[0002]本发明总的来讲涉及用于治疗或预防全身性炎症的方法。(2)相关领域的描述

[0003]炎症反应是在身体受到感染因子侵袭、抗原攻击或者物 理、化学或外伤损害后恢复和维持稳态的努力。局部性炎症限于特定 部位，可表现出不同的症状，包括发红、肿胀、发热和疼痛。

[0004]虽然一般认为炎症反应是对损害的有益于健康的反应，但 是如果免疫系统调节不当，则可能出现不良的生理反应。在这种情况 下，身体的正常保护性免疫系统通过像对待受感染或异常组织那样对 待健康组织，从而对自身组织造成损害。或者，如果出现损害，则炎 症反应与引起损害的威胁不成比例。当出现这种情况时，炎症反应给 身体造成的损害可能比因子本身所造成的损害大得多。

[0005]研究表明，炎症反应部分由促炎细胞因子和抗炎细胞因子 两者的表达增加组成。细胞因子是低分子量的生物活性蛋白，参与免 疫反应和炎症反应的协调，以及特定免疫细胞群之间的沟通。在炎症 反应期间多种细胞类型产生细胞因子，包括嗜中性粒细胞、单核细胞 和淋巴细胞。

[0006]炎症部位产生的细胞因子由存在的多种机制影响炎症反 应。然而，如果促炎反应无法被抗炎细胞因子成功抵销，则可能发生 不受控制的全身性炎症。

[0007]与局部性炎症相比，全身性炎症是遍及全身分布的。这种 类型的炎症可包括特定部位的局部性炎症，但是也可能与普通“流感 样”症状有关，包括发热、寒战、疲劳或活力减退、头痛、食欲减退 和肌肉僵硬。全身性炎症可导致蛋白质降解、分解代谢和代谢亢进。 因此，重要器官(例如肌肉、心脏、免疫系统和肝脏)的结构和功能可 能受损，并且可能引起多器官衰竭，最终导致死亡。Jeschke等，Insulin Attenuates the Systemic Inflammatory Response to Thermal Trauma(胰岛 素减弱对烧伤的全身性炎症反应)，Mol.Med.8(8)：443-450(2002)。虽 然在对全身性炎症机制的了解方面已经取得了重大进展，但是由此病 引起的死亡率之高仍然令人无法接受。

[0008]通常，细胞因子反应是促炎还是抗炎取决于在任何特定时 间定居在肠腔内各种微生物的平衡。肠道粘膜表面定居着数量非常 多、组成极其复杂且不断变化的微生物是众所周知的。肠道微生物区 系的组成随消化道以及不同的小环境(例如上皮粘膜层、隐窝深粘膜层 和粘膜上皮细胞表面)而变化。具体的定居状况取决于内外因素，包括 腔内可获得的分子、粘膜性质以及宿主与微生物间的相互作用和微生 物与微生物间的相互作用。Murch，S.H.，Toll of Allergy Reduced by Probiotics(益生菌降低Toll的变态反应)，Lancet，357：1057-1059 (2001)。

[0009]这些微生物构成了肠道微生物区系，主动参与免疫应答。 在存在双方互利共生关系(互利共生)的条件下，或者在对一方有利而 对另一方并无害(偏利共生)的条件下，它们与上皮相互作用。Hooper 等，How Host-Microbial Interactions Shape the Nutrient Environment of the Mammalian Intestine(宿主与微生物的相互作用如何形成哺乳动物 肠道的营养环境)，Annu.Rev.Nutr.22：283-307(2002)。实际上，有大 量证据显示肠道微生物区系与肠粘膜中不同细胞群之间强的相互作 用或“相互影响”。Bourlioux等，The Intestine and its Microflora are Partners for the Protection of the Host：Report on the Danone Symposium “The Intelligent Intestine”(肠及其微生物区系是保护宿主的伙伴：达能 专题研讨会报告“巧妙的肠”)，2002年6月14日在巴黎举行，Am.J. Clin.Nutr.78：675(2003)；Hooper，L.V.和Gordon，J.I.，Commensal Host-Bacterial Relationships in the Gut(肠内共生的宿主与细菌之间的 关系)，Sci.292：1115(2001)；Haller等，Non-Pathogenic Bacteria Elicit a Differential Cytokine Response by Intestinal Epithelial Cell/Leucocyte Co-Gultures(肠上皮细胞/白细胞共培养物中非致病性细菌诱导不同的 细胞因子反应)，GUT 47：79(2000)；Walker，W.A.，Role of Nutrients and Bacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense(营 养物和细菌定居在肠宿主防御发展中的作用)，J.Pediatr.Gastroenterol. Nutr.30：S2(2000)。另外，研究表明肠道微生物区系在成人局部和全 身水平上诱导特异性免疫应答，Isolauri，E.等，Probiotics：Effects on Immunity(益生菌对免疫力的作用)，Am.J.Clin.Nutr.73：444S-50S (2001)。[00010]已知婴幼儿体内肠道微生物区系的发育程度远不及成 人。虽然成人的微生物区系由1013个以上的微生物和接近500种菌种 组成，但是有一些是有害的，有一些是有益的，在绝对数和菌种多样 性两者上，婴幼儿的微生物区系仅含有这些微生物的一小部分。婴幼 儿与生具有无菌肠道，但是从产道、他们最初的环境和他们摄入的食 物中获得肠内微生物区系。因为肠道微生物区系在新生儿早期生命中 非常不稳定，婴幼儿的肠道通常难以维持有害细菌和有益细菌之间脆 弱的平衡，因此降低了免疫系统正常发挥作用的能力。
