改进的基于NK细胞的疗法
阅读：301发布：2020-05-13
专利汇可以提供改进的基于NK细胞的疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且癌症 治疗 方法，其包括施用自然杀伤(NK)细胞或细胞系与IL-6拮抗剂，例如IL-6或其受体的 抗体 ，特别是用于治疗癌症的方法，该癌症表达IL-6受体，并且其中诸如PDL-1和/或PDL-2的检查点抑制性受体在 疾病 期间表达/上调。，下面是改进的基于NK细胞的疗法专利的具体信息内容。
1.自然杀伤(NK)细胞或细胞系与IL-6拮抗剂组合用于治疗癌症。
2.根据权利要求1所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述癌症表达IL-6受体。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
4.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述IL-6拮抗剂为结合IL-6、IL-6R或gp130中的一种的抗体。
5.根据权利要求4所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述IL-6抗体选自西妥昔单抗(siltuximab)、奥昔单抗(olokizumab)(CDP6038)、艾西莫单抗(elsilimomab)、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(sirukumab)(CNTO 136)。
6.根据权利要求5或6所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述IL-6R抗体选自塔西单抗(tocilizumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、PM-1和AUK12-20。
7.根据权利要求4所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述gp130抗体为AM64。
8.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其与单独的抗癌疗法组合。
9.根据权利要求8所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述单独的抗癌疗法利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞。
10.根据权利要求8或9所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述单独的抗癌疗法为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述癌症为血癌。
12.根据权利要求11所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述血癌为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
13.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的一种或多种检查点抑制性受体的表达。
14.根据权利要求13所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述检查点抑制性受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
15.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以表达突变TRAIL配体。
16.根据权利要求15所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述突变TRAIL配体具有增加的对诸如DR4和/或DR5的TRAIL受体的亲和力。
17.根据权利要求15或16所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述突变TRAIL配体具有降低的对诱骗TRAIL受体的亲和力。
18.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，所述NK细胞或细胞系表达嵌合抗原受体(CAR)。
19.根据权利要求18所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述CAR为双特异性CAR。
20.根据权利要求19所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR结合一种细胞类型上的两种配体。
21.根据权利要求19所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR结合两种不同细胞类型中每一种上的一种配体。
22.根据权利要求11和22所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述CAR或双特异性CAR的一种或多种配体在癌细胞上表达。
23.根据权利要求22所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR的配体均在癌细胞上表达。
24.根据权利要求22所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR的配体在癌细胞和免疫效应细胞上表达。
25.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的IL-6受体表达。
26.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞系为KHYG-1。
27.IL-6拮抗剂用于治疗癌症的用途，其中所述癌症的细胞表达IL-6受体。
28.根据权利要求27所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
29.根据权利要求27-28所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6拮抗剂为结合IL-6、IL-6R或gp130中的一种的抗体。
30.根据权利要求29所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6抗体选自西妥昔单抗、奥昔单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(CNTO 136)。
31.根据权利要求29所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6R抗体选自塔西单抗、沙利鲁单抗、PM-1和AUK12-20。
32.根据权利要求29所述的的IL-6拮抗剂的用途，其中所述gp130抗体为AM64。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6拮抗剂与单独的抗癌疗法组合使用。
34.根据权利要求33所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述单独的抗癌疗法利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞。
35.根据权利要求33或34所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述单独的抗癌疗法为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
36.根据权利要求27-36中任一项所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述癌症为血癌。
37.根据权利要求36所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述血癌为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
38.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的NK细胞和IL-6拮抗剂的组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症表达IL-6受体。
40.根据权利要求38-39中任一项所述的方法，其中所述癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中提供具有预结合的IL-6拮抗剂的NK细胞或细胞系。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂为结合IL-6、IL-6R或gp130中的一种的抗体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述IL-6抗体选自西妥昔单抗、奥昔单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(CNTO 136)。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述IL-6R抗体选自塔西单抗、沙利鲁单抗、PM-1和AUK12-20。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述gp130抗体为AM64。
46.根据权利要求38-45中任一项所述的方法，其与单独的抗癌疗法组合使用。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述单独的抗癌疗法利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述单独的抗癌疗法为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
49.根据权利要求38-48中任一项所述的方法，其中所述癌症为血癌。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述血癌为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
51.根据权利要求38-50中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的一种或多种检查点抑制性受体的表达。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述检查点抑制性受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
53.根据权利要求38-52中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以表达突变TRAIL配体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述突变TRAIL配体具有增加的对诸如DR4和/或DR5的TRAIL受体的亲和力。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述突变TRAIL配体具有降低的对诱骗TRAIL受体的亲和力。
56.根据权利要求38-55中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系表达嵌合抗原受体(CAR)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述CAR为双特异性CAR。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述双特异性CAR结合一种细胞类型上的两种配体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述双特异性CAR结合在两种不同细胞类型的每一种上的一种配体。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述CAR或双特异性CAR的一种或多种配体在癌细胞上表达。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述双特异性CAR的配体均在癌细胞上表达。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述双特异性CAR的配体在癌细胞和免疫效应细胞上表达。
63.根据权利要求38-62中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的IL-6受体表达。
64.根据权利要求38-63中任一项所述的方法，其中所述NK细胞系为KHYG-1。
65.一种药物组合物，其包括NK细胞或细胞系和IL-6拮抗剂，所述NK细胞任选地如本文所述进行修饰。
66.一种NK细胞或细胞系，其经修饰以具有降低或缺失的IL-6受体功能。
67.根据权利要求66所述的NK细胞或细胞系，其经遗传修饰以降低或缺失的IL-6R的表达。
68.一种治疗人类患者中的癌症的方法，所述癌症选自(i)表达IL-6受体的多发性骨髓瘤，和(ii)表达IL-6受体的白血病，所述方法包括向患者施用有效量的NK细胞和中和IL-6的抗体的组合。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述抗体选自西妥昔单抗、奥昔单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(CNTO 136)。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述NK细胞为KHYG-1。
改进的基于NK细胞的疗法
技术领域
背景技术
[0002] 尽管对各种物理、药物和其他疗法进行了大量投资，但人类癌症仍然是所有年龄组死亡的重要原因。
[0003] 例如，急性髓性白血病(AML)是一种涉及致力于骨髓发育的前体细胞的造血系统恶性肿瘤，并且在成人(90％)和儿童(15-20％)中占急性白血病很大比例(Hurwitz,Mounce et al.1995；Lowenberg,Downing et al.1999)。尽管80％的患者通过标准化疗实现缓解(Hurwitz,Mounce et al.1995；Ribeiro,Razzouk et al.2005)，但是由于微小残留病(MRD)的高复发率，存活率仍然不能令人满意。五年存活率依赖于年龄；儿童占60％(Rubnitz2012)，65岁以下成人占40％(Lowenberg，Downing et al.1999)，65岁以上成人占10％(Ferrara and Schiffer 2013)。如果患者有合适的造血细胞供体，这些结果可以得到改善，但很多人没有合适的造血细胞供体，这就突显了对替代治疗方法的需求。
[0004] 自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，具有与自然杀伤T(NK-T)细胞不同的不同表型和效应子功能。例如，虽然NK-T细胞表达CD3和T细胞抗原受体(TCR)，但NK细胞不表达。通常发现NK细胞表达标志物CD16和CD56，其中CD16作为Fc受体起作用并介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，这将在下文进行论述。在这方面，KHYG-1是一个值得注意的例外。
[0005] 尽管NK细胞具有天然细胞毒性，但已开发出具有增加的细胞毒性的NK细胞系。NK-92和KHYG-1代表两种NK细胞系，这些细胞系已被广泛研究并显示出在癌症治疗方面的前景(Swift et al.2011；Swift et al.2012)。
[0006] 用于癌症治疗的过继性细胞免疫疗法通常涉及向患者施用天然和修饰的T细胞。T细胞可以以各种方式修饰，例如遗传修饰，以表达与某些靶癌细胞特异性结合的受体和/或配体。用对癌细胞抗原有特异性的高亲和力T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)转染T细胞，可以产生高反应性的癌症特异性T细胞应答的增强。该免疫治疗方法的主要限制是必须从患者获得T细胞用于自体体外扩增，或者必须在将细胞转移至患者后或者在某些情况下移植物抗宿主病(GVHD)发病后立即使用MHC匹配的T细胞以避免免疫清除。此外，成功转移的T细胞通常在循环中存活较长时间，使得难以控制由治疗引起的持续副作用。
