一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备
方法
技术领域
背景技术
[0002] 小反刍兽疫(PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的以发热、口炎、腹泻、
肺炎为特征的急性、高度
接触性传染病，给畜牧养殖业造成严重的经济损失。OIE将该病列为A类烈性传染病，我国将其列为Ⅰ类动物疫病。2007年7月，我国西藏阿里首次暴发了PPR。中国农业部立即公布了
预防和控制PPR国家技术规范、预防和控制PPR应急计划，并从2008年在全国实施PPR监控策略。
[0003] 我国目前采取弱毒
疫苗(Nigera75/1)接种预防PPR，该疫苗免疫效果较好，但由于带毒与排毒给
疾病的诊断及检测带来困难。活疫苗诱导
机体，与病毒灭活疫苗相比，有高的和潜在的毒
力返强现象，全病毒灭活疫苗将是一个更安全的替代品。当前还没有商品化的PPR 灭活苗、痘载体疫苗等，也没有关于PPRV蛋白单抗制备的相关研究，但PPR疫苗研究趋向于基因工程苗和灭活苗。
[0004] 应用现有RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒总RNA中扩增V基因
片段924bp(代HA标签)，克隆至pGEX-4T-1载体中，原核表达PPRV蛋白，纯化蛋白，制备了V蛋白单抗，为PPR的诊断与预防提供技术
支撑。
[0005]
现有技术中，还没有关于一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法的相关报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法。
[0007] 其具体技术方案为：
[0008] 一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：
[0010] 根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp。应用DNAStar
软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点。上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI。下游引物加HA标签，HA序列为：TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT，HA标签反转录序列：AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA。
[0011] 根据Oligo 7软件设计V基因引物，上游引物P1：
[0012] AACCGAATTCATGGCAGAAGAACAAGCATACCAT；下游引物加HA标签如下，
[0013] P2：ATTTCCCGGGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCTGAGTCAGTGATGC。
[0014] 突变引物M1：
[0015] 突变引物M2：方框里的
碱基是V基因的突变点。引物由上海
生物工程有限公司合成。
[0016] (二)Nigera75/1疫苗毒(本实验室保存)RNA的提取：
[0017] TRIzol LS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶。
[0018] 1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液250ul，再加入TRIzol LS 750ul，充分混匀，室温放置5min；
[0019] 2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)，室温放置3min(由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心)；
[0020] 3、4℃，12000r/min离心15min，取上层液
相移入另一管(切忌吸动白色中间相)；
[0021] 4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；
[0022] 5、4℃，12000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清；
[0023] 6、加1ml75％
乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在室温干燥5min；
[0024] 7、加入25ul DEPC处理
水，立即进行PT–PCR扩增。
[0025] (三)RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因
[0026] 以提取的2.5uLRNA溶液做模板，按照宝生物公司的RT–PCR
试剂盒进行加样，应用P1和 M2、P2和M1为引物进行RT-PCR扩增。反应体系：2×Buffer 25uL，上下游引物各1uL，RNA 模板2.5uL，酶1uL，水19.5uL，总体系50uL。反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃ 45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶
电泳进行RT-PCR 产物分析。P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；P2和M1引物扩增的片段大小为
220bp，命名为N2。
[0027] (四)融合PCR扩增
[0028] 以P1和P2为引物，N1和N2为模板进行PCR扩增。反应体系：10×Buffer 5uL，上下游引物各1uL，模板N1和N2各0.35uL，Ex Taq酶0.3uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。目的片段V基因大小924bp。
[0029] (五)PCR产物胶回收和纯化
[0030] 应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因。
[0031] (六)分别单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒
[0032] SmaI 30℃过夜酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒(实验室保存)，回收纯化后应用 EcoRI 37℃单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒。
[0033] (七)双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒胶回收和纯化
[0034] 应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化上述(六)V基因和 pGEX–4T–1载体质粒，–20℃保存备用。
[0035] (八)V基因和pGEX–4T–1载体的连接和转化(DH5α中)。
[0036] 1、双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒进行连接(16℃过夜)和转化。
[0037] 2、连接产物转化。
[0038] 全部的连接产物和0.5uL pGEX–4T–1载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞 DH5α(购自天根公司)过4μL)中；
冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；加900uL 无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50-100uL涂在含有
氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
[0039] 大肠杆菌DH5α/pGEX–4T–1(Escherichia coli DH5α/pGEX–4T–1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2018400，保藏日期为2018年6月26日。保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
[0040] (九)重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定(DH5α中)
[0041] 1、重组质粒pGEX–4T–V的提取
[0042] 挑取琼脂板里的7个单菌落接种到含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基里，37℃过夜摇菌。第二天提取质粒，按照上海生物工程有限公司的质粒抽提试剂盒说明进行重组质粒pGEX–4T–V的提取。重组质粒琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定1和2泳道为阳性重组质粒，分别命名质粒1和质粒2。下一步进行PCR和双酶切鉴定。
[0043] 2、重组质粒pGEX–4T–V PCR鉴定
[0044] PCR反应体系：10×Buffer 5uL，P1和P2上下游引物各1uL，模板0.5uL，Ex Taq酶0.5uL， dNTP4uL，水38uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃
1min， 35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。我们选取质粒1和质粒2 进行扩增，V基因片段大小约900bp左右，扩增正确；
[0045] 3、重组质粒pGEX–4T–V双酶切鉴定
[0046] 质粒1和质粒2分别进行双酶切鉴定，大小完成正确。
[0047] 4、重组质粒pGEX–4T–V测序
[0048] 质粒1和质粒2送上海生工进行测序菌种测序，测序结果正确，全长924bp(V基因+ HA序列)，如下所示：
[0049] ATGGCAGAAGAACAAGCATACCATGTCAACAAGGGACTGGAATGTATCAAGTCTCTCAAAGCCTCTC CCCCGGATCTATCCACCATCAAAGATGCCCTTGAGAGCTGGAGAGAGGGGCTTAGCCCCTCAGGCCG TGCAACACCGAACCCTGATACGTCCGAGGGAGACCATCAGAATATCAACCAATCATGCTCACCAGCA ATCGGATCAGACAAAGTCGACATGTCTCCTGAAGATAATCTCGGATTTAGAGAGATCACTTGTAATGA CAGTGAGGCTGGGCTCGGAGGAGTTCTGGATAAAGGATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTT TATAGCCACGGGGGTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGACTCTCTCGTGGTTCAAGCAAAT CCTCCAGTTACTGACACCTTCAATGGAGGAGAGGATGGATCTGACGACAGCGATGTGGACTCTGGC CCAGATGATCCCGGCAGAGATCCTCTATATGACCGGGGATCTGCTGCCGGCAATGATGTCTCTAGGTC AACAGATGTCGAAAAATTAGAAGGAGATGACATTCAAGAAGTTCTTAACTCCCAGAAGAGTAAAGG AGGAAGATTCCAAGGCGGGAAAATCTTGCGGGTCCCGGAAATACCCGATGTCAAGAACTCTAGACC ATCAGCCCAATCAATTAAAAAGGGGCACAGACGGGAACTCAGTCTTATCTGGAACGGTGACGGAGT GTTCATCGATAAGTGGTGCAACCCAAGCTGTGCCAGAGTCCAAATGGGAGTCATCAGAGCGAAATG CGTCTGTGGGGAGTGTCCCCAAATCTGCGAGGGGTGCAAAGACGATCCAGGGGTTGACACAAGAAT CTGGTACCATAGCATCACTGACTCAGCCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTAA
[0050] (十)载体质粒pGEX–4T–1和阳性重组质粒pGEX–4T–V转化到表达的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中
[0051] 转化、挑菌、质粒提取如前(八)和(九)所述的具体的方法。
[0052] (十一)重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE鉴定
[0053] 将阳性重组菌按照1％接种到5mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基里， 37℃、250rpm/min摇菌过夜。第二天保存菌种到50％的甘油里，按照2％接种到10mL LB液体培养基，摇菌2个小时测菌液OD值在0.6～0.8之间加1mM/mLIPTG诱导表达蛋白，加诱导剂之前取1mL菌液做阴性对照。诱导表达4小时后，取菌液到10mL离心管里，离心弃掉上清，用PBS洗涤一次。用2mL的PBS溶解，超声
破碎，超声4s，间隔5s，超声25 次。12000rpm/min离心
10min，分装上清和用500uLPBS溶解沉淀。取诱导后沉淀(PBS溶解)和上清各60ul溶解在4倍的上样缓冲液中，同时取诱导后的载体沉淀和上清做阴性对照，沸水中煮沸5min，上样10ul进行SDS–PAGE。
[0054] (十二)western–blot鉴定
[0055] SDS–PAGE之后1
块胶进行转膜，使用PVDF膜，转移液提前2小时放入到–20℃保存备用。取出来的胶用去离子水冲洗，放入到转移液里；剪比蛋白胶大一点的
滤纸6层，放入到转移液中；浸泡黑色的海绵到转移液里，再放到转膜曹里；浸泡的滤纸放到海绵上；蛋白胶放在滤纸上，浸泡在甲醇里膜放在胶上；浸泡的另外3层滤纸放在膜上；赶走多余的气泡，放入浸泡过的黑海绵；整体夹紧放入转膜曹里，倒入转移液和放冰袋，100V 1小时。
[0056] 拿出转移好的膜，PBST洗涤3次，每次3min；用5％的
脱脂奶粉4℃封闭过夜；PBST 洗涤3次，加抗HA标签的单抗(购自上海生物工程有限公司)1:150，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，加抗鼠的二抗1:2500，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，显色；显色液配方：
1ml去离子水，0.01克氯化镍，9ml 20mMpH7.6的This-HCl，0.006克DAB， 10ul30％双
氧水；
显色后晾干观察结果。
[0057] (十三)pGEX–4T–V蛋白纯化
[0058] 诱导表达300mlpGEX–4T–V重组菌；离心，沉淀用PBS洗涤1次；用6mlPBS溶解沉淀，超声4s，间隔5s，超声30次；12000rpm/min离心15min，上清2ml/管分装到EP管里；使用GE公司的GST重力柱按照
说明书的步骤进行纯化表达的蛋白为免疫小鼠做准备。
[0059] (十四)纯化的蛋白浓度测定
[0060] 应用上海生物工程有限公司的BCA法
蛋白质浓度测定试剂盒，测定纯化的蛋白浓度，然后免疫Balb/c小鼠。
[0061] (十五)小鼠免疫
[0062] 纯化的蛋白3.00mg/mL，以0.1mg/mL与弗氏完全佐剂等体积混匀，选择7周龄Balb/c 雌性小鼠，
腹腔注射0.2mL；分别在第14、28d，用弗氏不完全佐剂乳化
抗原加强免疫(免疫部位及方法同首免)，在第42d断尾
采血，分离血清；用间接ELISA方法进行
抗体水平检测，对免疫效果较好及抗体效价测定较高的小鼠腹腔注射0.1mL蛋白，第45d无菌取小鼠脾细胞进行融合。
[0063] (十六)Nigero75/1病毒的制备
[0064] Vero细胞由本实验室保存。扩大培养的Vero细胞在225cm2细胞瓶里进行传代，同步按照2％接Nigero75/1病毒，37℃、饱和湿度、5％CO2
培养箱中培养。每天观察细胞状态，第三天细胞病变明显，反复冻融三次后﹣20℃保存，进行病毒浓缩。
[0065] 500ml的毒液10000rpm离心30min去除细胞碎片；用100KD
超滤浓缩离心管6000rpm 离心15min；吸取V型管内液体，将离心管内的液体弃之。反复离心多次，最终浓缩的病毒液100ml。将浓缩的毒液分装到2ml离心管内，﹣70℃冻存备用。
[0066] (十七)间接ELISA单抗筛选检测方法的建立
[0067] 按常规间接ELISA操作步骤，采用方阵法确定抗原(Nigero75/1病毒)最佳包被浓度、抗体的最佳工作浓度及叛定标准。根据阳性血清孔的OD值接近1.0，阴性血清OD值<0.2， P/N>2.1为阳性，同时设立空白对照及SP2/0上清对照。
[0068] 纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被，采用方阵试验进行测定：病毒用包被液做1:1、 1:2、1:4、1:8稀释，加入酶标板，100μL/孔，并轻弹或振动平板以使抗原分布均匀。将包被的酶标板用盖封好，4℃过夜，弃去ELISA板中液体，用多道移液器加入洗涤液(PBST溶液)200μL/孔，室温下轻微振摇3min，在布上轻轻拍干，重复洗涤三次。用5％脱脂奶粉封闭液250μL/孔，37℃封闭60min，同样洗涤三次，拍干。小鼠阳性和阴性血清的稀释倍数为1:
100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200，加入酶标板中，100μL/孔，同时设空白对照，37℃作用45min，洗涤三次，拍干。加入1:10000稀释的兔抗鼠IgG，100μL/孔，25℃作用45min，洗涤三次，拍干。加TMB显色液，100μL/孔，25℃作用3-5min，加入终止液 (2M H2SO4溶液)，100μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm吸光值。以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N>2.1的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度。最终筛选出纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被最佳浓度为1:8，抗体稀释度为1:800。
[0069] (十八)细胞融合
[0070] 1、饲养细胞的制备
[0071] 在融合前1天，选择7周龄的Balb/c雌性小鼠1只颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5 min，固定于架子上，移入超净台，用
镊子提起小鼠腹部