[00011]对于配方奶粉喂养的婴幼儿(formula-fed infant)尤其难以 维持由配方奶粉喂养的婴幼儿和母乳喂养的婴幼儿(breast-fed infant) 肠内细菌菌种之间的差异所引起的这种平衡。母乳喂养的婴幼儿粪便 中主要含有双歧杆菌属(Bifidobacterium)，和作为不常见贡献者的链球 菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)。相比之下，配方奶粉喂 养的婴幼儿体内微生物区系更为多样化，含有双歧杆菌属和拟杆菌属 (Bacteroides)以及更多种致病菌-葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌 (Escherichia coli)和梭菌(Clostridia)。母乳喂养的婴幼儿和配方奶粉喂 养的婴幼儿的粪便中，双歧杆菌属的各种菌种也有不同。研究提出了 作为母乳喂养的婴幼儿和配方奶粉喂养的婴幼儿不同粪便菌群的原 因的多个因素，包括人乳中蛋白质含量较低、蛋白质组成不同，人乳 中磷含量较低，人乳中有大量寡糖以及母乳中多种有免疫功能的体液 介质和细胞介质。Agostoni等，Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants：A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition(婴 幼儿食品中的益生细菌：ESPGHAN委员会对营养的意见)，J.Pediatr. Gastro.Nutr.38：365-374(2004年4月)。
[00012]因为配方奶粉喂养的婴幼儿体内微生物区系非常不稳 定，肠道微生物区系在很大程度上参与刺激肠免疫，所以配方奶粉喂 养的婴幼儿发生炎症性疾病的可能性更高。许多影响婴幼儿的主要疾 病，包括慢性肺病、脑室周围白质软化、新生儿脑膜炎、新生儿肝炎、 脓毒症和坏死性小肠结肠炎本质上都是炎症性质的。根据具体疾病， 伴发的炎症可发生在特定器官(例如肺、脑、肝或肠)中，或者炎症可 能完全是全身性质的。
[00013]例如，慢性肺病引起肺内组织发炎，而新生儿脑膜炎包 括脑膜(linings of the brain)炎症和脊髓炎症。脑室周围白质软化由正在 发育中的脑的脑室周围区域的炎性损害所引起。坏死性小肠结肠炎引 起可导致部分或全部肠被破坏的肠炎，而新生儿肝炎包括发生于婴儿 早期的肝炎。脓毒症，亦称全身性炎症反应综合征，是由产毒素细菌 对血流的致死性感染所引起的严重疾病。该病中，血流中的病原体引 起遍及全身的炎症反应。
[00014]在肠免疫发展和全身性炎症预防方面，也是对早产婴儿 和患严重疾病的婴儿的严重挑战。常常将早产婴儿或患严重疾病的婴 儿及时放入无菌恒温箱，使他们保持不暴露于健康足孕婴儿可正常暴 露于其中的细菌群体中。这可延迟或削弱天然定居过程。这些婴儿还 常常用广谱抗生素治疗，该抗生素可杀死力图定居在婴儿肠道中的共 生细菌。另外，这些婴儿常常用婴儿配方奶粉喂养，而不是用母乳喂 养。这些因素的每一个都可引起婴儿肠内微生物区系的产生不当，因 此引起或加快危及生命的全身性炎症。
[00015]近年来，有研究提议向配方奶粉喂养的婴幼儿饮食中补 充益生细菌以便促进有益微生物的肠定居。益生细菌是对宿主健康发 挥有益作用的活的微生物。Fuller，R.Probiotics in Man and Animals(人 与动物中的益生菌)，J.Appl.Bacteriol.66：365-78(1989)。
[00016]虽然有活力的益生细菌(viable probiotic bacteria)可有效 地使肠道微生物区系正常化，但是已公布的评价其在早产婴儿和受免 疫抑制婴幼儿中的安全性的研究却非常少。这些特定群体的肠防御屏 障尚未成熟，这就增加了腔内细菌(luminal bacteria)发生转移的风险， 引起感染风险的可能性增高。在许多情况下，有活力的益生菌剂(viable probiotics)一般不推荐给受免疫抑制的患者、心脏手术后患者、患胰腺 功能障碍的患者或患有便血的患者使用。已经报道了在受免疫抑制个 体中有至少一宗死亡事件是由于补充益生菌所致的。MacGregor G.等， Yoghurt biotherapy：contraindicated in immunosuppressed patients(酸乳 酪生物制剂疗法：在受免疫抑制的患者中的禁忌)？Postgrad Med J.78： 366-367(2002)。
[00017]因此，对于受免疫抑制的患者或早产婴儿，提供可治疗 或预防全身性炎症的无活力的补充剂(non-viable supplement)可能是有 益的。活益生菌(live probiotics)的无活力替代品(non-viable alternative) 可具有其它益处，例如存放期较长。活的益生菌对热、湿度和光敏感， 理想的是应冷藏以保持其存活力。即使利用这些预防措施，典型的益 生菌的存放期仍相对较短。活益生菌的无活力替代品可避免冷藏需 要，可提供具有较长存放期的产品。然后无需易于利用的冷藏条件便 可将该产品配送到世界各地。另外，益生菌的无活力替代品可能与其 它食物组分发生相互作用的风险较小，例如发酵以及产品味道、质地 和新鲜度的改变。因此，提供用于减轻或预防配方奶粉喂养的婴幼儿 的全身性炎症的方法将会是有益的，该方法包括给予灭活益生菌 (inactivated probiotics)。
发明概述
[00018]因此简单来讲，本发明涉及用于治疗、预防或减轻受治 疗者的全身性炎症的新方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的 灭活LGG。
[00019]在其它实施方案中，本发明涉及制备用于治疗、预防或 减轻受治疗者的全身性炎症的药物的方法，其特征在于至少介于约 1×104个细胞等同物/kg体重/天和1×1010个细胞等同物/kg体重/天之间 的灭活鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)被用作药 理活性物质。