[0007] 在单倍型移植中，当存在KIR抑制性受体-配体错配时，认为移植物抗白血病效应是由NK细胞介导的，这可以改善AML治疗中的存活率(Ruggeri,Capanni et al.2002；Ruggeri,Mancusi et al.2005)。此外，在AML中进行单倍型T耗竭的造血细胞移植(HCT)的患者中，快速的NK恢复与更好的结果和更强的移植物抗白血病(GVL)效应相关(Savani,Mielke et al.2007)。其他试验使用体外扩增的单倍相合NK细胞来治疗成人AML(Miller,Soignier et al.2005)和儿童(Rubnitz,Inaba et al.2010)。
[0008] 已经建立了几种永久性NK细胞系，最值得注意的是NK-92(如上所述)，其来源于表达除CD16(Fcγ受体III)之外的典型NK细胞标记物的非霍奇金淋巴瘤患者。NK-92经历了广泛的临床前试验，与活化的NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)相比，其对多种肿瘤表现出优异的溶解作用(Gong,Maki et al.1994)。已经证实了NK-92细胞对原发性AML的细胞毒性(Yan,Steinherz et al.1998)。
[0009] 另一种NK细胞系KHYG-1已被确定为临床使用的潜在竞争者(Suck et al.2005)，但其具有降低的细胞毒性，因此受到的关注不如NK-92。已知KHYG-1细胞是预活化的。与内源性NK细胞不同，KHYG-1细胞始终是极化的，这增加它们的细胞毒性并使其更快地响应外部刺激。NK-92细胞比KHYG-1细胞具有更高的基线细胞毒性。
[0010] Cifaldi et al.(Arthritis Rheumatol.2015Nov；67(11):3037-46)报道了IL-6降低小鼠和人类关节炎患者的NK细胞细胞毒性。Kang et al(Hum Reprod.2014Oct 10；29(10):2176-89)表明，使用IL-6中和抗体可以逆转子宫内膜异位症患者的腹膜液中的NK细胞毒性。Wang et al.(PLoS One.2013Oct 7；8(10):e75788)推测在癌症治疗中靶向IL-6/STAT3途径，但没有提供支持数据。此外，先前已经证明IL-6上调某些骨髓瘤细胞系上的PD-L1表达的作用(Tamura et al.Leukemia.2013Feb；27(2):464-72)。此外，其他人报道了IL-6拮抗剂导致减弱的肿瘤控制(Idorn et al.Cancer Immunol Immunother.2017May；66(5):667-671)。
[0011] 存在对使用这种NK细胞并且通常使用NK细胞的替代且优选的改进的癌症疗法的需求。
[0012] 本发明的一个目的是提供使用NK细胞和NK细胞系的组合疗法，例如，其比仅依赖NK细胞的疗法更有效，例如细胞毒性更高。更具体的实施方案旨在提供针对被识别的癌症的治疗，例如血癌，如白血病。
发明内容
[0013] 本文提供了使用IL-6的拮抗剂与NK细胞组合治疗癌症的方法。所述细胞可以是患者的，在这种情况下，干预可以包括施用拮抗剂，因此依赖于患者的已经存在的NK细胞。细胞可以作为治疗的一部分施用，在这种情况下它们可以是自体同源的、同种异体的、原代细胞或细胞系等。这些疗法一起被称为组合，因为NK细胞和拮抗剂都是必需的。
[0014] 本发明提供治疗方法，所述方法包括施用拮抗剂，包括施用拮抗剂和细胞，包括施用细胞(其中抗体单独存在，例如作为相关疗法的一部分)。本发明提供了用于治疗癌症的组合。本发明还提供了包含细胞和拮抗剂的组合物。
[0015] 此外，本发明提供了NK细胞，其经修饰以具有降低或缺失的IL-6受体的表达。
[0017] 发明详述
[0018] 因此，本发明在组合疗法中使用自然杀伤(NK)细胞或NK细胞系。如下文详细描述的，NK细胞和NK细胞系也可以进行遗传修饰，以在这些疗法中增加它们对抗癌症的细胞毒活性。原代NK细胞和NK细胞系一起称为NK细胞(除非上下文另有要求)。本文所述的NK细胞还使用IL-6信号传导的拮抗剂，所述拮抗剂单独使用或与NK细胞组合使用。
[0019] 因此，本发明尤其提供了自然杀伤(NK)细胞或细胞系与IL-6拮抗剂组合用于治疗癌症的用途。癌症适当地表达IL-6受体和/或表达一种或多种检查点抑制性受体配体，例如，PDL-1和/或PDL-2。
[0020] 类似地，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向患者施用有效量的NK细胞与IL-6拮抗剂的组合。同样，癌症适当地表达IL-6受体和/或表达一种或多种检查点抑制性受体配体，例如，PDL-1和/或PDL-2。
[0021] 任选地提供具有预结合的IL-6拮抗剂的NK细胞或细胞系。拮抗剂和细胞也可以不预先结合，提供在单一制剂中或单独的制剂中。
[0022] 该组合疗法也可以用作其他单独的抗癌疗法的辅助疗法，例如利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞的那些。因此，可以通过使用本文所述的方法和组合物来补充包含抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的癌症疗法。
[0023] 可以对根据本发明使用的NK细胞或细胞系进行遗传修饰以降低IL-6受体的表达。单独地，NK细胞系可以选自已知的品系，例如，以下实施例中所使用的NK-92或KHYG-1。细胞或细胞系可以表现出细胞表面E-选择素配体的高水平表达。使用HECA-452抗体测定E-选择素配体表达。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系表现出高水平的E-选择素配体细胞表面表达。优选地，通过与同种型对照抗体结合相比HECA-452抗体结合增加至少2、4、6、8或10倍而表现出高水平的E-选择素配体细胞表面表达。可以例如通过流式细胞术测量该表达。
KHYG-1细胞系是一种这样的细胞系，与诸如NK-92细胞的其他NK细胞系相比，其表达高水平的HECA-452抗原。修饰细胞以表达高水平的E-选择素配体的其他方法包括，例如：1)用GDP-岩藻糖底物和α1,3岩藻糖基转移酶-VI酶进行化学处理；和2)表达或过表达FUT6或FUT7。此外，细胞系可以表现出TRAIL受体(例如DR4或DR5)的低水平的细胞表面表达。例如，与NK-92细胞相比，KHYG-1细胞表达低水平的DR4或DR5。例如，细胞表面TRAIL受体表达可以使用如实施例中详述的流式细胞术定量。
KHYG-1细胞系是一种这样的细胞系，与诸如NK-92细胞的其他NK细胞系相比，其表达高水平的HECA-452抗原。修饰细胞以表达高水平的E-选择素配体的其他方法包括，例如：1)用GDP-岩藻糖底物和α1,3岩藻糖基转移酶-VI酶进行化学处理；和2)表达或过表达FUT6或FUT7。此外，细胞系可以表现出TRAIL受体(例如DR4或DR5)的低水平的细胞表面表达。例如，与NK-92细胞相比，KHYG-1细胞表达低水平的DR4或DR5。例如，细胞表面TRAIL受体表达可以使用如实施例中详述的流式细胞术定量。
[0024] 本文进一步提供了其中NK细胞已经存在于患者体内的疗法；因此，本发明提供IL-6拮抗剂用于治疗癌症的用途，其中癌症细胞表达IL-6受体，以及治疗癌症的方法，其包括施用有效量的IL-6拮抗剂。
[0025] 如实施例中更详细描述的，已发现该组合在体外癌症模型中是有效的，特别是其中癌症表达IL-6受体。进一步注意到，本发明可治疗例如响应于治疗过程或在治疗过程中表达一种或多种检查点抑制性受体配体的癌症。在一个具体实例中，使用本发明组合治疗的癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
[0026] 本发明还提供了包含NK细胞或细胞系和IL-6拮抗剂的组合物。在组合物中，根据本文其他地方描述的一种或多种或所有修饰，任选地修饰细胞。
[0027] 在实施本发明时，IL-6的拮抗剂通过阻断IL-6信号转导起作用并因此抑制IL-6活性。
[0028] 可用于本发明的IL-6拮抗剂的实例包括如下适当地定义的抗体。这些抗体包括例如IL-6抗体、IL-6R抗体和gp130抗体。这些抗体结合IL-6、IL-6R或gp130以抑制IL-6和IL-6R之间或IL-6R和gp130之间的结合。
[0029] 因此，抗体阻断IL-6信号转导，抑制IL-6活性，从而减少NK细胞和/或靶细胞(癌)中的IL-6信号传导。
[0030] 因此，有用的抗体减少或停止IL-6信号以及对NK细胞/靶标的下游作用。本发明某些实施方案的特征在于与阻断IL-6对NK细胞的直接作用的第一效应(否则IL-6会降低NK活性)一样，存在阻断IL-6对靶标(癌症)细胞的作用的效果的第二效果；否则IL-6会提升或促进靶标中抑制NK细胞的细胞毒活性的反应。具体而言，阻断IL-6对靶细胞的作用已被证明可以阻止检测点抑制性受体配体在靶标上的表达，因此，靶标更容易受到NK细胞的细胞毒性作用的攻击。
[0031] 适用于本发明组合治疗的IL-6抗体的实例包括西妥昔单抗(siltuximab)(FDA批准的抗体)、奥昔单抗(olokizumab)(CDP6038)、艾西莫单抗(elsilimomab)、BMS-945429(Clazakizumab/ALD518)MH-166和西鲁库单抗(sirukumab)(CNTO 136)。IL-6R抗体的实例包括塔西单抗(tocilizumab)(FDA批准的抗体)、沙利鲁单抗(sarilumab)、PM-1和AUK12-20。gp130抗体的实例为AM64。
[0032] 适用于本发明组合治疗的其他IL-6拮抗剂包括mAb 1339(OP-R003)、PF-04236921、MEDI 5117、C326(AMG-220)、6a、sgp130Fc(FE301)、ALX-0061、NRI、SANT-7、ERBF、ERBA、MDL-A、SC144、雷洛昔芬(Raloxifene)(Keoxifene/LY156758/Evista)、Bazeoxifene(viviant)和LMT-28。
[0033] 通过常规技术制备单克隆抗体，使用例如IL-6、IL-6R或gp130中的一种作为免疫的致敏抗原。
[0034] 对IL-6R特异的抗体可以结合存在的两种类型的IL-6R中的一种或两种，即膜结合的IL-6R和从细胞膜分离的可溶性IL-6R(sIL-6R)。sIL-6R主要由附着于细胞膜的IL-6R的细胞外结构域构成，与膜结合的IL-6R的不同之处在于，其缺少跨膜结构域和/或细胞内结构域。
[0035] 对IL-6、IL-6R或gp130特异的抗体可以与本发明的NK细胞或NK细胞系分开或同时施用。由于NK细胞和NK细胞系的最佳药代动力学可能与抗体的最佳药代动力学不同，因此NK细胞和NK细胞系可以与IL-6、IL-6R或gp130抗体以不同的方案施用。例如，可以每周一次施用本发明的抗体，而NK细胞和细胞系可以每周施用两次。另一个实例是本发明的抗体可以每两周施用一次，而NK细胞和细胞系可以每周施用一次。
[0036] 如本文所用，除非另有说明，术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合与全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如单链可变区片段(scFv)、纳米抗体和由具有不同特异性的抗体片段形成多特异性抗体，例如双特异性抗体。优选地，抗体被人源化以减少个体对抗体的免疫应答。例如，抗体可以是嵌合的，例如具有人恒定区的非人可变区、或CDR移植的，例如具有人恒定区和可变区框架序列的非人CDR区。
[0037] 如上所述，目前的观察结果是，除了对NK细胞的活性外，癌细胞中的IL-6信号传导通过上调癌细胞膜上的检查点抑制性受体(cIR)配体间接抑制NK细胞的细胞毒性，并且还可以预防或减少IL-6信号传导的这类其他作用。这些cIR配体结合NK细胞上的cIR并抑制NK细胞的细胞毒性。
[0038] 由表达IL-6R的癌症表达的检查点抑制性受体配体包括cIR CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3的配体。
[0039] 根据本发明的IL-6拮抗剂可以以有效剂量向患者单独施用。IL-6拮抗剂能够阻止癌细胞和内源性NK细胞中的IL-6信号转导。IL-6拮抗剂阻止IL-6直接通过NK细胞中的信号传导以及间接通过癌细胞中的信号的对NK细胞细胞毒性的抑制作用。
[0040] 因此，本发明提供IL-6拮抗剂用于治疗癌症的用途，例如表达IL-6R的癌症。待治疗的癌症可以为实体组织肿瘤，例如肝肿瘤，包括肝细胞癌；肺肿瘤；非小细胞肺癌；胰腺肿瘤，包括胰腺癌或胰腺腺泡细胞癌；结肠癌、胃癌、肾癌，包括肾细胞癌(RCC)和移行细胞癌(TCC，也称为尿路上皮细胞癌)；卵巢癌；前列腺癌；乳腺癌；或宫颈癌。待治疗的癌症优选为血液癌症，也称为血癌，包括白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。更优选地，待治疗的癌症选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒状淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
[0041] 本发明的组合疗法通常可以使用NK细胞进行，包括但不限于自体细胞或同种异体细胞或特定细胞系，例如NK92或KHYG-1等。使用选定的NK细胞的以下具体实施例仅用于说明目的。如本文所述，治疗可以利用经修饰的NK细胞。
[0042] 在这种经修饰的细胞的第一个实例中，提供/使用具有降低或缺失的检查点抑制性受体(cIR)功能的NK细胞。因此，在下面的实施例中，产生基因敲除一个或多个cIR的NK细胞。优选地，这些受体是特异性cIR。优选地，这些检查点抑制性受体为CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和/或TIM-3中的一种或多种或全部。
[0043] 还可以提供/使用NK细胞，其中一种或多种抑制性受体信号传导通路被敲除或表现出功能降低-结果是再次降低或缺失抑制性受体功能。例如，由SHP-1、SHP-2和/或SHIP介导的信号通路通过细胞的遗传修饰被敲除。
[0044] 由此产生的NK细胞表现出改善的细胞毒性，因此在癌症治疗，特别是血癌治疗，特别是白血病和多发性骨髓瘤的治疗中具有更大的用处。
[0045] 在一个实施方案中，遗传修饰发生在细胞分化成NK细胞之前。例如，多能干细胞(例如iPSC)可进行遗传修饰以丧失表达一种或多种检查点抑制性受体的能力。然后将经修饰的iPSC分化以产生具有增加的细胞毒性的经遗传修饰的NK细胞。
[0046] 由于NK细胞活化后检查点抑制性受体的表达，优选减少检查点抑制性受体的功能而不是其它抑制性受体。正常或“经典”抑制性受体，例如大多数的KIR家族、NKG2A和LIR-2、结合MHC I类，因此主要参与减少自我靶向的问题。因此，优选地，敲除检查点抑制性受体。根据本发明的这些受体的功能的降低或缺失可防止癌细胞抑制免疫效应功能(如果受体功能完全，则可能发生这种情况)。因此，本发明这些实施方案的关键优势在于NK细胞不易受癌细胞抑制其细胞毒活性的影响。因此，它们可用于癌症治疗。
[0047] 如本文所用，对抑制性受体的提及通常是指在免疫效应细胞例如NK细胞的质膜上表达的受体，其结合其互补配体所产生细胞内信号负责降低所述免疫效应细胞的细胞毒性。这些抑制性受体在免疫效应细胞的“静息”和“活化”状态期间表达，并且通常与为免疫系统提供抑制针对身体细胞和组织的细胞毒性反应的“自身耐受”机制相关。一个实例为抑制性受体家族‘KIR’，其在NK细胞上表达并识别在身体的健康细胞上表达的MHC I类。
[0048] 同样如本文所用，检查点抑制性受体通常被认为是上述抑制性受体的子集。然而，与其他抑制性受体不同，检查点抑制性受体在免疫效应细胞例如NK细胞的延长激活和细胞毒性作用过程中以较高水平表达。该现象可用于抑制例如炎症部位的慢性细胞毒性作用。实例包括检查点抑制性受体PD-1、CTLA-4和CD96，它们都在NK细胞上表达。
[0049] 因此，本发明还可以使用缺乏编码选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3的检查点抑制性受体的基因的NK细胞。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系缺少CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3中的两种或多种。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系缺少CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD279(PD-1)或CD328(SIGLEC7)中的两种或多种。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系缺少CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD279(PD-1)或CD328(SIGLEC7)中的三种或多种。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系缺少CD96(TACTILE)和CD328(SIGLEC7)。
