大豆中含有三种脂肪氧化酶(Lipoxygenase，简称Lox)同功酶即Lox1、 Lox2和Lox3，它们能专一催化具有cis，cis-1，4-戊二烯结构的多元不饱 和脂肪酸通过分子加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物，即醛、酮 等具有挥发性的异味物质，使大豆具有豆腥味，从而降低了豆制品的耐储 性、食用性和营养价值。通常在大豆加工过程中人们通过加热、微波照射、 改变介质的pH值、有机溶剂萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但这些方 法都会不同程度地降低豆制品的营养价值，并且使得成本增高，培育脂肪 氧化酶缺失品种可以从根本上解决上述问题。但在脂肪氧化酶缺失材料的 选育过程中，Lox在田间不存在指示性状，从种子外观和农艺性状上无法 鉴别，并且田间脂肪氧化酶缺失材料选择工作量大，因此急需一种快速、 简便、成本低、一次可以同时检测出三种脂肪氧化酶的检测方法。
目前脂肪氧化酶的常用的检测方法是薄层等电聚焦电泳(IEF)检测方 法，这种方法主要是通过酶染法和蛋白染色方法结合使Lox同功酶带显色， 虽然能同时检测出三种脂肪氧化酶，但检测中常常会因Lox的缺失而发生 其它Lox等电点正极漂移现象；另外该方法所需设备、试剂昂贵，操作要 求严格，一般育种、仓储单位和加工质检部门不便操作。
另外据日本Suzuki，Y.等1992年报道(Prodution and use of monolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3.Biosci Biotech.Biochem.56：678-679)：用单克隆抗体可以检测水稻中的Lox3， 这种方法虽然结果准确可靠，但检测过程中除需要做封闭外，还需要过夜 包被酶标板，因此耗时，操作起来不方便。
申请号00112539.7的专利公开了一种作物脂肪氧化酶同功酶的检测 方法，该方法具有操作简便、结果直观等特点。但由于它是利用脂肪氧化 酶的偶联氧化还原指示剂显色反应的原理来进行测定的，所以它的灵敏度 和特异性受到一定的限制。

本发明的目的在于避免上述方法的缺陷，而提供一种利用双抗体夹心 酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测大豆中三种脂肪氧化酶同功酶的方法和专 用试剂盒。适用于对大豆中三种脂肪氧化酶的定性和定量测定。
本发明是这样实现的：这种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特 征在于包括如下步骤：
A、制备大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)： 诱发哺乳动物产生特异抗体，制备特异杂交瘤细胞，通过筛选阳性细胞株， 诱导小鼠产生腹水得到大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、 D-2、D-3)；
B、制备多克隆抗体：利用Sigma公司的Soybean Lox type1-B产品(I) 作为免疫抗原诱发哺乳动物产生多克隆抗体血清，得到多克隆抗体；
C、制备阳性和阴性对照试剂(B-1、B-2)：以含有3种Lox的普通大 豆种子中提取的总蛋白制备阳性对照试剂(B-1)；以脂肪氧化酶全缺失大 豆种子中提取的总蛋白制备阴性对照试剂(B-2)；
D、包被酶标板：将步骤B得到的多克隆抗体结合到酶标板上，制备检 测时所用酶标板(K)；
E、检测：将步骤A和C制备的试剂、步骤D包被的酶标板以及检测过 程应用的辅助试剂装在试剂盒内，检测时在酶标板(K)中加上样品后，再 加入单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)，同时做阳性和阴性对照，利用抗 原抗体的结合反应，通过显色检测酶的存在和酶的含量。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤A所述哺乳动物选择小 白鼠，制备大豆Lox1、Lox3的特异单克隆抗体试剂(D-1、D-3)的步骤如 下：
①Lox1和Lox3的分离纯化：以美国的脂肪氧化酶缺失近等基因系材 料Century中的Lox-1.3和Lox-2.3作为标准对照，首先采用非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳从“冀豆12号”中分离得到3条Lox酶带；然后将Lox1 和Lox3酶带切下，置于电洗脱仪洗脱管中，采用电洗脱法洗脱5～6小时， 分别得到Lox1和Lox3的纯化溶液；