[00020]在其它实施方案中，本发明涉及用于治疗、预防或减轻 受治疗者的呼吸道炎症的新方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效 量的灭活LGG。
[00021]在其它实施方案中，本发明涉及用于减轻或预防受治疗 者的一种或多种促炎细胞因子或趋化因子的全身性释放的方法，该方 法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。
[00022]在另一个实施方案中，本发明包括用于预防受治疗者的 IkB表达的遍在蛋白化的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量 的灭活LGG。此外，本发明可包括用于降低受治疗者体内NFkB转运 的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。
[00023]在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗、预防 或减轻受治疗者的全身性炎症或呼吸道炎症的方法，该方法包括给予 受治疗者治疗有效量的灭活LGG以及至少一种LCPUFA和/或至少一 种有活力的益生菌。在具体实施方案中，LCPUFA可以是二十二碳六 烯酸(DHA)或花生四烯酸(ARA)。
[00024]通过本发明所获得的若干优势之一是减轻或预防全身性 炎症。本发明可减轻肝、血浆、肺和肠的炎症。另外，本发明减少或 防止各种促炎细胞因子和趋化因子(包括白介素-1β(IL-1β)、IL-8、 CINC-1)的释放和生长相关性癌基因(GRO/KC)水平。因为本发明可用 于改善炎症状况，所以它还可防止发生造成伤害的感染(deleterious infection)和疾病。
附图简述
[00025]为了更全面地理解本发明，下面结合附图进行下列描述 以供参考。
[00026]图1表示采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的活 LGG和灭活LGG对肝中的细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物 -1(CINC-1)肽产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG(heat-LGG)”。
[00027]图2表示采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的活 LGG和灭活LGG对血浆中的细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱 物-1(CINC-1)肽产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00028]图3表示采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的活 LGG和灭活LGG对肺中的细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物 -1(CINC-1)肽产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00029]图4表示采用细胞因子多重测定法(cytokine multiplex assay)测定的活LGG和灭活LGG对肝中的生长相关性癌基因 (GRO/KC)产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00030]图5表示采用细胞因子多重测定法测定的活LGG和灭活 LGG对肺中的生长相关性癌基因(GRO/KC)产生的作用。灭活LGG被 标记为“热-LGG”。
[00031]图6表示采用细胞因子多重测定法测定的活LGG和灭活 LGG对肝中的IL-1β水平的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
优选实施方案详述
[00032]下面将提供下文所述的本发明实施方案、一个或多个实 施例的详情以供参考。提供各实施例是为了解释本发明，而不是对本 发明的限制。实际上，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本 发明的范围或精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和变动。例 如，所说明或描述的特征作为一个实施方案的组成部分，可被用于另 一个实施方案中以便得到更进一步的实施方案。
[00033]因此，本发明旨在涵盖落入所附权利要求书及其等同内 容范围内的这些修改和变动。本发明的其它目的、特征和方面公开于 下面的详述中，或者从下面的详述来看是显而易见的。本领域普通技 术人员应当了解的是，本发明的论述只是对示例性实施方案的描述， 不是对本发明更多方面的限制。
[00034]本文使用了下列缩写：LGG，鼠李糖乳杆菌GG； LCPUFA，长链多不饱和脂肪酸；LPS，脂多糖；IL，白介素；CINC-1， 细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1；GRO/KC，生长相关性 癌基因；ELISA，酶联免疫吸附测定法；RT-PCR，逆转录-聚合酶链 式反应；ANOVA，方差分析；SD，标准差；RMS，大鼠乳代用品； TLR，Toll样受体；核因子κB，NF-κB；EPA，二十碳五烯酸；DHA， 二十二碳六烯酸；ARA，花生四烯酸。
[00035]术语“灭活益生菌”或“灭活LGG”是指益生菌或LGG 生物的代谢活性或繁殖能力降低或遭到破坏。然而，“灭活益生菌” 或“灭活LGG”仍然还在细胞水平上保持至少部分其生物糖蛋白和 DNA/RNA结构。本文所用术语“灭活”与“无活力”同义。