[0050] 或者，NK细胞可表现出选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3的检查点抑制性受体的表达降低。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系表现出CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3中两种或多种的表达降低。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系表现出CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD279(PD-1)或CD328(SIGLEC7)中的两种或多种的表达降低。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系表现出CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD279(PD-1)或CD328(SIGLEC7)中三种或多种的表达降低。在某个实施方案中，NK细胞或细胞系表现出CD96(TACTILE)和CD328(SIGLEC7)的表达降低。可以通过使用例如siRNA、shRNA构建体(质粒或病毒载体)或反义技术来修饰NK细胞以降低检查点抑制性受体的表达。
[0051] 缺少基因的NK细胞可以指完全或部分缺失、突变或其他导致不表达功能性基因产物的因素。在实施方案中，NK细胞缺乏编码两种或多种抑制性受体的基因。
[0052] 更具体的实施方案包括缺乏编码选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)和CD279(PD-1)的检查点抑制性受体的基因的NK细胞。下面更详细描述的具体实施方案包括NK细胞，其是KHYG-1的衍生物。
[0053] 在下面描述的实施例中，发明人已经明确地证明了使用siRNA来敲低KHYG-1细胞中检查点抑制性受体CD96的表达的细胞毒性作用。CD96敲低的(KD)KHYG-1细胞在多种效应物:靶标(E:T)比例下表现出针对白血病细胞的增强的细胞毒性。
[0054] 在其他实施方案中，提供/使用修饰的NK细胞，其表达TRAIL配体，或优选地，突变(变体)TRAIL配体。如以下实施例中进一步描述的，NK细胞的增强细胞毒性的修饰因此还包括TRAIL配体和/或突变的TRAIL配体变体的表达增加。
[0055] 得到的NK细胞表现出与TRAIL受体的结合增加，结果增加了对癌症，特别是血癌，尤其是白血病的细胞毒性。
[0056] 与野生型TRAIL与诱骗受体的结合相比，突变体/变体优选对“诱骗”受体具有较低的亲和力(或实际上没有亲和力)。此类诱骗受体代表一类TRAIL受体，所述TRAIL受体结合TRAIL配体但不具有启动细胞死亡的能力，并且在一些情况下，起到拮抗死亡信号通路的作用。可根据WO2009/077857制备突变体/变体TRAIL配体。
[0057] 突变体/变体可以分别对诸如DR4和DR5的TRAIL受体具有增强的亲和力。通常已知野生型TRAIL对于DR4具有>2nM的KD，对于DR5具有>5nM的KD，对于诱骗受体DcR1具有>20nM的KD(WO2009/077857；通过表面等离子体共振测量)，或对于DR4具有约50-100nM的KD，对于DR5具有1-10nM的KD，对于DcR1具有175-225nM的KD(Truneh,A.et al.2000；通过等温滴定量热法和ELISA测量)。因此，增强的对DR4的亲和力适当地分别定义为<2nM或<50nM的KD，而增强的对DR5的亲和力适当地分别定义为<5nM或<1nM的KD。降低的对诱骗受体DcR1的亲和力适当地分别定义为>50nM或>225nM的KD。在任何情况下，TRAIL变体/突变体表现出的亲和力的增强或降低与野生型TRAIL表现出的基线亲和力有关。与野生型TRAIL表现出的亲和力相比，亲和力优选增加至少10％，更优选至少25％、至少50％或100％。
[0058] 与对DR4、DcR1和DcR2的亲和力相比，TRAIL变体优选对DR5具有增强的亲和力。优选地，对于DR5的亲和力是对于DR4、DcR1和DcR2中的一种或多种的亲和力的至少1.5倍、2倍、5倍、10倍，100倍或甚至1,000倍或更高。更优选地，对于DR5的亲和力是对于DR4、DcR1和DcR2中的至少两种，或优选全部的亲和力的至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍或甚至1,000倍或更高。
[0059] 本发明这些实施方案的关键优点在于NK细胞具有更强的杀死癌细胞的效力。
[0060] 组合疗法提供了抵抗癌症进一步发展的潜力。
[0061] 其他具体实施方案包括/使用表达突变TRAIL配体的NK细胞，该配体对TRAIL诱骗受体具有降低的亲和力或没有亲和力。优选地，该NK细胞为KHYG-1的衍生物。其他具体实施方案包括表达突变TRAIL配体的NK细胞，该配体对TRAIL诱骗受体具有降低的亲和力或没有亲和力，并且对DR4和/或DR5具有增强的亲和力。在某个实施方案中，TRAIL受体变体包含人TRAIL的两个氨基酸突变：D269H和E195R。在另一个实施方案中，TRAIL受体变体包含人TRAIL的三个氨基酸突变：G131R、N199R和K201H。
[0062] 在以下更详细描述的本发明的实施例中，对NK细胞进行遗传修饰以表达突变TRAIL。修饰的KHYG-1细胞表达突变TRAIL，NK-92表达突变TRAIL。修饰的KHYG-1细胞在体外表现出对癌细胞系的改善的细胞毒性。KHYG-1细胞表达TRAIL受体(例如DR4和DR5)，但水平较低。修饰的NK细胞的其他优选实施方案不表达或基本上不表达TRAIL受体，或仅以低水平-足够低的水平表达以使修饰的NK细胞的活力不受突变TRAIL表达的不利影响。
[0063] 在任选的实施方案中，使用表达TRAIL或TRAIL变体的修饰的NK细胞的癌症治疗通过向患者施用能够上调癌细胞上TRAIL死亡受体表达的药剂来增强。该药剂可以在施用修饰的NK细胞之前施用、与其组合施用或随后施用。然而，优选在施用修饰的NK细胞之前施用该药剂。
[0065] 本发明不限于能够上调DR5表达的任何特定试剂，但DR5诱导剂的实例包括硼替佐米(Bortezomib)、吉非替尼(Gefitinib)、荜茇酰胺(Piperlongumine)、亚德里亚霉素(Doxorubicin)、α-生育酚琥珀酸酯(Alpha-tocopheryl succinate)和HDAC抑制剂。
[0066] 根据本发明的一个优选实施方案，突变体/变体TRAIL配体与一个或多个NK细胞共刺激结构域连接，例如，41BB/CD137、CD3zeta/CD247、DAP12或DAP10。变体与靶细胞上的受体的结合因此促进靶细胞内的凋亡信号，以及刺激NK细胞中的细胞毒性信号。
[0067] 根据本发明的进一步优选的实施方案，提供和/或使用具有降低的检查点抑制性受体功能并且还表达突变TRAIL配体的NK细胞，如上文关于这些相应的NK细胞修饰所更详细地描述的。在甚至更优选的实施方案中，表达对TRAIL诱骗受体具有降低的亲和力或没有亲和力的突变TRAIL配体的NK细胞可以为KHYG-1的衍生物，进一步缺少编码选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3的检查点抑制性受体的基因。
[0068] 本发明还提供和/或使用经修饰以表达一种或多种CAR的NK细胞和NK细胞系，优选KHYG-1细胞及其衍生物。通常，提供结合癌相关抗原的CAR，例如CD38、CD319/SLAMF-7、TNFRSF17/BCMA、SYND1/CD138、CD229、CD47、Her2/Neu、表皮生长因子受体(EGFR)、CD123/IL3-RA、CD19、CD20、CD22、间皮素、EpCAM、MUC1、MUC16、Tn抗原、NEU5GC、NeuGcGM3、GD2、CLL-1、HERV-K。还考虑了特异性结合血癌抗原的CAR，例如CD38、CD319/SLAMF-7、TNFRSF17/BCMA、SYND1/CD138、CD229、CD47、CD123/IL3-RA、CD19、CD20、CD22、GD2、CLL-1、HERV-K。
[0069] 适于癌症疗法使用的CAR特异性结合癌细胞上的一种或多种配体，例如骨髓瘤细胞上的CS1(SLAMF7)。为了用于治疗特定癌症，例如多发性骨髓瘤，CAR可与CD38结合。例如，CAR可以包括例如衍生自、类似于或与之相同的已知单克隆抗体达雷木单抗(daratumumab)的可变区的结合特性。这种NK细胞可以与抑制血管生成的药剂一起用于癌症治疗，例如来那度胺(lenalidomide)。为了用于治疗癌症，尤其是白血病和AML，CAR可以与CLL-1结合。
[0070] CAR-NK可以是双特异性的，其中它们的亲和力针对两种不同的配体/抗原。双特异性CAR-NK可用于增加癌细胞上潜在结合位点的数量，或者用于将癌细胞定位于表达NK-CAR特异性配体的其他免疫效应细胞。为了用于癌症治疗，双特异性CAR可以结合靶肿瘤细胞和效应细胞，例如T细胞、NK细胞或巨噬细胞。因此，例如，在多发性骨髓瘤的情况下，双特异性CAR可以结合T细胞抗原(例如CD3等)和肿瘤细胞标记物(例如CD38等)。双特异性CAR可以替代地结合两个单独的肿瘤细胞标志物，增加NK细胞对靶肿瘤细胞的总体结合亲和力。这可以通过下调一种靶抗原来降低癌细胞产生耐受性的风险。在这种情况下，在多发性骨髓瘤中的一个实例是与CD38和CS-1/SLAMF7均结合的CAR。CAR适当靶向的另一种肿瘤细胞标记物为肿瘤上的“不要吃我(don’t eat me)”型标记物，例如CD47。
[0071] 本发明的任选特征包括提供对上述NK细胞和NK细胞系的进一步修饰，其中，例如，Fc受体(可以为CD16、CD32或CD64，包括亚型和衍生物)在细胞表面上表达。在使用中，这些细胞可显示出对抗体包被的癌细胞的识别增加并改善细胞毒性反应的活化。
[0072] 本发明的其他任选特征包括使修饰的NK细胞和NK细胞系适于更好地归巢至(home)身体的特定靶区域。本发明的NK细胞可以靶向特定的癌细胞位置。在用于治疗血癌的优选实施方案中，本发明的NK效应细胞适于归巢至骨髓。通过岩藻糖基化和/或唾液酸化修饰特异性NK细胞以归巢至骨髓。这可以通过遗传修饰NK细胞以分别表达合适的岩藻糖基转移酶和/或唾液酸转移酶来实。通过破坏肿瘤脉管系统，例如，通过节律化学疗法，或通过使用靶向血管生成的药物，可以使增加NK效应细胞向肿瘤部位的归巢成为可能(Melero et al,2014)，从而通过癌症血管使NK细胞浸润正常化。
[0073] 本发明的另一个任选特征是提供/使用经修饰的NK细胞和NK细胞系，其具有增强的内在能力以在培养中快速生长和增殖。这可以通过例如转染细胞以过表达生长诱导细胞因子IL-2和IL-15来实现。此外，这种任选的改变为连续补充具有细胞因子的生长培养基提供了成本有效的替代方案。
[0074] 本发明进一步提供/使用制备修饰的NK细胞或NK细胞系的方法，其包括遗传修饰如本文所述细胞或细胞系以增加其细胞毒性。这种遗传修饰可以是基因的稳定敲除，例如通过CRISPR，或基因的瞬时敲低，例如通过siRNA。
[0075] 在优选的实施方案中，使用稳定的遗传修饰技术，例如CRISPR，以提供具有增加的细胞毒性的新NK细胞系，例如，KHYG-1细胞的衍生物。
[0076] 在实施方案中，该方法用于制备经修饰以降低抑制性受体功能的NK细胞或NK细胞系。优选地，这些抑制性受体为检查点抑制性受体。
[0077] 更具体的实施方案包括制备具有降低的抑制性受体功能的NK细胞或NK细胞系的方法，其中检查点抑制性受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
[0078] 在优选的实施方案中，该方法包括修饰NK细胞以降低两种或多种抑制性受体的功能。
[0079] 本发明还进一步提供/使用制备修饰的NK细胞或NK细胞系的方法，其包括遗传修饰细胞或细胞系以表达TRAIL配体或突变TRAIL(变体)配体。
[0080] 在实施方案中，该方法包括修饰NK细胞或NK细胞系以表达对TRAIL受体具有增强的亲和力的突变TRAIL配体。优选地，TRAIL受体为DR4和/或DR5。优选的实施方案提供了修饰NK细胞或NK细胞系以表达对诱骗TRAIL受体具有降低的亲和力的突变TRAIL配体的方法。
[0081] 在进一步优选的实施方案中，该方法包括修饰NK细胞或NK细胞系以除去检查点抑制性受体的功能，并且还表达对诱骗TRAIL受体具有降低的亲和力或没有结合亲和力的突变TRAIL配体。
[0082] 进一步的典型实施方案提供了制备NK细胞或NK细胞系的方法，其中已经去除一种或多种检查点抑制性受体的功能和/或表达突变TRAIL配体，所述突变TRAIL配体对诱骗TRAIL受体具有降低的亲和力或没有结合亲和力，并进一步修饰细胞以表达CAR或双特异性CAR。CAR的性质任选地如上所述。
[0083] 在实施方案中，该方法包括制备NK细胞或NK细胞系，其中已经去除一种或多种检查点抑制性受体的功能和/或表达突变TRAIL配体，所述突变TRAIL配体对诱骗TRAIL受体具有降低的亲和力或没有结合亲和力，任选地修饰细胞以表达CAR或双特异性CAR，并进一步修饰细胞以表达一种或多种Fc受体。合适的Fc受体选自CD16(FcRIII)、CD32(FcRII)和CD64(FcRI)。
[0084] 所有上述的优选实施方案包括制备NK细胞和NK细胞系的方法，NK细胞和NK细胞系为KHYG-1衍生物。
[0085] 根据本发明的目的，具有增加的细胞毒性的经修饰的NK细胞、NK细胞系或其组合物用于治疗患者的癌症，尤其是血癌。
[0086] 在甚至更优选的实施方案中，本发明为NK细胞系用于治疗血癌的用途，NK细胞系通过降低KHYG-1细胞中的检查点抑制性受体功能或在KHYG-1细胞中表达突变TRAIL配体或通过两者作为KYHG-1的衍生物获得。
[0087] 在上下文中，本文所述的经修饰的NK细胞、NK细胞系及其组合物，适用于治疗癌症，特别是人类的癌症，例如用于治疗血细胞癌或实体癌。NK细胞和衍生物优选为人NK细胞。对于人类治疗，优选使用人NK细胞。
[0088] 本发明进一步提供了具有降低或缺失的IL-6R功能的NK细胞本身，例如，经遗传修饰的NK细胞缺失IL-6受体功能。本发明的NK细胞还可以如本文所述进行修饰，以具有降低或缺失的一种或多种cIR的功能，以表达突变TRAIL，或具有所有这三种修饰。
[0089] 本领域技术人员已知各种给药途径，以将活性剂及其组合递送至需要的患者。本发明的实施方案用于血癌治疗。修饰的NK细胞和/或NK细胞系的施用可以是全身性的或局部的，例如通过腹膜内途径。
[0090] 在其他实施方案中，更直接地施用活性剂。因此，可以直接肿瘤内施用，尤其适用于实体瘤。
[0091] 一般认为NK细胞适合于本发明的方法、用途和组合物。根据本文某些实施例中使用的细胞，NK细胞可以为从癌细胞系获得的NK细胞。有利地，可以从血癌细胞系获得NK细胞并于本发明的方法中以治疗血癌，优选NK细胞经过处理以降低其致肿瘤性，例如通过使其是致命的和/或不能分裂。
[0092] 为了使癌症来源的细胞更适于治疗用途，通常以某种方式对其进行处理或预处理以减少或消除其在患者中形成肿瘤的倾向。实施例中使用的具有特定修饰的NK细胞系是安全的，因为它们已经不能分裂；它们被辐射并保持其杀灭能力但在3-4天内死亡。因此，特定的细胞和细胞系不能增殖，例如作为辐射的结果。用于本文方法的潜在的NK细胞处理包括辐射以防止它们在体内分裂和形成肿瘤，以及遗传修饰以减少致肿瘤性，例如插入编码自杀基因的序列，该序列可被激活以防止细胞在体内分裂并形成肿瘤。自杀基因可以通过外源(例如循环)试剂开启，然后在表达该基因的那些细胞中引起细胞死亡。另一种替代方案是疗法中使用靶向特定NK细胞的单克隆抗体。例如，CD52在KHYG-1细胞上表达，单克隆抗体与该标记物的结合可导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和KHYG-1细胞死亡。
