一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物
专利汇可以提供一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种促进骨髓再生的Endomucin 抗体 药物，公开了Endomucin对造血细胞的增殖、分化具有负调控作用，即对骨髓恢复、再生具有抑制作用，而Endomucin抗体可以削弱这种抑制作用，促进骨髓造血功能的恢复。采用骨髓瘤细胞融合技术制备Endomucin单克隆抗体，制成药物制剂，对5-Fu化疗的小鼠进行 治疗 ，能够促进骨髓细胞的恢复、再生，可以显著提高化疗小鼠的生存率，对骨髓再生功能具有明显的促进作用。Endomucin在调控骨髓造血功能方面的功能，具有巨大的潜在临床应用和研究价值。，下面是一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物专利的具体信息内容。
1.Endomucin在制备促进骨髓再生的抗体药物中的用途。
2.一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物的制备方法，包括以下步骤：
1）Endomucin基因的克隆、蛋白表达与纯化
采用基因合成的方法制备人Endomucin基因，将人Endomucin全长基因分别克隆到pGEX-2T载体中，使目的基因接到谷胱苷肽巯基转移酶（GST）基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达；然后应用anti-GST的亲和层析介质Glutathione-Sepharose对GST-Endomucin融合蛋白进行纯化，采用凝血酶切下GST肽段，获得纯度超过98%的人Endomucin蛋白；
2）Endomucin单克隆抗体的制备与纯化
①抗原免疫：选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案，每次将0.5mL，20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞；
②细胞融合：在免疫结束后的第14天，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备10mL脾细胞悬液；将准备好的SP20骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合剂聚乙二醇；使各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
③杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：在HAT培养基中培养杂交瘤细胞，只有少数是分泌人Endomucin单克隆抗体的细胞能够生长，用有限稀释法在96孔细胞培养板上进行杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养，应用ELISA方法筛选出能产生Endomucin单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；在T100细胞培养瓶中进行杂交瘤细胞的克隆扩增，培养条件为37℃,5%CO2,然后取10mL细胞混悬液转入850 mL罗氏瓶中进一步扩增，最后向收获的细胞培养液中加入20%二甲基亚砜，在液氮中对杂交瘤细胞株进行冻存；④单克隆抗体的大量制备：应用CelliGen Plus生物反应器，工作容积14升罐体中间填装200g的聚酯片载体Cytodex I；
聚酯片载体Cytodex I是由50%聚酯纤维和50%聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，比表面
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积为120mm/mm；搅拌和通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，促使培养基不断流经聚酯片载体Cytodex I，以利于营养物质和气体的传递；采用连续灌流方式对杂交瘤细胞进行培养，培养基是CD杂交瘤细胞培养基；培养条件为：温度37℃，pH7.2，搅拌速度60-80rpm，
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溶氧40-50%，接种细胞密度2-3×10/mL，四气混合系统供气（氧气、空气、氮气、二氧化碳）；
在培养过程中，杂交瘤细胞产生单克隆抗体并分泌到细胞培养液中，培养21天后收集细胞培养液，应用Contifuge Stratos连续流离心机进行连续流离心处理，在4℃、12000rpm条件下离心去除细胞及其碎片，流速80mL/min，离心收获的上清液是含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液；
⑤单克隆抗体的纯化：
应用AKTA Explorer 100蛋白纯化系统进行人Endomucin单克隆抗体的亲和层析纯化；亲和层析柱的介质为Mabselect Sure，将人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液进行亲和层析柱纯化；柱层析纯化的流速是5mL/min，以20mM,pH7.4的磷酸盐缓冲液作为平衡柱缓冲液和上样缓冲液，以4个柱体积（CV）的平衡缓冲液平衡Mabselect Sure柱后，将离心收获的含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液调整为pH7.4后直接上柱，上样量约是10CV，上样结束后以约2CV的平衡缓冲液洗净未结合的杂蛋白；以20mM,pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱并收获Endomucin单克隆抗体，然后以0.1N NaOH冲洗层析柱4CV，清洗柱中的杂蛋白和再生介质，以20%乙醇冲洗层析柱2CV保存柱子；通过一步亲和层析柱纯化收获纯度超过95%的人Endomucin单克隆抗体；将纯化收获的人Endomucin单克隆抗体溶液应用Centramate Cassette超滤器进行超滤浓缩和溶液置换，采用截留分子量