皮肤，无菌剪开腹部皮肤(注意不可损伤腹膜)，经镊子剥离使腹膜充分暴露。用一次性无菌
注射器吸取
基础培养液10mL注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精
棉球轻轻揉动小鼠腹部2-3 min，再用注射器吸出腹腔内的培养液(内含巨噬细胞)，注入灭菌平皿中。吸取20％完全培养液50mL(含HAT)，用多道移液器加入到5块96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃、饱和湿度、
5％CO2培养箱中培养。18-24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性好时可用。
[0072] 2、SP2/0细胞的制备
[0073] 骨髓瘤SP2/0细胞分别经8-AG选择培养和Balb/c雌性小鼠腹腔回归纯化。在融合前30 天左右，细胞复苏，用加入8-AG(20μg/mL)的DMEM完全培养液选择培养三代以上，以保持HGPRT—
缺陷型。取生长状态良好的经8-AG处理的细胞，离心，PBS缓冲液洗涤一次，台盼蓝
染色活细胞记数，把细胞稀释为106个/mL，接种到一周前经腹腔注射弗氏不完全佐剂(0.5mL/只)刺激过的Balb/c雌性小鼠腹腔内。注意观察小鼠状态，待小鼠腹腔膨大时(一周左右)，无菌采集腹水，用完全培养液调整细胞
密度，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中传代培养，冻存备用。
[0074] 3、脾细胞的制备
[0075] 取加强免疫的Balb/c小鼠，眼球摘除
放血，分离血清供阳性抗体用；将小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精消毒5min，移入超净
工作台内，固定于架子上，用灭菌
剪刀、镊子分别剪开皮肤和膜腹，无菌取出脾脏，放人已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入到另一个盛有10mL基础培养液和0.22um
铜网的平皿内，用注射器针管在铜网上
研磨脾脏，将平皿中脾细胞悬液转移到50mL离心管中，吹打混匀1000rpm离心5min，用10mL基础培养液重悬混匀。
[0076] 4、细胞融合
[0077] 按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量5:1混合，加入50mL 的无菌离心管内，1000rpm离心5min，弃上清，用
手指弹击管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状；将离心管置于37℃水的烧杯中，吸取37℃预热的50％PEG溶液1mL在45sec 内缓慢滴入，边滴边转动离心管，静止1min，在45sec内缓慢滴入37℃预热的基础培养液1 mL，边滴边转动离心管，静置15sec；45sec内滴入基础培养液2mL，同样边滴边转动离心管；随后在第3min内加入4mL基础培养液，最后补加基础培养液至30mL轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用。800rpm离心8min，弃上清，将细胞沉淀轻悬于50mL 含20％胎
牛血清的预热的HAT选择培养液中，混合均匀，用多道移液器加入到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板移至37℃、5％CO2、饱和湿度温箱中培养。
[0078] (十九)、阳性杂交瘤细胞的筛选
[0079] 融合后的细胞第5d更换培养液，采用半换液方式。所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合10d内用HAT培养液；第10d以后用HT培养液，三次克隆后用普通完全培养液。杂交瘤细胞长至15d时，即可取细胞培养上清100μL，用Nigero75/1病毒包被的间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照。
[0080] (二十)、杂交瘤细胞的克隆、冻存和复苏
[0081] 1、克隆及扩增(有限稀释法)
[0082] 将已检测为分泌阳性的特定孔中的杂交瘤细胞集落吹起混匀，细胞用台盼蓝染色计数，取上述细胞悬液，用含20％胎牛血清的HT培养液稀释到10个/mL细胞，将稀释好的细胞悬液100μL加入到事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。克隆后第10天
显微镜下观察单克隆孔并标记。经过3次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。筛选出一株单抗，命名为3E6。
[0083] 2、细胞冻存
[0084] 每次克隆化前将杂交瘤细胞冻存，另外已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3E6的冻存。将生长旺盛、形态良好的待冻存的3E6细胞离心，用细胞冻存液(含10％DMSO、
90％胎牛血清)将细胞调至3-5×106个/mL，加入到1.8mL细胞冻存管中，做好标记，然后将冻存管放入冻存盒中，－70℃低温
冰箱中过夜，第二天投入液氮容器中，并做好记录。
[0085] 3、细胞复苏
[0086] 间隔一个月后自液氮容器中取出一支3E6细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液悬浮于基础培养液中，1000rpm离心5min洗涤，以5mL完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置 5％CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。验证细胞是否冻存好。细胞冻存没有问题，复苏后生长旺盛。
[0087] (二十一)、单克隆抗体腹水的制备
[0088] 在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前1周，先给8周龄雌性BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5mL降植烷。将培养的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000rpm离心5min，再用PBS缓冲液(PH7.2)悬浮离心洗涤1次，台盼蓝染色做活细胞记数后将细胞密度数调至 2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，约含1×106个细胞。接种后注意观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大(7～12d)，行动不便时，用酒精棉球消毒下腹部皮肤后，可用 12号针头刺入腹腔，可见有腹水滴出，用无菌离心管收集，4℃放置过夜，5000rpm离心5min，上清即为腹水，分装、标记，-70℃保存；间隔2-3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可
抽取2-3次。
[0089] 本发明试验与相关报道的关键不同点就是应用的小反刍兽疫Nigero75/1疫苗毒的V蛋白。
[0090] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：我国目前采取弱毒疫苗(Nigera75/1)接种预防PPR，该疫苗免疫效果较好，但由于带毒与排毒给疾病的诊断及检测带来困难。活疫苗诱导机体，与病毒灭活疫苗相比，有高的和潜在的
毒力返强现象，全病毒灭活疫苗将是一个更安全的替代品。当前还没有商品化的PPR灭活苗、痘载体疫苗等，也没有关于PPRV蛋白单抗制备的相关研究，但PPR疫苗研究趋向于基因工程苗和灭活苗。本发明为小反刍兽疫基因工程疫苗的诊断奠定可靠的技术保障和支撑。
附图说明
[0091] 图1 RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因，其中，1和3为N1；2和4为N2；–阴性对照；M为Marker 2000bp；
[0092] 图2融合PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因，其中，1至5泳道扩增出V基因；–为阴性对照；M为Marker 2000bp；
[0093] 图3重组质粒pGEX–4T–V琼脂糖凝胶电泳图，其中，1和2泳道为阳性重组质粒； M为Marker 15000bp；
[0094] 图4重组质粒pGEX–4T–V PCR鉴定，其中，1和2泳道为质粒4F21和质粒2扩增的 V基因片段；M为Marker 15000bp；
[0095] 图5双酶切鉴定质粒1和质粒2；
[0096] 图6重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE鉴定，其中，1和2泳道分别为重组V蛋白沉淀和上清；3和4泳道分别为诱导后载体的沉淀和上清；M为彩虹Marker；
[0097] 图7重组pGEX–4T–V蛋白western–blot鉴定，其中，1和2泳道分别为诱导后载体的上清和沉淀；3和4泳道分别为重组V蛋白上清和沉淀；M为彩虹Marker；
[0098] 图8重组pGEX–4T–V蛋白的纯化，其中，1至9泳道为纯化的蛋白；M为彩虹Marker；
[0099] 图9 RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因，其中，1泳道为N1；2和3泳道为N3； M为Marker 2000bp；
