大组织外植体、其方法和用途
阅读：23发布：2021-04-07
专利汇可以提供大组织外植体、其方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了胃肠道的组织外植体。还提供了制备和使用组织外植体的方法，以及为所述组织外植体设计的基质。，下面是大组织外植体、其方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种体外细胞组合物，其包含：
(i)包含多个微孔的基质；和
(ii)包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
其中该组织外植体与所述基质平面接触，从而提供所述体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述体外细胞组合物中被保持。
2.如权利要求1所述的体外细胞组合物，其中所述组织外植体包含小肠上皮、环肌层和肠绒毛。
3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体源自所述胃肠道的回肠。
4.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体源自所述胃肠道的空肠。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组织外植体源自所述胃肠道的胃、十二指肠、食道、颊部、舌或结肠。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含完全完整的细胞外基质。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述完全完整的细胞外基质包含固有层。
8.如权利要求6-7中任一项所述的组合物，其中所述完全完整的细胞外基质包含肌层。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体源自猪胃肠道。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体在培养中形成粘液层。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体在培养中保持24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述外源生长因子是Wnt3a。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体是在哺乳动物被放血后获得的。
15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含肠的肠上皮细胞。
16.如权利要求15所述的组合物，其中肠的肠上皮细胞通过绒毛蛋白、e-钙粘蛋白、角蛋白20和/或脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的存在来鉴定。
17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含紧密连接。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含分泌粘蛋白的杯状细胞。
19.如权利要求18所述的组合物，其中分泌粘蛋白的杯状细胞通过粘蛋白2(Muc2)和/或尾型同源盒2(CDX2)的存在来鉴定。
20.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含肠干细胞。
21.如权利要求20所述的组合物，其中肠干细胞通过含富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)和/或嗅质蛋白4(OLFM4)的存在来鉴定。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含肠内分泌细胞。
23.如权利要求22所述的组合物，其中肠内分泌细胞通过胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的存在来鉴定。
24.如权利要求22-23中任一项所述的组合物，其中肠内分泌细胞是L细胞。
25.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含至少一种药物运转体。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述药物运转体是MDR-1。
27.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含至少一种代谢酶。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述代谢酶是CYP3A4。
29.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含微皱褶细胞。
30.如权利要求29所述的组合物，其中微皱褶细胞通过波形蛋白的存在来鉴定。
31.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含粘液物质。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述粘液物质是糖蛋白、糖脂或粘蛋白。
33.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含神经细胞。
34.如权利要求33所述的组合物，其中神经细胞通过巢蛋白的存在来鉴定。
35.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体模拟其所来源的胃肠道的体内结构。
36.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体保持恒定的分泌Wnt3a水平。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述分泌Wnt3a水平通过蛋白质印迹分析来测定。
38.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含完整的隐窝。
39.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含硫氧还蛋白还原酶活性。
40.如权利要求39所述的组合物，其中硫氧还蛋白还原酶活性保持至少7天。
41.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述大型非人类哺乳动物为至少3周龄。
42.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述大型非人类哺乳动物为3周龄至
12周龄之间。
43.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体产生GLP-1或Muc-2。
44.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体对葡萄糖有反应。
45.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体对毒素有反应。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述毒素是具有胃肠毒性的物质或具有细胞毒性的物质。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述毒素是非甾体抗炎药(NSAID)。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述NSAID是萘普生。
49.如权利要求47所述的组合物，其中所述毒素是多西环素。
50.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述基质包含6、12、24、48、96、384或
1536个微孔。
51.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中各个微孔被所述组织外植体完全覆盖。
52.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体的血液含量被最小化。
53.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述基质不包含外源细胞外基质。
54.一种用于高通量药物吸收筛选分析的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统包含：
(i)包含多个微孔的基质；和
(ii)包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
其中该组织外植体与所述基质平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述细胞培养系统中被保持，
从而测量药物通过所述组织外植体的吸收。
55.一种高通量系统，其包含：(i)包含多个微孔的基质；和(ii)组织外植体，其包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体与所述基质平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在该系统中被保持。
56.一种用于通过胃肠组织外植体测定测试化合物的吸收的方法，其包括：
(a)使组织外植体与测试化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；和
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述测试化合物的存在来测定吸收，其中在基底外侧表面处所述测试化合物的存在表明该化合物通过所述组织外植体被吸收的能力。
57.如权利要求56所述的方法，其中检测所述测试化合物的存在包含测定所述化合物在所述腔表面和基底外侧表面处的浓度。
58.一种用于测定胃肠组织外植体中测试化合物的浓度的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；和
(b)检测所述组织外植体内所述化合物的存在。
59.如权利要求58所述的方法，其中测定所述化合物的浓度包括高内涵共焦分析。
60.一种用于通过胃肠组织外植体测定测试化合物的口服生物利用度的方法，其包含：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
(b)检测该化合物在所述腔表面和所述基底外侧表面处的存在，其中该化合物在所述基底外侧表面处的存在指示该化合物的口服生物利用度。
61.一种用于预测测试化合物通过人胃肠道的吸收的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；和
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来预测吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过人胃肠道吸收的能力。
62.一种用于在组织外植体中测定药物-食物相互作用对测试化合物的吸收的影响的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与消化的食物接触；和
(c)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测定吸收，其中在所述基底外侧表面处所述化合物的存在指示所述化合物通过所述组织外植体被吸收的能力。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述组织外植体还包括使所述组织外植体与源自所述大型非人类哺乳动物胃肠道的天然肠介质接触。
64.如权利要求63所述的方法，其进一步包括在使所述组织外植体与所述目的化合物接触之前，将所述目的化合物溶解在天然肠介质中。
65.如权利要求62-64中任一项所述的方法，其中使所述组织外植体与所述消化的食物和所述目的化合物接触同时进行。
66.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其进一步包括在存在或不存在所述消化的食物的情况下测定目的化合物的吸收的差异。
67.一种用于通过胃肠组织外植体的测试化合物吸收的时延分析的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
(b)测定一段时间内的吸收，其包括在不同时间点检测所述化合物在所述腔表面和所述基底外侧表面处的存在，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体被吸收的能力。
68.一种用于通过组织外植体测定测试化合物的灌注速率的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；和
(b)测定一段时间内的灌注，其包括在不同的时间点检测所述化合物在所述腔表面和所述基底外侧表面处的存在，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体灌注的能力。
69.一种用于测定测试化合物对胃肠组织外植体的影响的方法，其包括：
(a)在组织外植体上至少进行一个第一分析，其中该组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)在所述组织外植体上进行至少一个第二分析；和
(d)比较所述第一分析和所述第二分析的结果，其中所述第一分析和第二分析是相同的分析，
从而测定该化合物的影响。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第一和第二分析选自药物溶出分析、吸收分析、细胞毒性分析、药物降解分析和激素分泌分析。
71.如权利要求69-70中任一项所述的方法，其中同时进行超过一个分析。
72.一种用于通过组织外植体测定药物运转体对测试化合物的吸收的影响的方法，其包括：
(a)改变所述药物运转体在组织外植体中的表达，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)通过检测所述化合物在所述腔表面和所述基底外侧表面处的存在来测定吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力；和
(d)比较具有或不具有改变的药物运转体的情况下所述组织外植体的吸收，从而测定所述药物运转体对所述化合物的吸收的影响。
73.一种用于测定代谢酶对化合物通过人胃肠道吸收的影响的方法，其包括：
(a)改变所述代谢酶在组织外植体中的表达，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测定吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示该化合物通过所述组织外植体吸收的能力；和
(d)比较具有或不具有改变的代谢酶的情况下所述组织外植体的吸收，从而测定所述药物运转体对所述化合物的吸收的影响。
74.如权利要求72-73中任一项所述的方法，其中(a)包括遗传修饰。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述遗传修饰包括siRNA敲低。
76.一种用于高通量药物筛选的方法，其包括使组织外植体与化合物库接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；并测定所述化合物库对所述组织外植体的影响。
77.一种用于分析药物制剂的吸收的高通量方法，其包括：
(a)使组织外植体与包含目的化合物和赋形剂的制剂库接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测量所述目的化合物通过所述组织外植体的吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力；
(c)比较所述目的化合物对于各个制剂的吸收，
从而鉴定用于药物吸收的制剂。
78.一种高通量药物吸收筛选方法，其中同时测定多种药物组合物的吸收，该方法包括：
(a)使组织外植体与多种包含目的化合物和赋形剂的药物组合物在所述组织外植体的不同位置上接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测量所述目的化合物通过所述组织外植体的吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
79.一种制备体外肠模型的方法，其包括：
(a)提供组织外植体，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供了腔表面和基底外侧表面，其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
和
(b)使所述组织外植体与包含多个微孔的基质接触。
80.一种适用于组织外植体的基质组件，其包含
第一板，其具有主体，该主体具有形成在其中的多个微孔和形成在其中的多个紧固件接收孔，
第二板，其具有主体并具有形成在其中的多个微孔和形成在其中的多个紧固件接收孔，以及
多个磁体，其中一个或所述多个磁体位于所述第一和第二板的所述多个紧固件接收孔中的每个孔内。
81.如权利要求80所述的基质组件，其中所述第一板具有顶表面和相对的底表面，其中所述底表面具有围绕所述底表面的外周边缘形成在其上并从其向外延伸的边缘部分，其中所述边缘部分形成腔室。
82.如权利要求81所述的基质组件，还包含沿着所述第一板的底表面的中心部分形成并从其向外延伸的脊部分，其中该脊部分将所述腔室分成多个子腔室，各个子腔室适应于容纳组织外植体。
83.如权利要求81所述的基质组件，其中所述边缘部分沿着所述第一板的主体的相对侧面在其中形成一个或多个切口特征。
84.如权利要求81所述的基质组件，其中所述第二板具有顶表面和相对的底表面，其中所述顶表面具有围绕所述顶表面的外周边缘在其上形成并从其向外延伸的边缘部分，其中所述边缘部分形成腔室。
85.如权利要求84所述的基质组件，还包含沿着所述第二板的顶表面的中心部分形成并从其向外延伸的脊部分，其中该脊部分将所述腔室分成多个子腔室，各个子腔室适应于容纳组织外植体。
86.如权利要求84所述的基质组件，其中在所述第二板的顶表面上形成的所述边缘部分具有沿着所述顶板的主体的相对侧面在其中形成的一个或多个切口特征。
87.如权利要求80所述的基质组件，其中所述第一板和所述第二板的所述多个微孔包含6、12、24、28、96、384或1536个微孔。
88.如权利要求80所述的基质组件，其中所述多个微孔中的各个微孔被组织外植体完全覆盖。
89.一种用于在胃肠组织外植体中同时测定测试化合物的吸收和溶出的方法，其包括：
(a)将测试化合物溶解在溶剂中，从而产生药物溶液，并且使所述药物溶液在足够的时间内蒸发以产生最终的药物粉末；
(b)将来自(a)的所述药物粉末与赋形剂组合；
(c)使组织外植体与来自(b)的所述药物粉末接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(d)通过检测上清液中的浓度来测定溶出度；和
(e)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述测试化合物的存在来测定吸收，其中在所述基底外侧表面处所述测试化合物的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
90.如权利要求56所述的方法，其中相对于使用Caco-2细胞测定的吸收的Pearson相关值，通过所述组织外植体的吸收与体内测量的吸收相比具有较高的Pearson相关值。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述较高的Pearson相关值是至少0.70、至少0.75、至少0.80、至少0.85或至少0.90。
92.如权利要求56所述的方法，其中相对于使用Caco-2细胞测定的吸收，通过所述组织外植体的吸收具有较低的变异系数。
93.一种用于测定测试化合物的组织蓄积对胃肠组织外植体的影响的方法，其包括：
(a)对组织外植体进行至少一个第一分析，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)对所述组织外植体进行至少一个第二分析；和
(d)比较所述第一分析和所述第二分析的结果，其中所述第一分析和所述第二分析是相同的分析，
从而测定所述化合物的组织积累的影响。
94.一种体外细胞组合物，其包含：
(i)基质，其包含多个微孔；和
(ii)组织外植体，其包含来自大型哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中该肠上皮包含在该组织外植体中具有极性的上皮细胞，
其中该组织外植体与所述基质平面接触，从而提供所述体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述体外细胞组合物中被保持。
95.如权利要求94所述的体外细胞组合物，其中所述组织外植体包含小肠上皮、环肌层和肠绒毛。
96.如权利要求94-95中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体源自：
(i)所述胃肠道的回肠；
(ii)所述胃肠道的空肠；
(iii)所述胃肠道的胃；
(iv)所述胃肠道的食道；
(v)所述胃肠道的颊部组织；
(vi)所述胃肠道的舌组织；或
(vii)所述胃肠道的结肠。
97.如权利要求94-96中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含完全完整的细胞外基质，任选地其中所述完全完整的细胞外基质包含固有层、肌层或两者。
98.如权利要求94-97中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体源自人胃肠道。
99.如权利要求94-98中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体在培养中形成粘液层。
100.如权利要求94-99中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体在培养中保持24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间。
101.如权利要求94-100中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
102.如权利要求101所述的组合物，其中所述外源生长因子是Wnt3a。
103.如权利要求94-102中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含(i)肠的肠上皮细胞，任选地其中肠的肠上皮细胞通过绒毛蛋白、e-钙粘蛋白、角蛋白
20和/或脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的存在来鉴定；和/或
(ii)紧密连接；和/或
(iii)分泌粘蛋白的杯状细胞，任选地其中分泌粘蛋白的杯状细胞通过粘蛋白2(Muc2)和/或尾型同源盒2(CDX2)的存在来鉴定；和/或
(iv)肠干细胞，任选地其中肠干细胞通过含有富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)和/或嗅质蛋白4(OLFM4)的存在来鉴定；和/或
(v)肠内分泌细胞，任选地其中肠内分泌细胞通过胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的存在来鉴定，进一步任选地其中内分泌细胞是L细胞；和/或
(vi)微皱褶细胞，任选地其中微皱褶细胞通过波形蛋白的存在来鉴定；和/或(vii)神经细胞，任选地其中神经细胞通过巢蛋白的存在来鉴定。
104.如权利要求94-103中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含至少一种药物运转体，任选地其中所述药物运转体是MDR-1。
105.如权利要求94-104中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体至少包含一种代谢酶，任选地其中所述代谢酶是CYP3A4。
106.如权利要求94-105中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含粘液物质，任选地其中所述粘液物质是糖蛋白、糖脂或粘蛋白。
107.如权利要求94-106中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体模拟其所来源的胃肠道的体内结构。
108.如权利要求94-107中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体保持恒定水平的分泌Wnt3a，任选地其中所述分泌Wnt3a的水平通过蛋白质印迹分析来测定。
109.如权利要求94-108中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含完整的隐窝。
110.如权利要求94-109中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体包含硫氧还蛋白还原酶活性，任选地其中硫氧还蛋白还原酶活性保持至少7天。
111.如权利要求94-110中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体产生GLP-1或Muc-2和/或对葡萄糖有反应。
112.如权利要求94-111中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体对毒素有反应。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述毒素是具有胃肠毒性的物质或具有细胞毒性的物质。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述毒素是非甾体抗炎药(NSAID)。
115.如权利要求114所述的组合物，其中所述NSAID是萘普生。
116.如权利要求113所述的组合物，其中所述毒素是多西环素。
117.如权利要求94-116中任一项所述的组合物，其中所述基质包含6、12、24、48、96、
384或1536个微孔。
118.如权利要求94-117中任一项所述的组合物，其中各个微孔被所述组织外植体完全覆盖。
119.如权利要求94-118中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体的血液含量最小化。
120.如权利要求94-119中任一项所述的组合物，其中所述基质不包含外源细胞外基质。
121.一种用于高通量药物吸收筛选分析中的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统包含：
(i)基质，其包含多个微孔；和
(ii)组织外植体，其包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
其中所述组织外植体与所述基质平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述细胞培养系统中被保持，
从而允许测量药物通过所述组织外植体的吸收。
122.一种高通量系统，其包含：(i)包含多个微孔的基质；(ii)包含来自人胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体与所述基质平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述系统中被保持。
123.一种用于通过胃肠组织外植体测定受试化合物的吸收的方法，其包括：
(a)使组织外植体与测试化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持，和
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述测试化合物的存在来测定吸收，其中所述测试化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
124.如权利要求123所述的方法，其中检测所述测试化合物的存在包括测定所述化合物在所述腔表面和基底外侧表面处的浓度。
125.一种用于测定胃肠组织外植体中测试化合物的浓度的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
和
(b)检测所述组织外植体内所述化合物的存在。
126.如权利要求125所述的方法，其中测定所述化合物的浓度包括高内涵共焦分析。
127.一种用于通过胃肠组织外植体测定受试化合物的口服生物利用度的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
和
(b)检测所述化合物在所述腔表面和所述基底外侧表面处的存在，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示该化合物的口服生物利用度。
128.一种预测测试化合物通过人胃肠道的吸收的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
和
(b)通过检测所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来预测吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示该化合物通过人胃肠道吸收的能力。
129.一种用于在组织外植体中测定药物-食物相互作用对测试化合物的吸收的影响的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与消化的食物接触；和
(c)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测定吸收，其中在所述基底外侧表面处所述化合物的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述组织外植体进一步包括使所述组织外植体与源自人胃肠道的天然肠介质接触。
131.如权利要求130所述的方法，其进一步包括在使所述组织外植体与所述目的化合物接触之前，将所述目的化合物溶解在天然肠介质中。
132.如权利要求129-131中任一项所述的方法，其中使所述组织外植体与所述消化的食物和所述目的化合物接触是同时的。
133.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其进一步包括在存在或不存在所述消化的食物的情况下测定所述目的化合物的吸收的差异。
134.一种用于通过胃肠组织外植体的测试化合物吸收的时延分析的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
和
(b)测定一段时间内的吸收，包括在不同时间点检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在，其中在所述基底外侧表面处所述化合物的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
135.一种用于通过组织外植体测定测试化合物的灌注速率的方法，其包括：
