编码免疫刺激融合分子的多核苷酸及其用途
阅读：1021发布：2020-12-29
专利汇可以提供编码免疫刺激融合分子的多核苷酸及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了编码免疫刺激融合分子的多核苷酸，其药物和制剂，及其使用和制备方法，该免疫刺激融合分子包括免疫细胞靶向部分和细胞因子分子。，下面是编码免疫刺激融合分子的多核苷酸及其用途专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包含：
(a)一种或多种包含mRNA的工程改造的多核苷酸，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含通过肽接头可操作地连接至免疫细胞靶向部分的细胞因子或生长因子分子或其变体，所述免疫细胞靶向部分包含针对靶免疫细胞上细胞表面抗原的完全或部分结合位点，和
(b)靶免疫细胞。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸中的至少一种还包含编码信号肽的序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述mRNA是修饰的mRNA。
4.如权利要求1所述的工程改造的多核苷酸分子，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸包含非整合RNA。
5.一种在免疫细胞中诱导瞬时基因表达的方法，其包括在适合将所述多核苷酸引入所述免疫细胞的条件下，使靶免疫细胞与有效量的第一组合物接触，所述第一组合物包含一种或多种包含mRNA的工程改造的多核苷酸，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含通过肽接头与免疫细胞靶向部分可操作地连接的细胞因子或生长因子分子或其变体，所述免疫细胞靶向部分包含针对所述靶免疫细胞上细胞表面抗原的完全或部分结合位点。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述免疫细胞具有在其表面表达或以其他方式展示的细胞表面抗原。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸通过脂转染，通过电穿孔，通过核穿孔，通过流体动力休克或以纳米颗粒方式引入所述免疫细胞。
8.一种在免疫细胞中表达细胞因子或生长因子分子或其变体的方法，其包括在适合将工程改造的多核苷酸引入所述免疫细胞的条件下，使所述靶免疫细胞与一种或多种包含mRNA的工程改造的多核苷酸接触，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含通过肽接头可操作地连接至免疫细胞靶向部分的细胞因子或生长因子分子或其变体，所述免疫细胞靶向部分包含针对所述靶免疫细胞上细胞表面抗原的完全或部分结合位点。
9.如权利要求5或8所述的方法，其中所述接触体内或离体发生。
10.如权利要求5所述的方法，还包括在适合于将第二组合物的一种或多种工程改造的多核苷酸引入所述免疫细胞的条件下，使所述免疫细胞与有效量的包含一种或多种工程改造的多核苷酸的第二组合物接触。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第二组合物包含一起编码细胞因子分子，生长因子分子，共刺激分子和前述任一种的变体中的一种或多种的一种或多种工程改造的多核苷酸。
12.如权利要求10所述的方法，其中将第一组合物的一种或多种工程改造的多核苷酸和所述第二组合物的一种或多种工程改造的多核苷酸共转染到免疫细胞中。
13.一种修饰的免疫细胞，其包含：
具有其中转染有一种或多种工程改造的多核苷酸的免疫细胞，
其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸包含mRNA，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码细胞因子或生长因子分子或其变体，和
其中任选地，所述细胞因子或生长因子分子以与免疫细胞靶向部分可操作地连接的融合分子提供，所述免疫细胞靶向部分具有针对由免疫细胞表达或以其他方式在其上展示的细胞表面抗原的完全或部分结合位点。
14.如权利要求13所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是健康和/或非恶性免疫细胞、淋巴细胞或T细胞。
15.如权利要求13所述的修饰的免疫细胞，其中所述细胞因子分子选自IL-15，IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27中的一种或多种。
16.如权利要求15所述的修饰的免疫细胞，其中所述细胞因子分子是IL-12和/或IL-
15。
17.如权利要求13所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞靶向部分选自抗体或其抗原结合片段，非抗体支架或与免疫细胞表面受体结合的配体，其中所述免疫细胞表面受体选自CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD25，CD127，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8，CCR10，CD16，CD56，CD137，OX40或GITR中的一种或多种。
18.如权利要求17所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞靶向部分包含结合CD45的抗体或其抗原结合片段。
19.如权利要求13所述的修饰的免疫细胞，其中所述融合分子还包含用于可操作地连接所述免疫细胞靶向部分和所述细胞因子分子的接头。
20.如权利要求13所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞还包含所述免疫细胞的表面上结合的融合分子，所述融合分子包含细胞因子或生长因子分子，或其变体，其可操作地连接免疫细胞靶向部分，所述免疫细胞靶向部分与由所述免疫细胞表达或以其他方式在其上展示的细胞表面抗原具有亲和力。
21.如权利要求20所述的修饰的免疫细胞，其中由所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码的细胞因子或生长因子分子或其变体不同于结合在所述免疫细胞表面上的融合分子的细胞因子或生长因子分子或其变体。
22.如权利要求20所述的修饰的免疫细胞，其中由所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码的细胞因子或生长因子分子或其变体与结合在所述免疫细胞表面上的融合分子的细胞因子或生长因子分子或其变体相同。
23.如权利要求20所述的修饰的免疫细胞，其中由所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码的免疫细胞靶向部分不同于结合在所述免疫细胞表面上的融合分子的免疫细胞靶向部分。
24.如权利要求20所述的修饰的免疫细胞，其中由所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码的免疫细胞靶向部分与结合在所述免疫细胞表面上的融合分子的免疫细胞靶向部分相同。
25.一种制备如权利要求13-24中任一项所述的修饰的免疫细胞的方法，包括将所述一种或多种工程改造的多核苷酸转染到免疫细胞中。
26.一种提供细胞疗法的方法，包括向有此需要的对象给予多个如权利要求13-24中任一项所述的修饰的免疫细胞。
27.一种用于治疗对象中癌症的方法，所述方法包括以适合于T细胞的体内转染并随后表达由所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码的生长因子分子或细胞因子的形式和条件向人对象给予如权利要求1所述包含一种或多种工程改造的多核苷酸的组合物；其中由所述一种或多种工程改造的多核苷酸表达的细胞因子或生长因子分子或其变体在体内作用于对象中的转染的T细胞和/或其他免疫细胞以刺激针对所述癌症的免疫应答。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述细胞因子或生长因子分子或其变体的表达是瞬时表达的。
29.如权利要求27所述的方法，其中给予通过静脉内或瘤内注射进行。
30.一种用于治疗对象中癌症的方法，所述方法包括：
(a)向人对象给予细胞治疗组合物，所述组合物包含T细胞群，所述T细胞群归巢于癌细胞或癌细胞存在的组织，其中所述T细胞被多个免疫刺激融合分子修饰，各个融合分子包含(i)免疫刺激性细胞因子或生长因子分子；和(ii)对所述T细胞上的细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分，其中所述多个免疫刺激融合分子结合至所述T细胞的表面，和(b)以适合于在步骤(a)中给予的所述修饰的T细胞体内转染并随后表达由所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码的生长因子分子或细胞因子的形式和条件向人对象给予如权利要求1所述包含一种或多种工程改造的多核苷酸的组合物，
其中步骤(a)中给予的和/或由步骤(b)中给予的所述一种或多种工程改造的多核苷酸表达的所述细胞治疗组合物的细胞因子和/或生长因子分子在体内作用于对象中的T细胞和/或其他免疫细胞群体以刺激针对所述癌症的免疫应答。
编码免疫刺激融合分子的多核苷酸及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年7月3日提交的美国临时申请号62/528,411、2017年12月13日提交的美国临时申请号62/598,433、2018年1月22日提交的美国临时申请号62/620,418、2018年1月22日提交的美国临时申请号62/620,107和2018年4月13日提交的美国临时申请号62/657,455，全部内容在此通过引用纳入本文。
[0004] 通过EFS-Web在2018年7月3日创建的名为“174285_010900_sequence.txt”的具有231,529字节大小的ASCII文本文件通过引用其全部内容纳入本文。
技术领域
[0005] 本公开总体上涉及编码经工程改造以包含免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分的免疫刺激融合分子的多核苷酸。还提供了其制造和使用的方法。
[0006] 背景
[0007] 细胞因子参与免疫系统的调节。当用于癌症治疗时，细胞因子可以充当具有抗肿瘤作用的免疫调节剂，并且可以增加针对某些类型肿瘤的免疫应答。然而，快速的血液清除和缺乏肿瘤特异性需要全身性给予大剂量的细胞因子，以便在肿瘤部位和其他相关组织(例如淋巴结和脾脏)达到足以激活免疫应答或有抗肿瘤作用的细胞因子浓度。这些高水平的全身细胞因子可导致严重的毒性和不良反应。
[0009] 本公开内容尤其提供了一种或多种编码包含免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分的免疫刺激融合分子(IFM；可与“系连融合体”互换使用)的多核苷酸。
[0010] 一方面，本文提供了包括以下的组合物：(a)一种或多种包含mRNA的工程改造的多核苷酸，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含通过肽接头可操作地连接至免疫细胞靶向部分的细胞因子或生长因子分子或其变体，所述免疫细胞靶向部分包含针对靶免疫细胞上细胞表面抗原的完全或部分结合位点，和(b)靶免疫细胞。
[0011] 在一些实施方式中，一种或多种工程改造的多核苷酸中的至少一种还包含编码信号肽的序列。在一些实施方式中，mRNA是修饰的mRNA。在一些实施方式中，一种或多种工程改造的多核苷酸包含非整合RNA。
[0012] 另一方面涉及在免疫细胞中诱导瞬时基因表达的方法，其包括在适合将多核苷酸引入免疫细胞的条件下，使靶免疫细胞与有效量的第一组合物接触，所述第一组合物包含一种或多种包含mRNA的工程改造的多核苷酸，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含通过肽接头与免疫细胞靶向部分可操作地连接的细胞因子或生长因子分子或其变体，所述免疫细胞靶向部分包含针对靶免疫细胞上细胞表面抗原的完全或部分结合位点。在一些实施方式中，接触体内或离体发生。
[0013] 在一些实施方式中，免疫细胞具有在其表面表达或以其他方式展示的细胞表面抗原。在一些实施方式中，通过脂转染，通过电穿孔，通过核穿孔，通过流体动力休克或以纳米颗粒方式将一种或多种工程改造的多核苷酸引入免疫细胞。
[0014] 本文还提供了一种在免疫细胞中表达细胞因子或生长因子分子或其变体的方法，其包括在适合将工程改造的多核苷酸引入免疫细胞的条件下，使靶免疫细胞与一种或多种包含mRNA的工程改造的多核苷酸接触，其中所述一种或多种工程改造的多核苷酸编码包含以下的融合蛋白：细胞因子或生长因子分子或其变体，通过肽接头与免疫细胞靶向部分可操作地连接，该免疫细胞靶向部分包含针对靶免疫细胞上细胞表面抗原的完全或部分结合位点。在一些实施方式中，接触体内或离体发生。
[0015] 在一些实施方式中，该方法还包括在适合于将第二组合物的一种或多种工程改造的多核苷酸引入免疫细胞的条件下，使免疫细胞与有效量的包含一种或多种工程改造的多核苷酸的第二组合物接触。在一些实施方式中，第二组合物包含一起编码细胞因子分子，生长因子分子，共刺激分子和前述任一种的变体中的一种或多种的一种或多种工程改造的多核苷酸。在一些实施方式中，将第一组合物的一种或多种工程改造的多核苷酸和第二组合物的一种或多种工程改造的多核苷酸共转染到免疫细胞中。
[0016] 另一方面涉及修饰的免疫细胞，其包括：
[0017] 具有其中转染有一种或多种工程改造的多核苷酸的免疫细胞，
[0018] 其中一种或多种工程改造的多核苷酸包含mRNA，其中一种或多种工程改造的多核苷酸编码细胞因子或生长因子分子或其变体，和
[0019] 其中任选地，细胞因子或生长因子分子以与免疫细胞靶向部分可操作地连接的融合分子提供，所述免疫细胞靶向部分具有针对由免疫细胞表达或以其他方式在其上展示的细胞表面抗原的完全或部分结合位点。
[0020] 在一些实施方式中，免疫细胞是健康和/或非恶性免疫细胞，淋巴细胞或T细胞。在一些实施方式中，细胞因子分子选自IL-15，IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27中的一种或多种。在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-12和/或IL-15。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自抗体或其抗原结合片段，非抗体支架或与免疫细胞表面受体结合的配体，其中免疫细胞表面受体选自CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD25，CD127，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8，CCR10，CD16，CD56，CD137，OX40或GITR中的一种或多种。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，融合分子还包含用于可操作地连接免疫细胞靶向部分和细胞因子分子的接头。在一些实施方式中，免疫细胞还包含结合在免疫细胞表面上的融合分子，该融合分子包含细胞因子或生长因子分子或其变体，可操作地连接至与由免疫细胞表达或以其他方式在其上展示的细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分。在一些实施方式中，由一种或多种工程改造的多核苷酸编码的细胞因子或生长因子分子或其变体不同于结合在免疫细胞表面上的融合分子的细胞因子或生长因子分子或其变体。在一些实施方式中，由一种或多种工程改造的多核苷酸编码的细胞因子或生长因子分子或其变体与结合在免疫细胞表面上的融合分子的细胞因子或生长因子分子或其变体相同。在一些实施方式中，由一种或多种工程改造的多核苷酸编码的免疫细胞靶向部分不同于结合在免疫细胞表面上的融合分子的免疫细胞靶向部分。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分或由一种或多种工程改造的多核苷酸编码的免疫细胞靶向部分与结合在免疫细胞表面上的融合分子的免疫细胞靶向部分相同。
[0021] 本文还提供了制备本文公开的修饰的免疫细胞的方法，其包括将一种或多种工程改造的多核苷酸转染到免疫细胞中。
[0022] 本文还提供了提供细胞疗法的方法，其包括将本文公开的多个修饰的免疫细胞给予有此需要的对象。本文还公开了修饰的免疫细胞用于提供细胞疗法的用途。
[0023] 另一个方面涉及一种用于治疗对象的癌症的方法，该方法包括在这样的形式和条件下向该人对象给予包含一种或多种本文公开的工程改造的多核苷酸的组合物，所述形式和条件适用于T细胞的体内转染和随后由一种或多种工程改造的多核苷酸编码的细胞因子或生长因子分子或其变体的表达；其中由一种或多种工程改造的多核苷酸表达的细胞因子或生长因子分子或其变体在体内作用于对象中转染的T细胞和/或其他免疫细胞以刺激针对癌症的免疫应答。
[0024] 在一些实施方式中，细胞因子或生长因子分子或其变体的表达是瞬时表达的。在一些实施方式中，给予是静脉内或通过肿瘤内注射进行的。
[0025] 另一方面涉及用于治疗对象的癌症的方法，该方法包括：
[0026] (a)向人对象给予细胞治疗组合物，该组合物包含T细胞群，所述T细胞群归巢于癌细胞或癌细胞存在的组织，其中所述T细胞被多个免疫刺激融合分子修饰，各个融合分子包含(i)免疫刺激性细胞因子或生长因子分子；和(ii)对T细胞上的细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分，其中多个免疫刺激融合分子结合至T细胞的表面，和
[0027] (b)以适合于在步骤(a)中给予的修饰的T细胞体内转染并随后表达由一种或多种工程改造的多核苷酸编码的生长因子分子或细胞因子的形式和条件向人对象给予包含一种或多种根据权利要求1所述的工程改造的多核苷酸的组合物，
[0028] 其中步骤(a)中给予的和/或由步骤(b)中给予的一种或多种工程改造的多核苷酸表达的细胞治疗组合物的细胞因子和/或生长因子分子在体内作用于对象中的T细胞和/或其他免疫细胞群体以刺激针对癌症的免疫应答。
[0029] 本文还提供了所述组合物(例如工程改造的多核苷酸和/或修饰的免疫细胞)在治疗癌症中的用途。
[0030] 在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子，包括：
[0031] (a)免疫刺激细胞因子分子；和
[0032] (b)免疫细胞靶向部分，其包含对靶免疫细胞表面上的抗原具有亲和力的抗体的抗原结合片段，
[0033] 其中所述免疫刺激细胞因子分子与所述抗原结合片段可操作地连接。
[0034] 在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子，包括：
[0035] (a)免疫刺激细胞因子分子；和
[0036] (b)免疫细胞靶向部分，其包含具有对在靶免疫细胞表面上抗原有特异性的抗原结合位点的抗体，其中该抗体包含具有C末端和N末端的轻链，和具有C末端和N末端的重链，其中轻链通过二硫键与重链连接，
[0037] 其中免疫刺激细胞因子分子在轻链的C末端，轻链的N末端或重链部分的N末端与抗体可操作地连接。
[0038] 在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子，包括：
[0039] (a)IL-12分子；和
[0040] (b)T细胞靶向部分，其包含具有对CD45细胞表面受体有特异性的抗原结合位点的Fab片段；
[0041] 其中Fab片段和IL-12分子作为融合分子可操作地连接在一起。
[0042] 在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分靶向选自效应T细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞和CTL的T细胞。在一些实施方式中，抗原是在T细胞的细胞表面上表达的CD45受体。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分包含抗CD45抗体BC8、4B2、GAP8.3或9.4的Fab片段，F(ab')2，Fv，单链Fv或前述任一项的人源化形式。在一些实施方式中，免疫刺激细胞因子分子包含IL-12，单链IL-12，IL-12的亚基或任何前述形式的变体。免疫刺激融合分子可进一步包括对靶免疫细胞表面上的抗原具有亲和力的单链Fv，其中任选地，该单链Fv与抗原结合片段对相同的抗原具有亲和力。在一些实施方式中，单链Fv对不同于抗原结合片段的抗原具有亲和力。在一些实施方式中，抗原结合片段是Fab片段，其任选地包含任选地通过二硫键连接的轻链和重链片段，并且其中免疫刺激细胞因子分子在轻链的C-末端，轻链的N-末端，重链片段的C-末端或重链片段的N-末端可操作地连接至Fab片段。
[0043] 在一些实施方式中，免疫刺激细胞因子分子通过接头可操作地连接至抗原结合片段。在一些实施方式中，接头选自可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头和非螺旋接头，例如包含Gly和Ser的肽接头。在一些实施方式中，肽接头是(GGGS)N(SEQ ID NO：124)或(GGGGS)N(SEQ ID NO：125)接头，其中N表示基序的重复数，并且是选自1-10的整数。
[0044] 在一些实施方式中，抗原结合片段对CD45受体具有亲和力，并且包含：
[0045] (a)对应于SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的抗体部分中可变结构域的轻链可变氨基酸序列，或与SEQ ID NO：82的可变结构域有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列；和/或
[0046] (b)对应于SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的可变结构域的重链可变氨基酸序列，或与SEQ ID NO：79的可变结构域有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列。
[0047] 在一些实施方式中，细胞因子分子包含IL-12分子，该IL-12分子具有对应于SEQ ID NO：50所示氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：50的细胞因子部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列。
[0048] 在一些实施方式中，细胞因子分子包含单链IL-12分子，其具有通过接头与IL-12B亚基连接的IL-12A亚基，该接头具有对应于SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：70的细胞因子部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列。
[0049] 在一些实施方式中，接头包含肽接头，该肽接头具有对应于与SEQ ID NO：36中的氨基酸序列的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36的细胞因子部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列。
[0050] 在一些实施方式中，单链Fv具有对应于SEQ ID NO：80的Fv部分的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80的Fv部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列。
[0051] 在一些实施方式中，所述Fab片段包含具有可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)的轻链和具有可变结构域(VH)和恒定结构域(CH1)的重链片段，其中所述轻链和重链片段任选地通过二硫键连接，并且其中轻链和重链片段各自包含C-末端和N-末端。在一些实施方式中，IL-12分子与轻链或重链片段的C-末端或N-末端可操作地连接。
[0052] 在一些实施方式中，免疫刺激融合分子进一步包含肽接头，该肽接头具有与IL-12分子融合的第一末端和与Fab片段融合的第二末端，从而可操作地连接IL-12分子和Fab片段。
[0053] 本文还提供了编码本文公开的任何免疫刺激融合分子的分离的核酸分子。
[0054] 本文还提供了包含一种或多种核酸的载体，该核酸编码对应于SEQ ID NO：36、50、70、79、80或82的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36、50、70、79、80或82有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列的多肽。
[0055] 本文还提供了包含本文公开的核酸分子或载体的宿主细胞。
[0056] 另一方面涉及修饰的免疫细胞，其包括：
[0057] (a)免疫刺激融合分子，其包含
[0058] (i)免疫刺激细胞因子分子；和
[0059] (ii)对细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分；和
[0060] (b)表达或以其他方式展示细胞表面抗原的靶免疫细胞，
[0061] 其中免疫刺激融合分子通过与细胞表面抗原的相互作用结合到免疫细胞的表面。
[0062] 另一个方面涉及修饰的免疫细胞，其包含健康和/或非恶性免疫细胞以及与之结合的本文公开的免疫刺激融合分子。
[0063] 另一方面涉及制备修饰的免疫细胞的方法，其包括：
[0064] (a)提供免疫细胞群；和
[0065] (b)将本文公开的免疫刺激融合分子与免疫细胞群一起孵育，以允许免疫刺激融合分子与其靶向结合，从而产生在细胞表面上结合有免疫刺激融合分子的免疫细胞群。
[0066] 另一方面涉及用于免疫细胞疗法的组合物，该组合物包含：
[0067] (a)多个免疫刺激融合分子，各个融合分子包含
[0068] (i)免疫刺激细胞因子分子；和
[0069] (ii)对T细胞的细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分；
[0070] (b)表达或以其他方式展示细胞表面抗原的T细胞群，其中多个免疫刺激融合分子通过与细胞表面抗原的相互作用结合到T细胞的表面上；和
[0071] (c)药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂。
[0072] 另一方面涉及药物组合物，其包含本文公开的免疫刺激融合分子和药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂。
[0073] 本文还提供了用于治疗人对象的癌症的方法，该方法包括向人对象给予细胞治疗组合物，该组合物包括：
[0074] (a)多个免疫刺激融合分子，各个融合分子包含
[0075] (i)免疫刺激细胞因子分子；和
[0076] (ii)对T细胞的细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分；和
[0077] (b)归巢于癌细胞或癌细胞存在的组织的T细胞群，其中T细胞表达细胞表面抗原，[0078] 其中多个免疫刺激融合分子结合至T细胞的表面，并且其中细胞因子分子在体内作用于人对象中的T细胞和/或其他免疫细胞群以刺激针对癌症的免疫应答。
[0079] 在一些实施方式中，T细胞群包括原代T细胞，扩增的原代T细胞，衍生自PBMC细胞的T细胞，衍生自脐带血细胞的T细胞，与人对象自体的T细胞，与人对象同种异体的T细胞，基因工程改造的T细胞，CAR-T细胞，效应T细胞，活化T细胞，CD8+T细胞，CD4+T细胞和/或CTL。在一些实施方式中，在选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法或富集抗原特异性T细胞疗法的细胞疗法过程中将细胞治疗组合物给予人对象。
[0080] 在一些实施方式中，本文公开的免疫刺激融合分子可以进一步包括纳米颗粒，脂质体和/或可生物降解的聚合物。在一些实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒或固体纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质纳米凝胶。在一些实施方式中，纳米颗粒任选地在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，纳米颗粒包含通过对氧化还原(二硫化物)或pH(可水解基团)或酶(蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。
[0081] 在一方面中，提供了一种组合物，其包含：
[0082] (a)免疫刺激融合分子，其包含
[0083] (i)免疫刺激细胞因子分子；和
[0084] (ii)对细胞表面抗原具有亲和力的免疫细胞靶向部分；
[0085] (b)表达或以其他方式展示细胞表面抗原的靶免疫细胞，
[0086] 其中免疫刺激融合分子通过与细胞表面抗原的相互作用结合到免疫细胞的表面；和
[0087] (c)纳米颗粒，纳米凝胶或脂质体。
[0088] 在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子(IFM)，其包括：
[0089] (i)选自IL-15，IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27中的一种或多种的细胞因子分子，包括；和
[0090] (ii)与免疫细胞上的免疫细胞表面受体具有亲和力的免疫细胞靶向部分，其中该免疫细胞靶向部分选自与免疫细胞表面受体结合的抗体或其抗原结合片段，非抗体支架或配体，其中免疫细胞表面受体选自CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD25，CD127，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8，CCR10，CD16，CD56，CD137，OX40或GITR中的一种或多种；
[0091] 其中细胞因子分子和免疫细胞靶向部分作为融合分子可操作地连接在一起。
[0092] 在一些实施方式中，细胞因子分子可包含IL-15和/或IL-12。免疫细胞靶向部分可包含与CD45结合的抗体或配体。
[0093] 在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子(IFM)，其包括：
[0094] (i)选自IL-12和/或IL-15或其变体形式的细胞因子分子；和
[0095] (ii)与免疫细胞上的免疫细胞表面受体具有亲和力的免疫细胞靶向部分，其中该免疫细胞靶向部分选自与免疫细胞表面受体结合的抗体或其抗原结合片段，非抗体支架或配体，其中免疫细胞表面受体是CD45；
[0096] 其中细胞因子分子和免疫细胞靶向部分作为融合分子可操作地连接在一起。
[0097] 在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-12和/或IL-15。免疫细胞靶向部分可包含与CD45结合的抗体或其抗原结合片段。
[0098] 在一些实施方式中，免疫细胞是健康和/或非恶性免疫细胞。在各种实施方式中，IFM可进一步包括用于可操作地连接靶向部分和细胞因子分子的接头。例如，接头可以选自：可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头或非螺旋接头，优选肽接头，其任选地包含Gly和Ser，其中优选肽接头是(GGGS)N或(GGGGS)N接头，其中N表示基序的重复数，并且是选自1-10的整数。
[0099] 本文还提供了包含本文所公开的IFM和药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂的药物组合物。
[0100] 另一个方面涉及修饰的免疫细胞，其包含健康和/或非恶性免疫细胞以及与之结合或靶向的本文公开的IFM。
[0101] 另一方面涉及体外制备修饰的免疫细胞的方法，其包括：
[0102] 提供多个健康和/或非恶性免疫细胞；和
[0103] 将本文公开的IFM与多个健康和/或非恶性免疫细胞一起孵育，以允许IFM与其靶向结合，从而产生多个修饰的免疫细胞。
[0104] 另一方面涉及提供细胞疗法的方法，包括：
[0105] 提供多个健康和/或非恶性免疫细胞；
[0106] 将本文公开的IFM与多个健康和/或非恶性免疫细胞一起孵育，以允许IFM与其靶向结合，从而产生多个修饰的免疫细胞；和
[0107] 将多个修饰的免疫细胞给予有此需要的对象；
[0108] 其中优选在不进行对象的预处理的情况下给予细胞疗法，其中所述预处理包括CPX(环磷酰胺)或其他淋巴细胞清除调节化学疗法。
[0109] 在一些实施方式中，细胞疗法可用于治疗癌症，优选实体瘤癌症或血液癌症。实体瘤癌可以是以下的一种或多种：卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域癌，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，卡波济肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，子宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊髓轴肿瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，所述癌症的转移性病变或其组合。血液癌症可以是以下的一种或多种：白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，毛细胞白血病，急性单核细胞白血病(AMoL)，慢性髓单核细胞白血病(CMML)，青少年髓单核细胞白血病(JMML)或大颗粒性淋巴细胞性白血病)，淋巴瘤(例如与AIDS相关的淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主导的霍奇金淋巴瘤)，真菌病(mycosis fungoides)，非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(真菌病，间变性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞淋巴瘤))，原发性中枢神经系统淋巴瘤，Sézary综合征，巨球蛋白血症)，慢性骨髓增殖性疾病，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，或骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤。
[0110] 在各种实施方式中，细胞疗法可以选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，富集的抗原特异性T细胞疗法或NK细胞疗法。在某些实施方式中，多个健康和/或非恶性免疫细胞对对象是自体的。
[0111] 在另一方面，本公开提供了一种颗粒，例如纳米颗粒，其包含如本文所述的IFM，例如包括蛋白质(例如，蛋白质纳米凝胶)的纳米颗粒。在一个实施方式中，颗粒包含相同的IFM。在其他实施方式中，颗粒包含一种或多种不同类型的IFM。纳米颗粒及其制备方法公开于2017年6月13日提交的PCT国际申请PCT/US2017/037249，例如第57-79页上，其全部内容通过引用纳入本文。在某些实施方式中，此类纳米颗粒可与背包技术结合使用，例如在美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944，美国公开号2014/0081012和PCT申请号PCT/US2017/037249中所述，其各自通过引用全文纳入本文。
[0112] 在一些实施方式中，免疫刺激部分选自细胞因子分子，共刺激分子的激动剂或负免疫调节剂的抑制剂，例如检查点抑制剂的抑制剂。
[0113] 在一些实施方式中，免疫刺激部分是细胞因子分子。在某些实施方式中，细胞因子分子包括细胞因子，例如包括选自IL-2，IL-6，IL-7，IL-9，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27中的一种或多种的细胞因子，包括其变体形式(例如，细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式)。在一个实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子。
[0114] 在其他实施方式中，免疫刺激部分是共刺激分子，例如选自CD137，OX40，CD28，GITR，VISTA，抗CD40或CD3的共刺激分子的激动剂。在一些实施方式中，免疫刺激分子的激动剂是针对CD137，OX40，GITR，CD3或CD28的激动剂抗体分子或其激动剂配体。
[0115] 在其他实施方式中，免疫刺激部分是负免疫调节剂的抑制剂，例如检查点抑制剂，例如选自PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3，或CTLA-4的检查点抑制剂的抑制剂。在一些实施方式中，负免疫调节剂的抑制剂是抗体分子或配体。例如，检查点抑制剂的抑制剂，例如抗体分子，结合和/或抑制PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或CTLA-4。
[0116] 在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分能够结合免疫细胞表面靶标，从而将免疫刺激部分靶向免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如淋巴细胞)。不希望受到理论的系连，认为免疫细胞靶向部分与免疫细胞表面靶标的结合会增加免疫刺激部分(例如细胞因子分子)及免疫细胞表面上的其相应受体，例如细胞因子受体的浓度，例如随时间的浓度，例如，相对于游离细胞因子分子与其细胞因子受体的缔合。在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标大量存在于免疫细胞的表面上(例如，超过免疫细胞表面上存在的细胞因子分子的受体的数目)。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分可以选自与免疫细胞表面靶标结合的抗体分子或配体分子，所述靶标例如选自CD4，CD8，CD11a，CD19，CD20或CD45。在一个实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体分子或配体分子。在其他实施方式中，免疫细胞靶向部分结合免疫检查点抑制剂，例如PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或CTLA-4。在免疫检查点抑制剂被靶向的实施方式中，免疫细胞靶向部分可以结合或可以结合并抑制免疫检查点抑制剂。在实施方式中，据信靶向部分特异性地将细胞因子分子递送至免疫细胞表面和/或增加至免疫细胞表面的浓度，从而导致细胞因子分子增加的定位、分布和/或增强细胞表面可及性中的一种或多种。在实施方式中，IFM基本上不干扰细胞因子分子的信号传导功能。这种靶向作用导致免疫细胞的增殖和活化的局部和长期刺激，从而诱导免疫应答的受控放大和活化。
[0117] 因此，本文尤其提供了包括上述部分的IFM，其药物组合物和制剂，例如包含IFM的纳米颗粒(例如，本文所述的蛋白质纳米凝胶)，编码所述IFM的核酸，产生前述分子的方法，以及使用前述IFM及其组合物治疗疾病例如癌症、传染性疾病或自身免疫性疾病的方法。
[0118] 因此，一方面，本公开内容提供了一种免疫刺激融合分子(IFM)，其包含免疫刺激部分(例如，细胞因子分子，共刺激分子的激动剂或负免疫调节剂的抑制剂)和免疫细胞靶向部分。
[0119] 在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，连接至，例如共价连接至免疫细胞靶向部分(例如，直接或间接地，例如，通过肽接头)。在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分结合至免疫细胞例如免疫效应细胞上的表面靶标，例如表面受体。在实施方式中，IFM将免疫刺激部分(例如细胞因子分子)和免疫细胞靶向部分与免疫细胞(例如效应免疫细胞)缔合，例如连接在一起。在一些实施方式中，IFM增加免疫细胞表面上IFM的细胞因子分子的浓度(例如，随着时间例如特定时间段，IFM的细胞因子分子的浓度)。在实施方式中，IFM的细胞因子分子在免疫细胞表面上的浓度增加导致以下一种或多种：(i)例如，相对于游离细胞因子分子，IFM的细胞因子分子在免疫细胞表面上的定位增加(例如水平)；(ii)例如，相对于游离细胞因子分子，IFM的细胞因子分子的细胞表面可及性(例如浓度(例如水平或量)和/或暴露持续时间)增加；(iii)例如，相对于游离细胞因子分子，在靶向的免疫细胞群，例如表达预选表面靶标，例如本文所述的表面靶标的细胞群中，细胞因子信号传导增加；(iv)例如，相对于游离细胞因子分子，延长靶细胞群中的细胞因子信号传导(例如，将细胞因子信号传导的持续时间延长至少8小时，例如24小时)；(v)引起免疫刺激；(vi)增加，例如靶向的免疫细胞群的免疫细胞的活化和/或增殖；或(vii)与游离细胞因子分子相比显示减少的副作用，例如较低的全身毒性。在一些实施方式中，IFM以比游离细胞因子分子更大的程度改变(例如增加)(i)-(vii)中的任一个，例如至少8小时，例如24小时。在一个实施方式中，细胞因子分子是如本文所述的IL-15分子，并且免疫细胞靶向部分是抗CD45抗体分子，例如，与本文所述的CD45结合的抗体或抗体片段。
[0120] 在相关方面，本公开内容提供了一种组合物，例如IFM，其包含偶联至例如融合至免疫细胞靶向部分的细胞因子分子，例如IL-15分子。在实施方式中，免疫细胞靶向部分与免疫细胞上的靶标或受体结合。在实施方式中，免疫细胞靶向部分包括或为结合细胞，例如免疫细胞(例如，免疫效应细胞，例如淋巴细胞)上的CD45受体的抗体分子，例如抗体或抗体片段，例如抗CD45抗体分子(例如IgG，Fab，scFv)。在实施方式中，组合物，例如IFM，将细胞因子分子和免疫细胞靶向部分缔合(例如，连接到一起)到免疫细胞，例如效应免疫细胞。在实施方式中，例如相对于游离的IL-15分子，抗CD45抗体与细胞的结合随时间增加了IL-15分子与细胞的缔合并改善了IL-15信号传导，免疫刺激中的一种或多种(在组合物中未发现IL-15分子)。在实施方式中，信号传导和/或免疫刺激发生在一段时间内，例如几分钟，几小时，几天，例如至少8小时，例如24小时。
[0121] 在另一方面，本公开提供了一种颗粒，例如纳米颗粒，其包含如本文所述的IFM，例如包括蛋白质(例如，本文所述的蛋白质纳米凝胶)的纳米颗粒。在一个实施方式中，颗粒包含相同的IFM。在其他实施方式中，颗粒包含一种或多种不同类型的IFM。
[0122] 还公开了包含本文公开的IFM和/或颗粒的组合物，例如药物组合物。在实施方式中，药物组合物还包含药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂。
[0123] 在另一方面，本公开内容提供了分离的核酸分子，其包含编码本文公开的IFM的核苷酸序列或包含与其基本相同(例如，与其至少95％相同)的核苷酸序列，以及载体，例如，表达载体，和包含本文公开的核酸分子的宿主细胞。
[0124] 还公开了制造例如生产本文公开的IFM的方法。在实施方式中，该方法包括在合适的生长条件下培养包含本文公开的核酸分子的宿主细胞。
[0125] 在另一方面，本公开提供了一种治疗对象例如人的疾病或病症的方法。该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向需要治疗的对象给予本文所述的组合物，例如IFM或颗粒。在一些实施方式中，所述疾病是癌症，例如实体瘤或血液癌症。在其他实施方式中，所述疾病是感染，例如病毒，细菌或酵母感染。在其他实施方式中，所述疾病是自身免疫疾病。本文公开的组合物可以单独使用，或与但不限于细胞疗法组合使用，以及与化学疗法或放射疗法组合使用。在一些实施方式中，细胞疗法选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法。
[0126] 在相关方面，本公开提供了用于药物的组合物，例如本文公开的IFM和/或颗粒，例如，用于治疗对象例如哺乳动物(例如，人)的疾病或病症。或者，公开了组合物例如IFM在制备用于治疗对象例如哺乳动物(例如人)的病症或病状的药物中的用途。在一些实施方式中，所述疾病是癌症，例如实体瘤或血液癌症。在其他实施方式中，所述疾病是感染，例如病毒(例如HIV)，细菌或酵母感染。在其他实施方式中，所述疾病是自身免疫疾病。本文公开的组合物可以单独使用，或与但不限于细胞疗法组合使用，以及与化学疗法或放射疗法组合使用。在一些实施方式中，细胞疗法选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法。
[0127] 在另一方面，本公开内容提供了一种在对象例如哺乳动物(例如人)中选择性地将细胞因子分子例如IL-15分子递送至免疫细胞的方法。该方法包括将如本文所述的IFM给予对象，其中将细胞因子分子选择性地递送至免疫细胞。
[0128] 在本文公开的治疗和递送方法的实施方式中，本文的对象需要基于细胞的疗法，例如免疫细胞疗法。例如，对象需要细胞疗法，其选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法。在一些实施方式中，对象是患者，例如人患者。在一些实施方式中，对象患有选自癌症，糖尿病，自身免疫性疾病，过敏或过敏性疾病，哮喘或心血管疾病的疾病。在一个实施方式中，对象需要移植。
[0129] 本文所述的IFM可以通过例如静脉内或皮下给药直接给予患有待治疗的疾病(例如癌症)的对象。在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分将细胞因子分子递送至免疫细胞的表面，从而增加免疫细胞表面上的细胞因子分子的浓度。在实施方式中，IFM导致以下一种或多种：定位细胞因子分子的分布和/或增强细胞因子分子的细胞表面可及性，从而激活和/或刺激免疫细胞。
[0130] 在其他实施方式中，本文所述的IFM可以与免疫细胞疗法组合给予，以在体内或体外激活和/或刺激免疫细胞疗法。例如，本文所述的IFM可以通过例如静脉内或皮下给药与基于细胞的疗法共同给予患有要治疗的疾病(例如，癌症)的对象。在其他实施方式中，在给药之前，用本文所述的IFM在体外对细胞疗法进行脉冲化。在一些实施方式中，细胞疗法选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法。
[0131] 本文公开的任何IFM，组合物，纳米颗粒，方法，用途，核酸，载体和宿主细胞的附加特征和实施方式包括以下一个或多个。
[0132] 在一些实施方式中，IFM是双功能或双特异性分子，例如，其具有至少两种不同种类的成员，例如，具有不同的功能和/或结合特异性。例如，IFM包括或由以下组成：免疫刺激部分，例如细胞因子分子，和免疫细胞靶向部分，其中免疫刺激部分和免疫细胞靶部分结合到相同或不同的细胞，例如，一种或多种免疫细胞中两个不同的细胞表面靶标或受体上。在实施方式中，免疫刺激部分和免疫细胞靶部分结合至相同免疫细胞例如相同免疫效应细胞上的两个不同靶标。双功能或双特异性分子可以进一步包含另外的部分，例如，另外的结合和/或功能部分。例如，IFM可以是多功能或多特异性分子，例如它是三功能或三特异性或四功能或四特异性融合分子。
[0133] 在某些实施方式中，IFM可以在N至C末端的方向上用下式表示：R1-(任选地L1)-R2或R2-(任选地L1)-R1；其中R1包含免疫细胞靶向部分，L1包含接头(例如本文所述的肽接头)，并且R2包含免疫刺激部分，例如细胞因子分子。
[0134] 在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，与免疫细胞靶向部分功能性连接，例如共价连接(例如，通过化学偶联，遗传或蛋白质融合，非共价缔合或其他方式)。例如，免疫刺激部分可以例如通过接头与免疫细胞靶向部分间接地共价偶联。在实施方式中，接头选自：可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施方式中，接头是肽接头。肽接头的长度可以是5-20、8-18、10-15或约
8、9、10、11、12、13、14、15-20、20-25或25-30个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头可以是30个氨基酸或更长；例如30-35、35-40、40-50、50-60个氨基酸长。在一些实施方式中，肽接头包含Gly和Ser，例如，包含氨基酸序列(Gly3-Ser)n或(Gly4-Ser)n的接头，其中n表示基序的重复数，例如，n＝1、2、3、4或5(例如(Gly3-Ser)2或(Gly4Ser)2或(Gly3-Ser)3或(Gly4Ser)3接头)。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：36、37、38或39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代)。在一个实施方式中，接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)。在另一个实施方式中，接头包含衍生自抗体铰链区的氨基酸。在某些实施方式中，接头包含衍生自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgGM或IgGA抗体的铰链区的氨基酸。在实施方式中，接头包含衍生自IgG铰链区，例如IgG1，IgG2或IgG4铰链区的氨基酸。例如，接头包含来自IgG铰链的变体氨基酸序列，例如具有一个或多个半胱氨酸例如被丝氨酸取代的变体。在一些实施方式中，接头包含DKTHTCPPSCAPE(SEQ ID NO：126)，其一个或两个半胱氨酸被另一种氨基酸例如丝氨酸取代。在一些实施方式中，接头包含氨基酸DKTHTSPPSPAP(SEQ ID NO：38)，EPKSSDKTHTSPPSPAPE(SEQ ID NO：127)或其衍生物。在实施方式中，接头包含衍生自IgG2铰链区的氨基酸，例如氨基酸SVESPPSP(SEQ ID NO：128)，ERKSSSVESPPSP(SEQ ID NO：129)或其衍生物。在实施方式中，接头包含衍生自IgG4铰链区的氨基酸，例如氨基酸PPSPSSP(SEQ ID NO：130)，ESKYGPPSPSSP(SEQ ID NO：131)或其衍生物。
8、9、10、11、12、13、14、15-20、20-25或25-30个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头可以是30个氨基酸或更长；例如30-35、35-40、40-50、50-60个氨基酸长。在一些实施方式中，肽接头包含Gly和Ser，例如，包含氨基酸序列(Gly3-Ser)n或(Gly4-Ser)n的接头，其中n表示基序的重复数，例如，n＝1、2、3、4或5(例如(Gly3-Ser)2或(Gly4Ser)2或(Gly3-Ser)3或(Gly4Ser)3接头)。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：36、37、38或39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代)。在一个实施方式中，接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)。在另一个实施方式中，接头包含衍生自抗体铰链区的氨基酸。在某些实施方式中，接头包含衍生自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgGM或IgGA抗体的铰链区的氨基酸。在实施方式中，接头包含衍生自IgG铰链区，例如IgG1，IgG2或IgG4铰链区的氨基酸。例如，接头包含来自IgG铰链的变体氨基酸序列，例如具有一个或多个半胱氨酸例如被丝氨酸取代的变体。在一些实施方式中，接头包含DKTHTCPPSCAPE(SEQ ID NO：126)，其一个或两个半胱氨酸被另一种氨基酸例如丝氨酸取代。在一些实施方式中，接头包含氨基酸DKTHTSPPSPAP(SEQ ID NO：38)，EPKSSDKTHTSPPSPAPE(SEQ ID NO：127)或其衍生物。在实施方式中，接头包含衍生自IgG2铰链区的氨基酸，例如氨基酸SVESPPSP(SEQ ID NO：128)，ERKSSSVESPPSP(SEQ ID NO：129)或其衍生物。在实施方式中，接头包含衍生自IgG4铰链区的氨基酸，例如氨基酸PPSPSSP(SEQ ID NO：130)，ESKYGPPSPSSP(SEQ ID NO：131)或其衍生物。
[0135] 在其他实施方式中，接头是非肽化学接头。例如，免疫刺激部分通过交联共价偶联至免疫细胞靶向部分。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。在其他实施方式中，将免疫刺激部分直接共价偶联至免疫细胞靶向部分，而无需接头。在其他实施方式中，IFM的免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分不是共价连接的，例如是非共价缔合的。
[0136] 在其他实施方式中，接头可以是蛋白质或其片段或衍生物，例如人白蛋白或Fc结构域，或其片段或衍生物。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分连接至N末端，并且免疫刺激部分连接至C末端。
[0137] 在其他实施方式中，接头将免疫细胞靶向部分与免疫刺激部分非共价缔合。例如，接头包含二聚化结构域，例如卷曲的螺旋或亮氨酸拉链。
[0138] 也可以使用基于其他非共价相互作用的融合，例如，利用IL-15/sushi相互作用的高亲和力来结合其他两种蛋白质。
[0139] 免疫细胞
[0140] 在实施方式中，免疫细胞是有核细胞，例如如下文所述的有核细胞。
[0141] 在一些实施方式中，免疫细胞是免疫效应细胞群，例如选自以下一种或多种的免疫效应细胞群：T细胞，例如CD4 T细胞，CD8 T细胞，αT细胞，βT细胞，γT细胞和δT细胞；B细胞；自然杀伤(NK)细胞；自然杀伤T(NKT)细胞；或树突状细胞。在实施方式中，免疫细胞，例如免疫效应细胞，显示结合免疫细胞靶向部分的细胞表面受体。
[0142] 在更具体的实施方式中，免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如，选自淋巴细胞，T细胞，B细胞或天然杀伤细胞的免疫细胞)，或造血干细胞。在实施方式中，免疫细胞包括淋巴细胞。在实施方式中，免疫细胞包括T细胞。在实施方式中，免疫细胞包括B细胞。在实施方式中，免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞。在实施方式中，免疫细胞包括造血干细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其包含，例如，表达嵌合抗原受体(CAR)，例如结合癌抗原的CAR。在其他实施方式中，免疫细胞表达外源高亲和力Fc受体。在一些实施方式中，免疫细胞包含，例如表达工程改造的T细胞受体。在一些实施方式中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞毒性T细胞(例如，CD8 T细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞是调节性T细胞(“Treg”)。
[0143] 在实施方式中，免疫细胞是从患者(例如患者的血液)获得的免疫细胞，例如NK细胞。在其他实施方式中，免疫细胞是从健康供体获得的免疫细胞，例如NK细胞。在一些实施方式中，在输注给患者之前，将NK细胞群纯化(例如，消耗)T细胞，例如同种异体T细胞。在实施方式中，免疫细胞是来自胚胎干细胞和/或iPSC细胞的免疫细胞，例如NK细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞系，例如稳定的或永生化的细胞系(例如，NK细胞永生化细胞系)。在一些实施方式中，免疫细胞获自患者，例如患有血液癌症，例如白血病或淋巴瘤的患者。在实施方式中，免疫细胞是NK细胞系，例如选自NK-92(例如，ATCC目录号CRL-2407)，NK-YS，KHYG-1，NKL，NKG，SNK-6，IMC-1的NK细胞系，例如，如Klingemann,H.等，(2016)Frontiers in Immunology卷7(文章91):1-7所述，在此通过引用纳入。在一个实施方式中，免疫细胞是NK92细胞系，例如表达高亲和力Fc受体的变体NK92细胞，例如表达FcγRIIIa的细胞(例如158V)。在其他实施方式中，NK92细胞系包含与癌症抗原结合的CAR，例如，也如Klingemann等，同上所述。
[0144] 细胞因子分子
[0145] 在一些实施方式中，IFM的细胞因子分子包括免疫调节细胞因子，例如促炎细胞因子或抗炎细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子是细胞因子的共同γ链(γc)家族的成员。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自以下的一种或多种的细胞因子：白细胞介素15(IL-15)，白细胞介素1，例如白细胞介素-1α(IL-1α)或白细胞介素-1β(IL-1β)，白介素2(IL-2)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)，白介素7(IL-7)，白介素9(IL-9)，白介素10(IL-10)，白介素12(IL-12)，白介素13(IL-13)，白介素18(IL-18)，白介素21(IL-
21)，白介素23(IL-23)，白介素27(IL-27)，白介素35(IL-35)，IFNγ，TNFα，IFNα，IFNβ，GM-CSF或GCSF，包括其变体形式(例如细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式)。在一些实施方式中，细胞因子分子是选自IL-1，IL-2，IL-6，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27细胞因子分子的促炎性细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子是选自IL-4，IL-10，IL-13，IL-35细胞因子分子的抗炎细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子选自IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-
15，IL-21或IL-27，包括其变体形式(例如，细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式，例如非中和性抗细胞因子抗体分子)。在一些实施方式中，细胞因子分子是例如本文所述的超激动剂(SA)。例如，与天然存在的细胞因子相比，超激动剂可以具有增加的细胞因子活性，例如至少10％，20％或30％。在一些实施方式中，细胞因子分子是单体或二聚体。在实施方式中，细胞因子分子还包含受体或其片段，例如细胞因子受体结构域。
21)，白介素23(IL-23)，白介素27(IL-27)，白介素35(IL-35)，IFNγ，TNFα，IFNα，IFNβ，GM-CSF或GCSF，包括其变体形式(例如细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式)。在一些实施方式中，细胞因子分子是选自IL-1，IL-2，IL-6，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27细胞因子分子的促炎性细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子是选自IL-4，IL-10，IL-13，IL-35细胞因子分子的抗炎细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子选自IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-
15，IL-21或IL-27，包括其变体形式(例如，细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式，例如非中和性抗细胞因子抗体分子)。在一些实施方式中，细胞因子分子是例如本文所述的超激动剂(SA)。例如，与天然存在的细胞因子相比，超激动剂可以具有增加的细胞因子活性，例如至少10％，20％或30％。在一些实施方式中，细胞因子分子是单体或二聚体。在实施方式中，细胞因子分子还包含受体或其片段，例如细胞因子受体结构域。
[0146] 在一个实施方式中，细胞因子分子包含野生型细胞因子，例如野生型，例如人氨基酸序列。在其他实施方式中，细胞因子分子包含与野生型细胞因子序列，例如人细胞因子序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞因子分子包含相对于野生型细胞因子序列(例如人细胞因子序列)至少95％至100％相同，或具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，细胞因子分子相对于野生型细胞因子序列，例如人细胞因子序列，包含不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)。
