糖水解物可用于微生物生产多种多样的精细化学品或生物聚合 物，诸如有机酸，例如乳酸，或乙醇或其它醇，例如正丁醇、1，3-丙二 醇或聚羟基链烷酸酯(PHA)。糖水解物亦可作为其它例如用于富集、 分离及纯化高价值糖的非微生物方法或许多聚合方法的原料。糖水解 物的主要用途之一是生产生物燃料。生物乙醇和/或其它化学品的生产 可能发生于生物炼制的一体化工艺中(Wyman 2001)。
化石燃料的资源有限，及其所释放的二氧化碳量增加并导致温室 现象，唤起了使用生物质作为可再生和清洁的能源来源的需求。从纤 维素材料生产生物燃料即乙醇是一种有前景替代技术。生物燃料是目 前运输业的唯一选择，其可以数量级减少二氧化碳的排放。乙醇可用 于现行的交通工具及配送系统，因此毋须昂贵的基础设施投资。源自 木质纤维素再生性原料的糖亦可用作各种各样可取代油基化学品的化 学产品的原料。
植物中大部分碳水化合物是木质纤维素的形式，木基本上由纤维 素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)、果胶(pectin)及木质素 (lignin)组成。在木质纤维素到乙醇的方法中，木质纤维素材料首先经 化学或物理预处理，使纤维素成分更容易水解。接着纤维素部分被水 解以得到可经酵母菌发酵成为乙醇的糖。木质素是得到的主要副产品， 其可用作固体燃料。
生物乙醇的生产成本高且其能量输出低，是该方法更经济的研究 仍在持续进行中。酶法水解被认为是将纤维素生物质转换成可发酵糖 的最有前景的技术。然而，酶法水解在工业规模中仅被有限地被利用， 特别是当利用高度木质化的材料如木材或农业废弃物时，该项技术不 令人满意。酶法步骤的成本是该方法的主要经济因素的一。已经作出 许多努力以改善纤维素材料酶法水解的效率(Badger 2002)。
US2002/0192774A1描述用于转换固体木质纤维素生物质成为可 燃烧的燃料产物的连续方法。经湿式氧化或汽爆的预处理后，该生物 质被部份分离成为纤维素、半纤维素及木质素，然后利用一或多种碳 水化合酶(EC3.2)进行部份水解。CelluclastTM，Novo Nordisk A/S公 司的商品，含有纤维素酶及木聚糖酶活性，被提供作为范例。
US2004/0005674A1描述可直接用于木质纤维素底物上的新颖酶 混合物，从而可以避免预处理过程中形成的毒性废弃物并可以节省能 源。该增效的酶混合物包含纤维素酶及辅助酶如纤维素酶、木聚糖酶、 木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖醛酸酶或其任何组合物。 考虑的纤维素酶包含内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)及纤 维二糖水解酶(CBH)。该实施例说明木霉木聚糖酶及纤维素酶制剂 的混合物的用途。
Kurabi等人(2005)研究了以新颖及商品化的真菌纤维素酶来酶 法水解经汽爆及乙醇有机溶剂预处理的花旗松。他们测试了两种商品 化的里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制剂及两种由木霉属 (Trichoderma sp.)及青霉属(Penicillium sp.)的突变菌株产生的新颖 制剂。木霉属制剂相较于其它制剂显示显著更好的表现。更好的表现 至少有部分被认为是由于显著较高的β-葡萄糖苷酶活性所致，其减轻 纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶的产物抑制。
US2004/005 3373 A1是关于一种将纤维素转换成葡萄糖的方法， 通过以包含纤维素酶及经修饰的纤维二糖水解酶I(CBHI)的酶混合 物处理经预处理的木质纤维素底物。该CBHI已通过灭活其纤维素结合 结构域(CBD)加以修饰。CBHI修饰的优点为例如高底物浓度下较好 的回收及较高的水解率。纤维素酶选自EG、CBH及BG。优选CBHI 得自木霉菌。
US2005/016 4355 A1描述了在至少一种表面活性剂存在时，以一 或多种纤维分解酶分解木质纤维素材料的方法。其它的酶诸如半纤维 素酶、酯酶、过氧化物酶、蛋白酶、漆酶(laccase)或其混合物亦可以 使用。表面活性剂存在相较于表面活性剂不存在，可增加木质纤维素 材料的分解。纤维分解酶可以是任何参与木质纤维素分解的酶，包括 CBH、EG及BG。
有大量文献公开了各种纤维素酶及半纤维素酶。
纤维二糖水解酶(CBHs)公开于例如WO03/000941，其涉及得自 各种真菌的CBHI酶。未提供所述酶的生理特性，亦未提供其用途的任 何实施例。Hong等人(2003b)表征了产生于酵母菌中的金黄色嗜热 子囊菌(Thermoascus aurantiacus)CBHI的特征。该酶的应用未描述。 Tuohy等人(2002)描述了得自埃莫森篮状菌(Talaromyces emersonii) 的3种形式的纤维二糖水解酶。
Cel5家族的内切葡聚糖酶(EGs fam 5)被描述于例如 WO03/062409，其涉及用于饲料应用的包含至少2种热稳定性酶的组成 物。Hong等人(2003a)描述于酵母菌中生产来自金黄色嗜热子囊菌的 热稳定性β-1，4-内切葡聚糖酶。其应用未解释。WO01/70998涉及得自 篮状菌的β-葡聚糖酶。它们还描述了得自埃莫森篮状菌的β-葡聚糖 酶。讨论了食物、饲料、饮料、酿造及清洁剂应用。并未提及木质纤 维素水解。WO98/06858描述了得自黑曲霉菌(Aspergillus niger)的β -1，4-内切葡聚糖酶，且讨论了该酶于饲料及食物上的应用。WO97/13853 描述了在cDNA文库中筛检编码酶的DNA片段的方法。该cDNA文库 是酵母菌或真菌源的，优选来自曲霉菌。该酶优选为纤维素酶。Van Petegem等人(2002)描述了来自金黄色嗜热子囊菌的Cel5家族内切 葡聚糖酶的三维结构。Parry等人(2002)描述了来自金黄色嗜热子囊 菌的Cel5家族内切葡聚糖酶的作用模式。
Cel7家族的内切葡聚糖酶(EGs fam 7)被披露于例如US5,912,157， 其关于毁丝霉属(Myceliophthora)内切葡聚糖酶及其同源物及其于清 洁剂、纺织及纸浆上的应用。US6,071,735描述于碱性条件下展现高度 内切葡聚糖酶活性的纤维素酶。讨论了作为清洁剂在纸浆和造纸及纺 织应用上的用途。未提及生物乙醇。US5,763,254公开了分解纤维素/ 半纤维素且于CBD中具有保守的氨基酸残基的酶。
Cel45家族的内切葡聚糖酶(EGs fam 45)被描述于例如 US6,001,639，其涉及具有内切葡聚糖酶活性且具有2个保守氨基酸序 列的酶。一般性讨论了在纺织、清洁剂及纸浆和造纸应用上的用途， 并提及木质纤维素材料的处理，但未提供实施例。WO2004/053039涉 及内切葡聚糖酶的清洁剂应用。US5,958,082公开了内切葡聚糖酶、特 别是得自太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)者于纺织应用上的用途。 EP0495258涉及包含腐质霉(Humicola)纤维素酶的清洁剂组合物。 US5,948,672描述了包含内切葡聚糖酶、特别是得自腐质霉者的纤维素 酶制剂及其于纺织及纸浆应用上的用途。木质纤维素水解未被提及。
小量的β-葡萄糖苷酶(BG)通过水解由纤维二糖水解酶所产生的 纤维二糖，增强了生物质水解成葡萄糖。纤维二糖转换成葡萄糖通常 是主要的限速步骤。β-葡萄糖苷酶被公开于例如US2005/021 4920，其 涉及得自烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的BG。该酶已于米曲霉菌 (Aspergillus oryzae)及里氏木霉中生产。该酶于分解生物质或清洁剂 应用上的用途被一般性讨论，但未举例说明。WO02/095014描述了具 有纤维二糖酶活性的米曲霉菌酶。从生物质生产乙醇的用途被一般性 讨论但未举例说明。WO2005/074656公开了源自例如金黄色嗜热子囊 菌；烟曲霉菌；太瑞斯梭孢壳霉及金黄色嗜热子囊菌的具有增强纤维 素分解活性的多肽。WO02/26979公开了植物物质的酶法处理。 US6,022,725描述了克隆及扩增里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因，及 US6,103,464描述用于编码来自丝状真菌的β-葡萄糖苷酶的DNA的检 测方法。未提供应用实施例。
木聚糖酶被描述于例如FR2786784，其有关可用于例如处理动物 饲料及面包制作的热稳定性木聚糖酶。该酶源自嗜热性真菌，特别是 嗜热子囊菌属。
US6,197,564描述了具有木聚糖酶活性且得自棘孢曲霉菌 (Aspergillus aculeatus)的酶。举例说明了该酶于烘培上的应用。 WO02/24926涉及篮状菌木聚糖酶。提供了饲料及烘培的实施例。 WO01/42433公开了用于食品及饲料应用的来自埃莫森篮状菌的热稳 定性木聚糖酶。
研究最透彻且应用最广泛的真菌来源的纤维素分解酶已经源自里 氏木霉(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型)。因此大多数商 业化的真菌纤维素酶亦源自里氏木霉。然而，大部分来自较不知名真 菌的纤维素酶尚未被应用于具有实际意义的方法，诸如分解纤维素材 料，包括木质纤维素。
对于用于分解纤维素底物、特别是木质纤维素底物的新方法，及 增强分解效率的新颖酶及酶混合物，有持续的需求。还需要在高温下 工作的方法及酶，如此可使用高黏稠度的生物质并导致高浓度的糖及 乙醇。这种方法可能引起显著节省能源及投资成本。高温还可降低水 解过程中污染的风险。本发明的目标在于达到至少部分这些需求。
发明简述
目前意外发现纤维素分解酶，特别是得自金黄色嗜热子囊菌、嗜 热枝顶孢菌(Acremonium thermophilum)或嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的纤维二糖水解酶，对于水解纤维素材料特别有用。除 了纤维二糖水解酶之外，这些真菌还具有非常适合用于分解纤维素材 料的内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶。这些酶在宽温度范围 内呈现非常有效的动力学，并且虽然它们在高温下有高度活性，但在 标准水解温度下亦非常有效。这使它们极度适合各种在常规温度及升 高的温度下进行的纤维素底物水解方法。
本发明提供一种以纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷 酶处理纤维素材料的方法，其中所述纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO：2、4、6或8、或与其酶活性片段具有至少80％同一性的氨基酸 序列。
本发明进一步提供一种酶制剂，其包含纤维二糖水解酶、内切葡 聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，其中所述纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO： 2、4、6或8、或与其酶活性片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。
还提供了所述酶制剂分解纤维素材料的用途，以及所述方法在从 纤维素材料制备乙醇的过程中的用途。
本发明还涉及一种多肽，其包含具有纤维素分解活性的片段且选 自：
a)包含的氨基酸序列至少与SEQ ID NO：4具有66％同一性、与 SEQ ID NO：6具有79％同一性、与SEQ ID NO：12具有78％同一性、 与SEQ ID NO：14具有68％同一性、与SEQ ID NO：16具有72％同 一性、与SEQ ID NO：20具有68％同一性、与SEQ ID NO：22或24 具有74％同一性或与SEQ ID NO：26具有78％同一性的多肽；
b)包含具有纤维素分解活性片段的a)的变异体；及
c)具有纤维素分解活性的a)或b)的片段。
本发明的另一个目标是一种选自下列的分离的多核苷酸：
a)SEQ ID NO：3、5、11、13、15、19、21、23或25的核苷酸 序列，或编码权利要求35的多肽的序列；
b)a)的互补链；
c)包含至少20个核苷酸的a)或b)的片段；及
d)由于基因密码而与a)、b)或c)所定义的任一序列简并的序 列。
本发明还另外提供一种载体，其包含作为异源性序列的所述多核 苷酸，以及一种包含所述载体的宿主细胞。本发明还包括登录号为DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16726、 DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667的大肠杆菌(Escherichia coli) 菌株。
本发明的其它目标为包含至少一种新颖多肽的酶制剂，以及所述 多肽或酶制剂于燃料、纺织、清洁剂、纸浆和造纸、食品、饲料或饮 料工业上的用途。
还提供了一种制备多肽的方法，该多肽包含具有纤维素分解活性 的片段且选自：
a)包含的氨基酸序列至少与SEQ ID NO：4具有66％同一性、与 SEQ ID NO：6具有79％同一性、与SEQ ID NO：12具有78％同一性、 与SEQ ID NO：14具有68％同一性、与SEQ ID NO：16具有72％同 一性、与SEQ ID NO：20具有68％同一性、与SEQ ID NO：22或24 具有74％同一性或与SEQ ID NO：26具有78％同一性的多肽；
b)包含具有纤维素分解活性片段的a)的变异体；及
c)具有纤维素分解活性的a)或b)的片段，
所述方法包括用编码所述多肽的载体转化宿主细胞，并于能够表 达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，和任选回收并纯化所产生的 多肽。
还进一步提供一种以至少一种能够产生上述多肽的微生物的耗尽 培养基处理纤维素材料的方法，其中该方法包括令纤维素材料与耗尽 培养基反应以得到经水解的纤维素材料。
本发明的特定实施方案于从属权利要求中提及。
本发明的其它目标、细节及优点可自下列附图、详细说明及实施 例中变得明了。

