本发明提供一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法,通过将中药 提取物分别与PDE样品反应后,检测该PDE活性,判断抑制PDE活性的选 择性作用靶点;再根据中药提取物指纹图谱的变化,判断抑制PDE的有效 成分,从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。
本发明的目的是通过以下技术方法实现的:
一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法,该方法通过将中药提取 物分别与PDE样品反应后,检测该PDE活性,判断抑制PDE活性的选择性 作用靶点;再根据中药提取物指纹图谱的变化,判断抑制PDE的有效成分, 从而筛选出选择性磷酸二酯酶抑制剂。
该方法包括的步骤为:
I.中药提取物的制备:
A.将中药
原料药用蒸馏水淋洗后,加入水进行浸泡处理,再进行第 一次煎煮,得到第一次煎液,将所述的第一次煎液存入另一容器中;
B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮,得到第二 次煎液;将所述的第一次煎液与第二次煎液合并,得到总煎液;
C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理,得到浓缩液;所述的减压处 理的
温度为70℃;
D.向所述的浓缩液中加入95%
乙醇,边加边搅拌,得到混合溶液A; 将所述的
混合液A于4℃的环境中放置48小时,得到冷却后的混合液A; 所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3;
E.将所述的混合溶液A进行第一次离心处理,得到第一次上清液; 再将所述的第一次上清液中的乙醇去除,得到无醇上清液;
F.将所述的无醇上清液进行浓缩处理,直至生药浓度为1g/ml,得到生药 药液;
G.用pH值为7.4的PBS溶液调节所述的生药药液的pH值为7.4,再 用所述的pH值为7.4的PBS溶液将所述的生药药液稀释10倍体积,得到 生药稀释液;
H.将所述的生药稀释液中进行第二次离心处理,得到第二次上清液, 作为中药提取物样品;于4℃的环境中储存备用;
II.PDE样品制备:
A.动物组织PDE样品制备:
a.用心脏
放血快速致死的方法处死试验动物,迅速采集该试验动物的 各个组织;
b.分别向所述的动物的各个组织中加入钙镁PBS溶液,所述的各个 组织与所述的钙镁PBS溶液的重量比为1∶10;再将所述的各个组织和所 述的钙镁PBS溶液混合物
冰浴制成各个组织溶浆,置于-80℃超低温
冰箱 中保存备用,作为动物组织PDE样品;
B.动物骨骼肌PDE样品制备:
a.将试验动物处死后取骨骼肌组织,将所述的骨骼肌组织用Hank’s 平衡盐缓冲液清洗;
b.将所述的骨骼肌组织剪碎,进行消化处理,得到骨骼肌组织消化液; 该消化处理,再终止消化,得到骨骼肌组织消化终止液;所述的骨骼肌组 织消化终止液进行离心处理,弃上清得到沉淀物;
c.向所述的沉淀物中加入含血清培养基,将细胞团
块吹散,得到细 胞悬液;再将所述的细胞悬液进行过滤处理,得到骨骼肌细胞
d.将所述的骨骼肌细胞进行预培养,再进行细胞计数,再将所述的 预培养后的骨骼肌细胞进行培养;
e.进行所述的培养48小时后,将培养基更换为含10%FCS的 DMEM培养基继续培养;继续培养96小时后,将培养基更换为含5%胎
牛血清的DMEM培养基;
f.将所述的含5%胎牛血清的DMEM培养基培养过的骨骼肌细胞进 行清洗处理,得到清洗过的骨骼肌细胞;
g.将所述的清洗过的骨骼肌细胞加入钙镁PBS进行冻融处理,得 到细胞裂解液;
