技术领域
[0001] 本
发明涉及一种提取DNA的方法，具体是采用磁珠法结合离心套管提取DNA的方法。
背景技术
[0002]
生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体
磁性材料等特点，在外
磁场的作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。
[0003] 裂解液是一种蛋白变性剂，可使动
植物的细胞裂解，并使与DNA结合的
蛋白质变性，DNA游离释放，磁球可以特异地
吸附DNA，通过洗涤，去除DNA以外的RNA、蛋白质等杂质，再因洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA，得到纯度和浓度均很高的DNA，可用于PCR扩增、酶切、分子杂交等。
[0004]
专利文献CN102229927A公开的一种提取案件微量检材DNA的方法：
[0005] 1)将已转移好的可能含有脱落细胞的载体置于离心管，并加入裂解液和蛋白酶，漩涡震荡混匀，离心管置于孵育器上56度孵育40～60分钟；
[0006] 2)离心管漩涡震荡混匀，置于孵育器上70-100度孵育3～8分钟后，13000转离心3分钟；
[0007] 3)转移上清，加入磁珠悬液、结合液I和结合液II，吹打混匀，形成固液均相分散的悬浊液；
[0008] 4)磁
力架将吸附了DNA的磁珠从固液均相分散的悬浊液中分离出；
[0009] 5)清洗液洗涤吸附有DNA的磁珠2-3次，将磁珠上的杂质洗去；
[0010] 6)超纯
水解吸附磁珠上的DNA，获得纯的浓缩的DNA溶液。
[0011] 以上这种方法在行业内广泛使用，其优点是提取后的DNA模板纯度高，基本无杂质残留，有利于PCR扩增，对于血迹、烟头等杂质含量高、模板浓度高的常规检材，提取效果好。但这种方法在微量检材检验时效果差，DNA面板损失量较大，损失率高达80-90％，检出率低下。
发明内容
[0012] 本发明的目的是提供一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，该提取方法适用于微量检材的检验。
[0013] 为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0014] 一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，包括以下步骤：
[0015] (1)将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌
氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2～3:2～3(优选体积比10:2:2)混匀后，取160～200微升，加入离心套管的内套管内，置37～56℃金属浴上裂解20～30分钟，95～99℃裂解10～15分钟；
[0016] 在本专利中，离心套管采用专利文献CN103146569B公开的离心管，该离心管包括离心管和内套管。
[0017] 本步骤的目的是将DNA裂解，将DNA与蛋白质分离，从细胞核中释放出来。
[0018] (2)将离心套管放入离心机中13000～17000g(优选15000g)离心0.5～1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液200～300微升，再次放入离心机13000～17000g离心2～5分钟；本步骤是利用具有过滤作用的离心套管去除载体和杂质。
[0019] (3)打开离心套管管盖，去除内套管，加入吸附液700～1000微升，加入磁珠悬浊液10～16微升，置自动涡旋仪上1000～1300转吸附15～20分钟；本步骤的目的是将
水溶性DNA吸附在磁珠上。
[0020] 上述吸附液优选硫氰酸胍。
[0021] (4)去除吸附液：将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内6000～8000g离心20～30秒，再次吸去残液；
[0022] (5)加入-20℃
冰乙醇600～800微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内6000～8000g离心20～30秒，再次吸去残夜；本步骤的目的是洗去残留扩增抑制物，如残留吸附液。
[0023] (6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液20～100微升，充分涡旋后，置56～60℃金属浴上孵化15～20分钟，将DNA从磁珠上释放出来。
[0024] (7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增，提高DNA模板产量。
[0025] 本发明利用机械离心原理，使用离心套管将载体上的DNA充分移至离心管内，并最大限度地过滤杂质，保留DNA模板；加大吸附液的用量，(
现有技术用量为300微升，本发明中用量在1200微升左右)，从而保证吸附液的浓度没有明显下降，从而保证磁珠能够充分吸附DNA；删去现有技术中的漂洗步骤，不仅简化提取流程，更重要的是减少DNA模板损失；减少乙醇漂洗步骤，在充分吸取残留物的
基础上，减少DNA模板损失；将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增，使磁珠上的残留的DNA模板得到充分利用。
[0026] 本发明方法检出率高，最终模板保有量达50-70％，特别适用于微量检材的检验，可检出模板含量在100pg以上的现场DNA检材。
具体实施方式
[0028] (1)将手
套印棉签拭子置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2:2混匀后，取200微升，加入离心套管的内套管内，置56℃金属浴上裂解20分钟，99℃裂解10分钟；
[0029] (2)将离心套管放入离心机中17000g离心30秒，打开离心套管的管盖加入吸附液200微升，再次放入离心机15000g离心2分钟；
[0030] (3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入磁珠悬浊液10微升，置自动涡旋仪上1300转吸附15分钟；
[0031] (4)将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残液；
[0032] (5)加入-20℃冰乙醇750微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内6000g离心30秒，再次吸去残夜；
[0033] (6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液20微升，充分涡旋后，置56℃金属浴上孵化15分钟；
[0034] (7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。
[0035] 提取结果：检出模板含量在100pg的手套印棉签拭子。
[0036] 实施例2
[0037] (1)将网线插头压片剪入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:2:3混匀后，取160微升，加入离心套管的内套管内，置56℃金属浴上裂解20分钟，95℃裂解15分钟；
[0038] (2)将离心套管放入离心机中15000g离心1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液200微升，再次放入离心机13000g离心5分钟；
[0039] (3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍700微升，加入磁珠悬浊液16微升，置自动涡旋仪上1000转吸附20分钟；
[0040] (4)将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内8000g离心30秒，再次吸去残液；
[0041] (5)加入-20℃冰乙醇600微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残夜；
[0042] (6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液80微升，充分涡旋后，置60℃金属浴上孵化15分钟；
[0043] (7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。
[0044] 提取结果：检出模板含量在100pg，检出率在80％以上。
[0045] 实施例3
[0046] (1)将作案工具
手柄擦拭子置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K(10mg/ml)按体积比10:3:3混匀后，取180微升，加入离心套管的内套管内，置37℃金属浴上裂解30分钟，99℃裂解10分钟；
[0047] (2)将离心套管放入离心机中13000g离心1分钟，打开离心套管的管盖加入吸附液300微升，再次放入离心机17000g离心2分钟；
[0048] (3)打开离心套管的管盖，去除内套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入磁珠悬浊液16微升，置自动涡旋仪上1200转吸附18分钟；
[0049] (4)将离心套管的离心管置于磁力架上，充分吸去上清后，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残液；
[0050] (5)加入-20℃冰乙醇800微升，充分涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内8000g离心20秒，再次吸去残夜；
[0051] (6)置56℃金属浴上烘干磁珠，加入洗脱液100微升，充分涡旋后，置56℃金属浴上孵化20分钟；
[0052] (7)将磁珠悬浊液加入PCR扩增液内扩增。
[0053] 提取结果：检出模板含量在100pg，检出率在80％以上。
[0054] 上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得