图1.纤维素酶及β-葡萄糖苷酶活性于6种测试真菌菌株上清液 中的温度依赖性。给定温度下分析中的孵育时间为60分钟，分析pH 值为5.0(MUL活性)或4.8(CMCase或BGU)。于60℃得到的活性 被设定为100％的相对活性。A)金黄色嗜热子囊菌ALKO4239，B)金 黄色嗜热子囊菌ALKO4242，C)嗜热枝顶孢菌ALKO4245，D)嗜热篮 状菌(Talaromyces thermophilus)ALKO4246，E)嗜热毛壳菌 ALKO4261，F)嗜热毛壳菌ALKO4265。
图2.用于转化里氏木霉原生质体以产生重组真菌蛋白质的表达 盒的示意图。该重组基因处于里氏木霉cbh1(Cel7A)启动子(cbh1 prom)控制下且通过使用里氏木霉cbh1终止子(cbh1 term)来确保转 录终止。包含amdS基因作为转化标记。
图3A).测定得自金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌 ALKO4265及嗜热枝顶孢菌ALKO4245的重组CBH/Cel7蛋白制剂在 4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷(MUL)上50℃下10分钟时的最适pH。 结果以三次单独测量的平均值(±标准差)表示。B)测量得自金黄色 嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌ALKO4265及嗜热枝顶孢菌 ALKO4245的重组CBH/Cel7蛋白制剂在4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷 糖(MUL)上最佳pH下60分钟时的热稳定性。结果以三次单独测量 的平均值(±标准差)表示。这二个反应皆包含BSA(100微克/毫升) 以作为稳定剂。
图4.以纯化的重组纤维二糖水解酶于45℃下水解结晶纤维素 (Avicel)。底物浓度1％(重量/体积)，pH5.0，酶浓度1.4微摩尔。 A)具有CBD的纤维二糖水解酶，B)没有CBD的纤维二糖水解酶(核 心)。
图5.以纯化的重组纤维二糖水解酶于70℃下水解结晶纤维素 (Avicel)。底物浓度1％(重量/体积)，pH5.0，酶浓度1.4微摩尔。 A)包含CBD的纤维二糖水解酶，B)没有CBD的纤维二糖水解酶(核 心)。
图6A).在50℃下与CMC底物反应10分钟，测定异源生产的枝顶 孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜热子囊菌EG_28/Cel5A 活性的pH依赖性。B)分别于pH5.5、4.8及6.0处测量枝顶孢菌 EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜热子囊菌EG_28/Cel5A的最适 温度。除了EG_28/Cel5A为10分钟，该包含CMC作为底物的反应进 行60分钟。添加BSA(100微克/毫升)作为稳定剂。
图7A).在50℃与4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷底物反应10分钟， 测定异源生产的枝顶孢菌BG_101/Cel3A、毛壳菌BG_76/Cel3A及嗜热 子囊菌BG_81/Cel3A活性的pH依赖性。B)分别于pH4.5、5.5及4.5 下测量枝顶孢菌βG_101/Cel3A、毛壳菌βG_76/Cel3A及嗜热子囊菌 βG_81/Cel3A的最适温度。该包含4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为 底物的反应进行达60分钟，并添加BSA(100微克/毫升)作为稳定剂。
图8A).与桦木木聚糖(birch xylan)底物50℃反应10分钟，测 定异源生产的嗜热子囊菌XYN_30/Xyn10A木聚糖酶活性的pH依赖 性。B)在pH5.3的60分钟反应中测量XYN_30/Xyn10A的最适温度， 并添加BSA(100微克/毫升)作为稳定剂。
图9.于55及60℃下以嗜热性酶的混合物(混合物1)与里氏木 霉酶水解经清洗的汽爆的云杉纤维(10毫克/毫升)。酶剂量以FPU/ 克底物干物质的剂量给予，FPU于50℃、pH5下分析。于pH5下搅拌 水解达72小时。结果以三次单独测量的平均值(±标准差)表示。
图10.于45、55及57.5℃下以嗜热性酶的混合物(混合物2)及 里氏木霉酶水解经汽爆的玉米杆(10毫克/毫升)。用于“混合物2” 的酶剂量为5FPU/克的底物干物质，及里氏木霉酶的酶剂量为5FPU/ 克Celluclast干物质添加100nkat/克Novozym 188干物质(滤纸活性于 50℃、pH5下测定)。于pH5下伴随搅拌进行水解达72小时。结果以 三次单独测量的平均值(±标准差)表示。该底物包含可溶性还原糖 (约0.7毫克/毫升)。此背景糖含量从水解过程中形成的还原糖中减去。
图11.于45、55及60℃下以包含得自金黄色嗜热子囊菌的新颖 嗜热性木聚糖酶的嗜热性酶混合物(混合物3)及里氏木霉酶水解经汽 爆的玉米杆(10毫克/毫升)。“混合物3”的酶剂量为5FPU/克底物 干物质，里氏木霉酶的酶剂量为5FPU/克Celluclast干物质添加100nkat/ 克Novozym 188干物质(滤纸活性于50℃、pH5下测定)。于pH5下 伴随搅拌进行水解达72小时。结果以三次单独测量的平均值(±标准 差)表示。该底物包含可溶性还原糖(约0.7毫克/毫升)。此背景糖 含量从水解期间所形成的还原糖中减去。
图12.于45、55及60℃下以包含得自金黄色嗜热子囊菌的新颖 嗜热性木聚糖酶XYN_30/Xyn10A的嗜热性酶混合物(混合物3)及里 氏木霉酶水解经汽爆的云杉纤维(10毫克/毫升)。“混合物3”的酶 剂量为5FPU/克底物干物质，里氏木霉酶的酶剂量为5FPU/克Celluclast 干物质添加100nkat/克Novozym 188干物质(滤纸活性于50℃、pH5 下测定)。于pH5下伴随搅拌进行水解达72小时。结果以三次单独测 量的平均值(±标准差)表示。
图13.葡萄糖对于不同β-葡萄糖苷酶制剂活性的影响。使用对硝 基苯基-β-D-吡喃葡糖苷为底物的标准分析于分析混合物中存在葡萄 糖时进行。该活性以没有葡萄糖时所得到的活性的百分比表示。
图14.从50至70℃的温度下酶混合物的FPU活性，以标准条件 下(50℃，1小时)的活性的百分比表示。
图15.两种不同里氏木霉菌株的相对纤维素酶活性，该菌株生长 于含未处理的Nutriose(NO)或经BG_81/Cel3A预处理的Nutriose (NBG81)作为碳源的培养基中。
本发明的详细说明
纤维素是高等植物的主要结构成分。其提供植物细胞高抗张强度， 帮助它们抵抗机械应力及渗透压。纤维素是一种β-1，4-葡聚糖，其由通 过β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖残基直链组成。纤维二糖是纤维素最小的 重复单位。在细胞壁中纤维素被堆叠成不同方向的板层，其包埋于半 纤维素及木质素的基质中。半纤维素是碳水化合物聚合物的异质性类 型，其主要包含不同的葡聚糖、木聚糖及甘露聚糖。半纤维素由线性 骨架组成，其中β-1，4-连接残基被通常包含乙酰基、葡萄糖醛酸基、阿 拉伯糖基及半乳糖基的短侧链取代。半纤维素可以化学方式与木质素 交联。木质素是各种取代的对羟苯基丙烷单位的复杂交联聚合物，其 提供细胞壁强度以承受机械应力，同时可保护纤维素不受酶水解。
木质纤维素是纤维素和半纤维素与苯酚丙醇单位的聚合物和木质 素的组合物。其物理性质坚硬、密实且不易受影响，为生物圈中含量 最丰富的生化材料。含木质纤维素的材料的实例为：硬木及软木屑、 木浆、锯屑及林木业废弃物；农业生物质如谷类禾杆、甜菜渣、玉米 杆及穗轴、甘蔗渣、茎、叶、皮、壳等；废弃物品如都市固体废弃物、 报纸及办公室废纸、例如谷粒的研磨废料；专用能源作物(例如柳木、 杨木、柳枝稷(switchgrass)或草芦等)。优选实例为玉米杆、柳枝稷、 谷类禾杆、甘蔗渣及木材衍生材料。
本文所使用的“纤维素材料”涉及任何包含纤维素、半纤维素和/ 或木质纤维素以为重要成分的材料。“木质纤维素材料”是指任何包 含木质纤维素的材料。这类材料是例如植物材料如包括软木及硬木的 木材、草本作物、农业残余物、纸浆及造纸残余物、废纸、食物及饲 料业废弃物等。纺织纤维诸如棉、源自棉、亚麻、大麻、黄麻的纤维 及人造纤维素纤维如木代尔(modal)、黏胶(viscose)、天丝(lyocell) 是纤维素材料的特定例子。
纤维素材料在自然界中会被很多不同的生物体包括细菌及真菌分 解。纤维素通常由不同纤维素酶相继或同时作用分解。纤维素经生物 转换成葡萄糖通常需要三种类型的水解酶：(1)切断内部β-1，4-糖苷 键的内切葡聚糖酶；(2)从纤维素聚合物链末端切割双糖纤维二糖的 外切型纤维二糖水解酶；(3)水解纤维二糖及其它短纤维寡糖成为葡 萄糖的β-葡萄糖苷酶。换句话说，三种主要类型的纤维素酶为纤维二 糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)及β-葡萄糖苷酶(BG)。
包含底物的更复杂纤维素的分解需要广泛的各种酶。举例来说， 木质纤维素是由半纤维素酶如木聚糖酶及甘露聚糖酶分解。半纤维素 酶是一种水解半纤维素的酶。
“纤维素分解酶”为具有“纤维素分解活性”的酶，这表示它们能 够将纤维素底物或其衍生物水解成较小的糖。因此纤维素分解酶包括 纤维素酶及半纤维素酶。本文所使用的纤维素酶包括纤维二糖水解酶、 内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。
里氏木霉具有著名且有效的纤维素酶系统，其包含两个CBH、两 个主要及一些次要的EG及BG。里氏木霉CBHI(Cel7A)自纤维素链 的还原端切割糖，并具有C端纤维素结合结构域(CBD)且可能构成 多达60％的总分泌蛋白质。里氏木霉CBHII(Cel6A)自纤维素链的非 还原端切割糖，并具有N端纤维素结合结构域且可能构成多达20％的 总分泌蛋白质。内切葡聚糖酶EGI(Cel7B)及EGV(Cel45A)于C 端具有CBD，EGII(Cel5A)具有N端CBD而EGIII(Cel12A)根本 没有纤维素结合结构域。CBHI、CBHII、EGI及EGII也称为木霉菌的 “主要纤维素酶”，共占总分泌蛋白质的80至90％。本领域技术人员 了解，一种酶可能对几种底物有活性且酶活性可利用不同底物、方法 及条件测定。鉴别不同的纤维素分解活性讨论于例如van Tilbeurgh等 人1988。
除了表达纤维素分解活性的催化结构域/核心之外，纤维素分解酶 可能包含一或多种纤维素结合结构域(CBD)，亦称为碳水化合物结 合结构域/组件(CBD/CBM)，其可位于催化结构域的N或C端。CBD 具有碳水化合物结合活性且介导纤维素酶与结晶纤维素结合，但是对 该酶对于可溶性底物的纤维素酶水解活性的影响很少或没有。这两个 结构域通常通过柔性且高度糖基化的接头区域连接。
本文使用的“纤维二糖水解酶”或“CBH”是指自葡萄糖链末端 切割纤维素且主要产生纤维二糖的酶。它们也称为1，4-β-D-葡聚糖纤 维二糖水解酶或纤维素-1，4-β-纤维二糖酶。它们从包含1，4-β-D-糖苷 键的聚合物如纤维素的还原或非还原端水解该键，从而释出纤维二糖。 从里氏木霉已分离出两种不同的CBH，CBHI和CBHII。它们具有由连 接纤维素结合结构域(CBD)的催化结构域所组成的模块结构。自然 界中亦有缺乏CBD的纤维二糖水解酶。
“内切葡聚糖酶”或“EG”是指切断纤维素链内部糖苷键的酶。 它们被分类为EC3.2.1.4。它们是1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶且催 化葡萄糖聚合物如纤维素及其衍生物中1，4-β-D-糖苷键的内切水解。 有些天然存在的内切葡聚糖酶具有纤维素结合结构域，其它则没有。 有些内切葡聚糖酶也具有木聚糖酶活性(Bailey等人，1993)。
“β-葡萄糖苷酶”或“BG”或“βG”是指将小的可溶性寡糖包 括纤维二糖分解成葡萄糖的酶。它们分类为EC3.2.1.21。它们是β-D- 葡糖苷葡萄糖水解酶，通常催化末端非还原的β-D-葡萄糖残基的水解。 这些酶识别葡萄糖的寡糖。典型的底物为纤维二糖及纤维三糖。纤维 二糖为纤维二糖水解酶的抑制剂，因此分解纤维二糖对于克服纤维二 糖水解酶的终产物抑制而言很重要。
木聚糖酶是能识别及水解半纤维素的酶，它们包括外切水解及内 切水解的酶。它们通常具有将半纤维素分解成木糖的内切-1，4-β-木聚 糖酶(EC3.2.1.8)或β-D-木糖苷酶(EC3.2.1.37)活性。与本发明有 关的“木聚糖酶”或“Xyn”特别是指分类为EC3.2.1.8的、水解木质 纤维素基体或纯化木聚糖的木糖聚合物的酶。
除此之外，纤维素酶可根据它们的主要序列分类为各种糖基水解 酶家族，由家族一些成员的三维结构分析得到支持(Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993，1996)。某些糖基水解酶为多功能性酶， 其包含属于不同糖基水解酶家族的催化结构域。家族3由β-葡萄糖苷 酶(EC3.2.1.21)组成，诸如本文所述的Ta BG_81、At BG_101及Ct BG_76。家族5(过去称为celA)主要由内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)组 成，诸如本文所述的Ta EG_28。家族7(过去称为纤维素酶家族celC) 包含内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)及纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，诸 如本文所述的Ct EG_54、Ta CBH、At CBH_A、At CBH_C及Ct CBH。 家族10(过去称为celF)主要由木聚糖酶(EC3.2.1.8)组成，诸如本 文所述的Ta XYN_30及At XYN_60。家族45(过去称为celK)包含 内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，诸如本文所述的At EG_40及At EG_40_like。
用于水解纤维素材料的纤维素分解酶可得自金黄色嗜热子囊菌、 嗜热枝顶孢菌或嗜热毛壳菌。“可得自”是指它们可以从所述物种得 到，但是不排除从其它来源得到的可能性。换句话说，它们可能源自 任何有机体，包括植物。优选它们源自微生物例如细菌或真菌。该细 菌可能例如来自选自芽胞杆菌属(Bacillus)、固氮螺菌属(Azospirillum) 及链霉菌属(Streptomyces)的类属。更优选该酶源自真菌(包括丝状 真菌及酵母菌)，例如来自选自嗜热子囊菌属、枝顶孢菌属、毛壳菌 属、无毛毛壳菌属(Achaetomium)、梭孢壳菌属(Thielavia)、曲霉 菌属、葡萄孢属(Botrytis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、金钱菌 属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、镰孢属(FUSarium)、腐质霉 属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinus)、马兰 诺菌属(Melanocarpus)、毁丝霉属、麦瑞菌属(Myriococcum)、脉 孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、毛平革菌属 (Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、侧耳属(PleurotUS)、柄孢 壳属(Podospora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、西塔利菌属(Scytalidium)、 密孔菌属(PycnoporUS)、栓菌属(Trametes)及木霉菌属。
根据本发明的优选实施方案，酶可得自保藏为CBS 116239的金黄 色嗜热子囊菌菌株ALKO4242、目前被归类为嗜热枝顶孢菌的保藏为 CBS 116240的菌株ALKO4245、或保藏为CBS 730.95的嗜热毛壳菌菌 株ALKO4265。
该纤维二糖水解酶优选包含与SEQ ID NO：2、4、6或8或与其 酶活性片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。
  纤维二糖 水解酶   基因 可得自 CBD 核酸SEQ ID NO：   氨基酸SEQ ID NO：     Ta CBH Ta cel7A 金黄色嗜热子囊菌 - 1 2 At CBH_A At cel7B 嗜热枝顶孢菌 - 3 4 At CBH_C At cel7A 嗜热枝顶孢菌 + 5 6 Ct CBH Ct cel7A 嗜热毛壳菌 + 7 8
这些CBHs相较于里氏木霉CBH具有优势的纤维素抑制常数，且 当以不同纤维素底物测试时，它们显示改善的水解结果。SEQ ID NO： 2及4不包含CBD。当纤维素结合结构域(CBD)与本身不具有CBD 的CBH连接时，则可获得特别加强的水解结果。该CBD可得自例如 木霉菌属或毛壳菌属物种，且优选通过接头与CBH连接。所形成的包 含通过接头与CBD连接的CBH核心区的融合蛋白可能包含与SEQ ID NO：28或30具有至少80％同一性的氨基酸序列。包含SEQ ID NO： 27或29序列的多核苷酸编码该融合蛋白。
内切葡聚糖酶可能包含与SEQ ID NO：10、12、14或16或其酶 活性片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。这些内切葡聚糖酶具有 良好的热稳定性。
  内切葡聚糖酶              基因      可得自        CBD     核酸SEQ ID NO：   氨基酸 SEQ ID  NO：    Ta EG_28 Ta cel5A 金黄色嗜热子囊菌 - 9 10 At EG_40 At cel45A 嗜热枝顶孢菌 + 11 12 At EG40_like At cel45B 嗜热枝顶孢菌 - 13 14 Ct EG_54 Ct cel7B 嗜热毛壳菌 + 15 16
β-葡萄糖苷酶可能包含与SEQ ID NO：22、24或26或其酶活性 片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。这些β-葡萄糖苷酶对于葡萄 糖抑制具有良好抗性，这有利于避免纤维素材料的酶法水解期间的终 产物抑制。该β-葡萄糖苷酶可能也被用于制备槐糖(sophorose)，一 种用于里氏木霉培养中的纤维素酶诱导物。
  β-葡萄糖苷 酶 基因 可得自 核酸SEQ ID NO： 氨基酸SEQ ID NO： Ta BG_81 Ta cel3A 金黄色嗜热子囊菌 21 22 At BG_101 At cel3A 嗜热枝顶孢菌 23 24 Ct BG_76 Ct cel3B 嗜热毛壳菌 25 26
木聚糖酶可能包含与SEQ ID NO：18或20或其酶活性片段具有 至少80％同一性的氨基酸序列。
  木聚糖酶 基因 可得自 CBD 核酸SEQ ID NO：   氨基酸SEQ ID NO：     Xyn_30 Ta xyn10A 金黄色嗜热子囊菌 + 17 18 Xyn_60 At xyn10A 嗜热枝顶孢菌 - 19 20
术语“同一性”在此是指两个氨基酸序列之间从由对应基因所编 码第一个氨基酸至最后一个氨基酸互相比较的整体同一性。全长序列 的同一性是利用EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套件；Rice等 人，2000)程序包3.0.0版中的尼德曼-王氏(Needleman-Wunsch)整体 比对程序测量，参数如下：EMBLOSUM62，间隔罚分10.0，延长罚分 0.5。该算法在尼德曼-王氏(1970)中描述。本领域技术人员了解这样 的事实，利用尼德曼-王氏算法所得到的结果仅在比对序列的对应结构 域时才是可比较的。因此例如包含CBD或信号序列的纤维素酶序列与 缺乏这些元件的序列相比较是做不到的的。
根据本发明的一种实施方式，使用与SEQ ID NO：2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24或26或至少与其酶活性片段具有至 少80、85、90、95或99％同一性的纤维素分解多肽。
术语“酶活性片段”是指具有纤维素分解活性的定义序列的任何 片段。换句话说，酶活性片段可能是该定义序列的成熟蛋白质部分或 可能只是成熟蛋白质部分的片段，条件是其仍具有纤维二糖水解酶、 内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性。
优选纤维素分解酶是重组酶，其可以用一般的已知方式生产。分 离包含该酶基因的多核苷酸片段，将该基因插入表达载体中的强启动 子下，该载体被转移至适当宿主细胞内，且令该宿主细胞于激发该酶 产生的条件下培养。不同宿主系统中利用重组技术生产蛋白质的方法 是该领域所熟知的(Sambrook等，1989；Coen，2001；Gellissen，2005)。 优选该酶被产生成为分泌至培养基的胞外酶，这样可方便酶的回收及 分离。生产宿主的耗尽培养基可以就这样用，或可以自其中除去宿主 细胞，和/或可以浓缩、过滤或分馏该耗尽培养基。其也可被干燥。
本文中分离的多肽可以仅表示细胞及细胞碎片已被从包含该多肽 的培养基中除去。该多肽的分离可方便地通过例如向耗尽培养基中添 加阴离子和/或阳离子聚合物以促进细胞、细胞碎片及一些具有无用副 作用的酶沉积。接着该培养基利用无机过滤剂及滤器过滤，以除去形 成的沉淀物。之后滤液利用半透膜进一步处理以去除过量的盐、糖及 代谢产物。
根据本发明的一种实施方案，异源性多核苷酸包含的基因类似于 登录号DSM 16723、DSM 16728、DSM 16729、DSM 16727、DSM 17326、 DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16724、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667的微生物所包含的基因。
该生产宿主可以是任何能够表达纤维素分解酶的有机体。优选该 宿主是微生物细胞，更优选是真菌。最优选该宿主是丝状真菌。优选 该重组宿主被修饰以表达及分泌纤维素分解酶，作为其主要活性或主 要活性之一。这可通过删除主要的同源分泌基因例如木霉菌的四个主 要纤维素酶和通过将异源性基因打靶到已经修饰以确保高表达及生产 浓度的基因座中达成。用于生产纤维素分解酶的优选宿主特别是来自 木霉菌属或曲霉菌属的菌株。
可以添加酶法有效量的根据本发明水解纤维素材料所需的酶，或 同时，例如以酶混合物的形式，或相继，或作为同步糖化及发酵(SSF) 的一部分。任何包含与SEQ ID NO：2、4、6或8或与其酶活性片段具 有至少80％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶组合物可以与内切 葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶的任何组合物一起使用。如果该纤维素材料 包含半纤维素，将额外使用半纤维素酶，优选木聚糖酶以供分解。内 切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶可能选自本文所描述者，但不 限于此。它们也可以是例如商品化的酶制剂。除了纤维素酶及任选的 半纤维素酶之外，还可以使用一或多种其它酶，例如蛋白酶、淀粉酶、 漆酶、脂肪酶、果胶酶、酯酶和/或过氧化物酶。其它酶处理可以在纤 维素酶处理之前、之中或之后进行。
术语“酶制剂”表示包含至少一种所需酶的组合物。该制剂可包 含至少为部分纯化和分离形式的酶。其可以甚至基本上由所需的酶组 成。或者该制剂可以为包含一或多种纤维素分解酶的耗尽培养基或滤 液。除纤维素分解活性之外，该制剂可包含添加物，诸如媒介物、稳 定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂 为该些通常用于供特定应用的酶制剂中者。该酶制剂可以是液体、粉 末或颗粒的形式。该酶制剂优选为耗尽培养基。“耗尽培养基”是指 包含所产生的酶的宿主的培养基。优选该宿主细胞于生产后与所述培 养基分离。
根据本发明的一种实施方案，酶制剂包含CBH、EG及BG的混合 物，任选加上木聚糖酶和/或其它酶。CBH包含与SEQ ID NO：2、4、 6或8或与其酶活性片段具有至少80％同一性的氨基酸序列，且其可 得自金黄色嗜热子囊菌、嗜热枝顶孢菌或嗜热毛壳菌，然而EG、BG 及木聚糖酶可能来自任何来源包括来自所述有机物。可能存在于制剂 的其它酶为例如蛋白酶、淀粉酶、漆酶、脂肪酶、果胶酶、酯酶和/或 过氧化物酶。
不同的酶混合物及组合物可用来配合不同的处理条件。举例来说， 如果分解过程是在高温下进行，则选择热稳定性酶。家族7的CBH与 家族45的内切葡聚糖酶的组合物，任选与家族3的BG和/或家族10 的木聚糖酶组合，于45℃及升高的温度下均具有出色的水解性能。
里氏木霉的纤维素分解酶于水解时常规用于约40至50℃的温度 范围内，且于SSF时为30至40℃。可得自金黄色嗜热子囊菌、嗜热枝 顶孢菌或嗜热毛壳菌的CBH、EG、BG及Xyn在这些温度下也有效， 但除此之外它们大部分在介于50至75℃、或甚至高达80和85℃的温 度下亦非常有效，诸如介于55至70℃，例如介于60至65℃。对于短 暂孵育时间而言，酶混合物在甚至高达85℃仍有作用，至于完全水解 通常使用较低温度。
以CBH、EG、BG及Xyn处理纤维素材料的方法特别适用于自木 质纤维素材料生产可发酵糖。该可发酵糖接着利用酵母菌发酵成为乙 醇，并且作为燃料使用。它们亦可作为用于化工过程例如所谓生物炼 制中生产各种化学物质或结构单元的中间物或原料。木质纤维素材料 在酶法水解之前可预处理以破坏纤维素底物的纤维结构，并使纤维素 成分更容易接触纤维素分解酶。目前的预处理包括机械性、化学性或 热处理方法及其组合。该材料可以例如通过汽爆或酸水解预处理。
很多新颖的纤维素分解多肽可见于金黄色嗜热子囊菌、嗜热枝顶 孢菌及嗜热毛壳菌。该新颖的多肽可包含具有纤维素分解活性且选自 包含氨基酸序列的多肽的片段，所述氨基酸序列至少与SEQ ID NO：4 具有66％、优选为70％或75％的同一性，与SEQ ID NO：6具有79 ％同一性，与SEQ ID NO：12具有78％同一性，与SEQ ID NO：14 具有68％、优选为70％或75％同一性，与SEQ ID NO：16具有72％、 优选为75％的同一性，与SEQ ID NO：20具有68％、优选为70％或 75％同一性，与SEQ ID NO：22或24具有74％同一性或与SEQ ID NO： 26具有78％同一性。
该新颖多肽也可以使所述多肽的变异体。“变异体”可以是同菌 株、种或属中天然发生成为例如等位变异体的多肽，或可以通过突变 产生。其可包含氨基酸取代、删除或插入，但仍与上述定义的酶以基 本上类似的方式发挥作用，也就是包含具有纤维素分解活性的片段。
该纤维素分解多肽通常作为包含信号序列的不成熟多肽于细胞中 产生，该信号序列于蛋白质分泌过程中被切割。它们的N端和/或C端 都可能于分泌时被进一步处理以得到成熟、具有酶活性的蛋白质。因 此“包含具有纤维素分解活性的片段”的多肽是指该多肽可以是不成 熟或成熟形式，优选为成熟形式，也就是经过处理。
该新颖多肽可进一步为上述“多肽或变异体的片段”。该片段可 以是上述蛋白质的成熟形式，或其可以只是该成熟蛋白质的酶活性部 分。根据本发明的一种实施方案，该多肽具有与SEQ ID NO：4、6、 12、14、16、20、22、24或26或与其纤维素分解活性片段具有至少 80、85、90、95或99％同一性的氨基酸序列。其亦可以为变异体，或 其具有纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶或β-葡萄糖苷酶活 性的片段。根据本发明的另一实施方案，该多肽基本由SEQ ID NO：4、 6、12、14、16、20、22、24或26序列的纤维素分解活性片段组成。
该新颖的多核苷酸可以包含SEQ ID NO：3、5、11、13、15、19、 21、23或25的核苷酸序列或编码上述新颖多肽的序列，包括其互补链。 本文所使用的多核苷酸是指RNA及DNA，且其可以为单链或双链。 该多核苷酸也可以是包含至少20个核苷酸、例如至少25、30或40个 核苷酸的所述多核苷酸的片段。根据本发明的一种实施方案，其长度 至少为100、200或300个核苷酸。另外该多核苷酸可以因基因密码而 与上述定义的任一序列简并。这表示不同的密码子可以编码相同的氨 基酸。
根据本发明的一种实施例方案，多核苷酸“包含于”SEQ ID NO： 3、5、11、13、15、19、21、23或25中，这表示该序列具有上述序列 的至少部分。根据本发明的另一种实施方案，该多核苷酸包含的基因 类似于登录号DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、 DSM 17729、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667的 微生物所包含的基因。
该新颖蛋白质/多肽可以如上述制备。该新颖多核苷酸被插入载体 中，其能够表达由异源性序列编码的多肽，且该载体可以被插入能够 表达所述多肽的宿主细胞中。该宿主细胞优选为木霉菌属或曲霉菌属。
编码该新颖多肽的异源性基因被导入登录号为DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16726、DSM 16725、 DSM 17325或DSM 17667的大肠杆菌菌株中的质粒上。
该新颖的酶可以是酶制剂的成分。该酶制剂可以包含一或多种新 颖的多肽，且其可以例如耗尽培养基、粉末、颗粒或液体的形式。根 据本发明的一种实施方案，其包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、 β-葡萄糖苷酶及任选的木聚糖酶活性和/或其它酶活性。其可以进一步 包含任何常规添加剂。
该新颖的酶可被用于任何与纤维素分解酶有关的工艺，诸如于燃 料、纺织、清洁剂、纸浆和造纸、食品、饲料或饮料工业上，特别是 用于水解纤维素材料以供生产包含乙醇的生物燃料。在纸浆和造纸工 业上，它们可被用于修饰纤维素纤维例如处理牛皮纸浆、机械纸浆或 回收纸。
本发明由下列非限制性实施例说明。然而应了解的是，上述说明 及实施例中给出的实施方案仅供说明之用，且在本发明的范围内各种 改变及修饰皆是有可能的。
实施例
实施例1.筛选表达纤维素分解活性的菌株及其培养供纯化
测试约25个来自罗尔(Roal Oy)菌种保藏中心的真菌菌株的纤 维素分解活性包括β-葡萄糖苷酶。经过初步筛选，选出6个菌株供进 一步试验。它们是金黄色嗜热子囊菌ALKO4239及ALKO4242、嗜热 枝顶孢菌ALKO4245、嗜热篮状菌ALKO4246及嗜热毛壳菌ALKO4261 及ALKO4265。