h.吸取10μl所述的细胞裂解液作为PDE酶样品,加入浓度为25 μmol·L-1的cAMP中进行反应,再将该反应终止,得到反应液;
i.将所述的反应液进行离心处理,得到上清液,将该上清液用纯水 做10倍稀释,得到动物骨骼肌PDE样品;吸取10μl所述的得到动物骨 骼肌PDE样品作为检测样品,测定PDE反应活性;
C.动物中性粒细胞PDE样品制备:
a.采集动物的新鲜血液,向该血液中加入肝素,得到
全血样品;
b.将葡聚糖溶液混入所述的全血样品中,进行沉降处理,得到上清 液;
c.将所述的上清液取出按3∶1比例轻铺在淋巴细胞分离液上,离 心处理后可见液体分为4层,保留最底层;
d.将所述的最底层进行纯化处理,得到高纯的中性粒细胞悬液;
e.用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液,得到中性粒细胞稀释 液;
f.将所述的中性粒细胞稀释液进行检测,再进行
粉碎处理,得到中 性粒细胞匀浆,即为所述的中性粒细胞PDE样品;
III.细胞孵育:
用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液,得到中性粒细胞稀释液;所 述的中性粒细胞稀释液中,中性粒细胞数目为107-108个/L;在24孔培养 板中,加入所述的白芍提取物样品和中性粒细胞稀释液,空白对照组加入 所述的白芍提取物样品和PBS,放入5%CO2
培养箱中培养,培养时间为 1小时;
将培养结束后的所述的中性粒细胞稀释液进行离心处理,得到上清 液;将所述的上清液进行除菌处理,得到细胞孵育样品;
IV.PDE活性检测:
A.配制反应体系:
中药管的反应体系:cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L,所 述的PDE样品量为10μL,cAMP 80μL,所述的中药样品量为10μL;
空白对照管的反应体系:加入灭活的所述的PDE样品10μL,用PBS 补充反应液总量至100μL;
同时设中药对照管,反应体系:所述的各种中药提取物10μL,PBS 90μL;
B.酶反应及活性检测:
a.将装有以上所述的各个反应体系的容器进行培养,所述的培养的温 度为35℃,时间为30分钟;
b.将容器在沸水浴中加热2分钟终止反应;
c.将该管进行离心处理,得到上清液;
d.从该上清液中取其中的80μL,用超纯水做10倍稀释,过0.22-0.45 μm微孔滤膜,得到HPLC样品;
检测结果中,PDE活性以底物
水解百分率表示:
PDE活性%=(空白对照管底物浓度-对照管或中药管底物浓度)/空 白对照管底物浓度×100%
所述的中药样品对PDE活性的影响用以下公式表示:
PDE活性变化率%=(空白对照管PDE活性-中药管PDE活性)/空 白对照管PDE活性×100%。
所述的PDE活性变化率大于50%的中药提取物所对应的原料药为该 PDE样品来源的组织或细胞的磷酸二酯酶抑制剂;
V.中药提取物指纹图谱检测:
将所述的中药提取物样品分别与所述的PDE样品和细胞孵育样品反 应后,如PDE活性显著降低,则进行高效液相色谱(HPLC)指纹图谱检 测,确定该中药的PDE活性特异性抑制成分。
本发明的有益效果为:
本发明能够快速、高效地从中药复杂成分中筛选组织或细胞特异性磷 酸二酯酶抑制剂,克服了现有的从中药中筛选PDE抑制剂成本高,难度大, 周期长,工作量大等不足。
附图说明
图1:白芍提取物样品与动物中性粒细胞PDE样品反应前后指纹图谱 变化;
图2:白芍提取物样品与中性粒细胞孵育前后指纹图谱变化。
实施例1:
不同组织PDE活性的大小,决定着其对环核苷酸的调节能力和不同激 动剂与抑制剂作用的发应水平。试验1主要研究了主要脏腑组织cAMP-PDE 和cGMP-PDE的活性大小,以及对不同传统归经药物的反应,分析药物归 经与PDE的关系。