②小鼠首次免疫：选择4～6周龄行动敏捷的纯系BALB/c雌小鼠，取 步骤①中制备的Lox1和Lox3纯化液分别作为抗原与等体积的完全付氏佐 剂混合并振荡，形成油包水状态后，分别吸入到一支注射器当中给不同的 小鼠进行皮下多点注射，每只小鼠只能注射一种抗原，每只注射的免疫剂 量为25～35ug；
③再次免疫：间隔1周后利用步骤①制备的Lox1和Lox3的纯化液分 别与不完全付氏佐剂等体积混合按照步骤②再次进行免疫，如此进行第三 次免疫；
④效价测定及再免疫：步骤③中的小鼠第三次免疫后第四天从小鼠尾 部分别取血2-3滴，离心取上清，用间接酶联免疫吸附法测定其效价，如 果效价小于1∶1600，则对步骤③中免疫的小鼠1周后按照步骤③再次进行 免疫，并进行效价测定，直至血清效价达到或高于1∶1600为止；
⑤加强免疫：分别选择步骤④中Lox1和Lox3免疫小鼠血清效价最高 的小鼠在细胞融合前3天按步骤③加强免疫1次；
⑥细胞融合：分别取步骤⑤中的不同小鼠的脾细胞与复苏的SP2/0细 胞混匀，在细胞培养板HAT培养基上分别筛选Lox1和Lox3杂交瘤细胞；
⑦特异性阳性细胞株筛选：细胞融合7～15天后，利用步骤①中分离 纯化的Lox1和Lox3分别作为检测抗原，采用间接酶联免疫吸附法对步骤 ⑥中长有相对应杂交瘤细胞孔内的上清液进行首次阳性细胞株筛选，上清 液的OD450值与空白对照孔的OD450值之比大于2.1的即判断为阳性孔， 其中的杂交瘤细胞称为阳性细胞株；
⑧亚克隆：采用有限稀释法对步骤⑦中筛选到的Lox1和Lox3阳性细 胞株分别进行亚克隆，连续两次亚克隆之后剔除掉假阳性细胞株，将得到 的Lox1和Lox3阳性细胞株通过分别与脂氧酶全缺失大豆品种中其它蛋白 交叉反应，证明这些细胞株分别为特异性分泌Lox1和Lox3单克隆抗体的 细胞株；
⑨单克隆抗体腹水制备：将步骤⑧中得到的分泌Lox1和Lox3单克隆 抗体细胞株分别以(1～2)×106个细胞/只的量接种到经过石蜡油预处理 过的不同BALB/C小鼠腹腔，诱导腹水产生，经过6～8天后即可采集腹水， 分别得到Lox1和Lox3单克隆抗体试剂(D-1、D-3)。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤A所述制备特异Lox2 杂交瘤细胞的步骤如下：
①免疫抗原制备：取单缺Lox2的“五星2号”和普通大豆“冀豆12 号”豆粉，分别与8～15倍稀释20倍的pH为8.0的Tris-CaCl2缓冲液 (A)混匀，离心后取上清备用；
②小鼠免疫：选择4～6周龄的行动敏捷的纯系BALB/C雌小鼠，分别 称量各小鼠体重并标记；取步骤①中制备的单缺Lox2的“五星2号”上清 液，用生理盐水将其稀释到蛋白含量4mg/ml，加入等体积弗氏完全佐剂混 合后，采取皮下多点注射首次免疫小鼠，每只小鼠的免疫剂量为0.3～ 0.5mg：
③注射环磷酰胺溶液(CY)：将步骤②中首免的小鼠分别于免疫10min、 24h、48h后，按照100mg/kg的量分别对小鼠进行颈背部多点注射浓度 20mg/ml的环磷酰胺溶液(CY)进行消减；
④再次免疫：首次免疫1周后用步骤①中制备的普通大豆“冀豆12 号”上清液做抗原对步骤③中的小鼠按照步骤②方法再次进行免疫，如此 进行第三、四次免疫。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤B所述哺乳动物选择大 白兔，制备多克隆抗体的步骤如下：
①免疫大白兔：选择2～3kg的新西兰大白兔，将Sigma公司的Soybean Lox type1-B蛋白稀释成8mg/ml作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂混合 乳化后，采取背部皮下多点注射免疫兔子，每只兔子免疫剂量为1.6mg；
②再次免疫：间隔10～14天后利用不完全付氏佐剂和浓度为8mg/ml 的Soybean Lox type1-B蛋白等体积混合后按照步骤①进行再次免疫，如 此进行第三次免疫；
③效价测定：第三次免疫后第11天从上述步骤②中免疫的大白兔耳缘 静脉取血检测其效价，如果效价小于1∶10000时，则对步骤②中大白兔再 次按照步骤②免疫，如此反复免疫直至所测效价高于1∶10000为止；
