眼病的治疗
阅读：97发布：2020-05-11
专利汇可以提供眼病的治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了用于 治疗 特征在于血管不 稳定性 、血管渗漏和新血管形成的眼病或病况的方法，所述眼病或病况是例如糖尿病黄斑 水 肿、年龄相关黄斑水肿、脉络膜新生血管化、糖尿病 视网膜 病变、创伤、眼缺血和葡萄膜炎。，下面是眼病的治疗专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗或防止眼障碍的方法，包括给受试者施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述眼障碍是眼部新生血管形成、眼部水肿、视网膜水肿、视网膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、非增生性视网膜病变、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张或葡萄膜炎。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述眼障碍是视网膜水肿。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述眼障碍是视网膜新生血管形成。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述眼障碍是糖尿病视网膜病变。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述眼障碍是糖尿病黄斑水肿。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是结合HPTPβ的细胞外部分的抗体、蛋白质、肽、适体、肽体、adnectin或核酸。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，或多克隆抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是：由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-7680产生的单克隆抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂具有与由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-7680产生的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物特征相同或基本上相同的生物特征。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是：F(ab′)2、Fab、Fab的二聚体、Fv、Fv的二聚体或scFv的二聚体。
14.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为F(ab′)2、Fab的二聚体、Fv的二聚体或scFv的二聚体。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述HPTPβ-ECD结合剂是蛋白质、肽、适体、肽体、核酸或adnectin。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中给所述受试者施用的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐的剂量为按受试者的重量计约0.01mg/kg至约500mg/kg。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中给受试者施用的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐的剂量为按受试者的重量计约0.1mg/kg至约10mg/kg。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中每日1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月3次、每月2次、每月1次和每二月1次施用剂量。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中将所述HPTPβ-ECD结合剂缀合至媒介物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述媒介物是PEG。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中通过眼内注射施用所述HPTPβ-ECD结合剂。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中通过皮下注射施用所述HPTPβ-ECD结合剂。
23.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中通过静脉内注射施用所述HPTPβ-ECD结合剂。
眼病的治疗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年10月13日提交的美国临时申请系列No.61/546,708的优先权。将美国临时申请系列No.61/546,708的完整内容通过引用并入本文。
[0003] 通过引用并入电子地提交的材料
[0004] 通过引用将其整体并入本文的是与其同时提交的和如下鉴定的计算机可读序列表：一个于2012年10月12日12:42pm创建的名称为″233106-331562_Seq_Listing_ST25.txt″的92KB ASCII(文本)文件。
[0005] 领域
[0006] 用于治疗特征在于血管不稳定性、血管渗漏和新血管形成例如眼部水肿、眼部新生血管形成、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管化、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞(中央或分枝)、眼缺血、眼创伤、手术诱发的水肿和葡萄膜炎的眼疾病或病况的方法。
[0007] 背景
[0008] 眼睛包括几个结构和功能上不同的血管床，所述血管床提供对于为视觉的维持是至关重要的屈光要素。这些血管床包括视网膜和脉络膜血管系统，其分别提供视网膜的内部和外部部分，和位于角膜周围的角膜缘血管系统。损害这些血管床的正常结构或功能的损伤和疾病是视觉障碍和失明的首要原因。例如，糖尿病视网膜病变是影响视网膜血管系统的最常见疾病，并且是美国工作年龄群体中视觉丧失的首要原因。继发于损伤或疾病的角膜的血管化是另一类可导致视觉的严重损害的眼血管疾病。
[0009] “黄斑变性”是用于几个疾病综合征的任一个的一般医学术语，其牵涉因视网膜中央的黄斑区的细胞和组织变性而引起的视力的逐渐丧失或损害。黄斑变性通常被表征为两种类型：非渗出性(干型)或渗出性(湿型)之一。虽然两种类型都是双向和进行性的，但每一个类型可反映不同的病理过程。年龄相关性黄斑变性(AMD)的湿型是脉络膜新生血管化的最常见形式并且是老年人中失明的首要原因。AMD影响数百万60岁以上的美国人，并且是老年人中新的失明的首要原因。
[0010] 脉络膜新生血管膜(CNVM)是与众多种视网膜疾病相关，但最常见地与年龄相关性黄斑变性关联的问题。对于CNVM，源自脉络膜(正好在视网膜底下的富含血管的组织层)的异常血管生长穿过视网膜层。这些新血管非常脆并且容易破裂，从而引起血液和液体在视网膜的层内混合。
[0011] 糖尿病(糖尿病(diabetes mellitus))是因胰腺不能产生胰岛素或不能使用产生的胰岛素而引起代谢病。最常见类型的糖尿病是1型糖尿病(通常称为青少年糖尿病)和2型糖尿病(通常称为成人发病型糖尿病)。1型糖尿病由身体因丧失胰岛素生成细胞而不能产生胰岛素引起，并且目前需要人注射胰岛素。2型糖尿病通常由胰岛素抗性(其中细胞不能恰当地使用胰岛素的病况)引起。2型糖尿病同样地可具有胰岛素缺陷的组分。
[0012] 糖尿病是造成许多疾病状况的直接原因，包括眼的病况或疾病，包括为大多数发达国家的视力丧失和失明的首要原因的糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病黄斑水肿(DME)。世界范围内数目不断增加的糖尿病个体表明DR和DME在未来许多年将继续为视力丧失和相关功能障碍的主要贡献者。
[0013] 糖尿病视网膜病变是糖尿病的并发生症，其因对眼后部(视网膜)上的感光组织的血管的破坏而引起。最初，糖尿病视网膜病变可以不产生症状或仅轻微的视觉问题。然而，最后，糖尿病视网膜病变可导致失明。糖尿病视网膜病变可在具有1型糖尿病或2型糖尿病的任何人中发生。
[0014] 在其最早阶段，非增生性视网膜病变微动脉瘤在视网膜的很小的血管中发生。随着疾病进展，更多的这些血管被破坏或阻塞，视网膜的这些区域向局部组织内发送信号以生长新的血管来提供营养。该阶段称为增生性视网膜病变。新血管沿着视网膜和沿着充满眼睛内部的澄清的玻璃体凝胶表面生长。
[0015] 这些血管本身不引起病症或视力丧失。然而，它们具有薄而脆的壁并且在没有及时治疗的情况下，这些新血管可渗漏血液(全血或其组分)，这可导致严重的视力丧失和甚至失明。
[0016] 同样地，液体可渗入黄斑的中央(眼的其中灵敏的向前直视时的视觉发生的部分)。液体和相关蛋白质开始沉积在黄斑上或黄斑下，从而引起患者的中央视觉被扭曲。该病况称为黄斑水肿。其可在糖尿病视网膜病变的任何阶段发生，尽管其更可能随着疾病进展而发生。约一半的具有增生性视网膜病变的人也具有黄斑水肿。
[0017] 葡萄膜炎是其中葡萄膜开始发炎的病况。眼呈现非常象网球的形状，内部中空，3层不同的组织围绕中央腔。最外面是巩膜(眼的白膜)，最里面是视网膜。巩膜与视网膜之间的中间层称为葡萄膜。葡萄膜包含许多营养眼睛的血管。葡萄膜炎的并发症包括青光眼、白内障或新血管形成(新生血管形成)。
[0018] 渗出性(湿型)黄斑变性、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、脉络膜新生血管膜、来自葡萄膜炎或眼创伤的并发症的目前可获的干预包括激光光凝疗法、低剂量辐射(远距放射疗法)和新生血管膜的手术去除(玻璃体切除术)。激光疗法具有有限的成功并且选择的最初对激光疗法作出反应的脉络膜新生血管膜具有较高的疾病复发率。还存在因激光疗法引起的替在视力丧失。低剂量辐射已无效地用于诱导脉络膜新生血管化的消退。最近，血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、雷珠单抗和阿柏西普已被批准用于年龄相关性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿和视网膜静脉阻塞(RVO)。
[0019] (RVO)是糖尿病视网膜病变后最常见的视网膜血管疾病。取决于被有效阻塞的视网膜静脉引流的区域，其被广泛地分类为中央视网膜静脉阻塞(CRVO)、半球形视网膜静脉阻塞(HRVO)或视网膜分枝静脉阻塞(BRVO)。已观察到这些疾病的每一种具有两个亚型。RVO的表现一般具有拥有由视网膜血管扭曲、视网膜出血(呈污点状和呈火焰状)、棉絮状渗出斑、视乳头水肿和黄斑水肿组成的眼底发现的任意组合的可变无痛性视力丧失。在CRVO中，将在眼底的所有4个象限中发现视网膜出血，然而这些被严格限制于HRVO的上眼底半球或下眼底半球。在BRVO中，出血主要被定位于通过视网膜静脉的阻塞排放的区域。
