技术领域
[0001] 本
发明涉及免疫原和抗体及其制备方法，特别是用于针对1,3-β-D-葡聚糖免疫原和抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆的抗体及其制备方法。
背景技术
[0002] 侵袭性
真菌疾病(Invasive fungal disease，IFD)又称深部真菌感染，指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖引致组织损害、器官功能障碍、
炎症反应的病理改变及病理生理过程。
[0003] 近年来，由于广谱抗菌药物、肾上腺皮质
激素、
肿瘤化疗、放疗和器官移植后免疫
抑制剂的长期广泛应用以及
艾滋病的流行，侵袭性真菌疾病的发病率逐年升高，该疾病早期症状无特异性，病程长，发现较晚，死亡率极高。因此，对侵袭性真菌疾病
治疗成败关键在于早期诊断、早期给予抗真菌治疗。
[0004] 目前侵袭性真菌疾病诊断的常规方法，阳性率低、很难确诊，而非常规方法检测成本高、实验条件苛刻很难在医院普遍推广。常用的鲎
试剂检测1,3-β-D-葡聚糖，
假阳性因素较多，其它
抗原、抗体和酶类检测产品一般只针对特定几种真菌，不适合侵袭性真菌疾病大量临床筛选工作。而酶联
免疫吸附试验(ELISA)技术成熟，成本相对较低，诊断快速，便于临床实验室使用。因此，针对真菌1,3-β-D-葡聚糖的ELISA检测体系具有十分重要的临床应用价值，而制备抗1,3-β-D-葡聚糖抗体是建立该ELISA体系的关键技术。
[0005] 非
专利文献“(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA检测方法建立及初步临床应用”(现代检验医学杂志，2003年，第5期)中公开了以半乳糖神经酰胺为包被物,鼠抗(1,3)-β-D-葡聚糖单克隆抗体、
生物素化抗鼠IgG和辣根过
氧化物酶标记亲和素为检测系统建立ELISA法。
[0006] 非 专 利 文 献“Development of a two-site enzyme immunoassay based on monoclonal antibodies to measure airborne exposureto(1→3)-β-d-glucan”(Journal of Immunological Methods，V.337,No.1)以氧化昆布多糖免疫小鼠，得到1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，在此
基础上，建立了一种双抗体夹心ELISA法。但上述方法中使用的是抗(1,3)-β-D-葡聚糖单克隆抗体，制备方法较为复杂。
[0007] 尽管
现有技术中公开有葡聚糖多克隆抗体的制备方法，通常采用葡聚糖与BSA交联物为抗原，进行动物免疫后，获得葡聚糖多克隆抗体。但是上述葡聚糖多克隆抗体或者不具备特异性或者抗体的纯度和效价也不能满足疾病检测的需要，不适用于ELISA检测体系。
[0008] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法。
发明内容
[0009] 本发明的一个目的在于提供一种1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法，解决1,3-β-D-葡聚糖抗体制备工艺复杂，效价低，特异性差的
缺陷。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体在侵袭性真菌疾病检测中的应用，成本相对较低，诊断快速，降低了检测的假阳性，适合于侵袭性真菌疾病大量临床样本的筛选。
[0011] 因此，本发明第一方面提供了一种1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，所述抗体的制备方法包括：
[0012] (1)制备1,3-β-D-葡聚糖免疫原；
[0013] (2)用1,3-β-D-葡聚糖免疫原进行动物免疫；
[0014] (3)从免疫后的动物体内取血；
[0015] (4)依次用饱和
硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。
[0016] 本发明所述的步骤(1)中，制备1,3-β-D-葡聚糖免疫原的方法包括：将1,3-β-D-葡聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1,3-β-D-葡聚糖免疫原；或者，将真菌孢子和/或菌体培养后
破碎获得破碎液制备得到1,3-β-D-葡聚糖免疫原。多抗制备的关键是免疫抗原的合成，免疫抗原需要纯度好,而且能保持1,3-β-D-葡聚糖的化学结构,有利于后续动物体内抗体的产生。
[0017] 所述的步骤(1)为1,3-β-D-葡聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1,3-β-D-葡聚糖免疫原时，1,3-β-D-葡聚糖可以为本领域熟知的1,3-β-D-葡聚糖，例如海带多糖(Laminarin)、茯苓多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苓多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香菇多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、
酵母葡聚糖(Yeast glucan)、
大麦葡聚糖(Barley glucan)、燕麦葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等。优选的，所述的1,3-β-D-葡聚糖选自海带多糖、茯苓多糖、羧甲基化茯苓多糖、凝胶多糖、羧甲基化凝胶多糖。最优选，所述的1,3-β-D-葡聚糖为凝胶化多糖或羧甲基化凝胶多糖。所述的偶联蛋白可以为
牛血清
白蛋白(Bull serum albumin，BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、破伤
风毒素(Tetanus toxin，TT)、鸡卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)，优选为牛血清白蛋白。1,3-β-D-葡聚糖和蛋白的偶联方法可以选用碘酸盐氧化法、DMTMM试剂法、
碳二亚胺法、戊二
醛法、活化脂法、混合酸酐法等。