10000道尔顿的膜包，超滤缓冲液为pH7.4,140mM NaCl,0.5mM EDTA,将Endomucin抗体溶液体系置换为pH7.4,140mM NaCl,0.5mM EDTA,按照终浓度20mg/mL进行稀释配制，制备人Endomucin单克隆抗体制剂。
一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物
技术领域
背景技术
发明内容
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小圆盘，比表面积为120mm/mm；搅拌和通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，促使培养基不断流经聚酯片载体Cytodex I，以利于营养物质和气体的传递；采用连续灌流方式对杂交瘤细胞进行培养，培养基是CD杂交瘤细胞培养基；培养条件为：温度37℃，pH7.2，搅
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拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接种细胞密度2-3×10/mL，四气混合系统供气（氧气、空气、氮气、二氧化碳）；在培养过程中，杂交瘤细胞产生单克隆抗体并分泌到细胞培养液中，培养
21天后收集细胞培养液，应用Contifuge Stratos连续流离心机进行连续流离心处理，在
4℃、12000rpm条件下离心去除细胞及其碎片，流速80mL/min，离心收获的上清液是含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液；
附图说明
具体实施方式
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50%聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，比表面积为120mm/mm。搅拌和通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，促使培养基不断流经聚酯片载体Cytodex I，以利于营养物质和气体的传递。采用连续灌流方式对杂交瘤细胞进行培养，培养基是Gibco 公司的CD杂交瘤细胞培养基。培养条件为：温度37℃，pH7.2，搅拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接种细胞密
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度2-3×10/mL，四气混合系统供气（氧气、空气、氮气、二氧化碳）。在培养过程中，杂交瘤细胞产生单克隆抗体并分泌到细胞培养液中，培养21天后收集细胞培养液，应用Contifuge Stratos连续流离心机（美国Thermo Fisher公司）进行连续流离心处理，在4℃、12000rpm条件下离心去除细胞及其碎片，流速80mL/min，离心收获的上清液是含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液。
0.1N NaOH冲洗层析柱4CV，清洗柱中的杂蛋白和再生介质，以20%乙醇冲洗层析柱2CV保存柱子。通过一步亲和层析柱纯化收获纯度超过95%的人Endomucin单克隆抗体。将纯化收获的人Endomucin单克隆抗体溶液应用Centramate Cassette超滤器（美国PALL公司）进行超滤浓缩和溶液置换，采用截留分子量10000道尔顿的膜包，超滤缓冲液为pH7.4,140mM NaCl,0.5mM EDTA,将Endomucin抗体溶液体系置换为pH7.4,140mM NaCl,0.5mM EDTA,按照终浓度20mg/mL进行稀释配制，制备人Endomucin单克隆抗体制剂。
5-Fu后连续5天皮下注射0.2mL抗体(10mg/mL)。统计小鼠的死亡情况，对照组的小鼠从
5-Fu注射后第7天开始出现死亡情况，至第12天共有17只小鼠死亡，仅有3只小鼠健存，存活率15%；而治疗组至第十二天只有5只小鼠死亡，有15只小鼠健存，存活率75%，死亡率从85%提高到25%；治疗组与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。统计分析发现，对照组小鼠的平均生存时间为8.8天，治疗组小鼠的平均生存时间＞12天，与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。实验结果表明，Endomucin单克隆抗体可以提高小鼠对5-Fu化疗药物的耐受剂量， Endomucin抗体对小鼠骨髓造血恢复、再生具有促进作用。
5-Fu后连续5天皮下注射0.4mL抗体(10mg/mL)。统计小鼠的死亡情况，对照组的小鼠从
5-Fu注射后第7天开始出现死亡情况，至第12天共有18只小鼠死亡，仅有2只小鼠健存，存活率10%；而治疗组至第十二天只有3只小鼠死亡，有17只小鼠健存，存活率85%，死亡率从90%提高到15%；治疗组与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。统计分析发现，对照组小鼠的平均生存时间为8.6天，治疗组小鼠的平均生存时间＞12天，与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。实验结果表明，Endomucin单克隆抗体可以提高小鼠对5-Fu化疗药物的耐受剂量， Endomucin抗体对小鼠骨髓造血恢复、再生具有促进作用。
5-Fu后连续5天皮下注射0.6mL抗体(10mg/mL)。统计小鼠的死亡情况，对照组的小鼠从
5-Fu注射后第7天开始出现死亡情况，至第12天共有18只小鼠死亡，仅有2只小鼠健存，存活率10%；而治疗组至第十二天只有4只小鼠死亡，有16只小鼠健存，存活率80%，死亡率从90%提高到20%；治疗组与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。统计分析发现，对照组小鼠的平均生存时间为8.3天，治疗组小鼠的平均生存时间＞12天，与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。实验结果表明，Endomucin单克隆抗体可以提高小鼠对5-Fu化疗药物的耐受剂量， Endomucin抗体对小鼠骨髓造血恢复、再生具有促进作用。
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