④多克隆抗体的制备：3天后对步骤③效价最高的大白兔采用颈动脉 放血法采血，分离血清，采用间接酶联免疫吸附法测定分离血清与Lox1、 Lox2、Lox3及大豆中其它蛋白的交又，证明该血清与Lox1、Lox2、Lox3 均有交叉而与大豆中其它蛋白无交叉后即得到多克隆抗体血清。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤C所述阳性和阴性对照 试剂制备包括：阳性对照试剂取含有3种Lox的市售普通大豆冀豆12号种 子的豆粉1g；阴性对照试剂取大豆脂肪氧化酶全缺失品种“中特1号”的 种子豆粉1g，分别加入10ml稀释20倍的pH为8.0的Tris-CaCl2缓冲液 (A)，混匀后在4℃下浸提30min后，4000rpm离心10min，取上清置-20℃ 保存备用，使用时用Tween20-NaCl缓冲液(C)1∶10进行稀释。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤D所述包被酶标板是采 用0.05M pH为9.6碳酸盐包被缓冲液将制备的多克隆抗体血清稀释5000 倍，在96孔聚苯乙烯酶标板每个反应孔中加100ul，放置在4℃下过夜。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤E所述检测方法包括如 下操作步骤：
①待测大豆中Lox提取液的制备：将待测大豆的种子磨成豆粉，加入 8～15倍体积的pH为8.0的Tris-CaCl2缓冲液(A)，混匀后离心取上清 备用；
②洗板：用Tween20-NaCl缓冲液(C)将多克隆抗体包被的酶标板(K) 反复洗3～4次，每次2～3min，拍干，目的洗去未结合到板子上的多克隆 抗体；
③-1加样：将步骤①中制备的Lox提取液加到步骤②备好的酶标板(k) 中，每孔100μL，每个样品加3孔，同时做阳性和阴性对照，25℃～37℃ 放置30～90min后按照步骤②洗板；
③-2加样：将sigma公司Soybean Lox type1-B产品稀释成80万活 力单位/ml的标准液(I)，用Tween20-NaCl缓冲液(C)按10、30、90、 270、810、2430、7290、21870、65610、196830、590490、0共12个稀释 浓度进行倍比稀释，同时将步骤①中制备的Lox提取液稀释10、50、100、 200共4个浓度，然后将不同稀释浓度的标准液(I)和Lox提取液按每个 浓度100μL/孔分别加到步骤②备好的酶标板(k)中，均设3次重复，37 ℃放置45min后按照步骤②洗板；
④-1加入大豆脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆抗体试剂 (D-1、D-2、D-3)：将大豆脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆 抗体试剂(D-1、D-2、D-3)按每孔100μL分别加入到步骤③-1已加入 待测样品的酶标板孔内，25℃～37℃放置30-90min后按照步骤②洗板；
④-2加入大豆脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆抗体试剂 (D-1、D-2、D-3)：将大豆脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆 抗体试剂(D-1、D-2、D-3)按每孔100μL分别加入到步骤③-2已加入 待测样品的酶标板孔内，25℃～37℃放置30-90min后按照步骤②洗板；
⑤-1加入酶标二抗试剂(E)：使用稀释20倍的含有5-10％脱脂奶粉 的Tween20-NaCl溶液(F)将酶标二抗试剂(E)稀释10000倍，按每孔 100μL加入步骤④-1中的酶标板孔内，25℃～37℃放置30-90min后按照 步骤②洗板；
⑤-2加入酶标二抗试剂(E)：使用稀释20倍的含有5-10％脱脂奶粉 的Tween20-NaCl溶液(F)将酶标二抗试剂(E)稀释10000倍，按每孔 100μL加入步骤④-2中的酶标板孔内，25℃～37℃放置30-90min后按照 步骤②洗板；
⑥显色及终止：将含有20％的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的无水乙醇 底物液(G-1)和pH为5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物液(G-2)等体积混合， 按每孔100μL加入到所有孔中，避光放置15～20min，显色的样品中含有 与所加单克隆抗体相对应的Lox，不显色的样品中则不含有与所加单克隆 抗体相对应的Lox；按每孔50μL加入2M H2SO4终止液(H)终止显色；
⑦酶标仪读数：设置参数：450nm，外部振摇3秒；