[0100] 图10融合PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因，其中，1和2泳道扩增出V基因；M 为Marker 2000bp；
[0101] 图11重组质粒pFastBacTMDual–V琼脂糖凝胶电泳图，其中，7和10泳道为阳性重组质粒，其他泳道均为空载体质粒；M为Marker 15000bp；
[0102] 图12重组质粒pFastBacTMDual–V PCR鉴定，其中，1和2泳道为质粒7和质粒10 扩增的V基因片段；3泳道为空载体；M为Marker 2000bp；
[0103] 图13双酶切鉴定重组质粒pFastBacTMDual–V，其中，1泳道为pFastBacTMDual载体双酶切；质粒7和质粒10扩增V基因片段；M为Marker 15000bp；
[0104] 图14 M13引物PCR鉴定杆粒DNA，其中，1至8泳道为重组杆粒；9和10为载体杆粒；M为Marker 15000bp；
[0105] 图15 P1和B2引物PCR鉴定杆粒DNA，其中，1至8泳道为重组杆粒；9为载体杆粒； M为Marker 2000bp；
[0107] 图17重组杆状病毒表达V蛋白，其中，1和2泳道分别是P3代毒的沉淀；3泳道为杆粒DNA载体转染Sf9细胞的沉淀；M为彩虹Marke；
[0108] 图18重组杆状病毒表达V蛋白的western–blot鉴定，其中，1和2泳道分别是P3代毒的沉淀，3泳道为杆粒DNA载体转染Sf9细胞的沉淀；M为彩虹Marker；
[0109] 图19 Sf9细胞表达V蛋白的间接免疫
荧光试验；
[0110] 图20 vero细胞接种小反刍兽疫病毒Nigera75/1的间接免疫荧光试验；
[0111] 图21三株单抗抗体类型。
具体实施方式
[0112] 下面结合附图和具体
实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0113] 1(一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：
[0114] 根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp。应用DNAStar软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点。上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI。下游引物加HA标签，HA序列为：TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT，HA标签反转录序列：AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA。
[0115] 根据Oligo 7软件设计V基因引物，上游引物P1：
[0116] AACCGAATTCATGGCAGAAGAACAAGCATACCAT；下游引物加HA标签如下，
[0117] P2：ATTTCCCGGGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCTGAGTCAGTGATGC。
[0118] 突变引物M1：
[0119] 突变引物M2：方框里的碱基是V基因的突变点。引物由上海生物工程有限公司合成。
[0120] (二)Nigera75/1疫苗毒(本实验室保存)RNA的提取：
[0121] TRIzol LS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶。
[0122] 1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液250ul，再加入TRIzol LS 750ul，充分混匀，室温放置5min；
[0123] 2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)，室温放置3min(由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心)；
[0124] 3、4℃，12000r/min离心15min，取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)；
[0125] 4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；
[0126] 5、4℃，12000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清；
[0127] 6、加1ml75％乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在室温干燥5min；
[0128] 7、加入25ul DEPC处理水，立即进行PT–PCR扩增。
[0129] (三)RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因
[0130] 以提取的2.5uLRNA溶液做模板，按照宝生物公司的RT–PCR试剂盒进行加样，应用P1和 M2、P2和M1为引物进行RT-PCR扩增。反应体系：2×Buffer 25uL，上下游引物各1uL，RNA 模板2.5uL，酶1uL，水19.5uL，总体系50uL。反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃ 45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行RT-PCR 产物分析。P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；P2和M1引物扩增的片段大小为
220bp，命名为N2。如图1所示，正确扩增N1和N2。
[0131] (四)融合PCR扩增
[0132] 以P1和P2为引物，N1和N2为模板进行PCR扩增。反应体系：10×Buffer 5uL，上下游引物各1uL，模板N1和N2各0.35uL，Ex Taq酶0.3uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。目的片段V基因大小924bp，扩增正确，如图2所示。
[0133] (五)PCR产物胶回收和纯化
[0134] 应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因。
[0135] (六)分别单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒
[0136] SmaI 30℃过夜酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒(实验室保存)，见表1。EcoR I 37℃ 3小时酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒，见表2。
[0137] 表1：SmaI单酶切
[0138]
[0139] 表2：EcoR I单酶切
[0140]
[0141] (七)双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒胶回收和纯化
[0142] 应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化双酶切后的V基因和 pGEX–4T–1载体质粒，–20℃保存备用。
[0143] (八)V基因和pGEX–4T–1载体的连接和转化(DH5α中)。
[0144] 1、双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒进行连接(16℃过夜)和转化，见表3。
[0145] 表3：目的片段和载体连接
[0146]
[0147] 2、连接产物转化。
[0148] 全部的连接产物和0.5uL pGEX–4T–1载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞 DH5α(购自天根公司)过4μL)中；冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；加900uL 无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50-100uL涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
[0149] (九)重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定(DH5α中)
[0150] 1、重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定
[0151] 挑取琼脂板里的7个单菌落接种到含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基里，37℃过夜摇菌。第二天提取质粒，按照上海生物工程有限公司的质粒抽提试剂盒说明进行重组质粒pGEX–4T–V的提取。重组质粒琼脂糖凝胶电泳图见图3，初步鉴定1和2泳道为阳性重组质粒，分别命名质粒1和质粒2。下一步进行PCR和双酶切鉴定。
[0152] 2、重组质粒pGEX–4T–V PCR鉴定
[0153] PCR反应体系：10×Buffer 5uL，P1和P2上下游引物各1uL，模板0.5uL，Ex Taq酶0.5uL， dNTP4uL，水38uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃
1min， 35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。我们选取质粒1和质粒2 进行扩增，V基因片段大小约900bp左右，扩增正确，如图4所示。
[0154] 3、重组质粒pGEX–4T–V双酶切鉴定
[0155] 质粒1和质粒2分别进行双酶切鉴定，大小完成正确。具体酶切程序见表4，酶切结果见图5。
[0156] 表4：双酶切鉴定
[0157] 37℃3小时
10×H Buffer 1uL
质粒 2uL
EcoR I酶 1uL
SmaI酶 1uL
H2O 5uL
总计 10uL
[0158] 4、重组质粒pGEX–4T–V测序
[0159] 质粒1和质粒2送上海生工进行测序菌种测序，测序结果正确，全长924bp(V基因+ HA序列)，如下所示：
[0160] ATGGCAGAAGAACAAGCATACCATGTCAACAAGGGACTGGAATGTATCAAGTCTCTCAAAGCCTCTC CCCCGGATCTATCCACCATCAAAGATGCCCTTGAGAGCTGGAGAGAGGGGCTTAGCCCCTCAGGCCG TGCAACACCGAACCCTGATACGTCCGAGGGAGACCATCAGAATATCAACCAATCATGCTCACCAGCA ATCGGATCAGACAAAGTCGACATGTCTCCTGAAGATAATCTCGGATTTAGAGAGATCACTTGTAATGA CAGTGAGGCTGGGCTCGGAGGAGTTCTGGATAAAGGATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTT TATAGCCACGGGGGTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGACTCTCTCGTGGTTCAAGCAAAT CCTCCAGTTACTGACACCTTCAATGGAGGAGAGGATGGATCTGACGACAGCGATGTGGACTCTGGC CCAGATGATCCCGGCAGAGATCCTCTATATGACCGGGGATCTGCTGCCGGCAATGATGTCTCTAGGTC AACAGATGTCGAAAAATTAGAAGGAGATGACATTCAAGAAGTTCTTAACTCCCAGAAGAGTAAAGG AGGAAGATTCCAAGGCGGGAAAATCTTGCGGGTCCCGGAAATACCCGATGTCAAGAACTCTAGACC ATCAGCCCAATCAATTAAAAAGGGGCACAGACGGGAACTCAGTCTTATCTGGAACGGTGACGGAGT GTTCATCGATAAGTGGTGCAACCCAAGCTGTGCCAGAGTCCAAATGGGAGTCATCAGAGCGAAATG CGTCTGTGGGGAGTGTCCCCAAATCTGCGAGGGGTGCAAAGACGATCCAGGGGTTGACACAAGAAT CTGGTACCATAGCATCACTGACTCAGCCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTAA
[0161] (十)载体质粒pGEX–4T–1和阳性重组质粒pGEX–4T–V转化到表达的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中
[0162] 转化、挑菌、质粒提取如前所述的方法。
[0163] (十一)重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE鉴定
[0164] 将阳性重组菌按照1％接种到5mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基里， 37℃、250rpm/min摇菌过夜。第二天保存菌种到50％的甘油里，按照2％接种到10mL LB液体培养基，摇菌2个小时测菌液OD值在0.6～0.8之间加1mM/mLIPTG诱导表达蛋白，加诱导剂之前取1mL菌液做阴性对照。诱导表达4小时后，取菌液到10mL离心管里，离心弃掉上清，用PBS洗涤一次。用2mL的PBS溶解，超声破碎，超声4s，间隔5s，超声25 次。12000rpm/min离心
10min，分装上清和用500uLPBS溶解沉淀。取诱导后沉淀(PBS溶解)和上清各60ul溶解在4倍的上样缓冲液中，同时取诱导后的载体沉淀和上清做阴性对照，沸水中煮沸5min，上样10ul进行SDS–PAGE。如图6所示，表明蛋白成功表达。
[0165] (十二)western–blot鉴定
[0166] SDS–PAGE之后1块胶进行转膜，使用PVDF膜，转移液提前2小时放入到–20℃保存备用。取出来的胶用去离子水冲洗，放入到转移液里；剪比蛋白胶大一点的滤纸6层，放入到转移液中；浸泡黑色的海绵到转移液里，再放到转膜曹里；浸泡的滤纸放到海绵上；蛋白胶放在滤纸上，浸泡在甲醇里膜放在胶上；浸泡的另外3层滤纸放在膜上；赶走多余的气泡，放入浸泡过的黑海绵；整体夹紧放入转膜曹里，倒入转移液和放冰袋，100V 1小时。
[0167] 拿出转移好的膜，PBST洗涤3次，每次3min；用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；PBST 洗涤3次，加抗HA标签的单抗(购自上海生物工程有限公司)1:150，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，加抗鼠的二抗1:2500，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，显色；显色液配方：
1ml去离子水，0.01克氯化镍，9ml 20mM pH7.6的This-HCl，0.006克DAB， 10ul30％双氧水；
显色后晾干观察结果，见图7，表明表达的蛋白具有很好的反应原性。
[0168] (十三)pGEX–4T–V蛋白纯化
[0169] 诱导表达300ml pGEX–4T–V重组菌；离心，沉淀用PBS洗涤1次；用6mlPBS溶解沉淀，超声4s，间隔5s，超声30次；12000rpm/min离心15min，上清2ml/管分装到EP管里；使用GE公司的GST重力柱按照说明书的步骤进行纯化表达的蛋白。结果见图8，蛋白成功被纯化，为免疫小鼠做准备。
[0170] (十四)纯化的蛋白浓度测定
[0171] 应用上海生物工程有限公司的BCA法蛋白质浓度测定试剂盒，测定纯化的蛋白浓度，然后免疫Balb/c小鼠。
[0172] (十五)小鼠免疫
[0173] 纯化的蛋白3.00mg/mL，以0.1mg/mL与弗氏完全佐剂等体积混匀，选择7周龄Balb/c 雌性小鼠，腹腔注射0.2mL；分别在第14、28d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原加强免疫(免疫部位及方法同首免)，在第42d断尾采血，分离血清；用间接ELISA方法进行抗体水平检测，对免疫效果较好及抗体效价测定较高的小鼠腹腔注射0.1mL蛋白，第45d无菌取小鼠脾细胞进行融合。
[0174] (十六)Nigero75/1病毒的制备
[0175] Vero细胞由本实验室保存。扩大培养的Vero细胞在225cm2细胞瓶里进行传代，同步按照2％接Nigero75/1病毒，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。每天观察细胞状态，第三天细胞病变明显，﹣20℃保存，反复冻融三次后进行病毒浓缩。
[0176] 500ml的毒液10000rpm离心30min去除细胞碎片；用100KD超滤浓缩离心管6000rpm 离心15min；吸取V型管内液体，将离心管内的液体弃之。反复离心多次，最终浓缩的病毒液100ml。将浓缩的毒液分装到2ml离心管内，﹣70℃冻存备用。
[0177] (十七)间接ELISA单抗筛选检测方法的建立
[0178] 按常规间接ELISA操作步骤，采用方阵法确定抗原(Nigero75/1病毒)最佳包被浓度、抗体的最佳工作浓度及叛定标准。根据阳性血清孔的OD值接近1.0，阴性血清OD值<0.2， P/N>2.1为阳性，同时设立空白对照及SP2/0上清对照。
[0179] 纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被，采用方阵试验进行测定：病毒用包被液做1:1、 1:2、1:4、1:8稀释，加入酶标板，100μL/孔，并轻弹或振动平板以使抗原分布均匀。将包被的酶标板用盖封好，4℃过夜，弃去ELISA板中液体，用多道移液器加入洗涤液(PBST溶液)200μL/孔，室温下轻微振摇3min，在布上轻轻拍干，重复洗涤三次。用5％脱脂奶粉封闭液250μL/孔，37℃封闭60min，同样洗涤三次，拍干。小鼠阳性和阴性血清的稀释倍数为1:
100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200，加入酶标板中，100μL/孔，同时设空白对照，37℃作用45min，洗涤三次，拍干。加入1:10000稀释的兔抗鼠IgG，100μL/孔，25℃作用45min，洗涤三次，拍干。加TMB显色液，100μL/孔，25℃用3-5min，加入终止液(2M H2SO4溶液)，100μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm吸光值。以阳性血清孔的OD值接近 1.0，P/N>2.1的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度。最终筛选出纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被最佳浓度为1:8，抗体稀释度为1:800。