[0020] 因此存在对治疗特征在于血管不稳定性、血管渗漏和新生血管形成的眼疾病的方法的长期未满足的重大需要。
[0021] 概述
[0022] 公开了结合人蛋白酪氨酸磷酸酶β(HPTPβ)的细胞外部分并且抑制其的试剂。还公开了用于治疗特征在于血管不稳定性、血管渗漏和新血管形成的眼疾病或病况(例如眼部水肿、眼部新生血管形成、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管化、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞(中央或分枝)、眼缺血、眼创伤、手术诱发的水肿和葡萄膜炎)的方法。
[0024] 图1.单克隆抗体R15E6识别内皮细胞上的内源HPTPβ。(图框A)利用对照抗体(泳道1)、利用R15E6(泳道2)或用抗-Tie2与抗-VEGFR2抗体(泳道3)的混合物免疫沉淀内皮细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀，将其转移至PVDF膜，利用R15E6、抗-Tie2和抗-VEGFR2抗体的混合物通过蛋白质印迹探测。对于R15E6(泳道2)而非对照抗体(泳道1)，或抗-Tie2和抗-VEGFR2的混合物(泳道3)，看到与HPTPβ一致的单个主要高分子量条带。对于R15E6(白色峰)或无第一抗体的对照(黑色峰)，(图框B)将内皮细胞经历FACS分析。荧光的强烈偏移表明R15E6结合完整内皮细胞表面上的HPTPβ。
[0025] 图2.单克隆抗体R15E6增强HUVEC中的Tie2受体活化。如和例4中所述测量人内皮细胞中的Tie2活化。R15E6剂量依赖性地增强基线和Ang1-诱导的Tie2活化。
[0026] 图3.是在一只眼中通过1μg或2μg的抗-VE-PTP细胞外结构域抗体治疗的眼对利用对照的另一只眼的类似治疗的激光损伤后14天，C57BL/6小鼠的脉络膜新生血管化的平均面积的图示。
[0027] 图4.显示在从P5至P12于75％的氧气氛中密闭并且在P12当小鼠返回至室内空气时进行抗-VE-PTP细胞外结构域抗体的玻璃体内注射后，在P17天C57BL/6小鼠的视网2
膜新血管形成平均面积(mm)。
膜新血管形成平均面积(mm)。
[0028] 图5显示在媒介物或2μg的抗-VE-PTP细胞外结构域抗体的玻璃体内注射后氧诱发的视网膜病变模型中小鼠视网膜的代表性荧光显微照片。
[0029] 图6.显示在从P5至P12于75％的氧气氛中密闭，随后在P12返回至室内空气，在第P12、14和16天皮下施用1mg/kg的抗-VE-PTP细胞外结构域抗体后，第P17天的C57BL/62
小鼠的视网膜新血管形成的平均面积(mm)。
小鼠的视网膜新血管形成的平均面积(mm)。
[0030] 图7.显示在从P5至P12于75％氧气氛中密闭，随后在P12返回至室内空气，在第P12、14和16天皮下施用2mg/kg的抗-VE-PTP细胞外结构域抗体后，第P17天的C57BL/62
小鼠的视网膜新血管形成的平均面积(mm)。
小鼠的视网膜新血管形成的平均面积(mm)。
[0031] 详述
[0032] 一般定义
[0034] 术语″HPTPβ-ECD结合剂″和“特异性结合剂”在本文中可互抑制使用，并且是指特异性结合HPTPβ及其变体和衍生物(如本文中定义的)的细胞外部分，抑制HPTPβ的Tie2去磷酸化酶活性的分子。
[0035] 如本文中所用，除非另有所指，否则“试剂”是批“HPTPβ结合剂”。
[0036] “特异性结合HPTPβ-ECD”是指本发明的特异性结合剂识别HPTPβ的细胞外结构域的表位并且以高于其它相关和/或不相关分子的结合亲和力结合所述表位的能力。特异性结合剂优选结合蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的HPTPβ。特异性结合剂优选具有对于HPTPβ的选择性。“选择性的”意指相较于其它相关和/或不相关分子对于HPTPβ具有显著更大的活性，而不是对于其它分子完全无活性的试剂。例如，选择性试剂可显示相较于对其它相关或不相关分子对HPTPβ的10倍、100倍或1000倍的选择性。
[0037] 术语“抗-HPTPβ-ECD抗体”是指结合HPTPβ的细胞外结构域的抗体或抗体片段。抗-HPTPβ-ECD抗体是一种类型的本文中定义的HPTPβ-ECD结合剂。
[0038] 术语“VE-PTP”是指HPTPβ的小鼠直系同源物。
[0039] 除非另有所指，否则本文中所有百分比、比率和比例按重量计算。除非另有所指，否则所有温度以摄氏度(℃)表示。
[0040] 范围在本文中可表达为从特定值至另一个特定值，终点包括在范围内。例如对于从“1mg至50mg”的范围，包括1mg和50mg的特定值。先行词“约”表示值为近似的。例如，对于从“约1mg至约50mg”的范围，表示值为近似值。此外，当表达这样的范围时，范围包括范围“从1mg至50mg”。还应理解，范围的每一个的终点与另一个终点显著相关，并且不依赖于另一个终点。例如范围“从1mg至50mg”包括范围“从30mg至40mg”。
[0041] “有效量”意指对于改善或预防待治疗的患者的障碍或延长存活期是有效的活性剂或试剂的组合的量。有效量可根据本领域已知的因素例如待治疗的人或动物的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。虽然特定的给药方案可描述于本文中的实施例中，但本领域技术人员将理解，给药方案可被改变来提供最佳治疗反应。例如，可每日施用若干分份剂量或可按治疗状况的紧急性所显示的，相应地减少剂量。此外，可按达到治疗量所必需的频率施用本公开内容的组合物。治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别地根据本文中提供详细公开内容。
[0042] 如本文中所用，术语“抑制”或“抑制(inhibiting)”是指活性的统计上显著且可测量的减少，优选相对于对照至少约10％的减少，更优选约50％或更多的减少，更优选约80％或更多的减少。
[0043] 如本文中所用，术语“增加”或“增强”是指活性的显著且可测量的增加，优选相对于对照至少约10％的增加，更优选约50％或更多的增加，更优选约80％或更多的增加。
[0044] “HPTP贝塔”或“HPTPβ”在本文中可互换使用，并且是人蛋白酪氨酸磷酸酶β的缩写。
[0045] 如本文中所用，“受试者”意指个体。因此，“受试者”可包括家养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。“受试者”还可包括哺乳动物例如灵长类动物或人。“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。优选地受试者是人。
[0046] “减少”或该单词的其它形式例如“减小”或“减少”意指事件或特征(例如，血管渗漏)的下降。应理解，这通常与与一些标准或表达的值相关，换句话说，其是相对的，但对于提及的标准或相对值不总是必需的。
[0047] 术语“治疗”、“医治”、“医疗”等是指获得期望的药理学和/或生理学效应例如缓和宿主的疾病或障碍，和/或减少、抑制或消除与障碍(例如，眼部水肿)相关的特定特征或事件。因此，术语″治疗″包括，防止障碍在宿主中发生，特别地当宿主易于获得疾病时但还未被诊断患有疾病时；抑制障碍；和/或逆转障碍。在本发明的方法用于预防障碍的范围内，应理解术语″患者″不需要疾病状态完全被阻止。相反地，如本文中所用，术语预防是指本领域技术人员鉴定易患障碍的群体，以便可在疾病发作之前施用本发明的化合物的能力。术语无意指疾病状态被完全避免。
[0048] 除非另有所指，否则糖尿病视网膜病变包括非增生性视网膜病变和增生性视网膜病变的所有阶段。
[0049] 在本说明书的整个描述和权利要求中，单词“包含”及该单记号的其它形式例如“包括”和“含有”意指包括但不限于以及无意排除，例如其它衍生物、组分、整体或步骤。
[0050] 如说明书和所附权利要求中所用，除非另外明确地指定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数所指物。因此，例如，“一种(a)组合物”包括一种组合物或两种或更多种这样的组合物的混合物。
[0051] “任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且描述包括其中事件或情况发生的情况以及其中其不发生的情况。
[0052] “特异性结合HPTPβ”是指本发明的试剂相较于针对其它相关和/或不相关分子以更高的亲和力识别和结合HPTPβ的细胞外结构域的能力。试剂优选具有对于HPTPβ的选择性。“特异性的”意指试剂相较于针对其它相关和/或不相关分子具有显著更大的针对HPTPβ的活性，而非对其它分子完全无活性。例如，选择性试剂相较于针对其它相关或不相关分子针对于HPTPβ可显示10倍、100倍或1000倍的选择性。
[0053] 术语“表位”是指能够被试剂在试剂的抗原结合区域的一个或多个上识别并且结合的任何分子的任意部分。表位通常由不同的可识别的表面基团例如氨基酸、糖、脂质、磷酰基或磺酰基组成，并且在某些实施方案中，可具有特殊三维结构特征，和/或特殊电荷特征。如本文中所用，表位可以为构象或线性的。
[0054] “肽体”是包含连接至至少一个肽的抗体Fc结构域的分子。肽体的产生通常描述于WO2002/24782中。
[0055] “片段”是指试剂的一部分。片段可保留期望的试剂的生物活性，可被认为是试剂本身。例如，其中氨基末端和/或羧基末端和/或内部氨基酸残基被缺失的截断的蛋白质是蛋白质的片段，免疫球蛋白分子的Fab是免疫球蛋白的片段。还可通过直接连接(例如，肽或二硫键)或通过接头将这样的片段连接至另一个分子。
[0056] “蛋白质”在本文中可与肽和多肽互换使用。
[0057] 本发明的肽包括但不限于具有约3至75个氨基酸，或约5至约50个氨基酸，或约10至约25个氨基酸的氨基酸序列。肽可以是天然存在的或人造氨基酸序列。
[0058] 本发明的蛋白质可通过本领域公知的方法，例如使用标准直接技术例如通过固相合成来获得。如果基因序列是已知的或可推导时，则可通过标准重组法产生蛋白质。蛋白质可以以本领域技术人员已知的多种方法来分离或纯化。标准纯化法包括利用盐、电泳、层析技术等的沉淀。
[0059] 可将试剂共价地或非共价地缀合至媒介物。术语“媒介物”是指阻止试剂的降解和/或增加其半衰期、减小其毒性、减小其免疫原性或增加其生物活性的分子。示例性媒介物包括但不限于免疫球蛋白的Fc结构域和聚合物，例如：聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、葡聚糖、脂质、胆固醇基团(例如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或任何天然或合成蛋白质或结合补救受体的肽。
[0060] “衍生物”包括已以一些与插入、缺失或置换变体不同的方式化学修饰的那些结合剂。例如，当结合剂是蛋白质时，可用氨基例如NH2给羧基末端封端。
[0061] 在一些实施方案中，将一个或多个分子连接在一起形成试剂。例如，可通过接头连接抗体片段。一般而言，接头的化学结构不是至关重要的，因为其主要用作间隔。在一个实施方案中，接头由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。在另一个实施方案中，接头是非肽接头例如非空间位阻的C1-C6烷基。在另一个实施方案中，接头是PEG接头。还应理解，接头可被插入分子上的许多位置中。