菌株ALKO4239、ALKO4242及ALKO4246于摇瓶中以3XB培养 基42℃培养7天，包含(克/升):Solka Floc纤维素18、酒糟18、斯 佩尔特燕麦木聚糖9、碳酸钙2、豆粉4.5、(NH4)HPO44.5、小麦麸皮 3.0、磷酸二氢钾1.5、水合硫酸镁1.5、氯化钠0.5、硝酸钾0.9、刺槐 豆胶9.0、微量元素溶液#10.5、微量元素溶液#20.5及Struktol(Stow， OH，USA)消泡剂0.5毫升；pH调至6.5。微量元素溶液#1含(克/ 升):硫酸锰1.6、七水硫酸锌3.45及六水氯化钴2.0；微量元素溶液 #2含(克/升):七水硫酸铁5.0及两滴浓硫酸。
菌株ALKO4261于摇瓶中以1XB培养基培养，其具有3XB培养 基(上述)各成分的1/3，但碳酸钙、氯化钠及微量元素的浓度相同。 该菌株于45℃下培养7天。
菌株ALKO4265于摇瓶中以下列培养基培养，克/升：Solka Floc 纤维素40、PharmamediaTM(Traders Protein，Memphis，TN，USA)10、玉 米浆粉5、硫酸铵5及磷酸二氢钾15；pH调至6.5。该菌株于45℃下 培养7天。
培养后的细胞及其它固体经离心收集且回收上清液。为了摇瓶培 养，分别添加蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲基磺酰氟)及抑胃肽至1毫摩 尔和10微克/毫升。若非立即使用，将该制剂分装储存于-20℃下。
为了评估该酶的热活性，在作为稳定剂的100微克牛血清白蛋白 (BSA)/毫升存在下，于50℃、60℃、65℃、70℃及75℃下对该摇瓶 培养的制备物进行1小时的分析。初步分析于50℃及65℃下以两种不 同的pH值(4.8/5.0或6.0)进行，以确认哪一个pH更适合热活性分 析。
所有摇瓶上清液进行下列活性的分析：
类纤维二糖水解酶I活性(“CBHI”)及类内切葡聚糖酶I活性 (“EGI”)：
这些在50毫摩尔的乙酸钠缓冲液中测量，以0.5毫摩尔的MUL (4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷糖)作为底物。添加葡萄糖(100毫摩尔) 以抑制任何干扰性β-葡萄糖苷酶活性。于370纳米处测定释出的4-甲 基伞形酮基。通过测量纤维二糖(5毫摩尔)存在及不存在时的活性来 区分“CBHI”及“EGI”活性。未被纤维二糖抑制的活性代表“EGI” 活性，其余的MUL活性代表“CBHI”活性(van Tilbeurgh等，1988)。 该分析于pH5.0或6.0进行(见下述)。
内切葡聚糖酶(CMCase)活性：
基本上按照Bailey和Nevalainen 1981；Haakana等2004所述，以 2％(重量/体积)的羧甲基纤维素(CMC)作为底物于50毫摩尔柠檬 酸盐缓冲液中分析。还原糖以DNS试剂测定。分析于pH4.8或6.0进 行(见下述)。
β-葡萄糖苷酶(BGU)活性
如Bailey和Nevalainen 1981所述，以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖 苷(1毫摩尔)于50毫摩尔柠檬酸盐缓冲液中分析。于400纳米处测 定释出的4-硝苯苯酚。该分析于pH4.8或6.0进行(见下述)。
酶的相对活性如图1所示。该相对活性的表示是以60℃的活性设 定为100％(图1)。所有菌株皆产生酶，所述酶于高温下(65℃至75 ℃)具有高活性。
在蛋白质纯化方面，ALKO4242亦于2升生物反应器中(Braun B，Braun，Melsungen，德国)生长于下列培养基(克/升)中：Solka Floc纤维素40、豆粉10、硝酸铵5、磷酸二氢钾5、七水硫酸镁0.5、 二水氯化钙0.05、微量元素溶液#10.5、微量元素溶液#20.5。通气 量为1vvm，以Struktol控制消泡，搅拌200至800rpm及温度为47℃。 运行二个批次，一批的pH值为4.7±0.2(氨气/硫酸)，另一批的初始 pH为4.5。培养时间为7天。培养后的细胞及其它固体经离心去除。
菌株ALKO4245于2升生物反应器中(Braun B，Braun， Melsungen，德国)生长于下列培养基中，克/升：Solka Floc纤维素40、 玉米浆粉15、酒糟5、斯佩尔特燕麦木聚糖3、刺槐豆胶3、硫酸铵5 及磷酸二氢钾5。pH的范围为5.2±0.2(氨气/硫酸)，通气量1vvm， 以300至600rpm搅拌，以Struktol控制消泡及温度为42℃。培养时间 为4天。培养后的细胞及其它固体经离心去除。
在酶纯化方面，ALKO4261于10升的生物反应器中(Braun  ED，Braun，Melsungen，德国)生长于下列培养基中，克/升： Solka Floc纤维素30、酒糟10、斯佩尔特燕麦木聚糖5、碳酸钙2、豆 粉10、小麦麸皮3.0、硫酸铵5、磷酸二氢钾5、七水硫酸镁0.5、氯化 钠0.5、硝酸钾0.3、微量元素溶液#10.5及微量元素溶液#20.5。pH 值范围为5.2±0.2(氨气/硫酸)，通气量1vvm，以200至600rpm搅 拌，以Struktol控制消泡及温度为42℃。培养时间为5天。第二批以 类似条件生长，除了Solka Floc添加至40克/升及酒糟加至15克/升。 上清液经离心回收，且通过Seitz-K150及EK滤纸(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)过滤。之后上清液利用 Pellicon微细超过滤系统(滤纸NMWL 10kDa；Millipore，Billerica，MA， USA)浓缩约10倍。
在酶纯化方面，ALKO4265亦于10升的生物反应器中(Braun ED，Braun，Melsungen，德国)在与上述相同的培养基中生长， 除了磷酸二氢钾添加至2.5克/升。pH值范围为5.3±0.3(氨气/磷酸)， 通气量0.6vvm，以500rpm搅拌，以Struktol控制消泡及温度为43℃。 培养时间为7天。上清液经离心回收，且通过Seitz-K150及EK滤纸过 滤(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)。之后 上清液利用Pellicon微细超过滤系统(滤纸NMWL 10kDa；Millipore， Billerica，MA，USA)浓缩约20倍。
实施例2.纯化及表征来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245及嗜热毛壳菌 ALKO4265的纤维二糖水解酶
嗜热枝顶孢菌ALKO4245及嗜热毛壳菌ALKO4265按实施例1所 述生长。主要的纤维二糖水解酶利用对氨基苄基1-硫基-β-纤维二糖苷 -基亲和柱纯化，按Tomme等.，1988所述制备。
培养上清液先缓冲成50毫摩尔的乙酸钠缓冲液pH5.0，含1毫摩 尔δ-葡萄糖酸内酯及0.1摩尔葡萄糖以阻止β-葡萄糖苷酶存在时配体 水解。纤维二糖水解酶以0.1摩尔乳糖洗脱，且最后利用AKTA系统 Amersham Pharmacia Biotech)的Superdex 200HR 10/30柱(，以凝胶 过滤色谱法纯化。凝胶过滤法中所使用的缓冲液为50毫摩尔磷酸钠 pH7.0，其包含0.15摩尔氯化钠。
纯化的纤维二糖水解酶以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，且根据 分子量标准(低分子量校正试剂盒，Amersham Biosciences)评估的两 个蛋白质的分子量均被确定为约70kDa。纯化的枝顶孢菌及毛壳菌纤维 二糖水解酶遵照Henrissat等人的方案(1998)(Henrissat，1991； Henrissat和Bairoch，1993)，分别被命名为At Cel7A及Ct Cel7A。
该制剂的比活度利用4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷(MUL)、4- 甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖苷(MUG2)或4-甲基伞形酮基-β-D-纤 维三糖苷(MUG3)作为底物(van Tilbeurgh等，1988)，于0.05摩 尔柠檬酸钠缓冲液pH5中于50℃下10分钟测定的。内切葡聚糖酶及 木聚糖酶活性利用羧甲基纤维素(CMC)及桦木葡糖醛酸木聚糖(Bailey 等.，1992)作为底物，以标准程序(根据IUPAC，1987)测定。根据 与1％底物及0.25微摩尔酶剂量于50℃、pH5.0进行24小时反应所形 成的还原糖，计算对Avicel的比活度。根据Lowry等，1951所述测量 纯化酶制剂的蛋白质含量。为了表征水解的终产物，以高效液相色谱 (Dionex)分析如上述于24小时水解试验中释出的可溶性糖。里氏木霉 经纯化的纤维二糖水解酶I(CBHI/Cel7A)被当作参比。
该纯化的酶及里氏木霉CBHI/Cel7A的比活度列于表1。与里氏木 霉CBHI/Cel7A比较，纯化的At Cel7A及Ct Cel7A纤维二糖水解酶对 于小的合成性底物具有较高的比活度。本文所公开的酶对Avicel明显 具有较高的比活度。纯化的酶制剂对木聚糖及CMC的低活性可以是因 为蛋白质本身的性质，或至少部分是因为残余的少量污染性酶。所有 纯化的酶水解纤维素的主要终产物为纤维二糖，其对纤维二糖水解酶 是典型的。
表1.纯化的纤维二糖水解酶及里氏木霉的参比酶的比活度(nkat/ 毫克)(50℃，pH5.0，24小时)
  底物 嗜热枝顶孢菌 ALKO4245 Cel7A  嗜热毛壳菌  ALKO4265 Cel7A 里氏木霉Cel7A 木聚糖 11.3 6.7 1.3 CMC 26.2 5.5 1.0 MUG2 9.2 18.9 4.3 MUG3 1.3 1.5 0.9 MUL 21.5 54.0 21.9 Avicel 1.8 1.4 0.6
纯化的纤维二糖水解酶的热稳定性于不同温度下测定。该反应利 用4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷糖作为底物，于0.1％BSA存在时于 pH5.0下进行60分钟。嗜热毛壳菌ALKO4265 CBH/Cel7A及嗜热枝顶 孢菌ALKO4245 CBH/Cel7A分别直到65℃及60℃时稳定。里氏木霉参 比酶(CBHI/Cel7A)在到达55℃时维持100％活性。
实施例3.纯化和表征来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的内切葡聚糖 酶
嗜热枝顶孢菌ALKO4245按实施例1所述生长。培养上清液于70 ℃下孵育24小时，之后以超过滤浓缩。纯内切葡聚糖酶通过疏水交互 作用及阳离子交换色谱法然后以凝胶过滤连续纯化得到。纯化期间收 集到的级分的内切葡聚糖酶活性利用羧甲基纤维素(CMC)作为底物 测定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作为标准，通过BioRad 分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)测量蛋白质含量。
浓缩的培养上清液被施加于用含1摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾 缓冲液pH6.0平衡的HiPrep 16/10丁基FF疏水性相互作用柱。结合的 蛋白质以从上述缓冲液至5毫摩尔磷酸钾pH6.0的线性梯度洗脱。收 集级分并以上述方式测定内切葡聚糖酶活性。内切葡聚糖酶活性于120 至15mS/cm的宽电导区域内洗脱。
组合的级分被施加于以8毫摩尔乙酸钠pH4.5平衡的HiTrap SP XL阳离子交换柱。结合的蛋白质以平衡缓冲液中0至0.25摩尔氯化钠 的线性梯度洗脱。含有内切葡聚糖酶活性的蛋白质在3至7mS/cm的电 导区被洗脱。重复阳离子交换色谱法且以冷冻干燥浓缩该蛋白质洗脱 物。
溶解的样品加样到用含0.15摩尔氯化钠的20毫摩尔磷酸钠缓冲 液pH7.0平衡的Superdex 75 HR10/30凝胶过滤管柱。主要的蛋白质级 分从滞留体积为13.3毫升的柱中被洗脱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳判断该蛋白质洗脱物为纯的，且经评估其分子量为40kDa。该名为 At EG_40的纯化蛋白质于50℃下的比活度被测定为450nkat/mg (IUPAC法1987，使用CMC为底物)。
纯化的内切葡聚糖酶的热稳定性于不同温度下测定。该反应利用 羧甲基纤维素作为底物，于0.1毫克/毫升BSA存在时于pH5.0下进行 60分钟。嗜热枝顶孢菌EG_40/Cel45A直到80℃都稳定。里氏木霉参 比酶EGI(Cel7B)及EGII(Cel5A)分别于高达60℃及65℃时都维持 100％活性。
实施例4.纯化来自嗜热毛壳菌ALKO4261的内切葡聚糖酶
嗜热毛壳菌ALKO4261按照实施例1所述生长。纯内切葡聚糖酶 通过用疏水交互作用及阳离子交换色谱法继以凝胶过滤连续纯化得 到。于纯化期间收集的级分的内切葡聚糖酶活性利用羧甲基纤维素 (CMC)作为底物测定(IUPAC法1987)。
培养上清液中添加硫酸铵以达到与含有1摩尔硫酸铵的20毫摩尔 磷酸钾pH6.0相同的电导性。该样品被施加于用含1摩尔硫酸铵的20 毫摩尔磷酸钾pH6.0平衡的HiPrep 16/10苯基FF疏水性柱。以20至0 毫摩尔磷酸钾pH6.0的线性梯度及之后以5毫摩尔磷酸钾pH6.0和水进 行洗脱。结合的蛋白质以0至6摩尔尿素的线性梯度洗脱。收集级分 并以上述方式测定内切葡聚糖酶活性。含内切葡聚糖酶活性的蛋白质 于尿素梯度刚开始时被洗脱。
级分通过10DG柱(Bio-Rad)被合并、平衡成为16毫摩尔Tris-HCl pH7.5(I＝1.4mS/cm)，且施加于以20毫摩尔Tris-HCl pH7.5平衡的 HiTrap DEAE FF阴离子交换柱。结合的蛋白质以平衡缓冲液中0至1 摩尔氯化钠的线性梯度洗脱。收集级分并如上述分析内切葡聚糖酶活 性。该蛋白质于10至20mS/cm的范围被洗脱。
该样品利用10DG柱(Bio-Rad)平衡至15毫摩尔乙酸钠，且被 施加到以20毫摩尔乙酸钠pH4.5平衡的HiTrap SP XL阳离子交换柱。 蛋白质以0至0.4摩尔乙酸钠pH4.5的线性梯度洗脱。内切葡聚糖酶活 性在1至10mS/cm的范围被洗脱。收集样品经冷冻干燥。
该样品被溶解于水中且施加到以含0.15摩尔氯化钠的20毫摩尔 磷酸钠pH6.0平衡的Superdex 75 HR10/30凝胶过滤柱。收集级分且合 并那些含有内切葡聚糖酶活性的级分。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判 断该蛋白质洗脱物为纯的，且根据分子量标准(预染色的SDS-PAGE 标准，Broad Range，Bio-Rad)评估其分子量为54kDa。该名为Ct EG_54 的纯化蛋白质的等电点以PhastSystem(Pharmacia)测定约为5.5。
实施例5.纯化来自金黄色嗜热子囊菌ALKO4242的内切葡聚糖 酶
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242按照实施例1所述生长。纯内切葡 聚糖酶通过疏水相互作用及阴离子交换色谱法继以凝胶过滤连续纯化 得到。于纯化期间收集的级分的内切葡聚糖酶活性利用羧甲基纤维素 (CMC)作为底物确定(IUPAC法1987)。蛋白质含量利用牛血清白 蛋白作为标准以BioRad分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)测量。
培养上清液被施加于以含有0.7摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾缓 冲液pH6.0平衡的HiPrep 16/10丁基疏水性相互作用柱。结合的蛋白质 以0.2摩尔硫酸铵(I＝39mS/cm)洗脱。含有内切葡聚糖酶活性的级分 被组合并以超过滤浓缩。
该样品于10DG柱(Bio-Rad)中脱盐并被施加于以15毫摩尔 Tris-HCL pH7.0平衡的HiTrap DEAE FF阴离子交换柱。结合的蛋白质 于平衡缓冲液中以0至0.4摩尔氯化钠的线性梯度洗脱。含有内切葡聚 糖酶活性的蛋白质在15至21mS/cm的电导区被洗脱。收集到的级分如 上述合并及浓缩。
样品被施加于以含0.05摩尔氯化钠的50毫摩尔乙酸钠缓冲液 pH5.0平衡的Sephacryl S-100 HR26/60凝胶过滤柱。从柱中洗脱含有内 切葡聚糖酶活性的蛋白质级分，该柱具有对应分子量16kDa的滞留体 积。收集到的级分被合并、浓缩且重复凝胶过滤。以SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳判断该蛋白质洗脱物为纯的，且评估其分子量为28kDa。该名 为Ta EG_28的纯化蛋白质的等电点在IEF凝胶 (PhastSystem，Pharmacia)中测定约为3.5。Ta EG_28于50℃下的比活 度被测定为4290nkat/mg(IUPAC法1987，使用CMC为底物)。
实施例6.纯化和表征来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的β-葡萄糖苷 酶
嗜热枝顶孢菌ALKO4245按照实施例1所述生长。纯β-葡萄糖苷 酶通过疏水相互作用及阴离子交换色谱法继以凝胶过滤连续纯化得 到。纯化期间收集到的级分的β-葡萄糖苷酶活性利用4-硝基苯基-β -D-吡喃葡糖苷作为底物测定(Bailey和Linko，1990)。蛋白质含量利 用牛血清白蛋白作为标准通过BioRad分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)测量。
该培养上清液被施加于以含1摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾缓冲 液pH6.0平衡的HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性相互作用柱。结 合的蛋白质于137至16mS/cm电导区中以从平衡缓冲液至5毫摩尔磷 酸钾的线性梯度洗脱。收集的级分被合并并经超滤浓缩。
该样品于10DG柱(Bio-Rad)中脱盐并被施加于以10毫摩尔磷 酸钾pH7.0平衡的HiTrap DEAE FF阴离子交换柱。结合的蛋白质于1.5 至12mS/cm电导区中以从平衡缓冲液至含0.25摩尔氯化钠的相同缓冲 液的线性梯度洗脱。如上述重复阴离子交换色谱，除了所使用的是4 毫摩尔磷酸钾缓冲液pH7.2。蛋白质在6至9mS/cm的电导区被洗脱。 含有β-葡萄糖苷酶活性的级分被收集、组合及浓缩。
来自阴离子交换色谱的活性物质被施加于以含0.15摩尔氯化钠的 20毫摩尔磷酸钠pH6.5平衡的Sephacryl S-300 HR 26/60柱。具有β- 葡萄糖苷酶活性的蛋白质以对应分子量243kDa的滞留体积被洗脱。该 蛋白质以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断为纯的，且其分子量被评估为 101kDa。该名为At β G_101的纯化蛋白质的等电点在IEF凝胶 (PhastSystem，Pharmacia)中测定为5.6至4.9的范围内。At β G_101 于50℃下的比活度被测定为1100nkat/mg(利用4-硝基苯基-β-D-吡喃 葡糖苷作为底物，Bailey和Linko，1990)。
纯化的β-葡萄糖苷酶的热稳定性于不同温度下测定。该反应利用 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物，于0.1毫克/毫升BSA存在时 在pH5.0下进行60分钟。嗜热枝顶孢菌β G_101直到70℃都是稳定的。 曲霉菌参比酶(Novozym 188)于高达60℃时维持100％活性。
实施例7.纯化来自嗜热毛壳菌ALKO4261的β-葡萄糖苷酶
嗜热毛壳菌ALKO4261按照实施例1所述生长。纯β-葡萄糖苷酶 通过疏水相互作用、阴离子和阳离子交换色谱法继以凝胶过滤连续纯 化得到。于纯化期间收集到的级分的β-葡萄糖苷酶活性利用4-硝基苯 基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物测定(Bailey和Linko，1990)。
该培养上清液被施加于以含0.8摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾 pH6.0平衡的HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性相互作用柱。以从 平衡缓冲液至3毫摩尔磷酸钾pH6.0的线性梯度进行洗脱，随后以水 及6摩尔尿素洗脱。具有β-葡萄糖苷酶活性的第一级分于80至 30mS/cm电导区被洗脱。第二β-葡萄糖苷酶活性以6摩尔尿素洗脱。 以尿素洗脱的活性级分在以10毫摩尔Tris-HCl pH7.0平衡的10DG柱 (Bio-Rad)中被集合和脱盐。
经脱盐后，该样品被施加于以15毫摩尔Tris-HCl pH7.0平衡的 HiTrap DEAE FF阴离子交换柱。蛋白质不与柱结合而是于样品装填期 间被洗脱。该通流级分在用7毫摩尔乙酸钠pH4.5平衡的10DG柱 (Bio-Rad)中脱盐。
来自阴离子交换色谱的样品被施加于以10毫摩尔乙酸钠pH4.5平 衡的HiTrap SP FF阳离子交换柱。结合的蛋白质以10毫摩尔至400毫 摩尔乙酸钠pH4.5的线性梯度洗脱。收集在电导区6.5至12mS/cm中 被洗脱的具有β-葡萄糖苷酶活性的级分，在以7毫摩尔乙酸钠pH4.5 平衡的10DG柱(Bio-Rad)中脱盐并冷冻干燥。
经冻干的样品稀释到100微升水中并至于以含0.15摩尔氯化钠的 20毫摩尔磷酸钠pH4.5平衡的Superdex 75 HF10/30凝胶过滤柱。β- 葡萄糖苷酶活性于13.64毫升的滞留体积处被洗脱。收集到的级分被合 并、冷冻干燥并溶解于水。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断该蛋白质 为纯的，且评估其分子量为76kDa。该蛋白质被命名为Ct β G_76。
实施例8.纯化和表征来自金黄色嗜热子囊菌ALKO4242的β-葡萄 糖苷酶
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242按照实施例1所述生长。纯β-葡萄 糖苷酶通过疏水相互作用、阴离子和阳离子交换色谱法继以凝胶过滤 连续纯化得到。于纯化期间收集到的级分的β-葡萄糖苷酶活性利用4- 硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物测定(Bailey和Linko，1990)。蛋 白质含量利用牛血清白蛋白作为标准以BioRad分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)测量。
该培养上清液被施加于以含0.7摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾 pH6.0平衡的HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性相互作用柱。结合 的蛋白质以0.2摩尔硫酸铵至5毫摩尔磷酸钾pH6.0的线性梯度洗脱。 β-葡萄糖苷酶活性是于梯度期间电导区28.0至1.1mS/cm中洗脱的。 级分合并并以超滤浓缩。
该样品于10DG柱(Bio-Rad)中脱盐并施加于以20毫摩尔Tris-HCl pH7.0平衡的HiTrap DEAE FF阴离子交换柱。该酶于平衡缓冲液中以 0至0.2摩尔氯化钠的线性梯度洗脱且以含0.4摩尔氯化钠的20毫摩尔 Tris-HCl延迟洗脱。在约10至30mS/cm电导区中洗脱的样品以超滤浓 缩并以10DG柱(Bio-Rad)脱盐。
该样品被施加于以9毫摩尔乙酸钠pH4.5平衡的HiTrap SP XL阳 离子交换柱。该酶以10至400毫摩尔乙酸钠的线性梯度洗脱并利用400 毫摩尔乙酸钠pH4.5延迟洗脱。具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质在线 性梯度期间于5.0至11.3mS/cm电导区中被广泛洗脱。
来自阳离子交换色谱的活性物质被施加于以含0.15摩尔氯化钠的 20毫摩尔磷酸钠pH7.0平衡的Sephacryl S-300 HR 26/60柱。具有β- 葡萄糖苷酶活性的蛋白质以对应分子量294kDa的滞留体积被洗脱。所 收集的级分被合并、冻干并溶解于水。该蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳分析被判断为纯的，且其分子量被评估为81kDa，表示最可能 的蛋白质的单体形式。利用3至9等电点的凝胶进行等电聚焦(IEF)。 经银染色后，除了对应等电点4.55的狭窄带以外，等电点5.85以上的 广泛区域被染色。被命名为Ta β G_81的纯化蛋白质于50℃下的比活 度利用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物，经测定为600nkat/mg (Bailey和Linko，1990)。
纯化的β-葡萄糖苷酶的热稳定性于不同温度下测定。该反应利用 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物，于0.1毫克/毫升BSA存在时 在pH5.0下进行60分钟。金黄色嗜热子囊菌βG_81直到75℃都稳定。 曲霉菌参比酶(Novozym 188)于高达60℃时维持100％活性。
实施例9.纯化来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245的木聚糖酶
嗜热枝顶孢菌ALKO4245按照实施例1所述生长。培养上清液于 70℃下孵育24小时，之后以超滤浓缩。纯木聚糖酶通过疏水相互作用 及阳离子交换色谱法然后以凝胶过滤连续纯化得到。木聚糖酶活性利 用桦木木聚糖作为底物测定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作 为标准以BioRad蛋白分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)分析蛋白质。
浓缩的培养上清液被施加于以含1摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾 缓冲液pH6.0平衡的HiPrep 16/10丁基FF疏水性相互作用柱。结合的 蛋白质以从上述缓冲液至5毫摩尔磷酸钾pH6.0的线性梯度洗脱。蛋 白质级分于120至15mS/cm的广泛电导区域内洗脱。
来自疏水性相互作用柱的样品被施加于以8毫摩尔乙酸钠pH4.5 平衡的HiTrap SP XL阳离子交换柱。该蛋白质不与该柱结合，而是于 样品装填期间通流洗脱。此洗脱物经超滤浓缩。如上述重复进行疏水 性色谱。收集未结合的蛋白质并冷冻干燥。
该溶解样品被加样到用含有0.15摩尔氯化钠的20毫摩尔磷酸钠 缓冲液pH7.0平衡的Superdex 75 HR10/30凝胶过滤管。以11.2毫升滞 留体积从柱中被洗脱的蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断为纯 的。该纯化蛋白质的分子量根据分子量标准(预染色的SDS-PAGE标 准，Broad Range，Bio-Rad)评估为60kDa。该名为At XYN_60的蛋白 质于50℃下的比活度被测定为1800nkat/mg(IUPAC法1987，利用桦 木木聚糖作为底物)。较之50℃，相对活性于60℃增加约1.2倍及70 ℃下为1.65倍(10分钟，pH5.0)。对MUG2(4-甲基伞形酮基-β-D- 纤维二糖苷)、MUL(4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷)及MUG3(4- 甲基伞形酮基-β-D-纤维三糖苷)的比活度分别为54、33及78nkat/mg (50℃，pH5.0，10分钟)。这与家族10木聚糖酶也显示对芳基吡喃葡 糖苷的活性的事实相一致(Biely等1997)。
实施例10.纯化来自金黄色嗜热子囊菌ALKO4242的木聚糖酶
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242按照实施例1所述生长。纯木聚糖 酶通过疏水相互作用、阴离子及阳离子交换色谱法然后以凝胶过滤连 续纯化得到。木聚糖酶活性利用桦木木聚糖作为底物测定(IUPAC法 1987)。利用牛血清白蛋白作为标准以BioRad蛋白分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)分析蛋白质。
培养上清液被施加于以含0.7摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾缓冲 液pH6.0平衡的HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性相互作用柱。结 合的蛋白质以二步骤洗脱方案洗脱。先将盐浓度降低至0.2摩尔硫酸 铵，然后以含0.2摩尔硫酸铵的20毫摩尔磷酸钾pH6.0至5毫摩尔磷 酸钾pH6.0的线性梯度进行洗脱。该蛋白质以0.2摩尔硫酸铵洗脱(I ＝39mS/cm)。
该样品于10DG柱(Bio-Rad)中脱盐并被施加于以15毫摩尔 Tris-HCL pH7.0平衡的HiTrap DEAE FF阴离子交换管柱。蛋白质不与 阴离子交换管柱结合而是通流洗脱。超滤浓缩期间，该样品的电导率 通过加水调至对应20毫摩尔乙酸钠pH4.5的电导性，且pH调至4.5。
该样品被施加于以20毫摩尔乙酸钠pH4.5平衡的HiTrap SP XL 阳离子交换柱。结合的蛋白质以该平衡缓冲液至含1摩尔氯化钠的相 同缓冲液的线性梯度洗脱。该酶于1至7mS/cm的电导区被洗脱。该样 品经冷冻干燥且之后溶解于水。
冻干样品被溶解于水且施加于以含0.15摩尔氯化钠的20毫摩尔 磷酸钠pH7.0平衡的Superdex 75 HR 10/30凝胶过滤柱。该蛋白质以对 应分子量26kDa的滞留体积自柱中被洗脱。该蛋白质通过SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳判断为纯的。该纯蛋白质的分子量根据分子量标准(预 染色的SDS-PAGE标准，Broad Range，Bio-Rad)评估为30kDa。该名为 Ta XYN_30的纯化蛋白质的等电点以PhastSystem(Pharmacia)测定为 约6.8。Ta XYN_30于50℃下的比活度被测定为4800nkat/mg(IUPAC 法1987，利用桦木木聚糖作为底物)。
实施例11.内氨基酸测序
内肽是利用Q-TOF1(Micromass)仪器，通过电喷雾离子化结合 串联质谱(ESI-MS/MS)测序。蛋白质首先被烷基化且经消化成为胰 蛋白肽。所产生的肽在施加于Q-TOF1仪器之前通过纳米液相色谱技术 (反相)脱盐且部分分离。嗜热毛壳菌与嗜热枝顶孢菌纤维二糖水解酶 的内肽序列显示于表2。毛壳菌CBH的肽于对应的cbh基因被克隆后 得到。从枝顶孢菌CBH测定的肽未被利用于克隆该对应基因。
表2.从嗜热毛壳菌ALKO4265 CBH(1_C-4_C)及嗜热枝顶孢菌 ALKO4245的CBH(1_A-4_A)测定的内肽序列。
  肽 序列 肽1_C TPSTNDANAGFGR 肽2_C VAFSNTDDFNR 肽3_C FSNTDDFNRK 肽4_C PGNSL/ITQEYCDAQ/KK 肽1_A VTQFI/LTG 肽2_A MGDTSFYGPG 肽3_A CDPDGCDFN 肽4_A SGNSL/ITTDF