[0180] (十八)细胞融合
[0181] 1、饲养细胞的制备
[0182] 在融合前1天，选择7周龄的Balb/c雌性小鼠1只颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5 min，固定于架子上，移入超净台，用镊子提起小鼠腹部皮肤，无菌剪开腹部皮肤(注意不可损伤腹膜)，经镊子剥离使腹膜充分暴露。用一次性无菌注射器吸取基础培养液10mL注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部2-3 min，再用注射器吸出腹腔内的培养液(内含巨噬细胞)，注入灭菌平皿中。吸取20％完全培养液50mL(含HAT)，用多道移液器加入到5块96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃、饱和湿度、
5％CO2培养箱中培养。18-24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性好时可用。
[0183] 2、SP2/0细胞的制备
[0184] 骨髓瘤SP2/0细胞分别经8-AG选择培养和Balb/c雌性小鼠腹腔回归纯化。在融合前30 天左右，细胞复苏，用加入8-AG(20μg/mL)的DMEM完全培养液选择培养三代以上，以保持HGPRT—缺陷型。取生长状态良好的经8-AG处理的细胞，离心，PBS缓冲液洗涤一次，台盼6
蓝染色活细胞记数，把细胞稀释为10 个/mL，接种到一周前经腹腔注射弗氏不完全佐剂(0.5mL/只)刺激过的Balb/c雌性小鼠腹腔内。注意观察小鼠状态，待小鼠腹腔膨大时(一周左右)，无菌采集腹水，用完全培养液调整细胞密度，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中传代培养，冻存备用。
[0185] 3、脾细胞的制备
[0186] 取加强免疫的Balb/c小鼠，眼球摘除放血，分离血清供阳性抗体用；将小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精消毒5min，移入超净工作台内，固定于架子上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开皮肤和膜腹，无菌取出脾脏，放人已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入到另一个盛有10mL基础培养液和0.22um铜网的平皿内，用注射器针管在铜网上研磨脾脏，将平皿中脾细胞悬液转移到50mL离心管中，吹打混匀1000rpm离心5min，用10mL基础培养液重悬混匀。
[0187] 4、细胞融合
[0188] 按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量5:1混合，加入50mL 的无菌离心管内，1000rpm离心5min，弃上清，用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状；将离心管置于37℃水的烧杯中，吸取37℃预热的50％PEG溶液1mL在45sec 内缓慢滴入，边滴边转动离心管，静止1min，在45sec内缓慢滴入37℃预热的基础培养液1 mL，边滴边转动离心管，静置15sec；45sec内滴入基础培养液2mL，同样边滴边转动离心管；随后在第3min内加入4mL基础培养液，最后补加基础培养液至30mL轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用。800rpm离心8min，弃上清，将细胞沉淀轻悬于50mL 含20％胎牛血清的预热的HAT选择培养液中，混合均匀，用多道移液器加入到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板移至37℃、5％CO2、饱和湿度温箱中培养。
[0189] (十九)、阳性杂交瘤细胞的筛选
[0190] 融合后的细胞第5d更换培养液，采用半换液方式。所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合10d内用HAT培养液；第10d以后用HT培养液，三次克隆后用普通完全培养液。杂交瘤细胞长至15d时，即可取细胞培养上清100μL，用Nigero75/1病毒包被的间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照。
[0191] (二十)、杂交瘤细胞的克隆、冻存和复苏
[0192] 1、克隆及扩增(有限稀释法)
[0193] 将已检测为分泌阳性的特定孔中的杂交瘤细胞集落吹起混匀，细胞用台盼蓝染色计数，取上述细胞悬液，用含20％胎牛血清的HT培养液稀释到10个/mL细胞，将稀释好的细胞悬液100μL加入到事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。克隆后第10天显微镜下观察单克隆孔并标记。经过3次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。筛选出一株单抗，命名为3E6。
[0194] 2、细胞冻存
[0195] 每次克隆化前将杂交瘤细胞冻存，另外已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3E6的冻存。将生长旺盛、形态良好的待冻存的3E6细胞离心，用细胞冻存液(含10％DMSO、
90％胎牛血清)将细胞调至3-5×106个/mL，加入到1.8mL细胞冻存管中，做好标记，然后将冻存管放入冻存盒中，－70℃低温冰箱中过夜，第二天投入液氮容器中，并做好记录。
[0196] 3、细胞复苏
[0197] 间隔一个月后自液氮容器中取出一支3E6细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液悬浮于基础培养液中，1000rpm离心5min洗涤，以5mL完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置 5％CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。验证细胞是否冻存好。细胞冻存没有问题，复苏后生长旺盛。
[0198] (二十一)、单克隆抗体腹水的制备
[0199] 在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前1周，先给8周龄雌性BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5mL降植烷。将培养的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000rpm离心5min，再用PBS缓冲液(PH7.2)悬浮离心洗涤1次，台盼蓝染色做活细胞记数后将细胞密度数调至 2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，约含1×106个细胞。接种后注意观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大(7～12d)，行动不便时，用酒精棉球消毒下腹部皮肤后，可用 12号针头刺入腹腔，可见有腹水滴出，用无菌离心管收集，4℃放置过夜，5000rpm离心5min，上清即为腹水，分装、标记，-70℃保存；间隔2-3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2-3次。
[0200] 实施例1小反刍兽疫V基因一个片段(已知序列)的多肽合成制备单抗
[0201] 详细步骤如下：
[0202] (一)、多肽的序列和浓度
[0203] 多肽序列：GGATCAGACAAAGTCGACATGTCTCCTGAAGATAATCTCGGATTT，位于V基因 207bp-252bp之间；编码的氨基酸：GSDKVDMSPEDNLGF。多肽由广州洛孚生物科技有限责任公司合成，并偶联-KLH，合成的浓度为1mg/ml。
[0204] (二)、小鼠免疫
[0205] 多肽以0.1mg/mL与弗氏完全佐剂等体积混匀，选择7周龄Balb/c雌性小鼠，腹腔注射 0.2mL；分别在第14、28d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原加强免疫(免疫部位及方法同首免)，在第42d断尾采血，分离血清；用间接ELISA方法进行抗体水平检测，对免疫效果较好及抗体效价测定较高的小鼠腹腔注射0.1mL蛋白，第45d无菌取小鼠脾细胞进行融合。
[0206] (三)、间接ELISA单抗筛选检测方法的建立
[0207] 按常规间接ELISA操作步骤，采用方阵法确定抗原(pGEX–4T–V蛋白)最佳包被浓度、抗体的最佳工作浓度及叛定标准。根据阳性血清孔的OD值接近1.0，阴性血清OD值<0.2， P/N>2.1为阳性，同时设立空白对照及SP2/0上清对照。具体方法如前所述。最终筛选出V 蛋白包被最佳浓度为1:200，抗体(免疫小鼠的血清)稀释度为1:800。
[0208] (四)、细胞融合
[0209] 饲养细胞的制备、SP2/0细胞的制备、脾细胞的制备、细胞融合的方法如前所述。
[0210] (五)、阳性杂交瘤细胞的筛选
[0211] 方法如前所述，最终筛选出2株单抗，命名为4F2和4F11。
[0212] (六)、杂交瘤细胞的克隆、冻存和复苏