[0147] 示例性的细胞因子氨基酸序列在本文中公开，例如，IL-15的氨基酸以例如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：40提供；IL-7的氨基酸以例如SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43提供；IL-21的氨基酸以例如SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45提供；IL-12A的氨基酸以例如SEQ ID NO：
46和SEQ ID NO：47提供；IL-12B的氨基酸以例如SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49提供；IL-
12A和IL-12B的示例性融合体以例如SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51公开。本文公开的任何细胞因子序列和基本相同的序列(例如，至少90％，95％或更高的序列相同性)可以用于本文公开的IFM中。
46和SEQ ID NO：47提供；IL-12B的氨基酸以例如SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49提供；IL-
12A和IL-12B的示例性融合体以例如SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51公开。本文公开的任何细胞因子序列和基本相同的序列(例如，至少90％，95％或更高的序列相同性)可以用于本文公开的IFM中。
[0148] 在一个实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子。在一个实施方式中，IL-15分子(例如，IL-15多肽分子)包含野生型IL-15氨基酸序列，例如人IL-15氨基酸序列，例如，包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞因子分子是保留IL-15活性的IL-15分子，例如IL-15，例如人IL-15的全长，片段或变体。在其他实施方式中，IL-15分子是人IL-5的变体，例如，其具有对人IL-15氨基酸序列的一个或多个氨基酸改变，例如取代。在一些实施方式中，IL-15变体在位置45、51、52或72处包含突变或由其组成，例如，如US 2016/
0184399中所述。在一些实施方式中，IL-15变体包含N，S或L向D，E，A，Y或P之一的取代或由其组成。在一些实施方式中，所述突变选自L45D，L45E，S51D，L52D，N72D，N72E，N72A，N72S，N72Y或N72P(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)。
0184399中所述。在一些实施方式中，IL-15变体包含N，S或L向D，E，A，Y或P之一的取代或由其组成。在一些实施方式中，所述突变选自L45D，L45E，S51D，L52D，N72D，N72E，N72A，N72S，N72Y或N72P(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)。
[0149] 在实施方式中，IL-15分子包括IL-15变体，例如具有一个或多个氨基酸取代的人IL-15多肽。在一些实施方式中，IL-15分子在72位包含取代，例如N向D的取代。在一个实施N72D方式中，IL-15分子是SEQ ID NO：11的IL-15 多肽或与其具有至少80％，85％，90％，
95％，96％，97％，98％，99％的相同性的氨基酸序列，其具有IL-15Ra结合活性。
95％，96％，97％，98％，99％的相同性的氨基酸序列，其具有IL-15Ra结合活性。
[0150] 在其他实施方式中，IL-15分子包含IL-15(例如，IL-15野生型或变体序列)和IL-15受体例如IL-15受体α的IL-15结合片段或其IL-15结合片段的复合物。在一些实施方式中，IL-15分子包含IL-15和IL-15受体片段，例如IL-15受体的胞外结构域或其片段的复合物。在一些实施方式中，IL-15分子和IL-15受体的IL-15结合片段不是共价连接的，例如是非共价缔合的。
[0151] 在一个实施方式中，IL-15受体片段包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列，或其片段，或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列或其片段基本相同的氨基酸序列(例如，与其至少95％相同，或具有至少一个，两个，三个，四个，五个氨基酸改变，但不超过十，十五，二十个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)，并具有IL-15结合活性。
[0152] 在一些实施方式中，IL-15分子包含IL-15和IL-15受体片段例如sushi结构域(例如，如本文所述)的复合物。在一些实施方式中，sushi结构域来自人或非人动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类。在一个实施方式中，sushi结构域包含人序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少95％相同)。在实施方式中，IL-15受体α的胞外结构域包含与IL-15结合的结构域，本文称为“sushi结构域”。在实施方式中，sushi结构域以以下提供：本文称为“最小结构域”的62个氨基酸(例如，具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列)，或65个氨基酸的延伸结构域(例如，具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列)，或包含77个氨基酸的结构域，其包含例如SEQ ID NO：63的氨基酸31-107或由其组成。
[0153] 在一些实施方式中，IL-15受体片段具有野生型序列。在其他实施方式中，IL-15受体片段具有突变的序列，例如在77位的取代，例如L77I取代(编号指的是SEQ ID NO：4的野生型IL-15Ra)。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列(例如，与其至少95％相同，或具有至少一个，两个，三个，四个，五个氨基酸改变，但不超过该氨基酸的十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)，并具有IL-15结合活性。
[0154] 在一些实施方式中，IL-15受体α胞外结构域由SEQ ID NO：63的62-171个氨基酸或与其基本相同的氨基酸序列组成(例如，与之至少95％相同，与其96％，97％，98％或99％相同，或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个改变(例如，取代)，并具有IL-15结合活性)。在一些实施方式中，IL-15受体α胞外结构域由SEQ ID NO：63的65-171个氨基酸或与其基本相同的氨基酸序列组成(例如，与之至少95％相同，与其96％，97％，98％或99％相同，或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个改变(例如，取代)，并具有IL-15结合活性)。在一些实施方式中，IL-15受体α胞外结构域由SEQ ID NO：63的多至171个氨基酸或与其基本相同的氨基酸序列组成(例如，与之至少95％相同，与其96％，97％，98％或99％相同，或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个改变(例如，取代)，并具有IL-15结合活性)。在一些实施方式中，IL-15受体α胞外结构域由以下组成：SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-
171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80、65-70或65-77个氨基酸，或与其具有至少95％相同性，具有96％，97％，98％或99％相同性或相对于它们具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个改变(例如，取代)，并具有IL-15结合活性的序列。
在一些实施方式中，IL-15受体α胞外结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-
140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90、62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-
140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80、65-70或65-77个氨基酸组成。
171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80、65-70或65-77个氨基酸，或与其具有至少95％相同性，具有96％，97％，98％或99％相同性或相对于它们具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个改变(例如，取代)，并具有IL-15结合活性的序列。
在一些实施方式中，IL-15受体α胞外结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-
140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90、62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-
140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80、65-70或65-77个氨基酸组成。
[0155] 在一些实施方式中，含有IL-15分子的IFM可进一步包含多肽，例如细胞因子受体，例如细胞因子受体结构域，和第二异源结构域。在一个实施方式中，异源结构域是免疫球蛋白Fc区。在其他实施方式中，异源结构域是抗体分子，例如，Fab片段，FAB2片段，scFv片段或亲和体片段或衍生物，例如sdAb(纳米抗体)片段，重链抗体片段。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的N-末端，并且在其他实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的C-末端。
[0156] 在一些实施方式中，细胞因子分子包含细胞因子和抗细胞因子抗体分子的复合物。例如，细胞因子可以是IL-2，并且抗细胞因子抗体可以是非中和性抗IL-2抗体分子(参见例如Spangler,J.B.等，(2015)www.dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2015.04.015；Letourneau,S.等，(2010)PNAS Vol 107(5):2171-2176；Boyman,O.等，(2006)Science
311,1924)；和Spangler,J.B.(2015)Annu Rev Immunol 33:139-167，其内容通过引用全文纳入)。
311,1924)；和Spangler,J.B.(2015)Annu Rev Immunol 33:139-167，其内容通过引用全文纳入)。
[0157] 免疫细胞靶向部分
[0158] 在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分包括与免疫细胞表面靶标例如免疫细胞表面受体选择性结合的抗体分子或配体。在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标或受体可以具有以下性质中的一种，两种，三种或更多种：(i)大量存在于免疫细胞的表面上(例如，超过存在于免疫细胞表面上的细胞因子分子的受体的数目)；(ii)例如，相对于由IFM的细胞因子激活的受体，显示缓慢的下调，内在化和/或细胞表面更新；(iii)例如，相对于被IFM的细胞因子激活的受体而言，存在于免疫细胞表面上的时间较长；或(iv)一旦内在化，则基本上被循环回细胞表面，例如至少25％，50％，60％，70％，80％，90％或更多的免疫细胞表面靶标被循环回细胞表面。
[0159] 在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分与回收细胞表面受体结合。不受理论的系连，据信与回收细胞表面受体的结合介导了受体和IFM的内在化。例如，与受体一起内化的IFM可以被螯合到早期的内体中，并随后循环回到细胞表面，而不是推进到随后的降解(例如，通过网格蛋白介导的和网格蛋白非依赖性的内吞作用)。通过将IFM的细胞因子分子恢复到细胞表面，IFM/受体返回到细胞表面可以改善细胞因子信号传导，从而增加细胞因子分子结合其自身细胞表面受体的时间和可及性。另外，通过本公开的融合蛋白的结合在表面膜处引发的信号传导事件可以从内体区室继续。
[0160] 在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标或受体存在于免疫细胞的表面上，但是不存在于癌细胞或肿瘤细胞，例如实体瘤或血液癌细胞上。在一些实施方式中，与其在癌细胞或肿瘤细胞上的存在相比，免疫细胞表面靶标或受体主要存在于免疫细胞的表面，例如相对于癌细胞或肿瘤细胞，以至少5:1、10:1、15:1、20:1更高的比率存在。
[0161] 在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分与细胞(例如免疫细胞)上，例如细胞的表面膜上表达的受体结合，并且细胞还表达细胞因子受体(例如，IFM的细胞因子分子的受体)。
[0162] 在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分可以选自与免疫细胞表面靶标结合的抗体分子或配体分子，所述靶标例如选自CD16，CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD25，CD127，CD56，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD137，OX40，GITR，CD56，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8或CCR10。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分与CD4，CD8，CD11a，CD18，CD20，CD56或CD45结合。在其他实施方式中，免疫细胞表面靶标选自CD19，CD20或CD22。在一个实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体分子或配体分子(在本文中也可互换地称为“CD45受体”或“CD45R”)。在一些实施方式中，靶标是CD45(例如，选自CD45RA，CD45RB，CD45RC或CD45RO的CD45同种型)。在实施方式中，CD45主要在T细胞上表达。例如，CD45RA主要在原初T细胞上表达；CD45RO主要在活化的T细胞和记忆T细胞上表达。
[0163] 在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分(例如抗体分子)结合检查点抑制剂，例如PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或CTLA-4。在实施方式中，检查点抑制剂存在于免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞上。
[0164] 在其他实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分包含抗体分子(例如，抗原结合结构域)，受体分子(例如，受体，受体片段或其功能变体)或配体分子(例如，配体，其配体片段或功能变体)或它们的组合，它们与免疫细胞靶标或受体结合。
[0165] 在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分的抗体分子包含完整抗体(例如，包含至少一条，优选两条完整的重链，以及至少一条，优选两条完整的轻链的抗体)或抗原结合片段(例如Fab，F(ab')2，Fv，单链Fv，单域抗体，双抗体(dAb)，二价抗体或双特异性抗体或其片段，其单结构域变体或骆驼科动物抗体))，其与免疫细胞靶标或受体结合。
[0166] 抗体分子的重链恒定区可以选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其片段，更通常为IgG1，IgG2或IgG4。在一些实施方式中，重链的Fc区可包括一种或多种改变，例如取代，以增加或减少以下一种或多种：Fc受体结合，新生儿-Fc受体结合，抗体糖基化，半胱氨酸残基的数目，效应细胞功能，补体功能或稳定抗体形成(例如，稳定IgG4)。例如，IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区可在228位包含取代(例如Ser向Pro取代)(参见，例如Angal,S,King,DJ等，(1993)Mol Immunol 30:105-108(最初使用不同的编号系统描述为S241P)；Owens,R,Ball,E等，(1997)Immunotechnology 3:107-116)。
[0167] 抗体分子的轻链恒定区可以选自κ或λ的轻链恒定区或其片段。
[0168] IFM免疫细胞靶向部分的抗体分子可以小于约100nM，50nM，25nM，10nM(例如，小于1nM(例如，约10–100pM))的解离常数与靶抗原结合。在实施方式中，抗体分子结合抗原上的构象或线性表位。在某些实施方式中，由免疫细胞靶向部分的抗体分子结合的抗原在免疫细胞的表面上稳定表达。在实施方式中，抗原是细胞表面受体，其相对于细胞表面上IFM的细胞因子分子的受体在细胞表面上更为丰富。
[0169] 在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自抗体分子(例如，完整抗体(例如，包括至少一个且优选地两个完整的重链，以及至少一个且优选地两个完整的轻链的抗体)或抗原结合片段(例如Fab，F(ab')2，Fv，单链Fv，单域抗体，双抗体(dAb)，二价抗体或双特异性或多特异性抗体或其片段，其单结构域变体或骆驼科动物抗体))，或非抗体支架，或与免疫细胞表面靶标或配体结合的配体。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分是与CD45，CD2，CD4，CD8，CD11(例如，CD11a(整联蛋白α-L)，CD11b或CD11c)，CD18(整联蛋白β-2)，CD19，CD20或CD25或其组合结合的抗体，例如与两个或多个上述靶标结合的双特异性抗体。
[0170] 在一些实施方式中，抗体分子(例如，单或双特异性抗体)结合CD45，CD8，CD18或CD11a中的一个或多个，例如，它是IgG，例如人IgG4，或抗原结合结构域，例如，与CD45，CD8，CD18或CD11a结合的Fab，F(ab')2，Fv，单链Fv。在一些实施方式中，抗体分子是人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。在实施方式中，抗体分子是重组抗体。
[0171] 在一些实施方式中，抗CD45抗体是人抗CD45抗体，人源化抗CD45抗体或嵌合抗CD45抗体。在一些实施方式中，抗CD45抗体是抗CD45单克隆抗体。示例性的抗CD45抗体包括抗体BC8、4B2，GAP8.3或9.4。还公开了针对其他免疫细胞表面靶的抗体，例如抗CD8抗体，例如OKT8单克隆抗体，抗CD18抗体，例如1B4单克隆抗体，以及抗CD11a抗体，例如MHM24抗体。
[0172] 本公开内容还包括具有本文公开的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列的抗体分子，编码其的核酸分子，包含该核酸分子的宿主细胞和载体。
[0173] 在一个实施方式中，与CD45结合的抗体分子对一种CD45同种型是特异性的或与超过一种CD45同种型结合的抗体分子是，例如，泛CD45抗体。在一些实施方式中，抗CD45抗体分子结合CD45RA和CD45RO。在一个实施方式中，抗CD45抗体分子是BC8抗体。在一些实施方式中，BC8抗体结合CD45RA和CD45RO。在其他实施方式中，抗CD45抗体分子是CD45RO特异性的或是泛CD45抗体分子，例如，其与活化的和记忆T细胞结合。抗CD45抗体分子的其他实例包括但不限于GAP8.3、4B2和9.4。
[0174] 在一个实施方式中，抗CD45抗体分子是BC8抗体，例如嵌合或人源化的BC8抗体。在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包括：
[0175] (i)对应于SEQ ID NO：1、2、3、4、7、21或22所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1、2、3、4、7、21或22的抗体部分至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0176] (ii)分别为SEQ ID NO：5、6或8所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括具有S228P取代的人IgG1重链序列或人IgG4序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，分别与SEQ ID NO：5、6或8至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：1-4、7、21或22或5-6或8的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0177] 在其他实施方式中，SEQ ID NO：1-4的氨基酸或与其基本相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：1-4有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)(任选地，进一步包括κ轻链序列)，包括，任选地经由接头，IL-15细胞因子或受体，例如本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9或与其基本上相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：9有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在一个实施方式中，IL-15细胞因子或受体偶联至SEQ ID NO：1-4的BC8抗体的轻链的N末端。在其他实施方式中，IL-15细胞因子或受体偶联至SEQ ID NO：1-4的BC8抗体的轻链的C末端。在一个实施方式中，接头包含SEQ ID NO：37或38或由其组成。
[0178] 在其他实施方式中，SEQ ID NO：21或22的氨基酸或与其基本相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：21或22有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)(任选地，进一步包括κ轻链序列)，包括，任选地经由接头，IL-15细胞因子或受体，例如本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9或与其基本上相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：9有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在一个实施方式中，IL-15细胞因子或受体通过SEQ ID NO：37或38的接头偶联至SEQ ID NO：21或22的BC8抗体的轻链的N末端。在一个实施方式中，IL-15细胞因子或受体通过SEQ ID NO：37或38的接头偶联至SEQ ID NO：21或22的BC8抗体的轻链的C末端。
[0179] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：6或8的氨基酸，或与其基本相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：6或8有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，包括重链恒定区。在其他实施方式中，SEQ ID NO：6或8的氨基酸或与其基本相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：6或8有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括，IL-15细胞因子或受体，例如本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9或与其基本上相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：9有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在一个实施方式中，IL-15细胞因子或受体偶联SEQ ID NO：6或8的BC8抗体的轻链的N末端。在其他实施方式中，IL-15细胞因子或受体偶联至SEQ ID NO：6或8的BC8抗体的轻链的C末端。
[0180] 在其他实施方式中，人源化BC8抗体包括：
[0181] (i)对应于SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：19的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0182] (ii)SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：18有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：18或19的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0183] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：19的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：19有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：19的N-或C-末端偶联。
[0184] 替代地或组合地，SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：18有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：18的N-或C-末端偶联。
[0185] 在其他实施方式中，结合CD45的抗体分子是9.4抗体，例如嵌合或人源化9.4抗体。在一些实施方式中，嵌合9.4抗体包括：
[0186] (i)对应于SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：15的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0187] (ii)SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：14有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，9.4抗体包含9.4抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：14或15的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0188] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：15的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：15有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：15的N-或C-末端偶联。
[0189] 替代地或组合地，SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：14有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列头，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：14的N-或C-末端偶联。
[0190] 在其他实施方式中，结合CD45的抗体分子是4B2抗体，例如嵌合或人源化4B2抗体。在一些实施方式中，嵌合4B2抗体包括：
[0191] (i)对应于SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：17的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0192] (ii)SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：16有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，4B2抗体包含4B2抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：16或17的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0193] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：17有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：17的N-或C-末端偶联。
[0194] 替代地或组合地，SEQ ID NO：16的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：16有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：16的N-或C-末端偶联。
[0195] 在另一个实施方式中，结合CD8的抗体分子是OKT8抗体，例如嵌合或人源化OKT8抗体。在一些实施方式中，嵌合OKT8抗体包括：
[0196] (i)对应于SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：31的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0197] (ii)SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：30有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，OKT8抗体包含OKT8抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：30或31的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0198] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：31的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：31有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：31的N-或C-末端偶联。
[0199] 替代地或组合地，SEQ ID NO：30的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：30有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：30的N-或C-末端偶联。
[0200] 在另一个实施方式中，结合CD18的抗体分子是1B4抗体，例如嵌合或人源化1B4抗体。在一些实施方式中，嵌合1B4抗体包括：
[0201] (i)对应于SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：31的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0202] (ii)SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：28有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，1B4抗体包含1B4抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：28或29的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0203] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：29的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：29有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：29的N-或C-末端偶联。
[0204] 替代地或组合地，SEQ ID NO：28的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：28有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：28的N-或C-末端偶联。
[0205] 在另一个实施方式中，结合CD11a的抗体分子是MHM24抗体，例如嵌合或人源化MHM24抗体。在一些实施方式中，嵌合MHM24抗体包括：
[0206] (i)对应于SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
[0207] (ii)SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：26有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，MHM24抗体包含MHM24抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：26或27的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0208] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：27的N-或C-末端偶联。
[0209] 替代地或组合地，SEQ ID NO：26的氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：26有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)包括IL-15细胞因子分子，例如IL-15细胞因子，其任选地通过接头(例如，接头，其包含SEQ ID NO：36-39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：36-39有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列))与SEQ ID NO：26的N-或C-末端偶联。
[0210] 示例性IFM格式
[0211] IFM的示例性格式包括与结合至免疫细胞表面靶标的抗体分子(例如，免疫球蛋白部分(Ig)，例如抗体(例如，完整抗体，IgG)或抗体片段(Fab，scFv，半抗体或单域抗体等))偶联的细胞因子分子(例如，一个或多个细胞因子分子)。在实施方式中，IFM包括与抗体分子的氨基末端(N末端)或羧基末端(C-末端)，通常是C末端融合。细胞因子分子可以任选地通过接头与抗体分子偶联。在一些实施方式中，细胞因子或细胞因子受体，例如受体片段(例如，sushi结构域)与抗体分子的N末端或C末端偶联。在实施方式中，细胞因子或细胞因子受体，例如受体片段(例如sushi结构域)与抗体分子(例如完整抗体或其片段，例如Fab，scFv或半抗体)的轻链的N末端或C末端偶联。或者或组合地，将细胞因子或细胞因子受体，例如受体片段(例如，sushi结构域)偶联至抗体分子(例如，完整抗体或其片段，例如，Fab，scFv，半抗体或单域抗体(VH))的重链的N末端或C末端。格式的示例在例如图1、2A，3A-3D，6A，11A和12A中提供。
[0212] 在一些实施方式中，IFM包括抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如，BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a的轻链，其偶联至，例如，共价连接至细胞因子分子，例如IL-15，IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-21，IL-27或细胞因子受体，例如IL-15RαSushi结构域，在轻链或重链的N末端区或C末端区(例如，图1、2A，3A-3D，6A，11A和12A中所示)。轻链或重链-细胞因子分子取向的任意组合可以存在于IFM中。
[0213] 例如，IFM可以包括完整抗体或两个相同的半抗体的四聚体(例如，第一和第二抗体)，每个均具有抗免疫细胞靶向抗体分子(例如抗-CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a)的轻链和重链，其在轻链的N末端区域与例如IL-15或IL-15sushi结构域等的细胞因子分子偶联，例如，共价连接(例如，图3A和3C所示)。
[0214] 在其他实施方式中，IFM可以包括完整抗体或两个相同的半抗体的四聚体(例如，第一和第二抗体)，每个均具有抗免疫细胞靶向抗体分子(例如抗-CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a)的轻链和重链，其在轻链的C末端区域与例如IL-15或IL-15sushi结构域等的细胞因子分子偶联，例如，共价连接(例如，图2A，3A，3C和6A所示)。
[0215] 或者，或与前述格式组合，IFM可以包括完整抗体或两个相同的半抗体的四聚体(例如，第一和第二抗体)，每个均具有抗免疫细胞靶向抗体分子(例如抗-CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a)的轻链和重链，其在重链的C末端区域与例如IL-15或IL-15sushi结构域等的细胞因子分子偶联，例如，共价连接(例如，图6A所示)。
[0216] 或者，或与前述格式组合，IFM可以包括完整抗体或两个相同的半抗体的四聚体(例如，第一和第二抗体)，每个均具有抗免疫细胞靶向抗体分子(例如抗-CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a)的轻链和重链，其在重链的N末端区域与例如IL-15或IL-15sushi结构域等的细胞因子分子偶联，例如，共价连接。
[0217] 或者，或与前述格式组合，IFM可包括具有抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a的轻链可变结构域和重链可变结构域的抗体片段(例如，scFv，Fab)，其在重链可变结构域的N-或C-末端区域与细胞因子分子(例如IL-15或IL-15sushi结构域)偶联(例如，共价连接)(例如，图2A，3B，3D，11A和12A所示)。
[0218] 或者，或与前述格式组合，IFM可包括具有抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a的轻链可变结构域和重链可变结构域的抗体片段(例如，scFv，Fab)，其在轻链可变结构域的N-或C-末端区域与细胞因子分子(例如IL-15或IL-15sushi结构域)偶联(例如，共价连接)。
[0219] 或者，IFM包括两个不同的半抗体的四聚体，例如第一和第二抗体，其中第一抗体具有抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a的轻链和重链(或其片段，例如scFv或Fab)，其在轻链的N末端区域与细胞因子分子(例如IL-15或IL-15sushi结构域偶联(例如，共价连接)；并且第二抗体具有抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如BC8抗体)，抗CD8，抗CD18或抗CD11a的轻链和重链(或其片段，例如scFv或Fab)，其在轻链或重链的C末端区域与细胞因子分子(例如IL-15或IL-15sushi结构域)偶联(例如，共价连接)。可以使用针对相同或不同靶标的任何抗体对，例如CD45:CD8，CD45:CD18，CD45:CD11a，CD8:CD18，CD8:CD11a或CD18:CD11a。
[0220] 在其他实施方式中，IFM包括在重链的N末端区域或C末端区域(例如，如图6A所示)偶联至，例如共价连接至细胞因子分子，例如IL-15或IL-15sushi结构域的抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如BC8抗体)或抗CD8的重链，和相应的轻链。在实施方式中，细胞因子分子与重链的C末端共价连接。
[0221] 在其他实施方式中，IFM包括抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如，BC8抗体)或抗CD8的重链，其与非细胞因子免疫刺激分子，例如免疫刺激分子的激动剂偶联，例如共价连接。在一些实施方式中，免疫刺激分子是CD137，OX40，GITR，CD3或CD28的激动剂。在一些实施方式中，免疫刺激分子的激动剂是抗体分子或配体。例如，免疫刺激分子的激动剂是针对CD137，OX40，GITR，CD3或CD28的激动剂抗体分子。在一些实施方式中，免疫刺激分子在重链和相应的轻链的N-末端区域或C-末端区域连接。在实施方式中，免疫刺激分子与重链的C末端共价连接。
[0222] 在其他实施方式中，IFM包括与例如，负免疫调节剂的抑制剂，如检查点抑制剂的抑制剂偶联，例如共价连接的抗免疫细胞靶向抗体分子，例如抗CD45(例如BC8抗体)或抗CD8的重链。在一些实施方式中，负免疫调节剂的抑制剂是选自PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或CTLA-4的检查点抑制剂的抑制剂。在一些实施方式中，免疫刺激分子的激动剂是抗体分子或配体。例如，检查点抑制剂的抑制剂，例如抗体分子，结合和/或抑制PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或CTLA-4。
[0223] 在实施方式中，本文所述的IFM(LC-chBC8-sushi，sushi-LC-chBC8，LC-chBC8-L1-IL15，IL15-LC-chBC8和HC-chBC8-Fab，HC-chBC8-IgG4S228P)可包含：
[0224] (i)选自SEQ ID NO：1、2、3或4的轻链的氨基酸序列，或其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：1、2、3或4具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：1、2、3或4包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入(例如保守取代)；和
[0225] (ii)选自SEQ ID NO：5或6的重链的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：5或6有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：5或6具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：5或6包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0226] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chBC8-IgG4S228P-IL15和LC-chBC8)可包含：
[0227] (i)SEQ ID NO：7所示的轻链可变氨基酸序列(任选地，还包括来自人κ的恒定结构域序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：7有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：7具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0228] (ii)SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：8有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高相同性的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：8具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：7或8包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0229] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如，HC-ch9.4-Fab和LC-ch9.4-IL15)可包含：
[0230] (i)SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：15的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：15具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0231] (ii)SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：14有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：15具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：14或15包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0232] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如，HC-ch4B2-Fab和LC-ch4B2-IL15)可包含：
[0233] (i)SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：16的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：16具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0234] (ii)SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：17有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：17具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：16或17包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0235] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-hBC8(23)-Fab和LC-hBC8(23)-IL15)可包含：
[0236] (i)SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：18的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：18具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0237] (ii)SEQ ID NO：19所述的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：19有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：19具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：18或19包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0238] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chBC8-Fab和LC-chBC8-L2-IL15)可包含：
[0239] (i)SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：5的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：5具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0240] (ii)SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：21有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：21具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：21或5包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0241] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chBC8-Fab和LC-chBC8-L3-IL15)可包含：
[0242] (i)SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：5的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：5具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0243] (ii)SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：22有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：22具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：22或5包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0244] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chMHM24-Fab和LC-chMHM24-IL15)可包含：
[0245] (i)SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：26的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：26具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0246] (ii)SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：27具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：26或27包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0247] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chMHM24-Fab和LC-chMHM24-scIL12p70)可包含：
[0248] (i)SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：26的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：26具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0249] (ii)SEQ ID NO：50或51分别所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，分别与SEQ ID NO：50或51有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：50或51具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：50或51或26包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0250] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chMHM24-Fab和LC-chMHM24-IL7)可包含：
[0251] (i)SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：26的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：26具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)；和
[0252] (ii)SEQ ID NO：42或43分别所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，分别与SEQ ID NO：42或43有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：42或43具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：42或43或26包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0253] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chMHM24-Fab和LC-MHM24-IL15)可包含：
[0254] (i)SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：26的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：26具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0255] (ii)SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：27具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：27或26包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0256] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-ch1B4-Fab和LC-ch1B4-IL15)可包含：
[0257] (i)SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：28的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：28具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0258] (ii)SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：29有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：29具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：28或29包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0259] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如HC-chOKT8-Fab和LC-chOKT8-IL15)可包含：
[0260] (i)SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：30的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：30具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列；和
[0261] (ii)SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：31有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：31具有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：30或31包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0262] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如，BC8scFv-IL15)可包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：32的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)，或相对于SEQ ID NO：32具有至少1、2、3、4、
5、6、7、8、9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，删除或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。
5、6、7、8、9或10或更多个氨基酸改变(例如，取代，删除或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。
[0263] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如四价CD137激动剂)可包含共价融合至抗CD137激动剂单链可变片段抗体的C末端的抗CD45人源化IgG4(例如人源化BC8)。在一些实施方式中，IFM在IgG4的C末端上进一步包括另外的抗CD137 scFv，例如，从而产生对于CD45为二价并且对于CD137为四价的分子。在其他实施方式中，IFM还可包含如上规定的抗CD45 IgG4和仅与IgG的C末端融合的scFv抗CD137激动剂，从而产生对于CD45为二价且对于CD137为二价的分子。
[0264] 在其他实施方式中，本文所述的IFM(例如，二价CD137激动剂)可包含通过Fab的重链和轻链的C末端共价融合至抗CD137激动剂单链可变片段抗体的N末端的抗CD45人源化IgG1 Fab(例如人源化BC8)，由此产生对于CD45为单价而对于CD137为二价的分子。
[0265] 在另一方面，本公开提供了聚合物支架，例如聚合物水凝胶，例如聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)，其包含本文所述的IFM，例如包含IFM的水凝胶。聚合物也可以是多肽，壳聚糖，PVA(聚乙烯醇)，PLA(聚乳酸)，PEG(聚乙二醇)或嵌段共聚物。在一些实施方式中，聚合物支架包含多种不同的多肽或聚合物。在一个实施方式中，聚合物支架包含一种IFM。在其他实施方式中，聚合物支架包含一种或多种不同的IFM。在一些实施方式中，聚合物支架是可生物降解的。在实施方式中，聚合物支架可通过被动扩散和/或通过聚合物支架的降解而随时间释放IFM。
[0266] 在一些实施方式中，聚合物支架至少部分地通过化学交联形成，例如但不限于，使用本文公开的接头。该聚合物可包含在聚合物链之间使用共价交联剂或非共价相互作用(例如，H键，静电相互作用或范德华相互作用)的交联聚合物网络。在一些实施方式中，交联剂是可逆的，例如但不限于，通过改变氧化还原状态或改变环境的pH，例如，通过包含二硫键或酸不稳定的酯基。其他酸不稳定的接头可以是，例如，顺式-乌头酸接头，乙缩醛，缩酮，活化的酰胺，例如2,3-二甲基马来酰胺酸的酰胺，乙烯基醚，其他活化的醚和酯，例如烯醇或甲硅烷基醚或酯，亚胺，亚胺离子，烯胺，氨基甲酸酯，腙类和本领域已知的其他键。
