[技术领域]

本发明涉及免疫安全检测技术中单克隆抗体的制备，进一步讲涉及可 应用于水环境及水产品中短裸甲藻毒素单克隆抗体的制备。

[背景技术]

水体富营养化致使藻类异常增殖，并释放生物毒素——藻毒素(Algae Toxin)，这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的 安全。其中导致神经系统麻痹的短裸甲藻毒素(Brevetoxins，BTX)是毒 性较强，危害很大的一种藻类毒素。毒素通过食物链毒化鱼、贝等水生动 物，人类因摄食这些动物而发生中毒。

BTX是由短裸甲藻属的双鞭甲藻(dinoflagellate)产生的具有独特药理 功能的梯型聚醚类化合物。BTX属神经性贝毒，与钠通道受体靶部位VI结 合。BTX为低熔点耐热固体，酯溶性，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、 乙醚、苯等有机溶剂和NaOH溶液，不易溶于中性和酸性水溶液。通常会 导致鱼群的大量死亡，其它动物摄食该藻类或被污染的鱼类后即可引起中 毒。中毒后会产生肠胃不适及神经系统症状如恶心、呕吐、腹泻、神经麻 木及冷热知觉的颠倒等，严重时会心律失常、窒息。该毒素除了通过食物 链引起中毒外，也可通过海洋中的气溶胶造成呼吸道急性中毒，中毒症状 为晕眩、瞳孔放大、气喘、干咳、流鼻涕及眼角膜炎等。BTX有10余种类 似物，由醚环串联而成。I型毒素是短裸甲藻产生的主要毒素。分子式为 C50H70O14，分子量约为894。欧美等一些发达国家对冷藏鲜贝肉中的该毒 素最高允许限量为0.8μg/g。目前，我国还没有BTX检测的国家标准，这不 仅影响到消费者的健康和生命安全，还会影响到水产品的出口。

有关BTX的检测方法主要有(1)色谱分析法：包括薄层色谱法(TLC) 和高效液相色谱(HPLC)法。TLC法主要用于BTX的分离和纯化。HPLC 法由于共流出物背景干扰，采用紫外检测在灵敏度和选择性方面较差，而 采用质谱(MS)检测，可提高选择性和灵敏度，检测限为0.9ng；采用高效液 相色谱/四极杆飞行时间质谱(HPLC/Q TOFMS)联用技术检测限可达到 0.5ng。缺点是样品预处理要求高；缺乏标准品，设备庞大、昂贵；需专业 人员。(2)组织培养法：其基本原理是利用小鼠神经瘤细胞系易被毒素阻 断Na+通道这一特性检测毒素。当加入通道活化剂后，Na+离子过度内流， 造成细胞肿胀，甚至死亡。但加入了拮抗剂毒素，可使细胞存活，从而可 确定毒素的存在进而确定毒素的量。该方法的特点是灵敏、廉价、不需要 大量动物。缺点是缺乏特异性；对样品的处理要求高；要具有组织培养技 术和设备。

免疫学检测法以其检测的稳定性、高灵敏性和速度快等优点在一些藻 类毒素检测中得以广泛应用。

单克隆抗体的制备是建立免疫学检测方法的关键步骤之一。但由于 BTX标准品价格昂贵、难以获得，至今国内外尚未见BTX单克隆抗体制备 的报道。

目前，单克隆抗体的制备多采用腹腔及皮下注射免疫方案。待被免疫 小鼠血清效价达4×104以上后，取小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合，有限稀释 法克隆，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株，阳性细胞扩大培养后，小鼠腹水 制备单克隆抗体。该方法已经是一项非常成熟的技术，广泛应用于食品及 环境免疫安全检测技术中单克隆抗体的制备。但是，传统方法制备单克隆 抗体至少需要4次以上的免疫后才能进行细胞融合，至少需3.5个月以上的 时间才能生产出单克隆抗体；同时传统方法对抗原的需求量大，一般需 200-475μg/鼠。这大大地增加了单克隆抗体制备的成本，特别是对BTX等 价格昂贵的海洋生物毒素，制备一株单克隆抗体需要数万元人民币。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种制备短裸甲藻毒素单克隆抗体 的方法，具有速度快，所需抗原量少的特点，从而有效降低单克隆抗体制 备的成本。