[0213] 克隆及扩增(有限稀释法)、细胞冻存、细胞复苏
[0214] (七)、单克隆抗体腹水的制备
[0215] 方法如前所述。
[0216] 实施例2真核表达小反刍兽疫V蛋白
[0217] (一)、引物设计
[0218] 根据真核表达载体pFastBacTMDual(本实验室保存)上的酶切位点和应用DNAStar软件分析V基因序列的酶切位点，设计了上游和下游引物的酶切位点分别为EcoRI和HindIII。下游引物加HA标签，HA序列为：TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT，HA标签反转录序列：AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA。上游引物
[0219] P1：AACCGAATTCATGGCAGAAGAACAAGCATACCAT；下游引物加HA标签如下，[0220] B2：ATTTAAGCTTTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCTGAGTCAGTGATGC。
[0221] 突变引物M1：
[0222] 突变引物M2：方框里的碱基是V基因的突变点。引物由上海生物工程有限公司合成。
[0223] (二)、RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因
[0224] 以提取的2.5uLRNA溶液做模板，应用P1和M2、B2和M1为引物进行RT-PCR扩增。具体步骤和方法如前所述，结果如图9所示。成功扩增了P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；B2和M1引物扩增的片段大小为220bp，命名为N3。如图9所示，正确扩增出 N1和N3。
[0225] (三)融合PCR扩增
[0226] 以P1和B2为引物，N1和N3为模板进行PCR扩增，具体步骤和方法如前所述，成功扩增目的片段V基因大小924bp，如图10所示。
[0227] (四)V基因PCR产物胶回收和纯化
[0228] 应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因，方法如前所述。
[0229] (五)分别双酶切V基因和pFastBacTMDual载体质粒
[0230] 双酶切V基因和pFastBacTMDual载体质粒，见表5。
[0231] 表5：V基因双酶切
[0232]
[0233] 表6：pFastBacTMDual载体双酶切
[0234]
[0235] (六)双酶切后V基因和pFastBacTMDual载体质粒胶回收和纯化
[0236] 应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化双酶切后的V基因和 pFastBacTMDual载体质粒，–20℃保存备用。
[0237] (七)V基因和pFastBacTMDual载体的连接和转化(DH5α中)。
[0238] 1、双酶切后的V基因和pFastBacTMDual载体质粒进行连接(16℃过夜)，见表7。
[0239] 表7：目的片段和载体连接
[0240]
[0241] 2、连接产物转化。
[0242] 全部的连接产物和0.5uL pFastBacTMDual载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自天根公司)中；冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；分别加900uL 无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50-100uL涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
[0243] (八)重组质粒pFastBacTMDual–V的提取和鉴定(DH5α中)
[0244] 挑取琼脂板里的10个单菌落接种到含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基里，37℃过夜摇菌。第二天提取质粒，按照上海生物工程有限公司的质粒抽提试剂盒说明进行重组质粒的提取。重组质粒琼脂糖凝胶电泳图见图11，初步判断2个阳性重组质粒，分别为质粒7和质粒10，质粒送上海生工进行测序菌种测序，测序结果正确，全长924bp (V基因+HA序列)，如下所示：
[0245] ATGGCAGAAGAACAAGCATACCATGTCAACAAGGGACTGGAATGTATCAAGTCTCTCAAAGCCTCTC CCCCGGATCTATCCACCATCAAAGATGCCCTTGAGAGCTGGAGAGAGGGGCTTAGCCCCTCAGGCCG TGCAACACCGAACCCTGATACGTCCGAGGGAGACCATCAGAATATCAACCAATCATGCTCACCAGCA ATCGGATCAGACAAAGTCGACATGTCTCCTGAAGATAATCTCGGATTTAGAGAGATCACTTGTAATGA CAGTGAGGCTGGGCTCGGAGGAGTTCTGGATAAAGGATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTT TATAGCCACGGGGGTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGACTCTCTCGTGGTTCAAGCAAAT CCTCCAGTTACTGACACCTTCAATGGAGGAGAGGATGGATCTGACGACAGCGATGTGGACTCTGGC CCAGATGATCCCGGCAGAGATCCTCTATATGACCGGGGATCTGCTGCCGGCAATGATGTCTCTAGGTC AACAGATGTCGAAAAATTAGAAGGAGATGACATTCAAGAAGTTCTTAACTCCCAGAAGAGTAAAGG AGGAAGATTCCAAGGCGGGAAAATCTTGCGGGTCCCGGAAATACCCGATGTCAAGAACTCTAGACC ATCAGCCCAATCAATTAAAAAGGGGCACAGACGGGAACTCAGTCTTATCTGGAACGGTGACGGAGT GTTCATCGATAAGTGGTGCAACCCAAGCTGTGCCAGAGTCCAAATGGGAGTCATCAGAGCGAAATG CGTCTGTGGGGAGTGTCCCCAAATCTGCGAGGGGTGCAAAGACGATCCAGGGGTTGACACAAGAAT CTGGTACCATAGCATCACTGACTCAGCCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTAA
[0246] 重组质粒PCR鉴定。PCR反应体系：10×Buffer 5uL，P1和B2上下游引物各1.5uL，模板 0.2uL，Ex Taq酶0.3uL，dNTP4uL，水37.5uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃ 45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。
扩增的V基因片段大小为924bp，如图12所示。
[0247] 重组质粒双酶切鉴定。见表8和图13。
[0248] 表8：双酶切鉴定
[0249] 37℃3小时
10×MBuffer 2uL
质粒 3uL
EcoRI 1uL
HindIII 1uL
H2O 5uL
总计 10uL
[0250] (九)载体质粒pFastBacTMDual和阳性重组质粒pFastBacTMDual–V转化到DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞中(转变成杆粒)
[0251] 1、取2管DH10BacTM感受态细胞冰上解冻。
[0252] 2、将8ul载体质粒pFastBacTMDual和8ul重组质粒pFastBacTMDual–V分别加入到DH10BacTM感受态细胞中，轻轻混合。千万不要上下吹吸混合，感受态细胞不要离开冰面。
[0253] 3、冰上抚育30分钟；42℃热激45s；立即冰上2min，保持静止。
[0254] 4、加入900ul室温的SOC培养基(购自上海生工)37℃225转/分钟震荡培养4小时。
[0255] 5、培养完成后，无需离心，用SOC培养基(室温)10倍、100倍和1000倍稀释上述两种转化产物，每个稀释度用100ul铺一个LB平板，平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin， 10ug/ml tetracycline，100ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG，用来进行DH10BacTM转化株的筛选。
[0256] 6、37℃抚育48小时。注意：不推荐早于48小时挑单克隆，因为这样可能会难于区分蓝白斑。
[0257] (十)载体杆粒和重组杆粒DNA的鉴定(DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞中)[0258] 1、挑了8个载体杆粒pFastBacTMDual克隆菌(白色)和16个重组杆粒
[0259] pFastBacTMDual–V克隆菌(白色)，接种至含有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline LB的液体中，37℃225转/分钟过夜培养。最终摇起13株菌，载体菌4株，
[0260] 重组质粒菌株9株。
