以梯度 洗脱法提纯残留物，其梯度洗脱液为10％-40％的乙酸乙酯在己烷中 的溶液，得到48mg重氮化合物(产率60％)。 通式如下的化合物： 其中
n是0-10；而
Ar是五氯苯酚，2，4，6-三氯苯酚，2，4，5-三氯苯酚，或2，6- 二氯-4-氟苯酚， 其制备如下：
将香草酸甲酯(0.729g，4.0mmole)、1-羟基-9-(2，3，4，5，6 -五氯苯氧基)壬烷(1.634g，4.0mmole)、和三苯基膦(1.259g，4.8 mmole)于氩气下溶解于20ml无水甲苯中。滴加入DEAD(0.76ml， 0.836g，4.8mmole)，并将该混合物搅拌(25℃)1小时。将该溶液浓 缩至一半体积，采用快速色谱，以DCM洗脱将其提纯，得到1.0g(1.7 mmole，43％)产物，为白色晶状固体。
将上述甲酯(1.0g，1.7mmole)溶于50ml THF中，加入2ml水接 着加入氢氧化锂(1.2g，50mmole)。该混合物于25℃搅拌1小时，然 后回流5小时。冷却至25℃之后，将该混合物倾入乙酸乙酯(200ml) 中，溶液用1M HCl(50ml×3)，然后用饱和NaCl(1×50ml) 水溶液洗涤，用硫酸钠干燥。除去溶剂且酸粗产物与甲苯共沸一次。
将上述粗产物溶于100ml甲苯，加入10ml(1.63g，14mmole)亚 硫酰氯，将该混合物回流90分钟。蒸馏使该溶液体积减至约30ml，然 后真空蒸发除去其余甲苯。将该酰氯粗品溶于20ml无水DCM中，氩气 下冷至-78℃，加入约10mmole重氮甲烷的50ml无水乙醚溶液。混合 物升至室温，并搅拌90分钟。通过溶液充入氩气10分钟，然后真空蒸 发除去溶剂，采用以10-20％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱的快速色谱提 纯该粗产物。获得重氮酮化合物(0.85g，1.4mmol，三步得82％产率)， 为浅黄色固体。
如上所述制备下述鉴定剂： 可光裂解
制备下式的50种鉴定剂 其中  ：
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。 氧化裂解I型
制备下式7种鉴定剂 其中： Ar是   
n是4、5、6、7、8、9和10。 氧化裂解II型
制备下式13种鉴定剂 其中： Ar是  
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；并且其中 3Ar是 且n是0、3和9。
                        实施例10 由质谱可读的标记编码的组合文库
将有相同结构，但由于氘取代不同而分子量各异的标记4、11和13 (反应路线8)分别合成(反应路线9和10)，并用质谱(MS)分开 分析。MS技术中，正化学电离质谱(PCIMS)给出标记的最小片段， 这样仅有分子离子([M+NH4]+)，和一个其它片段([MH-H2O]+) 是明显的(图1、2和3)。这实际使得标记的存在或不存在，可通过 观察两个信号来确定，这就消除了当分析更为复杂的混合物时可能出现 的不明确性。将近似等量的三个标记混合并用PCIMS分析(图5)，再 次看出，相应于各分离标记的二个信号可很容易区分。
现将标记4转化成重氮酮前体8(反应路线9)，然后连接到称之 为9的Tentagel树脂上(反应路线12)。随后将9的一个珠粒移出，并 使用硝酸铈铵氧化释放出4。PCIMS分析再次清楚地表示有标记4存 在。
综上所述，标记4、11和13组成的有相同结构，但分子量不同的 一组被合成。用PCIMS在混合物中均很容易同时检测出所有各标记。从 用于组合文库合成的单个Tentagel树脂珠粒上释放的少量4，由PCIMS 可检测出。MS是对标记的有效且灵敏的检测法，可用作编码组合文库 方案的基础。
采用PCIMS分析4、11和13是使用1％NH3在甲烷中的气体混合 物试剂完成的。
(2).在11.1ml(125mmol，5.00g)1，4-丁二醇(1)、6.97ml (50.0mmole，2.00当量)Et3N和0.153g(1.25mmol，0.05当量)4- 二甲基氨基吡啶的无水CH2Cl2(100ml)溶液中，于0℃氩气下加入3.88g (25.0mmol，1.00当量)97％叔丁基二甲基甲硅烷基氯。新的溶液于 0℃搅拌15分钟，然后于25℃搅拌16小时。然后用CH2Cl2(250ml) 稀释反应物，并用1M HCl(100ml)，饱和NaHCO3水溶液(100ml)， 和H2O(100ml)洗涤，再干燥(MgSO4)。真空除去挥发物，得到粗 产物2，为油状物。