[00036]术语“益生菌(probiotic)”是指对宿主健康发挥有益作用 的活的、有活性的或有活力的微生物。
[00037]术语“益生素(prebiotic)”是指刺激益生菌的生长和/或活 性的非消化性食物成分。
[00038]本文所用术语“治疗”是指改善、改进或医治疾病、病 症或者疾病或病症的症状。
[00039]术语“减轻”是指范围、数量减小或程度降低。
[00040]术语“预防”是指通过某些措施终止或阻碍疾病、病症 或者疾病或病症的症状。
[00041]本文所用术语“全身性”是指与整个身体有关或者累及 整个身体。
[00042]术语“治疗有效量”是指使疾病、病症或者疾病或病症 的症状得到医治或改善的量。
[00043]术语“早产儿(preterm)”是指在妊娠第37周结束前出生 的婴儿。
[00044]术语“婴(幼)儿”是指不满1岁的人。
[00045]术语“儿童”是指年龄介于1岁左右和12岁左右之间的 人。在某些实施方案中，儿童的年龄介于1岁左右和6岁左右之间。 在其它实施方案中，儿童的年龄介于7岁左右和12岁左右之间。
[00046]本文所用术语“婴幼儿配方奶粉(infant formula)”是指通 过替代人乳以满足婴幼儿营养需要的组合物。
[00047]本发明发明了一种用于治疗或预防全身性炎症的新方 法。该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。在一些实施方 案中，受治疗者是婴幼儿。
[00048]以前有效给予灭活益生菌的尝试都遇到了巨大的障碍。 例如，Kirjavainen，P.等人报道了在活LGG和热灭活LGG的比较中， 接近40％补充了灭活LGG的儿童经历了严重腹泻。Probiotic Bacteria in the Management of Atopic Disease：Underscoring the Importance of Viability(特应性疾病控制中的益生细菌：强调存活力的重要性)，J.Ped. Gastro.36：223-227(2003)。未报道在安慰剂或有活力的LGG组中出 现不良反应(出处同上，P225)。因为腹泻在很大程度上与炎症有关， 所以Kirjavainen的研究表明灭活LGG实际上可引起胃肠炎症。实际 上，该研究指出，“热灭活方法可引起表面肽变性和热激蛋白表达， 因此以可诱导炎症反应从而增加肠通透性的热灭活形式的这种方式， 改变了LGG的免疫刺激性质”(出处同上，P226)。相比之下，本发明 的发明人研发出了通过给予灭活LGG而用于治疗或预防全身性炎症 的新方法。
[00049]LGG是自健康人体肠内微生物区系分离出的益生菌菌 株。它公开于Gorbach等人的美国专利号5,032,399，该专利通过引用 全部结合到本文中。LGG对多数抗生素具有耐药性，在酸和胆汁存在 下保持稳定，与人肠道粘膜细胞的附着具有亲合力。在多数个体中存 活1-3天，在30％受治疗者中存活长达7天。除其定居能力以外，LGG 还有益地影响粘膜免疫应答。LGG保藏于保藏权威机构美国典型培养 物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏号为ATCC 53103。
[00050]在本发明中，使用已被灭活的LGG。可通过本领域任何 目前已知或者仍在开发的方法进行灭活。例如，可通过热处理、冻干、 紫外线、γ辐射、加压、化学分解或机械破坏来实现灭活。例如，可 将LGG保存在80℃和100℃之间10分钟经热处理灭活。LGG还可通 过距离为5cm的30瓦UVC灯照射5分钟经紫外线灭活。或者，灭 活LGG可使用距离为20cm的钴-60源通过2kg-Gray(kGy)照射经γ 辐射灭活。
[00051]在本发明的方法中，灭活LGG的治疗有效量是足以减轻 或预防受治疗者的全身性炎症的量。该量相当于约1×104个细胞等同 物/kg体重/天和1×1012个细胞等同物/kg体重/天之间。在另一个实施 方案中，本发明包括给予从约1×106个细胞等同物/kg体重/天到1×109 个细胞等同物/kg体重/天。在又一个实施方案中，本发明包括给予约 1×108个细胞等同物/kg体重/天。
[00052]在本发明的一些实施方案中，受治疗者有治疗、减轻或 预防全身性炎症的需要。受治疗者可能由于遗传体质、饮食、生活方 式、疾病、病症等而有患全身性炎症的风险。例如，早产儿或受免疫 抑制的婴幼儿可能有患全身性炎症的风险，因此可能需要这类治疗、 减轻或预防。
[00053]在某些实施方案中，可将灭活LGG给予婴幼儿或儿童以 预防、治疗或减轻全身性炎症。在一个实施方案中，婴幼儿可不满1 岁。在另一个实施方案中，儿童的年龄可介于1岁和6岁之间。在又 一个实施方案中，儿童的年龄可介于7岁和12岁之间。
[00054]在本发明的方法中，灭活LGG的给药方式并不是关键， 只要给予治疗有效量即可。在一些实施方案中，通过片剂、丸剂、包 囊剂(encapsulation)、囊片剂、软胶囊剂、胶囊剂、油滴剂或小药囊剂 给予受治疗者灭活LGG。在该实施方案的方法中，灭活LGG补充剂 可与其它营养补充剂(例如维生素)或与LCPUFA补充剂(例如DHA或 ARA)组合摄取。
[00055]在另一个实施方案中，灭活LGG用糖、脂肪或多糖包封。 在又一个实施方案中，将灭活LGG加到食物或饮品中食用。食物或 饮品可以是儿童营养品，例如改良配方乳品(follow-on formula)、成长 奶(growing up milk)、饮料、奶、酸乳酪、果汁、果汁型饮料、咀嚼片、 饼干、薄脆饼(cracker)或奶粉，或者产品可以是婴幼儿营养品，例如 婴幼儿配方奶粉。