试验1:
一种筛选磷酸二酯酶(PDE)抑制剂的方法,通过将中药提取物分别 与PDE样品反应后,检测该PDE活性及中药提取物指纹图谱的变化,判断 抑制PDE活性的选择性作用靶点及有效成分,并快速筛选出选择性磷酸二 酯酶抑制剂及其成分;该方法包括的步骤为:
I.中药提取物的制备:
A.将中药原料药用蒸馏水淋洗后,加入水进行浸泡处理,再进行第 一次煎煮,得到第一次煎液,将所述的第一次煎液存入另一容器中;所述 的浸泡处理中,所述的原料药与所述的水的重量比为1∶10-15,浸泡的时 间为0.5小时;所述的第一次煎煮中,时间为0.5小时;所述的中药原料 药为中药饮片:黄连、白芍、白术、防
风、通草,购自北京前
门同仁堂药 店;
B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮,得到第二 次煎液;将所述的第一次煎液与第二次煎液合并,得到总煎液;所述的第 二次煎煮中,时间为0.5小时;所述的第一次煎煮后的中药原料药与水的 重量比为1∶8;
C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理,得到浓缩液;所述的减压处理 的温度为70℃;所述的浓缩液和所述的中药原料药的重量比为0.8-1∶1;
D.向所述的浓缩液中加入95%乙醇,边加边搅拌,得到混合溶液A; 将所述的混合液A于4℃的环境中放置48小时,得到冷却后的混合液A; 所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3;
E.将所述的混合溶液A进行第一次离心处理,得到第一次上清液; 再将所述的第一次上清液中的乙醇去除,得到无醇上清液;所述的第一次 离心处理中,转速为3000rpm,时间为20分钟;所述的去除乙醇的方法 为旋转
蒸发,采用的仪器为
旋转蒸发仪,温度为65℃;
F.将所述的无醇上清液进行浓缩处理,直至生药浓度为1g/ml,得到 生药药液;
G.用pH值为7.4的PBS溶液调节所述的生药药液的pH值为7.4,再 用所述的pH值为7.4的PBS溶液将所述的生药药液稀释10倍体积,得到 生药稀释液;
H.将所述的生药稀释液中进行第二次离心处理,得到第二次上清液, 作为中药提取物样品,于4℃的环境中储存备用;所述的第二次离心处理 中,转速为10000rpm,时间为20分钟;
II.PDE样品制备:
A.动物组织PDE样品制备:
a.用心脏放血快速致死的方法处死试验动物,迅速采集该试验动物的 各个组织;该组织为心、肝、脾、
肺、肾;所述的试验动物为性成熟雌性 中国小香猪,购自中国农业大学昌平实验基地;
b.分别向所述的动物的各个组织中加入钙镁PBS溶液,所述的各个 组织与所述的钙镁PBS溶液的重量比为1∶10;再将所述的各个组织和所 述的钙镁PBS溶液混合物冰浴制成各个组织溶浆,置于-80℃超低温冰箱 中保存备用,作为动物组织PDE样品;
B.动物骨骼肌PDE样品制备:
a.将试验动物处死后取骨骼肌组织,将所述的骨骼肌组织用Hank’s 平衡盐缓冲液清洗3次;具体操作为:取1~3天新生ICR小鼠,用75% 酒精对所述的小鼠体表进行充分消毒,脱颈处死后所述的小鼠,
剥皮取四 肢的骨骼肌组织;
b.将所述的骨骼肌组织剪碎,进行消化处理,得到骨骼肌组织消化液; 该消化处理采用以0.1%(w∶v)胶原酶II和0.2%(w∶v)胰酶37℃消化 30min,再中终止消化,得到骨骼肌组织消化终止液;该终止消化为向所 述的骨骼肌组织消化液加入重量相等的含15%胎牛血清(FCS)的DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium)培养基;所述的骨骼肌组织消化终止 液进行离心处理,弃上清得到沉淀物;所述的离心处理的转速为1000rpm (200×g),时间为10min;