(a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
和
(b)测定一段时间内的灌注，包括在不同的时间点检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体灌注的能力。
136.一种用于测定测试化合物对胃肠组织外植体的影响的方法，其包括：
(a)在组织外植体上进行至少一个第一分析，其中该组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)在所述组织外植体上进行至少一个第二分析；和
(d)比较所述第一分析和所述第二分析的结果，其中所述第一分析和所述第二分析是相同的分析，
从而测定该化合物的影响。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述第一和第二分析选自于药物溶出分析、吸收分析、细胞毒性分析、药物降解分析和激素分泌分析。
138.如权利要求136-137中任一项所述的方法，其中同时进行超过一种的分析。
139.一种用于通过组织外植体测定药物运转体对测试化合物的吸收的影响的方法，其包括：
(a)改变药物运转体在组织外植体中的表达，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测定吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示该化合物通过组织外植体吸收的能力；和(d)比较具有或不具有改变的药物运转体的情况下所述组织外植体的吸收，从而测定所述药物运转体对所述化合物的吸收的影响。
140.一种用于测定代谢酶对化合物通过人胃肠道的吸收的影响的方法，其包括：
(a)改变所述代谢酶在组织外植体中的表达，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测定吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示该化合物通过所述组织外植体吸收的能力；和
(d)比较具有或不具有修饰的代谢酶的情况下所述组织外植体的吸收，从而测定所述药物运转体对所述化合物的吸收的影响。
141.如权利要求139-140中任一项所述的方法，其中(a)包括遗传修饰。
142.如权利要求141所述的方法，其中基因修饰包括siRNA敲低。
143.一种用于高通量药物筛选的方法，其包括使组织外植体与化合物库接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；和测定所述化合物库对所述组织外植体的影响。
144.一种用于分析药物制剂的吸收的高通量方法，其包括：
(a)使组织外植体与其中包含目的化合物和赋形剂的制剂库接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测量所述目的化合物通过所述组织外植体的吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力；
(c)比较所述目的化合物与各个制剂的吸收，
从而确定用于药物吸收的制剂。
145.一种高通量药物吸收筛选方法，其中同时测定多种药物组合物的吸收，该方法包括：
(a)使组织外植体与多种包含目的化合物和赋形剂的药物组合物在所述组织外植体上的不同位置接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述化合物的存在来测量所述目的化合物通过所述组织外植体的吸收，其中所述化合物在所述基底外侧表面处的存在指示所述化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
146.一种制备体外肠模型的方法，其包括：
(a)提供组织外植体，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；和
(b)使所述组织外植体与包含多个微孔的基质接触。
147.一种用于在胃肠组织外植体内同时测定测试化合物的吸收和溶出的方法，其包括：
(a)将测试化合物溶解在溶剂中，从而产生药物溶液，并且使所述药物溶液在足够的时间内蒸发以产生最终的药物粉末；
(b)将来自(a)的所述药物粉末与赋形剂组合；
(c)使组织外植体与来自(b)的所述药物粉末接触，其中所述组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(d)通过检测上清液中的浓度来测定溶出度；和
(e)通过检测在所述腔表面和所述基底外侧表面处所述测试化合物的存在来测定吸收，其中在所述基底外侧表面处所述测试化合物的存在指示该化合物通过所述组织外植体吸收的能力。
148.如权利要求123所述的方法，其中相对于使用Caco-2细胞测定的吸收的Pearson相关值，通过所述组织外植体的吸收与体内测量的吸收相比具有较高的Pearson相关值。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述较高的Pearson相关值是至少0.70、至少
0.75、至少0.80、至少0.85或至少0.90。
150.一种用于测定测试化合物的组织蓄积对胃肠组织外植体的影响的方法，其包括：
(a)在组织外植体上进行至少一个第一分析，其中该组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中所述上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
(b)使所述组织外植体与目的化合物接触；
(c)在所述组织外植体上进行至少一个第二分析；和
(d)比较所述第一分析和所述第二分析的结果，其中所述第一分析和所述第二分析是相同的分析，
从而测定所述化合物的组织蓄积的影响。
大组织外植体、其方法和用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2017年3月24日提交的美国临时申请号62/476,181的优先权，以及于2017年9月19日提交的美国临时申请号62/560,485的优先权。上述参考申请的其全部内容通过引用结合于此。
背景技术
[0004] 但是，这些系统无法完全重演组织的结构和功能。此外，这些培养物通常与高通量系统不相容。因此，仍然需要可以模拟组织的体内结构和功能并经受高通量实验测试的系统。发明内容
[0005] 本公开部分地基于以下发现：源自胃肠道的组织外植体可对于至少药物吸收、药物溶出、药物诱导的胃肠毒性和内分泌系统调节而用于高通量筛选测定中。例如，可以操纵猪小肠的解剖以用于高通量系统中，其中可以通过灌注来测量药物的吸收。
[0006] 因此，在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0007] (i)包含多个微孔的基质(substrate)；和
[0008] (ii)包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
[0009] 其中该组织外植体与基质平面地接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0010] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0011] (i)包含多个微孔的基质；和
[0012] (ii)包含来自人胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
[0013] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0014] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含小肠上皮、环肌层和肠绒毛。在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体源自胃肠道的回肠。在本公开的其他方面，本文所述的组织外植体源自胃肠道的空肠。在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体源自胃肠道的胃、十二指肠、食道、颊部、舌或结肠。
[0015] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含完全完整的细胞外基质。在本公开的其他方面，完全完整的细胞外基质包含固有层。在本公开的再其他方面，完全完整的细胞外基质包含肌层。
[0016] 在本公开的另一方面，本文所述的组织外植体源自猪胃肠道。在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体在培养中形成粘液层。在本公开的再进一步的方面，本文所述的组织外植体在培养中保持至少24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间。
[0017] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。在本公开的进一步的方面，外源生长因子是Wnt3a。
[0018] 在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体是在哺乳动物被放血后获得的。
[0019] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含肠的肠上皮细胞。在本公开的进一步的方面，肠的肠上皮细胞通过绒毛蛋白、e-钙粘蛋白、角蛋白20和/或脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的存在来鉴定。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含紧密连接。在某些方面，紧密连接通过Claudin-1的存在来鉴定。
[0020] 在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体包含分泌粘蛋白的杯状细胞。在本公开的一些方面，通过粘蛋白2(Muc2)和/或尾型同源盒2(CDX2)的存在来鉴定分泌粘蛋白的杯状细胞。
[0022] 在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体包含肠内分泌细胞。在一些实施方案中，肠内分泌细胞是神经内分泌细胞(L-细胞)。在本公开的一些方面，通过胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的存在来鉴定肠内分泌细胞。
[0023] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含至少一种药物运转体。在本公开的进一步的方面，药物运转体是MDR-1。在一些方面，药物运转体选自：MDR-1、ABCC3、MRP-2、PEPT-1、BCRP、OCT-1、OST-α和MCT-1。
[0024] 而在本公开的再进一步的方面，本文所述的组织外植体包含至少一种代谢酶。在本公开的一些方面，所述代谢酶是CYP3A4。
[0025] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含微皱褶细胞。在本公开的再进一步的方面，微皱褶细胞通过波形蛋白的存在来鉴定。
[0026] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含粘液物质。在本公开的进一步的方面，粘液物质是糖蛋白、糖脂或粘蛋白。
[0027] 在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体包含神经细胞。在本公开的一些方面，通过巢蛋白的存在鉴定神经细胞。
[0028] 在本公开的再进一步的方面，本文所述的组织外植体模拟其所来源的胃肠道的体内结构。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体保持恒定的分泌Wnt3a的水平。在本公开的进一步的方面，通过蛋白质印迹分析测定分泌的Wnt3a的水平。
[0029] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含完整的隐窝。在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体包含硫氧还蛋白还原酶活性。在本公开的再进一步的方面，硫氧还蛋白还原酶活性保持至少7天。在本公开的一些方面，组织外植体包含细胞色素P4503A4(CYP3A4)活性。在本公开的再进一步的方面，CYP3A4活性保持至少7天。在本公开的一些方面，组织外植体含有尿苷5’-二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)活性。
[0030] 在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体源自至少3周龄的大型非人类哺乳动物。在本公开的一些方面，大型非人类哺乳动物在3周至12周龄之间。
[0031] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体产生GLP-1或Muc-2。在本公开的一些方面，组织外植体产生GLP-1。在本公开的进一步的方面，本文所述的组织外植体对葡萄糖有反应。
[0032] 在本公开的再进一步的方面，本文所述的组织外植体对毒素有反应。在一些方面，本文所述的组织外植体从暴露于毒素中恢复。在本公开的一些方面，毒素是具有胃肠毒性的物质或具有细胞毒性的物质。在本公开的进一步的方面，该毒素是非甾体抗炎药(NSAID)。在本公开的再进一步的方面，NSAID是萘普生。在本公开的一些方面，该毒素是多西环素。在本公开的一些方面，该毒素选自于抗生素、NSAID、双膦酸盐、支气管扩张药、抗病毒药、血管扩张药、利尿药和质子泵抑制剂。在一些方面，该毒素是抗生素，其中该抗生素是头孢泊肟或多西环素。在一些方面，该毒素是NSAID，其中NSAID选自美洛昔康、美沙拉敏、萘普生和吲哚美辛。在一些方面，该毒素是双膦酸盐，其中该双膦酸盐是依替膦酸盐
(etidronate)。在一些方面，该毒素是支气管扩张剂，其中该支气管扩张剂是茶碱。在一些方面，该毒素是抗病毒药，其中该抗病毒药是依诺福韦(enofovir)或奥司他韦
(oseltamivir)。在一些方面，该毒素是血管扩张剂，其中该血管扩张剂是他达拉非(tadalafil)。在一些方面，该毒素是利尿剂，其中该利尿剂是阿米洛利(amiloride)。在一些方面，该毒素是质子泵抑制剂，其中该质子泵抑制剂是奥美拉唑(omeprazole)。
(etidronate)。在一些方面，该毒素是支气管扩张剂，其中该支气管扩张剂是茶碱。在一些方面，该毒素是抗病毒药，其中该抗病毒药是依诺福韦(enofovir)或奥司他韦
(oseltamivir)。在一些方面，该毒素是血管扩张剂，其中该血管扩张剂是他达拉非(tadalafil)。在一些方面，该毒素是利尿剂，其中该利尿剂是阿米洛利(amiloride)。在一些方面，该毒素是质子泵抑制剂，其中该质子泵抑制剂是奥美拉唑(omeprazole)。
[0033] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛。
[0034] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质。
[0035] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含固有层的完全完整的细胞外基质。
[0036] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含肌层的完全完整的细胞外基质。
[0037] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含固有层和肌层的完整的细胞外基质。
[0038] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中所述组织外植体在培养中形成粘液层。
[0039] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中所述组织外植体在培养中保持24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间。
[0040] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中所述组织外植体在培养中保持24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间，并且其中组织外植体在培养中形成粘液层。
[0041] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中所述组织外植体在培养中保持24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0042] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中所述组织外植体模拟其所来源的胃肠道的体内结构。
[0043] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)完全完整的细胞外基质，和(d)完整的隐窝。
[0044] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)完全完整的细胞外基质，和(d)完整的隐窝，其中所述组织外植体模拟其所来源的胃肠道的体内结构。
[0045] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中该组织外植体对葡萄糖有反应。
[0046] 在一些方面，本文所述的组织外植体包含：(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，其中该组织外植体对毒素有反应。
[0047] 在本公开的一些方面，本文所述的基质包含6、12、24、48、96、384或1536个微孔。在本公开的进一步的方面，每个微孔被组织外植体完全覆盖。在本公开的一些方面，基质不包含外源细胞外基质。在本公开的再进一步的方面，组织外植体的血液含量已被最小化。
[0048] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0049] (i)包含多个微孔的基质；和
[0050] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛，[0051] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0052] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0053] (i)包含多个微孔的基质；和
[0054] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)完全完整的细胞外基质，[0055] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0056] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0057] (i)包含多个微孔的基质；和
[0058] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)包含固有层的完全完整的细胞外基质，
[0059] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0060] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0061] (i)包含多个微孔的基质；和
[0062] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)包含肌层的完全完整的细胞外基质，
[0063] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0064] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0065] (i)包含多个微孔的基质；和
[0066] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质，
[0067] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0068] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0069] (i)包含多个微孔的基质；和
[0070] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，
[0071] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0072] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0073] (i)包含多个微孔的基质；和
[0074] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含固有层的完全完整的细胞外基质，
[0075] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0076] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0077] (i)包含多个微孔的基质；和
[0078] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含肌层的完全完整的细胞外基质，
[0079] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0080] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0081] (i)包含多个微孔的基质；和
[0082] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含固有层和肌层的完整的细胞外基质，
[0083] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0084] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0085] (i)包含多个微孔的基质；和
[0086] (ii)包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
[0087] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0088] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0089] (i)包含多个微孔的基质；和
[0090] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛，[0091] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0092] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0093] (i)包含多个微孔的基质；和
[0094] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)完全完整的细胞外基质，[0095] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体不需要外源生长因子以在培养中保持。
[0096] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0097] (i)包含多个微孔的基质；和
[0098] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)包含固有层的完全完整的细胞外基质，
[0099] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0100] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0101] (i)包含多个微孔的基质；和
[0102] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)包含肌层的完全完整的细胞外基质，
[0103] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0104] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0105] (i)包含多个微孔的基质；和
[0106] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质，
[0107] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0108] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0109] (i)包含多个微孔的基质；和
[0110] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)完全完整的细胞外基质，
[0111] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0112] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0113] (i)包含多个微孔的基质；和
[0114] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含固有层的完全完整的细胞外基质，
[0115] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0116] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0117] (i)包含多个微孔的基质；和
[0118] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含肌层的完全完整的细胞外基质，
[0119] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0120] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0121] (i)包含多个微孔的基质；和
[0122] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质，
[0123] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0124] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0125] (i)包含多个微孔的基质；和
[0126] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)至少一种药物运转体，
[0127] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0128] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0129] (i)包含多个微孔的基质；和
[0130] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)完全完整的细胞外基质；(c)至少一种药物运转体，
[0131] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0132] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0133] (i)包含多个微孔的基质；和
[0134] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)包含固有层的完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0135] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0136] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0137] (i)包含多个微孔的基质；和
[0138] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)包含肌层的完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0139] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0140] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0141] (i)包含多个微孔的基质；和
[0142] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0143] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0144] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0145] (i)包含多个微孔的基质；和
[0146] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0147] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0148] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0149] (i)包含多个微孔的基质；和
[0150] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)包含固有层的完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0151] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0152] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0153] (i)包含多个微孔的基质；和
[0154] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)包含肌层的完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0155] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0156] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0157] (i)包含多个微孔的基质；和