I/L＝具有相同分子量且ESI-MS/MS分析不能区别的亮氨酸及异亮 氨酸
Q/K＝谷氨酰胺及赖氨酸的分子量仅差0.036Da且ESI-MS/MS分析 不能区别
嗜热枝顶孢菌ALKO4245、嗜热毛壳菌ALKO4261及金黄色嗜热 子囊菌ALKO4242的纯化内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的 内肽序列列于表3、表4及表5。
表3.从嗜热枝顶孢菌ALKO4245 EG_40、嗜热毛壳菌ALKO4261 EG_54及金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 EG_28内切葡聚糖酶所测定的 内肽序列。
  蛋白质 肽 序列(a At EG_40 肽1 QSCSSFPAPLKPGCQWR 肽2 YALTFNSGPVAGK 肽3 VQCPSELTSR 肽4 NQPVFSCSADWQR 肽5 YWDCCKPSCGWPGK 肽6 PTFT Ct EG_54 肽1 EPEPEVTYYV 肽2 YYLLDQTEQY 肽3 RYCACMDLWEANSR 肽4 PGNTPEVHPQ/K 肽5 SI/LAPHPCNQ/K 肽6 QQYEMFR 肽7 ALNDDFCR 肽8 WGNPPPR Ta EG_28 肽1 I/LTSATQWLR 肽2 GCAI/LSATCVSSTI/LGQER 肽3 PFMMER 肽4 QYAVVDPHNYGR
(a I/L＝具有相同分子量且ESI-MS/MS分析不能区别的亮氨酸及 异亮氨酸，Q/K＝谷氨酰胺及赖氨酸的分子量仅差0.036Da且 ESI-MS/MS分析不能区别
表4.从嗜热枝顶孢菌ALKO4245 βG_101、嗜热毛壳菌ALKO4261 βG_76及金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 βG_81β-葡萄糖苷酶所测定的 内肽序列。
  蛋白质 肽 序列(a At βG_101 肽1 SPFTWGPTR 肽2 VVVGDDAGNPC 肽3 AFVSQLTLLEK 肽4 GTDVL/IYTPNNK 肽5 QPNPAGPNACVL/IR Ct βG_76 肽1 EGLFIDYR 肽2 PGQSGTATFR 肽3 ETMSSNVDDR 肽4 IALVGSAAVV 肽5 MWLCENDR 肽6 YPQLCLQDGPLGIR 肽7 ELNGQNSGYPSI Ta βG_81 肽1 TPFTWGK 肽2 LCLQDSLPGVR 肽3 GVDVQLGPVAGVAPR 肽4 VNLTLE 肽5 FTGVFGEDVVG 肽6 NDLPLTGYEK
(a I/L＝具有相同分子量且ESI-MS/MS分析不能区别的亮氨酸及 异亮氨酸
表5.自嗜热枝顶孢菌ALKO4245 XYN_60及金黄色嗜热子囊菌 ALKO4242 XYN_30木聚糖酶所测定的内含肽序列。
  蛋白质 肽 序列 At XYN_60 肽1 YNDYNLEYNQK 肽2 FGQVTPEN 肽3 VDGDATYMSYVNNK 肽4 KPAWTSVSSVLAAK 肽5 SQGDIVPRAK Ta XYN_30 肽1 VYFGVATDQNR 肽2 NAAIIQADFGQVTPENSMK 肽3 GHTLVWHSQLPSWVSSITDK 肽4 NHITTLMTR 肽5 AWDVVNEAFNEDGSLR 肽6 LYINDYNLDSASYPK 肽7 ASTTPLLFDGNFNPKPAYNAIVQDLQQ 肽8 QTVFLNVIGEDYIPIAFQTAR
实施例12.构建金黄色嗜热子囊菌、嗜热毛壳菌及嗜热枝顶孢菌 的基因组文库
嗜热毛壳菌ALKO4265及嗜热枝顶孢菌ALKO4245的基因组文库 是根据厂商说明制成Lambda 载体(Stratagene，USA)。根据 Raeder和Broda(1985)的方法分离的染色体DNA经Sau3A部分消化。 该经消化的DNA按大小分级且所选大小的片段(约5至23kb)被去磷 酸化且与BamHI消化的λ载体臂连接。该连接的混合物依制造商说明 (Stratagene，USA)使用Gigapack III Gold包装提取物包装。嗜热毛壳 菌及嗜热枝顶孢菌基因组文库的滴度分别为3.6×106及3.7× 105pfu/ml，扩增的文库的滴度分别为6.5×1010及4.2×108pfu/ml。
根据厂商说明，使用Lambda II/Xho I部分补平载体试剂盒 (Stratagene，USA)来构建金黄色嗜热子囊菌ALKO4242及嗜热毛壳菌 ALKO4261的基因组文库。根据Raeder和Broda(1985)的方法分离 的染色体DNA经Sau3A部分消化。该经消化的DNA按大小分级且该 所选大小的片段(约6至23kb)被补平且与XhoI消化的λFIXII载体 臂连接。该连接混合物依制造商说明(Stratagene，USA)使用Gigapack III金包装提取物包装。金黄色嗜热子囊菌ALKO4242及嗜热毛壳菌 ALKO4261基因组文库的滴度分别为0.2×106及0.3×106pfu/ml，扩增 基因库的滴度分别为1.8×109及3.8×109pfu/ml。
实施例13.从金黄色嗜热子囊菌、嗜热毛壳菌及嗜热枝顶孢菌中 克隆纤维二糖水解酶(cbh/cel7)基因
利用标准分子生物学技术进行DNA(质粒、DNA片段)的分离 及酶处理、大肠杆菌转化等。所使用的基本方法描述于标准分子生物 学手册，例如Sambrook等(1989)及Sambrook和RUSsell(2001)。
用于筛选依实施例12所述构建的基因组文库的探针以PCR扩增， 该PCR在反应中使用金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌 ALKO4265及嗜热枝顶孢菌ALKO4245基因组DNA作为模板。根据发 表的核苷酸序列(WO03/000941，Hong等，2003b)设计一些于PCR反 应中测试的引物。该PCR反应混合物包含50毫摩尔Tris-HCl pH9.0、 15毫摩尔硫酸铵、0.1％ Triton X-100、1.5毫摩尔氯化镁、0.2毫摩尔 dNTPs、5微摩尔的各引物及1单位Dynazyme EXT DNA聚合酶 (Finnzymes，芬兰)及约0.5至1微克的基因组DNA。PCR反应的条 件如下：95℃初次变性5分钟，后续进行30个循环的95℃变性1分钟、 嗜热子囊菌ALKO4242及毛壳菌ALKO4265模板于62℃(±8℃梯度) 退火1分钟或枝顶孢菌ALKO4245模板于58℃(±6℃梯度)退火1 分钟、72℃延伸2分钟及72℃最后延伸10分钟。
预期大小(从发表的cbh序列计算)的DNA产物得自所有使用的 基因组模板。预期大小的DNA片段自最特定的PCR反应分离且将它 们克隆到 Blunt-载体(Invitrogen，USA)。该插入片段通 过测序及与经数种限制酶消化的基因体DNA进行Souther斑点杂交来 表征。被选来用作筛选金黄色嗜热子囊菌、嗜热毛壳菌及嗜热枝顶孢 菌基因组文库的探针的PCR片段示于表6。
表6.用于PCR反应的引物及被选择用于从金黄色嗜热子囊菌、 嗜热毛壳菌及嗜热枝顶孢菌基因组文库筛选cbh/cel7基因的探针。并显 示基因组模板DNA及包含该探针片端的质粒名称。
  基因 正向引物 反向引物 模板DNA 片段(kb) 质粒 Ta cbh TCEL11                atgcgaactggcgttgggtcc TCEL12                 gaatttggagctagtgtcgacg 嗜热子囊菌 ALKO4242    0.8kb pALK1633 Ct cbh TCEL7                 cgatgccaactggcgctggac TCEL8                 ttcttggtggtgtcgacggtc 毛壳菌  ALKO4265 0.8kb pALK1632 At cbh TCEL13                agctcgaccaactgctacacg TCEL4                 accgtgaacttcttgctggtg 枝顶孢菌 ALKO4245  0.7kb pALK1634
从所有这些探针推导出的氨基酸序列与糖基水解酶家族7 (Henrissat，1991；Henrissat和Bairoch，1993)的一些发表的CBH序列 具有同源性(NCBI，国家生物技术信息中心，BLAST程序，2.2.9版； Altschul等，1990)。
来自表6所列的质粒的插入片段根据厂商说明(Roche，德国)以 洋地黄毒甙标记，且以标记的探针片段筛选扩增基因组文库(2×105 至3×105噬斑)。滤纸的杂交温度为68℃且该滤纸在室温下用 2xSSC-0.1％ SDS清洗2×5分钟，之后于68℃下用0.1xSSC-0.1％ SDS 加上所使用的同源探针清洗2×15分钟。各次杂交中得到一些阳性噬斑。 在筛选枝顶孢菌ALKO4245基因组文库时，一些阳性噬斑与所述探针 强烈杂交，但除此之外，不少噬斑与探针的杂交较弱。这表示该基因 组中可能存在其它纤维二糖水解酶基因，导致交叉反应。4至5个强烈 杂交的噬斑从嗜热子囊菌ALKO4242及毛壳菌ALKO4265基因组文库 筛选中被纯化。在嗜热枝顶孢菌ALKO4245的例子中，6个纯化噬斑 中有4个与使用的探针弱杂交。分离噬菌体DNA并以Souther斑点杂 交表征。该选出的与探针杂交的限制片段被亚克隆到pBluescript II KS+ 载体且该克隆的相关区域被测序。
总共克隆了4个cbh/cel7基因；1个来自金黄色嗜热子囊菌 ALKO4242，1个来自嗜热毛壳菌ALKO4265及2个来自嗜热枝顶孢菌 ALKO4245(在早期工作中，这些编号为At_cbh_C及At_cbh_A，后来 分别被命名为At cel7A及At cel7B)。表7归纳了有关用于筛选基因 的探针、从中分离基因的噬菌体克隆、包含带有启动子及终止子区域 的全长基因的选择限制片段、质粒名称及带有这些质粒的大肠杆菌菌 株的DSM保藏号的信息。
表7.用于克隆cbh/cel7基因的探针、噬菌体克隆株及选择的次克 隆株、质粒编号及对应大肠杆菌菌株的储存编号。
  基因 用于筛选的 探针 噬菌体 克隆 亚克隆至 pBluescript II的片段 质粒编号 大肠杆菌保 藏号 Ta ce/7A pALK1633 F12 3.2kb Xbal pALK1635 DSM 16723 Ct ce/7A pALK1632 F36 2.3kb Pvul-HindIII pALK1642 DSM 16727 At ce/7B pALK1634 F6 3.1kb EcoRI pALK1646 DSM 16728 At ce/7A pALK1634 F2 3.4kb Xhol pALK1861 DSM 16729
有关基因及推导蛋白质序列(SEQ ID NO：1至8)的相关信息分 别归纳于表8及9。
从含Ct cel7A及At cel7A基因的克隆的推导氨基酸序列中发现了 嗜热毛壳菌ALKO4265及嗜热枝顶孢菌ALKO4245的纯化CBH蛋白 质的肽序列(表2)。因此，可以推断编码嗜热毛壳菌及嗜热枝顶孢菌 的纯化CBH/Cel7蛋白质的基因被克隆。
表8.从金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌ALKO4265及 嗜热枝顶孢菌ALKO4245分离的cbh/cel7基因的概要。
  cbh基因 带内含子的长度 (bp)(a         编码区域(bp)(b 内含子数量 内含子长度 (bp)       SEQ ID NO： Ta ce/7A 1439 1371 1 65 1 Ct ce/7A 1663 1596 1 64 7 At CE/7B 1722 1377 3 134，122，87 3 At ce/7A 1853 1569 4 88，53，54，86 5
(a包含终止密码子
(b不包含终止密码子
表9.从金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌ALKO4265 及嗜热枝顶孢菌ALKO4245的cbh/cel7基因序列所推导的氨基酸序列 的概要。ss，信号序列。
  CHB    蛋白质 氨基 酸   数量 ss长度   NN/HMM(a C端   CBD(b 预测分子量       (Da，不包含ss)(c 预测的等电点 (不包含ss)   推导的N  糖基化位 占d)     SEQ ID NO：   TaCel7A 457 17/17 无 46873 4.44 2 2 CtCel7A 532 18/18 有，T497 至L532   54564 5.05 3 8 AtCel7B 459 21/21 无 47073 4.83 2 4 AtCel7A 523 17/17 有，Q488 至L523   53696 4.67 4 6
(a对信号序列的预测利用SignalP V3.0程序(Nielsen等，1997； Bendtsen等，2004)进行；NN值利用神经网络得到，HMM值利用隐马 尔可夫模型得到。
(b纤维素结合结构域(CBD)，指出了C端CBD区域的氨基酸 (M1(Met#1)包含在编号中)
(c不包含预测的信号序列。该预测于ExPASy服务器利用 Compute pI/MW工具进行(Gasteiger等，2003)。
(d N-X-S/T序列的数量。
金黄色嗜热子囊菌cel7A及嗜热枝顶孢菌Cel7A的推导氨基酸序 列(不含CBD的核心)彼此的同源性最高(以尼德曼-王氏整体比对， EMBOSS 3.0.0Needle分析，Matrix EBLOSUM62，间隔罚分10.0及延 长罚分0.5；Needleman和Wunsch，1970)。此外，推导的嗜热枝顶孢 菌Cel7A与推导的嗜热毛壳菌Cel7A具有较低的同一性。嗜热枝顶孢 菌Cel7B与本发明的CBH/Cel7序列最为不同。
推导的毛壳菌Cel7A序列与WO03/000941中所述的嗜热毛壳菌、 嗜热西塔利菌(Scytalidium thermophilum)及澳洲梭孢壳霉(Thielavia australiensis)CBHI的多肽具有最高同一性(以尼德曼-王氏整体比对， EMBOSS Needle分析，见上述)。同样的，推导的金黄色嗜热子囊菌 Cel7A序列与金黄色嗜热子囊菌发表的CBHI具有高度同一性 (WO03/000941，Hong等，2003B)。嗜热枝顶孢菌Cel7B与先前发表 的序列具有显著较低的同一性，其与来自水稻(Oryza sativa)的CBHI 多肽更密切相关。与推导的嗜热枝顶孢菌Cel7A序列同源性最高的是 黑耳(Exidia glandulosa)及嗜热枝顶孢菌CBHI多核苷酸 (WO03/000941)。比对显示，该克隆的金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、 嗜热毛壳菌ALKO4265及嗜热枝顶孢菌ALKO4245序列编码与糖苷水 解酶家族7的多肽具有高度同源性的CBH蛋白质，因此这些序列被命 名为Cel7A或Cel7B(Henrissat等1998)。
表10显示金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌ALKO4265 及嗜热枝顶孢菌ALKO4245梭孢壳霉的cbh/cel7基因的推导氨基酸序 列的互相比较，及进一步与数据库中发现的序列比较。
表10.与金黄色嗜热子囊菌ALKO4242、嗜热毛壳菌ALKO4265 及嗜热枝顶孢菌ALKO4245的cbh/cel7基因的推导氨基酸序列同源性 最高的序列。比对利用尼德曼-王氏整体比对进行(EMBLOSUM62，间 隔罚分10.0，延长罚分0.5)。*表示源自本工作所克隆的纤维二糖水 解酶基因之一的氨基酸序列。“核心”表示无CBD的比对。
             有机体、酶及登录号 同一性(％)          *金黄色嗜热子囊菌Cel7A                 金黄色嗜热子囊菌，AY840982              金黄色嗜热子囊菌，AX657575              金黄色嗜热子囊菌，AF421954                埃莫森篮状菌，AY081766         屏东类毛壳菌(Chaetomidium pingtungium)，                 AX657623                      Trichophaea saccata，AX657607              *嗜热枝顶孢菌Cel7A(核心)         构巢裸孢壳菌(Emericella nidulans)，AF420020                  (核心)                          *嗜热毛壳菌Cel7A(核心)          100.0  99.6  99.1  97.8  79.5  76.4  73.4  70.6  70.4  66.4             *嗜热毛壳菌Cel7A           嗜热毛壳菌，AY861347        嗜热毛壳菌，AX657571       嗜热西塔利菌，AX657627      澳洲梭孢壳霉，AX657577      嗜热枝顶孢菌，AX657569          黑耳，AX657613            *嗜热枝顶孢菌Cel7A      *金黄色嗜热子囊菌Cel7A(核心)        黑耳，AX657615          屏东类毛壳菌，AX657623     *嗜热枝顶孢菌Cel7B(核心)   100.0  91.9  91.7  74.7  74.6  72.3  68.0  66.9  66.4  60.8  60.7  60.2
        *嗜热枝顶孢菌Cel7B             水稻，AK108948               黑耳，AX657615        嗜热枝顶孢菌，AX657569(核心)  金黄色嗜热子囊菌，AX657575       *嗜热枝顶孢菌，Cel7A        *金黄色嗜热子囊菌，Cel7A   Trichophaea saccata，AX657607     *嗜热毛壳菌Cel7A(核心)    100.0  66.1  65.0  64.8  64.8  64.6  64.4  63.6  60.2      *嗜热枝顶孢菌Cel7A             黑耳，AX657613              黑耳，AX657615          嗜热枝顶孢菌，AX657569      澳洲梭孢壳霉，AX657577   *金黄色嗜热子囊菌Cel7A(核心)    嗜热西塔利菌，AX657627       嗜热毛壳菌，AX657571       屏东类毛壳菌，AX657623         *嗜热毛壳菌Cel7A         *嗜热枝顶孢菌Cel7B(核心)   100.0  77.9  77.9  77.5  71.0  70.6  67.5  67.5  67.3  66.9  64.6
实施例14.于里氏木霉生产重组CBH/Cel7蛋白质
构建表达质粒以生产来自金黄色嗜热子囊菌(Ta Cel7A)、嗜热 毛壳菌(Ct Cel7A)及嗜热枝顶孢菌(At Cel7A，At Cel7B早期工作 中这些蛋白质的暂时编号分别为At_CBH_C及At_CBH_A)的重组 CBH/Cel7蛋白。构建的表达质粒列于表11。包括其本身信号序列的重 组cbh/cel7基因通过PCR与里氏木霉cbh1(cel7A)启动子精确融合。 如Paloheimo等(2003)所述，转录终止由里氏木霉cel7A终止子确保 且利用构巢曲霉(A.nidulans)amdS标记基因筛选转化体。线性表达 盒(图2)于EcoRI消化后自载体骨架分离且被转化到里氏木霉A96 及A98原生质中(二菌株都删除了编码4种主要的纤维素酶 CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B及EGII/Cel5A的基因)。转 化按照Penttila等(1987)加上Karhunen等(1993)所述的修改进行， 以乙酰胺为唯一氮源筛选。转化体于筛选盘上在它们在PD上形成孢子 之前透过单一的分生孢子被纯化。
表11.用于里氏木霉中生产金黄色嗜热子囊菌ALKO4242(Ta Cel7A)、嗜热毛壳菌ALKO4265(Ct Cel7A)及嗜热枝顶孢菌 ALKO4245(At Cel7A，At Cel7B)的CBH/Cel7蛋白质所构建的表达盒。 表达盒的整体结构如图2所示。该克隆的cbh/cel7基因与里氏木霉 cbh1/cel7A启动子完全融合。
  CBH/Cel7 表达质粒 表达盒大小(a Ce/7A终止子(b Ta Cel7A pALK1851 9.0kb 245bp(XbaI) Ct Cel7A pALK1857 9.2kb 240bp(HindIII) AT Cel7B pALK1860 9.4kb 361bp(EcoRI) AT Cel7A pALK1865 9.5kb 427bp(EcoRV)
(a用于里氏木霉转化的表达盒利用EcoRI消化从载体骨架中分 离。
(b从基因组cbh1/cel7A终止子区域在终止密码子之后的核苷酸数 量。括号中包括位于3’端用于剪切基因组基因片段的限制位点。
转化子的CBH/Cel7生产是从摇瓶培养(50毫升)的培养上清液 分析。转化体在以5％磷酸二氢钾缓冲的复合乳糖基纤维素酶诱导培养 基(Joutsjoki等1993)中于28℃下生长7天。纤维二糖水解酶活性根 据van Tilbeurgh等(1988)利用4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷(MUL) 底物进行分析。选择转化体的基因型是利用Souther斑点法确认，其中 包含一些基因组消化物且相应的表达盒被用来作为探针。Ta Cel7A、 Ct Cel7A、At Cel7A及At Cel7B蛋白质的异源性表达以SDS-PAGE分 析，之后以考马斯染色。结果发现包含整合的表达盒的At Cel7B转化 体在SDS-PAGE中不能检测到纤维二糖水解酶活性或异源性蛋白质产 生，这表示利用所述实验设计于木霉中所产生的At Cel7B在检测水平 以下。
重组CBH/Cel7酶制剂以最适pH及热稳定性表征。得自金黄色嗜 热子囊菌、嗜热毛壳菌及嗜热枝顶孢菌的重组CBH/Cel7蛋白质的最适 pH是利用4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷(MUL)作为底物于pH3.0至 8.0的范围内在通用马氏(Mcllvaine)缓冲液中测定(图3A)。Ct Cel7A 及At Cel7A酶的最适pH为5.5，这以上活性开始逐渐下降。重组粗Ta Cel7A的最适pH为5.0(图3A)。重组Cel7酶的热稳定性通过测量 MUL于通用马氏缓冲液中最适pH下反应1小时的活性来测定。如结 果所示，Ta Cel7A及Ct Cel7A于70℃下保持60％以上的活性，然而 At Cel7A于较高温度下(≧65℃)表现出明显较不稳定(图3B)。
选择的CBH/Cel7转化体在28℃培养于实验室生物反应器中的上 述培养基中达3至4天，pH控制于4.4±0.2(氨气/磷酸)以获得用于 应用测试的物质。离心回收上清液并通过Seitz-K 150和EK过滤器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)过滤。
实施例15.于里氏木霉生产重组金黄色嗜热子囊菌Cel7A+CBD 融合蛋白质
将金黄色嗜热子囊菌Cel7A(AF478686，Hong等，2003b；SEQ ID NO：1)与接头及里氏木霉CBHI/Cel7A(AR088330，Srisodsuk等1993) 的CBD(＝Tr CBD)融合，随后按照2005年4月29日提交的 FI20055205/US11/119526所述在里氏木霉中生产融合蛋白(SEQ ID NO：28，对应核酸SEQ ID NO：27)。此外，金黄色嗜热子囊菌Cel7A 与接头及嗜热毛壳菌Cel7A的CBD(SEQ ID NO：7)(Ct CBD)融 合。为此，以PCR利用下列引物合成接头及嗜热毛壳菌Cel7A的CBD 的编码序列：
5’-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCG GACCCATCGGCTCGACCGTCCCTGGCCTTGAC-3’(正向序列)
及
5’-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTC CAGCAAATCAGGGAACTG-3’(反向序列)。
PCR反应混合物包含1xDyNAzymeTM EXT反应缓冲液(Finnzymes， 芬兰)、15毫摩尔镁离子、0.2毫摩尔dNTP、2微摩尔的各引物、0.6 单位的DyNAzymeTM EXT DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)及约75纳 克/30微升包含嗜热毛壳菌全长cel7A基因的模板DNA。PCR反应条件 如下：98℃初始变性2分钟，后续进行30个循环的98℃30秒、68℃ (±4℃梯度)退火30秒、72℃延伸30秒及72℃最后延伸10分钟。PCR 反应中的特定DNA片段于64℃至68.5℃的退火温度范围内得到。嗜热 毛壳菌的合成CBD片段被连接到金黄色嗜热子囊菌Cel7A基因之后， 在结构域之间形成GPIGST的接合点。在质粒中的PCR扩增片段经测 序确认(SEQ ID NO：29)。构建的融合Cel7A基因与里氏木霉cbh1 (Cel7A)启动子完全融合。转录终止由里氏木霉Cel7A终止子保证且 如Paloheimo等(2003)所述利用构巢曲霉amdS标记基因筛选转化体。
线性表达盒于NotI消化后自载体骨架分离且被转化到里氏木霉 A96原生质体。转化按照Penttila等(1987)所述加上如Karhunen等 (1993)所述的修改进行，以乙酰胺为唯一氮源筛选。转化体于筛选盘 上于PD上形成孢子之前通过单一分生孢子被纯化。
金黄色嗜热子囊菌Cel7A+CBD(SEQ ID NO：28及30)生产的 转化体由摇瓶培养(50毫升)的培养上清液分析。转化体于以5％磷 酸二氢钾pH5.5缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993) 中生长7天。纤维二糖水解酶活性根据van Tilbeurgh等(1988)利用 4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷糖MUL)底物进行分析。选择转化体的 基因型利用Souther印迹法确认，其中一些基因组消化物被包含且表达 盒被用来作为探针。SDS-PAGE分析显示重组金黄色嗜热子囊菌Cel7A +CBD酶于里氏木霉中被生产成为稳定的融合蛋白。
生产Ta Cel7A+Tr CBD融合蛋白(SEQ ID NO：28)的选择转化 体也在28℃培养于2升生物反应器中的上述培养基中达3至4天，pH 控制于4.4±0.2(氨气/磷酸)以获得用于应用测试的物质。离心回收 上清液并通过Seitz-K 150及EK过滤器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)过滤。
实施例16.比较纯化的重组纤维二糖水解酶的米-曼氏常数 (Michaelis-Menten)及纤维二糖抑制常数
测定于里氏木霉中异源性产生的纤维二糖水解酶(实施例14及 15)的米-曼氏常数及纤维二糖抑制常数。该酶按照实施例2所述纯化。 纯化酶的蛋白质浓度通过它们在280nm波长处的吸光度利用理论摩尔 消光是数测量，该系数从氨基酸序列计算(Gill和von Hippel，1989)。
Tr CBHI/Cel7A、Ta CBH/Cel7A、At CBH/Cel7A及Ct CBH/Cel7A 的动力学常数(Km及kcat值)及纤维二糖抑制常数(Ki)利用CNPLac (2-氯-4-硝基苯基-β-D-乳糖苷)作为底物于室温下(22℃)在50毫摩 尔磷酸钠缓冲液pH5.7中测量。为了测量抑制常数(Ki)，在5种抑 制剂浓度范围(0至100微摩尔或0至400微摩尔)(其与Ki值有关 (bracket the Ki value))存在的情况下使用8种不同底物浓度(31至 4000微摩尔)。所有试验均在微量滴定板上进行且总反应体积为200 微升。初始速率在各种情况下利用Varioscan(Thermolabsystems)微量 低定板读取仪，通过在405nm的测量值，以连续监测氯-硝苯苯酚盐阴 离子(CNP，2-氯-4-硝苯酚)的释放测量。结果由CNP标准曲线(从 0至100微摩尔)计算。所使用的酶浓度为：Tr CBHI/Cel7A 2.46μM，Ta CBH/Cel7A 1.58μM，Ct CBH/Cel7A 0.79μM及At CBH/Cel7A 3μM。Km 及kcat常数利用Origin程序，从米-曼氏方程式的拟合计算。使用林- 柏氏(Lineweaver-Burk)作图法、再作图(LWB斜率对[Glc2；纤维二 糖])及汉氏(Hanes)作图法区别竞争型及混合型抑制及确定抑制常 数(Ki)。
动力学测量的结果显示于表12及13。可见，Ct CBH/Cel7A明显 具有较高的对CNPLac的转换数(kcat)，同时专一性常数(kcat/Km) 相较于里氏木霉的CBHI/Cel7A为高。纤维二糖(Glc2)是所有测量的 纤维素酶的竞争型抑制剂，且Tr CBHI/Cel7A(用作对照)被纤维二糖 抑制得最强(也就是Ki值最低)。At CBH/Cel7A的抑制常数较Tr CBHI/Cel7A高出7倍以上。这些结果表明，所有三种新颖的纤维二糖 水解酶均能更好地作用于纤维二糖水解，因为其纤维二糖抑制作用较 里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I降低。
表12.比较四种GH家族7纤维二糖水解酶的纤维二糖抑制常数， 于22℃下在50毫摩尔磷酸钠缓冲液pH5.7中测量CNPLac。
  酶 Ki(微摩尔) 抑制类型 Ct Cel7A 39 竞争型 Ta Cel7A 107 竞争型 At Cel7A 141 竞争型 Tr Cel7A 19 竞争型
表13.比较嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Cel7A与里氏木霉 CBHI/Cel7A的米-曼氏动力学常数，于22℃下在50毫摩尔磷酸钠缓冲 液pH5.7中测量CNPLac。
  酶 kcat(分钟-1) Km(微摩尔) kcat/Km        (分钟-1摩尔-1) Ct Cel7A 18.8 1960 9.5  103 Tr Cel7A 2.6 520 5.0  103
实施例17.以重组纤维二糖水解酶水解结晶纤维素(Avicel)