[0062] 试剂的变体包括在本发明的范围内。如本文中所用，“变体”或“变型”意指具有这样的蛋白质或核苷酸序列的试剂，所述蛋白质或核苷酸序列与非变体试剂的蛋白质或核苷酸序列大体相似，并且共有非变体试剂的类似活性。可以以各种方式改变蛋白质或核苷酸序列以产生本发明包括的变体，包括置换、缺失、截断、插入和其它修饰。用于这样的操作的方法在本领域是公知的。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(和最近的资料)Ausubel等人编辑(1996)，John Wiley and Sons，New York：Methods in Molecular Biology，第182卷，In vitro Mutagenesis Protocols，第2版，Barman编辑(2002)，Humana Press，以及本文中引用的参考资料。例如，变体包括其中将氨基酸残基插入结合剂的已知氨基酸序列，从所述氨基酸序列缺失氨基酸残基，和/或将氨基酸残基置换进入所述氨基酸序列的肽和多肽。在一个实施方案中，氨基酸的置换是保守的，因为其最低限度地改变变体的生物化学性质。在其它实施方案中，变体可以是全长蛋白质的活性片段、化学修饰蛋白质、通过添加亲和或附加表位、或荧光或其它标记部分修饰的蛋白质，无论是通过蛋白质的体内或体外酶促处理，通过化学修饰还是通过使用修饰氨基酸进行的蛋白质合成获得的。
[0063] 本文中还涉及融合蛋白。通过使用已知方法，本领域技术人员将能够制备本发明的蛋白质的融合蛋白；即，尽管与天然形式不同，但可以是有用的。例如，融合伴侣可以是信号(或前导)多肽序列，其可共翻译地或翻译后地指导蛋白质从其合成位置至另一位置的转移(例如，酵母α因子前导序列)。或者，其可被添加来促进本发明的纯化或鉴定(例如，多聚-His、Flag肽或荧光蛋白)。
[0064] 标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。可按照制造商的说明书或如本领域中通常实现的或如本文中所描述的，进行酶促反应和纯化技术。通常按照本领域中已知的和在整个本说明书中引用和论述的各种一般和更专门的参考资料中所描述的常规方法进行技术和方法。除非提供具体定义，否则与本文中描述的分析化学、合成有机化学和医学及药物化学结合使用的命名法以及所述分析化学、合成有机化学和医学及药物化学的实验室方法和技术是本领域中已知的和通常使用的命名法以及实验室方法和技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送以及患者的治疗。
[0065] 序列表
[0066] 表1.
[0067]SEQ ID NO：1 全长人HPTPβ核苷酸序列(X54131)
SEQ ID NO：2 全长人HPTPβ氨基酸序列(P23467)
SEQ ID NO：3 具有(His)6Gly标签的人HPTPβ的细胞外部分
SEQ ID NO：4 人HPTPβ的细胞外部分
SEQ ID NO：5 全长小鼠VE-PTP核苷酸序列
SEQ ID NO：6 全长小鼠VE-PTP氨基酸序列
SEQ ID NO：7 小鼠VE-PTP氨基酸序列的细胞外部分
SEQ ID NO：2 全长人HPTPβ氨基酸序列(P23467)
SEQ ID NO：3 具有(His)6Gly标签的人HPTPβ的细胞外部分
SEQ ID NO：4 人HPTPβ的细胞外部分
SEQ ID NO：5 全长小鼠VE-PTP核苷酸序列
SEQ ID NO：6 全长小鼠VE-PTP氨基酸序列
SEQ ID NO：7 小鼠VE-PTP氨基酸序列的细胞外部分
[0068] HPTPβ-ECD结合剂
[0069] 用于本发明的试剂包括蛤不限于抗体、蛋白质、darpin、肽、适体、adnectin、肽体或特异性结合HPTPβ的细胞外部分并且抑制HPTPβ的至少一种磷酸酶活性的核酸。如本文中所用，“磷酸酶活性”包括其中生物活性通过评估Tie2磷酸化来进行测量的酶促活性和生物活性。
[0070] 用于本发明的试剂还包括：结合HPTPβ的细胞外部分的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段抑制HPTPβ的至少一个磷酸酶活性。这些试剂包括单克隆和多克隆抗体。试剂可以是抗体的片段，其中所述片段包含重链和轻链可变区，或片段为F(ab’)2，或片段为Fab、Fv、scFv的二聚体或三聚体，或来源于抗体的双链、三链或四链抗体。
[0071] 例如，试剂可以是但不限于结合HPTPβ的细胞外部分的抗体或抗体片段；或具体地结合HPTPβ的FN3重复的集，或更具体地结合HPTPβ的第一FN3重复的抗体。
[0072] 试剂还包括：描述于美国专利号7,973,142(将其通过引用整体并入)中描述的单克隆抗体R15E6。(可用于产生抗体的小鼠杂交瘤Balbc脾细胞(B细胞)，其被赋予ATCC No.PTA-7580)(在本文中称为R15E6)，于2006年5月4日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，Va.20108USA)、具有与R15E6相同或基本上相同的生物特征的抗体；R15E6的抗体片段，其中片段包含重链和轻链可变区；R15E6的F(ab’)2；Fab、Fv、scFv的二聚体或三聚体；以及来源于R15E6的双链体、三链体或四链体。
[0073] 具体地，适合用于本发明的试剂是单独的或通过已知技术提供的与其它氨基酸序列组合的抗体、抗体片段、其变体或衍生物。这样的技术包括但不限于酶促切割、化学切割、肽合成或重组技术。本发明还包括衍生剂例如肽体。
[0074] 因此，HPTPβ-ECD结合剂的一个实施方案是抗体，另一个实施方案是蛋白质，另一个实施方案是肽，以及另一个实施方案是darpin，另一个实施方案是适体，另一个实施方案是肽体，另一个实施方案是adnectin，另一个实施方案是核酸。在一些实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂是单克隆抗体或是多克隆抗体。在具体的实施方案，HPTPβ-ECD结合剂是能够结合HPTPβ-ECD的抗体片段。优选地，HPTPβ-ECD结合剂是抗体，或抗体片段，包括但不限于F(ab’)2、Fab、Fab的二聚体、Fv、Fv的二聚体、scFv、scFv的二聚体、二聚体Fab、Fv、Fv的二聚体、scFv、scFv的二聚体、Fab的三聚体、Fv的三聚体、scFv的三聚体、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、线性抗体、蛋白质、肽、适体、肽体、adnectin或核酸，上述分子结合HPTPβ的细胞外部分。在某些实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂是单克隆抗体和其F(ab’)2。在一些实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂包含多个HPTPβ-ECD结合部位，例如其中HPTPβ-ECD结合剂是完整抗体或F(ab’)2，或Fab的二聚体，或Fab的三聚体。例如，在一些实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂能够同时在相同或不同的表位上结合两个HPTPβ分子，从而将两个HPTPβ分子彼此拉近。在其它实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂能够同时在相同或不同表位上同时结合3个HPTPβ分子，从而将3个HPTPβ分子彼此拉近。在另一个实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂是由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-7680产生的单克隆抗体。在另一个实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂是由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-7680产生的单克隆抗体的抗原结合片段。在另一个实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂是具有与由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-7680产生的单克隆抗体相同或基本上相同的生物特征的抗体或其抗原结合片段。
[0075] 可将本申请中公开的HPTPβ-ECD结合剂的实施方案的任一个共价地或非共价地缀合至媒介物。术语“媒介物”是指影响试剂的生物性质的分子。例如，媒介物可阻止试剂的降解和/或增加其半衰期、吸收、减小春毒性、减小其免疫原性或增加其生物活性。示例性媒介物包括但不限于免疫球蛋白的Fc结构域；聚合物，例如：聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、葡聚糖；脂质；胆固醇基团(例如类固醇)；碳水化合物、树状聚合物、寡糖或结合补救受体的肽。在一些实施方案中，媒介物是聚乙二醇(PEG)，在其它实施方案中，媒介物是多聚赖氨酸，在其它实施方案中媒介物是葡聚糖，在其它实施方案中，媒介物是脂质。
[0076] 水溶性聚合物附着例如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇，如美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337中描述的，将所述美国专利通过引用整体并入本文。本领域已知的其它有用的聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇以及这些聚合物的混合物。特别优选的是利用聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰的肽体。可在指定的位置，例如在肽体的氨基末端键合水溶性聚合物，或可将所述聚合物随机地连接至多肽的一个或多个侧链。PEG用于改善试剂例如肽体和具体地人源化抗体的治疗能力的用途描述于美国专利No.6,133,426中。本发明还涉及衍生试剂的肽或媒介物部分。这样的衍生物可改善试剂的溶解度、吸收、生物半衰期等。部分可以可选择地消除或减弱试剂的任何不期望的副作用等。
[0077] 如本文中所用，术语″抗体″(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单链抗体，例如来自骆马和骆驼的抗体、抗体片段例如可变区和/或恒定区片段，只要它们显示期望的生物活性，例如抗原结合活性。术语″免疫球蛋白″(Ig)可与本文中的″抗体″互换使用。
[0078] 如本文中所用，“抗原结合片段”是结合HPTPβ的部分并且抑制HPTPβ的活性的试剂的片段。
[0079] ″分离的抗体″是已被鉴定，和/或与其天然环境分离的，和/或从其天然环境回收的抗体。