[0158] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0159] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持。
[0160] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0161] (i)包含多个微孔的基质；和
[0162] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；和(b)至少一种药物运转体，[0163] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0164] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0165] (i)包含多个微孔的基质；和
[0166] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；和(c)至少一种药物运转体，
[0167] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0168] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0169] (i)包含多个微孔的基质；和
[0170] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0171] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0172] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0173] (i)包含多个微孔的基质；和
[0174] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)包含固有层的完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0175] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0176] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0177] (i)包含多个微孔的基质；和
[0178] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)包含肌层的完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0179] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0180] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0181] (i)包含多个微孔的基质；和
[0182] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)其中包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质；和(c)至少一种药物运转体，
[0183] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0184] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0185] (i)包含多个微孔的基质；和
[0186] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0187] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0188] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0189] (i)包含多个微孔的基质；和
[0190] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)包含固有层的完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0191] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0192] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0193] (i)包含多个微孔的基质；和
[0194] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)包含肌层的完全完整的细胞外基质；和(d)至少一种药物运转体，
[0195] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0196] 在一些方面，本公开涉及体外细胞组合物，其包含：
[0197] (i)包含多个微孔的基质；和
[0198] (ii)组织外植体，其包含(a)来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞；(b)小肠上皮、环肌层和肠绒毛；(c)包含固有层和肌层的完全完整的细胞外基质；(d)至少一种药物运转体，
[0199] 其中该组织外植体与基质平面接触，从而提供体外细胞组合物的腔表面和基底外侧表面，其中上皮细胞的极性在体外细胞组合物中被保持，并且其中组织外植体在培养中保持不需要外源生长因子。
[0200] 本公开还提供了用于高通量药物吸收筛选分析的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统包含：
[0201] (i)包含多个微孔的基质；和
[0202] (ii)包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮的组织外植体，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，
[0203] 其中组织外植体与基质平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在细胞培养系统中被保持，
[0204] 从而允许测量药物通过组织外植体的吸收。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0205] 在其他方面，本公开提供了一种高通量系统，其包含：(i)包含多个微孔的基质；(ii)组织外植体，其包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体与所述基质平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在系统中被保持。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0206] 本公开还提供了用于通过胃肠组织外植体测定测试化合物的吸收的方法，其包括：
[0207] (a)使组织外植体与测试化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0208] (b)通过检测在腔表面和基底外侧表面处测试化合物的存在来测定吸收，其中在基底外侧表面处测试化合物的存在指示该化合物通过组织外植体吸收的能力。在一些方面，检测测试化合物的存在包含测定在腔表面和基底外侧表面处化合物的浓度。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0209] 在一些方面，相对于使用Caco-2细胞测定的吸收的Pearson相关值，通过组织外植体的吸收与体内测量的吸收相比具有较高的Pearson相关值。在一些方面，较高的Pearson相关值是至少0.70、至少0.75、至少0.80、至少0.85或至少0.90。在一些方面，相对于使用Caco-2细胞测定的吸收，通过组织外植体的吸收具有较低的变异系数(CV)。
[0210] 在再进一步的方面，本公开提供了用于测定胃肠组织外植体中测试化合物的浓度的方法，其包括：
[0211] (a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0212] (b)检测组织外植体内化合物的存在。在一些方面，测定化合物的浓度包括高内涵共焦分析(gigh content confocal analysis)。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0213] 在进一步的方面，本公开提供了用于通过胃肠组织外植体测定测试化合物的口服生物利用度的方法，其包括：
[0214] (a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0215] (b)检测该化合物在腔表面和基底外侧表面处的存在，其中该化合物在基底外侧表面处的存在指示该化合物的口服生物利用度。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0216] 在一些方面，本公开提供了预测测试化合物通过人胃肠道的吸收的方法，其包括：
[0217] (a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0218] (b)通过检测腔表面和基底外侧表面处化合物的存在来预测吸收，其中化合物在基底外侧表面处的存在指示该化合物通过人胃肠道吸收的能力。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0219] 在再进一步的方面，本公开提供了用于在组织外植体中测定药物-食物相互作用对测试化合物的吸收的影响的方法，其包括：
[0220] (a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0221] (b)使组织外植体与消化的食物接触；和
[0222] (c)通过检测在腔表面和基底外侧表面处化合物的存在来测定吸收，其中在基底外侧表面处化合物的存在指示化合物通过组织外植体吸收的能力。在本公开的一些方面，该方法进一步包括使组织外植体与源自大型非人类哺乳动物胃肠道的天然肠介质(native intestinal medium)接触。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。在本公开的进一步的方面，在使组织外植体与目的化合物接触之前，将目的化合物溶解在天然肠介质中。在本公开的一些方面，使组织外植体与消化的食物和目的化合物同时接触。在本公开的其他方面，该方法进一步包括测定在存在或不存在消化的食物的情况下目的化合物的吸收差异。
[0223] 在一些方面，本公开提供了用于通过胃肠组织外植体的测试化合物吸收的时延分析(time lapse analysis)的方法，其包括：
[0224] (a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0225] (b)测定一段时间内的吸收，其包括在不同时间点检测化合物在腔表面和在基底外侧表面处的存在，其中在基底外侧表面处化合物的存在指示化合物通过组织外植体吸收的能力。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0226] 在进一步的方面，本公开提供了用于测定测试化合物通过组织外植体的灌注速率的方法，其包括：
[0227] (a)使组织外植体与目的化合物接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0228] (b)测定一段时间内的灌注，其包括在不同的时间点检测化合物在腔表面和基底外侧表面处的存在，其中在基底外侧表面处化合物的存在指示化合物通过组织外植体灌注的能力。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0229] 在进一步的方面，本公开提供了用于测定测试化合物对胃肠组织外植体的影响的方法，其包括：
[0230] (a)在组织外植体上进行第一分析，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0231] (b)使组织外植体与目的化合物接触；
[0232] (c)在组织外植体上进行第二分析；和
[0233] (d)比较第一分析和第二分析的结果，
[0234] 从而测定该化合物的影响。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。在本公开的一些方面，第一和第二分析测量化合物对胃肠道的细胞毒性的影响。在本公开的进一步的方面，该第一和第二分析法测量化合物对胃肠道的代谢的影响。
[0235] 在一些方面，本公开提供用于通过组织外植体测定药物运转体对测试化合物的吸收的影响的方法，其包括：
[0236] (a)改变药物运转体在组织外植体中的表达，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，和其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0237] (b)使组织外植体与目的化合物接触；
[0238] (c)通过检测在腔表面和基底外侧表面处化合物的存在来测定吸收，其中化合物在基底外侧表面处的存在指示该化合物通过组织外植体被吸收的能力；和
[0239] (d)比较具有或不具有改变的药物运转体的情况下组织外植体的吸收，从而测定药物运转体对化合物的吸收的影响。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0240] 在再进一步的方面，本公开提供了测定代谢酶对化合物通过人胃肠道的吸收的影响的方法，其包括：
[0241] (a)改变代谢酶在组织外植体中的表达，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，和其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0242] (b)使组织外植体与目的化合物接触；
[0243] (c)通过检测在腔表面和基底外侧表面处化合物的存在来测定吸收，其中化合物在基底外侧表面处的存在指示该化合物通过组织外植体被吸收的能力；和
[0244] (d)比较具有或不具有改变的代谢酶的情况下组织外植体的吸收，从而测定药物运转体对化合物的吸收的影响。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0245] 在本公开的一些方面，改变表达包括遗传修饰。在本公开的进一步的方面，遗传修饰包括siRNA敲低。
[0246] 在进一步的方面，本公开提供了用于高通量药物筛选的方法，包括使组织外植体与化合物库接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；以及测定化合物库对组织外植体的影响。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0247] 在一些方面，本公开提供了用于分析药物制剂的吸收的高通量方法，其包括：
[0248] (a)使组织外植体与其中包含目的化合物和赋形剂的制剂库接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在所述组织外植体中被保持；
[0249] (b)通过检测在腔表面和基底外侧表面处化合物的存在来测定目的化合物通过组织外植体的吸收，其中化合物在基底外侧表面处的存在指示化合物通过组织外植体吸收的能力；
[0250] (c)比较目的化合物与各个制剂的吸收，
[0251] 从而鉴定用于药物吸收的制剂。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0252] 在进一步的方面，本公开提供了高通量药物吸收筛选的方法，其中同时测定多种药物组合物的吸收，该方法包括：
[0253] (a)使组织外植体与多种包含目的化合物和赋形剂的药物组合物在组织外植体的不同位置处接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0254] (b)通过检测在腔表面和基底外侧表面处化合物的存在来测量目的化合物通过组织外植体的吸收，其中化合物在基底外侧表面处的存在指示化合物通过组织外植体吸收的能力。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0255] 在再进一步的方面，本公开提供了制备体外肠模型的方法，其包括：
[0256] (a)提供组织外植体，其中该组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中该肠上皮包含在该组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中该组织外植体提供了腔表面和基底外侧表面，和其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；和
[0257] (b)使组织外植体与包含多个微孔的基质接触。在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体包含来自人胃肠道的肠上皮。
[0258] 在一些方面，本公开提供了适于与组织外植体一起使用的基质组件，其包含：
[0260] 第二板，其具有主体并具有形成在其中的多个微孔和具有形成在其中的多个紧固件接收孔，以及
[0261] 多个磁体，其中一个或所述多个磁体位于第一和第二板的多个紧固件接收孔的每个孔内。在一些方面，所述第一板具有顶表面和相对的底表面，其中所述底表面具有围绕所述底表面的外周边缘形成在其上的并从其向外延伸的边缘部分，其中所述边缘部分形成腔室。在进一步的方面，基质组件还包含沿着第一板的底表面的中心部分形成并从其向外延伸的脊部分，其中该脊部分将腔室分成多个子腔室，各个子腔室适于容纳组织外植体。在再进一步的方面，所述边缘部分沿着第一板的主体的相对侧而在其中形成一个或多个切口特征(cut-out feature)。在一些方面，第二板具有顶表面和相对的底表面，其中该顶表面具有围绕所述顶表面的外周边缘形成在其上并从其向外延伸的边缘部分，其中所述边缘部分形成腔室。
[0262] 在一些方面，该基质组件还包含沿着第二板的顶表面的中心部分形成的并从其向外延伸的脊部分，其中该脊部分将腔室分成多个子腔室，各个子腔室适于容纳组织外植体。在一些方面，在第二板的顶表面上形成的边缘部分沿着顶板的主体的相对侧而在其中形成一个或多个切口特征。
[0263] 在基质组件的前述方面的任一方面中，所述第一板和所述第二板的多个微孔包含6、12、24、28、96、384或1536个微孔。在一些方面，多个微孔中的各个微孔被组织外植体完全覆盖。
[0264] 在一些方面，本公开提供了用于同时在胃肠组织外植体中测定测试化合物的吸收和溶出的方法，其包括：
[0266] (b)将来自(a)的药物粉末与赋形剂组合；
[0267] (c)使组织外植体与来自(b)的药物粉末接触，其中所述组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0268] (d)通过检测上清液中的浓度来确定溶出度；和
[0269] (e)通过检测在腔表面和基底外侧表面处受试化合物的存在来测定吸收，其中在基底外侧表面处测试化合物的存在指示该化合物通过组织外植体吸收的能力。
[0270] 在进一步的方面，本公开提供了用于测定测试化合物的组织蓄积对胃肠组织外植体的影响的方法，其包括：
[0271] (a)对组织外植体进行至少一个第一分析，其中该组织外植体包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞，其中所述组织外植体提供腔表面和基底外侧表面，并且其中上皮细胞的极性在组织外植体中被保持；
[0272] (b)使组织外植体与目的化合物接触；
[0273] (c)对组织外植体进行至少一个第二分析；和
[0276] 图1A提供了在不同培养基组合物中离体培养5、10和20天的小肠组织外植体的LiveDead分析的图像。比例尺＝200μm。
[0277] 图1B提供了有培养基或无培养基离体培养7天的小肠组织外植体的管腔侧的图像。
[0278] 图1C提供了在有(顶部)或没有(底部)完整基质层的情况下培养的小肠组织外植体的LiveDead分析的图像。比例尺＝200μm。
[0279] 图1D提供了具有基质层(顶部)的情况下培养0天(新鲜组织)、7天、3周、6周、10周或在除去基质层(底部)的情况下培养5或7天的小肠组织外植体切片的共焦分析图像。切片用Dapi(细胞核)、鬼笔环肽(F-肌动蛋白和质膜)和LysoTracker(溶菌酶)染色。比例尺＝200μm。
[0281] 图1F提供了离体培养3周(左)或新鲜分离(右；“T0”)，然后用过碘酸席夫(Periodic acid-Schiff，PAS)/阿尔新蓝染剂(上)或Masson's三色(Masson's trichrome，下)染色的小肠组织外植体切片的光学显微镜分析图像。比例尺＝200μm。
[0282] 图1G提供了从年幼动物(约3周龄；左)或年老动物(约3月龄；右)分离、离体培养3周并用过碘酸席夫(PAS)/阿尔新蓝染剂(上)或Masson's三色(下)染色的小肠组织外植体切片的光学显微镜分析图像。比例尺＝200μm。
[0283] 图1H提供了显示离体培养了0天(新鲜)或7天的小肠组织外植体通过蛋白质印迹分析法分析的蛋白质表达(左)和通过rtPCR分析的基因表达(右)的代表性图像。
[0284] 图1I提供了用于来自离体培养0天(新鲜)、3天或7天或者3周的小肠组织外植体的蛋白质裂解物对于Wnt3a的蛋白质印迹分析的代表性图像。
[0285] 图1J提供了从新鲜的肠组织或者具有完整基质层的培养3或10周或者无基质层培养10天的肠组织外植体中分离的肠绒毛和隐窝的共焦显微镜分析图像。比例尺＝500μm。
[0286] 图1K提供的条形图显示离体培养0天(新鲜)或7天的小肠组织外植体的蛋白酶活性(左)、硫氧还蛋白还原酶(thioreductase)活性(左侧第二)、细胞色素P450活性(右侧第二)和UGT活性(右)。结果代表3个独立实验(n＝3)。误差棒显示标准偏差。
[0287] 图2A的图像显示了用于高通量分析的96孔板装置设置的示意图。
[0289] 图2C示出了随孔的几何形状和所施加压缩力变化的组织上的力和位移的计算模型。
[0290] 图2D提供显示了在包含小肠组织外植体的基于磁体的界面系统中，50分钟内FITC和FITC-葡聚糖4kDa的灌注的图(左)，以及显示FITC灌注和取决于磁体强度的孔间泄漏的图(右)。
[0291] 图2E是描绘通过具有或不具有浆膜和外肌层的肠组织外植体的荧光素(FITC)灌注的图。相对标准偏差(σ)显示了分析的480个样本中的变异性。
[0292] 图2F提供的图描绘了组织压缩对各种模型药物的灌注的影响。相对标准偏差(σ)显示了所分析的来自3个不同批次的100个样品中的变异性。
[0293] 图2G是描绘各种模型药物的灌注的变异性分析的图。相对标准偏差(σ)显示了各来自6个不同动物批次的500个样本中的变异性。
[0294] 图2H提供的图描绘了用在实验前离体孵育1、2、3或7天的肠组织外植体进行的各种模型药物灌注的变异性分析。相对标准偏差(σ)显示了各来自3个不同动物批次的500个样品中的变异性。
[0295] 图2I提供了各种模型药物的96个独立肠灌注时延分析(超过2小时)的线图。
[0296] 图2J提供了用苏木精和曙红(H&E)染色的结肠、十二指肠和胃组织的图像。比例尺＝400μm。
[0297] 图2K提供了离体培养1或3周的来自胃、十二指肠或结肠的组织外植体的LiveDead分析的图像。比例尺＝200μm。
[0298] 图2L提供的图描绘了结肠、十二指肠和胃组织外植体中各种模型药物灌注的变异性分析。
[0299] 图2M是示出了用于高通量分析的384孔板装置设置的示意图的图像。
[0300] 图2N是描绘荧光素(FITC)和FITC-葡聚糖4kDa的灌注的变异性分析的图。相对标准偏差(σ)显示了各来自2个不同动物批次的500个样品中的变异性。
[0301] 图3A是显示了来自一式两份进行的6个独立实验的约60种模型药物的灌注分析的箱线图。
[0302] 图3B是显示从肠组织外植体获得的灌注值与文献中报道的人吸收之间的相关性的图。
[0303] 图3C提供显示在一式四份进行的3个独立实验(n＝12)中，使用小肠中的不同段(十二指肠、空肠和回肠)的一组模型药物的灌注测量的箱线图。
[0304] 图3D是显示在各种浓度的MDR-1抑制剂维拉帕米存在下对MDR-1的选择性荧光底物肠吸收的剂量依赖性抑制的图。
[0305] 图3E是显示来自一式两份进行的3个独立实验的天然肠液中模型药物的灌注分析的箱线图。
[0306] 图4提供的图描绘了已知具有缓慢、中度或快速肠吸收的各种模型药物的灌注时延分析。该图显示了在4小时内的12个单独的时延。
[0307] 图5A提供了通过灌注筛选用基于2种赋形剂组合的2976种制剂配制的Alexa488-催产素获得的数据的热图。颜色代码表示与未配制的对照相比的倍数变化(红色＝负变化，黑色＝无变化，绿色＝3倍增加，蓝色＝3倍以上增加)。
[0308] 图5B是示出用作催产素灌注增强剂的聚乙烯亚胺(PEI)的剂量依赖性验证实验的箱线图。结果显示一式两份进行的3个独立实验。
[0309] 图5C是描绘对PEI制剂与各种小分子或大分子模型药物的灌注分析的条形图。结果显示一式两份进行的3个独立实验。误差条显示标准偏差。
[0310] 图5D提供的条形图描绘了PEI 25kDa(左)和PEI 800Da(右)与各种小分子或大分子模型药物的灌注分析。结果显示一式两份进行的3个独立实验。
[0311] 图5E是条形图，其显示了在2小时的时间内猪中PEI-催产素、矿物油-催产素、仅催产素和仅PEI的累积血浆水平浓度。结果代表每种条件的4个实验。
[0312] 图6A提供了利用超声用cy3.3-siRNA转染的肠组织外植体进行的共焦显微镜分析的图像。比例尺＝200μm。
[0313] 图6B提供的图显示了在转染后孵育48小时后，与阴性对照siRNA(乱序siRNA)和未处理对照相比，用siABCB1(MDR1)或siCYP3A4转染的裂解物的蛋白质印迹分析的定量结果。
[0314] 图6C提供的条形图描绘了用siCYP3A4或siMDR-1转染的肠组织外植体中雷尼替丁(CYP3A4底物)及奎宁和奎尼丁(MDR-1底物)的灌注分析。结果显示一式两份进行的3个独立实验。误差条显示标准偏差。
[0315] 图7A提供的图显示了针对两个不同靶基因(靶基因1和靶基因2)的FAM标记的反义寡核苷酸在小肠组织外植体中在6小时内的灌注动力学，每个具有500个样品。
[0317] 图7C的图显示了在小肠组织外植体中筛选与FAM缀合的反义寡核苷酸的共制剂的结果，其比较基底组织蓄积倍数变化和灌注倍数变化以鉴定组织蓄积增强者和组织灌注增强者。
[0318] 图7D是显示在小肠组织外植体中针对靶基因(靶基因1)的反义寡核苷酸的敲低效率百分比的箱线图，其中反义寡核苷酸在6种不同制剂中配制。
[0319] 图8提供的图显示了以各种浓度在SDS中配制的吲哚美辛的溶出数据(左)，以及从用在SDS中配制的或非配制的吲哚美辛处理的肠组织外植体获得的溶出和吸收值的比较。
[0321] 图10提供的图显示了在指示的制剂中配制的美洛昔康在肠组织外植体中的灌注，其中测试了不同的美洛昔康浓度以模拟在肠中的稀释。
[0322] 图11提供的图显示了用已知的GLP-1刺激剂乙酰胆碱(左)、LiCl(中间)和葡萄糖(右)处理时，通过ELISA测定的肠组织外植体的GLP-1刺激。
[0324] 图13提供的图显示了来自食道(左)、胃(中)和小肠(右)并用乙醇(上)、甲醇(中)或福尔马林(下)处理的组织外植体的存活力百分比。
[0325] 图14提供的图显示了与分类为具有局部胃肠毒性或无胃肠毒性的药物相比，肠组织外植体的存活力的百分比或细胞系的LogIC50值。
[0326] 图15提供的图显示了与单独的药物和阴性对照(100％乙醇)相比，用在三种不同制剂中配制的萘普生(左)或多西环素(右)处理的肠组织外植体的细胞存活力百分比。
[0327] 图16是本公开的基质或板组件的另一实施方式的示意性透视图，其示出了安置在其中的组织外植体。
[0328] 图17是根据本公开教导的图16的板组件的顶板的底视图。
具体实施方式
[0330] 定义
[0332] 必须注意，在说明书和权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包含复数对象，除非上下文另外明确指出。
[0333] 如本文所使用的，“约”将被普通技术人员理解，并且将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如果在给定其被使用的上下文的情况下存在对普通技术人员而言不清楚的术语使用，则“约”表示特定值的正负10％。
[0334] 如本文所用，“结构(achitecture)”是指包含组织内的特定细胞类型和围绕细胞的细胞外基质的组织结构。在一些实施方案中，本发明的体外细胞组合物包含组织外植体，其包含来自大型非人类哺乳动物胃肠道或人胃肠道的肠上皮，其中所述肠上皮包含在所述组织外植体中具有极性的上皮细胞，并且本文所述的体外细胞组合物基本上保持了其来源组织(例如，小肠)的全部或大部分的源结构(例如，体内结构)。例如，当组织外植体包含肠上皮，该肠上皮包含在组织外植体中具有极性的上皮细胞时，组织外植体中的上皮细胞的极性在体外细胞组合物中及其使用中基本上如其来源组织的原始结构中(例如，小肠)一样保持。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体模拟体内结构。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体模拟小肠的体内结构。在一些实施方案中，组织外植体模拟其中包含其来源的体内组织代表性的一个或多个物理结构的体内结构。例如，其中组织外植体源自小肠，它通过包含至少一个来自其所来源的组织的小肠结构来模拟小肠的体内结构，例如，通过其包含完整的隐窝、肠上皮、环肌层和/或绒毛，或前述的任何组合。在一些实施方案中，组织外植体通过包含其来源的组织的一个或多个或者大部分结构来模拟体内结构，例如通过包含完整的隐窝、肠上皮、环肌层和/或绒毛，或前述的任意组合。在一些实施方案中，组织外植体包含来自其来源组织(例如，大型非人类哺乳动物胃肠道或人胃肠道)的完整的隐窝、肠上皮、环肌层和绒毛。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的标准技术来确定组织外植体的结构及其是否模拟其来源组织的体内结构，例如通过本文所述方法(例如组织学染色)与本领域技术人员可获得的图像或信息(例如先前获得的外植体源自其中的组织的图像)来比，本公开的体外细胞组合物中的组织外植体的结构。在一些实施方案中，在离体培养的组织外植体与新鲜切下的组织外植体之间进行比较。
[0335] 如本文所用的“基底外侧表面”是指组织外植体与基质接触时的定向，使得组织外植体包含顶端/管腔-基底外侧极性。在一些实施方案中，基底外侧表面与顶表面即管腔表面相对。
[0336] 如本文所用，“接触”是指将基质置于本文所述的组织外植体上(或使组织外植体与基质接触)，或将目的化合物置于本文所述的体外细胞组合物上(或使目的化合物与体外细胞组合物接触)。