[0267] 在实施方式中，将包含一种或多种IFM的聚合物支架给予需要其的对象。在实施方式中，包含一种或多种IFM的聚合物支架是局部(例如肿瘤内)给予的。在实施方式中，聚合物支架是在注射或植入体内时例如以1000cP或更高的粘度增加而固化的液体。
[0268] 在另一方面，本公开提供了一种颗粒，例如纳米颗粒，其包含如本文所述的IFM，例如包括蛋白质(例如，本文所述的蛋白质纳米凝胶)的纳米颗粒。在一个实施方式中，颗粒包含相同的IFM。在其他实施方式中，颗粒包含一种或多种不同类型的IFM。
[0269] 在实施方式中，本文的组合物包含颗粒，例如，纳米颗粒或微粒，或纳米颗粒和微粒两者。在实施方式中，颗粒(例如，纳米颗粒)具有在30nm和1200nm之间，40nm和1100nm之间，50nm和1000nm之间，例如50和500nm之间，更典型地，70和400nm之间的平均流体动力学直径(例如，通过动态光散射测量)。
[0270] 在一些实施方式中，纳米颗粒包含脂质体，蛋白质纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒或固体纳米颗粒。在实施方式中，颗粒任选地在颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在其他实施方式中，纳米颗粒包含通过对氧化还原(二硫化物)或pH(可水解基团)或酶(蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。
[0271] 在一些实施方式中，如本文提供的，本文公开的一种或多种IFM可彼此交联。在其他实施方式中，一种或多种IFM可以形成或自组装成各种纳米结构，包括但不限于蛋白亲水聚合物偶联物(例如，用PEG可逆修饰)，蛋白疏水聚合物偶联物(例如，可逆修饰的PLA或PLGA)，块状交联的蛋白质水凝胶，交联的蛋白质纳米凝胶颗粒，具有不同壳材料的蛋白质纳米胶囊(例如脂质，聚合物或二氧化硅)，偶联蛋白质的纳米颗粒(例如胶束，聚合物纳米颗粒，无机纳米颗粒)和脂质体。同样，在一些实施方式中，如本文所提供的，彼此交联的蛋白质可以形成或可以自组装成蛋白质纳米结构。
[0272] 在实施方式中，任选地，IFM例如任选地经由可降解的接头(例如，二硫键)与纳米颗粒的蛋白质亲水聚合物共价偶联，例如交联，并保持生物学活性，例如，维持其功能。因此，本文公开的方法和组合物可为细胞疗法(例如免疫疗法)提供显著益处。
[0273] 在实施方式中，包含IFM的颗粒还包含有核细胞，例如免疫细胞(本文也称为“有核细胞-纳米颗粒复合物”)。
[0274] 因此，本公开内容提供了包含IFM和颗粒，例如纳米颗粒的组合物。在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含有核细胞和至少一种本文所述的IFM和/或颗粒。
[0276] 在实施方式中，纳米颗粒共价偶联至，例如，有核细胞(例如免疫细胞)的表面。在实施方式中，纳米颗粒不共价偶联至有核细胞。
[0277] 在实施方式中，颗粒还可包含选自一种或多种(例如，2，3，4，5种或更多种)治疗性蛋白质的一种或多种其他治疗性蛋白质，例如细胞因子分子(例如，IL-2，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-23，IL-4，IL-1α，IL-1β，IL-5，IFNγ，TNFα(TNFa)，IFNα，IFNβ，GM-CSF，或GCSF，包括其变体形式，例如突变体；包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物；其融合或激动剂形式)；生长因子；和其他分子，例如，抗共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中共刺激分子选自CD137、OX40、CD28、GITR、VISTA、抗-CD40或CD3的激动剂。
[0278] 在其他方面，本公开提供了一种制备上述颗粒的方法。
[0280] 除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语的含意与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
附图说明
[0281] 图1描绘了用于细胞表面靶向和刺激的结合细胞因子和免疫球蛋白部分的本公开的示例性融合蛋白。
[0282] 图2A-2C描绘了包含各种抗体形式的IFM。图2A描绘了包含各种抗体形式的IL-15IFM的示意图。图2B和2C描绘了在使用CellTiter Blue(图2B)或流式细胞术计数珠(图
2C)的脉冲测定中对IFM对CD8 T细胞扩增的评价。
2C)的脉冲测定中对IFM对CD8 T细胞扩增的评价。
[0283] 图3A-3D描绘了IL-15/sushi复合物与抗CD45抗体之间的各种融合策略的示意图。图3A和3B描绘了IL-15与chBC8 IgG(图3A)或chBC8 Fab(图3B)轻链的N-或C-末端融合的示意图。抗体融合体通过与IL-15的高亲和力相互作用而包含与IL-15Rα-sushi的复合物。图
3C和3D描绘了IL-15Rα-sushi与chBC8 IgG(图3C)或chBC8Fab(图3D)轻链的N-或C-末端融合的示意图。抗体融合体通过与IL-15Rα-sushi的高亲和力相互作用而包含与IL-15N72D的复合物。
3C和3D描绘了IL-15Rα-sushi与chBC8 IgG(图3C)或chBC8Fab(图3D)轻链的N-或C-末端融合的示意图。抗体融合体通过与IL-15Rα-sushi的高亲和力相互作用而包含与IL-15N72D的复合物。
[0284] 图4A-4B描绘了包括多种融合策略的IFM对CD8 T细胞扩增的影响。(图4A和4B)在脉冲生物测定中评估了包含IL-15N72D和chBC8 Fab(图4A)或chBC8 IgG(图4B)的IFM的T细胞扩增。使用CellTiter Blue分析CD8 T细胞的增殖；包括IL15N72D/sushiL77I-Fc和未刺激的T细胞(阴性对照)进行比较。
[0285] 图5A-5D描绘了包含野生型或突变的IL-15的IFM以及IL-15/sushi复合物与抗CD45抗体的各种融合策略的生物学活性。图5A和5B描绘了包含野生型IL-15或IL-15N72D和chBC8 Fab(图5A)或chBC8 IgG(图5B)的IFM，其在与IFM的脉冲孵育后三天使用CellTiter Blue在脉冲测定中评估了CD8 T细胞的扩增。图5C和5D描绘了在与IFM孵育三天之后使用CellTiter Blue以恒定暴露(例如静态)测定形式对包含chBC8 Fab(图5C)或chBC8 IgG(图
5D)的IFM对CD8 T细胞扩增的评估。
5D)的IFM对CD8 T细胞扩增的评估。
[0286] 图6A-6B描绘了包含与chBC8 IgG轻链或重链的C末端融合的IFM。图6A描绘了IFM的示意图，该IFM包含与chBC8 IgG轻链或重链的C末端融合的IL-15以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价复合物。图6B描绘了IFM对脉冲生物测定法中CD8 T细胞扩增的影响。
[0287] 图7A-7C描绘了IFM需要抗体片段的功能性结合以提高活性。图7A和7B描绘了在存在或不存在可溶性BC8 IgG竞争物的情况下，包含chBC8Fab(图7A)或chBC8 IgG(图7B)的IL-15IFM，使用CellTiter Blue在脉冲测定中评估了CD8 T细胞的扩增。图7C描述了对IL-15IFM的评估，该IL-15IFM包含人源化的BC8 Fab片段或包含在脉冲生物测定中为CD8 T细胞扩增而消除与CD45结合的突变CDR-H3的人源化的BC8 Fab片段。
[0288] 图8A-8C描绘了细胞表面加载和IFM的持久性。图8A描绘了流式细胞术直方图，其显示了IFM脉冲后的MFI，如通过用荧光标记的抗IL15或抗IgG抗体染色所检测的。图8B描绘了IL-15的细胞表面染色随时间的持久性。图8C描绘了使用流式细胞术计数珠测量的随时间的细胞密度。
[0289] 图9A-9B描绘了对在IL-15和chBC8之间包含变化的接头组成的IFM的评估。图9A描述了用于IL-15与chBC8 Fab轻链的C末端融合的三种不同接头的氨基酸序列。图9B描绘了在使用CellTiter Blue的脉冲生物测定法中对包含不同接头组成的IFM对CD8 T细胞扩增的评估。
[0290] 图10A-10B描述了对包含替代性CD45抗体克隆的IFM的评估。图10A描绘了各种CD45抗体克隆与在T细胞上表达的CD45的结合亲和力。图10B描述了在使用CellTiter Blue的脉冲生物测定法中对包含不同抗CD45抗体克隆的IL-15IFM的评估。
[0291] 图11A-11B描绘了包含靶向CD8，CD11a或CD18的抗体的IFM。图11A描绘了IL-15IFM的示意图，该IL-15IFM包含IL-15与靶向替代性细胞表面受体的Fab抗体片段的轻链C末端的融合；IFM在IL-15和IL-15Rα-sushi之间包含非共价结合。图11B描绘了在使用CellTiter Blue的脉冲生物测定法中对IL-15IFM对CD8 T细胞扩增的评估。
[0292] 图12A-12B描述了在CD4或CD8 T细胞上包含抗CD8的IFM效能的评估。图12A描述了IL-15IFM的示意图，该IL-15IFM包括IL-15与抗CD8 Fab轻链的C-末端的融合，以及与IL-15Rα-sushi的非共价结合。图12B描述了在使用CellTiter Blue的脉冲生物测定中评估抗CD8 IFM对纯化的CD4或CD8 T细胞的效力。使用磁珠分选从总T细胞(自然包含CD4和CD8 T细胞的混合物)中纯化CD4或CD8 T细胞。
[0293] 图13A-13C描绘了显示包含IL-15IFM的纳米颗粒支持T细胞扩增的图。图13A和13B描绘了通过尺寸排阻色谱法分析的IFM交联成蛋白质纳米凝胶(图13A)；显示了包含IL15N72D/sushiL77I-Fc的蛋白纳米凝胶用于比较(图13B)。在脉冲生物测定中评估了包含IL-15IFM或IL15N72D/sushiL77I-Fc的背包的CD8 T细胞扩增(图13C)。使用流式细胞仪计数珠分析细胞密度；数据以倍数扩增表示。
[0294] 图14A至图14B显示了引发可以改善ACT功效。
[0295] 图15显示了示例性的免疫靶向的表面受体和细胞因子，说明了平台的多功能性。
[0296] 图16A-16E显示了在实体瘤模型中IL-15系连融合体改善了肿瘤特异性T细胞疗法。
[0297] 图17A-图17G显示了通过用CD8靶向的IFM脉冲孵育，系连融合平台能够在活化的总CD3人T细胞的培养物中进行选择性的细胞靶向和改善的CD8 T细胞的扩增。
[0298] 图18A-18E显示了IL-15的各种突变形式的细胞活性和包含IL-15突变体的IFM的表面持久性。
[0299] 图19A-19C显示了通过包含野生型或突变的IL-15的CD8靶向IFM的选择性细胞靶向和CD8 T细胞扩增。
[0300] 图20显示了包含野生型或突变的IL-15的CD45靶向IFM的表面持久性。
[0301] 图21显示IL-15系连融合体支持IL-15受体下游的持续信号传导。
[0302] 图22A-22D显示了包含抗CD45抗体和IL-12(也称为“抗CD45-IL12-TF”或“ɑCD45-IL12-TF”或“IL12-TF”)的4种示例性构建体。
[0303] 图23显示抗CD45-IL12-TF支持IL-12的强细胞加载和强表面持久性。
[0305] 图25显示了IL-15和IL-21IFM的组合的表面加载和持久性。
[0306] 图26显示了靶向CD45的IL-15和靶向CD8的IL-21IFM的组合的表面加载。
[0307] 图27A-27B显示了来自IL-15和IL-21IFM的组合的STAT5磷酸化。
[0308] 图28显示了来自IL-12和IL-15IFM的组合的表面加载。
[0309] 图29显示了来自IL-12和IL-15IFM的组合的STAT4磷酸化。
[0310] 图30显示了通过CD45系连的IL-15-D61H IFM和CD18系连的野生型IL-15IFM的组合的T细胞扩增。
[0311] 图31显示使用靶向CD45，CD11a或CD18的各种人源化抗体的IL-12或IL-15的表面加载。
[0312] 图32显示了小鼠T细胞系连的IL-12的表面持久性。
[0313] 图33显示了小鼠T细胞系连的IL-12的定量。
[0314] 图34A-34B显示了示意图，其描绘了系连融合体可以顺式，反式和通过转移到靶细胞中进行信号传递，并且显示了通过IL-12系连融合体在加载的(“顺式”)未加载的靶细胞(“反式”和“转移的”)中激活STAT4磷酸化。
[0315] 图35A显示了肿瘤生长，小鼠体重变化，存活(直至ACT后第100天)。
[0316] 图35B显示了携带替代IL12-TF先导候选物的Pmel细胞诱导转移的和内源性免疫细胞的瞬时淋巴细胞减少。
[0317] 图35C-35D显示了循环内源性CD8 T细胞的增殖(通过KI67阳性)。
[0318] 图35E显示了内源性NK细胞增殖(通过Ki67阳性)和活化(通过CD69阳性)。
[0319] 图36显示了当IL12-TF预先加载到过继转移的T细胞上或可溶地共同给予时，IL12-TF增强了肿瘤特异性T细胞疗法。
[0320] 图37A显示了单剂量或多剂量携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞后的肿瘤生长曲线。
[0321] 图37B显示了单剂量或多剂量携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞的存活。
[0322] 图37C显示IL12-TF增强体内肿瘤特异性T细胞的扩增和植入。
[0323] 图37D显示了用一剂或两剂携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞治疗后的体重变化。
[0324] 图38显示了携带两种IL12-TF之一的Pmel的ACT后的IFN-γ血浆水平。
[0325] 图39显示了携带两个IL12-TF之一的Pmel的ACT后的CXCL10血浆水平。
[0326] 图40A-40D显示体内包含野生型或突变的IL-15的靶向CD8的IFM与CD8 T细胞的特异性结合，以及靶向CD8的IFM对循环CD4 T，CD8 T和NK细胞的活性。
[0327] 图41A-41C显示，与包含野生型或突变的IL-15变体的靶向CD8的IFM的安全性相比，在增加剂量或给药方案后IL-15的毒性。*表示第二次给药后。
[0328] 图42A-42B显示了随着IL-12，靶向CD8的IL-12IFM或两种不同的靶向CD45的IL-12IFM的剂量增加，抗肿瘤功效和体重变化。
[0329] 具体说明
[0330] 本公开内容尤其提供了制备和使用免疫刺激融合分子(IFM)或系连融合体(TF)的组合物和相关方法。如本文所述的“IFM”或“TF”包括免疫刺激部分，例如细胞因子分子(例如，生物学活性细胞因子)，和能够结合免疫细胞，例如免疫效应细胞的免疫细胞靶向部分，例如抗体分子(例如，抗体或抗体片段)。在实施方式中，免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分功能性连接(例如，通过化学偶联，遗传融合，非共价结合或其他方式)。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分能够与免疫细胞表面靶标结合，从而将免疫刺激部分，例如细胞因子分子靶向免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如淋巴细胞)。
[0331] 在一些实施方式中，可以通过将编码系连融合体的多核苷酸转染到免疫细胞中来提供系连融合体。由于至少几个原因，这可能是有利的。首先，这节省了在加载到免疫细胞上之前表达系连融合体的额外步骤。第二，转染的免疫细胞一旦作为细胞疗法给予患者，就可以从多核苷酸连续表达系连融合体，从而提供了更持续水平的系连融合体。第三，转染的免疫细胞可以分泌系连融合体，而后者又可以结合转染的免疫细胞本身(自分泌信号转导)和/或结合邻近的免疫细胞(旁分泌信号转导)，从而在体内实现双重自分泌和旁分泌活性。
[0332] 在某些实施方式中，可以设计多核苷酸以表达和分泌具有或不具有免疫细胞靶向部分的细胞因子分子。可以选择用于分泌细胞因子分子的信号肽并将其工程改造到多核苷酸上，本领域已经很好地描述了几种合适的信号肽(参见，例如，Stern等，“改善哺乳动物细胞工厂：信号肽的选择对哺乳动物细胞中重组蛋白的合成和分泌有重大影响(Improving mammalian cell factories:The selection of signal peptide has a major impact on recombinant protein synthesis and secretion in mammalian cells)”。Trends Cell Mol Biol.2007；2:1–7，通过引用全文纳入本文)。
[0333] 在一些实施方式中，多核苷酸包括质粒，cDNA或mRNA，所述质粒，cDNA或mRNA可包括例如用于表达细胞因子的序列(例如基因)。合适的质粒包括标准质粒载体和可用于将基因转移至免疫细胞的小环质粒。多核苷酸(例如，质粒或小环质粒)可以进一步包括任何附加的序列信息，以促进遗传物质(例如，编码受体到抗原的序列)向免疫细胞的转移和/或遗传物质在免疫细胞中的表达。例如，多核苷酸可以包括启动子，例如通用启动子，组织特异性启动子，细胞特异性启动子和/或对细胞核或细胞质具有特异性的启动子。在一些实施方式中，细胞特异性启动子选自CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD56，NK1.1，CD11a，CD11b或CD11c的天然启动子。该启动子可以是组成型启动子或诱导型(正或负)启动子。在一些实施方式中，该启动子可以是与T细胞活化相关的启动子，以使系连融合体表达与T细胞活化偶联。在一些实施方式中，启动子选自PD-1，CD25，CD137，CD69，CD45RO的天然启动子或在T细胞活化后上调的其他基因的启动子。在其他实施方式中，启动子选自CD27，CD62L或CCR7的启动子。在其他实施方式中，启动子可以与T细胞阴性共刺激相关联以将阴性调节信号转化为系连融合体的表达。启动子和质粒(例如小环质粒)通常是本领域众所周知的，并且可以使用常规技术来制备。
[0334] 在各种实施方式中，多核苷酸可用于转染免疫细胞。除非另有说明，否则术语转染，经转染或进行转染可用于指示免疫细胞，例如淋巴细胞中存在外源多核苷酸或由其表达的多肽。如本领域已知的，许多方法和载体能够介导多核苷酸向淋巴细胞的转移。实例包括使用病毒载体(参见例如Zhang等，MicroRNA-31通过抑制视黄酸可诱导蛋白3来负调控外周衍生的调节性T细胞生成(MicroRNA-31negatively regulates peripherally derived regulatory T-cell generation by repressing retinoic acid-inducible protein3).Nat.Commun.6,7639(2015)；Cribbs等，慢病毒载体的简化生产和浓缩以在原代人T细胞中实现高转导(Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells)，BMC Biotechnol.13,98(2013))，电穿孔(参见例如Van Driessche等，信使RNA电穿孔：免疫疗法和干细胞研究中的一种有效的工具(Messenger RNA electroporation:an efficient tool in
immunotherapy and stem cell research)，FOLIA HISTOCHEMICA ET CYTOBIOLOGICA，第
43卷，第4期，2005年，第213-216页)，以及纳米颗粒(参见，例如，Moffett等，使用mRNA纳米载体对治疗性细胞试剂进行Hit-and-run编程(Hit-and-run programming of
therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers)。NATURE COMMUNICATIONS.8:389(2017)；美国公开号20170296676和20180030153)。
immunotherapy and stem cell research)，FOLIA HISTOCHEMICA ET CYTOBIOLOGICA，第
43卷，第4期，2005年，第213-216页)，以及纳米颗粒(参见，例如，Moffett等，使用mRNA纳米载体对治疗性细胞试剂进行Hit-and-run编程(Hit-and-run programming of
therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers)。NATURE COMMUNICATIONS.8:389(2017)；美国公开号20170296676和20180030153)。
[0335] 在一些实施方式中，多核苷酸可以是合成的，例如可以使用本领域已知的方法在体外设计和合成的合成mRNA。在某些实施方式中，mRNA序列可以适应特定需要，提高稳定性和翻译效率，其可以通过mRNA中的顺式作用结构元件来控制或优化：5'-帽(例如，甲基化的m7GpppN帽)，多聚(A)-尾(可以定义长度，也可以不存在3'-末端“掩蔽”序列)，非翻译区和编码区的序列可以针对细胞背景和更高的稳定性进行优化，例如细胞中更长的半衰期(参见例如Kuhn等，mRNA作为外源蛋白质表达的通用工具(mRNA as a versatile tool for exogenous protein expression).Curr Gene Ther，12(2012)，第347-361页；Petsch等，体外合成，特异性抗甲型流感病毒感染的mRNA疫苗的保护功效(Protective efficacy of in vitro synthesized,specific mRNA vaccines against influenza A virus infection)。Nat Biotechnol，30(2012)，第1210-1216页；Diken等，合成mRNA的抗肿瘤疫苗接种：体外和体内临床前研究的策略(Antitumor vaccination with synthetic mRNA:
strategies for itro and ivo preclinical studies)。Methods Mol Biol,969(2013)，第235-246页；和Grudzien-Nogalska等，具有卓越翻译和稳定性能的合成mRNA(Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties)，Methods Mol Biol,
969(2013)，第55-72页)。在一些实施方式中，可将核苷酸修饰插入mRNA中(参见Warren等，使用合成修饰的mRNA高效地重编程人细胞的多能性和定向分化(Highly efficient
reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells
with synthetic modified mRNA)，Cell Stem Cell，7(2010)，第618-630页)。
strategies for itro and ivo preclinical studies)。Methods Mol Biol,969(2013)，第235-246页；和Grudzien-Nogalska等，具有卓越翻译和稳定性能的合成mRNA(Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties)，Methods Mol Biol,
969(2013)，第55-72页)。在一些实施方式中，可将核苷酸修饰插入mRNA中(参见Warren等，使用合成修饰的mRNA高效地重编程人细胞的多能性和定向分化(Highly efficient
reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells
with synthetic modified mRNA)，Cell Stem Cell，7(2010)，第618-630页)。
[0336] 在各种实施方式中，可以使用例如噬菌体RNA聚合酶通过cDNA模板如质粒DNA的体外转录来合成mRNA。设计，合成，纯化，稳定化和递送的另外方面可以在以下中找到：Tolmachov等，(2015年11月26日)信使RNA基因载体的转染方法(Methods of Transfection with Messenger RNA Gene Vectors)，Doaa Hashad，IntechOpen,DOI:10.5772/61688；Van der Jeught等，(2015)mRNA的肿瘤内递送：克服有效免疫疗法的障碍(Intratumoral
delivery of mRNA:Overcoming obstacles for effective immunotherapy)，
OncoImmunology，4：5，e1005504，DOI：10.1080/2162402X.2015.1005504；Schlake等，(2012)开发mRNA疫苗技术(Developing mRNA-vaccine technologies)，RNA Biology，9:
11，1319-1330，DOI：10.4161/rna.22269；和Quabius等，用于操纵细胞表型的合成mRNA：综述(Synthetic mRNAs for manipulating cellular phenotypes:an overview)。New
Biotechnology，第32卷，第1期，2015年1月25日，第229-235页；全部通过引用纳入本文。
delivery of mRNA:Overcoming obstacles for effective immunotherapy)，
OncoImmunology，4：5，e1005504，DOI：10.1080/2162402X.2015.1005504；Schlake等，(2012)开发mRNA疫苗技术(Developing mRNA-vaccine technologies)，RNA Biology，9:
11，1319-1330，DOI：10.4161/rna.22269；和Quabius等，用于操纵细胞表型的合成mRNA：综述(Synthetic mRNAs for manipulating cellular phenotypes:an overview)。New
Biotechnology，第32卷，第1期，2015年1月25日，第229-235页；全部通过引用纳入本文。
[0337] 不希望受到理论的束缚，认为免疫细胞靶向部分与免疫细胞表面靶标的结合会增加免疫刺激部分(例如细胞因子分子)及免疫细胞上的其相应受体，例如细胞因子受体在表面上的浓度，例如随时间的浓度，例如，相对于游离细胞因子分子与其细胞因子受体的缔合。这可以对由IFM结合的免疫细胞本身(自分泌信号传导)和/或对另一个(例如，相邻的)免疫细胞(旁分泌信号传导)产生免疫作用。有利地，与其他疗法例如可溶性细胞因子，武装CAR-T(具有细胞因子)和纳米凝胶背包(在免疫细胞上)相比，本发明的系连融合体可以提供平衡的双重自分泌和旁分泌活性，结合了两者的优点，足够高的活性和低毒性。相反，在提供全身活性的同时递送可溶性细胞因子以其高毒性而闻名。武装CAR-T可以局部分泌提供旁分泌和全身活性以及全身毒性的细胞因子。纳米凝胶背包，例如在美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944，美国公开号2014/0081012和PCT申请号PCT/US2017/
037249中描述的那些(在此通过引用全文纳入本文)能够提供高度局部的自分泌活性，这对于某些细胞因子(例如IL-15)可能是理想的。然而，对于需要旁分泌活性的细胞因子(例如IL-12)，本文公开的系连融合体可以是平衡的自分泌和旁分泌活性的最佳位置。如图34A所示，系连融合体一旦系连(或加载)到免疫细胞上，就可以顺式发出信号，反式传给邻近的靶标免疫细胞，并转移到与原始背包没加载的细胞非常接近的靶免疫细胞。
037249中描述的那些(在此通过引用全文纳入本文)能够提供高度局部的自分泌活性，这对于某些细胞因子(例如IL-15)可能是理想的。然而，对于需要旁分泌活性的细胞因子(例如IL-12)，本文公开的系连融合体可以是平衡的自分泌和旁分泌活性的最佳位置。如图34A所示，系连融合体一旦系连(或加载)到免疫细胞上，就可以顺式发出信号，反式传给邻近的靶标免疫细胞，并转移到与原始背包没加载的细胞非常接近的靶免疫细胞。
[0338] 在实施方式中，免疫细胞靶向部分导致以下的一种或多种增加：免疫细胞上的免疫刺激部分的结合，可及性，激活和/或信号传导，例如，在指定的时间内。在实施方式中，IFM基本上不干扰细胞因子分子的信号传导功能。这种靶向作用导致免疫细胞的增殖和活化的局部和长期刺激，从而诱导免疫应答的受控放大和活化。本文公开的IFM提供了优于本领域已知细胞因子的若干优点，包括减少的副作用，例如较低的全身毒性，同时保留了细胞因子分子的免疫刺激性生物活性(例如，信号传导活性和/或效力)。
[0339] 免疫细胞因子-抗体-细胞因子融合蛋白的先前公开内容通常被设计为通过其抗体组分靶向疾病抗原(例如，肿瘤相关抗原，例如细胞膜抗原和细胞外基质组分)，以通过其细胞因子组分增强效应功能。(Clin.Pharmacol.2013；5(增刊1):29–45.Thomas List and Dario Neri.网上公开，2013年8月20日.doi:10.2147/CPAA.S49231 PMCID:PMC3753206。)与细胞因子治疗性使用相关的示例性障碍涉及血清半衰期短和生物利用度有限。高剂量的细胞因子可以克服这些障碍，但会导致剂量限制的毒性。因此，大多数细胞因子需要蛋白质工程改造方法来减少毒性并增加半衰期。具体策略包括聚乙二醇化，抗体复合物和融合蛋白形式以及诱变。(Antibodies 2013,2,426-451；doi:10.3390/antib2030426 Rodrigo Vazquez-Lombardi Brendan Roome and Daniel Christ。)
[0340] 本公开内容尤其提供融合蛋白作为细胞因子和靶向部分的共价偶联物，所述靶向部分的功能是将融合蛋白靶向具有特定受体组成的免疫细胞(例如，健康的和/或非恶性的)。将促炎细胞因子与靶向部分(优选抗体或抗体片段(例如单链Fv，Fab，IgG))融合，将融合蛋白引导至目标细胞并增强细胞因子的细胞表面可及性。感兴趣的细胞尤其包括免疫细胞，尤其是淋巴细胞，优选T细胞(例如，总CD3 T细胞，CD4 T细胞或CD8T细胞)，并且可以包括其他细胞类型。在一些实施方式中，融合蛋白可以激活CD8 T细胞的亚型。感兴趣的细胞，包括免疫细胞，可以在体内(例如，在对象中)，体外或离体(例如，基于细胞的疗法)。
[0341] 在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标大量存在于免疫细胞的表面上(例如，超过免疫细胞表面上存在的细胞因子分子的受体的数目)。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分可以选自与免疫细胞表面靶标结合的抗体分子或配体分子，所述靶标例如选自CD4，CD8，CD18，CD11a，CD11b，CD11c，CD19，CD20或CD45。在一个实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体分子或配体分子。
[0342] CD45是丰富受体的一个例子。CD45也被称为白细胞共同抗原，是除有助于细胞激活的红细胞外，存在于造血细胞上的I型跨膜蛋白(参见例如Altin，JG，Immunol Cell Biol.1997年10月；75(5):430-45))。理想地，IFM的靶向部分的其他受体保持在细胞表面上，并且对细胞的内在化具有抵抗力(例如持久性受体)。丰富而持久的受体的一个例子是CD45。或者，可以将靶向部分的受体组成性地翻转，例如，尽管它们是动态内在化的(再循环受体)，但仍被细胞内化并再循环回表面，因此为融合蛋白提供了重要的结合机会。CD22是再循环受体的例子。
[0343] 细胞因子受体的表达水平可基于多种因素而变化，包括(i)细胞类型和(ii)细胞的活化状态。在实施方式中，表达水平可以影响细胞因子信号转导，信号强度和持续时间中的一种或多种。在一个实施方式中，在免疫细胞表面上表达的受体以有效比例存在，由此靶向部分的受体数量超过细胞表面上细胞因子组分的受体数量。当靶向部分受体是持久的时，实现这样的有效比率；或者当通过回收机制有效地维持其细胞表面密度时，该回收机制可使受体恢复至细胞表面，从而使靶向成分的结合机会超过细胞因子组分。对于再循环的受体(例如内在化并返回到细胞表面)，抗体受体将以有效比例存在，以使靶向部分的结合机会超过蛋白质的细胞因子组分的结合机会。这样的有效比率允许细胞因子定位于细胞表面，因此增加了细胞因子结合其自身细胞表面受体的时间和可及性(尽管动态存在，内化并返回到靶向受体的表面)。
[0344] 在某些情况下，由质膜受体引发的信号传导调节与内吞作用偶联。活化受体的内化是信号衰减的一种手段，但也调节了受体信号转导的持续时间和信号输出特异性(在Barbieri,P.P.Di Fiore,S.Sigismund.质膜上的信号转导的内吞控制(Endocytic control of signaling at the plasma membrane)，Curr.Opin.Cell Biol.，第39期
(2016)，第21–27页中进行了综述)。内体可以用作移动信号转导平台，促进多蛋白信号转导组装的形成，从而实现时空上高效的信号转导。在质膜上引发的一些信号转导事件，例如，细胞因子信号转导事件可能会从内体隔室继续。
(2016)，第21–27页中进行了综述)。内体可以用作移动信号转导平台，促进多蛋白信号转导组装的形成，从而实现时空上高效的信号转导。在质膜上引发的一些信号转导事件，例如，细胞因子信号转导事件可能会从内体隔室继续。
[0345] 一般而言，本公开的IFM可以赋予激动性细胞因子特别是IL-15，IL-7，IL-21和IL-12p70改善的生物学活性。其他激动性细胞因子包括IL-2，IL-6和IL-27。在某些实施方式中，细胞因子分子包括促炎性细胞因子，例如包括选自IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-15，IL-
21或IL-27中的一种或多种的细胞因子，包括其变体形式(例如，细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式)。在一个实施方式中，细胞因子分子包括IL-15和/或IL-12(在一个IFM或两个IFM中)。
21或IL-27中的一种或多种的细胞因子，包括其变体形式(例如，细胞因子衍生物，包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物，及其其他激动剂形式)。在一个实施方式中，细胞因子分子包括IL-15和/或IL-12(在一个IFM或两个IFM中)。
[0346] 在一个示例性的实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分衍生自抗CD45抗体分子，并且细胞因子分子是任选地复合至IL-15受体α亚基的sushi结构域的白介素-15(αCD45-IL15和αCD45-IL15/sushi)。在另一个示例性的实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分衍生自抗-CD45抗体分子，并且细胞因子分子是白介素-12(αCD45-IL12)。αCD45-IL15/sushi IFM和αCD45-IL12IFM可以在例如联合疗法中一起使用。
[0347] 在另一个实施方式中，IFM可以系连至不同的细胞表面分子，例如IFM，其中免疫细胞靶向部分衍生自靶向除CD45以外的丰富或持久性细胞表面受体的抗体，例如选自CD4，CD8，CD18，CD11a，CD11b，CD11c，CD19或CD20的靶标。IFM可以包含细胞因子，例如白介素-15，其任选地复合至IL-15受体α亚基和/或白介素12的sushi结构域。IFM可以与αCD45-IL15，αCD45-IL15/sushi或αCD45-IL12的联合疗法一起使用。
[0348] 在另一个实施方式中，例如在联合疗法中一起使用包含与相同或不同细胞表面受体系连的另外的细胞因子的IFM。免疫细胞靶向部分可以选自与免疫细胞表面靶标结合的抗体分子或配体分子，例如，选自以下的靶标：CD4，CD8，CD18，CD11a，CD11b，CD11c，CD19，CD20或CD45，和促炎性细胞因子，例如包括选自IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-15，IL-21或IL-27中的一种或多种的细胞因子，包括其变体形式。在一些实施方式中，使用两种不同的IFM的组合。在其他实施方式中，使用三种不同的IFM的组合。在其他实施方式中，使用多于三种的IFM的组合。
[0349] 本公开内容的融合蛋白的治疗用途尤其包括：(1)作为通过受体介导的特异性细胞独特受体(例如，CD4或CD8)的结合特异性递送治疗性蛋白质的试剂；(2)作为离体药剂，以在重新引入患者之前诱导分离的自体和同种异体细胞的活化和扩增；例如，在包括ACT(过继细胞转移)在内的T细胞疗法中，以及在其他重要的免疫细胞类型中，包括例如B细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，NK细胞，抗原特异性CD8 T细胞，经遗传工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或CAR-T细胞，经遗传工程改造以表达肿瘤抗原特异性的T细胞受体的T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或受抗原训练的T细胞(例如已经通过展示感兴趣抗原(例如肿瘤相关抗原(TAA)的抗原呈递细胞(APC)“训练”的T细胞)；和(3)作为体内药剂，用于给药以递送用以支持用于包括ACT在内的细胞疗法的细胞扩增的细胞因子。
[0350] 这样，包含本公开内容的IFM和药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂的药物组合物可以用于将治疗性蛋白质递送至需要其的对象。还提供了修饰的免疫细胞，其包含健康和/或非恶性免疫细胞以及与其结合或靶向的本公开的IFM。这种修饰的免疫细胞可以在体外或体内制备。
[0351] 本公开还提供了一种体外制备经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括：提供多个健康和/或非恶性免疫细胞；和将本公开的IFM与多个健康和/或非恶性免疫细胞一起孵育，以允许IFM与其靶向结合，从而产生多个修饰的免疫细胞。
[0352] 本文还提供了一种提供细胞疗法的方法，其包括：提供多个健康和/或非恶性免疫细胞；将本公开的IFM与多个健康和/或非恶性免疫细胞一起孵育，以允许IFM与其靶向结合，从而产生多个修饰的免疫细胞；和
[0353] 将多个修饰的免疫细胞给予有需要的对象。在一些实施方式中，在不进行对象的预处理的情况下给予细胞疗法，其中所述预处理包括CPX(环磷酰胺)或其他淋巴细胞清除调节化学疗法。消除预处理是有利的，因为众所周知，用化学治疗剂进行预处理可对包括健康细胞在内的所有细胞产生全身性高毒性，削弱免疫系统并诱导许多不良副作用。
[0354] 定义
[0355] 某些术语在下面定义。在整个申请中提供了额外定义。
[0356] 本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。术语“一种”或“一个”当与“包含”在本文中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。
[0357] 如本文所用，“约”和“近似”通常表示在考虑测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定数值范围的20％以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。术语“基本上”表示超过50％，更优选超过80％并且最优选超过90％或95％。
[0358] 如本文所用，术语“包含”或“包括”是指存在于给定实施方式中，但未包含未指定要素的组合物，方法及其各自的组分。
[0359] 如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本公开的该实施方式的基本和新颖的或功能的特征的附加要素。
[0360] 术语“由……组成”是指本文所述的组合物，方法及其各自的组分，其排除了在该实施方式的描述中未列举的任何要素。
[0361] 如本文所用，除非另有说明，否则术语“转录”是指从DNA模板合成RNA；术语“翻译”是指从mRNA模板合成多肽。通常，翻译受mRNA转录物5'非翻译区(5'-UTR)的序列和结构调控。一种调节序列是核糖体结合位点(RBS)，其促进mRNA的高效和准确翻译。原核RBS是Shine-Dalgarno序列，一种富含嘌呤的5'-UTR序列，其与16S rRNA 3'-末端的UCCU核心序列(位于30S小核糖体亚基内)互补。在原核mRNA中已经发现了各种Shine-Dalgarno序列，通常位于AUG起始密码子上游约10个核苷酸。RBS的活性可能受分隔RBS和引发剂(或起始密码子)AUG的间隔子的长度和核苷酸组成的影响。在真核生物中，核糖体募集是由5'加帽的mRNA介导的。内部核糖体进入位点(IRES)也可以介导真核生物中核糖体的募集。这些被各种病毒用于mRNA翻译，并且本领域技术人员将熟悉它们在促进真核宿主中异源蛋白表达中的用途。此外，在真核生物中，Kozak序列位于短5'非翻译区内，并指导mRNA的翻译。如果缺少Kozak共有序列的mRNA具有乏稳定的二级结构的中等长度的5'-UTR，则该mRNA在体外系统中也可以高效翻译。大肠杆菌核糖体优先识别Shine-Dalgarno序列，而真核生物核糖体(例如在网状细胞裂解物中发现的核糖体)可以高效地使用Shine-Dalgarno或Kozak核糖体结合位点。
[0362] 如本文所用，术语“启动子”，“启动子元件”或“启动子序列”是指当与感兴趣核苷酸序列连接时能够控制感兴趣核苷酸序列向mRNA转录的DNA序列。尽管不是必须的，但是启动子通常位于感兴趣的核苷酸序列的5’(即上游)，其转录成它所控制的mRNA，并提供了供RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点以启动转录。启动子可以是组成型活性的(“组成型启动子”)或受其他因素(例如化学，热或光)控制。“诱导型启动子”的活性由存在或不存在生物或非生物因素来诱导。常用的组成型启动子包括CMV，EF1a，SV40，PGK1，Ubc，人β肌动蛋白，CAG，Ac5，多面体，TEF1，GDS，ADH1(被乙醇抑制)，CaMV35S，Ubi，H1，U6，T7(需要T7 RNA聚合酶)和SP6(需要SP6 RNA聚合酶)。常见的诱导型启动子包括TRE(可被四环素或其衍生物诱导；可被TetR阻遏物抑制)，GAL1和GAL10(可被半乳糖诱导；可被葡萄糖抑制)，lac(可在无lac阻遏物(LacI)的情况下组成；可由IPTG或乳糖诱导)，T7lac(T7和lac的杂交体；需要T7 RNA聚合酶，该酶也受lac操纵子控制；可以由IPTG或乳糖诱导)，araBAD(由结合了阻遏物AraC的阿拉伯糖诱导，从而将其切换以激活转录；在葡萄糖存在下通过CAP结合位点或通过抗诱导剂岩藻糖的竞争性结合来抑制分解代谢物抑制)，trp(与TrpR阻遏物结合时色氨酸可抑制)，tac(lac和trp的杂交体；像lac启动子一样受到调控；例如tacI和tacII)和pL(温度调节的)。该启动子可以是原核或真核启动子，取决于宿主。在真核生物中，启动子可以进一步是细胞特异性或组织特异性启动子，或取决于上游细胞内信号转导分子的激活。本领域技术人员将熟悉细胞特异性，组织特异性或激活依赖性启动子，以驱动感兴趣蛋白质的选择性转录。常见的启动子及其序列是本领域众所周知的。
[0363] 应该认识到，启动子具有模块化架构，并且模块化架构可以更改。细菌启动子通常包括核心启动子元件和其他启动子元件。核心启动子是指启动转录所需的启动子的最小部分。核心启动子包括转录起始位点，RNA聚合酶的结合位点和一般转录因子结合位点。“转录起始位点”是指要转录的第一个核苷酸，并被指定为+1。起始位点下游的核苷酸编号为+1，+2等，并且起始位点上游的核苷酸编号为-1，-2等。其他启动子元件位于核心启动子的5'(即，通常为起始位点上游30-250bp)并调节转录频率。近端启动子元件和远端启动子元件构成特异性转录因子位点。在原核生物中，核心启动子通常包括两个共有序列，一个-10序列或一个-35序列，它们被sigma因子识别。-10序列(第一个转录的核苷酸上游10bp)的长度通常约为6个核苷酸，并且通常由核苷酸腺苷和胸苷(也称为Pribnow盒)组成。此框的存在对于转录的开始至关重要。核心启动子的-35序列通常长约6个核苷酸。-35序列的核苷酸序列通常由四个核苷中的每一个组成。该序列的存在允许非常高的转录速率。在一些实施方式中，-10和-35序列间隔约17个核苷酸。真核启动子比原核启动子更多样化，并且可以位于转录起始位点上游几千个碱基处。一些真核启动子含有TATA盒，其通常位于转录起始位点的40至120个碱基内。被特异性结合蛋白识别的一个或多个上游激活序列(UAS)可以充当转录激活子。这些UAS序列通常位于转录起始位点的上游。UAS序列和TATA盒之间的距离是高度可变的，可能长达1kb。
[0364] 如本文所用，术语“载体”是指当与适当的控制元件关联时能够复制并可以将基因序列转移到细胞中或在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如质粒(包括微质粒和微质粒)，噬菌体，转座子，粘粒，染色体，人工染色体，附加体，病毒，病毒粒子等。基因序列通常可操作地连接至一个或多个调节序列，例如启动子，激活子/阻遏子结合位点，终止子，增强子等。启动子序列可以是组成型，可诱导的和/或可抑制的。
[0365] 术语“自体的”是指衍生自后来将其重新引入该个体的同一个体的任何材料。术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。
[0366] 如本文所用的“抗体”或“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在一个实施方式中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如，IgG)。在实施方式中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体片段(例如功能片段)是抗体的一部分，例如Fab，Fab’，F(ab’)2，F(ab)2，可变片段(Fv)，域抗体(dAb)或单链可变片段(scFv)。功能性抗体片段结合与完整(例如，全长)抗体识别的抗原相同的抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段，例如由重链和轻链的可变区或其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子组成的“Fv”片段。在一些实施方式中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如，dAb(域抗体)，单链，Fab，Fab’和F(ab’)2片段以及单链可变片段(scFv)。术语“Fab”和“Fab片段”可互换使用，并且是指包括来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定域和一个可变域的区域，即VL，CL，VH，和CH1。
[0367] 如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指能形成免疫球蛋白可变结构域结构的氨基酸序列。例如，该序列可包括天然存在可变结构域氨基酸序列的全部或部分。例如，该序列可包含或不包含一个、两个或更多给N-或C-末端氨基酸，或可包含与蛋白质结构形成相容的其他改变。
[0368] 在实施方式中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用，“双特异性抗体分子”是指对一种以上(例如，两，三，四或更多种)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。
[0369] 如本文所用，“抗原”(Ag)是指大分子，包括所有蛋白质或肽。在一些实施方式中，抗原是可以引起免疫应答的分子，例如涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体产生。抗原不仅参与抗体产生。T细胞受体还识别抗原(尽管其肽或肽片段与MHC分子复合的抗原)。任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以是抗原。抗原也可以源自基因组重组体或DNA。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都编码“抗原”。在实施方式中，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也不需要完全由基因编码。在实施方式中，抗原可以合成或可以衍生自生物学样品，例如组织样品，肿瘤样品，细胞或具有其他生物学组分的流体。如本文所用，“肿瘤抗原”或可互换使用的“癌症抗原”包括存在于癌症，例如，癌症细胞或肿瘤微环境上或与之相关的可以激发免疫应答的任何分子。如本文所用，“免疫细胞抗原”包括存在于免疫细胞上或与之相关的可引起免疫应答的任何分子。
[0370] 抗体分子的“抗原结合位点”或“抗原结合片段”或“抗原结合部分”(在本文中可互换使用)是指抗体分子，例如免疫球蛋白(Ig)分子，例如IgG参与抗原结合的一部分。在一些实施方式中，抗原结合位点由重(H)链和轻(L)链的可变(V)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的可变区域内的三个高度发散的延伸(称为高变区域)位于称为“框架区”(FR)的更为保守的侧翼延伸之间。FR是天然在免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在实施方式中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面，其与结合的抗原的三维表面互补。重链和轻链三个高变区中的每一个被称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR已经在例如Kabat,E.A.等，(1991)《热门免疫学蛋白质序列》，第五版，美国卫生和人服务部，NIH出版号91-3242，和Chothia，C.等，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917中被定义和描述。每条可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个CDR和四个FR组成，按照下述氨基酸顺序从氨基端到羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。可变轻链(VL)CDR通常定义为包括位置27-32(CDR1)，50-56(CDR2)和91-97(CDR3)上的残基。可变重链(VH)CDR通常定义为包括位置27-33(CDR1)，
52-56(CDR2)和95-102(CDR3)上的残基。本领域普通技术人员将理解，环在抗体之间可以具有不同的长度，并且以诸如Kabat或Chotia的编号系统为准，从而框架在抗体之间具有一致的编号。
52-56(CDR2)和95-102(CDR3)上的残基。本领域普通技术人员将理解，环在抗体之间可以具有不同的长度，并且以诸如Kabat或Chotia的编号系统为准，从而框架在抗体之间具有一致的编号。
[0371] 在一些实施方式中，抗体的抗原结合片段(例如，当作为本公开的融合分子的一部分包括时)可以缺乏或没有完整的Fc结构域。在某些实施方式中，抗体结合片段不包含完整的IgG或完整的Fc，但是可以包含来自轻链和/或重链的一个或多个恒定区(或其片段)。在一些实施方式中，抗原结合片段可以完全不含任何Fc结构域。在一些实施方式中，抗原结合片段可以基本上没有完整的Fc结构域。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括完整Fc结构域的一部分(例如，CH2或CH3结构域或其部分)。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括完整的Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域是IgG结构域，例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。
[0372] 如本文所用，“细胞因子分子”是指天然存在的野生型细胞因子的全长，片段或变体(包括其具有天然存在的细胞因子分子的至少10％活性的片段和功能变体)。在实施方式中，细胞因子分子具有天然存在的分子至少30％，50％或80％的活性，例如免疫调节活性。在实施方式中，细胞因子分子还包含任选地与免疫球蛋白Fc区偶联的受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在其他实施方式中，细胞因子分子与免疫球蛋白Fc区偶联。在其他实施方式中，细胞因子分子与抗体分子(例如，免疫球蛋白Fab或scFv片段，Fab片段，FAB2片段或亲和体片段或衍生物，例如sdAb(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单域抗体，双特异性或多特异性抗体)，或非抗体支架和抗体模拟物(例如载脂蛋白(例如抗运载蛋白(anticalin))，亲和体，纤连蛋白(例如单抗体(monobody)或阿迪连接素(Adnectin))，结蛋白，锚蛋白重复序列(例如DARPins)和A域(例如avimer)))偶联。
[0373] 如本文所用，“癌症”可以涵盖所有类型的致癌过程和/或癌性生长。在实施方式中，癌症包括原发性肿瘤以及转移组织或恶性转化的细胞，组织或器官。在实施方式中，癌症涵盖癌症的所有组织病理学和阶段，例如侵袭性/严重性阶段。在实施方式中，癌症包括复发和/或耐药性癌症。术语“癌症”和“肿瘤”可以互换使用。例如，两个术语都包括实体瘤和液体瘤。如本文所用，术语“癌”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
[0374] 如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫系统中起作用，例如保护免受感染和异物侵害的各种细胞中的任何一种。在实施方式中，该术语包括白细胞，例如嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞。术语“免疫细胞”包括本文所述的免疫效应细胞。“免疫细胞”还指参与免疫应答的细胞的修饰形式，例如，修饰的NK细胞，包括NK细胞系NK-92(ATCC目录号CRL-2407)，haNK(表达高亲和力Fc受体FcγRIIIa(158V)的NK-92变体)和taNK(靶向的NK-92细胞，其用表达给定肿瘤抗原的CAR的基因转染)，例如，如上文Klingemann等所述。
[0375] 如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫效应应答。免疫效应细胞的示例包括但不限于T细胞，例如CD4 T细胞，CD8 T细胞，αT细胞，βT细胞，γT细胞和δT细胞；B细胞；自然杀伤(NK)细胞；自然杀伤T(NKT)细胞；树突状细胞；和肥大细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其包含，例如，表达嵌合抗原受体(CAR)，例如结合癌抗原的CAR。在其他实施方式中，免疫细胞表达外源高亲和力Fc受体。在一些实施方式中，免疫细胞包含，例如表达工程改造的T细胞受体。在一些实施方式中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含免疫细胞群，并且包含已经针对肿瘤相关抗原(TAA)的特异性富集的T细胞，例如，通过分选针对展示感兴趣的TAA(例如MART-1)的MHC具有特异性的T细胞来富集。在一些实施方式中，免疫细胞包括免疫细胞群，并且包括已经被展示感兴趣的TAA肽的抗原呈递细胞(APC)，例如，树突状细胞“训练”以具有针对TAA的特异性的T细胞，。在一些实施方式中，针对选自MART-1，MAGE-A4，NY-ESO-1，SSX2，生存素或其他中的一种或多种的TAA训练T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含T细胞群，其已被展示了多个感兴趣的TAA肽的APC，例如，树突状细胞“训练”以对多种TAA具有特异性。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞毒性T细胞(例如，CD8 T细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞是辅助T细胞，例如CD4 T细胞。
[0376] 术语“效应功能”或“效应响应”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0377] 如本文所用的“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)是指具有杀死靶细胞能力的T细胞。当发生以下两个步骤时可以发生CTL活化：1)靶细胞上的抗原结合的MHC分子和CTL上的T细胞受体之间产生相互作用；2)通过T细胞上共刺激分子和靶细胞的接合而产生共刺激信号。然后，CTL识别靶细胞上的特异性抗原并诱导这些靶细胞的破坏，例如通过细胞裂解。在一些实施方式中，CTL表达CAR。在一些实施方式中，CTL表达工程改造的T细胞受体。
[0378] 术语“对象”包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，人)。在一个实施方式中，对象是患者，例如需要免疫细胞疗法的患者。在另一个实施方式中，对象是供体，例如，免疫细胞的同种异体供体，例如，用于同种异体移植。
[0379] 本文所述的组合物和方法包括具有指定序列的多肽和核酸，或具有与指定序列基本相同或与其相似(例如与指定序列有至少85％、90％、95％或更高相同性)的序列的多肽和核酸。在描述氨基酸序列的情况下，用于本文的术语“基本相同”是指第一氨基酸含有足够或最少数量的如下氨基酸残基：i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或ii)第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基的保守取代，从而第一和第二氨基酸序列可具有共有的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含与参比序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的共有结构域的氨基酸序列。
[0380] 在描述核苷酸序列的情况下，本文所用术语“基本相同”是指第一核酸序列包含足够或最少数量的与第二核酸序列中的比对核苷酸相同的核苷酸，从而第一和第二核苷酸序列编码具有相同功能活性的多肽、或编码共有结构多肽结构域或共有功能性多肽活性。例如，包含与参比序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列。序列间的同源性或序列相同性(这些术语在本文中可互换使用)的计算如下进行。
[0381] 为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比相同性，可以为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的之一或两条中引入缺口以达到最佳对齐，并且出于比较目的可以不考虑非同源序列)。在优选的实施方式中，为了比较目的而比对的参比序列的长度为参比序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，60％，甚至更优选至少70％，80％，90％，或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸的“相同性”等同于氨基酸酸或核酸“同源性”)。
[0382] 考虑到用于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条序列之间的百分比相同性与序列共有相同位置的数目相关。
[0383] 可采用数学算法进行两条序列间的序列比较以及确定其百分比相同性。在优选的实施方式中，两条氨基酸序列之间的百分比相同性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定，该算法已经结合到GCG软件包中的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、
14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在其他优选的实施方式中，两条核苷酸序列之间的相同性百分比使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，采用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80，长度权重1、2、3、4、5或6进行计算。一组特别优选的参数(以及除非另有说明而应采用的参数组)为Blossum 62评分矩阵，其缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，移码缺口罚分为5。