⑧标准曲线的绘制：按步骤③-2中标准液(I)的稀释度的log值为 横坐标，以步骤⑦中得到的OD值为纵坐标，绘制“S”形标准曲线；
⑨利用“S”形标准曲线中间呈线性关系的一段，利用该线段的回归方 程以及待测样品系列稀释度的OD值计算出Lox的活力单位数。
所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法制备的试剂盒，包括盒体、设 在盒体内的酶标板和存放在盒体内的试剂，盒体为双层结构，下层放置多 克隆抗体包被的96孔或384孔聚苯乙烯酶标板(k)；上层为纸质的支架， 盒内存放的瓶装检测试剂包括：
(A)缓冲液：pH为8.0的Tris-CaCl2缓冲液；
(B-1)阳性对照试剂；
(B-2)阴性对照试剂；
(C)缓冲液：Tween20-NaCl溶液；
(D-1、D-2、D-3)：大豆脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆抗 体试剂；
(E)酶标二抗试剂；
(F)酶标二抗稀释液：含有5-10％脱脂奶粉的Tween20-NaCl溶液；
(G-1)底物液：含有20％的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的无水乙醇；
(G-2)底物液：pH为5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液；
(H)终止液：2M H2SO4；
(I)标准液：用双蒸水将sigma公司Soybean Lox type1-B产品稀释成 80万活力单位/ml。
本发明的优点是：1、利用Sigma公司的Soybean Lox type1-B产 品作为免疫抗原诱发哺乳动物产生多克隆抗体，后将多抗隆抗体结合到 酶标板上；同时利用从大豆种子中纯化的Lox1、Lox3和普通大豆总蛋 白作为免疫抗原诱发哺乳动物产生对Lox1、Lox3和Lox2专一的抗体， 制备特异杂交瘤细胞，通过筛选阳性细胞株，得到大豆Lox1、Lox2和 Lox3的单克隆抗体。检测时多克隆抗体已被结合到酶标板上，其它辅助 试剂也装在试剂盒中，检测过程中不需做封闭和过夜包被酶标板，因此 省时，操作方便。2、利用抗原抗体的结合反应，通过显色检测酶的存 在和酶的含量，检测时形成“多抗+样品+单抗”双抗体夹心，准确可 靠、特异性强。3、样品处理简单，一次可以同时检测出三种脂肪氧化 酶，并且一次可以同时检测多个样品，适用于育种单位、仓储单位和加 工质检部门，最适用于育种中大量品种(系)的筛选。
附图说明
图1是本发明的试剂盒结构及组成示意图
图中：
A、缓冲液：pH为8.0的Tris-CaCl2溶液
B-1、阳性对照试剂：从普通大豆中提取的总蛋白
B-2、阴性对照试剂：从脂肪氧化酶全缺失大豆中提取的总蛋白
C、缓冲液：Tween20-NaCl溶液
D-1、D-2、D-3、大豆脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆抗 体试剂
E、酶标二抗试剂
F、酶标二抗稀释液：含有5-10％脱脂奶粉的Tween20-NaCl溶液
G-1、底物液：含有20％的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的无水乙醇
G-2、底物液：pH为5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液
H、终止液：2M H2SO4
I、标准液：用双蒸水将sigma公司Soybean Lox type1-B产品稀释成80 万活力单位/ml
K、多克隆抗体包被的酶标板
图2是本发明检测效果图
图中：Yp1为Lox全缺失样品，Yp2为单缺Lox-1样品，Yp3为单缺Lox-3 样品，Yp4为双缺失Lox-2，3样品，Yp5为双缺失Lox-1，3样品，Yp6 为双缺失Lox-1，2样品。
图3为定量测定“冀豆12号”中Lox1含量的标准曲线图
图中：呈线性关系的部分的回归方程为x＝1.957y-5.5405(0.3558≤y≤0.7688， -4.8442≤x≤-4.0358)。

实施例1：试剂盒的中测试试剂制备
1-1制备阳性对照试剂B-1
取市售普通大豆冀豆12号(含有3种Lox)的豆粉1g，加入10ml 稀释20倍的pH为8.0的Tris-CaCl2缓冲液(A)，混匀后在4℃下浸 提30min后，4000rpm离心10min，取上清置-20℃保存备用，使用时用 Tween20-NaCl缓冲液(C)1∶10进行稀释。
1-2制备阴性对照试剂B-2