(3).在～10.0mmol粗产醇2，1.93g(10.5mmol，1.05当量) 五氟苯酚和2.89g(11.0mmol，1.10当量)三苯基膦的无水CH2Cl2(40ml)溶液中，于0℃通氩气下加入1.73ml(11.0mmol，1.10当量) 氮杂二甲酸二乙酯。将所得橙色溶液于0℃搅拌5分钟，然后在25℃搅 拌15小时。后用CH2Cl2(250ml)稀释反应物，并用饱和Na2CO3水溶 液(100ml)、饱和NH4Cl水溶液(100ml)和水(100ml)洗涤，然 后干燥(MgSO4)。真空除去挥发物，用快速色谱(0-20％EtOAc的己烷液)提纯，得到产物3，为油状物。
(4).在1.85g(5.00mmol，1.00当量)经甲硅烷基保护的醇3 的THF(20ml)溶液中，25℃下加入10.0ml(10.0mmol，2.00当量) 1.0M四丁基氟化铵的THF溶液。将所得橙色溶液于25℃搅拌4小时。 真空除去挥发物，用快速色谱提纯(20-40％EtOAc的己烷液)，得 到1.10g(86％)产物4，为油状物。
(5).在0.800g(3.125mmol，1.00当量)醇4、0.569g(3.125 mmol，1.00当量)香草酸甲酯、和0.984g(3.75mmol，1.20当量)三苯 基膦的无水CH2Cl2(20ml)溶液中，于0℃通氩气下加入0.59lml(3.75 mmol，1.20当量)氮杂二甲酸二乙酯。新得浅黄色溶液于0℃搅拌5分 钟，然后于25℃搅拌19小时。然后用CH2Cl2(100ml)稀释该反应物， 并用1M NaOH(50ml)、饱和NH4Cl水溶液(50ml)、和H2O(50ml) 洗涤、尔后干燥(MgSO4)。真空除去挥发物，用快速色谱提纯(20％ EtOAc的己烷液)，得到产物5，为油状物。
(6).在3.1 25mmol产物5酯化合物的THF(12ml)溶液中， 加入1.31g(31.3mmol，10.0当量)氢氧化锂单水合物。新得悬浮液中 加入MeOH(24ml)形成溶液，将其于25℃搅拌1小时，然后回流1 天。真空除去挥发物，然后加入1M HCl直至该溶液pH约为1止。收 集形成的白色沉淀产物，干燥，得到0.968g(二步产率76％)产物6。
(7).在羧酸6(0.968g，2.38mmol，1.00当量)中，通氩气下加 入2.43ml亚硫酰氯。将新得悬浮液回流1.5小时，之后形成黄色溶液。 真空除去挥发物，所得残留物与甲苯共沸三次，得到产物7，为无色晶 体。
(8).在2.38mmol酰氯7的1∶1 THF：MeCN(20ml)溶液中， 于0℃通氩气中，加入1.16ml(8.33mmole，3.50当量)Et3N，接着加 入3.57ml(7.14mmol，3.00当量)2.0M(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷 的己烷溶液。所得黄色溶液于0℃搅拌1小时，尔后于25℃搅拌1天。 用EtOAc(150ml)稀释反应物，用饱和NaHCO3水溶液(2×75ml) 和饱和NaCl水溶液(2×75ml)洗涤，然后干燥(MgSO4)。真空除 去挥发物，得到粗产物8，为油状物。
(11).使用市售1，4-丁二醇-2，2，3，3-d4(10)代替1， 用将1转化为4所述类似程序，获得产物11，三步产率41％。
使用市售1，4-丁二醇-2，2，3，3，4，4-d8(10)代替1，并用 将1转化为4所述类似程序，获得产物13，三步产率42％。
使用5-50％(w/w对树脂)前体重氮酮8将标记4引入固体载体， 用基本上与实施例4相同之方法得到9，即杂Diels-Alder文库。并用 实施例4步骤G基本相同之方法，随后将标记4从9中除去。
采用与标记11和13相应的重氮酮，将这些标记引入固体载体，以 便同8一起，这些重氮酮产生一组二进制编码元件。
                 反应路线8
                  4                 M.W.＝256
                  11                  M.W.＝260