14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在其他优选的实施方式中，两条核苷酸序列之间的相同性百分比使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，采用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80，长度权重1、2、3、4、5或6进行计算。一组特别优选的参数(以及除非另有说明而应采用的参数组)为Blossum 62评分矩阵，其缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，移码缺口罚分为5。
[0384] 两条氨基酸或核苷酸序列之间的相同性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。
[0385] 本文公开的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”来对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其他家族组成部分或相关序列。这样的检索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可利用NBLAST程序进行
BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与本公开的核酸(例如，SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(得分＝50，字长＝3)来获取与本公开中蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的缺口比对结果，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402所述利用缺口BLAST。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://
www.ncbi.nlm.nih.gov。应理解，本公开所述分子可具有额外的保守或非必需的氨基酸取代，其不对分子功能产生实质性影响。
BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与本公开的核酸(例如，SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(得分＝50，字长＝3)来获取与本公开中蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的缺口比对结果，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402所述利用缺口BLAST。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://
www.ncbi.nlm.nih.gov。应理解，本公开所述分子可具有额外的保守或非必需的氨基酸取代，其不对分子功能产生实质性影响。
[0386] 术语“氨基酸”旨在涵盖包含氨基官能团和酸官能团且能够被包含于天然存在氨基酸形成的聚合物的所有分子，不论其为天然或合成分子。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物及同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及前述中任意的所有立体异构体。如本文所用，术语“氨基酸”包括D-和L-光学异构体和模拟肽。
[0387] “保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代的情况。本领域已定义具有带相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0388] 在多肽的上下文中，术语“功能变体”或“变体”或“变体形式”是指能够具有天然存在的序列的一种或多种活性的至少10％的多肽。在一些实施方式中，功能变体与天然存在的序列具有实质性的氨基酸序列相同性，或由基本上相同的核苷酸序列编码，使得功能变体具有天然存在的序列的一种或多种活性。
[0389] 如本文所用，本文所用的术语“分子”可以指多肽或编码多肽的核酸。该术语包括天然存在的野生型多肽的全长，片段或变体或编码其的核酸，例如其功能变体。在一些实施方式中，变体是野生型多肽或编码其的核酸的衍生物，例如突变体。
[0390] 本文所用术语“分离的”指，某一物质是从其原生或天然环境(例如，若其是天然产生的，则从天然环境)脱离。例如，活体动物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的某些或所有共存物质分离的该多核苷酸或多肽则是分离的。此类多核苷酸可为载体的部分和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的部分，但其仍为分离的，这是因为该载体或组合物不是该多核苷酸或多肽天然存在环境的一部分。
[0391] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(若为单链)在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线形或分支聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，并且可间插有非氨基酸。该术语也包括修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联。多肽可从天然来源分离，可采用重组技术由原核或真核宿主产生，或者可为合成方法的产品。
[0392] 术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以是单链或双链，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰，如通过与标记组分偶联。核酸可为重组多核苷酸、或基因组多核苷酸、cDNA、半合成或合成来源，即非天然存在或以非天然排列方式与另一多核苷酸相联。
[0393] 术语“亲本多肽”指野生型多肽，并且该野生型多肽的氨基酸序列或核苷酸序列是公众可及的蛋白质数据的一部分(例如，EMBL核苷酸序列数据库、NCBI Entrez、ExPasy、蛋白质数据库等)。
[0394] 术语“突变多肽”或“多肽变体”或“突变蛋白”指这样一种形式的多肽，其中，其氨基酸序列不同于其相应的野生型(亲本)形式、自然存在的形式或任何其它亲本形式的氨基酸序列。突变多肽可以包含一个或多个突变，例如，替换，插入，缺失等，其导致突变多肽。
[0395] 术语“对应亲本多肽”(或该术语的语法变体)用于描述本发明的多肽，其中，该多肽的氨基酸序列与相应的亲本多肽的氨基酸序列仅存在至少一个氨基酸变异的区别。通常，变体多肽和亲本多肽的氨基酸序列表现出高百分比的相同性。在一示例中“对应亲本多肽”表示变体多肽的氨基酸序列与亲本多肽的氨基酸序列具有至少50％的相同性，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的相同性。在另一示例中，编码变体多肽的核酸序列与编码亲本多肽的核酸序列具有至少约50％的相同性，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的相同性。
[0396] 术语“向亲本多肽中引入(或添加等)变异”(或其语法变体)，或“修饰亲本多肽”以包括变异(或其语法变体)，不一定意味着该亲本多肽是这种转化的物理起始材料，而是亲本多肽提供了指导氨基酸序列，用于制备变体多肽。在一个实例中，“将变体引入亲本多肽中”是指通过适当的突变修饰亲本多肽的基因以产生编码变体多肽的核苷酸序列。在另一个实例中，“将变体引入亲本多肽中”是指在理论上使用亲本多肽序列作为指导来设计所得多肽。然后可以通过化学或其他方式产生设计的多肽。
[0398] 细胞因子分子
[0399] 细胞因子是蛋白质信号转导化合物，其是免疫应答的介质。它们控制许多不同的细胞功能，包括增殖，分化和细胞存活/凋亡；细胞因子也参与多种病理生理过程，包括病毒感染和自身免疫性疾病。细胞因子是在多种刺激下由多种细胞合成的，包括先天性(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞)和适应性(T细胞和B细胞)免疫系统的那些。细胞因子可分为两类：促炎和抗炎。促炎细胞因子，包括IFN-γ，IL-1，IL-6和TNF-α，主要来源于先天免疫细胞和Th1细胞。从Th2免疫细胞合成抗炎细胞因子，包括IL-10，IL-4，IL-13和IL-5。
[0400] 本公开内容尤其提供了IFM(例如IFM多肽)，其包括例如经工程改造以包含一种或多种细胞因子分子，例如其免疫调节性(例如促炎性)细胞因子及其变体例如功能变体。因此，在一些实施方式中，细胞因子分子是白介素或其变体，例如其功能变体。在一些实施方式中，白介素是促炎性白介素。
[0401] 在实施方式中，细胞因子分子是细胞因子的全长，片段或变体，例如，包含一个或多个突变的细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自以下的细胞因子：白介素15(IL-15)，白介素-1α(IL-1α)，白介素-1β(IL-1β)，白介素-2(IL-2)，白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素7(IL-7)，白介素12(IL-12)，白介素18(IL-18)，白介素21(IL-21)，白介素23(IL-23)，干扰素(IFN)α，IFN-β，IFN-γ，肿瘤坏死因子α，GM-CSF，GCSF或其片段或变体或任何上述细胞因子的组合。在其他实施方式中，细胞因子分子选自白介素2(IL-2)，白介素12(IL-12)，白介素15(IL-15)，白介素18(IL-18)，白介素21(IL-21)，或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。
[0402] 在一些实施方式中，细胞因子或生长因子分子可以是选自下列的一种或多种的Treg抑制分子：Ifn-γ，IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-12，IL-21，IL-23，IL-27或TNF-α。Ifn-γ促进Treg易碎性，并可以减少肿瘤微环境中的抑制作用。IL-1和IL-6，IL-21和IL-23可以诱导Treg产生促炎性IL-17和/或将Treg转化为Th17 T细胞亚群。IL-12促进Treg中Ifn-γ的产生，导致Treg易碎和普遍的促免疫原性环境。TNF-α既损害Treg的发育又降低现有Treg的功能。因此，这些细胞因子可损害Treg发育，降低Treg功能或诱导Treg转分化为免疫活化细胞。
[0403] 在癌症的情况中，需要降低Treg活性的情况下，可以通过Treg特异性IFM全身性地递送一种或多种Treg抑制性细胞因子以总体上降低Treg抑制。双特异性靶向(例如，CD4：CD25，CD4：NRP1，CD4：CD39)可用于将全身注射的IFM体内引导至Treg细胞。在实施例中描述了靶向特定细胞群的概念。这些IFM然后减少Treg数目和/或功能，并驱动它们进入促炎或免疫原性状态。
[0404] 另外，可以将Treg特异性IFM离体加载到抗肿瘤免疫细胞上，并通过反式或旁分泌信号转导传递至Treg。在这种情况下，抗肿瘤细胞通过增加Treg抑制性细胞因子的局部浓度来创建局部抗抑制环境。这可以促进局部而不是整体的Treg功能障碍。
[0405] IL-15分子
[0406] 在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子，例如IL-15，例如人IL-15的全长，片段或变体。在实施方式中，IL-15分子是野生型人IL-5，例如具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在其他实施方式中，IL-15分子是人IL-5的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。
[0407] 在一些实施方式中，IL-15变体在位置45、51、52或72处包含突变或由其组成，例如，如US 2016/0184399中所述。在一些实施方式中，IL-15变体包含N，S或L至D，E，A，Y或P之一的取代或由其组成。在一些实施方式中，所述突变选自L45D，L45E，S51D，L52D，N72D，N72E，N72A，N72S，N72Y或N72P(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)。如本领域技术人员将意识到的，位置的任何组合都可以被突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含两个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含三个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含四个，五个或六个或更多个突变。
[0408] 在一些实施方式中，IL-15分子包含突变，例如，如本文SEQ ID NO：11所示的N72D点突变。在一些实施方式中，IL-15分子包含与SEQ ID NO：11具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列包含相对于野生型人IL-15的N72D突变，并具有IL-15Rα结合活性。
[0409] 在一些实施方式中，IL-15变体在氨基酸位置8、10、61、64、65、72、101或108(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)包含一个或多个突变或由其组成。在一些实施方式中，与野生型IL-15相比，IL-15变体具有增加的活性。在一些实施方式中，与野生型IL-15相比，IL-15变体具有降低的活性。在一些实施方式中，与野生型IL-15相比，IL-15变体具有降低约两倍，四倍，十倍，20倍，40倍，60倍，100倍或超过100倍的活性。在一些实施方式中，所述突变选自D8N，K10Q，D61N，D61H，E64H，N65H，N72A，N72H，Q101N，Q108N或Q108H(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)。如本领域普通技术人员将意识到的，位置的任何组合可以被突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含两个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含三个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含四个，五个或六个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体在位置61和64处包含突变。在一些实施方式中，在位置61和64处的突变为D61N或D61H和E64Q或E64H。在一些实施方式中，IL-15变体在位置61和108处包含突变。在一些实施方式中，在位置61和108处的突变为D61N或D61H和Q108N或Q108H。
[0410] 在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在一个实施方式中，细胞因子分子包含如本文所述的IL-15受体或其片段(例如，IL-15受体α的IL-15结合结构域)。在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子，例如本文所述的IL-15或IL-15超激动剂。如本文所用，与天然存在的细胞因子相比，细胞因子分子的“超激动剂”形式显示增加，例如至少10％，20％，30％的活性。示例性的超激动剂是IL-15SA。在一些实施方式中，IL-15SA包含IL-15和IL-15受体的IL-15结合片段，例如IL-15受体α或其IL-15结合片段的复合物，例如，如本文所述。在其他实施方式中，细胞因子分子还包含任选地与免疫球蛋白Fc或抗体分子偶联的受体结构域，例如IL-15Rα的胞外结构域。在实施方式中，细胞因子分子是如WO 2010/059253中所述的IL-15超激动剂(IL-15SA)。在一些实施方式中，细胞因子分子包含IL-15和与Fc融合的可溶性IL-15受体α结构域(例如，sIL-15Ra-Fc融合蛋白)，如Rubinstein等，PNAS 103:24p.9166-9171(2006)。
[0411] IL-15分子可进一步包含多肽，例如细胞因子受体，例如细胞因子受体结构域，和第二异源结构域。在一个实施方式中，异源结构域是免疫球蛋白Fc区。在其他实施方式中，异源结构域是抗体分子，例如，Fab片段，FAB2片段，scFv片段或亲和体片段或衍生物，例如sdAb(纳米抗体)片段，重链抗体片段。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的N-末端，并且在其他实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的C-末端。
[0412] 野生型IL-15受体α序列以及该序列的片段和变体在下面列出。
[0413] 野生型IL-15受体α序列(Genbank登记号AAI21141.1)：SEQ ID NO：41。
[0414] 野生型IL-15受体α胞外结构域(登录号Q13261的部分)：SEQ ID NO：63。
[0415] 异构体CRA_d IL-15受体α胞外结构域(登录号EAW86418的部分)：SEQ ID NO：64。
[0416] 野生型IL-15受体α序列在上文以SEQ ID NO：41提供。IL-15受体α包含胞外结构域，23个氨基酸的跨膜区段和39个氨基酸的细胞质尾。IL-15受体α的胞外结构域以SEQ ID NO：63提供。
[0417] 在其他实施方式中，可以使用IL-15激动剂。例如，IL-15受体的激动剂，例如针对IL-15受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引起天然存在的细胞因子的至少一种活性。在实施方式中，IL-15受体或其片段来自人或非人动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类。
[0418] IL-15受体αsushi结构域
[0419] 野生型IL-15受体α序列在上文以SEQ ID NO：64提供。IL-15受体α包含胞外结构域，23个氨基酸的跨膜区段和39个氨基酸的细胞质尾。sushi结构域已经在包括例如Bergamaschi等，(2008),JBC卷283，第7期，第4189-4199页；Wei等，(2001),Journal of Immunology 167:277-282；Schluns等，(2004)PNAS卷110(15)5616–5621；US 2016/0184399的文献中进行了描述(其各自内容通过引用纳入本文)。
[0420] IL-15受体α的胞外结构域以SEQ ID NO：63提供。IL-15受体α的胞外结构域包含与IL-15结合的结构域，本文称为sushi结构域。通用sushi结构域，也称为补体控制蛋白(CCP)模块或短共有重复序列(SCR)，是在几种蛋白中发现的蛋白结构域，包括补体系统的多个成员。sushi结构域采用β三明治折叠，由四个高度保守的半胱氨酸残基的第一个和第四个半胱氨酸所界定，包含约60个氨基酸的序列延伸(Norman，Barlow等，J Mol Biol.1991年6月20；219(4)：717-25)。IL-15Rα中由sushi结构域的第一和第四半胱氨酸界定的氨基酸残基包含62个氨基酸的多肽，我们将其称为最小结构域(SEQ ID NO：52)。在最小sushi结构域的N和C端包括IL-15Rα的其他氨基酸，例如包含N末端Ile和Thr以及C末端Ile和Arg残基，形成
65个sushi氨基酸结构域(SEQ ID NO：9)。
65个sushi氨基酸结构域(SEQ ID NO：9)。
[0421] 本文所述的sushi结构域可包含相对于野生型sushi结构域的一个或多个突变。例如，IL-15Ra的残基77在野生型基因中是亮氨酸(并且在SEQ ID NO：41中加下划线)，但是可以突变为异亮氨酸(L77I)。因此，以SEQ ID NO：65提供了包含L77I的最小sushi结构域(编号参考SEQ ID NO：41的野生型IL-15Ra)。以SEQ ID NO：66提供了包含L77I的延伸的sushi结构域(编号参考SEQ ID NO：41的野生型IL-15Ra)。
[0422] 最小sushi结构域，野生型：
[0423] CPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKC(SEQ ID NO:52)
[0424] 延伸的sushi结构域，野生型：
[0425] ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:9)
[0426] 最小sushi结构域，L77I：
[0427] CPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVINKATNVAHWTTPSLKCI(SEQ ID NO:65)
[0428] 延伸的sushi结构域，L77I：
[0429] ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVINKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:66)
[0430] 在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的65-171个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。
在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的多至171个氨基酸或与其具有至少
80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。
在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-
130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-
130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸或与其具有至少80％，85％，
90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、
62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-
110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸组成。在一些实施方式中，sushi结构域包含或由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的多至171个氨基酸或与其具有至少
80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。
在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-
130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-
130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸或与其具有至少80％，85％，
90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、
62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-
110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸组成。在一些实施方式中，sushi结构域包含或由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成。
[0431] 在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171个氨基酸或相对于其具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)，并具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：5的多至171个氨基酸或相对于其具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)，并具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-
171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如取代)且具有IL-15结合活性的序列组成。
171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如取代)且具有IL-15结合活性的序列组成。
[0432] 在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少65个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的一部分或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
[0433] 在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：66的一部分或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。
[0434] 在实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少10、20、30、40、50、60、62、65、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个连续氨基酸，或相对于其具有L77I突变的序列。在实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、
60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160或
160-170个连续氨基酸，或相对于其具有L77I突变的序列组成。
60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160或
160-170个连续氨基酸，或相对于其具有L77I突变的序列组成。
[0435] 在实施方式中，sushi结构域是来自人或非人动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类的sushi结构域。
[0436] 在一些实施方式中，多肽可以具有第二异源结构域，例如Fc结构域或Fab结构域。
[0437] 在一些实施方式中，包含IL-15受体或其片段的多肽包含Fc结构域。在实施方式中，Fc结构域是效应减弱的Fc结构域，例如人IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID NO：54的人IgG2 Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。
[0438] 在实施方式中，效应减弱的Fc结构域具有降低的效应活性，例如，与野生型IgG1 Fc结构域相比，例如与SEQ ID NO：67的野生型IgG1 Fc结构域相比。在一些实施方式中，效应活性包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在实施方式中，例如，与SEQ ID NO：67的野生型IgG1 Fc结构域相比，在ADCC测定中效应活性降低了10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。在一些实施方式中，效应活性包括补体依赖性细胞毒性(CDC)。在实施方式中，在CDC测定例如在Armor等，“缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities)”，Eur J Immunol(1999)29：2613-24所述的CDC中，例如，与SEQ ID NO：67的野生型IgG1 Fc结构域相比，效应活性降低了10％，
20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。
20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。
[0439] 在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：67的IgG1 Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
[0440] 在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：68的IgG2恒定区或或其片段，与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
[0441] 在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：55的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在实施方式中，使用Kabat编号系统，Fc结构域包含A330S和P331S突变之一或两者。在实施方式中，Fc结构域是Armor等，“缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities)”Eur J Immunol(1999)29：2613-24中描述的那个结构域。
[0442] 在一些实施方式中，Fc结构域具有二聚化活性。
[0443] 在一些实施方式中，Fc结构域是IgG结构域，例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。
[0444] 在一些实施方式中，纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：56的序列的蛋白质(sushi-IgG2Da-Fc)或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。
[0445] 在一些实施方式中，IFM包括本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9)和本文所述的Fc结构域，例如IgG2 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：54或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列)。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和本文所述的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：67的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和IgG2 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：54的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：67的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，
97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
[0446] 在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和SEQ ID NO：56的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和SEQ ID NO：56的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包含sushi-IgG2Da-Fc蛋白，其具有SEQ ID NO：56的序列或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
[0447] 在实施方式中，IL-15分子是PCT国际申请公开号WO2017/027843中描述的分子，其通过引用全文纳入本文。
[0448] IL-12分子
[0449] 白介素-12(IL-12)是由p35和p40亚基组成的异二聚体细胞因子，分别由2个独立的基因IL-12A和IL-12B编码。IL-12参与将幼稚T细胞分化为Th1细胞。它被称为T细胞刺激因子，其可以刺激T细胞的生长和功能。它刺激T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并减少IL-4介导的IFN-γ抑制。产生IL-12的T细胞具有一个共受体CD30，该受体与IL-12活性有关。
[0450] IL-12在NK细胞和T淋巴细胞的活性中起重要作用。IL-12介导NK细胞和CD8细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性增强。NK细胞中IL-2和IL-12的信号转导之间似乎也存在联系。IL-2刺激两种IL-12受体IL-12R-β1和IL-12R-β2的表达，从而维持NK细胞中与IL-12信号转导有关的关键蛋白的表达。IFN-γ的产生和靶细胞的杀伤证明了增强的功能反应。
[0451] IL-12也具有抗血管生成活性，这意味着它可以阻断新血管的形成。它通过增加干扰素γ的产生来做到这一点，这又增加了一种被称为诱导蛋白-10(IP-10或CXCL10)的趋化因子的产生。IP-10然后介导这种抗血管生成作用。由于其诱导免疫应答的能力及其抗血管生成活性，人们一直在测试IL-12作为一种可能的抗癌药物。IL-12与银屑病和炎症性肠病之间可能存在可用于治疗的联系。
[0452] IL-12与IL-12受体结合，后者是由IL-12R-β1和IL-12R-β2形成的异二聚体受体。IL-12R-β2被认为在IL-12功能中起关键作用，因为它被发现在活化的T细胞上，并受到促进Th1细胞发育的细胞因子的刺激和被促进Th2细胞发育的细胞因子的抑制。结合后，IL-12R-β2被酪氨酸磷酸化，并提供激酶Tyk2和Jak2的结合位点。这些对于激活关键的转录因子蛋白(例如STAT4)很重要，该蛋白与T细胞和NK细胞的IL-12信号转导有关。
[0453] IL-12是一种有效的细胞因子，具有重塑实体瘤中抗炎环境的潜力。然而，其临床应用受到可溶给药或工程改造分泌IL-12的过继转移T细胞产生的严重毒性的限制。本文公开的系连融合体(TF)能够改善对细胞因子剂量和生物分布的控制。在体外模型系统中，IL12-TF细胞因子在T细胞表面提供持久的IL-12加载，并在IL-12受体下游提供持续的T细胞活化和信号转导。反过来，这可以激活先天免疫和适应性免疫。
[0454] 系连融合体中的IL-12可以是包含IL-12A和IL-12B亚基的单链形式。在一些实施方式中，IL-12可作为非单链存在(即，作为IL-12的天然形式的IL-12A和IL-12B的异二聚体)。例如，TF可以通过三个蛋白亚基(Fab重链，Fab轻链w/IL-12A(或IL-12B)和IL-12B(或IL-12A))的共表达制备。
[0455] 免疫细胞靶向部分
[0456] 在某些实施方式中，本文公开的免疫刺激融合分子包括免疫细胞靶向部分。免疫细胞靶向部分可以选自抗体分子(例如，如本文所述的抗原结合结构域)，受体或受体片段，或配体或配体片段，或其组合。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分与免疫细胞(例如，存在于免疫细胞表面上的分子，例如抗原)缔合，例如结合。在某些实施方式中，免疫细胞靶向部分将本文公开的免疫刺激融合分子靶向，例如引导至免疫(例如淋巴细胞，例如T细胞)。
[0457] 在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自抗体分子(例如，完整抗体(例如，包括至少一个且优选地两个完整的重链，以及至少一个且优选地两个完整的轻链的抗体)或抗原结合片段(例如Fab，F(ab')2，Fv，单链Fv，单域抗体，双抗体(dAb)，二价抗体，或双特异性抗体或其片段，其单结构域变体或骆驼科动物抗体))，非抗体支架，或与CD45受体结合的配体。
[0458] 在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分将IFM靶向在免疫细胞表面上表达的持久的，丰富的和/或再循环的细胞表面受体和分子。这些受体/分子包括,例如CD45(通过例如BC8(ACCT：HB-10507)，9.4(ATTC：HB-10508)，GAP8.3(ATTC：HB-12)，单克隆抗体)，CD8(通过OKT8单克隆抗体)，跨膜整合素分子CD11a(通过MHM24单克隆抗体)或CD18(通过嵌合1B4单克隆抗体)。在其他优选的实施方式中，靶向部分指向选自CD4，CD8，CD11a，CD18，CD19，CD20和CD22的标志物。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自与CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD25，CD127，CD137，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8或CCR10结合的抗体分子，例如抗原结合结构域，非抗体支架或配体。
[0459] “CD45”，也称为白细胞共同抗原，是指人CD45蛋白及其种类，同种型和其他序列变体。因此，CD45可以是天然的全长蛋白质，或者可以是保留了天然蛋白质的至少一种生物学活性的截短的片段或序列变体(例如，天然存在的同种型或重组变体)。CD45是在白细胞上表达的受体连接的蛋白酪氨酸磷酸酶，并且在这些细胞的功能中起重要作用(综述于Altin,JG(1997)Immunol Cell Biol.75(5):430-45，在此通过引用纳入)。例如，CD45的胞外结构域在T细胞上以几种不同的同种型表达，并且表达的特定同种型取决于细胞的特定亚群，它们的成熟状态和抗原暴露。CD45的表达对于通过TCR激活T细胞很重要，并且不同的CD45同种型显示不同的支持T细胞激活的能力。
[0460] “CD4”是II类MHC的共受体(与TCR，T细胞受体一起)；在免疫细胞如T辅助细胞，单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞的表面上发现。CD4 T细胞对于实现对病原体的调节有效免疫应答至关重要。幼稚CD4 T细胞在与抗原-MHC复合物相互作用后被激活，并分化成特定的亚型，这主要取决于微环境的细胞因子。除了经典的T-辅助1和T-辅助2，还鉴定了其他子集，包括T-辅助17，调节性T细胞(Treg)，滤泡性T细胞和T-辅助9，每个子集均具有特征性的细胞因子谱。CD4 T细胞具有多种功能，其范围包括先天免疫系统细胞，B淋巴细胞，细胞毒性T细胞以及非免疫细胞的激活，并且在抑制免疫应答中也起着关键作用。参见例如Rishi Vishal等，“CD4+T细胞：分化和功能(CD4+T Cells:Differentiation and Functions)”，Clinical and Developmental Immunology,卷2012，文章编号925135,12页,2012.doi:10.1155/2012/925135。
[0461] “CD8”是跨膜糖蛋白，其充当T细胞受体(TCR)的共受体。像TCR一样，CD8与主要的组织相容性复合物(MHC)分子结合，但对I类MHC蛋白具有特异性。该蛋白质有两种同种型，即α和β，分别由不同的基因编码。在人中，这两个基因都位于2号染色体的2p12位置。CD8共受体主要在细胞毒性T细胞的表面表达，但也可以在自然杀伤细胞，皮质胸腺细胞和树突状细胞中发现。它在T细胞淋巴母细胞淋巴瘤和色素减少的蕈样真菌病中表达。为了起作用，CD8形成由一对CD8链组成的二聚体。CD8的最常见形式由CD8-α和CD8-β链组成，免疫球蛋白超家族的两个成员均具有通过细杆连接到膜的免疫球蛋白可变(IgV)样胞外结构域和胞内尾。CD8-α链很少见的同型二聚体也在某些细胞上表达。CD8-α的胞外IgV样结构域与I类MHC分子的α3部分相互作用。这种亲和力使细胞毒性T细胞的T细胞受体和靶细胞在抗原特异性激活过程中紧密结合在一起。具有CD8表面蛋白的细胞毒性T细胞称为CD8 T细胞。参见例如，Leahy DJ等，(1992年3月)“人T细胞共受体CD8在2.6A分辨率下的可溶形式的晶体结构(Crystal structure of a soluble form of the human T cell coreceptor CD8 at 2.6A resolution)”Cell.68(6):1145–62；Gao G等，(2000)“共受体CD8和I类MHC的分子相互作用：与T细胞受体功能协调的分子基础(Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I:the molecular basis for functional coordination with the T-cell receptor)”Immunol Today.21(12):630–6；和Devine L等，(1999)“相对于MHC I类，CD8αβ的Ig结构域的取向(Orientation of the Ig domains of CD8 alpha beta
relative to MHC class I)”J Immunol.162(2):846–51。
relative to MHC class I)”J Immunol.162(2):846–51。
[0462] “CD11a”也称为“整合素αL(ITGAL)”和“LFA-1的α亚基”是一种膜糖蛋白，其通过与ICAM-1相互作用提供细胞-细胞粘附。ITGAL基因编码整合素αL链。整合素是由α链和β链组成的异二聚体内在膜蛋白。含I结构域的α整合素与β2链(ITGB2)结合形成整合素淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，该抗原在所有白细胞上表达。LFA-1通过与配体ICAM 1-3(细胞间粘附分子1至3)相互作用，在白细胞细胞间粘附中发挥重要作用，并在淋巴细胞共刺激信号转导中起作用。已经发现该基因的两个编码不同同种型的转录物变体。参见例如，Cornwell RD等，白细胞功能相关抗原1(LFA-1或CD11a)启动子的描述(Description of the leukocyte function-associated antigen 1(LFA-1 or CD11a)promoter)。Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1993；90(9):4221-4225；和Bose TO等，CD11a响应单核球增多性李斯特菌感染调节效应CD8 T细胞分化和中枢记忆发育(CD11a Regulates Effector CD8 T Cell Differentiation and Central Memory Development in Response to Infection with Listeria
monocytogenes)。Flynn JL编著《，感染和免疫》(Infection and Immunity).2013；81(4):
1140-1151.doi:10.1128/IAI.00749-12。
monocytogenes)。Flynn JL编著《，感染和免疫》(Infection and Immunity).2013；81(4):
1140-1151.doi:10.1128/IAI.00749-12。
[0463] “CD18”也称为整合素β2链(ITGB2)，是四种不同结构的β亚基：LFA-1(与CD11a配对)；巨噬细胞1抗原(与CD11b配对)；整合素αXβ2(与CD11c配对)；和整合素αDβ2(与CD11d配对)。人缺乏CD18会导致白细胞粘附缺乏症，这是一种由缺乏白细胞从血液渗入组织所定义的疾病。还发现了可溶形式的β2整合素。可溶性β2整合素与配体结合，血浆水平与自身免疫性疾病脊椎关节炎的疾病活性呈负相关。参见，例如，Mazzone A1等，白细胞CD11/CD18整合素：生物学和临床相关性(Leukocyte CD11/CD18 integrins:biological and clinical relevance).Haematologica.1995年3月至4月；80(2)：161-75；和Gjelstrup等，(2010年9月8日)“滑膜炎症过程中从白细胞膜中脱落的大量功能活跃的CD11/CD18整合素复合物通过差异表位暴露区分了三种类型的关节炎(Shedding of Large Functionally Active
CD11/CD18 Integrin Complexes from Leukocyte Membranes during Synovial
Inflammation Distinguishes Three Types of Arthritis through Differential
Epitope Exposure)”.The Journal of Immunology.185(7):4154–4168。
CD11/CD18 Integrin Complexes from Leukocyte Membranes during Synovial
Inflammation Distinguishes Three Types of Arthritis through Differential
Epitope Exposure)”.The Journal of Immunology.185(7):4154–4168。
[0464] “CD20”是在B细胞上发现的III型跨膜蛋白，在细胞膜中形成钙通道，从而使细胞活化所需的钙流入；在B细胞淋巴瘤，毛细胞白血病和B细胞慢性淋巴细胞性白血病中表达。对于这些疾病的治疗很重要，因为存在针对CD20的抗体：利妥昔单抗和奥法木单抗，还有几种正在开发中。同样，抗CD20单克隆抗体，奥美珠单抗(Ocrelizumab)也正在多发性硬化症的试验中。参见例如Cragg MS等，(2005)“CD20的生物学及其作为mAb治疗靶标的潜力(The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy)”.Current
Directions in Autoimmunity.Current Directions in Autoimmunity.8:140–74；和Kuijpers TW等，(2010年1月)“人CD20缺乏症会导致T细胞非依赖性抗体应答受损(CD20 deficiency in humans results in impaired T cell-independent antibody
responses)”.The Journal of Clinical Investigation.120(1):214–22。
Directions in Autoimmunity.Current Directions in Autoimmunity.8:140–74；和Kuijpers TW等，(2010年1月)“人CD20缺乏症会导致T细胞非依赖性抗体应答受损(CD20 deficiency in humans results in impaired T cell-independent antibody
responses)”.The Journal of Clinical Investigation.120(1):214–22。
[0465] 靶向检查点抑制剂的部分
[0466] 在一些实施方式中，免疫刺激部分或靶向部分(例如抗体分子)结合免疫抑制剂的抑制剂，例如检查点抑制剂的抑制剂，例如PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3，CTLA-4，抑制性KIR，CD276，VTCN1，BTLA/HVEM，HAVCR2和ADORA2A，例如，如US 2016/0184399中所述，其通过引用纳入本文。在实施方式中，检查点抑制剂存在于免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞上。
[0467] 在一些实施方式中，免疫刺激或靶向部分结合PD-1。例如，匹利珠单抗(Pidilizumab)和其他抗PD-1抗体在Rosenblatt,J.等，(2011)J Immunotherapy 34(5)：
409-18，US 7,695,715，US 7,332,582和US 8,686,119中公开，通过引用全文纳入本文。
MEDI0680和其他抗PD-1抗体在US 9,205,148和WO 2012/145493中公开，其通过引用全文纳入。其他抗PD-1抗体包括例如在WO 2010/027827WO 2011/066342，WO 2015/112800，WO
2016/092419，WO 2015/085847，WO 2014/179664，WO 2014/194302，WO 2014/209804，WO
2015/200119，US 8,735,553，US 7,488,802，US 8,927,697，US 8,993,731和US 9,102,727中描述的那些，通过引用将其全部内容纳入本文。
409-18，US 7,695,715，US 7,332,582和US 8,686,119中公开，通过引用全文纳入本文。
MEDI0680和其他抗PD-1抗体在US 9,205,148和WO 2012/145493中公开，其通过引用全文纳入。其他抗PD-1抗体包括例如在WO 2010/027827WO 2011/066342，WO 2015/112800，WO
2016/092419，WO 2015/085847，WO 2014/179664，WO 2014/194302，WO 2014/209804，WO
2015/200119，US 8,735,553，US 7,488,802，US 8,927,697，US 8,993,731和US 9,102,727中描述的那些，通过引用将其全部内容纳入本文。
[0468] 在一些实施方式中，免疫刺激或靶向部分结合PD-L1。例如，阿特朱单抗(Atezolizumab)和其他抗PD-L1抗体在US 8,217,149中公开，其通过引用全文纳入本文。阿维鲁单抗(Avelumab)和其他抗PD-L1抗体在WO 2013/079174中公开，其通过引用全文纳入本文。德瓦鲁单抗(Durvalumab)和其他抗PD-L1抗体已在US 8,779,108中公开，其通过引用全文纳入本文。BMS-936559和其他抗PD-L1抗体在US 7,943,743和WO 2015/081158中公开，其通过引用全文纳入。其他抗PD-L1抗体包括例如在WO 2015/181342，WO 2014/100079，WO
2016/000619，WO 2014/022758，WO 2014/055897，WO 2015/061668，WO 2013/079174，WO
2012/145493，WO 2015/112805，WO 2015/109124，WO 2015/195163，US 8,168,179，US 8,
552,154，US 8,460,927和US 9,175,082中所述的那些，其通过引用全文纳入。
2016/000619，WO 2014/022758，WO 2014/055897，WO 2015/061668，WO 2013/079174，WO
2012/145493，WO 2015/112805，WO 2015/109124，WO 2015/195163，US 8,168,179，US 8,
552,154，US 8,460,927和US 9,175,082中所述的那些，其通过引用全文纳入。
[0469] 在一些实施方式中，免疫刺激或靶向部分结合LAG-3。LAG-3抗体在本领域已有报道，例如BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)，TSR-033(Tesaro)，MK-4280(Merck&Co)或REGN3767(Regeneron)。IMP731和其他抗LAG-3抗体在WO 2008/132601和US 9,244,059中公开，其通过引用全文纳入。其他抗LAG-3抗体包括例如在WO 2008/132601，WO 2010/019570，WO 2014/140180，WO 2015/116539，WO 2015/200119，WO 2016/028672，US 9,244,059，US 9,505,839中所述的那些，其通过引用全文纳入本文。
[0470] 在一些实施方式中，免疫刺激或靶向部分结合TIM-3。在一些实施方式中，TIM-3靶向部分选自TSR-022(Tesaro)或LY3321367(Eli Lilly)。APE5137，APE5121和其他抗TIM-3抗体公开于WO 2016/161270，在此通过引用全文纳入本文。其他抗TIM-3抗体包括例如在WO 2016/111947，WO 2016/071448，WO 2016/144803，US 8,552,156，US 8,841,418和US 9,
163,087中描述的那些，其通过引用全文纳入本文。
163,087中描述的那些，其通过引用全文纳入本文。
[0471] 在一些实施方式中，免疫刺激或靶向部分结合CTLA-4。抗体伊匹木单抗和其他抗CTLA-4抗体在US 6,984,720中公开，其通过引用全文纳入本文。抗体曲美木单抗(Tremelimumab)和其他抗CTLA-4抗体在US 7,411,057中公开，其通过引用全文纳入本文。
[0472] 抗体分子
[0473] 本文所述的免疫刺激融合分子可包含一种或多种抗体分子。例如，免疫细胞衔接物可以包含抗体分子。在一个实施方式中，抗体分子结合癌症抗原，例如肿瘤抗原或基质抗原。在一些实施方式中，癌症抗原是，例如哺乳动物，例如人癌症抗原。在其他实施方式中，抗体分子结合免疫细胞抗原，例如哺乳动物，例如人免疫细胞抗原。例如，抗体分子特异性结合癌症抗原或免疫细胞抗原上的表位，例如线性或构象表位。
[0474] 在一个实施方式中，抗体分子是单特异性抗体分子，并结合单个表位。例如，具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个序列结合相同的表位。
[0475] 在另一个实施方式中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方式中，第一和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方式中，第一和第二表位重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方式中，多特异性抗体分子包含第三，第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子，三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
[0476] 在一个实施方式中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方式中，第一和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方式中，第一和第二表位重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或Fab或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其Fab或其片段。
[0477] 在一个实施方式中，抗体分子包含双抗体，和单链分子，以及抗体的抗原结合片段(例如，Fab，F(ab’)2和Fv)。例如，抗体分子可包含重(H)链可变区序列(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区序列(本文中缩写为VL)。在一个实施方式中，抗体分子包含重链和轻链或由重链和轻链组成(在本文中称为半抗体。在另一个实例中，抗体分子包两条重(H)链可变结构域序列和两条轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(二价且单或双特异性)、三抗体(三价且单或多特异性)、以及嵌合或人源化抗体，其可通过修饰完整抗体或采用重组DNA技术从头合成的那些产生。这些功能性抗体片段保留了选择性结合其相应抗原或受体的能力。抗体和抗体片段可来自任何抗体类型(包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，并来自任何抗体亚型(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子的制剂可以是单克隆的或多克隆的。抗体分子还可为人、人源化、CDR移植或体外产生的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如，κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白(Ig)”与本文中的术语“抗体”可互换使用。
[0478] 抗体分子的抗原结合片段的示例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；
(v)双抗体(diabody，dAb)片段，其由VH结构域组成；(vi)骆驼或骆驼源化可变结构域；
(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等，(1988)Science 242:423-426；以及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)；(viii)单域抗体。这些抗体片段可使用本领域普通技术人员所知的常规技术获得，并且筛选与完整抗体具有相同应用的片段。
(v)双抗体(diabody，dAb)片段，其由VH结构域组成；(vi)骆驼或骆驼源化可变结构域；
(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等，(1988)Science 242:423-426；以及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)；(viii)单域抗体。这些抗体片段可使用本领域普通技术人员所知的常规技术获得，并且筛选与完整抗体具有相同应用的片段。
[0479] 抗体分子包括完整分子及其功能片段。可改变(例如突变)抗体分子的恒定区以修饰该抗体的性能，例如增加/提高或减少/降低如下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。
[0480] 抗体分子也可以是单域抗体。单域抗体可包括其互补决定区为单域多肽一部分的抗体。实例包括但不限于：重链抗体、天然缺失轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单域抗体、工程改造的抗体和非衍生自抗体的单结构域骨架。单域抗体可为本领域中任何单域抗体或任何未来的单域抗体。单域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于：小鼠、人、骆驼、大羊驼、鱼、鲨鱼、羊、兔和牛。根据本公开的另一方面，单域抗体是已知为缺失轻链的重链抗体的天然存在单域抗体。此类单域抗体公开于例如WO9404678。清楚起见，衍生自天然缺失轻链的重链抗体的该可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体以区别于四链免疫球蛋白的常规VH。该VHH分子可衍生自骆驼科(Camelidae)物种中生长的抗体，例如衍生自骆驼、大羊驼、单峰驼、羊驼和驮马。除了骆驼科，其他物种也可产生天然缺失轻链的重链抗体；本公开的范围也包括了这些VHH。
[0481] 抗体分子可包括非抗体支架和抗体模拟物。示例性的非抗体支架包括：载脂蛋白(例如抗运载蛋白(anticalin))，亲和体，纤连蛋白(例如单抗体(monobody)或阿迪连接素(Adnectin))，结蛋白，锚蛋白重复序列(例如DARPins)和A域(例如avimer)。
[0482] VH和VL区可进一步细分为超变区，称为“互补决定区(CDR)”，其间间插更保守的被称为“框架区”(FR或FW)的区。
[0483] 已采用多种方法精确来划定框架区和CDR的范围(参见Kabat,E.A.,等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(《热门免疫学蛋白质序列》，第5版，美国公共卫生署，国立卫生研究院，公开号91-3242；Chothia,C.等，(1987)
J.Mol.Biol.196:901-917；以及牛津分子的AbM抗体造模软件(Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software)所用的AbM定义。总体上参见例如“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”(《抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析》)。于《：抗体工程实验室手册》(Antibody Engineering Lab Manual)(Duebel,S.和Kontermann,R.编，Springer-Verlag,Heidelberg)。