[00056]在一个实施方案中，用于本发明的婴幼儿配方奶粉营养 齐全，含有适当类型和适量的脂质、糖、蛋白质、维生素和矿物质。 脂质或脂肪的含量通常可从约3g/100kcal到约7g/100kcal不等。蛋 白质的含量通常可从约1g/100kcal到约5g/100kcal不等。糖的含量 通常可从约8g/100kcal到约12g/100kcal不等。可以任意使用本领域 的蛋白质源，例如脱脂奶、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、水解蛋白、 氨基酸等。可以任意使用本领域的糖源，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖 浆干粉(corn syrup solid)、麦芽糖糊精、蔗糖、淀粉、米糖浆干粉(rice syrup solid)等。可以任意使用本领域的脂质源，例如植物油，例如棕 榈油、大豆油、棕榈油精、椰子油、中链甘油三酯油、高油酸葵花籽 油、高油酸红花油等。
[00057]可适当地使用市售的婴幼儿配方奶粉。例如 早产儿配方奶粉、加铁 和(可获自Mead Johnson&Company， Evansville，IN，U.S.A.)可以补充适当水平的灭活LGG，并用于实施 本发明的方法。
[00058]在本发明的一个实施方案中，灭活LGG可与一种或多种 有活力的益生菌和/或灭活益生菌联用以治疗或预防配方奶粉喂养的 婴幼儿的全身性炎症。在本实施方案中，本领域已知的任何活益生菌 或灭活益生菌都是可接受的，只要它能达到预期效果。在一个具体的 实施方案中，有活力的益生菌和/或灭活益生菌选自乳杆菌属和双歧杆 菌属。
[00059]如果活益生菌与灭活益生菌联用，则活益生菌的量可相 当于约1×104菌落形成单位(cfu)/kg体重/天和1×1012菌落形成单位 (cfu)/kg体重/天之间。在另一个实施方案中，活益生菌可包含约 1×106～1×109cfu/kg体重/天。在又一个实施方案中，活益生菌可包含 约1×108cfu/kg体重/天。
[00060]在本发明的另一个实施方案中，灭活LGG可与一种或多 种益生素联用以治疗或预防配方奶粉喂养的婴幼儿的全身性炎症。在 本实施方案中，本领域已知的任何益生素都是可以接受的，只要能达 到所需效果。本发明的益生素可包括乳果糖、低聚半乳糖 (galacto-oligosaccharide)、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低 聚乳蔗糖(lactosucrose)、低聚木糖和低聚龙胆糖 (gentio-oligosaccharide)。
[00061]在本发明的又一个实施方案中，婴幼儿配方奶粉可含有 其它活性剂，例如长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。合适的LCPUFA 包括但不限于α-亚油酸、γ-亚油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸 (EPA)、ARA和DHA。在一个实施方案中，灭活LGG与DHA联用。 在另一个实施方案中，灭活LGG与ARA联用。在又一个实施方案中， 灭活LGG与DHA和ARA两者联用。含有DHA、ARA或其组合的 市售婴幼儿配方奶粉可以补充灭活LGG并用于本发明。例如，含有 有效水平的DHA和ARA的是市售的，可以补充 灭活LGG并用于本发明。
[00062]在一个实施方案中，DHA和ARA同时与灭活LGG联用 以治疗婴幼儿的全身性炎症。在该实施方案中，ARA∶DHA的重量比 通常为约1∶3至约9∶1。在本发明的一个实施方案中，该比率为约1∶2 至约4∶1。在又一个实施方案中，该比率为约2∶3至约2∶1。在一个具 体实施方案中，该比率约为2∶1。在本发明的另一个具体实施方案中， 该比率约为1∶1.5。在其它实施方案中，该比率约为1∶1.3。在另外其 它的实施方案中，该比率约为1∶1.9。在一个具体的实施方案中，该比 率为约1.5∶1。在又一个实施方案中，该比率为约1.47∶1。
[00063]在本发明的某些实施方案中，DHA的水平以重量计是脂 肪酸的约0.0％和1.00％之间。
[00064]DHA的水平可约为0.32％(重量)。在一些实施方案中， DHA的水平可约为0.33％(重量)。在另一个实施方案中，DHA的水 平可约为0.64％(重量)。在另一个实施方案中，DHA的水平可约为 0.67％(重量)。在又一个实施方案中，DHA的水平可约为0.96％(重量)， 在又一个实施方案中，DHA的水平可约为1.00％(重量)。
[00065]在本发明的实施方案中，ARA的水平以重量计是脂肪酸 的0.0％和0.67％之间，在另一个实施方案中，ARA的水平可约为0.67％ (重量)。在另一个实施方案中，ARA的水平可约为0.5％(重量)。在又 一个实施方案中，DHA的水平可介于约0.47％和0.48％(重量)之间。
[00066]在本发明的一个实施方案中，DHA的有效量通常为约3 mg/kg体重/天至约150mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中， 该量为约6mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。在另一个实施方案 中，该量为约10mg/kg体重/天至约60mg/kg体重/天。在又一个实施 方案中，该量为约15mg/kg体重/天至约30mg/kg体重/天。
[00067]在本发明的一个实施方案中，ARA的有效量通常为约5 mg/kg体重/天至约150mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中， 该量从约10mg/kg体重/天到约120mg/kg体重/天不等。在另一个实 施方案中，该量从约15mg/kg体重/天到约90mg/kg体重/天不等。在 又一个实施方案中，该量从约20mg/kg体重/天到约60mg/kg体重/ 天不等。
[00068]用于本发明的婴幼儿配方奶粉中的DHA的量通常从约5 mg/100kcal到约80mg/100kcal不等。在本发明的一个实施方案中， DHA从约10mg/100kcal到约50mg/100kcal不等；在另一个实施方 案中，从约15mg/100kcal到约20mg/100kcal不等。在本发明的一个 具体实施方案中，DHA的量约为17mg/100kcal。