[0337] 如本文所用，“探测”、“检测”和“检出”是指样品中目的化合物(例如，药物、试剂等)的鉴定和/或定量。在一些实施方案中，检测包括测定样品中是否存在目的化合物。在一些实施方案中，检测包括定量样品中的目的化合物。在一些实施方案中，检测包括在不同时间点鉴定和/或定量样品中的目的化合物。在一些实施方案中，检测包括鉴定和/或定量第一样品和第二样品中的目的化合物。
[0338] 如本文所用，“药物吸收”或“药物灌注(drug perfusion)”是指给药后药物进入血流并通过组织的运动，以及药物与组织外植体接触后药物通过组织外植体的运动。药物吸收或灌注由药物的理化性质、剂型和给药途径决定。
[0339] 如本文所用，“药物溶出”是指药物的剂型(例如，片剂)在吸收进入系统循环之前在胃肠道的流体中溶解的速率。
[0340] 如本文所用，“药物运转体”是指使药物跨细胞膜移动的蛋白质。通常，药物运转蛋白分为两个主要的超家族：ATP结合盒(ABC)家族和溶质载体(solute carrier)(SLC)家族。ABC转运蛋白是利用来自ATP水解的能量来将底物(例如，药物)跨膜转运的主要的主动转运蛋白。SLC转运蛋白可以是易化转运体，其将底物顺梯度跨膜转运，或者次级主动转运体，其通过耦合另一底物的下向运输将其底物逆梯度跨膜转运。
[0341] 如本文所用，“外源的”是指自生物体、组织或细胞外来源或产生的分子或组合物。
[0342] 如本文所用，“细胞外基质”是指由胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和几种其他糖蛋白组成的复杂的非细胞三维大分子网络。这些分子由细胞局部分泌，并与它们保持紧密结合以提供结构、粘附和生化信号传导支持。
[0343] 如本文所用，“离体”是指在生物体外发生的状况。在一些实施方案中，离体是指在外部环境中在来自生物体的组织内或组织上进行的实验或测量。
[0345] 如本文所用，“高通量”是指实验的并行化。具体地说，与一个接一个地进行的单一实验相反，可以同时进行多个实验。在一些实施方案中，使用自动化技术进行高通量实验。
[0346] 如本文所用，“肠细胞”是指组成哺乳动物肠上皮的细胞。哺乳动物胃肠道的肠上皮具有明确的组织化结构。上皮可分为两个区域，容纳分化细胞(绒毛)的功能区域和表示上皮干细胞生态位的增殖区域(Lieberkuhn隐窝)。多能上皮干细胞居于隐窝中，并产生四个主要的上皮细胞谱系：吸收性肠上皮细胞、分泌粘蛋白的杯状细胞、分泌肽激素的肠内分泌细胞和Paneth细胞。
[0347] 如本文所用，“肠”是指哺乳动物的小肠和哺乳动物的大肠。
[0348] 如本文所用，与“上皮干细胞”互换使用的“肠干细胞”是指具有增殖并分化成肠上皮细胞的潜能的干细胞。多能上皮干细胞产生各种上皮谱系，并可以产生所有肠上皮谱系，其包括：吸收性肠细胞、分泌粘蛋白的杯状细胞、分泌肽激素的肠内分泌细胞和Paneth细胞。
[0349] 如本文所用，“体外”是指在活生物体外进行或发生的过程。在一些实施方案中，所述过程在培养皿中进行或发生。
[0350] 如本文所用，“体内”是指在活生物体中发生的过程。
[0351] 如本文所用，“固有层”是指疏松结缔组织或致密的不规则结缔组织的薄层，其位于上皮之下并与上皮细胞一起构成粘膜。
[0352] 如本文所用，“肌层”、“粘膜肌层”和“肌粘膜”是指位于固有层外并将其与粘膜下层分开的胃肠道的薄肌肉层。
[0353] 如本文所用，“大型哺乳动物”是指其中任一性别的正常成熟成体可以达到至少一千克体重的物种。在一些实施方案中，大型哺乳动物是有蹄类动物(即有蹄的哺乳动物，例如猪、牛、山羊、绵羊、马、驴、鹿、羚羊等)。在一些实施方案中，大型哺乳动物是牲畜(即，出于农业目的饲养的哺乳动物，例如猪、牛、山羊、绵羊、马、兔等，和/或驮兽，例如驴、马、大象、骆驼、美洲驼等)。在一些实施方案中，大型哺乳动物是人。
[0354] 如本文所用，“腔表面”是指当与基质接触时组织外植体的定向，使得组织外植体包含顶/管腔-基质外侧极性。在一些实施方案中，腔表面与基底外侧表面相对。
[0355] 如本文所用，“在培养中保持”是指连续施用特定细胞类型在人工环境中生长或存活所需的条件。在一些实施方案中，人工环境包含提供必要营养物质(例如氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素、气体(例如，O2、CO2)和物理化学环境(例如pH、渗透压、温度)的基质或者培养基。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体在培养中保持长达1周。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体在培养中保持长达2周。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体在培养中保持多达3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17周。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体在培养中保持长达18周。
[0356] 如本文所用，“药物代谢酶”、“DME”和“代谢酶”是指负责代谢大量异种生物化学物质(包括药物、致癌物、杀虫剂、污染物和食品毒物)以及内源性化合物(例如类固醇、前列腺素和胆汁酸)的多肽。DME对化学物质进行的代谢生物转化形成更亲水性的极性实体，其增强从体内的清除，并导致通常药理上无活性且相对无毒的化合物。在一些实施方案中，代谢生物转化可以导致具有药理活性的代谢产物的形成。生物异源物质通过四种不同的反应代谢：氧化、还原、水解和结合。氧化、还原和水解被称为I相反应，而结合称为II相反应。I相氧化性DME包括细胞色素P450(CYP或P450)、含黄素的单加氧酶(FMO)、单胺氧化酶(MAO)和黄嘌呤氧化酶/醛氧化酶(XO/AO)。II相结合性DME包括尿苷5'-二磷酸(UDP)-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)、磺基转移酶(SULT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、N-乙酰基转移酶(NAT)和甲基(N-甲基-、硫代甲基-和硫嘌呤甲基-)转移酶。在参与药物代谢的DME中，主要的角色是P450酶，接着是UGT和酯酶。因此，在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含I相和II相代谢酶。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含细胞色素P450酶和UGT酶。
[0357] 如本文所用，“基因表达的调节”是指基因的诱导或阻遏的变化。基因调控涉及的机制包括遗传物质的结构和化学变化、蛋白质与特定DNA元件的结合以调控转录和/或调节mRNA的翻译的机制。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体的基因表达被调节。在一些实施方案中，存在于本文所述的组织外植体中的至少一种药物运转体的基因表达被调节。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体中存在的至少一种代谢酶的基因表达被调节。
[0358] 如本文所用，“粘液”是指通常富含粘蛋白并且由其润湿和保护的粘膜产生的粘性分泌物。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体产生粘液。
[0359] 如本文所用，“外肌层”是指将粘膜下层与浆膜下层分开的环肌层和纵肌层。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含完整的外肌层。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体仅包含环肌层。
[0360] 如本文所用，“口服生物利用度”是指口服给药后药物或其他物质成为可用于靶组织的程度。生物利用度与药物或其他物质的物理化学性质(例如溶解、膜转运、化学稳定性等)，以及与宿主的相互作用(例如代谢归宿、分布和清除)有关。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体预测药物或其他目的物质的口服生物利用度。
[0361] 如本文中所使用的“Pearson积矩相关系数”或“Pearson相关系数”是指两个变量之间的线性关联的强度的度量，并且用“r”表示。
[0362] 如本文所用，“平面接触”是指组织外植体放置在基质上，使得组织外植体与基质的二维表面相互作用。平面接触可以通过本领域技术人员已知的方法确定。例如，用于分析平面接触的方法包括：(i)使组织外植体与包含标志物(例如，染料)的溶液接触以使组织染色；以及(ii)通过照相检查、分光光度法或通过激光扫描仪检测组织表面上的染色。如果与完全浸没在包含标志物的溶液中的未安装组织的等同区域相比，在与基质接触的区域内标志物的变异性没有显著差异，则认为组织外植体与基质平面接触。在另一个实例中，平面接触通过(i)用在基质的表面上形成均一层的标志物涂覆基质；(ii)使基质与组织外植体接触；和(iii)一旦组织外植体与基质分离，通过目视检查分析其上所得的染色来确定。如果组织在整个组织上显示出与基质图案相关的规则标记图案，则认为组织外植体与基质平面接触。
[0363] 如本文所用，“极性”是指细胞膜与相关蛋白的组织化，以及细胞质内细胞骨架和细胞器的排列。例如，上皮细胞沿着从面向外部管腔的顶侧延伸到面向细胞外基质或相邻细胞的基质侧的细胞轴组织。除了顶端-基底极性轴外，上皮细胞通常沿近端-远端轴在组织平面内定向，称为“组织极性”或“平面极性”。在一些实施方案中，上皮细胞的顶端-基底极性轴在从源组织中移除后在组织外植体中保持。在一些实施方案中，上皮细胞的顶端-基底极性轴在与基质接触后在组织外植体中保持。在用于本文所述的方法后，上皮细胞的顶端-基底极性轴在体外细胞组合物中保持。在一些实施方案中，上皮细胞的近端-远端的极性轴在从源组织中移除后在组织外植体中保持。在一些实施方案中，上皮细胞的近端-远端极性轴在与基质接触后在组织外植体中保持。在一些实施方案中，在用于本文所述方法之后，上皮细胞的近端-远端极性轴在体外细胞组合物中保持。在一些实施方案中，在与基质接触之后，顶端-基底极性轴和近端-远端极性轴在组织外植体中保持。在一些实施方案中，在与基质接触之后，上皮细胞的顶端-基底极性轴和近端-远端极性轴在组织外植体中保持。在一些实施方案中，在用于本文所述方法之后，上皮细胞的顶端-基底极性轴和近端-远端极性轴在体外细胞组合物中保持。确定极性的方法是本领域技术人员已知的。可以在《细胞极性和形态发生》(Cell Polarity and Morphogenesis)(Academic Press,2017，以引用的方式全文并入本文)的第7章中找到此类方法的综述。在一些实施方案中，通过视觉(例如，显微镜)检查来分析本文所述的组织外植体的极性。例如，在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含两个或更多个遗传上不同的细胞群体，并且可以通过仅在细胞亚群中表达标记的蛋白质，然后通过显微技术可视化来确定极性。在一些实施方案中，免疫组织化学和荧光报告的实时图像用于使蛋白质在其组织背景下可视化并评估其分布。在一些实施方案中，通过分析荧光图像中的蛋白质定位并计算蛋白质存在的区域与蛋白质弱定位或不存在的区域之间的荧光强度的比率来量化细胞极化。荧光比率提供了不对称蛋白质分布的定量测量。参见Marcinkevicius，E.等，J.Biol.2009,Vol.8(12):103，通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，荧光比率通过选择合适的分析设置并结合内部对照来标准化，如Shimoni,R.,等PLos ONE 2014,Vol.9(6):e99885描述的，其通过引用整体并入本文。
[0364] 如本文所用，“可重复使用”是指组织外植体连续经受多于一次实验的能力。
[0365] 如本文所用，“反应性的(responsive)”是指由刺激引起的反应。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体对刺激有反应。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体对葡萄糖有反应。在一些实施方案中，增加的GLP-1活性(例如，增加的活性GLP-1 7-36的浓度)表明组织外植体对葡萄糖有反应。在一些实施方案中，当组织外植体的顶端侧与葡萄糖接触时，GLP-1活性增加。在一些实施方案中，肠激素和/或组织行为的调节表明组织外植体对葡萄糖有反应。本文描述了用于测量肠激素和组织行为的方法。
[0366] 如本文所用，“基质”是指在某物(例如细胞、细胞培养物、细胞培养材料等)之下或过程在其上发生的表面或层。在一些实施方案中，基质是生物体在其上生活、生长和/或任选地获得营养的表面或材料。术语“基质”还指在其上沉积另一种材料的表面或层，例如基础表面或层。示例性的基质包括但不限于，玻璃、硅、聚合物材料、塑料(例如组织培养塑料)等。基质可以是载玻片、芯片、孔等。
[0367] 如本文所用，“组织外植体”是指分离的一个或多个组织块。在一些实施方案中，所述组织外植体从胃肠道分离。
[0368] 组织外植体
[0369] 本文所述的组织外植体可用于本文所述的方法，因为它们提供了其来源的体内组织的特征。特征包含但不限于，随增殖、多谱系分化以及细胞和组织结构(包括上皮组织、粘膜下组织和基质环境)的重演的持久组织扩增。
[0370] 在一些实施方案中，用于本公开的组织外植体包括但不限于来自胃、小肠、十二指肠、食道、颊部、结肠或舌的组织。
[0371] A.用于获取组织外植体的方法
[0372] 本文所述的组织外植体提供用于培养、维持体内结构和组织功能的重演，例如，体内结构的长期或延长的培养、维持及组织功能的重演，以及用于本文所述的方法中。本文所述的组织外植体可用于分析目的组织(例如，小肠)和高通量筛选分析。
[0373] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体源自人类或大型非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该大型非人类哺乳动物包括有蹄类动物(即有蹄的哺乳动物，例如猪、奶牛、山羊、绵羊、马、驴、鹿、羚羊等)，并且更一般地，牲畜(即，出于农业目的饲养的哺乳动物，例如猪、奶牛、山羊、绵羊、马、兔等，和/或驮兽，例如驴、马、大象、骆驼、美洲驼等)。在一些实施方案中，大型非人类哺乳动物是猪。
[0374] 在一些实施方案中，通过手术获得目的组织(例如，小肠)。在一些实施方案中，在放血(即，排干血)后通过手术获得目的组织(例如，小肠)。在一些实施方案中，获得的组织外植体是目标基质的长度和宽度。在一些实施方案中，获得的组织外植体是标准的6、12、24、48、96、384、1536或3456孔板的长度和宽度。在一些实施方案中，获得的组织外植体是标准的6、12、24、48、96、384、1536或3456孔板的长度和一半的宽度。在一些实施方案中，组织外植体的长度为约127.8mm，和宽度为约42.75mm。在一些实施方案中，组织外植体的长度为约127.8mm，宽度为85.5mm。
[0375] 在一些实施方案中，动物的年龄可能对组织外植体的维持和功能具有影响。在一些实施方案中，动物在3周至12周龄之间。在一些实施方案中，动物为3周龄。在一些实施方案中，动物为12周龄。在一些实施方案中，动物为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周龄。在一些实施方案中，动物是1、2、3、4、5、6或7月龄。在一些实施方案中，利用胎儿组织。
[0376] 在一些实施方案中，在解剖后将组织外植体浸入一系列盐水溶液中。在一些实施方案中，解剖后将组织外植体浸入70％乙醇中，然后用盐水溶液洗涤。在一些实施方案中，盐水溶液补充有抗生素溶液。在一些实施方案中，盐水溶液补充有抗霉菌溶液。在一些实施方案中，盐水溶液补充有抗生素和抗霉菌溶液。抗生素和抗霉菌溶液是本领域技术人员已知的。例如， 抗生素-抗霉菌溶液可用于本文所述的方法。在一些实施方案中，抗生素和/或抗霉菌剂溶液包含青霉素、链霉素， 两性霉素B或其组合。
[0377] 在一些实施方案中，将组织外植体浸入已知的保存溶液中。保存溶液的实例包含但不限于Krebs-Henseleit溶液、UW溶液、St.Thomas II溶液、Collins溶液和Stanford溶液(参见，例如，美国专利号4,798,824和4,938,961；Southard和Belzer，Ann.Rev.Med.46:235-247(1995)；以及Donnelly和Djuric，Am.J.Hosp.Pharm.48:2444-2460(1991))。该溶液可以包含钠、钾、钙、镁、谷氨酸、精氨酸、腺苷、甘露醇、别嘌呤醇、谷胱甘肽、棉子糖和乳糖酸中的一种或多种。在一些实施方案中，溶液保持在约7.2-7.4的生理pH下。
[0378] 在一些实施方案中，在解剖前将组织保持在冰上。因此，在一些实施方案中，溶液在使用前为4℃。
[0379] 随后将组织外植体安置于目标基质(例如多孔板)上，并在37℃下气密容器中的培养基中培养。在一些实施方案中，培养基不含血清。在一些实施方案中，培养基包含血清。
[0380] 在一些实施方案中，培养基不包含外源生长因子(例如，Wnt3a)。在一些实施方案中，由于基质层的存在，组织外植体不需要外源生长因子。在一些实施方案中，培养基是Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM)或高级DMEM/F-12。在一些实施方案中，培养基包含胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，培养基包含EGF重组人蛋白。在一些实施方案中，FBS和/或EGF的存在不影响组织外植体的存活力。
[0381] 在一些实施方案中，组织外植体源自人类或大型非人类哺乳动物的胃肠道。胃肠道包括口、食道、胃和/或瘤胃、肠(小肠和大肠)、盲肠(阑尾)、发酵囊和肛门。在一些实施方案中，组织外植体源自肠。在一些实施方案中，组织外植体源自小肠。
[0382] 成年男子大约8米的肠在生理动态平衡中起着许多作用，包括吸收、分泌和免疫功能。与这些关键作用相对应，肠道疾病是人类发病率和死亡率的重要来源。事实上，许多病理状态，其包含癌症、炎症性肠病、肠系膜缺血、先天性综合征和外伤，无论是否伴有肠切除，导致“短肠”综合征，从而导致严重的肠道生理功能缺陷和实际的肠道衰竭。
[0383] 肠是具有巨大再生潜能的器官，因此驻留在增殖隐窝区域中的干细胞产生能够多谱系分化的祖细胞。肠道干细胞(ISC)能够每5-7天重恢复成年人整个8米长的肠的上皮细胞，从而有助于保持粘膜屏障的完整性并在损伤时实现组织修复。据推测，ISC小生境具有复杂的结构要求，从而包围增殖性隐窝的成肌纤维细胞向隐窝干细胞和/或祖细胞提供必要的信号。
[0384] 小肠有三个不同的区域，即十二指肠、空肠和回肠。十二指肠连接到胃的远端，并通过胰管接收胆汁和胰液。空肠和回肠主要吸收营养和水分，而不是分解食物。
[0385] 在一些实施方案中，组织外植体源自小肠的空肠。在一些实施方案中，组织外植体源自小肠的回肠。在一些实施方案中，组织外植体源自小肠的十二指肠。
[0386] B.组织外植体的组成
[0387] 组织
[0388] 肠
[0389] 像胃肠道的其他部分一样，小肠由四个基本层组成：粘膜、粘膜下层、外肌层和浆膜层。它是人体的主要消化器官，是消化完成且几乎所有吸收发生的部位。小肠非常适合营养吸收。它的长的长度和内表面的修饰都提供了超大的表面积并极大地增强了吸收。
[0390] 肠的最外层(浆膜)是光滑的膜，由分泌浆液的薄细胞层和薄结缔组织层组成。邻近粘膜下膜的外肌层包含内部圆形和外部纵向平滑肌的两个肌肉层。它负责肠道运动(即蠕动)。粘膜下层是一层致密的不规则结缔组织或疏松的结缔组织，其支撑粘膜并将其与下面的平滑肌接合。小肠的最内层和内衬是粘膜。它是一种分泌消化酶和激素的粘液膜。粘膜包含肠绒毛、上皮和固有层。固有层是疏松的结缔组织或致密的不规则结缔组织的薄层，其位于上皮细胞之下并与上皮一起构成粘膜。
[0391] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含浆膜、外肌层、粘膜下层和粘膜。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含外肌层、粘膜下层和粘膜。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含内部圆形平滑肌、粘膜下层和粘膜。用于识别这些结构的方法包括目视检查，例如通过组织学染色(例如苏木精和曙红染色)，然后进行显微镜分析。使用这样的方法，本领域技术人员可以识别组织外植体的各种结构。
[0392] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含完全完整的细胞外基质。在一些实施方案中，细胞外基质包含固有层。在一些实施方案中，细胞外基质包含肌层。
[0393] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保持本文所述的极性(例如，上皮细胞极性)。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体处于平面位置，从而提供腔表面和基底外侧表面。在一些实施方案中，任一表面都是可接近的。测定极性的方法是本领域技术人员已知的。可以在《细胞极性和形态发生》(Cell Polarity and Morphogenesis)，(Academic Press，2017，以引用的方式全文并入本文)的第7章中找到此类方法的综述。在一些实施方案中，通过视觉(例如，显微镜)检查来分析本文所述的组织外植体的极性。例如，由于本文所述的组织外植体包含两个或更多个遗传上不同的细胞群体，因此可以通过仅在细胞亚群中表达标记的蛋白质，然后通过显微技术对其进行可视化来测定极性。在一些实施方案中，免疫组织化学和荧光报告的实时图像用于使蛋白质在其组织背景下可视化并评估其分布。在一些实施方案中，通过分析荧光图像中的蛋白质定位并计算蛋白质存在的区域与蛋白质弱定位或不存在的区域之间的荧光强度的比率来量化细胞极化。荧光比率提供了不对称蛋白质分布的定量测量。参见Marcinkevicius，E.等，J.Biol.2009,Vol.8(12):103，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，通过选择合适的分析设置并结合内部对照来标准化荧光比率，如Shimoni,R.等PLos ONE 2014,Vol.9(6):e99885描述的，通过引用整体并入本文。
[0394] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保持了其所来源的肠组织的体内结构。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知并且在下文中描述的方法通过目视检查来确定体内结构。例如，在一些实施方案中，体内结构保持的测定包括将新鲜切除的组织与随时间体外培养的组织外植体进行比较。
[0395] 小肠绒毛(粘膜内表面的指状延伸)是肠吸收和消化功能的主要专门化特征之一。构成绒毛的上皮细胞主要是吸收性细胞或肠上皮细胞。它们分泌、吸收和消化特定离子和营养物的能力取决于它们在肠道长度上的位置。肠上皮细胞本身具有微绒毛，使粘膜表面出现模糊的外观，有时称为“刷状边界”。微绒毛包含有助于消化的酶，例如二糖酶和肽酶。
在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含肠上皮细胞。在一些实施方案中，通过绒毛蛋白、e-钙粘蛋白、角蛋白20和/或脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的存在来鉴定肠上皮细胞。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含绒毛。
在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含肠上皮细胞。在一些实施方案中，通过绒毛蛋白、e-钙粘蛋白、角蛋白20和/或脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的存在来鉴定肠上皮细胞。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含绒毛。
[0396] 肠粘液层起着重要的保护作用。粘液层主要由粘蛋白组成。粘蛋白是高度糖基化的大的糖蛋白，具有富含丝氨酸和苏氨酸的蛋白骨架结构，其与多种多样的O-连接的寡糖侧链相连，这些侧链占分子重量的70％以上。已鉴定出多达20种不同的粘蛋白基因，根据发现的顺序，MUC1至MUC20。粘蛋白基因以组织和细胞类型特异性的方式表达，且大致分为分泌型和膜结合型两种类型。在小肠和大肠中，MUC2是杯状细胞合成和分泌的主要分泌性粘蛋白。杯状细胞分泌的肠粘液层主要由粘稠的、可渗透、凝胶形成MUC2粘蛋白的紧密网状网络组成，它为抵御内源性和外源性刺激物以及微生物附着和侵入提供一线宿主防御，但允许营养物质的转运。在一些实施方案中，组织外植体包含分泌粘蛋白的杯状细胞。在一些实施方案中，组织外植体在培养中形成粘液层。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含粘液物质。在一些实施方案中，粘液物质是糖蛋白、糖脂或粘蛋白。
[0397] 粘蛋白2(Muc 2)以及尾型同源框2(CDX2)都是肠上皮内分泌粘蛋白的杯状细胞的标志物。在一些实施方案中，通过粘蛋白2(Muc 2)和/或尾型同源盒2(CDX2)的存在来鉴定杯状细胞。
[0398] 在一些实施方案中，通过测量粘蛋白和/或粘液物质的存在来确定本文所述的组织外植体中粘液层的存在。在一些实施方案中，通过测量Muc 2和/或CDX2的基因表达来确定本文所述的组织外植体中粘液层的存在。在一些实施方案中，通过测量Muc 2和/或CDX2的蛋白质表达来确定本文所述的组织外植体中粘液层的存在。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体中粘液层的存在通过目视检查(例如显微分析)确定。在一些实施方案中，组织学染色，例如阿尔新蓝组织染色，用于视觉检查。
[0399] 在绒毛之间，粘膜布满了凹陷或开口，这些凹陷或开口通向称为肠隐窝或Lieberkuh隐窝的管状小肠腺。内衬隐窝的上皮细胞分泌肠液，一种包含粘液的流体混合物。隐窝的深处是Paneth细胞，其产生各种多肽，例如隐窝素(cryptdin)、溶菌酶、II型(分泌型)磷脂酶A2、肠防御素(例如RIP-3)。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含完整的隐窝。在一些实施方案中，通过视觉检查(例如，显微镜分析)鉴定完整的隐窝。用于识别完整隐窝的视觉检查方法包括但不限于，组织学组织染色和正常光学显微镜检查。
[0400] 胃肠道的特征是自我更新的上皮，由位于肠隐窝底部和胃腺的成体干细胞驱动。在成体肠中，细胞分裂仅发生在隐窝中，而不发生在绒毛中。隐窝中已经提出了几种潜在的干细胞群体。其中之一(命名为基于隐窝的柱状(CBC)细胞)与隐窝底部的Paneth细胞紧密结合。长期以来，人们一直认为CBC与Paneth细胞一起在隐窝内形成受限的干细胞区，这一点已通过谱系追踪实验得到证实。这样的谱系追踪实验表明，单一Lgr5+(含有富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5)CBC细胞能够再生整个隐窝-绒毛轴。这些细胞处于“干性(stemness)”状态，并具有长期的自我更新能力以及多能分化能力。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含肠干细胞。在一些实施方案中，肠干细胞是Lgr5+。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体中肠道干细胞的存在负责外植体的长期保持。
[0401] 除了Lgr5+，嗅质蛋白-4(OLFM4)基于Lrg5干细胞的基因标记成为肠道干细胞的可靠标志物。因此，在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含OLFM4+干细胞。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含Lrg5+和OLFM4+干细胞。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的并在本文中进一步描述的方法检测Lrg5+和OLFM4_干细胞。
[0402] 几种信号传导机制也涉及保持小肠的更新能力。Wnt、BMP/TGF-β、Notch和EGF是上皮稳态和自我更新活性的关键调节剂。当细胞在隐窝-绒毛轴上移动时，它们暴露于Wnt梯度。干细胞变为负载由相邻Paneth细胞产生的Wnt介质，其与同源的Frizzled受体结合。由于它们的局部产生和有限的扩散，当细胞离开干细胞区并远离Paneth细胞时，Wnt分子及其受体通过细胞分裂经更新而减少。除Lgr5+外，CBC干细胞还表达一整套其他Wnt途径相关基因，这些基因直接控制肠道隐窝的干性。CBC干细胞中的高Wnt活性是通过分泌的R-spondin家族成员与CBC膜上的Lgr家族成员结合介导的。这种结合增强了卷曲介导Wnt途径的活化，并导致Wnt途径的稳定激活。此外，成肌纤维细胞通过提供信号传导提示在保持小肠的更新能力中发挥作用。具体而言，围绕肠隐窝的成肌纤维细胞分泌诸如Wnt配体、HGF、BMP和Noggin的因子，其在调节分化中起重要作用(参见Medema，J.和Vermeulen，L.，Nature，Vol.474：318-326，2011，以引用方式并入本文)。
[0403] 之前的肠模型系统，包含原代肠上皮细胞和/或肠干细胞，需要外源添加Wnt以保持系统。本文所述的组织外植体不需要外源Wnt来保持培养。完整的隐窝和绒毛以及间质的存在有助于本文所述的组织外植体的这一特征。
[0404] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含肠内分泌细胞。肠的内分泌细胞或肠内分泌细胞限于粘膜，并位于肠隐窝和绒毛内(Moran,G.等Therap Adv Gastroenterol.2008Jul；Vol.1(1):51-60，全文并入本文作为参考)。在小肠中发现的肠内分泌细胞包括但不限于分泌胆囊收缩素的细胞、分泌分泌素的S细胞、分泌胃抑制性多肽的细胞、分泌胃动素的M细胞和分泌神经降压素的N细胞以及神经内分泌L细胞。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含L细胞。肠内分泌细胞的特征在于存在分泌性囊泡。肠内分泌细胞分泌胰高血糖素样肽1(GLP-1)。在一些实施方案中，GLP-1的分泌是响应于葡萄糖的存在。在一些实施方案中，GLP-1的分泌是响应于乙酰胆碱的存在。在一些实施方案中，GLP-1的分泌是响应于LiCl的存在。在一些实施方案中，GLP-1的分泌通过GLP-1 7-36的浓度测定。在一些实施方案中，由于肠内分泌细胞的存在，本文所述的组织外植体对葡萄糖、乙酰胆碱和/或LiCl有反应。
[0405] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含紧密连接。在一些实施方案中，紧密连接通过claudin-1、e-钙粘蛋白或其组合的存在来鉴定，其通过本领域技术人员已知并在本文中进一步描述的方法确定。Claudin-1是膜内在蛋白，而e-钙粘蛋白是跨膜蛋白，两者都是紧密连接的组成部分。紧密连接代表上皮或内皮细胞片层中细胞间粘附的一种模式，从而在细胞周围形成连续的密封并充当物理屏障以防止溶质和水自由通过。
