专利汇可以提供利用GST表达体系制备的hZimp10-N端高效价抗体及应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 工程 技术领域,涉及利用GST表达体系制备的hZimp10-N端高效价 抗体 及应用。利用基因工程技术,将hZimp10基因N端克隆到原核表达载体中,经酶切鉴定后,用重组质粒转化大肠杆菌,并IPTG诱导产生GST-hZimp10融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测。该抗hZimp10多克隆抗体效价与特异性良好,可以应用于细胞中hZimp10蛋白的检测并能有效检出hZimp10蛋白在不同细胞中的差异表达,对于系统研究hZimp10蛋白功能及其在 肿瘤 细胞凋亡中的作用机制意义重大。,下面是利用GST表达体系制备的hZimp10-N端高效价抗体及应用专利的具体信息内容。
1.利用GST表达体系制备的hZimp10-N端高效价抗体,其特征在于利用GST表达体系以hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-hZimp10融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得,该抗血清中抗GST-hZimp10抗体的滴度高达
1∶100 000,并经过Western blot鉴定该抗GST-hZimp10血清具有较好的特异性,其中,N端128个氨基酸序列为:
其对应核苷酸序列为:
1 atgaattcta tggacaggca catccagcag accaatgacc gactgcagtg catcaagcag
61 cacttacaga atcctgccaa cttccacaat gccgccacgg agctgctgga ctggtgcgga
121 gacccacggg ccttccagcg gcccttcgag cagagcctga tgggctgttt gacggtggtc
181 agtcgggtgg cagcccagca aggctttgac ctggacctcg gctacagact gctggctgtg
241 tgtgctgcaa accgagacaa gttcaccccg aagtctgccg ccttgttgtc ctcctggtgc
301 gaagagctcg gccgcctgct gctgctccga catcagaaga gccgccagag cgatccccct
361 gggaaactcc ccatgcagcc ccct。
2.如权利要求1所述的原核表达GST-hZimp10融合蛋白的多克隆抗体的制备方法,其特征在于利用GST表达系统获得GST-hZimp10融合蛋白,再经免疫兔获得抗GST-hZimp10抗血清,具体包括四步:
第一步,PCR-PMD18-T/hZimp10重组质粒的构建,hZimp10基因N-128片段从Genebank 得到,基因序列号为AY235683,以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,上游引物为
5’-GGATCC ATGAAT TCTATG GACAGG(含BamHI,EcoRI酶切位点);下游引物为5’-CTAGAG AGGGGG CTGCAT GGGGAG(含XhoI酶切位点),扩增得到的片段与PMD18-T载体连接,将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以EcoR I和BamHI,Xhol I单双酶切鉴定;
第二步,原核表达载体pGEX-4T-1的构建,将含有hZimp10基因N-128片段的pMD18-T质粒经BamHI和Xho1双酶切后,利用回收试剂盒获得hZimp10基因N-128片段,同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1,然后将回收的hZimp10基因N-128片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜,酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定;
第三步,GST-hZimp10融合蛋白的诱导表达和纯化,重组质粒PGEX-4T-1/hZimp10转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中,37℃振摇培养过夜,次日,将培养物按
1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中,继续在37℃摇床培养至对数生长中期,在培养液的A600为0.5~0.6时,加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L,不加入IPTG者为阴性对照,置25℃继续培养4~5h,离心收集菌体,以SDS-PAGE进行鉴定GST-hZimp10融合蛋白的表达,并优化表达条件,进行大量扩增诱导,以5000r/min于4℃离心5min,收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀,用超声裂解细菌,再以9600rpm,于4℃离心15min,取上清,过Glutathione-Sepharose4B柱,先以等体积洗脱缓冲液1,含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl,pH=8.0,洗脱,收集洗脱液,再以等体积洗脱缓冲液2,含100mM谷胱甘肽,洗两遍,收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物;
第四步,兔抗hZimp10抗血清的制备及纯化
以纯化的hZimp10融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射,免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照,2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-hZimp10融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射,之后每隔2wk加强免疫1次,于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清,将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱,平衡柱子后加入经过稀释的抗血清,控制流速保证抗血清与填料的结合,即亲和层析使抗体结合在柱子上,经2次洗涤后,加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱,收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度,将含抗体的收集管混合,纯化后的抗体与纯化前的抗血清 用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定;
第五步,hZimp10抗体的免疫学检测
用GST-hZimp10融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照,将纯化后的GST-hZimp10抗体先稀释10倍再倍比稀释后,采用间接ELISA方法测定抗体的效价,并采用Western blot方法分析抗hZimp10血清特异性,将纯化的融合蛋白GST-hZimp10样品,经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上,以5%脱脂奶粉封闭1h,依次滴加兔抗鼠hZimp10抗血清,室温2h、PBS洗3次,山羊抗兔IgG2HRP,室温反应1h、PBS洗涤3次,最后加底物DAB显色,并拍照。
用
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