[0080] 基本四链抗体单位是由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链组成的异源四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本异四聚体单位连同称为J链的额外多肽组成，从而包含10个抗原结合部位，而分泌型IgA抗体可聚合以形成包含2-5个基础4链单位连同J链的多价集合体)。在IgG的情况下，4链单位通常为约150千道尔顿(kDa)。每一个L链通过一个共价二硫键连接至H链，然而，取决于H链同种型，两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接。每一个H和L链还具有有规律间隔的链间二硫桥。每一个H链在N-末端具有可变结构域(VH)，随后3个恒定结构域(CH)(对于每一个α和γ链)和4个CH结构域(对于μ和ε同种型)。每一个L链在N-末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端一个恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。特定氨基酸残基据信形成轻链与重链可变结构域之间的界面。VH与VL的配对一起形成单个抗原结合部位。关于不同种类的抗体的结构和性质，参见例如，Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，1994，第71页和第6章。
[0081] 来自任何脊椎动物物种的L链可基于它们的恒定结构域的氨基酸序列被分配至称为κ和λ的两个明确不同类型之一。取决于它们的重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分配至不同的种类或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对小的差异，γ和α种类被进一步细分成亚类，例如人表达下列亚类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
[0082] 骆驼科的成员例如骆马、骆驼和单峰骆驼包含独特类型的抗体，其不存在轻链，并且还不存在CH1结构域(Muyldermans，S.，Rev.Mol.Biotechnol.，第74卷，第277-302页(2001))。这些重链抗体的可变区称为VHH或VHH，并且构成来源于功能性免疫球蛋白的最小可获得的完整抗原结合片段(15kDa)。
[0083] 术语″可变的″是指可变结构域的某些区段在抗体之间在序列广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合并且确定特定抗体对于其抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分配在可变结构域的110个氨基酸跨度上的。相反地，V区域由称为″高变区″的具有极高可变性的更短区域(其各自在长度上为9-12个氨基酸)间隔的具有15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的区段组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR，主要采取β-折叠片构型，其形成环连接，在一些情况下形成β-折叠片结构的部分。每一条链中的高变区通过FR和与来自另一条链的高变区紧密地保持在一起，促成抗体的抗原结合部位的形成。恒定结构域并不直接地参与抗体对抗原的结合，但显示不同的效应子功能，例如抗体在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中的参与。
[0084] 当在本文中使用时，术语″高变区″是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自″互补决定区″或″CDR″的氨基酸残基(例如VL中的大约残基
24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中的大约1-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；
Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或来自″高变环″的残基。
24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中的大约1-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；
Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或来自″高变环″的残基。
[0085] 如本文中所用，术语″单克隆抗体″是指获自一组基本上同源的抗体的抗体，即除以少量存在的可能的天然存在的突变外，包含单个抗体的群体是相同的。与包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每一个单克隆抗体针对单个表位，即单个抗原决定簇。除它们的特异性以外，单克隆抗体还有利的方面在于它们可不受其它抗体污染地合成。修饰词″单克隆的″不被解释为需要通过任何特定方法进行抗体的产生。例如，本发明中使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法来制备或可使用重组DNA法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。还可使用可获得的技术(例如Clackson等人，Nature，第352卷，第624-628页(1991))从噬菌体抗体文库分离″单克隆抗体″。
[0086] 本文中的单克隆抗体包括″嵌合″抗体，其中一部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，然而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们显示期望的生物活性(参见美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第81卷，第6851-6855页(1984))。
[0087] ″抗体片段″包含多嵌合抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fab缀合物、Fv、scFv、微型抗体的二聚体和三聚体；双链、三链和四链抗体；线性抗体(参见Hudson等人，Nature Med.第9卷，第129-134页(2003))。
[0088] ″Fv″是包含完整抗原结合部位的最小抗体片段。该片段由一个重链和轻链可变区结构域通过紧密的非共价缔合组成的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发射出为抗原结合提供氨基酸残基并且赋予抗体抗原结合特异性的6个高变环(来自H和L链的各自3个环)。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含3个对于抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)具有识别并且结合抗原的能力，从而包括在Fv的定义中。
[0089] 单链可变片段(scFv)是通过10至约25个氨基酸的短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VI)的可变区的融合蛋白。接头通常富含半胱氨酸(以赋予柔性)以及丝氨酸或苏氨酸(以赋予可溶性)，并且可连接VH的N-末端与VL的C-末端或反之亦然。该蛋白质保持原始免疫球蛋白的特异性，尽管除去了恒定区和引入了接头。
[0090] 二价(或双价)单链可变片段(二-scFv，双-scFv)可通过连接两个scFv来进行工程化。这可通过利用有两个VH和两个VL区产生单肽链来进行，从而产生串联scFv。另一个可能性是产生具有接头肽的scFv，所述接头肽太短以至于两个可变区不能折叠在一起(约5个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。该类型称为双链抗体。已显示双链抗体具有达到对应scFv的1/40的解离常数，意味着它们具有高得多的对于它们的靶的亲和力。因此，双链抗体药物可以以比其它治疗抗体低得多的剂量给药，并且能够高度特异性地体内靶向肿瘤。更短的接头(1或2个氨基酸)导致三聚体(所谓的三链体或或三体)形成。四链抗体是已知的，并且经显示显示甚至比双链抗体更高的对于它们的靶的亲和力。
[0091] 术语″人源化抗体″或″人抗体″是指这样的抗体，所述抗体包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区，但其中VH和/或VI序列的至少一部分已被改变而成为更加″人样″，即与人种系可变序列更相似。一种类型的人源化抗体是CDR移植抗体，其中人CDR序列被引入非人VH和VL序列以替代对应的非人CDR序列。用于制备嵌合CDR移植和人源化抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，美国专利No.4,816,567和5,225,539)。用于人抗体的一个方法使用转基因动物，例如转基因小鼠。这些转基因动物包含插入它们自已的基因组的一大部分人抗体生成基因组，并且使动物自己的内源抗体产生在抗体的产生中缺乏。用于产生这样的转基因动物的方法在本领域是已知的。这样的转基因动物可使用XenoMouse.RTM.技术或通过使用″微小基因座(minilocus)″法来制备。用于制备XenoMice.RTM.的方法描述于美国专利No.6,162,963，6,150,584，6,114,598和6,075,181中。用于使用“微小基因座”法制备转基因动物的方法描述于美国专利No.5,545,807，5,545,806，5,625,825和WO93/12227中。
[0092] 非人抗体的人源化近年来已成为常规技术，并且现在本领域技术人员的知识范围内。几个公司提供了制备人源化抗体的服务例如，Xoma，Aries，Medarex，PDL和Cambridge Antibody Technologies。人源化方案详尽地描述于技术文献中，例如Kipriyanov和Le Gall，Molecular Biotechnol.，第26卷，第39-60页(2004)，Humana Press，Totowa，N.J.；Lo，Methods Mol.Biol.，第248卷，第135-159页(2004)，Humana Press，Totowa，N.J.；Wu等人，J.Mol.Biol.，第294卷，第151-162页(1999)。
[0093] 在某些实施方案中，本发明中使用的抗体可在除杂交瘤细胞系外的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的已知方法转化适当的哺乳动物宿主细胞，包括例如将多核苷酸包含装在病毒中(或包装进入病毒载体)和利用病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本领域已知的转染方法转染宿主细胞，如美国专利No.4,399,216，4,912,040，4,740,461和4,959,455中举例说明的。使用的转化法可取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域是已知的并且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的封装、核酸与带正电荷的脂质的混合以及DNA至细胞核的直接显微注射。