J.Mol.Biol.196:901-917；以及牛津分子的AbM抗体造模软件(Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software)所用的AbM定义。总体上参见例如“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”(《抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析》)。于《：抗体工程实验室手册》(Antibody Engineering Lab Manual)(Duebel,S.和Kontermann,R.编，Springer-Verlag,Heidelberg)。
[0484] 本文所用术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和性的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中有三个CDR(HCDR1，HCDR2，HCDR3)，每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1，LCDR2，LCDR3)。
[0485] 给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多已知方案中的任何一种编号来确定，包括Kabat等，(1991)，“热门免疫学蛋白质序列(Sequences of Proteins of
Immunological Interest)”，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。
Immunological Interest)”，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。
[0486] 例如，在Kabat的情况下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)，50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia的情况下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)，52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)，50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。
[0487] 各VH和VL通常包含三个CDR和四个FR，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。
[0488] 抗体分子可为多克隆或单克隆抗体。
[0489] 本文所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物针对具体表位显示单一的结合特异性和亲和力。单克隆抗体的制备可采用杂交瘤技术或不采用杂交瘤技术的方法(例如重组法)。
[0490] 可重组产生抗体，例如通过任何噬菌体展示或组合方法(combinatorial method)来产生。
[0491] 各种用于生成抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域已知的(如下所述，例如，Ladner等，美国专利号5,223,409；Kang等，国际公开号WO 92/18619；Dower等，国际公开号WO 91/17271；Winter等，国际公开号WO 92/20791；Markland等，国际公开号WO 92/15679；Breitling等，国际公开号WO 93/01288；McCafferty等，国际公开号WO 92/01047；Garrard等，国际公开号WO 92/09690；Ladner等，国际公开号WO 90/02809；Fuchs等，(1991)Bio/Technology 9:1370 1372；Hay等，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等，(1989)Science 246:1275-1281；Griffths等，(1993)同上；Hawkins等，(1992)J Mol Biol
226:889；Clackson等，(1991)Nature 352:624；Gram等，(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology 9:13731377；Hoogenboom等，(1991)Nuc Acid Res 19:4133-
4137；和Barbas等，(1991)PNAS 88:7978-7982，其内容在此全部引入以供参考)。
226:889；Clackson等，(1991)Nature 352:624；Gram等，(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology 9:13731377；Hoogenboom等，(1991)Nuc Acid Res 19:4133-
4137；和Barbas等，(1991)PNAS 88:7978-7982，其内容在此全部引入以供参考)。
[0492] 在一个实施方式中，抗体是完整人抗体(例如由小鼠产生的抗体，该小鼠在已通过遗传工程改造以产生源自人免疫球蛋白序列的抗体)、或非人抗体，例如啮齿类(小鼠或大鼠)、羊、灵长类(例如猴)、骆驼抗体。优选地，非人抗体是啮齿类抗体(小鼠或大鼠抗体)。制备啮齿类抗体的方法是本领域已知的。
[0493] 人单克隆抗体可采用携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠而不是小鼠体系产生。来自用感兴趣抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞被用于产生分泌人mAb的杂交瘤，这些人mAb对来自人蛋白质的表位具有特异性亲和力(参见例如，Wood等，国际申请号WO 91/
00906,Kucherlapati等，PCT公开号WO 91/10741；Lonberg等，国际申请号WO 92/03918；Kay等，国际申请号92/03917；Lonberg等，1994Nature 368:856-859；Green,L.L.等，
1994Nature Genet.7:13-21；Morrison,S.L.等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-
6855；Bruggeman等，1993Year Immunol 7:33-40；Tuaillon等，1993 PNAS 90:3720-3724；
Bruggeman等，1991Eur J Immunol 21:1323-1326)。
00906,Kucherlapati等，PCT公开号WO 91/10741；Lonberg等，国际申请号WO 92/03918；Kay等，国际申请号92/03917；Lonberg等，1994Nature 368:856-859；Green,L.L.等，
1994Nature Genet.7:13-21；Morrison,S.L.等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-
6855；Bruggeman等，1993Year Immunol 7:33-40；Tuaillon等，1993 PNAS 90:3720-3724；
Bruggeman等，1991Eur J Immunol 21:1323-1326)。
[0494] 抗体分子可为其中的可变区或其部分(例如CDR)在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生的抗体。嵌合、CDR移植以及人源化抗体均包含在本公开内容中。本公开内容包括在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生并随后(例如在可变框架或恒定区中)进行修饰以降低在人体内抗原性的抗体分子。例如，可以使用本领域已知的技术将抗人CD45抗体例如9.4、4B2和BC8人源化，以制备本文公开的系连融合体。
[0495] “有效/效果上的人(effectively human)”蛋白是基本上不引发中和性抗体应答(例如人抗鼠抗体(HAMA)应答)的蛋白质。HAMA在许多情况下(例如若抗体分子在例如治疗慢性或复发性疾病症状时被反复施用的情况下)会造成问题。HAMA应答可造成反复给予抗体因血清抗体清除率提高(参见例如Saleh等，Cancer Immunol.Immunother.32:180-190(1990))以及潜在的过敏反应(参见例如LoBuglio等，Hybridoma,5:5117-5123(1986))而可能失去效果。
[0496] 嵌合抗体(例如，含有小鼠可变结构域和人恒定结构域的抗体)可以通过本领域已知的重组DNA技术来制备(参见Robinson等，国际专利公开号PCT/US86/02269；Akira,等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等，(1988Science 240:1041-1043)；Liu等，(1987)PNAS
84:3439-3443；Liu等，1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等，(1987)PNAS 84:214-218；
Nishimura等，1987,Canc.Res.47:999-1005；Wood等，(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等，1988,J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。
84:3439-3443；Liu等，1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等，(1987)PNAS 84:214-218；
Nishimura等，1987,Canc.Res.47:999-1005；Wood等，(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等，1988,J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。
[0497] 人源化或CDR移植抗体中(免疫球蛋白重链或轻链的)至少一个或两个但通常为全部三个受者CDR被供体CDR替代。可在抗体中用至少部分非人CDR进行替换，或用非人CDR替换仅部分CDR。仅需要替换抗原结合所需的CDR数。优选地，供体可为啮齿类抗体，例如大鼠或小鼠抗体，而受者可为人框架或人共有框架。通常，提供CDR的免疫球蛋白被称“供体”，而提供框架区的免疫球蛋白被称作“受体”。在一个实施方式中，供体免疫球蛋白是非人的(例如，啮齿类)。受体框架为天然存在(例如人)的框架或共有框架，或与其有约85％或更高，优选90％、95％、99％或更高相同性的序列。
[0498] 如本文所用，术语“共有序列”是指由相关序列家族中最高频存在氨基酸(或核苷酸)组成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes to Clones(从基因到克隆，Verlagsgesellschaft出版公司，德国威因海姆(Weinheim,Germany)，1987)。在某一蛋白家族中，共有序列中的各位置上是该家族中该位置处出现频率最高的氨基酸。如果两种氨基酸出现频率相同，可将其中任一种包含于共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。
[0499] 可采用本领域已知的方法将抗体分子人源化，本领域中已知许多此类方法(参见例如，Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202-1207,Oi等，1986,BioTechniques 4:214,以及Queen等，US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，其全部内容作为参考纳入本文)。
[0500] 可采用CDR移植或CDR取代来产生人源化或CDR移植抗体，其中可替换免疫球蛋白链中的一个、两个或全部CDR。参见例如美国专利号5,225,539；Jones等，1986Nature 321:552-525；Verhoeyan等，1988Science239:1534；Beidler等，1988J.Immunol.141:4053-
4060；Winter US 5,225,539，其全部内容作为参考纳入本文。Winter描述了可用于制备本公开的人源化抗体的CDR移植方法(英国专利申请GB 2188638A，提交于1987年3月26日；
Winter US 5,225,539)，其全部内容作为参考纳入本文。
4060；Winter US 5,225,539，其全部内容作为参考纳入本文。Winter描述了可用于制备本公开的人源化抗体的CDR移植方法(英国专利申请GB 2188638A，提交于1987年3月26日；
Winter US 5,225,539)，其全部内容作为参考纳入本文。
[0501] 人源化抗体分子也在本公开的范围内，其中特定氨基酸已被取代，缺失或添加。从供体中选择氨基酸的标准描述于例如US 5,585,089，例如US5,585,089的第12-16栏，其内容通过参考纳入本文。使抗体人源化的其他技术描述于Padlan等EP519596A1(公开于1992年12月23日)。
[0502] 抗体分子可为单链抗体。可对单链抗体(scFV)进行工程改造(参见例如Colcher,D.等，(1999)Ann N Y Acad Sci 880:263-80；以及Reiter,Y.(1996)Clin Cancer Res 2:245-52)。单链抗体可二聚化或多聚化以产生对相同靶蛋白上不同表位具有特异性的多价抗体。
[0503] 在其他实施方式中，抗体分子所具有的重链恒定区选自例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；具体而言，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人的)重链恒定区。在另一个实施方式中，抗体分子所具有的轻链恒定区选自例如κ或λ(例如人的)轻链恒定区。可改变(例如突变)恒定区以修饰该抗体的性能(例如以增加或减少如下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能和/或补体功能)。在一个实施方式中，抗体具有效应功能且能够固定补体。在其他个实施方式中，抗体不募集效应细胞或固定补体。在另一个实施方式中，抗体结合Fc受体的能力降低或不具备该能力。例如，抗体是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如其具有经诱变的Fc受体结合区或缺失的Fc受体结合区。
[0504] 改变抗体恒定区的方法是本领域中已知的。具有改变的功能(例如对效应体配体(如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和力改变)的抗体可通过将该抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基替换为不同的残基来产生(参见例如EP388,151A1、美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其全部内容通过引用纳入本文)。可描述相似类型的改变，其若应用于鼠或其他物种免疫球蛋白将减弱或消除这些功能。
[0505] 抗体分子可以被衍生化或连接至另一个功能分子(例如，本文所述的细胞因子分子或其他化学或蛋白质基团)。如本文所用，“衍生化”抗体分子是已被修饰的抗体分子。衍生化的方法包括但不限于：添加荧光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或亲和配体(如生物素)。因此，本公开的抗体分子旨在包括本文所述抗体的衍生化和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可与一个或多个其他分子实体功能性联接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价关联或其他)，所述其他分子实体为例如细胞因子分子、另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、细胞毒性剂、药剂和/或能介导该抗体或抗体部分与其他分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽。
[0506] 一种类型的衍生抗体分子是通过使抗体分子与一种或多种蛋白质(例如细胞因子分子)，另一种抗体分子(相同或不同类型，例如产生双特异性抗体)交联而产生的。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。此类交联剂可获自Pierce化学品公司(伊利诺斯州罗克福德)。
[0507] 示例性免疫刺激融合分子和接头
[0508] 在某些实施方式中，IFM可以在N至C末端的方向上用下式表示：R1-(任选地L1)-R2或R2-(任选地L1)-R1；其中R1包含免疫细胞靶向部分，L1包含接头(例如本文所述的肽接头)，并且R2包含免疫刺激部分，例如细胞因子分子。
[0509] 在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，连接至，例如共价连接至免疫细胞靶向部分。
[0510] 在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，与免疫细胞靶向部分功能性连接，例如共价连接(例如，通过化学偶联，融合，非共价缔合或其他方式)。例如，免疫刺激部分可以例如通过接头与免疫细胞靶向部分间接地共价偶联。
[0511] 在实施方式中，接头选自：可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施方式中，接头是肽接头。肽接头的长度可以是5-20、8-18、10-15或约8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头包含Gly和Ser，例如，包含氨基酸序列(Gly4-Ser)n的接头，其中n表示基序的重复数，例如，n＝1、
2、3、4或5(例如(Gly4Ser)2或(Gly4Ser)3接头)。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：
36、37、38或39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代)。在一个实施方式中，接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)。在另一个实施方式中，接头包含来自IgG4铰链区的氨基酸，例如氨基酸DKTHTSPPSPAP(SEQ ID NO：38)。
2、3、4或5(例如(Gly4Ser)2或(Gly4Ser)3接头)。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：
36、37、38或39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代)。在一个实施方式中，接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)。在另一个实施方式中，接头包含来自IgG4铰链区的氨基酸，例如氨基酸DKTHTSPPSPAP(SEQ ID NO：38)。
[0512] 在其他实施方式中，接头是非肽化学接头。例如，免疫刺激部分通过交联共价偶联至免疫细胞靶向部分。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。
[0513] 在一些实施方式中，接头可以是可生物降解或可裂解的接头。可裂解的接头允许IFM裂解，从而可以从免疫靶向部分释放免疫刺激部分，例如细胞因子分子。接头的裂解可以由相关组织内的生物激活引起，或者由外部刺激例如电磁辐射例如UV辐射引起。
[0514] 在一个实施方式中，可裂解的接头被配置用于在细胞外部裂解，例如在与细胞或组织损伤或疾病相关的条件下裂解。这样的条件包括例如酸中毒；细胞内酶(通常局限于细胞内)的存在，包括坏死条件(例如被钙蛋白酶或其他从坏死细胞中溢出的蛋白酶裂解)；低氧条件，例如还原性环境；血栓形成(例如，接头可能被凝血酶或与凝血级联反应相关的另一种酶裂解)；免疫系统激活(例如，接头可通过激活的补体蛋白的作用裂解)；或与疾病或伤害相关的其他条件。
[0515] 在一个实施方式中，可裂解的接头可包括S-S连接(二硫键)，或可包括当金属被还原时会分解的过渡金属络合物。S-S接头的一个实施方式可以具有以下结构(如美国专利号9,603,944中公开的内容，该专利通过引用整体并入本文)：
[0516]
[0517] 另一个示例性的pH敏感接头，其在pH变化时例如在低pH下被裂解，其将促进酸(或碱)不稳定部分，例如酸不稳定酯基团等的水解。这些条件可以在细胞外环境中发现，例如酸性条件，其可能存在于癌细胞和组织附近，或还原性环境中，如可能存在于缺氧或缺血性细胞和组织附近；通过蛋白酶或在其他酶，其存在于待治疗疾病的细胞，例如患病，凋亡或坏死的细胞和组织表面上或在其附近释放；或通过其他条件或因素。酸不稳定的接头可以是例如顺式-乌头酸接头。pH敏感连接的其他示例包括乙缩醛，缩酮，活化的酰胺(例如2,3二甲基马来酰胺的酰胺)，乙烯基醚，其他活化的醚和酯(例如烯醇或甲硅烷基醚或酯)，亚胺，亚铵，原酸酯，烯胺，氨基甲酸酯，腙，和本领域已知的其他连接(参见，例如，PCT公开号WO 2012/155920和Franco等，AIMS Materials Science，3(1)：289-323，通过引用并入本文)。也可以使用2017年9月5日提交的美国临时专利申请62/554,067和2018年1月11日提交的美国临时专利申请62/616,221中公开的接头，在此通过引用纳入。表述“pH敏感”是指所讨论的可裂解的接头在酸性pH(例如，低于6.0的pH，例如在4.0-6.0的范围内)基本上裂解的事实。
[0518] 在又一个实施方式中，可裂解的接头被配置用于被诸如蛋白酶(例如，胃蛋白酶，胰蛋白酶，热赖氨酸，基质金属蛋白酶(MMP)，去整合素和金属蛋白酶(ADAM；例如，ADAM-10或ADAM-17))，糖苷酶(例如α-，β-，γ-淀粉酶，α-，β-葡萄糖苷酶或乳糖酶)或酯酶(例如乙酰胆碱酯酶，假胆碱酯酶或乙酰酯酶)的酶裂解。可能将可裂解的接头裂解的其他酶包括尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)，组织纤溶酶原激活物(tPA)，颗粒酶A，颗粒酶B，溶酶体酶，组织蛋白酶，前列腺特异性抗原，单纯疱疹病毒蛋白酶，巨细胞病毒蛋白酶，凝血酶，胱天蛋白酶和白介素1β转化酶。
[0519] 另一个例子是酶，例如蛋白酶(例如，胃蛋白酶，胰蛋白酶)在目的组织中的过表达，由此在到达感兴趣的组织时将裂解专门设计的肽接头。在这方面，合适的接头的说明性实例是Gly-Phe-Ser-Gly(SEQ ID NO：105)，Gly-Lys-Val-Ser(SEQ ID NO：106)，Gly-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO：107)，Gly-Lys-Lys-Trp(SEQ ID NO：108)，Gly-Ala-Tyr-Met(SEQ ID NO：109)。
[0520] 在又一个例子中，感兴趣的组织中酶，例如糖苷酶(例如α-淀粉酶)的过表达引起特别设计的碳水化合物接头在到达感兴趣的组织时被裂解。在这方面，合适的接头的说明性实例是-(α-1-4-D-葡萄糖)n-，其中n≥4。
[0521] 在又一个实例中，可裂解的接头被配置用于通过电磁辐射，例如UV辐射进行裂解。感兴趣的组织的紫外线暴露导致接头B断裂，可以在所需组织中促进药物释放或促进纳米颗粒的吸收。
[0522] 可裂解的接头可包含总共2至60个原子，例如2至20个原子。可裂解的接头可以包括氨基酸残基，并且可以是例如1至30或2至10个氨基酸残基的肽键。在一个变体中，可裂解的接头B由1至30个，例如2至10个，或2至8个，或3至9个，或4至10个氨基酸组成。对于pH敏感的接头，原子数通常为2至50，例如2至30。
[0523] 在本发明的一些实施方式中，接头包括氨基己酸(也称为胺基己酸)键或由1至30或2至10个碳水化合物残基组成的键。
[0524] 在一个实施方式中，接头包括可以充当基质金属蛋白酶底物的肽。由于已知基质金属蛋白酶，例如，MMP-1(间质胶原酶)，MMP-2(明胶酶A)，MMP-3，MMP-7，MMP-9(明胶酶B)等，可使用可以用作上述那些中的一种或多种基质金属蛋白酶的底物的底物肽。对于基质金属蛋白酶，参见，例如，“癌症转移的分子机制(Molecular mechanism of cancer metastasis)”，由Tsuruo T.编，第92-107页，Medical View有限公司，于1993年出版。关于可以用作基质金属蛋白酶底物的底物肽，例如，特定类型的基质金属蛋白酶和由其特异性识别的底物肽在Nature Biotechnology，19，第661-667页，2001中解释。因此，通过参考该出版物，可以选择被特定类型的基质金属蛋白酶特异性切割的底物肽。例如，已知Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Tyr-Ser-Gly(SEQ ID NO：110)作为MMP-9的特异性底物，并且优选使用上述八肽作为可以用作MMP-9的底物的底物肽。可以用作基质金属蛋白酶底物的底物肽的说明性实例包括Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ ID NO：111)，Val-Pro-Met-Ser-Met-Arg-Gly-Gly(SEQ ID NO：112)，Ile-Pro-Val-Ser-Leu-Arg-Ser-Gly(SEQ ID NO：113)，Arg-Pro-Phe-Ser-Met-Ile-Met-Gly(SEQ ID NO：114)，Val-Pro-Leu-Ser-Leu-Thr-Met-Gly(SEQ ID NO：115)，Ile-Pro-Glu-Ser-Leu-Arg-Ala-Gly(SEQ ID NO：116)，Arg-His-Asp，Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(SEQ ID NO：117)，Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-Lys(SEQ ID NO：118)，Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gla-Gln-Arg(SEQ ID NO：119)，Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Arg(SEQ ID NO：120)，Gly-Pro-Leu-Gly-Pro(SEQ ID NO：121)，Gly-Pro-Ile-Gly-Pro(SEQ ID NO：122)等。
[0525] 在另一个实施方式中，接头包括可用作崩解酶和金属蛋白酶(ADAM)，MMP或颗粒酶的底物的肽。例如但不限于，接头可以包含ADAM-8，ADAM-10，ADAM-12，ADAM-17，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-13，颗粒酶A或颗粒酶B的肽底物。ADAM，MMP和颗粒酶的底物已得到充分描述(例如，在Miller，MA等，Integrative Biology(2011)3：422-438，Van Damme等，Biol Chem(2010)391：983-997和Casciola-Rosen，L等，J Biol Chem(2007)282：4545-
4552中)和本领域技术人员将能够容易地纳入此类肽或其变体至感兴趣的接头中。
4552中)和本领域技术人员将能够容易地纳入此类肽或其变体至感兴趣的接头中。
[0526] 除底物肽外，该接头还可包含连接物，参与与治疗性蛋白的一个或多个键合。这样的连接物可各自由一个氨基酸残基或含有2至10个，例如3至9，或4至8，或2至8个氨基酸残基的寡肽组成。如果存在，作为连接物的氨基酸残基或寡肽可与底物肽的两端结合，或可仅与底物肽的一端结合以代表结构之一。可以用作连接物的一个氨基酸的类型和构成可用作连接物的寡肽的氨基酸残基的类型没有特别限制，并且可以使用任意类型的一个氨基酸残基或包含例如以下的任意寡肽，例如2至8个任意类型的相同或不同氨基酸残基。可用作连接物的寡肽的实例包括，例如，富含Gly氨基酸的连接物。其他有机部分也可以用作连接物。
[0527] 在其他实施方式中，将免疫刺激部分直接共价偶联至免疫细胞靶向部分，而无需接头。
[0528] 在其他实施方式中，IFM的免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分不是共价连接的，例如是非共价缔合的。
[0529] 细胞因子分子与抗体分子，例如免疫球蛋白部分(Ig)(例如抗体(IgG)或抗体片段(Fab，scFv等))融合的示例性格式可包括与抗体分子的氨基末端(N末端)或羧基末端(C末端)，通常是抗体分子的C末端的融合。在一个实施方式中，包含结合至Ig多肽的细胞因子多肽，细胞因子-受体复合物或细胞因子-受体Fc复合物，细胞因子多肽链和Ig多肽链之间的合适连接的细胞因子-Ig部分融合分子包括直接多肽键，在两个链之间具有多肽接头的连接；以及链之间的化学键。典型的连接是由小的Gly4Ser接头(GGGGS)N组成的柔性接头，其中N表示基序的重复数。(GGGGS)2和(GGGGS)3是用于本公开的融合构建体中的接头的优选实施方式。
[0530] 本文所述的示例性免疫刺激融合分子可包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：104的氨基酸序列或与其基本相同(例如，与任何上述氨基酸序列具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性)的氨基酸序列。
[0531] 本文描述了本公开的示例性免疫刺激融合分子(或其部分)。应当注意，在某些scFv中，排列是VH-接头-VL。然而，在不影响功能的情况下，也可以使用VL-接头-VH排列。另外，尽管在各种构建体中使用了特定的接头(接头-1，接头2等)，但是本文公开的其他接头也可以互换使用。
[0532] SEQ ID NO：1
[0533] 名称：LC-chBC8-sushi
[0534] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本BC8小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15R5α-sushi结构域，该结构域使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0535]
[0536] 从N端到C端，显示了嵌合BC8 Fab的轻链部分通过肽接头与IL-15结合的sushi结构域融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和单下划线表示；并且双下划线显示了sushi结构域。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0537] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：1所示的轻链可变氨基酸序列(任选地，还包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1具有至少95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，嵌合BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：1的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0538] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：1具有至少1，2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：1包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0539] SEQ ID NO：2
[0540] 名称：sushi-LC-chBC8
[0541] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本BC8小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15R5α-sushi结构域，该结构域使用柔性接头遗传融合至抗体轻链N末端。
[0542]
[0543] 从N端至C端，显示了IL-15结合的野生型sushi结构域通过肽接头与嵌合BC8 Fab的轻链部分融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和单下划线表示；并且双下划线显示了sushi结构域。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0544] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：2所示的轻链可变氨基酸序列(任选地，还包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：2具有至少85％，90％，95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变区的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：2的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0545] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：2有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：2具有至少1，2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：2包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0546] SEQ ID NO：3
[0547] 名称：LC-chBC8-IL15(也称为LC-chBC8-L1-IL15)
[0548] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0549]
[0550] 从N端到C端，显示了嵌合BC8 Fab的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和单下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0551] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：3所示的轻链可变氨基酸序列(任选地，还包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：3具有至少85％，90％，95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：3的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0552] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，至少85％，90％，95％，96％，与SEQ ID NO：3有97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：3具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：3包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0553] SEQ ID NO：4
[0554] 名称：IL15-LC-chBC8
[0555] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链N末端。
[0556]
[0557] 从N端到C端，显示了IL-15细胞因子通过肽接头与嵌合BC8 Fab的轻链部分融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0558] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：4所示的轻链可变氨基酸序列(任选地，还包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：4具有至少95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：4的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0559] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：2有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：4具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：4包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0560] 嵌合BC8抗体分子，例如Fab或IgG的示例性的相应重链在下面分别显示为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
[0561] SEQ ID NO：5
[0562] 名称：HC-chBC8-Fab
[0563] 嵌合BC8抗CD45抗体的Fab重链；包含来自亲本BC8小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0564] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：5所示的重链可变氨基酸序列(任选地，还包括来自人IgG1的CH1结构域序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：5具有至少85％，90％，95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：5的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0565] SEQ ID NO：6
[0566] 名称：HC-chBC8-IgG4S228P
[0567] 嵌合BC8抗CD45抗体的重链；包含来自亲本BC8小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自包含S228P突变的人IgG4(IgG4-S228P)的恒定区。
[0568] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：6所示的重链可变氨基酸序列(任选地，还包括包含S228P突变的人IgG4(IgG4-S228P)的恒定区)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：6具有至少85％，90％，95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，嵌合BC8抗体包含BC8抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：6的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0569] SEQ ID NO：7
[0570] 名称：LC-chBC8
[0571] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；包含来自亲本BC8小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域。
[0572] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含SEQ ID NO：7所示的轻链可变氨基酸序列(任选地，还包括来自人κ的恒定结构域序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：7具有至少85％，90％，95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：7的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0573] SEQ ID NO：8
[0574] 名称：HC-chBC8-IgG4S228P-IL15
[0575] 嵌合BC8抗CD45抗体的重链；含有来自亲本BC8小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自含有S228P突变的人IgG4(IgG4-S228P)的恒定区；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体重链C末端。
[0576]
[0577]
[0578] 从N端到C端，显示了嵌合BC8 IgG4的重链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。重链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。
[0579] 在一些实施方式中，BC8抗体包含SEQ ID NO：8所示的重链可变氨基酸序列(任选地，还包括人IgG4恒定序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：8具有至少95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：8的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0580] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：8有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：8具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：8包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0581] SEQ ID NO：14
[0582] 名称：HC-ch9.4-Fab
[0583] 嵌合9.4抗CD45抗体的Fab重链；包含来自亲本9.4小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0584] 在一些实施方式中，嵌合9.4抗体包含SEQ ID NO：14所示的重链可变氨基酸序列(任选地，还包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：14具有至少95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，9.4抗体包含9.4抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：14的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0585] SEQ ID NO：15
[0586] 名称：LC-ch9.4-IL15
[0587] 嵌合9.4抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本9.4小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0588]
[0589] 从N端到C端，显示了嵌合9.4IgG1的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0590] 在一些实施方式中，嵌合9.4抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：15的抗体部分至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，9.4抗体包含BC8抗体的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：15的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0591] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：15有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：15具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：15包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0592] SEQ ID NO：16
[0593] 名称：HC-ch4B2-Fab
[0594] 嵌合4B2抗CD45抗体的Fab重链；包含来自亲本4B2小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0595] 在一些实施方式中，嵌合4B2抗体包含SEQ ID NO：16所示的重链可变氨基酸序列(任选地，还包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：16具有至少95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，4B2抗体包含4B2抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：16的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0596] SEQ ID NO：17
[0597] 名称：LC-ch4B2-IL15
[0598] 嵌合4B2抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本4B2小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0599]
[0600]
[0601] 从N端到C端，显示了嵌合4B2 IgG1的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0602] 在一些实施方式中，嵌合4B2抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：17的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，4B2抗体包含4B2抗体的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：17的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0603] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：17有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：17具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：17包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0604] SEQ ID NO：18
[0605] 名称：HC-hBC8(23)-Fab
[0606] 人源化BC8抗CD45抗体的Fab重链；包含来自人IgG1的CH1结构域和人源化可变结构域。
[0607] 在一些实施方式中，人源化BC8抗体的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括来自人IgG1的CH1结构域序列)具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：18的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：18的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0608] SEQ ID NO：19
[0609] 名称：LC-hBC8(23)-IL15
[0610] 人源化BC8抗CD45抗体的轻链；包含人源化可变结构域和人恒定κ结构域；含有使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C端的野生型IL-15。
[0611]
[0612] 从N端到C端，显示人源化BC8 IgG1的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0613] 在一些实施方式中，人源化BC8抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：19的抗体部分至少85％，90％，95％或更高相同的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：19的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0614] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：19有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：19具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：19包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0615] SEQ ID NO：20
[0616] 名称：HC-hBC8(23)-无-Fab
[0617] 人源化BC8抗CD45抗体的Fab重链；包含人源化可变结构域，CDR-H3中的SGGGS(SEQ ID NO：123)取代，和人IgG1的CH1结构域。
[0618] SEQ ID NO：21
[0619] 名称：LC-chBC8-L2-IL15
[0620] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用具有序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0621]
[0622] 从N端到C端，显示了嵌合BC8 IgG1的轻链部分通过肽接头(L2)与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0623] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：21的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：21的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0624] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：21有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：21具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：21包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0625] SEQ ID NO：22
[0626] 名称：LC-chBC8-L3-IL15
[0627] 嵌合BC8抗CD45抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用与人IgG1铰链有关的接头(SEQ ID NO：38)遗传融合至抗体轻链C末端。
[0628]
[0629] 从N端到C端，显示了嵌合BC8 IgG1的轻链部分通过肽接头(L3)与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0630] 在一些实施方式中，嵌合BC8抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：22的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含BC8抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：22的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0631] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：22有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：22具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：22包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0632] SEQ ID NO：25
[0633] 名称：hBC8(23)-无重链可变结构域
[0634] 人源化BC8抗CD45抗体的重链可变结构域；在CDR-H3中包含SGGGS取代。
[0635] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：25有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：25具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：25包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0636] SEQ ID NO：26
[0637] 名称：HC-chMHM24-Fab
[0638] 嵌合MHM24抗CD11a抗体的Fab重链；包含来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0639] 在一些实施方式中，嵌合MHM24抗体的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括来自人IgG1的CH1结构域序列)具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：26的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，MHM24抗体包含MHM24抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：26的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0640] SEQ ID NO：69
[0641] 名称：HC-hMHM24-Fab
[0642] 人源化MHM24抗CD11a抗体的Fab重链；包含来自人源化MHM24重链可变结构域的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0643] 在一些实施方式中，人源化MHM24抗体的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括来自人IgG1的CH1结构域序列)具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，MHM24抗体包含MHM24抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：27的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0644] SEQ ID NO：27
[0645] 名称：LC-chMHM24-IL15
[0646] 嵌合MHM24抗CD11a抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0647]
[0648]
[0649] 从N端到C端，显示了嵌合MHM24 IgG1的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0650] 在一些实施方式中，嵌合MHM24抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，MHM24抗体包含抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：27的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0651] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：27有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：27具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：27包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0652] SEQ ID NO：28
[0653] 名称：HC-ch1B4-Fab
[0654] 嵌合1B4抗CD18抗体的Fab重链；包含来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0655] 在一些实施方式中，嵌合1B4抗体的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括来自人IgG1的CH1结构域序列)具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：28的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，嵌合1B4抗体包含1B4抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：28的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0656] SEQ ID NO：29
[0657] 名称：LC-ch1B4-IL15
[0658] 嵌合1B4抗CD18抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0659]
[0660] 从N端到C端，显示了嵌合1B4 IgG1的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0661] 在一些实施方式中，嵌合1B4抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：29的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，嵌合1B4抗体包含抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：29的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0662] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：29有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：29具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：29包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0663] SEQ ID NO：30
[0664] 名称：HC-chOKT8-Fab
[0665] 嵌合OKT8抗CD8抗体的Fab重链；包含来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