[0093] 如Suck et al,2006发表的文章中所讨论的，使用诸如Gammacell 3000Elan的辐照器容易地辐射源自癌症的NK细胞和细胞系。铯-137源用于控制辐射的剂量，并且例如1Gy和50Gy之间的剂量-响应曲线可用于确定消除细胞增殖能力并同时保持增加细胞毒性的好处的最佳剂量。这通过在施用每个辐射剂量后测定细胞的细胞毒性来实现。
[0094] 与成熟的自体同源的或MHC匹配的T细胞方法相比，使用经辐照的NK细胞系进行过继性细胞免疫治疗具有显著的益处。首先，使用具有高度增殖性质的NK细胞系意味着可以更容易地在商业水平上实现修饰的NK细胞系的扩增。然后可以在将细胞施用于患者之前进行修饰的NK细胞系的辐射。这些保留其有用细胞毒性的经辐射后的细胞具有有限的寿命，并且与经修饰的T细胞不同，不会长时间循环导致持久的副作用。
[0095] 此外，同种异体的经修饰的NK细胞和NK细胞系的使用意味着患者中的表达MHC I类的细胞不能以与它们对自体NK细胞毒性应答相同的方式抑制NK细胞毒性应答。同种异体NK细胞和细胞系用于癌细胞杀伤的益处受益于前面提到的GVL效应，并且与T细胞不同，同种异体NK细胞和细胞系不刺激GVHD的发作，使得它们成为通过过继性细胞免疫疗法的治疗癌症的首选方案。
[0096] 经修饰的NK细胞可以以大于约1×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约1×108个细胞/kg、约1×109个细胞/kg和约1×1010个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×106至约1×1011个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×107至约1×1010个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×108至约1×1010个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×109至约1×1010个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×107至约1×109个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×107至约1×108个细胞/kg的量施用。在某些实施方案中，经修饰的NK细胞以约1×108至约1×109个细胞/kg的量施用。对于血液癌症，可以静脉内施用细胞。对于实体组织癌，可以通过肿瘤内或腹膜内施用细胞。
[0097] IL-6拮抗剂抗体及其组合可以以约0.1-30mg/kg体重，例如约0.4mg/kg体重、约0.8mg/kg体重、约1.6mg/kg体重或约4mg/kg体重的浓度施用于个体。在一个优选的实施方案中，本文所述的IL-6拮抗剂抗体及其组合以每二十六周或更短时间一次的频率施用接受者个体，例如每十六周或更短时间一次、每八周或更短时间一次、或每四周或更短时间一次。在另一个优选的实施方案中，IL-6拮抗剂抗体以约一周一次、约每两周一次、约每三周一次或约每四周一次的频率施用给接受者个体。
[0098] 应理解，有效剂量可取决于接受者个体属性，例如可能影响组合物的代谢或耐受性的接受者个体的年龄、性别、妊娠状态、体重指数、瘦体重、施用组合物所针对的病症或状况、其他健康状况、接受者个体中IL-6的水平和对组合物的耐受性(例如，患者产生针对该组合物的抗体)。
[0099] 与IL-6拮抗剂一起施用的经修饰的NK细胞还可以与某些佐剂一起施用，例如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)或蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、伊沙佐米(ixazomib)或其组合。在某些实施方案中，IL-2、IL-8、IL-12、IL-15或蛋白酶体抑制剂中的任何一种可以在施用经修饰的NK细胞之前施用于患者。在某些实施方案中，IL-2、IL-8、IL-12、IL-15或蛋白酶体抑制剂中的任何一种可在施用经修饰的NK细胞期间施用于患者。在某些实施方案中，IL-2、IL-8、IL-12、IL-15或蛋白酶体抑制剂中的任何一种可在施用经修饰的NK细胞后施用于患者。在某些实施方案中，IL-2、IL-8、IL-12、IL-15的活性可由IL-2、IL8、IL-12和IL-15受体的非白细胞介素类激动剂提供。例如，白细胞介素-12激动剂可以为ALT-803或ALT-801；白细胞介素-15激动剂可以为NIZ985。
[0100] 本文还设想了某些治疗佐剂，主要是使用节律性环磷酰胺或四环素抗生素。这些佐剂中的任何一种都可以在用经修饰的NK细胞治疗之前或期间施用。它们还可以在治疗过程中与经修饰的NK细胞和IL-6拮抗剂如IL-6抗体同时施用。
[0101] 四环素抗体，例如多西环素(doxycycline)，可以以每天约50mg至约300mg的浓度，或者以每天约100mg至200mg的浓度口服或静脉内给药。也可以使用其他等效的四环素抗生素，例如四环素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、替加环素(tigecycline)、地美环素(demeclocycline)、美他环素(methacycline)、金霉素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、赖甲环素(lymecycline)、甲氯环素(meclocycline)或氢吡四环素(rolitetracycline)。
[0102] 环磷酰胺可以口服或静脉内给药。在某些实施方案中，环磷酰胺以节律方式施用，例如，持续的低剂量环磷酰胺。在某些实施方案中，环磷酰胺以每天或每隔一天约100mg至约25mg的剂量口服给药一周、两周、三周、四周或更多周。在某些实施方案中，环磷酰胺以每天约50mg的剂量口服给药一周、两周、三周、四周或更多周。在某些实施方案中，环磷酰胺以每周约1000mg至约250mg的剂量静脉内施用一周、两周、三周、四周或更多周。在某些实施方案中，环磷酰胺以每周约750mg、500mg、250mg或更少的剂量静脉内施用一周、两周、三周、四周或更多周。
[0103] 根据本发明，还提供了治疗癌症的方法，其包括向患者施用有效量的NK细胞和IL-6拮抗剂的组合。该方法包括本文所述的本发明其他方面的优选和任选特征。
[0104] 根据本发明，本文描述了一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用有效量的(a)NK细胞，和(b)IL-6拮抗剂。NK细胞和IL-6拮抗剂任选地分开施用。进一步任选地，在施用NK细胞之前，用IL-6拮抗剂预处理患者。
[0105] 根据本发明，还提供了包含NK细胞或细胞系和IL-6拮抗剂的药物组合物。药物组合物包含本文所述的本发明其他方面的优选和任选特征。
[0106] 除非上下文另有明确规定，否则本文所用的单数冠词如“一个”或“一种”包括复数。
[0107] 如本文所用，术语“约”是指比所述量差/多约10％、5％或1％的量。
[0108] 如本文所用，除非另有说明，术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合与全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如单链可变区片段(scFv)、纳米抗体和由具有不同特异性的抗体片段形成的多特异性抗体，例如双特异性抗体。优选地，抗体以降低个体对抗体的免疫应答的方式人源化。例如抗体可以为嵌合的，例如具有人恒定区的非人可变区、或CDR移植的，例如具有人恒定区和可变区框架序列的非人CDR区。
[0110] 1.自然杀伤(NK)细胞或细胞系与IL-6拮抗剂组合用于治疗癌症。
[0111] 2.根据实施方案1所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述癌症表达IL-6受体。
[0112] 3.根据实施方案1或2所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
[0113] 4.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述IL-6拮抗剂为结合IL-6、IL-6R或gp130中的一种的抗体。
[0114] 5.根据实施方案4所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述IL-6抗体选自西妥昔单抗、奥昔单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(CNTO 136)。
[0115] 6.根据实施方案5或6所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述IL-6R抗体选自塔西单抗、沙利鲁单抗、PM-1和AUK12-20。
[0116] 7.根据实施方案4所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述gp130抗体为AM64。
[0117] 8.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其与单独的抗癌疗法组合。
[0118] 9.根据实施方案8所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述单独的抗癌疗法利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞。
[0119] 10.根据实施方案8或9所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述单独的抗癌疗法为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0120] 11.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述癌症为血癌。
[0121] 12.根据实施方案11所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述血癌为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
[0122] 13.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的一种或多种检查点抑制性受体的表达。
[0123] 14.根据实施方案13所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述检查点抑制性受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
[0124] 15.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以表达突变TRAIL配体。
[0125] 16.根据实施方案15所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述突变TRAIL配体具有增加的对诸如DR4和/或DR5的TRAIL受体的亲和力。
[0126] 17.根据实施方案15或16所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述突变TRAIL配体具有降低的对诱骗TRAIL受体的亲和力。
[0127] 18.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，所述NK细胞或细胞系表达嵌合抗原受体(CAR)。
[0128] 19.根据实施方案18所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述CAR为双特异性CAR。
[0129] 20.根据实施方案19所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR结合一种细胞类型上的两种配体。
[0130] 21.根据实施方案19所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR结合两种不同细胞类型中每一种上的一种配体。
[0131] 22.根据实施方案11和22所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述CAR或双特异性CAR的一种或多种配体在癌细胞上表达。
[0132] 23.根据实施方案22所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR的配体均在癌细胞上表达。
[0133] 24.根据实施方案22所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述双特异性CAR的配体在癌细胞和免疫效应细胞上表达。
[0134] 25.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的IL-6受体表达。
[0135] 26.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或细胞系的用途，其中所述NK细胞系为KHYG-1。
[0136] 27.IL-6拮抗剂用于治疗癌症的用途，其中所述癌症的细胞表达IL-6受体。
[0137] 28.根据实施方案27所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
[0138] 29.根据实施方案27-28所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6拮抗剂为结合IL-6、IL-6R或gp130中的一种的抗体。
[0139] 30.根据实施方案29所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6抗体选自西妥昔单抗、奥昔单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(CNTO 136)。
[0140] 31.根据实施方案29所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6R抗体选自塔西单抗、沙利鲁单抗、PM-1和AUK12-20。
[0141] 32.根据实施方案29所述的的IL-6拮抗剂的用途，其中所述gp130抗体为AM64。
[0142] 33.根据实施方案27-32中任一项所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述IL-6拮抗剂与单独的抗癌疗法组合使用。
[0143] 34.根据实施方案33所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述单独的抗癌疗法利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞。
[0144] 35.根据实施方案33或34所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述单独的抗癌疗法为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0145] 36.根据实施方案27-36中任一项所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述癌症为血癌。
[0146] 37.根据实施方案36所述的IL-6拮抗剂的用途，其中所述血癌为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
[0147] 38.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的NK细胞和IL-6拮抗剂的组合。
[0148] 39.根据实施方案38所述的方法，其中所述癌症表达IL-6受体。
[0149] 40.根据实施方案38-39中任一项所述的方法，其中所述癌症表达PDL-1和/或PDL-2。
[0150] 41.根据实施方案38-40中任一项所述的方法，其中提供具有预结合的IL-6拮抗剂的NK细胞或细胞系。
[0151] 42.根据实施方案38-41中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂为结合IL-6、IL-6R或gp130中的一种的抗体。
[0152] 43.根据实施方案42所述的方法，其中所述IL-6抗体选自西妥昔单抗、奥昔单抗(CDP6038)、艾西莫单抗、BMS-945429(ALD518)、MH-166和西鲁库单抗(CNTO 136)。