选用大豆脂肪氧化酶全缺失品种“中特1号”的种子，按照1-1制 备阳性对照试剂的方法进行制备。
1-3制备大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂D-1、D-2、D-3
1-3-1制备Lox1和Lox3单克隆抗体试剂D-1、D-3
①Lox1和Lox3的分离纯化：以美国的脂肪氧化酶缺失近等基因系 材料Century中的Lox-1.3和Lox-2.3作为标准对照，首先采用非变性 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)从“冀豆12号”中分离得到3条Lox酶 带，其分离胶浓度为11％、恒压150V 6小时；然后将Lox1和Lox3酶带 切下，置于电洗脱仪洗脱管中，采用电洗脱法洗脱5小时，最终分别得 到4ml浓度为0.3206mg/ml、0.2595mg/ml的Lox1和Lox3的纯化溶液；
②小鼠首次免疫：选择6周龄行动敏捷的纯系BALB/c雌小鼠10只， 取500μL步骤①制备的Lox1和Lox3纯化液分别做为抗原与等体积的 完全付氏佐剂混合并振荡，形成油包水状态后，分别吸入到一支注射器 当中给小鼠进行皮下多点注射，两种抗原各注射5只小鼠，每只小鼠注 射200μL，Lox1、Lox3免疫剂量分别为32ug、26ug；
③再次免疫：间隔1周后利用步骤①制备的Lox1和Lox3的纯化液 分别与不完全付氏佐剂等体积混合后按照步骤②再次进行免疫，如此进 行第三次免疫；
④效价测定及再免疫：步骤③中的小鼠第三次免疫后第四天从小鼠 尾部分别取血2-3滴，离心取上清，用间接ELISA(酶联免疫吸附法) 检测其效价，结果用Lox1做为抗原的5只小鼠血清效价分别为1∶400、 1∶400、1∶200、1∶800和1∶0，用Lox3做为抗原的5只小鼠血清效价分 别为1∶400、1∶200、1∶200、1∶800和1∶800，效价均小于1∶1600，选 择血清效价为1∶800的3只小鼠按照步骤③分别进行第四次免疫并对其 血清进行效价测定，结果用Lox1做为抗原的小鼠血清效价为1∶800，用 Lox3做为抗原的2只小鼠血清效价为1∶800、1∶800；如此再对小鼠进 行第五次免疫，结果用Lox1做为抗原的小鼠血清效价为1∶1600，用Lox3 做为抗原的2只小鼠血清效价为1∶1600、1∶3200；
⑤加强免疫：选择步骤④中血清效价1∶1600 Lox1免疫的小鼠和血 清效价1∶3200 Lox3免疫的小鼠在细胞融合前3天按步骤③加强免疫1 次；
⑥细胞融合：分别取步骤⑤中的不同小鼠的脾细胞与复苏的SP2/0 细胞混匀，在细胞培养板HAT培养基上分别筛选Lox1和Lox3杂交瘤细 胞，由河北省生物研究所细胞生化室完成；
⑦特异性阳性细胞株筛选：细胞融合10天后，利用步骤①中纯化 的Lox1和Lox3分别作为检测抗原，采用间接ELISA法对步骤⑥中长有 相对应杂交瘤细胞孔内的上清液进行首次阳性细胞株筛选，其中Lox1 抗体检测阳性为26孔，Lox3抗体检测阳性为20孔；
⑧亚克隆：采用有限稀释法对步骤⑦中筛选到的Lox1和Lox3阳性 细胞株分别亚克隆，连续两次亚克隆之后剔除掉假阳性细胞株，Lox1 得到了1个阳性细胞株5G11，Lox3得到了4个阳性细胞株1A4、2H6、3H10、 4E7，通过与脂肪氧化酶全缺失大豆品种“中特一号”种子总蛋白进行交 叉反应，证明这些细胞株分别为特异性分泌Lox1、Lox3单克隆抗体的 细胞株；
表1：Lox1阳性细胞株5G11亚克隆情况统计表 亚克隆次数 克隆孔数 检测孔数 阳性孔数 阳性率 第一次亚克隆 第二次亚克隆 第三次亚克隆 32 96 96 15 14 31 15 14 31 100％ 100％ 100％
表2：Lox3阳性细胞株1A4亚克隆情况统计表 亚克隆次数 克隆孔数 检测孔数 阳性孔数   阳性率 第一次亚克隆 第二次亚克隆 第三次亚克隆 第四次亚克隆 48 96 48 48 13 26 9 4 12 21 8 4   92.3％   80.77％   88.89％   100％
表3：Lox3阳性细胞株2H6亚克隆情况统计表 亚克隆次数 克隆孔数 检测孔数 阳性孔数   阳性率 第一次亚克隆 第二次亚克隆 第三次亚克隆 第四次亚克隆 48 96 48 48 24 20 20 3 11 6 18 3   45.8％   30％   90％   100％
表4：Lox3阳性细胞株3H10亚克隆情况统计表 亚克隆次数 克隆孔数 检测孔数 阳性孔数 阳性率 第一次亚克隆 第二次亚克隆 第三次亚克隆 第四次亚克隆 32 96 64 48 7 13 33 8 5 12 8 8 71.4％ 91.65％ 88.89％ 100％