[00069]用于本发明的婴幼儿配方奶粉中的ARA的量通常从约 10mg/100kcal到约100mg/100kcal不等。在本发明的一个实施方案 中，ARA的量从约15mg/100kcal到约70mg/100kcal不等。在另一 个实施方案中，ARA的量从约20mg/100kcal到约40mg/100kcal不 等。在本发明的一个具体实施方案中，ARA的量约为34mg/100kcal。
[00070]用于本发明的补充了含有DHA和ARA的油的婴幼儿配 方奶粉可采用本领域已知的标准技术制备。例如，通过替换正常存在 于配方奶粉中的等量的油(例如高油酸葵花籽油)，将其加到配方奶粉 中。又如，可通过替换等量的其余正常存在于不含DHA和ARA的配 方奶粉中的总脂肪混合物，将含有DHA和ARA的油加到配方奶粉中。
[00071]DHA源和ARA源可以是本领域已知的任何来源，例如 海产油、鱼油、单细胞油、蛋黄脂质、脑脂质等。DHA和ARA可以 是天然形式，只要LCPUFA源的其余成分不会对婴幼儿产生任何重大 的有害作用。或者，可以使用精炼形式的DHA和ARA。
[00072]在本发明的一个实施方案中，DHA源和ARA源为单细 胞油，参见美国专利号5,374,567、5,550,156和5,397,591，该专利的 公开内容通过引用全部结合到本文中。然而，本发明不仅仅限于这类 油。
[00073]在一个实施方案中，LCPUFA源含有EPA。在另一个实 施方案中，LCPUFA源基本上不含EPA。例如，在本发明的一个实施 方案中，婴幼儿配方奶粉含有不超过约16mg/100kcal的EPA；在另 一个实施方案中，EPA不超过约10mg/100kcal；在又一个实施方案 中，EPA不超过约5mg/100kcal。一个具体的实施方案基本上不含 EPA。另一个实施方案不含EPA，因为即使痕量的EPA都不存在于配 方奶粉中。
[00074]我们认为对于含有这些成分的制剂的抗炎性质，提供灭 活LGG与DHA和/或ARA的组合便提供了互补效应(complimentary effect)或协同效应。虽然无意受该理论或任何其它理论的束缚，但是 我们认为灭活LGG通过防止抑制性-kB(inhibitory-kB，IkB)的遍在蛋 白化而部分赋予抗炎作用。在正常细胞中，IkB与胞质内的核因子kB (NFkB)结合。当发生IkB遍在蛋白化时，NFkB被释放出来，进入到 细胞核中，并激活负责炎症反应的基因。我们认为正是这种特异性相 互作用和所引起的基因表达的改变参与了炎症的调节。我们认为灭活 LGG防止IkB的遍在蛋白化，从而防止NFkB的释放，并减轻或预防 炎症。
[00075]相比之下，ω-3脂肪酸(例如DHA)被认为是通过改变广 义上称为类二十烷酸的脂肪酸衍生的促炎介质的产生而赋予抗炎作 用。细胞膜磷脂层(phospholipid pool)中的ω-6脂肪酸(例如ARA)在炎 症反应期间释放出来，并释出一层游离的ARA。该层ARA然后通过 被称为脂加氧酶和环加氧酶的两类酶起作用，它产生各种类二十烷 酸，包括2系列前列腺素类激素(prostanoids)，例如前列腺素、血栓烷 和白三烯。
[00076]已知这些类二十烷酸在许多细胞类型和器官中的促炎作 用过剩。已知富含ω-3脂肪酸(例如EPA和DHA)的饮食在该过程的若 干步骤中是ω-6脂肪酸的竞争剂，因此，降低了ARA的促炎效果。 例如，ω-3脂肪酸调节ω-6脂肪酸延长至ARA、ARA掺入细胞膜磷脂 层和由ARA产生促炎类二十烷酸。因此，DHA和ARA的组合在多 个组织中提供调节炎症反应的独特而又互补的作用。
[00077]另外，在本发明的一些实施方案中，活LGG和灭活LGG 相互联用。对于含有这些成分的制剂的抗炎性质，我们认为活LGG 和灭活LGG的组合提供互补效应或协同效应。虽然无意受该理论或 任何其它理论的束缚，但是我们认为活益生菌(例如LGG)部分通过与 特定免疫细胞表面的特异性受体(称为Toll样受体(TLR))相互作用而 赋予抗炎作用。活LGG和这些受体之间的直接或间接相互作用启动 胞内信号转导级联，这导致了在这些靶细胞中基因表达的改变，我们 认为正是这种特异性相互作用以及在基因表达和其它细胞作用中所 引起的改变参与了炎症的调节。正是因为我们认为活LGG和灭活 LGG通过不同的机制起作用，所以相信这些组分的组合可提供互补或 协同的抗炎作用。
[00078]另外，在本发明的一些实施方案中，将活LGG、灭活 LGG和至少一种LCPUFA联用。因为我门认为活LGG、灭活LGG 和LCPUFA是分别通过不同机制起作用的，对于含有这些成分的制剂 的抗炎性质，我们认为活LGG和灭活LGG的组合提供互补效应或协 同效应。
[00079]在本发明的一个实施方案中，受治疗者是配方奶粉喂养 的婴幼儿。在一个实施方案中，婴幼儿是自出生起就用配方奶粉喂养。 在另一个实施方案中，婴幼儿是自出生起就用母乳喂养直到不满1岁， 之后用配方奶粉喂养，期间开始补充灭活LGG。
[00080]在本发明的一个具体实施方案中，该方法包括治疗或预 防配方奶粉喂养的早产儿的全身性炎症。在该方法中，可以婴幼儿配 方奶粉的形式或其它合适的形式给予早产儿灭活LGG。另外，如有需 要，可将灭活LGG与DHA、ARA和/或一种或多种活益生菌组合给 予早产儿以产生潜在的协同抗炎作用。
[00081]在本发明的方法中，灭活LGG减少或防止一种或多种促 炎细胞因子或趋化因子的全身性释放。本文所用“促炎”细胞因子或 趋化因子包括本领域已知的参与上调炎症反应的促炎细胞因子或趋 化因子。实例包括但不限于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18和 GRO/KC。
[00082]趋化因子是能够使白细胞从血液迁移到炎症部位组织的 一组细胞因子。当趋化因子过量产生时，可导致健康组织受到损害。 生长相关性癌基因(GRO/KC)是向炎症部位募集免疫细胞的趋化因子。 它是大鼠细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物(CINC-1)的人的对 应物，在功能上与白介素-8家族有关。