[0666] 在一些实施方式中，嵌合OKT8抗CD8抗体的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括来自人IgG1的CH1结构域序列)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：30的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，嵌合OKT8抗CD8抗体包含OKT8抗CD8抗体的重链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：30的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0667] SEQ ID NO：31
[0668] 名称：LC-chOKT8-IL15
[0669] 嵌合OKT8抗CD8抗体的轻链；含有来自亲本小鼠单克隆抗体的可变结构域和人恒定κ结构域；含有野生型IL-15，其使用柔性接头遗传融合至抗体轻链C末端。
[0670]
[0671]
[0672] 从N端到C端，显示了嵌合OKT8 IgG1的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。轻链的序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线显示了细胞因子分子。κ恒定区显示为SEQ ID NO：74。
[0673] 在一些实施方式中，嵌合OKT8抗体的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)对应于SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：31的抗体部分至少85％，90％，95％或更高相同的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，嵌合OKT8抗体包含抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：31的任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0674] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：31有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：31具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：31包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0675] SEQ ID NO：32
[0676] 名称：BC8scFv-IL15
[0677] IL-15使用短的柔性接头和六组氨酸标签融合到BC8-scFv的C末端。
[0678]
[0679]
[0680] 从N端到C端，显示了BC8 scFv的轻链部分通过肽接头与IL-15细胞因子融合。scFv序列以普通字体显示；肽接头的位置用斜体和下划线表示；并且双下划线表示细胞因子分子。
[0681] 在一些实施方式中，BC8 scFv抗体的轻链可变氨基酸序列对应于SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的抗体部分，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：32的抗体部分具有至少85％，90％，95％或更高的相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，BC8抗体包含抗体的轻链可变结构域的一个，两个或全部三个CDR1，CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：32内任意CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
[0682] 在实施方式中，本文所述的IFM可包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：32有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：32具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的氨基酸序列。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：32包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0683] 可以在本公开的IFM中包括的其他序列在下表1中显示。在一些实施方式中，IFM包括恒定的兰巴(lamba)或λ区。示例性恒定兰巴或λ区包括SEQ ID NO：74-78。在各种实施方式中，本文所述的IFM可包含选自SEQ ID NO：1-104的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1-104中任一个有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：1-104中任一个具有至少1，2、3、4、
5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：1-104中任一个包括不超过五个，十个或十五个变化(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：1-104中任一个包括不超过五个，十个或十五个变化(例如，取代，缺失或插入，例如，保守取代)。
[0684] 表1.其他序列
[0685]
[0686]
[0687]
[0688]
[0689]
[0690]
[0691]
[0692] 蛋白质变体
[0693] 全长多肽及其变体描述如下。全长IL-15序列(SEQ ID NO：40)取自Genbank登录号CAA62616.1；成熟IL-15没有信号序列，并在SEQ ID NO：10中定义。全长IL-15Rα(SEQ ID NO：41)取自Genbank登录号AAI21141.1。IL-15Rα的sushi结构域(IL-15Rα-sushi)由SEQ ID NO：9给出。最小sushi结构域包括第一和第四半胱氨酸和间插氨基酸(SEQ ID NO：52)在其他地方有描述，并且是合理取代物。类似地，向包含天然Thr或Ile-Thr的最小sushi结构域的任选N-末端添加和/或向包含Ile或Ile-Arg残基的最小sushi结构域的任选C-末端添加也是合理的。
[0694] 下文描述的蛋白质变体指定了蛋白质亚基名称和与成熟蛋白质相对应的SEQ ID NO。每个蛋白质亚基都与N端信号肽重组表达，以促进从表达细胞的分泌。天然IL-15Rα信号肽(SEQ ID NO：35)用于sushi，sushi-L77I-Fc和sushi-Fc。SEQ ID NO：33中的前导序列用于支持抗体轻链，IL15-WT，N末端IL-15融合体，IL15-N72D以及sushi与Fab轻链的N末端融合体的分泌。SEQ ID NO：34中的前导序列用于支持抗体重链的分泌。
[0695] 对于“重链”和“轻链”命名法，我们使用标准的抗体命名系统。例如，在抗体Fab片段中，两条链具有大约相同的分子量，但是我们将重链称为Fab片段的链，其对应于全长抗体中的重链(例如，包含可变重链和CH1结构域)。此外，在细胞因子与Fab片段的轻链融合的情况下，由于细胞因子融合，轻链实际上具有比重链更大的分子量；为了保持一致，然而，我们维持标准命名约定，其中可变轻链结构域和恒定κ结构域和细胞因子融合体包含“轻链”，而可变重链结构域和CH1结构域包含“重链”。
[0696] 蛋白质名称：chBC8-IL15/sushi Fab(也称为chBC8-L1-IL15/sushi Fab)。
[0697] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-Fab(SEQ ID NO：5)，LC-chBC8-IL15(SEQ ID NO：3)和IL-15R4-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合BC8 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。嵌合BC8 Fab是抗人CD45R抗体Fab片段，其包含来自亲本小鼠单克隆抗体(mAb)的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0698] 蛋白质名称：IL15-chBC8/sushi Fab
[0699] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-Fab(SEQ ID NO：5)，IL15-LC-chBC8(SEQ ID NO：4)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15与嵌合BC8Fab片段轻链的N-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0700] 蛋白质名称：chBC8-sushi/IL15-N72D Fab
[0701] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-Fab(SEQ ID NO：5)，LC-chBC8-IL15(SEQ ID NO：1)和IL15-N72D(SEQ ID NO：11)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15Rα-sushi与嵌合BC8 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及IL15-N72D和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0702] 蛋白质名称：sushi-chBC8/IL15-N72D Fab
[0703] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-Fab(SEQ ID NO：5)，sushi-LC-chBC8(SEQ ID NO：2)和IL15-N72D(SEQ ID NO：11)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15Rα-sushi与嵌合BC8 Fab片段轻链的N-末端的融合体，以及IL15-N72D和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0704] 蛋白质名称：chBC8-IL15/sushi IgG
[0705] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-IgG4S228P(SEQ ID NO：6)，LC-chBC8-IL15(SEQ ID NO：3)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合BC8 IgG-S228P轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15R5-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。嵌合BC8 IgG4-S228P是抗人CD45R抗体，包含来自亲本小鼠mAb的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和包含S228P点突变的人IgG4，其降低了IgG4的Fab臂交换的敏感性)。
[0706] 蛋白质名称：IL15-chBC8/sushi IgG
[0707] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-IgG4S228P(SEQ ID NO：6)，IL15-LC-chBC8(SEQ ID NO：4)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合BC8 IgG4-S228P轻链的N-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0708] 蛋白质名称：chBC8-sushi/IL15-N72D IgG
[0709] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-IgG4S228P(SEQ ID NO：6)，LC-chBC8-sushi(SEQ ID NO：1)和IL15-N72D(SEQ ID NO：11)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15Rα-sushi与嵌合BC8 IgG4-S228P轻链的C-末端的融合体，以及IL-15Rα-sushi和IL15之间的非共价缔合。
[0710] 蛋白质名称：sushi-chBC8/IL15-N72D IgG
[0711] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-IgG4S228P(SEQ ID NO：6)，sushi-LC-chBC8(SEQ ID NO：2)和IL15-N72D(SEQ ID NO：11)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15Rα-sushi与嵌合BC8 IgG4-S228P轻链的N-末端的融合体，以及IL-15Rα-sushi和IL15之间的非共价缔合。
[0712] 蛋白质名称：chBC8-(HC)-IL15/sushi IgG
[0713] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-IgG4S228P-IL15(SEQ ID NO：8)，LC-chBC8(SEQ ID NO：7)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15与嵌合BC8 IgG4-S228P重链的C-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0714] 蛋白质名称：chBC8-IL15/sushi scFv
[0715] 该蛋白是通过两个亚基的共表达而制成的：BC8scFv-IL15(SEQ ID NO：32)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的IL-15与BC8-scFv的C-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。BC8-scFv包含来自亲本小鼠mAb的可变结构域，该结构域通过柔性接头连接。
[0716] 蛋白质名称：IL15-N72D/sushiL771-Fc
[0717] 该蛋白是通过两个亚基的共表达而制成的：IL15-N72D(SEQ ID NO：11)和sushi-L77I-Fc(SEQ ID NO：12)。所得的蛋白质包括IL-15Rα-sushi，其含有与人IgG1-Fc区的N末端融合的L77I突变，和IL15-N72D和IL-15Rα-sushi之间非共价缔合。
[0718] 蛋白质名称：IL15-WT/sushi-Fc
[0719] 该蛋白是通过两个亚基的共表达而制成的：IL15-WT(SEQ ID NO：10)和sushi-Fc(SEQ ID NO：13)。所得的蛋白质包括IL-15Rα-sushi与人IgG1-Fc区的N-末端的融合体，以及IL15-WT和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0720] 蛋白质名称：IL15-WT/sushi-IgG2Da-Fc
[0721] 该蛋白是通过两个亚基的共表达而制成的：IL15-WT(SEQ ID NO：10)和sushi-IgG2Da-Fc(SEQ ID NO：56)。所得的蛋白质包括IL-15Rα-sushi与人IgG2Da-Fc区的N-末端的融合体，以及与IL15-WT的非共价缔合(通过与IL-15Rα-sushi的相互作用)。
[0722] 蛋白质名称：ch9.4-IL15/sushi Fab
[0723] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-ch9.4-Fab(SEQ ID NO：14)，LC-ch9.4-IL15(SEQ ID NO：15)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合9.4Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。嵌合9.4Fab是抗CD45R抗体Fab片段，包含来自亲本小鼠mAb的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)(对应于ATCC杂交瘤HB-10508)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0724] 蛋白质名称：ch4B2-IL15/sushi Fab
[0725] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-ch4B2-IL15(SEQ ID NO：16)，LC-ch4B2-IL15(SEQ ID NO：17)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合4B2 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。嵌合4B2 Fab是抗CD45R抗体Fab片段，包含来自亲本小鼠mAb的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)(对应于ATCC杂交瘤HB-11186)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0726] 蛋白质名称：hBC8(23)-IL15/sushi Fab
[0727] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-hBC8(23)-Fab(SEQ ID NO：18)，LC-hBC8(23)-IL15(SEQ ID NO：19)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与人源化BC8 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。人源化BC8(23)Fab是抗CD45R抗体Fab片段，包含从亲本小鼠mAb人源化的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定区(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0728] 蛋白质名称：hBC8-无-IL15/sushi Fab
[0729] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8(23)-无-Fab(SEQ ID NO：20)，LC-hBC8(23)-IL15(SEQ ID NO：19)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与人源化BC8 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。该蛋白质与hBC8(23)-IL15/sushi Fab的不同之处在于，其重链在CDR-H3环内包含GGGS取代，这导致对CD45R的结合亲和力减弱(因此，命名为“无”结合变体)。因此，该IL15融合蛋白充当CD45R接合作用的阴性对照。
[0730] 蛋白质名称：chBC8-L2-IL15/sushi Fab
[0731] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-Fab(SEQ ID NO：5)，LC-chBC8-L2-IL15(SEQ ID NO：21)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L2(SEQ ID NO：37)的IL-15与嵌合BC8 Fab片段轻链的N-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0732] 蛋白质名称：chBC8-L3-IL15/sushi Fab
[0733] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chBC8-Fab(SEQ ID NO：5)，LC-chBC8-L3-IL15(SEQ ID NO：22)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L3(SEQ ID NO：38)的IL-15与嵌合BC8 Fab片段轻链的N-末端的融合体，以及IL-15和IL-15Rα-sushi之间的非共价缔合。
[0734] 蛋白质名称：chMHM24-IL15/sushi Fab
[0735] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chMHM24-Fab(SEQ ID NO：26)，LC-chMHM24-IL15(SEQ ID NO：27)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合MHM24 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15R5-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。嵌合MHM24 Fab是抗人CD11a抗体Fab片段，其包含来自亲本小鼠mAb的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0736] 蛋白质名称：ch1B4-IL15/sushi Fab
[0737] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-ch1B4-Fab(SEQ ID NO：28)，LC-ch1B4-IL15(SEQ ID NO：29)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合1B4 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。嵌合1B4 Fab是抗人CD18抗体Fab片段，其包含来自亲本小鼠mAb的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0738] 蛋白质名称：chOKT8-IL15/sushi Fab
[0739] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chOKT8-Fab(SEQ ID NO：30)，LC-chOKT8-IL15(SEQ ID NO：31)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合OKT8 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。嵌合OKT8 Fab是抗人CD8抗体Fab片段，其包含来自亲本小鼠mAb的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0740] 蛋白质名称：h9.4Fab-scIL-12p70
[0741] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab(SEQ ID NO：79)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体。h9.4 Fab是抗人CD45R抗体Fab片段，包含来自h9.4的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)和来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
[0742] 蛋白质名称：h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70
[0743] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab-h9.4scFv(SEQ ID NO：80)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1的h9.4 scFv与h9.4 Fab片段重链的融合体。
[0744] 蛋白质名称：h9.4Fab-hBC8scFv-scIL-12-p70
[0745] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab-hBC8scFv(SEQ ID NO：81)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1(SEQ ID NO：36)的hBC8 scFv与h9.4 Fab片段重链的融合体。
[0746] 蛋白质名称：h9.4Fab-scIL-12p70AB
[0747] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab(SEQ ID NO：79)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70AB(SEQ ID NO：102)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体。
[0748] 蛋白质名称：h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70AB
[0749] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab-h9.4scFv(SEQ ID NO：80)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70AB(SEQ ID NO：102)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1的h9.4 scFv与h9.4 Fab片段重链的融合体。
[0750] 蛋白质名称：h9.4Fab-hBC8scFv-scIL-12-p70AB
[0751] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab-hBC8scFv(SEQ ID NO：81)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70AB(SEQ ID NO：102)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1(SEQ ID NO：36)的hBC8 scFv与h9.4Fab片段重链的融合体。
[0752] 蛋白质名称：h9.4Fab-IL-12p70AB
[0753] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-h9.4Fab(SEQ ID NO：79)，LC-h9.4Fab-IL-12A(SEQ ID NO：103)和IL-12B(SEQ ID NO：49)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的人IL-12A与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体。全长IL-12p70是通过IL-12A和IL-12B之间的缔合形成的。
[0754] 蛋白质名称：h9.4Fab-h9.4scFv-IL-12p70AB
[0755] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-h9.4Fab-h9.4scFv(SEQ ID NO：80)，LC-h9.4Fab-IL-12A(SEQ ID NO：103)和IL-12B(SEQ ID NO：49)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的人IL-12A与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1的h9.4 scFv与h9.4 Fab片段重链的融合体。全长IL-12p70是通过IL-12A和IL-12B之间的缔合形成的。
[0756] 蛋白质名称：h9.4Fab-hBC8scFv-IL-12-p70AB
[0757] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-h9.4Fab-hBC8scFv(SEQ ID NO：81)，LC-h9.4Fab-IL-12A(SEQ ID NO：103)和IL-12B(SEQ ID NO：49)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的人IL-12A与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1(SEQ ID NO：36)的hBC8 scFv与h9.4 Fab片段重链的融合体。全长IL-12p70是通过IL-12A和IL-12B之间的缔合形成的。
[0758] 蛋白质名称：h9.4Fab-IL-12p70BA
[0759] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-h9.4Fab(SEQ ID NO：79)，LC-h9.4Fab-IL-12B(SEQ ID NO：104)和IL-12A(SEQ ID NO：47)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的人IL-12B与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体。全长IL-12p70是通过IL-12B和IL-12A之间的缔合形成的。
[0760] 蛋白质名称：h9.4Fab-h9.4scFv-IL-12p70BA
[0761] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-h9.4Fab-h9.4scFv(SEQ ID NO：80)，LC-h9.4Fab-IL-12B(SEQ ID NO：104)和IL-12A(SEQ ID NO：47)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的人IL-12B与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1的h9.4 scFv与h9.4Fab片段重链的融合体。全长IL-12p70是通过IL-12B和IL-12A之间的缔合形成的。
[0762] 蛋白质名称：h9.4Fab-hBC8scFv-IL-12-p70BA
[0763] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-h9.4Fab-hBC8scFv(SEQ ID NO：81)，LC-h9.4Fab-IL-12B(SEQ ID NO：104)和IL-12A(SEQ ID NO：47)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的人IL-12B与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1(SEQ ID NO：36)的hBC8 scFv与h9.4 Fab片段重链的融合体。全长IL-12p70是通过IL-12B和IL-12A之间的缔合形成的。
[0764] 蛋白质名称：chM1Fab-scIL-12p70
[0765] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-chM1Fab(SEQ ID NO：83)和LC-chM1Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：84)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链小鼠IL-12p70与chM1 Fab片段轻链的C末端的融合体。
[0766] 蛋白质名称：chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70
[0767] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-chM1Fab-M1scFv(SEQ ID NO：86)和LC-chM1Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：84)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链小鼠IL-12p70与chM1 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1(SEQ ID NO：36)的M1 scFv与chM1Fab片段重链的融合体。
[0768] 蛋白质名称：chM1Fab-IL-15/sushi
[0769] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chM1Fab(SEQ ID NO：83)，LC-chM1Fab-IL-15(SEQ ID NO：85)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型人IL-15与chM1 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。
[0770] 蛋白质名称：chM1Fab-M1scFv-IL-15/sushi
[0771] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chM1Fab-M1scFv(SEQ ID NO：86)，LC-chM1Fab-IL-15(SEQ ID NO：85)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头1(SEQ ID NO：36)的野生型人IL-15与chM1 Fab片段轻链C末端的融合体，使用接头-1(SEQ ID NO：36)的M1 scFv与chM1 Fab片段重链的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15的相互作用)。
[0772] 蛋白质名称：chY169Fab-IL-15/sushi
[0773] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chY169Fab(SEQ ID NO：87)，LC-chY169Fab-IL-15(SEQ ID NO：88)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-L1(SEQ ID NO：36)的野生型IL-15与嵌合Y169 Fab片段轻链的C-末端的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15相互作用)。
[0774] 蛋白质名称：chY169Fab-M1scFv-IL-15/sushi
[0775] 该蛋白质是通过三个亚基的共表达而制成的：HC-chY169Fab-M1scFv(SEQ ID NO：89)，LC-chY169Fab-IL-15(SEQ ID NO：88)和IL-15Rα-sushi(SEQ ID NO：9)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的野生型人IL-15与嵌合Y169 Fab片段轻链C末端的融合体，使用接头-1(SEQ ID NO：36)的M1 scFv与chY169 Fab片段重链的融合体，以及与IL-15Rα-sushi的非共价缔合(通过与IL-15的相互作用)。
[0776] 蛋白质名称：chY169Fab-M1scFv-scIL-12p70
[0777] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-chY169Fab-M1scFv(SEQ ID NO：89)和LC-chY169Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：90)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链小鼠IL-12p70与嵌合Y169 Fab片段轻链的C末端的融合体，和使用接头-1(SEQ ID NO：36)的M1 scFv与chY169 Fab片段重链的融合体。
[0778] 蛋白质名称：chY169Fab-scIL-12p70
[0779] 该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-chY169Fab-(SEQ ID NO：87)和LC-chY169Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：90)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链小鼠IL-12p70与嵌合Y169 Fab片段轻链的C末端的融合体。
[0780] 核酸/载体/细胞
[0781] 本公开的特征还在于包含编码本文所述的免疫刺激融合分子的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包含编码IFM和本文所述的抗体分子的核苷酸序列的载体。在一个实施方式中，载体包含编码IFM和本文描述的抗体分子的核苷酸。在一个实施方式中，载体包含本文所述的核苷酸序列。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。可采用许多种载体系统。例如，一类载体利用DNA元件，这些元件衍生自动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(劳斯氏肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一类载体利用衍生自RNA病毒的RNA元件，所述RNA病毒为例如塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒和黄病毒。
[0782] 此外，通过引入能够选择已转染宿主细胞的一种或多种标记物，可选择已将DNA稳定整合入其染色体中的细胞。该标记物可向营养缺陷型宿主提供例如营养缺陷型、杀生物剂(如抗生素)抗性或对重金属如铜等的抗性。选择性标记基因可直接连接于待表达的DNA序列，或者通过共同转化引入同一细胞内。mRNA的优化合成也可能需要其它元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
[0783] 一旦制得用于表达的含构建体的表达载体或DNA序列，可将表达载体转染或导入合适的宿主细胞。可用各种技术实现之，例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情形下，可在培养基中使细胞生长，并筛选适当的活性。
[0784] 培养所得转染细胞以及回收所产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的，且可基于本文的描述，根据所用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞进行改变或优化。
[0785] 在另一方面中，本申请的特征包括包含本文所述核酸的宿主细胞和载体。核酸可存在于同一宿主细胞或非同一宿主细胞中的单个载体中或独立的多个载体中。宿主细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母细胞或原核细胞，例如，大肠杆菌。例如，哺乳动物细胞可以是培养细胞或细胞系。示例性的哺乳动物细胞包括淋巴细胞细胞系(例如，NSO)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS细胞，卵母细胞和来自转基因动物例的细胞，如乳腺上皮细胞。
[0786] 本公开还提供了宿主细胞，其包含编码如本文所述的抗体分子的核酸。在一个实施方式中，宿主细胞经遗传工程改造以包含编码抗体分子的核酸。在一个实施方式中，采用表达盒对宿主细胞进行遗传工程改造。术语“表达盒”是指能够影响与此类序列相容的宿主中基因表达的核苷酸序列。此类表达盒可包括启动子、含或不含内含子的开放阅读框、以及终止信号。还可以采用实现表达所必需或有帮助的其他因子，例如诱导型启动子。本公开还提供了包含本文所述载体的宿主细胞。细胞可为但不限于：真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于：Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于：Sf9细胞。
[0787] 组合物
[0788] 本文提供了包含免疫刺激融合分子的组合物，包括药物组合物。组合物可以以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物配制。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分(例如，纳米颗粒的生物活性蛋白)的生物活性的有效性的无毒材料。在一些实施方式中，此类组合物可包含盐，缓冲剂，防腐剂和任选地其他治疗剂。在一些实施方式中，药物组合物还可包含合适的防腐剂。在一些实施方式中，药物组合物可以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。在一些实施方式中，适合于肠胃外给药的药物组合物包含纳米颗粒的无菌水性或非水性制剂，在一些实施方式中，其与受体对象的血液等渗。该制剂可以根据已知方法配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。
[0789] 另外的组合物包括修饰的细胞，例如修饰的免疫细胞，其在其细胞表面上进一步包含一种或多种系连融合蛋白。这可用于离体制备细胞疗法，例如过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，富集的抗原特异性T细胞疗法或NK细胞疗法。
[0790] 在一些实施方式中，本公开内容的IFM可以以例如纳米凝胶或水凝胶或生物凝胶的形式直接给予给需要其的患者，作为用于经由受体介导的对特定细胞独特的受体(例如CD4或CD8)结合来特异性递送治疗性蛋白质的试剂。这种直接给予可以是全身性的(例如，肠胃外的，例如静脉内注射或输注)或局部的(例如，肿瘤内的，例如，注射到肿瘤微环境中)。本文所用的术语“肠胃外给药”和“胃肠外给予”是指除肠内(即，通过消化道)和局部给药以外的给药方式，通常通过注射或输注给药，包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，包膜下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0791] 在一些实施方式中，本发明的IFM可以用作离体药剂，以在通过全身或局部给药给予患者或重新引入患者之前诱导分离的自体和同种异体细胞的活化和扩增。例如，扩增后的细胞可用于包括ACT(过继性细胞转移)在内的T细胞疗法，也可与其他重要的免疫细胞类型联用，包括B细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，NK细胞，抗原特异性CD8 T细胞，经遗传工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或CAR-T细胞，经遗传工程改造以表达对肿瘤抗原具有特异性的T细胞受体的T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，和/或经过抗原训练的T细胞(例如，已经被展示感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原(TAA))的抗原呈递细胞(APC)“训练”的T细胞)。
[0792] 治疗用途和方法
[0793] 免疫刺激融合分子和包含其的组合物具有多种治疗用途，包括例如癌症和传染病的治疗。本公开尤其提供了用于在患有癌症的对象中诱导免疫应答以治疗患有癌症的对象的方法。示例性方法包括向对象给予治疗有效量的本文所述的任何免疫刺激融合分子，其中已经选择并设计了IFM以增加细胞因子的细胞表面可及性并因此增强其信号传导。
[0794] 本文所述的方法包括通过使用IFM，例如IFM或包含本文所述的IFM的纳米颗粒，例如，使用本文所述的药物组合物，来治疗对象的癌症。还提供了用于减少或改善对象的癌症症状的方法，以及用于抑制癌症的生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在实施方式中，本文描述的方法在给予了本文描述的或本文描述的药物组合物的对象中减小了肿瘤的大小和/或减少了癌细胞的数量。
[0795] 在实施方式中，癌症是血液癌症。在实施方式中，血液癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“血液癌症”是指造血或淋巴组织的肿瘤，例如，影响血液，骨髓或淋巴结的肿瘤。示例性的血液癌症包括，但不限于：白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，毛细胞白血病，急性单核细胞白血病(AMoL)，慢性髓单核细胞白血病(CMML)，青少年髓单核细胞白血病(JMML)或大颗粒性淋巴细胞性白血病)，淋巴瘤(例如与AIDS相关的淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主导的霍奇金淋巴瘤)，真菌病
(mycosis fungoides)，非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(真菌病，间变性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞淋巴瘤))，原发性中枢神经系统淋巴瘤，Sézary综合征，巨球蛋白血症)，慢性骨髓增殖性疾病，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，或骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤。
(mycosis fungoides)，非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(真菌病，间变性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞淋巴瘤))，原发性中枢神经系统淋巴瘤，Sézary综合征，巨球蛋白血症)，慢性骨髓增殖性疾病，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，或骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤。
[0796] 在实施方式中，癌症是实体癌。示例性的实体瘤癌包括，但不限于：卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域癌，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，卡波济肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，子宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊髓轴肿瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，所述癌症的转移性病变或其组合。
[0797] 在实施方式中，以适合于待治疗或预防的疾病的方式给予免疫刺激融合分子(或药物组合物)。通过诸如患者状态这样的因素以及患者疾病的类型和严重程度确定给药的数量和频率。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医师可以考虑对象的肿瘤大小，感染或转移程度，年龄，体重和状况的个体差异来确定要给予的药物组合物(或免疫刺激融合分子)的精确量。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以104至109个细胞/kg体重，例如105至106个细胞/kg体重的剂量给予，包括那些范围内的所有整数值。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以这些剂量多次给予。在实施方式中，本文描述的药物组合物可以使用免疫疗法中描述的输注技术给予(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.Med.319：1676，1988)。
[0798] 在实施方式中，将免疫刺激融合分子或药物组合物肠胃外给予给对象。在实施方式中，将细胞静脉内，皮下，肿瘤内，结节内，肌内，皮内或腹膜内给予给对象。在实施方式中，将细胞直接给予(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在实施方式中，以输注(例如，如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988中所述)或静脉内推注方式给予细胞。在实施方式中，细胞以可注射的储库制剂形式给予。
[0799] 在实施方式中，对象是哺乳动物。在实施方式中，对象是人，猴，猪，狗，猫，牛，绵羊，山羊，兔，大鼠或小鼠。在实施方式中，对象是人。在实施方式中，所述对象是儿科对象，例如小于18岁，例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或以下。在实施方式中，对象是成年人，例如，至少18岁，例如，至少19、20、21、22、23、24、25、25-30、30-35、35-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90岁。
[0800] 联合治疗
[0801] 本文公开的免疫刺激融合分子可以与第二种治疗剂或过程联合使用。
[0802] 在一些实施方式中，免疫刺激融合分子与放射疗法联合给予。
[0803] 在一些实施方式中，免疫刺激融合分子与细胞疗法联合给予，例如选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原-训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法的细胞疗法。
[0804] 在实施方式中，在已经诊断出对象患有癌症之后，例如在从对象中消除癌症之前，给予/进行免疫刺激融合分子和第二治疗剂或过程。在实施方式中，免疫刺激融合分子和第二治疗剂或过程同时或一起给予/进行。例如，当第二种药物的递送开始时，一种药物的递送仍在发生，例如，在治疗的给药上存在重叠。在实施方式中，免疫刺激融合分子和第二治疗剂或过程依次给予/进行。例如，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前停止。
[0805] 在实施方式中，联合疗法可以比单独使用任一药剂的单一疗法导致更有效的治疗。在实施方式中，与单独的第一或第二治疗相比，第一和第二治疗的组合更有效(例如，导致症状和/或癌细胞的更大减少)。在实施方式中，与作为单一疗法给予时通常达到相似效果所需的第一或第二治疗剂量相比，联合疗法允许使用更低剂量的第一或第二治疗。在实施方式中，联合疗法具有部分累加作用，完全累加作用或大于累加作用。
[0806] 在一个实施方式中，将免疫刺激融合分子与疗法例如癌症疗法(例如抗癌药，免疫疗法，光动力疗法(PDT)，手术和/或放射中的一种或多种)联合给予。术语“化疗剂”，“化学治疗剂”和“抗癌剂”在本文中可互换使用。给予免疫刺激性融合分子和治疗，例如癌症治疗，可以是依次的(有或没有重叠)或同时的。免疫刺激性融合分子的给予在治疗(例如癌症治疗)过程中可以是连续的或间歇的。本文所述的某些疗法可用于治疗癌症和非癌性疾病。例如，使用本文所述的方法和组合物(例如在Agostinis,P.等，(2011)CA Cancer
J.Clin.61：250-281中综述)，可以在癌性和非癌性疾病(例如，结核病)中增强PDT功效。
J.Clin.61：250-281中综述)，可以在癌性和非癌性疾病(例如，结核病)中增强PDT功效。
[0807] 抗癌疗法
[0808] 在其他实施方式中，免疫刺激融合分子与低或小分子量化学治疗剂联合给予。示例性的低分子量或小分子量化学治疗剂包括但不限于13-顺-视黄酸(异维甲酸，TM
)，2-CdA(2-氯脱氧腺苷，克拉屈滨，LEUSTATIN )，5-氮杂胞苷(氮杂胞苷，
)，5-氟尿嘧啶(5-FU，氟尿嘧啶， )，6-巯基嘌呤(6-MP，巯基嘌呤，
)，6-TG(6-硫鸟嘌呤，硫鸟嘌呤， )，
Abraxane(紫杉醇蛋白质-结合)，放线菌素D(放线菌素， )，铝维甲酸
(alitretinoin) 全反式视黄酸(ATRA，维甲酸， )，六甲
蜜胺(六甲基三聚氰胺，HMM， )，氨甲蝶呤(甲氨蝶呤，甲氨蝶呤钠，MTX，
TREXALLTM， )，氨磷汀 阿拉伯糖胞嘧啶(Ara-C，阿糖胞
苷， )，三氧化二砷 天冬酰胺酶(欧文氏菌L-天冬酰胺
酶，L-天冬酰胺酶， )，BCNU(卡莫司汀， )，苯达莫司汀
贝沙罗汀 博来霉素 白
消安 亚叶酸钙(嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)，
亚叶酸(folinic acid)，四氢叶酸(folinic acid))，喜树碱11(CPT-11，伊立替康，
)，卡培他滨 卡铂 卡莫司汀片
(prolifeprospan 20与卡莫司汀植入物， 晶圆)，CCI-779(西罗莫司脂化物
(temsirolimus)， )，CCNU(洛莫司汀(lomustine)，CeeNU)，CDDP(顺铂，
)，苯丁酸氮芥(瘤可宁(leukeran))，环磷酰胺
达卡巴嗪(DIC，DTIC，咪唑甲酰胺， )，
道诺霉素(柔红霉素，柔红霉素盐酸盐，盐酸鲁比霉素， )，地西他滨
右雷佐生 DHAD(米托蒽醌， )，
多西他赛 阿霉素 表柔比星
(ELLENCETM)，雌莫司汀 依托泊苷(VP-16，依托泊苷磷酸盐，
)，氟尿嘧啶 氟达拉滨
氟尿嘧啶(乳膏)(CARACTM， )，吉西他滨
羟基尿EA( DROXIATM，MYLOCELTM)，伊达比星
异环磷酰胺 依沙贝比隆(IXEMPRATM)，LCR(白屈菜碱，长
春新碱，VCR， )，L-PAM(L-肌溶素，美法仑，苯丙氨酸芥
末， )，甲氯乙胺(盐酸甲氯乙胺，芥子碱，氮芥末， )，美司
钠(MESNEXTM)，丝裂霉素(丝裂霉素-C，MTC， )，奈拉拉滨(nelarabine)
奥沙利铂(ELOXATINTM)，紫杉醇( ONXALTM)，培门冬酶(PEG-
L-天冬酰胺酶， )，PEMETREXED 喷司他丁
甲苄肼(procarbazine) 链脲佐菌素 替莫唑胺
替尼泊苷(VM-26， )，TESPA(硫代磷酰胺，塞替派，TSPA，
)，托泊替康 长春碱(硫酸长春碱，长春新碱，VLB，
)，长春瑞滨(酒石酸长春瑞滨， )和伏立
诺他
)，2-CdA(2-氯脱氧腺苷，克拉屈滨，LEUSTATIN )，5-氮杂胞苷(氮杂胞苷，
)，5-氟尿嘧啶(5-FU，氟尿嘧啶， )，6-巯基嘌呤(6-MP，巯基嘌呤，
)，6-TG(6-硫鸟嘌呤，硫鸟嘌呤， )，
Abraxane(紫杉醇蛋白质-结合)，放线菌素D(放线菌素， )，铝维甲酸
(alitretinoin) 全反式视黄酸(ATRA，维甲酸， )，六甲
蜜胺(六甲基三聚氰胺，HMM， )，氨甲蝶呤(甲氨蝶呤，甲氨蝶呤钠，MTX，
TREXALLTM， )，氨磷汀 阿拉伯糖胞嘧啶(Ara-C，阿糖胞
苷， )，三氧化二砷 天冬酰胺酶(欧文氏菌L-天冬酰胺
酶，L-天冬酰胺酶， )，BCNU(卡莫司汀， )，苯达莫司汀
贝沙罗汀 博来霉素 白
消安 亚叶酸钙(嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)，
亚叶酸(folinic acid)，四氢叶酸(folinic acid))，喜树碱11(CPT-11，伊立替康，
)，卡培他滨 卡铂 卡莫司汀片
(prolifeprospan 20与卡莫司汀植入物， 晶圆)，CCI-779(西罗莫司脂化物
(temsirolimus)， )，CCNU(洛莫司汀(lomustine)，CeeNU)，CDDP(顺铂，
)，苯丁酸氮芥(瘤可宁(leukeran))，环磷酰胺
达卡巴嗪(DIC，DTIC，咪唑甲酰胺， )，
道诺霉素(柔红霉素，柔红霉素盐酸盐，盐酸鲁比霉素， )，地西他滨
右雷佐生 DHAD(米托蒽醌， )，
多西他赛 阿霉素 表柔比星
(ELLENCETM)，雌莫司汀 依托泊苷(VP-16，依托泊苷磷酸盐，
)，氟尿嘧啶 氟达拉滨
氟尿嘧啶(乳膏)(CARACTM， )，吉西他滨
羟基尿EA( DROXIATM，MYLOCELTM)，伊达比星
异环磷酰胺 依沙贝比隆(IXEMPRATM)，LCR(白屈菜碱，长
春新碱，VCR， )，L-PAM(L-肌溶素，美法仑，苯丙氨酸芥
末， )，甲氯乙胺(盐酸甲氯乙胺，芥子碱，氮芥末， )，美司
钠(MESNEXTM)，丝裂霉素(丝裂霉素-C，MTC， )，奈拉拉滨(nelarabine)
奥沙利铂(ELOXATINTM)，紫杉醇( ONXALTM)，培门冬酶(PEG-
L-天冬酰胺酶， )，PEMETREXED 喷司他丁
甲苄肼(procarbazine) 链脲佐菌素 替莫唑胺
替尼泊苷(VM-26， )，TESPA(硫代磷酰胺，塞替派，TSPA，
)，托泊替康 长春碱(硫酸长春碱，长春新碱，VLB，
)，长春瑞滨(酒石酸长春瑞滨， )和伏立
诺他
[0809] 在另一个实施方式中，免疫刺激融合分子与生物制剂联合给予。示例性的生物制剂包括例如 (曲妥珠单抗)； (氟维司群)；(阿那曲唑)； (依西美坦)； (来曲唑)； (他莫昔
芬)， (贝伐单抗)；和 (替伊莫单抗)。
实施例
芬)， (贝伐单抗)；和 (替伊莫单抗)。
实施例
[0810] 实施例1.构建具有提高的生物持久性的抗体/IL-15融合分子
[0811] 为了证明产生具有改进特性的IFM的能力，我们构建了包含多种形式的一系列IFM：(i)包含IgG，Fab片段或scFv片段的IFM，(ii)与抗体或抗体片段的N或C端的融合体；
(iii)IL-15或IL-15Rαsushi结构域与抗体或抗体片段的融合(例如，图1和图2A-2C)；和(iv)在抗体和细胞因子之间包含变化的接头组成的IFM。
(iii)IL-15或IL-15Rαsushi结构域与抗体或抗体片段的融合(例如，图1和图2A-2C)；和(iv)在抗体和细胞因子之间包含变化的接头组成的IFM。
[0812] A.包含多种不同抗体形式的IL-15IFM
[0813] 为了探索IL-15和免疫靶向抗体的融合分子改善IL-15生物活性的潜力，我们构建了包含IL-15和mAb克隆BC8的IFM，该克隆靶向人CD45(免疫细胞表面上的丰富受体)(Cyster等，EMBO Journal，第10卷，第4期，893-902，1991)。IFM包含三种不同的抗体形式：
scFv，Fab和全长IgG。简而言之，使用由(GGGGS)3(SEQ ID NO：36)组成的氨基酸接头将野生型IL-15遗传融合至Fab或IgG轻链的C末端，或使用氨基酸接头RSGSGGGGSLQ(SEQ ID NO：
39)将野生型IL-15遗传融合至scFv的C末端。Fab和IgG抗体形式包含人恒定区和来自小鼠单克隆抗体BC8的可变结构域(例如，chBC8 Fab或chBC8 IgG)。scFv包含与(GGGGS)3接头遗传融合的BC8重链和轻链可变结构域。IL-15/抗体融合体与IL-15Rα-sushi共表达；IL-15与sushi之间的高亲和力相互作用产生了IL-15-抗体复合物，该复合物包含与IL-15Rα-sushi的非共价缔合。这些一起产生了三种IFM变体：chBC8-IL15/sushi scFv，chBC8-IL15/sushi Fab和chBC8-IL15/sushi IgG(图2A；有关更多详细信息，请参见蛋白质变体部分)。
scFv，Fab和全长IgG。简而言之，使用由(GGGGS)3(SEQ ID NO：36)组成的氨基酸接头将野生型IL-15遗传融合至Fab或IgG轻链的C末端，或使用氨基酸接头RSGSGGGGSLQ(SEQ ID NO：
39)将野生型IL-15遗传融合至scFv的C末端。Fab和IgG抗体形式包含人恒定区和来自小鼠单克隆抗体BC8的可变结构域(例如，chBC8 Fab或chBC8 IgG)。scFv包含与(GGGGS)3接头遗传融合的BC8重链和轻链可变结构域。IL-15/抗体融合体与IL-15Rα-sushi共表达；IL-15与sushi之间的高亲和力相互作用产生了IL-15-抗体复合物，该复合物包含与IL-15Rα-sushi的非共价缔合。这些一起产生了三种IFM变体：chBC8-IL15/sushi scFv，chBC8-IL15/sushi Fab和chBC8-IL15/sushi IgG(图2A；有关更多详细信息，请参见蛋白质变体部分)。