表5：Lox3阳性细胞株4E7亚克隆情况统计表 亚克隆次数 克隆孔数 检测孔数 阳性孔数 阳性率 第一次亚克隆 第二次亚克隆 第三次亚克隆 第四次亚克隆 24 96 64 48 18 28 22 10 5 28 22 10 27.8％ 100％ 100％ 100％
⑨单克隆抗体腹水制备：将步骤⑧中得到的分泌Lox1单克隆抗体 的细胞株5G11和分泌Lox3单克隆抗体的细胞株1A4、2H6、3H10、4E7分别 接种到经过石蜡油预处理过的不同BALB/C小鼠腹腔诱导腹水产生，共5 只，接种量为106个细胞/只。7天后采集腹水，共得到Lox1单抗腹水 15ml，Lox3单抗腹水50.8ml；
⑩单克隆抗体腹水效价测定：用间接ELISA方法分别测定Lox1和 Lox3单克隆抗体腹水的效价，结果Lox1单克隆抗体腹水的效价为1∶15 万，Lox3单克隆抗体腹水的效价为分别为1∶5万、1∶5万、1∶10万和 1∶50万。
1-3-2制备Lox2单克隆抗体试剂D-2
①免疫抗原制备：分别取单缺Lox2的“五星2号”和普通大豆“冀 豆12号”豆粉各1g，分别与12ml稀释20倍的pH为8.0的Tris-CaCl2 缓冲液A试剂混合，离心后取上清备用，单缺Lox2的“五星2号”上 清液蛋白含量10.49mg/ml，普通大豆“冀豆12号”上清液蛋白含量 8.1mg/ml；
②小鼠免疫：选择6周龄的行动敏捷的纯系BALB/C雌小鼠3只， 分别称量各小鼠体重并标记；取115ul步骤①中制备的单缺Lox2的“五 星2号”上清液，用生理盐水将其稀释到300μL，加入等体积弗氏完全 佐剂混合后，采取皮下多点注射给每只小鼠注射200μL进行首次免疫， 每只小鼠的免疫剂量为0.4mg；
③注射环磷酰胺溶液(CY)：将步骤②中首免的小鼠分别于免疫 10min、24h、48h后，按照100mg/kg的量分别对3只小鼠进行颈背部多 点注射浓度20mg/ml的环磷酰胺溶液(CY)进行消减；
表6：小鼠首次免疫和注射环磷酰胺溶液(CY)情况表 首次免疫 抗原蛋白   数   量 标记   小鼠体重   /g   CY注射剂量 CY原液注射量 单缺Lox-2 总蛋白   1   1   1 红 黑 无标记   15.93   15.426   15.72   100mg/kg   100mg/kg   100mg/kg 84μL 80μL 82μL
④再次免疫：首次免疫1周后用步骤①中制备的普通大豆“冀豆12 号”上清液做抗原对步骤③中的小鼠按照步骤②方法再次进行免疫，如 此进行第三、四次免疫；
⑤效价测定、再免疫及加强免疫：操作步骤同1-3-1制备Lox1和 Lox3单克隆抗体试剂④和⑤，免疫抗原仍使用步骤①中制备的普通大豆 “冀豆12号”上清液；第四次免疫后，小鼠血清效价为1∶200、1∶800、 1∶400；经过第五次免疫后小鼠血清效价最高达到1∶3200；
⑥细胞融合、特异性阳性细胞株筛选、亚克隆、单克隆抗体腹水的 制备和单克隆抗体腹水效价测定操作步骤同1-3-1制备Lox1和Lox3单 克隆抗体试剂的⑥、⑦、⑧、⑨和⑩。首次筛选得到5个分泌Lox2单 克隆抗体的阳性孔，最终得到1株特异分泌Lox2的阳性细胞株4G6，共 得到单抗腹水3ml，效价为1∶1000000。
表7：4G6细胞株亚克隆情况统计表 亚克隆次数 克隆孔数 检测孔数 阳性孔数   阳性率 第一次亚克隆 第二次亚克隆 第三次亚克隆 96 192 96 30 45 32 30 45 32   100％   100％   100％
1-4制备多克隆抗体
①免疫大白兔：选择2只2.5kg的新西兰大白兔，将Sigma公司 的Soybean Lox type1-B蛋白稀释成8mg/ml作为抗原，取0.4ml抗原 与弗氏完全佐剂等体积混合乳化后，采取背部皮下多点注射兔子，每只 兔子注射0.4ml乳化液，免疫剂量为1.6mg；
②再次免疫：间隔14天后利用不完全付氏佐剂和浓度为8mg/ml的 Soybean Lox type1-B蛋白地等体积混合按照步骤①操作再次进行免疫， 每只免疫剂量为1.6mg，如此进行第三次免疫；
③效价测定：第三次免疫后第11天从上述步骤②中免疫的大白兔 耳缘静脉取血，用间接ELISA(酶联免疫吸附)检测其效价，结果效价 均达到1∶200000；