本发明解决技术问题所采用的方案采用如下步骤：

1.完全抗原的制备

免疫抗原(BTX-IgG)和检测抗原(BTX-BSA)具体制备方法如下：

(1)混合液的制备：取0.5mg BTX、0.08mg N-羟丁二酰亚胺、0.15mg N，N双环乙烷碳二亚胺于0.5mL DMF中混均，在10-30℃条件下孵育2h 制成混合液，并将混合液平均分成两等份；(2)载体蛋白反应液的制备： 取0.4mg IgG溶于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3缓冲液中，混匀后做为载体蛋白 反应液；(3)将步骤(2)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混 合液中，在10-30℃条件下孵育2h，所得产物为免疫抗原(BTX-IgG)，超滤 离心去除未反应的物质，分装后-20℃保存备用；(4)取0.4mg BSA，溶 于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3缓冲液中，混匀后做为载体蛋白反应液；(5)

将步骤(4)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混合液中，在 10-30℃条件下孵育2h，所得产物为检测抗原(BTX-BSA)，超滤离心去除 未反应的物质，分装后-20℃保存备用。

2.动物免疫

(1)免疫动物为8周龄雄性BALB/C小鼠，免疫前断尾采血作为阴 性血清；

(2)配制免疫抗原标准液2μg/μL。首次免疫使用弗氏完全佐剂乳 化免疫抗原，抗原佐剂比1：1，腹腔注射100μL/鼠。(3)18天后采用脾 内注射法注射，具体方法如下：将小鼠禁食禁水24小时，使用2％戊巴比 妥钠每只100μL将小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，将小鼠俯卧固定于简 易操作台上，对背部皮毛消毒，在背部中线左侧0.5cm最后肋骨0.1cm处， 沿体中轴向下剪开1cm长切口，用手轻轻按压两侧腹壁，使脾脏暴露出腹 腔，使用1mL注射器，注射10μL全抗原标准液，边注射边退针尽量使 其均匀注入脾内，小心将脾脏放回腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤，首免21 天后断尾取血检测效价。

3、取血清效价大于104的被免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按 常规方法融合，制备单克隆抗体。

采用本免疫方法所制备的单克隆抗体腹水效价可达2.4×105，亲和常 数达0.6×109M-1，腹水抗体效价和亲和常数不低于传统免疫方法所得抗 体。本方案与传统方法相比，具有免疫速度快，至少节省30天的时间； 所需抗原量少(仅需要120μg/鼠)。从而有效地降低单克隆抗体制备的成 本。

【具体实施方式】

[实施例1]免疫抗原(BTX-IgG)和检测抗原(BTX-BSA)具体制备

(1)混合液的制备：取0.5mg BTX、0.08mg N-羟丁二酰亚胺、0.15mg N，N双环乙烷碳二亚胺于0.5mL DMF中混均，在10-30℃条件下孵育2h 制成混合液，并将混合液平均分成两等份；(2)载体蛋白反应液的制备： 取0.4mg IgG溶于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3缓冲液中，混匀后做为载体蛋白 反应液；(3)将步骤(2)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混 合液中，在10-30℃条件下孵育2h，所得产物为免疫抗原(BTX-IgG)，超滤 离心去除未反应的物质，分装后-20℃保存备用；(4)取0.4mg BSA，溶 于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3缓冲液中，混匀后做为载体蛋白反应液；(5)将 步骤(4)制备的载体蛋白反应液加入步骤(1)制备的混合液中，在10-30 ℃条件下孵育2h，所得产物为检测抗原(BTX-BSA)，超滤离心去除未反应 的物质，分装后-20℃保存备用。

[实施例2]