                  13                  M.W.＝264
                   反应路线9
                   反应路线10
                    反应路线11
制备氘化标记
在PPh3(3.2g，12.1mmol)的THF(30ml)溶液中，于0℃加入 氮杂二甲酸二乙酯(1.9ml，12mmol)。10分钟后，于0℃加入4-羟 苯基乙酸甲酯(1.66g，10mmol)和d5-乙醇(800μl，12.3mmol)的 10ml THF溶液。25℃搅拌2小时后，浓缩反应混合物，并用快速色谱 提纯，得到4-d5乙氧基苯基乙酸甲酯(1.86g，93％)，为无色油状物。
在4-d5乙氧基苯基乙酸酯(1g，5mmol)的无水乙醚溶液中，于 0℃加入氢化铝锂(380mg，10mmol)。于25℃搅拌8小时后，将反应 混合物倾入冷3M HCl中。然后用乙醚提取该水溶液二次。合并有机层， 用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。除去溶剂，得到4-d5乙氧基苯乙醇 (850mg，100％)，为白色固体。 H1 NMR(CDCl3)2.79(2H，t，J＝6.6Hz)，3.80(2H，t，J＝6.5Hz)，6.83(2H， d，J＝8.6Hz)，7.12(2H，d，J＝8.6Hz)。
在4-d5乙氧基苯基乙酸酯(800mg，4mmol)的无水乙醚溶液中， 于0℃加入氘化铝锂(340mg，8mmol)。25℃下搅拌8小时之后，将 该反应混合物倾入冷3M HCl中。然后用乙醚提取水溶液两次、合并有 机层，用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。除去溶剂得到4-d5乙氧基d2 -苯乙醇(680mg，98％)，为白色固体。
H1 NMR(CDCl3)2.79(2H，s)，6.85(2H，d，J＝8.5Hz)，7.13(2H，d，J＝ 8.5Hz)。
反应路线12给出了一张表，该表中列出由横向栏的化合物与相应的 竖向栏化合物结合所形成的7种不同的标记。
                     反应路线12
评价d-7或d-5氘样品
为满足灵敏度的要求，该两样品于室温、使用衍生剂双(三甲基甲 硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)定量地形成三甲基甲硅烷基酯而进行衍 生处理30分钟。室温下通N2(g)气流除去试剂和溶剂。再用乙酸乙 酯溶解样品，注射入柱中用正化学电离质谱分析。d-7和d-5成份 不可能在GC上分离，但当使用Hewlett-Packard  GC/MS，以约20ng 之量注射入柱中时，质谱可测定两种成份存在的比例。对于衍生d-5 和d-7样品的质谱而言，图6中所观察到的(M+NH4)+离子表明 d-7的m/z＝263，而d-5的m/z＝261，这与计算结果相符。对乙 氧基苄基阳离子的片断也在图6中观察到，d-7的m/z＝156，而d -5的m/z＝154。假如使用更为灵敏的JEOL SX-102高分辨质谱， 其灵敏度可以提高到只注射1ng或更少。JEOL SX-102比Hewlett -Packard体系灵敏度要高两个数量级。图6表示证明由于衍生作用色谱 图得到改善后的光谱和色谱图。图5表示仅有未衍生d-7样品的质谱 和色谱图。
从上面的介绍很清楚看出，本发明提供一种通用，简单的鉴定化合 物的方法，其中存在的化合物的量排除了任何能获取测定其反应历程的 保证。本发明能生产非常大量的不同产物，可用各种筛选技术测定感兴 趣之物的生物学及其它活性。使用操作条件下化学惰性的标记，提供了 在各种环境下，采用各种合成技术，生产感兴趣之产物的极大适应性。 所述标记可以很容易合成，并能精确地分析，使之能精确定义组合物之 性质。
本说明书所摘录的所有公开文献及专利申请均列入本文作为参考， 正如曾在具体和个别地方表示过的将各文献及各专利列为参考一样。
虽然为清楚了解之目的，本发明前面已通过描述和举例作过详细介 绍，但很明显，对本领域普通技术人员来说，根据本发明的指数，可以 作出某些改变和修正，而并不偏离所附权利要求书的精神和范围。
本申请是1994年4月13日递交，流水号08/227,007的美国申请之 后续部份，因此，其内容列入该主申请作为参考。