[0018] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的偶联步骤包括：将海带多糖溶液和NaIO4溶液混合，室温避光反应0.5-3小时，优选反应1小时，用色谱柱脱盐，将得到的溶液中加入牛血清白蛋白和NaBH3CN溶液，室温振荡反应，加入NaBH4溶液，室温振荡反应，用
磷酸盐缓冲液
透析，离心除去沉淀。在本发明的另一个具体实施方式中，所述的偶联步骤包括：将羧甲基化茯苓多糖和/或羧甲基化凝胶多糖溶液和DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
盐酸盐)溶液混合，振荡反应，超纯
水透析过夜，加入BSA，室温避光振荡过夜，离心除去沉淀。
[0019] 所述的步骤(1)为真菌孢子和/或菌体培养后破碎获得破碎液制备得到1,3-β-D-葡聚糖免疫原时，所述的真菌为本领域适用的致病真菌，包括曲霉菌(Aspergillus)、念珠菌(Candida albaican)、隐球菌(Crytococcus)、毛霉菌(Mucor)、
马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)、镰刀菌(Fusarium)、卡氏
肺孢子菌(Penumocystis carinii bacteria)。所述的真菌菌体可以采用经液体培养基
发酵收集菌体；所述的真菌孢子可以经平皿固体培养洗脱收集孢子。所述的破碎步骤可以采用
研磨破碎和/或超声破碎。在本发明一个具体实施方式中，所述步骤(1)可以包括：将致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，用含体积百分比1-10％甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液；或者，将致病真菌经平皿固体培养洗脱收集孢子，用含体积百分比
1-10％甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，孢子用超声破碎，收集上清液。
[0020] 优选的，所述的步骤(1)中，1，3-β-D-葡聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1,3-β-D-葡聚糖免疫原后，任选的包括对蛋白修饰后1，3-β-D-葡聚糖的鉴定步骤，所述的鉴定方法方法包括高效凝胶排阻色谱法、紫外/红外吸收
光谱法、聚丙烯酰胺凝胶
电泳法等。
[0021] 本发明所述的步骤(2)中，所述的动物可以为本领域使用的制备多克隆抗体的动物，选自：小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或两种以上，优选为小鼠、大鼠、兔。所述免疫的方法选自皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、
腹腔注射法等。步骤(2)免疫步骤中的免疫剂量可视具体动物种类而定，优选的免疫剂量为10-1000μg/只/次。在本发明一个优选的是实施方式中，所述的步骤(2)包括：将步骤(1)得到的1,3-β-D-葡聚糖免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对动物进行皮下多点注射，免疫剂量为每只动物10-1000μg，初次免疫后每2-4周免疫1次，免疫次数≥3次。优选的，所述的初次免疫后每2周免疫1次，免疫次数为3-5次，更优选的免疫次数为3次。
[0022] 本发明所述的步骤(3)中，优选的，从免疫后的动物体内取血前，还包括测定免疫后动物的血清效价的步骤，更优选的，所述的测定免疫后动物的血清效价步骤在免疫后每隔1-7天进行一次。所述的步骤(3)中从免疫后的动物体内取血为处死后
采血，也可以不处死。更优选的，所述的从免疫后的动物体内取血步骤包括：用颈动脉
放血的方法采血，待血液
凝固，血清分离出后，离心，取上清。
[0023] 本发明所述的步骤(4)中，所述的纯化方法为先用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行初步纯化，再用亲和层析法进一步纯化。现有的抗体纯化方法存在多种，例如硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、轻基
磷灰石层析法、凝胶层析法、亲和层析法。不同性质的抗体适用的纯化方法不同，需要筛选出工艺简单、能够得到高效价抗体。
[0024] 本发明所述的饱和硫酸铵盐析沉淀法包括：取步骤(3)得到的血清，加等体积的生理盐水，再加入饱和硫酸铵溶液，0-10℃沉淀过夜,优选为4℃沉淀过夜；10000G离心5-20min，优选离心10min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，
0-10℃静置0.5-2h，优选4℃静置1h；10000G离心5-20min，优选离心10min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液0-10℃透析过夜，优选4℃透析过夜。
[0025] 本发明所述的亲和层析法包括：用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体。优选的，所述的洗脱缓冲液为甘
氨酸-盐酸缓冲液(pH 4.2)、
柠檬酸缓冲液(pH 4.5)等中的一种，所述的偶联缓冲液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)等中的一种，所述的亲和色谱柱为用1,3-β-D-葡聚糖抗原、葡萄球菌A蛋白或者链球菌G蛋白交联的固相载体作为柱填料。
[0026] 本发明的另一方面提供了一种1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备方法，包括：
[0027] (1)制备1,3-β-D-葡聚糖免疫原；
[0028] (2)用1,3-β-D-葡聚糖免疫原进行动物免疫；
[0029] (3)从免疫后的动物体内取血；
[0030] (4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。
[0031] 优选的，所述的步骤(1)包括：
[0032] 将1,3-β-D-葡聚糖和NaIO4溶液混合，室温避光反应0.5-3小时，优选反应1小时，用色谱柱脱盐，将得到的溶液中加入按
质量比为抗原1,3-β-D-葡聚糖1-10倍的BSA和NaBH3CN溶液，室温振荡反应，加入NaBH4溶液，室温振荡反应，用磷酸盐缓冲液透析，离心除去沉淀；
[0033] 或者，将1,3-β-D-葡聚糖免疫原和DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)溶液混合，振荡反应，超纯水透析过夜，加入按质量比为抗原1,3-β-D-葡聚糖1-10倍的BSA，室温避光振荡过夜，离心除去沉淀；