2.动物免疫

(1)免疫动物为8周龄雄性BALB/C小鼠，免疫前断尾采血作为阴 性血清；

(2)配制免疫抗原标准液2μg/μL。首次免疫使用弗氏完全佐剂乳 化免疫抗原，抗原佐剂比1：1，腹腔注射100μL/鼠。(3)18天后采用脾 内注射法注射，具体方法如下：将小鼠禁食禁水24小时，使用2％戊巴比 妥钠每只100μL将小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，将小鼠俯卧固定于简 易操作台上，对背部皮毛消毒，在背部中线左侧0.5cm最后肋骨0.1cm处， 沿体中轴向下剪开1cm长切口，用手轻轻按压两侧腹壁，使脾脏暴露出腹 腔，使用1mL注射器，注射10μL全抗原标准液，边注射边退针尽量使 其均匀注入脾内，小心将脾脏放回腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤，首免21 天后断尾取血检测效价。

[实施例3]试剂来源及SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备

BTX为Express Technology Co.，Ltd.产品；人IgG为Thermo产品；聚 乙二醇(polythylene glycol-4000，PEG)、RPMI1640培养基、HAT选择性 培养基、牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛、β-巯基乙胺、福氏完全佐剂(FCA)、 福氏不完全佐剂(FICA)、邻苯二胺(OPD)、N-羟丁二酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide)、N，N双环乙烷碳二亚胺(N，N-dimethyformamide， DMF)等购自Sigma公司；离心超滤管为MILLPORE产品；辣根过氧化 物酶标记羊抗鼠IgG购于鼎国生物技术有限公司(北京)，甲醇、乙酸、碳 酸钠、碳酸氢纳、ELISA所用化学试剂等为国产分析纯。

在融合前15天复苏SP2/0骨髓瘤细胞并扩大培养。取出SP2/0细胞冻 存管，立即放入装有40℃水的保温桶内，轻轻晃动，直至动存液完全溶 解，要在1-2min内完成。将动存液移到15mL离心管，加入5mL培养液， 轻轻吹均匀，1000rpm，5min，弃上清。用巴斯德吸管加入1管培养液， 吹打均匀，移入50mL培养瓶内，再加入2吸管培养液，吹打均匀，分到 2个新的50mL培养瓶内，这样就将一个冻存管细胞分到3个50mL培养 瓶内。放于37℃含5％的二氧化碳培养箱中培养。24h后换液，每瓶4巴 斯德管。48h后就可用于融合，在融合前24小时需要换液一次，使细胞在 融合时正处于对数分裂期。

[实施例4]饲养细胞的制备

取12周龄以上，与骨髓瘤同系小鼠1-2只。挖去一只眼球放血，待血 滴不出为止。拉颈处死，将鼠浸在75％酒精5min消毒。无菌条件下用消 毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤(切勿将腹膜剪破而使腹腔内液体流 失)。然后向上下两侧方向拉开小鼠皮肤，暴露腹膜。用消毒注射器抽取 3mL无血清HT1640培养液，用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内。 一只手固定针筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁1-2min(使巨噬细胞 游出)，然后用注射器抽回腹腔内液体，并进行3次冲洗。收集冲洗液， 1000rpm离心5min，弃上清。用HAT培养液稀释离心沉淀的细胞，并调 整细胞浓度至1×105个/mL。将细胞悬液按每孔100μl(约两滴)铺板。放 于37℃含5％的二氧化碳培养箱中培养。此细胞在融合前24h制备。

[实施例5]免疫淋巴结B细胞悬液的制备

将免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于EP管中，37℃放 置2h后离心分离血清，-20℃贮存备用。将猝死后小鼠浸入75％酒清中 3min。无菌取腘淋巴结，放入载有200目铜网的无菌平皿内。加2mL基础 培养基将淋巴结浸润，用胶棒将淋巴结研磨成浆状。巴斯德吸管吹打分散 细胞，转移至50mL玻璃离心管内，1000g/min离心5min，重复洗2次， 并计数细胞。最后用适量的RPMI-1640悬浮细胞，使成5×107/mL，体积 应为2mL以上。