纯化的重组纤维二糖水解酶Ct Cel7A、Ta Cel7A、Ta Cel7A+Tr CBD、Ta Cel7A+Ct CBD、At Cel7A以及Ct Cel7A的核心版(见下) 于两种温度下，45及70℃，以等摩尔量测试结晶纤维素水解；纯化的 里氏木霉Tr Cel7A及其核心版(见下)被用来比较。结晶纤维素(Ph101， Avicel；Fluka，Bucsh，瑞士)水解分析于1.5毫升试管规模50毫摩尔乙 酸钠pH5.0中进行。Avicel及酶溶液(1.4微摩尔)于45℃或70℃下摇 晃，且该反应混合物的最后体积为325微升。继续水解直至24小时， 于6个不同时间点采集样品且加入含9体积94％乙醇及1体积1摩尔 甘氨酸(pH11)的163微升停止试剂以停止反应。该溶液通过Millex GV13 0.22微米过滤单位(Millipore，Billerica，MA，USA)过滤。在上 清液中所形成的可溶性还原糖利用纤维二糖标准曲线(50至1600微摩 尔纤维二糖)，以对羟基苯甲酰肼(PA-HBAH)方法(Lever，1972) 测定。将新鲜调配的0.1摩尔PAHBAH(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO， USA)的0.5摩尔氢氧化钠(100微升)溶液加入到150微升的过滤样 品中并煮沸10分钟，之后令该溶液于冰上冷却。测量该样品于405nm 处的吸光度。
天然形式的包含CBD的纤维二糖水解酶的核心版依下列方式获 得：Ct Cel7A及Tr Cel7A暴露于蛋白水解消化以移除纤维素结合结构 域。木瓜蛋白酶(木瓜乳胶，14单位/毫克，Sigma)消化天然纤维二 糖水解酶在反应混合物中以37℃进行24小时，该反应混合物由10毫 摩尔L-半胱胺酸及2毫摩尔EDTA于50毫摩尔乙酸钠缓冲液(pH5.0) 加上木瓜蛋白酶组成(测试二种木瓜蛋白酶浓度：反应混合物中Cel7A 总量的1/5或1/10量的木瓜蛋白酶)。所形成的核心蛋白如上述以DEAE Sepharose FF(Pharmacia，Uppsala，瑞士)阴离子交换管柱纯化。产物 以SDS-PAGE分析。
于45及70℃下的水解结果分别如图4及5所示。该结果清楚地 显示，所有纤维二糖水解酶相较于现有技术的纤维二糖水解酶里氏木 霉Cel7A在这两种温度下皆表现出更快更完全的水解。在70℃下，来 自金黄色嗜热子囊菌ALKO4242及嗜热毛壳菌ALKO4265的热稳定性 纤维二糖水解酶较里氏木霉Cel7A出色，在嗜热子囊菌Cel7A核心与 里氏木霉Cel7A的CBD连接(Ta Cel7A+Tr CBD)的情况下亦然。令 人意外的是，本研究分离及克隆的纤维二糖水解酶在包含CBD时，其 在相较于同样酶浓度的现有技术的纤维二糖水解酶里氏木霉Cel7A (CBHI)时，于惯用的水解温度45℃下，其结晶纤维素水解的速率及 产物形成也同样出色。这些结果亦与酶制剂(At Cel7A及Ct Cel7A) 相同，该些酶制剂纯化自原始宿主且测试Avicel水解(50℃，24小时) (实施例2，表1)。
实施例18.克隆嗜热枝顶孢菌ALKO4245、嗜热毛壳菌ALKO4261 及金黄色嗜热子囊菌ALKO4242的内切葡聚糖酶基因
如实施例13所述使用标准分子生物学技术。枝顶孢菌、毛壳菌及 嗜热子囊菌基因组文库的构建已于实施例12中描述。
源自纯化的枝顶孢菌及毛壳菌内切葡聚糖酶的肽分别与一些糖基 水解酶家族45的内切葡聚糖酶具有同源性，例如白马兰诺菌 (Melanocarpus albomyces)Cel45A内切葡聚糖酶(AJ515703)及特异 腐质霉(Humicola insolens)内切葡聚糖酶(A 35275)。源自嗜热子 囊菌内切葡聚糖酶的肽与发表的金黄色嗜热子囊菌EG1内切葡聚糖酶 序列(AF487830)具有几乎100％的同一性。为了扩增用于筛选枝顶 孢菌及毛壳菌基因组文库的探针，根据肽序列设计简并引物。蛋白质 序列中肽的顺序及引物的相应有义或反义性质从与已发表的同源性内 切葡聚糖酶的比较推导而来。引物序列及该对应肽列于表14。由于嗜 热子囊菌肽与已发表的序列几乎具有100％同一性，该内切葡聚糖酶基 因直接从该基因组DNA通过PCR扩增。
表14.被合成且用来作为PCR引物以扩增用于从对应的基因组文 库中筛选嗜热枝顶孢菌cel45A(EG_40)及嗜热毛壳菌cel7B(EG_54) 基因的探针的寡核苷酸。
  蛋白质 肽 引物位置(a 引物序列(b At EG_40 肽5 1-6 TAYTGGGAYTGYTGYAARCC WFQNADN(c RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA Ct EG_54 肽7 3-7 GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT(d 肽2 5-9 GGAATTCGAYCARACNGARCARTA(e
(a用于设计引物序列的肽的氨基酸
(bN＝A、C、G或T；R＝A或G；Y＝C或T
(c不是源自纯化的枝顶孢菌EG_40蛋白质但源自与EG_40同源 的白马兰诺菌Cel45A序列(AJ515703)的肽
(d于寡核苷酸5’端加入HindIII限制位点
(e于寡核苷酸5’端加入EcoRI限制位点
利用基因组DNA为模板，以正向 (TAYTGGGAYTGYTGYAARCC)及反向 (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA)引物扩增供筛选基因组文库的嗜热 枝顶孢菌cel45A基因特异性探针。PCR反应混合物包含50毫摩尔 Tris-HCl pH9.0、15毫摩尔硫酸铵、0.1％ Triton X-100、1.5毫摩尔氯化 镁、0.1毫摩尔dNTP、0.5微摩尔的各引物、1单位Dynazyme EXT DNA 聚合酶(Finnzymes，芬兰)及约0.5微克的枝顶孢菌基因组DNA。PCR 反应的条件如下：95℃初次变性5分钟，后续进行30个循环的95℃变 性1分钟、50至60℃退火1分钟、72℃延伸2分钟及72℃最后延伸 10分钟。为了扩增嗜热毛壳菌cel7B基因(编码Ct EG_54)特异性探 针，使用正向引物(GGAATTCGAYCARACNGARCARTA)及反向引 物(GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT)。PCR反应混合物包含 10毫摩尔Tris-HCl pH8.8、50毫摩尔氯化钾、0.1％ Triton X-100、1.5 毫摩尔氯化镁、0.2毫摩尔dNTP、250皮摩尔的各引物、2单位Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)及约2微克的毛壳菌基因组DNA。 PCR反应的条件如上述，除了退火于45至50℃进行。
自枝顶孢菌PCR反应得到两个PCR产物。从琼脂糖凝胶分离约 0.6及0.8kb大小的DNA片段且被克隆到pCR4-TOPOTA载体 (Invitrogen，USA)，分别形成质粒pALK1710及pALK1711。该DNA 产物通过测序及与经过数种限制酶消化的基因组枝顶孢菌DNA进行 Souther印迹杂交来表征。用两个片段在严格清洗条件下得到的杂交模 式表明，从枝顶孢菌基因组文库可筛选出两个推导的内切葡聚糖酶基 因。这两个PCR产物的推导氨基酸序列与糖基水解酶家族45的一些已 发表的内切葡聚糖酶序列具有同源性(BLAST程序，美国国家生物技 术信息中心(National Center for Biotechnology Information)；Altschul 等，1990)。
从毛壳菌PCR反应得到一个预期大小(从同源的特异腐质霉内切 葡聚糖酶序列A35275推算)的PCR产物。此约0.7kb的DNA片段被 克隆导入pCR4-TOPOTA载体(Invitrogen，USA)以形成质粒 pALK2005并依上述方法分析。此PCR产物的推导的氨基酸序列与糖 基水解酶家族7的一些已发表的纤维素酶序列具有同源性(NCBI，美 国国家生物技术信息中心，BLAST程序，2.2.9版；Altschul等，1990)。
来自质粒pALK1710、pALK1711及pALK2005的插入片段根据厂 商说明(Roche，德国)以限制酶消化分离并以洋地黄毒甙标记。来自 扩增的枝顶孢菌或毛壳菌基因组文库的约1-2×105个噬斑被筛选。杂 交温度为68℃且该滤纸在室温下用2 x SSC-0.1％ SDS清洗2×5分钟， 之后于68℃下以0.1xSSC-0.1％ SDS清洗2×15分钟。得到一些阳性噬 斑，其中每次筛选纯化5至6个强杂交噬斑。噬菌体DNA通过Souther 印迹杂交法分离和分析。与探针杂交的限制性片段被亚克隆导入 pBluescript II KS+载体(Stratagene，USA)且相关部分被测序。在所有 情况下，该亚克隆的噬菌体片段包含感兴趣的全长基因。表15概括了 用于筛选内切葡聚糖酶基因的探针、自其中分离基因的噬菌体克隆、 包含带有启动子及终止子区域的全长基因的选择限制性片段、包含亚 克隆噬菌体片段的质粒名称及带有这些质粒的大肠杆菌菌株于 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH培养 物保藏中心(DSM)的保藏号的信息。
表15.用于克隆内切葡聚糖酶基因的探针、噬菌体克隆株及选择 的亚克隆、质粒名称及大肠杆菌菌株的对应保藏号。
  基因 基因组文库 用于筛选的探 针           噬菌体克 隆       亚克隆的片 段         质粒 大肠杆菌保 藏号       At ce/45A 嗜热枝顶孢菌 ALKO4245      pALK1710 P24 5.5kb Smal pALK1908 DSM 17324 At ce/45B 嗜热枝顶孢菌 ALKO4245      pALK1711 P41 6.0kb Xhol pALK1904 DSM 17323 Ct ce/7B 嗜热毛壳菌 ALKO4261    pALK2005 P55 5.1kb BamHI pALK2010 DSM 17729
金黄色嗜热子囊菌cel5A基因(编码EG_28)(SEQ ID NO:9)通 过PCR反应直接从分离的基因组DNA扩增。用于扩增的正向 (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTCGGCTCTCTCGTGCT C)及反向(AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT)引物根据 已发表的金黄色嗜热子囊菌egl基因(AF487830)设计。该PCR反应 混合物包含1xPhusion HF缓冲液、0.3毫摩尔dNTP、0.5微摩尔的各引 物、2单位Phusion TM DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)及约0.25微克的 嗜热子囊菌基因组DNA。PCR反应的条件如下：95℃初次变性5分钟， 后续进行25个循环的95℃ 30秒，于57至67℃退火30秒，72℃延伸 2.5分钟及72℃最后延伸5分钟。该包含精确基因(从启动至终止密码 子)的1.3kb扩增产物被作为SacII-PstI片段克隆导入pBluescript II KS+ 载体。测序两个独立的克隆株且选择一个克隆并命名为pALK1926。包 含pALK1926的大肠杆菌菌株于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH培养物保藏中心的保藏号为 DSM17326。
该基因及推导的蛋白质序列(SEQ ID NO：9至16)的相关信息 分别归纳于表16及17。纯化的枝顶孢菌EG_40(基因At cel45A)、 毛壳菌EG_54(基因Ct cel7B)及嗜热子囊菌EG_28(基因Ta cel5A) 内切葡聚糖酶的肽序列可见于克隆基因的对应推导氨基酸序列，这表 示适当的基因被克隆。
表16.从嗜热枝顶孢菌、嗜热毛壳菌及金黄色嗜热子囊菌分离的 内切葡聚糖酶基因的概要。
  内切葡聚糖酶基 因             含内含子的长度 (bp)(a         编码区域 (bp)(b   内含子数量 内含子长度(bp) SEQ ID NO： At ce/45A 1076 891 2 59，123 11 At ce/45B 1013 753 2 155，102 13 Ct ce/7B 1278 1275 - - 15 Ta ce/5A 1317 1005 5 55，60，59，74，61 9
(a包含终止密码子
(b不包含终止密码子
表17.嗜热枝顶孢菌、嗜热毛壳菌及金黄色嗜热子囊菌的推导内 切葡聚糖酶序列的概要。ss，信号序列。
  内切葡聚糖酶 蛋白质       氨基酸 数量   ss长度   NN/HMM(a CBD(b 预测分子量     (Da，不含ss)(c 预测等电点 (不含ss)   推定的N糖  基化位点(d SEQ ID NO：            At EG_40     297       21/21          有，K265 至L297         28625      4.79   2    12 At EG_40_like 251 20/20 无 23972 6.11 2 14 Ct EG_54 425 17/17 无 45358 5.44 1 16 Ta EG_28 335 30(e 无 33712 4.30 1 10
(a信号序列的预测是利用SignalP V3.0程序进行(Nielsen等， 1997；Bendtsen等，2004)；NN值利用神经网络得到及HMM值利用 隐马尔可夫模型得到。
(b蛋白质中存在纤维素结合结构域，指出C端CBD的氨基酸(根 据全长多肽编号)。
(c不包含预测的信号序列。该预测于ExPASy服务器利用 Compute pI/MW工具进行(Gasteiger等，2003)。
(d利用NetNGlyc 1.0程序预测推定的N糖基化位点N-X-S/T (Gupta等，2004)。
(e依据Hong等，2003a。
枝顶孢菌EG_40(At Cel45A)及EG_40_like(At Cel45B)、毛 壳菌EG_54(Ct Cel7B)及嗜热子囊菌EG_28(Ta Cel5A)内切葡聚糖 酶的推导蛋白质序列与糖基水解酶家族45(枝顶孢菌)、家族7(毛 壳菌)及家族5(嗜热子囊菌)的纤维素酶享有同源性，从而确认这些 被分离的基因是这些基因家族的成员。与枝顶孢菌内切葡聚糖酶 EG_40/Cel45A及EG_40_like/Cel45B具有最近同源性的分别是太瑞斯 梭孢壳霉(CQ827970，77.3％同一性)及嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)(AR094305，66.9％同一性)的内切葡聚糖酶(表18)。 两个分离的枝顶孢菌家族45内切葡聚糖酶互相仅具有53.7％的同一 性。在这些酶中，只有EG_40/Cel45A包含纤维素结合结构域(CBD)。
与毛壳菌EG_54/Cel7B内切葡聚糖酶的预测蛋白质序列的最近同 源性发现是白马兰诺菌Cel7A纤维素酶序列(AJ515704)。这二个蛋 白质序列之间的同一性为70.6％。
分离的金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶的蛋白质序列与已发表的 金黄色嗜热子囊菌EGI的序列(AF487830，表18)完全相同。其与埃 莫森篮状菌的β-葡聚糖酶序列(AX254752，71.1％同一性)有最近的 同源性。
表18.推导的嗜热枝顶孢菌EG_40、EG_40_like/Cel45B、嗜热毛 壳菌EG_54/Cel7B及金黄色嗜热子囊菌EG_28/Cel5A内切葡聚糖酶与 其同源性配对物的比较。该比对利用EMBOSS程序套件包的Needle程 序进行。*表示由本研究克隆的基因编码的内切葡聚糖酶。
                    有机体、酶及登录号 同一性(％)                   嗜热枝顶孢菌EG_40                              太瑞斯梭孢壳霉EG_45，CQ827970                          白马兰诺菌Cel45A，AJ515703                   粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，假设XM_324477     灰腐质霉嗜热变种(Humicola grisea var thermoidea)，EGL3，                       AB003107                                       特异腐质霉EG5，A23635                             嗜热毁丝霉家族45，AR094305                             *嗜热枝顶孢菌EG_40_like                100.0  77.3  75.3  68.9  67.5        67.3  57.9  53.7              *嗜热枝顶孢菌EG_40_like                        嗜热毁丝霉家族45，AR094305           稻瘟菌(Magnaporthe grisea)70-15假设性，XM_363402           太瑞斯梭孢壳霉EG45，CQ827970                         *嗜热枝顶孢菌EG_40                          白马兰诺菌Cel45A，AJ515703            100.0  66.9  61.9  56.8  53.7  52.8                     *嗜热毛壳菌EG_54                                    白马兰诺菌Cel7A，AJ515704                              灰腐质霉嗜热变种EGI，D63516                               特异腐质霉EGI，AR012244                                 嗜热毁丝霉EGI，AR071934                 尖镰孢菌西红柿变种(Fusarium oxysporum var lycopersici)EGI，                         AF29210                                          尖镰孢菌EGI，AR012243                  100.0  70.6  68.8  67.7  61.7  53.5        52.6
        金黄色嗜热子囊菌EG_28          金黄色嗜热子囊菌EG，AX812161     金黄色嗜热子囊菌EGI，AY055121   埃莫森篮状菌β-葡聚糖酶，AX254752      埃莫森篮状菌EG，AF440003             黑曲霉菌EG，A69663                黑曲霉菌EG，A62441               黑曲霉菌EG，AF331518            棘孢曲霉菌EGV，AF054512      100.0 100.0  99.4  71.1  70.4  70.1  69.9  69.6  68.5
实施例19.于里氏木霉中生产重组的内切葡聚糖酶
构建表达质粒以如实施例14所述生产重组枝顶孢菌 EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜热子囊菌EG_28/Cel5A蛋白 质。线性表达盒(表19)通过限制酶消化从载体骨架分离、转化到里 氏木霉A96中且依实施例14所述纯化转化体。
表19.为了在里氏木霉中生产嗜热枝顶孢菌EG_40/Cel45A、 EG_40_like/Cel45B及金黄色嗜热子囊菌EG_28/Cel5A内切葡聚糖酶构 建的表达盒。表达盒的示意性结构在图2中表述。
  内切葡聚糖酶 表达质粒 表达盒大小(a 异源性终止子(b At EG_40 pALK1920 10.9kb NotI 156bp(HindIII) At EG_40_like pALK1921 8.6kb EcoRI 282bp(SspI) Ta EG_28 pALK1930 8.6kb NotI 无
(a用于里氏木霉转化的表达盒利用EcoRI或NotI消化从自载体 骨架中分离。
(b指示包含在表达盒中的克隆基因的终止密码子后的核苷酸数 量。括号中指示位于基因的3’区域用来构建表达盒的限制性位点。
转化体的内切葡聚糖酶生产是由摇瓶培养的培养上清液分析的 (50毫升)。转化体按照实施例14生长，而重组蛋白质的酶活性基本 按照Bailey和Nevalainen 1981；Haakana等2004所述，于50毫摩尔 柠檬酸盐缓冲液pH4.8中测量50℃下培养上清液中还原糖自羧甲基纤 维素(2％(重量/体积)CMC)的释出。重组蛋白质的生产还通过SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳从培养上清液检测。枝顶孢菌EG_40特异性多克 隆抗体于兔中生产(芬兰赫尔辛基大学，University of Helsinki)。EG_40 的表达利用ProBlotWestern印迹AP系统(Promega)以抗EG_40抗体 通过Western印迹法验证。选出的转化体的基因型利用表达盒作为探 针以Souther印迹法分析。
异源性生产的内切葡聚糖酶的最适pH利用羧甲基纤维素作为底 物，于pH4.0至8.0的范围内在通用马氏缓冲液中测定。如图6A所示， 枝顶孢菌EG_40/Cel45A蛋白质的pH范围最广(4.5至6.0)，最适是 于pH5.5。其它异源性生产的内切葡聚糖酶的最适pH对于枝顶孢菌 EG_40_like/Cel45B及嗜热子囊菌EG_28/Cel5A分别为pH5.0至5.5及 6.0。这些内切葡聚糖酶酶活性的最适温度如上述于50至85℃的温度 范围内测定。枝顶孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜热子囊 菌EG_28/Cel5A的酶最高活性作用温度分别被测定为75℃、60℃及75 ℃(图6B)。
选择的转化体如实施例14所述，于2升生物反应器中培养4天(28 ℃，pH4.2)，以获得用于应用测试的物质。
实施例20.克隆嗜热枝顶孢菌ALKO4245、嗜热毛壳菌ALKO4261 及金黄色嗜热子囊菌ALKO4242β-葡萄糖苷酶基因
如实施例13所述使用标准分子生物学技术。枝顶孢菌、毛壳菌及 嗜热子囊菌基因组文库的构建已于实施例12中描述。
源自纯化的枝顶孢菌、毛壳菌及嗜热子囊菌β-葡萄糖苷酶的肽分 别与一些糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶具有同源性，例如纤维素 分解枝顶孢菌(Acremonium cellulolyticus)(BD168028)、绿木霉 (Trichoderma viride)(AY368687)及埃莫森篮状菌(AY072918)的 β-葡萄糖苷酶。为了扩增用于筛选枝顶孢菌、毛壳菌或嗜热子囊菌基 因组文库的探针，根据肽序列设计简并引物。蛋白质序列中肽的顺序 及引物的相应有义或反义性质是从与已发表的同源性β-葡萄糖苷酶的 比较推导而来。引物序列及该对应肽列于表20。
表20.被合成且用作PCR引物以扩增用于从对应基因组文库中筛 选嗜热枝顶孢菌cel3A(βG_101)、嗜热毛壳菌cel3A(βG_76)及金 黄色嗜热子囊菌cel3A(βG_81)基因的探针的寡核苷酸。
  蛋白质 肽 引物位置1(a 引物序列(b At βG_101 EKVNLT(c GARAARGTNAAYCTNAC 肽4 6-11 YTTRCCRTTRTTSGGRGTRTA Ct βG_76 肽6 4-9 TNTGYCTNCARGAYGG 肽1 3-8 TCRAARTGSCGRTARTCRATRAASAG Ta βG_81 肽3 1-5 AARGGYGTSGAYGTSCAR 肽1 2-7 YTTRCCCCASGTRAASGG
(a用于设计引物序列的肽的氨基酸
(b为了降低简并性，一些密码子的选择是根据真菌的偏好。 N＝A、C、G或T；R＝A或G；S＝C或G；Y＝C或T
(c不是源自纯化的枝顶孢菌βG_101蛋白质但源自与βG_101 具有同源性的纤维素分解枝顶孢菌β-葡萄糖苷酶序列(BD 168028) 的肽
利用枝顶孢菌、毛壳菌或嗜热子囊菌基因组DNA为模板，以所列 的引物组合(表20)扩增供筛选构建的基因组文库的探针。PCR反应 混合物包含50毫摩尔Tris-HCl pH9.0、15毫摩尔硫酸铵、0.1％ Triton X-100、1.5毫摩尔氯化镁、0.1至0.2毫摩尔dNTP、0.25微摩尔的各 引物、1单位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)及约0.5 微克的基因组DNA。PCR反应条件如下：95℃初次变性5分钟，接着 30个循环的95℃ 1分钟，于40℃(枝顶孢菌DNA为模板)、50℃(以 毛壳菌DNA为模板)或63℃(以嗜热子囊菌DNA为模板)退火1分 钟，72℃延伸2至3分钟及72℃最后延伸5至10分钟。
自琼脂糖凝胶分离预期大小的特定PCR产物(从同源性β-葡萄糖 苷酶序列BD168028、AY072918及AY368687估计)。约1.8kb(枝顶 孢菌)、1.5kb(毛壳菌)及1.52kb(嗜热子囊菌)的DNA片段被克隆 导入pCR4-TOPOTA载体(Invitrogen，USA)，分别形成质粒 pALK1924、pALK1935及pALK1713。该DNA产物通过测序及与经过 数种限制酶消化的基因组DNA进行Souther印迹杂交来表征。严格清 洗条件下的杂交模式表明，自枝顶孢菌、毛壳菌及嗜热子囊菌基因组 文库可分离出一个假定的β-葡萄糖苷酶基因。所有三个PCR产物的推 导氨基酸序列与糖基水解酶家族3的一些已发表的β-葡萄糖苷酶序列 具有同源性(BLAST程序，国家生物技术信息中心；Altschul等，1990)。
来自质粒pALK1713、pALK1924及pALK1935的插入片段根据厂 商说明(Roche，德国)通过限制酶消化分离并以洋地黄毒甙标记。约 1-2×105个来自扩增的枝顶孢菌、毛壳菌或嗜热子囊菌基因组文库的噬 斑如实施例18所述被筛选。得到一些阳性噬斑，其中自每次筛选纯化 5至6个强杂交噬斑。噬菌体DNA通过Souther印迹杂交法分离和分 析。与探针杂交的限制性片段被亚克隆导入pBluescript II KS+载体 (Stratagene，USA)且相关部分被测序。在所有情况下，亚克隆的噬菌 体片段包含感兴趣的全长基因。表21概括了用于筛选β-葡萄糖苷酶基 因的探针、自其中分离基因的噬菌体克隆、包含带有启动子及终止子 区域的全长基因的选择的限制性片段、包含亚克隆噬菌体片段的质粒 名称及带有这些质粒的大肠杆菌菌株于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH培养物保藏中心(DSM)保藏 号的信息。
表21.用于克隆β-葡萄糖苷酶基因的探针、噬菌体克隆及选择的 亚克隆、质粒名称及大肠杆菌菌株的相应保藏号。
  基因 基因组文库 用于筛选的 探针       噬菌体克 隆株     亚克隆片段 质粒 大肠杆菌保 藏号       At ce/3A 嗜热枝顶孢菌 ALKO4245      pALK1924 P44 6.0kb   HindIII pALK1925 DSM   17325 Ct ce/3A 嗜热毛壳菌 ALKO4261    pALK1935 P51 7.0kb XbaI  pALK2001 DSM   17667 Ta ce/3A 金黄色嗜热子囊菌 ALKO4242          pALK1713 P21 5.3kb BamHI pALK1723 DSM   16725
该基因及推导的蛋白质序列(SEQ ID NO：21至26)的相关信息 分别归纳于表22及23。纯化的枝顶孢菌βG_101(At Cel3A)、毛壳 菌βG_76(Ct Cel3A)及嗜热子囊菌βG_81(Ta Cel3A)蛋白质的肽序 列可见于克隆基因的相应的推导氨基酸序列，证明适当的基因被克隆。
表22.自嗜热枝顶孢菌、嗜热毛壳菌及金黄色嗜热子囊菌分离的 β-葡萄糖苷酶基因的概要。
  β-葡萄糖苷 酶基因      含内含子的 长度(bp)(a 编码区域 (bp)(b   内含子 数量   内含子长度(bp) SEQ ID NO：   At ce/3A 2821 2583 3 92，74，69 23 Ct ce/3A 2257 2202 1 52 25 Ta ce/3A 3084 2529 7 134，67，56，64，59，110，62 21
(a包含终止密码子
(b不包含终止密码子
表23.嗜热枝顶孢菌、嗜热毛壳菌及金黄色嗜热子囊菌的推导β- 葡萄糖苷酶序列的概要。ss，信号序列。
  β-葡萄糖苷酶 蛋白质 氨基酸 数量 ss长度 NN/HMM(a CBD(b 预测分子量 (Da，不含ss)(c 预测等电点 (不含ss) 推定的N糖 基化位点(d SEQ ID NO： At βG_101 861 19/18 无 91434 5.46 8 24 Ct βG_76 734 20/20 无 76457 6.3 2 26 Ta βG_81 843 19/19 无 89924 4.95 8 22
(a信号序列的预测利 用SignalP V3.0程序进行(Nielsen等，1997；Bendtsen等，2004)；NN 值利用神经网络得到及HMM值利用隐马尔可夫模型得到。
(b蛋白质中存在纤维素结合结构域。
(c不包含预测的信号序列。该预测于ExPASy服务器利用 Compute pI/MW工具进行(Gasteiger等，2003)。
(d利用NetNGlyc 1.0程序预测推定的N糖基化位点N-X-S/T (Gupta等，2004)。
枝顶孢菌βG_101/Cel3A、毛壳菌βG_76/Cel3A及嗜热子囊菌 βG_81/Cel3Aβ-葡萄糖苷酶的推导蛋白质序列与糖基水解酶家族3的酶 具有同源性，因此确认这些被分离的基因属于此基因家族。枝顶孢菌、 毛壳菌及嗜热子囊菌β-葡萄糖苷酶的最相近的对应物分别为稻瘟菌 (β-葡萄糖苷酶，AY849670)、粗糙脉孢菌(假设性，XM_324308) 及埃莫森篮状菌(β-葡萄糖苷酶，AY072918)中者(表24)。发现 的最高序列同一性(73.2％)是嗜热毛壳菌β G_76/Cel3A与粗糙脉孢 菌的假设性蛋白质，表示新颖的酶基因被克隆。
表24.推导的嗜热枝顶孢菌β G_101/Cel3A、嗜热毛壳菌 βG_76/Cel3A及金黄色嗜热子囊菌βG_81/Cel3A的β-葡萄糖苷酶与其 同源性配对物的比较。该比对利用EMBOSS程序包的Needle程序进行。
*表示本研究克隆的基因所编码的β-葡萄糖苷酶。