[0261] 2、杆粒DNA的提取：
[0262] ⑴2ml离心管收集3ml菌液，12000rpm离心1min。
[0263] ⑵弃掉上清，加0.3ml Buffer P1(上海生工质粒抽提试剂盒)重悬沉淀，轻轻
地震荡和混匀。
[0264] ⑶加0.3ml的Buffer P2轻轻混匀，室温孵育5min。
[0265] ⑷缓慢加入0.3ml Buffer P3，加入过程中轻轻混匀。蛋白会形成白色沉淀，冰上放置5-10min。
[0266] ⑸12000rpm离心10min。
[0267] ⑹轻轻将上清转移到含有0.8ml异丙醇的离心管里。不要吸到白色沉淀，颠倒混匀，冰上 5-10min。
[0268] ⑺室温12000rpm离心15min。
[0269] ⑻小心弃去上清，不要浮起沉淀，加入0.5ml70％的乙醇。颠倒离心管数次清洗沉淀。
[0270] ⑼室温12000rpm离心5min。
[0271] ⑽尽可能多的去除上清，不要搅动沉淀。室温5-10min
风干沉淀，不要过分干燥。
[0272] ⑾用40ul pH8.0的TE溶解DNA沉淀。为了避免剪切，不要机械的重选DNA，让溶液顺管子轻轻流下溶解DNA，4℃储存。
[0273] 3、PCR鉴定杆粒DNA
[0274] M13F(上游引物)：GTTTTCCCAGTCACGAC；M13R(下游引物)： CAGGAAACAGCTATGAC。本试验应用的是pFastBacTMDual载体，目的片段大小924bp。应用M13引物鉴定载体杆粒和重组杆粒DNA的大小分别是2560bp和3484bp，见图14，成功拿到重组杆粒。应用P1和B2引物鉴定重组杆粒DNA，目的V基因成功插入到载体 pFastBacTMDual中，见图15。
[0275] ⑴载体杆粒PCR鉴定。
[0276] PCR反应体系：10×Buffer 5uL，M13F和M13R上下游引物各1.5uL，模板0.2uL，Ex Taq 酶0.3uL，dNTP5uL，水36.5uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃ 30s，72℃3min，35个循环，72℃10min。扩增的基因片段大小为2560bp左右(见表9)，如图14所示。
[0277] 表9：M13引物鉴定重组杆粒目的片段大小
[0278]样品 PCR产物扩增的大小
杆状病毒基因组的质粒(杆粒) ～300bp
重组pFastBacTM1杆粒 ～2300bp+目的基因
TM
重组pFastBac 1–Gus杆粒 ～4200bp
重组pFastBacTMHT杆粒 ～2430bp+目的基因
重组pFastBacTMHT–CAT杆粒 ～3075bp
重组pFastBacTMDual杆粒 ～2560bp+目的基因
TM
重组pFastBac Dual–Gus/CAT杆粒 ～5430bp
[0279] ⑵重组杆粒(pFastBacTMDual+V)DNAPCR鉴定。
[0280] PCR反应体系一：10×Buffer 5uL，引物M13F和M13R上下游引物各1.5uL，模板0.2uL，Ex Taq酶0.3uL，dNTP5uL，水36.5uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，
55℃30s，72℃4min，35个循环，72℃10min。扩增的基因片段大小为3484bp左右，如图 14所示。
[0281] PCR反应体系二：10×Buffer 5uL，引物P1和PB上下游引物各1.5uL，模板0.2uL，Ex Taq 酶0.3uL，dNTP4uL，水37.5uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。扩增的基因片段大小为900bp左右，如图15所示。
[0282] 以上试验证明重组杆粒中含有目的基因V，下一步进行昆虫细胞的转染，产生重组杆状病毒。
[0283] (十一)、Sf9细胞的培养
[0284] Sf9细胞由天康生物技术有限公司赠送，Grace`s InsectMedium和胎牛血清均为Gibco公司生产。25cm2Sf9细胞长满后，弃去培养液，细胞瓶里加入含有10％的胎牛血清培养液2ml，用手掌敲打细胞瓶底部，使细胞脱落，一传三，放入27℃温箱培养，3-4天传代培养。
[0285] (十二)转染
[0286] 使用的转染试剂盒见图16，转染具体步骤如下。
[0287] ⑴1瓶25cm2Sf9细胞长满传代到6孔板上的4个孔里，2ml/孔，第二天进行转染。
[0288] ⑵摇菌15ml，平均分装到4个EP管里提取重组杆粒，具体方法如前所述。抽提的重组杆粒进行DNA浓度测定。测定V1＝5738ng/ul，且A260/A280＝1.756，表明此管提取的杆粒DNA 无RNA、蛋白质和酚等污染，放置4℃转染备用。
[0289] ⑶将1ug的杆粒DNA稀释进入100ul无血清的Grace培养基里，轻轻混匀。
[0290] ⑷颠倒5-10次完全混匀Cellfectin试剂，吸出6ul Cellfectin试剂进入100ul无血清的Grace 培养基。
[0291] ⑸将⑶和⑷上述两种液体轻轻混合在一起，总体积约210ul，室温抚育30分钟。
[0292] ⑹从温箱中拿出6孔板细胞，弃去培养基，用无血清Grace培养基清洗2次，清洗过程中避免细胞脱落。
[0293] ⑺向⑸的管子中加入0.8ml无血清的Grace培养基，轻轻混匀，加入到细胞孔中，27℃培养5小时。留一个细胞孔做对照，加入杆粒DNA载体，按照上述方法进行转染。
[0294] ⑻弃去细胞中的转染试剂，向细胞孔中加入2ml含10％胎牛血清的培养基，27℃孵育96 小时后，细胞有
病毒感染的现象。
[0295] ⑼收集上述杆状病毒P1代(无需反复冻融)4℃保存。
[0296] ⑽P1代500g离心5min，加上清300ul/孔接种到细胞里(6孔板)继续盲传到P3代进行鉴定。
[0297] (十三)SDS–PAGE鉴定
[0298] 杆状病毒P3代1ml 500g离心5min，弃上清沉淀用PBS溶解，取60ul样品加4倍上样缓冲液(购自上海生工)20ul混匀，煮沸5min。Sf9细胞对照(杆粒DNA载体)沉淀用PBS 溶解，按照上述方法处理样品。每孔上样10ul进行SDS–PAGE。如图17所示，成功拿到重组杆状病毒，目的V基因成功表达。
[0299] (十四)western–blot鉴定
[0300] SDS–PAGE之后1块胶进行转膜，使用PVDF膜，具体转膜步骤按照先前的方法进行。拿出转移好的膜，PBST洗涤3次，每次3min；用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；PBST洗涤 3次，加抗HA标签的单抗(购自上海生物工程有限公司)1:150，室温摇床孵育2小时；PBST 洗涤3次，加抗鼠的二抗1:2500，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，显色；显色液配方：1ml去离子水，0.01克氯化镍，9ml 20mM pH7.6的This-HCl，0.006克DAB，10ul30％双氧水；显色后晾干观察结果，见图18。表达的蛋白具有较好的反应原性。
[0301] (十五)pFastBacTMDual+V杆状病毒株的获得
[0302] 通过上述实验，V蛋白成功在杆状病毒株中进行表达。后续该蛋白进行了切胶免疫Balb/c 小鼠，产生的抗体效价低，没有用该蛋白进行单抗制备。
[0303] 实施例3三株单抗间接免疫荧光和抗体分型试验
[0304] (一)Sf9细胞表达V蛋白间接免疫荧光试验
[0305] ⑴1瓶长满的25cm2Sf9细胞1传4到96孔板里，第二天接毒400ul，10％的培养液继续培养3天。
[0306] ⑵接毒3天后弃掉细胞上清液，每孔轻轻加PBS洗涤2次，避免细胞被悬浮。
[0307] ⑶尽可能的去除细胞孔里的液体，每孔加无水乙醇100ul 4℃固定2小时。
[0308] ⑷弃掉固定液，干燥后加三株单抗3E6、4F2和4F11的腹水1:200，加HA单抗1:200，加 SP2/0细胞上清做对照，37℃1小时。
[0309] ⑸用PBS洗涤3次，轻轻拍板子甩干液体，加Sigma公司的抗鼠荧光抗体1:100，37℃1 小时。
[0310] ⑹用PBS洗涤3次，轻轻拍板子甩干液体，荧光显微镜下观察，见图19。结果表明三株单抗3E6、4F2和4F11反应原性较好；HA单抗也和杆状病毒表达的V蛋白(加HA标签)有较好的反应原性；阴性对照成立。
[0311] (二)vero细胞接种小反刍兽疫病毒Nigera75/1的间接免疫荧光试验
[0312] ⑴1瓶长满的25cm2vero细胞，1传20到96孔板里，同步接毒300ul，5％的培养液继续培养3天。
[0313] ⑵接毒3天后弃掉细胞上清液，每孔轻轻加PBS洗涤2次，避免细胞被悬浮。
[0314] ⑶尽可能的去除细胞孔里的液体，每孔加无水乙醇100ul 4℃固定2小时。
[0315] ⑷弃掉固定液，干燥后加三株单抗3E6、4F2和4F11的腹水1:200，加SP2/0细胞上清做对照，37℃1小时。
[0316] ⑸用PBS洗涤3次，轻轻拍板子甩干液体，加Sigma公司的抗鼠荧光抗体1:100，37℃1 小时。
[0317] ⑹用PBS洗涤3次，轻轻拍板子甩干液体，荧光显微镜下观察，见下图20。结果表明三株单抗3E6、4F2和4F11具有较好的反应原性。
[0318] (三)三株单抗抗体分型试验
[0319] 购自Thermo公司的抗体分型试剂盒，按照说明书进行操作，三株单抗3E6、4F2和4F11 抗体类型分别是IgMλ型、IgMλ型和IgMκ型，如图21所示。
[0320] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