[0094] 以适当的组合编码抗体或其片段的重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区或轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子必要时，使用标准连接技术来将其插入适当的表达载体。可将抗体重链或轻链恒定区连接至适当可变区的C末端，连接进入表达载体。载体通常被选择在使用的特定宿主细胞中具有功能(即，载体可与宿主细胞的机器相容，以便基因的扩增和/或基因的表达可进行)。关于表达载体的综述，参见Methods Enzymol.第185卷，(Goeddel编辑)，1990，Academic Press。
[0095] 特异性结合剂的鉴定
[0096] 适当的HPTPβ-ECD结合剂可使用本领域已知的多种技术来鉴定。例如，可筛选候选试剂的对HPTPβ的结合，筛选其活性。一般地，首先筛选候选试剂的结合，随后筛选显示选择性结合的那些候选试剂以测定抑制HPTPβ-介导的Tie2的去磷酸化的能力。然而，在一些情况下，可以首先体外筛选候选试剂的活性。
[0097] 结合活性的测定
[0098] 用于鉴定特异性结合剂的适当的测定的选择取决于待筛选的候选试剂。本领域技术人员能够选择用于特定候选试剂的适当测定。
[0099] 例如，当候选试剂是抗体或包含Fc部分的肽体时，如实施例3B中描述的FACS分析允许基于其结合表达HPTPβ的细胞的能力来选择候选试剂。细胞可内源地表达HPTPβ或可进行遗传工程以表达HPTPβ。
[0100] 对于其它候选试剂例如适体，其它技术在本领域是已知的。例如，特异性结合HPTPβ的适体可使用称为SELEX(指数富集的配体系统进化技术)的技术来选择，所述技术通过重复轮的体外选择来选择特异性适体。
[0101] 通过蛋白质印迹进行的抑制剂活性的测定
[0102] 如实施例4中例举的，在一个适当的测定中，将HUVEC在不同浓度的候选试剂存在或不存在的情况下培养在无血清培养基中，制备细胞的裂解物，利用Tie2抗体进行免疫沉淀，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，随后转移至PVDF膜。随后利用抗磷酸酪氨酸抗体对膜结合的免疫沉淀的蛋白质进行系列蛋白质印迹，以定量Tie2磷酸化，接着是Tie2抗体以定量总的Tie2。Tie2磷酸化表达为抗-磷酸酪氨酸信号对总的Tie2信号的比率。更高水平的抗磷酸酪氨酸信号表明候选试剂的更大HPTPβ抑制。
[0103] 可筛选的候选试剂包括但不限于已知试剂的文库，所述试剂包括天然产物例如植物或动物提取物、生物活性分子，包括蛋白质、肽，包括但不限于随机肽文库的成员，以及由D或L构型氨基酸组成的组合化学衍生的分子文库、抗体，包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、人、单链抗体、Fab、F(ab)2和Fab表达文库片段及其表位结合片段。
[0104] 如本文中所用，“抗体片段”包括但不限于F(ab’)2、Fab、Fv、scFv的二聚体或三聚体，或来源于抗体的双链抗体、三链抗体或四链抗体。
[0105] 方法
[0106] 公开了用于治疗眼的疾病或病况，特别地视网膜病变，眼部水肿和眼部新生血管形成的方法。这些疾病或病况的非限定性实例包括糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性(湿型)、脉络膜新生血管化、糖尿病视网膜病变、眼缺血、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞(中央或分枝)、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、葡萄膜炎等。这些疾病或病况特征在于眼血管系统的变化，无论是进行性的还是非进行性的，无论是急性疾病或病况还是慢性疾病或病况的结果。
[0107] 公开的方法的一个方面涉及作为糖尿病的直接或间接结果的疾病，除其它以外，糖尿病黄斑水肿和糖尿病视网膜病变。糖尿病的眼血管系统随时间过去变得不稳定，从而导致病况例如非增生性视网膜病变、黄斑水肿和增生性视网膜病变。当液体渗入黄斑的中央(眼的其中灵敏的向前直视时的视觉可发生的部分)时，流体和相关蛋白质的积累开始沉积在黄斑上或黄斑下。这导致扰乱受试者的中央视觉的隆起部分。该病况称为“黄斑水肿”。可发生的另一种病况是其中血管变化例如微动脉瘤可在眼的黄斑区外部发生的非增生性视网膜病变。
[0108] 这些病况可以进展至或可以不进展至特征在于新生血管形成的糖尿病性增生性视网膜病变。这些新的血管是脆性的并且易于出血。结果是视网膜的结痂，以及因新血管的过度形成而导致的通过眼的光路通道的阻塞或完全阻塞。通常地，具有糖尿病黄斑水肿的患者遭受糖尿病视网膜病变的非增生性阶段；然而，对于受试者常见地是仅在增生性阶段开始时开始表面黄斑水肿。
[0109] 糖尿病视网膜病变，如果不治疗，可最终导致失明。事实上，糖尿病视网膜病变是工作年龄人群中失明的首要原因。
[0110] 因此，公开的方法涉及防止、治疗、控制、消除具有糖尿病的受试者或经诊断具有糖尿病的受试者的眼部新生血管形成和/或另外地使所述眼部新生血管形成减小至最低程度。此外，具有糖尿病的受试者或经诊断具有糖尿病的受试者可被警示或可意识到发生糖尿病相关失明的风险，从而本发明方法可用于防止或延迟已知处于风险中的受试者的非增生性视网膜病变的发作。同样地，本发明方法可用于治疗具有非增生性糖尿病视网膜病变或经诊断具有该病的受试者以阻止病况的进展。
[0111] 公开的方法涉及通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐，来防止或控制眼部新生血管形成或治疗与眼部新生血管形成的发作相关的疾病或病况。
[0112] 本方法的一个方面涉及通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐来治疗或防止眼部新生血管形成。本方面的一个实施方案涉及用于治疗眼部新生血管形成的方法，包括给受试者施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物。
[0113] 因此，本公开内容的一个实施方案是治疗或防止受试者的眼部新生血管形成的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的另一个实施方案是治疗或防止受试者的眼部新生血管形成的方法，包括施用有效量的包含HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物。本公开内容的另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗眼的新生血管形成的用途。
[0114] 公开的方法还涉及通过给受试者施用HPTPβ-ECD结合剂来防止或控制眼部水肿或治疗与眼部水肿的发作相关的疾病或病况。
[0115] 本方法的一个方面涉及通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐来治疗或防止眼部水肿。本方面的一个实施方案涉及用于治疗眼部水肿的方法，包括给受试者施用组合物，所述组合物包含：
[0116] a.有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐；和
[0117] b.一种或多种载体或相容性赋形剂。
[0118] 因此，本公开内容的一个实施方案是治疗或防止受试者的眼部水肿的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的另一个实施方案是治疗或防止受试者的眼部水肿的方法，包括施用有效量的包含HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物。本公开内容的实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗眼部水肿的用途。
[0119] 另一个公开的方法涉及通过给受试者施用HPTPβ-ECD结合剂来防止或控制视网膜水肿或视网膜新生血管形成，或治疗与视网膜水肿或视网膜新生血管形成的发作相关的疾病或病况。本方法的一个方面涉及通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐来治疗或防止视网膜水肿或视网膜新生血管形成。本方面的一个实施方案是用于治疗视网膜水肿或视网膜新生血管形成的方法，包括给受试者施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物。
[0120] 因此，本公开内容的一个实施方案是治疗或防止受试者的视网膜水肿的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。另一个实施方案是治疗或防止视网膜新生血管形成的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的一个实施方案是通过施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物来治疗或防止受试者的视网膜水肿的方法。另一个实施方案是通过施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂来治疗或防止视网膜新生血管形成的方法。另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗视网膜水肿的用途。其它实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗视网膜新生血管形成的用途。
[0121] 还公开的方法涉及通过给受试者施用HPTPβ-ECD结合剂来治疗、防止或控制糖尿病视网膜病变，或治疗与糖尿病视网膜病变的发作相关的疾病或病况。
[0122] 本方法的一个方面涉及通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐来治疗或防止糖尿病视网膜病变。本方面的一个实施方案涉及用于治疗糖尿病视网膜病变的方法，包括给受试者施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物。
[0123] 因此，本公开内容的一个实施方案是治疗或防止受试者的糖尿病视网膜病变的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的另一个实施方案是通过施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物，来治疗或防止受试者的糖尿病视网膜病变的方法。本公开内容的另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗糖尿病视网膜病变的用途。
[0124] 还公开的方法涉及用于治疗或防止非增生性视网膜病变的方法，包括给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。
[0125] 本方面的另一个实施方案涉及用于治疗或防止非增生性视网膜病变的方法，包括给受试者施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物。