  有机体、酶及登录号 同一性(％)            *嗜热枝顶孢菌βG_101                稻瘟病菌β-葡萄糖苷酶，AY849670             粗糙脉孢菌假设性，XM_330871                  里氏木霉Cel3B，AY281374                   *金黄色嗜热子囊菌βG_81               棘孢曲霉菌β-葡萄糖苷酶，D64088         埃莫森篮状菌β-葡萄糖苷酶，AY072918                米曲霉菌，AX616738            纤维素分解枝顶孢菌β-葡萄糖苷酶，BD168028             *嗜热毛壳菌βG_76             100.0  73.1        71.1  65.2  62.2  59.5  58.9  58.2  57.2  40.9              嗜热毛壳菌βG_76                    粗糙脉孢菌，假设性XM_324308                 稻瘟菌，假设性XM_364573                     绿木霉BGI，AY368687            纤维素分解枝顶孢菌β-葡萄糖苷酶，BD168028            *嗜热枝顶孢菌βG_101                     里氏木霉Cel3B，AY281374                   *金黄色嗜热子囊菌βG_81          100.0  76.9  70.2  65.8  41.2  40.9  40.0  39.9          *金黄色嗜热子囊菌βG_81             埃莫森篮状菌β-葡萄糖苷酶，AY072918                米曲霉菌，AX616738                 棘孢曲霉菌β-葡萄糖苷酶，D64088      纤维素分解枝顶孢菌β-葡萄糖苷酶，BD168028            *嗜热枝顶孢菌βG_101                     里氏木霉Cel3B，AY281374                      *嗜热毛壳菌βG_76             100.0  73.2  69.5  68.0  65.7  62.2  57.9  39.9
实施例21.在里氏木霉中生产重组的β-葡萄糖苷酶
按照实施例14所述，构建表达质粒以生产重组枝顶孢菌 βG_101/Cel3A、毛壳菌βG_76/Cel3A及嗜热子囊菌βG_81/Cel3A蛋白 质。线性表达盒(表25)通过限制酶消化从载体骨架分离、转化导入 里氏木霉A96或A33(这两种菌株皆删除了编码4种主要纤维素酶 CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B及EGII/Cel5A基因)且依实 施例14所述纯化转化体。
表25.用于在里氏木霉中生产嗜热枝顶孢菌βG_101/Cel3A、嗜热 毛壳菌βG_76/Cel3A及金黄色嗜热子囊菌βG_81/Cel3A的β-葡萄糖苷 酶所构建的表达盒。表达盒的示意性结构表述于图2。
  β-葡萄糖苷酶 表达质粒 表达盒大小(a 异源性终止子(b At βG_101 pALK1933 10.5kb NotI 300bp(HindIII) Ct βG_76 pALK2004 10.1kb EcoRI 528bp(XbaI) Ta βG_81 pALK1914 10.9kb EcoRI 452bp(ApoI)
(a用于里氏木霉转化的表达盒利用EcoRI或NotI消化从载体骨 架中分离。
(b显示包含在表达盒中的克隆基因的终止密码子后的核苷酸数 量。括号中显示位于基因的3’区域用来构建表达盒的限制位点。
转化体的β葡聚糖酶生产是由摇瓶培养的培养上清液分析(50毫 升)。转化体如实施例14所述生长，且重组蛋白质的酶活性依Bailey 和Nevalainen 1981所述，利用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷底物于培 养上清液中测量。重组蛋白质的生产还通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 从培养上清液分析。此外，嗜热子囊菌βG_81的表达如实施例19所 述用抗βG_81抗体经Western印迹分析验证。选择的转化体的基因型 利用表达盒作为探针以Souther印迹法分析。
异源性生产的β-葡萄糖苷酶的最适pH利用4-硝基苯基-β-D-吡 喃葡糖苷作为底物，于pH3.0至8.0的范围内于通用马氏缓冲液中测 定。枝顶孢菌βG_101、毛壳菌βG_76及嗜热子囊菌βG_81的最适pH 分别为pH4.5、5.5及4.5(图7A)。这些β-葡萄糖苷酶的最适酶活性 温度如上述于50至85℃的温度范围内测定。枝顶孢菌βG_101/Cel3A、 毛壳菌βG_76/Cel3A及嗜热子囊菌βG_81/Cel3A的酶最高活性分别被 测定为在70℃、65℃及75℃(图7B)。
选择的转化体如实施例14所述，于2升生物反应器中培养4天(28 ℃，pH4.2)，以获得用于应用测试的物质。
实施例22.克隆嗜热枝顶孢菌ALKO4245及金黄色嗜热子囊菌 ALKO4242的木聚糖酶基因
如实施例13所述使用标准分子生物学技术。枝顶孢菌基因组文库 的构建已于实施例12中描述。
源自纯化的枝顶孢菌木聚糖酶的肽与糖基水解酶家族10的木聚 糖酶具有同源性，例如灰腐质霉XYNI(AB001030)。源自嗜热子囊 菌木聚糖酶的所有肽与已发表的金黄色嗜热子囊菌XYNA序列 (AJ132635)完全一致，因此证实该纯化的蛋白质是相同的酶。因此嗜 热子囊菌木聚糖酶基因通过PCR从基因组DNA扩增。
为了扩增用于从基因组文库中筛选枝顶孢菌木聚糖酶基因的探 针，根据肽序列设计简并引物(实施例11，表5)。蛋白质序列中肽 的顺序及引物的相应有义或义性质是从与同源性特异腐质霉XYNI序 列(AB001030)的比较中推导而来。有义引物序列 (GAYGGYGAYGCSACYTAYATG)是根据肽3(氨基酸2至8)，而 反义引物(YTTYTGRTCRTAYTCSAGRTTRTA)是根据肽1(氨基酸 4至11)。
预期大小的PCR产物(自同源性特异腐质霉XYNI序列AB001030 估算)自反应中得到。该约0.7kb大小的DNA片段被克隆导入 pCR4-TA载体(Invitrogen，USA)，得到质粒p ALK1714，且 通过测序表征。该PCR产物的推导氨基酸序列与糖基水解酶家族10 的一些已发表的木聚糖酶序列具有同源性(BLAST程序，国家生物技 术信息中心；Altschul等，1990)。
来自质粒pALK1714的插入片段根据厂商说明(Roche，德国)， 通过限制性酶消化而分离并以洋地黄毒甙标记。约1-2×105个来自扩 增的枝顶孢菌基因组文库的噬斑如实施例18所述被筛选。得到一些阳 性噬斑，其中有5个强烈杂交噬斑被纯化。噬菌体DNA通过Souther 印迹杂交法被分离并分析。与探针杂交的0.3kb XbaI限制性片段被亚 克隆导入pBluescript II KS+载体(Stratagene，USA)，形成质粒 pALK1725。pALK1725的相关部分被测序并发现其包含全长嗜热枝顶 孢菌xyn10A基因(SEQ ID NO:19)。包含pALK1725的大肠杆菌菌株 在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH培 养物保藏中心的保藏号为DSM16726。
金黄色嗜热子囊菌xyn10A基因(SEQ ID NO:17)利用PCR反应 直接自分离的基因组DNA扩增。用于扩增该基因的正向 (TTATACCGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCCTAC)及反向 (TTATAGGATCCACCGGTCTATACTCACTGCTGCAGGTCCTG)引物 是根据发表的金黄色嗜热子囊菌xynA基因(AJ132635)设计。PCR 反应混合物包含50毫摩尔Tris-HCl pH9.0、15毫摩尔硫酸铵、0.1％ Triton X-100、1.5毫摩尔氯化镁、0.3毫摩尔dNTP、1微摩尔各引物、 1单位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)及约0.5微克 的嗜热子囊菌基因组DNA。PCR反应的条件如下：95℃初次变性5分 钟，接着30个循环的95℃1分钟，于60至66℃退火1分钟，72℃延 伸3分钟及72℃最后延伸10分钟。该包含准确基因(从启动至终止密 码子)的1.9kb扩增产物被作为SacII-BamHI片段克隆导入pBluescript II KS+载体。三个独立克隆被测序且选择一个克隆被并命名为 pALK1715。包含pALK1715的大肠杆菌菌株于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH培养物保藏中心的保藏号为 DSM16724。
该基因及推导的蛋白质序列(SEQ ID NO：17至20)的相关信息 分别归纳于表26及27。纯化的枝顶孢菌XYN_60及嗜热子囊菌 XYN_30蛋白质的肽序列可见于该克隆基因(分别为At xyn10A及Ta xyn10A)的相应推导氨基酸序列，证明适当的基因被克隆。
表26.从嗜热枝顶孢菌及金黄色嗜热子囊菌分离的木聚糖酶基因 的概要。
  木聚糖酶基 因         含内含   子的长   度(bp)(a 编码区域 (bp)(b   内含子 数量   内含子长度 (bp)       SEQ ID NO：   At xyn10A 1471 1248 2 135，85 19 Ta xyn10A 1913 987 10 73，74，68，103，69，65，93，66，100，212 17
(a包含终止密码子
(b不包含终止密码子
表27.嗜热枝顶孢菌及金黄色嗜热子囊菌的推导木聚糖酶序列的 概要。ss，信号序列。
  木聚糖酶蛋 白质       氨基 酸   数量 ss长度   NN/HMM(a CBD(b       预测分子量     (Da，不含ss)(c 预测等电点 (不含ss)   推定的N糖基 化位点(d    SEQ ID NO：   At     XYN_60 416 19/19 有，W385至 L416       42533 6.32 1-2 20 Ta XYN_30 329 26(e 无 32901 5.81 0 18
(a信号序列的预测利用SignalP V3.0程序进行(Nielsen 等，1997；Bendtsen等，2004)；NN值利用神经网络得到及HMM值利 用隐马尔可夫模型得到。
(b存在碳水化合物结合结构域CBD，显示C端CBD的氨基酸 (根据全长多肽编号)。
(c不包含预测的信号序列。该预测于ExPASy服务器利用 Compute pI/MW工具进行(Gasteiger等，2003)。
(d利用NetNGlyc 1.0程序预测假定的N糖基化位点N-X-S/T (Gupta等，2004)。
(e根据Lo Leggio等，1999
枝顶孢菌及嗜热子囊菌木聚糖酶的推导蛋白质序列与糖基水解酶 家族10的一些酶具有同源性，鉴别相应的基因是家族10木聚糖酶的 成员。发现的枝顶孢菌XYN_60/Xyn10A最相近的对应物是灰腐质霉 XYLI(AB001030)，其显示与XYN_60具有67.1％同一性(表28)。 该分离的金黄色嗜热子囊菌XYN_30/Xyn10A木聚糖酶的预测蛋白质 序列与发表的金黄色嗜热子囊菌XYNA(P23360，表28)的序列完全 相同。最相近的同源性在黑曲霉菌的木聚糖酶序列中发现(A62445， 69.7％同一性)。
表28.推导的嗜热枝顶孢菌XYN_60/Xyn10A及金黄色嗜热子囊 菌XYN_30/Xyn10A木聚糖酶与其同源性配对物的比较。该比对利用 EMBOSS程序包的Needle算法进行。*表示本研究克隆的基因所编码 的木聚糖酶。
  有机体、酶及登录号 同一性(％)              *金黄色嗜热子囊菌XYN_30                       金黄色嗜热子囊菌XynA，P23360                    金黄色嗜热子囊菌XynA，AF127529                      黑曲霉菌木聚糖酶，A62445                       棘孢曲霉菌木聚糖酶，AR137844             土曲霉菌(Aspergillus terreus)家族10xyn，DQ087436      酱油曲霉菌(Aspergillus sojae)，XynXI AB040414    产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)木聚糖酶AY583585 100.0 100.0  99.4  69.7  69.9  65.0  63.8  62.5             *嗜热枝顶孢菌XYN_60                      灰腐质霉XYLI，AB001030                 稻瘟病菌70-15，假设性XM_364947              棘孢曲霉菌木聚糖酶，AR149839              埃莫森篮状菌木聚糖酶，AX403831       玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)木聚糖酶，AY575962           稻瘟病菌XYL5，AY144348                     埃莫森篮状菌，AX172287           100.0  67.1  63.8  53.7  51.8  51.4  48.5  46.9
实施例23.在里氏木霉中生产重组木聚糖酶
按照实施例14所述，构建表达质粒以生产重组枝顶孢菌 XYN_60/Xyn10A及嗜热子囊菌XYN_30/Xyn10A蛋白质。线性表达盒 (表29)通过限制酶消化从载体骨架分离、转化导入里氏木霉A96，且 依实施例14所述纯化转化体。
表29.为了在里氏木霉中生产嗜热枝顶孢菌XYN_60/Xyn10A及 金黄色嗜热子囊菌XYN_30/Xyn10A木聚糖酶所构建的表达盒。表达盒 的示意性结构示于图2。
  木聚糖酶 表达质粒 表达盒大小(a 异源性终止子(b At XYN_60 pALK1912 9.0kb 150bp(BamHI) Ta XYN_30 pALK1913 9.3kb 无
(a用于里氏木霉转化的表达盒通过EcoRI消化从载体骨架中分 离。
(b显示包含在表达盒中的克隆基因的终止密码子后的核苷酸数 量。括号中显示位于基因的3’区域用来构建表达盒的限制位点。
转化体的木聚糖酶生产从摇瓶培养的培养上清液分析(50毫升)。 转化体按照实施例14生长，且重组蛋白质的酶活性依Bailey和 Poutanen 1989所述，于50毫摩尔柠檬酸盐缓冲液pH5.3中测量50℃ 下培养上清液中还原糖自桦木木聚糖(1％重量/体积)的释出。重组蛋 白质的生产还通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从培养上清液中分析。此 外，这两种木聚糖酶的表达如实施例19所述以抗XYN_30或抗XYN_60 抗体通过Western印迹法确认。选择转化体的基因型是利用表达盒作 为探针以Souther印迹法分析。
嗜热子囊菌XYN于里氏木霉中生产，且该异源性生 产的蛋白质的最适利用木木聚作为底物，于pH3.0至8.0的范 围内在通用马氏缓冲液中测定(图8A)。最适pH值测定为pH4.5。 XYN_30酶活性的最适温度经测定为75℃(图8B)。
选择的转化体如实施例14所述，于2升生物反应器中培养4天(28 ℃，pH4.2)，以获得用于应用测试的物质。
实施例24.重组纤维二糖水解酶在水解中的性能
纯化的重组纤维二糖水解酶的性能在水解研究中以纯化的里氏木 霉酶评估。水解用纯化酶的受控混合物作用于数种经预处理的底物进 行。依实施例14及15所述，获得包含不同的克隆CBH/Cel7酶的里氏 木霉培养过滤物，且利用实施例2所述的亲和色谱法纯化CBH酶。此 外，纯里氏木霉纤维素酶(依Suurnakki等，2000所述纯化)被用于酶 混合物中。试验中所使用的纤维二糖水解酶为：
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 CBH(Ta Cel7A)
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 CBH(Ta Cel7A)，带有基因连接 的里氏木霉CBD(Ta Cel7A+Tr CBD)
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 CBH(Ta Cel7A)，带有基因连接 的嗜热毛壳菌CBD(Ta Cel7A+Ct CBD)
嗜热枝顶孢菌ALKO4245 CBH(At Cel7A)
嗜热毛壳菌ALKO4265 CBH(Ct Cel7A)
各种待测试的CBH/Cel7(剂量14.5毫克/克底物干物质)与里氏 木霉的EGII/Cel5A(3.6毫克/克)或与包含里氏木霉EGI/Cel7B(1.8 毫克/克)、EGII/Cel5A(1.8毫克/克)、木聚糖酶pI9(Tenkanen等 1992)(5000nkat/克)及乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)(AXE) (Sundberg和Poutanen，1991)(250nkat/克)的混合物一起使用。所有 混合物均额外添加来自商业酶制剂Novozym188的β-葡萄糖苷酶 (176nkat/克干重)。包含酶混合物及悬浮于0.05摩尔乙酸钠的10毫克 (干物质)/毫升底物的三份重复试管于45℃下以磁搅拌混合孵育48小 时。还制备含灭活的酶及相应底物的参比样品。水解产物的释出用葡 萄糖为标准以DNS法测定还原糖(表30)。
下列底物于试验中使用：
结晶纤维素(Avicel)
经清洗蒸气预处理的云杉纤维(以3％重量/重量二氧化硫浸渗20 分钟，之后于215℃下以蒸气预处理5分钟)，干物质25.9％(SPRUCE)。
经清洗的湿氧化玉米杆纤维(WOCS)
经清洗蒸气预处理的柳木纤维(于210℃下预处理14分钟)，干 物质23.0％(WILLOW)。
表30.用CBH酶水解产物(45℃，pH5.0)。48小时水解后的反 应产物为还原糖(毫克/毫升)，测量葡萄糖作为标准。缩写：CBH＝ 纤维二糖水解酶；EGI＝里氏木霉的内切葡聚糖酶I(Cel7B)；EGII＝ 里氏木霉的内切葡聚糖酶II(Cel5A)；bG＝β-葡萄糖苷酶(来自Novozym 188)；XYL＝里氏木霉的木聚糖酶pI9(XYNII)，AXE＝里氏木霉的 乙酰木聚糖酯酶；nd＝未进行。
  酶 CBH                  额外的酶 底物 Avicel SPRUCE  WOCS   WILLOW Ta Cel7A             EGII，bG Ta Cel7A+Tr CBD      EGII，bG Ta Cel7A+Ct CBD      EGII，bG At Cel7A             EGII，bG Ct Cel7A             EGII，bG 里氏木霉的Cel7A      EGII，bG 2.0     2.0     2.8     2.0 5.8     4.0     4.4     4.0 4.9     3.7     4.6     3.7 5.3     3.3     4.5     3.3 6.0     2.6     3.4     2.6 4.7     2.9     2.9     2.9 Ta Cel7AEGII，    EGI，XYL，AXE，bG Ta Cel7A+Tr CBD   EGII，EGI，XYL，AXE，bG Ta Cel7A+Ct CBD   EGII，EGI，XYL，AXE，bG At Cel7A          EGII，EGI，XYL，AXE，bG Ct Cel7A          EGII，EGI，XYL，AXE，bG 里氏木霉的Cel7A   EGII，EGI，XYL，AXE，bG nd      nd      4.3     2.8 nd      nd      7.2     5.9 nd      nd      7.2     5.6 nd      nd      6.4     5.4 nd      nd      5.6     4.0 nd      nd      6.0     4.1
在表30中，不同的纤维二糖水解酶根据相同的蛋白质水解剂量加 以比较。结果显示在纤维素底物(Avicel及云杉纤维)上，具有基因连 接的CBD的金黄色嗜热子囊菌的Cel7A比里氏木霉CBHI/Cel7A显示 出明显较高的水解作用。没有CBD，则的金黄色嗜热子囊菌Cel7A对 这些底物的效率较低。嗜热枝顶孢菌及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶对 一些底物的性能也比里氏木霉CBHI/Cel7A好；特别是，嗜热毛壳菌对 纯纤维素(Avicel)表现出高效率。
当底物包含显著量的半纤维素(柳木及玉米杆)时，CBHI/Cel7A 酶明显同时需要额外的半纤维素酶及内切葡聚糖酶才能有效作用。若 额外的半纤维素酶不存在时，具有基因连接的CBD的金黄色嗜热子囊 菌Cel7A再次呈现明显的最高的水解活性。若加上最重要的半纤维素 分解酶(木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶及EGI)，具有基因连接的CBD 的金黄色嗜热子囊菌的Cel7A同样呈现最高效率。嗜热枝顶孢菌Cel7A 较里氏木霉酶更有效且嗜热毛壳菌Cel7A产生的水解产物与里氏木霉 CBHI/Cel7A的水平相同。里氏木霉的纤维素结合结构域看来比嗜热毛 壳菌的CBD在金黄色嗜热子囊菌Cel7A的水解性能效率略好，即使该 差异相当小。
可以做出结论，当木霉菌酶混合物中CBHI/Cel7A被本发明所生 产的纤维二糖水解酶取代时，就具有基因连接的CBD的金黄色嗜热子 囊菌Cel7A而言，其以本实验设计所判断的水解活性被明显改善，就 嗜热枝顶孢菌Cel7A及嗜热毛壳菌Cel7A而言亦得到改善。同时考虑 到本发明所生产的纤维二糖水解酶较好的温度稳定性，结果显示在45 ℃以上的温度下使用本发明生产的纤维二糖水解酶可明显改善纤维素 酶的酶混合物的性能。
实施例25.重组内切葡聚糖酶于水解中的性能
在与纯化CBH/Cel7及CBH/Cel6酶混合的水解试验中，比较包含 内切葡聚糖酶的制剂对数种经预处理底物的作用。依实施例19所述获 得包含不同的克隆内切葡聚糖酶酶的里氏木霉培养过滤物。利用热处 理(60℃，2小时，pH5)自混合物中去除不耐热蛋白质以富集该酶， 上清液被使用于水解试验。此外，纯里氏木霉纤维素酶(依Suurnakki 等，2000所述纯化)被用于酶混合物中。试验中所使用的内切葡聚糖酶 为：
嗜热枝顶孢菌ALKO4245内切葡聚糖酶At EG_40/Cel45A (ALKO4245 EG_40)
嗜热枝顶孢菌ALKO4245内切葡聚糖酶At EG_40_like/Cel45B (ALKO4245 EG_40_like)
金黄色嗜热子囊菌ALKO4242内切葡聚糖酶Ta EG_28/Cel5A (ALKO4242 EG_28)
下列底物于试验中使用：
经清洗蒸气预处理的云杉纤维(以3％二氧化硫浸渗20分钟，之 后于215℃下以蒸气预处理5分钟)，干物质25.9％(SPRUCE)。
汽爆的玉米杆纤维(于210℃下以蒸气预处理5分钟)，干物质 31.0％(SECS)
待研究的内切葡聚糖酶(剂量840nkat/克干物质，根据IUPAC， 1987的内切葡聚糖酶对HEC的活性)与里氏木霉的纤维二糖水解酶 (CBHI/Cel7A，8.1毫克/克干物质及CBHII/Cel6A，2.0毫克/克干物质) 或与具有基因连接的里氏木霉CBD的金黄色嗜热子囊菌Cel7A(10.1 毫克/克干物质)一起使用。里氏木霉的纯化(Suurnakki等，2000)EGI (Cel7B)及EGII(Cel5A)亦被包含于试验中以供比较。所有混合物均 额外添加来自Novozym 188的β-葡萄糖苷酶(为了使β-葡萄糖苷酶总 剂量达560nkat/克干重，使用相对高剂量以补偿不同EG制剂背景活性 的差异)。三份重复试管于45℃下混合孵育达48小时，并准备含不活 化的酶及相应底物的参比样品。水解产物的释出采用以葡萄糖为标准 的DNS法测定还原糖(表31)。
表31.不同内切葡聚糖酶制剂与里氏木霉的纤维二糖水解酶或与 包含里氏木霉CBD的金黄色嗜热子囊菌Cel7A一起使用时的水解产 物。于48小时水解(45℃，pH5.0)后的反应产物为还原糖(毫克/毫 升)，以葡萄糖为标准测量。缩写：CBHI＝里氏木霉的纤维二糖水解 酶I(Cel7A)；CBHII＝里氏木霉的纤维二糖水解酶II(Cel6A)；EGI ＝里氏木霉的内切葡聚糖酶I(Cel7B)；EGII＝里氏木霉的内切葡聚 糖酶II(Cel5A)；bG＝β-葡萄糖苷酶(来自Novozym 188)；nd＝ 未进行。
      酶                                     底物 内切葡聚糖酶      CBH/Cel7               SPRUCE   SECS 未添加EG          里氏木霉的CBHI及CBHII  2.4      3.2 EGI               里氏木霉的CBHI及CBHII  3.5      4.6 EGII              里氏木霉的CBHI及CBHII  3.8      3.5 At EG_40          里氏木霉的CBHI及CBHII  4.9      4.3 At EG_40like      里氏木霉的CBHI及CBHII  4.5      4.8 Ta EG_28          里氏木霉的CBHI及CBHII  3.0      3.9 未添加EG   金黄色嗜热子囊菌Cel7A+TrCBD   1.8      2.1 EGI        金黄色嗜热子囊菌Cel7A+TrCBD   nd.      4.2 EGII       金黄色嗜热子囊菌Cel7A+TrCBD   3.2      nd. At EG_40   金黄色嗜热子囊菌Cel7A+TrCBD   4.8      4.0 Ta EG_28   金黄色嗜热子囊菌Cel7A+TrCBD   1.5      nd.
在表31中，不同的内切葡聚糖酶根据相同的水解活性剂量加以比 较。这有利于试验中所使用的对底物(羟乙基纤维素)特异活性较低 的酶，且低估对羟乙基纤维素具有高特异活性酶的效率。在任何情况 下，结果显示嗜热枝顶孢菌内切葡聚糖酶在与混合物中使用的这两种 纤维二糖水解酶一起作用时具有非常好的水解表现。嗜热枝顶孢菌内 切葡聚糖酶的表现与里氏木霉EGI/Cel7B类似，其对于含半纤维素的 玉米杆底物是非常有效的酶，因为它的强烈木聚糖酶副活性。金黄色 嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Cel5A(ALKO4242EG_28)比里氏木霉酶显 示较低的水解活性。
可以做出以下结论，来自嗜热枝顶孢菌的内切葡聚糖酶与相应的 木霉菌酶比较时，在此实验设计所评判的水解作用上，表现出相当或 提高的效率。同时考虑到本发明所描述的内切葡聚糖酶的热稳定性， 结果显示在高于45℃的温度下使用本发明所述的内切葡聚糖酶可改善 纤维素酶混合物的性能。
实施例26.于高温下水解经蒸气预处理的云杉
令干物质为25.9％的经清洗的汽爆云杉纤维(以3％重量/重量二 氧化硫浸渗20分钟，之后于215℃下以蒸气预处理5分钟)以10毫克 /毫升的稠度悬浮于5毫升的0.05摩尔乙酸钠缓冲液中。此底物利用不 同的酶混合物于试管中在调节到不同温度的水浴中磁性搅拌水解达72 小时。于各采样点，取出水解中的三份重复试管，煮沸10分钟以终止 酶水解，将其离心，分析上清液中水解的反应产物。仅包含底物的空 白(仅加入缓冲液代替酶)亦以相应条件孵育。
利用下列成分制备嗜热性纤维素酶的混合物：
嗜热性CBH/Cel7制剂，其包含具有基因的里氏木霉CBHI/Cel7A 的CBD的金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 Cel7A。该蛋白质制剂以实施 例15所述生产并根据实施例2纯化，形成纯化的Ta Cel7A+Tr CBD 制剂，其蛋白质含量为5.6毫克/毫升。
嗜热性内切葡聚糖酶制剂，其包含嗜热枝顶孢菌ALKO4245内切 葡聚糖酶At EG_40/Cel45A。该蛋白质如实施例19所述于里氏木霉中 生产。为了富集该嗜热性成分，该耗尽培养基经热处理(60℃下2小 时)。所得到的制剂包含4.9毫克/毫升的蛋白质及422nkat/毫升的内切 葡聚糖酶活性(根据IUPAC，1987)。
依实施例21所述制备嗜热性β-葡萄糖苷酶制剂，其包含金黄色 嗜热子囊菌ALKO4242 β-葡萄糖苷酶Ta βG_81/Cel3A。为了富集该 嗜热性成分，发酵液经热处理(65℃下2小时)。所得到的制剂包含 4.3毫克/毫升蛋白质及6270nkat/毫升的β-葡萄糖苷酶活性(根据Bailey 和Linko，1990)。
这些酶制剂组合如下(每10毫升混合物):CBH/Cel7制剂4.51 毫升，内切葡聚糖酶制剂5.19毫升及β-葡萄糖苷酶制剂0.29毫升。此 混合物被用作嗜热性酶的“混合物1”。
为了比较及参比，构建商用里氏木霉酶的现有技术混合物，组合 下列成分(每10毫升)：8.05毫升Celluclast 1，5L FG(来自Novozymes A/S)及1.95毫升Novozym188(来自Novozymes A/S)。此被称为“里 氏木霉酶”。
酶基于混合物的FPU活性定剂量，“混合物1”每1克干物质云 杉底物使用5.5FPU的剂量，及“里氏木霉酶”每1克干物质云杉底物 使用5.8FPU。
于水解后24、48及72小时收集样品并如上所述处理。利用以葡 萄糖为标准的还原糖分析(Bernfeld，1955)定量水解产物。水解产物 的量于图9以还原糖表示。
结果清楚地显示本发明所述的酶相较于现有技术的里氏木霉酶于 55及60℃下对云杉底物有更好的性能。根据HPLC分析，自底物的最 高糖收率为每10毫克干云杉底物5.67毫克。由于酶剂量相对较低，最 终糖收率明显较低。对热稳定性酶而言，在55℃及60℃下基于还原糖 分析的糖收率理论值分别为66％及57％。对现有技术的里氏木霉酶而 言，在55℃及60℃下分别只有31％及11％。
实施例27.于高温下水解经蒸气预处理的玉米杆
令干物质为45.3％的汽爆玉米杆纤维(于195℃下处理5分钟) 以10毫克/毫升的稠度悬浮于5毫升的0.05摩尔乙酸钠缓冲液中。其 处理及测量按实施例26所述进行。
利用下列成分构建本发明所述的嗜热性纤维素酶的混合物：
嗜热性CBH制剂，其包含具有基因连接的里氏木霉CBHI/Cel7A 的CBD的金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 Cel7A(Ta Cel7A+Tr CBD， 实施例15)。该制剂的蛋白质含量为31毫克/毫升。
包含嗜热枝顶孢菌ALKO4245内切葡聚糖酶At EG_40/Cel45A的 嗜热性内切葡聚糖酶制剂如实施例19所述获得。该浓缩的酶制剂包含 2057nkat/毫升的内切葡聚糖酶活性(根据IUPAC，1987)。
依实施例21所述得到包含金黄色嗜热子囊菌ALKO4242 β-葡萄 糖苷酶Ta βG_81/Cel3A的嗜热性β-葡萄糖苷酶制剂，其含有11500 nkat/毫升的β-葡萄糖苷酶活性(根据Bailey和Linko，1990)。
嗜热性木聚糖酶产物，其包含源自弯曲野野村菌(Nonomuraea flexuosa)DSM43186的AM24木聚糖酶。该产物利用如WO2005/100557 所述的已经以表达盒p ALK1502转化的重组里氏木霉菌株制备。该固 体产物溶解于水以形成10％溶液并得到具有208000nkat/毫升木聚糖 酶活性的酶制剂(依Bailey等，1992分析)。