c.向所述的沉淀物中加入含血清培养基,用5ml移液管将细胞团 块吹散,得到细胞悬液;再将所述的细胞悬液进行过滤处理,得到骨骼 肌细胞;该过滤处理采用100μm的尼龙网,将骨骼肌细胞过滤至60mm 培养皿中;
d.将所述的骨骼肌细胞进行预培养,再进行细胞计数,再将所述的 预培养后的骨骼肌细胞进行培养;所述的预培养在含5%CO2的二
氧化
碳培养箱中进行,预培养温度为37℃,时间为60分钟;所述的培养中, 所述的预培养后的骨骼肌细胞的浓度为2~3.5×105,所述的培养在0.1% (w∶v)明胶的24孔培养板中进行;
e.进行所述的培养48小时后,将培养基更换为含10%胎牛血清的 的DMEM培养基继续培养;继续培养96小时后,将培养基更换为含5% 胎牛血清的DMEM培养基;
f.将所述的含5%胎牛血清的DMEM培养基培养过的骨骼肌细胞进 行清洗处理,得到清洗过的骨骼肌细胞;该清洗处理先吸去培养板中的 培养基,再用温度为4℃的钙镁PBS清洗所述的含5%胎牛血清的DMEM 培养基培养过的骨骼肌细胞3次;
g.将所述的清洗过的骨骼肌细胞加入钙镁PBS进行冻融处理,得 到细胞裂解液;所述的冻融处理中,将所述的24孔板中每孔加入30μl 钙镁PBS,置-80℃冰箱反复冻融数次,至骨骼肌细胞裂解;
h.吸取10μl所述的细胞裂解液作为PDE酶样品,加入浓度为25 μmol·L-1的cAMP中进行反应,再将该反应终止,得到反应液;该反应 在35℃振荡培养箱中进行,转速为60rpm,时间为30分钟;终止该反 应的方法为进行沸水浴3min,使酶灭活;
i.将所述的反应液进行离心处理,得到上清液,将该上清液用纯水 做10倍稀释,得到动物骨骼肌PDE样品;吸取10μl所述的得到动物骨 骼肌PDE样品作为检测样品,测定PDE反应活性;所述的离心处理中, 转速为15000rpm,温度为4℃,时间为20分钟。
C.中性粒细胞磷酸二酯酶样品制备:
a.采集动物的新鲜血液,向该血液中加入肝素,所述的1ml新鲜血 液中加入35U肝素;得到全血样品;
b.将葡聚糖溶液混入所述的全血样品中,进行沉降处理,得到上清 液;所述的沉降处理为静置40min;所述的葡聚糖溶液的重量百分比为 为4.5%,与所述的全血样品的体积比为1∶5;
c.将所述的上清液取出轻铺在淋巴细胞分离液上,离心处理后可见 液体分为4层,保留最底层;所述的4层中,最上层为
血浆层;第2 层为单核细胞和淋巴细胞层;第3层为淋巴细胞分离液层;最底层为中 性粒细胞层,夹杂少量红细胞而微带红色;所述的离心处理的时间为15 分钟,
离心力为500g;
所述的淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司;
d.将所述的最底层进行纯化处理,得到高纯的中性粒细胞悬液;该 纯化处理的方法为:用蒸馏水将残余的红细胞溶胀后,再经钙镁PBS漂 洗;
e.用钙镁PBS稀释所述的中性粒细胞悬液,得到中性粒细胞稀释 液;所述的中性粒细胞稀释液中,中性粒细胞数目为1011个/L;
f.将所述的中性粒细胞稀释液进行检测,再进行粉碎处理,得到中 性粒细胞匀浆,即为所述的中性粒细胞PDE样品;
所述的检测为:用Wright
染色法检测细胞纯度(中性粒细胞呈蓝紫 色,多为二到三叶核,近圆形)>95%,台盼蓝染色法检查活性(活细胞排斥台 盼蓝染料)>95%。所述的粉碎处理中,工具为玻璃匀浆器;在
显微镜下 确认所述的中性粒细胞匀浆的中细胞被粉碎细小均匀,即为所述的中性 粒细胞PDE样品;
III.酶反应及活性检测:
A.配制反应体系:
a.cAMP-PDE活性检测:
中药管的反应体系:cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至80μmol/L,所述 的PDE样品量为20μL,cAMP 70μL,所述的中药样品量为10μL;
b.cGMP-PDE活性检测:
中药管的反应体系:cGMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L,所 述的PDE样品量为10μL,cGMP 80μL,所述的中药样品量为10μL;
c.动物组织活性检测:
中药管的反应体系:cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至100μmol/L,所 述的PDE样品量为10μL,cAMP 80μL,所述的中药样品量为10μL;
d.空白对照管的反应体系:加入灭活的所述的PDE样品10μL,用 PBS补充反应液总量至100μL;
同时设中药对照管:反应体系:所述的各种中药提取物10μL,PBS 90μL;
所述的PDE样品分别为按照本实施例II部分中得到的动物组织PDE 样品、骨骼肌细胞PDE样品和动物中性粒细胞PDE样品;
所述的cAMP、cGMP均购自SIGMA公司;
以上所述的各个反应体系在Eppendorf管中配制;
B.酶反应及活性检测:
a.将装有以上所述的各个反应体系的EP管进行培养,所述的培养的温 度为35℃,时间为30分钟,采用的仪器为震荡式培养箱;
b.将该EP管在沸水浴中加热2分钟终止反应;
c.将该管进行离心处理,得到上清液;所述的离心处理的温度为4℃, 转速为15000rpm,时间为30分钟;
d.从该上清液中取其中的80μL,用超纯水做10倍稀释,过0.45μm 微孔滤膜,得到HPLC样品;
e.将所述的HPLC样品进行HPLC反应;平行进样两次,每次所述的 HPLC样品的用量为10μL;所述的HPLC的色谱条件为:Waters高效液 相色谱仪,色谱柱采用Diamonsil C18 5μm,250×4.6mm,检测
波长为254 nm,灵敏度为0.05AUFS,柱温为室温,cAMP测定流速为1.0mL/min, cGMP测定流速为0.8mL/min。分析流动相由甲醇和50mmol磷酸缓冲液 (pH 6.6)组成,容积比为1∶9;
检测结果中,PDE活性以底物水解百分率表示:
PDE活性%=(空白对照管底物浓度-中药对照管或中药管底物浓度) /空白对照管底物浓度×100%
所述的中药样品对PDE活性的影响用以下公式表示:
PDE活性变化率%=(空白对照管PDE活性-中药管PDE活性)/空 白对照管PDE活性×100%。
正数表示抑制作用,负数表示促进作用。
C.检测结果
a.中药对动物五脏组织PDE活性的影响:
表1 中药对五脏组织PDE活性的影响(PDE活性变化率%)
由表1可见,因为黄连对心组织cGMP的PDE活性变化率大于50%, 所以黄连是心组织cGMP-PDE选择性抑制剂;因为白芍对肺组织cGMP 的PDE活性变化率大于50%,所以白芍是肺组织cGMP-PDE选择性抑制 剂;
b.中药对骨骼肌cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响
表2 中药对骨骼肌cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响(PDE活性变化率%)
由表2可见,在所选中药中,白芍对骨骼肌cAMP-PDE活性抑制作用 最强,PDE活性变化率为82.11%,所以白芍是骨骼肌PDE活性抑制剂。
c.中药对中性粒细胞cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响