④多克隆抗体的制备：3天后对步骤②中兔子采用颈动脉放血法采 血，分离血清，分别使用“五星1号”、Century近等基因系材料Lox-1.3、 实施例1中1-3-1制备Lox1和Lox3单克隆抗体步骤①中纯化的Lox3 及脂肪氧化酶全缺失的“中特1号”大豆种子全蛋白浸提液包被，采用 间接ELISA法测定分离血清与Lox1、Lox2、Lox3及大豆中其它蛋白的 交叉反应，结果显示该血清与大豆中其它蛋白无交叉，而与Lox1、Lox2、 Lox3的效价均达到了1∶20000，共得到多克隆抗体血清28ml。
1-5包被酶标板
用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将1-4中制备的多克隆抗体血清 稀释5000倍，在96孔聚苯乙烯酶标板每个反应孔中加100ul，放置在 4℃下过夜。
1-6、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测试剂盒的组装
取长为13cm、宽为9cm、高为10cm长方体纸盒，内设双层结构， 下层放置1块96孔包被有多克隆抗体的酶标板，上层为纸质的支架， 支架内从左到右存放5列检测试剂，依次
第1列为1瓶10ml终止液H：2M H2SO4，1瓶15ml Tween20-NaCL 缓冲溶液C：含有0.1％Tween20、1.8％氯化钠，C试剂使用前稀释20 倍；
第2列为底物液G-1、G-2各1瓶，7ml/瓶，其中G-1为含有20％ 的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)无水乙醇溶液，G-2为pH 5.0 磷酸盐柠檬酸缓冲液，其中含有1.46％的无水Na2HPO4、0.933％的柠檬 酸和0.05％的双氧水；
第3列为1管1ml的缓冲液A：为pH8.0的Tris-CaCl2缓冲液， 其中含有12.12％Tris、4.4％的氯化钙，使用前稀释20倍；1瓶的15ml 酶标二抗稀释液F：为含有5-10％脱脂奶粉的Tween20-NaCl溶液，使 用前稀释20倍；
第4列为1管100ul阳性对照B-1：从普通大豆“冀豆12号”中提 取的总蛋白，1管100ul阴性对照B-2：从大豆脂肪氧化酶全缺失品种 “中特一号”大豆中提取的总蛋白，1管5ul酶标二抗E试剂，1管1ml 标准液I：用双蒸水将sigma公司Soybean Lox type1-B产品稀释成80 万活力单位/ml；
第5列为3管单克隆抗体D试剂：包括D-1、D-2、D-3分别是大豆 脂肪氧化酶同功酶Lox1、Lox2和Lox3单克隆抗体腹水，10ul/管，效 价均为1∶20000，使用前稀释2000倍。
实施例2：定性检测“冀豆12号”脂肪氧化酶缺失近等基因系高代材料 10个
①待测样品的制备：使用钢锉从每粒待检测的大豆种子上磨取 0.05g豆粉，放置于1.5ml离心管中，分别编号1号～10号，各加入0.5ml 稀释20倍的A试剂，混匀4℃静置30min后，4000rpm离心10min，使 用稀释20倍后的C试剂将离心后的上清液10倍稀释备用；
②洗板：将酶标板K用稀释20倍的C试剂洗板3次，每次2-3min， 拍干；
③加待测样品：将阴阳性对照B-2、B-1和步骤①中制备的待测样 品按表8所示位置加到步骤②备好的酶标板反应孔中，每孔100μL，样 品均设3次重复，37℃放置45min后，按照步骤②操作洗板；
表8酶标板反应孔位置示意   1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 11 12 A  B-1 B-1 B-1 3号 3号 3号 5号 5号 5号 8号 8号 8号 B  B-2 B-2 B-2 3号 3号 3号 6号 6号 6号 8号 8号 8号 C  1号 1号 1号 3号 3号 3号 6号 6号 6号 9号 9号 9号 D  1号 1号 1号 4号 4号 4号 6号 6号 6号 9号 9号 9号 E  1号 1号 1号 4号 4号 4号 7号 7号 7号 9号 9号 9号 F  2号 2号 2号 4号 4号 4号 7号 7号 7号 10号 10号 10号 G  2号 2号 2号 5号 5号 5号 7号 7号 7号 10号 10号 10号 H  2号 2号 2号 5号 5号 5号 8号 8号 8号 10号 10号 10号
④加Lox1、Lox2、Lox3单克隆抗体：分别取3.5ml稀释2000倍后 的D-1、D-2、D-3试剂，按100μL/孔第1、4、7、10列加D-1试剂，2、 5、8、11列加D-2试剂，3、6、9、12列加D-3试剂，37℃放置45min 后按照步骤②操作洗板；
⑤加入E试剂：使用稀释20倍的F试剂将E试剂稀释10000倍，共 配制10ml，按100μL/孔将其加入每个反应孔中，37℃放置30min后按 照步骤②操作洗板；