这些酶制剂式组合如下(每10毫升混合物):CBH/Cel7制剂7.79 毫升，内切葡聚糖酶制剂0.96毫升，β-葡萄糖苷酶制剂1.14毫升及木 聚糖酶制剂0.31毫升。此混合物被当作嗜热性酶的“混合物2”使用。
为了比较及参比，组合(每10毫升)8.05毫升Celluclast 1，5L FG (来自Novozymes A/S)及1.95毫升Novozym 188(来自Novozymes A/S)，构建商用里氏木霉酶的现有技术混合物。此被称为“里氏木霉 酶”。
于水解后24、48及72小时收集样品并按上述处理。利用以葡萄 糖为标准的还原糖分析(Bernfeld，1955)，定量水解产物。将含酶样品 的结果减去底物空白的结果，以还原糖表示的水解产物浓度如图10所 示。
结果清楚地显示本发明所述的酶相较于现有技术的木霉酶有更好 的性能。在45℃下，嗜热性酶的混合物相较于里氏木霉酶显示更有效 率的水解：水解更快，同时得到更高的糖收率。根据HPLC分析，自 底物的最高糖收率(包括使用的未清洗底物中的游离可溶性糖)为每 10毫克干底物5.73毫克。因此，混合物2酶的水解在48小时内几乎 完成。在55℃及57.5℃下，本发明所述的嗜热性酶相较于现有技术木 霉酶亦显示明显更好的性能。
实施例28.于高温下利用热稳定性木聚糖酶混合物水解经预处理 的玉米杆
重复实施例27所述的程序，除了木聚糖酶产物XT 02026A3被包 含了在里氏木霉中生产的金黄色嗜热子囊菌ALKO4242木聚糖酶Ta XYN_30/Xyn10A的嗜热性木聚糖酶制剂取代。如实施例23所述生产 的发酵液含有132000nkat/毫升的木聚糖酶活性(依Bailey等，1992分 析)。
这些酶制剂组合如下(每10毫升混合物):CBH/Cel7制剂7.64 毫升、内切葡聚糖酶制剂0.96毫升、β-葡萄糖苷酶制剂1.15毫升及木 聚糖酶制剂0.25毫升。此混合物被当作嗜热性酶的“混合物3”使用。
为了比较及参比，组合(每10毫升)8.05毫升的Celluclast 1，5L FG (来自Novozymes A/S)及1.95毫升的Novozym 188(来自Novozymes A/S)，构建商用里氏木霉酶的现有技术混合物。此被称为“里氏木霉 酶”。
于水解后24、48及72小时收集样品并按上述处理。利用使用葡 萄糖为标准的还原糖分析(Bernfeld，1955)定量水解产物。将含酶样品 的结果减去底物空白的结果，以还原糖表示的水解产物浓度如图11所 示。
结果清楚地显示本发明所述的酶混合物相较于现有技术的木霉酶 的性能更好。在45℃下，嗜热性酶的混合物相较于里氏木霉酶显示更 有效率的水解。在55℃及60℃下，本发明所述的嗜热性酶相较于现有 技术的木霉酶清楚地显示更好的水解性能。新的酶混合物于60℃的性 能与现有技术酶于45℃的性能处于相同的水平。
实施例29.于高温下利用热稳定性木聚糖酶混合物水解经预处理 的云杉
重复实施例28所述的程序，以清洗过的汽爆云杉纤维(以3％重 量/重量二氧化硫浸渗20分钟，之后于215℃下以蒸气预处理5分钟， 干物质为25.9％)为底物，水解温度为45、55及60℃。于水解后24、 48及72小时收集样品并按上述处理。利用使用葡萄糖为标准的还原糖 分析(Bernfeld，1955)定量水解产物。将含酶样品的结果减去底物空白 的结果，以还原糖表示的水解产物浓度如图12所示。
结果清楚地显示本发明所述的酶混合物相较于现有技术的木霉酶 在所有的研究温度下都具有更好的性能。在45℃下，嗜热性酶的混合 物相较于里氏木霉酶显示更有效率的水解，这明显是因为在长期水解 时具有更好的稳定性。本发明所述的酶混合物在55℃的效率仍与45℃ 处于相同水平，然而现有技术的混合物在此温度下对底物效率差。本 发明所述的嗜热性酶于60℃下呈现降低的水解作用，然而与现有技术 的酶于45℃的性能几乎在相同水平上。
实施例30.评价来自嗜热枝顶孢菌ALKO4245、嗜热毛壳菌 ALKO4261及金黄色嗜热子囊菌ALKO4242的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖 抑制
由嗜热枝顶孢菌ALKO4245、嗜热毛壳菌ALKO4261及金黄色嗜 热子囊菌ALKO4242菌株所生产的培养过滤液如实施例1中所述。这 些制剂的β-葡萄糖苷酶活性(依Bailey和Linko，1990测量)分别为21.4 nkat/毫升、5.6nkat/毫升及18.6nkat/毫升。为了比较，本试验亦包含商 业酶Celluclast 1，5L(β-葡萄糖苷酶534nkat/毫升)及Novozym 188(β- 葡萄糖苷酶5840nkat/毫升)。
为了评估不同的β-葡萄糖苷酶对葡萄糖抑制的敏感性，在不同浓 度的葡萄糖存在下进行标准活性分析程序。β-葡萄糖苷酶活性分析的 底物(对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷)溶液中添加葡萄糖，令分析混合 物中的葡萄糖浓度调整为0至0.5摩尔的值。除此葡萄糖添加之外，该 分析使用标准方法进行(Bailey和Linko，1990)。不同葡萄糖浓度存 在时的活性以不含葡萄糖的活性的百分比表示于图13。
结果显示来自嗜热毛壳菌及金黄色嗜热子囊菌的β-葡萄糖苷酶 受到葡萄糖抑制的影响小于商用酶中存在的β-葡萄糖苷酶：Novozym 188中的曲霉菌源β-葡萄糖苷酶或Celluclast 1，5L中的木霉源β-葡萄糖 苷酶。嗜热枝顶孢菌酶显示与Celluclast的里氏木霉酶相当的表现。尤 其是嗜热毛壳菌酶明显较不受高葡萄糖浓度的影响。因此这些结果显 示考虑到葡萄糖的抑制，在高葡萄糖浓度的工业条件下，使用新β-葡 萄糖苷酶，特别是来自嗜热枝顶孢菌ALKO4242及嗜热毛壳菌 ALKO4261菌株，在水解中具有明显的优势。
实施例31.酶混合物于高温下的滤纸活性
酶制剂的滤纸活性是根据IUPAC(1987)方法测定，除了酶反应 于50至70℃的温度下进行之外，按照程序进行。计算的FPU活性单 位是根据试验条件下于1小时内水解4％滤纸底物所需的酶量。FPU活 性被视为代表酶制剂的总纤维素酶活性。
酶混合物为依实施例27所述制备的混合物2、依实施例28所述 制备的混合物3、及混合物4。混合物4的制备是组合实施例27所述 的酶制剂(每10毫升混合物)如下：CBH/Cel7制剂7.84毫升，内切 葡聚糖酶制剂0.99毫升及β-葡萄糖苷酶制剂1.17毫升。
作为参比用的酶混合物，代表现有技术混合物，为：
依实施例26所述的“里氏木霉酶”制剂制备的“里氏木霉酶A”。
“里氏木霉酶B”的构建是组合(每10毫升)8.05毫升Econase CE (AB Enzymes OY，Rajamaki，芬兰的商用里氏木霉纤维素酶制剂)及1.95 毫升Novozym 188(来自Novozymes A/S)。
酶制剂于不同温度下测定的FPU活性以标准(IUPAC，1987)条 件(50℃)的百分比表示于图14。
结果清楚显示本发明的混合物较之基于来自木霉及曲霉酶的现有 技术混合物在高温下(60至70℃)具有较高的整体纤维素酶活性。
实施例32.利用新颖的β-葡萄糖苷酶制备槐糖
高浓度的淀粉水解物混合物(Nutriose 74/968，Roquette)经依实施 例21所述生产的富含金黄色嗜热子囊菌βG_81/Cel3A的酶制剂处理， 以产生包含显著量的纤维素酶诱导物(槐糖)的糖混合物以克服葡萄 糖阻遏。
富含Ta β G_81/Cel3A的酶制剂被加入70％(重量/重量)Nutriose 溶液中，使最终浓度为1克总蛋白/升。该混合物的容器在65℃水浴中 恒速搅拌下孵育3天，并用来作为两种不同木霉菌株(A47及Rut-C30) 的摇瓶培养基的碳源。酶处理的作用是以7天摇瓶培养期间所形成的 内切葡聚糖酶活性测量。而参比培养于相同条件下以未经处理的 Nutriose为碳源进行。用测试菌株在经Ta βG_81/Cel3A预处理的 Nutriose培养基上进行的摇瓶培养中，得到增加超过两倍的活性。结果 显示于图15。
保藏的有机体列表
  菌株 包含的质粒 保藏机构 保藏日期 保藏号 嗜热枝顶孢菌 ALKO4245      - CBS(1) 2004年9月20日 CBS116240 金黄色嗜热子囊菌 ALKO4242          - CBS(1) 2004年9月20日 CBS116239 嗜热毛壳菌 ALKO4265    - CBS(2) 1995年11月8日 CBS730.95(4) 大肠杆菌 pALK1635 DSMZ(3) 2004年9月16日 DSM 16723 大肠杆菌 pALK1642 DSMZ 2004年9月16日 DSM 16727 大肠杆菌 pALK1646 DSMZ 2004年9月16日 DSM 16728 大肠杆菌 pALK1861 DSMZ 2004年9月16日 DSM 16729 大肠杆菌 pALK1715 DSMZ 2004年9月16日 DSM 16724 大肠杆菌 pALK1723 DSMZ 2004年9月16日 DSM 16725 大肠杆菌 pALK1725 DSMZ 2004年9月16日 DSM 16726 大肠杆菌 pALK1904 DSMZ 2005年5月13日 DSM 17323 大肠杆菌 pALK1908 DSMZ 2005年5月13日 DSM 17324 大肠杆菌 pALK1925 DSMZ 2005年5月13日 DSM 17325 大肠杆菌 pALK1926 DSMZ 2005年5月13日 DSM 17326 大肠杆菌 pALK2001 DSMZ 2005年10月18日 DSM 17667 大肠杆菌 pALK2010 DSMZ 2005年11月18日 DSM 17729
(1)the Centralbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，the Nether-lands
(2)the Centralbureau Voor Schimmelcultures at Oosterstraat 1，3742 SK BAARN，The Nether-lands
(3)Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany
(4)[在目前储存期结束后，样品将按照关于使菌株于本专利可行 使时间过后可取得的协议而储藏。]
参考文献
Altschul S.，Gish W.，Miller W.，Myers E.W.and Lipman D.J. (1990)Basic local alignment search tool(基本局部比对搜索工具).J. MoI.Biol.215：403-410.
Badger，P.C.(2002)Ethanol from cellulose：a general review.In Trends in new crops and new uses(来自纤维素的乙醇：一般性综述—— 在新作物和新用途中的趋势).J.Janick and A.Whipkey(eds.).ASHS Press，Alexandria，VA，USA，pp.17-21.
Bailey M.J.and K.M.H.Nevalainen(1981)Induction，isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solu-bilizing cellulase(改进生产溶解性纤维素酶的稳定的里氏木霉 突变株的诱导，分离和测试).Enz Microbiol Technol.3：153-157.
Bailey，MJ.，Biely，P.and Poutanen，K.(1992)Interlaboratory testing for assay of xylanase activity(木聚糖酶活性分析的实验室间测 试).J Biotechnol.23:257-270.
Bailey，M.J.and Linko，M.(1990)Production of β-galactosidase by Aspergillus oryzae in submerged bioreactor cultivation(通过米曲霉的液 面下生物反应器培养生产β-半乳糖苷酶).J.Biotechnol.16:57-66.
Bailey M.J.and Poutanen K.(1989)Production of xylanases by strains of Aspergillus(通过曲霉菌株生产木聚糖酶).Appl.Microbiol. Biotechnol.30:5-10.
Bailey M.，Siika-aho M.，Valkeajarvi A.and Penttila M.(1993) Hydrolytic properties of two cellulases of Trichoderma reesei expressed in yeast(在酵母菌中表达的里氏木霉的两种纤维素酶的水解性质). Biotehnol.Appl.Biochem 17：65-76.
Bendtsen J.D.，Nielsen H.，von Heijne G.and Brunak S.(2004) Improved prediction of signal peptides：SignalP 3.0(改进的信号肽预测： SignalP 3.0).J.MoI.Biol.340：783-795.
Bemfeld，B.(1955)Amylases，α and β.In：Methods in Enzymology， vol.1(酶学方法，第一卷，淀粉酶α和β)，Eds.Colowick，S.P.and Kaplan，N.O.Academic Press，New York，pp.149-158.
Biely P.，Vrsanska M.，Tenkanen M.，Kluepfel D.(1997)Endo-beta- l，4-xylanase families：differences in catalytic properties(β-1，4-内切木聚 糖酶家族：催化性质不同).Journal of Biotechnology 57：151-166.
Coen，D.M.(2001)The polymerase chain reaction(聚合酶链反应). In：Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，More，D.D.，Seidman，J.G.， Smith，K.and Struhl，K.(eds.)Current protocols in molecular biology(分 子生物学实验方法汇编).John Wiley & Sons.Inc.，Hoboken，USA.
Gasteiger，E.，Gattiker A.，Hoogland C，Ivanyi I.，Appel R.D.and Bairoch A.(2003)ExPASy：the proteiomics server for in-depth protein knowledge and analysis(ExPASy：深入的蛋白质知识和分析的蛋白组 学服务).Nucleic Acids Res.31：3784-3788.
Gellissen，G.(ed.)(2005)Production of recombinant proteins.Novel microbial and eukaryotic expression systems.(生产重组蛋白——新型微 生物和真核表达系统)Wiley-VCH Verlag Gmbh&Co.Weinheim， Germany.
Gill，S.C，and von Hippel，P.H.(1989)Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data(从氨基酸序列数据 计算蛋白质消光系数).Anal.Biochem.182：319-326.
Gupta，R.，E.Jung and S.Brunak.(2004)Prediction of N-glycosylation sites in human proteins，In preparation.(预测人类蛋白 中的N-糖基化位点，准备中)www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIyc/
Haakana H.，Miettinen-Oinonen A.，Joutsjoki V.，Mantyla A.， Suominen P，and Vehmaanpera J.(2004)Cloning of cellulase genes from Melanocarpus albomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei.(从白马兰诺菌中克隆纤维素酶基因及其在里氏木霉中的有效表 达)Enz.Microbiol.Technol.34：159-167.
Henrissat B.(1991)A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem.(根据氨基酸序列类似性对糖 基水解酶进行分类)J.280：309-316.
Henrissat B.and Bairoch A.(1993)New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities(在根据 氨基酸序列类似性对糖基水解酶进行分类中的新家族).Biochem.J. 293：781-788.
Henrissat B.and Bairoch A.(1996).Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.(糖基水解酶基于序列的分类的更 新)Biochem.J.316：695-696
Henrissat B.，Teeri T.T.and Warren R.A.J.(1998)A scheme for designating enzymes that hydrolyse the polysaccharides in the cell wall of plants.(水解植物细胞壁中的多糖的酶的命名方案)FEBS Letters 425： 352-354.
Hong J.，H.Tamaki，K.Yamamoto，and Kumagai H.(2003a)Cloning of a gene encoding a thermo-stabile endo-β-1，4-glucanase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast.(编码金黄色嗜热子 囊菌的耐热β-1，4-内切葡聚糖酶的基因的克隆及其在酵母菌中的表达) Biotech.Letters 25：657-661.
Hong J.，Tamaki H.，Yamamoto K.and Kumagai H.(2003b)Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast.(编码金黄色嗜热子囊菌的热稳 定性纤维二糖水解酶的基因的克隆及其在酵母菌中的表达)Appl. Microbiol.Biotechnol.63：42-50.
IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)(1987). Measurement of cellulase activities.(纤维素酶活性的测量)Pure and Appl.Chem.59：257-268.
Joutsjoki，V.V.，Torkkeli T.K.and Nevalainen K.M.H.(1993) Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P(gamP)gene：production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei.(转化带有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P (gamP)基因的里氏木霉：用里氏木霉生产异源性葡萄糖淀粉酶)Curr. Genet.24：223-228.
Karhunen T.，Mantyla A.，Nevalainen K.M.H.and Suominen P.L. (1993)High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei.I. Endoglucanase I overproduction.(里氏木霉中高频率一步基因置换.I. 内切葡聚糖酶I过度生产)MoI.Gen.Genet.241：515-522.
Kurabi A.，Berlin A，Gilkes N.，Kilburn D.，Markov A.，Skomarovsky A.，Gusakov A.，Okunev O.，Sinitsyn A.，Gregg D.Xie D.and Saddler J. (2005)Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv-pretreated Douglas-Fir by novel and commercial fungal cellulases.(经汽爆的和乙醇有机溶液-预处理的花旗松以新型商业化真 菌纤维素酶进行酶法水解)Appl.Biochem and Biotechn.VoI 121-124： 219-229.
Lever，M.(1972)A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.(碳水化合物比色测定的新反应)Anal.Biochem.，47： 276-279.
Lo Leggio，L.，Kalogiannis S.，Bhat M.K.，and Pickersgill R.W. (1999)High resolution structure and sequence of the T.aurantiacus xylanase I：implications for evolution of thermostability in family 10 xylanases and enzymes with(beta)alpha-barrel architecture.(金黄色嗜热 子囊菌木聚糖酶I的高分辨率结构和序列：牵涉家族10木聚糖酶和带 有(β)α-桶构造的酶的热稳定性进展)Proteins 36(3)：295-306.
Lowry，O.，Rosenbrough，N.，Farr，A.and Randall，R.(1951)Protein measuremen with the Folin phenol reagent.(用福林酚试剂测量蛋白质) J.Biol.Chem.193：265-275.
Needleman S.and Wunsch C.(1970)A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.(用 来研究两个蛋白质的氨基酸序列相似性的一般方法)Journal of Molecular Biology 48，443-453.
Nielsen H.，Engelbrecht J.，Brunak S.and von Heijne G.(1997) Identification of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.(鉴别原核和真核信号肽并预测其切割位点) Protein Engineering 10：1-6.
Paloheimo M.，Mantyla A.，KaIMo J.，and Suominen P.(2003)High- yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure.(在丝状真菌里氏木霉中高产率生产细菌木聚糖酶需要具有 完整结构域结构的载体多肽)Appl.Env.Microbiol.69：7073-7082.
Parry N.，Beever D.，Owen E.，Nerinckx W.Claeyssens M，Van Beeumen J.and Bhat M.(2002)Biochemical characterization and mode of action of a thermostable endoglucanase purified from Thermoascus aurantiacus，(从金黄色嗜热子囊菌中纯化的热稳定性内切葡聚糖酶的生 化特征和作用模式)Arch，of Biochem.and Biophys.404：243-253.
Penttila M.，Nevalainen H.，Ratto M.，Salminen E.and Knowles J. (1987)A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.(纤维素水解性丝状真菌里氏木霉的通用转 化系统)Gene 61：155-164.
Raeder U.and Broda P.(1985)Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.(从丝状真菌快速制备DNA)Lett.Appl.Microbiol.1： 17-20.
Rice P，Longden I and Bleasby A.(2000)，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite.(EMBOSS：欧洲分子生物开放 软件套)Trends in Genetics 16：276-277.
Sambrook J.，Fritsch E.F.and Maniatis T.(1989)Molecular cloning， a laboratory manual.(分子克隆实验室手册)Cold Spring Harbor Laboratory，New York，US.
Sambrook J.and Russell D.W.(2001)Molecular cloning，a laboratory manual.(分子克隆实验室手册)Cold Spring Harbor Laboratory，New York，US.
Srisodsuk M，Reinikainen T，Penttila M and Teeri T.(1993)Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose.(里氏木霉纤维素二糖水解酶 I的结构域间接头肽在与结晶纤维素的相互作用中的作用)J.Biol. Chem.Oct 5；268(28)：20756-61.
Sundberg，M.，and Poutanen，K.(1991)Purification and properties of two acetylxylan esterases of Trichoderma reesei.(里氏木霉的两种乙 酰基木聚糖酯酶的纯化和性质)Biotechnol.Appl.Bio-chem.13：1-11.
Suumakki，A.，Tenkanen M.，Siika-aho，M.，Niku-Paavola，M.-L.， Vii-kari，L.and Buchert，J.(2000)Trichoderma reesei cellulases and their core domains in the hydrolysis and modification of chemical pulp.(化学 纸浆水解和修饰中的里氏木霉纤维素酶及其核心结构域)Cellulose 7： 189-209.
Tenkanen，M.，PuIs，J.and Poutanen，K(1992)Two major xylanases of Trichoderma reesei.(里氏木霉的两种主要的木聚糖酶)Enzyme Microbiol.Technol.14：566-574.
Tomme，P.McRae，S.，Wood，T.and Claeyssens，M.(1988) Chromatographic separation of cellulolytic enzymes.(纤维素水解酶的色 谱分离)Methods in Enzymol.160：187-192.
Tuohy M.，Walsh J.，Murray P.，Claeyssens M.，Cuffe M.，Savage A. and Coughan M.(2002)Kinetic parameters and mode of action of cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii.(埃莫森篮状菌 产生的纤维素水解酶的动力学参数和作用模式)Biochem.Biophys.Acta 1596：366-380(abstract).
Van Petegem et al(2002)Atomic resolution structure of major endoglucanase from Thermoascus aurantiacus，Biochem.and Biophys. (金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶的原子分辨结构，生物化学和生物物 理)Res.Comm.296，pp.161-166.
Van Tilbeurgh，H.，Loonties，F.，de Bruyne，C.and Claeyssens， M.(1988)Fluorogenic and chromogenic glycosides as substrates and ligands of carbohydrases.(作为碳水化合物底物和配体的荧光和发色糖 苷)Methods Enzymol.160：45-59.
Wyman，CE.(2001)Twenty years of trials，tribulations，and research progress in bioethanol technology.(生物乙醇技术的二十年试验，考验 和探索进程)Applied Biochemistry and Biotech-nology 91-93：5-21.
序列表
<110>罗尔公司
<120>纤维素材料的处理和用于其中的酶
<130>SCT082711-00
<160>30
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3192
<212>DNA
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<220>
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<223>N＝unidentified
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<212>DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<221>CDS
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<220>
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<222>(2786)..(2786)
<223>N＝not identified
<400>16