[0406] 粘膜下层包含单个的和聚集的淋巴斑，后者称为Peyer's结。仅在十二指肠中，发现分泌粘液的十二指肠腺(也称为Brunner's腺)。微皱褶(M)细胞在肠道的Peyer’s结中发现，并专门用于肠腔大分子的吞噬和转胞吞。这些细胞在诱导Peyer's结中特异性的粘膜免疫反应中起重要作用，并允许微生物和颗粒穿过上皮细胞层从肠腔转运到固有层，在其中可以与免疫细胞发生相互作用。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含微皱褶细胞。微皱褶细胞通过在细胞边缘或细胞表面上表达的细胞骨架和细胞外基质成分来鉴定，包括含肌动蛋白、绒毛蛋白、细胞角蛋白和波形蛋白。在一些实施方案中，通过波形蛋白、肌动蛋白、细胞角蛋白、绒毛蛋白或其组合的存在来鉴定微皱褶细胞。在一些实施方案中，通过波形蛋白的存在鉴定微皱褶细胞。在一些实施方案中，通过肌动蛋白的存在鉴定微皱褶细胞。在一些实施方案中，通过绒毛蛋白的存在鉴定微皱褶细胞。在一些实施方案中，通过细胞角蛋白的存在鉴定微皱褶细胞。
[0407] 肠神经系统(ENS)是胃肠道的内在神经系统。它包含检测胃肠道的生理状况，整合有关胃肠道状态的信息并提供输出以控制肠道运动、肠道与其内腔以及局部血流之间的流体交换的完整的反射回路。ENS与中枢神经系统(CNS)协同工作以在局部和全身生理需求的情况下控制消化系统。
[0408] ENS源于神经嵴细胞。这些细胞增殖并分化为神经元和神经胶质细胞，并形成位于肠壁肌肉层中的神经节细胞的两个同心神经丛(Furness，JB(2006)。The organisation of the autonomic nervous system:peripheral connections.Auton.Neurosci.130,1-5.doi:10.1016/j.autneu.2006.05.003)。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含神经细胞。在一些实施方案中，通过巢蛋白的存在鉴定神经细胞。巢蛋白是一种中间丝蛋白，其是已知的神经干/祖细胞标志物。
[0409] 结肠
[0410] 在一些实施方案中，组织外植体源自结肠。结肠是消化系统的部分，其功能是吸收水分、电解质和通过小肠后残留的营养物质，以及粪便的压实。结肠的内膜及其最内层是粘膜。浆膜是消化管的最外层覆盖物。它由被间皮(一种鳞状上皮)包围的不规则的致密结缔组织组成。浆膜之下是外肌层，包含内部圆形和外部纵向肌肉的两个肌肉层。在层之间是神经丛(Auberbach's肠肌层)。下一层存在纤维弹性结缔组织。称为粘膜下层的，它包含粘膜下(Meissner)神经丛，神经节前和神经节后副交感神经纤维以及迷走神经的非髓鞘前神经节纤维。结肠的最内层和内衬是粘膜。它由上皮、固有层和粘膜肌层组成。上皮是简单的柱状吸收性上皮。固有层是上皮下的疏松结缔组织，而粘膜肌层是围绕粘膜的薄平滑肌细胞层。粘膜含有腺体或隐窝。隐窝包含杯状细胞和再生细胞或肠上皮细胞。固有层(LP)填充隐窝之间的空间。隐窝充满了大量的杯状细胞，这些杯状细胞分泌粘液以润滑粪便的排出。
[0411] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了其所来源的结肠组织的体内结构。例如，在一些实施方案中，所述外植体包含结肠的上皮和固有层。在一些实施方案中，组织外植体包含结肠的上皮、固有层和粘膜肌层。在一些实施方案中，组织外植体还包含来自结肠外肌层的内部环形肌肉。在一些实施方案中，组织外植体包含外肌层的内部圆形和纵向肌肉。在一些实施方案中，组织外植体还包含结肠的粘膜下层。在一些实施方案中，组织外植体还包含在结肠中发现的完整隐窝。在一些实施方案中，源自结肠的组织外植体包含粘液层。在一些实施方案中，源自结肠的组织外植体包含粘液层和存在于结肠顶侧的肠内容物。在一些实施方案中，包含粘液层和存在于结肠顶端的肠内容物的来自结肠的组织外植体对于微生物组学研究是有用的。
[0412] 胃
[0413] 在一些实施方案中，组织外植体源自胃或胃的组织。胃是消化道的肌肉性、中空的、扩张的部分。它包含含有粘膜上皮和固有层的粘膜层；它被包含疏松结缔组织的粘膜下层包围；它被包含几个厚肌肉层的肌层包围。粘膜上皮由四种主要类型的分泌性上皮细胞组成：粘液细胞，其分泌碱性粘液以保护上皮免受剪切应力和酸的侵蚀；分泌盐酸的壁细胞；分泌酶原胃蛋白酶原的主细胞(也称为“消化细胞”)；和分泌激素胃泌素的G细胞。粘膜上皮内的细胞可以通过本领域技术人员已知的方法鉴定。上皮被折叠成成千上万个称为胃小窝的小凹部，在其底部是胃腺；粘液细胞位于凹部的颈部，而腺体区中主细胞和壁细胞则保留在凹部底部。终末胃上皮分化的其他标志物包括H+/K+ATP酶和粘蛋白(MUC5A)。
[0414] 胃组织还包含胃特异性干细胞，即绒毛蛋白+Lgr5+细胞，其能够产生所有胃细胞谱系。胃祖细胞和胃癌干细胞的当前分子标志物被描述于J.Gastroenterol.2011July；46(7):855-65中，其公开内容通过引用并入本文。
[0415] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了其来源的胃组织的体内结构。例如，在一些实施方案中，组织外植体包含来自胃的粘膜上皮和固有层。在一些实施方案中，组织外植体还包含来自胃的肌层。在一些实施方案中，源自胃的组织外植体包含粘液细胞、壁细胞、主细胞、G细胞或其组合。在一些实施方案中，源自胃的组织外植体包含绒毛蛋白+Lgr5+干细胞。
[0416] 食道
[0417] 在一些实施方案中，组织外植体源自食道。食道是将喉咙(咽)与胃相连的肌肉管。食道长约8英寸，且内衬粘膜。上食道括约肌(UES)是食管顶部的一束肌肉，其受到有意控制。下食道括约肌(LES)是食管下端的一束肌肉，在此处与胃部会合，并且不受自主控制。当关闭时，LES防止酸和胃内容物反向移动。
[0418] 食道由粘膜、粘膜下层、纤维组织层之间的肌肉纤维层和结缔组织外层(浆膜)组成。粘膜(最内层)是大约三层鳞状细胞的分层鳞状上皮，其与胃的单层柱状细胞形成对比。在粘膜的基部是粘膜肌层。上皮层、结缔组织和粘膜肌层构成粘膜。
[0419] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了其来源的食道组织的体内结构。例如，在一些实施方案中，组织外植体包含食道的粘膜。在一些实施方案中，组织外植体包含食道的粘膜和粘膜肌层。在一些实施方案中，源自食道的组织外植体进一步包含浆膜。
[0420] 颊部与舌
[0422] 颊部组织由两层组成，表面分层鳞状上皮和较深的固有层。上皮由以下四层组成：基底层、棘层、颗粒层和角质层。取决于口腔的区域，上皮可以被角质化或未角质化。未角质化的鳞状上皮覆盖了软腭、内唇、内颊和口底。角质化的鳞状上皮存在于连接的牙龈和硬颚中。
[0423] 在一些实施方案中，组织外植体保留了其来源的颊部组织的体内结构。例如，在一些实施方案中，组织外植体包含颊部组织的表面分层鳞状上皮。在一些实施方案中，组织外植体包含基底层、棘层、颗粒层、角质层或其组合。在一些实施方案中，组织外植体包含颊部组织的表面分层鳞状上皮和固有层。在一些实施方案中，源自颊部组织的组织外植体包含角质化上皮。在一些实施方案中，源自颊部组织的组织外植体包含未角质化的上皮。
[0424] 舌是口腔中被粘膜覆盖的肌肉器官。它是交织的骨骼肌、具有一些粘液和浆液腺的结缔组织以及脂肪组织的口袋的团块。舌通过坚韧的组织和粘膜的网片锚定到口腔上。保持舌头前部的系绳称为系带。在口腔后部，舌被锚定在舌骨上。舌由舌乳突组成，舌乳突是舌上表面上的小结构。舌头有四种类型的乳突：周缘乳突、菌状乳突、丝状乳突和叶状乳突。除丝状乳突外，其他都与味蕾有关。
[0425] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了其来源的舌组织的体内结构。例如，在一些实施方案中，组织外植体包含舌组织的结缔组织。在一些实施方案中，组织外植体包含存在于舌组织中的粘液和浆液腺。在一些实施方案中，源自舌组织的组织外植体包含完整的舌乳突。在一些实施方案中，源自舌组织的组织外植体包含周缘乳突、菌状乳突、丝状乳突、叶状乳突或其组合。
[0426] 组织外植体的培养和活性
[0427] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了其来源的组织的功能特征。在一些实施方案中，保留的功能特征是药物转运/吸收。
[0428] 药物转运是由ATP结合盒(ABC)转运蛋白和溶质载体(SLC)转运蛋白家族介导的。这些肠转运蛋白位于刷状边界膜和基质外侧膜中。每种转运蛋白表现出其自身的底物特异性，且某些转运蛋白具有比其他转运蛋白更广泛的特异性。另外，肠转运蛋白的分布和特征沿肠表现出区域差异，这意味着多样的生理功能以及某些情况下的病理反应。国际转运蛋白联合会(The International Transporter Consortium)基于其影响药物处置和/或副作用的临床证据描述了有限数量的转运蛋白((Nat Rev Drug Discov,2010Mar；9(3):215-
236，在此全文引入作为参考)。在一些实施方案中，组织外植体包含至少一种完整的药物运转体。在一些实施方案中，该至少一种完整的药物运转体是MDR-1(多药耐药性P-糖蛋白)、小管多特异性有机阴离子转运蛋白2(ABCC3)、多药耐药相关蛋白2(MRP-2)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、有机阳离子转运蛋白1(OCT1)、钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)、肽转运蛋白1(PEPT1)、单羧酸转运蛋白1(MCT1)或有机溶质转运蛋白亚基α(OST-alpha)。
236，在此全文引入作为参考)。在一些实施方案中，组织外植体包含至少一种完整的药物运转体。在一些实施方案中，该至少一种完整的药物运转体是MDR-1(多药耐药性P-糖蛋白)、小管多特异性有机阴离子转运蛋白2(ABCC3)、多药耐药相关蛋白2(MRP-2)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、有机阳离子转运蛋白1(OCT1)、钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)、肽转运蛋白1(PEPT1)、单羧酸转运蛋白1(MCT1)或有机溶质转运蛋白亚基α(OST-alpha)。
[0429] 药物运转体通常与药物代谢酶(DME)一起在药物的吸收和消除中发挥作用。药物代谢对药物功效和毒性有重大影响。药物代谢反应分类为I相和II相，其中I相使药物分子功能化并为进一步的代谢做准备，II相是结合性的。通常，I相反应产物是部分或完全非活性的。但是，I期反应产物有时比最初施用的药物具有更高活性。I相酶的主要类别包括但不限于，细胞色素P450和含黄素单加氧酶。II相酶的主要种类包含但不限于UDP葡糖醛酸基转移酶、磺基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶、N-酰基转移酶和N-乙酰基转移酶。因此，在一些实施方案中，本文所述的组织外植体包含至少一种药物代谢酶。在一些实施方案中，该至少一种药物代谢酶是I相酶。在一些实施方案中，至少一种药物代谢酶是CYP3A4。CYP3A4是细胞色素P450的同工型。在一些实施方案中，至少一种药物代谢酶是II相酶。在一些实施方案中，至少一种药物代谢酶是尿苷5’-二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)。UGT是在肠中表达的药物代谢酶，其催化葡萄糖醛酸化，其中它会将葡萄糖醛酸部分添加到药物或其他物质上，从而触发它们通过肾脏的清除。在一些实施方案中，至少一种药物代谢酶是磺基转移酶、N-乙酰基转移酶、S-甲基转移酶、硫代嘌呤甲基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶或葡糖醛酸基转移酶。
[0430] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了硫氧还蛋白还原酶活性。硫氧还蛋白还原酶是一种遍在的酶，其参与许多细胞过程，例如细胞生长和抗氧化应激的保护。硫氧还蛋白在许多生理过程中起着至关重要的作用，这些过程从核苷酸的还原为脱氧核糖核苷酸到异生物物质、氧化剂和自由基的解毒。硫氧还蛋白的氧化还原功能严重依赖于硫氧还蛋白还原酶。硫氧还蛋白系统包含硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH。硫氧还蛋白充当酶(例如，核糖核苷酸还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶和蛋氨酸亚砜还原酶)的电子供体。许多转录因子需要硫氧还蛋白还原以与DNA结合。
[0431] 在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法测定组织外植体的硫氧还蛋白还原酶活性。在一些实施方案中，使用市售试剂盒(例如，硫氧还蛋白还原酶活性测定试剂盒，Ray Biotech)测定组织外植体的硫氧还蛋白还原酶活性。
[0432] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保留了蛋白酶活性。蛋白酶占人类基因组的2％，已鉴定出500-600种不同的蛋白酶。蛋白酶特异性地在蛋白质末端(N-末端或C-末端区域)切割蛋白质，并称为外肽酶，或在蛋白质的中间切割蛋白质，并称为内肽酶。取决于机制，人蛋白酶被分类为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或金属蛋白酶。一些蛋白酶在细胞外环境中分泌和释放，而其它蛋白酶具有细胞内功能，并专门地保留在细胞内。蛋白酶大量存在于胃肠道中，既在管腔中也深入到组织中。胰腺蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等)被释放到上胃肠道的管腔中，在其中发挥消化功能。微生物群构成蛋白酶的重要来源。
[0433] 在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法测定组织外植体的蛋白酶活性。例如，可以使用可商购的试剂盒(例如，蛋白酶活性测定试剂盒，RayBiotech)测定组织外植体的蛋白酶活性。
[0434] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体对毒素有反应。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体对具有胃肠毒性的物质有反应。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体对具有细胞毒性的物质有反应。在一些实施方案中，毒素是非甾体抗炎药(NSAID)、支气管扩张剂、双膦酸盐、抗生素、抗病毒剂、血管扩张剂或利尿剂。在一些实施方案中，NSAID是萘普生、美沙拉嗪(mesalamine)、酮洛芬(ketoprofen)、吲哚美辛(indomethacin)或美洛昔康。在一些实施方案中，支气管扩张剂是茶碱。在一些实施方案中，双膦酸盐是依替膦酸盐(etidronate)。在一些实施方案中，抗生素是多西环素或头孢泊肟。在一些实施方案中，抗病毒剂是奥司他韦或替诺福韦。在一些实施方案中，血管扩张剂是他达拉非。在一些实施方案中，利尿剂是阿米洛利。在一些实施方案中，毒素是多西环素。
[0435] 在一些实施方案中，通过测定本文所述的组织外植体的存活力来测定毒性。例如，毒性物质可能会降低组织外植体的存活力。存活力分析包含但不限于，将细胞染色并允许随后显微镜分析的Live/Dead分析。在一些实施方案中，FACS分析用于分析存itd力(例如，Live/Dead染色)。在一些实施方案中，通过测定本文所述的组织外植体的细胞培养保持的差异来分析毒性。例如，毒性物质可以减少组织外植体在培养保持中的时间。在一些实施方案中，通过测定本文所述的组织外植体的结构差异来分析毒性。例如，毒性物质可能以其不再模拟该组织外植体所来源的体内组织的方式改变结构。在一些实施方案中，通过分析代谢活性来测定毒性。在一些实施方案中，通过 染色来测量代谢活性。在一些实施方案中，通过分析细胞化合物向培养基中的释放来测量毒性。在一些实施方案中，经由腺苷酸激酶测量细胞化合物的释放。在一些实施方案中，通过分析坏死和/或凋亡标志物来测量毒性。在一些实施方案中，凋亡标志物包含但不限于切割的胱天蛋白酶3、切割的核纤层蛋白A和pHistone H2A。本领域普通技术人员可以使用多种方法容易地确定凋亡的诱导，例如，半胱天冬酶激活测定(例如，半胱天冬酶-3/7激活测定)、染色剂和染料(例如，CELLTOXTM、 碘化丙啶和YOYO3)、细胞活力分析、细胞形态和
PARP-1切割。在一些实施方案中，通过FACS分析具有坏死和/或凋亡标志物的细胞的染色。
在一些实施方案中，使用TUNEL分析法测量毒性。
PARP-1切割。在一些实施方案中，通过FACS分析具有坏死和/或凋亡标志物的细胞的染色。
在一些实施方案中，使用TUNEL分析法测量毒性。
[0436] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体从暴露于毒素中恢复。如本文所用，术语“复原”和“恢复”是指通过本文所述的方法(例如通过 分析)所测量的存活力的增加和/或毒性的降低。在一些实施方案中，恢复在最初暴露于毒素后1天、2天、3天、
4天、5天、6天或至少7天发生。
4天、5天、6天或至少7天发生。
[0437] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体保持在培养中。如果组织外植体是存活的，则认为其保持在培养中。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持培养2、4、6、8、10或12小时。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持24小时。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持至少2天。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持至少3天。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持至少4天。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持1周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持至少1周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持2周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持至少2周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持3周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持4周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持5周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持6周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持7周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持8周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持9周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持10周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持11周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持12周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持13周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持14周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持15周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持16周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持17周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持
18周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持18周或更长时间。
18周。在一些实施方案中，组织外植体在培养中保持18周或更长时间。
[0438] 组织外植体的分析
[0439] 如上文所述，胃肠道内的组织包含区别的特征和细胞类型。在一些实施方案中，组织外植体的结构在培养中得以保持。在一些实施方案中，通过微观评估来分析结构。在一些实施方式中，电子显微镜用于分析组织外植体的结构。电子显微镜包含但不限于，透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和聚焦离子束(FIB)显微镜。在一些实施方案中，通过对组织外植体染色并在显微镜下观察来评估组织外植体的结构。用于组织染色的方法是本领域技术人员已知的，并且包含但不限于免疫组织化学分析、免疫荧光分析和原位杂交分析。在一些实施方案中，用苏木精和曙红(H&E)染色组织外植体。在一些实施方案中，用Masson's Trichrome染色组织外植体。Masson's Trichrome染色结缔组织、细胞核和细胞质。在一些实施方案中，用阿尔新蓝染色组织外植体。阿尔新蓝染色酸性粘液物质和乙酸粘蛋白。
[0440] 鉴定特定细胞类型的方法也是本领域技术人员已知的。例如，用识别细胞类型的特异性标志物的抗体染色，或使用诸如DNA/RNA的探针进行原位杂交。组织外植体的免疫组织化学染色用于直接定量基因产物的表达。可用于免疫组织化学染色和/或分析样品液的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并可以在任何哺乳动物中制备。方便地，可以针对多肽的天然序列或针对基于编码多肽的DNA序列的合成肽或者针对与编码多肽和编码特异性抗体表位的DNA融合的外源序列来制备抗体。
[0441] 此外，可以测定组织外植体内蛋白质的表达。用于蛋白质表达的分析包含但不限于，ELISA(酶联免疫吸附测定)、SPR分析、免疫沉淀分析、亲和色谱、蛋白质印迹、RIA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。这样的测定方法是常规的并且是本领域众所周知的。
[0442] 在一些实施方案中，组织外植体是新鲜分离的。在一些实施方案中，组织外植体被冷冻。在一些实施方案中，组织外植体是福尔马林固定的石蜡包埋的。在一些实施方案中，组织外植体被裂解。
[0443] 用于组织外植体的基质
[0444] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体被置于基质上。在本公开的方法和系统中可以使用各种培养基质。这样的基质包含但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、不锈钢、硅等。在一些实施方案中，基质是聚(甲基丙烯酸甲酯)。在一些实施方案中，基质是聚碳酸酯、丙烯酸共聚物、聚氨酯、铝、碳或特氟隆(聚四氟乙烯)。细胞培养表面可以选自多种刚性或弹性载体。例如，细胞培养材料可包含玻璃或聚合物显微镜载玻片。在一些实施方案中，可以基于组织结合到基质的倾向来选择基质。在一些实施方案中，可以基于基质对组织外植体的潜在影响(例如，电刺激/电阻率、机械刺激/应力)来选择基质。
[0445] 细胞培养表面/基质可以由适合于培养哺乳动物细胞的任何材料制成。例如，基质可以是易于消毒的材料，例如塑料或其他人造聚合物材料，只要该材料是生物相容的。在一些实施方案中，基质是允许细胞和/或组织粘附(或可以被修饰以允许细胞和/或组织在选定位置处粘附或不粘附)的任何材料。可以使用多种材料来形成基质/表面，其包括但不限于，聚酰胺；聚酯；聚苯乙烯；聚丙烯；聚丙烯酸酯；聚乙烯基化合物(例如，聚氯乙烯)；聚碳酸酯；聚四氟乙烯(PTFE)；硝酸纤维素；棉；聚乙醇酸(PGA)；纤维素；葡聚糖；明胶；玻璃；含氟聚合物；氟化乙烯丙烯；聚乙二烯；聚二甲基硅氧烷；和硅基质(例如熔融石英、多晶硅或单晶硅)等。而且，可以使用金属(例如金、银、钛膜)。
[0446] 在一些实施方案中，可以修饰基质以促进细胞粘附(例如，涂覆粘附材料)。例如，可以用诸如胶原蛋白或纤连蛋白的蛋白质(即，至少两个氨基酸的肽)处理玻璃基质以帮助组织的细胞粘附于基质。在一些实施方案中，单一蛋白质粘附至基质。在一些实施方案中，两种或更多种蛋白质粘附至基质。适用于修饰基质以促进粘附的蛋白质包含在细胞培养条件下特定细胞类型与其粘附的蛋白质。
[0447] 沉积在基质上的粘附材料的类型(例如，ECM材料、糖、蛋白聚糖等)部分地取决于组织外植体中的一种或多种细胞类型。
[0448] 在一些实施方案中，基质不需要粘附材料。现有的利用原代细胞的胃肠培养系统需要外源细胞外基质。在一些实施方案中，本文所述的组织外植体不需要外源细胞外基质。
[0449] 在一些实施方案中，基质是单孔板。在一些实施方案中，基质是多孔板或组件。在一些实施方案中，基质包含微孔。在一些实施方案中，基质包含6、12、24、48、96、384或1536个微孔。在一些实施方案中，基质包含96个微孔。在一些实施方案中，基质包含384个微孔。在一些实施方案中，基质包含1536个微孔。在一些实施方案中，每个微孔被本文所述的组织外植体完全覆盖。
[0450] 在一些实施方案中，本文所述的组织外植体被放置在界面装置上，其包含标准板、薄的中间板和上载荷板(示例性设置参见图2A和2M)。组织外植体放置在中间板的通孔上方，然后将上载荷板放置在组织外植体上以将其压缩到中间板上并围绕通孔，同时安置在标准板上。在一些实施方案中，每个板包含6、12、24、48、96、384或1536个微孔。
[0451] 在一些实施方案中，上载荷板包含直径为3mm至5mm的柱。在一些实施方案中，上载荷板包含直径为约3mm至约5mm的柱。在一些实施方案中，上载荷板包含直径为4mm的柱。在一些实施方案中，上载荷板包含直径为约4mm的柱。在一些实施方案中，放置在中间板上的组织外植体通过来自上层板的力稍微凹入每个孔中。在一些实施方案中，中间板的厚度是1mm或2mm。在一些实施方案中，中间板的厚度为约1mm或约2mm。在一些实施方案中，中间板的厚度是1mm。在一些实施方案中，中间板的厚度为约1mm。在一些实施方案中，中间板的柱的直径大于上载荷板的直径以确保组织外植体位于上层板和中间板之间。在一些实施方案中，中间板包含直径为6.5mm至8mm的柱。在一些实施方案中，中间板包含直径为约6.5mm至约8mm的柱。在一些实施方案中，中间板包含直径为6mm的柱。在一些实施方案中，中间板包含直径为约6mm的柱。
[0452] 在一些实施方案中，施加至组织外植体的压力使孔间泄漏最小化。在一些实施方案中，施加至组织外植体的压力为20N、15N、10N或5N。在一些实施方案中，施加至组织外植体的压力为约20N、约15N、约10N或约5N。在一些实施方案中，施加至组织外植体的压力为5N。在一些实施方案中，施加至组织外植体的压力为约5N。
[0453] 本公开还预期使用适合用于本公开的基质或板组件100的另一实施方案的使用，如图16至18所示。基质组件100可与本文所述的组织外植体结合使用。组织外植体可以包含，例如，来自大型非人类哺乳动物胃肠道的肠上皮，例如来自猪肠。组织外植体可以包含单一组织层或块，或者可以包含多个组织块或层。本公开的基质组件100可以形成常规高通量药物吸收筛选分析系统(未示出)的一部分或可以与其结合使用。常规的高通量分析系统是本领域已知的并且是众所周知的。常规分析系统可以包含机械臂(未示出)以在使用期间抓握和操纵板组件。
[0454] 本公开的所示基质组件100可包含任何选定数量的板和部件。如图所示，基质组件100包含顶板102和相对的底板104。组织外植体106适应于布置在顶板和底板之间。如图16和17所示，顶板102包含主体108，主体108中形成有多个微孔110，如本领域中已知的。微孔
110可以包含以任何选择的配置布置的微孔阵列，并且可以包含任意选择数量的行和列，这取决于期望在板中形成的微孔的总数。微孔110可具有本领域已知的任何选定直径。主体
108还具有在选定位置处形成在其顶表面114中的多个孔112。根据一种实践，孔112形成在板102中的选定位置处，包括绕板的外围区域。本领域普通技术人员容易认识到，可以在其中形成任何选择数量的孔112，并且可以以任何选择的配置来布置。根据优选的实施方案，孔112围绕板102的顶表面114均匀地分布。孔112可以是紧固件容纳孔，用于在其中容纳和安装已知的紧固件，例如螺钉、磁体等。根据优选实施方案，孔112适于将磁体116安置在其中。与顶板102结合使用的磁体116可以是具有任何选定强度的任何选定类型的磁体，并且优选地包含提供选定量的力的高强度磁体，例如每个磁体大约1.7磅的力至每个磁体大约
2.5磅的力，和优选地，每个磁体约2.28磅力。本领域普通技术人员将容易认识到，可以根据放置组织外植体与顶板和底板流体密封接触所需的力来选择磁体强度。当安装在顶板和底板内时，由磁体施加的力可以被构造成使得仅不在反应孔区域内的组织暴露于压缩力。
110可以包含以任何选择的配置布置的微孔阵列，并且可以包含任意选择数量的行和列，这取决于期望在板中形成的微孔的总数。微孔110可具有本领域已知的任何选定直径。主体
108还具有在选定位置处形成在其顶表面114中的多个孔112。根据一种实践，孔112形成在板102中的选定位置处，包括绕板的外围区域。本领域普通技术人员容易认识到，可以在其中形成任何选择数量的孔112，并且可以以任何选择的配置来布置。根据优选的实施方案，孔112围绕板102的顶表面114均匀地分布。孔112可以是紧固件容纳孔，用于在其中容纳和安装已知的紧固件，例如螺钉、磁体等。根据优选实施方案，孔112适于将磁体116安置在其中。与顶板102结合使用的磁体116可以是具有任何选定强度的任何选定类型的磁体，并且优选地包含提供选定量的力的高强度磁体，例如每个磁体大约1.7磅的力至每个磁体大约
2.5磅的力，和优选地，每个磁体约2.28磅力。本领域普通技术人员将容易认识到，可以根据放置组织外植体与顶板和底板流体密封接触所需的力来选择磁体强度。当安装在顶板和底板内时，由磁体施加的力可以被构造成使得仅不在反应孔区域内的组织暴露于压缩力。
[0455] 顶板102的主体108具有大致四边形的形状，并且优选地具有矩形的形状。根据一种实践，主体108可以可选地具有形成基本直角的三个角和圆角的第四个角118。圆角118向使用者或向分析系统提供了基质组件100定向的视觉指示器。