表3 中药对中性粒细胞cAMP-PDE磷酸二酯酶活性的影响(PDE活性变化率%)
由表3可见,在所选中药中,白芍对cAMP-PDE活性抑制作用最强, PDE活性变化率为97.42%,所以白芍是中性粒细胞的PDE活性抑制剂。
试验2:
本试验在试验1的基础上,进一步研究白芍提取物对中性粒细胞 PDE、中性粒细胞孵育后PDE的活性变化及反应后白芍提取物指纹图谱变 化。
一、白芍提取物对中性粒细胞PDE活性的影响及反应后指纹图谱变 化:
1.白芍提取物的制备:
A.将中药原料药用蒸馏水淋洗后,加入水进行浸泡处理,再进行第 一次煎煮,得到第一次煎液,将所述的第一次煎液存入另一容器中;所述 的浸泡处理中,所述的原料药与所述的水的重量比为1∶10-15,浸泡的时 间为0.5小时;所述的第一次煎煮中,时间为0.5小时;所述的中药原料 药为白芍购自北京前门同仁堂药店;
B.将第一次煎煮后的中药原料药中加入水进行第二次煎煮,得到第二 次煎液;将所述的第一次煎液与第二次煎液合并,得到总煎液;所述的第 二次煎煮中,时间为0.5小时;所述的第一次煎煮后的中药原料药与水的 重量比为1∶10;
C.将所述的总煎液进行减压浓缩处理,得到浓缩液;所述的减压处理 的温度为70℃;所述的浓缩液和所述的中药原料药的重量比为1∶1;
D.向所述的浓缩液中加入95%的乙醇,边加边搅拌,得到混合溶液A; 将所述的混合液A于4℃的环境中放置24小时,得到冷却后的混合液A; 所述的浓缩液与乙醇的重量比为1∶3;
E.将所述的混合溶液A进行第一次过滤处理,得到第一次滤液,调 节所述的第一次滤液的pH值为7.5-8.0;
F.将所述的第一次滤液放置12小时,进行第二次过滤处理,得到第 二次滤液;将所述的第二次滤液中的乙醇挥发掉,再加入注射用水,得到 无醇第二次滤液,所述的无醇第二次滤液中的中药含量为1g/ml;所述的 去除乙醇的方法为旋转蒸发,采用的仪器为旋转蒸发仪,温度为65℃;
G.将所述的无醇第二次滤液放置24小时,进行第三次过滤处理,得 到第三次滤液;
H.将所述的第三次滤液进行灭菌处理,得到白芍提取物,冷藏备用; 该灭菌处理中,温度为115℃,时间为30分钟;所述的白芍提取物中的中 药含量为1g/ml;
I.用pH值为7.4的PBS稀释所述的白芍提取物,得到白芍提取物稀 释液,并调节pH值为7.4;所述的白芍提取物稀释液与所述的PBS的体 积比为1∶10;
J.将所述的白芍提取物稀释液进行离心处理,得到上清液;将所述的 上清液进行除菌处理,得到白芍提取物样品;所述的除菌处理采用0.22μm 的滤膜;所述的离心处理中,温度为4℃,时间为30分钟,离心力为10000g;
2.中性粒细胞分离及PDE制备:
具体方法参见试验1;
所述的中性粒细胞稀释液中,中性粒细胞数目为108个/L;
所述的检测为:用Wright染色法检测细胞纯度(中性粒细胞呈蓝紫 色,多为二到三叶核,近圆形)>96%,台盼蓝染色法检查活性(活细胞排斥台 盼蓝染料)>98%。所述的粉碎处理中,工具为玻璃匀浆器;在显微镜下 确认所述的中性粒细胞匀浆的中细胞被粉碎细小均匀,即为所述的中性 粒细胞PDE样品;
3.PDE活性检测:
具体方法参见试验1;
A.配制反应体系
白芍提取物样品管的反应体系:cAMP用钙镁PBS溶解并稀释至 50μmol/L,所述的PDE样品量为20μL,cAMP 70μL,所述的白芍提取物 样品量为10μL;
空白对照管的反应体系:加入灭活的所述的PDE样品10μL,用PBS 补充反应液总量至100μL;
B.酶反应及活性检测
a.将装有以上所述的各个反应体系的EP管进行培养,所述的培养的温 度为35℃,时间为30分钟,采用的仪器为震荡式培养箱;
b.将该EP管在沸水浴中加热2分钟终止反应;