[0034] 或者，将致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，用含体积百分比1-10％甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液；
[0035] 或者，将致病真菌经平皿固体培养后，洗脱收集孢子，用含体积百分比1-10％甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，孢子用超声破碎，收集上清液。
[0036] 所述的1,3-β-D-葡聚糖优选为海带多糖、茯苓多糖、羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖中的一种或两种以上的组合。
[0037] 优选的，所述的步骤(2)包括：将步骤(1)得到的1,3-β-D-葡聚糖免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对动物进行皮下多点注射，免疫剂量为每只动物10-1000μg，初次免疫后每2-4周免疫1次，免疫次数≥3次。
[0038] 优选的，所述的步骤(3)包括：测定免疫后动物的血清效价后，用颈动脉放血的方法采血，待血液凝固，血清分离出后，离心，取上清。
[0039] 优选的，所述的步骤(4)包括：所述的纯化方法为先用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行初步纯化，再用亲和层析法进一步纯化。所述的饱和硫酸铵盐析沉淀法包括：取步骤(3)得到的血清，加等体积的生理盐水，再加入饱和硫酸铵溶液，0-10℃沉淀过夜,优选为4℃沉淀过夜；10000G离心5-20min，优选离心10min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，0-10℃静置0.5-2h，优选4℃静置1h；10000G离心5-20min，优选离心10min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液0-10℃透析过夜，优选4℃透析过夜。所述的亲和层析法包括：用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体。优选的，所述的洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(pH4.2)、柠檬酸缓冲液(pH 4.5)等中的一种，所述的偶联缓冲液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)等中的一种，所述的亲和色谱柱为用1,3-β-D-葡聚糖抗原、葡萄球菌A蛋白或者链球菌G蛋白交联的固相载体作为柱填料。
[0040] 本发明的另一方面提供了一种所述的1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体在制备用于侵袭性真菌疾病检测的
试剂盒中的应用。所述的检测是指利用抗原抗体间的特异性结合反应，优选为酶联免疫吸附检测、免疫胶体检测、免疫
荧光检测检测、
化学发光免疫分析检测，更优选为酶联免疫吸附检测。侵袭性真菌疾病即侵袭性真菌感染引起的疾病，侵袭性真菌包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌、肺孢子菌、镰刀菌、暗色真菌、毛孢子菌、组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌、马尼菲青霉、孢子丝等，优选是烟曲霉菌、白色念珠菌和新型隐球菌。
[0041] 本发明的另一方面提供一种用于侵袭性真菌疾病检测的ELISA检测试剂盒，包括包被抗原、1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体和酶标二抗。所述的包被抗原为1,3-β-D-葡聚糖，例如海带多糖(Laminarin)、茯苓多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苓多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香菇多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、大麦葡聚糖(Barley glucan)、燕麦葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等，优选的，所述的1,3-β-D-葡聚糖选自海带多糖(Laminarin)、茯苓多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苓多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)，最优选，所述的1,3-β-D-葡聚糖为羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)。所述的1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体优选为本发明所述的1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体。所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG抗体，优选的为，HRP标记羊抗兔IgG抗体。
[0042] 在本发明的一个实施方式中，所述的用于侵袭性真菌疾病检测的ELISA检测试剂盒中还包括：洗涤液、底物显色液、抗原标准品、终止液中的一种或几种。所述的洗涤液优选为PBST洗涤液，所述的底物显色液为TMB显色液。所述的抗原标准品为1,3-β-D-葡聚糖抗原。所述的终止液优选为H2SO4，更优选为2mol/L H2SO4。
[0043] 本发明的还一方面提供了一种侵袭性真菌疾病的检测方法，包括：(1)以1,3-β-D-葡聚糖为包被抗原制备抗原包被的酶标板；(2)使用(1)制备得到的抗原包被的酶标板，加入抗原标准品或者待检测样品，再加入1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，混匀后