[0456] 所示的顶板102具有底表面126，该底表面具有沿板的外围部分或边缘形成并从其向外延伸的边缘部分128。边缘部分128因此在其中形成腔室或凹部130。板102的底表面126还具有沿着底表面的中心部分形成并从其向外延伸的任选的脊部分132。因此脊部分132(如果存在的话)可以将凹部130分成多个子腔室，每个子腔室适于安置组织外植体。边缘部分128还沿着主体的相对侧120和122在其中形成选定的切口特征124。该切口特征124在其中形成以提供空间或区域供使用者操纵板从而将它们放置在一起或将其拉开。此外，切口特征允许分析系统的机械臂通过经由切口特征至组件偶联来操纵基质组件。
[0457] 基质组件100的底板104在图16和图18中示出。底板104以类似于顶板102的方式构造。所示的底板104具有主体140，该主体具有形成在其中的多个微孔142，如本领域所知的。微孔142也可以以任何选择的配置布置成微孔阵列，并且可以包含任意选择数量的行和列，这取决于期望在板104中形成的微孔的总数。底板中微孔142的数量优选地与在顶板102中形成的微孔110的数量匹配。微孔142可以具有本领域已知的任何选择的直径。主体140还具有在选定位置处形成在其顶表面146中的多个孔144。主体还具有相对的底表面150。根据一种实践，孔144形成在底板104中的选定位置处，包括围绕板的外围区域。本领域普通技术人员将容易认识到，可以在其中形成任何选择数量的孔144，并且可以以任何选择的配置来布置。根据本公开的优选实施方案，孔144围绕底板104的顶表面146均匀地分布。孔144可以形成为紧固件容纳孔，用于在其中容纳和安装已知的紧固件，例如螺钉、磁体等。根据优选实施方案，孔144适于将磁体116安置在其中。根据已知技术，安装在顶板102和底板104中的磁体116帮助将板磁性地保持或固定在一起。
[0458] 底板104的主体140也具有大致矩形的形状。根据一种实践，主体可以任选地具有形成基本上直角的三个角和作为圆角的第四角148。圆角148向使用者或向分析系统提供了基质组件100的相对取向的视觉指示器。
[0459] 底板104的顶表面146也具有沿板的外围部分或边缘形成并从其向外延伸的边缘部分152。边缘部分152因此在其中形成腔室或凹部154。板104的顶表面146还具有沿顶表面形成并从顶表面向外延伸的任选的脊部分156。因此脊部分156(如果存在的话)可以将凹部130分为多个子腔室，每个子腔室适于安置组织外植体。边缘部分152还沿主体的相对侧158和160在其中形成选择的切口特征162。切口特征162类似于顶板的切口特征124，并且在其中形成以向使用者提供操纵板的空间或区域，以便将板放置在一起或将其拉开。此外，切口特征允许分析系统的机械臂通过经由切口特征124、162与组件偶联来操纵基质组件。
[0460] 顶板102和底板104可以由任何选择的材料形成，并且优选地由与组织外植体在生物学上相容的同时具有高机械强度和具有相对低重量的材料形成。适用于顶板102和底板104的材料的实例包含聚氨酯、聚碳酸酯、丙烯酸、铝、钛、聚四氟乙烯(PTFE)、玻璃和聚苯乙烯。所述板也可以具有任何选择的颜色，以便相对于彼此更好地识别板。此外，具有不同颜色的板能够实现不同的信息读取能力，例如通过采用已知的生物发光和荧光技术。尽管基质组件100被示出为采用一对板102、104，但是本领域普通技术人员将认识到，附加的部件、层或板也可以形成组件的部分。
[0461] 当将组织外植体106放置在顶板102和底板104之间时，该组织外植体106被放置成与板的微孔平面接触，从而提供组织外植体的顶部腔表面和底部基底外侧表面。组织外植体106位于形成在板中的凹部或腔室130、154内。安装在顶板和底板中的磁体116有助于使板彼此磁性对准，从而将组织外植体捕获并保持在其间。由磁体对组织外植体形成的压缩力形成或集中在组织外植体的非微孔区域或部位上，从而避免了施加到外植体上的溶液通过顶板102的微孔孔间泄漏。
[0462] 组织外植体可以形成为适于覆盖整个微孔阵列的单一块，或者可以形成为适于覆盖整个微孔阵列的多个块。如果组织外植体形成为单块，则可以省略分别顶板和底板的任选脊部分132、156。
[0463] 根据本公开的方面，本文所述的基质组件100的板102、104包含选定数量的微孔(例如，如6、12、24、48、96、384或1536个微孔)。在本公开的其他方面，当在板之间固定或保持时，在各个板中形成的微孔阵列的每个微孔完全被组织外植体的选定表面覆盖。
[0464] 根据本公开的其他方面，基质组件适合用于高通量药物吸收筛选分析系统中，其中组织外植体被设置成与板的微孔相对平面地接触，从而提供腔表面和基底外侧表面以允许测量药物通过组织外植体的吸收。在本公开的其他方面，基质组件适合用于高通量吸收-溶出筛选分析系统中，其中组织外植体被设置成与板的微孔相对平面接触，从而提供腔表面和基底外侧表面以用于在测量药物溶出之前或之后测量药物通过组织外植体的吸收。
[0465] 在本公开的其他方面，基质组件适合用于高通量毒性筛选分析系统中，其中所述组织外植体被设置成与所述板的微孔相对平面接触，从而允许测量在所述组织外植体上的毒性。而在本公开的其他方面，基质组件适合用于高通量GLP-1刺激筛选分析系统，其中所述组织外植体被设置为与所述板的微孔相对平面接触，从而提供腔体和基底外侧表面以允许测量来自组织外植体的GLP-1分泌。
[0466] 根据再其他的方面，本公开还提供了用于放置在基质组件中时测定测试化合物通过组织外植体的吸收的方法。该方法包括使组织外植体与通过顶板102的微孔110供应的测试化合物接触。组织外植体的顶表面形成腔表面，并且组织外植体的底表面形成基底外侧表面。该方法还包括通过检测在腔表面和基底外侧表面处测受试化合物的存在来测定测试化合物的吸收的步骤。在基底外侧表面处测试化合物的存在指示该化合物通过组织外植体被吸收的能力。在一些方面，检测测试化合物的存在包括测定在腔表面和基底外侧表面处化合物的浓度。也可以使用类似的方法来测定测试化合物随时间的灌注速率。在一些方面，该方法进一步包括测定测试化合物的溶出。
[0467] 制备体外细胞组合物的方法
[0468] 在一些方面，本公开提供了一种体外细胞组合物，其包含如本文所述的基质和如本文所述的组织外植体，其中所述组织外植体与所述基质接触。
[0469] 在一些实施方案中，组织外植体与基质平面的接触。平面接触可以通过本领域技术人员已知的标准方法测定。例如，将包含标志物(例如，荧光团或有色化合物)的溶液添加至与基质接触的组织外植体。该溶液将组织的表面染色，并使得能够通过照相检查、分光光度法或基于激光扫描仪的技术对组织进行检测。如果与完全浸入溶液中的未安装组织的等效面积相比，与基质接触的组织外植体中染色剂的变异性没有显著差异，则组织外植体与基质平面接触。在一些实施方案中，基质包含多个微孔。因此，可以将包含标志物的溶液放置在微孔内，并在微孔内的染色和未安装的组织之间进行比较。
[0470] 在一些实施方案中，通过在将基质与组织外植体接触之前，用标志物涂覆基质的表面和分析标志物的分布来测定平面接触。例如，面向组织的基质的整个区域涂覆有在基质的表面上形成均匀层的标志物。当紧密接触时，该涂层将组织染色，并且在基质和组织分离后，组织上产生的染色仍保持完整。通过目视检查分析所得的染色，并且如果观察到与基质设置相对应的规则标志物图案，则组织外植体与基质平面接触。在一些实施方案中，基质包含多个微孔，因此组织上的染色可与微孔设置相关。
[0471] 在一些实施方案中，基质包含多个微孔，并且在与组织外植体接触时，每个微孔被组织外植体完全覆盖。在一些实施方案中，在体外细胞组合物中孔间泄漏最小化。在一些实施方案中，基质中的各个微孔被组织外植体完全覆盖使孔间泄漏最小化。
[0472] 在一些实施方案中，包含具有多个微孔的基质的体外细胞组合物在微孔之间具有低的样品变异性。样品变异性可以通过本领域技术人员已知的标准方法测定。例如，可以在基质的每个微孔中测定药物的灌注分析，并进行比较以测定样品的变异性。
[0473] 在一些实施方案中，在组织外植体从胃肠道切除后立即将其与基质接触。在一些实施方案中，在组织外植体与基质接触之前，将其在第一容器(例如，细胞滤器)中保持一段时间。在一些实施方案中，当在与基质接触之前保持在第一容器中时，本文所述的组织外植体的性质得以保持。
[0474] 在一些实施方案中，在用于本文所述方法之前，将体外细胞组合物保持24小时、2天、3天、1周、2周、3周、4周或更长时间。
[0475] 使用方法
[0476] A.预测或测定药物吸收和口服利用度
[0477] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体可用于预测目的化合物或组合物的吸收。在本公开的其他方面，本文所述的组织外植体可用于预测目的化合物或组合物的口服利用度。
[0478] 小肠是吸收药物剂的重要部位。小肠的近端具有最大的药物吸收能力。预测药物吸收的当前标准是CaCo-2单层模型。但是，该模型系统存在许多缺陷。CaCo-2模型缺乏肠粘液层、代谢酶和细胞外基质，以及体内存在的结构和各种细胞类型。此外，CaCo-2细胞是异源的人类上皮结肠直肠腺癌细胞，相对于其细胞行为(例如，蛋白质/基因表达，连续细胞分裂和细胞-细胞粘附复合物)，其性质与原代细胞相比非常不同。已经开发出其他系统来克服CaCo-2系统中的缺陷，并进行了描述(Dedhia,P.等Gastroenterology 2016；Vol.150:1098-1112；Ranga,A.等Advanced Drug Delivery Reviews 69-70 2014；19-28；Shamir,E.和Ewald,A.,Nature Reviews:Molecular Cell Biology2014；Vol.15:647-664,Ootani,A.等Nature Medicine 2009June；Vol.15(6):701-706)。
[0479] 但是，这些系统仍然不能完全重演胃肠道(例如小肠)的复杂的体内结构和功能。本文所述的组织外植体提供了优于当前模型系统的显著优势。例如，如上所述，本文所述的组织外植体保持了其所来源的胃肠道(例如，小肠)的体内结构。另外，组织外植体包含药物吸收所必需的组分(例如，药物代谢酶、药物运转体)。与先前开发的系统不同，本文所述的组织外植体还可以在培养中长时间保持。此外，本文所述的组织外植体不需要外源因子来保持培养。此外，如下文所述，本文所述的组织外植体可用于高通量筛选。这些特征突出了对现有模型系统的改进。
[0480] 本文所述的组织外植体提供了用于测试和预测目的化合物的药物吸收的模型系统。有效的药物治疗依赖于施用后化合物的药代动力学和药效学(PK/PD)之间的相互作用。在药物发现的初始阶段，进行了许多研究以评估新化学实体(NCE)的药理作用，从而选择提供发挥治疗功效的最大前景的先导化合物。尽管药物与治疗靶标结合的能力对其临床成功至关重要，但最终效力还取决于其以足以减轻或治疗疾病的浓度达到治疗靶标的能力。因此，还必须在药物发现阶段的早期评估任何NCE的药代动力学，从而不仅根据生物学活性而且还根据潜在的体内生物利用度，提高从许多被筛选的NCE合理选择前导化合物。美国FDA将生物利用度定义为“活性成分或活性部分从药品中吸收并可在作用部位利用的速率和程度”(21CFR320.1(a))。总体生物利用度在很大程度上取决于目标患者群体中所选化合物的吸收、分布、代谢和排泄。跨肠上皮的吸收尤其重要。本文所述的组织外植体提供了用于测量候选药剂吸收率的独特工具。类似地，本文所述的组织外植体可用于筛选调节消化酶的试剂。
[0481] 在本公开的一些方面，通过测定目的化合物通过组织外植体的灌注来预测药物吸收。具体地，将目的化合物添加到组织外植体中，然后在组织的基质外侧和腔表面两者处检测该化合物。在基底外侧表面处存在该化合物指示该化合物通过组织外植体的灌注能力，从而预测药物吸收和口服生物利用度。本领域普通技术人员可以使用多种方法容易地测定化合物的浓度，例如分光光度分析、具有分光光度检测的高效液相色谱法或液相色谱-质谱法。在一些实施方案中，对候选试剂进行放射性标记，以允许在接收器腔室内和组织内进行检测。
[0482] 在一些实施方案中，本公开提供了用于测定本文所述的组织外植体中测试化合物的浓度的方法。在一些实施方案中，使组织外植体与目的化合物接触，并测定该化合物在组织外植体内的存在。在一些实施方案中，使用高内涵共焦分析测定组织外植体内化合物的浓度。在一些实施方案中，测试化合物包含荧光信号，并且可以用激发源(例如，荧光发射检测器)测量化合物的浓度。具体而言，关于激发的荧光信号的量对应于组织外植体内化合物的浓度。
[0483] 在一些实施方案中，本公开提供了用于分析药物-食物相互作用对测试化合物吸收的影响的方法。具体而言，使组织外植体与目的化合物和消化的食物接触。在一些实施方案中，组织外植体与目的化合物和消化的食物同时接触。在一些实施方案中，在与组织外植体接触之前，将目的化合物与消化的食物接触。在一些实施方案中，在使组织外植体与目的化合物接触之前，使组织外植体与消化的食物接触。在一些实施方案中，利用组织外植体所来源的动物的天然肠介质测定药物-食物相互作用的影响。在一些实施方案中，使用天然肠介质和来自组织外植体所来源的动物的离体微生物组来测定药物-食物相互作用的影响。在一些实施方案中，在使组织外植体与目的化合物接触之前，将目的化合物溶解在天然肠介质中。在一些实施方案中，测定药物-食物相互作用对测试化合物吸收的影响包括测定在存在或不存在消化食物的情况下目的化合物的吸收差异。
[0484] 在一些实施方案中，本公开提供了用于分析测试化合物随时间的吸收的方法(即，延时分析)。在一些实施方案中，本公开提供了用于测定测试化合物通过组织外植体的灌注速率的方法。为了测定灌注速率和/或进行延时分析，使组织外植体与目的化合物接触，并在不同的时间点测量在供体(例如腔)和接受体(例如基质外侧)表面处化合物的存在和/或浓度。在一些实施方案中，连续测量化合物的存在和/或浓度。
[0485] 在一些实施方案中，本公开提供了用于测定药物运转体和/或代谢酶对测试化合物吸收的影响的方法。在一些实施方案中，通过改变本文所述的组织外植体中药物运转体和/或代谢酶的表达，使组织外植体与目的化合物相接触，测定该化合物的吸收，并比较在有或没有改变的药物运转体和/或代谢酶的情况下化合物在组织外植体中的吸收情况，来测定药物运转体和/或代谢酶的影响。下文描述了改变药物运转体和/或代谢酶的表达的方法。在一些实施方案中，药物运转体是MDR-1。在一些实施方案中，代谢酶是CYP3A4。
[0486] 在一些实施方案中，本公开提供了用于测定药物吸收的解剖部位的方法。使用本文所述的方法，比较测试化合物在来自胃肠道(胃、空肠、回肠等)的不同组织之间的吸收可预测体内药物吸收发生的部位。
[0487] B.预测或测定胃肠毒性
[0488] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体可用于预测目的化合物或组合物的胃肠毒性。在本公开的其他方面，本文所述的组织外植体可用于预测包含目的化合物或组合物的制剂的胃肠道毒性的降低。
[0489] 胃肠道副作用在几乎所有口服药物中常见。这些副作用大多数是自限性的，但是某些药物会引起更严重的胃肠道副作用，例如溃疡形成或出血，并且在少数患者中可能危及生命。这些毒性作用主要留下了“沉默流行病(silent epidemic)”，许多医生和大多数患者并未意识到问题的严重性。据估计，胃肠道副作用占药物引起不良反应(DIAE)的20-40％。在美国，DIAE每年导致100,000例死亡，并占所有住院人数的5％。据估计，即使是仅针对类风湿性关节炎和骨关节炎患者开具的NSAID由于胃肠道副作用每年在美国也可导致
16,500人死亡。NSAID与质子泵抑制剂的共同制剂是目前预防或管理NSAID诱发的胃溃疡的唯一方法。但是，该策略的有效性是有限的，因为它仅适用于药物引起的胃部损害，并且仅适用于某些药物。需要降低现有药物的胃肠道副作用的方法，但是测试局部胃肠毒性的挑战构成了主要障碍。
16,500人死亡。NSAID与质子泵抑制剂的共同制剂是目前预防或管理NSAID诱发的胃溃疡的唯一方法。但是，该策略的有效性是有限的，因为它仅适用于药物引起的胃部损害，并且仅适用于某些药物。需要降低现有药物的胃肠道副作用的方法，但是测试局部胃肠毒性的挑战构成了主要障碍。
[0490] 目前，在动物模型中进行了药物毒性的临床前评估。估计大型动物模型对人类毒性的可预测性总体上约为60-70％，和尤其是对于胃肠组织毒性约为85％。啮齿动物模型显示出与人类所观察到的约毒性显著较低的50％的一致性。虽然大型动物模型似乎很好地预测了人类胃肠毒性，但由于在时间、资源消耗和动物使用等方面的高成本，加上道德方面的考虑，它们都被限制在较低的样品量中。因此，胃肠毒性测试限于在临床前药物发现阶段结束时对药物化合物的验证，这是进入临床研究之前监管安全性评估的部分。
[0491] 传统的体外细胞毒性测定能够进行定量的高通量样品筛选，并且对作用机制鉴别和产生高度稳健的数据集(其增强机器学习和预测模型构建的简便性和有效性)产生重大影响。然而，当前基于细胞的体外测定法主要基于二维细胞环境，其不考虑三维组织结构以及复杂的细胞-细胞和细胞外基质-细胞相互作用。结果，生物医学研究已转向使用三维模型，其可以更准确地复制其中取得了各种成功的某些方面。这些体外测定大多数基于使用肿瘤衍生的模型细胞，其与原代细胞相比表现出非常不同的行为，但与源自胃肠上皮的原代细胞相比更易于培养。
[0492] 为了建模药物-胃肠组织相互作用，组织结构通过组织屏障功能和粘液层决定了细胞药物暴露。本文所述的组织外植体克服了这一限制。
[0493] 在一些实施方案中，目的化合物或组合物的胃肠毒性通过以下方法测定：使本文所述的组织外植体与该化合物或组合物接触；等待足够的时间；并进行毒性分析。分析化合物或组合物的毒性的方法是本领域技术人员已知的，并且在本文中进一步描述。例如，在一些实施方案中，毒性分析是基于刃天青的存活力测定。刃天青为氧化还原指示剂，其中它在代谢细胞中不可逆地还原为粉红色和高度红色荧光的试卤灵。在一些实施方案中，毒性测定是Live/Dead分析。在一些实施方案中，毒性分析是 分析。在一些实施方案中，通过测量凋亡标志物(如切割的半胱天冬酶3和切割的核纤层蛋白A/C)的蛋白质表达来测定毒性。在一些实施方案中，通过测量DNA损伤标志物(例如，组蛋白H2A磷酸化)的蛋白质表达来测定毒性。分析蛋白质表达的方法是本领域技术人员已知的并且在本文中描述。
[0494] C.预测或测定内分泌刺激
[0495] 在本公开的一些方面，本文所述的组织外植体可用于鉴定诱导内分泌刺激的化合物或组合物。例如，在一些实施方案中，组织外植体对胰高血糖素样肽1(GLP-1)诱导刺激物起反应。在一些实施方案中，组织外植体包含在刺激后分泌GLP-1的肠内分泌细胞。
[0496] 胃肠内分泌系统，也称为肠内分泌系统，控制和/或调节各种过程，例如食物摄入、能量代谢和内分泌平衡。胃肠道是人体中最大的内分泌器官，且胃肠道与内分泌系统之间的关系是多向的，其中传统内分泌器官释放的激素也可以调节胃肠功能。
[0497] GLP-1是通过调节胰岛细胞功能来降低餐后葡萄糖浓度的胃肠激素，伴随葡萄糖依赖性胰岛素的刺激和胰高血糖素分泌的抑制。还认为GLP-1直接刺激肝葡萄糖摄取并抑制肝葡萄糖产生，从而增加空腹和餐后葡萄糖水平的降低。已开发出模仿GLP-1作用的GLP-1受体激动剂用于治疗2型糖尿病。因此，刺激GLP-1分泌的药剂可用于治疗2型糖尿病和/或一般的代谢疾病，包括糖尿病。
[0498] 可以通过本领域技术人员已知的方法来测定用于评估组织外植体响应于药剂的GLP-1分泌的方法。例如，可以通过ELISA或质谱法分析组织外植体的上清液中GLP-1的存在。在一些实施方案中，在组织外植体与药剂接触之前和之后获得的GLP-1值的比较表明药剂是否刺激GLP-1分泌。
[0499] D.筛选方法
[0500] 在本公开的一些方面，筛选候选药物制剂被本文所述的组织外植体吸收的能力。通过将目的化合物与制剂组合加入本文所述的组织外植体中，并测量该化合物在组织外植体任一侧的浓度来确定制剂的效果。该化合物在基底外侧的存在指示该化合物通过组织外植体灌注。
[0501] 在一些方面，结合吸收筛选测定药物的溶出。例如，在一些实施方案中，用于同时测量吸收和溶出的方法包括：(1)药物+溶剂的组合以形成药物溶液；(2)溶液蒸发形成药物粉末；(3)将药物粉末与赋形剂库组合；(4)分光光度法检测上清液中的药物浓度以得到溶出度数据；(5)使肠组织外植体与上清液接触；和(6)分光光度法检测灌注的药物浓度。通过分析，可以鉴定出增强溶出和吸收的制剂。
[0502] 在一些实施方案中，基于上文所述的吸收和溶出筛选测定法增强了溶解性差的具有或不具有差的渗透性的已知药物的溶出。
[0503] 在其他方面，针对候选药剂的毒性作用进行筛选。将组织外植体暴露于候选药剂或媒介物，并评估其存活力、培养中的保持和结构。在一些实施方案中，毒性药剂降低了存活力。在一些实施方案中，毒性药剂减少了组织外植体在培养中保持的时间。在一些实施方案中，毒性药剂改变组织外植体的结构。
[0504] 与常规的体外测定法相比，本文所述的组织外植体能够以更高的体内可预测性分析胃肠毒性。在一些方面，组织外植体用作预测胃肠毒性和/或胃肠道副作用的筛选平台。此外，本文所述的组织外植体可用于筛选改变药物胃肠毒性的赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂包含但不限于来自GRAS列表的那些赋形剂、FDA的非活性成分列表、其他生物相容性和/或非毒性的小分子化合物和聚合物以及营养物。
[0505] 在本公开的另一方面，提供了一种用于筛选药剂对不同组织的细胞的作用的方法，其包括癌症起始和治疗过程，并且包括使用本文所述的实验修饰的外植体。通过本文所述方法培养的组织外植体暴露于候选药剂。目的药剂包含药物试剂，例如小分子、抗体、肽等，以及遗传药剂，例如反义RNAi、可表达的编码序列等，例如候选肿瘤抑制物、候选致癌基因等的可表达编码序列。在一些实施方案中，测定对干细胞的影响。在其他实施方案中，测定了肿瘤细胞转化或生长的影响，例如，其中药剂可以包括但不限于化疗、单克隆抗体或其他基于蛋白质的药剂、放射/放射敏化剂、cDNA、siRNA、shRNA、小分子等等。通过组织外植体生长的变化和指示组织特异性干细胞的多谱系分化标志物的存在来检测对组织特异性干细胞具有活性的药剂。另外，通过分析组织外植体的长期重构活性来检测活性药剂。还提供了使用外植体培养物筛选调节组织功能的药剂的方法。在一些实施方案中，该方法可用于鉴定用于治疗疾病的新药剂。在一些实施方案中，该方法可用于测定已经存在的药剂的有效递送。
[0506] 在一些实施方案中，通过进行第一分析，使组织外植体与目的化合物接触，等待足够的时间，在组织外植体上进行第二分析，并比较第一分析和第二分析的结果以测定化合物的作用，来测定测试化合物的作用。分析方法的例子包含但不限于，药物溶出、吸收、对组织的作用(例如毒性、遗传修饰、蛋白质或基因表达的改变、组织的组织学/形态的改变)、药物降解和激素分泌。分析细胞毒性的测定法的例子包含但不限于，Live/Dead测定、和 生物发光细胞毒性测定试剂盒。在一些实施方案中，同时进行一种以上测定。
[0507] 将药剂以溶液或易溶的形式添加到培养基中。可以在流通系统中以流、间歇、连续的形式添加药剂，或者将大剂量的化合物单一或增量地添加到另外的静态溶液中。在流通系统中，使用两种流体，其中一种是生理中性溶液，和另一种是具有添加的目的化合物的相同溶液。第一种流体流经细胞，然后第二种流体流过。在单一溶液法中，将大剂量的测试化合物添加到组织外植体周围的培养基体积中。在一些实施方案中，将目的化合物直接注射到组织外植体中。
[0508] 高通量筛选
[0509] 在本公开的一些方面，提供了用于以高通量形式筛选候选药剂的方法和培养系统。“高通量”或“HT”是指同时针对目的活性筛选大量候选药剂或候选细胞。大量的意思是一次筛选20个或更多候选者，例如，40个或更多候选者，例如100个或更多候选者、200个或更多候选者，500个或更多候选者，或者1000个候选者或更多。
[0510] 在一些实施方案中，高通量筛选基于所使用的组织培养板的孔的数量来设计，如24孔形式，其中分析24种候选药剂(或更少，加上对照)；48孔形式，其中分析48种候选药剂(或更少，加上对照)；96孔形式，其中分析96种候选药剂(或更少，加上对照)；384孔形式，其中分析384种候选药剂(或更少，加上对照)；1536孔形式，其中分析1536个候选药剂(或更少，加上对照)；或3456孔形式，其中分析3456个候选药剂(或更少，加上对照)。
[0511] 在一些实施方案中，本公开提供了用于分析药物制剂吸收的高通量筛选的方法。在一些实施方案中，使组织外植体与基质接触，其中基质包含多个微孔，其中使组织外植体与包含目的化合物和赋形剂的制剂库接触，其中测定目的化合物的吸收，和其中比较吸收结果以鉴定用于药物吸收的制剂。
[0512] 在一些实施方案中，制剂库是基于GRAS的赋形剂的库，其是已知的吸收促进剂或对肠吸收具有未知的作用。
[0513] 目的化合物
[0514] 目的化合物是涵盖许多化学类别的生物活性剂、有机分子(其可包含有机金属分子)、无机分子，遗传序列等。本公开的一方面是评估候选药物的吸收并确定用于吸收的最佳制剂。本公开的另一方面是分析活性药物成分(API)对组织的局部作用。例如，作用可以包含但不限于，局部组织毒性、组织的遗传修饰、组织渗透性的暂时变化、药物运转体/代谢酶的抑制、粘液或微生物组的调节以及激素产生和/或分泌的调节。本公开的另一方面是评估API的组合的效果。
[0515] 目的化合物包含与蛋白质进行结构相互作用，特别是氢键结合所必需的官能团，并且通常包含至少胺、羰基、羟基或羧基基团，通常至少两个功能性化学基团。该化合物通常包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。也在生物分子中发现了目的化合物，其包括肽、多核苷酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。包括药理活性药物、遗传活性分子等。在一些实施方案中，目的化合物包含化疗剂、抗炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道修饰剂和神经活性剂。
[0516] 包含候选药剂的化合物可从多种来源获得，包括合成或天然化合物的库。例如，许多方式可用于多种多样有机化合物(包括生物分子)的随机和定向合成，其包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽。或者，可获得或容易产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库。另外，天然或合成产生的库和化合物可通过常规化学、物理和生化方式容易地修饰，并可用于产生组合库。已知的药理学试剂可以进行直接或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。在一些实施方案中，库包含批准的和/或实验的药物。在一些实施方案中，库包含与生物活性或非活性分子缀合的批准的和/或实验的药物。在一些实施方案中，药物库是可商购的。
[0517] 在一些实施方案中，候选药剂也可以是遗传药剂，例如，多核苷酸及其类似物，其通过将遗传药剂添加至组织外植体而在本文所述的筛选分析中进行测试。引入遗传药剂可导致组织外植体内细胞的总遗传组成的改变。遗传药剂(例如DNA)通常可以通过将序列整合到染色体中导致在细胞基因组中实验地引入的变化。遗传变化也可以是瞬时的，其中外源序列没有整合，而是保持作为附加因子存在。遗传药剂(例如，反义寡核苷酸)也可以通过干扰mRNA的转录或翻译来影响蛋白质的表达，而不改变细胞的基因型。遗传药剂，例如短干扰RNA(siRNA)或短发夹(shRNA)，可以通过介导与其结合的mRNA的降解而在不改变细胞基因型的情况下影响蛋白质的表达。遗传药剂的作用是增加或减少细胞中一种或多种基因产物的表达。
[0518] 本文所述的组织外植体可用于预测多种药剂类型的吸收、毒性和/或内分泌刺激。在一些实施方案中，候选药剂是小分子(例如，多西环素)。在一些实施方案中，候选药剂是小分子药物。在一些实施方案中，候选药剂是生物制剂，其包含肽药物(例如，催产素)和蛋白质药物(例如，胰岛素)。在一些实施方案中，候选药剂是反义寡核苷酸。
[0519] 在一些实施方案中，候选药剂是由FDA生物制药分类系统(FDA’s Biopharmaceutics Classification System，BCS)分类的已知药物，其考虑了控制速释(IR)固体口服剂型的药物吸收速率和程度的三个主要因素：溶出度、溶解度和肠渗透性。
BCS I类是指高溶解度和高渗透性。BCS II类是指低溶解度和高渗透性。BCS III类是指高溶解度和低渗透性。BCS IV类是指低溶解度和低渗透性。
BCS I类是指高溶解度和高渗透性。BCS II类是指低溶解度和高渗透性。BCS III类是指高溶解度和低渗透性。BCS IV类是指低溶解度和低渗透性。
[0520] E.组织外植体的修饰
[0521] 本文所述的组织外植体可以进行实验修饰。在一些实施方案中，在培养期之前或期间修饰组织外植体。在一些实施方案中，通过暴露于病毒或细菌病原体来修饰组织外植体。在一些实施方案中，通过改变基因表达的模式(例如，通过提供重编程因子)来修饰组织外植体。在一些实施方案中，通过遗传修饰来修饰组织外植体。在一些实施方案中，遗传修饰包含但不限于，用例如干扰RNA(shRNA、siRNA)敲低基因，和用例如CRISPR/Cas9进行稳定的遗传修饰。实验修饰的组织外植体可用于研究药物运转体或药物代谢酶的作用；治疗剂的作用；用于肿瘤治疗，对分化的作用等。
[0522] 在一些实施方案中，药物运转体和/或药物代谢酶的表达被改变在一些实施方案中，药物运转体和/或药物代谢酶的表达被敲低。在一些实施方案中，至少一种药物运转体的表达被改变。在一些实施方案中，至少一种药物运转体的表达被敲低。在一些实施方案中，至少一种药物代谢酶的表达被改变。在一些实施方案中，至少一种药物代谢酶的表达被敲低。
[0523] 在一些实施方案中，组织外植体被修饰以产生病理状态。病理状态的实例包含但不限于，炎性肠病(IBD)、结肠癌、肠系膜缺血、先天性综合症和创伤，其可能导致功能丧失或强制进行足以损害器官生理的大段肠道物理切除。在培养中保持组织外植体的能力对于开发用于治疗肠道疾病和创伤引起的肠道衰竭的疗法非常有价值。
[0524] 修饰细胞或组织的方法是本领域技术人员已知的。例如，编码多肽的表达载体的引入可用于在缺乏该序列的细胞中表达编码的产物，或过表达产物。可以使用组成型的或受外部调控的各种启动子，在后者的情况下，可以启动或关闭基因的转录。这些编码序列可以包含全长cDNA或基因组克隆，从其衍生的片段或将天然存在的序列与其他编码序列的功能或结构域组合的嵌合体。或者，引入的序列可编码反义序列；可以是反义寡核苷酸；siRNA或shRNA，编码天然序列的显性负突变或显性或组成性活性的突变；改变的调控序列等。代替从转染或转导到组织外植体中的载体表达，可以直接将寡核苷酸、siRNA或shRNA转染或转导到组织外植体中。
[0525] 除了源自宿主细胞物种的序列外，其他目的序列包含，例如，病原体的遗传序列，例如病毒、细菌和原生动物基因的编码区，尤其是其中基因影响人类或其他宿主细胞功能。也可以引入来自其他物种的序列，其中可以存在或不存在相应的同源序列。
[0526] 大量公共资源可作为遗传序列的来源，例如对于人类，其他哺乳动物和人类病原体序列。测序了人类基因组的相当大的部分，且可以通过公共数据库(如Genbank)进行访问。资源包含单基因集以及基因组序列。例如，参见Dunham等(1999)Nature 402,489-495；或Deloukas等(1998)Science 282,744-746。
[0527] 对应于许多人类基因序列的cDNA克隆可从IMAGE联合会获得。国际IMAGE联合会实验室开发并排列cDNA克隆以供全球使用。这些克隆是可商购的，例如可从Genome Systems,Inc.,St.Louis,Mo获得。通过基于DNA序列信息的PCR来克隆序列的方法在本领域中也是已知的。