c.将该管进行离心处理,得到上清液;所述的离心处理的温度为4℃, 转速为15000rpm,时间为30分钟;
d.从该上清液中取其中的80μL,用超纯水做10倍稀释,过0.22μm 微孔滤膜,得到HPLC样品;
e.将所述的HPLC样品进行HPLC反应;平行进样两次,每次所述的 HPLC样品的用量为10μL;色谱条件参见试验1;
根据检测结果,生药浓度为10mg/ml的白芍提取物的PDE活性变化 率为75.55%。
4.反应后白芍提取物指纹图谱变化
色谱条件:Agilent 1100色谱仪,色谱柱Eclipse XDB-C18,5μm, 4.6×150mm。流动相由乙腈和水组成(v/v=12/88),流速0.8ml/min,柱温 25℃;
有图1可知:与对照比较(图1中上面色谱图),反应后白芍提取物 指纹图谱(图1中下面色谱图)中,仅有a峰峰高及峰面积显著降低,其 它各主要峰峰高及峰面积均无明显变化。
二.白芍提取物与中性粒细胞孵育后PDE活性变化及反应后白芍提取 物指纹图谱变化
1.中性粒细胞准备:
具体方法参见试验1;
所述的中性粒细胞稀释液中,中性粒细胞数目为6.5×107个/L;
所述的检测为:用Wright染色法检测细胞纯度(中性粒细胞呈蓝紫 色,多为二到三叶核,近圆形)>96%,台盼蓝染色法检查活性(活细胞排斥台 盼蓝染料)>98%。
2.细胞孵育:
在24孔培养板中,每孔加入0.1ml的所述的白芍提取物样品和0.9ml 的中性粒细胞稀释液,空白对照组加入所述的白芍提取物样品和0.9ml的 PBS,放入5%CO2培养箱中培养,培养时间为1小时;培养结束后检查 细胞的形态正常;
将培养结束后的所述的中性粒细胞稀释液进行离心处理,得到上清 液;所述的离心处理的温度为4℃,时间为3分钟,离心力为1000g;将 所述的上清液进行除菌处理,得到细胞孵育样品;所述的除菌处理采用 0.22μm的滤膜;
3.PDE活性检测
具体方法参见试验2中的第一部分;
根据检测结果,反应液浓度为10mg生药/ml的白芍提取物对孵育中性 粒细胞的PDE活性变化率为15.25%。
4.与中性粒细胞孵育后白芍提取物指纹图谱变化
色谱条件参见试验2中的第一部分;由图2可见,与对照比较(图2 中,上面色谱图),反应后白芍提取物指纹图谱(图2中,下面色谱图) 中,只有a峰峰高及峰面积明显降低,其它各主要峰峰高及峰面积均无显 著变化。
本实施例中的采用的试剂Hank’s平衡盐缓冲液、胶原酶II(Sigma), 胰酶、DMEM培养基、胎牛血清(Gibco),牛血清
白蛋白(Amersco),cAMP、 HEPES、rolipram(Sigma),Dextran T-500(Phamacia),淋巴细胞分离液 (上海恒信化学试剂有限公司),均为分析纯;甲醇为色谱纯。
本实施例中的试剂的配制方法:
PBS配制方法:137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,8.8mmol/L Na2HPO4,1.5mmol/L KH2PO4,pH 7.4。
钙镁PBS:在PBS基础上加1mmol/L MgCl2,1mmol/L CaCl2,pH 7.4。 50mmol磷酸缓冲液(pH 6.6):0.1mol/L KH2PO4与0.1mol/L Na2HPO4以 3∶2(v∶v)比例混匀,再做1倍稀释,即为50mmol磷酸缓冲液。
特殊分离液(在HBSS中加入缓冲能力很强的HEPES和Tris以增强 提取过程中对中性粒细胞的保护):140mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1 mmol/L MgCl2,1mmol/L CaCl2,1mmol/L NaH2PO4,10mmol/L HEPES, 5mmol/L Tris。