[0814] 使用脉冲生物测定法评估IFM对CD8 T细胞扩增的影响，其中将细胞因子与细胞孵育固定的时间，然后通过洗涤除去未结合的细胞因子。与不冲洗掉细胞因子的“静态”刺激测定法相比，脉冲生物测定法可更好地表征生物效应的持久性。它还适应与配体耗竭相关的混杂因素，这是定量分析高亲和力受体/配体相互作用的公认挑战(Hulme，Tevethick，配体结合测定处于平衡状态：验证和解释(Ligand binding assays at equilibrium:validation and interpretation)，Br J Pharm 2010,161:1219-1237)。相同的原理适用于基于细胞的细胞因子和生长因子定量分析，该因子通过结合细胞受体来介导其作用。我们将IFM的作用与包含sushi结构域的IL15/sushi-Fc蛋白进行比较，该sushi结构域包含与人IgG1-Fc结构域融合的保守L77I突变，并且与含有N72D突变的IL-15变体非共价缔合(通过与sushi结构域相互作用)：IL15N72D/sushiL77I-Fc。N72D突变据称改善IL-15的激动特性(Zhu，Marcus，Xu，Lee等，新型人白介素-15激动剂(Novel Human Interleukin-
15Agonists).Journal of Immunology 2009)。作为阴性对照，我们还评估了单独的chBC8(不与IL-15融合)。将IFM和对照与CD8 T细胞在37℃下孵育1小时，然后进行3次洗涤以去除未结合的蛋白质。然后将细胞铺板在完全培养基中，使其生长三天，然后使用CellTiter Blue(图2B)和流式细胞术计数珠(图2C)评估增殖。这两种方法均产生一致的结果，并证明所有三种抗体形式都能够产生比IL-15N72D/sushiL77I-Fc蛋白具有更大持久性的IFM。存在包含scFv，Fab或IgG的IFM的效力增加趋势(即效力：IgG IFM>Fab IFM>scFv IFM)。单独chBC8抗体的阴性对照没有诱导T细胞扩增，表明IL-15的存在对于IFM的增殖作用是必需的。前述内容提供了IL-15与抗CD45抗体或抗体片段的融合提高IL-15的生物持久性的非限制性实例。例如，如本文所述，多抗体形式能够产生具有改善的效力的此类IFM。
15Agonists).Journal of Immunology 2009)。作为阴性对照，我们还评估了单独的chBC8(不与IL-15融合)。将IFM和对照与CD8 T细胞在37℃下孵育1小时，然后进行3次洗涤以去除未结合的蛋白质。然后将细胞铺板在完全培养基中，使其生长三天，然后使用CellTiter Blue(图2B)和流式细胞术计数珠(图2C)评估增殖。这两种方法均产生一致的结果，并证明所有三种抗体形式都能够产生比IL-15N72D/sushiL77I-Fc蛋白具有更大持久性的IFM。存在包含scFv，Fab或IgG的IFM的效力增加趋势(即效力：IgG IFM>Fab IFM>scFv IFM)。单独chBC8抗体的阴性对照没有诱导T细胞扩增，表明IL-15的存在对于IFM的增殖作用是必需的。前述内容提供了IL-15与抗CD45抗体或抗体片段的融合提高IL-15的生物持久性的非限制性实例。例如，如本文所述，多抗体形式能够产生具有改善的效力的此类IFM。
[0815] B.包含不同的IL-15与抗-CD45的融合策略的IFM
[0816] 为了探索IFM的细胞因子和抗体之间的替代融合策略，我们另构建了六个IFM，包括IL-15与嵌合BC8 Fab或IgG抗体的N端或C端的融合体。前两个IFM通过将IL-15遗传融合到chBC8 Fab或chBC8 IgG轻链的N末端而构建，并且抗体融合体与IL-15Rα共表达以产生IFM：IL15-chBC8/sushi Fab和IL15-chBC8/sushi IgG(图3A-3B；更多信息，请参见“蛋白质变体”部分)。我们在以上实施例1A中使用chBC8-IL15的命名约定，在此使用IL15-chBC8的命名约定分别指IL-15与抗体C-或N-末端的融合体。通过将野生型IL-15Rα-sushi融合到chBC8 Fab或IgG轻链的N或C末端来构建另外四个IFM，并共表达这些带IL-15N72D的抗体融合体(图3C-3D)：chBC8-sushi/IL15N72D Fab，sushi-chBC8/IL15N72D Fab，chBC8-sushi/IL15N72D IgG，sushi-chBC8/IL15N72D IgG(更多信息请参见蛋白质变体部分)。连同实施例1A中的两个Fab和IgG IFM(chBC8-IL15/sushi Fab和chBC8-IL15/sushi IgG)，这八个IFM允许我们测试各种抗体融合策略，IL-15的遗传融合与将sushi与免疫靶向部分的遗传融合，以及包含野生型或突变的IL-15变体的IFM。
[0817] 在第一个实验中，我们以脉冲生物测定形式评估了包含IL-15N72D的IFM，发现与包含IL-15N72D和sushi-Fc变体之间的复合物的IL-15形式相比，对于Fab和IgG融合体以及N和C端融合体，IFM均显示更高的活性(图4A-4B)。在比较所有八个IFM变体的另一个实验中，我们观察到了IL-15或sushi与抗体的融合体的相似效力，还观察到了包含野生型IL-15和IL15-N72D的蛋白质变异的相似效力(图5A-5B)。我们观察到一种趋势，其中IL-15或sushi与chBC8 IgG或Fab的C末端融合比与抗体N末端融合导致更大的CD8 T细胞扩增(图4A-4B和图5A-5B)。然而，每个IFM变体(包括与IgG或Fab的N-末端融合)显示比不包含CD45受体结合功能的对照蛋白IL15-N72D/sushiL77I-Fc更大的效力(图3C-3D和图4A-4B)。作为对照，单独的嵌合BC8或亲本BC8小鼠mAb抗体不会诱导T细胞扩增(图4A-4B和图5A-5B)，与我们上面的观察一致。我们还以“静态”分析形式评估了8个IFM对CD8 T细胞增殖的影响。孵育三天(不洗涤)后，每个IFM产生与IL15N72D/sushiL77I-Fc相似的活性，除了包含IL-15与Fab片段的N端融合体的IFM(IL15-chBC8/sushi Fab)，这导致该测定形式的效力稍弱(图5C-5D)。IgG融合体显示与IL-15Fab融合体相似的效价(图3B)。我们得出的结论是，IL-15/sushi复合物与靶向CD45受体的抗体的多种融合策略会导致IFM具有更高的生物持久性，并且IFM融合策略可改善野生型和突变形式的IL-15的活性。
[0818] C.包含与抗体重链或轻链的C端融合的IL-15的IMF
[0819] 我们构建了另一种chBC8-细胞因子融合体以评估将细胞因子融合至抗体重链或轻链C末端的能力。将野生型IL-15遗传融合到chBC8重链(HC)的C端，并将此构建体与IL15Rα-sushi共表达以产生IFM变体chBC8(HC)-IL15/sushi IgG(图6A)。我们将chBC8(HC)-IL15/sushi IgG与先前实例中描述的chBC8-IL15/sushi IgG进行了比较，该chBC8-IL15/sushi IgG包含与轻链C末端融合的IL-15；为了清楚起见，为了将其与包括与重链C末端融合的IFM区分开，在此我们将后者蛋白质称为chBC8(LC)-IL15/sushi IgG。在37℃下将活化的人CD8 T细胞用chBC8(HC)-IL15/sushi IgG或chBC8-IL15(LC)/sushi IgG的400nM至25.6pM的七次连续五倍稀释液脉冲处理1小时，然后用全培养基洗涤三遍并以500,000细胞/mL接种。仅对培养基进行系列稀释，将亲本BC8抗体(不包含与IL-15的融合体)或IL-
15WT/sushi-Fc(不具有免疫靶向功能)用作对照。培养5天后，我们使用CellTiter-Blue测量了CD8 T细胞扩增。chBC8(HC)-IL15/sushi IgG和chBC8-IL15(LC)/sushi IgG IFM，但非IL15WT/sushi-Fc或亲本BC8抗体，各自诱导T细胞扩增并表现出相似的剂量反应特征(图
6B)。我们得出的结论是，IL-15与抗体轻链或重链C末端的融合均能够产生持续性提高的IFM。
15WT/sushi-Fc(不具有免疫靶向功能)用作对照。培养5天后，我们使用CellTiter-Blue测量了CD8 T细胞扩增。chBC8(HC)-IL15/sushi IgG和chBC8-IL15(LC)/sushi IgG IFM，但非IL15WT/sushi-Fc或亲本BC8抗体，各自诱导T细胞扩增并表现出相似的剂量反应特征(图
6B)。我们得出的结论是，IL-15与抗体轻链或重链C末端的融合均能够产生持续性提高的IFM。
[0820] D.改善的IFM效力需要功能性抗体结合
[0821] 上面我们已经证明，单独与CD45结合(例如，用不包含与IL-15融合体的BC8抗体)不能解释IFM活性的提高(图3C-3D，图4A-4B和图5A-5D)。这支持了IFM效力的细胞因子需求。我们另采用两个对照以证明抗体与其同源细胞表面受体结合的功能要求。在第一个实验中，我们在存在或不存在作为CD45细胞表面受体可溶性竞争剂的1μM BC8的情况下，针对实施例1A中所述的八个IFM中的每一个，对活化的原代人CD8 T细胞进行了脉冲分析。在37℃脉冲孵育1小时后，将细胞洗涤3次，然后以300,000个细胞/mL的密度接种在完全RPMI培养基中。在37℃下放置5天后，使用CellTiter Blue测量细胞扩增；BC8竞争剂的存在消除了脉冲生物测定法中所有八个IFM的活性(图7A-7B)。
[0822] 在第二个实验中，我们生成了两个包含功能性或非功能性BC8结合区的IFM。具有功能性BC8区的IFM包含具有人源化BC8可变结构域的Fab抗体片段，其中将来自亲本BC8抗体的CDR移植到人可变结构域上，以及IL-15WT与人源化BC8 Fab轻链的融合体。该复合物与IL-15Rα-sushi共表达，形成了IFM变体hBC8(23)-IL15/sushi Fab(更多信息，请参见“蛋白质变体”部分)。人源化BC8抗体(hBC8(23))具有与嵌合BC8抗体相似的结合亲和力(图10A)。具有非功能性BC8区的IFM(hBC8-无-IL15/sushi Fab)包含相同的Fab片段，但抗体重链中CDR3的五个氨基酸除外，这些氨基酸被残基SGGGS取代。这些氨基酸取代导致人源化BC8抗体，对于所测试的浓度，其未表现出可检测到的与细胞CD45的结合(图10A)。这些蛋白质中的每一个都用活化的人CD8 T细胞(浓度范围为400nM至25.6pM的七个连续的五倍稀释液)脉冲处理，然后洗涤细胞并以500,000个细胞/mL接种在96孔板中。在37℃下三天后，hBC8(23)-IL15/sushi Fab，而非hBC8-无-IL15/sushi Fab，支持CD8 T细胞扩增(图7C)。综上所述，这些数据表明需要功能性细胞表面受体结合来提高IFM的效力。
[0823] E.与抗-CD45的融合增加了IL-15的加载和细胞表面持久性
[0824] 为了探索改善的IFM的生物持久性是否与IL-15在细胞上的增加的加载和持久性相关，我们分析了随时间推移的细胞表面IFM水平。在PBS和HBSS的1:1混合物中用0.75mg/mL的hBC8(23)-IL15/sushi Fab，IL-15/sushi-Fc2Da或IL-15N72D/sushiL77I-Fc脉冲处理密度为5x 107细胞/mL的CD8 T细胞1小时，然后用完全培养基洗涤3次。Sushi-Fc2Da是野生型IL-15Rα-sushi与人IgG2-Fc结构域的变体的融合体。将其中细胞在PBS和HBSS的1:1混合物中孵育的空白脉冲对照用作阴性对照。然后使用荧光标记的抗IL-15抗体对细胞进行IL-15染色，或者使用识别人IgG轻链和重链的荧光标记的多克隆抗体对细胞进行IgG结构域(Fab或Fc片段)染色。这些抗体可检测T细胞表面上的IL-15或相关的Fab或Fc片段。hBC8(23)-IL15/sushi Fab蛋白产生的IL-15染色水平明显高于IL15/sushi-Fc2Da或IL15-
N72D/sushiL77I-Fc蛋白，表明细胞表面IL-15的丰度更高(图8A)。我们观察到IgG染色的一致结果，其中IFM比IL15/sushi-Fc构建体导致更高水平的染色(图8A)。作为IL-15增殖作用的阳性对照，我们向空白(mock)脉冲对照(“空白然后饱和”条件)中添加了约10nM IL15/sushi-Fc2Da；对于含IL-15/sushi的变体，这对应于高于EC90的浓度(参见图3A-3D)，因此用作IL-15的最大增殖作用的阳性对照。脉冲孵育后三天，将细胞在培养物中繁殖并监测IL-15表面水平。对于hBC8(23)-IL15/sushi Fab，IL-15的检测值仍高于背景，而在脉冲孵育后的一天，两个IL15/sushi-Fc变体与背景却无法区分(图8B)。hBC8(23)-IL15/sushi Fab的脉冲进一步导致与IL15/sushi-Fc变体的饱和量相似的细胞扩增(图8C)。
N72D/sushiL77I-Fc蛋白，表明细胞表面IL-15的丰度更高(图8A)。我们观察到IgG染色的一致结果，其中IFM比IL15/sushi-Fc构建体导致更高水平的染色(图8A)。作为IL-15增殖作用的阳性对照，我们向空白(mock)脉冲对照(“空白然后饱和”条件)中添加了约10nM IL15/sushi-Fc2Da；对于含IL-15/sushi的变体，这对应于高于EC90的浓度(参见图3A-3D)，因此用作IL-15的最大增殖作用的阳性对照。脉冲孵育后三天，将细胞在培养物中繁殖并监测IL-15表面水平。对于hBC8(23)-IL15/sushi Fab，IL-15的检测值仍高于背景，而在脉冲孵育后的一天，两个IL15/sushi-Fc变体与背景却无法区分(图8B)。hBC8(23)-IL15/sushi Fab的脉冲进一步导致与IL15/sushi-Fc变体的饱和量相似的细胞扩增(图8C)。
[0825] 我们认为我们使用的IL-15抗体(克隆编号34559，RD系统公司(R&D Systems))可能与IL-15上至少部分与IL-15Rβ重叠的表位结合，因此可能检测到尚未与IL-15信号转导受体大量结合的IL-15。该抗体已被多个小组描述为封闭/中和抗体(参见例如，Neely,GG,Robbins,Amankwah等，(2001)J Imm 167:5011-5017；Krutzik,Hewison,Liu,Robles等，(2008)J Imm 181:7115-7120；Schlaepfer,Speck(2008)PLoS ONE 3:e1999；和Correia,Cardoso,Pereira,Neves等，J Imm(2009)182:6149-6159)。然而，它似乎没有通过竞争性的IL-15与IL-15Rα的竞争结合而介导其中和作用：IL-15通过与IL-15Rα的相互作用而出现在树突状细胞表面，该抗体先前已用于在树突状细胞上检测IL-15的这种呈递(Ferlazzo，Pack，Thomas，Paludan等，PNAS 2004)。与这些观察结果一致，我们能够使用该抗体在T细胞表面上检测hBC8(23)-IL15/sushi Fab和IL15/sushi-Fc变体(图8A-8B；每种蛋白质变体都包含IL-15Rα-sushi和IL-15之间的缔合)。因此，抗体的中和活性可能来自与IL-15，IL-2/IL-15Rβ或共同γ链的其他两个细胞表面受体之一的竞争性结合。这样，用该抗体检测IL-15可能反映出IL-15在T细胞表面上的过量加载，超过了使其细胞表面受体，例如，IL-2/IL-
15Rβ或共同γ链饱和的水平。这也可以解释为IL-15/sushi-Fc构建体检测到的细胞表面IL-15水平低(图8A-8B)，其仅通过IL-15受体与T细胞相互作用，尽管与sushi-Fc融合体缔合而产生二聚体IL-15可能导致细胞因子的轻微丰度。总体而言，我们得出的结论是，IFM既可以促进T细胞表面上IL-15的更大初始加载，又可以支持细胞表面上可生物利用的IL-15随时间推移的水平升高。
15Rβ或共同γ链饱和的水平。这也可以解释为IL-15/sushi-Fc构建体检测到的细胞表面IL-15水平低(图8A-8B)，其仅通过IL-15受体与T细胞相互作用，尽管与sushi-Fc融合体缔合而产生二聚体IL-15可能导致细胞因子的轻微丰度。总体而言，我们得出的结论是，IFM既可以促进T细胞表面上IL-15的更大初始加载，又可以支持细胞表面上可生物利用的IL-15随时间推移的水平升高。
[0826] F.多接头组合物支持增强IFM效力
[0827] 为了评估围绕IL-15和IFM抗体之间的连接的柔性，我们探索了多种不同的多肽接头组合物。实施例1中探索的IFM各自包含IL-15或sushi之间的柔性15氨基酸接头和由(GGGGS)3的三个串联重复序列组成的抗体；接头-1，SEQ ID NO：36)。在这里，我们探索了另外两个接头组合物，包括一个柔性的8个氨基酸接头((GGGS)2；接头2，SEQ ID NO：37)和一个衍生自人IgG1铰链区的中等柔性的12个氨基酸接头(DKTHTSPPSPAP；接头-3，SEQ ID NO：
38，带下划线的位置表示IgG1铰链区的残基，其对于该接头从半胱氨酸突变为丝氨酸)。使用接头-2或接头-3将IL-15WT融合到chBC8 Fab片段轻链的C末端，并与IL-15Rα-sushi共表达以分别生成chBC8-L2-IL15/sushi Fab和chBC8-L3-IL15/sushiFab(图9A)。我们之前在实施例1中描述了chBC8-IL15/sushi Fab；该IFM变体在IL-15和chBC8轻链之间包含
(GGGGS)3接头(接头1，SEQ ID NO：36)；为了一致性，我们在这里将该构建体称为chBC8-L1-IL15/sushi Fab(图9A)。如实施例1中所述，在具有CD8 T细胞的脉冲生物测定法中评估这些蛋白质构建体。与空白连续稀释液一起孵育，该空白连续稀释液仅包含培养基或hBC8-无-IL15/sushi Fab，其包含突变为消除与CD45亲和力的BC8结合结构域(图10A)，用作阴性对照。脉冲孵育三天后，我们使用CellTiter Blue分析了细胞增殖情况，发现所有三种接头组合物均能够诱导T细胞扩增(图9B)。我们得出的结论是，细胞因子和抗体之间的多个接头组合物能够产生具有增强效力的IFM。
38，带下划线的位置表示IgG1铰链区的残基，其对于该接头从半胱氨酸突变为丝氨酸)。使用接头-2或接头-3将IL-15WT融合到chBC8 Fab片段轻链的C末端，并与IL-15Rα-sushi共表达以分别生成chBC8-L2-IL15/sushi Fab和chBC8-L3-IL15/sushiFab(图9A)。我们之前在实施例1中描述了chBC8-IL15/sushi Fab；该IFM变体在IL-15和chBC8轻链之间包含
(GGGGS)3接头(接头1，SEQ ID NO：36)；为了一致性，我们在这里将该构建体称为chBC8-L1-IL15/sushi Fab(图9A)。如实施例1中所述，在具有CD8 T细胞的脉冲生物测定法中评估这些蛋白质构建体。与空白连续稀释液一起孵育，该空白连续稀释液仅包含培养基或hBC8-无-IL15/sushi Fab，其包含突变为消除与CD45亲和力的BC8结合结构域(图10A)，用作阴性对照。脉冲孵育三天后，我们使用CellTiter Blue分析了细胞增殖情况，发现所有三种接头组合物均能够诱导T细胞扩增(图9B)。我们得出的结论是，细胞因子和抗体之间的多个接头组合物能够产生具有增强效力的IFM。
[0828] 方法
[0829] 蛋白质表达。在无血清培养基中从悬浮液适应的HEK 293细胞生产蛋白质。一例例外是亲本小鼠单克隆抗体BC8，该抗体是从美国典型细胞培养(American Type Cell Culture)(ATCC，目录号HB-10507)获得的BC8杂交瘤培养物中纯化得到的。然后通过蛋白A树脂(用于Fc融合体和全长(IgG)抗体)，KappaSelect树脂(GE医疗公司(GE Healthcare)；
用于与抗体Fab片段的融合体)，或组氨酸亲和树脂(例如镍-氨三乙酸，Ni-NTA；适用于6-His标记的scFv融合体)适当地纯化蛋白质。将纯化的蛋白质缓冲液交换成磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过还原和非还原SDS-PAGE和聚集来确认近似分子量，并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定多聚体状态。基于聚集或多聚体状态，任选地使用AKTA Pure色谱系统(GE生命技术公司(GE Life Sciences))上的HiLoad Superdex 200制备级色谱柱(GE生命技术公司)通过SEC纯化蛋白质。
用于与抗体Fab片段的融合体)，或组氨酸亲和树脂(例如镍-氨三乙酸，Ni-NTA；适用于6-His标记的scFv融合体)适当地纯化蛋白质。将纯化的蛋白质缓冲液交换成磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过还原和非还原SDS-PAGE和聚集来确认近似分子量，并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定多聚体状态。基于聚集或多聚体状态，任选地使用AKTA Pure色谱系统(GE生命技术公司(GE Life Sciences))上的HiLoad Superdex 200制备级色谱柱(GE生命技术公司)通过SEC纯化蛋白质。
[0830] 静态生物测定。根据制造商的说明，在存在10ng/mL人IL-2(目录号202-IL-050/CF，RD系统公司)的情况下，使用CD3/CD28磁珠(Dynabeads目录号11132D，赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific，Inc.))激活从人血(得自Biospecialty集团)中分离的CD8 T细胞，在装有含RPMI 1640并添加10％热灭活的胎牛血清(FBS-HI，赛默飞世尔科学公司)，青霉素/链霉素和1％Glutamax(产品目录号35050-061，赛默飞世尔科学公司)的完全2
RPMI培养基(目录号30-2001，美国类型细胞培养)6孔9.5cm板上中接种，并且在37℃和5％CO2下培养。刺激3天后，将CD3/CD28珠除去，并将细胞在完全RPMI培养基中静置24小时。除非有另外说明，然后在浓度范围为20nM至4.9pM的六次连续四倍稀释的IFM或对照蛋白质存在下将T细胞以0.5 x 106个细胞/mL的浓度接种到96孔板中，或仅培养基作为阴性对照。在
37℃和5％CO2下三天后，通过CellTiter-Blue(目录号G8081，普洛麦格公司(Promega))分析了细胞扩增。
RPMI培养基(目录号30-2001，美国类型细胞培养)6孔9.5cm板上中接种，并且在37℃和5％CO2下培养。刺激3天后，将CD3/CD28珠除去，并将细胞在完全RPMI培养基中静置24小时。除非有另外说明，然后在浓度范围为20nM至4.9pM的六次连续四倍稀释的IFM或对照蛋白质存在下将T细胞以0.5 x 106个细胞/mL的浓度接种到96孔板中，或仅培养基作为阴性对照。在
37℃和5％CO2下三天后，通过CellTiter-Blue(目录号G8081，普洛麦格公司(Promega))分析了细胞扩增。
[0831] 脉冲生物测定。如在静态生物测定中所述，在存在10ng/mL IL-2的情况下，用CD3/CD28珠(Dynabeads，赛默飞世尔科学公司)刺激人CD8 T细胞(来自Biospecialty集团)。刺激3天后，将CD3/CD28珠除去，并将细胞在完全RPMI培养基中静置24小时。除非另有说明，将活化的T细胞以500,000细胞/mL的细胞密度与在80nM至5nM的浓度范围(三次连续四倍稀释)的IFM或对照蛋白质孵育，除非另有说明，仅培养基(0nM)作为阴性对照。在37℃和5％CO2下1小时后，用完全RPMI培养基洗涤3次以去除未结合的细胞因子，然后在96孔板中以完全RPMI培养基中0.5x106细胞/mL的浓度接种，除非另有说明。其他对照任选地包括亲本BC8抗体或chBC8 IgG抗体。在37℃和5％CO2下三天后，通过CellTiter-Blue或流式细胞术分析了T细胞扩增。对于流式细胞术，使用7-AAD(目录号A9400-5MG，西格玛公司(Sigma))对CountBright绝对计数珠(目录号C36950，赛默飞世尔科学公司)进行染色(随后在分析过程中排除死细胞))用于根据制造商的说明定量活细胞密度。
[0832] 测量细胞表面上的IFM。在脉冲孵育和洗涤后的培养0、1和3天后，通过免疫荧光染色分析细胞以检测细胞表面IFM。简而言之，将细胞用含有1mg/mL牛血清白蛋白(PBS/BSA)的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后用在PBS/BSA中1:100稀释的PE偶联的抗IL15抗体(克隆号34559；RD系统公司，目录号IC2471P)和1:100稀释的DyLight650偶联的抗人IgGH+L多克隆抗体(赛默飞世尔目录号Sa5-10129)染色。在4℃下孵育20-30分钟后，将细胞用PBS/BSA洗涤一次，然后重悬于PBS/BSA中，以使用Diva软件(BD生物科学公司(BD Biosciences))在FACSCelesta上进行分析。使用Cytobank(Cytobank公司)和GraphPad Prism(GraphPad软件公司)分析数据。
[0833] 实施例2.IL15与替代抗-CD45抗体的融合体
[0834] 为了评估除BC8以外的抗CD45抗体是否能够产生具有增强效力的IFM，我们评估了另外两种抗CD45单克隆抗体(mAb克隆9.4和4B2)。我们首先评估了这些抗体的嵌合IgG形式与活化CD8 T细胞表面上表达的CD45的结合亲和力。嵌合抗体各自包含小鼠可变结构域和人恒定区(人恒定κ结构域和含有S228P突变以稳定IgG4铰链区的人IgG4)。为了与以前的结果进行比较，我们评估了这些抗体以及chBC8，hBC8(23)和非结合变体hBC8-无。人源化BC8抗体由含有从BC8移植的CDR区的可变结构域组成，并且hBC8-无变体在重链CDR3中包含SGGGS取代，其消除了与CD45的结合(图10A)。ch4B2和ch9.4抗体表现出对细胞CD45的最高亲和力，表观解离常数(KD，app)分别为0.44和0.84nM，而chBC8和hBC8(23)抗体表现出的KD，app分别为6.68和7.8nM(图10A)。在所检验的最高浓度(500nM；图10A)下，hBC8-无抗体没有显示显著结合。我们使用术语表观解离常数(KD，app)来区分真正平衡解离常数：IgG抗体的二价性质引入了亲合力效应，这种效应使这些类型的测定的真正平衡解离常数的计算复杂化。然而，KD，app是在其天然情况下对抗体对细胞受体的相对亲和力进行评分的有用度量。
[0835] 接下来，我们评估了包含每种抗体的IFM的效力。简而言之，将IL-15融合到ch9.4或ch4B2 Fab片段轻链的C末端，并与IL-15Rα-sushi共表达以分别生成ch9.4-IL15/sushi Fab和ch4B2-IL15/sushi Fab。实施例1中描述了chBC8-IL15/sushi Fab，hBC8(23)-IL15/sushi Fab和hBC8-无-IL15/sushi Fab的构建。我们在脉冲生物测定法中比较了这些IFM的效力，并包括一系列阴性对照：hBC8-无-IL15/sushi Fab(具有清除的CD45结合的IFM)，IL-WT15 /sushi-Fc，BC8抗体和仅培养基。如在脉冲孵育后三天测量，每个IFM诱导的T细胞扩增均大于阴性对照(图10B)。与包含chBC8或hBC8(23)的IFM相比，包含4B2或9.4的IFM具有增加的效力。与chBC8和hBC8(23)相比，这与4B2和9.4的亲和力增加是一致的，并且与抗体对细胞表面受体的亲和力增加导致IFM效力增加的想法是一致的。总的来说，我们得出结论，具有改善的生物持久性的IFM的生成不限于BC8抗体，并且与细胞表面受体的亲和力增加可以改善IFM的效力。
[0836] 方法
[0837] 细胞结合测定。如实施例1中所述，用CD3/CD28珠和10ng/mL IL-2激活原代人CD8 T细胞。激活后，在完全RPMI培养基中过夜放置(参见实施例1的方法)，在4℃下将T细胞与浓度范围从500nM到6.4pM的七次连续五倍稀释的抗体，或与仅培养基对照孵育1小时。用MACS缓冲液(PBS，2％FBS，1mM EDTA)洗涤细胞3次，并使用偶联有PE的抗人IgG-Fc抗体(BioLegend，目录号HP6017)在4℃检测抗体结合20分钟。将细胞用MACS缓冲液洗涤两次，并重悬于具有活-死染料(7-AAD)的MACS缓冲液中。使用PE信号范围内的活细胞群(通过7-AAD排除法)的中值荧光强度(MFI)对抗体结合进行定量。通过针对抗体浓度绘制平均荧光单位来生成曲线，并使用四参数对数方程，使用GraphPad Prism(GraphPad软件公司)，通过非线性回归确定表观解离常数(KD，app)。
[0838] 脉冲生物测定。如实施例1所述进行脉冲生物测定。
[0839] 蛋白质表达。如实施例1所述产生蛋白质。
[0840] 实施例3.靶向另外的细胞表面受体的IFM促进改善的效力和特异性
[0841] A.除CD45以外的其他细胞表面受体有助于改善细胞因子的效力。
[0842] 为了探索靶向除CD45以外的细胞表面受体的IFM是否能够提高生物效力，我们构建了包含针对其他细胞表面受体的抗体的IFM。替代受体可以是细胞表面上的丰富受体，或可以在蛋白质水平上表现出持久性(例如，显示缓慢的受体内化或受体内化后强烈再循环回到细胞表面)。理想地，受体既丰富又持久。基于这些考虑，我们选择了靶向CD8，CD11a或CD18的IFM进行评估。CD8是在细胞毒性T细胞上表达的T细胞受体的辅助受体。CD8也可以在皮质胸腺细胞，树突状细胞和自然杀伤细胞中表达。在细胞毒性T细胞中，CD8有助于维持活化的T细胞受体/MHC复合物在细胞表面上(Wooldridge，van den berg，Glick等，JBC，2005年)，一旦T细胞受体被内化，与T细胞受体相比，CD8辅助受体就会优先保留在细胞表面上(1989J Imm Boyer，Auphan，Gabert，Schmitt-Verhulst等，T细胞上抗原受体/CD3复合物，CD8和I类MHC编码蛋白的磷酸化和内化比较(Comparison of phosphorylation and internalization of the antigen receptor/CD3 complex,CD8,and Class I MHC-
encoded proteins on T cells))。淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)是由整合素α-L
(CD11a)和整合素β-2(CD18)组成的异二聚体细胞表面受体，并参与细胞间粘附和淋巴细胞共刺激。整合素通常在蛋白质水平上表现出持久性：它们通常在细胞表面表现出缓慢的内化或在内后再循环回到细胞表面(2012 J Cell Sci，整合素概述(Integrins at a
Glance)和1989 EMBO J CHO中Fn受体的内吞作用和再循环(Endocytosis and recycling of the Fn receptor in CHO))。LFA-1高水平存在于几种不同类型的白细胞中，并已显示在多种不同细胞类型中的缓慢内化，包括单核U937细胞，早幼粒细胞白血病细胞系HL-60和成淋巴细胞样细胞系JY(1992，EMBO J循环整合素Bretscher(Circulating Integrins Bretscher))。此外，对CD11a抗体，依法珠单抗的临床前研究表明，CD11a在从血液中分离的人和小鼠T细胞中在蛋白质水平上表现出持久性；然而，在二级交联抗体存在下，依法珠单抗可以诱导受体内化和降解(2004 Coffey，Pippig等，J Pharm Exp Ther)。
encoded proteins on T cells))。淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)是由整合素α-L
(CD11a)和整合素β-2(CD18)组成的异二聚体细胞表面受体，并参与细胞间粘附和淋巴细胞共刺激。整合素通常在蛋白质水平上表现出持久性：它们通常在细胞表面表现出缓慢的内化或在内后再循环回到细胞表面(2012 J Cell Sci，整合素概述(Integrins at a
Glance)和1989 EMBO J CHO中Fn受体的内吞作用和再循环(Endocytosis and recycling of the Fn receptor in CHO))。LFA-1高水平存在于几种不同类型的白细胞中，并已显示在多种不同细胞类型中的缓慢内化，包括单核U937细胞，早幼粒细胞白血病细胞系HL-60和成淋巴细胞样细胞系JY(1992，EMBO J循环整合素Bretscher(Circulating Integrins Bretscher))。此外，对CD11a抗体，依法珠单抗的临床前研究表明，CD11a在从血液中分离的人和小鼠T细胞中在蛋白质水平上表现出持久性；然而，在二级交联抗体存在下，依法珠单抗可以诱导受体内化和降解(2004 Coffey，Pippig等，J Pharm Exp Ther)。
[0843] 通过将IL-15遗传融合到各个抗体片段轻链的C末端，我们构建了靶向CD8(抗体克隆OKT8)，CD11a(抗体克隆MHM24)或CD18(抗体克隆1B4)的IFM。IL-15抗体融合体与IL-15Rα-sushi共表达以产生三种IFM：chMHM24-IL15/sushi Fab，ch1B4-IL15/sushi Fab和chOKT8-IL15/sushi Fab(图11A)。每个Fab片段由具有小鼠可变区和人恒定结构域(κ和CH1)的嵌合人和小鼠区组成。如实施例1中所述，在脉冲生物测定法中分析了IFM对CD8 T细胞的效力；脉冲孵育后培养三天后，使用CellTiter Blue分析细胞的增殖。这三个IFM各自支持与chBC8-IL15/sushi Fab相似的T细胞增殖水平(图11B)。上面我们已经证明了不包含免疫靶向功能的IL-15形式在脉冲生物测定中显示最小的作用(图2A-2C，4A-4B，5A-5D，6A-6B和8A-8C)。这一起证明其他细胞表面受体能够产生具有改善的生物持久性的IFM。
[0844] B.促进提高对CD8 T细胞效力的IFM
[0845] 为了评估细胞表面受体靶向能否促进获得针对个体细胞类型的改善效力，我们比较了CD4和CD8 T细胞上CD8靶向的IFM的效力。用chOKT8-IL15/sushi Fab以脉冲生物测定形式处理CD4或CD8细胞，并在脉冲孵育三天后测量细胞增殖。与CD4 T细胞相比，靶向CD8的IFM更有效地刺激了CD8 T细胞(图12A-12B)，从而支持了基于IFM抗体靶向特定细胞类型的能力。
[0846] 方法
[0847] 对CD4或CD8 T细胞进行脉冲生物测定。如实施例1中所述，在10ng/mL IL-2存在下，使用CD3/CD28激活珠激活了原代人CD3 T细胞，该细胞包含表达CD4，CD8或CD4和CD8辅助受体的细胞的混合物。激活三天后，将珠去除，并将细胞在完全RPMI培养基中静置过夜。然后，我们根据制造商的方案，使用磁激活细胞分选(MACS)，使用(目录号130-045-101和
130-045-201，美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec，Inc.))纯化了CD4和CD8 T细胞的个体群。然后按照实施例1所述在脉冲生物测定法中分析CD4或CD8 T细胞。
130-045-201，美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec，Inc.))纯化了CD4和CD8 T细胞的个体群。然后按照实施例1所述在脉冲生物测定法中分析CD4或CD8 T细胞。
[0848] 实施例4.包含IL-15IFM的蛋白质纳米凝胶支持长期细胞扩增
[0849] 载有药物的纳米颗粒(在本文中也称为“背包”)具有支持细胞活力和功能的潜力。因此，我们探索了形成包含IFM的纳米颗粒的能力以及这些纳米颗粒对T细胞活力和扩增的影响。我们使用可逆的，胺反应性，同双功能交联剂将hBC8(23)-IL15/sushi Fab交联到蛋白质纳米凝胶中。包含IL15N72D/sushiL77I-Fc的蛋白质纳米凝胶用作比较物。这两种蛋白质均高效地交联成蛋白质纳米凝胶：通过SEC分析，蛋白质纳米凝胶的洗脱时间比游离蛋白质的洗脱时间快，这与较大物质相符(图13A和13B)。将该蛋白质纳米凝胶的HPLC迹线与游离的(非交联的)蛋白质进行比较(图13A-13B)，发现交联的纳米凝胶中保留了最少量的游离蛋白质，表明该蛋白质高度转化为纳米凝胶。蛋白质纳米凝胶涂有聚乙二醇和聚赖氨酸的共嵌段聚合物，并与CD8 T细胞孵育。与非交联的蛋白质和未刺激的对照相比，两种蛋白质纳米凝胶均支持长期的细胞扩增(图13C)。
[0850] 方法
[0851] 蛋白质纳米凝胶合成。包含交联的蛋白质纳米颗粒的蛋白质纳米凝胶如下形成。chBC8-IL15/sushi Fab融合蛋白通过在存在终浓度为2.5％的聚乙二醇，平均分子量为400道尔顿(PEG-400，斯百全化学公司(Spectrum Chemical Mfg.Corp.))和10％的甘油(西格玛公司)的条件下，与27倍摩尔过量的可降解交联剂(式I)以17mg/mL的浓度孵育，从而将其交联成蛋白质纳米凝胶。通过将浓度为17mg/mL的蛋白质与27倍摩尔过量的可降解交联剂一起孵育，将IL15N72D/sushiL77I-Fc蛋白交联成蛋白质纳米凝胶(式I)。本研究中使用的交联剂二[2-(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基氧基)乙基]二硫化物包含两个N-羟基琥珀酰亚胺
(NHS)酯基，它们通过式I所示的含柔性二硫键的接头连接在一起。
(NHS)酯基，它们通过式I所示的含柔性二硫键的接头连接在一起。
[0852] 式I：
[0853]
[0854] 在室温下孵育30分钟后，将反应液用Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)稀释至最终细胞因子浓度为1.5mg/mL。然后，通过使用Zeba色谱柱(截止分子量为40,000MW，赛默飞世尔)将缓冲液交换成DPBS，从接头离去基团(包含作为交联反应的一部分被除去的接头的分子片段)和未反应的接头中纯化蛋白质纳米凝胶。根据制造商的说明使用Zeba色谱柱，包括使用DPBS连续洗涤3次以平衡DPBS中的色谱柱，以促进缓冲液交换，然后施加反应产物。使用BioSepTM SEC-s4000色谱柱(Phenomenex公司(Phenomenex Inc.))，以PBS(pH 7.2)作为洗脱液(流速0.5mL/分钟)，在配备有光电二极管阵列(岛津公司(Shimadzu Corp.))的Prominence HPLC系统上通过尺寸排阻色谱(SEC)分析缓冲液交换的蛋白质纳米凝胶。
[0855] 细胞因子浓度约为1-1.5mg/mL的蛋白质纳米凝胶与聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG-polyK)嵌段共聚物：PEG5k-polyK30(Alamanda聚合物目录号050-KC030)偶联，该嵌段共聚物包含平均分子量为5千道尔顿(kD)的聚乙二醇聚合物和30个氨基酸的聚赖氨酸聚合物(polylysine30或polyK30)。PEG5k-polyK30或在DPBS中重建至1mg/mL，并以50ug/mL的最终嵌段共聚物浓度添加至1-1.5mg/mL的蛋白质纳米凝胶中，并在室温下孵育30分钟。
[0856] T细胞扩增分析。将蛋白质浓度为1-1.5mg/mL的包含PEG5k-polyK30的蛋白质纳米凝胶与以100 x 106细胞/mL的细胞浓度在HBSS中的1 x 106CD8 T细胞等体积混合，并在37℃下孵育1小时。然后用含10％FBS，青霉素/链霉素和Glutamax(均来自赛默飞世尔科学公司)的RPMI培养基将T细胞洗涤3次，以大约1 x 106细胞/mL的细胞密度接种，并在24孔组织培养板中培养9天。背包细胞附着后三天，将细胞以1：5的比例分入新鲜培养基。在第0、1、2、3、6和9天通过流式细胞术通过活死细胞染色(7-AAD)和计数珠(CountBright绝对计数珠，赛默飞世尔科学公司)测量细胞增殖。
[0857] 实施例5：包含与免疫调节剂的融合体的示例性IFM
[0858] 除了与细胞因子的融合体外，免疫细胞靶向抗体可以与非细胞因子免疫调节剂偶联，例如针对共刺激分子或检查点抑制剂的抗体或配体。
[0859] 在一个实施方式中，可以将包含chBC8抗CD45 Fab或IgG的构建体偶联至靶向共刺激受体如4-1BB(CD137)的抗体分子，例如Fab或scFv。在一些实施方式中，针对CD137的抗体分子是激动剂抗体。在一些实施方式中，针对CD137的抗体分子选自scFv，Fab或IgG。在实施方式中，融合体包含与融合体的抗CD45(或CD11，CD8，CD4等)部分的N端或C端结构域融合的针对共刺激受体的抗体分子。简而言之，可以对上述和附图中的所有融合体进行修饰，以使细胞因子被4-1BB的Fab或scFv激动剂(或任何其他细胞表面受体的激动剂)替代。
[0860] 在其他实施方式中，可以将包含chBC8抗CD45 Fab或IgG的构建体偶联至靶向阴性免疫调节剂，例如检查点抑制剂的抑制剂，例如选自PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或CTLA-4的检查点抑制剂的抑制剂的抗体分子例如Fab或scFv。例如，可以用针对CTLA-4或PD-1的拮抗剂(例如IgG，Fab或scFv抗体)替代细胞因子，从而通过与CD45，CD11等的融合相互作用而导致细胞表面受体的持续拮抗作用。
[0861] 实施例6：引发可以改善ACT效力
[0862] 在一些实施方式中，已经显示了引发(或预处理)细胞治疗剂，肿瘤微环境和/或宿主可以为过继细胞治疗(ACT)提供扩展的益处。在某些实施方式中，即使短的(例如，约1-3天，约1天或少于1天)引发事件也可以令人惊讶地对细胞疗法的效力具有显著影响。
[0863] 如图14A中所示，用例如CPX(环磷酰胺)或其他淋巴清除处理化学疗法引发宿主和肿瘤微环境显著抑制了肿瘤生长，因此提高了ACT效力。Pmel转基因小鼠系来自Finkelstein等，J Leukoc Biol，2004年8月；76(2)：333-337。
[0864] 在一些实施方式中，细胞治疗剂(例如，T细胞ACT)也可以被引发以改善或优化T细胞活化。如图14B所示，用IL-21预处理显示ACT效力的最大改善，其次是IL-2/IL-7和IL-7。
[0865] 在某些实施方式中，本文公开的免疫刺激融合分子可用于将此类引发延伸至体内环境。
[0866] 实施例7：免疫靶向的表面受体的多功能性
[0867] 图15显示了免疫靶向部分(例如，针对各种细胞表面受体的抗体)和细胞因子分子的各种组合。多种受体可以促进细胞因子免疫靶向。例如，可以用多种细胞因子进行系连融合，所述细胞因子系连于针对可能存在于多种细胞类型中的“丰富”细胞表面受体(例如CD11a，CD18，CD45和/或CD2)的抗体。细胞因子还可以通过细胞类型特异性表面受体(例如CD4，CD8或CD56)免疫靶向特定细胞。
[0868] 实施例8：IL-15系连融合体改善实体瘤中的T细胞治疗
[0869] 我们使用两种不同的肿瘤特异性细胞治疗模型评估了IL-15IFM增强抗癌治疗效力的能力。这些研究共同证明了IL-15IFM在包括人或小鼠T细胞，CAR-T细胞或肿瘤特异性TCR以及免疫缺陷或免疫活性动物模型的肿瘤模型中增强肿瘤特异性细胞治疗的能力。在肿瘤特异性T细胞上预加载免疫靶向的IL-15支持体内抗肿瘤活性，如图16A-16C(携带B16-F10肿瘤的免疫活性C57BL/6J小鼠)和图16D-16E(异种肿瘤模型，携带H1299肿瘤的NSG小鼠)所示，IL-15系连融合随着时间的推移可增强肿瘤特异性细胞治疗的效力。
[0870] 首先在Pmel/B16-F10模型中检查了IL-15IFM。对于该模型，对黑素瘤抗原(gp100)特异的CD8 T细胞离体扩增，然后注射到携带表达gp100的B16-F10肿瘤细胞系的同系小鼠中。在ACT之前的9天，将200,000个B16-F10鼠黑色素瘤细胞皮内注射到C57BL/6J小鼠的右侧腹。从Pmel小鼠中分离出黑色素瘤抗原gp100特异的小鼠CD8 T细胞，使用针对小鼠CD3和CD28受体的板包被抗体活化两天，然后在IL-21存在下扩增两天。离体扩增后，细胞以0.75mg/mL的浓度加载chM1Fab-IL15/sushi。在HBSS中将细胞洗涤3次以去除过量的细胞因子，然后以6.0 x 106个细胞/小鼠的单剂量注射。其他组包括单独载剂(无细胞)和在没有IL-15IFM的情况下空白加载HBSS的单剂量6.0 x 106细胞(仅Pmel)。在ACT前一天，所有动物也接受了环磷酰胺淋巴清除(4mg/小鼠)。
[0871] 图16A-16C显示了来自上述研究的肿瘤生长曲线，小鼠存活曲线和Pmel扩增曲线。在研究过程中，单独的Pmel细胞减少了肿瘤体积，并且通过向细胞预加载chM1Fab-IL15/sushi增强了这种效果(图16A)。这种减少的肿瘤体积转化为改善的生存结果，如通过至
400mm3肿瘤体积时间所测量(图16B)。载剂对照小鼠的中位生存期为13天，而单独用Pmel细胞治疗可将中位生存期延长至34天。预加载chM1Fab-IL15/sushi的Pmel将中位生存时间延长至43天，并导致两例完全缓解(28.6％)。载剂对照和单独的Pmel组都没有小鼠存活超过
39天。这种增加的肿瘤控制和存活与循环的Pmel细胞数量增加相关(图16C)。在峰扩展期，chM1Fab-IL15/sushi加载的Pmel的血液浓度比单独的Pmel高2.6倍，并且这种增加的浓度在峰扩展后的很长时间内一直保持：对于chM1Fab-IL15/sushi加载的组，Pmel细胞数量仍然超过200个/μl血液持续到ACT后42天，这远远多于空白加载的Pmel组(图16C)。我们得出的结论是，用IL-15系连融合分子预加载靶向肿瘤的T细胞可增强同系宿主中的细胞扩增，并导致更好的肿瘤控制和总体生存。
400mm3肿瘤体积时间所测量(图16B)。载剂对照小鼠的中位生存期为13天，而单独用Pmel细胞治疗可将中位生存期延长至34天。预加载chM1Fab-IL15/sushi的Pmel将中位生存时间延长至43天，并导致两例完全缓解(28.6％)。载剂对照和单独的Pmel组都没有小鼠存活超过
39天。这种增加的肿瘤控制和存活与循环的Pmel细胞数量增加相关(图16C)。在峰扩展期，chM1Fab-IL15/sushi加载的Pmel的血液浓度比单独的Pmel高2.6倍，并且这种增加的浓度在峰扩展后的很长时间内一直保持：对于chM1Fab-IL15/sushi加载的组，Pmel细胞数量仍然超过200个/μl血液持续到ACT后42天，这远远多于空白加载的Pmel组(图16C)。我们得出的结论是，用IL-15系连融合分子预加载靶向肿瘤的T细胞可增强同系宿主中的细胞扩增，并导致更好的肿瘤控制和总体生存。
[0872] 包含人异种移植肿瘤和嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法的其他小鼠模型用于测试IL-15IFM增强肿瘤特异性细胞疗法的能力。简而言之，根据类似于用于临床CAR-T细胞体外扩增的方案产生CAR-T细胞。在用靶向EGFR的CAR构建体(将识别肿瘤细胞上表达的EGFR)转导和扩增CD3人T细胞后，在细胞中加载了靶向CD45的人IL-15IFM(h9.4Fab-IL15/sushi)，注射到携带肿瘤的异种移植小鼠体内，并评估其体内扩增和治疗效果。在这项研究中，从美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)获得了H1299人肺癌细胞系，并将1.0x107肿瘤细胞皮下(SC)注入了NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(NSG，杰克逊实验室，巴港，缅因州)剃光的右胁腹。用Dynabeads，T细胞Expander珠以1:1的珠:细胞比例
6
和1x10个细胞/mL的细胞密度激活人CD3 T细胞。向T细胞培养基(TCM，RPMI 1640补充10％胎牛血清，25mM HEPES缓冲液和2mM L-谷氨酰胺)补充IL-7(10ng/mL)和IL-21(100ng/mL)，并将细胞在37℃和5％CO2下培养。培养2天后，用磁体从培养物中除去珠，并用培养基洗涤细胞。将T细胞以2.0×107细胞/mL重悬于新鲜培养基中，并在500g离心下，用表达CAR-T的慢病毒载体用10ng/mL硫酸鱼精蛋白以5的感染复数转导30分钟。离心30分钟后，用新鲜TCM将细胞稀释至5.0x106细胞/mL，并分别以10ng/mL和100ng/mL的浓度补充IL-7和IL-21。将细胞在37℃和5％CO2的条件下再转导12小时。转导12小时后，将细胞沉淀以除去含病毒的培养基，并以1.0x106细胞/mL的浓度重悬在补充了IL-15(50ng/mL)和IL-21(100ng/mL)的新鲜T细胞培养基中。将细胞在37℃和5％CO2中再培养3天，然后以0.75mg/mL的浓度加载IL-15IFM。将细胞在HBSS中洗涤3次以去除多余的细胞因子，然后以5.0x106 CAR-T细胞/小鼠的单剂量注射入H1299荷瘤小鼠。其他组包括单独载剂(无细胞)和空白加载HBSS的单剂量5.0x106细胞(仅CAR-T)。在第37天重复产生CAR-T(使用相同的人供体)，并向动物注射第二剂量的5x106 CAR-T细胞(有或没有IL-15IFM)。
6
和1x10个细胞/mL的细胞密度激活人CD3 T细胞。向T细胞培养基(TCM，RPMI 1640补充10％胎牛血清，25mM HEPES缓冲液和2mM L-谷氨酰胺)补充IL-7(10ng/mL)和IL-21(100ng/mL)，并将细胞在37℃和5％CO2下培养。培养2天后，用磁体从培养物中除去珠，并用培养基洗涤细胞。将T细胞以2.0×107细胞/mL重悬于新鲜培养基中，并在500g离心下，用表达CAR-T的慢病毒载体用10ng/mL硫酸鱼精蛋白以5的感染复数转导30分钟。离心30分钟后，用新鲜TCM将细胞稀释至5.0x106细胞/mL，并分别以10ng/mL和100ng/mL的浓度补充IL-7和IL-21。将细胞在37℃和5％CO2的条件下再转导12小时。转导12小时后，将细胞沉淀以除去含病毒的培养基，并以1.0x106细胞/mL的浓度重悬在补充了IL-15(50ng/mL)和IL-21(100ng/mL)的新鲜T细胞培养基中。将细胞在37℃和5％CO2中再培养3天，然后以0.75mg/mL的浓度加载IL-15IFM。将细胞在HBSS中洗涤3次以去除多余的细胞因子，然后以5.0x106 CAR-T细胞/小鼠的单剂量注射入H1299荷瘤小鼠。其他组包括单独载剂(无细胞)和空白加载HBSS的单剂量5.0x106细胞(仅CAR-T)。在第37天重复产生CAR-T(使用相同的人供体)，并向动物注射第二剂量的5x106 CAR-T细胞(有或没有IL-15IFM)。
[0873] 图16D显示了来自上述研究的肿瘤生长曲线。与对照组相比，单独的CAR-T细胞可在整个研究过程中减少肿瘤体积(HBSS：无T细胞；WT：已激活和扩增，但未通过CAR转化的T细胞)，这种作用可通过向细胞预加载h9.4Fab-IL15/sushi强化。仅用IL-15IFM加载的CAR-T细胞治疗的小鼠显示持续的肿瘤消退，h9.4Fab-IL15/sushi系连融合分子增强了CAR-T的抗肿瘤活性。ACT后8周后，收获肿瘤并称重；图16E显示，与单独的CAR-T细胞相比，IL-15IFM降低了肿瘤重量，并且还导致七只小鼠中有三只具有完全应答(无肿瘤)。
[0874] 实施例9：系连融合平台可实现选择性细胞靶向
[0875] 靶向CD8的IL-7提供CD8 T细胞的选择性加载和扩增。图17A-17B显示了细胞特异性靶向，其中靶向CD8的IL-7选择性地靶向CD8 T细胞。图17C显示了通过用靶向CD8的IL-7进行脉冲孵育，在活化的总CD3人T细胞的培养物中CD8 T细胞而非CD4 T细胞的选择性扩增。简而言之，通过使用CD3/CD28 Dynabead活化物珠(Thermo)根据制造商的说明并在存在20ng/mL IL-7和100ng/mL IL-21的条件下，通过刺激总的CD3人T细胞(包含CD4和CD8 T细胞)三天来制备活化的人T细胞。然后除去CD3/CD28珠，并在37℃和5％CO2存在20ng/mL IL-
7和100ng/mL IL-21的情况下，将细胞在完全培养基(含有10％FBS的RPMI 1640)中孵育过夜。然后洗涤细胞，并与500nM CD8靶向的IL-7构建体(chOKT8Fab-IL7)孵育。在37℃下1小时后，将细胞用完全培养基洗涤两次，以200,000个细胞/mL的密度铺板，并在37℃和5％CO2下孵育。单独地，通过用偶联DyLight 650的抗人IgG多克隆抗体(Thermo目录号SA5-10129；
对于流式细胞术，可以在APC通道上读取DyLight 650荧光团，参见图17B)，FITC偶联的抗CD4抗体(BioLegend目录号344604)和APC/Cy7偶联的抗CD8抗体(BioLegend目录号344715)对T细胞进行染色来分析细胞在CD8和CD4 T细胞上的加载情况。抗人IgG多克隆抗体可检测CD8靶向的IFM的Fab区。抗CD4和抗CD8抗体可以区分CD4和CD8 T细胞群(图17A)。图17B显示了当与CD4和CD8 T细胞的混合群孵育时，靶向CD8的IL-7构建体以更高的水平选择性地加载到CD8 T细胞上。图17C显示了通过靶向CD8的IL-7构建体对CD8 T细胞的选择性扩增。
7和100ng/mL IL-21的情况下，将细胞在完全培养基(含有10％FBS的RPMI 1640)中孵育过夜。然后洗涤细胞，并与500nM CD8靶向的IL-7构建体(chOKT8Fab-IL7)孵育。在37℃下1小时后，将细胞用完全培养基洗涤两次，以200,000个细胞/mL的密度铺板，并在37℃和5％CO2下孵育。单独地，通过用偶联DyLight 650的抗人IgG多克隆抗体(Thermo目录号SA5-10129；
对于流式细胞术，可以在APC通道上读取DyLight 650荧光团，参见图17B)，FITC偶联的抗CD4抗体(BioLegend目录号344604)和APC/Cy7偶联的抗CD8抗体(BioLegend目录号344715)对T细胞进行染色来分析细胞在CD8和CD4 T细胞上的加载情况。抗人IgG多克隆抗体可检测CD8靶向的IFM的Fab区。抗CD4和抗CD8抗体可以区分CD4和CD8 T细胞群(图17A)。图17B显示了当与CD4和CD8 T细胞的混合群孵育时，靶向CD8的IL-7构建体以更高的水平选择性地加载到CD8 T细胞上。图17C显示了通过靶向CD8的IL-7构建体对CD8 T细胞的选择性扩增。
[0876] 为了进一步探讨通过不同抗体克隆和抗体构型的选择性细胞加载，我们比较了两种不同的抗CD8单克隆抗体对CD4和CD8 T细胞的加载。简而言之，我们重组生产了抗人CD8抗体克隆OKT8和51.1作为Fab片段(chOKT8Fab和ch51.1Fab)。我们还构建了两个IL-15IFM：一个包含chOKT8Fab(chOKT8Fab-IL15/sushi)，另一个包含chOKT8Fab和抗CD45 scFv
(chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi)。后一种构建体包含针对两种不同细胞表面受体CD8和CD45的抗体片段，我们认为它可以通过亲合力作用赋予CD8 T细胞更强的细胞加载。我们使用全部CD3 T细胞(包含CD4和CD8 T细胞的混合物)评估了这四种抗体和IFM构建体加载到CD4和CD8 T细胞上的能力。图17D显示了针对每种构建体的强选择性加载到CD8T细胞上。在图17E中，我们类似地显示了使用抗IL15染色(不含IL-15，chOKT8Fab和ch51.1Fab的Fab构建体在该测定中当然是阴性的)将IL-15选择性地加载到CD8 T细胞上。
(chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi)。后一种构建体包含针对两种不同细胞表面受体CD8和CD45的抗体片段，我们认为它可以通过亲合力作用赋予CD8 T细胞更强的细胞加载。我们使用全部CD3 T细胞(包含CD4和CD8 T细胞的混合物)评估了这四种抗体和IFM构建体加载到CD4和CD8 T细胞上的能力。图17D显示了针对每种构建体的强选择性加载到CD8T细胞上。在图17E中，我们类似地显示了使用抗IL15染色(不含IL-15，chOKT8Fab和ch51.1Fab的Fab构建体在该测定中当然是阴性的)将IL-15选择性地加载到CD8 T细胞上。
[0877] 为了比较对CD8 T细胞的相对亲和力，我们将来自图17D的对CD8 T细胞的结合滴定汇编成图17F中的单个图。chOKT8Fab-BC8scFv抗体构型提供了与CD8 T细胞的最紧密结合。当以较高浓度使用时，该IFM还导致加载到CD4T细胞上(图17D和图17E)。我们认为这是由于BC8scFv与CD45受体结合，而CD45受体同时存在于CD4和CD8 T细胞上。在图17D中观察到的chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi对CD4 T细胞的相对亲和力类似于单体BC8scFv对T细胞的亲和力(图17G，使用六组氨酸标签构建了BC8scFv，在此用作通过流式细胞仪检测的手柄)；连同chOKT8Fab和chOKT8Fab-115/sushi与CD4 T细胞的最小结合，我们得出结论，chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi与CD4 T细胞的结合是由BC8scFv驱动的。BC8scFv的二聚体形式导致与T细胞的亲和力更高，这可能是由于二价结合的亲和力影响所致。我们进一步认为，chOKT8Fab-BC8scFv-IL15/sushi与CD8 T细胞对比CD4 T细胞的结合力更高，并且与单价chOKT8Fab-IL15/sushi相比，与CD8 T细胞的结合力更高，同样是由于亲和力效应这是由于与CD8 T细胞的二价结合所致。因此，我们得出结论，可以使用对不同细胞表面受体具有特异性的抗体克隆来构建IFM，以改善细胞亲和力和加载。此外，一种或多种选择的抗体可以对特定的细胞类型具有特异性，以便能够提高亲和力，同时仍然保留细胞的选择性加载。使用这种方法，我们证明构建在不同细胞类型上具有不同加载效率的异种特异性抗体(例如，在这种情况下，更强的CD8 T细胞加载和较弱但非零的CD4 T细胞加载)是进一步可行的。
[0878] 实施例10：细胞因子工程改造提高了系连融合效力
[0879] 我们评估了通过工程改造具有调节的生物学活性的细胞因子突变体进一步增强IFM效力的能力。基于对IL-15及其细胞信号受体之间相互作用的结构功能理解(Chirifu等，Nat Immunol.2007年9月；8(9):1001-7；Ring等，Nat Immunol.201年12月；13(12):1187-95)，我们构建了三个IL-15变体，这些变体包含据信与IL-15/IL-2受体β(特别是IL-
15-D8N，IL-15-D61N和IL-15N72A)相互作用的氨基酸侧链突变，以及三个其他IL-15变体，其中包括氨基酸侧链的突变(据信与γ链相互作用)(IL-15-K10Q，IL-15-Q101N和IL-15-Q108N)。我们构建了作为与chBC8Fab抗体片段的融合体的IL-15突变体，并评估了它们对人T细胞的结合和活性。简而言之，如实施例1中所述活化原代人T细胞，然后与包含IL-15变体的IFM的五倍系列稀释液一起孵育(在IFM孵育后无需洗涤，例如“恒定”孵育测定形式)。包含野生型IL-15和IL-15/sushi-Fc构建体的IFM用作对照，用于比较。将IL-15构建体在37℃和5％CO2下孵育三天后，按照制造商的说明使用CountBright绝对计数珠(Thermo)通过流式细胞术分析细胞密度。含有IFM的野生型IL-15(chBC8Fab-IL15/sushi)表现出与IL-15/sushi-Fc构建体相似的细胞效力(图18A和图18B)。另外，图18A和图18B显示三种不同的IL-
15变体(IL-15-K10Q，IL-15-Q101N和IL-15-N72A)比野生型IL-15产生更强的细胞效力，其中两种IL-15变体(IL-15-D61N和IL-15-Q108N)导致细胞效力降低，并且一种IL-15变体(IL-15-D8N)在所评估的浓度范围下不显示细胞活性。在一个单独的实验中，我们按照实施例1中所述的脉冲测定形式评估了两种减弱的IL-15变体(IL-15-D61N和IL-15-Q108N)的表面持久性。我们发现包含减弱变体的IFM在细胞表面上表现出更强的持久性(图18C)。生长因子和细胞因子信号受体的激活诱导细胞内的负调节反馈机制。一种这样的机制涉及活化的细胞因子和生长因子受体的内化和降解(在Jones人，Trends Biotechnol.2008年9月；26(9):498-505中综述)。不希望受到理论束缚，我们认为具有减弱的活性的细胞因子变体的表面持久性升高可能归因于细胞内对这种负调节反馈机制的较弱诱导。
15-D8N，IL-15-D61N和IL-15N72A)相互作用的氨基酸侧链突变，以及三个其他IL-15变体，其中包括氨基酸侧链的突变(据信与γ链相互作用)(IL-15-K10Q，IL-15-Q101N和IL-15-Q108N)。我们构建了作为与chBC8Fab抗体片段的融合体的IL-15突变体，并评估了它们对人T细胞的结合和活性。简而言之，如实施例1中所述活化原代人T细胞，然后与包含IL-15变体的IFM的五倍系列稀释液一起孵育(在IFM孵育后无需洗涤，例如“恒定”孵育测定形式)。包含野生型IL-15和IL-15/sushi-Fc构建体的IFM用作对照，用于比较。将IL-15构建体在37℃和5％CO2下孵育三天后，按照制造商的说明使用CountBright绝对计数珠(Thermo)通过流式细胞术分析细胞密度。含有IFM的野生型IL-15(chBC8Fab-IL15/sushi)表现出与IL-15/sushi-Fc构建体相似的细胞效力(图18A和图18B)。另外，图18A和图18B显示三种不同的IL-
15变体(IL-15-K10Q，IL-15-Q101N和IL-15-N72A)比野生型IL-15产生更强的细胞效力，其中两种IL-15变体(IL-15-D61N和IL-15-Q108N)导致细胞效力降低，并且一种IL-15变体(IL-15-D8N)在所评估的浓度范围下不显示细胞活性。在一个单独的实验中，我们按照实施例1中所述的脉冲测定形式评估了两种减弱的IL-15变体(IL-15-D61N和IL-15-Q108N)的表面持久性。我们发现包含减弱变体的IFM在细胞表面上表现出更强的持久性(图18C)。生长因子和细胞因子信号受体的激活诱导细胞内的负调节反馈机制。一种这样的机制涉及活化的细胞因子和生长因子受体的内化和降解(在Jones人，Trends Biotechnol.2008年9月；26(9):498-505中综述)。不希望受到理论束缚，我们认为具有减弱的活性的细胞因子变体的表面持久性升高可能归因于细胞内对这种负调节反馈机制的较弱诱导。