[0153] 44.根据实施方案42所述的方法，其中所述IL-6R抗体选自塔西单抗、沙利鲁单抗、PM-1和AUK12-20。
[0154] 45.根据实施方案42所述的方法，其中所述gp130抗体为AM64。
[0155] 46.根据实施方案38-45中任一项所述的方法，其与单独的抗癌疗法组合使用。
[0156] 47.根据实施方案46所述的方法，其中所述单独的抗癌疗法利用内源性NK细胞作为免疫效应细胞。
[0157] 48.根据实施方案46或47所述的方法，其中所述单独的抗癌疗法为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0158] 49.根据实施方案38-48中任一项所述的方法，其中所述癌症为血癌。
[0159] 50.根据实施方案49所述的方法，其中所述血癌为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(SMM)、多发性骨髓瘤(MM)或轻链型骨髓瘤。
[0160] 51.根据实施方案38-50中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的一种或多种检查点抑制性受体的表达。
[0161] 52.根据实施方案51所述的方法，其中所述检查点抑制性受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
[0162] 53.根据实施方案38-52中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以表达突变TRAIL配体。
[0163] 54.根据实施方案53所述的方法，其中所述突变TRAIL配体具有增加的对诸如DR4和/或DR5的TRAIL受体的亲和力。
[0164] 55.根据实施方案53或54所述的方法，其中所述突变TRAIL配体具有降低的对诱骗TRAIL受体的亲和力。
[0165] 56.根据实施方案38-55中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系表达嵌合抗原受体(CAR)。
[0166] 57.根据实施方案56所述的方法，其中所述CAR为双特异性CAR。
[0167] 58.根据实施方案57所述的方法，其中所述双特异性CAR结合一种细胞类型上的两种配体。
[0168] 59.根据实施方案58所述的方法，其中所述双特异性CAR结合在两种不同细胞类型的每一种上的一种配体。
[0169] 60.根据实施方案58或59所述的方法，其中所述CAR或双特异性CAR的一种或多种配体在癌细胞上表达。
[0170] 61.根据实施方案60所述的方法，其中所述双特异性CAR的配体均在癌细胞上表达。
[0171] 62.根据实施方案60所述的方法，其中所述双特异性CAR的配体在癌细胞和免疫效应细胞上表达。
[0172] 63.根据实施方案38-62中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或细胞系经遗传修饰以具有降低的IL-6受体表达。
[0173] 64.根据实施方案38-63中任一项所述的方法，其中所述NK细胞系为KHYG-1。
[0174] 65.一种药物组合物，其包括NK细胞或细胞系和IL-6拮抗剂，所述NK细胞任选地如本文所述进行修饰。
[0175] 66.一种NK细胞或细胞系，其经修饰以具有降低或缺失的IL-6受体功能。
[0176] 67.根据实施方案66所述的NK细胞或细胞系，其经遗传修饰以降低或缺失的IL-6R的表达。实施例
[0177] 现在更具体详细地描述与产生的与产生经修饰以显示出更高的细胞毒活性并因此能够在人体中引起白血病细胞死亡的NK细胞系KHYG-1衍生物以及使用IL-6拮抗剂来增加NK细胞的细胞毒性并减少靶(癌)诱导的抗-NK细胞细胞毒性反应相关的本发明。
[0179] 图1显示LIR2基因靶区域的DNA序列并标记了gRNA侧翼区域；
[0180] 图2显示CTLA4基因靶区域的DNA序列并标记了gRNA侧翼区域；
[0181] 图3显示用于转染的gRNA构建体(表达载体)；
[0182] 图4显示转染前后亲本和突变LIR2DNA的凝胶电泳条带；
[0183] 图5显示转染前后亲本和突变CTLA4DNA的凝胶电泳条带；
[0184] 图6A为显示使用电穿孔成功敲低CD96的FACS图。
[0185] 图6B为显示使用电穿孔成功敲低CD96的FACS图。
[0186] 图7为显示CD96敲低的KHYG-1细胞在各种E:T比例下对K562细胞的增强的细胞毒性的条形图。
[0187] 图8显示NK-92细胞中CD328(Siglec-7)的敲低；
[0188] 图9显示CD328(Siglec-7)敲低的NK细胞的增强的细胞毒性；
[0189] 图10显示TRAIL在KHYG-1细胞上的基线表达的FACS图。
[0190] 图11显示转染KHYG-1细胞后TRAIL和TRAIL变体的表达的FACS图。
[0191] 图12显示转染KHYG-1细胞后CD107a的表达的FACS图。
[0192] 图13显示用TRAIL和TRAIL变体转染KHYG-1细胞对细胞活性的影响；
[0193] 图14显示DR4、DR5、DcR1和DcR2在KHYG-1细胞和NK-92细胞上的基线表达的FACS图。
[0194] 图15、16和17显示了在KHYG-1细胞中表达TRAIL或TRAIL变体分别对三种靶细胞群：K562、RPMI8226和MM1.S的凋亡的影响；
[0195] 图18显示在RPMI8226细胞和MM1.S细胞上的DR5表达的两个FACS图，其中显示了硼替佐米处理对DR5表达的影响。
[0196] 图19显示在与具有或没有TRAIL变体的KHYG-1细胞共培养的经硼替佐米预处理/未处理的MM1.S细胞中的细胞凋亡的FACS图。
[0197] 图20显示用100nM CMA处理2小时的KHYG-1细胞中穿孔素表达水平的FACS图。
[0198] 图21显示用100nM CMA或载体处理后的KHYG-1细胞存活率的FACS图。
[0199] 图22显示在与具有或没有TRAIL变体的KHYG-1细胞共培养并用/不用CMA预处理的MM1.S细胞中的细胞凋亡的FACS图。
[0200] 图23显示在与具有CD96-siRNA和/或TRAIL变体表达的KHYG-1细胞共培养的K562细胞中的细胞凋亡的FACS图。
[0201] 图24显示在与具有CD96-siRNA和/或TRAIL变体表达的KHYG-1细胞共培养的MM1.S细胞中细胞凋亡的FACS图。
[0202] 图25显示在与KHYG-1细胞或与预先暴露于IL-6中12小时的KHYG-1细胞共培养的RPMI8226细胞中细胞凋亡的FACS图。
[0203] 图26显示在有或没有预先暴露于IL-6中12小时，并与KHYG-1细胞共培养的RPMI8226细胞中细胞凋亡的FACS图；
[0204] 图27显示在与KHYG-1细胞或与预先暴露于IL-6中12小时的KHYG-1细胞共培养的MM1.S细胞中细胞凋亡的FACS图。
[0205] 图28显示在有或没有预先暴露于IL-6中12小时，并与KHYG-1细胞共培养的MM1.S细胞中细胞凋亡的FACS图。
[0206] 图29显示在与KHYG-1细胞或与预先暴露于IL-6中12小时的KHYG-1细胞共培养的K562细胞中细胞凋亡的FACS图。
[0207] 图30显示在有或没有预先暴露于IL-6中12小时，并与KHYG-1细胞共培养的K562细胞中细胞凋亡的FACS图。
[0208] 图31和32显示KHYG-1细胞上IL-6R(CD126)表达的FACS图。
[0209] 图33和34显示KHYG-1细胞上gp130(CD130)表达的FACS图。
[0210] 图35显示NK-2细胞上IL-6R(CD126)表达的FACS图。
[0211] 图36显示NK-92细胞上gp130(CD130)表达的FACS图。
[0212] 图37显示U266细胞上IL-6R(CD126)和gp130(CD130)表达的FACS图。
[0213] 图38显示RPMI8226细胞上IL-6R(CD126)和gp130(CD130)表达的FACS图。
[0214] 图39显示NCI-H929细胞上IL-6R(CD126)和gp130(CD130)表达的FACS图。
[0215] 图40显示KMS11细胞上IL-6R(CD126)和gp130(CD130)表达的FACS图。
[0216] 图41显示MM1.S细胞上IL-6R(CD126)和gp130(CD130)表达的FACS图。
[0217] 图42和43显示K562细胞上IL-6R(CD126)表达的FACS图。
[0218] 图44显示Kp62细胞上gp130(CD130)表达的FACS图。
[0219] 图45显示在存在或不存在IL-6持续48小时的情况下RPMI8226细胞上的PD-L1表达的FACS图。
[0220] 图46显示在存在或不存在IL-6持续48小时的情况下RPMI8226细胞上的PD-L2表达的FACS图。
[0221] 图47显示在存在或不存在IL-6持续48小时的的情况下NCI-H929细胞上PD-L1表达的FACS图。
[0222] 图48显示在存在或不存在IL-6持续48小时的的情况下NCI-H929细胞上PD-L2表达的FACS图。
[0223] 图49和50显示在存在或不存在IL-6持续48小时的的情况下MM1.S细胞上PD-L1表达的FACS图。
[0224] 图51和52显示在存在或不存在IL-6持续48小时的的情况下MM1.S细胞上PD-L2表达的FACS图。
[0225] 图53和54显示在存在或不存在IL-6持续48小时的的情况下U266细胞上PD-L1表达的FACS图。
[0226] 图55和56显示在存在或不存在IL-6持续48小时的的情况下U266细胞上PD-L2表达的FACS图。
[0227] 图57-60显示在存在或不存在IL-6持续48小时的阻断抗体的情况下U266细胞上PD-L1表达的FACS图。
[0228] 图61-64显示在存在或不存在IL-6阻断抗体持续48小时的情况下U266细胞上PD-L2表达的FACS图。
[0229] 图65显示KHYG-1细胞暴露于IL-2后STAT3-S727、STAT3-Tyr705、总STAT3、SHP-1、SHP-2和P44/42的凝胶电泳。
[0230] 图66显示KHYG-1细胞暴露于IL-6后STAT3-S727、STAT3-Tyr705、总STAT3、SHP-1、SHP-2、P44/42和总p44/42的凝胶电泳。
[0231] 图67显示KETG-1细胞暴露于IL-2和IL-6后P44/42、总p44/42和肌动蛋白的凝胶电泳。
[0232] 图68显示单独培养以及与K562、U937、HL60、Raji、RPMI8226、U266或MM1.S细胞共培养24小时后KHYG-1细胞上PD-1表达的FACS图。
[0233] 图69显示中和IL-6改善KHYG-1细胞对U266细胞的细胞毒性；和
[0234] 图70显示IL-6通过降低NKG2D表达(70A)和增加NKG2A表达(70B)直接抑制KHYG-1细胞的细胞毒性。
[0235] DNA、RNA和氨基酸序列如下所述，其中：
[0236] SEQ ID NO:1为完整的LIR2DNA序列；
[0237] SEQ ID NO:2为LIR2氨基酸序列；
[0238] SEQ ID NO:3为LIR2g9gRNA序列；
[0239] SEQ ID NO:4为LIR2g18gRNA序列；
[0240] SEQ ID NO:5为LIR2正向引物序列；
[0241] SEQ ID NO:6为LIR2反向引物序列；
[0242] SEQ ID NO:7为完整的CTLA4DNA序列；
[0243] SEQ ID NO:8为CTLA4氨基酸序列；
[0244] SEQ ID NO:9为CTLA4g7gRNA序列；
[0245] SEQ ID NO:10为CTLA4g15gRNA序列；
[0246] SEQ ID NO:11为CTLA4正向引物序列；和
[0247] SEQ ID NO:12为CTLA4反向引物序列。
[0248] 实施例1-抑制性受体功能的敲除
[0249] CRISPR/Cas9
[0250] 如下制备去除抑制性受体功能的细胞。设计并制备gRNA构建体以靶向编码NK细胞的人基因组中的“经典”抑制性受体LIR2和“检查点”抑制性受体CTLA4的基因。然后使用CRISPR/Cas9基因组编辑来敲除LIR2和CTLA4靶基因。
[0251] 为每个靶基因选择两个gRNA候选物，并测定它们在K562细胞中的切割效率。表1中显示了gRNA候选物的序列，并且前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif(PAM))涉及序列的最后3个碱基。LIR2基因(SEQ ID NO:1)和CTLA4基因(SEQ ID NO:7)上的gRNA序列的侧翼区分别显示在图1和图2中。
[0252] 表1.gRNA候选物和序列
[0253]
[0254] 用制备的gRNA构建体转染K562细胞(图3)，随后收获细胞用于PCR扩增。GFP表达的存在用于报告gRNA构建体成功并入K562细胞中。这证实了Cas9基因的表达，因此能够敲除LIR2和CTLA4基因的表达。
[0255] 使用体外错配检测测定法测定gRNA构建体的切割活性。T7E1内切核酸酶I识别并切割非完全匹配的DNA，使得能够将亲本LIR2和CTLA4基因与CRISPR/Cas9转染和非同源末端连接(NHEJ)后的突变基因进行比较。
[0256] 图4显示了用g9和g18gRNA序列敲除LIR2基因后琼脂糖凝胶电泳后得到的条带。对应于每个突变的三个条带涉及亲本基因和在检测转染后DNA序列中的错配后所得的两个链。g9gRNA序列得到11％的转染成功率，而g18gRNA得到10％的转染成功率。
[0257] 图5显示在用g7和g15gRNA序列敲除CTLA4基因后琼脂糖凝胶电泳后得到的条带。g7gRNA序列得到为32％的转染成功率，而g15gRNA得到为26％的转染成功率。
[0258] 在K562细胞中成功敲除LIR2和CTLA4后，用gRNA构建体转染KHYG-1细胞。
[0259] 选择具有纯合缺失的KHYG-1衍生克隆。为此目的使用Cas9/嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)表达载体。基于它们对抗生素嘌呤霉素的抗性，选择成功转染的细胞。
[0260] Cas9RNP
[0261] 用于敲除NK细胞中检查点抑制性受体的另一种方案是Cas9RNP转染。与使用CRISPR/Cas9的DNA质粒方案相比，使用该方案的一个优点是可实现相似的转染效率，但毒性显著降低。
[0262] 每次转染实验收获1×106个KHYG1细胞。用PBS洗涤细胞并在离心机中离心。然后弃去上清液。然后如下制备CRISPR RNP(RNA结合蛋白)材料：
[0263] (1)制备所需的合成crRNA和tRNA(购自Dharmacon)的20μM溶液。
[0264] (2)将4μl crRNA(20μM)和4μl tRNA(20μM)混合在一起。
[0265] (3)然后将混合物加入2μlCas9蛋白(5μg/μl)中。
[0266] (4)将所有组分混合并在室温下孵育10分钟。
[0267] 在 转染系统后，将细胞与Cas9RNP混合，并使用以下参数进行电穿孔：
[0269] 脉冲宽度：30ms
[0270] 脉冲数：1
[0271] 然后将细胞转移到含有生长培养基(包含IL-2和IL-15)的12孔板的一个孔中。
[0272] 48-72小时后收获细胞，以通过T7核酸内切酶测定和/或Sanger测序确认基因编辑效率。证实了插入缺失标记(indel)的存在，表明在KHYG1细胞中成功敲除了CTLA4、PD1和CD96。
[0273] 位点特异性核酸酶
[0274] 用于敲除NK细胞中检查点抑制性受体的另一种方案是XTN TALEN转染。与野生型CRISPR相比，使用该方案的优点是可实现特别高水平的特异性。
[0275] 步骤1：制备试剂
[0276] 测定KHYG-1细胞的某些属性，包括转染效率、单细胞克隆效率和核型/拷贝数。然后根据供应商的建议培养细胞。
[0277] 根据要敲除的检查点抑制性受体，通过定制设计至少2对XTN TALEN制备核酸酶。定制设计的步骤包括评估基因位点、拷贝数和功能评估(即同源物、脱靶评估)。
[0278] 第2步：细胞系工程
[0279] 用步骤1的核酸酶转染细胞；该步骤重复最多3次以获得高水平的切割，并且在每次转染之前拆分培养物并保留中间培养物。
[0280] 在每次转染后几天进行初步筛选；通过Cel-1测定法测试细胞池的切割效率。在重复转染后切割水平达到可接受的水平或停滞后，认为细胞准备好用于单细胞克隆。