[0126] 因此，本公开内容的一个实施方案是治疗或防止受试者的非增生性视网膜病变的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的另一个实施方案是通过施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物，来治疗或防止受试者的非增生性视网膜病变的方法。本公开内容的另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗非增生性视网膜病变的用途。
[0127] 还公开的方法涉及通过给受试者施用HPTPβ-ECD结合剂来防止或控制糖尿病黄斑水肿，或治疗与糖尿病黄斑水肿的发作相关的疾病或病况。
[0128] 本方法的一个方面涉及通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐来治疗或防止糖尿病黄斑水肿的方法。本方面的一个实施方案涉及用于治疗受试者的糖尿病黄斑水肿的方法，包括给受试者施用组合物，所述组合物包含：a)有效量的一种或多种HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐；和b)一种或多种载体或相容性赋形剂。
[0129] 因此，本公开内容的一个实施方案是治疗或防止受试者的糖尿病黄斑水肿的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的另一个实施方案是通过施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物，来治疗或防止受试者的糖尿病黄斑水肿的方法。本公开内容的另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗糖尿病黄斑水肿的用途。
[0130] 本公开内容的另一个实施方案是用于治疗或防止受试者的年龄相关湿型黄斑变性水肿的方法，包括施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本公开内容的另一个实施方案是通过施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物来治疗或防止年龄相关湿型黄斑变性水肿的方法。本公开内容的另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗年龄相关湿型黄斑变性水肿的用途。
[0131] 其它实施方案是通过给受试者施用有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐，来治疗、防止或控制脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血或葡萄膜炎的方法。另一个实施方案是用于通过给受试者施用包含有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种载体或相容性赋形剂的组合物，来治疗、防止或控制脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张或葡萄膜炎的方法。本公开内容的另一个实施方案是HPTPβ-ECD结合剂用于治疗脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张或葡萄膜炎的用途。
[0132] 另一个实施方案是用于治疗或防止眼障碍的组合物，其包含HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体。另一个实施方案是用于治疗或防止眼障碍的组合物，其包含HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体组合物，其中眼障碍是眼部新生血管形成、眼部水肿、视网膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、非增生性视网膜病变、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张或葡萄膜炎。
[0133] 在一些实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐用于治疗眼障碍。在一些实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐用于治疗眼障碍，其中眼障碍是眼部新生血管形成、眼部水肿、视网膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、非增生性视网膜病变、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张或葡萄膜炎。
[0134] 在其它实施方案中，HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐用于药剂的制造，所述药剂用于治疗眼障碍。在一些实施方案中，眼障碍是眼部新生血管形成、眼部水肿、视网膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管化、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、眼创伤、手术诱发的水肿、手术诱发的新生血管形成、囊样黄斑水肿、眼缺血、非增生性视网膜病变、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张或葡萄膜炎。
[0135] 给药
[0136] 可经验地确定施用HPTPβ-ECD结合剂的有效剂量和时间安排，产生这样的决定在本领域技术人员的能力范围内。本领域技术人员钭理解，必须施用的试剂的剂量可取决于例如将接受试剂的受试者、施用途径、使用的试剂的具体类型以及待给受试者施用的其它药物而变化。例如，选择抗体的适当剂量的指导方针见于关于抗体的治疗性应用的文献例如Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编辑.，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，(1985)第22章和第303-357页；Smith等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人编辑，Raven Press，New York(1977)第365-389页中。取决于上述因素，单独使用的试剂的典型剂量可在约0.01mg/kg至达到500mg/kg的体重或更多/天，或约0.01mg/kg至约50mg/kg，或0.1mg/kg至约50mg/kg，或约0.1mg/kg至达到约10mg/kg，或约0.2mg/kg至约1mg/kg的范围内。
[0137] 一个实施方案涉及用于治疗眼部水肿和/或新生血管形成的方法，包括给受试者施用约0.01mg/kg至约50mg/kg的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本实施方案的另一个重复涉及给受试者施用按待治疗的受试者重量计约0.1mg/kg至约10mg/kg的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本实施方案的另一个重复涉及用于治疗或防止与眼部水肿和/或新生血管形成相关的疾病或病况的方法，包括给受试者施用按受试者的重量计约1mg/kg至约10mg/kg的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。本实施方案的另一个重复是用于治疗或防止与眼部水肿和/或新生血管形成相关的疾病或病况的方法，包括给受试者施用按受试者的重量计约5mg/kg至约10mg/kg的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。在本实施方案的其它重复中，涉及用于治疗或防止与眼部水肿和/或新生血管形成相关的疾病或病况的方法，包括给受试者施用按受试者的重量计约1mg/kg至约5mg/kg的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。在本实施方案的其它重复中，涉及用于治疗或防止与眼部水肿和/或新生血管形成相关的疾病或病况的方法，包括给受试者施用按受试者的重量计约3mg/kg至约7mg/kg的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐。
[0138] 用于HPTPβ-ECD结合剂的施用的给药方案包括但不限于每天1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月3次、2次、每月1次和每2月1次。
[0139] 还公开了治疗或防止本文中上述的与眼部水肿和/或新生血管形成相关的疾病或病况的一种或多种的方法，所述疾病或病况是施用另一种药物活性剂的结果。这样，本方面涉及包括给受试者施用组合物的方法，所述组合物包含：a)有效量的HPTPβ-ECD结合剂或其药学上可接受的盐；b)一种或多种另外的药物活性剂；和c)一种或多种载体或相容性赋形剂。
[0140] 可将本发明的方法与护理标准包括但不限于激光治疗组合。
[0141] 适合与HPTPβ-ECD结合剂组合的药物活性剂的非限定性实例包括抗感染剂即氨基糖苷类、抗病毒剂、抗微生物剂、抗胆碱药/抗痉挛剂、抗糖尿病剂、抗高血压药、抗肿瘤药、心血管药、中枢神经系统药、凝固改性剂、激素、免疫制剂、免疫抑制剂、眼用制剂等。
[0142] 公开的方法还涉及公开的试剂和组合物的施用。施用可以是通过皮下或i.v.施用的全身性的；或将HPTP-β抑制剂直接施用至眼例如局部。局部施用法包括例如，通过滴眼剂、结膜下注射或植入、玻璃体内注射或植入、眼球筋膜下注射或植入、手术灌洗液中的掺入等。
[0143] 公开的方法涉及将HPTPβ-ECD结合剂作为药物组合物的部分施用。适合用于局部施用的组合物在本领域中是已知的(参见，例如，美国专利公布2005/0059639)。在不同的实施方案中，本发明的组合物可包含含有溶液中、悬浮液中或两者中的活性剂的液体。如本文中所用，液体组合物包括凝胶。在一个实施方案中，液体组合物是含水的。或者，组合物采用软膏剂的形式。在另一个实施方案中，组合物是原位可胶化的含水组合物。这样的组合物可以以在与眼或眼外部的泪液接触后有效地促进胶凝的浓度包含胶凝剂。本发明的含水组合物具有眼睛相容性pH和重量摩尔渗透压浓度。组合物可包括用于结膜下施用的含有活性剂的滴眼剂。可将包含活性剂的微粒包埋在生物相容性药学上可接受的聚合物或液体封装剂中。滴剂可适合于在长时期内释放全部或基本上全部活性物质。聚合物或脂质基质，如果存在，可适合于在全部或基本上全部活性剂释放后充分降解以从施用位置运走。滴剂可以是液体制剂，包含药学上可接受的聚合物和溶解的或分散的活性剂。注射后，聚合物例如通过胶凝化或沉淀在注射位置形成仓库。组合物可包括可被插入在眼的适当位置中例如眼与眼脸之间或结膜囊中的固体制品，在所述位置中制品释放活性剂。适合于以这样的方式眼内植入的固体制品通常包含聚合物并且可以是可生物蚀解的或非生物可蚀解的。
[0144] 在公开的方法的一个实施方案中，具有至少一只视力受损的眼的人受试者利用2-4000μg的HPTPβ-ECD结合剂通过玻璃体内注射来治疗。临床症状的改善通过本领域已知的一个或多个方法来监控，所述方法是例如检眼镜间接检查法、眼底照相术、荧光素血管造影研究、视网膜电锚记术、外部眼检查、裂隙灯活组织显微镜检查、压平眼压测量法、厚度测量法、光协调性体层摄影术和自动验光法。后随剂量可以以2-8周或1-12个月的间隔的频率每周或每月施用一次。