[0528] 可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建表达载体，其包含编码序列以及用于增加引入细胞中的外源基因的表达的适当的转录和翻译控制信号。这些方法包含，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。或者，可以使用例如，合成仪化学合成能够编码基因产物序列的RNA。参见，例如在“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”，1984,Gait,M.J.ed.,IRL Press,Oxford中描述的技术。
[0529] 可以利用多种宿主表达载体系统来表达遗传编码序列。表达构建体可以含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子、延伸因子启动子、肌动蛋白启动子等)、来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒等)。
[0530] 在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统，例如，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒等。在将腺病毒用作表达载体的情况下，可以将目的编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启动子和三重前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非关键区域(例如，区域E1或E3)中将产生重组病毒，该重组病毒是可存活的并且能够在被感染的宿主中表达基因产物(参见Logan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3655-3659)。为了有效翻译插入的基因产物编码序列，可能还需要特定的起始信号。这些信号包含ATG起始密码子和相邻序列。产生用于插入序列的表达的腺病毒载体的标准系统可从商业来源获得，例如来自Clontech的Adeno-X TM表达系统(Clontechniques，2000年1月，第10-12页)。
[0531] 在将包含其自身的起始密码子和相邻序列的整个基因插入到适当的表达载体中的情况下，可能不需要另外的翻译控制信号。然而，在仅插入一部分基因编码序列的情况下，必须提供外源翻译控制信号，其也许包含ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种来源。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以提高表达的效率(参见Bittner等，1987,Methods in Enzymol.153:516-544)。
[0532] 在一些实施方案中，使用了实现高转染效率的方法，并因此避免了使用选择标记的需要。这些可包含物理递送模式，其包含微针、微喷射、离子电渗和超声介导的siRNA递送。
[0533] 催产素制剂
[0534] 在一些方面，本公开提供了用于催产素的口服制剂。由于其低的肠渗透性，催产素目前不能口服施用。在一些实施方案中，聚乙烯亚胺(800Da，封端的；“PEI”)制剂增加了催产素的肠吸收。在一些实施方案中，催产素使用PEI配制。在一些实施方案中，与未配制的催产素相比，用PEI配制的催产素具有升高的血浆浓度水平。
[0535] 如本文所用，“口服制剂”是指药物递送系统的方式。口服制剂旨在由受试者吞咽。
[0536] 当应用于催产素时“有效量”是指通常足以引起受试者所需变化的催产素的量。当应用于口服制剂的非活性成分(例如PEI)，“有效量”是指足以在所需的时间段内以期望的速率对催产素的释放产生积极影响的非活性成分的量。
[0537] 在一些方面，本公开提供了催产素制剂，其包含治疗有效量的催产素或其功能类似物以及PEI。在一些实施方案中，催产素的有效浓度为50μg/mL。在一些实施方案中，催产素的有效浓度为约50μg/mL。在一些实施方案中，PEI的浓度为1-100μg。在一些实施方案中，PEI的浓度为约1至约100μg。在一些实施方案中，PEI的浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg。
[0538] 试剂盒
[0539] 在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其至少包含本文所述的组织外植体。试剂盒可包含本文所述的组织外植体，和任选地基质，以及使用说明书。试剂盒可在合适的容器中包含本文所述的组织外植体，和任选地基质，以及各种缓冲液、试剂、酶和本领域公知的其他标准成分。在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的组织外植体、基质和一种或多种制剂。在一些实施方案中，所述制剂是基于GRAS(通常认为是安全的)的赋形剂。在一些实施方案中，试剂盒包含制剂库。在一些实施方案中，基质包括用于与组织外植体接口的板，以及覆盖膜以密封板之一。
[0540] 在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的组织外植体和包含用于与组织外植体接口的板的基质和密封板之一的覆盖膜，其中该基质与机械臂相容。这样的容器可以包含注塑造或吹塑的塑料容器，期望的成分保持在其中。容器和/或试剂盒可包含带有使用说明和/或警告的标签。
[0541] 实施例
[0542] 材料和方法：
[0543] 组织解剖与培养
[0544] 从选定的地方屠宰场的猪新鲜获得的完整胃肠道分离小肠组织。纵向解剖组织后，在无菌条件下将其浸入补充有5％抗生素-抗霉菌剂溶液(目录号15240062，Thermo Fisher Scientific)的一系列盐水溶液中。然后根据实验将组织安置在肠组织外植体装置上或保存在细胞滤器(FalconTM细胞滤器，筛孔尺寸：100um，Thermo Fisher Scientific)中，并在37℃孵育下培养在气密容器中无血清细胞培养基中孵育。为了培养，使用了以下培养基和补充剂：Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM)高葡萄糖(Life Technologies，目录号11965084)；DMEM，高葡萄糖，HEPES(Life Technologies，目录号12430054)；DMEM，高葡萄糖，不含谷氨酰胺(Life Technologies，目录号11960044)；DMEM，高葡萄糖，丙酮酸，不含谷氨酰胺(Life Technologies，目录号10313021)；高级DMEM/F-12(Life Technologies，目录号12634028)；MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies，目录号11140050)；EGF重组人蛋白(Life Technologies，目录号PHG0311)；胎牛血清，经认证，美国来源(Life Technologies，目录号16000044)。对于生物学表征，基于先前公开的实验方案(Sato,T.&Clevers,H.,Methods Mol.Biol.Vol.945:319-328,2013)分离肠隐窝和绒毛。
[0545] 试剂
[0546] 使用A-20000 NHS酯(琥珀酰亚胺酯)标记试剂盒在使用前标记人催产素(合成的，O3251-5000IU，Sigma)、人胰岛素(重组，产品目录号I2643-25MG，Sigma)，替考拉宁(重组，产品目录号T0578，Sigma)、乙酸卡贝缩宫素(合成的，SML0748，Sigma)。标记 Delivery 购自Mirus Bio。此外，以下模型药物
均购自Sigma：安替比林，β-胡萝卜素，达那唑，维拉帕米，伊维菌素，美托洛尔
(Metropolol)，萘普生，磷酸奥司他韦，美金刚，一水合恩替卡韦，恩曲他滨，麦角胺D-酒石酸盐，拉贝洛尔(Labetalol)，酮洛芬，地西拉明，莫西沙星，卡马西平(Carbamazepine)，阿托伐他汀(Atorvastatin)，多潘立酮(Domperidone)，吡罗昔康，布洛芬，茶碱
(Theophylline)，普萘洛尔(Propranolol)，美沙拉嗪(Mesalamine)，咖啡因，苯妥英(Phenytoin)，伐昔洛韦，香豆素，多西环素，二甲双胍，氟伐他汀，特布他林，华法林，吲哚美辛，阿昔洛韦，氯苯那敏，沙奎那韦，瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)，奎宁，奎尼丁，呋塞米，雷尼替丁，氯四环素，二氢麦角胺-酒石酸盐，阿米洛利，奥美拉唑，阿替洛尔，法莫替丁，姜黄素，FITC葡聚糖4kDa，FITC葡聚糖20kDa，FITC葡聚糖70kDa和荧光素。下列所有作为制剂赋形剂测试的化学品均购自Sigma：δ-癸内酯，2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，4臂PEG，8臂PEG，4-(二甲基氨基)吡啶，6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸，安赛蜜K，己二酸，琼脂，琼脂糖，白蛋白(牛血清)，海藻酸钠盐(褐藻)，海藻酸钠盐(巨藻)，α-环糊精，杆菌肽，B-丙氨酸，B-环糊精，BD PuraMatrix肽水凝胶，膨润土，咖啡因，Carbopol 934，羧甲基纤维素，1号巴西棕榈蜡黄色，蓖麻油，醋酸纤维素，醋酸纤维素邻苯二甲酸酯(Cellulose Acetate Phalate)，醋酸纤维素丙酸酯，几丁质(来自虾壳)，壳聚糖，壳聚糖，中等分子量，胆固醇，柠檬酸，玉米油，棉籽油，半胱胺，D(+)-甘露糖，D(-)果糖，D(+)葡萄糖，D(+)海藻糖二水合物，葡聚糖，右旋糖，D-乳糖醇，D-亮氨酸，DL-酒石酸，D-甘露醇，D-蛋氨酸，D-色氨酸，Dynasan 118Microfine，依地酸二钠，乙撑二次氮基-四乙酸二钠盐(Ethylenedinitrilol-tetracetic acid
disodium salt)，L(+)阿拉伯糖，锂皂石，L-精氨酸，L-抗坏血酸，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，卵磷脂，L-组氨酸，来自刺槐种子的刺槐豆胶，L-苯丙氨酸(L-Phenylaline)，L-脯氨酸，L-苏氨酸，葡甲胺(meglomine)，Miglyol 812，矿物油，Mowiol 10-98，Mowiol 18-88，Mowiol 4-98，Mowiol 56-98，Mowiol8-88，粘蛋白(猪胃)，新亚铜试剂(Neocuproine)，固体石蜡(Parrafin Wax)，花生油，PEG-嵌段-PEG-嵌段-PEG，来自猪胃粘膜的胃蛋白酶，Pluronic F-127，Pluronic F-68，Pluronic P85，聚(二甲基硅氧烷)，双(3-氨基丙基)封端，聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)，聚(L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)，聚(丙二醇)二缩水甘油醚，聚(二甲基硅氧烷)-接枝聚丙烯酸酯，聚(乙二醇)双(胺)，聚(乙烯-共-甲基丙烯酸缩水甘油酯)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯基酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)，聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)，聚(丙二醇)二缩水甘油醚，聚(丙烯酸叔丁酯-共-丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸)，聚醋酸乙烯酯，聚(乙烯醇)，聚乙烯醇，聚[二甲基硅氧烷-共-[3-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-丙基]甲基硅氧烷]，聚[二甲基硅氧烷-共-甲基(3-羟丙基)硅氧烷]接枝-聚(乙二醇)甲基醚，聚丙烯酸，聚丙烯酸，聚苯胺，聚己内酯(PCL)，聚己内酯，聚己内酯三醇，聚乙二醇3350Da，聚乙二醇400Da，聚乙二醇甲基醚，聚乙二醇10kDa，聚乙二醇
35kDa，聚乙二醇500kDa，聚乙二醇800Da，聚乙烯亚胺，聚氧乙烯(20kDa)，失水山梨醇单油酸酯(吐温80)，聚山梨聚酯80，聚苯乙烯珠(200nm)，聚苯乙烯硫醇封端的，聚氯乙烯-乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮K90，没食子酸丙酯，核黄素，核黄素5'-单磷酸钠盐，SDS，癸二酸，芝麻油，Sigma 7-9(Tris碱)，硅胶，甘氨胆酸钠(Sodium Glycholate)，甘氨鹅脱氧胆酸钠，水合甘氨胆酸钠，透明质酸钠，水合牛磺胆酸钠，Soluplus，大豆油，Span
80，淀粉，可溶性蔗糖，超蔗糖(Sucrose Ultra)(Fluka)，Synperonic F108，滑石粉，牛磺酸(Tauchloric Acid)，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，四甘醇，硫代黄素T，黄芪胶，甘油三乙酸酯，三硬脂酸甘油酯，TritonX100，吐温28-LQ-(AP)，吐温20，尿苷，香草醛，植物油，维生素B12，来自野油菜黄单胞菌的黄原胶，木糖醇，γ-癸内酯，Zonyl FSO-100含氟表面活性剂，α-生育酚，ε-己内酰胺，ε-己内酯，ω-十五内酯，明胶，牛皮明胶，B型，冷水鱼皮明胶，猪皮明胶，A型，甘油，甘氨酸，甘胆酸，瓜尔胶，来自猪肠粘膜的肝素钠盐，羟磷灰石纳米颗粒(200nm)，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(Hydroxypropylmethylcellulose phalate)，流感病毒血凝素(HA)肽，氧化铁(III)， EL， SR 30D，
25， VA 64， 12PF， P188， SR，
V67， P407， RH40， E PO，
E100， NM 30D， RL PO，
S 100， L 100-55， RS PO。为了进行
免疫标记，以1：200稀释度使用了以下一级抗体：CDX2(兔，Cell Signaling)、E-钙粘蛋白(小鼠，Cell Signaling)、Claudin-1(兔，Cell Signaling)、波形蛋白(兔，Cell Signaling)、FABP1(兔，Cell Signaling)、GLP-1(山羊，Santa Cruz)、Lgr5/GPR49(兔，Thermo Fisher)、Wnt3a(兔，Abcam)、绒毛蛋白(兔，Thermo Fisher)、MUC2(兔，Thermo Fisher)、巢蛋白(兔，Thermo Fisher)、MDR-1(兔，Novus)、CYP3A4(兔，Cell Signaling)、R-spondin1(鼠，R&D Systems)、嗜铬粒蛋白A(小鼠，Abcam)、溶菌酶(兔，Abcam)、HLA DR+HLA DP(小鼠，Abcam)、OLFM4(兔，Abcam)、角蛋白20(兔，Cell Signaling)、GFAP(鸡，Abcam)。此外，小麦胚芽凝集素、 偶联物、L12492、 深红色和
R37112 ActinRedTM 555 试剂DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸
盐)均购自Life Technologies。
均购自Sigma：安替比林，β-胡萝卜素，达那唑，维拉帕米，伊维菌素，美托洛尔
(Metropolol)，萘普生，磷酸奥司他韦，美金刚，一水合恩替卡韦，恩曲他滨，麦角胺D-酒石酸盐，拉贝洛尔(Labetalol)，酮洛芬，地西拉明，莫西沙星，卡马西平(Carbamazepine)，阿托伐他汀(Atorvastatin)，多潘立酮(Domperidone)，吡罗昔康，布洛芬，茶碱
(Theophylline)，普萘洛尔(Propranolol)，美沙拉嗪(Mesalamine)，咖啡因，苯妥英(Phenytoin)，伐昔洛韦，香豆素，多西环素，二甲双胍，氟伐他汀，特布他林，华法林，吲哚美辛，阿昔洛韦，氯苯那敏，沙奎那韦，瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)，奎宁，奎尼丁，呋塞米，雷尼替丁，氯四环素，二氢麦角胺-酒石酸盐，阿米洛利，奥美拉唑，阿替洛尔，法莫替丁，姜黄素，FITC葡聚糖4kDa，FITC葡聚糖20kDa，FITC葡聚糖70kDa和荧光素。下列所有作为制剂赋形剂测试的化学品均购自Sigma：δ-癸内酯，2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，4臂PEG，8臂PEG，4-(二甲基氨基)吡啶，6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸，安赛蜜K，己二酸，琼脂，琼脂糖，白蛋白(牛血清)，海藻酸钠盐(褐藻)，海藻酸钠盐(巨藻)，α-环糊精，杆菌肽，B-丙氨酸，B-环糊精，BD PuraMatrix肽水凝胶，膨润土，咖啡因，Carbopol 934，羧甲基纤维素，1号巴西棕榈蜡黄色，蓖麻油，醋酸纤维素，醋酸纤维素邻苯二甲酸酯(Cellulose Acetate Phalate)，醋酸纤维素丙酸酯，几丁质(来自虾壳)，壳聚糖，壳聚糖，中等分子量，胆固醇，柠檬酸，玉米油，棉籽油，半胱胺，D(+)-甘露糖，D(-)果糖，D(+)葡萄糖，D(+)海藻糖二水合物，葡聚糖，右旋糖，D-乳糖醇，D-亮氨酸，DL-酒石酸，D-甘露醇，D-蛋氨酸，D-色氨酸，Dynasan 118Microfine，依地酸二钠，乙撑二次氮基-四乙酸二钠盐(Ethylenedinitrilol-tetracetic acid
disodium salt)，L(+)阿拉伯糖，锂皂石，L-精氨酸，L-抗坏血酸，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，卵磷脂，L-组氨酸，来自刺槐种子的刺槐豆胶，L-苯丙氨酸(L-Phenylaline)，L-脯氨酸，L-苏氨酸，葡甲胺(meglomine)，Miglyol 812，矿物油，Mowiol 10-98，Mowiol 18-88，Mowiol 4-98，Mowiol 56-98，Mowiol8-88，粘蛋白(猪胃)，新亚铜试剂(Neocuproine)，固体石蜡(Parrafin Wax)，花生油，PEG-嵌段-PEG-嵌段-PEG，来自猪胃粘膜的胃蛋白酶，Pluronic F-127，Pluronic F-68，Pluronic P85，聚(二甲基硅氧烷)，双(3-氨基丙基)封端，聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)，聚(L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)，聚(丙二醇)二缩水甘油醚，聚(二甲基硅氧烷)-接枝聚丙烯酸酯，聚(乙二醇)双(胺)，聚(乙烯-共-甲基丙烯酸缩水甘油酯)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯基酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)，聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)，聚(丙二醇)二缩水甘油醚，聚(丙烯酸叔丁酯-共-丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸)，聚醋酸乙烯酯，聚(乙烯醇)，聚乙烯醇，聚[二甲基硅氧烷-共-[3-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-丙基]甲基硅氧烷]，聚[二甲基硅氧烷-共-甲基(3-羟丙基)硅氧烷]接枝-聚(乙二醇)甲基醚，聚丙烯酸，聚丙烯酸，聚苯胺，聚己内酯(PCL)，聚己内酯，聚己内酯三醇，聚乙二醇3350Da，聚乙二醇400Da，聚乙二醇甲基醚，聚乙二醇10kDa，聚乙二醇
35kDa，聚乙二醇500kDa，聚乙二醇800Da，聚乙烯亚胺，聚氧乙烯(20kDa)，失水山梨醇单油酸酯(吐温80)，聚山梨聚酯80，聚苯乙烯珠(200nm)，聚苯乙烯硫醇封端的，聚氯乙烯-乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮K90，没食子酸丙酯，核黄素，核黄素5'-单磷酸钠盐，SDS，癸二酸，芝麻油，Sigma 7-9(Tris碱)，硅胶，甘氨胆酸钠(Sodium Glycholate)，甘氨鹅脱氧胆酸钠，水合甘氨胆酸钠，透明质酸钠，水合牛磺胆酸钠，Soluplus，大豆油，Span
80，淀粉，可溶性蔗糖，超蔗糖(Sucrose Ultra)(Fluka)，Synperonic F108，滑石粉，牛磺酸(Tauchloric Acid)，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，四甘醇，硫代黄素T，黄芪胶，甘油三乙酸酯，三硬脂酸甘油酯，TritonX100，吐温28-LQ-(AP)，吐温20，尿苷，香草醛，植物油，维生素B12，来自野油菜黄单胞菌的黄原胶，木糖醇，γ-癸内酯，Zonyl FSO-100含氟表面活性剂，α-生育酚，ε-己内酰胺，ε-己内酯，ω-十五内酯，明胶，牛皮明胶，B型，冷水鱼皮明胶，猪皮明胶，A型，甘油，甘氨酸，甘胆酸，瓜尔胶，来自猪肠粘膜的肝素钠盐，羟磷灰石纳米颗粒(200nm)，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(Hydroxypropylmethylcellulose phalate)，流感病毒血凝素(HA)肽，氧化铁(III)， EL， SR 30D，
25， VA 64， 12PF， P188， SR，
V67， P407， RH40， E PO，
E100， NM 30D， RL PO，
S 100， L 100-55， RS PO。为了进行
免疫标记，以1：200稀释度使用了以下一级抗体：CDX2(兔，Cell Signaling)、E-钙粘蛋白(小鼠，Cell Signaling)、Claudin-1(兔，Cell Signaling)、波形蛋白(兔，Cell Signaling)、FABP1(兔，Cell Signaling)、GLP-1(山羊，Santa Cruz)、Lgr5/GPR49(兔，Thermo Fisher)、Wnt3a(兔，Abcam)、绒毛蛋白(兔，Thermo Fisher)、MUC2(兔，Thermo Fisher)、巢蛋白(兔，Thermo Fisher)、MDR-1(兔，Novus)、CYP3A4(兔，Cell Signaling)、R-spondin1(鼠，R&D Systems)、嗜铬粒蛋白A(小鼠，Abcam)、溶菌酶(兔，Abcam)、HLA DR+HLA DP(小鼠，Abcam)、OLFM4(兔，Abcam)、角蛋白20(兔，Cell Signaling)、GFAP(鸡，Abcam)。此外，小麦胚芽凝集素、 偶联物、L12492、 深红色和
R37112 ActinRedTM 555 试剂DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸
盐)均购自Life Technologies。
[0547] 猪模型中的药代动力学分析
[0548] 所有动物程序均按照麻省理工学院动物伦理委员会(Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care)批准的方案进行。对于组织实验，从当地屠宰场获得处死20分钟内的新鲜组织。
[0549] 扫描电子显微镜(SEM)分析
[0550] 将组织外植体于4℃下在PBS中的4％(v/w)福尔马林中固定2天。之后，将样品用去离子水洗涤五次，然后通过梯度乙醇(Sigma，ACS试剂99.5％)系列对于每个浓度(20、30、40、50、70、80、90、100、100、100％(v/v))脱水两次，每种溶液中2分钟。脱水后，将样品浸入六甲基二硅氮烷(Sigma)溶液中过夜。由于六甲基二硅氮烷的挥发性，溶液蒸发过夜产生干燥的组织块。使用JEOL5600LV SEM观察所制造表面的形态。在SEM下可视化之前，使用Hummer 6.2Sputter Coating System对所有样品进行碳溅射涂覆。将样品切成面积小于
0.5cm2，并用双面粘合碳导电胶带固定在铝棒上。
0.5cm2，并用双面粘合碳导电胶带固定在铝棒上。
[0551] 免疫组织化学染色
[0552] 室温下，将分离的绒毛和隐窝用PBS中的4％(v/w)福尔马林固定30分钟，用PBS洗涤，用0.25％(v/v)Triton-X-100/PBS透化2分钟，用PBS洗涤，然后用PBS中的4％(w/v)牛血清白蛋白封闭1小时。一抗和二抗在封闭缓冲液中于室温孵育2小时或4℃下孵育过夜。然后使用 Diamond Antifade Mountant(Thermo Fisher Scientific)将染色的细胞封固在盖玻片上。
[0554] 通过液氮中速冻在最佳切割温度(O.C.T.)制剂(Tissue- O.C.T.Compound，Finetek)中包埋的组织来生成组织外植体的冷冻切片。通过使用Cryostat产生
组织切片。将所得的组织切片在室温下用PBS中的4％(v/w)福尔马林固定30分钟，用PBS洗涤，用PBS洗涤，然后用PBS中的4％(w/v)牛血清白蛋白封闭1小时接着根据制造商的实验方案使用组织染料。
组织切片。将所得的组织切片在室温下用PBS中的4％(v/w)福尔马林固定30分钟，用PBS洗涤，用PBS洗涤，然后用PBS中的4％(w/v)牛血清白蛋白封闭1小时接着根据制造商的实验方案使用组织染料。
[0555] 显微镜分析
[0556] 使用具有10倍或20倍空气物镜的EVOS FL细胞成像系统对组织学切片进行光学显微镜分析。使用尼康A1R超快速光谱扫描共焦显微镜在Galvano扫描仪中使用20倍空气或60倍油浸物镜分析荧光样品。用NIS-Elements C软件和ImageJ分析所得的原始图像。
[0557] 肠组织外植体灌注实验
[0558] 为了组装肠组织外植体系统，根据描述的组织解剖程序从空肠制备新鲜分离的肠道组织，并使用通用的96孔板作为接收板( 孔板，透明底，Corning)或UV透明板( -孔UV板，Corning)安装在制造的界面设计上。空肠被确定为幽门后约
50cm的小肠区域。空肠和回肠之间的差异根据解剖位置、组织的结构差异、血液供应的差异和脂肪沉积以及淋巴样组织的存在来确定。对于384孔形式的系统，使用带玻璃底部的384微孔板(Greiner SensoplateTM玻璃底多壁板，Sigma)。然后根据所述的培养方案在该系统中将组织培养特定的离体培养时间。除非另有说明，否则仅在离体培养24小时后使用该系统进行一次肠灌注实验。
50cm的小肠区域。空肠和回肠之间的差异根据解剖位置、组织的结构差异、血液供应的差异和脂肪沉积以及淋巴样组织的存在来确定。对于384孔形式的系统，使用带玻璃底部的384微孔板(Greiner SensoplateTM玻璃底多壁板，Sigma)。然后根据所述的培养方案在该系统中将组织培养特定的离体培养时间。除非另有说明，否则仅在离体培养24小时后使用该系统进行一次肠灌注实验。
[0559] 对于灌注实验，使用以下设置：使用液体处理站(Evo 150液体处理平台，Tecan)制备制剂样品，使用自动分配器(EL406组合洗涤器分配器，BioTek Instruments)填充接收96孔板，然后使用微板阅读仪( M1000PRO，Tecan)进行分光光度分析。具体而言，按照实验方案制备制剂样品以将制备的赋形剂板混合10次，吸取适量的赋形剂并分配到具有已加入其中的适量化合物的96孔板中。然后将赋形剂/化合物制剂混合60次，和然后吸取适量并分配到组织外植体上。包括样品孵育的所有实验均在室温下进行。
[0560] 表观渗透率(Papp)值使用以下公式计算：
[0561]
[0562] 其中V是接收室中的体积，A是组织表面积，C0是供体室中的初始浓度，和ΔCR是在孵育时间Δt中接收室中浓度的增加。
[0563] 统计分析
[0564] 通过双侧非参数Spearman相关函数进行人体吸收与组织外植体的Papp或Caco-2的Papp相比的相关性。通过单因素ANOVA分析催产素体内药代动力学数据，然后进行Tukey和Bonferroni后验分析。为了进行制剂筛选分析，将赋形剂混合物中的两个成分处理为特征或个体，并使用基于Euclidian距离的上升层次聚类独立进行聚类，任选地根据矩阵的大小，先进行k-均值算法。然后根据相应的聚类对数据矩阵的行和列进行排列以使相似的列彼此靠近和相似的线彼此靠近。然后，将这数据显示在颜色编码的热图中以反映排列矩阵中的数据。
[0565] 实施例1：肠组织的离体培养系统
[0566] 为了确定肠组织是否可以以保持存活力和体内结构的方式培养，从新鲜获得的猪的完整胃肠道分离出小肠组织。发现肠组织外植体的存活力取决于具体的培养基组成(图1A)。在单独DMEM F12中和添加了FBS或EGF的DMEM F12中培养的组织之间没有观察到存活力差异。另外，图1B显示7天后有或没有培养基培养的小肠组织外植体的管腔侧的照片，表明外植体在具有培养基的情况下存活最好。发现基质(stroma)在离体培养中对于保持肠上皮的细胞存活是必不可少的(图1C)。对切片的肠组织外植体(用Dapi(蓝色，细胞核)、鬼笔环肽(绿色，F-肌动蛋白)、小麦胚芽凝集素(质膜，红色)和 (溶菌酶，紫
色)染色)进行的共焦分析显示完整的细胞达10周，而2-3周后组织形态表现出改变(图1D)。
此外，当在离体外植体培养之前去除基质层时，在相同培养条件下5天后未检测到完整细胞(图1D)。
色)染色)进行的共焦分析显示完整的细胞达10周，而2-3周后组织形态表现出改变(图1D)。
此外，当在离体外植体培养之前去除基质层时，在相同培养条件下5天后未检测到完整细胞(图1D)。
[0567] 另外，通过扫描电子显微镜(SEM)分析离体培养的肠组织外植体的绒毛-隐窝形貌以确定绒毛结构是否保持完整。图1E显示绒毛结构确实完整。
[0568] 培养3周或更长时间的组织的组织学分析表明，与新鲜组织相比，组织结构发生了变化。这些变化可能包括细胞外基质的降解和肠上皮细胞群体的变化，如图1F所示。此外，对来自年幼(约3周龄)或年老(约3个月大)动物的培养组织进行了组织学分析。图1G显示从年幼动物分离的组织中更完整的组织结构。
[0569] 为了研究离体培养引起的肠上皮的变化，研究了新鲜组织和离体培养7天的组织中各种各样的细胞类型标志物和药物运转体的表达水平。
[0570] 通过rtPCR分析基因表达。通过蛋白质印迹分析研究抗体可得的细胞标志物的蛋白质水平。具体地，将组织切成约30mg的块，随后立即将其在液氮中速冻并保存在-80℃。对于组织裂解，用1体积的冷PBS洗涤冷冻的组织，然后用含有蛋白酶抑制剂(HaltTM蛋白酶抑制剂混合物，ThermoFisher)的2倍体积新鲜制备的RIPA裂解和提取缓冲液(Cell Signal)洗涤。用手动马达将组织裂解30秒的3-5各个循环，然后在冰上冷却30秒直至组织完全均质化。将裂解物在4℃下以1200rpm离心30分钟，并将所得的上清液转移至新的小瓶中。然后根据制造商的方案通过BCA分析(PierceTM BCA蛋白分析试剂盒，ThermoFisher)分析裂解物的总蛋白浓度。对于SDS-PAGE，将每组组织蛋白(在含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，pH 7.5中约500μg)在含有β-巯基乙醇的浓缩(2x)Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)中混合。将样品在95℃下加热5分钟，然后在pH 8.0的SDS-Tris-甘氨酸缓冲液中在含3.5mM SDS的12％聚丙烯酰胺凝胶中以120伏电泳90-120分钟。将蛋白质在200毫安下转移到甲醇活化的PVDF膜上1-3小时。在5％BSA封闭后，将膜与一抗(1：200作为工作浓度)在4℃下孵育过夜，然后与抗-小鼠(1：3000，Abcam)或抗-兔(1：2000，Abcam)二抗在室温下孵育3小时。根据生产商的方案使用Bio-Rad成像仪检测目标蛋白。