[0281] 将合并的细胞在96孔板中分选至每孔一个细胞；每个池的平板数取决于步骤1中测定的单细胞克隆效率。将平板培养3-4周。
[0282] 第3步-筛选和扩增
[0283] 一旦细胞在96孔板中汇合，将培养物合并并分至96孔板，一式三份；将一个平板冷冻备用，将一个平板重新铺板以继续扩增克隆，并将最后一个平板用于基因型确认。
[0284] 分析基因型板中的每个克隆的qPCR信号的缺失，该缺失表明所有等位基因都已被修饰。将阴性克隆PCR扩增并克隆以确定插入缺失标记的性质以及任何野生型或框内插入缺失标记的缺失。
[0285] 将具有经确认的敲除的克隆合并到不超过一个24孔板中并进一步扩大；通常每个小瓶含有1×106个细胞的5-10个冷冻冷冻瓶在每次敲除产生最多5个单个克隆。
[0286] 第4步-验证
[0287] 细胞在无菌条件下储存。
[0288] 所有库存细胞的基本放行标准包括活细胞数(预冷冻和冷冻复苏)，通过STR确认的同一性、保证基本无菌和支原体检测；必要时应用其他放行标准(核型、表面标志物表达、高无菌水平、转录物或蛋白质的敲除评估等)。
[0289] 实施例2-通过RNAi敲除检查点抑制性受体CD96功能
[0290] 通过电穿孔进行KHYG-1细胞中CD96的siRNA敲低。Nucleofection Kit T与Lonza的Amaxa Nucleofector II结合使用，因为它适用于细胞系，并且可成功转染分裂和非分裂细胞，实现高达90％的转染效率。
[0291] 对照siRNA(目录号：sc-37007)和CD96siRNA(目录号：sc-45460)获自Santa Cruz Biotechnology。含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的无抗生素RPMI-1640用于核转染后培养。从Biolegend获得小鼠抗人CD96-APC(目录号：338409)用于染色。
[0292] 制备20μM的siRNA原液。将冻干的siRNA双链体重悬浮于33μl无RNAse的水(siRNA稀释缓冲液：sc-29527)中，得到FITC-对照/对照-siRNA，靶基因siRNA(siRNA CD96)重悬浮于165μl无RNAse的水中。将管加热至90℃保持1分钟，然后在37℃下孵育60分钟。然后将siRNA原液储存在-20℃直至需要。
[0293] KHYG-1细胞在核转染前一至两天传代，因为细胞必须处于对数生长期。
[0294] 将核转染溶液温热至室温(每个样品100μl)。
[0295] 将含有血清和补充剂的培养基的等分试样也在37℃下在50ml管中预热。通过加入1.5ml含有血清和补充剂的培养基制备6孔板。将板在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育。
[0296] 将在100μl核转染溶液中的2×106个细胞与4μl20μMsiRNA溶液(1.5μg siRNA)轻轻混合。混合期间避免气泡。将混合物转移到经Amaxa认证的比色皿中，置于核转染比色皿支架中并选择程序U-001。
[0297] 完成程序，并立即取出比色皿中的样品。然后将500μl预平衡的培养基加入每个比色皿中。然后将每个比色皿中的样品轻轻转移到制备的6孔板的相应孔中，以建立每孔2ml的最终体积。
[0298] 然后将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育直至进行转染分析。在电穿孔16-24小时后进行流式细胞术分析，以测量CD96表达水平。该电穿孔方案进行多次，发现可靠地导致KHYG-1细胞中的CD96敲低(参见例如图6A和6B)。
[0299] 实施例3–CD96敲低的NK细胞的增强的细胞毒性
[0300] 将具有和不具有敲低的CD96的KHYG-1细胞与K562细胞以不同的效应物:靶标(E:T)比例共培养。
[0301] 共培养后4小时，使用PerkinElmer的DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(目录号：AD0116)测量细胞毒性。
[0302] 在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640培养基中培养靶细胞K562。从SARSTEDT购买96孔V型底板(目录号：83.3926)。使用Eppendorf离心机5810R(带有板转子)使板旋转。使用VARIOSKAN FLASH(使用ScanIt软件2.4.3)测量裂解的K562细胞产生的荧光信号。
[0303] 用培养基洗涤K562细胞，用培养基将细胞数调节至1×106细胞/mL。将2-4mL细胞加入5μl BATDA试剂中并在37℃下孵育10分钟。在细胞内，酯键被水解以形成亲水配体，其不再通过膜。将细胞以1500RPM离心5分钟以洗涤加载的K562细胞。用含有1mM丙磺舒(Probenecid)(Sigma P8761)的培养基重复洗涤3-5次。最后一次洗涤后，将细胞沉淀物重悬于培养基中并调节至约5×104个细胞/mL。
[0304] 设置孔以检测背景、自发释放和最大释放。将100μL加载的靶细胞(5,000个细胞)转移至V-底板的孔中，并以不同的细胞浓度加入100μL效应细胞(KHYG-1细胞)，以产生范围为1:1-20:1的效应物与靶标比例。将板以100×g离心1分钟，并在潮湿的5％CO2气氛中在37℃下孵育4小时。对于最大释放孔，在收获培养基前15分钟向每个孔中加入10μL裂解缓冲液。将板以500×g离心5分钟。
[0305] 将20μL上清液转移至平底96孔板中，其中加入有200μL预热的铕溶液。使用平板振荡器将其在室温下孵育15分钟。当K562细胞被KHYG-1细胞裂解时，它们将配体释放到培养基中。然后该配体与铕溶液反应形成荧光螯合物，该荧光螯合物与裂解细胞的量直接相关。
[0306] 然后通过使用VARIOSKAN FLASH在时间分辨荧光计中测量荧光。使用以下公式计算特异性释放：
[0307] ％特异性释放＝实验释放-自发释放/最大释放-自发释放
[0308] 使用Graphpad Prism 6.04软件进行统计学分析。使用配对t检验比较siRNA CD96敲低的KHYG-1细胞和对照组(n＝3)之间的差异。
[0309] 发现在含有CD96敲低的KHYG-1细胞的共培养物中特异性释放显著增加。所有E:T比例都是如此(见图7)。
[0310] 由于荧光与细胞裂解直接相关，因此证实了敲低KHYG-1细胞中的CD96表达导致该细胞杀死K562癌细胞靶标的能力增加。
[0311] 实施例4-CD328(Siglec-7)敲低的NK细胞的增强的细胞毒性
[0312] SiRNA介导的NK-92细胞中CD328的敲低
[0313] 材料、试剂和仪器
[0314] 对照siRNA(目录号：sc-37007)和CD328siRNA(目录号：sc-106757)购自Santa Cruz Biotechnology。为了实现NK-92细胞中高达90％的转染效率以及高细胞活性(>75％)，使用来自Lonza的NucleofectorTM装置(Nucleofector II，Lonza)和NucleofectorTM试剂盒T。含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、不含抗生素的RPMI-1640用于核转染后培养。从Biolegend购买小鼠抗人CD328-APC(目录号：339206)。
[0315] 方案
[0316] 制备10μM的siRNA原液
[0317] ·将冻干siRNA双链体重悬于66μl无RNAse的水(siRNA稀释缓冲液：sc-29527)中，得到FITC-对照/对照-siRNA，靶基因siRNA(siRNA CD328)重悬浮于330μl无RNAse的水中。
[0318] ·将管加热至90℃保持1分钟。
[0319] ·在37℃下孵育60分钟。
[0320] ·如果不直接使用，将siRNA原液储存在-20℃。
[0321] ·一个核转染样品含有(用于100μl标准比色皿)
[0322] ·细胞数：2×106个细胞
[0323] ·siRNA：4μl 10μM原液
[0324] ·核转染溶液：100μl
[0325] 核转染
[0326] ·培养所需数量的细胞。(在核转染前一天或两天传代，细胞必须处于对数生长期)。
[0327] ·为每个样品准备siRNA。
[0328] ·将核转染溶液预热至室温(每个样品100μl)。
[0329] ·将含有血清和补充剂的培养基的等分试样在37℃下在50ml管中预热。通过填充1.5ml含有血清和补充剂的培养基制备6孔板，并在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育平板。
[0330] ·取一份细胞培养物并计数细胞以确定细胞密度。
[0331] ·以1500rpm离心所需数量的细胞5分钟。完全丢弃上清液，使残留的培养基不会覆盖细胞沉淀物。
[0332] ·将细胞沉淀物重悬于室温核转染溶液中至终浓度为2×106个细胞/100μl。避免将细胞悬液在核转染溶液中储存超过15-20分钟，因为这会降低细胞活性和基因转移效率。
[0333] ·将100μl细胞悬液与siRNA混合。
[0334] ·将样品转移到经过amaxa认证的比色皿中。确保样品覆盖比色皿底部，移液时避免产生气泡。用蓝色盖子盖上比色皿。
[0335] ·选择适当的核转染程序(A-024用于NK-92细胞)。将比色皿插入比色皿支架(核转染II：将转盘顺时针旋转到最终位置)，然后按“x”按钮启动程序。
[0336] ·为避免损坏细胞，在程序完成后立即从比色皿中取出样品(显示“OK”)。将500μl预热的培养基加入比色皿中，并将样品转移到准备好的6孔板中。
[0337] ·将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育。16-24小时后进行流式细胞分析和细胞毒性测定。
[0338] 结果：我们按照上述方案进行了NK-92细胞中CD328表达水平的流式细胞术分析。一个代表性实验的结果显示在图8中，证实了成功的敲低。
[0339] 敲低CD328增强了细胞毒性
[0340] 材料、试剂和仪器
[0341] 基于荧光增强配体的DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(目录号：AD0116)购自PerkinElmer。靶细胞K562在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640培养基中培养。从SARSTEDT购买96孔V型底板(目录号：83.3926)。使用Eppendrof离心机5810R(带有板转子)使板旋转。使用VARIOSKAN FLASH(使用ScanIt软件2.4.3)测量裂解的K562细胞产生的荧光信号。
[0342] 方案
[0343] ·用荧光增强配体DELFIA BATDA试剂加载目标K562细胞
[0344] ·用培养基洗涤K562细胞，用培养基将细胞数调整为1×106个细胞/mL。将2-4mL细胞加入5μl BATDA试剂中，在37℃下孵育10分钟。
[0345] ·在1500RPM下旋转5分钟，用含有1mM丙磺舒(Sigma P8761)的培养基洗涤加载的K562细胞3-5次。
[0346] ·最后一次洗涤后，将细胞沉淀物重悬于培养基中，并调节至约5×104个细胞/mL。
[0347] 细胞毒性测定
[0348] ·设置孔以检测背景、自发释放和最大释放。
[0349] ·将100μL加载的靶细胞(5,000个细胞)转移至V-底板。
[0350] ·加入100μL不同细胞浓度的效应细胞(NK-92)。效应物与目标比例范围为1:1-20:1。
[0351] ·以100×g RCF旋转平板1分钟。
[0352] ·在37℃下在潮湿5％CO2气氛中孵育2小时。对于最大释放孔，在收获培养基前15分钟向每个孔中加入10μL裂解缓冲液。
[0353] ·将板以500×g旋转5分钟。
[0354] ·将20μL上清液转移至平底96孔板，加入200μL预热的铕溶液，在室温下使用平板振荡器孵育15分钟。
[0355] ·使用VARIOSKAN FLASH在时间分辨荧光计中测量荧光。使用以下公式计算特异性释放：
[0356] ·％特异性释放＝实验释放-自发释放/最大释放-自发释放
[0357] 结果：我们按照上述方法确定了CD328敲低对细胞毒性的影响。一个代表性实验的结果显示在图9中。显然，具有CD328敲低的细胞中针对靶细胞的细胞毒性增加。
[0358] 实施例5-通过敲低/敲除检查点抑制性受体的血癌治疗方案
[0359] 如以上实施例中所证明的，可以以多种方式敲低或敲除检查点抑制性受体功能。开发了以下方案用于治疗血癌患者：
[0360] 在诊断患有适合用本文所述方法治疗的癌症的患者后，可以在向患者施用之前解冻和培养经修饰的NK细胞的等分试样。
[0361] 或者，如上所述，可以在一天或两天内使用例如siRNA制备瞬时突变。MaxCyte Flow Electroporation平台为临床上实现快速大规模转染提供了合适的解决方案。
[0362] 某些检查点抑制性受体的去除可能比其他受体更有益。这可能取决于患者和癌症。出于这个原因，癌症任选地进行活组织检查，并且癌细胞在体外培养中生长。因此可以测试具有不同检查点抑制性受体修饰的一系列NK细胞对特定癌症的细胞毒性。该步骤可用于选择最合适用于治疗的NK细胞或其衍生物。
[0363] 在成功修饰后，将细胞重悬于合适的载体(例如生理盐水)中，用于静脉内和/或肿瘤内注射到患者体内。
[0364] 实施例6-TRAIL/TRAIL变体的KHYG-1敲入
[0365] 用TRAIL和TRAIL变体转染KHYG-1细胞，以评估它们在转染后的活性和杀死癌细胞的能力。
[0366] 使用的TRAIL变体是WO2009/077857中描述的变体。它由含有D269H/E195R突变的野生型TRAIL基因编码。该突变显著增加TRAIL变体对DR5的亲和力，同时降低对两种诱骗受体(DcR1和DcR2)的亲和力。
[0367] 基线TRAIL表达
[0368] 使用流式细胞术测定KHYG-1细胞中的基线TRAIL(CD253)表达。
[0369] 使用小鼠抗人CD253-APC(Biolegend目录号：308210)和同种型对照(Biolegend目录号：400122)染色细胞样品，并在BD FACS Canto II流式细胞仪上分析。
[0370] 在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)/链霉素(100mg/mL)和IL-2(10ng/mL)的RPMI 1640培养基中培养KHYG-1细胞。通过离心(1500rpm×5分钟)收集0.5-1.0×106个细胞/试验并吸出上清液。用4mL冰冷的FACS缓冲液(PBS、0.5-1％BSA、0.1％NaN3叠氮化钠)洗涤细胞(单细胞悬浮液)。将细胞重悬于100μL冰冷的FACS缓冲液中，向每个管中加入5μL抗体并在冰上孵育30分钟。通过以1500rpm离心5分钟洗涤细胞3次。然后将细胞重悬于500μL冰冷的FACS缓冲液中并在黑暗中暂时保持在冰上。
[0371] 随后在流式细胞仪(BD FACS Canto II)上分析细胞，并使用FlowJo7.6.2软件处理产生的数据。
[0372] 如图10中可见，FACS分析显示在KHYG-1细胞表面上TRAIL的弱基线表达。
[0373] TRAIL/TRAIL变体通过电穿孔敲入
[0374] 通过TriLink BioTechnologies合成野生型TRAIL mRNA和TRAIL变体(D269H/195R)mRNA，等分并储存在-80℃下。小鼠抗人CD253-APC(Biolegend目录号：308210)和同种型对照(Biolegend目录号：400122)，小鼠抗人CD107a-PE(eBioscience目录号：12-1079-
42)和同型对照(eBioscience目录号：12-4714)抗体用于染色细胞样品，并在BD FACS Canto II流式细胞仪上分析。使用DNA染料SYTOX-Green(Life Technologies目录号：
S7020；5mM DMSO溶液)。为了实现KHYG-1细胞中高达90％的转染效率和高细胞活性，使用来自Lonza的NucleofectorTM装置(Nucleofector II，Lonza)和NucleofectorTM试剂盒T。含有
10％FBS、L-谷氨酰胺(2mM)和IL-2(10ng/mL)的不含抗生素的RPMI 1640用于核转染后培养。
42)和同型对照(eBioscience目录号：12-4714)抗体用于染色细胞样品，并在BD FACS Canto II流式细胞仪上分析。使用DNA染料SYTOX-Green(Life Technologies目录号：