[0145] 公开的方法包括与药学上可接受的载体组合的公开的试剂的施用。“药学上可接受的”意指不是生物学上或另外地不想要的物质，即可给受试者施用所述物质而不引起任何不想要的生物效应或以有害的方式与包含在其中的药物制剂的任何其它组分相互作用。载体可天然地被选择来使活性成分的任何降解降至最低程度和使受试者中的任何不利副作用减小至最小，这对于本领域技术人员来说是公知的。在另一个方面，可预防性使用许多公开的试剂，即用作预防剂(纯净的或具有药学上可接受的载体)。可将本文中公开的离子型液体组合物方便地配制成由纯净的离子型液体组成的或与药学上可接受的载体结合地组成的药物组合物。参见《雷氏药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》，第
18版，Gennaro，AR.编辑，Mack Publishing，Easton Pa.(1990)，其公开了可与本文中公开的试剂的制剂的制备结合使用的常见载体和制备药物组合物的常规方法，并且将所述药学大全通过引用并入本文。这样的药物载体最常见地可以是用于给人和非人施用组合物的标准载体，例如无菌水、盐水和在生理pH下的缓冲溶液。其它试剂可按照由本领域技术人员使用的标准方法来进行施用。例如，药物组合物还可包含一种或多种另外的活性成分例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
18版，Gennaro，AR.编辑，Mack Publishing，Easton Pa.(1990)，其公开了可与本文中公开的试剂的制剂的制备结合使用的常见载体和制备药物组合物的常规方法，并且将所述药学大全通过引用并入本文。这样的药物载体最常见地可以是用于给人和非人施用组合物的标准载体，例如无菌水、盐水和在生理pH下的缓冲溶液。其它试剂可按照由本领域技术人员使用的标准方法来进行施用。例如，药物组合物还可包含一种或多种另外的活性成分例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
[0146] 药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，更优选约7至约7.5。其它载体包括持续释放制剂例如包含公开的试剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质以成形的制品的形式存在，例如，薄膜、脂质体、微粒或微胶种。对于本领域技术人员很显然的是取决于例如施用途径和待施用的组合物的浓度，某些载体可以是更优选的。其它试剂可按照本领域技术人员使用的标准方法来进行施用。
[0148] 为了本公开内容的目的，术语“赋形剂”和“载体”在本公开内容的整个说明书中可互换使用，并且所述术语在本文中定义为“在配制安全有效的药物组合物的实践中使用的成分”。
[0149] 配制者应理解，赋形剂主要用于在递送安全、稳定的功能性药物中起作用，不仅用作用于递送的总的媒介物的部分而且还用作用于实现被活性成分的接受者有效吸收的工具。赋形剂可简单直接地作为惰性填充剂起作用，或如本文中所用，赋形剂可以为pH稳定系统的部分。配制者还可利用这样的事实：本发明的试剂具有改善的细胞能力、药代动力学性质。
[0150] 公开的试剂还可存在于用于递送活性治疗剂的液体、乳剂或悬浮剂中。药学上可施用的液体组合物可以例如通过在本文中描述的活性剂和任选的药物佐剂在赋形剂中溶解、分散等(从而形成溶液或悬浮剂)来制备，所述赋形剂是例如水、含水葡萄盐溶液、甘油、乙醇等。必要时，待施用的药物组合物还可包含少量无毒辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如醋酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺油酸酯等。制备这样的剂型的实际方法是已知的，或对于本领域技术人员来说是显然的，例如参见上文中引用的《雷氏药学大全》。
[0151] 试剂盒
[0152] 还公开了包括待递送至人、哺乳动物或细胞内的试剂和组合物的试剂盒。试剂盒可包括一个或多个包装单位剂量的包含待递送至人、哺乳动物或细胞内的一种或多种试剂的组合物。其中可在使用前包装待递送的试剂的单位剂量安瓿或多剂量容器，可包括封装单位剂量的组合物或多个单位剂量的熔封容器。。可将试剂包装为无菌制剂，熔封闭容器被设计来保持制剂的无菌性直至使用。实施例
[0153] 实施例1
[0154] HPTPβ细胞外结构域蛋白的产生
[0155] 按照制造商(Origene)的说明书，从人胎盘文库克隆全长HPTPβcDNA(SEQ ID NO：1)。通过PCR从编码具有添加的c末端His-His-His-His-His-His-Gly(6His-Gly)的氨基酸1-1621(SEQ ID NO：3)的全长cDNA克隆编码HPTPβ的完整可溶性细胞外结构域(ECD)的cDNA。将所得的cDNA克隆进入哺乳动物表达载体以在HEK293细胞中进行瞬时(pShuttle-CMV)或稳定的(pcDNA3.1(-))表达。为了获得纯化的HPTPβECD(βED)，在正常生长条件下将利用βECD表达载体转染的HEK293细胞在无血清OptiMEM(Gibco)中温育24小时。随后回收条件培养基，离心以除去碎片，将1mL洗涤的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)(500μL包装材料)添加至每一个10μL的清洁培养基，使其在4℃下摇动过夜。在第二天，将混合物加载至柱子中，用20倍床体积的50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑、pH8洗涤。
随后以200μL/洗脱于50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑、pH8中洗脱纯化的HPTPβ细胞外结构域蛋白(SEQ ID NO：4)。使用还原-变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析级分的蛋白质含量，通过银染(Invitrogen)进行检测，和通过质谱法进行确认。
随后以200μL/洗脱于50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑、pH8中洗脱纯化的HPTPβ细胞外结构域蛋白(SEQ ID NO：4)。使用还原-变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析级分的蛋白质含量，通过银染(Invitrogen)进行检测，和通过质谱法进行确认。
[0156] 实施例2
[0157] 针对HPTPβ细胞外结构域的单克隆抗体的产生
[0158] 通过例如实施例1中描述的方法产生纯化的HPTPβ细胞外结构域蛋白。为了产生HPTPβ细胞外结构域免疫原，使用EDC偶联化学(Hockfield，S.等人，(1993)Cold Spring Habor Laboratory Press.，第1卷，第111-201页，Immunocytochemistry)将纯化的HPTPβ细胞外结构域-6-His蛋白缀合至猪甲状腺球蛋白(Sigma)。将所得的HPTPβ细胞外结构域-甲状腺球蛋白缀合物针对PBS，pH7.4进行透析。随后利用所述缀合物(100-200μg)和完全弗氏佐剂的1∶1混合物皮下免疫成年Balb/c小鼠。2-3周后，利用不完全弗氏佐剂和缀合物的1∶1混合物腹膜内或皮下注射小鼠。在第4-6周重复注射。在第三次注射后7天从小鼠收集血清，利用ELISA和蛋白质印迹测定其对HPTPβ细胞外结构域抗原的免疫反应性。通过使用31规超长针(Goding，J.W，(1996)Monoclonal Antibodies：Principles and Practices.第3版，Academic Press Limited.第145页)，利用50μl的与氢氧化铝
1∶1混合的纯化的HPTPβ细胞外结构域蛋白的单次脾内注射，加强显示良好的对抗原的反应的小鼠。简而言之，用2.5％阿佛丁麻醉小鼠，在皮肤和左斜肌体壁上产生1厘米的切口。通过在纵向注射中将针从脾的后部插入前部来施用抗原混合物。缝合体壁，用两个小的金属夹封闭皮肤。监控小鼠的安全回收。手术后4天，取出小鼠的脾，制备单细胞悬浮物来与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞系(Spitz，M.，(1986)Methods In Enzymology，第121卷.编辑John J，Lagone和Helen Van Vunakis.第33-41页(Academic Press，New York，NY))。将所得的杂交瘤培养在补充有15％胎牛血清(Hyclone)和次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的Dulbeccos改良培养基(Gibco)中。
1∶1混合的纯化的HPTPβ细胞外结构域蛋白的单次脾内注射，加强显示良好的对抗原的反应的小鼠。简而言之，用2.5％阿佛丁麻醉小鼠，在皮肤和左斜肌体壁上产生1厘米的切口。通过在纵向注射中将针从脾的后部插入前部来施用抗原混合物。缝合体壁，用两个小的金属夹封闭皮肤。监控小鼠的安全回收。手术后4天，取出小鼠的脾，制备单细胞悬浮物来与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞系(Spitz，M.，(1986)Methods In Enzymology，第121卷.编辑John J，Lagone和Helen Van Vunakis.第33-41页(Academic Press，New York，NY))。将所得的杂交瘤培养在补充有15％胎牛血清(Hyclone)和次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的Dulbeccos改良培养基(Gibco)中。
[0159] 阳性杂交瘤的筛选在融合后8天开始，并且继续15天。在两组96孔板上通过ELISA鉴定产生抗-HPTPβ细胞外结构域抗体的杂交瘤：一个用组氨酸标记的-HPTPβ细胞外结构域涂覆，另一个用组氨酸标记的细菌MurA蛋白涂覆作为阴性对照。第二抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson Immunoresearch)标记的驴抗-小鼠IgG。使用通过溶解在TBS缓冲液，pH7.5中的ABTS片剂起始的显色监控孔中的免疫反应性。通过添加100微升的1％SDS终止单个HRP反应混合物，利用分光光度计在405nm读取吸光度。产生与HPTPβ细胞外结构域-6His相互作用，但不与murA-6His蛋白作用的抗体的杂交瘤用于进一步分析。对96孔板中的阳性克隆进行有限稀释(0.8个细胞/孔)两次，克隆形成能力被定义为具有大于99％的具有阳性反应性的孔。使用iso-strip技术(Roche)测定抗体的同种型。为了获得纯化的抗体以进行进一步评价，使用蛋白A或蛋白G柱亲和纯化组织培养上清液。
[0160] 分离5个对HPTPβ-ECD蛋白免疫反应的单克隆抗体，并且给予其下列命名：R15E6、R12A7、R3A2、R11C3、R15G2和R5A8。基于其在ELISA和蛋白质印迹中与HPTPβ-ECD蛋白的反应，R15E6被选择用于进一步研究。
[0161] 实施例3
[0162] 单克隆抗体R15E6