37℃孵育；(3)用洗涤液洗板1-5次，加入酶标二抗，37℃孵育1-3h，洗涤液洗板1-5次，加底物显色液显色，加入终止液终止；(4)测定OD450nm。所述的包被抗原为1,3-β-D-葡聚糖，例如海带多糖(Laminarin)、茯苓多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苓多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香菇多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、大麦葡聚糖(Barley glucan)、燕麦葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等，优选的，所述的1,3-β-D-葡聚糖选自海带多糖(Laminarin)、茯苓多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苓多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)，最优选，所述的1,3-β-D-葡聚糖为羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)。所述的1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体优选为本发明所述的1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体。所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG抗体，优选的为，HRP标记羊抗兔IgG抗体。所述的待检测样品为待检测血清。
[0044] 在本发明的一个实施方式中，所述的使用侵袭性真菌疾病的检测方法，包括：(1)以1,3-β-D-葡聚糖为包被抗原制备抗原包被的酶标板；(2)使用(1)制备得到的抗原包被的酶标板，加入50μL抗原标准品或者待检测样品，再加入50μL1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，混匀后37℃孵育2h；(3)用PBST洗涤液洗板3次，加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30min，PBST洗涤液洗板3次，加入TMB底物显色液显色，加入终止液终止；(4)酶标仪读取OD450nm。
[0045] 本发明所述的一种侵袭性真菌疾病的检测方法可以是治疗目的的，可以是非治疗目的的。因而，本发明还提供了一种用于非治疗目的的检测侵袭性真菌疾病的方法。
[0046] 本发明提供了1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法，免疫原为化学修饰和真菌提取获得，纯度好,而且能保持1,3-β-D-葡聚糖的化学结构,制备的多克隆抗体具有高效价，高特异性的特点，用SDS-PAGE显示为均一抗体产物，间接法ELISA检测显示其效5
价不低于1:1.28×10，该抗体在侵袭性真菌疾病临床诊断领域中，应用前景广阔。
附图说明
[0047] 附图1显示了BSA修饰后的海带多糖的高效凝胶排阻色谱法检测结果。
[0048] 附图2显示了BSA修饰后的羧甲基化凝胶多糖免疫获得的兔IgG型多克隆抗体Ab-3B的SDS-PAGE检测结果。
[0049] 附图3显示了BSA修饰后的羧甲基化凝胶多糖免疫获得的兔IgG型多克隆抗体Ab-3B的效价测定结果。
[0050] 附图4显示了ELISA竞争法体系对各种菌体的特异性检测结果。
[0051] 附图5显示了ELISA竞争法体系的灵敏度检测结果。
具体实施方式
[0052]
实施例1 1,3-β-D-葡聚糖免疫原的制备
[0053] (1)海带多糖和BSA偶联制备免疫原
[0054] 将10mL 20mg/mL海带多糖溶液和0.5mL 5mol/LNaIO4溶液混合，室温避光反应60min，用Sephadex-G25柱脱盐。上述溶液中加入抗原海带多糖质量1-10倍的BSA和NaBH3CN溶液，室温振荡反应。加入NaBH4溶液，室温振荡反应。用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析过夜。最后离心除去沉淀。
[0055] (2)羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖和BSA偶联制备免疫原
[0056] 将羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖溶液和DMTMM溶液混合，振荡反应，超纯水透析过夜，加入抗原羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖质量1-10倍的BSA，室温避光振荡过夜，最后离心除去沉淀。
[0057] (3)采用真菌菌体和孢子制备免疫原
[0058] 将常见的致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，经平皿固体培养洗脱收集孢子，用含甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液，孢子用血球板法计数后，超声破碎，得到免疫原。
[0059] 实施例2 1,3-β-D-葡聚糖免疫原的鉴定
[0060] 使用高效凝胶排阻色谱法，取实施例1中按照(1)和(2)的方法制备得到的BSA修饰后的1,3-β-D-葡聚糖适当稀释，以5mg/mL的BSA溶液作为对照。色谱条件：色谱柱为TSK-GELG3000SWXL，进样体积为20μL，柱温为常温，流动相为0.3mol/L
氯化钠-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶液，流速为1mL/min，检测
波长为280nm。
[0061] 其中BSA修饰后的海带多糖的鉴定结果见附图1。
[0062] 实施例3 抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体的制备
[0063] (1)免疫动物
[0064] 将实施例1(1)中得到的1,3-β-D-葡聚糖免疫原(经BSA修饰的海带多糖)与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大
耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。
[0065] (2)多克隆抗体纯化
[0066] 1)效价测定：免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价1次，免疫次数不少于3次。