[实施例6]细胞融合及融合后细胞的培养

将实施例5所得腘淋巴细胞与实施例3所得SP2/0细胞(细胞数之比 为10：1)移到圆底玻璃离心管中，混均匀，1000rpm离心10min。弃掉上 清后，用手指稍用力弹击试管底部，使沉淀呈桨糊状。迅速滴入50％的PEG (约0.7mL)，用吸管轻轻吹吸4-5次，30s后，700rpm离心3min；缓慢 加入20mL RPMI-1640培养基(动作尽量轻柔)，然后使试管底部做划圆运 动；2min后1000g/min离心5min，弃上清，同法再洗一次；缓慢加入50mL 含HT培养基轻轻混匀后，加入到已准备好滋养细胞的96孔板上，每孔 加入100μL融合细胞悬液，置于37℃ 5％的CO2培养箱中培养。融合24 小时后，每孔补加50μL含HAT培养基。并分别于4天、7天和10天， 根据细胞生长情况更换或补加HAT培养基，第14、18、22、25天换以20％ 小牛血清HT培养基。在培养过程中，采用半量换液法，即每次从每个小 孔中吸出0.1mL培养液，再加入0.1mL新鲜培养液。

[实施例7]杂交瘤细胞的筛选

观察融合细胞的生长情况，一般3天后可见克隆化生长的细胞，待融 合细胞集落生长至1/2视野(×100)以上时，就可检测上清液中的抗体， 筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆。第一次检测抗体在第二次换 液的两天后，即融合后的第10天进行。以被测孔的OD值高于瘤细胞上清 液对照OD值的2倍以上定为阳性。

[实施例8]阳性杂交瘤细胞的再克隆及扩大培养

待阳性孔细胞接近长满时，用含20％胎牛血清的RPMI1640培养基将 细胞轻轻吹起，吸到无菌小瓶中，细胞计数，稀释至每100μl中含有0.5-1 个细胞密度。然后将稀释的细胞悬液滴入实施例4方法准备的饲养细胞培 养板内，每孔100μl。将板置入37℃含5％ CO2温箱培养，每天观察一次， 3天左右换液一次，观察每孔有几个克隆株，对有两个或没有细胞的孔分 别作出标记，待克隆细胞生长至8-10天时，检测抗体，标出阳性孔，对所 有的克隆细胞孔换液，换液2天后，再检测，将两次检测OD值高的孔进 行对照，对两次检测都是阳性的孔再次克隆。直到克隆到所有的克隆细胞 孔都为阳性，最后选择OD值高、细胞活力好的杂交瘤细胞进行扩大培养。

[实施例9]腹水抗体的制备

取8周龄BALB/C小鼠，将高压(113℃，15min)灭菌的石蜡油注射 到小鼠腹腔，0.5mL/只，8d后腹腔注射实施例8所得杂交瘤细胞2×106/ 只，接种7d后每天观察小鼠腹水产生情况，如腹腔明显鼓起，小鼠行动困 难并且皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，将腹水3000rpm离心10 min，取上清，弃去脂肪，收集中间澄清腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法初步 纯化，-20℃分装冻存备用。

[实施例10]腹水抗体亲和力的测定

纯化后腹水稀释至纯化前相同体积，同时以SP2/0细胞接种的腹水同 等稀释倍数做对照。采用非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力。检测抗原 (BSA-BTX)按1、0.5、0.25、0.125μg/ml包被酶标板，100μl/孔，37℃， 2h；1％的明胶封闭后，将单抗从2000倍开始倍比稀释。以抗体浓度(mol/L) 的对数值为横座标，以其对应的OD值为纵座标，可在一个座标系内作出 4条S形曲线。找出S曲线的顶部，设定为ODmax。在曲线中分别找出4 条曲线各自50％ ODmax对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据公 式计算单抗的亲和常数。

Ka＝(n-1)/2(n[Ab`]t-[Ab]t)

注：n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab`]t和[Ab]t分别为每组中两 个50％ ODmax对应的抗体浓度(mol/L)，Ka为亲和常数。