[0163] 如本申请和美国专利No.7,973,142中的实施例2中所述鉴定和表征单克隆抗体R15E6；过程和结果概述于下文中。
[0164] A.R15E6结合内源性HPTPβ，如通过免疫沉淀显示的。
[0165] 材料：来自Cambrex的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、EGM培养基和胰蛋白酶中和溶液；OPTIMEM I(Gibco)、牛血清白蛋白(BSA；Santa Cruz)、磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)、生长因子，包括血管生成素1(Ang1)、血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)(R&D Systems)、Tie2单克隆抗体(Duke University/P&GP)、VEGF受体2(VEGFR2)多克隆抗体(Whitaker等人)、蛋白A/G琼脂糖(Santa Cruz)、Tris-甘氨酸预制凝胶电泳/转移系统(6-8％)(Invitrogen)、PVDF膜(Invitrogen)、裂解缓冲液(20mm Tris-HCl，137mm NaCl，10％甘油，1％triton-X-100，2mM EDTA，1mM NaOH，1mM NaF，1mMPMSF，1μg/ml亮抑酶肽，1μg/ml胃酶抑素)。
[0166] 方法：利用单独的抗体(于OPTIMEM中)或OPTIMEM I预处理HUVEC，进行30分钟。在除去预处理后，用Ang1(100ng/ml)在PBS+0.2％BSA中处理细胞6分钟，在裂解缓冲液中裂解所述细胞。将裂解物在Tris-甘氨酸凝胶上直接电泳或用2-5μg/ml Tie-2抗体或10μg/ml R15E6抗体和A/G琼脂糖进行免疫沉淀。利用裂解缓冲液对免疫沉淀的样品漂洗1次，在1倍样品缓冲液中煮沸5分钟。在Tris-甘氨酸凝胶上分离样品，将其转移至PVDF膜，使用指定的抗体(pTYR Ab(PY99，Santa Cruz)，Tie-2，VEGFR2和/或R15E6)通过蛋白质印迹进行检测。
[0167] 结果：通过IP/蛋白质印迹，R15E6识别与HPTPβ的大小一致的主要高分子量条带(图1，图框A，泳道2)。不太强的更低分子量的条带可能代表糖基化程度较低的HPTPβ的前体形式。利用对照、非免疫IgG的免疫沉淀(IP)在HPTPβ的分子量范围内未显示条带(图1，图框A，泳道1)，组合的Tie2/VEGFR2IP显示具有预期分子量的条带(图1，图框A，泳道3)。该结果显示R15E6识别HPTPβ并且对于HPTPβ是特异性的。
[0168] B.R15E6结合内源性HPTPβ，如通过FACS分析显示的
[0169] 材料：来自Cambrex的HUVEC、EGM培养基和胰蛋白酶中溶液；来自Molecular Probes的第二Alexfluor488-标记抗体；Hanks平衡盐溶液(Gibco)；来自Becton Dickenson的FACSCAN流式细胞仪和CellQuest软件。
[0170] 方法：对HUVEC进行胰蛋白酶处理，随后利用胰蛋白酶中和溶液处理，利用HBSS进行漂洗。将R15E6抗体(0.6μg)添加至50μl的HBSS中的250,000个细胞，在冰上温育20分钟。用1ml HBSS漂洗细胞，随后添加2μg的缀合有荧光的第二抗体，在冰上进行20分钟。在1ml HBSS漂洗和重悬浮细胞，随后在FACSCAN流式细胞仪上，利用CellQuest软件进行分析。仅用缀合有荧光的第二抗体处理对照细胞。
[0171] 结果：通过FACS分析，完整HUVEC、R15E6相较于单独的第二抗体引起荧光信号的强烈偏离(>90％的细胞)(图1，图框B)。该结果显示R15E6结合存在于完整内皮细胞表面上的内源HPTPβ。
[0172] 实施例4
[0173] R15E6增强Tie2激活
[0174] R15E6在血管生成素1(Ang1)(Tie2配体)不存在和存在的情况下增强Tie2磷酸化。
[0175] 方法：在不同浓度的R15E6存在或不存在的情况下以及在添加或不添加Ang1的情况下将HUVEC培养在上述无血清培养基中。制备裂解物，利用Tie2抗体进行免疫沉淀，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，将其转移至PVDF膜。随后利用抗磷酸酪氨酸抗体对膜结合的免疫沉淀的蛋白质进行一系列蛋白质印迹，以定量Tie2磷酸化，随后利用Tie2抗体定量总的Tie2。Tie2磷酸化表达为抗磷酸酪氨酸信号相对总的Tie2信号的比率。
[0176] 结果：R15E6在Ang1不存在和存在的情况下增强Tie2磷酸化(图2)。该结果表明R15E6对内皮细胞表面上的HPTPβ的结合调节其生物功能，从而在配体不存在或存在的情况下导致增强的Tie2的激活。
[0177] 实施例5
[0178] 抗VE-PTP细胞外结构域抗体的生成
[0179] A.小鼠VE-PTP细胞外结构域蛋白(VE-PTP-ECD)的产生
[0180] VE-PTP-ECD可通过任何适当的方法产生。这样的方法在本领域是公知的。例如，可使用与本公开内容的实施例1相似的方法产生VE-PTP-ECD，其中VE-PTP-ECD cDNA用于替代编码HPTPβ-ECD的cDNA。SEQ ID NO：7提供编码VE-PTP-ECD的核苷酸序列。SEQ ID NO：8提供VE-PTP-ECD的氨基酸序列。
[0181] B.针对VE-PTP ECD的抗体的产生
[0182] 抗-VE-PTP抗体可通过本领域公知的方法容易地产生。例如，抗VE-PTP抗体可使用本公开内容的实施例2的方法，通过用VE-PTP-ECD替代HPTPβ细胞外结构域和利用所得的蛋白质免疫大鼠来产生。本研究中使用的大鼠抗-小鼠VE-PTP抗体由Dr.D.Vestweber友好地提供(mAb109)。如Baumer S.等人，Blood，2006；107：4754-4762中所述产生抗体。简而言之，通过用VE-PTP-Fc融合蛋白免疫大鼠来产生抗体。如Gotsch U.等人，J Cell Sci.，1997，第110卷，第583-588页以及BosseR.和Vestweber D.，Eur J Immunol.，1994，第24卷，第3019-3024中所述进行免疫、杂交瘤融合和筛选。
[0183] 这样构建融合蛋白，以便以VE-PTP的位置732上的氨基酸脯氨酸结尾的前8个纤连蛋白III型样重复与人IgG1的Fc部分(始于位置239上的氨基酸脯氨酸)框内融合。将克隆进入pcDNA3(Invitrogen)的该构建体稳定地转染入CHO细胞，通过蛋白A Sepharose亲和层析纯化融合蛋白。
[0184] 实施例6
[0185] 抗-VE-PTP ECD抗体的玻璃体内注射
[0186] 激光诱发的脉络膜新生血管化模型：脉络膜新生血管化模型被认为代表新生血管性年龄相关性黄斑变性的模型。如先前所述产生脉络膜NV。参见Tobe T，等人，Am.J.Pathol.，1998，第153卷，第1641-1646页。成年C57BL/6小鼠在每一只眼的3个位置具有激光诱发的布鲁赫膜破裂，随后在一只眼中给予1或2μg的VE-PTP-ECD抗体(IgG2a)的1μL玻璃体内注射，在对侧眼中给予媒介物(5％葡萄糖)的玻璃体内注射。在第7天6
重复这些处理。在激光处理后14天，利用荧光素标记葡聚糖(2×10 的平均MW，Sigma，St.Louis，MO)灌注小鼠，利用荧光显微镜术在脉络膜平展支架中评价新生血管形成的程度。由对处理组不知情的观察者通过成像分析测量每一个布鲁赫膜破裂位置上的CNV面积。CNV的面积是是一只眼中的3个破裂位置的平均值。如图3中所示，利用VE-PTP-ECD抗体的处理相对于利用媒介物对照的处理在1和2μg的剂量显著减少脉络膜新生血管化。
重复这些处理。在激光处理后14天，利用荧光素标记葡聚糖(2×10 的平均MW，Sigma，St.Louis，MO)灌注小鼠，利用荧光显微镜术在脉络膜平展支架中评价新生血管形成的程度。由对处理组不知情的观察者通过成像分析测量每一个布鲁赫膜破裂位置上的CNV面积。CNV的面积是是一只眼中的3个破裂位置的平均值。如图3中所示，利用VE-PTP-ECD抗体的处理相对于利用媒介物对照的处理在1和2μg的剂量显著减少脉络膜新生血管化。
[0187] 实施例7
[0188] 氧诱发的缺血性视网膜病变
[0189] 氧诱发的缺血性视网膜病变模型被认为代表了增生型糖尿病性视网膜病变的模型。利用由Smith，L.E.H.，等人Oxygen-induced retinopathy in the mouse.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.35，101-111(1994)描述的方法产生C57BL/6小鼠的缺血性视网膜病变。
[0190] 将出生后第7天(P7)的C57BL/6小鼠及它们的母亲置于密闭室中并且暴露于高氧(75±3％的氧)进行5天。利用PROOX型110氧气控制器(Reming Bioinstruments Co.，Redfield，NY)连续监测氧。在P12，将小鼠返回室内空气并且在解剖显微镜下，将Harvard泵显微注射系统和拉制的玻璃吸管用于递送1μl的1或2μg的VE-PTP-ECD抗体的玻璃体内注射(在一只眼中进行的)和在对侧眼中注射媒介物。在P17，如先前所述，在P17测量视网膜表面上NV的面积。参见ShenJ，等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，2007，第48卷，第4335-4341页。简而言之，给小鼠提供1μl的包含0.5μg大鼠抗小鼠PECAM抗体(Pharmingen，San Jose，CA)的眼内注射。12小时后，使小鼠无痛致死，在10％福尔马林中固定眼睛。切取视网膜，将其在1∶500的缀合有Alexa488的山羊抗-大鼠IgG(Invitrogen，Carlsbad，CA)中温育40分钟，随后洗涤，进行全标本包埋。对处理组不知情的观察者利用Nikon荧光显微镜检查载玻片，使用ImagePro Plus软件(Media Cybemetics，Silver Spring，MD)通过计算机化成像分析测量每视网膜NV的面积。图4显示利用VE-PTP-ECD抗体的处理在约1和2μg的剂量上相对于利用媒介物对照的处理显著减少视网膜新血管形成。图5显示利用媒介物处理的小鼠相对于利用2μg的VE-PTP-ECD抗体处理的小鼠的代表性视网膜全标本包埋。
[0191] 实施例8
[0192] VE-PTP-ECD抗体的皮下注射
[0193] 除在P12当将小鼠返回室内气体时进行VE-PTP-ECD抗体(1mg/kg)的皮下给药和在第P14和P16天再次给药(总共3个剂量)外，如实施例7中所述(从P5至P12于75％氧气氛中封闭)进行氧诱导的缺血性视网膜病变模型的玻璃体内给药。如上述在第(P17)天所描述的，评价新生血管形成。图6显示VE-PTP-ECD抗体的皮下给药减少视网膜新血管形成的面积。
[0194] 实施例9
[0195] 在2mg/kg的皮下剂量上报告了实施例8中描述的实验。(图7)
[0196] 虽然描述了本公开内容的许多实施方案，但很明显基本实施方案可被改变来提供利用或包括本发明的HPTPβ-ECD结合剂、方法和过程的其它实施方案。实施方案和实施例用于举例说明目的，并且不被解释为限定本发明的公开内容，相反地，所述权利要求界定本发明的范围。
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