[0067] 2)分离抗血清：血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20℃保存。
[0068] (3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
[0069] 1)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀过夜。
[0070] 2)10000G低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mL磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加1mL饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。
[0071] 3)10000G低温离心10min，弃上清，将沉淀用1mL磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
[0072] (4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0073] 1)用10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0074] 2)用10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0075] 3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0076] 4)用10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0077] 5)用5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测器检测，收集蛋白峰即为抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体；
[0078] 6)用1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)调至pH值中性，用磷酸盐缓冲液透析过夜。
[0079] 其中，层析柱中用葡萄球菌A蛋白交联的固相载体作为柱填料，洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 4.2)，偶联缓冲液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。
[0080] 实施例4 抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体的制备
[0081] (1)免疫动物
[0082] 将实施例1(2)中得到的1,3-β-D-葡聚糖免疫原(经BSA修饰的羟甲基化茯苓多糖)与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。
[0083] (2)多克隆抗体纯化
[0084] 1)效价测定：免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价1次，免疫次数不少于3次。
[0085] 2)分离抗血清：血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20℃保存。
[0086] (3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
[0087] 1)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀过夜。
[0088] 2)10000G低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mL磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加1mL饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。
[0089] 3)10000G低温离心10min，弃上清，将沉淀用1mL磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
[0090] (4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0091] 1)用7.5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0092] 2)用7.5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0093] 3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0094] 4)用7.5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0095] 5)用4倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测器检测，收集蛋白峰即为抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体；
[0096] 6)用1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)调至pH值中性，用磷酸盐缓冲液透析过夜。
[0097] 其中，层析柱中用1,3-β-D-葡聚糖抗原交联的固相载体作为柱填料，洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，偶联缓冲液为0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)。
[0098] 实施例5 抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体的制备
[0099] (1)免疫动物
[0100] 将实施例1(2)中得到的1,3-β-D-葡聚糖免疫原(经BSA修饰的羟甲基化凝胶多糖)与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。
[0101] (2)多克隆抗体纯化