[0880] 为了进一步探讨细胞因子活性与IFM表面持久性和效力之间的关系，我们另设计了四个IL-15变体，这些变体包含与IL-15及其IL-15/IL-2受体β的界面处的突变。具体而言，我们构建了包含IL-15变体IL-15-D61H，IL-15E64H，IL-15-D65H或IL-15-N72H的CD8靶向IFM。根据制造商的说明，使用CD3/CD28 Dynabead活化物珠(Thermo)刺激CD3人T细胞三天制备活化的人T细胞，然后去除磁珠，并细胞在完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)中在37℃和5％CO2的条件下，在20ng/mL IL-7和100ng/mL IL-21的存在下孵育过夜。然后将活化的T细胞与浓度范围为10–0.0032nM的IFM的连续5倍稀释液一起孵育，并以200,000细胞/mL的密度接种到96孔板中(在IFM孵育后没有洗涤，例如“恒定”孵育测定形式)。在37℃和
5％CO2下三天后，收获细胞并评估细胞扩增和IFM表面水平。为了分析IFM表面水平，将细胞分别用BV421偶联的抗CD4抗体(BioLegend目录号344632)，BV786偶联的抗CD8抗体
(BioLegend目录号344740)和Alexa-Fluor-647-偶联的抗人κ(轻链)抗体染色。图18D表明靶向CD8的IL-15构建体高加载到CD8 T细胞上，而最小加载到CD4 T细胞上。将靶向CD8的IFM加载到CD4 T细胞上的能力有限，从而能够对IL-15突变对细胞应答的影响进行可控评估。响应于与包含D61H，E64H，N65H或N72H点突变的CD8靶向的IL-15构建体孵育，CD4 T细胞的扩增显示了D61H，E64H和N65H突变的减弱活性(图18E)。
5％CO2下三天后，收获细胞并评估细胞扩增和IFM表面水平。为了分析IFM表面水平，将细胞分别用BV421偶联的抗CD4抗体(BioLegend目录号344632)，BV786偶联的抗CD8抗体
(BioLegend目录号344740)和Alexa-Fluor-647-偶联的抗人κ(轻链)抗体染色。图18D表明靶向CD8的IL-15构建体高加载到CD8 T细胞上，而最小加载到CD4 T细胞上。将靶向CD8的IFM加载到CD4 T细胞上的能力有限，从而能够对IL-15突变对细胞应答的影响进行可控评估。响应于与包含D61H，E64H，N65H或N72H点突变的CD8靶向的IL-15构建体孵育，CD4 T细胞的扩增显示了D61H，E64H和N65H突变的减弱活性(图18E)。
[0881] 我们以脉冲测定形式进一步评估了这些构建体对CD8和CD4 T细胞的活性。简而言之，将活化的总CD3人T细胞与靶向CD8的IL-15变体在37℃孵育1小时，洗涤以除去未结合的IFM，以200,000个细胞/mL的密度接种，并在37℃和5％CO2下孵育。为了控制诱导的细胞因子分泌或系连的融合解除结合和重新结合的作用(这些中的每种都可能支持进一步的T细胞存活或扩增)，我们在脉冲孵育后一到三天更新了细胞培养基；脉冲孵育三天后，以五倍稀释比例将细胞另外分裂至新鲜培养基，以使细胞进一步扩增。与CD4T细胞相比，每个靶向CD8的构建体选择性地更高程度地加载到CD8 T细胞上(图19A)。另外，在将脉冲孵育施加到混合的CD4和CD8 T细胞上后一天，每个包含减弱的细胞活性的组氨酸突变体(D61H，E64H和N65H)表现出较高的表面持久性(图19A)。为了评估靶向CD8的构建体选择性扩增CD8对比CD4 T细胞的能力，我们将其活性与以与CD8靶向IL-15IFM相同的抗体构型构建的非选择性加载、靶向CD45的IL-15IFM进行了比较(h9.4Fab-BC8scFv-IL15/sushi，其包含与靶向CD8的构建体的抗体形式一致的Fab-scFv形式)。每个靶向CD8的IL-15构建体均能选择性扩增CD8 T细胞，与包含野生型IL-15的CD8靶向构建体相比，包含D61H和E64H突变的CD8靶向IL-15构建体支持更大的CD8 T细胞扩增(图19B)。值得注意的是，在这种脉冲测定形式中，每个靶向CD8的IL-15构建体仅弱扩增CD4 T细胞(图19B)，这与其针对CD8特异性的设计以及针对其加载至CD8 T细胞上的特异性相一致。为了比较，显示了包含野生型IL-15，IL-15-D61H或IL-15-E64H的CD8-靶向构建体的完整扩增时间进程(图19C)。
[0882] 我们还在CD45靶向IFM(h9.4Fab-BC8scFv-IL15-D61H)的背景下评估了减弱的IL-15变体IL-15-D61H。与针对CD8靶向的IL-15-D61H IFM观察到的数据一致，与单价和二价CD45系连的IL-15IFM相比，CD45系连的构建体提供了更强的细胞表面持久性(图20)。总的来说，我们得出的结论是，包含减弱的IL-15变体的IFM可以导致更高的细胞表面持久性，并随着时间的推移诱导更强的细胞增殖。
[0883] 实施例11：IL-15系连融合体支持IL-15受体下游的持续信号转导
[0884] 我们在与系连融合体脉冲孵育后一天评估了IL-15系连融合体支持细胞内信号转导的能力。简而言之，如制造商说明中所述，用CD3/CD28Dynabeads激活人T细胞三天。除去珠，将细胞与IL-2孵育1天，然后与IL-15构建体进行脉冲或恒定孵育。将细胞与PBS(空白条件)和IL-15/sushi-Fc构建体或hBC8Fab-IL15/sushi的生物学重复于37℃孵育1小时，然后用完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)洗涤3次。然后将细胞以约400,000个细胞/mL的细胞密度接种于完全培养基中，并在37℃，5％CO2下孵育。对于“恒定”孵育条件，用指示的IL-15构建体以大约1μg/mL的浓度补充细胞。第二天，回收细胞，在室温下用约1.5％多聚甲醛固定10分钟，并在4℃下用100％甲醇透化10分钟。然后使用磷酸化STAT5(由IL-15受体下游的信号转导分子激活的转录因子)特异性的抗体对细胞进行免疫染色，并使用Diva软件在FACSCelesta上进行分析；使用Cytobank分析数据。虽然两种IL-15构建体在以“恒定”形式与T细胞一起孵育时均诱导STAT5磷酸化，但只有系连融合体在脉冲孵育后的一天保持
STAT5磷酸化(图21)。
STAT5磷酸化(图21)。
[0885] 实施例12a：包含IL-12的示例性免疫刺激融合蛋白
[0886] 包含IL-12的系连融合体(也称为IFM)可以以与针对IL-15描述的那些相似的方式构建。在图22A-22D中描绘了示例性的IL-12系连融合体(IL12-TF)。已使用人或小鼠IL-12和对人或小鼠CD45有特异性的抗体片段构建了可在人或小鼠细胞上使用的IL12-TF。IL12-TF chM1Fab-sc-IL12p70包含与小鼠单链IL-12p70融合的抗小鼠CD45 Fab片段(图22A)。小鼠单链IL-12p70包含小鼠IL-12A和IL-12B之间的遗传融合。用于小鼠细胞的另一种IL12-TF，chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70，包含抗小鼠CD45 Fab和scFv抗体片段与小鼠单链IL-12p70的Fab-scFv融合体(图22B)。还构建了与人细胞一起使用的对应的IL12-TF：h9.4Fab-scIL-12p70(图22C)和h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70(图22D)包含对人CD45有特异性的Fab或Fab-scFv融合体和单链人IL-12p70。尽管相反的表达方向也是可能的(例如，IL-12A-IL-12B)，全部四种构建体的相应IL-12p70亚基IL-12A和IL-12B表达成具有方向IL-12B-IL-12A的单链分子。连接IL-12A和IL-12B亚基的多个不同的柔性接头是可能的。IL-12p70也可以表达为IL-12A和IL-12B的异源二聚体，后者是该蛋白质的天然形式。本文公开的各种接头可用于可操作地连接抗CD45抗体和IL-12，其起到在它们之间增加空间的作用。
[0887] 实施例12b：IL-12与CD45的抗体介导的系连支持IL-12的细胞加载和延长的表面持久性
[0888] 我们评估了IL12-TF支持将IL-12加载到T细胞上的能力。简而言之，将人总CD3 T细胞用CD3/CD28 Dynabeads激活三天。除去珠子，将细胞与IL-2孵育1天，然后与在完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)中稀释的h9.4Fab-scIL-12p70脉冲孵育。将细胞与完全培养基(空白条件)或h9.4Fab-scIL-12p70的生物重复物中于37℃孵育1小时，然后用完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)洗涤3次以去除未结合的IL12-TF。然后将细胞以约200,000个细胞/mL的细胞密度接种于完全培养基中，并在37℃，5％CO2下孵育。通过使用多克隆抗人IgG抗体免疫染色，使用流式细胞仪检测了表面系连的IL-12。使用CountBright绝对流式细胞术计数珠对细胞进行计数。在每种情况下，使用Diva软件在FACSCelesta上分析细胞；使用Cytobank分析数据。
[0889] 如图23所示，与抗CD45抗体融合的IL-12的脉冲孵育不仅支持IL-12在T细胞表面上的显著加载和延长的持久性，而且还支持显著的T细胞扩增。
[0890] 实施例13：IL-12系连融合体诱导持久的STAT4磷酸化
[0891] 将人总CD3 T细胞用CD3/CD28 Dynabeads激活三天。除去珠子，将细胞与IL-2孵育1天，然后与在完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)中稀释的IL-12和IL-15系连融合构建体脉冲孵育。将细胞在完全培养基(空白条件)，IL-15/sushi-Fc，h9.4Fab-scIL-12p70，h9.4Fab-IL-15/sushi或h9.4Fab-scIL-12p70和h9.4Fab-IL-15/sushi构建体的组合的生物学重复物中(每个浓度为500nM)在37℃下孵育1小时，然后用完全培养基洗涤两次。然后将细胞以约200,000个细胞/mL的细胞密度接种于完全培养基中，并在37℃，5％CO2下孵育。
对于恒定的IL-15孵育的对照条件，以约25nM的浓度向细胞补充IL-15/sushi-Fc构建体。第二天，回收细胞，在室温下用约2％多聚甲醛固定10分钟，并在4℃下用100％甲醇透化10分钟。然后使用对磷酸化STAT4或磷酸化STAT5具有特异性的抗体对细胞进行免疫染色，并使用Diva软件在FACSCelesta上进行分析；使用Cytobank分析数据。
对于恒定的IL-15孵育的对照条件，以约25nM的浓度向细胞补充IL-15/sushi-Fc构建体。第二天，回收细胞，在室温下用约2％多聚甲醛固定10分钟，并在4℃下用100％甲醇透化10分钟。然后使用对磷酸化STAT4或磷酸化STAT5具有特异性的抗体对细胞进行免疫染色，并使用Diva软件在FACSCelesta上进行分析；使用Cytobank分析数据。
[0892] 如图24所示，与25nM IL-15/sushi-Fc的恒定孵育相比，IL-15系链融合体的脉冲孵育诱导STAT5磷酸化达到相似的水平，而与IL-15/sushi-Fc的脉冲孵育则不诱导高于背景水平的STAT5磷酸化。IL-12系连融合体诱导STAT4磷酸化；通过与IL-15系连融合体组合脉冲孵育，可以增强这种活性。我们得出的结论是，单独使用或组合使用时，系连融合体可诱导持续的细胞内信号转导活性，IFM与不同细胞因子的组合可提供比单个IFM更高的活性。
[0893] 实施例14：将多种细胞因子系连至免疫细胞表面
[0894] 免疫细胞通常会感应并整合来自多个不同输入的信号。实际上，本领域中的许多实例证明了多种细胞因子比单独的个体细胞因子引起更广泛或更强效的免疫应答的能力。因此，我们评估了使用IFM平台将多种细胞因子同时系连到免疫细胞表面的能力。我们使用多种不同的细胞因子组合以及通过系连来自多种不同细胞表面受体的刺激物来检验这种可能性。
[0895] 我们首先通过将来自单个细胞表面受体的IL-15和IL-21系连在一起证明了将两种细胞因子同时系连到免疫细胞表面的能力。简而言之，如实施例13所述，使用CD3/CD28刺激来活化总的CD3人T细胞。然后将细胞与CD45系连的IL-15和IL-21(h9.4Fab-IL15/sushi和h9.4Fab-IL21)在一定的摩尔比范围内一起孵育以检查相对浓度对细胞表面细胞因子加载的影响。通过分别以500nM:0nM，1500nM:500nM，500nM:1500nM和500nM:1500nM的浓度混合IL-15和IL-21TF来评估1:0、3:1、1:1和1:3的IL-15:IL-21系连融合(TF)比率。在37℃下孵育1小时后，将细胞在完全培养基中洗涤两次，然后用PE偶联的抗IL-15和Alexa-Fluor-647偶联的抗IL-21抗体染色(RD系统公司目录号IC2471P和BioLegend目录号513006)。使用DiVa软件在FACSCelesta流式细胞仪上分析细胞，并使用Cytobank分析数据。图25表明IL-
15和IL-21都可以通过与CD45受体的系连同时加载到T细胞表面上。然而，我们还观察到，增加IL-21:IL-15TF的摩尔比会导致细胞表面上IL-21的量增加，但以减少IL-15的量为代价；
图25显示了在加载当天(第0天)和脉冲孵育后一天(第1天)都观察到这种效果，表明加载的初始差异影响随着时间推移观察到的表面水平。
15和IL-21都可以通过与CD45受体的系连同时加载到T细胞表面上。然而，我们还观察到，增加IL-21:IL-15TF的摩尔比会导致细胞表面上IL-21的量增加，但以减少IL-15的量为代价；
图25显示了在加载当天(第0天)和脉冲孵育后一天(第1天)都观察到这种效果，表明加载的初始差异影响随着时间推移观察到的表面水平。
[0896] 接下来，我们通过将多种细胞因子系连在不同的细胞表面受体上，来评估在细胞表面上“叠加”加载多种细胞因子的能力。我们还通过使用靶向CD8的IL-21构建体评估了将细胞选择性细胞因子加载与TF组合偶联的潜力。据报道，IL-21可在CD8 T细胞上赋予理想的干细胞记忆表型，但会不期望地抑制CD4 T细胞分化为产生IFNg的Th1表型，同时促进CD4 T细胞分化为Th2辅助表型(Tian等，Trends Immunol.2016年8月；37(8):557–568)。因此，对于CD8 T细胞特异的IL-21系连融合体将是抗癌治疗所需要的。简而言之，如实施例13中所述激活了总的人CD3 T细胞。然后将细胞与CD45系连的IL-15(h9.4Fab-IL15/sushi)或CD8系连的IL-21(chOKT8Fab-BC8scFv-IL21)的组合一起孵育，各自浓度为500nM。在37℃孵育1小时后，将细胞洗涤两次，然后用偶联有PE的抗IL-15抗体和偶联有Alexa-fluor-647的抗IL-21抗体染色。为了能够独立定量加载到CD4或CD8 T细胞上的细胞因子，还用PE/Cy7偶联的抗CD4和BV785偶联的抗CD8抗体(BioLegend目录号344612和344740)对细胞进行染色。使用DiVa软件在FACSCelesta流式细胞仪上分析细胞，并使用Cytobank分析数据。图26证明了CD45系连的IL-15在CD4和CD8 T细胞上均以相似的高水平加载。相比之下，靶向CD8的IL-21在CD8 T细胞上选择性加载至高水平。至关重要的是，添加CD8靶向的IL-21不会降低CD45靶向的IL-15的水平(图26)，这表明了通过来自不同细胞表面受体的系连的叠加的细胞因子加载。
[0897] 为了探索IFM组合增强生物活性的能力，我们在用IL-15和IL-21TF脉冲孵育后，评估了STAT5的激活(通过磷酸化)，STAT5是IL-15和IL-21信号转导受体下游的转录因子。简而言之，在上述脉冲孵育和洗涤之后，将细胞以约200,000细胞/mL的密度接种到完全培养基中，在37℃和5％CO2下孵育过夜。细胞内信号转导是一个动态过程，其中信号通过细胞内的负调节反馈机制随着时间的流逝而减少；因此，我们包括一个对照条件，该条件包括与饱和量(25nM)的IL15/sushi-Fc构建体进行恒定孵育，以反映STAT5信号转导活性的上限。我们还评估了CD45系连的IL-15和IL-21或CD45系连的IL-15和CD8系连的IL-21的组合(每个TF在500nM下孵育)。如实施例11所述，在37℃和5％CO2下孵育一或三天后，将孔固定，透化并针对STAT5磷酸化进行免疫染色。值得注意的是，在脉冲孵育后一天，靶向CD45的IL-15诱导的STAT5磷酸化至接近与IL15/sushi-Fc的恒定孵育的水平(图27A)。IL-15和IL-21系连融合体的组合-通过将每种细胞因子系连在同一受体上，或通过将细胞因子系连在分开的受体上-与单独的IL-15TF相比，STAT5磷酸化进一步提高，并达到与恒定IL15/sushi-Fc对照条件相似的水平(图27A)。叠加加载的系连融合体(即CD45靶向的IL-15与CD8靶向的IL-21的组合)在第3天的时间点进一步将STAT5磷酸化水平维持在与饱和IL15/sushi-Fc条件相似的水平(图27B)。我们得出的结论是，通过将多个细胞因子系连在细胞表面上(通过系连至同一受体或系连至不同受体)，可以增大细胞反应。来自不同细胞表面受体的系连还可以进一步实现叠加细胞因子的加载，并进一步改善细胞活性。
[0898] 为了进一步探索IFM组合的细胞因子和细胞表面受体的模块性(modularity)，我们检验了包含IL-15和IL-12的IFM组合的细胞表面加载和细胞应答。从IL-15和IL-12组合改善的抗肿瘤活性已经在本领域中充分描述(Di Carlo等，J Immunol.2000年9月15日；165(6):3111-8；Lasek等，Eur Cytokine Netw.1999年9月；10(3):345-56)。这可能至少部分是由于由IL-15诱导的IL-12受体水平的表达升高(Wu等，Eur J Immunol.1997年1月；27(1)：147-54)。因此，包含IL-15和IL-12的IFM的组合可以提供进一步改善的治疗活性。我们评估了其中IL-15和IL-12都与CD45受体系连的IFM组合，以及IL-12与CD45系连而IL-15与CD18系连的组合。简而言之，如实施例13中所述激活了总人CD3 T细胞。然后将细胞与CD45系连的IL-15或IL-12(h9.4Fab-IL15/sushi和h9.4Fab-scIL12p70)的组合，或CD45系连的IL-12与CD18系连的IL-15(ch1B4Fab-IL15/sushi)的组合孵育。对于每种IFM，以25、100和400nM的浓度评估两种组合。在37℃下孵育1小时后，洗涤细胞，然后以200,000个细胞/mL的密度接种在完全培养基中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。在第0天和第1天评估IL-12(使用Alexa-fluor-647偶联的抗IL-12抗体，BioLegend目录号501818)的细胞表面水平，并在第1天分析STAT4的活化(使用PE偶联的抗p-STAT4抗体(BD Biosciences目录号558249)，一种IL-12受体下游的转录因子。对细胞表面细胞因子的染色和细胞内信号转导如上所述进行。
与上面观察到的组合IL-15和IL-21加载的数据一致，我们观察到与CD45靶向的IL-15组合时靶向CD45的IL-12的较低总体加载(h9.4Fab-scIL12p70和h9.4Fab-IL15/sushi组合；图
28)。然而，靶向CD45的IL-12与靶向CD18的IL-15的组合并未降低细胞表面上IL-12的水平(h9.4Fab-scIL12p70和ch1B4Fab-IL15/sushi组合，图28)。IL-12系连融合体(但不是IL-15系连融合体，也不与20nM IL15/sushi-Fc恒定孵育)诱导STAT4磷酸化(图29)。这与对IL-15和IL-12对细胞内信号转导的理解是一致的，并且表明来自IFM的脉冲孵育能够提供通常仅通过天然细胞因子的恒定孵育才能观察到的细胞因子活性。值得注意的是，即使IL-15TF自身不诱导STAT4活性，IL-12TF与IL-15TF的组合也会增强STAT4的磷酸化作用(图29)。我们得出的结论是，组合包含IL-15和IL-12的IFM可以进一步增强信号转导，超过仅由IL-12诱导的信号转导。这可能是由于IL-15诱导IL-12受体表达所致。IL-2和IL-7还被描述为提高IL-12受体的表达(Wu等，Eur J Immunol.1997年1月；27(1):147-54)，并且包含IL-2或IL-7的IFM与IL-12IFM的组合也可能会增强IL-12或IL-12IFM的活性。
与上面观察到的组合IL-15和IL-21加载的数据一致，我们观察到与CD45靶向的IL-15组合时靶向CD45的IL-12的较低总体加载(h9.4Fab-scIL12p70和h9.4Fab-IL15/sushi组合；图
28)。然而，靶向CD45的IL-12与靶向CD18的IL-15的组合并未降低细胞表面上IL-12的水平(h9.4Fab-scIL12p70和ch1B4Fab-IL15/sushi组合，图28)。IL-12系连融合体(但不是IL-15系连融合体，也不与20nM IL15/sushi-Fc恒定孵育)诱导STAT4磷酸化(图29)。这与对IL-15和IL-12对细胞内信号转导的理解是一致的，并且表明来自IFM的脉冲孵育能够提供通常仅通过天然细胞因子的恒定孵育才能观察到的细胞因子活性。值得注意的是，即使IL-15TF自身不诱导STAT4活性，IL-12TF与IL-15TF的组合也会增强STAT4的磷酸化作用(图29)。我们得出的结论是，组合包含IL-15和IL-12的IFM可以进一步增强信号转导，超过仅由IL-12诱导的信号转导。这可能是由于IL-15诱导IL-12受体表达所致。IL-2和IL-7还被描述为提高IL-12受体的表达(Wu等，Eur J Immunol.1997年1月；27(1):147-54)，并且包含IL-2或IL-7的IFM与IL-12IFM的组合也可能会增强IL-12或IL-12IFM的活性。
[0899] 我们通过将来自多个不同细胞表面受体的单个细胞因子系连起来，进一步探索了IFM组合的潜力。特别是，我们评估了组合CD45靶向的IL-15点突变体和CD18靶向的野生型IL-15对T细胞扩增和存活力的影响，前者可改善细胞表面的持久性。简而言之，如实施例13中所述激活了总人CD3T细胞。然后将细胞与25或100nM含有D61H突变的CD45系连的IL-15(h9.4Fab-BC8scFv-IL15-D61H/sushi)，100nM CD18系连的野生型IL-15(ch1B4Fab-IL15/sushi)，或两种IFM的组合孵育。在37℃下1小时后，将细胞用完全培养基洗涤两次，以200,000个细胞/mL的密度接种，并在37℃和5％CO2下孵育。使用DiVa软件在FACSCelesta流式细胞仪上使用CountBright绝对流式细胞术计数珠(赛默飞世尔公司)随时间监测活细胞密度；使用Cytobank分析数据。h9.4Fab-BC8scFv-IL15-D61H/sushi和ch1B4Fab-IL15/sushi的组合比单个系连的细胞因子导致更大的T细胞增殖(图30)。我们得出的结论是，可以从多个细胞表面受体系连个体细胞因子或细胞因子变异体，以提高生物学效力。
[0900] 在此我们已经表明，细胞因子既可以从单个受体(例如，从CD45受体系连的两种细胞因子)，也可以从不同受体的组合中，被系连到细胞表面。尽管这些研究使用靶向CD8，CD18或CD45受体的抗体检查了组合的细胞因子加载，但细胞表面受体的其他组合也是可能的(例如，可选地包括CD4，CD11a和/或CD2)。将三种或三种以上的细胞因子系连在单个细胞上也是可能的，这将增加更多的好处(例如，基因我们在这里的观察，将IL-12，IL-15和IL-21的组合加载到单个免疫细胞上可增强STAT4和STAT5信号转导)。我们还证明了来自不同受体的系连细胞因子能够“叠加”加载细胞因子，其中第二细胞因子被加载到T细胞表面而不会降低第一细胞因子的水平。不受理论束缚，我们认为从不同受体加载时观察到的可叠加性是IFM的抗体组分不必竞争加载到单个细胞表面受体上的结果。我们进一步证明了叠加加载可以与细胞特异性靶向结合。例如，我们显示了组合IL-15和IL-21的能力，其中IL-
21被选择性地加载到CD8 T细胞上，而IL-15被加载到CD4和CD8 T细胞上。这是有利的，因为已显示IL-21可促进CD4 T细胞分化为Th2表型，同时抑制CD4 T细胞分化为产生IFNg的Th1表型(Tian等，Trends Immunol.2016年8月；37(8):557–568)。因此，将IL-21重定向离开CD4 T细胞对于抗癌治疗将是理想的，因为Th1CD4 T细胞被认为是更具生产力的抗癌CD4 T细胞亚群。最后，我们证明了可以将个体细胞因子和/或细胞因子变体加载到多种不同的受体上，以促进进一步提高的生物学活性。具体而言，我们通过组合包含IL-15的靶向CD18和CD45的系连融合体和包含IL-15突变体的增强活性的系连融合体，表现出改善的细胞扩增。
总体而言，这些数据支持系连融合平台的广泛用途，以通过免疫细胞表面的非基因工程改造来提供免疫刺激活性。
21被选择性地加载到CD8 T细胞上，而IL-15被加载到CD4和CD8 T细胞上。这是有利的，因为已显示IL-21可促进CD4 T细胞分化为Th2表型，同时抑制CD4 T细胞分化为产生IFNg的Th1表型(Tian等，Trends Immunol.2016年8月；37(8):557–568)。因此，将IL-21重定向离开CD4 T细胞对于抗癌治疗将是理想的，因为Th1CD4 T细胞被认为是更具生产力的抗癌CD4 T细胞亚群。最后，我们证明了可以将个体细胞因子和/或细胞因子变体加载到多种不同的受体上，以促进进一步提高的生物学活性。具体而言，我们通过组合包含IL-15的靶向CD18和CD45的系连融合体和包含IL-15突变体的增强活性的系连融合体，表现出改善的细胞扩增。
总体而言，这些数据支持系连融合平台的广泛用途，以通过免疫细胞表面的非基因工程改造来提供免疫刺激活性。
[0901] 实施例15：系连来自CD11a或CD18受体的IL-15或IL-12
[0902] 在实施例3中，我们证明了多种不同的丰富的或持久的细胞表面受体能够产生具有改善的生物学活性和持久性的IFM(也称为系连融合体)。在这里，我们评估了选择的受体靶向抗体的人源化形式支持IL-15和IL-12高细胞表面加载的能力。简而言之，如实施例1中所述激活了CD3人T细胞。将活化的CD3 T细胞与500nM包含人源化MHM24可变结构域(hMHM24Fab-scIL-12p70)的CD11a-靶向的IL-12IFM一起孵育；包括CD45靶向的IL-12IFM用于比较(h9.4Fab-scIL-12p70和h9.4Fab-BC8scFv-scIL-12p70；各自为500nM)。在37℃下1小时后，将细胞在完全培养基中洗涤两次，然后用偶联有AlexaFluor-647的抗人IL-12抗体进行染色用于流式细胞术分析。图31A显示了用包含人源化抗体的系链融合体的脉冲孵育支持将IL-12加载到细胞表面上。
[0903] 在一个单独的实验中，我们评估了IL-15系连融合蛋白对靶向CD45，CD11a或CD18受体的人源化抗体的细胞表面加载。简而言之，如实施例1中所述活化CD3人T细胞，然后与包含与多种人源化抗体：抗CD45 Fab片段(h9.4Fab-IL15/sushi)，抗CD11a Fab片段(hHMH24Fab-IL15/sushi)或抗CD18 Fab片段(h1B4Fab-IL15/sushi)的轻链的C末端融合的IL-15的IFM的五倍系列稀释液一起孵育。在37℃下1小时后，将细胞在完全培养基中洗涤两次，然后用偶联有PE的抗人IL-15抗体染色以进行流式细胞术分析，以检测表面IFM水平。图
31B显示了用包含各种人源化抗体的系连融合体的脉冲孵育支持了IL-15在细胞表面上的剂量依赖性加载。
31B显示了用包含各种人源化抗体的系连融合体的脉冲孵育支持了IL-15在细胞表面上的剂量依赖性加载。
[0904] 实施例16：小鼠T细胞系连的IL-12的表面持久性和定量
[0905] 我们评估了包含对小鼠CD45和小鼠scIL-12p70细胞因子具有特异性的抗体的系连融合体促进IL-12在小鼠T细胞表面的加载和持久性的能力。在与小鼠IL12-TF孵育之前，从Pmel小鼠中分离出小鼠CD8 T细胞，使用针对小鼠CD3和CD28受体的抗体激活两天，然后在IL-21存在下扩增两天。简而言之，将分离的CD8 T细胞在先前已涂有抗小鼠CD3和CD28受体抗体的Nunc HighBind板中的完全培养基(含RPMI 1640、10％FBS，胰岛素-转铁蛋白-硒，青霉素/链霉素和50uMβ-巯基乙醇)中孵育；并且CD3和CD28抗体的包被浓度分别为0.5ug/mL和5ug/mL。在抗体包被的板上孵育约24小时后，分别添加IL-2和IL-7至终浓度为20ng/mL和0.5ng/mL。孵育第二天后，从抗体包被的板中回收细胞，并在含有终浓度为20ng/mL的IL-21的培养基中稀释至约200,000细胞/mL的密度。在IL-21中扩增一天后，将细胞在含有终浓度为20ng/mL的IL-21的培养基中再次稀释至约200,00细胞/mL的密度。然后回收细胞，洗涤，并与浓度为125nM的IL-12系连融合体(chM1Fab-scIL-12p70或chM1Fab-M1scFv-scIL-
12p70)一起于37℃孵育1小时，然后在完全培养基中洗涤3次。将细胞以500,000个细胞/mL的密度接种于24孔培养皿中的完全培养基中。在脉冲孵育后的第0、1、3和5天，使用对小鼠IL-12具有特异性的抗体对细胞进行免疫染色，并使用Diva软件在FACSCelesta上进行分析；使用FlowJo分析数据。如图32所示，IL-12系连融合体支持将IL-12高水平地加载到小鼠T细胞上。在为期五天的实验期间，可以在空白条件的背景以上检测到IL-12。
12p70)一起于37℃孵育1小时，然后在完全培养基中洗涤3次。将细胞以500,000个细胞/mL的密度接种于24孔培养皿中的完全培养基中。在脉冲孵育后的第0、1、3和5天，使用对小鼠IL-12具有特异性的抗体对细胞进行免疫染色，并使用Diva软件在FACSCelesta上进行分析；使用FlowJo分析数据。如图32所示，IL-12系连融合体支持将IL-12高水平地加载到小鼠T细胞上。在为期五天的实验期间，可以在空白条件的背景以上检测到IL-12。
[0906] 在一个单独的实验中，我们量化了脉冲孵育后系连在小鼠T细胞上的IL-12的量。简而言之，将小鼠CD8 T细胞与连续稀释的chM1Fab-scIL-12p70在37℃下脉冲孵育1小时，并通过洗涤除去未结合的系连融合体。细胞表面结合的IL-12水平通过PE偶联的单克隆抗IL-12抗体和QUANTBriteTMPE定量试剂盒(BD生物科学公司)通过流式细胞仪分析进行定量。
如图33所示，在饱和浓度的脉冲IL-12系连融合体下，约3600个IL-12系连融合分子结合到小鼠T细胞的表面。这相当于每1E6个细胞约650pg chM1Fab-scIL-12p70，每百万个细胞约
430pg IL-12p70。
如图33所示，在饱和浓度的脉冲IL-12系连融合体下，约3600个IL-12系连融合分子结合到小鼠T细胞的表面。这相当于每1E6个细胞约650pg chM1Fab-scIL-12p70，每百万个细胞约
430pg IL-12p70。
[0907] 实施例17：通过IL-12系连融合在未加载的靶细胞中激活STAT4磷酸化
[0908] 系连融合体可以同时激活加载的细胞和未加载的靶细胞(图34A)。因此，我们评估了IL-12系连融合体以顺式/自分泌，反式和旁分泌方式支持人T细胞活性的能力。简而言之，在与IL-12系连融合体(h9.4Fab-scIL-12p70)进行脉冲孵育后一天，通过三种单独的测定中测量STAT4磷酸化水平，以探测顺式，反式和旁分泌活性。简而言之，如实施例13中所述激活了总CD3 T细胞。将活化的人T细胞与IL12-TF(h9.4Fab-scIL-12p70)在37℃下孵育1小时，通过洗涤除去未结合的系连融合体，并将细胞以4E5细胞/mL的密度接种，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。在没有细胞因子的情况下，将未加载的细胞在完全培养基中再繁殖一天，并在第二天用作反式和旁分泌测定的“靶标”细胞。对于顺式呈递/自分泌活性，如上所述，将细胞固定，透化并针对STAT4磷酸化进行免疫染色。对于反式呈递评估，未装载IL12-TF的靶细胞用CellTrace远红染料(赛默飞世尔公司)标记，以便使用流式细胞术从加载IL12-TF的细胞中分化出来。将加载IL12-TF的细胞与荧光标记的未加载细胞混合，沉淀并一起孵育30分钟。然后将细胞固定，透化并针对STAT4磷酸化进行免疫染色。为了进行转移/旁分泌，在脉冲孵育后一天从IL12-TF加载的细胞中回收条件培养基，并转移到未加载的细胞中，孵育30分钟，然后固定透化并针对STAT4磷酸化进行免疫染色。在所有测定中，使用DiVa软件在FACSCelesta流式细胞仪上分析细胞，并使用Cytobank分析数据。对于所有测定，IL12-TF在“空白”脉冲细胞的背景之上诱导STAT4磷酸化，该空白脉冲细胞用不含系连融合体的培养基脉冲处理(图34B)。据报道，IL-15可以增强IL-12的活性，并且我们在上面显示，IL-15和IL-12系连融合体的组合可以增强STAT4磷酸化；因此，我们还评估了与IL-12(h9.4Fab-scIL-12p70)和IL-15(h9.4Fab-IL-15/sushi)系连融合体在本文所述的三种测定方法中组合脉冲孵育中的STAT4磷酸化。尽管IL-15系连融合体本身并不诱导强烈的
STAT4磷酸化，但通过顺式和转移测定法中IL-12和IL-15系连融合体的组合，STAT4的磷酸化作用得以增强，如图34B所示。
STAT4磷酸化，但通过顺式和转移测定法中IL-12和IL-15系连融合体的组合，STAT4的磷酸化作用得以增强，如图34B所示。
[0909] 实施例18：IL 12-FT在肿瘤特异性T细胞疗法中的作用
[0910] 当在过继细胞治疗(ACT)前预加载到细胞上时，评估了表面系连的IL-12针对癌症增强肿瘤特异性细胞治疗的能力。简而言之，用400,000个B16-F10黑色素瘤细胞皮内接种C57BL/6J小鼠。从Pmel-1小鼠中分离出CD8 T细胞，其在B16-F10黑色素瘤细胞中表达对小鼠gp100抗原具有特异性的T细胞受体。如实施例16中所述活化和扩增细胞。通过将小鼠IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70)与浓度为50nM的细胞一起孵育，将其加载到活化的CD8 Pmel T细胞上；通过洗涤除去未结合的细胞因子，并将细胞重悬于HBSS(汉克斯平衡盐溶液)中。我们还评估了单独的IL15-TF(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)(浓度为250nM)或与IL-12系连融合体(浓度为50nM)组合使用的方法。在37℃下用系连融合体孵育1小时后，将细胞用完全培养基洗涤两次，重悬于HBSS中，并通过尾静脉注射过继转移(5x106细胞/小鼠)至B16-F10荷瘤小鼠。作为对照，还单独用HBSS或Pmel T细胞治疗小鼠。虽然清髓性淋巴清除通常用于抗肿瘤T细胞疗法，但本研究中的所有治疗条件均在不进行清髓性淋巴结清扫术的情况下进行。
[0911] 图35A显示了肿瘤生长，小鼠体重变化，存活(直至ACT后第100天)。就抗肿瘤生长和长期存活而言，包含IL-12的方案(IL12-TF和IL12/15TF)显示最高的抗肿瘤活性。来自用携带IL12-TF(单独或与IL15-TF结合使用)的Pmel治疗组的七只小鼠中有四只(57％)表现出完全应答。值得注意的是，在含有IL15-TF的组中有一个长期存活者。所有治疗组的体重减轻峰值均小于5％，这与HBSS治疗组的体重减轻一致，表明此处测试的治疗策略没有明显的毒性。
[0912] 携带小鼠IL12-TF的Pmel细胞显示对内源性免疫系统具有活性的迹象。它们诱导转移的和内源性免疫细胞(包括CD8 T细胞和NK细胞)的瞬时淋巴细胞减少(图35B)。随后是内源性CD8 T细胞的增殖(如Ki67阳性所定义)和分化(图35C)。内源性CD8 T细胞的进一步细分显示，增殖细胞几乎完全包含在经历过抗原的内源性CD8 T细胞群中(通过流式细胞术，该群对同基因Pmel T细胞标记物CD90.1均为阴性，并且对于CD8和CD44为双阳性)，表明IL12-TF的存在正在激活内源性免疫系统的特定区室(图35D)。如图35B所示，内源性NK细胞的瞬时淋巴细胞减少后，其增殖(通过Ki67阳性)和激活(通过CD69阳性)增加，如图35E所示。我们得出结论，携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞具有增强癌症ACT和引发内源性免疫系统的潜力。
[0913] 实施例19：当IL12-TF预加载在过继转移的T细胞上或可溶地共同给予时，增强了肿瘤特异性T细胞疗法
[0914] 评估了表面系连的IL-12增强针对癌症的过继细胞治疗(ACT)的能力。简而言之，用400,000个B16-F10黑色素瘤细胞皮内接种C57BL/6J小鼠。在用肿瘤特异性T细胞进行过继细胞治疗的前一天(接种B16-F10细胞后9天)，用4mg环磷酰胺处理荷瘤小鼠。分别地，从表达对在B16-F10黑素瘤细胞中gp100抗原有特异性的T细胞受体的Pmel-1小鼠中分离CD8T细胞，并如实施例16中针对T细胞所述活化和扩增。然后收获细胞用于ACT并与浓度为125nM的IL-12系连融合体(chM1Fab-scIL-12p70)孵育。通过洗涤除去未结合的系连融合体，将细胞重悬于HBSS中，然后通过静脉内(i.v.)注射将CD8 Pmel T细胞过继转移(3E6细胞/小鼠)到B16-F10荷瘤小鼠中。作为对照，小鼠也分别接受了HBSS，仅CD8 Pmel T细胞或CD8 Pmel T细胞然后再给予单剂量的可溶性IL-12p70(剂量水平为10、50或250ng，相当于0.143，0.715和3.575pmol的IL-12p70)或可溶的IL-12系连融合体(0.143、0.715或3.575pmol的系连融合体)治疗，在所有情况下可静脉内给药。不希望受到理论束缚，基于实施例16中的初步计算，迄今为止测试的最高剂量对应于大于100倍量的表面系连IL-12剂量。
[0915] 如图36所示，预加载或可溶共给予的IL-12系连融合体均显著抑制肿瘤生长并支持延长的生存。在每种情况下，与游离IL-12共同给药相比，系连融合体更强烈地抑制肿瘤生长并延长生存。观察到体重减轻形式的最小明显毒性。为了清楚起见，将数据绘制在两个单独的图中；在第二组图中，将HBSS，仅Pmel和Pmel携带IL12-TF组重新绘制以进行比较。显示了ACT后的前35天或截至给定组中的两只小鼠死亡的肿瘤生长动力学。
[0916] 实施例20：IL12-TF候选物能够在多细胞剂量下进一步改善肿瘤控制
[0917] 大多数细胞疗法需要在ACT之前进行涉及清髓化学疗法的预处理方案，以产生强大的抗肿瘤反应。然而，该方法具有局限性，包括由于连续几轮预处理化学疗法清除先前给予的细胞活性的风险而无法给予多个细胞剂量。在实施例18中，我们证明了在实体瘤模型中在没有预处理的情况下IL12-TF增强肿瘤特异性T细胞疗法的潜力。考虑到这些作用，我们评估了IL12-TF通过使用多细胞剂量进一步增强抗肿瘤控制的能力。简而言之，用400,000个B16-F10黑色素瘤细胞皮内接种C57BL/6J小鼠。分别地，如实施例18所述，分离，活化，扩增并用IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70)加载来自Pmel小鼠的CD8 T细胞。在肿瘤接种后第
9天用CD8 Pmel T细胞通过iv注射处理小鼠。在第一细胞剂量前一天使用环磷酰胺进行淋巴清除；在没有另进行淋巴切除术的情况下，在第一剂量之后14天给予第二细胞剂量。我们还评估了IL12-TF(chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)的替代配置增强单剂量肿瘤特异性细胞治疗的疗效的能力。IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70和chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)与通过系链融合体离体加载的单个细胞剂量都改善了肿瘤生长的抑制和存活率(图37A)。多剂量肿瘤特异性T细胞与chM1Fab-scIL-12p70离体加载进一步提高了抗肿瘤生存率，但多剂量的单独肿瘤特异性T细胞却没有(图37B)。
9天用CD8 Pmel T细胞通过iv注射处理小鼠。在第一细胞剂量前一天使用环磷酰胺进行淋巴清除；在没有另进行淋巴切除术的情况下，在第一剂量之后14天给予第二细胞剂量。我们还评估了IL12-TF(chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)的替代配置增强单剂量肿瘤特异性细胞治疗的疗效的能力。IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70和chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)与通过系链融合体离体加载的单个细胞剂量都改善了肿瘤生长的抑制和存活率(图37A)。多剂量肿瘤特异性T细胞与chM1Fab-scIL-12p70离体加载进一步提高了抗肿瘤生存率，但多剂量的单独肿瘤特异性T细胞却没有(图37B)。
[0918] IL12-TF增加了循环中的Pmel T细胞的峰值扩增及其长期持久性(图37C)。我们没有观察到体重减轻形式的明显毒性迹象(图37D)。观察到的体重减轻似乎均主要是由环磷酰胺进行的淋巴清除驱动的：在每个治疗组中，小鼠的体重减轻了约10％(图37D)，而在没有淋巴消除的情况下进行的实施例18中，我们观察到所有治疗组中不足5％的体重减轻(图35A)。我们还观察到用Pmel携带IL12-TF的ACT后一天时，血浆中全身性IFN-γ(图38)和CXCL10(图39)处于适度水平；在过继细胞转移后的四天内，循环水平恢复到基线(图38-
39)。
39)。
[0919] 总而言之，我们在临床前研究中证明，抗体介导的细胞因子系连的多种构型可在T细胞表面上实现IL-12的强加载和持久性。此外，表面系连的IL-12在侵略性实体瘤模型中显著提高了过继转移的肿瘤特异性T细胞的功效，包括比全身给予的IL-12摩尔过量>100倍更好的肿瘤控制和存活率。在没有淋巴清除的情况下，加载IL12-TF的肿瘤特异性T细胞的功效使得可以通过多细胞剂量给药来进一步提高疗效。
[0920] 表面系连IL-12还支持内源性免疫系统的激活(包括增加经历抗原的CD8 T细胞的增殖)，而没有体重减轻和持续的全身性细胞因子释放形式的明显毒性。
[0921] 我们得出的结论是，细胞表面系连的免疫刺激细胞因子是增强针对癌症(包括实体瘤)的细胞疗法功效的有效方法。这种方法不需要基因工程改造，可以很容易地整合到目前正在临床研究中的细胞疗法中，例如CAR-T，TCR-T，肿瘤相关抗原特异性T细胞和NK细胞。
[0922] 实施例21：系连融合平台使体内特异性细胞靶向成为可能
[0923] 已经建立了使用靶向CD8的IL-7或IL-15系连融合体在体外选择性加载CD8 T细胞的能力(请参见示例9)，我们使用靶向CD8的IL-15IFM测试了体内对CD8 T细胞的选择性靶向。鉴于我们先前在人T细胞中的观察结果，表明使用二价Fab-scFv构建体可改善CD8亲和力(图17D-图17F)，我们生成了包含相似Fab-scFv抗体配置的小鼠靶向CD8的IL-15变体(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)。设计靶向CD8的Fab以提供特异性，而靶向CD45的scFv可提高在靶向的细胞上的持久性。
[0924] 在此示例中描述的第一实验中，我们测试了静脉内给予的系连融合体是否可以在体内特异性靶向小鼠CD8 T细胞。两只C57BL/6J小鼠/组分别注射chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi(2μg/小鼠)，chM1Fab-IL15/sushi(CD45靶向的IFM，2μg/小鼠)或PBS载剂对照。注射后一小时，抽血并通过流式细胞术评估系连的融合细胞表面结合。裂解红细胞，剩余的细胞用针对κ和IL-15的荧光偶联抗体染色，以检测系连融合体。还包括对小鼠CD4，CD8，NK1.1和CD45特异性的抗体，以进行免疫细胞亚群分析。通过对κ和IL-15的阳性定义了系连融合表面结合。载剂对照和chM1Fab-IL15/sushi处理的动物均具有最小的阳性染色细胞(3.5-3.9/μl)，而chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi处理的动物的循环系连融合体阳性细胞浓度高出10倍以上(图40A)。图40A中的直方图显示了chM1Fab-IL15/sushi处理的动物的荧光主体偏移；但是，没有明显的TF阳性群。因为CD45存在于所有免疫细胞上，所以很可能存在特异性结合，但是系连融合信号却散布在多得多的细胞上。对于用CD8靶向的IL-15(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)治疗的小鼠，虽然总细胞中只有一小部分对系连融合体呈阳性
(1.73％)，但大多数CD8 T细胞均为阳性(图40B)。此外，其他所有分析的亚组(CD4 T细胞，NK细胞)均未显示TF染色。这些数据一起显示chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi系连融合体对CD8细胞的特异性，高水平靶向，以及CD45特异性chM1Fab-IL15/sushi系连融合体对CD8细胞的非特异性，低水平靶向。
(1.73％)，但大多数CD8 T细胞均为阳性(图40B)。此外，其他所有分析的亚组(CD4 T细胞，NK细胞)均未显示TF染色。这些数据一起显示chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi系连融合体对CD8细胞的特异性，高水平靶向，以及CD45特异性chM1Fab-IL15/sushi系连融合体对CD8细胞的非特异性，低水平靶向。
[0925] 在第二实验中，我们评估了单剂量(2或10ug)CD45或CD8靶向的IL-15IFM对循环免疫细胞的影响。我们还包括了非靶向IL-15/sushi-Fc构建体和包含D61H和E64H突变的CD8靶向IL-15变体(chY169Fab-M1scFv-IL15-DHEH/sushi；有关这些突变的更多信息，请参见实施例9)。注射后第3天抽血，裂解红细胞，剩余的细胞用针对CD45，CD4，CD8和NK1.1的荧光偶联抗体染色。注射后第3天，对于任何系连融合形式或浓度，CD4 T细胞数量有最小变化(图40C)。相反，所有系连融合形式和浓度的CD8数量都增加了3.4-13.6倍。靶向CD45和CD8的系连融合体对CD8细胞的作用相似，并且相对于非靶向IL15/sushi-Fc而言增加。与其生物学活性降低相对应，DHEH突变体驱动的CD8扩增比野生型IL-15IFM少。尽管相对于CD45，靶向CD8的系连融合体的CD8 T细胞扩增没有增强，但对NK细胞的脱靶效应却有所降低(通过循环中NK1.1+细胞的定量测定)。NK细胞对IL-15也高度敏感，通过靶向chM1Fab-IL15/sushi系连融合体的IL-15/sushi-Fc和pan-CD45，它们的数量急剧增加(扩增6-13倍，相对于HBSS治疗组)。相反，靶向CD8的chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi导致NK细胞数量仅适度增加(3-5倍)。DHEH突变体对NK细胞的脱靶作用甚至被进一步减弱，相对于载剂对照仅扩增了1.5-3倍。通过比较CD8 T细胞与NK细胞的比例，可以最清楚地看到这些效果(图40D)。非靶向的IL15/sushi确实降低了CD8 T细胞与NK细胞的比率，这表明在不靶向的情况下，更倾向于NK比活性。虽然靶向pan-CD45的系连融合体显著增加了CD8 T细胞数量，但它对NK细胞数量也具有相当的影响，而与载剂治疗小鼠的CD8:NK比没有变化。靶向野生型CD8的系连融合体使2μg和10μg剂量的CD8:NK比率显著增加，分别增加9.2倍和4.4倍。DHEH突变体对CD8 T细胞没有显著影响，但对NK细胞的脱靶作用也有所降低，并且用该构建体处理的小鼠的CD8:NK比率与靶向CD8的野生型系连融合体相似。我们得出的结论是，IFM靶向可以调节IL-
15的CD8和NK细胞效应的大小和选择性；特别是，通过控制IL-15的靶向作用(CD8对比CD45对比非靶向)，剂量和活性(通过减弱IL-15突变)，可以使IL-15活性偏向CD8细胞。
15的CD8和NK细胞效应的大小和选择性；特别是，通过控制IL-15的靶向作用(CD8对比CD45对比非靶向)，剂量和活性(通过减弱IL-15突变)，可以使IL-15活性偏向CD8细胞。
[0926] 这些实验共同表明，全身给予CD8靶向的IL-15变体可以将IL-15体内加载到CD8 T细胞上，可以使IL-15偏向这些细胞，并且可以进一步增加CD8 T细胞的循环水平，使其超过通过用本领域描述的IL-15构建体，例如IL15/sushi-Fc处理可达到的水平。
[0927] 实施例22：靶向CD8的IL-15的全身给药显示毒性降低
[0928] 我们评估了将IL-15重新靶向CD8 T细胞对全身毒性的影响。简而言之，通过静脉内注射10、30或90μg IL15/sushi-Fc构建体(IL-15的半衰期延长形式)或两种不同的含有D61H(DH)或D61H和E64H(DHEH)突变的靶向CD8的IL-15变体(chY169Fab-M1scFv-IL15-DH/sushi和chY169Fab-M1scFv-IL15-DHEH/sushi)，向C57BL/6J小鼠每周一次给予两剂量；每组n＝5只小鼠。我们还评估了以90μg剂量水平包含野生型IL-15，chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi的CD8靶向IFM。在上面的实施例21中，我们证明了与IL15/sushi-Fc或靶向CD45的构建体相比，靶向CD8的构建体偏向于IL-15对CD8 T细胞的加载和活性，并且在10μg剂量下，靶向CD8的构建体诱导循环CD8 T细胞的扩增等于或优于10μg IL15/sushi-Fc，同时诱导循环NK细胞的较小扩增。我们还评估了在固定剂量水平下每周增加剂量的数量，特别是，我们检查了持续两周(每周两次或三剂)的10μg IL15/sushi-Fc或靶向CD8的IL-15IFM(每组n＝3只小鼠)。图41A显示针对靶向CD8的IL-15变体的剂量增加，没有随时间的体重减轻形式的明显毒性。但是，IL15/sushi-Fc构建体的IL15/sushi-Fc的最大耐受剂量为每周10μg：30和
90μg剂量诱导明显的毒性，并在注射后四天导致死亡(图41A，图例中括号中的数字表示实验结束时存活小鼠的比例)。我们进一步从死小鼠中收获脾脏，并在用30和90μg IL15/sushi-Fc处理的小鼠中发现脾肿大(图41B)。相比之下，在这里检查的完整的两周给药方案后，与10μg IL15/sushi-Fc相比，每种靶向CD8的IL-15变体都能够完成完整的两周研究，得到最小的体重减轻(图41A)，无死亡动物，并且脾脏增大较小(图41B)。此外，虽然IL15/sushi-Fc的耐受性为每周一次10μg，但将其剂量增加至每周两次或三次会导致明显的毒性和第二次注射后的死亡(图41C，图例中括号中的数字表示实验结束时存活小鼠的比例)。死亡小鼠也表现出脾肿大(图41B)。相比之下，在完整的两周给药方案过程中，以10μg的剂量每周两次或三次给予靶向CD8的IL-15变体不会导致体重明显减轻，死亡动物(图41C)或明显脾脏肿大(图41B)。我们得出结论，将IL-15重新靶向CD8 T细胞可在体内降低IL-15的毒性并提高剂量。已经显示通过IL-15扩增NK细胞对体内IL-15毒性有强烈贡献(Guo等，J Immunol.2015年9月1日；195(5):2353-64)。不希望受到理论限制，有理由认为，IL-15在体内偏离NK细胞的偏向活性可以降低毒性并能够针对CD8 T细胞进行更强的剂量给药。考虑到IL-15的抗肿瘤功效可以由CD8 T细胞介导，这在治疗上有优势且是显著的(Xu等，Cancer Res.2013年5月15日；73(10):3075-86；Cheng等，J Hepatol.2014年12月；61(6):1297-
303)。
90μg剂量诱导明显的毒性，并在注射后四天导致死亡(图41A，图例中括号中的数字表示实验结束时存活小鼠的比例)。我们进一步从死小鼠中收获脾脏，并在用30和90μg IL15/sushi-Fc处理的小鼠中发现脾肿大(图41B)。相比之下，在这里检查的完整的两周给药方案后，与10μg IL15/sushi-Fc相比，每种靶向CD8的IL-15变体都能够完成完整的两周研究，得到最小的体重减轻(图41A)，无死亡动物，并且脾脏增大较小(图41B)。此外，虽然IL15/sushi-Fc的耐受性为每周一次10μg，但将其剂量增加至每周两次或三次会导致明显的毒性和第二次注射后的死亡(图41C，图例中括号中的数字表示实验结束时存活小鼠的比例)。死亡小鼠也表现出脾肿大(图41B)。相比之下，在完整的两周给药方案过程中，以10μg的剂量每周两次或三次给予靶向CD8的IL-15变体不会导致体重明显减轻，死亡动物(图41C)或明显脾脏肿大(图41B)。我们得出结论，将IL-15重新靶向CD8 T细胞可在体内降低IL-15的毒性并提高剂量。已经显示通过IL-15扩增NK细胞对体内IL-15毒性有强烈贡献(Guo等，J Immunol.2015年9月1日；195(5):2353-64)。不希望受到理论限制，有理由认为，IL-15在体内偏离NK细胞的偏向活性可以降低毒性并能够针对CD8 T细胞进行更强的剂量给药。考虑到IL-15的抗肿瘤功效可以由CD8 T细胞介导，这在治疗上有优势且是显著的(Xu等，Cancer Res.2013年5月15日；73(10):3075-86；Cheng等，J Hepatol.2014年12月；61(6):1297-
303)。
[0929] 实施例23：IL-12的全身性，CD8靶向给药的抗癌功效
[0930] IL-12是一种强效的细胞因子，可在鼠肿瘤模型中诱导强抗肿瘤活性，但在人临床试验中有高毒性。IL-12支持CD4 T细胞分化为Th1表型，增加CD8 T细胞的细胞毒性，并激活NK细胞。然而，用于癌症治疗的IL-12的临床试验发现，IL-12对人患者的作用在NK细胞上最为突出(Robertson等，Clin Cancer Res.1999年1月；5(1):9-16；Bekaii-Saab等，Mol Cancer Ther.2009年11月；8(11):2983–2991)。IL-12对NK细胞的显性活性，再加上与激活NK细胞相关的毒性，可能会限制将IL-12的生物学效应有效传递至CD4和CD8 T细胞的能力。为了验证该假设，我们构建了靶向小鼠CD8 T细胞的小鼠IL-12IFM(chY169Fab-M1scFv-scIL-12p70)，并评估了其在鼠黑色素瘤肿瘤模型中的安全性和抗肿瘤功效。
[0931] 简而言之，通过皮内注射用400,000B16-F10黑色素瘤细胞接种B6D2F1/J小鼠。10天后，将荷瘤小鼠随机分组并用0.05、0.25、1或5μg重组IL-12(RD系统公司)，靶向CD45的IL-12(chM1Fab-M1scFv-scIL12p70和chM1Fab-scIL12p70)，或靶向CD8的IL-12通过静脉注射处理(每组n＝5只小鼠)。图42A表明，与每周注射IL-12相比，每周注射靶向CD45的IL-12IFM或靶向CD8的IL-12IFM各自提供更强的抗肿瘤功效。靶向CD8的IL-12另外提供了与靶向CD45的IL-12类似的肿瘤生长抑制作用(图42A)。值得注意的是，用Fab-scFv靶向CD45的IL-12构建体治疗的小鼠在1和5ug剂量水平下均以体重减轻的形式遭受毒性，而以Fab-scFv靶向CD8的IL-12治疗的小鼠则没有表现出相似的毒性(图42B)。我们得出的结论是，与单独使用IL-12相比，包含IL-12的IFM可以提供更高的抗肿瘤功效，并且细胞特异性靶向的IL-12可以降低全身毒性。
[0932] 实施例24：转染编码系连融合体的mRNA和
[0933] mRNA合成。可以产生用修饰的核糖核苷酸假尿苷(Ψ)和5-甲基胞苷(m5C)完全取代并用ARCA封端的本文公开的系连融合(例如IL-15或IL-12融合体)或eGFP的密码子优化的mRNA。Ψ和m5C修饰的eGFP mRNA可以与cy5(也来自TriLink)偶联，以跟踪这些转录物的递送。
[0934] T细胞的mRNA转染。可以通过逐滴加入温热的TCM，然后离心(450×g持续10分钟)来解冻来自正常供体的冷冻PBMC。可以通过阴性选择(Stemcell)分离CD8 T细胞。可以在TCM+IL-2中以106个细胞/ml培养细胞，并用CD3/CD28珠(Dynabeads，生命技术公司(Life Technologies))以1:1的珠:细胞比率进行刺激。对于涉及靶向αCD3的转染的实验，可以在加入NP前24小时除去这些珠。
[0935] 对于纳米颗粒(NP)介导的转染，可以使用例如实施例4的方法制备NP，并且可以将T细胞重悬于XFSFM中至2×106/ml的浓度。可以将含有2.5μg mRNA/106细胞的靶向抗体的NP在该混悬液中混合在37℃下暴露2小时，然后通过添加补充了50IU IL-2/ml的T细胞培养基将其稀释四倍。对照NP含有eGFP mRNA。
[0936] 对于电穿孔，可以用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤2×106个T细胞两次，重悬于100ul含3μg eGFP mRNA的T细胞电穿孔培养基(隆萨公司(Lonza))中，然后转移至电穿孔比色皿中，并使用程序T-20在Nucleofector(隆萨公司)仪器中进行处理。可以将电穿孔的细胞转移到不含抗生素的含2ml TCM+IL-2的平板中。
[0937] CD34+细胞的纳米颗粒转染。可以从先前从正常供体中动员的外周血干细胞(PBSC)纯化CD34+细胞。解冻后，可以对细胞进行计数，然后在HSC培养基中以106/ml的浓度培养过夜：StemSpan SFEMII无血清培养基，添加50ng/ml人干细胞因子(Scf)，50ng/ml鼠Flt3/Flk-2配体，和25ng/ml的人血小板生成素(干细胞技术公司(Stemcell
Technologies))。第二天，细胞可以经收集，计数并在96孔组织培养板(Costar)中以2.5×
104细胞/孔重悬于100μl没有细胞因子的HSC中。可以用每孔含有1μg eGFP或Musashi-
2mRNA的靶向CD105或对照NP处理细胞1小时，然后用1ml没有细胞因子的HSC培养基洗涤两次。然后将洗涤后的细胞转移到24孔组织培养板中的500μl完全HSC培养基中；48小时后，将细胞针对CD34，CD133和CD105(BioLegend)标记，以通过流式细胞仪进行分析。
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104细胞/孔重悬于100μl没有细胞因子的HSC中。可以用每孔含有1μg eGFP或Musashi-
2mRNA的靶向CD105或对照NP处理细胞1小时，然后用1ml没有细胞因子的HSC培养基洗涤两次。然后将洗涤后的细胞转移到24孔组织培养板中的500μl完全HSC培养基中；48小时后，将细胞针对CD34，CD133和CD105(BioLegend)标记，以通过流式细胞仪进行分析。
[0938] 测量细胞表面和上清液中的IFM。可以通过免疫荧光染色分析细胞，以检测转染后0、1和3天培养后的细胞表面IFM以及上清液中的IFM。简而言之，可将细胞用含有1mg/mL牛血清白蛋白(PBS/BSA)的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后用在PBS/BSA中1:100稀释的PE偶联的抗IL15抗体(克隆号34559；RD系统公司，目录号IC2471P)和1:100稀释的DyLight650偶联的抗人IgG H+L多克隆抗体(赛默飞世尔目录号Sa5-10129)染色。在4℃下孵育20-30分钟后，可将细胞用PBS/BSA洗涤一次，然后重悬于PBS/BSA中，以使用Diva软件在
FACSCelesta(BD生物科学公司(BD Biosciences))上进行分析。可使用Cytobank(Cytobank公司)和GraphPad Prism(GraphPad软件公司)分析数据。同时，可以收集上清液并进行Western印迹。
FACSCelesta(BD生物科学公司(BD Biosciences))上进行分析。可使用Cytobank(Cytobank公司)和GraphPad Prism(GraphPad软件公司)分析数据。同时，可以收集上清液并进行Western印迹。
[0939] 对本公开所述方法和组合物的改进和变动对本领域技术人员是显而易见的，而不偏离本公开的范围和精神。虽然已结合具体的优选实施方案对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方案。实际上，本公开所属领域的相关领域的技术人员意图和理解对所描述的用于实施本公开的方式的各种修改，这些修改落入由所附权利要求所表示的本公开的范围内。
[0940] 通过引用纳入
[0941] 本说明书中提到的所有专利和公开通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的专利或公开专门和单独地通过引用纳入本文那样。在2018年7月3日提交的，代理档案号为174285-010800/PCT且题为“免疫刺激融合分子及其用途”的PCT国际申请，和在2018年7月3日提交的，代理档案号为174285-011000/PCT且题为“融合分子靶向免疫调节细胞及其用途”的PCT国际申请均在此通过引用全文纳入本文。
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