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<220>
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<220>
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<220>
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<223>
<220>
<221>CDS
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<400>17




<210>18
<211>329
<212>PRT
<213>Thermoascus aurantiacus
<400>18



<210>19
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<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>CDS
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<223>
<220>
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<223>
<220>
<221>CDS
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<223>
<220>
<221>Intron
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<223>
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>19





<210>20
<211>416
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>20



<210>21
<211>5092
<212>DNA
<213>Thermoascus aurantiacus
<220>
<221>CDS
<222>(669)..(728)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(729)..(872)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(873)..(1015)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1016)..(1082)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1083)..(1127)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1128)..(1183)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1184)..(1236)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1237)..(1300)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1301)..(1717)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1718)..(1776)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1777)..(2489)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(2490)..(2599)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(2600)..(3469)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(3470)..(3531)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(3532)..(3759)
<223>
<400>21








<210>22
<211>843
<212>PRT
<213>Thermoascus aurantiacus
<400>22





<210>23
<211>3510
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>CDS
<222>(391)..(447)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(448)..(539)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(540)..(685)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(686)..(759)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(760)..(1148)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1149)..(1217)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1218)..(3208)
<223>
<400>23






<210>24
<211>861
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>24





<210>25
<211>3392
<212>DNA
<213>Chaetomium thermophilum
<220>
<221>CDS
<222>(608)..(2405)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(2406)..(2457)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(2458)..(2861)
<223>
<400>25






<210>26
<211>734
<212>PRT
<213>Chaetomium thermophilum
<400>26





<210>27
<211>1631
<212>DNA
<213>Thermoascus aurantiacus
<220>
<221>Intron
<222>(610)..(674)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(675)..(1628)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(609)
<223>
<400>27




<210>28
<211>521
<212>PRT
<213>Thermoascus aurantiacus
<400>28




<210>29
<211>1734
<212>DNA
<213>Thermoascus aurantiacus
<220>
<221>Intron
<222>(610)..(674)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1726)..(1731)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(675)..(1661)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(609)
<223>
<220>
<221>Intron
<222>(1662)..(1725)
<223>
<400>29




<210>30
<211>534
<212>PRT
<213>Thermoascus aurantiacus
<400>30