[0571] 对于所有分析的标志物，观察到离体培养物与新鲜收获的组织相比相似的基因和蛋白质表达(图1H)。尾型同源盒2(CDX-2)、角蛋白20(KRT20)以及脂肪酸结合蛋白1(FABP-1)以及肠上皮细胞间粘附标志物(ZO-2和E-钙粘蛋白以及各种Claudins)的存在证明了分化的肠上皮的完整性。含有富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGFR5)和嗅质蛋白4(OLFM4)的存在表明肠干细胞在组织外植体中。Claudin-1和胰高血糖素样肽1(GLP-1)的存在表明内分泌细胞在组织外植体中。波形蛋白的存在表明组织外植体中存在微皱褶细胞(M细胞)。粘蛋白2(MUC-2)的存在表明杯状细胞在组织外植体中。溶菌酶1的存在表明Paneth细胞在组织外植体中。巢蛋白和突触素(SYP)的存在表明神经元细胞在组织外植体中。重要的是，未观察到各种肠道药物运转体的蛋白质浓度有明显变化(即，ABC药物外排转运蛋白MDR-1、小管多特异性有机阴离子转运蛋白2(ABCC3)、多药耐药相关蛋白2(MRP-2)、肽转运蛋白1(PEPT-1)、乳腺癌抗性蛋白(BCRP)、有机阳离子转运蛋白1(OCT-1)、有机溶质转运蛋白亚基α(OST-α)和单羧酸转运蛋白(MCT-1))。有趣的是，根据蛋白质印迹分析(图1H和1I)，离体培养的组织保持恒定水平的分泌的Wnt3a和R-Spondin-1，其中Wnt3a显示长达3周的分泌(图1I)。Wnt3a和R-Spondin-1是经典Wnt/β-连环蛋白途径的可溶性配体，并据报道在保持肠道干细胞功能和存知力中起着重要作用。此外，在长期离体培养后，但仅在不去除基质层的情况下，从肠上皮中分离出完整的绒毛和隐窝(图1J)。
[0572] 而且，通过免疫组织化学分析切片的肠组织外植体(数据未显示)。在新鲜分离的和离体培养7天的组织中都通过波形蛋白染色观察到固有层中波形蛋白-间质细胞。在CDX-2染色中发现了相似的结果，在分化的肠上皮的细胞核中具有CDX-2信号的特征性累积。发现其他成熟肠上皮标志物(FABP-1和KRT20)对肠上皮是特异性的，但在新鲜切除的和离体培养的组织之间显示出各种信号强度。重要的是，E-钙粘蛋白染色显示离体培养7天后组织外植体中完整的细胞间粘附，与新鲜分离的组织相比无明显差异。还发现Wnt3a存在于肠隐窝中，且与新鲜组织相比，在离体培养的组织中观察到相似数量的杯状细胞。
[0573] 使用硫氧还蛋白还原酶活性测定试剂盒(Thioredoxin Reductase Activity Assay Kit，目录号68AT-ThioRed-S100，Ray Biotech)测量了硫氧还蛋白还原酶活性的生物活性分析，其是参与许多细胞过程(例如，细胞生长、抗氧化应激保护)的遍在的酶。如图1K所示，在新鲜组织裂解物或离体培养长达7天的组织之间无显著差异。还使用蛋白酶活性测定试剂盒(Protease Activity Assay Kit，目录号68AT-Protease-S100，RayBiotech)研究了蛋白酶活性。在新鲜组织和离体培养7天的组织之间没有观察到显著变化(图1K)。此外，确认了代谢酶细胞色素P450 3A4(CYP3A4)和尿苷5’-二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)的活性(图1K)。有趣的是，该活性表现为在新鲜切除的组织和离体培养7天的组织外植体之间波动。
[0574] 这些结果表明肠组织外植体可以长期离体保持，并且在上皮和粘膜内保留组织结构和特定细胞类型约2-3周。此外，发现肠组织外植体的离体存活力取决于保持下层基质完整、培养条件和最佳培养基组成。
[0575] 实施例2：肠组织外植体平台开发
[0576] 接下来，研究了在高通量平台中实施例1的肠组织外植体的使用。设计了一个用于肠组织外植体培养的接口平台，其可实现与长期的组织培养能力结合的高通量的肠药物灌注测量。具体而言，系统地评估了用于潜在接口系统的广泛的不同设计和材料。如图2A所示，开发了能够实现低样品变异性、组织存活力保持、快速组装和与机器人处理相容的系统。该设计由以96孔板的形式使肠组织区室化的上部装置组成。该组织形成多孔板的底部，并通过在组织下方使用附加装置在96孔中的每一个周围密封。该系统由外壳封闭，该外壳可调节压力以将系统保持在适当位置以进行机器人操作。
[0577] 更具体地说，接口设备由标准的96孔板、薄的中间板和上载荷板组成。将肠组织置于中间板的通孔上。将上载荷板放置在组织上，其将组织压缩到中间板上并围绕通孔。基于上层板保持的压力，建立密封。在原型阶段使用了几种制造方法。使用的设备包含3D打印机(Stratasys Objet30 Pro)、水刀(OMAX MicroMax)和激光切割机(Universal VLS6.60)。对于上载荷板，使用3D打印机为96孔形式打印了从3mm到5mm的不同直径的柱。在测试过程中添加了附加重量以补偿3D打印机聚合物的轻重量。最终设备使用具有4mm柱的铝合金制造。铝板由Proto Labs Inc.通过直接金属激光烧结(DMLS)提供。通过来自上层板的力，放置在中间板上的组织略微凹入每个孔中。探索了中间板的厚度、刚度和通孔直径以优化此条件。
由于其刚性和可加工性，使用了数种材料，包括铝和丙烯酸。水喷射切割铝板，而激光切割丙烯酸板。探索在1mm和2mm之间的板厚度，并选择1mm。中间板的直径被设计为大于上载荷板的直径，因此组织可以放置在上层板和中间板之间。探索了从6.5mm到8mm的几种直径，并选择了6mm的直径。
由于其刚性和可加工性，使用了数种材料，包括铝和丙烯酸。水喷射切割铝板，而激光切割丙烯酸板。探索在1mm和2mm之间的板厚度，并选择1mm。中间板的直径被设计为大于上载荷板的直径，因此组织可以放置在上层板和中间板之间。探索了从6.5mm到8mm的几种直径，并选择了6mm的直径。
[0578] 该装置的上段和下段之间的界面的开发包括确定上段的最佳几何形状和组织上的压力以最小化孔间泄漏。图2B示出6mm直径导致最小的泄漏。为了了解压力对与药物相互作用区域的影响，对该设备进行的精细元件分析显示了组织中的不均匀应变分布。使用了有限元软件包COMSOL Multiphysics/Structural(COMSOL 5.2,Stockholm,Sweden)。由于系统的对称性，对在组织上具有周期性边界条件的单孔系统进行了建模。使用各向同性的近不可压缩超弹性(neo-Hookean)模型捕获组织行为，剪切模量为μ＝3160Pa，和κ/μ＝50，其中κ是组织的体积模量。由于板比组织硬得多，因此上下两个板都被认为是刚性的。通过线性六边形元件的精细网格对组织进行建模。使用惩罚技术对组织与板之间的接触进行建模。结果表明，与孔板周围的组织相比，位于每个孔内的组织区域受到的机械影响明显较小(参见图2C)。
[0579] 而且，基于磁体的接口系统被设计为通过磁压缩来密封孔。如本文所述，板的重量、尺寸和形状被专门设计成与机器人筛选平台完全对接。随时间测量使用该接口的具有或不具有葡聚糖(4kDa)的FITC的灌注分析。此外，还分析了FITC在多个实验中的灌注变异性，以及使用的不同磁体强度变化的FITC在6小时内的孔间泄漏。图2D显示基于磁体的接口系统提供可再现性，并且适用于本文所述的方法。
[0580] 接下来，通过分析荧光素(FITC)的灌注研究了有或无外肌肉和浆膜的肠组织之间的信号变异性。加入药物后，测量上层板和下层板之间的浓度差异以计算1-2小时内药物通过肠组织的灌注速率。当在组织分离过程中除去外肌肉和浆膜时，信号变异性降低(图2E)。相对标准偏差(σ)显示，在去除外肌肉和浆膜后，分析的480个样品上的变异性降低了。
[0581] 还研究了灌注和实验变异性。首先，分析了在一定压力范围下FITC在具有或不具有各种分子量的葡聚糖的情况下通过肠组织的灌注。如图2F所示，在整个组织板上施加5N的力时，通过相对标准偏差测量的样品变异性最低。接下来，用广泛分子量的模型化合物(FITC、葡聚糖、催产素和胰岛素)，和用来自不同动物、小肠的空肠内不同区域的肠道组织以及不同的孵育时间进行了灌注实验。在一个数据集中来自6个不同动物批次的500个单独测量产生所有不同模型药物的约20％的相对标准偏差(σ)(图2G)。还对siRNA的灌注进行了研究，并产生约25％的相对标准偏差(数据未显示)。出乎意料的是，在7天的时间过程中多次将组织重新用于灌注实验不会影响灌注结果(图2H)。最后，在有或没有葡聚糖的情况下进行FITC的灌注时延分析。图2I显示2个小时内的96个单独时延，表明可以通过连续取样进行动态测量。
[0582] 此外，在系统中测试了来自胃肠道的其他组织，包括胃、十二指肠和结肠。图2J显示了这些组织的切片的H&E染色，而图2K显示了离体培养1周和3周的这些组织的LiveDead分析。这些结果表明来自胃、十二指肠和结肠的组织可以在系统中保持。图2L显示了在2小时内通过各个组织的FITC和FITC-葡聚糖4kDa的灌注，表明这些组织可用于灌注研究。尽管根据所使用的组织观察到不同的渗透率值，但这些差异在所使用的不同模型药物之间并不相关，表明差异并非仅归因于一种特定因素，例如不同的表面积。
[0583] 另外，测试了该组织在384孔系统中使用的能力。所制造的装置包含具有2mm至3mm直径的柱的上载荷板和具有玻璃底的384微孔板(Greiner SensoplateTM,Sigma；图2M)。在2小时内测量FITC和FITC-葡聚糖4kDa的灌注。如图2N所示，对来自2个不同动物批次的500个样品进行测试时，相对标准偏差约为30％，这表明系统可以增加到384孔。
[0584] 总体而言，这些结果表明本文所述的肠组织外植体能够用于高通量系统中。
[0585] 实施例3：肠组织外植体系统肠吸收验证
[0586] 食品药品监督管理局(The Food and Drug Administration，FDA)建议使用已获批准用于口服的具有人类临床药代动力学数据的药物以验证体外肠道灌注系统的体内可预测性(Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Sold Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics
Classification System,U.S.Dep.Heal.Hum.Serv.Food drug Adm.Cent.Drug
Eval.Res.,2000)。因此，为了确认肠组织外植体作为预测肠吸收的系统的使用，对60种模型药物的灌注进行了分析。具体而言，使用了来自4种生物制药分类系统(BCS)种类的药物(BCS I类16个，BCS II类13个，BCS III类15个和BCS IV类12个)以及4种基于葡聚糖的对照物质。根据先前公布的数据，将从肠道组织外植体系统获得的肠灌注数据与人体肠吸收进行比较。为了定量检测每种模型药物，建立了分光光度检测方法和校准曲线(数据未显示)。
分析了来自6只不同动物的数据以确定批次间的变异性。图3A显示了结果，其中方框图显示了重复进行的6个独立实验的数据，并且近似的人体内肠道吸收被显示为所施用的总药物的百分比。通过肠组织外植体系统获得的灌注值使得能够预测所有测试的模型药物的近似吸收范围。图3B示出了平均肠灌注值与所报告的人吸收数据之间的相关性，提供了0.906的Spearman相关系数。使用小肠的其他部分(即十二指肠、空肠和回肠)也发现了相似的结果(图3C)。
Classification System,U.S.Dep.Heal.Hum.Serv.Food drug Adm.Cent.Drug
Eval.Res.,2000)。因此，为了确认肠组织外植体作为预测肠吸收的系统的使用，对60种模型药物的灌注进行了分析。具体而言，使用了来自4种生物制药分类系统(BCS)种类的药物(BCS I类16个，BCS II类13个，BCS III类15个和BCS IV类12个)以及4种基于葡聚糖的对照物质。根据先前公布的数据，将从肠道组织外植体系统获得的肠灌注数据与人体肠吸收进行比较。为了定量检测每种模型药物，建立了分光光度检测方法和校准曲线(数据未显示)。
分析了来自6只不同动物的数据以确定批次间的变异性。图3A显示了结果，其中方框图显示了重复进行的6个独立实验的数据，并且近似的人体内肠道吸收被显示为所施用的总药物的百分比。通过肠组织外植体系统获得的灌注值使得能够预测所有测试的模型药物的近似吸收范围。图3B示出了平均肠灌注值与所报告的人吸收数据之间的相关性，提供了0.906的Spearman相关系数。使用小肠的其他部分(即十二指肠、空肠和回肠)也发现了相似的结果(图3C)。
[0587] 为了比较目的，将组织外植体系统的体内预测性与Caco-2Transwell灌注测定法的体内预测性进行了比较。对小组中使用的每种药物进行了Caco-2 Transwell药物渗透性的系统性文献分析。平均Caco-2渗透率值与人吸收数据比较产生0.302的Spearman相关系数(数据未显示)。研究了肿瘤衍生的Caco-2细胞系固有的基因组不稳定性可能增加由药物运转体表达水平的差异性引起的转运变异性的可能性。与被动吸收的药物相比，发现主动吸收的药物的平均变异系数(CV)大约高出两倍(数据未显示)。相比之下，在组织外植体系统中的6只独立动物的CV在主动和被动吸收药物之间相似，支持Caco-2细胞的基因组不稳定背景似乎增加主动转运药物的变异性的假说。
[0588] 此外，发现组织外植体可用于使用荧光MDR-1特异性底物的MDR-1药物运转体抑制剂研究。一旦MDR-1特异性底物被组织吸收，它就会发出荧光。将底物与各种浓度的底物竞争性抑制剂，维拉帕米(verapamil)，共同温育导致剂量依赖性摄取，其随维拉帕米浓度的增加而增加(图3D)。
[0589] 另外，研究了组织外植体在研究药物-食物相互作用中的用途。已知药物-食物相互作用在药物吸收中起重要作用。具体地，天然肠液包含消化的食物、粘液和细菌，并因此影响肠吸收。与Caco-2Transwell灌注分析不同，通过肠组织外植体系统的模型药物灌注能够在天然肠介质存在的情况下进行分析。从分离组织外植体的同一动物的空肠内腔中收集天然肠液。用PBS以1∶4的比例稀释流体，并在-20℃下储存直至需要。将模型药物直接溶解在肠液中，涡旋60秒，和然后添加到组织外植体中。如图3E所示，大多数药物在天然肠介质中显示出较低或较高的药物吸收，从而强调了在有或没有食物的情况下分析药物吸收的重要性。
[0590] 除了在小肠中吸收的药物总量外，吸收速率是另一个重要因素。FDA处方药标签根据人体的血浆峰值水平将药物分为慢速、中等或快速三种。在肠组织外植体系统中对模型药物进行时延灌注分析以建立吸收动力学。图4显示，使用肠组织外植体系统的时延分析证实了对于缓慢、中度和快速吸收药物的非常清晰的吸收-时间曲线，并因此该系统可以准确预测人体体内吸收动力学。
[0591] 为了比较目的，使用了预测模型药物的肠道吸收的计算分析技术。具体而言，评估了admetSAR，一种由drugbank.ca使用的模型，和基于Lipinski的“rule of five violations”的预测(Lipinski,C.A.等,Adv.Drug Deliv.Rev.Vol.23:3-25,1997)。对于所分析的模型药物集，这两种方法均未显示与人吸收数据的任何相关性，这表明这些系统的预测能力非常低(数据未显示)。
[0592] 实施例4：肠组织外植体平台上催产素口服制剂的开发
[0593] 与当前的技术相比，除了提供更高的体内预测性之外，肠组织外植体系统的优势还在于其与高通量筛选的相容性。为了检查组织外植体系统在口服制剂开发中的潜能，对肽类药物催产素(其目前由于低肠道渗透性而无法用于口服)用基于GRAS(通常公认为安全)的赋形剂库进行了大规模的吸收筛选，，其是已知的吸收促进剂或对肠吸收的作用未知。来自多种化学组的2976种共赋形剂制剂水溶液与Alexa488共轭的催产素一起使用。如图5A所示，几种制剂表现为使催产素的灌注增加几倍。这些制剂包含亲水性聚合物、表面活性剂和胆汁酸组合。针对初始筛选命中进行了额外的筛选和验证实验(数据未显示)。聚乙烯亚胺(800Da，封端的)以浓度依赖性方式一致地使催产素的肠灌注增加数倍(图5B)。另外，用其他模型药物(包括Alexa488-替考拉宁(teicoplainin)、Alexa488-卡贝缩宫素和Alexa488-胰岛素)测试了该制剂，并且根据所用的药物，肠吸收似乎有不同程度的增加(图5C)。所测试的其他聚乙烯亚胺变体没有显著增强所测试的各种药物的肠吸收(图5D)。有趣的是，当与聚乙烯亚胺一起配制时，对于催产素类似物卡贝缩宫素观察到肠灌注的有限增加(图5C)。此外，使用制剂的亚组，研究了Alexa488共轭催产素的荧光检测与未标记催产素的ELISA检测之间的相关性以解决以下问题：使用荧光标记的催产素的吸收测量不能测量完整的催产素，并且荧光标记可能影响催产素灌注。初始筛选中鉴定的大多数制剂通过ELISA分析确认(数据未显示)。
[0594] 体内进行药代动力学验证。使用重量在45至50公斤之间的Yorkshire母猪。在每次实验之前，将动物禁食过夜，并在手术当天禁食早晨饲料。向动物肌内注射特拉唑(替拉明/唑拉西坦)5mg/kg，甲苯噻嗪2mg/kg和阿托品0.04mg/kg进行镇静。内窥镜下进入十二指肠，并将制剂直接递送至十二指肠。从外周静脉进行连续血液采样以定量催产素。对于催产素血清定量，根据制造商的方案使用催产素ELISA试剂盒(目录号ab133050，Abcam)。发现单独催产素的绝对生物利用度为0.64％，而催产素-PEI(800Da，封端)和催产素-矿物油(筛选的另一命中)制剂导致平均口服生物利用度为3.8％和2％，与未配制的催产素对照相比，分别显示出6和3倍的增强(图5E)。为了研究吸收增强的机制并从组织学角度分析该制剂对小肠的潜在局部作用，开发了一种与定制的装置偶联的外科程序，其使得该制剂能够受控地暴露在肠道组织的特定区域上。活检标本的E-钙粘蛋白染色切片用于分析细胞间粘附的破坏。与未配制的催产素和未处理的对照相比，暴露于催产素-PEI(800Da，封端)和催产素-矿物油的混合物的肠上皮显示细胞间粘附没有差异(数据未显示)。
[0595] 用作为蛋白质生物制剂代表的胰岛素和制剂库进行了另外的高通量筛选以鉴定肠吸收的增强者(数据未显示)。
[0596] 总体而言，这些结果表明肠组织外植体系统可用于高通量筛选，并且可以准确地鉴定增强吸收的制剂。
[0597] 实施例5：用于肠组织外植体平台的表达调节的核酸递送
[0598] 鉴于肠组织外植体系统的扩展离体存活力，调查了使用RNAi核酸的表达调节以研究用于功能性药物吸收研究的特定药物运转体或代谢酶的作用。如通过基于共焦显微镜的荧光标记siRNA分析所评估的，发现超声介导的siRNA递送是最有效的转染方法(与脂质体转染相比)(图6A)。具体而言，通过应用其中使用单独的超声发生器(Sonics and Materials，Inc.)和定制的96头探针产生的40kHz持续1分钟，间隔5秒，使用超声将siRNA传递至组织外植体。使用在去离子水中1μm浓度的以下siRNA： Select Pre-
Designed siRNA(siRNA ID：s3846，Gene Symbol：CYP3A4)， Select Pre-
DesignedbsiRNA(siRNA ID：s10419，Gene Symbol：ABCB1)， Select阴性对照1
号siRNA。外排药物运转体MDR-1以及代谢酶CYP3A4的敲低通过蛋白质印迹分析证实，并如图6B所示进行定量。用雷尼替丁和奎宁(分别为MDR-1和CYP3A4的已知底物)进行的随后灌注实验导致灌注的显著变化(图6C)。
Designed siRNA(siRNA ID：s3846，Gene Symbol：CYP3A4)， Select Pre-
DesignedbsiRNA(siRNA ID：s10419，Gene Symbol：ABCB1)， Select阴性对照1
号siRNA。外排药物运转体MDR-1以及代谢酶CYP3A4的敲低通过蛋白质印迹分析证实，并如图6B所示进行定量。用雷尼替丁和奎宁(分别为MDR-1和CYP3A4的已知底物)进行的随后灌注实验导致灌注的显著变化(图6C)。
[0599] 这些结果表明，本文所述的肠组织外植体系统可用于研究药物运转体和代谢酶对通过小肠的药物吸收的影响。此外，这些结果证实了肠组织外植体系统在基因工程中的用途。
[0600] 实施例6：肠组织外植体平台上反义寡核苷酸口服制剂的开发
[0601] 如实施例3和4中所述，发现本文所述的组织外植体预测体内肠吸收，并可用于分析蛋白质或肽药物制剂的高通量能力中以增强这种肠吸收。为了进一步研究组织外植体的有用性，研究了反义寡核苷酸吸收的增强。
[0602] 寡核苷酸在富含酶的胃肠道中显示低稳定性，不能通过粘液层，并且显示出非常差的GI吸收(Ensigna，L.等人，Adv Drug Deliv Rev.Vol:64(6):557-570,2012；Thomsen，TB等，Nanoscale,Vol.6(21):12547-12554,2014)。荧光偶联的反义寡核苷酸(AON)用于检测蓄积和通过组织外植体的灌注。具体地，发现通过对不同动物批次和空肠部分上的6-羧基荧光素(FAM)标记的AON进行测量来评估时，用组织外植体进行的自动高通量动力学灌注分析是高度可再现的(图7A)。
[0603] 开发了基于高通量分光光度法的读数方法来测量FAM-AON组织，并通过基于共焦显微术的信号检测进行了验证(数据未显示)。在多个动物批次和空肠各个区段上仅FAM标记和FAM-AON的自动化高通量寡核苷酸顶端和基质组织蓄积测量证实低变异性和高再现性(图7B)。
[0604] 分析建立后，使用针对两个靶基因的FAM标记的AON制剂进行筛选实验。同时实时测量肠灌注和组织吸收。利用了定制设计的多样的化学化合物库，其代表了广泛的化学特性，以鉴定调节局部肠组织摄取用于进行局部治疗(定义为“肠吸收”)或通过肠道组织渗透进入系统循环(定义为“肠灌注”)的化合物。图7C提供的图显示了相对于组织灌注增强剂的组织蓄积增强剂。
[0605] 此外，开发了一种使得能够评估荧光标记AON在天然肠粘液中随时间的3D位移的4D共焦成像技术，以测量粘液内的扩散。建立了在新鲜收获的天然猪肠道粘液中均匀分布的FAM-AON的检测。在粘液层顶部添加FAM-AON溶液，然后进行4D共焦成像显示随时间的清晰信号位移(数据未显示)。研究了各种制剂的粘液扩散变化，发现那些导致扩散多倍增加的制剂与洗掉粘液层的肠组织上具有完整粘液层的肠道组织的渗透率和吸收的增加比率相关(数据未显示)。
[0606] 在对制剂进行验证分析后，选择一组用于未标记的AON，并在Yorkshire猪中胃肠道递送后测试局部胃肠道治疗功效。通过ISH染色对来自处理区域的活检样品进行组织学分析以研究完整AON的摄取，以及通过rtPCT确认功效。图7D显示了配制的AON的功效，而未配制的AON与未处理的对照对比没有作用。
[0607] 这些结果表明，肠组织外植体可用于反义寡核苷酸的高通量筛选，并且可以准确地鉴定增强敲低功效以及组织蓄积和/或组织灌注的制剂。
[0608] 实施例7：肠组织外植体平台上的吸收-溶出分析
[0609] 接下来，研究肠组织外植体在同时评估目的化合物的溶出和吸收方面的用途。剂型中化合物的有效性取决于吸收到全身循环中之前在胃肠道流体中溶解的药物。溶出是用于测量药物从剂型释放的速率的标准化方法。目前正在开发的药物中70％被归类为BCS II类(低溶解度/高渗透性)。专注于提高溶解度的制剂的问题在于，它可能会影响渗透性。因此，同时分析制剂对溶出和吸收的影响是理想的。
[0610] 为了研究肠组织外植体在同时评估溶出和吸收中的用途，采用以下方法：(1)药物+溶剂的组合以形成高浓度的可溶性药物的溶液；(2)溶液蒸发以形成药物粉末；(3)将药物粉末与赋形剂库在水性缓冲溶液或天然胃肠液中组合；(4)通过离心分离可溶和非可溶药物；(5)分光光度法检测上清液中的药物浓度以得到溶出数据；(6)使肠组织外植体与上清液接触；和(7)分光光度法检测灌注的药物浓度(即实施例2和3中所述的吸收分析)。用吲哚美辛与SDS进行该方法的验证。图8提供了溶出数据(左)以及溶出和吸收数据的比较(右)。可以确定增加溶出和吸收两者的制剂。
[0611] 此外，使用吲哚美辛、美洛昔康和呋塞米进行同时溶出和吸收高通量筛选。吲哚美辛和美洛昔康是BCS II类药物，而呋塞米是BCS IV类药物(低溶解度/低渗透性)。基于该筛选，进一步测试了美洛昔康的几种制剂。图9显示了在肠液存在下，赋形剂对固定药物浓度(20mg/ml)的美洛昔康的吸收的剂量依赖性影响。图10显示了使用不同浓度的药物-赋形剂制剂(以恒定比率)以模拟在肠中的稀释的吸收。非是改变组织区域，这可以保持系统的高通量能力。具体而言，系统地改变药物和赋形剂的浓度以模拟胃肠道内表面积的变化。可以在任何运输缓冲液以及天然胃肠液中制备药物赋形剂溶液。根据药物的水溶性极限确定最高的药物赋形剂浓度。所使用的浓度包括高于在水中的药物溶解度极限的浓度和在溶解度极限内的浓度。该分析法能够分析难溶性药物的制剂依赖性肠药物吸收增强作用，并发现它取决于制剂所暴露的表面积。
[0612] 这些结果表明肠组织外植体可用于鉴定以高通量和有效方式增强溶出和吸收的制剂。
[0613] 实施例8：肠组织外植体平台中的内分泌刺激筛选
[0614] 如实施例1中所测定的，肠组织外植体包含内分泌细胞，其由Claudin-1和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的表达来确定。因此，研究了肠组织外植体对已知的GLP-1刺激物反应的能力。具体而言，将乙酰胆碱、LiCl和葡萄糖以不同的剂量添加到肠组织外植体中24小时，然后分离肠上皮顶侧内的细胞。通过ELISA分析测定这些细胞裂解物的GLP-1活性裂解肽(GLP-1(7-36))的浓度。如图11所示，发现肠组织外植体响应于已知刺激物以剂量依赖性方式显示出浓度升高的GLP-1(7-36)。乙酰胆碱、LiCl和葡萄糖的GLP-1分泌刺激(它们通过不同的途径起作用)表明这些途径在肠道组织外植体中是完整的。乙酰胆碱和LiCl充当GLP-1的非营养刺激物，其据报道通过神经元调节来刺激GLP-1活性。葡萄糖通过基于营养物的途径触发GLP-1活性。
[0615] 基于这些结果，测试了基于激酶库的600种化合物的筛选和240种GRAS/非活性成分化合物的GLP-1刺激(数据未显示)。GLP-1刺激物可用于各种治疗应用，包括2型糖尿病和肥胖症。
[0616] 这些结果证实了肠组织外植体中反应性内分泌细胞的存在，以及该组织外植体在鉴定刺激GLP-1分泌的制剂中的有用性。
[0617] 实施例9：肠组织外植体平台的毒性筛选
[0618] 胃肠道副作用在几乎所有口服药物中都常见。据估计，胃肠道副作用占药物引起的不良反应(DIAE)的20-40％。在美国，DIAE每年导致100,000例死亡，占所有住院人数的5％。需要降低现有药物的胃肠道副作用的方法，但是测试局部胃肠毒性的挑战构成了主要障碍。因此，研究了肠组织外植体用于测试和预测胃肠毒性的用途。
[0619] 为了测定肠道组织外植体对毒素的反应性，在暴露于化学物质24小时后，在胃肠道的各个节段进行了基于刃天青的存活力分析。刃天青是一种氧化还原指示剂，并且已经建立了哺乳动物细胞的存活力分析法。在代谢细胞中，刃天青不可逆地还原为粉红色和高度红色荧光的试卤灵。图12显示了使用新鲜培养或在暴露前离体培养24、48或72小时的组织，在肠道组织中剂量依赖性化学诱导的减少。有趣的是，在初始化学暴露之后，观察到离体培养的组织外植体的测量存活力的恢复(数据未显示)。图13显示了源自食道、胃或小肠并用乙醇、甲醇或福尔马林处理的胃肠组织外植体的组织存活力的剂量依赖性化学诱导的降低。将组织在接收腔室中包含培养基的多孔板中孵育，而各种化学品在供体腔室中以PBS中的不同浓度孵育。24小时后，通过基于刃天青的存活力分析测量存活力。
[0620] 一旦确定组织外植体可以检测药物诱导的毒性，就分析其与人体中局部药物诱导的胃肠毒性的相关性。具体而言，对报道的所有已批准药物的副作用进行了系统分析。基于此分析，测试了一组明确分类为具有局部胃肠毒性或无胃肠道副作用的药物。在肠组织外植体上用这些药物与3种不同的细胞系(HT29-MTX-E1；C2BBe1；HeLa)一起分析剂量依赖性存活力分析(图14)。比较表明，基于细胞的毒性分析与人体局部胃肠毒性之间很少或没有相关性。
[0621] 在确定肠组织外植体可以预测人体中局部药物诱导的胃肠毒性后，该系统用于大规模筛选分析以研究是否可以通过赋形剂共制剂来调节现有药物的药物诱导的局部胃肠毒性。使用了用于多种病症的并显示出局部胃肠道副作用的15种口服药物：抗生素(头孢泊肟和多西环素)；非甾体抗炎药(美洛昔康、美沙拉嗪、萘普生、吲哚美辛)；双膦酸盐(依替膦酸)；支气管扩张剂(茶碱)；抗病毒药(替诺福韦和奥司他韦)；血管扩张剂(他达拉非)；利尿剂(阿米洛利)；以及质子泵抑制剂(奥美拉唑)；药物与定制组装的化合物库共同配制，该库为GRAS列表的或用作经批准用于口服的非活性成分。在测量药物吸收的同时，同时筛选了药物诱导的胃肠毒性。
[0622] 观察到局部胃肠药物毒性的制剂依赖性差异，并且发现其是药物依赖性的(未发现数据)。制剂依赖性存活力的变化与药物吸收之间没有明确的相关性，表明存活力的变化不能仅通过改变的药物灌注来解释(数据未显示)。
[0623] 萘普生和多西环素的筛选结果在肠道组织外植体中验证。图15显示，与单独药物的施用相比，测试的三种不同制剂显著改善了存活力。通过对各种细胞毒性标志物(切割的半胱天冬酶3、切割的层粘连蛋白A和磷酸化的组蛋白H2B)进行免疫生物学定量以及通过病理学家的病理学评估证实了组织存活力。
[0624] 总体而言，这些结果表明肠道组织外植体可以准确预测人体中的胃肠毒性，并可以用于筛选降低毒性的制剂。
[0625] 实施例10：在基质上的组织外植体的分析
[0626] 为了分析源自大型哺乳动物的胃肠道的组织外植体是否与本文所述的基质平面接触，可以采用几种方法。
[0627] 具体地，将含有标志物(例如染料)的溶液添加到与基质接触的组织外植体中以观察标志物在与基质接触的区域内组织表面上的均匀分布。例如，将溶液添加到包含微孔的基质的微孔中。含有易于沾染组织外植体表面的标志物(例如荧光团或有色化合物)的水性溶液使得能够通过照相检查、分光光度法或基于激光扫描仪的技术在组织表面上进行检测。例如，可以使用在PBS中浓度为0.1mg/ml的荧光标志物荧光素。将荧光素溶液添加到组织外植体中(例如，在基质的微孔内)，孵育30分钟，洗涤并随后通过分光光度法和通过使用共焦显微镜进行分析。如果该区域(例如微孔区域)内荧光信号的变异性与完全浸没在荧光素溶液中的未安装组织的等同区域相比没有显著差异，则认为组织外植体与基质处于平面接触。
[0628] 可选地，组织外植体与基质的平面接触可以通过用标志物(例如染料)涂覆装置的表面以观察不在基质接触的区域内(例如，在包含微孔的基质的微孔内)的组织区域的组织表面上标志物的均匀分布(或图案)来确定。具体地，装置面向组织的整个区域覆盖在装置的表面上形成均匀层的标志物。当处于紧密接触时，该涂层将组织染色。一旦装置和组织分离，在组织上产生的染色保持完整，并随后可以通过目视检查进行分析。例如，装置的表面涂覆一层均匀的市售组织学染料，例如CDI’s Tissue Marking(Cancer Diagnostics Inc.)。然后，以该装置-组织组件意图如何使用的方式，将涂覆的装置与组织精确地组装。之后，将装置与组织分离，并通过摄影术分析组织上的颜色标记。如果组织在整个组织上显示出与基质设置(例如，微孔设置)相关的规则标记图案，则组织外植体与基质平面接触。
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