⑥显色：将G-1和G-2试剂等体积混合，配制10ml，按100μL/孔 加入每个反应孔中，避光放置15min；
⑦结果判读：1、4、7、10列当中出现绿色(即阳性)的为待测样 品中含有Lox1，若无色(与阴性对照相同)说明不含有Lox1，同理可 以判断各样品是否含有Lox2、Lox3。结果显示：1号、6号、8号属 Lox-1.2.3，2号属Lox-1，3号属Lox-2，4号、9号属Lox-2.3，5号、 7号属Lox-1.2，10号属正常。
实施例3：定量检测“冀豆12号”中Lox1的含量
①Lox1提取液的制备：使用钢锉从1粒“冀豆12号”种子上磨取 0.05g豆粉，放置于1.5ml离心管中，同实施例2中的①来制备Lox1 提取液；
②洗板：将酶标板K用稀释20倍的C试剂洗板3次，每次2-3min， 拍干；
③加样：将标准液I试剂用C试剂按10、30、90、270、810、2430、 7290、21870、65610、196830、590490、0共12个浓度进行倍比稀释， 同时将步骤①制备好的Lox提取液稀释10、50、100、200共4个浓度， 然后将不同稀释浓度的标准液(I)和Lox提取液按每个浓度100μL/ 孔按表9所示分别加到步骤②备好的酶标板(k)中，均设3次重复， 37℃放置45min后按照步骤②洗板；
表9酶标板反应孔位置示意   1   2   3   4  5   6  7  8  9  10  11   12   I试剂   10   30   90   270  810   2430  7290  21870  65610  196830  590490   0   I试剂   10   30   90   270  810   2430  7290  21870  65610  196830  590490   0   I试剂   10   30   90   270  810   2430  7290  21870  65610  196830  590490   0   待测样品   1倍   5倍   10倍   50倍  100   200  1倍  5倍  10倍  50倍  100倍   200倍   待测样品   1倍   5倍   10倍   50倍  100倍   200倍
注：表9中前三排各孔当中所列数字为标准液的稀释倍数(均三次重复)， 第四、五排各孔当中所列数字为待测样品稀释倍数(均三次重复)。
④加Lox1单克隆抗体：取6ml稀释2000倍后的D-1试剂，按100 μL/孔加到酶标板中，37℃放置30min后按照步骤②操作洗板；
⑤加E试剂和显色操作同实施例2中的⑤和⑥，显色后按50μL/ 孔加入H试剂终止；
⑥酶标仪读数：设置参数：450nm，外部振摇3秒；
⑦标准曲线的绘制：按步骤③中标准液I试剂的稀释度的log值为 横坐标，以步骤⑥中得到的OD值为纵坐标，绘制“S”形标准曲线(见说 明书附图3)；
⑧利用“S”形标准曲线中间呈线性关系的一段，利用该线段的回 归方程以及待测样品系列稀释度的OD值计算出Lox的活力单位数，结 果“冀豆12号”中Lox1的含量为13.06活力单位。
本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这种检测大豆脂肪氧化 酶同功酶的方法及试剂盒的应用，而不对本发明的范围构成任何限制， 用本发明实施例和经由本发明权利要求书1-8所述的方法均可实现本发 明的目的。
本发明实施例中：
1、96孔聚苯乙烯酶标板购自厦门市云鹏科技发展有限公司；
2、普通大豆品种“冀豆12号”，审定号：国审豆2001001；
3、大豆脂肪氧化酶全缺失材料“中特1号”购自中国农业科学 院作物科学研究所；
4、美国Century近等基因系材料国家资源库保存号分别为： Lox-1：WDD01483、Lox-2：WDD01484、Lox-3：WDD01485、Lox-1.3： WDD01486、Lox-2.3：WDD01487；
5、缺Lox-2酶大豆品种“五星2号”，审定号：国审豆2004005；
6、双缺失Lox-2.3大豆品种“五星1号”，审定号：国审豆 2003021；
7、酶标二抗购自中杉公司产品；
8、BALB/C小鼠和小鼠SP2/0细胞购自军事医学科学院实验动物 中心(北京)；
9、新西兰大白兔：购自河北省实验动物中心；
10、HAT培养基、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Soybean Lox type1-B均为Sigma公司产品；
11、化学试剂：电泳试剂购自上海生物技术有限公司；其它所用 化学试剂均购自北京鼎国生物技术有限责任公司。