S7020；5mM DMSO溶液)。为了实现KHYG-1细胞中高达90％的转染效率和高细胞活性，使用来自Lonza的NucleofectorTM装置(Nucleofector II，Lonza)和NucleofectorTM试剂盒T。含有
10％FBS、L-谷氨酰胺(2mM)和IL-2(10ng/mL)的不含抗生素的RPMI 1640用于核转染后培养。
[0375] KHYG-1和NK-92细胞在核转染前一天或两天传代，因为细胞必须处于对数生长期。在37℃下在50mL管中将核转染溶液以及含有血清和补充剂的培养基的等分试样预热至室温(每个样品100μl)。通过填充含有血清和补充物的1.5mL培养基并在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育来制备6孔板。制备等份的细胞培养物并计数细胞以确定细胞密度。将所需数量的细胞以1500rpm离心5分钟，然后完全弃去上清液。将细胞沉淀物重悬于室温核转染溶液中至终浓度为2×106个细胞/100μl(悬浮液中的最长时间＝20分钟)。将100μl细胞悬浮液与10μg mRNA(RNA体积<10μL)混合。将样品转移到经Amaxa认证的比色皿中(确保样品覆盖在比色皿的底部并避免气泡)。选择合适的核转染程序(即，用于KHYG-1细胞的U-001)。
然后将比色皿插入比色皿支架中。将500μl预热的培养基加入到比色皿中，并在程序完成后立即将样品转移到准备好的6孔板中，以避免对细胞造成损害。将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育。在电穿孔后12-16小时进行流式细胞术分析和细胞毒性测定。如上进行流式细胞术染色。
然后将比色皿插入比色皿支架中。将500μl预热的培养基加入到比色皿中，并在程序完成后立即将样品转移到准备好的6孔板中，以避免对细胞造成损害。将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育。在电穿孔后12-16小时进行流式细胞术分析和细胞毒性测定。如上进行流式细胞术染色。
[0376] 如图11和12中可见，TRAIL/TRAIL变体和CD107a(NK活化标记物)的表达在转染后增加，证实了TRAIL基因成功敲入KHYG-1细胞。
[0377] 图13提供了通过电穿孔进行转染之前和之后KHYG-1细胞活性的证据。可以看出，在用TRAIL/TRAIL变体转染细胞后，未观察到细胞活性的统计学显著差异，证实了野生型或变体TRAIL的表达对细胞无毒。该观察结果与NK-92细胞中的相应发现相矛盾，NK-92细胞中的相应发现表明TRAIL变体基因敲入对细胞有毒(数据未显示)。然而，这可能通过NK-92细胞表面上TRAIL受体DR4和DR5的相对高表达水平来解释(参见图14)。
[0378] TRAIL/TRAIL变体对KHYG-1细胞毒性的影响
[0379] 使用小鼠抗人CD2-APC抗体(BD Pharmingen目录号：560642)。使用膜联蛋白(膜联蛋白)V-FITC抗体(ImmunoTools目录号：31490013)。使用DNA染料SYTOX-Green(Life Technologies目录号：S7020)。使用24孔细胞培养板(SARSTEDT AG目录号：83.3922)。将髓性白血病细胞系K562、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和MM1.S用作靶细胞。将K562、RPMI8226、MM1.S在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素(100U/mL)/链霉素(100mg/mL)的RPMI 1640培养基中培养。
[0380] 如上所述，用TRAIL/TRAIL变体转染KHYG-1细胞。
[0381] 洗涤靶细胞并通过以1500rpm离心5分钟沉淀。将转染的KHYG-1细胞稀释至0.5×6
10/mL。然后在预热的RPMI 1640培养基中调节靶细胞密度，以产生比例为1:1的效应物:靶标(E:T)。
10/mL。然后在预热的RPMI 1640培养基中调节靶细胞密度，以产生比例为1:1的效应物:靶标(E:T)。
[0382] 然后将0.5mL KHYG-1细胞和0.5mL靶细胞在24孔培养板中混合，并置于潮湿的37℃/5％CO2培养箱中培养12小时。然后使用流式细胞术分析来测定KHYG-1细胞的细胞毒性；洗涤共培养细胞(在不同时间点)，然后使用膜联蛋白V结合缓冲液用CD2-APC抗体(5μL/测试)、膜联蛋白V-FITC(5μL/测试)和SYTOX-Green(5μL/测试)染色。
[0383] 使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。设置CD2阳性门控(positive gate)和CD2阴性门控(negative gate)，分别代表KHYG-1细胞和靶细胞群。然后分析CD2阴性群中膜联蛋白V-FITC和SYTOX-Green阳性细胞的由TRAIL诱导的细胞凋亡。
[0384] 图15、16和17分别显示了表达TRAIL或TRAIL变体的KHYG-1细胞对三种靶细胞系(K562、RPMI8226和MM1.S)的凋亡的影响。对于所有靶细胞群而言，与正常KHYG-1细胞(未用TRAIL转染)相比，KHYG-1细胞上的TRAIL表达增加细胞凋亡水平是明显的。此外，与用野生型TRAIL转染的KHYG-1细胞相比，KHYG-1细胞上的TRAIL变体表达进一步增加了所有靶细胞系中的细胞凋亡。
[0385] 表达TRAIL变体的本发明细胞由于对死亡受体DR5表现出更高的亲和力，而在癌症治疗中提供显著优势。当被这些细胞挑战时，阻止了癌细胞被阻止开发防御策略以通过某种途径规避死亡。因此，癌症不能通过上调TRAIL诱骗受体有效地避免由TRAIL诱导的细胞死亡，因为NK细胞被修饰使得它们在那些情况下保持细胞毒性。
[0386] 实施例7-使用敲入TRAIL变体的NK细胞进行血癌治疗的方案
[0387] 如上文实施例6中所述，用TRAIL变体转染KHYG-1细胞。开发以下方案用于治疗患有血癌的患者：
[0388] 在诊断患有表达IL-6、IL-6R或gp130的癌症的患者后，在施用经修饰的NK细胞之前施用DR5诱导剂，例如硼替佐米，因此以低剂量使用DR5诱导剂以上调癌症上DR5的表达，使得经修饰的NK细胞疗法更有效。
[0389] 然后将经修饰的NK细胞的等分试样解冻，培养并施用于患者。
[0390] 由于用于治疗的NK细胞表达的TRAIL变体对诱骗受体的亲和力低于野生型TRAIL，因此在癌细胞表面上的死亡受体的结合增加，因此导致更多的癌细胞凋亡。
[0391] 在实施上述方案之前，另一种选择是体外活组织检查癌症并培养癌细胞。该步骤可用于鉴定表达特别高水平的诱骗受体和/或低水平的死亡受体的那些癌症，以帮助确定DR5诱导剂是否适合给定患者。该步骤也可以在用上述方案治疗期间进行，因为给定的癌症可能能够改变成，例如减少其DR5的表达，因此它可能适合于部分地在治疗中用DR5诱导剂治疗。
[0392] 实施例8-低剂量硼替佐米使癌细胞对表达TRAIL变体的NK细胞敏感
[0393] 硼替佐米(Bt)是一种蛋白酶体抑制剂(化疗样药物)，可用于治疗多发性骨髓瘤(MM)。已知硼替佐米在几种不同类型的癌细胞(包括MM细胞)中上调DR5表达。
[0394] 如上文实施例6中所述，用TRAIL变体转染KHYG-1细胞，然后用于靶向暴露于硼替佐米或不暴露于硼替佐米的MM细胞。
[0395] 硼替佐米诱导的DR5表达
[0396] 硼替佐米购自Millennium Pharmaceuticals。小鼠抗人DR5-AF647(目录号：565498)购自BD Pharmingen。在BD FACS Canto II上分析染色的细胞样品。
[0397] (1)在37℃下在5％CO2气氛中，MM细胞系RPMI8226和MM1.S在补充有2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、24mM碳酸氢钠、0.01％抗生素和10％胎牛血清(Sigma，St Louis，MO，USA)的RPMI1640培养基(Sigma，St Louis，MO，USA)中生长。
[0398] (2)将MM细胞以1×106/mL，2mL/孔接种于6孔板中。
[0399] (3)然后用不同剂量的硼替佐米处理MM细胞24小时。
[0400] (4)然后通过流式细胞术分析硼替佐米处理/未处理的MM细胞中的DR5表达(图18)。
[0401] 发现低剂量硼替佐米处理增加两种MM细胞系中的DR5表达(图18)。DR5上调与细胞凋亡的轻微诱导相关(数据未显示)。然而，发现高剂量硼替佐米不能上调DR5表达，因为高毒性导致大多数MM细胞死亡。
[0402] 硼替佐米诱导的癌细胞敏感化
[0403] 如上文实施例6中所述，用TRAIL变体(TRAIL D269H/E195R)转染KHYG-1细胞。
[0404] (1)硼替佐米处理/未处理的MM1.S细胞用作靶细胞。MM1.S细胞用2.5nM的硼替佐米或载体(对照)处理24小时。
[0405] (2)TRAIL变体mRNA电穿孔后6小时，然后将KHYG-1细胞与MM细胞一起在12孔板中培养。洗涤后，将细胞浓度调节至1×106/mL，然后以1:1的比例混合KHYG-1和MM1.S细胞以培养12小时。
[0406] (3)进行KHYG-1细胞的细胞毒性的流式细胞术分析。收集共培养的细胞，洗涤，然后使用膜联蛋白V结合缓冲液用CD2-APC抗体(5uL/测试)、膜联蛋白V-FITC(5uL/测试)和SYTOX-Green(5uL/测试)染色。
[0407] (4)使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。CD2阴性群代表MM1.S细胞。KHYG-1细胞呈CD2强阳性。最后，分析CD2阴性群中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-Green阳性细胞。
[0408] 在与用/不用TRAIL变体电穿孔的KHYG-1细胞共培养的硼替佐米预处理/未处理的MM1.S细胞中进行细胞凋亡的流式细胞术分析(图19)。
[0409] 发现硼替佐米诱导MM细胞对表达TRAIL变体的KHYG-1细胞的敏感性。因此，数据表明在模型中诱导DR5表达的试剂在增加对癌细胞的细胞毒性方面是有效的，因此可用于增强癌症治疗。
[0410] 实施例9-确认由TRAIL变体诱导的细胞凋亡
[0411] 尽管在前面的实施例中存在由TRAIL变体表达导致NK细胞细胞毒性增加的确凿证据，但我们希望确认增加的细胞毒性是由于诱导癌细胞凋亡(最有可能)还是由于无意中激活NK细胞而表现出更多的细胞毒性表型，并因此通过穿孔素分泌杀死癌细胞。
[0412] 已证明Concanamycin A(CMA)抑制穿孔素介导的NK细胞的细胞毒活性，这主要是由于裂解颗粒的pH增加加速了穿孔素的降解。我们研究了当穿孔素介导的细胞毒性被CMA部分消除时，是否可以突出表达TRAIL变体的KHYG-1细胞的细胞毒性。
[0413] CMA诱导的穿孔素表达减少
[0414] 小鼠抗人穿孔素-AF647(目录号：563576)购自BD pharmingen。Concanamycin A(目录号：SC-202111)购自Santa Cruz Biotechnology。使用BD FACS Canto II分析染色的细胞样品。
[0415] (1)在含有10％FBS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)/链霉素(100mg/mL)和IL-2(10ng/ml)的RPMI1640培养基中培养KHYG-1细胞。
[0416] (2)将KHYG-1细胞(电穿孔后6小时，在无青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养)用100nM CMA或等体积载体(DMSO)进一步处理2小时。
[0417] (3)通过离心(1500rpm×5分钟)收集细胞(1×106个细胞/试验)并吸出上清液。
[0418] (4)将细胞在室温下在4％多聚甲醛的PBS溶液中固定15分钟。
[0419] (5)用4mL FACS缓冲液(PBS，0.5-1％BSA，0.1％叠氮化钠)洗涤细胞两次。
[0420] (6)将细胞用1mL PBS/0.1％皂苷缓冲液在室温下透性化30分钟。
[0421] (7)用4mL PBS/0.1％皂苷缓冲液洗涤细胞。
[0422] (8)将细胞重悬于100μL PBS/0.1％皂苷缓冲液中，然后向每个管中加入5μL抗体，并在冰上孵育30分钟。
[0423] (9)通过以1500rpm离心5分钟，用PBS/0.1％皂苷缓冲液洗涤细胞3次。
[0424] (10)将细胞重悬于500μL冰冷的FACS缓冲液中，并在冰上或在冰箱中4℃下在黑暗中保持直至分析。
[0425] (11)在流式细胞仪(BD FACS Canto II)上分析细胞。使用FlowJo 7.6.2软件处理数据。
[0426] CMA处理显著降低了KHYG-1细胞中的穿孔素表达水平(图20)，并且对KHYG-1细胞的存活率没有负面影响(图21)。
[0427] 在CMA存在下NK细胞TRAIL变体的细胞毒性
[0428] 如上文实施例6中所述，用TRAIL变体(TRAIL D269H/E195R)转染KHYG-1细胞。
[0429] (1)MM1.S细胞用作靶细胞。
[0430] (2)TRAIL mRNA电穿孔后6小时，KHYG-1细胞用100mM CMA或等体积载体处理2小时。
[0431] (3)通过离心用RPMI1640培养基洗涤KHYG-1细胞，并重悬于含有IL-2的RPMI1640培养基中，将细胞浓度调节至1×106/mL。
[0432] (4)将MM1.S细胞重悬于含有IL-2的RPMI1640培养基中调节细胞浓度至1×106/mL。
[0433] (5)将KHYG-1和MM1.S细胞以1:1的比例混合并共培养12小时。
[0434] (6)进行KHYG-1细胞的细胞毒性的流式细胞术分析。洗涤共培养的细胞并用CD2-APC抗体染色(5μL/测试)。
[0435] (7)洗涤后，使用膜联蛋白V结合缓冲液用膜联蛋白V-FITC(5uL/测试)和SYTOX-Green(5uL/test)进行进一步染色。
[0436] (8)使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。CD2阴性群代表MM1.S细胞。KHYG-1细胞呈CD2强阳性。然后分析CD2阴性群中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-Green阳性细胞。
[0437] 再次表明表达TRAIL变体的NK细胞显示出比缺乏TRAIL变体表达的对照细胞更高的细胞毒性(图22)。然而，在该实施例中，进一步表明CMA不能显著降低表达TRAIL变体的NK细胞的细胞毒活性，这与用CMA处理的对照NK细胞的发现相反。
[0438] 没有TRAIL变体(对照或mock NK细胞)的NK细胞显示在不存在CMA时诱导48％的癌细胞死亡，并且在CMA存在下诱导35.9％的癌细胞死亡(图22)。在存在和不存在CMA的情况下，表达TRAIL变体的NK细胞能够比对照NK细胞诱导更多的癌细胞死亡。事实上，即使存在CMA，表达TRAIL变体的NK细胞比不存在CMA的情况下的对照NK细胞诱导更多的癌细胞死亡。
[0439] 因此，该数据表明TRAIL变体通过对穿孔素相关的下调较不敏感的机制增加NK细胞对癌细胞的细胞毒性的重要性。由于穿孔素通常被NK细胞用于杀死靶细胞，并且许多癌细胞已经开发出用于减少NK细胞穿孔素表达的机制以逃避细胞毒性攻击，本发明的NK细胞代表了不易被癌细胞减毒的强有力的替代方案。
[0440] 实施例10-KHYG-1细胞中的突变TRAIL变体和检测点抑制性受体CD96的敲低的组合表达
[0441] 当敲低检查点抑制性受体CD96表达时以及当表达TRAIL变体时，观察到NK细胞细胞毒性的增加。我们还测试了两种遗传修饰的组合，以激发对NK细胞细胞毒性的协同作用。
[0442] 如实施例2中所述，在KHYG-1细胞中敲低CD96表达。
[0443] 如上文实施例6中所述，用TRAIL变体(TRAIL D269H/E195R)转染KHYG-1细胞。
[0444] (1)电穿孔后12小时，将KHYG-1细胞与靶细胞(K562或MM1.S)以1×106/mL的浓度在12孔板(2mL/孔)中共培养12小时。E:T比例为1:1。
[0445] (2)共培养12小时后，收集细胞，洗涤，用CD2-APC染色，再次洗涤，用膜联蛋白V结合缓冲液用膜联蛋白V-FITC(5uL/test)和SYTOX-Green(5uL/test)进一步染色。
[0446] (3)使用BD FACS canto II流式细胞仪分析细胞样品。使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。CD2阴性群代表MM1.S细胞。KHYG-1细胞呈CD2强阳性。然后分析CD2阴性群中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-Green阳性细胞。