[0102] 1)效价测定：免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价1次，免疫次数不少于3次。
[0103] 2)分离抗血清：血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20℃保存。
[0104] (3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
[0105] 1)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀过夜。
[0106] 2)10000G低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mL磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加1mL饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。
[0107] 3)10000G低温离心10min，弃上清，将沉淀用1mL磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
[0108] (4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0109] 1)用5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0110] 2)用5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0111] 3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0112] 4)用5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0113] 5)用2倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测器检测，收集蛋白峰即为抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体；
[0114] 6)用1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)调至pH值中性，用磷酸盐缓冲液透析过夜。
[0115] 其中，层析柱中用葡萄球菌A蛋白交联的固相载体作为柱填料，洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，偶联缓冲液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。
[0116] 实施例6 抗1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体的验证
[0117] (1)SDS-PAGE电泳检测
[0118] 对实施例5制得的抗体Ab-3B进行SDS-PAGE电泳，得到的凝胶进行考马斯亮蓝
染色。
[0119] 实验结果见附图2，由图中可看出，在25kD和50kD分子量区有清晰明显的条带，证明抗体纯度高。
[0120] (2)抗体效价测定
[0121] 用间接ELISA法对实施例5制得的抗体Ab-3B抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为磷酸盐缓冲液。检测结果见附图3，从结5
果可看出，该抗体效价大于1:1.28×10，表明抗体效价高。
[0122] 实施例7 ELISA竞争法体系的建立和验证
[0123] 以羧甲基化凝胶多糖作为包被抗原，抗体Ab-3B和HRP标记羊抗兔IgG抗体作为检测抗体，建立了间接ELISA竞争法检测体系。检测方法如下：使用抗原包被的酶标板，分别依次加入50μL抗原标准品(或者处理后的血清)和50μL抗体Ab-3B，混匀后37℃孵育2h，PBST洗板3次，加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30min，PBST洗板3次，最后加TMB底物溶液显色后终止，酶标仪读取OD450nm。
[0124] (1)ELISA竞争法体系的特异性验证
[0125] 含菌血清样本的制备：分别称量10mg灭活处理的菌体干粉(菌体包括烟曲霉菌、白色念珠菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌、大肠杆菌、沙
门氏菌、克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌)，用健康人血清溶解并稀释，使血清样本中含100000、10000、1000、100、10和1ng/mL的菌粉，放入37℃恒温箱中孵育2d。
[0126] 血清样本处理：将血清样本和样本处理液混合，加热孵育，高速离心收集上清液。样本处理液为EDTA处理液、甘氨酸处理液和蛋白酶处理液等中的一种。
[0127] 最后用间接ELISA竞争法体系检测不同浓度的处理后的含菌血清样本。
[0128] 实验结果见附图4，由图看出，该抗体能有效的从血清样本中的检出3种常见的真菌性病原菌(包括烟曲霉菌、白色念珠菌和新型隐球菌)，并且对5种常见的细菌性病原菌(包括结核分枝杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌)抗干扰能
力强。证明抗体用于侵袭性真菌疾病检测具有高特异性。
[0129] (2)ELISA竞争法体系的灵敏度验证
[0130] 1,3-β-D-葡聚糖标准品的制备：用样本稀释液将海带多糖、茯苓多糖和凝胶多糖稀释到10000、1000、100、10、1、0.1和0.01ng/mL，样本稀释液为0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)等中的一种。
[0131] 最后用间接ELISA竞争法体系检测上述不同浓度的1,3-β-D-葡聚糖抗原标准品。
[0132] 实验结果见附图5，由图看出，该间接ELISA竞争法体系对海带多糖、茯苓多糖和凝胶多糖的检测下限至少能达到1、0.1和0.01ng/mL。
[0133] 本
说明书上文中结合具体实施方式对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本
申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的
权利要求书限定，并且涵盖了权利要求的等同变换。