[00083]在本发明的又一个实施方案中，灭活LGG显示出抑制核 因子kB(NFkB)的转运。NFkB是存在于所有细胞类型中的主要转录 因子，据信在炎症发生时起重要作用。在多数细胞中，NF-κB以潜伏 的无活性的抑制性kB(IkB)结合复合物形式存在于胞质中。当细胞接 受例如来自细胞因子、细菌抗原或自由基的大量胞外信号之一时， NF-κB便快速进入核中，并激活负责炎症反应的基因。研究表明在炎 症开始时抑制NFkB导致炎症反应降低。Lawrence等，Possible New Role for NFkB in the Resolution of Inflammation(NFkB在消除炎症中的 可能的新作用)，Nature Med.7：1291(2001)。因此，在本发明中通过补 充灭活LGG来抑制NFkB有助于减轻或预防全身性炎症。
[00084]如实施例中所示，灭活LGG显示减轻配方奶粉喂养的婴 幼儿的全身性炎症。在配方奶粉喂养的幼大鼠中，当补充LGG时， CINC-1和各种细胞因子水平降低到与母乳喂养的幼大鼠类似的水平。
[00085]如实施例中所示，灭活LGG还显示出在肠上皮中显著减 少IL-8产生、降低NF-κB转运并增加IkB产生。另外，本发明的发 明人预料不到地发现灭活LGG防止IkB的遍在蛋白化，而活LGG则 不能。
[00086]下面的实施例描述了本发明的各种实施方案。鉴于本文 所公开的说明书或本发明的实践，落入所附权利要求书范围内的其它 实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。本说明书连同实施 例一起被视为只是示例性的，落入实施例之后所附权利要求书中所限 定的本发明的范围和精神内。在实施例中，除非另有说明，否则所有 给出的百分比都是重量百分比。
实施例1
[00087]本实施例说明灭活LGG对配方奶粉喂养的新生大鼠幼 仔全身性炎症的作用。
材料与方法
[00088]在两个独立的实验中，将Sprague-Dawley(Taconic， Germantown，NY)幼大鼠随机分成以下4个胃造口进食组，每组5只 大鼠：对照组(无LPS或LGG)、LPS组、LPS加活LGG组和LPS加 灭活LGG组。用相同龄期的母鼠喂养大鼠作为对照。使用幼大鼠 “pup-in-the-cup”模型，从幼大鼠出生第7天开始进行胃造口进食。在 插入幼鼠胃中的聚乙烯管的24cm截面上放置胃造口术进食管。在异 氟烷麻醉下进行胃造口术放置。将定时器控制的注射泵与进食管相连 接，并设置成按依赖于体重的流速，在每小时的头20分钟内饲喂大 鼠。
[00089]在2天适应期内，给胃造口进食幼大鼠喂以大鼠奶代用 品(RMS)。适应期过后，给予RMS进食组之一补充1×108个细胞等同 物/kg体重/天的灭活LGG。LGG经致死热处理灭活。给予第二组补充 1×108cfu/L/kg体重/天的活LGG。给第三组饲喂未补充任何类型LGG 的RMS。这些饲喂法持续6天。所有胃造口进食组接受同等量的脂肪 和糖，蛋白质组分近似于正常生长所需要的量。用相同龄期的母鼠喂 养大鼠作为对照。
[00090]将得自大肠杆菌0127：B8的脂多糖(LPS)(LPS；Sigma， St.Louis，MO)按2mg/ml的浓度通过涡旋溶于水。在开始人工饲喂后 2天，开始通过胃造口术进食管给予胃造口进食大鼠0.25mg/kg/天至 0.5mg/kg/天的LPS。给予幼鼠LPS补充6天。该剂量是在导致偶发 战栗、立毛和体重增加缓慢但在6天时间内与死亡显著增加无关的初 步研究中确定的。
[00091]在6天治疗时间结束时，用过量的戊巴比妥钠使幼大鼠 安乐死。摘取小肠并分成三部分：回肠、空肠和十二指肠，保存在-80℃ 下用于酶测定和ELISA，或者在10％中性缓冲福尔马林中固定用于肠 形态研究。将肺、肝和血浆保存在-80℃下用于酶测定和ELISA。
[00092]应用Sigmastat统计软件(SPSS，Chicago，IL)分析体重、 CINC-1的ELISA和细胞因子/趋化因子多重测定的结果。所有数据都 用平均值±标准差(SD)报告。采用组间单因素方差分析(ANOVA)以确 定所有治疗组中是否存在显著差异。当ANOVA为显著时(p＜0.05)， 应用Holm-Sidak方法进行两两比较。
结果与讨论
生长
[00093]本实施例说明在胃造口进食后LGG对幼鼠生长的作用。 在胃造口进食后每天给幼大鼠称重，并与母鼠喂养的对照动物进行比 较。母鼠喂养动物的生长比LPS处理的胃造口进食幼鼠的快。给予胃 造口进食的LPS处理幼鼠活LGG或灭活LGG无法改善体重。
CINC-1
[00094]在本发明中，活LGG和灭活LGG均降低CINC-1水平。 通过用于大鼠生长相关性癌基因/CINC-1的TiterZyme酶免疫测定试 剂盒(Assay Designs，Ann Arbor，MI)测定CINC-1水平。从肝、肠、 血浆和肺的整个组织的细胞提取物中分离出组织样品。在450nm下 测定吸光度，利用从线性标准曲线推导出的公式计算出浓度。
[00095]如图1至图3所示，ELISA结果显示LPS增加肝、肺和 血浆中的CINC-1水平。活LGG和灭活LGG两者在肝(图1)和血浆(图 2)中都降低LPS诱导的CINC-1产生(p＜0.05)，在肺(图3)中也显示出 这种趋势(p＝0.09)。
[00096]图1表明当与LPS组相比时，补充活LGG使肝中的 CINC-1水平降低约50％。然而当与LPS组相比时，灭活LGG使肝中 的CINC-1水平降低约75％。因此，灭活LGG对肝CINC-1水平的降 低作用比活LGG的显著较大，这就表明较强的抗炎作用。同样地， 图2表明灭活LGG组中血浆的CINC-1水平比活LGG组中的低。在 肺中，活LGG和灭活LGG两者均降低CINC-1水平到同样的程度(图 3)。
