氨苄西林抗体检测试剂盒及其制备和使用方法
专利汇可以提供氨苄西林抗体检测试剂盒及其制备和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 氨 苄西林 抗体 检测 试剂 盒 及其制备和使用方法，主要是由氨苄西林抗体检测试剂卡、氨苄西林处理红细胞、非氨苄西林处理红细胞、氨苄西林抗体阳性对照液、氨苄西林抗体阴性对照液组成。该试剂盒具有操作简单，灵敏度与 稳定性 强，在临床应用上更加方便，能够对患者进行氨苄西林抗体的快速检测。，下面是氨苄西林抗体检测试剂盒及其制备和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种氨苄西林抗体检测试剂盒，其特征在于：主要是由氨苄西林抗体检测试剂卡、氨苄西林处理红细胞、非氨苄西林处理红细胞、氨苄西林抗体阳性对照液、氨苄西林抗体阴性对照液组成。
2.一种制备权利要求1所述氨苄西林抗体检测试剂盒的方法，其特征在于：包括如下步骤，各步骤间无先后次序，
步骤一、氨苄西林抗体检测试剂卡
(1.1)、量取：按批量取葡聚糖凝胶作为溶胀胶，将葡聚糖凝胶量取转移至洁净并灭菌的容器中；
(1.2)、洗涤：用氯化钠溶液洗涤葡聚糖凝胶，充分混匀，离心后移去上清液，重复操作5次以上，得洗涤后凝胶，作好标识；
(1.3)、配制：按批量量取抗人球蛋白试剂(抗IgG+C3d)，按抗体与凝胶体积比为1:3的比例，将抗人球蛋白试剂加入洗涤后的凝胶中混合，分别混合均匀成抗体凝胶，作好标识待用；
(1.4)、灌装、离心：将连续加样枪调到准确刻度，质量控制人员监控，按照每孔固定微升的抗体凝胶量将抗人球蛋白试剂凝胶加入到微管中，勿使凝胶附着在微管上端的反应槽壁上,；
(1.5)、封口：离心结束后，卡转移至封口机上封口；
步骤二、氨苄西林处理红细胞
(2.1)、过滤、洗涤：取O型原料血红细胞，用一次性白细胞过滤器过滤，将三人份的O型原料血红细胞混合，用氯化钠溶液洗涤，离心后移去上清液，重复操作3次以上；
(2.2)、药物致敏
a氨苄西林药物溶液配制：按批量称取硼酸、氯化钾，加纯化水充分溶解，配制为
0.1mol/L、pH9.8±0.1硼酸缓冲液，加入按批量称取的氨苄西林，充分溶解混匀，即得氨苄西林药物溶液；
b氨苄西林药物处理细胞：按批量量取氨苄西林药物溶液，加入O型红细胞压积，37℃孵育1小时，间断性混匀一次，使用氯化钠溶液洗涤致敏红细胞3次以上或直到上清无溶血现象，用血细胞分析用稀释液稀释至2～2.5％浓度，2～8℃保存；
(2.3)、分装：取氨苄西林药物处理细胞，分装至滴瓶中，于2～8℃保存；
步骤三、非氨苄西林处理细胞
(3.1)、过滤、洗涤：取O型原料血红细胞，用一次性白细胞过滤器过滤。将三人份的O型原料血红细胞混合，用氯化钠溶液洗涤，离心后移去上清液，重复操作3次以上，用血细胞分析用稀释液稀释至2～2.5％浓度，2～8℃保存；
(3.2)、分装：取非氨苄西林药物处理细胞，分装至滴瓶中，于2～8℃保存；
步骤四、氨苄西林抗体阳性对照液
(4.1)、制备：取一定效价的氨苄西林单克隆抗体，用BSA稀释；
(4.2)、分装：取过滤后的氨苄西林抗体阳性对照，分装至聚乙烯瓶中，每瓶3ml，于2～8℃保存；
步骤五、氨苄西林抗体阴性对照液
分装：取过滤后的氨苄西林抗体阴性对照，分装至瓶中，于2～8℃保存。
3.根据权利要求2所述的氨苄西林抗体检测试剂盒的方法，其特征在于：所述氯化钠溶液的浓度为0.9wt％。
4.根据权利要求3所述的氨苄西林抗体检测试剂盒的方法，其特征在于：步骤一中
0.9％氯化钠溶液与葡聚糖凝胶体积比为2:1；步骤二、三中原料血与0.9％氯化钠溶液体积比为1:4。
5.根据权利要求2所述的氨苄西林抗体检测试剂盒的方法，其特征在于：步骤一封口步序的封口条件为：0.3～0.35MPa压力、温度158±2℃，时间3秒/卡。
6.根据权利要求2所述的氨苄西林抗体检测试剂盒的方法，其特征在于：所述氨苄西林单克隆抗体的制备方法，步骤如下
(1)饲养细胞的制备：
取6-10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡与75％酒精内，消毒3-5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的10mL无血清1640培养液，用镊子底部轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入10mL离心管，1200r/min离心10min；
弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃CO2培养箱培养；
(2)杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选
a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有一定无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液以
1000r/min离心5min，弃上清；重复上一步骤，再洗一次；
b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；
c.按照1/10或1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；
d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；
e.将含融合细胞的离心管置于于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s；
f.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于37℃静置5min，
1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT(终浓度)，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；
g.5天后每孔补充50μL含1×HT的完全培养液；
h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；
i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；
j.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；
k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；
l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行交叉筛选；
m.制备饲养细胞层100μL/孔，2×104个/孔,，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存与液氮罐中，记录冻存位置。
7.一种权利要求1所述氨苄西林抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于：操作步骤如下
(1)、取氨苄西林抗体检测试剂卡，每份待检患者样本标记4孔，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；
(2)、向第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔的每孔中加入氨苄西林处理的红细胞悬液，向第Ⅳ孔中加入非氨苄西林处理的红细胞悬液；
(3)、向第Ⅰ和第Ⅳ孔中分别加入待检样本血浆，第Ⅱ孔中加入阳性对照液，第Ⅲ孔中加入阴性对照液，混匀，置试剂卡孵育器37±1℃孵育1小时以上；
(4)、置离心机离心，30min内观察结果并记录；
(5)、结果判定
阳性结果：红细胞位于胶表面或者悬浮在胶中均为阳性反应；
阴性结果：红细胞全部沉积在微孔底部为阴性。
氨苄西林抗体检测试剂盒及其制备和使用方法
技术领域
背景技术
发明内容
10min；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃CO2培养箱培养；
1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT(终浓度)，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；
具体实施方式
2.5％浓度，2～8℃保存。
10min；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃CO2培养箱培养；
1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT(终浓度)，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；
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