[0447] 发现敲低CD96表达并同时在KHYG-1细胞中表达TRAIL变体协同增强细胞对K562靶细胞(图23)和MM1.S靶细胞(图24)的细胞毒性。这表明在两种靶细胞组中，同时存在的遗传修饰导致的细胞死亡多于单个修饰单独导致的细胞死亡。
[0448] 同时，除了进一步的证据显示TRAIL突变体/变体的表达增加NK细胞的细胞毒性(图23和24)之外，还获得了显示敲低CD96增加了NK细胞的细胞毒性的其他证据(图23和24)。
[0449] 实施例11-IL-6对NK细胞细胞毒性的直接和间接作用
[0450] 材料和方法
[0451] 重组人IL-2(目录号：200-02)和IL-6(目录号：200-06)购自PEPROTECH。将IL-2在100mM乙酸溶液中复原，等分并在-80℃下储存。将IL-6在含有0.1％BSA的PBS中复原，等分并在-80℃下储存。
[0452] RPMI1640培养基(目录号：R8758)购自SIGMA-ALDRICH。胎牛血清购自SIGMA-ALDRICH(目录号：F7524)。用10,000单位青霉素和10mg链霉素/mL稳定的100X青霉素-链霉素溶液(目录号：P4333)购自SIGMA-ALDRICH。用于细胞培养的马血清(目录号：H1138-500ML)购自SIGMA-ALDRICH。Alpha MEM培养基(目录号：12561056)购自Thermo Fisher Scientific。
[0453] PE标记的小鼠抗人CD126(IL-6受体α链)(目录号：551850)、PE标记的小鼠抗人CD130(gp130，IL-6受体相关信号转导子)(目录号：555757)、PE标记小鼠IgG1k同种型对照(目录号：555749)、APC标记的小鼠抗人CD2(目录号：560642)、FITC标记的小鼠抗人CD2(目录号：555326)、APC标记的小鼠抗人PD-L1(目录：563741)和APC标记的小鼠抗人PD-L2(目录号：557926)购自BD Pharmingen。APC标记的小鼠抗人PD1抗体(目录号：329907)购自Biolegend。Phosphor-Stat3(Ser727)小鼠mAb(目录：9136)、Phosphor-Shp-1(Tyr564)兔mAb(目录；8849)、Phosphor-Shp-2(Tyr580)兔mAb(目录：5431)、Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)兔mAb(目录：4370)和p44/42MAPK(Erk1/2)兔mAb购自Cell Signaling Technology。Phosphor-Stat3(Tyr705)小鼠mAb(目录号：sc-81523)和兔抗人Stat3多克隆抗体(目录号：sc-7179)购自Santa Cruz Biotechnology。小鼠抗-β肌动蛋白(目录：A5441)购自SIGMA-ALDRICH。功能性IL-6阻断抗体(目录号：501110)和相关的同种型对照抗体(目录号：400414)购自Biolegend。
[0454] 用于死细胞的流式细胞术分析的DNA染料 green(目录：s34860)购自Life Technologies。用于凋亡细胞的流式细胞术分析的膜联蛋白V-FITC抗体(目录号：
556419)购自BD Pharmingen。
556419)购自BD Pharmingen。
[0455] 培养NK细胞系KHYG-1并保持在含有10％FBS、100U/mL青霉素/100mg/mL链霉素和10ng/mL IL-2的RPMI1640培养基中。NK细胞系NK-92在含有10％马血清、10％FBS、100U/mL青霉素/100mg/mL链霉素和10ng/mL IL-2的αMEM中培养。每2-3天，改变培养KHYG-1和NK-92细胞的培养基或将细胞以1:2或1:3稀释分开。
[0456] 在补充有10％FBS和100U/mL青霉素/100mg/mL链霉素的RPMI-1640中培养K562、U937、HL60、Raji、RPMI8226、U266、MM1.S、NCI-H929和KMS11细胞。
[0457] IL-6受体表达
[0458] 流式细胞术用于定量各种效应细胞和靶细胞上IL-6受体和gp130的表达水平。
[0459] 通过离心(1500rpm，5分钟)收获细胞(对数期)，并使用1百万个细胞/测试的密度。用含有0.1％BSA和0.1％叠氮化钠的冰冷PBS洗涤细胞。最后将细胞在50μL含有0.1％BSA和
0.1％叠氮化钠的PBS中在冰上暴露于PE标记的CD126、CD130或同种型对照抗体(2.5μL/测试)30分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞两次后，在FACS Canto II(BD Biosciences)上获得样品。使用FlowJo 7.6.1软件分析结果
0.1％叠氮化钠的PBS中在冰上暴露于PE标记的CD126、CD130或同种型对照抗体(2.5μL/测试)30分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞两次后，在FACS Canto II(BD Biosciences)上获得样品。使用FlowJo 7.6.1软件分析结果
[0460] 图31-44显示在KHYG-1、NK-92、RPMI8226、MM1.S、NCI-H929、U266、KMS11和K562细胞上的IL-6受体(CD126)和gp130(CD130)表达。
[0461] KHYG-1细胞表达低水平的CD126(图31和32)和CD130(图33和34)。
[0462] NK-92细胞表达低水平的CD126(图35)和CD130(图36)。
[0463] MM细胞(U266、RPMI8226、NCI-H929、KMS11和MM1.S)表达相对高水平的CD126和CD130(分别为图37-41)。
[0464] 然而，白血病K562细胞是CD126阴性的(图42和43)，但表达相对高水平的CD130(图44)。
[0465] IL-6直接抑制NK细胞的细胞毒性
[0466] 如上所述培养和维持KHYG-1、RPMI8226、MM1.S和K562细胞。在对数期收获细胞，洗涤并重悬于预热的适当培养基中，然后将细胞浓度调节至1百万个细胞/mL。根据E:T(效应物:靶标)比例调节靶细胞的浓度。将0.5mL KHYG-1细胞和0.5mL靶细胞加入24孔板的一个孔中。将IL-6以100ng/mL的终浓度加入孔中。然后将板置于潮湿的37℃/5％CO2培养箱中12小时(对于K562细胞为6或4小时)。在0小时的时间点将KHYG-1和靶细胞的相同混合物用作对照。
[0467] 流式细胞术用于测量KHYG-1细胞的细胞毒性。收集共培养的细胞(在不同的时间点)，洗涤，然后首先用CD2-APC抗体(2.5uL/测试)染色，然后使用膜联蛋白V结合缓冲液用膜联蛋白V-FITC(2.5uL/测试)和SYTOX-Green(0.5uL/测试)染色。使用FlowJo 7.6.1软件进一步分析数据。设置CD2阳性门控和CD2阴性门控，分别代表KHYG-1细胞和靶细胞。KHYG-1细胞为100％CD2阳性，但K562、RPMI8226和MM1.S细胞为CD2阴性。最后，分析了CD2阴性群中膜联蛋白V-FITC和SYTOX-Green阳性细胞(死细胞)的百分比。
[0468] 图25-30显示IL-6抑制在1：1的E:T比例下KHYG-1细胞对RPMI8226、MM1.S和K562靶细胞的细胞毒性。
[0469] 在IL-6(100ng/mL)存在下，当与KHYG-1细胞共培养时，死靶细胞的百分比降低。孵育12小时后的RPMI8226细胞(图25和26)、孵育12小时后的MM1.S细胞(图27和28)和孵育6小时或孵育4小时(图30)后的K562细胞(图29)就是这种情况。
[0470] 由于K562细胞为CD126阴性，结果表明对KHYG-1细胞的细胞毒性的抑制作用是通过KHYG-1细胞上的IL-6受体直接介导的。
[0471] 为了进一步研究所观察到的IL-6诱导的KHYG-1细胞毒性抑制背后的机制，将KHYG1细胞在IL-2存在下用50ng/mL IL-6刺激24小时，然后通过流式细胞术分析NKG2D(激活受体)和NKG2A(抑制性受体)的表达水平。阴性对照意味着FMO。APC抗人NKG2D抗体(目录号#320807)购自Biolegend。APC抗人类NKG2A抗体(目录号FAB1059A)购自R&D systems。
[0472] 如图70所示，IL-6通过降低活化受体NKG2D(70A)的表达水平直接抑制KHYG-1细胞的细胞毒性，同时增加抑制性受体NKG2A(70B)的表达。
[0473] IL-6间接抑制NK细胞的细胞毒性
[0474] 对数期的MM细胞以0.5百万个细胞/mL接种在含有10％FBS的RPMI1640培养基中。MM细胞以最终浓度为100ng/mL IL-6或用相同体积的载体(PBS)处理48小时。然后收获MM细胞，洗涤，并用PD-L1和PD-L2抗体染色(2.5μL/测试)。使用FACS Canto II获取流式细胞术数据，并通过FACSDIVA 8.0.1软件进一步分析结果。
[0475] 图45-56显示IL-6增加RPMI8226、NCI-H929、MM1.S和U266细胞上PD-L1和PD-L2的表达。
[0476] 在RPMI8226细胞(图45)、NCI-H929细胞(图47)、MM1.S细胞(图49和50)和U266细胞(图53和54)上观察到IL-6诱导的PD-L1上调。
[0477] 在RPMI8226细胞(图46)、NCI-H929细胞(图48)、MM1.S细胞(图51和52)和U266细胞(图55和56)上观察到IL-6诱导的PD-L2上调。
[0478] 由于众所周知的PD-L1和PD-L2与NK细胞上的检查点抑制性受体(cIR)PD-1结合，这些数据清楚地显示了第二种(间接)机制，通过该机制，IL-6还通过作用于癌细胞来抑制NK细胞的细胞毒性。
[0479] 这两个阐明的机制表明IL-6是参与癌细胞存活的关键细胞因子。
[0480] IL-6拮抗作用
[0481] 对数期的U266细胞以0.5百万个细胞/mL接种在含有10％FBS的RPMI1640培养基中。加入终浓度为10μg/mL的大鼠抗人IL-6mAb或同种型对照抗体以阻断U266细胞分泌的IL-6。在48小时的时间点，收获U266细胞，洗涤，并用PD-L1和PD-L2抗体染色(2.5μL/测试)。使用FACS Canto II获取流式细胞术数据，并使用FACSDIVA 8.0.1软件进一步分析结果。
[0482] 图57-60显示在IL-6阻断抗体存在下U266细胞上的PD-L1表达显著降低。
[0483] 图61-64显示在IL-6阻断抗体存在下U266细胞上的PD-L2表达显著降低。
[0484] 因此，证明了对IL-6信号传导的拮抗作用可通过使用IL-6阻断抗体实现。
[0485] 这些数据证实了IL-6信号传导负责调节癌细胞上PD-L1和PD-L2的表达。
[0486] 因此，根据本发明，阻断IL-6信号传导可用于治疗癌症，因为防止了IL-6直接和间接诱导的对NK细胞细胞毒性的抑制。此外，通过阻断IL-6信号传导也可以防止IL-6对癌细胞的任何直接增殖或抗细胞凋亡作用。
[0487] 为了进一步证明这一点，如上所述，在2μg/mL IL-6阻断单克隆抗体(LEAFTM纯化的抗人IL-6抗体，Biolegend，目录号#501110)或相同剂量的同种型对照抗体(Biolegend，目录号#400413)的存在下，用U266细胞刺激KHYG-1细胞。
[0488] 如图69所示，使用单克隆抗体阻断IL-6恢复了对U266细胞的KHYG-1细胞毒性(E:T比例为1:1；孵育12小时)。因此，除了上述RPMI8226、MM1.S和K562靶细胞的数据外，该数据表明抑制IL-6信号传导增加了KHYG-1细胞杀死另一种癌细胞系中的靶癌细胞的能力。
[0489] 在NK细胞中的IL-6信号传导
[0490] 如上所述培养和维持KHYG-1细胞。当测试单独的IL-6的作用时，KHYG-1细胞在补充有10％FBS(无IL-2)的RPMI160培养基中饥饿培养6小时，然后用10ng/mL的IL-2和/或100ng/mL的IL-6刺激。
[0491] 在正常条件下生长的KHYG-1细胞需要IL-2来促进细胞增殖并保持细胞毒性。
[0492] 如图65所示，发现IL-2单独激活p-STAT3和p-P44/42，但p-SHP1和p-SHP2的表达降低。
[0493] 如图66所示，IL-6单独激活p-STAT3、p-SHP1和p-SHP2，但p-P44/42的表达降低。
[0494] 如图67所示，在IL-2存在下，IL-6仍然能够降低p-P44/42表达并增加p-SHP1和p-SHP2表达。
[0495] 已经在模型(包括NK细胞)中证明了p-STAT3是IL-6信号通路的主要下游效应物，并且p-P44/42的水平与NK细胞细胞毒性正相关。
[0496] 上述数据表明，p-SHP1和p-SHP2在调节p-P44/42水平中起重要作用。此外，本文证明了IL-6的抗细胞毒性信号传导作用超过了IL-2的促细胞毒性信号传导作用，导致NK细胞细胞毒性的整体降低，并且可以有效地逆转-因此IL-6拮抗作用可以用作癌症疗法。
[0497] 癌细胞诱导的NK细胞中PD-1表达上调
[0498] 培养KHYG-1细胞并维持在含有10％FBS、100U/mL青霉素/100mg/mL链霉素和10ng/mL IL-2的RPMI1640培养基中。K562、U937、HL60、Raji、RPMI8226、U266和MM1.S细胞在补充有10％FBS和100U/mL青霉素/100mg/mL链霉素的RPMI1640中培养。在对数期收获细胞，洗涤并重悬于含有IL-2的预热的RPMI1640培养基(培养KHYG-1细胞的培养基)中，然后将细胞浓度调节至1百万个细胞/mL。根据E:T(效应物:靶标)比例调节靶细胞的浓度。将0.5mL KHYG-1细胞和0.5mL靶细胞加入到24孔板的一个孔中并培养24小时。收获细胞，洗涤并用CD2-FITC(2.5uL/测试)和PD1-APC(2.5uL/测试)抗体染色。使用FACS Canto II获取样品，并使用FACSDiva 8.0.1软件分析。CD2阳性门控和CD2阴性门控分别代表KHYG-1细胞和靶细胞。
KHYG-1细胞是100％CD2阳性的，但是MM细胞和其他恶性血癌细胞系是CD2阴性的。因此分析了CD2阳性群(即KHYG-1细胞)中的PD-1表达。
KHYG-1细胞是100％CD2阳性的，但是MM细胞和其他恶性血癌细胞系是CD2阴性的。因此分析了CD2阳性群(即KHYG-1细胞)中的PD-1表达。
[0499] 从图68可以看出，与不同血癌细胞系共培养的KHYG-1细胞中PD-1表达的流式细胞术分析(E:T比例＝1:1)显示PD-1表达由所有测试的血癌细胞系显著地诱导。
[0500] 这些数据突出了癌细胞对NK细胞细胞毒性的抑制作用，因为NK细胞上较高的PD-1表达通过表达PD-L1和/或PD-L2的癌症导致更大程度的细胞毒性抑制。
[0501] 因此，本文证明了癌细胞上调NK细胞上cIR PD-1的表达，而IL-6既直接降低NK细胞的细胞毒性又上调癌细胞上PD-L1和PD-L2的表达。NK细胞上PD-1表达的增加和癌细胞上PD-L1和PD-L2表达的增加共同作用以显著抑制NK细胞毒性。此外，IL-6直接促进癌细胞增殖。
[0502] 如上所示，阻断IL-6信号传导在降低癌细胞，尤其是那些表达IL-6受体的癌细胞的存活方面具有治疗应用。
[0503] IL-6拮抗剂治疗方案
[0504] 开发了以下方案用于治疗多发性骨髓瘤患者。然而，显然本发明适用于治疗患有多种不同癌症的患者，包括表达IL-6R的癌症。
[0505] 在诊断患有IL-6R阳性癌症的患者(在这种情况下为多发性骨髓瘤)后，在以有效剂量施用患者之前，将NK细胞的等分试样解冻并进行培养。可以如本文其他地方所述修饰等分试样的细胞。或者，可以使用例如病毒手段、电穿孔等制备瞬时转染。对于电穿孔，MaxCyte Flow Electroporation平台提供了一种可在临床上实现快速大规模转染的合适的解决方案。转染NK细胞后，培养它们以允许表达修饰，然后静脉内施用于患者。
[0506] 在施用NK细胞之前、同时或之后，以有效剂量向患者施用IL-6拮抗剂。该IL-6拮抗剂可以为一种拮抗剂或其组合。IL-6拮抗剂可结合IL-6、IL-6R、gp130等，条件是结合导致减少的(拮抗)IL-6信号传导。
[0507] 因此，本发明提供了基于拮抗NK细胞中IL-6信号传导的癌症疗法。
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