GRO/KC
[00097]如图4和图5所示，细胞因子多重测定法显示同样降低 肝和肺中的GRO/KC水平。在肝中，灭活LGG降低GRO/KC水平的 程度比活LGG的大，这就表明较强的抗炎作用(图4)。在肺中，活LGG 和灭活LGG两者均降低GRO/KC水平到同样的程度(图5)。
[00098]在本实验中，在肺中观察到CINC-1和GRO/KC水平的 降低表明灭活LGG的抗炎作用延伸到远端器官。因此，灭活LGG的 抗炎作用实质上完全是全身性的。
[00099]在肝中，补充灭活LGG降低CINC-1水平至实际上低于 母乳喂养的幼大鼠的水平。在肺和血浆中，灭活LGG降低CINC-1水 平至非常近似于母乳喂养的幼大鼠的水平。这些结果表明，灭活LGG 具有减轻配方奶粉喂养的幼鼠的全身性炎症的水平至近似于以及在 某些情况下低于母乳喂养的幼鼠的水平的能力。
细胞因子与趋化因子
[000100]活LGG和灭活LGG还降低细胞因子和趋化因子水平。 多重微珠试剂盒(Multiplex bead kit)购自LINCO Research，Inc.(St. Charles，MO，USA)。通过试剂盒进行了分析的细胞因子/趋化因子包 括：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素-λ(IFN-λ)、白介 素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、 IL-18、单核细胞化学引诱物蛋白-1(MCP-1)、GRO/KC(大鼠CINC-1) 和TNF-α。按照生产商的说明书进行了多重测定法。通过生产商供应 的参比浓度绘制各细胞因子/趋化因子的标准曲线。通过MasterPlex定 量软件(MiraiBio，Inc.，Alameda，CA，USA)对原始数据(平均荧光强 度)进行了分析得到浓度值。
[000101]如图6所示，比起对照幼鼠，胃造口进食的LPS处理 幼鼠肝中的IL-1β水平显著较高。活LGG和灭活LGG两者均使LPS 诱导的IL-1β的升高显著钝化。实际上，灭活LGG降低IL-1β水平的 程度比补充活LGG降低的程度大。灭活LGG降低IL-1β表达至近似 于对照幼鼠的水平。因此，本项实验的这一部分也表明了灭活LGG 的全身性抗炎活性。
[000102]总之，这些结果表明，补充灭活LGG减轻全身性炎症。 此外，结果表明，灭活LGG降低配方奶粉喂养的幼鼠的全身性炎症 至近似于母乳喂养的幼鼠的水平。这在本文所述的通过灭活LGG治 疗组和仅喂母乳组的比较结果中进行了说明。在一些情况下，给予灭 活LGG引起的炎症反应与母乳喂养组的炎症反应非常相似。
实施例2
[000103]本实施例进一步表明灭活LGG对配方奶粉喂养的新生 大鼠幼仔的炎症的作用。
[000104]肠上皮细胞用活LGG或UV灭活LGG按1×108cfu/L 预处理，然后用鞭毛蛋白500ng/mL刺激。通过ELISA测定IL-8的 产生。通过蛋白质印迹法和免疫沉淀法测定IkB和遍在蛋白化-IkB (UbQ-IkB)的表达。通过免疫荧光染色法评价了NFkB定位。
[000105]实验期间，鞭毛蛋白诱导细胞IL-8产生显著增加 (p＜0.05)。用活LGG或UV灭活LGG预处理，然后通过鞭毛蛋白刺 激的细胞显示IL-8、NFkB核转运、IkB和UbQ-IkB的变化显著 (p＜0.05)。结果见表1。上指箭头表示参数升高，而下指箭头则表示参 数降低。
表1.由于补充活LGG或灭活LGG所引起的表达改变。
  IL-8   NFkB转运   IkB   UbQ-IkB   仅鞭毛蛋白   ↑   ↑   ↓   ↑   活LGG   ↓   ↓   ↑   ↑   灭活LGG   ↓   ↓   ↑   ↓
[000106]如表1中所示，鞭毛蛋白诱导肠上皮细胞的IL-8产生 显著增加(p＜0.05)。IL-8的产生在活LGG和灭活LGG两者的存在下 显著下调。另外，由鞭毛蛋白刺激的细胞显示出NFkB核转运，活LGG 和灭活LGG可防止这种NFkB核转运。鞭毛蛋白降低IkB产生，但 活LGG和灭活LGG预处理使该作用逆转(p＜0.05)。鞭毛蛋白和活LGG 增加UbQ-IkB(p＜0.05)，而灭活LGG则降低UbQ-IkB。
[000107]本实施例表明活LGG和灭活LGG均有效地降低促炎细 胞因子IL-8的产生，因此具有抗炎作用。因为鞭毛蛋白和活LGG增 加UbQ-IkB，但灭活LGG降低UbQ-IkB，所以灭活LGG很可能通过 防止IkB的遍在蛋白化的机制起作用，而活LGG则很可能不是通过 防止IkB的遍在蛋白化的机制起作用。因此，本实施例进一步表明活 LGG和灭活LGG很可能通过不同的机制起作用，并且当同时给予时 可具有协同效应。
[000108]本发明表明在肝、血浆和肺中减轻炎症。因为本发明可 用于改善炎症状况，所以它还可防止发生造成伤害的感染和疾病。
[000109]本说明书所引用的所有参考文献，包括但不限于所有的 论文、出版物、专利、专利申请、简报、教科书、报告、手稿、小册 子、书籍、互联网上传文献、杂志文章、期刊等均通过引用全部结合 到本说明书中。有关参考文献的论述只是概述其作者提出的主张，并 非认定所有参考文献均构成现有技术。申请人保留对所引用的参考文 献的准确性和关联性提出异议的权利。
[000110]本领域普通技术人员无需偏离本发明的精神和范围便 可实施本发明的这些修改和变动以及其它的修改和变动，这些将在所 附权利要求书中予以更具体的描述。另外，应当了解的是，各个实施 方案的方面可完全或部分互换。此外，本领域普通技术人员应了解的 是，仅通过实施例进行了前面的描述，并不是对在所附权利要求书中 所进一步描述的本发明的限制。因此，所附权利要求书的精神和范围 不应局限于对其中所包括的优选形式的描述。
相关专利和专利申请的交叉引用

[0001]本申请是非临时申请，但要求2007年2月28日申请的美 国临时专利申请顺序号60/904,122的优先权的权益，该临时专利申请 通过引用全部结合到本文中。